ES2268684T3 - Inmunodeteccion de fosfoproteina especifica al estado de activacion. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTAN ANTICUERPOS ANTIFOSFOPROTEINAS ESPECIFICAS A UNA PROTEINA Y ESPECIFICAS A UN ESTADO DE ACTIVACION Y UN METODO PARA SU PRODUCCION. TAMBIEN SE PRESENTAN LOS METODOS PARA EVALUAR PRONOSTICOS Y RESULTADOS TERAPEUTICOS DE PACIENTES UTILIZANDO LOS ANTICUERPOS ANTIFOSFOPROTEINAS Y LOS METODOS PARA LA CARACTERIZACION DEL ESTADO DE ACTIVACION DE UNA PROTEINA FOSFORILADA DE FORMA REVERSIBLE, LOS KITS QUE INCLUYE LOS ANTICUERPOS A UTILIZAR EN LA CARACTERIZACION DEL ESTADO DE ACTIVACION DE UNA PROTEINA Y LOS METODOS PARA EVALUAR LA ACTIVIDAD AGONISTA O ANTAGONISTA DE COMPUESTOS FARMACEUTICAMENTE UTILES PARA LA CONVERSION DE UNA PROTEINA ESPECIFICA DE SU ESTADO INACTIVO A SU ESTADO ACTIVO.

Description

Inmunodetección de fosfoproteína específica al estado de activación.

La presente invención se refiere a la producción de anticuerpos específicos para isoformas. Tal y como se describirá a continuación, pueden usarse determinados anticuerpos producidos según la presente invención para distinguir diferencialmente proteínas activadas, entre las que se incluye tirosinas quinasas y productos génicos protooncogén.

Las decisiones de tratamiento personalizado para pacientes con cáncer de mama se basan con frecuencia en el número de ganglios linfáticos axilares implicados en la enfermedad, en el estado de los receptores de estrógenos y de progesterona, en el tamaño del tumor principal y etapa de la enfermedad en diagnóstico (Tandon et al., J. clin. Oncol. 7:1120-1128 (1989)). Sin embargo, incluso con esta variedad de factores, no es posible predecir con precisión el curso de la enfermedad para todos los pacientes con cáncer de mama. Existe la clara necesidad de identificar nuevos marcadores para separar a los pacientes con buena prognosis, que no necesitarán más terapia, de aquellos cuyo cáncer es más probable que reaparezca y que pueden beneficiarse de tratamientos adjuvantes más intensivos.

Algunos de los candidatos más prometedores de los nuevos factores de pronóstico incluyen protooncogenes los cuales pueden amplificarse, sobreexpresarse, mutarse o activarse de otro modo en células tumorales. Se han descubierto alteraciones de los protooncogenes en muchas formas de tumores humanos (Bishop, Science 235:305-311 (1987); Klein et al., Nature 315:190-195 (1985); Varmus, Ann. Rev. Genet., 18:553-612 (1984)). Para uno de estos genes potencialmente transformadores, el gen c-erbB-2 (HER-2/neu), se demostró que la amplificación era un sólido factor de pronóstico del cáncer de mama primario en humanos. los pacientes con c-erbB-2 amplificado presentaban una supervivencia libre de enfermedad y supervivencia global más breve que los pacientes sin amplificación (Slamon et al., Science 235:177-182 (1987); Varley et al., Oncogene 1:423-439 (1987)).

La expresión de la propia proteína del oncogén c-erbB-2 también ha sido examinada por su potencial de pronóstico del carcinoma de mama de ganglios positivos y ganglios negativos. En pacientes con ganglios positivos que se sabe poseen un elevado riesgo de recidiva, la sobreexpresión de c-erbB-2 al nivel de las proteínas se ha asociado de forma consistente con una supervivencia libre de enfermedad y global más breve. Sin embargo, en pacientes con ganglios negativos, en los que la mejora de la predicción pronostica posee mayores implicaciones terapéuticas, la expresión del receptor c-erbB-2 no ha logrado predecir el resultado de la enfermedad en numerosos estudios (Slamon et al., Science 235:177-182 (1987); Borg et al., Cancer Res. 50:4332-4337 (1990); Paterson et al., Cancer Res. 51:556-567 (1991)). Por lo tanto, un método más preciso para caracterizar la importancia biológica de la sobreexpresión del receptor en enfermedades con ganglios negativos proporcionaría beneficios clínicos.

Recientemente, se ha demostrado que el receptor natural c-erbB-2 existe en dos formas interconvertibles, p175 y p185 (Epstein et al., J. Biol. Chem. 265:10746-10751 (1990)). La isoforma del receptor p175/c-erbB-2 presenta actividad tirosina quinasa in vitro mejorada, contenido de fosfotirosina específico del receptor y movilidad electroforética al compararla con la isoforma p185. Sin embargo, al usar los ensayos convencionales de inmunodetección de c-erbB-2 de un paso, la tirosina fosforilada de p175 y la serina/treonina fosforilada de p185 pueden ser técnicamente indistinguibles.

Tan solo la forma activada de una tirosina quinasa puede influir en el crecimiento y diferenciación celular. Las incoherencias clínicas relativas al papel del c-erbB-2 en el carcinoma de mama pueden reflejar la heterogeneidad de la activación in vivo del receptor. Un método simple basado en anticuerpos que podría distinguir la forma quinasa activa de c-erbB-2 (originada, por ejemplo, por bucles autocrinos o paracrinos, o mutaciones del receptor) desde la configuración inerte quinasa inactiva podrían proporcionar valiosa información biológica y clínica.

Además, la industria farmacéutica está interesada en evaluar farmacéuticamente compuestos útiles que actúan como agonistas o antagonistas del factor de crecimiento. Deben ensayarse decenas de miles de compuestos al año en un nivel de entrada o protocolo de cribado de "alto flujo". De los miles de compuestos analizados, uno o dos mostrarán cierta actividad en el ensayo de nivel de entrada. Por lo tanto se escogen estos compuestos para su posterior desarrollo y ensayo. Idealmente, un protocolo de cribado debería estar automatizado para poder manipular muchas muestras a la vez, y no utilizaría radioisótopos u otras sustancias químicas que comprometan la seguridad o que planteen problemas de eliminación. Un enfoque basado en los anticuerpos para evaluar la actividad del factor de crecimiento del fármaco proporcionaría estas ventajas y ofrecería la ventaja añadida de una selectividad elevada.

Otros investigadores han aislado anticuerpos receptores específicos de la activación en una serie de estudios experimentales. Sin embargo, dichos aislamientos parecen haber sido, al menos parcialmente, accidentales y los procedimientos empleados no proporcionan un enfoque sistemático a esta tarea. Keating et al. (J. Biol. Chem. 263:12805-12808 (1988)) cultivaron anticuerpos policlonales para un péptido no fosforilado correspondiente a los residuos 934-951 de la región C-terminal del receptor PDGF y posteriormente demostró que este antisuero reconocía el receptor PDGF activado nativo (inmunoprecipitado) pero no el desnaturalizado (inmunotransferido). Keating concluyó que la activación de la tirosina quinasa inducible por ligandos está asociada con un cambio conformacional del receptor que de algún modo permite la unión de anticuerpos. De forma similar, Downing et al. (Mol. Cell. Biol. 11:2489-2495 (1991)) cultivaron anticuerpos policlonales en una secuencia no fosforilada del dominio yuxtamembrana (552-574) del receptor CSF-1. Este antisuero también presentó especificidad para la isoforma del receptor activado inmunoprecipitado (pero no desnaturalizado), teóricamente coherente con el cambio conformacional mediado por la unión de fosfatidilinositol 3-quinasa a esta región. Campos-González y Glenney (Growth Factors 4:305-316 (1991)) aislaron un anticuerpo monoclonal, cultivado contra receptor intacto, que reconocía tanto la forma nativa como la forma desnaturalizada del receptor EGF. Sin embargo, el antisuero también reconoció receptores EGF a los que les faltaban los tres sitios principales de autofosforilación en tirosina, y eran incapaces de reconocer péptidos trípticos marcados con 32. por lo tanto, se propuso que el anticuerpo reconoce un cambio conformacional dependiente de la fosforilación que se renaturaliza parcialmente tras la desnaturalización SDS para la inmunotransferencia. Hu et al. adoptaron un enfoque similar usando proteínas intactas como inmunogenes para la producción de anticuerpos monoclonales. (Mol. Cell. Biol. 11:5792-5799 (1991)). Estos investigadores desarrollaron una amplia gama de anticuerpos monoclonales para el producto génico del retinoblastoma (Rb), algunos de los cuales distinguían isoformas infrafosforiladas y no fosforiladas. Gullick et al. (EMBO J. 4:2869-2877 (1985)) prepararon antisuero para los sitios de autofosforilación del receptor EGF usando péptidos no fosforilados, pero los anticuerpos resultantes no distinguían isoformas activadas e inactivadas del receptor. También se han usado anticuerpos dirigidos contra la fosfotirosina en el intento de distinguir subtipos del receptor activados e inactivados (Wang, Mol. Cell. Biol. 5:3640-3643 (1985); Wildenhain et al., Oncogene 5:879-883 (1990)), pero dichos anticuerpos no son específicos del receptor. Los datos resultantes son, por lo tanto, difíciles de interpretar: las bandas fosforiladas en tirosina con movilidad electroforética entre 160 y 190 kilodaltons podrían representar la activación del receptor c-erbB-2, pero también podrían indicar la activación de receptores del factor de crecimiento epidérmico, factores de crecimiento de fibroblastos o factor de crecimiento derivado de las plaquetas (comparar, por ejemplo, la movilidad electroforética de los receptores c-erbB-2 y PDGF de las Fig. 4 y 6, Epstein et al., Cell Growth and Differentiation, 3:157-164 (1992)).

Lee et al (Science 251:675, 1991) describe los trabajos realizados con una proteína asociada al Alzheimer, tau, y un derivado fosforilado de tau, llamado A68. Lee et al sintetizó formas fosforiladas y no fosforiladas de péptidos basados en esta proteína y preparó antisuero para cada péptido. El antisuero del péptido fosforilado reconoció A68 pero no tau, y al revés con el péptido no fosforilado. Lee et al informaron que "examinaron inmunotransferidos de proteínas de homogenados cerebrales ... con ambos antisueros y descubrieron que ninguna otra proteína reacciona con dichos anticuerpos". Por lo tanto, Lee et al describieron el cultivo de anticuerpos contra péptidos fosforilados y no fosforilados determinados, e informaron que los antisueros resultantes eran específicos para las proteínas glicosiladas y no glicosiladas respectivas.

La invención presenta de forma general anticuerpos que reaccionan específicamente con una de las dos isoformas de una proteína fosforilada de forma reversible y no reactiva con ninguna de las otras isoformas de la proteína o con formas modificadas de forma similar (fosforiladas o no fosforiladas) de diferentes proteínas. También se describen métodos para producir los anticuerpos específicos del estado de activación y específicos de proteínas, incluyendo los juegos los anticuerpos para su uso en la caracterización del estado de activación de una proteína, y métodos para evaluar la actividad agonista o antagonista de compuestos farmacéuticamente útiles para la conversión de una proteína específica de su estado inactivo a su estado activo.

Según un primer aspecto de la presente invención, proporcionamos un método para producir anticuerpos que se unen específicamente a una de las dos isoformas de una proteína fosforilada de forma reversible y no se une a otras isoformas de dicha proteína ni a proteínas distintas de ella, comprendiendo dicho método los pasos de: a) proporcionar un péptido de al menos tres aminoácidos formado básicamente por un sitio de fosforilación reversible de dicha proteína, estando un aminoácido fosforilable de dicho sitio de fosforilación reversible en el estado de fosforilación de una de las dos isoformas de dicha proteína. b) cultivar anticuerpos contra dicho péptido; c) aislar una población de anticuerpos reactivos con dicho péptido; d) purificar de dicha población anticuerpos no reactivos con dicho péptido estando dicho aminoácido fosforilable en el mismo estado de fosforilación que en el paso (a), incluyendo dicho paso de purificación el paso de poner en contacto dicha población con dicho péptido que se encuentra en el estado de fosforilación de la otra isoforma de dicha proteína para eliminar los anticuerpos de dicha población que se unen a dicho péptido en dicha otra isoforma; y e) recoger los anticuerpos no eliminados de dicha población en el paso de purificación
(d).

En un segundo y alternativo aspecto, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo deseado que se une específicamente a una de los dos isoformas de una proteína fosforilada de forma reversible y no se une a la otra isoforma de dicha proteína ni a proteínas distintas de ella, comprendiendo dicho método los pasos de: proporcionar un péptido de al menos tres aminoácidos formado básicamente por un sitio de fosforilación reversible de dicha proteína, estando un aminoácido fosforilable de dicho sitio de fosforilación reversible en el estado de fosforilación de una de las dos isoformas de dicha proteína; cultivar anticuerpos contra dicho péptido; aislar una población de anticuerpos reactivos con dicho péptido; cribar dichos anticuerpos contra un primer péptido que se encuentra en estado de fosforilación de una isoforma de la proteína y contra un segundo péptido que se encuentra en el estado de fosforilación de la otra isoforma de la proteína; y aislar el anticuerpo deseado resultante de dicho cribado.

Se proporciona, en un tercer paso alternativo de la presente invención, un anticuerpo que se une específicamente a un sitio de fosforilación reversible en tirosina de una proteína fosforilada de forma reversible en su isoforma fosforilada y no se une a la isoforma no fosforilada de dicha proteína, ni a otras proteínas que no sean dicha proteína.

La invención proporciona, en un cuarto aspecto alternativo de la misma, un anticuerpo que se une específicamente a un sitio de fosforilación reversible en tirosina de una proteína fosforilada de forma reversible en su isoforma no fosforilada y no se une a la isoforma fosforilada de dicha proteína, ni a otras proteínas que no sean dicha proteína.

Un quinto aspecto alternativo de la presente invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a un sitio de fosforilación reversible del receptor c-erbB-2 en su forma activa y no se une a la forma inactiva de dicho receptor c-erbB-2, ni a proteínas distintas de dicho receptor c-erbB-2.

Los autores también proporcionan, en otro aspecto alternativo de la presente invención un juego para su uso en la identificación del estado de activación de una proteína fosforilada de forma reversible utilizando uno de los anticuerpos mencionados anteriormente; y un método para su uso en el cribado del potencial metastásico de tumores en pacientes con carcinoma de mama de ganglios negativos utilizando dicho anticuerpo para activar el receptor c-erB-2.

Los métodos de los inventores utilizan fosfopéptidos sintéticos que incorporan sitios de fosforilación de proteínas informativos. Estos péptidos se utilizan como inmunogenes para desarrollar anticuerpos que indican el estado de activación de tirosinas quinasas y otras proteínas fosforiladas en residuos de serina o treonina.

Los anticuerpos de los inventores poseen una amplia aplicación tanto en la investigación clínica como en la investigación de laboratorio. La tecnología descrita es relevante para la producción de reactivos de inmunodetección específicos del estado de activación de una amplia variedad de proteínas reguladoras importantes para la salud y enfermedad en humanos.

Otras características y ventajas de la invención resultarán aparentes a partir de la siguiente descripción de las realizaciones preferidas de la misma.

En los dibujos:

La Fig. 1 es un diagrama esquemático del receptor c-erbB-2.

La Fig. 2 es una representación (Nº ID SEC: 1) de los dos péptidos C-terminales c-erbB-2 sintetizados, uno de los cuales es un fosfopéptido;

Las Figs. 3a y 3b muestran purificación por inmunoafinidad inversa de antisuero policlonal cultivado contra la secuencia 1243-1255 de c-erbB-2 (Nº ID SEC: 1), que contiene un residuo de tirosina fosforilada.

Las Figs. 4a y 4b muestran purificación por inmunoafinidad inversa del antisuero policlonal de las Figs. 3a y 3b de anticuerpos antifosfotirosina no específicos de la proteína.

La Fig. 5 muestra una estrategia de cribado para aislar anticuerpos monoclonales reconociendo residuos fosforilados dentro de las secuencias de proteínas específicas.

Las Figs. 6a y 6b muestran el uso de fosfopéptidos como reactivos de purificación por inmunoafinidad inversa para preparar antisuero policlonal que reconoce solo la secuencia de proteínas no fosforiladas;

La Fig. 7 es una representación esquemática de algunas de las subfamilias conservadas en la escala evolutiva de la superfamilia del receptor tirosina quinasa.

Las Figs. 8a y 8b muestran secuencias comparativas de aminoácidos de las principales secuencias de autofosforilación que contienen tirosina y treonina dentro de los dominios C-terminal (Fig. 8a; Nº ID SEC: 2 y Nº ID SEC: 3) y yuxtamembrana (Fig. 8b); Nº ID SEC: 4 y Nº ID SEC: 5) del receptor EGF y de la molécula c-erbB-2, respectivamente;

La Fig. 9 muestra sitios de fosforilación que contienen serina y treonina dentro de las proteínas p53 (Nº ID SEC: 6), retinoblastoma (Rb) (Nº ID SEC: 7), y receptoras de progesterona (Nº ID SEC: 8);

La Fig. 10 muestra la purificación por inmunoafinidad inversa (RIP) de antisuero antifosfopéptido (apt) usando un péptido no fosforilado de secuencia idéntica a la del inmunogen para adsorber anticuerpos no específicos de estado de activación.

La Fig. 10b muestra la purificación por inmunoafinidad inversa (RIP) de antisuero apt usando fosfotiramina (PTyr-NH_{2}) para adsorber anticuerpos antifosfotirosina no específicos de proteínas; y

La Fig. 11 muestra la homología de la secuencia de aminoácidos entre el receptor PDGF (N° ID SEC: 9) y el receptor CSF-1 (Nº ID SEC: 10) de tirosinas quinasas y la tirosina quinasa tipo no receptor src (Nº ID SEC: 11).

Descripción de las realizaciones preferidas

En la presente memoria los autores describen el desarrollo de anticuerpos de especificidad elevada contra la forma activa del receptor salvaje de c-erbB-2, p175, usando una técnica que hemos llamado inmunodetección de fosfoproteínas específicas de activación, o APHID.

Para aplicar esta técnica, se sintetizaron péptidos fosforilados en tirosina correspondientes al principal sitio de autofosforilación en tirosina del receptor c-erbB-2, se sintetizaron aminoácidos C-terminal 1243-1255 (N° ID SEC: 1) (Akiyama et al., Mol. Cell. Biol., 11:838-842 (1991)), se acoplaron (a través de un residuo de cisteína aminoterminal) a una proteína de transporte (hemocianina), se combinaron con adyuvante y se inocularon en conejos. Tras cultivar el antisuero policlonal, se purificaron los anticuerpos del péptido fosforilado en tirosina mediante un proceso de purificación inversa por adsorción de anticuerpos no específicos de la activación en un péptido no fosforilado de la misma secuencia. Cuando fue necesario, se eliminaron los anticuerpos antifosfotirosina contaminantes no específicos del receptor por adsorción a fosfotiramina.

Por lo general, la tecnología APHID puede aplicarse en la identificación de isoformas de proteínas caracterizadas por diversos estados de fosforilación. Un esquema típico para preparar anticuerpos policlonales para la inmunodetección de fosfoproteínas específicas del estado de activación es el siguiente.

En relación con la Fig. 1, el receptor c-erbB-2 10 está formado por un dominio extracelular N-terminal 12 y un dominio intracelular C-terminal 14. Un sitio de autofosforilación principal del receptor 10 es la tirosina C-terminal del residuo del aminioácido 1248 (16). En relación con la Fig. 2, para preparar anticuerpos de elevada especificidad, se sintetizaron péptidos fosforilados en tirosina 20, correspondientes a la región C-terminal del c-erbB-2 activado, a partir de residuos 1243-1255 del aminoácido, tal y como se describirá a continuación con más detalle, y se usó con adyuvante para inmunizar conejos. Los anticuerpos dirigidos contra el residuo de tirosina fosforilada (PTyr) 24, referido como Y-P, y los aminoácidos flanqueadores deben ser específicos de la activación y específicos del receptor.

Los anticuerpos de interés se purificaron según el mismo esquema de aislamiento. En relación con la Fig. 3a, el antisuero bruto recogido de conejos inmunizados contiene anticuerpos policlonales 30 cultivados contra el inmunogen 20 (péptido X-P). Algunos de los anticuerpos 36 del antisuero reconocen un epítopo que incluye el residuo de tirosina fosforilada (PTyr) 24 y, por lo tanto, podría ser específico para la forma activada de los receptores c-erbB-2. Otros reconocen epítopos que no incluyen el residuo PTyr 24 y deben ser eliminados de la población de anticuerpos.

En relación con la Fig. 3b, el antisuero bruto que contiene anticuerpos policlonales 30 se purifica mediante purificación por inmunoafinidad inversa usando el péptido X no fosforilado 22 sujeto a perlas de cromatografía para eliminar dichos anticuerpos que no son específicos de PTyr. El antisuero aislado contiene tan solo anticuerpos antifosfoproteína (apt) específicos de la activación 36 que reconocen específicamente las secuencias 20 que contienen PTyr.

En algunos animales el inmunogén 20 puede haber producido anticuerpos antifosfotirosina no específicos del receptor. Este suero necesitaría un paso de purificación adicional. En relación con la Fig. 4a, la población de anticuerpos 44, purificada por inmunopurificación inversa de un paso usando el péptido no fosforilado 22, contiene algunos anticuerpos 46 no específicos del receptor que reconocen un epítopo que no se sobrepone a residuos aminoácidos que flaquean a PTyr 24. En relación también con la Fig. 4b, el antisuero 44 se purifica sobre perlas 48 ligadas a fosfotiramina para eliminar anticuerpos no específicos del receptor, dejando el antisuero que contiene tan solo anticuerpos 36 específicos de la activación y específicos del receptor, dirigidos contra la forma activada del receptor c-erbB-2.

La metodología de inmunodetección de fosfoproteína específica del estado de activación, o APHID, descrita anteriormente, puede resultar útil para identificar receptores de la tirosina quinasa que se activan (por mutaciones estructurales o por producción autocrina de ligandos) en tumores humanos, una distinción que podría demostrar tener importancia pronóstica y terapéutica. Con adaptaciones menores, el enfoque APHID podría resultar ser valioso, además, para una amplia variedad de otras aplicaciones clínicas y experimentales.

Por ejemplo, podrían cultivarse anticuerpos monoclonales específicos de la activación (mAb) contra fosfopéptidos sintéticos tal como el fosfopéptido 1243-1255 c-erbB-2 usado anteriormente. Se trata de una adaptación menor de la técnica puesto que los preparados de anticuerpos APHID policlonales en realidad no son más que una mezcla de múltiples anticuerpos monoclonales. Sin embargo, una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal APHID podría proporcionar una fuente inagotable de anticuerpos de una calidad uniforme. La producción de anticuerpos monoclonales específicos del estado de acticación no requiere purificación por inmunoafinidad inversa, pero implica una sofisticada estrategia de cribado clonal similar. En cuanto a la Fig. 5, se cultivan antifosfopéptidos monoclonales, anticuerpos apt 50 contra la fosfotirosina 1243-1255 c-erbB-2 (PTyr) que contiene el fosfopéptido 20. Inicialmente los sobrenadantes del hibridoma 54 se criban usando el inmunogén 20 en un ELISA basado en fosfopéptido, lo cual tiene como resultado el aislamiento de clones positivos A, B, y C, que expresan los 50A, 50B y 50C mAb. A continuación se usa una serie de cribas secundarias. Una criba 56 indica que el clon A es también positivo para el péptido no fosforilado, presumiblemente reflejando afinidad hacia una secuencia de péptido lateral a la porción fosforilada; por lo tanto, el clon A se descarta puesto que no es específico de la activación. En otra criba secundaria 58, el clon C se muestra positivo para una fosfotirosina no específica de la secuencia. por lo tanto, también se descarta. El clon B es negativo 60 en todas las cribas secundarias y, por lo tanto, se selecciona como anticuerpo monoclonal apt específico de la activación y específico de la proteína 62.

Además, puede obtenerse antisuero policlonal mediante el procedimiento de purificación por inmunoafinidad inversa usando fosfopéptidos sintéticos como purificación en lugar de reactivos de inmunización. Este enfoque permitiría la producción de anticuerpos que reconocen específicamente secuencias de péptidos no fosforilados en situaciones en las que dichas secuencias son de especial interés por sí mismas (por ejemplo, cuando se busca una proteína no activada, o cuando la activación de la proteína está asociada con la desfosforilación de un residuo específico; véase a continuación) o como controles o comparaciones para la inmunodetección de especies de proteínas fosforiladas.

En lo relativo a la Fig. 6a, el antisuero bruto recogido de conejos inmunizados con péptido X 64, que no está fosforilado, contiene anticuerpos policlonales A, B y C 66. El anticuerpo B reconoce un epítopo que incluye el residuo de tirosina no fosforilada 68 y, por lo tanto, sería específico para la forma no fosforilada de la proteína X 64. Por otro lado, los anticuerpos A y C reconocen epítopos que no incluyen el residuo de tirosina 68 y, por lo tanto, podrían no distinguir diferencialmente formas fosforiladas de esta proteína.

En relación con la Fig. 6b, el antisuero bruto que contiene anticuerpos policlonales 66 se purifica mediante purificación por inmunoafinidad inversa sobre el péptido fosforilado X-P 70 unido a un soporte sólido tal como perlas de agarosa. Los anticuerpos A y C se retienen en las perlas y el antisuero aislado contiene exclusivamente anticuerpos B que reconocen específicamente secuencias que contienen tirosina no fosforilada 64.

En función de si la fosforilación o desfosforilación de un residuo específico está asociada con el estado de activación deseado, pueden aplicarse las estrategias indicadas anteriormente para detectar isoformas de proteínas no solo activadas sino también desactivadas.

En otro enfoque, puede esperarse que el antisuero policlonal cultivado contra múltiples fosfopéptidos (o defosfopéptidos) proporcione mayor sensibilidad de detección (cuando es positivo) para proteínas que contienen más de un sitio crítico de fosforilación, así como una especificidad mejorada (cuando es negativo). Esta estrategia puede usarse para generar anticuerpos específicos altamente sensitivos de la activación y de la inactivación para la cuantificación de isoformas de proteínas. Por ejemplo, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) contiene al menos cuatro sitios de autofosforilación de la tirosina (Margolis et al., J. Biol. Chem. 264:10667-10671 (1989)). Por lo tanto, podría esperarse que el uso simultáneo de dichos péptidos (fosforilados o no fosforilados), en combinación como inmunogenes o como reactivos de purificación, aumente la sensibilidad y especificidad de la detección de proteínas específicas del estado de activación.

Las secuencias fosforiladas en tirosina proporcionan solo un tipo de modificación postraduccional por fosforilación; los otros principales residuos fosforilados en proteínas reguladoras son serinas y treoninas. En términos estructurales, la fosforilación se serina/treonina es altamente análoga a la fosforilación de la tirosina. Por lo tanto, la inmunodetección de fosforilación reversible en los residuos de serina o treonina usando la técnica APHID proporcionaría información de valor similar. Por ejemplo, Ser-315 en la proteína reguladora de ciclo celular p53 se fosforila en asociación con la progresión del ciclo celular (Bischoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4766-4770 (1990)). Así, la detección de esta modificación podría resultar útil como un marcador de los estadios iniciales de neoplasia de mama. De forma similar, Thr-686 del receptor c-erbB-2 representa el principal sitio de fosforilación de la proteína quinasa C de esta proteína; la detección de esta modificación podría proporcionar información útil en estudios de interacciones del factor de crecimiento in vitro e in vivo y también pueden proporcionar un marcador para cuantificar la expresión de receptor inactivado en muestras de tumores humanos. La importancia funcional de dichas modificaciones reversibles puede variar según las diferentes proteínas, siendo algunas proteínas activadas/inactivadas por fosforilación reversible de serina o treonina, y otras por modificación de tirosina.

Pueden cultivarse anticuerpos que se dirigen contra otros miembros de la superfamilia molecular de la proteína quinasa relacionadas estructuralmente. Las tirosinas quinasas (que incluyen quinasas receptoras y no receptoras) presentan una importante homología estructural y funcional (Hanks et al., Science, 241:42-52 (1988)).

En relación con la Fig. 7, algunos de los miembros de la superfamilia de receptores tirosina quinasa se muestran en representación esquemática. La familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) incluye c-erbB-2, c-erbB-3 y receptor EGF. La familia de receptores del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) se representa mediante los receptores del factor de crecimiento derivados de plaquetas alfa y beta (PDGFR alfa y PDGFR beta), receptor del factor-1 estimulador de colonias (CSF-1R) y el receptor del factor de crecimiento de células madres (también conocido como producto génico c-kit y producto génico locus W). Un conjunto de receptores de la familia del factor de crecimiento de fibroblasto es estructuralmente similar a la familia del receptor PDGF. En contraste, miembros de la familia de receptores de insulina (incluido el receptor de insulina y el receptor del factor de crecimiento análogo a la insulina 1) presentan una configuración heterotetramérica radicalmente diferente. En la vista esquemática mostrada en la Fig. 7, los rectángulos sólidos indican la posición aproximada de los dominios intracelulares de la tirosina quinasa (catalítico) que constituyen uno de los módulos estructuralmente homólogos compartidos entre dichas moléculas derivadas de forma ancestral. En relación con la Fig. 8a, se indican las secuencias de aminoácidos comparativas del receptor EGF C-terminal y de las secuencias de autofosforilación del receptor c-erbB-2, mostrando la sorprendente homología de la secuencia de los respectivos sitios de autofosforilación de la tirosina. La Fig. 8b muestra un grado similar de homología de secuencias entre el dominio yuxtamembrana de dichos dos receptores, que incluyen los principales sitios de fosforilación de la treonina de la proteína quinasa C. El sorprendente alcance de la homología estructural y funcional de estas moléculas evolucionariamente relacionadas indica que el enfoque de inmunodetección específico del estado de activación es aplicable a otras tirosinas quinasas (y también a proteína fosforilada en serina o treonina). Por ejemplo, la actividad de la proteína c-src (tirosina quinasa no receptora) depende críticamente de la fosforilación diferencial de Tyr-416 y Tyr-527 (Yarden et al., Nature 323:226-232 (1986); Hunter, Cell 49:1-4 (1987); Cobb et al., Mol. Cell. Biol. 11:5832-5838 (1991)). Los anticuerpos dirigidos contra esta secuencia de fosfopéptido deben ser capaces de distinguir diferentes estados de activación de la molécula src.

La fosforilación de tirosina o serina/treonina es un mecanismo ubicuo en la regulación de la actividad de la proteína que no se limita a las proteínas quinasas. Por lo tanto, la metodología APHID sería aplicable para distinguir diferencialmente isoformas fosforiladas no solo de proteínas quinasas, sino también de muchas otras fosfoproteínas. El regulador del ciclo celular p53 (Bischoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4766-4770 (1990)), el producto génico supresor tumoral retinoblastoma (Rb) relacionado funcionalmente (Lees et al., EMBO J., 10:4279-4290 (1991)), y la familia de receptores nucleares de hormonas esteroideas (Denner et al., Science, 250:1740-1743 (1990); Kemppainen et al., J. Biol. Chem., 267:968-974 (1992)) son algunas de las proteínas celulares importantes que se sabe regulan su actividad mediante fosforilación reversible.

En relación con la Fig. 9, la molécula de control del ciclo celular p53 se fosforila de forma reversible en serina-315 para dar las especies inactivas cuando comienza la proliferación celular a través del ciclo celular. Otra proteína de control del ciclo celular, la molécula retinoblastoma (Rb), se fosforila simultáneamente en dos residos estrechamente relacionados, Ser-249 y Thr-252, durante la modulación del ciclo celular (Lees et al., EMBO J. 10:5279-4290 (1991)). De forma similar, el receptor humano de la progesterona (hPR) -miembro de la superfamilia de receptores nucleares de hormonas esteroideas que incluye los receptores del estrógeno, glucocorticoides, mineralcorticoides, andrógenos, vitamina D, ácido retinoico y hormona tiroidea (T3)- se fosforila de forma reversible en serina 676 tras la activación del ligando (Denner et al., Science, 250:1740-1743 (1990)). Según se ha descrito, la tecnología APHID puede usarse para generar anticuerpos específicos de la activación y de la inactivación contra todas dichas especies de fosfoproteínas.

Se presentan los siguientes ejemplos para ilustrar las ventajas de la presente invención y para asistir a los expertos en la técnica ordinaria a elaborarla y a utilizarla. Estos ejemplos no pretenden en modo alguno limitar el alcance de la invención.

Ejemplo I

Aislamiento de anticuerpos de elevada especificidad contra la forma activa del receptor c-erbB-2

La síntesis del principal sitio de autofosforilación de péptidos A fosforilados en tirosina del receptor c-erbB-2 expresado en células NIH 3T3 es Tyr-1248 (Akiyama et al., Mol. Cell Biol., 11:833-842 (1991); Hazan et al., Cell Growth Differentiation, 1:3-7 (1990); Margolis et al., J. Biol. Chem., 264:10667-10671 (1989)). La secuencia C-terminal del péptido 1243-1255 de c-erbB-2, situada en el extremo C-terminal del receptor más allá del dominio quinasa, se sintetizó en asociación con una cisteína N-terminal. Sin embargo, en lugar de incorporar un residuo de tirosina en la posición 1248, se sintetizó un péptido fosforilado mediante procedimientos de síntesis en fase sólida de Merrifield estándar usando la estrategia t-Boc. La síntesis se efectuó en un sintentizador de péptidos ABI 430 usando ciclos rápidos de escala pequeña (0,1 mmol). Se incorporó la fosfotirosina como tert-butioxicarbonil-O-(dibenzil)fosfono-L-tirosina adquirida de Peninsula Laboratories (Belmont, CA). Se desprotegió el péptido totalmente protegido y se escindió de la resina de fenilacetamidometilo usando ácido trifluorometansulfónico Se obtuvo el análisis en fase inversa del péptido bruto en una columna Vydac C-18 de 5 micrones de 250 mm x 2,1 mm. Se ejecutó un gradiente lineal de 0 a 60 min. con 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) y 0,09% de TFA en acetonitrilo. Se realizó el análisis de aminoácidos usando procedimientos Pico-Tag estándar. Se realizó la hidrólisis con 6N HCl a 145°C durante 2 horas. Los análisis de composición mostraron una conversión casi completa de la fosfotirosina en tirosina debido a la hidrólisis. Para demostrar que en efecto la fosfotirosina estaba incorporada en el péptido, se realizó un análisis de secuencia usando un secuenciador de fase gaseosa ABI 477. Se determinó la presencia de un residuo de fosfotirosina por la falta de señal en el ciclo esperado (puesto que la fosfotirosina no se extrajo con los solventes utilizados) y por la reaparición de la secuencia esperada en ciclos posteriores.

También se sintetizó un péptido 1243-1255 no fosforilado asociado a cisteína.

Las células B104-1-1 que expresaban el mutante transmembrana c-erbB-2 activado constitutivamente (Weiner et al., Nature, 339:230-231 (1989)) se lisaron y se inmunoprecipitaron usando anticuerpos antifosfotirosina. La preincubación de la antifosfotirosina con el péptido que contenía PTyr o con el péptido acoplado a inmunoprecipitación de
c-erbB-2 antagonizada por hemocianina de lapa californiana activada al menos tan eficaz como 1 mM de fosfotirosina. Estos datos indican una incorporación con éxito de la fosfotirosina a la porción de péptido sintético.

Aislamiento y purificación de anticuerpos

Los péptidos vinculados a cisteína correspondientes a la secuencia del péptido 1243-1255 de c-erbB-2 del dominio C-terminal y que contenía Tyr-1248 fosforilado se acoplaron a hemocianina activada extraída de lapa californiana (KLH; Pierce Chemical Co., Rockford, IL). A continuación se purificó con gel el conjugado de péptido-KLH y se identificaron las fracciones en OD_{280}. Se mezcló adyuvante incompleto de Freud con el conjugado y se almacenó el inmunogen como alicuotas a -20ºC hasta estar listas para su uso. Se inoculó a los conejos en intervalos aproximados de 4-6 semanas. Se recogió el antisuero en cantidades de 20-40 ml comenzando una semana tras el inicio del crecimiento.

Para establecer la viabilidad de la purificación cromatográfica inversa del suero de antifosfopéptido (apt) bruto, se realizó inmunotransferencia de los lisatos que contenían c-erbB-2 tras preincubar soluciones de anticuerpos con diversos péptidos. Los péptidos que contenían PTyr-1248 antagonizaron la unión de apt a c-erbB-2 en las células del cáncer de mama humano SK-Br-3 más eficazmente que el péptido 1243-1255 no fosforilado, mientras que el péptido derivado del dominio yuxtamembrana (péptido Thr) no tuvo efecto alguno. En lisatos G8/DHFR, la adición de péptido no fosforilado eliminó virtualmente la inmunoreactividad de los anticuerpos anti-erbB-2 comercialmente disponibles en relación con esta secuencia no fosforilada (p185), mientras que la unión apt-p175 permaneció fuerte. Una monoespecifidad similar de la unión apt-p175 fue similarmente aparente tras el paso único de purificación cromatográfica inversa de un paso del antisuero apt bruto.

Por lo tanto, la purificación del antisuero se abordó acoplando en primer lugar el péptido 1243-1255 no fosforilado vinculado a cisteína a perlas de cromatografía Affigel-501 (Biorad, Richmond, CA) durante 16 h a 4ºC. Se quitó el péptido no unido de las perlas mediante seis ciclos de cuidadosa centrifugación seguida de resuspensión en dH_{2}O. A continuación se combinó las perlas lavadas con 1 ml de antisuero y se mezcló durante 6 h a 4ºC. Tras la centrifugación se extrajo el sobrenadante y se almacenó el anticuerpo purificado como alícuotas a -20ºC.

A diferencia de los anticuerpos policlonales diferentes del péptido 1243-1255 no fosforilado (Pab-1), el antisuero apt bruto puede reconocer preferencialmente la isoforma p175 de c-erbB-2. Esta distinción visual se atenuó mediante estímulos adicionales que aumentaron la inmunoreactividad de anti-p175 y anti-p185, pero estos antisueros de título más elevado se purificaron fácilmente mediante el proceso de inmunoafinidad inversa de un paso. En relación con la Fig. 10a, el antisuero antifosfopéptido de título elevado de un conejo (apt-2) no distinguió p175 y p185 antes de la purificación - de forma similar a los anticuerpos comercialmente disponibles (pan-erbB-2). Sin embargo, la purificación por inmunoafinidad inversa de un paso (RIP) del antisuero apt bruto usando el péptido no fosforilado vinculado a perlas de agarosa conduce a una inmunodetección de p175 de una monoespecifidad próxima. Esto no se antagoniza con la preincubación del antisuero apt-2 purificado (apt-RIP) con fosfotirosina (PTyr 1 mM), lo cual indica que la inmunodetección de p175 no se debió principalmente a anticuerpos antifosfotirosina no específicos del receptor.

A pesar de que fue detectable un menor grado de actividad antifosfotirosina no específica en dos de los tres antisueros de conejo producidos, esta combinación no deseada se eliminó rápidamente mediante una estrategia de purificación por inmunoafinidad inversa. En relación con la Fig. 10b, se advirtió que el antisuero apt-2 detectaba una pequeña proporción de fosfotirosina asociada al receptor EGF así como la observada en la tirosina quinasa lck recombinante. Sin embargo, la adsorción de este antisuero a fosfotiramina (PTyr-NH_{2}) condujo a la desaparición de esta inmunoreactividad.

Detección específica de la activación de las formas nativas y desnaturalizadas del receptor c-erbB-2

Anteriormente los autores han demostrado que el receptor c-erbB-2 de las células G8/DHRF se transmodula negativamente por exposición a suero de ternero, PDGF, el acetato de tetradecanoilforbol (TPA) (Epstein et al., J. Biol. Chem., 265:10746-10751 (1990)) o mayor cantidad de calcio extracelular (Epstein et al., Cell Growth Differentiation 3:157-164 (1992)). A diferencia de la expresión completa de c-erbB-2, la expresión p175 -medida mediante inmunoreactividad de apt- se anula rápidamente mediante dichos estímulos. El reconocimiento del receptor nativo c-erbB-2 aparece igualmente específico de la activación en experimentos de inmunoprecipitación y es igualmente útil en la tinción de células. También se han demostrado las principales diferencias de la inmunoreactividad de apt-1 en células del cáncer de mama y de ovarios en humanos.

La capacidad de distinguir entre la sobreexpresión de la proteína c-erbB-2 activada e inactivada a través de la utilización de APHID puede ayudar a distinguir subconjuntos de tumores que difieren en su potencial metastático o de respuesta terapéutica. Esto tendría un valor especial en enfermedades en etapa I (ganglio negativo) en las que la detección de c-erbB-2 tiene actualmente el menor valor clínico.

Células de procedimientos experimentales, lisis de células y anticuerpos de control

Cultivos madre de fibroblastos murinos G8/DHFR con constructo de reductasa dicistrónico amplificado c-neu/dihi-
drofolato de rata (un regalo del Dr. Robert Weinberg, Whitehead Institute, Cambridge, MA) se mantuvieron en medio mínimo esencial de Dulbecco (DME) complementado con 10% de suero bovino de ternero, glutamina, antibióticos y 0,3 \muM de metotrexato. El resto de líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection. La manipulación de las células, los protocolos de inmunotransferencia, la electroforesis en gel de poliacrilamida y los reactivos son los descritos anteriormente (Epstein et al., J. Biol. Chem., 265:10746-10751 (1990)). La fosfotirosina se obtuvo de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Se lisaron las células en 10 mM Na_{2}HPO_{4} \cdot 7H_{2}O, 10 mM NaH_{2}PO_{4} \cdot H_{2}O, 150 mM NaCl, 1% de Nonidet P-40 (v/v), 10% de glicerol (v/v), 50 mM de fluoruro de sodio, 10 mM de pirofosfato sódico, más inhibidores de la proteasa (ortovanadato sódico 1 mM, leupeptina 40 \muM, aprotinina 10 \mug/ml, fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) 1 mM, benzamidina HCl 50 \mug/ml, y molibdato sódico 50 \mug/ml). Para proporcionar controles negativos de fosfotirosina, se trataron algunas muestras de células G8/DHFR con 10% de suero bovino de ternero durante 15 min. para transmodular el receptor c-erbB-2 (Epstein et al., J. Biol. Chem., 265:10746-10751 (1990)) y a continuación se lisaron en ausencia del ortovanadato sódico inhibidor de la tirosina fosfatasa. Para la inmunotransferencia, se reconstituyó anticuerpo policlonal de conejo pAb-1 cultivado contra la secuencia péptido carboxiterminal 1243-1255 del producto génico neu (Triton Biosciences, Alameda, CA) en agua y se diluyó en 1:100 tampón TBST (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0,05% de Tween-20), mientras que el anticuerpo monoclonal antifosfotirosina (anti PT-yr) se purificó en una columna de afinidad sobre una proteína A S. aureus y se usó a una concentración de 1:1000. Se lisaron las muestras de las células tras su exposición a PDGF (30 nl/ml), EGF (100 ng/ml), TPA (100 \mug/ml) ó cloruro de calcio (10 mM). La inmunoprecipitación de control del receptor c-erbB-2 se realizó usando anticuerpos disponibles comercialmente (Oncogene Science, Manhasset, NY; Triton Biosciences, Alameda, CA).

Competencia de la unión de anticuerpos antifosfotirosina

Se lisaron las células B104-1-1 que expresaban el receptor c-erbB-2 activado constitutivamente y se inmunoprecipitaron con 1:100 de anticuerpo antifosfotirosina antes de su inmunotransferencia con el mismo anticuerpo a 1:1000. Se preincubó el anticuerpo durante 30 min. con KLH, 1 mM de fosfotirosina (PTyr), fosfopéptido sintético (PTyr péptido), péptido no fosforilado (Thr péptido), conjugado KLH-fosfopéptido (conjugado PTyr) o conjugado KLH-péptido no fosforilado (conjugado Thr).

Determinación de la inmunoreactividad del antisuero de conejo tras la inmunización del fosfopéptido

El anticuerpo policlonal Pab-1 (cultivado contra el péptido no fosforilado 1243-1255 c-erbB-2) se usó a una concentración de 1:100, mientras que se usó antifosfotirosina (anti-PTyr), apt, y anticuerpos preimmunes a una concentración de 1:1000. Se expuso a las células A431 con expresión del receptor EGF durante 15 min. a 100 ng/ml de EGF antes de la lisis, y a continuación se sometieron a electroforesis junto con lisatos de células G8/DHFR que contenían receptores c-erbB-2 activados o inactivados. Se incubaron los inmunotransferidos con antisuero apt sin purificar (1:1000), antisuero apt preincubado con 1 mM de fosfotirosina durante 30 min., o anticuerpo antifosfotirosina (1:1000).

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Ejemplo II

El receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es una molécula señalizadora importante de los tejidos conectivos en humanos y del cerebro en desarrollo (Williams, Science 248:1564-1570 (1989)). Al igual que el receptor c-erbB-2 y el receptor EGF, el receptor PDGF es un miembro de la superfamilia de la tirosina quinasa, aunque ha evoluacionado como parte de una subfamilia estructuralmente distinta que incluye el factor 1 estimulador de colonias (CSF-1) y el producto génico del kit; una importante tercera subfamilia de receptores de la tirosina quinasa se representa con el receptor de la insulina (IR) y el receptor asociado al factor de crecimiento análogo a la insulina 1, ó IGF-1 (Fig. 7). Uno de los principales sitios de autofosforilación del receptor PDGF humano se encuentra en tirosina-857 del dominio de inserción quinasa (Kazlauskas & Cooper, Cell 58:1121-1133 (1989)). Esta secuencia de autofosforilación tiene una fuerte homología a una secuencia colocada de forma similar en la inserción de la quinasa del receptor CSF-1 (Fig. 11).

Los autores esperan poder obtener rápidamente los anticuerpos específicos de la activación de la secuencia del péptido de tirosina-857 fosforilada del receptor PDGF -y, por lo tanto del propio receptor activado- usando la técnica APHID. Además del valor potencial de dichos anticuerpos en los estudios básicos de investigación de la regulación del crecimiento celular y de las interacciones embriogenéticas, la detección del receptor PDGF específico de la activación resultaría útil en el inmunofenotipado de tumores cerebrales humanos (Hermansson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:7748-7752 (1988)), sarcomas (Fahrer et al., Int. J. Cancer, 44:652-657 (1989)), y carcinomas de tiroides (Heldin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:9302-9306 (1988)).

De forma similar, los anticuerpos apt de los receptores CSF-1 podrían usarse para detectar activación autocrina, paracrina o asociada a la mutación de dichos receptores en hematología y otras especialidades. Dichos anticuerpos también se usarían en la investigación de leucocitosis no explicada y en la evaluación de las probables ventajas terapéuticas en pacientes que reciben terapia CSF por problemas clínicos tales como anemia aplástica, soporte quimioterapéutico y trasplante de médula ósea.

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Ejemplo III

Es notable que las dos secuencias descritas anteriormente conservan una mayor homología con un sitio clave de autofosforilación del producto src protooncogénico (Fig. 11), una tirosina quinasa no receptora que actúa como proteína crítica de la señalización intracelular.

La familia src engloba numerosos miembros que incluyen las moléculas fyn y lck que regulan la función de las células inmunes. En virtud de su estructura y activación dependiente de la fosforilación de la tirosina homólogas (Hanks et al., Science, 241:42-52 (1988)), esperamos que los anticuerpos específicos de la activación de proteínas similares a src pueden obtenerse rápidamente usando la tecnología APHID. Al igual que otros productos protoonocogénicos, src juega un importante papel en la señalización intracelular normal, mientras que también está implicado en la patogénesis de algunas enfermedades humanas. Por ejemplo, Cartwright et al. demostraron un incremento del doble de la expresión en c-src y de diez veces en la actividad tirosina quinasa c-src en adenomas y carcinomas colónicos en comparación con la mucosa adyacente normal (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:558-562 (1990)). Esta molécula representa una opción especialmente atractiva para aplicar el enfoque APHID, puesto que la tirosina-416 representa una secuencia de autofosforilación específica de la activación (Yarden et al., Nature 323:226-232 (1986)), mientras que la fosforilación de Tyr-527 está asociada a una regulación negativa (Cobb et al., Mol. Cell. Biol., 11:5832-5838 (1991)). Por lo tanto, se esperaría que la aplicación de cualquiera o de todos los enfoques descritos en las Fig. 3-6 produjeran anticuerpos que distinguirían las isoformas de moléculas src activadas e inactivadas. Esto resultaría útil en el estudio de los cambios en la señalización intracelular que se producen en los primeros estadios de los tumores humanos y durante la progresión del tumor, derivándose posibles implicaciones clínicas y terapéuticas de dichos estudios. Muchas otras proteínas clave de la señalización intracelular -tales como fosfolipasa C (Kim et al., Cell, 65:435-441 (1991)) y la familia ERK serina/treonina quinasa (que se fosforilan en tirosina; Boulton et al., Cell, 65:663-675 (1991))- deberían resultar similarmente sensibles a la caracterización inmunofenotípica del estilo de APHID.

Ejemplo IV

Inmunodetección del producto génico p53 fosforilado en Ser-315

Muchas proteínas alteran su actividad metabólica por la fosforilación de residuos de serina o treonina. Las quinasas responsables de dicha fosforilación incluyen la proteína quinasa C, proteína quinasa A y las caseina quinasas. Otra quinasa, la reguladora del ciclo celular cdc2, fosforila dos factores nucleares clave, la proteína retinoblastoma, Rb (Lees et al., EMBO J., 10:4279-4290 (1991)), y su producto génico p53 (Bischoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4766-4770 (1990)). Estos dos factores nucleares se han implicado como supresores tumorales que controlan la progresión del ciclo celular. P53 salvaje no fosforilada está asociada con la latencia celular, pero la proliferación celular está asociada con la fosforilación de p53 en serina-315, lo cual indica que la fosforilación de p53 puede anular la actividad antiproliferativa de esta molécula (Bischoff et al., op. cit.). La pérdida alélica del gen p53 se conoce en muchos tumores humanos comunes, y las mutaciones de este gen están implicadas en algunos síndromes familiares de cáncer de mama (Malkin et al., Science, 250:1233-1238 (1990)).

Los anticuerpos monoclonales comercialmente disponibles pueden reconocer las formas mutantes de la proteína (Gannon et al., EMBO J., 9: 1595-1602 (1990)). Aunque no se ha informado de ninguna evidencia de p53 mutado en los estadios iniciales de neoplasias de mama, una expresión general de p53 no se correlaciona con la presencia de mutaciones en tumores mamarios humanos (Thompson et al., Int. J. Cancer, 50:528-532 (1992)). Estos descubrimientos plantean la posibilidad de que la inmunodetección de p53 fosforilada con Ser-315 puede constituir un marcador clínicamente útil para la identificación de células neoplásticas y preneoplásticas que están sometidas a una proliferación disregulada, como resultado de mutaciones del ADN principal o como efecto secundario de otros estímulos tumorigénicos. Tal marcador podría ayudar en la caracterización clínica de los primeros estadios del cáncer de mama descubiertos en mamografías de cribado, y podría ayudar a dictar la necesidad de terapia sistémica adyuvante o local (por ej. masectomía o irradiación) en dichos pacientes.

Ejemplo V

Inmunodetección del receptor de progesterona fosforilado con Ser-675

La detección actual de receptores de hormonas primarias de cáncer de mama (estrógeno y progesterona) predice una probabilidad del 60-70% de respuesta a la terapia hormonal en caso de diseminación posterior del tumor. La predictividad de falso positivo de esta medida ha sido tema de debate desde hace tiempo. Una posibilidad es que las técnicas convencionales basadas en anticuerpos o en radioinmunoensayo pueden detectar receptores funcionalmente defectuosos. La aplicación de la metodología APHID puede identificar de forma selectiva tumores que expresan receptores de hormonas que funcionan activamente y (de ese modo) contribuyen al crecimiento y progresión de la enfermedad. Se espera que el tratamiento de dichos tumores consega una tasa de respuesta mucho más elevada que la que se obtiene actualmente, permitiendo así a los pacientes con receptores de la hormona APHID negativos iniciaran terapias más beneficiosas. Estudios recientes han demostrado que un aumento multiplicado por 20 de la fosforilación del residuo Ser-530 del receptor de progesterona del pollo acompaña la activación del receptor, y que esto se debe probablemente a la actividad de una quinasa dependiente de prolina (Denner et al., J. Biol. Chem. 265:16548-16555 (1990)). La porción Ser-530 corresponde al receptor humano homólogo de la progesterona Ser-675 (Misrahi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 143:740-748 (1987); Denner et al., J. Biol. Chem. 265:16548-16555 (1990)). Por lo tanto, la inmunodetección en este sitio del fosfopéptido puede ser clínicamente útil para detectar tumores que expresan el receptor funcional activado por el ligando y así predecir con mayor precisión la utilidad de manipulaciones endocrinas en la gestión adyuvante y metastásica del cáncer de mama.

Ejemplo VI

Identificación de agonistas o antagonistas del receptor PDGF usando anticuerpos apt en protocolos de cribado de fármaco "de flujo elevado"

Anticuerpos apt cultivados contra los receptores del factor de crecimiento, tirosinas quinasas y otras fosfoproteínas reguladoras pueden usarse en protocolos de cribado de fármaco "de flujo elevado" o de nivel de entrada para identificar compuestos farmacéuticamente útiles que actúan como agonistas o antagonistas del factor de crecimiento. Por lo general, se proponen dos enfoques para los cribados de fármacos de flujo elevado. Los enfoques basados en las células usan una línea celular indicadora que se expone al compuesto a ensayar. Se cree que este enfoque elimina rápidamente fármacos que presentan problemas de solubilidad o de permeabilidad de la membrana. Por otro lado, los cribados basados en proteínas o en enzimas usan proteínas purificadas y pueden identificar fármacos que reaccionan directamente con el receptor. Estos compuestos pueden modificarse químicamente para permitirles atravesar la membrana celular.

En el ensayo basado en células, una línea celular indicadora que expresa receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) puede cultivarse en placas de microtitulación de 96 pocillos directamente sobre filtros de nitrocelulosa estéril. Se añade una dosis fija de ligando PDGF a cada pocillo junto con el compuesto cuya actividad antagonista vaya a ensayarse. Pasados cinco minutos las células se lisan con detergente directamente sobre la superficie del filtro de nitrocelulosa. Se procesan los lisatos de los 96 cultivos mediante protocolos convencionales "Western Blot" bien conocidos en la técnica (por ej., tal y como se describe en Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354 (1979)) usando anticuerpos apt específicos para la forma activada del receptor PDGF. Los cultivos que no reaccionan con el anticuerpo indican una potencial actividad antagonista del PDGF. Este procedimiento podría modificarse rápidamente para cribar fármacos con actividad agonista del PDGF cultivando las células indicadoras descritas anteriormente, exponiéndolas a los compuestos a ensayar pero no al ligando PDGF y desafiando las células con anticuerpos específicos para la forma activada del receptor PDGF. Los lisatos de las células que reaccionan con el anticuerpo sugieren que el compuesto de ensayo es un potencial agonista PDGF.

En el ensayo basado en proteínas, se produce la proteína recombinante del receptor PDGF biológicamente activa usando un vector del baculovirus/sistema de células anfitrionas de insecto bien conocido en la técnica (por ej., tal y como describe Morrison et al, Cell 58: 649-657 (1989)). El receptor producido de este modo se autofosforila constitutivamente y presenta quinasa activa en solución. Sin embargo, el tratamiento de fosfatasa desfosforilará el receptor recombinante y producirá cantidades miligrámicas de receptor en un cribado de fármaco de nivel de entrada basado en proteínas. Tras añadir el ortovanadato sódico para desactivar la fosfatasa, se dispensan alícuotas del receptor PDGF recombinante desfosforilado en 96 pocillos de microtitulación junto con ligando PDGF, ATP y compuestos cuya actividad antagonista vaya a ensayarse. Pasados varios minutos, se dispensan las mezclas de reacción sobre los filtros de nitrocelulosa. A continuación se procesan cada una de las 96 mezclas de reacción mediante protocolos "Western Blot" convencionales usando anticuerpos específicos para la forma activada del receptor PDGF. Las mezclas de reacción que no reaccionaron con el anticuerpo indicaron un antagonista potencial del PDGF. Para ensayar fármacos con actividad agonista del PDGF, se expone el receptor recombinante (preparado como se ha descrito anteriormente) a los compuestos a ensayar y ATP, y la mezcla de reacción se desafía con los anticuerpos específicos para la forma activada de receptor del PDGF. Las mezclas de reacción que reaccionan con el anticuerpo sugieren que el compuesto ensayado es un potencial agonista del PDGF.

Los ejemplos anteriores han otorgado muchos usos clínicamente importantes a anticuerpos apt en los protocolos de diagnóstico y cribado. También se han formulado sugerencias en relación con las implicaciones terapéuticas de la información diagnóstica. Los anticuerpos apt se suministrarían en un juego para usar en un entorno de laboratorio de diagnósticos para caracterizar el estado de activación de la proteína fosforilada de forma reversible de interés. El juego contendría los componentes necesarios para la extracción de una muestra de tejido específica y los componentes necesarios para su utilización en un ensayo de unión, incluido el anticuerpo apt adecuado.

Mientras que la presente invención se ha descrito en conjunción con una realización preferida, un experto en la técnica, tras leer la especificación que antecede, podrá efectuar diversos cambios, sustituciones de equivalentes y otras alteraciones a las composiciones y métodos expuestos en esta memoria. Por lo tanto se pretende que la protección otorgada por la presente patente de invención se limiten exclusivamente las definiciones incluidas en las reivindicaciones anexas y sus equivalentes.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Epstein, Richard J.

\hskip3.9cm

Stiles, Charles D.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: INMUNODETECCIÓN DE FOSFOPROTEÍNA ESPECÍFICA DEL ESTADO DE ACTIVACIÓN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Weingarten, Schurgin, Gagnebin & Hayes

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

DIRECCIÓN: Ten Post Office Square

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Boston

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: MA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CP: 02109

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Ordenador compatible IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: PatentIn Release n° 1.0, Versión n° 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/918,370

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 23-JUL-1992

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/866,728

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 10-ABR-1992

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Heine, Holliday C.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 34.346

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/SUMARIO: DFCI-241BX

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (617) 542-2290

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (617) 451-0313

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TÉLEX: 940675

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA Nº ID SEC: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: N° ID SEC: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Gly Leu Asp Val Pro Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA Nº ID SEC: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Gly Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA Nº ID SEC: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA Nº ID SEC: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA Nº ID SEC: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: N° ID SEC: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg Arg Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA Nº ID SEC: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA N° ID SEC: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Asn Gly Ser Pro Arg Thr Pro Arg Arg Gly Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA Nº ID SEC: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Phe Thr Phe Ser Pro Gly Gln Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA N° ID SEC: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Leu Ala Arg Asp Ile Met Arg Asp Ser Asn Tyr Ile Ser Lys}

\sac{Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA Nº ID SEC: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: N° ID SEC: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Leu Ala Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys}

\sac{Gly Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA Nº ID SEC: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: N° ID SEC: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Leu Ala Arg Leu Ile Glu Asp Asn Glu Tyr Thr Ala Arg Gln}

\sac{Gly}

Claims (27)

1. Un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a una de las dos isoformas de una proteína fosforilada de forma reversible y no se une a la otra isoforma de dicha proteína ni a proteínas distintas de ella, comprendiendo dicho método los pasos de: a) proporcionar un péptido de al menos tres aminoácidos que comprende un sitio de fosforilación reversible de dicha proteína, estando un aminoácido fosforilable de dicho sitio de fosforilación reversible en el estado de fosforilación de una de las dos isoformas de dicha proteína; b) cultivar anticuerpos contra dicho péptido; c) aislar una población de anticuerpos reactivos con dicho péptido; d) cribado de dicha población para encontrar los anticuerpos que no reaccionen con dicho péptido, en donde dicho paso incluye en paso de poner en contacto dicha población con dicho péptido que se encuentra en el estado de fosforilación de la otra isoforma de dicha proteína para eliminar los anticuerpos de dicha población que se unen a dicho péptido en dicha otra isoforma; y e) recoger los anticuerpos no eliminados de dicha población en el paso (d).

2. Un método según la Reivindicación 1, en donde dicho paso de cribado incluye además el paso de poner en contacto dicha población con el aminoácido de dicho sitio de fosforilación, para eliminar de dicha población los anticuerpos no específicos del sitio.

3. Un método según la Reivindicación 1, en donde dicho paso de recogida incluye el paso de poner en contacto dicha población con dicho péptido que tiene la misma isoforma que la proteína para la cual es específico el anticuerpo deseado.

4. Un método para producir un anticuerpo deseado que se une específicamente a una de las dos isoformas de una proteína fosforilada de forma reversible y no se une a la otra isoforma de dicha proteína ni a proteínas distintas de ella, comprendiendo dicho método los pasos de: proporcionar un péptido de al menos tres aminoácidos formado básicamente por un sitio de fosforilación reversible de dicha proteína, estando un aminoácido fosforilable de dicho sitio de fosforilación reversible en el estado de fosforilación de una de las dos isoformas de dicha proteína; cultivar anticuerpos contra dicho péptido; aislar una población de anticuerpos reactivos con dicho péptido; cribar dichos anticuerpos contra un primer péptido que se encuentra en estado de fosforilación de una isoforma de la proteína y contra un segundo péptido que se encuentra en el estado de fosforilación de la otra isoforma de la proteína; y aislar el anticuerpo deseado resultante de dicho cribado.

5. Un método para producir un anticuerpo deseado que se une específicamente a una de las dos isoformas de una proteína fosforilada de forma reversible y no se une a la otra isoforma de dicha proteína ni a proteínas distintas de ella, comprendiendo dicho método los pasos de (a) proporcionar un péptido de al menos tres aminoácidos que comprende un sitio de fosforilación reversible de dicha proteína, estando un aminoácido fosforilable de dicho sitio de fosforilación reversible en el estado de fosforilación de una de las dos isoformas de dicha proteína; (b) cultivar anticuerpos contra dicho péptido; (c) aislar una población de clones de hibridoma produciendo anticuerpos que reaccionen con dicho péptido; (d) cribado de dicha población para detectar anticuerpos que no reaccionen con un segundo péptido que se encuentra en el estado de fosforilación de la otra isoforma de dicha proteína; (e) aislar los clones de hibridoma produciendo el anticuerpo deseado; y (f) recoger el anticuerpo deseado resultante de la realización de dicho cribado.

6. Un método según las Reivindicaciones 1, 4 ó 5, en donde dichas dos isoformas representan formas funcionalmente divergentes de dicha proteína.

7. Un método según las Reivindicaciones 1, 4 ó 5, en donde dichas dos isoformas representan formas activas e inactivas de dicha proteína.

8. Un método según la Reivindicación 7, en donde dicha proteína está activa en el estado fosforilado.

9. Un método según la Reivindicación 7, en donde dicha proteína está inactiva en el estado fosforilado.

10. Un método según las Reivindicaciones 1, 4 ó 5, en donde la proteína se fosforila en un residuo tirosina.

11. Un método según las Reivindicaciones 1, 4 ó 5, en donde la proteína se fosforila en un residuo de serina y/o treonina.

12. Un método según las Reivindicaciones 1, 4, ó 5, en donde la proteína es una tirosina quinasa.

13. Un método según las Reivindicaciones 1, 4, ó 5, en donde la proteína es una serina o treonina quinasa.

14. Un método según las Reivindicaciones 1, 4, ó 5, en donde la proteína es un receptor.

15. Un método según la Reivindicación 14, en donde dicho receptor es un receptor de hormonas.

16. Un método según la Reivindicación 14, en donde dicho receptor es un receptor del factor de crecimiento.

17. Un método según la Reivindicación 14, en donde dicho receptor es el receptor c-erbB-2.

18. Un método según la Reivindicación 1, que incluye adicionalmente el paso de ensayar los anticuerpos recogidos en el paso (e) para verificar que los anticuerpos se unen específicamente a una de las dos isoformas de dicha proteína fosforilada de forma reversible y no a la otra isoforma de dicha proteína o a otras proteínas distintas de ella.

19. Un método según la Reivindicación 18, en donde dicho paso de ensayo comprende hacer reaccionar dichos anticuerpos con un lisato de célula completa.

20. Un anticuerpo que se une específicamente a un sitio de fosforilación reversible en tirosina de una proteína fosforilada de forma reversible en su isoforma fosforilada y no se une a la isoforma no fosforilada de dicha proteína, ni a otras proteínas que no sean dicha proteína.

21. Un anticuerpo que se une específicamente a un sitio de fosforilación reversible en tirosina de una proteína fosforilada de forma reversible en su isoforma no fosforilada y no se une a la isoforma fosforilada de dicha proteína, ni a otras proteínas que no sean dicha proteína.

22. Un anticuerpo que se une específicamente a un sitio de fosforilación reversible del receptor c-erbB-2 en su forma activa y no se une a la forma inactiva de dicho receptor c-erbB-2, ni a proteínas distintas de dicho receptor c-erbB-2.

23. Un método para usar en el cribado del potencial metastásico de tumores en pacientes con carcinoma de mama de ganglios negativos, comprendiendo dicho método los pasos de: hacer reaccionar un anticuerpo según la Reivindicación 22 con tejido tumoral procedente de dicho paciente; y detectar el alcance de la unión de dicho anticuerpo a dicho tejido, proporcionando el grado de unión detectado de dicho anticuerpo una correlación con el potencial metastásico.

24. Un conjunto para su uso en la identificación del estado de activación de una proteína fosforilada de forma reversible en una muestra determinando si dicha proteína se encuentra en su isoforma activa o inactiva, comprendiendo dicho juego los componentes necesarios para la extracción de dicha muestra, y los componentes necesarios para su uso en un ensayo de unión, comprendiendo los componentes de dicho ensayo de unión el anticuerpo según las Reivindicaciones 20, 21 ó 22.

25. Un conjunto según la Reivindicación 24, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

26. Un conjunto según las Reivindicaciones 24 ó 25, en donde dichos componentes necesarios para su uso en un ensayo de unión comprenden además un segundo anticuerpo indicador vinculado a un reactivo indicador.

27. Un conjunto según la Reivindicación 26, en donde dicho reactivo indicador se selecciona de reactivos fluorescentes, colorimétricos, inmunoperoxidasa e isotópicos.