CN1894400B - 无血清vero细胞建库方法 - Google Patents

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Abstract

无血清Vero细胞建库方法提供一种产生用于病毒疫苗生产的可靠且稳定的细胞库的标准和一致的方式。在生长和冷冻培养基中用植物源性物质代替动物源性物质增加细胞在解冻后的生活力且减少其回收时间，从而使生产进度表更精确并使加工过程更一致。

Description

无血清VERO细胞建库方法
技术领域
本发明是关于无血清细胞冷冻培养基和此培养基在产生用于病毒疫苗生产的稳定无血清细胞库的方法中的用途。
背景技术
胎牛血清(FBS)是常用于细胞建库中的低温稳定剂。但是含血清培养系统在疫苗的大规模生产中正变得不受欢迎。血清添加物存在许多缺点，包括不同批次之间的组成改变、妨碍产物纯化的高蛋白含量以及病毒、支原体或朊病毒污染的可能性。此外，最近由牛海绵状脑病(BSE)的不明确因素引起的对人类健康的威胁可能会限制牛血清在用于合成诸如病毒疫苗的健康保健产品的培养方法中的继续使用[Butler等人，Biotechnol.Prog.，16，854-858(2000)]。因此，需要非动物源性低温稳定剂来替换FBS。
发明内容
本发明提供一种基本上由补充有(a)选自由大豆水解产物和水稻水解产物组成的群组的酶促水解产物低温稳定剂，每升所述培养基添加约2克和(b)二甲亚砜(DMSO)的病毒生产无血清培养基(VP-SFM)组成的无血清细胞冷冻培养基。在一个实施例中，所述无血清细胞冷冻培养基补充有约10％DMSO。
本发明进一步提供所述无血清细胞冷冻培养基在产生用作疫苗生产中的原料的标准和一致母细胞库和工作细胞库的方法中的用途。所述方法包含以下步骤：
(a)起始培养，其包含解冻冷冻的Vero细胞并将其添加到一个T-150cm2瓶中的生长培养基中，其中所述培养基由VP-SFM与4mM L-谷氨酰胺组成，在37℃和5％CO2下将所述细胞培养过夜，且在第二天再次向培养物供以新鲜生长培养基；增殖并扩增所述细胞，其包含在于37℃和5％CO2下培养的T-150cm2瓶中使所述细胞生长至铺满，移除培养基，用不含钙和镁的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤所述瓶，向所述烧瓶添加胰蛋白酶并在室温下培养足以使所述细胞离开瓶的时间，用大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)中和所述胰蛋白酶并添加VP-SFM用于营养支持，将所得悬浮液接种到五个T-150cm2瓶中并向各瓶添加VP-SFM至50毫升的水平，在37℃和5％CO2下将所述细胞培养3至4天，从五个烧瓶中汇集细胞悬浮液，用所汇集的悬浮液接种细胞工厂，再向所述细胞工厂供料，并收获所述细胞工厂；和
(b)冷冻细胞库，其包含在4℃下以210xg将从所述细胞工厂收获的细胞离心10分钟，以2×106至2×107细胞/毫升的密度将所述细胞重悬于根据权利要求1所述的无血清细胞冷冻培养基中，以每管1毫升细胞悬浮液将所述细胞悬浮液分配至冻存管中，使用主动速率控制冷冻机冷冻所述细胞，并将所述细胞储存在液氮中，其中因此产生的稳定无血清Vero细胞库在一年后具有至少80％的细胞生活力和40与60小时之间的回收加倍时间。
在一个具体实施例中，此方法包含以下步骤：
(a)起始培养，其包含解冻2×107冷冻的Vero细胞并将其添加到一个T-150cm2瓶中的50毫升生长培养基中以获得4-5×105细胞/毫升的细胞密度，其中所述生长培养基由VP-SFM与4mM L-谷氨酰胺组成，将所述细胞在37℃于5％CO2下培养过夜，且在第二天再次向所述培养物供以新鲜生长培养基；
(b)增殖并扩增所述细胞，其包含在于37℃于5％CO2下培养的所述T-150cm2瓶中使所述细胞生长至铺满，移除所述培养基，以20毫升不含钙和镁的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤所述瓶两次，向所述瓶添加5毫升胰蛋白酶并在室温下培养足以使所述细胞离开所述瓶的时间，用5毫升大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)中和所述胰蛋白酶并添加10毫升VP-SFM用于营养支持，将所得悬浮液以4×104细胞/平方厘米的浓度接种到五个T-150cm2瓶中并向各瓶添加VP-SFM至50毫升的水平，将所述细胞在37℃于5％CO2下培养3至4天，从所述五个烧瓶中汇集细胞悬浮液，用所汇集的悬浮液接种细胞工厂，向所述细胞工厂再次供料，并收获所述细胞工厂；和
(c)冷冻细胞库，其包含在4℃下以210xg将从所述细胞工厂收获的细胞离心10分钟，以1-2×107细胞/毫升的密度将所述细胞重悬于上述无血清细胞冷冻培养基中，以每管1毫升细胞悬浮液将所述细胞悬浮液分配到冻存管中，使用一台主动速率控制冷冻机冷冻所述细胞，并随后将所述细胞储存在液氮中，其中因此产生的稳定无血清Vero细胞库在一年后具有至少80％的细胞生活力和40与60小时之间的回收加倍时间。
本发明进一步提供一种由上述方法产生的用于疫苗生产的稳定无血清Vero细胞库，其中一年后平均细胞库生活力为至少80％且平均回收加倍时间在40与60小时之间。
附图说明
图1是用于100管细胞库的按比例扩大的流程图。200管和400管的细胞库根据相同流程图分别使用两个细胞工厂和四个细胞工厂。
图2是比较10管含有植物源性低温稳定剂的无血清细胞库和含有FBS细胞库的生活力的图表。
图3是比较10管含有植物源性低温稳定剂的无血清细胞库和含有FBS细胞库的回收加倍时间的图表。
图4是比较使用Hy-Soy
Figure 048377591_0
和HyPepRice作为低温稳定剂制成的大规模细胞库(100、200和400管)的细胞生活力的图表。
图5是比较使用Hy-Soy和HyPep Rice作为低温稳定剂制成的大规模细胞库(100、200和400管)的回收加倍时间的图表。
具体实施方式
正确的和标准化细胞建库方法的实施是提供具有一致性能和特征的细胞原料的基础。细胞建库应包括同源细胞的母细胞库和从所述母细胞库产生的众多工作细胞库。给定库的管数会根据预订用途而变化，但典型母细胞库可含有200管且典型工作细胞库可含有高达400管，其利用本发明的建库方法。此方法确保将提供用于一致生产的稳定底物的标准化细胞的长期供应。
多年以来，在所属技术领域内已知并使用Vero细胞(永生化非洲绿猴肾细胞，ATCC#CCI-81)用于生产人类病毒疫苗。所述细胞已经充分鉴定并具有优秀安全记录。
本发明的无血清Vero细胞建库方法由以下三个主要步骤组成：起始培养、增殖和扩增细胞和冷冻库。优化各个此等步骤使其可能产生高品质无血清细胞库。“高品质”意谓所述细胞的生活力高且回收快，意即回收加倍时间低。此等细胞生长和冷冻条件的组合产生提高的Vero细胞的回收率。用于来自细胞库的细胞的一致生产的最重要回收参数中的两个是回收时间和解冻生活力。回收时间和平皿接种效率密切相关，但其也提供更多关于解冻后细胞性能的信息。测量此等两个参数并用以优化接下来的细胞建库方法。
从细胞冷冻培养基中去掉酚红，因为据报导此组份可对细胞具有雌激素效应。[Berthois等人Cell Biology，83，2496-5000(1986)]。优化细胞冷冻培养基的组成以含有2g/L Hy-Soy(或HyPep Rice)、10％DMSO和作为生长培养基的剩余VP-SFM。
本文所用的“VP-SFM”由经改良以含有表1中所列成份的GibcoTM VP-SFM(可购自Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)代表。
表1
GIBCO VP-SFM(改良)
L-丙氨酸 无水磷酸氢二钠 腐胺2HCl
甘氨酸 无水硫酸镁 重组人类胰岛素
L-精氨酸HCl 无水氯化钙 表皮生长因子(EGF)，重组体
L-天冬酰胺H2O D泛酸钙 无水磷酸氢二钠
L-天冬氨酸 无水氯化镁 磷酸二氢钠H2O
L-半胱氨酸HClH2O 抗坏血酸2磷酸镁盐 HEPES
L-胱氨酸2HCl 氯化钠 柠檬酸铁络合物
L-谷氨酸 乙酸维生素A 腺嘌呤硫酸
还原型谷胱甘肽 维生素D2 腺苷-5-三磷酸
L-组氨酸HCl H2O 维生素K D-葡萄糖(右旋糖)
L-异亮氨酸 DL硫辛酸 维生素B12
L-亮氨酸 亚油酸 氯化胆碱
L-赖氨酸HCl 尿嘧啶 1-肌醇
L-甲硫氨酸 胸苷 烟酰胺
L-苯丙氨酸 生物素 吡哆醛HCI
L-脯氨酸 叶酸 2-脱氧核糖
L-丝氨酸 核黄素 乙醇胺HCI
L-苏氨酸 次黄嘌呤钠 磷酸乙醇胺
L-色氨酸 黄嘌呤钠 氯化钾
L-缬氨酸 对氨基苯甲酸 丙酮酸钠
硫胺素HCl 烟碱酸 专有植物水解产物
L-酪氨酸二钠盐 吡哆醇HCl 酵母提取物UF
作为方法的改良，从所属技术领域内习惯细胞密度的两倍起始培养。因此，并非以一管开始，而是从解冻到一个T-150cm2瓶的来源库的两个冷冻管起始培养。逐滴添加温暖VP-SFM以避免振荡和损害细胞。在解冻后的第二天再次向所述培养物供料移除剩余的低温稳定剂和细胞碎片，并且提高回收率。
按比例扩大流程和本发明的进度表使得能够以最少数量的通路(例如不超过四个通路)和操作来增殖Vero细胞，同时仍始终保持高的细胞浓度以维持健康培养。所述按比例扩大流程为：将来自来源库的两个冷冻管解冻到一个T-150cm2瓶中，扩大到五个用于接种一个10碟细胞工厂的T-150cm2瓶。一个100管细胞库可从一个细胞工厂产生。此流程使得容易调节库规模。
同时优化胰蛋白酶处理流程。发现对细胞单层进行两次缓冲液清洗对于解冻后的良好回收是最佳的。选择经γ射线照射的猪胰蛋白酶以使病毒污染的可能性最低。因为将足够的热转移到细胞工厂的所有十个水平是有问题的，从而产生不必要的微环境，所以在室温下用冷却的胰蛋白酶实施胰蛋白酶消化。
冷冻方法条件的组合显著改良了库的回收。首先，将收获和汇集的细胞悬浮液以210xg离心10分钟，而非引起相当数量细胞丢失的5或7分钟。以冷的冷冻培养基轻柔地进行重悬浮。其次，用一个中继移液器将所述细胞分配到冻存管中使得分配程序更快且减少在实际冷冻循环之前细胞暴露于冷冻培养基的时间。且第三，将在分配到冻存管期间的细胞悬浮液和已经充满的管冷却到2-8℃。
对于所述建库方法，需要解决低温保存Vero细胞的两个方面：冻存管中最佳细胞密度和设计速率控制冷冻机的程序以实现解冻后细胞的良好回收。在相改变期间，在材料冷冻时，将释放从液体转变到固体的热量(融解热)。优化程序从而解决融解热促使样品以恒定速率冷冻。已经清楚地证明最佳细胞密度为1-2×107细胞/毫升且对冷冻程序的修改有助于细胞的良好回收。
本发明的无血清Vero细胞建库方法提供一种产生用于病毒疫苗生产的可靠且稳定的细胞库的标准和一致的方法。在生长和冷冻培养基中用充当低温稳定剂的诸如Hy-Soy和HyPep Rice的植物源性物质替换动物源性产品。结果显示使用2g/L Hy-Soy或者2g/LHyPep Rice的无血清细胞库稳定至少一年。
产生接下来的细胞建库方法的改良增加解冻后细胞的生活力并且减少回收时间，其使得制造进度更精确且使得过程更一致。现在从更少数量的冻存管起始对于制造方法来说也是可能的。因此，一个全规模的400管库将持续更长久且连续运行会更连贯。
现在已经一般性描述了本发明，其将通过参考以下以说明性方式提供且除非说明否则不意欲限制本发明的实例更易于了解。
实例
在此研究中测试了若干种作为低温稳定剂的药剂。将含有Hy-Soy、HyPep Rice，、HyPep Wheat和甲基纤维素的细胞库与含有FBS的细胞库比较并检测细胞库稳定性。经证明对于研究的第一年Hy-Soy和HyPep Rice作为低温稳定剂和FBS一样有效。因而，Hy-Soy可用于无血清细胞库且HyPep Rice可用作代用品。
材料和方法
个人保护装置：无菌手套、无菌袖套、无菌连身服、洁净室头罩、洁净室须套、洁净室脚套。
一次性装置：一次性血清学移液管；1.8毫升Sarstedt冻存管；Corning Coastar 75cm2和150cm2组织培养瓶；十碟式Nunc细胞工厂[www.nuncbrand.com]。
玻璃器皿和附件：用于从10L和20L培养基总量分装培养基的带有C形弯管的玻璃罩；带有C形弯管的Gelman过滤器；细胞工厂适配器；带有转移装置和管的500ml、1L、2L和5L瓶；手泡。
试剂：经调配以含有表1中成份的GibcoTM VP-SFM；Gibco大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)；Gibco L-谷氨酰胺；不含钙和镁的Gibco磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)；Gibco牛血清白蛋白(BSA)；来自Quest International(Norwich，NY)的Hy-Soy、HyPep Rice、HyPep Wheat；Sigma(St.Louis，MO)二甲亚砜(DMSO)和甲基纤维素；70％异丙醇；Gibco 0.25％经辐射处理的胰蛋白酶/柠檬酸盐；Gibco 0.025 M柠檬酸钠缓冲液；Hyclone(Logan，UT)胎牛血清(FBS)或经辐射处理的FBS(irFBS)；Gibco杜贝卡氏(Dulbecco’s)最低必需培养基(DMEM)；注射用水或去离子水；Gibco 0.05％台盼蓝溶液。
装置：生物安全罩；层流净化罩或生物安全柜；旋转烧瓶底座；自动(中继)吸移管管理器；显微镜；倒置显微镜；血球计数器；循环式水浴槽；Forma Cryomed速率控制冷冻机(RCF)；蠕动泵；计量泵；37℃和5％CO2下的Forma培养箱；Forma离心机；吊桶式转子。
实例1
解冻和细胞生长
将两个含有2×107Vero细胞的冷冻储备管置于37℃水浴中。将所述管保持于水浴中同时伴以搅拌，且经常检查直至冷冻细胞解冻。将所述管的外侧用70％异丙醇清洁且置于层流净化罩中。快速将解冻的细胞转移至一个T-150cm2瓶中且逐滴添加50毫升生长培养基同时摇动培养容器。生长培养基由VP-SFM与4mM L-谷氨酰胺组成。在添加约一半的培养基后，剩余的培养基以稍微更快的速率添加。将所述细胞置于Forma培养箱(37℃，5％CO2)中且使其附着过夜。将所述培养基排气并在第二天向所述瓶中添加50毫升新鲜生长培养基。
实例2
细胞传递
使细胞在Forma培养箱中在37℃与5％CO2下培养的T-150cm2瓶中生长至铺满(4或5天)。将培养基排气并将所述瓶用20毫升不含镁和钙的PBS洗涤两次。向所述瓶添加5毫升胰蛋白酶并将所述瓶在室温下培养2至3分钟以从瓶中去除细胞。用5毫升STI中和胰蛋白酶并添加10毫升VP-SFM用于营养支持直至所述程序完成。将现在悬浮液中的细胞取样用于计数。向1毫升细胞样品添加1毫升台盼蓝溶液。用一个旋涡振荡器将其轻柔混合。将10微升混合物置于血球计数器的腔室中。将不接受染色的细胞计为活的并测定总细胞数。
随后将所述细胞悬浮液以4×104细胞/平方厘米的浓度接种到五个新的T-150cm2瓶中。向各T-150cm2瓶添加VP-SFM至50毫升的水平，且随后将所述瓶置于37℃和5％CO2的Forma培养箱中。三天以后再次向所述瓶供料。将所述瓶培养总计5天。汇集来自所述五个瓶中的细胞悬浮液，且将所汇集的悬浮液用于接种一Nunc细胞工厂。一个铺满的细胞工厂产生足够用于一个100管细胞库的细胞。
实例3
细胞工厂建立和接种
将由Nunc提供的用于所述细胞工厂的适配器之一连接到一根10英寸硅树脂管(内径3/16″，外径3/8″)。使用一个管连接器将一个8英寸长的C形弯管(内径.125″，外径.200″)连接到所述连接到细胞工厂的硅树脂管。其为入口/出口适配器。用生物防护材料包裹管的两端。将第二个用于细胞工厂的由Nunc提供的适配器连接到一根具有小Gelman过滤器(0.22微米)的3英寸硅树脂管(内径3/16″，外径3/8″)。用生物防护材料包裹所述适配器末端。将两个适配器均高压灭菌30分钟且干燥15分钟的时间。在生物安全柜(BSC)中，按照Nunc提供的说明手册将所述适配器连接到所述细胞工厂。细胞工厂上的每个端口均可用于入口/出口管线和过滤器组装管线。从冷藏室获得一包10升的VP-SFM或者3个1升瓶并将其升温至37℃。将5LC形弯曲转移管线置于无菌5升瓶中用于细胞接种。所使用的所有包均由制造商装备有C形弯管。使用无菌连接设备(SCD)将培养基连接至所述接种瓶并将2.5升培养基分装到所述接种瓶中。将细胞悬浮液添加到所述接种瓶中。使用所述SCD将所述接种瓶连接至细胞工厂。将所述细胞工厂置于填充和排出位置。将带有细胞的培养基缓慢手动泵入所述细胞工厂中。立即将连接至所述入口/出口管线的硅树脂管夹死。使用SCD将一个带有C形弯管的0.22微米Gelman过滤器(Acro 50)连接至所述细胞工厂。将所述细胞工厂置于水平检查位置。当将液体平均分配到十个水平时，将所述细胞工厂置入水平位置，且置于37℃、5％CO2培养箱中。
实例4
细胞工厂再次供料
在接种后的第二天和第五天向所述细胞工厂再次供料。使用SCD，将空包连接至所述细胞工厂。将所述细胞工厂轻柔地置于填充和排出位置且将液体水平标记。将空包置于地面以帮助排干培养基。其在给所述细胞工厂加压时是必需的。将一个手泡连接至过滤器组件以轻柔地向所述细胞工厂加压。一旦流动开始，即将手泡断开。当培养基排空时，将含有再供料培养基的包使用SCD连接至所述细胞工厂并将相同体积的培养基缓慢手动泵入所述细胞工厂。将所述细胞工厂置于水平检查位置。在完成水平检查之后将所述细胞工厂置于其在37℃、5％CO2培养箱中的水平工作位置。
实例5
细胞工厂收获
如上述将所述细胞工厂排干。第一洗涤液由300毫升25mM柠檬酸钠缓冲液或者300毫升不含钙和镁的PBS组成。将第一洗涤液泵入所述细胞工厂。使所述洗涤液等于各水平。将所述细胞工厂轻柔振荡以清洗细胞表面，将第一洗涤液排干并以与第一洗涤液相同的方式应用第二洗涤液。将第二洗涤液排干并将一瓶胰蛋白酶溶液(1.4毫升Gibco2.5％胰蛋白酶于300毫升2.5mM柠檬酸钠缓冲液中)连接于所述细胞工厂。将胰蛋白酶溶液泵入细胞工厂并将所述细胞工厂轻柔摇动从而覆盖所有细胞表面。每2或3分钟检查细胞表面以查看细胞是否开始分离。当细胞开始从所述细胞工厂分离时，精确敲打所述细胞工厂以释放剩余细胞。将其进行直至细胞工厂看起来透明。随后将所述细胞工厂连接至一个含有100毫升5毫克/毫升大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)的细胞收集瓶。将细胞混合物排入此瓶。将培养基洗涤瓶连接至所述细胞工厂，小心夹紧所述细胞收集瓶。将含有600毫升生长培养基的瓶连接至所述细胞工厂以清洗表面。将所述细胞工厂重新连接至细胞收集瓶并将清洗培养基排干。此洗涤液可含有高达1/3的总细胞。
实例6
冷冻方案
将从瓶中和Nunc细胞工厂收获的细胞取样用于计数，汇集并在Forma离心机中以210xg于4℃下离心10分钟。制备基本上由补充有10％DMSO的VP-SFM和2g/L在此研究中测试的低温稳定剂之一组成的细胞冷冻培养基。在所述过程期间将细胞保持于冰上。随后将所述细胞以1.5×107细胞/毫升的密度重悬于冷冻培养基中。将细胞浓缩物以每管1毫升细胞悬浮液置入1.8毫升Sarstedt冻存管中。使用主动速率控制冷冻机将细胞冷冻。在冷冻后，将所述细胞储存于液氮中。
实例7
细胞库
细胞库：使用源自T形瓶的10管细胞完成检测各种低温稳定剂的初始实验。基于所述10管细胞库的结果，将有希望的低温稳定剂用于较大的100、200和400管的细胞库。大规模细胞库所需要的细胞在细胞工厂中生长。
大规模细胞库的细胞扩增：如下进行用于细胞库的细胞扩增。对于欲制备的细胞库各100管解冻两管冷冻细胞。两管用于接种一个T-150cm2瓶。在第二天向所述T-150cm2瓶再次供料。在生长4天以后，将所述细胞分到5个T-150cm2瓶中。分开三天以后再次向所述瓶供料。将所述瓶培养5天。收集所述瓶并用于接种一个Nunc 10层细胞工厂。在两天和5天以后向所述细胞工厂再次供料。在第七天，收获所述细胞工厂。参见图1，其为用于制备所述细胞库的步骤的进度表。
细胞库测试：如实例1所述将来自各细胞库的5管解冻。各管用于接种两个含有25毫升VP-SFM的T-75cm2瓶。当细胞接近铺满时且在第二天收获细胞。加倍时间使用细胞计数和生长时间测定。如上述细胞生活力用台盼蓝测定。
结果和讨论
细胞库回收：两个参数用于测定细胞库稳定性：解冻后细胞回收加倍时间(当其接近铺满时且在第二天将瓶收获和计数)和细胞的生活力。在冷冻后立即且在各种时间点解冻细胞。所述细胞直接测试生活力且置于T形瓶中。收获所述T形瓶以测定细胞回收加倍时间。
十管Vero细胞库(参见图2和3)：在图2中在各种时间点取得各细胞库的5个样品的平均数。将所述样品快速解冻且使用台盼蓝测定生活力。在图3中在各种时间点取得各细胞库的5个样品的平均数。将所述样品快速解冻并置于T形瓶上。将细胞周期性计数以测定回收加倍时间。在液氮中储存一年后所有细胞库均具有大于90％的生活力。在第15个月仅10％DMSO的细胞库和0.1％甲基纤维素细胞库下降至80％以下。同样可见甲基纤维素库的回收极差而与其他细胞库的45至50小时加倍时间相比其加倍时间大于100小时。Hy-Soy、HyPep Rice和HyPep Wheat均具有见于对照细胞库(含FBS库)的加倍时间和生活力。基于此等数据，使用Hy-Soy和HyPep Rice作为低温稳定剂制备100、200和400管的大规模细胞库。
大规模细胞库(参见图4和5)：在图4中在各种时间点取得各细胞库的5个样品的平均数。将所述样品快速解冻并置于T形瓶上。将细胞周期性计数以测定回收加倍时间。在图5中在各种时间点取得各细胞库的5个样品的平均数。将所述样品快速解冻且使用台盼蓝测定生活力。9个月后所述100管含Hy-Soy和HyPep Rice细胞库的生活力仍大于80％。细胞回收也总是保持45至60小时之间的加倍时间。此等结果与含血清细胞库一致(参见图2和3)。经12个月的时期200管Hy-Soy库和400管Hy-Soy库也显示高于80％的生活力和40小时与60小时之间的回收加倍时间。Hy-Soy和HyPep Rice大规模细胞库均可比于含FBS细胞库。从上述实验结果，可得出结论：使用2g/L Hy-Soy或者2g/L HyPep Rice的无血清细胞库稳定高达一年。
本发明已由直接描述和实例描述。如上所述，所述仅意谓实例且不以任何有意义的方式限制本发明。另外，本发明所属技术领域一般技工在回顾说明书和所附权利要求书时应了解存在本发明的方面所主张的等价物。发明者意欲涵盖在所主张的合理范围内的等价物。

Claims (7)

1.一种无血清细胞冷冻培养基，其由补充有(a)选自由
Figure FSB00000250980100011
水解产物和Rice水解产物组成的群组的酶促水解产物低温稳定剂，每升所述培养基添加2克和(b)二甲亚砜的病毒生产无血清培养基组成。
2.根据权利要求1所述的无血清细胞冷冻培养基，其补充有10％二甲亚砜。
3.根据权利要求1或2所述的无血清细胞冷冻培养基，其中所述酶促水解产物低温稳定剂为水解产物。
4.根据权利要求1或2所述的无血清细胞冷冻培养基，其中所述酶促水解产物低温稳定剂为Rice水解产物。
5.一种用于产生稳定的无血清Vero细胞库的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)起始培养，其包括：解冻冷冻的Vero细胞并将其添加至T-150cm2瓶中的生长培养基中，其中所述生长培养基由病毒生产无血清培养基和4mM L-谷氨酰胺组成；在37℃和5％CO2下将所述细胞培养过夜；及在第二天再次向所述培养物供以新鲜生长培养基；
(b)增殖并扩增所述细胞，其包括：在于37℃和5％CO2下培养的所述T-150cm2瓶中使所述细胞生长至铺满；移除所述培养基；以不含钙和镁的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤所述瓶；向所述瓶添加胰蛋白酶并在室温下培养一足以使所述细胞离开所述瓶的时间；用大豆胰蛋白酶抑制剂中和所述胰蛋白酶并添加病毒生产无血清培养基用于营养支持；将所得悬浮液接种到五个T-150cm2瓶中并向各瓶添加病毒生产无血清培养基至50毫升的水平；在37℃和5％CO2下培养所述细胞3至4天；从所述五个瓶中汇集所述细胞悬浮液；用所述汇集的悬浮液接种细胞工厂；向所述细胞工厂再次供料；及收获所述细胞工厂；和
(c)冷冻所述细胞库，其包括：于4℃下以210xg将从所述细胞工厂收获的细胞离心10分钟；以2×106至2×107细胞/毫升的密度将所述细胞重悬浮于根据权利要求1中所述的无血清细胞冷冻培养基中；以每管1毫升细胞悬浮液将所述细胞悬浮液分配到冻存管中；使用主动速率控制冷冻机冷冻所述细胞；及将所述细胞储存在液氮中；其中因此产生的稳定无血清Vero细胞库在高达一年具有至少80％的细胞生活力和40与60小时之间的回收加倍时间。
6.一种用于产生稳定无血清Vero细胞库的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)起始培养，其包括：解冻2×107冷冻的Vero细胞并将其添加至T-150cm2瓶中的50毫升生长培养基中以获得4-5×105细胞/毫升的细胞密度，其中所述生长培养基由病毒生产无血清培养基与4mM L-谷氨酰胺组成；将所述细胞在37℃和5％CO2下培养过夜；及在第二天再次向所述培养物供以新鲜生长培养基；
(b)增殖并扩增所述细胞，其包括：在于37℃和5％CO2下培养的所述T-150cm2瓶中使所述细胞生长至铺满；移除所述培养基；以20毫升不含钙和镁的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤所述瓶两次；向所述瓶添加5毫升胰蛋白酶并在室温下培养一足以使所述细胞离开所述瓶的时间；用5毫升大豆胰蛋白酶抑制剂中和所述胰蛋白酶并添加10毫升改进的病毒生产无血清培养基用于营养支持；将所得悬浮液以4×104细胞/平方厘米的浓度接种到五个T-150cm2瓶中并向各瓶添加病毒生产无血清培养基至50毫升的水平；在37℃和5％CO2下培养所述细胞3至4天；从所述五个瓶中汇集所述细胞悬浮液；用所述汇集的悬浮液接种细胞工厂；向所述细胞工厂再次供料；及收获所述细胞工厂；和
(c)冷冻所述细胞库，其包括：于4℃下以210xg将从所述细胞工厂收获的细胞离心10分钟；以1-2×107细胞/毫升的密度将所述细胞重悬浮于根据权利要求2所述的无血清细胞冷冻培养基中；将所述细胞悬浮液以每管1毫升细胞悬浮液分配至冻存管中；使用主动速率控制冷冻机冷冻所述细胞；及将所述细胞储存于液氮中；其中因此产生的稳定的无血清Vero细胞库在高达一年具有至少80％的细胞生活力和40与60小时之间的回收加倍时间。
7.一种稳定的无血清Vero细胞库，其在高达一年具有至少80％的细胞生活力和40与60小时之间的回收加倍时间，其中所述细胞库由根据权利要求5或6所述的方法产生。
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