KR20070032273A

KR20070032273A - 무혈청 베로 세포 뱅킹 방법

Info

Publication number: KR20070032273A
Application number: KR1020067014410A
Authority: KR
Inventors: 엔 알릭멧츠; 아미 헬렌 니콜스; 도로씨 진 플럼머
Original assignee: 와이어쓰
Priority date: 2003-12-19
Filing date: 2004-12-10
Publication date: 2007-03-21
Also published as: KR101115087B1; PL1694828T3; IL176338A0; WO2005066332A1; CN1894400B; AU2004312352A1; US20090246868A1; EP1694828B1; CA2548162C; JP2007514449A; DE602004031872D1; SI1694828T1; JP4541365B2; ATE502104T1; AU2004312352B2; CN1894400A; BRPI0417775A; MXPA06007047A; CA2548162A1; DK1694828T3

Abstract

무혈청 베로 세포 뱅킹 방법은 바이러스 백신 제조를 위한 신뢰가능하고 안정한 세포 뱅크를 제조하는 표준화되고 일관된 방법을 제공한다. 생장 및 동결 배지에서, 동물-유래 물질을 식물 유래 물질로 대체하여 해동시 세포 생존율을 증가시키고 세포 회수 시간을 감소시킴으로써, 제조에 있어서의 보다 정확한 스케쥴 및 보다 일관된 방법을 가능하게 한다.

Description

무혈청 베로 세포 뱅킹 방법 {SERUM-FREE VERO CELL BANKING PROCESS}

본 발명은 무혈청 세포-동결 배지, 및 바이러스 백신 제조를 위한 안정한 무혈청 세포 뱅크(bank)의 제조 방법에 있어서 상기 배지의 용도에 관한 것이다.

태아소 혈청(FBS)은 세포 뱅킹에 통상적으로 사용되는 냉동안정화제이다. 그러나, 혈청-함유 배양 시스템은 백신의 대규모 제조에 바람직하지 않다. 조성물 중의 배치(batch)-대-배치 변화, 생성물 정제를 방해하는 높은 단백질 함량, 및 바이러스, 마이코플라스마 또는 프리온 오염의 가능성을 비롯하여, 혈청 보충의 많은 단점이 있다. 또한, 소 해면 뇌병증(BSE)의 미확인 물질에 의해 야기되는, 인간 건강에 대한 최근 위협은 바이러스 백신과 같은 건강 보호 제품의 합성에 이용되는 배양 방법에 있어서 소 혈청의 계속된 사용을 제한할 것이다 [Butler, et al., Biotechnol. Prog., 16, 854-858 (2000)]. 따라서, FBS를 대체하는, 비-동물 유래의 냉동안정화제가 필요하다.

본 발명의 개요

본 발명은 바이러스-생산 무혈청 배지(VP-SFM)를 본질적으로 포함하는 무혈청 세포-동결 배지로서, (a) 상기 세포-동결 배지 1 ℓ 당 약 2 g의 양으로 첨가되는, 대두 가수분해물 및 벼 가수분해물로 구성된 군으로부터 선택된 효소적 가수분해물 냉동안정화제, 및 (b) 디메틸술폭사이드(DMSO)로 보충된 무혈청 세포-동결 배 지를 제공한다. 한 실시양태에서, 무혈청 세포-동결 배지는 약 10% DMSO로 보충된다.

또한, 본 발명은 백신 제조에서 원료 물질로 사용되는, 표준화되고 일관된 마스터(master) 및 워킹(working) 세포 뱅크를 제조하는 방법에 있어서 상기 무혈청 세포-동결 배지의 용도를 제공한다. 상기 방법은

(a) 동결된 베로(Vero) 세포를 해동시키고 이를 T-150 ㎠ 플라스크 내의 생장 배지에 첨가하는 과정, 상기 세포를 약 37℃ 및 5% CO₂에서 밤새 인큐베이션하는 과정, 및 그 다음날 배양물에 새로운 생장 배지를 재공급하는 과정을 포함하는 배양 개시 단계(여기서, 상기 생장 배지는 4 mM L-글루타민과 함께 VP-SFM을 포함함);

(b) 세포를 약 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션되는 T-150 ㎠ 플라스크 내에서 컨플루언스(confluence)까지 생장시키는 과정, 배지를 제거하는 과정, 칼슘 및 마그네슘을 함유하지 않은 인산염 완충 식염수(PBS)로 플라스크를 세척하는 과정, 트립신을 상기 플라스크에 첨가하고 세포가 플라스크로부터 탈착되기에 충분한 시간 동안 실온에서 인큐베이션하는 과정, 트립신을 대두 트립신 억제제(STI)로 중화시키고 영양 보충을 위해 VP-SFM을 첨가하는 과정, 생성된 현탁물을 5개의 T-150 ㎠ 플라스크 내에 시딩(seeding)하고 VP-SFM을 50 ㎖ 수준까지 각 플라스크에 첨가하는 과정, 세포를 약 37℃ 및 5% CO₂에서 3일 내지 4일 동안 인큐베이션하는 과정, 상기 5개의 플라스크로부터 세포 현탁물을 풀링(pooling)하는 과정, 세포 팩토 리(factory)를 풀링된 현탁물로 시딩하는 과정, 세포 팩토리를 재공급하는 과정, 및 세포 팩토리를 수거하는 과정을 포함하는 세포 증식 및 증폭 단계; 및

(c) 세포 팩토리로부터 수거한 세포를 4℃에서 210xg로 10분 동안 원심분리하는 과정, 세포를 2 x 10⁶ 내지 2 x 10⁷ 세포/㎖의 밀도로 상기 무혈청 세포-동결 배지 중에 재현탁시키는 과정, 세포 현탁물을 바이알 당 1 ㎖의 세포 현탁물의 양으로 크리오바이알(cryovial) 내에 분배하는 과정, 고성능 속도 조절 동결기를 이용하여 세포를 동결시키는 과정, 및 세포를 액체 질소 중에 저장하는 과정을 포함하는 세포 뱅크(bank) 동결 단계

를 포함하며, 이 방법에 의해 제조된 안정한 무혈청 베로 세포 뱅크는 1 년 후에 80% 이상의 세포 생존율 및 40 내지 60 시간의 회수 배가 시간(recovery doubling time) 시간을 가진다.

구체적 실시양태에서, 본 방법은

(a) 2 x 10⁷의 동결된 베로 세포를 해동시키고 이를 T-150 ㎠ 플라스크 내의 생장 배지 50 ㎖에 첨가하여 4-5x10⁵ 세포/㎖의 세포 밀도를 얻는 과정, 상기 세포를 5% CO₂ 하에 37℃에서 밤새 인큐베이션하는 과정, 및 그 다음날 배양물에 새로운 생장 배지를 재공급하는 과정을 포함하는 배양 개시 단계(여기서, 상기 생장 배지는 4 mM L-글루타민과 함께 VP-SFM을 포함함);

(b) 세포를 5% CO₂ 하에 37℃에서 인큐베이션되는 T-150 ㎠ 플라스크 내에서 컨플루언스까지 생장시키는 과정, 배지를 제거하는 과정, 칼슘 및 마그네슘을 함유하지 않은 인산염 완충 식염수(PBS) 20㎖로 플라스크를 2회 세척하는 과정, 트립신 5㎖를 상기 플라스크에 첨가하고 세포가 플라스크로부터 탈착되기에 충분한 시간 동안 실온에서 인큐베이션하는 과정, 트립신을 대두 트립신 억제제(STI) 5 ㎖로 중화시키고 영양 보충을 위해 변형된 VP-SFM 10 ㎖를 첨가하는 과정, 생성된 현탁물을 4 x 10⁴ 세포/㎠의 농도로 5개의 T-150 ㎠ 플라스크 내에 시딩하고 VP-SFM을 50 ㎖ 수준까지 각 플라스크에 첨가하는 과정, 세포를 5% CO₂ 하에 37℃에서 3일 내지 4일 동안 인큐베이션하는 과정, 상기 5개의 플라스크로부터 세포 현탁물을 풀링하는 과정, 세포 팩토리를 풀링된 현탁물로 시딩하는 과정, 세포 팩토리를 재공급하는 과정, 및 세포 팩토리를 수거하는 과정을 포함하는 세포 증식 및 증폭 단계; 및

(c) 세포 팩토리로부터 수거한 세포를 4℃에서 210xg로 10분 동안 원심분리하는 과정, 세포를 1-2 x 10⁷ 세포/㎖의 밀도로 상기 무혈청 세포-동결 배지 중에 재현탁시키는 과정, 세포 현탁물을 바이알 당 1 ㎖의 세포 현탁물의 양으로 크리오바이알 내에 분배하는 과정, 고성능 속도 조절 동결기를 이용하여 세포를 동결시키는 과정, 및 세포를 액체 질소 중에 저장하는 과정을 포함하는 세포 뱅크 동결 단계

를 포함하며, 이 방법에 의해 제조된 안정한 무혈청 베로 세포 뱅크는 1 년 후에 80% 이상의 세포 생존율 및 40 내지 60 시간의 회수 배가 시간을 가진다.

본 발명은 상술한 방법에 의해 생성된,, 백신 제조를 위한 안정한 무혈청 베 로 세포 뱅크로서, 1년 후의 상기 세포 뱅크의 평균 생존 생존율이 80% 이상이며 평균 회수 배가 시간이 40 내지 60시간인 무혈청 베로 세포 뱅크를 추가로 제공한다.

도 1은 100 바이알 세포 뱅크를 위한 스케일-업 개요이다. 200 바이알 및 400 바이알의 세포 뱅크는 각각 2개 세포 팩토리 및 4개 세포 팩토리를 사용하는 상기 동일한 개요에 따른다.

도 2는 FBS-함유 세포 뱅크의 세포 생존율과 식물-유래의 냉동안정화제를 함유하는 10 바이알 무혈청 세포 뱅크의 세포 생존율을 비교한 그래프이다.

도 3은 FBS-함유 세포 뱅크의 회수 배가 시간과 식물-유래의 냉동안정화제를 함유하는 10 바이알 무혈청 세포 뱅크의 회수 배가 시간을 비교한 그래프이다.

도 4는 냉동안정화제로서 하이-소이®를 사용하여 제조한 대규모 세포 뱅크 (100, 200 및 400 바이알)의 세포 생존율과 냉동안정화제로서 HyPep® 벼를 사용하여 제조한 대규모 세포 뱅크 (100, 200 및 400 바이알)의 세포 생존율을 비교한 그래프이다.

도 5는 냉동안정화제로서 하이-소이®를 사용하여 제조한 대규모 세포 뱅크 (100, 200 및 400 바이알)의 회수 배가 시간과 냉동안정화제로서 HyPep® 벼를 사용하여 제조한 대규모 세포 뱅크 (100, 200 및 400 바이알)의 회수 배가 시간을 비교한 그래프이다.

정확하고 표준화된 세포 뱅킹 방법의 실시는 일관된 성능 및 특성을 가진 세포 스톡(stock)의 제공에 기여한다. 세포 뱅킹은 균일한 공급원 세포의 마스터 세포 뱅크, 및 마스터 세포 뱅크로부터 생성된 많은 워킹 세포 뱅크를 포함해야 한다. 본 발명의 뱅킹 방법을 이용할 때, 주어진 뱅크의 바이알 수는 목적하는 용도에 따라 다를 것이지만, 전형적인 마스터 세포 뱅크는 200 바이알을 함유할 수 있고, 전형적인 워킹 세포 뱅크는 400 바이알까지 함유할 수 있다. 본 방법은 일관된 제조를 위한 안정한 기질을 제공할 표준화된 세포의 장기간 공급을 보증한다.

베로 세포(불멸화된 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포, ATCC# CCI-81)는 오랜 기간 동안 인간 바이러스 백신의 제조용으로서 당분야에 공지되고 사용되고 있다. 상기 세포는 그 특징이 잘 규명되어 있고 우수한 안전성 기록을 가진다.

본 발명의 무혈청 베로 세포 뱅킹 방법은 배양의 개시, 세포의 증식 및 증폭, 및 뱅크의 동결이라는 세 가지 주된 단계를 포함한다. 이 단계들 각각의 최적화는 높은 질의 무혈청 세포 뱅크의 제조를 가능하게 한다. "높은 질"이라 함은 세포의 생존율이 높고 회수가 빠르다는 것, 즉 회수 배가 시간이 짧다는 것을 의미한다. 이들 세포의 생장 조건과 동결 조건의 조합은 베로 세포의 회수를 개선시킨다. 세포 뱅크로부터 세포의 일관된 생성에 있어서 가장 중요한 회수 파라미터 중 2가지가 회수 시간 및 해동 생존율이다. 회수 시간은 플레이팅 효율과 밀접하게 관련되어 있지만 해동 후 세포의 성능에 대한 보다 많은 정보도 제공한다. 이들 두 파라미터 모두를 측정하여 본 발명의 세포 뱅킹 방법의 최적화에 사용하였다.

페놀 레드는 이 성분이 세포에 대해 에스트로겐성 효과를 나타낼 수 있다는 보고 때문에 세포-동결 배지로부터 제외시켰다 [Berthois, et al. Cell Biology, 83, 2496-5000 (1986)]. 세포-동결 배지의 조성은 2 g/ℓ의 하이-소이 (또는 하이펩 벼), 10% DMSO, 및 생장 배지로서 나머지 VP-SFM을 함유하도록 최적화하였다.

본원에서 사용된 "VP-SFM"의 대표적 예로는 표 1에 기재된 성분을 함유하도록 변형된 Gibco™ VP-SFM[인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)으로부터 시판됨]이었다.

GIBCO VP- SFM (변형된 것)

L-알라닌	이염기성 인산나트륨 무수물	푸트레신 2HCl
글리신	황산마그네슘 무수물	재조합 인간 인슐린
L-아르기닌 HCl	염화칼슘 무수물	재조합 상피 성장 인자 (EGF)
L-아스파라긴 H₂O	D 판토텐산칼슘	이염기성 인산나트륨 무수물
L-아스파르트산	염화마그네슘 무수물	일염기성 인산나트륨 H₂O
L-시스테인 HCl H₂O	아스코르브산 2 마그네슘 포스페이트 염	HEPES
L-시스틴 2HCl	염화나트륨	시트르산철 착물
L-글루탐산	바타민 A 아세테이트	황산아데닌
환원된 글루타치온	비타민 D₂	아데노신-5-트리포스페이트
L-히스티딘 HCl H₂O	메나디온	D-글루코스 (덱스트로스)
L-이소류신	DL 리포산 치옥트산염	비타민 B₁₂
L-류신	리놀레산	염화콜린
L-라이신 HCl	우라실	I-이노시톨
L-메티오닌	티미딘	니아신아미드
L-페닐알라닌	바이오틴	피리독살 HCl
L-프롤린	엽산	2-데옥시리보스
L-세린	리보플라빈	에탄올아민 HCl
L-트레오닌	나트륨 하이포잔틴	포스포에탄올아민
L-트립토판	나트륨 잔틴	염화칼륨
L-발린	파라 아미노 벤조산	피루브산나트륨
티아민 HCl	니코틴산	독점 식물 가수분해물
L-티로신 이나트륨 염	피리독신 HCl	효모 추출물 UF

방법 개선으로서, 당분야에서 통상적으로 이용되는 세포 밀도의 두 배 밀도로부터 배양을 개시한다. 그러므로, 1개 바이알로 시작하기 보다는, 1개의 T-150 ㎠ 플라스크 내로 해동된, 공급원 뱅크로부터의 2개 동결 바이알로부터 배양을 개시한다. 가온된 VP-SFM을 적가하여 세포에 쇼크 또는 손상을 주지 않게 한다. 해동 다음날 배양물을 재공급함으로써, 남아 있는 냉동안정화제 및 세포 데브리스(debris)를 제거하고, 회수를 개선시킨다.

본 발명의 스케일-업 개요 및 스케쥴은 상태가 양호한 배양을 유지하기 위해 일관되게 세포 농도를 높게 계속 유지하면서 최소 계대(passage) 수 (예를 들어, 4 이하의 계대수)를 이용한 베로 세포의 증식, 및 조작(manipulation)을 가능하게 한다. 스케일-업 개요는 다음과 같다: 공급원 뱅크로부터의 2개 동결 바이알을 1개의 T-150 ㎠ 플라스크 내에 해동시키고, 1개의 10-트레이 세포 팩토리를 접종하는 데 사용되는 5개의 T-150 ㎠ 플라스크 내로 증폭시킨다. 100-바이알 세포 뱅크를 1개의 세포 팩토리로부터 제조할 수 있다. 이 개요는 뱅크 크기에 있어서의 용이한 조절을 가능하게 한다.

트립신처리 개요 또한 최적화하였다. 세포 단층의 2회 완충제 린스는 해동 후 우수한 회수에 최적인 것으로 밝혀졌다. 감마-조사된(irradiated) 돼지 트립신을 선택하여 가능한 바이러스 오염을 최소화하였다. 모든 10 레벨(level)의 세포 팩토리로의 충분한 열 전달이 불필요한 미세환경을 만들어내는 것으로 의심되기 때문에, 냉각된 트립신을 사용하여 실온에서 트립신처리를 수행한다.

동결 과정 조건의 조합은 뱅크의 회수를 상당히 개선시켰다. 첫 번째로, 상당한 세포 손실을 초래하는 5 또는 7분 동안의 원심분리와 반대로, 회수 및 풀링된 세포 현탁물을 10분 동안 210xg에서 원심분리하였다. 냉각된 동결 배지를 사용하여 재현탁을 부드럽게 수행하였다. 두 번째로, 세포를 리피터 피펫터(repeater pipettor)를 사용하여 크리오바이알 내에 분배시킴으로써 분배 과정을 보다 빠르게 하였고 실제 동결 주기 전에 세포가 동결 배지에 노출되어야 하는 시간을 감소시켰다. 세 번째로, 세포 현탁물을 크리오바이알 내로 분배하는 동안 이미 채워진 바이알을 2-8℃로 냉각시켰다.

베로 세포의 냉동보존의 두 가지 측면 즉 크리오바이알 내의 최적 세포 밀도, 및 해동시 세포의 우수한 회수를 위한 속도 조절 동결기의 프로그래밍이 뱅킹 방법에 있어서 해결될 필요가 있다. 상 변화 동안, 물질이 동결될 때 액체로부터 고체로의 전이 열이 방출된다 (융해열). 융해열이 샘플을 일정한 속도로 동결시키는 데 있어서 원인이 되도록 프로그램을 최적화하였다. 최적 세포 밀도는 1-2 x 10⁷ 세포/㎖이고 동결 프로그램에 대한 변형이 우수한 세포 회수에 기여한다는 것이 명백히 밝혀졌다.

본 발명의 무혈청 베로 세포 뱅킹 방법은 바이러스 백신 제조를 위한 신뢰할 수 있으면서 안정한 세포 뱅크를 제조하는 표준화되고 일관된 방법을 제공한다. 생장 및 동결 배지에 있어서, 동물-유래의 생성물은 냉동안정화제로서 작용하는 하이-소이 및 하이펩 벼와 같은 식물-유래의 물질로 대체되었다. 그 결과는 2 g/ℓ의 하이-소이 또는 2 g/ℓ의 하이펩 벼를 사용한 무혈청 세포 뱅크가 1년 이상 동안 안정하다는 것을 보여준다.

본 세포 뱅킹 방법에서 달성된 개선점은 해동시 세포의 생존율을 증가시키고 회수 시간을 감소시켜, 제조를 위한 보다 정확한 스케쥴 및 보다 일관된 방법을 가능하게 한다. 또한, 보다 적은 수의 동결 바이알로부터 시작하는 제조 방법을 가능하게 한다. 따라서, 1개의 완전한-크기의 400-바이알 뱅크는 보다 오래 지속될 것이고 연속적인 런(run)은 보다 일관될 것이다.

지금까지 일반적으로 기재된 본 발명은, 예시에 의해 제공되며 달리 명시하지 않는 한 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 하기 실시예에 대한 참조를 통해 보다 용이하게 이해될 것이다.

여러 물질을 본 연구에서 냉동안정화제로서 시험하였다. 하이-소이, 하이펩 벼, 하이펩 밀 및 메틸셀룰로스를 함유하는 세포 뱅크를 FBS-함유 세포 뱅크와 비교하고, 세포 뱅크 안정성을 조사하였다. 하이-소이 및 하이펩 벼는 본 연구의 처음 1년 동안 냉동안정화제로서 FBS만큼 효과적임이 입증되었다. 그러므로, 하이-소이는 무혈청 세포 뱅크에 사용할 수 있고, 하이펩 벼는 대안으로서 사용할 수 있다.

재료 및 방법

개인적 보호 장비: 멸균 장갑, 멸균 소매(sleeve), 멸균 낙하복, 클린 룸 해드 커버, 클린 룸 턱수염 커버, 클린 룸 발 커버.

일회용 장비: 일회용 혈청학적 피펫; 1.8 ㎖ 사스테드(Sarstedt) 크리오바이알; 코닝 코스타 75 ㎠ 및 150 ㎠ 조직 배양 플라스크; 10개의 트레이 넌크 세포 팩토리 [www.nuncbrand.com].

유리제품 및 부속품: 10 ℓ 및 20 ℓ 배지 공급원으로부터 배지를 분배하기 위한 C-플렉스 튜빙(tubing)을 가진 유리 벨(bell); C-플렉스 튜빙을 가진 겔만 필터; 세포 팩토리 아답터(adapter); 전달 장치 및 튜빙을 가진 500 ㎖, 1 ℓ, 2 ℓ 및 5 ℓ) 병.

시약: 표 1의 성분들을 함유하도록 제제화된 Gibco^TM VP-SFM; Gibco 대두 트립신 억제제 (STI); Gibco L-글루나민; 칼슘 및 마그네슘을 함유하지 않은 Gibco 인산염 완충 식염수(PBS); Gibco 소혈청 알부민(BSA); 하이-소이, 하이펩 벼, 및 하이펩 밀 (Quest International; Norwich, NY); Sigma (St. Louis, MO) 디메틸술폭사이드(DMSO) 및 메틸셀룰로스; 70% 이소프로필 알코올; 조사된 Gibco 0.25% 트립신/시트레이트; Gibco 0.025 M 시트르산나트륨 완충제; Hyclone (Logan, UT) 태아소 혈청(FBS) 또는 조사된 FBS(irFBS); Gibco 둘베코스 최소 필수 배지(DMEM); 주사용수 또는 탈이온수; Gibco 0.05% 트립판 블루 용액.

장비: 바이오 안전 후드; 층류 후드 또는 바이오 안전 캐비넷; 스피너(spinner) 플라스크 베이스(base); 자동 (리피터) 피펫터; 현미경; 역상 현미경; 헤마사이토미터(hemacytometer); 순환 수조; 포르마(Forma) 크리오메드(Cryomed) 속도 조절 동결기(RCF); 연동 펌프; 투입 펌프; 37℃ 및 5% 포르마 인큐베이터; 포르마 원심분리기; 216 진동 버킷 타입 로터.

실시예 1

해동 및 세포 생장

2 x 10⁷ 베로 세포를 함유하는 2개의 동결 스톡 바이알을 37℃ 수조 내에 두었다. 상기 바이알을 교반 중인 수조 내에 수용하고 동결 세포가 해동될 때까지 종종 확인하였다. 바이알의 외부를 70% 이소프로필 알코올로 소독하고 층류 후드 내에 배치하였다. 해동된 세포를 T-150 ㎠ 플라스크로 신속히 옮기고 배양 용기를 요동시키면서 50 ㎖의 생장 배지를 적가하였다. 생장 배지는 4 mM L-글루타민과 함께 VP-SFM을 포함하였다. 배지의 대략 절반을 첨가한 후, 나머지를 약간 더 빠른 속도로 첨가하였다. 세포를 포르마 인큐베이터 (37℃, 5% CO₂)에 넣어 두고 밤새 부착시켰다. 배지를 흡입 제거하고 그 다음날 50㎖의 새로운 생장 배지를 상기 플라스크에 첨가하였다.

실시예 2

세포 패싱( passing )

포르마 인큐베이터 내의 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션되는 T-150 ㎠ 플라스크 내에서 세포를 컨플루언스(4 또는 5일)까지 생장시켰다. 배지를 흡입 제거하고 마그네슘 및 칼슘을 함유하지 않은 20 ㎖ PBS로 상기 플라스크를 2회 세척하였다. 5 ㎖의 트립신을 상기 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 실온에서 2 내지 3분 동안 인큐베이션하여 세포를 플라스크로부터 탈착시켰다. 트립신을 5 ㎖의 STI로 중화시키고, 본 과정이 완결될 때까지 영향 보충을 위해 10 ㎖의 VP-SFM을 첨가하였다. 카운팅을 위해 현탁물 중의 세포를 샘플링하였다. 1 ㎖의 트립판-블루 용액을 1 ㎖의 세포 샘플에 첨가하였다. 이것을 볼텍서(vortexor)로 약하게 혼합하였 다. 10 ㎕의 혼합물을 헤마사이토미터의 챔버 내에 넣어 두었다. 염색되지 않은 세포를 생존 세포로서 카운팅하여 총 세포 수를 측정하였다.

그 다음, 세포 현탁물을 4 x 10⁴ 세포/㎠의 농도로 5개의 새 T-150 ㎠ 플라스크 내에 시딩하였다. VP-SFM을 50 ㎖ 수준까지 각각의 T-150 ㎠ 플라스크에 첨가한 다음, 플라스크를 37℃ 및 5% CO₂의 포르마 인큐베이터 내에 넣어 두었다. 3일 후, 플라스크에 배지를 재공급하였다. 플라스크를 총 5일 동안 인큐베이션하였다. 5개의 플라스크로부터의 세포 현탁물을 풀링하고, 풀링한 현탁물을 사용하여 넌크 세포 팩토리를 시딩하였다. 1개의 컨플루언트(confluent) 세포 팩토리는 100-바이알 세포 뱅크에 충분한 세포를 생산한다.

실시예 3

세포 팩토리 셋-업 및 시딩

세포 팩토리 용으로 넌크에 의해 제공된 아답터 중 하나를 10-인치 조각의 실리콘 튜빙(ID 3/16", OD 3/8")에 연결시켰다. 튜빙 컨넥터(connector)를 사용하여 8-인치 길이의 C-플렉스 튜빙을 세포 팩토리에 연결된 실리콘 튜빙에 부착시켰다(ID. 125", OD. 200"). 이것이 유입구/유출구 아답터이다. 튜빙의 양 말단을 바이오실드(bioshield)로 포장하였다. 세포 팩토리용으로 넌크에 의해 제공된 제2 아답터는 작은 겔만 필터(0.22 ㎛)를 가진 3-인치 조각의 실리콘 튜빙(ID 3/16", OD 3/8")에 부착시켰다. 이 아답터 말단을 바이오실드로 포장하였다. 두 아답터를 15분 동안의 건조 시간을 포함하여 30분 동안 고압멸균하였다. 바이오세이프티 캐비 넷(BSC)에 있어서, 넌크에 의해 제공된 설명 메뉴얼에 따라 아답터를 세포 팩토리에 부착시켰다. 세포 팩토리 상의 어느 한 출입구는 유입구/유출구 라인 및 필터 조립 라인을 위해 사용할 수 있다. 10-ℓ 백(bag)의 VP-SFM 또는 3 x 1 ℓ 병을 냉장 룸으로부터 획득하여 37℃로 가온하였다. 5 ℓ C-플렉스 운반 라인을 세포 시딩용 멸균 5-ℓ 병 안에 배치하였다. 사용된 모든 백에는 제조자에 의해 C-플렉스가 장착되어 있었다. 멸균 컨넥션 장치(SCD)를 사용하여 배지를 시딩 병에 연결시키고, 2.5 ℓ의 배지를 시딩 병에 분배하였다. 세포 현탁물을 시딩 병에 첨가하였다. SCD를 사용하여 시딩 병을 세포 팩토리에 연결시켰다. 세포 팩토리를 충전 및 유출 위치에 두었다. 세포가 함유된 배지를 세포 팩토리 내로 서서히 손으로 펌핑하여 넣었다. 유입구/유출구 라인에 연결된 실리콘 튜빙의 클램프를 즉시 제거하였다. SCD를 사용하여, C-플렉스를 가진 0.22 ㎛의 겔만 필터(Acro 50)를 세포 팩토리에 연결시켰다. 세포 팩토리를 레벨 확인 위치에 두었다. 액체가 10 레벨로 고르게 분포할 때까지, 세포 팩토리를 수평 위치로 배치하고, 37℃, 5 CO₂ 인큐베이터에 넣어 두었다.

실시예 4

세포 팩토리 재공급

시딩 2일 및 5일 후, 세포 팩토리를 제공급하였다. SCD를 사용하여 빈 백을 세포 팩토리에 연결시켰다. 세포 팩토리를 충전 및 유출 위치에 조심스럽게 배치하고, 액체 레벨을 표시하였다. 빈 백을 바닥에 배치하여 배지가 유출되게 하였다. 때때로 세포 팩토리를 가압시킬 필요가 있었다. 핸드 벌브(hand bulb)를 필터 조립기에 연결시켜 세포 팩토리를 약하게 가압시켰다. 일단 흐름이 시작되면, 핸드 벌브를 해체시켰다. 배지가 비었을 때, SCD를 사용하여 재공급 배지를 함유하는 백을 세포 팩토리에 연결시키고, 동일한 부피의 배지를 세포 팩토리 내로 서서히 손으로 펌핑하여 넣었다. 세포 팩토리를 레벨 확인 위치에 배치하였다. 레벨 확인을 완료한 후, 세포 팩토리를 37℃, 5 CO₂ 인큐베이터 내에 그의 수평 워킹 위치로 배치하였다.

실시예 5

세포 팩토리 회수

세포 팩토리를 상술한 바와 같이 유출시켰다. 제1 세척제는 25 mM 시트르산나트륨 완충제 300 ㎖, 또는 칼슘 또는 마그네슘 무함유 PBS 300 ㎖로 구성되었다. 제1 세척제를 세포 팩토리에 펌핑하여 넣었다. 세척제를 각 레벨에서 균등하게 하였다. 세포 팩토리를 약하게 진탕하여 모든 세포 표면물질을 린싱하였다. 제1 세척제를 유출시키고, 제2 세척제를 제1 세척제와 동일한 방식으로 공급하였다. 제2 세척제를 유출시키고 트립신 용액 한 병(2.5 mM 시트르산나트륨 완충제 300 ㎖ 중의 Gibco 2.5% 트립신 1.4 ㎖)을 세포 팩토리에 부착시켰다. 트립신 용액을 세포 팩토리 내로 펌핑하여 넣고, 세포 팩토리를 약하게 요동시켜 트립신이 모든 세포 표면물질을 덮게 하였다. 세포 표면을 2 또는 3분 마다 조사하여 세포가 탈착되기 시작하는 지를 확인하였다. 세포가 세포 팩토리 표면으로부터 탈착되기 시작할 때, 세 포 팩토리를 격렬하게 탭핑하여 나머지 세포를 방출시켰다. 이것은 세포 팩토리가 깨끗하게 보일 때까지 수행하였다. 이어서, 세포 팩토리를 100 ㎖의 5 mg/㎖ 대두 트립신 억제제(STI)가 함유된 세포 수집 병에 연결시켰다. 세포 혼합물을 상기 병 내로 유출시켰다. 세포 수집 병을 단단히 죄도록 조심하면서 배지 세척 병을 세포 팩토리에 연결시켰다. 600 ㎖의 생장 배지를 함유하는 병을 세포 팩토리에 부착시켜 표면을 린싱하였다. 세포 팩토리를 세포 수집 병에 다시 연결시키고, 린스 배지를 유출시켰다. 이 세척물은 총 세포의 1/3까지 함유할 수 있다.

실시예 6

동결 프로토콜

카운팅을 위해 플라스크 또는 넌크 세포 팩토리로부터 수거한 세포를 샘플링하여 풀링하고, 포르마 원심분리기 내, 4℃에서 210xg로 10분 동안 원심분리하였다. VP-SFM을 본질적으로 포함하며 10% DMSO 및 본 연구에서 시험된 냉동안정화제 중 한 냉동안정화제 2 g/ℓ로 보충된 세포-동결 배지를 제조하였다. 세포를 본 공정 동안 얼음 위에 보관하였다. 그 후, 세포를 1.5 x 10⁷ 세포/㎖의 밀도로 동결 배지에 재현탁시켰다. 세포 농축물을 바이알 당 1 ㎖의 세포 현탁물 수준으로 1.8 ㎖ 사스테드 크리오바이알 내에 넣었다. 고성능 속도 조절 동결기를 사용하여 세포를 동결시켰다. 동결 후, 세포를 액체 질소 중에 저장하였다.

실시예 7

세포 뱅크

세포 뱅크: 다양한 냉동안정화제를 조사하는 초기 실험은 T-플라스크로부터 유래된 10 바이알 세포 뱅크를 사용하여 달성하였다. 10 바이알 세포 뱅크의 결과를 기초로, 기대되는 냉동안정화제를 100, 200 및 400 바이알의 보다 큰 세포 뱅크에서 사용하였다. 대규모 세포 뱅크를 위해 필요한 세포를 세포 팩토리 내에서 생장시켰다.

대규모 세포 뱅크를 위한 세포 증폭: 세포 뱅크용 세포의 증폭은 다음과 같이 수행하였다. 만들어질 세포 뱅크의 각 100 바이알을 위해 2 바이알의 동결 세포를 해동시켰다. 2 바이알을 사용하여 1개의 T-150 ㎠ 플라스크를 접종시켰다. 다음날, T-150 ㎠ 플라스크에 배지를 재공급하였다. 4일 생장 후, 세포를 5개의 T-150 ㎠ 플라스크 내로 분할하였다. 분할한 지 3일 후, 플라스크에 배지를 재공급하였다. 플라스크를 5일 동안 인큐베이션하였다. 플라스크를 수거하여 1개의 넌크 10층 세포 팩토리를 접종하는 데 사용하였다. 2일 및 5일 후, 세포 팩토리를 재공급하였다. 7일째 되는 날, 세포 팩토리를 수거하였다. 세포 뱅크를 제조하는 데 사용된 단계의 스케쥴은 도 1을 참조한다.

세포 뱅크 시험: 실시예 1에 기재된 바와 같이 각 세포 뱅크로부터 5개의 바이알을 해동시켰다. 각 바이알을 사용하여 25 ㎖의 VP-SFM을 함유하는 2개의 T-75 ㎠ 플라스크를 시딩하였다. 세포가 컨플루언스에 가까울 때 및 그 다음날 플라스크로부터 세포를 수거하였다. 배가 시간은 세포 수 및 생장 시간을 이용하여 측정하였다. 세포 생존율은 상술한 바와 같이 트립판-블루로 측정하였다.

결과 및 논의

세포 뱅크 회수: 2개 파라미터, 즉 세포 회수 배가 시간 (세포가 컨플루언스에 가까울 때 및 그 다음날 플라스크를 회수하여 카운팅함) 및 해동 후 세포의 생존율을 이용하여 세포 뱅크 안정성을 측정하였다. 동결 직후 및 다양한 시점에서 세포를 해동하였다. 생존율에 대해 세포를 즉시 시험하고 세포를 T-플라스크 내에 두었다. 이 T-플라스크를 수거하여 세포 회수 배가 시간을 측정하였다.

10개 바이알 베로 세포 뱅크 (도 2 및 3 참조): 도 2에서, 각 세포 뱅크의 5개 샘플의 평균을 다양한 시점에서 측정하였다. 샘플을 신속히 해동하고 트립판-블루를 사용하여 생존율을 측정하였다. 도 3에서, 각 세포 뱅크의 5개 샘플의 평균을 다양한 시점에서 측정하였다. 샘플을 신속히 해동하고 T-플라스크 내에 두었다. 회수-배가 시간을 측정하기 위하여 주기적으로 세포를 카운팅하였다. 1년 동안 액체 질소에 저장한 후의 모든 세포 뱅크의 생존율이 90%를 초과하였다. 10% DMSO 세포 뱅크 및 0.1% 메틸셀룰로스 세포 뱅크의 생존율만이 15개월에서 80% 미만으로 떨어졌다. 또한, 메틸셀룰로스 뱅크의 회수가 다른 세포 뱅크의 회수 배가 시간 45 내지 50 시간에 비하여 100시간 초과의 배가 시간을 가지면서 매우 저조하다는 것을 확인하였다. 하이-소이, 하이펩 벼 및 하이펩 밀 모두가 대조구 세포 뱅크(FBS-함유 뱅크)에서 관찰된 배가 시간 및 생존율을 나타내었다. 이 데이타에 기초하여, 100, 200 및 400 바이알의 대규모 세포 뱅크는 냉동안정화제로서 하이-소이 및 하이펩 벼를 사용하여 만들었다.

대규모 세포 뱅크(도 4 및 5 참조): 도 4에서, 각 세포 뱅크의 5개 샘플의 평균을 다양한 시점에서 측정하였다. 샘플을 신속히 해동하고 T-플라스크 내에 두 었다. 회수-배가 시간을 측정하기 위해 세포를 주기적으로 카운팅하였다. 도 5에서, 각 세포 뱅크의 5개 샘플의 평균을 다양한 시점에서 측정하였다. 샘플을 신속히 해동하고 트립판-블루를 사용하여 생존율을 측정하였다. 100 바이알 하이-소이 및 하이펩 벼-함유 세포 뱅크의 생존율은 9개월 동안 80% 초과를 유지하였다. 세포 회수 또한 45 내지 60 시간의 배가 시간을 일관되게 유지하였다. 이 결과는 혈청-함유 세포 뱅크(도 2 및 3)와 일치한다. 200 바이알의 하이-소이 뱅크 및 400 바이알의 하이-소이 뱅크 또한 12개월의 기간에 걸쳐 80% 초과의 생존율 및 40시간 내지 60시간의 회수 배가 시간을 보였다. 하이-소이 및 하이펩 벼 대규모 세포 뱅크는 모두 FBS-함유 세포 뱅크에 필적할만하다. 상기 실험 결과로부터, 2 g/ℓ의 하이-소이 또는 2 g/ℓ의 하이펩 벼를 사용한 무혈청 세포 뱅크는 최대 1년 동안 안정한다고 결론지을 수 있다.

본 발명은 직접적인 설명 및 실시예로 설명되어 있다. 상술한 바와 같이, 실시예는 단지 예로서 제공될 뿐이지 본 발명을 어떠한 의미있는 방식으로 제한하는 것이 아니다. 또한, 본 명세서 및 하기 특허청구범위를 검토할 때 본 발명이 속하는 분야에서 숙련된 기술을 가진 자는 본 발명의 특허청구범위와의 등가물이 있다는 것을 인식할 것이다. 본 발명자들은 청구된 본 발명의 합리적인 범위 내에 상기 등가물을 포함시키고자 한다.

Claims

바이러스-생산 무혈청 배지(VP-SFM)를 본질적으로 포함하는 무혈청 세포-동결 배지로서, (a) 상기 세포-동결 배지 1 ℓ 당 약 2 g의 양으로 첨가되는, 대두 가수분해물 및 벼 가수분해물로 구성된 군으로부터 선택된 효소적 가수분해물 냉동안정화제, 및 (b) 디메틸술폭사이드(DMSO)로 보충된 무혈청 세포-동결 배지.
제1항에 있어서, 약 10% DMSO로 보충된 무혈청 세포-동결 배지.
(a) 동결된 베로(Vero) 세포를 해동시키고 이를 T-150 ㎠ 플라스크 내의 생장 배지에 첨가하는 과정, 상기 세포를 약 37℃ 및 5% CO₂에서 밤새 인큐베이션하는 과정, 및 그 다음날 배양물에 새로운 생장 배지를 재공급하는 과정을 포함하는 배양 개시 단계(여기서, 상기 생장 배지는 4 mM L-글루타민과 함께 VP-SFM을 포함함);

(b) 세포를 약 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션되는 T-150 ㎠ 플라스크 내에서 컨플루언스(confluence)까지 생장시키는 과정, 배지를 제거하는 과정, 칼슘 및 마그네슘을 함유하지 않은 인산염 완충 식염수(PBS)로 플라스크를 세척하는 과정, 트립신을 상기 플라스크에 첨가하고 세포가 플라스크로부터 탈착되기에 충분한 시간 동안 실온에서 인큐베이션하는 과정, 트립신을 대두 트립신 억제제(STI)로 중화 시키고 영양 보충을 위해 VP-SFM을 첨가하는 과정, 생성된 현탁물을 5개의 T-150 ㎠ 플라스크 내에 시딩(seeding)하고 VP-SFM을 50 ㎖ 수준까지 각 플라스크에 첨가하는 과정, 세포를 약 37℃ 및 5% CO₂에서 3일 내지 4일 동안 인큐베이션하는 과정, 상기 5개의 플라스크로부터 세포 현탁물을 풀링(pooling)하는 과정, 세포 팩토리(factory)를 풀링된 현탁물로 시딩하는 과정, 세포 팩토리를 재공급하는 과정, 및 세포 팩토리를 수거하는 과정을 포함하는 세포 증식 및 증폭 단계; 및

(c) 세포 팩토리로부터 수거한 세포를 4℃에서 210xg로 10분 동안 원심분리하는 과정, 세포를 2 x 10⁶ 내지 2 x 10⁷ 세포/㎖의 밀도로 제1항의 무혈청 세포-동결 배지 중에 재현탁시키는 과정, 세포 현탁물을 바이알 당 1 ㎖의 세포 현탁물의 양으로 크리오바이알(cryovial) 내에 분배하는 과정, 고성능 속도 조절 동결기를 이용하여 세포를 동결시키는 과정, 및 세포를 액체 질소 중에 저장하는 과정을 포함하는 세포 뱅크(bank) 동결 단계

를 포함하는, 안정한 무혈청 베로 세포 뱅크를 제조하는 방법으로서, 이로써 제조된 안정한 무혈청 베로 세포 뱅크는 1년 후에 80% 이상의 세포 생존율 및 40 내지 60시간의 회수 배가 시간(recovery doubling time)을 가지는 것인 방법.
(a) 2 x 10⁷의 동결된 베로 세포를 해동시키고 이를 T-150 ㎠ 플라스크 내의 생장 배지 50 ㎖에 첨가하여 4-5x10⁵ 세포/㎖의 세포 밀도를 얻는 과정, 상기 세포 를 37℃ 및 5% CO₂에서 밤새 인큐베이션하는 과정, 및 그 다음날 배양물에 새로운 생장 배지를 재공급하는 과정을 포함하는 배양 개시 단계(여기서, 상기 생장 배지는 4 mM L-글루타민과 함께 VP-SFM을 포함함);

(b) 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션되는 T-150 ㎠ 플라스크 내에서 컨플루언스까지 생장시키는 과정, 배지를 제거하는 과정, 칼슘 및 마그네슘을 함유하지 않은 인산염 완충 식염수(PBS) 20㎖로 플라스크를 2회 세척하는 과정, 트립신 5㎖를 상기 플라스크에 첨가하고 세포가 플라스크로부터 탈착되기에 충분한 시간 동안 실온에서 인큐베이션하는 과정, 트립신을 대두 트립신 억제제(STI) 5 ㎖로 중화시키고 영양 보충을 위해 변형된 VP-SFM 10 ㎖를 첨가하는 과정, 생성된 현탁물을 4 x 10⁴ 세포/㎠의 농도로 5개의 T-150 ㎠ 플라스크 내에 시딩하고 VP-SFM을 50 ㎖ 수준까지 각 플라스크에 첨가하는 과정, 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 3일 내지 4일 동안 인큐베이션하는 과정, 상기 5개의 플라스크로부터 세포 현탁물을 풀링하는 과정, 세포 팩토리를 풀링된 현탁물로 시딩하는 과정, 세포 팩토리를 재공급하는 과정, 및 세포 팩토리를 수거하는 과정을 포함하는 세포 증식 및 증폭 단계; 및

(c) 세포 팩토리로부터 수거한 세포를 4℃에서 210xg로 10분 동안 원심분리하는 과정, 세포를 1-2 x 10⁷ 세포/㎖의 밀도로 제2항의 무혈청 세포-동결 배지 중에 재현탁시키는 과정, 세포 현탁물을 바이알 당 1 ㎖의 세포 현탁물의 양으로 크리오바이알 내에 분배하는 과정, 고성능 속도 조절 동결기를 이용하여 세포를 동결 시키는 과정, 및 세포를 액체 질소 중에 저장하는 과정을 포함하는 세포 뱅크 동결 단계

를 포함하는, 안정한 무혈청 베로 세포 뱅크를 제조하는 방법으로서, 이로써 제조된 안정한 무혈청 베로 세포 뱅크는 1년 후에 80% 이상의 세포 생존율 및 40 내지 60시간의 회수 배가 시간을 가지는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 효소적 가수분해물 냉동안정화제가 대두 가수분해물인 무혈청 세포-동결 배지.
제1항 또는 제2항에 있어서, 효소적 가수분해물 냉동안정화제가 벼 가수분해물인 무혈청 세포-동결 배지.
1년 후에 80% 이상의 세포 생존율 및 40 내지 60시간의 회수 배가 시간을 가진 안정한 무혈청 베로 세포 뱅크.
1년 후에 80% 이상의 세포 생존율 및 40 내지 60시간의 회수 배가 시간을 가진 안정한 무혈청 베로 세포 뱅크로서, 제3항 또는 제4항의 방법에 의해 제조된 세포 뱅크.