KR101658245B1 - 개선된 세포 분석용 방법 및 장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 실시예들은 세포, 응집된 세포, 또는 고형 종양을 분석하기 위한 개선된 방법 및 장치에 관한 것이다. 그러한 방법 및 장치는 예를 들어 병리학 분야에 유용하고, 개선된 세포 처리 및 분석 결과를 제공할 수 있다.
Description
본 발명의 실시예들은 세포, 응집된 세포, 또는 고형 종양을 분석하기 위한 개선된 방법 및 장치에 관한 것이다. 그러한 방법 및 장치는 예를 들어 병리학 분야에 유용하고, 개선된 세포 처리 및 분석 결과를 제공할 수 있다.
종래의 병리학적 샘플은 대부분 세포를 사멸시키거나 긴 샘플 처리 시간을 수반하는 방법을 사용하여 처리되었다. 그러한 방법은 일반적으로 환자 진료 지점으로부터 상당히 멀리 떨어진 실험실에서 수행되었다. 이들 종래의 방법은 동적인, 생-세포 관련 바이오마커를 포함한 생세포의 검사를 가능하게 하지 못하고, 환자 진료 지점에서의 신속한 샘플 처리 또는 분석 결과 생성을 가능하게 하지 못한다. 이러한 완전하면서도 신속하게 획득되는 정보의 결여는 의사가 적절한 치료 계획을 확인하지 못하도록 하거나 적어도 처리를 지연시킬 수 있으며, 이는 환자의 삶의 질에 불리한 영향을 미친다. 몇몇 개선된 실시예들에 대한 종래의 처리의 비교가 도 9에 도시된다.
예를 들어, 암 전문의는 진료의 기준으로 특징지어지는 약물과, 특정 암에 활용되는 라벨을 갖지 않지만 그 암에서의 효능의 증거가 있는 다수의 약물의 상이한 조합을 비롯한 그들에게 이용가능한 다수의 치료 옵션을 갖는다. 우수한 치료 결과의 최고의 가능성을 위해서는, 환자에게 최적의 이용가능한 암 치료가 배정되어야 하고, 이 배정이 진단에 이어 최대한 신속하게 이루어져야 하는 것이 요구된다.
몇몇 암은 게놈 마커를 사용하여 쉽게 식별될 수 있지만, 신뢰성 있는 게놈 마커가 모든 암에 대해 이용가능하지 않으며, 이는 하나 또는 (전형적으로) 많은 정상 유전자의 비정상적 발현을 보이는 것으로 더욱 잘 특징지어질 수 있다. 특정 유형의 암을 진단하고 유전자 발현에 기초하여 상이한 치료 계획의 가능한 유효성을 평가하기 위한 현재 이용가능한 진단 테스트는 하나 이상의 단점을 가질 수 있으며, 예를 들어: (1) 테스트는 혈액 테스트를 위해 계획될 수 있고 쉽게 고형 종양 테스트에 맞게 구성되지 못하며; (2) 세포의 탈응집을 비롯한 고형 종양 샘플을 위한 샘플 준비 방법이 생세포 취급 또는 마커 발현의 후속 측정 수행에 부적합할 수 있고; (3) 예컨대 세침 생검을 사용하여 얻어진 작은 샘플은 완전한 분석에 충분한 조직을 제공할 수 없으며; (4) 테스트는 세포의 체외 배양, 장기간의 배양 주기, 및/또는 테스트 세포가 환자로부터 획득되는 시점과 세포가 테스트되는 시점 사이의 상당한 지연을 필요로 할 수 있어, 마커 발현에 대한 광범위한 변동 및 외부 영향의 가능성을 초래하고; (5) 테스트는 다수의 유전자, 인단백질 또는 다른 마커의 발현을 동시에 측정하기에 부적합할 수 있으며, 이는 발현을 비정상적인 것으로 인지 및 특징짓는데 매우 중요할 수 있으며; (6) 테스트는 상대적 유전자 발현 레벨과 대조적으로 단백질의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 원칙적으로 면역조직화학에 의존하는 비-정량적일 수 있고; (7) 시약 및 세포 취급 조건은 엄격하게 제어되지 않아, 테스트 간에 그리고 실험실 간에 고도의 변동성을 초래하며; (8) 테스트는 RNA의 불안정성 및 환자로부터 충분히 신선한 샘플을 얻는 것의 실제적 어려움으로 인해, RNA 레벨 분석에 부적합할 수 있고; (9) 테스트는 예컨대 선택된 시약의 존재 또는 부재 하에서, 임의의 유전자 발현 분석이 수행될 수 있기 전에 세포의 고정을 수반할 수 있다.
최근에, 몇몇 그룹이 마이크로어레이 유전자 발현 분석에 의한 다양한 암 유형의 분류에 관한 연구를 발표하였다[예컨대, 골럽(Golub) 등의 Science 286:531-537(1999); 바타카르예(Bhattacharjae) 등의 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98:13790-13795(2001); 첸-시앙(Chen-Hsiang) 등의 Bioinformatics 17(Suppl. 1):S316-S322(2001); 라마스와미(Ramaswamy) 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1514915154(2001) 참조]. 유전자 발현 패턴에 기초한 인간 유방암의 몇몇 분류가 또한 보고되었다[마틴(Martin) 등의 Cancer Res. 60:2232-2238(2000); 웨스트(West) 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:11462-11467(2001); 솔리(Sorlie) 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1086910874(2001); 얀(Yan) 등의 Cancer Res. 61:8375-8380(2001)]. 그러나, 이들 연구는 주로 유방암을 비롯한 다양한 유형의 암의 이미 확립되어 있는 분류를 개선 및 개량하는 것에 집중하며, 일반적으로 상이하게 발현된 유전자의 관계에 대한 새로운 식견을 제공하지 못한다. 이들 연구는 암 요법의 임상 결과를 개선시키기 위해 연구 결과를 치료 계획과 연결시키지 못하며, 그것들은 기존의 세포 취급 및 분석 기술을 개선 및 표준화시키는 문제를 해소하지 못한다.
현대의 분자 생물학 및 생화학이 종양 세포의 거동, 그것들의 분화 상태, 및 다소의 예외를 갖고서 몇몇 치료 약물에 대한 그것들의 민감성 또는 내성에 영향을 미치는 활성도를 갖는 100개 초과의 유전자를 밝혀내었지만, 이들 유전자의 상태가 정기적으로 약물 치료에 대한 임상적 결정을 내리는데 활용되지 못하고 있다. 한가지 주목할만한 예외는 환자에게 타목시펜과 같은 항-에스트로겐 약물에 의한 치료를 제공하도록 유방 암종에서의 에스트로겐 수용체(ER) 단백질 발현의 사용이다. 다른 예외적인 예는 환자에게 Her2 길항제 약물 허셉틴(Herceptin)®[캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨텍(Genentech)]을 제공하도록 유방 암종에서의 ErbB2(Her2) 단백질 발현의 사용이다. 그러나, 대부분의 암에 대해서, 유전자 발현에서의 병리는 더욱 미묘할 수 있고, 특정 자극에 응하여 다수의 유전자 발현의 패턴 또는 유전자 발현을 포함할 수 있다.
병원적으로 상이한 종양 유형에 특이한 치료 계획을 표적화시키기 위한, 그리고 결과를 최적화시키기 위해 최대한 조기에 최적의 치료를 식별하기 위한 암 치료의 도전이 여전히 남는다. 따라서, 다양한 치료 옵션에 대한 환자 반응에 관한 예후적 및/또는 예측적 정보를 동시에 제공하는 테스트에 대한 필요성이 존재한다.
고형 종양 생검물 또는 달리 응집된 세포를 준비하기 위한 장치 및 방법으로서, 이들 단점을 해소하고, 샘플이 생존력을 상실하거나 체외 복제를 통해 배양되기 전에 동일한 조직 샘플로부터 상이한 바이오마커 반응의 자극 및/또는 보존을 가능하게 하기 위해, 조직 샘플의 생존율을 유지시키는 제어된, 일관된 및 효율적인 단계를 사용하여 조직 샘플을 취급 및 준비하는 기능을 단일의 작고 콤팩트한 기구 내에 통합시키는 장치 및 방법에 대한 필요성이 있다.
본 발명의 실시예들은 대상물로부터 응집된 세포의 생 조직 샘플을 처리 또는 준비하기 위한 방법에 관한 것이다. 이들 방법은, 대상물로부터 얻은 응집된 생세포를 함유한 수용액을 탈응집시켜 제1 격리된 챔버 내에 적어도 하나의 테스트 분취물로 분산시키는 단계; 오염 세포를 제거함으로써 다른 오염 세포 유형에 대한 표적 세포의 백분율을 증가시키기 위해 분취물을 선택적으로 정제하는 단계; 선택적으로 정제된 생세포를 분석을 위해 하나 이상의 제2 격리된 챔버 내로 분배하는 단계; 및 분배된 세포의 세포 및/또는 분자 분석을 가능하게 하기 위해 분배된 세포를 안정화시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 몇몇 실시예들에서 고형 종양으로부터 암 세포를 처리 또는 준비하기 위한 방법에 관한 것이며, 이 방법은, 고형 종양으로부터 얻은 생 암세포를 탈응집시켜 적어도 하나의 제1 격리된 챔버 내에 적어도 하나의 테스트 분취물로 분산시키는 단계; 오염물질을 제거함으로써 생 암세포를 선택적으로 정제하는 단계; 생 암세포를 분석을 위해 하나 이상의 제2 격리된 챔버 내로 분배하는 단계; 및 분배된 세포의 세포 및/또는 분자 분석을 가능하게 하기 위해 분배된 세포를 안정화시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 몇몇 실시예들은 세포 처리를 위한 카트리지에 관한 것이다. 예를 들어, 생 암세포를 처리 또는 준비하는데 사용되는 카트리지는 복수의 멸균 분리 용기(sterile compartment)를 구비하고, 이 분리 용기는 서로로부터 분리될 수 있다. 다른 실시예들은 또한 세포를 분산시키기 위한 분리 용기, 세포를 정제하기 위한 분리 용기, 및 격리된 챔버인 분리 용기를 포함하는 복수의 분리 용기를 구비하는 카트리지에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 카트리지와 분석 장치를 포함하는 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 카트리지를 포함하는 키트도 또한 본 명세서에 포함된다.
도 1은 본 발명의 카트리지의 예시적인 실시예를 도시한다.
도 2는 샘플을 수용 및 취급하기 위한 카트리지 내의 예시적인 격리된 챔버들을 도시한다.
도 3은 본 발명에 따른 예시적인 탈응집 공정을 도시한다.
도 4는 본 발명의 카트리지의 추가적 실시예를 도시한다.
도 5는 본 발명의 카트리지 상에 위치될 수 있는 유리 슬라이드 홀더의 예시적인 실시예의 단면도 및 평면도를 도시한다.
도 6은 예시적인 특징부를 도시한 본 발명의 카트리지의 추가적 실시예를 도시한다.
도 7은 카트리지의 분리 용기들 중 몇몇이 서로로부터 분리될 수 있는 본 발명의 카트리지의 실시예의 예시적인 도면을 도시한다.
도 8은 예시적인 특징부를 도시한 본 발명의 카트리지의 추가적 실시예를 도시한다.
도 9는 종래의 병리학 샘플 처리 방법(좌측)과 본 발명의 예시적인 처리 방법(우측)과의 비교를 도시한다.
도 10은 본 발명의 방법이 포르말린 고정 파라핀 포매된 공정보다 큰 RNA 완전성 수(RIN)를 갖는 RNA 샘플을 산출하는 것을 도시한다.
도 11은 종래의 종양 샘플 처리 방법이 바이오마커를 손상시킬 수 있어 이용가능한 세포 정보를 감소시킬 수 있는 것을 도시한 도해를 제공한다.
도 12는 세침 흡인(FNA)을 사용한 추출로부터 시작되는 본 발명의 예시적인 처리 방법을 도시한다.
도 13은 변화하는 세포 수에서 HCT-116 세포의 RIN 스코어를 (a)에, 생성된 RNA의 ㎍을 (b)에, 및 260/280 값을 (c)에 도시한다.
도 14는 변화하는 세포 수에서 MCF-7 세포의 RIN 스코어를 (a)에, 생성된 RNA의 ㎍을 (b)에, 및 260/280 값을 (c)에 도시한다.
도 15는 MCF-7 및 HCT-116 세포의 클러스터 크기에 대한 변화하는 다인/㎠에서의 분산의 영향을 도시한다.
도 16은 MCF-7 및 HCT-116 세포의 세포 생존율에 대한 변화하는 다인/㎠에서의 분산의 영향을 도시한다.
도 17은 MCF-7 세포에서 분산 및 EGF 자극으로부터의 FOS 유도의 변화하는 레벨을 도시한다.
도 18은 HCT-116 세포에서 분산 및 EGF 자극으로부터의 FOS 유도의 변화하는 레벨을 도시한다.
도 19는 본 발명의 방법을 사용한 MCF-7 및 HCT-116 세포에서의 종양 세포 부화를 도시한다.
도 20은 본 방법을 사용하여 준비된 MCF-7 세포 대 3시간 포르말린 고정 절차를 사용하여 준비된 그것에 생세포 프로우브를 사용한 결과를 도시한다.
도 21은 본 방법을 사용하여 준비된 HCT-116 세포 대 3시간 포르말린 고정 절차를 사용하여 준비된 그것에 생세포 프로우브를 사용한 결과를 도시한다.
도 22는 본 명세서에 기재된 탈응집 기술을 사용한 MCF-7 및 HCT-116 세포의 예시적인 분산을 도시한다.
도 2는 샘플을 수용 및 취급하기 위한 카트리지 내의 예시적인 격리된 챔버들을 도시한다.
도 3은 본 발명에 따른 예시적인 탈응집 공정을 도시한다.
도 4는 본 발명의 카트리지의 추가적 실시예를 도시한다.
도 5는 본 발명의 카트리지 상에 위치될 수 있는 유리 슬라이드 홀더의 예시적인 실시예의 단면도 및 평면도를 도시한다.
도 6은 예시적인 특징부를 도시한 본 발명의 카트리지의 추가적 실시예를 도시한다.
도 7은 카트리지의 분리 용기들 중 몇몇이 서로로부터 분리될 수 있는 본 발명의 카트리지의 실시예의 예시적인 도면을 도시한다.
도 8은 예시적인 특징부를 도시한 본 발명의 카트리지의 추가적 실시예를 도시한다.
도 9는 종래의 병리학 샘플 처리 방법(좌측)과 본 발명의 예시적인 처리 방법(우측)과의 비교를 도시한다.
도 10은 본 발명의 방법이 포르말린 고정 파라핀 포매된 공정보다 큰 RNA 완전성 수(RIN)를 갖는 RNA 샘플을 산출하는 것을 도시한다.
도 11은 종래의 종양 샘플 처리 방법이 바이오마커를 손상시킬 수 있어 이용가능한 세포 정보를 감소시킬 수 있는 것을 도시한 도해를 제공한다.
도 12는 세침 흡인(FNA)을 사용한 추출로부터 시작되는 본 발명의 예시적인 처리 방법을 도시한다.
도 13은 변화하는 세포 수에서 HCT-116 세포의 RIN 스코어를 (a)에, 생성된 RNA의 ㎍을 (b)에, 및 260/280 값을 (c)에 도시한다.
도 14는 변화하는 세포 수에서 MCF-7 세포의 RIN 스코어를 (a)에, 생성된 RNA의 ㎍을 (b)에, 및 260/280 값을 (c)에 도시한다.
도 15는 MCF-7 및 HCT-116 세포의 클러스터 크기에 대한 변화하는 다인/㎠에서의 분산의 영향을 도시한다.
도 16은 MCF-7 및 HCT-116 세포의 세포 생존율에 대한 변화하는 다인/㎠에서의 분산의 영향을 도시한다.
도 17은 MCF-7 세포에서 분산 및 EGF 자극으로부터의 FOS 유도의 변화하는 레벨을 도시한다.
도 18은 HCT-116 세포에서 분산 및 EGF 자극으로부터의 FOS 유도의 변화하는 레벨을 도시한다.
도 19는 본 발명의 방법을 사용한 MCF-7 및 HCT-116 세포에서의 종양 세포 부화를 도시한다.
도 20은 본 방법을 사용하여 준비된 MCF-7 세포 대 3시간 포르말린 고정 절차를 사용하여 준비된 그것에 생세포 프로우브를 사용한 결과를 도시한다.
도 21은 본 방법을 사용하여 준비된 HCT-116 세포 대 3시간 포르말린 고정 절차를 사용하여 준비된 그것에 생세포 프로우브를 사용한 결과를 도시한다.
도 22는 본 명세서에 기재된 탈응집 기술을 사용한 MCF-7 및 HCT-116 세포의 예시적인 분산을 도시한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 실시예는 표적 치료 및 분자 생물학 검사의 발전 및 사용을 촉진시키는 자동화된, 완비된 유체 종양 세포 처리 및 테스트 시스템을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 또한 체외에서 생세포에 수행될 수 있는 개선된 병리학적 처리 방법을 비롯한, 시스템을 사용하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 시스템 및 방법과 함께 사용되는 키트에 관한 것이다.
본 발명은 체외에서 고형 세포 검체의 수집, 취급 및 처리를 위한 안전한, 효과적인, 정확한, 정밀한, 재생가능한, 저렴한, 비용 효율적인, 효율적인, 신속한 및 편리한 방법과 "카트리지-기반" 시스템을 제공한다. 이들 방법 및 카트리지는 바이오마커 완전성을 유지시키기 위해 공정 중 샘플의 생존율을 유지시킬 수 있고, 그리고 선택적으로 원 샘플에 존재하지 않는 인단백질 및 RNA와 같은 바이오마커를 체외 자극을 통해 유발시킬 수 있다. 본 발명은 완전한 진단 세포학 실험실 시스템과 생검에 부합하는 제어된 조건에서 완전 통합된 검체 및 정보 관리를 제공하며, 이는 테스트 사이의 변동성을 최소화시키고, 생체오염의 위험성을 최소화시키며, 바이오마커 발현에 대한 샘플 준비 공정 자체의 효과를 최소화시킨다. 본 발명의 실시예들은 종양의 표적 치료를 용이하게 하도록 사용될 수 있고, 선택적으로 세포-계수 기능 및/또는 다른 관계된 분석과 같은 조직 샘플 적합성 평가를 또한 제공한다.
도 9에 도시된 바와 같이, 종래의 세포 처리 기술은 조직 처리 전에 포르말린 고정을 사용할 수 있고, 궁극적으로 세포를 파라핀 내에 포매시킬 수 있다. 이는 많은 잠재적 세포 정보가 도 11에 도시된 바와 같이 "상실"되는 결과를 유발한다. 그러나, 본 명세서에 기재되고 예를 들어 도 9 및 도 12에 도시된 개선된 방법은 생세포의 자동화된 처리, 이들 세포의 자극, 및 그에 따른 후술되는 방법을 사용한 세포의 분석을 가능하게 한다.
당업자라면 인식할 바와 같이, 이들 새로운 장치, 시스템, 키트 및 방법은 임상 또는 연구 세팅에서 다수의 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 그것들은 검체를 멀리 떨어진 실험실로 보낼 필요 없이 즉각적인, 환자 근접한 생검 처리를 제공하도록 사용될 수 있다. 그것들은 또한 생검 처리를 비용 효율적인 방식으로 표준화 및 자동화시키도록 사용될 수 있다. 본 발명은 세포에 관해서 현재의 병리학적 과정이 가능하게 하는 것보다 더욱 상세한 분자 정보를 제공할 수 있으며, 이는 선택적으로 새로운 체외 바이오마커 및 진단 테스트를 사용하여, 생검시(예컨대, 암 세포) 세포의 더욱 큰 세분류를 가능하게 한다. 종합하면, 본 발명의 이점은 환자 진료 지점에서의 신속한 진단과 후속하는 보다 효과적인 환자 맞춤형 치료 계획의 생성을 가능하게 한다.
아래에 더욱 상세히 기술되는 장치, 시스템, 및 방법을 사용하기 위한 예시적인, 비-제한적인 공정이 도 12에 순서도로 도시된다. 이 공정은 도 12에 도시된 세침 흡인(Fine Needle Aspiration: FNA) 단계(1201)와 같은 응집된 세포의 샘플을 획득함으로써 시작될 수 있다. 샘플은 이어서 본 명세서에 기재된 새로운 기술을 사용하여 탈응집된 다음에, 격리된 챔버 내로 분산된다(1203). 만약 샘플이 관심 대상 세포와 다른 세포의 혼합물을 함유하면, 샘플은 관심 대상이 아닌 세포와 오염물질을 제거함으로써 샘플 내의 관심 대상 세포의 수를 부화시키도록(1205) 선택적으로 정제될 수 있다. 샘플은 이어서 선택적으로 체외에서 자극되거나(1207) 또는 달리 테스트 시약과 혼합될 수 있으며, 이어서 분취물(aliquot)들이 새로운 격리된 챔버 내에 배치된다(1209). 분취물은 또한 선택적으로 수행 중인 분석에 따라 체외에서 자극되거나 또는 달리 테스트 시약과 혼합될 수 있다. 분취물은 이어서 관심 대상 특성에 대해 분석된다. 예를 들어, 현미경 분석을 위해 분취물로부터 슬라이드가 준비될 수 있거나(1211), 또는 분취물은 그것들의 세포가 용해되어 각각 핵산, RNA 및 DNA가 분석될 수 있다(1213, 1215). 분석의 결과는 이어서 예를 들어 그로부터 FNA가 취해졌던 환자에 대한 치료 계획의 세팅과 같은 적절한 조치를 취할 수 있는 연구자 또는 임상의에게 전달된다. 또한, 도 11에 도시된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 개선된 방법 및 장치는 연구자 또는 임상의가 종래의 병리학적 세포 처리 기술 중에 "상실"되는 새로운 정보에 접근하도록 할 수 있다.
Ⅰ. 장치, 시스템, 및
키트
A. 장치
다른 실시예에서, 본 발명은 예컨대 본 명세서에 기재된 생세포 처리 및/또는 준비 방법에 유용한 장치 또는 플랫폼을 제공한다. 이 장치는 또한 카트리지로 지칭된다. 본 발명의 장치의 몇몇 실시예들이 아래에 더욱 상세히 기재되고 도 1 내지 도 8에 도시된다.
그러한 카트리지는 하나 이상의 격리된 챔버를 포함할 수 있다. 격리된 챔버는 임의의 분리 용기, 섹션, 또는 생세포의 샘플 또는 고정된, 처리된, 및/또는 안정화된 세포의 샘플을 유지시킬 수 있는 다른 실용적 홀더이다. 예를 들어, 용어 격리된 챔버는 웰(well), 바이알, 관, 슬라이드(예컨대, 유리), 및 플레이트를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 격리된 챔버 또는 분리 용기는 다음의 기능 중 하나, 일부 또는 전부에 적합하다: (1) 격벽 또는 다른 밀봉된 챔버를 통한 생물학적 검체의 수용; (2) 포함된 및 고정된 주사기 바늘 보관; (3) 격벽을 통한 제거에 이용가능한 액체 시약 보관; (4) 격벽을 통한 폐기물 수용 및 보관; (5) 액체 전단 및 기계적 전단을 통한 샘플 분열; (6) 세포 계수 및 세포 가시화; (7) 비드(bead) 기반 분리; 및 (8) 고형 수지 함유.
각각의 카트리지는 그것의 용도에 따라 하나 이상의 격리된 챔버를 포함할 수 있다. 예를 들어, 카트리지는 1개 내지 약 200개의 격리된 챔버, 약 1개 내지 100개의 격리된 챔버, 또는 약 1개 내지 50개의 격리된 챔버를 구비할 수 있다. 몇몇 실시예들은 약 24개, 약 48개, 또는 약 96개의 격리된 챔버를 구비한다.
몇몇 실시예들에서, 카트리지는 하나 이상의 제1 격리된 챔버와 하나 이상의 제2 격리된 챔버를 구비한다. 카트리지는 세포의 샘플을 유지시키기 위해 제1 격리된 챔버를 구비할 수 있다. 그러한 카트리지는 또한 세포 샘플의 분산된 분취물을 유지시키는 하나 이상의 제2 격리된 챔버를 특징으로 할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 제2 격리된 챔버는 세포의 분산된 분취물이 첨가되기 전에 챔버에 소정량의 테스트 시약을 함유할 수 있다. 도 2는 샘플의 수용 및 취급을 위해 존재할 수 있는 예시적인 격리된 챔버를 도시한다.
일 실시예에서, 본 발명은 서로로부터 분리될 수 있는 분리 용기(예컨대, 격리된 챔버)를 구비하는 카트리지를 제공한다. 도 7에 도시된 바와 같이, 분리 용기는 분리될 수 있고, 내부의 샘플은 상이한 분석 테스트에 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 분리 용기는 DNA 분석을 위해 보내어질 수 있고, 다른 것은 RNA 분석을 위해 보내어질 수 있으며, 다른 것은 현미경 분석을 위해 보내어질 수 있고, 다른 것은 면역조직화학적 분석을 위해 보내어질 수 있다. 예를 들어, 카트리지 상의 제2 격리된 챔버는 몇몇 실시예들에서 제1 격리된 챔버로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 장치는 카트리지의 온도를 원하는 온도로, 예를 들어 약 30℃ 내지 40℃로, 약 36℃ 내지 약 38℃로, 또는 임의의 다른 원하는 온도로 유지시키기 위해 가열 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 장치는 장치 내에서 카트리지 및/또는 세포의 샘플의 공급원을 식별하는 바코드 또는 다른 수단을 포함할 수 있다. 카트리지를 식별하는 바코드 또는 다른 수단은 검체 식별 및/또는 환자 안전을 용이하게 하도록 사용될 수 있다. 그러한 식별 수단은 컴퓨터 기반 데이터 저장 시스템, 자동화된 세포 처리 시스템 및/또는 분석물, 및 개인 휴대 정보 단말기와 상호 작용할 수 있다. 바코드를 구비한 카트리지의 예시적인 실시예가 도 4에 도시된다.
본 장치의 몇몇 실시예들은 예를 들어 도 2의 F에 도시된 바와 같이 세포 계수 메커니즘을 포함할 수 있다. 이들 메커니즘은 자동화된 시스템 또는 수동 시스템일 수 있다. 예를 들어, 세포 계수 메커니즘은 혈구계 또는 Cellometer®[넥스셀롬 바이오사이언시즈 엘엘씨(Nexcelom Biosciences, LLC)로부터 구입 가능함]와 잠재적 디지털 또는 광학 기반 계수기일 수 있다. 당업자라면 인식할 바와 같이, 다른 세포 계수 방법이 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 발명과 함께 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 임의의 실시예의 카트리지는 수지, 시약, 용매, 및 다른 물질을 함유한 하나 이상의 모듈 또는 격리된 챔버를 구비할 수 있다. 모듈은 특정 목적을 위해 사용되는 단일의 격리된 챔버 또는 일군의 복수의 격리된 챔버일 수 있다. 예를 들어, 다수의 조작(예컨대, 용해 및 염색)이 특정 테스트를 위해 수반되는 경우에, 하나 초과의 격리된 챔버가 그 시험 "모듈"의 일부분으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 격리된 챔버는 핵산, 단백질, 천연 또는 합성 폴리머 또는 저분자가 부착된 수지를 함유할 수 있다. 하나 이상의 격리된 챔버는 액체, 예컨대 완충액, 분자 생물학 효소, 핵산 또는 단백질을 비롯한 생물학적 분자, 또는 저분자 화학물질을 함유할 수 있다. 하나 이상의 격리된 챔버는 온-카트리지(on-cartridge) 가용화를 위한 건성 시약을 함유할 수 있으며, 예컨대 여기에서 건성 시약은 핵산, 단백질, 천연 또는 합성 폴리머 또는 저분자를 포함할 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 카메라 또는 다른 디지털 이미지형성 장치가 카트리지의 일부분이거나 또는 카트리지와 함께 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 임의의 실시예의 카트리지는 10 내지 500 마이크로리터 체적의 샘플에 대한 세포 가시화 및 디지털 이미지 기반 세포 계수(도 2의 F 참조)를 가능하게 하는 이미지형성 모듈을 포함할 수 있으며, 상기 체적은 정변위에 의해 또는 모세관 작용에 의해 이미지형성 세포 내로 분배된다. 이미지형성 장치는 또한 샘플, 예컨대 단백질 국부화 데이터와 같은 샘플 내의 세포 성분의 사진을 촬영하도록 사용될 수 있다.
본 발명의 임의의 실시예의 카트리지는 10 내지 1000 마이크로리터 체적을 사용하여 100 내지 800 다인/㎠의 벽면 전단 응력을 생성시키기 위해 10 내지 500 ㎛의 직경을 갖는 마이크로통로를 통해 세포를 통과시키는 유체 모듈을 구비할 수 있다.
본 발명의 임의의 실시예의 카트리지는 면역소실 모듈 또는 격리된 챔버를 구비할 수 있다. 그러한 면역소실 모듈 또는 격리된 챔버는 자기 비드 또는 다른 방법을 사용할 수 있다. 예컨대 노르웨이 오슬로 소재의 다이날 바이오테크(Dynal Biotech)로부터 입수가능한 자기 비드 제품을 참조하라. 이들 실시예는 방법 단락에서 더욱 상세히 기술된다.
본 발명의 임의의 실시예의 카트리지는 예를 들어 세침 흡인 생검, 심부 생검, 타액, 혈액, 정액, 또는 질액과 같은 생물학적 체액 샘플, 유기체로부터 채취된 조직, 또는 세포 배양 샘플일 수 있는 생물학적 검체를 함유하거나 또는 그것을 함유하도록 구성되는 하나 이상의 모듈 또는 격리된 챔버를 구비할 수 있다. 그러한 모듈은 또한 제1 격리된 챔버로 지칭될 수 있고, 예를 들어 도 2의 A 및 도 4에 도시된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 예컨대 본 명세서에 기재된 방법 및 장치에 사용하기에 적합한 카트리지, 예를 들어 개별적인 및 완비된 모듈들을 구비하는 카트리지로서, 이 모듈들은 세포 취급에 적합한 배지를 함유하고 각각 격벽 또는 다른 밀봉 메커니즘에 의해 밀봉되며, 상기 격벽 또는 밀봉 메커니즘은 관, 예컨대 바늘에 의해 우회 또는 천공될 수 있고 관의 제거시 재밀봉될 수 있는 카트리지를 제공한다. 몇몇 실시예들에서는, 분석 장치가 분석 중 생체유해 오염물질을 제공하는 경우에, 카트리지 또는 카트리지를 둘러싸는 분석 장치 내외로의 모든 액체 시약, 생물학적 테스트 검체, 날카로운 물체(즉, 바늘) 등의 통합된 전달 및 제거를 가능하게 하기에 충분한 모듈 또는 격리된 챔버가 있다. 모듈은 세포 계수 또는 생존율 분석과 같은 특정 테스트 또는 활동을 수행하기 위한 관련 시약 및 장치와 함께 다수의 격리된 챔버를 포함할 수 있다. 위에 기재된 실시예들은 예를 들어 도 1, 도 2, 도 4, 도 6, 도 7, 및 도 8에 도시된다.
도 5의 501B에 도시된 바와 같이, 본 발명의 카트리지는 예를 들어 계단형 구성(501A)으로 적층되는 슬라이드를 구비할 수 있고, 이 계단형 구성은 슬라이드가 세포 물질을 수용하도록 효율적으로 사용되도록 하고 이어서 수동 또는 로봇식 수단에 의해 하나씩 접근 및 분리되도록 한다. 도 5는 계단형 구성(501A/B)을 도시한 단면도를 도시한다. 따라서, 다른 실시예에서, 본 발명은 계단형 구성으로 배치된 다수의 평면형 기질, 예컨대 유리 슬라이드를 포함한 홀더를 포함하는 장치를 제공하며, 이 홀더는 기질의 측방향 및 수직 움직임을 제한한다. 적합한 기질은 유리 슬라이드와 같은 평탄한 직사각형 단품, 금속 플레이트, 또는 마이크로유체 장치를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 기질은 0.1 내지 3 mm의 두께 및/또는 2-3 cm 폭 × 7-9 cm 길이의 치수를 가질 수 있다. 당업자라면 인식할 바와 같이, 다른 기질 또는 격리된 챔버가 카트리지 상에 유사한 방식으로 배치될 수 있고, 그러한 실시예들이 본 명세서에 포함된다.
몇몇 실시예들에서, 카트리지 상의 홀더는 하단 부분 및 리드 부분을 구비하며, 이때 각각의 부분은 홀더 내에서의 또는 홀더에 대한 개별 기질의 계단형 스택의 위치설정 및 움직임 방지를 위한 단차부(stair step)를 포함한다. 홀더 내에 보관될 때, 기질은 최-하단 부분이 스택을 넘어 돌출되는 원위 단부를 구비할 수 있다(도 5의 501B 참조). 이 원위 단부는 하나 이상의 인쇄된 특징부, 웰 또는 함몰부를 구비할 수 있다. 이들 인쇄된 특징부는 기질이 사용된 후에 또는 사용 전에 기질을 식별하기 위한 라벨일 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 홀더는 리드를 구비하고, 기질의 원위 단부는 리드의 격벽 또는 격벽들을 통해 접근하기 위해 노출된다. 홀더는 프레임, 예를 들어 SBS-적합 풋프린트(SBS-compatible footprint)를 갖는 프레임 내에 장착 및 탈착될 수 있다. 선택적으로, 홀더는 하단에 작은 홀 또는 복수의 홀들을 구비할 수 있다.
도 5는 예시적인 홀더의 평면도를 도시한다. 슬라이드의 스택은 시스템을 자동화된 또는 수동 사용에 이상적이도록 만드는 표준화된 열 및 컬럼 간격에 따라 위로부터 어드레스될 수 있다. 홀더는 각각의 기질 위의 위치에 독립적으로 어드레스하기 위해 각각의 기질 위에 격벽을 구비한 리드를 구비할 수 있다. 예를 들어, 홀더는 각각의 기질의 각각의 어드레스가능 위치 위에 O-링 또는 가스켓 밀봉가능 챔버를 구비할 수 있다. 이들 O-링 또는 가스켓 밀봉가능 챔버는 원하는 임의의 형상, 예를 들어 원형 또는 직사각형 또는 정사각형일 수 있다.
홀더 및 기질을 소정의 방식으로 위치시키는 것은 피펫, 주사기 바늘, 또는 핀툴(pintool)의 사용을 통한 1 나노리터 내지 0.5 밀리리터 범위의 체적의 유체 샘플의 기질로의 다중 전달을 가능하게 할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 홀더는 유체 전달 중 기질의 측방향 또는 수직 변위를 제한하고, 유체 전달 중 기질의 움직임을 제한한다. 다른 실시예들에서, 홀더는 기질의 수직 회전을 가능하게 하지만, 기질의 측방향 움직임을 제한한다. 이 유연성은 다양한 방법 및 시스템을 사용하여 각각의 격리된 챔버로의 자동화된 또는 수동 다중 유체 전달과 그것으로부터의 제거를 가능하게 할 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 홀더는 리브 부분이 제거된 상태로 분해될 수 있고, 하단 부분은 홀더의 하단 부분 내의 홀을 통해 돌출부를 위치시키는 스탠드 상에 장착될 수 있다. 기질은 사람 손 또는 로봇 파지 도구에 의한 순차적 파지를 위해 스탠드 돌출부 상에 있는 상태에서 특유하게 제공될 수 있다. 이는 각각의 샘플 상에서 침착된 샘플 위로의 기질의 스크레이핑(scraping)을 방지하여 슬라이드-기반 세포 물질의 안정된 수송을 가능하게 하기 위해, 예컨대 첫 번째로 하단 슬라이드를 분리시키고 마지막으로 상단 슬라이드를 분리시키는 것과 같은 기질의 순차적 분리를 가능하게 한다. 위에 기재된 홀더의 실시예들을 갖는 카트리지의 예시적인 분해도가 도 6 및 도 8에 개시된다.
유체 샘플은 자동화된 시스템으로 또는 수동으로 기질로 전달될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 유체 샘플은 소정의 순서로 기질로 순차적으로 전달된다. 적합한 유체 샘플은 용액, 에멀젼, 현탁액, 또는 폴리머-함유 혼합물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 유체 샘플은 생물학적 또는 화학적 물질, 예컨대 유기 또는 무기 저분자, 단백질, 핵산, 세포, 입자, 휘발성 및 비-휘발성 용매, 폴리머, 또는 고착제일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 실시예들에서, 본 발명은 본 발명의 카트리지에 유용한 웰 플레이트를 또한 제공한다. 현재, 플레이트가 비스듬히 또는 거꾸로 유지되는 경우에 구성요소(개방된 관, 밀봉된 관, 주사기, 피펫 팁 등)가 제 위치를 벗어나지 않도록 구성요소가 제 위치에 로킹되게 하는 웰 플레이트 기술에 대한 필요성이 존재한다. 또한, 웰 플레이트 기술은 심지어 피펫 도구 상에 팁 이젝터도 필요로 하지 않고서, 속박된(locked-in) 구성요소가 표준[직교(Cartesian)] 피펫 도구에 의해 분리되어 사용된 다음에 속박된 위치로 복귀되도록 한다. 몇몇 실시예들에서, 본 발명은 구성요소의 측방향 통과를 가능하게 하는 개재 공간에 의해 웰 플레이트 상의 두 인접한 위치("이중 웰"로 불리움)가 연결되도록 제조되는 다수의 웰을 구비한 평면형 표면을 포함하는 웰 플레이트에 관한 것이다.
구성요소는 개방된 관, 밀봉된 관, 격벽을 구비한 관, 투명한 관, 임의의 컨테이너, 주사기, 바늘, 블레이드, 또는 피펫 팁일 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 구성요소는 로킹 메커니즘을 통과하기에 적합한 두께의 정사각형, 원형, 또는 다른 형상의 강성 재료 단품을 포함하고, 속박(lock-in) 웰의 로킹 메커니즘의 형상에 합치된다.
이중-웰 플레이트의 몇몇 실시예들에서, 제1 인접 위치의 이중 웰("속박 웰"로 불리움)은, 구성요소가 제 위치에 로킹되도록 하고 움직임, 특히 플레이트가 상향을 향하고 있을 때 수직 방향으로의 구성요소의 후퇴를 저지하는 작은 탭을 포함한다. 이들 이중-웰 플레이트는 또한 구성요소가 속박 웰 내로 로킹될 때 부분적으로 압축되는 유연성 가스켓을 포함한 속박 웰을 구비할 수 있으며, 이 가스켓은 속박된 구성요소의 움직임을 방지한다.
몇몇 실시예들에서, 구성요소는 도구(예컨대, 피펫터 또는 주사기)에 의해 어드레스가능한 "피팅"을 포함하며, 이 피팅[예컨대, 루어 록(luer lock)]은 도구와의 꼭 맞는 기밀 체결을 가능하게 한다. 도구는 속박 웰 내로 로킹되는 구성요소를 장착할 수 있고, 가스켓을 더욱 압축시키도록 구성요소를 내리누를 수 있어, 구성요소가 제1 위치의 이중 웰(속박 웰)로부터 "해제(release) 웰"로 불리우는 제2 위치로 이중 웰의 개재 공간 내에서의 측방향 통과를 가능하게 하는 위치에 존재하도록 한다. 몇몇 실시예들에서, 구성요소는 도구에 의해 수직으로 이동될 때 해제 웰 내외로 자유로이 이동할 수 있다. 도구는 또한 구성요소를 완전히 속박 웰 내로 전달할 수 있고, 웰 플레이트가 표면에 고정될 때, 도구는 웰 플레이트로부터 멀어지게 수직으로 이동할 수 있어, 구성요소가 속박 웰 내에 로킹된 상태에서 구성요소를 탈착시킬 수 있다.
도구 및 플레이트는, 직교 좌표(x, y, z)에서의 도구 및/또는 플레이트의 움직임을 가능하게 하여, 도구가 구성요소를 속박 웰로 전달한 다음에 구성요소를 속박 웰 내에 남겨두도록 하고, 구성요소를 속박 웰 내에 장착하여 그것들을 해제 웰로 이동시키도록 하며, 구성요소를 해제 웰로부터 분리하여 그것들을 웰 플레이트로부터 자유롭게 하는 컴퓨터 제어식 갠트리(gantry) 시스템 상에 각각 장착될 수 있다. 그러한 셋업은 또한 도구가 구성요소를 해제 웰로 전달하여 구성요소를 팁 이젝터에 의해 해제 웰 내에 남겨두도록 할 수 있다.
도구 및 플레이트를 사용한 몇몇 컴퓨터-제어식 시스템은 각도 운동(세타-축)의 사용을 필요로 하지 않도록 설정될 수 있어, 구성요소가 웰 플레이트 내에 있거나 웰 플레이트로부터 분리된 상태에서 웰 플레이트에 대한 구성요소의 위치 회전 재배향을 방지한다.
몇몇 실시예들에서, 이중-웰은 유체가 샘플로부터 오염물질을 제거시키도록 구성되었던 소정의 경로를 통해 유동하게 하도록 사용될 수 있다. 그러한 이중 웰 시스템은 예를 들어 도 2에 웰(C, D)로 도시된다.
B. 시스템
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 카트리지 및 방법을 사용하는 시스템에 관한 것이다. 예를 들어, 시스템은 본 발명의 카트리지 중 하나 이상을 개별적으로 또는 키트의 일부분으로서 포함할 수 있고, 적어도 하나의 분석 결과를 얻기 위해 카트리지와 상호작용할 수 있는 분석 장치(본 명세서에서 또한 기구로도 지칭됨)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 시스템은 환자에 대한 의료 진단을 얻기 위해 환자 진료 지점에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 몇몇 실시예들은 개별 모듈(예컨대, 격리된 분리 용기)을 포함하는 카트리지에 작업을 수행하기 위한 분석 장치에 관한 것이며, 이 장치는 하나 이상의 주사기를 위한 하나 이상의 홀더를 포함하고, 주사기는 중공 바늘을 구비하고, 흡인력을 인가하고 내용물을 카트리지의 모듈로 분배하기 위해 바늘이 컴퓨터 제어식 동작 제어에 의해 직교 좌표계(x, y, z)를 사용하여 카트리지의 개별 모듈로 지향될 수 있도록, 카트리지가 위치되는 플랫폼 위로 배향되며, 모듈은, 바늘에 의해 관통될 수 있지만 모듈의 내용물을 환경으로부터 달리 격리시키는 격벽을 각각 구비한다. 이들 카트리지의 몇몇 실시예들의 예가 도 1, 도 4 및 도 8에 도시된다. 몇몇 실시예들에서, 홀더는 카트리지에 의해 제공되는 도구 또는 주사기를 픽업할 수 있다.
분석 장치는 본 발명의 카트리지를 수용하는 수단을 구비할 수 있다. 예를 들어, 슬롯, 개구, 홀, 또는 다른 영역이 카트리지를 수용할 수 있다. 일단 카트리지가 수용 수단 내에 배치되면, 몇몇 실시예들에서, 도어가 수용 수단을 밀봉하도록 밀폐되어, 카트리지를 분석 장치 내에 완전히 봉입시킨다. 이 도어 밀폐는 수동으로 수행될 수 있거나 자동일 수 있다. 이들 완전히 둘러싸인 변형예는 잠재적 생체유해물질이 실험실 또는 임상 환경 내로 누출되거나 달리 방출되지 못하도록 하는데 특히 유용할 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 분석 장치 및 카트리지를 사용하기 위한 시스템은 진공 설비; 공기 보급 설비; 천연 가스 설비를 필요로 하지 않거나 사용하지 않으며; 모든 시약 라인(공정 유체, 분석 시약, 및 폐기물 스트림) 및 부착된 병을 구비하지 않을 수 있다. 즉, 장치는 완전히 완비된다.
그러한 시스템에 사용되거나 또는 독립적으로 사용되는 카트리지도 또한 완비될 수 있다. 이는 카트리지가 원하는 분석을 수동으로 또는 자동화된 시스템을 사용하여 수행하는데 필요로 하는 모든 필요한 도구(예컨대, 피펫 팁) 및 시약(예컨대, 테스트 시약, 염료, 또는 다른 화합물)으로 사전-적재됨을 의미한다. 예를 들어, 카트리지는 암 치료제 패널(예컨대, 플레이트 내의 웰과 같은 격리된 챔버 내에 각각 하나)과, 샘플을 탈응집시켜 이들 웰 내로 분산시키는데 필요한 모든 도구로 사전-적재될 수 있다.
본 발명의 시스템은 카트리지의 모듈을 어드레스할 내부 이미지형성 능력을 포함할 수 있다. 이 시스템은 데이터를 생성하도록 사용될 수 있으며, 이 데이터는 이어서 사용자 또는 다른 장치로 출력된다.
분석 장치는 또한 샘플에 테스트가 실시되는 상태에서 세포 생존율을 유지시키기 위해 열 배양에 필요한 구성요소를 포함할 수 있다. 그러한 분석 장치의 배양 부분은 하나 이상의 카트리지를 선택적으로 소정의 순서로(예컨대, 샘플 추출 시간을 기초로 시간순으로) 유지시킬 수 있다.
전술한 장치 중 임의의 것은 또한 샘플 식별자를 카트리지의 모듈에 부착시켜 샘플 정보 및 공정 정보를 통신 라인을 통해 다른 장치로 전송할 수 있거나, 또는 사용자 검사 결과를 디스플레이할 수 있다.
C.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 장치를 포함하는 키트에 관한 것이다. 예시적인 키트는 컨테이너 내에 패키지되는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 카트리지를 포함한다. 키트는 또한 인쇄된 사용 설명서, 시약 및 완충제, 분자 프로우브(molecular probe), 아래에서 논의되는 바와 같은 하나 이상의 테스트 시약, 피펫 또는 바늘과 같은 탈응집 또는 분배 도구, 및 후술되는 방법을 수행하는데 유용한 다른 물품을 포함할 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 이들 키트는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 멸균될 수 있고, 멸균상태를 유지시키는 방식으로 패키지될 수 있다. 키트는 개별 키트로서 또는 멀티팩으로 판매될 수 있다. 키트는 또한 개봉 방지(tamper resistant)식으로 구성될 수 있거나, 또는 개봉 여부를 지시하도록 구성될 수 있다.
키트는 자동화된 기구의 사용에 의하기보다는 수동으로 사용될 수 있는 본 명세서에 기재된 바와 같은 분석용 카트리지를 포함할 수 있다. 그러한 경우에, 테스트 또는 카트리지의 목적을 수행하는데 필요로 하는 시약 및 장비는 키트의 일부분으로서 제공될 수 있다. 장비, 예컨대 주사기 바늘, 피펫 등은 카트리지 상에 사전적재될 수 있거나, 또는 카트리지의 외부에 존재하여 키트의 일부분으로서 제공될 수 있다. 다른 실시예들에서, 장비는 사용자에 의해 공급될 수 있고, 키트의 일부분이 아닐 수 있다. 유사하게, 키트와 함께 사용되는 테스트 시약은 카트리지의 특정한 격리된 챔버 내에 사전적재될 수 있거나, 또는 사용자에 의한 응용을 위해 카트리지 외부에 패키지될 수 있다. 이들 실시예에 따른 키트는 예를 들어 단일 테스트용 단일 카트리지, 다중 테스트용으로 적재 또는 준비된 단일 카트리지, 또는 다중 테스트용 다중 카트리지로서 패키지될 수 있다.
선택적으로, 키트는 또한 본 명세서에 기재된 것들과 같은 분석 또는 방법의 일부분으로서, 카트리지를 정확하게 사용하기 위한 사용법과 다른 필요한 물품, 예컨대 시약을 포함한다. 예를 들어, 키트는 안내문 또는 인쇄된 사용 설명서를 포함할 수 있다. 그러한 인쇄된 사용 설명서는 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용, 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태일 수 있으며, 안내문은 본 명세서에 기재된 분석, 방법, 및 장치로부터 도출된 정보를 사용하여 치료될 수 있는 건강상태를 진단 또는 치료하기 위한 인체 투여에 대해 제조, 사용, 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영한다. 몇몇 실시예들에서, 키트는 예컨대 세포를 처리하기 위한 키트의 사용에 대한 정보를 제공하는 인쇄물(printed matter), 또는 예컨대 세포를 처리하기 위한 키트의 사용에 대한 정보를 제공하는 사전-기록된(pre-recorded) 매체 장치를 또한 포함한다.
"인쇄물"은 예를 들어 책, 작은 책, 브로셔 또는 낱장 인쇄물일 수 있다. 인쇄물은 실험 분석 및/또는 본 방법에 따라 세포를 처리하기 위한 프로토콜을 기술할 수 있다. 가능한 포맷은 단계별 사용 설명서, 불릿 포인트(bullet point) 리스트, 자주 묻는 질문(FAQ)의 리스트 또는 차트를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 제공될 정보는 그림, 그래픽, 또는 다른 기호를 사용하여 비-문자 표현으로 도해될 수 있다.
"사전-기록된 매체 장치"는 예를 들어 비디오테이프 카세트, DVD(디지털 비디오 디스크), 필름스트립, 35 mm 영화와 같은 시각 매체 장치, 또는 임의의 다른 시각 매체 장치일 수 있다. 대안적으로, 사전-기록된 매체 장치는 CD-ROM(콤팩트 디스크-판독 전용 메모리) 또는 플로피 디스크와 같은 쌍방향 소프트웨어 응용프로그램일 수 있다. 대안적으로, 사전-기록된 매체 장치는 예를 들어 레코드, 오디오카세트, 또는 오디오 콤팩트 디스크와 같은 오디오 매체 장치일 수 있다. 사전-기록된 매체 장치에 수용된 정보는 실험 분석 및/또는 본 방법에 따라 세포를 처리하기 위한 프로토콜을 설명할 수 있다.
Ⅱ. 방법
본 발명은 임상 또는 연구 맥락에서 사용될 수 있는, 세포 샘플, 특히 응집된 세포 또는 고형 종양을 처리하기 위한 새로운 방법에 관한 것이다. 이들 방법은, 대상물로부터 얻은 생 암세포를 함유한 수용액을 탈응집시켜 제1 격리된 챔버 내에 적어도 하나의 테스트 분취물로 분산시키는 단계; 오염 세포를 제거시킴으로써 다른 오염 세포 유형에 대한 표적 세포의 백분율을 증가시키기 위해 선택적으로 샘플을 정제 또는 조작하는 단계; 정제된 생 암세포를 분석, 조작, 또는 자극을 위해 하나 이상의 제2 격리된 챔버 내로 분배하는 단계; 및 분배된 세포의 세포 및/또는 분자 분석을 가능하게 하기 위해 분배된 생세포를 안정화시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 안정화된 및 분배된 세포는 원하는 결과 및 관심 있는 세포 분석에 따라 생세포 또는 사멸 세포(dead cell)일 수 있다.
본 발명의 다른 방법은 고형 종양으로부터 암세포를 처리 또는 준비하기 위한 방법을 포함하며, 이 방법은, 고형 종양으로부터 얻은 생 암세포를 탈응집시켜 적어도 하나의 제1 격리된 챔버 내에 적어도 하나의 테스트 분취물로 분산시키는 단계; 오염물질을 제거시키기 위해 선택적으로 생 암세포를 정제 또는 조작하는 단계; 정제된 생 암세포를 분석을 위해 하나 이상의 제2 격리된 챔버 내로 분배하는 단계; 및 세포의 세포 및/또는 분자 분석을 가능하게 하기 위해 분배된 세포를 안정화시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 생세포가 신속히 처리되도록 한다. 세포는 최소의 세포 활성화 또는 스트레스(stress)(예컨대, 환경 스트레스, 온도 유발 스트레스, 대사성 스트레스, 또는 화학적 유발 스트레스)를 갖고서 살아 있는 상태에서 처리될 수 있다. 용어 "최소의 세포 활성화 또는 스트레스"는 자극과 비교시 세포 신호전달의 배경 잡음 및 세포 스트레스 경로의 최소의 변화에 의해 정의된다. 예를 들어, 도 17에서 볼 수 있는 바와 같이, 탈응집 및/또는 분산 전과 후의 세포에서의 FOS(또는 c-fos) 유도의 비교는 자극된 샘플(20-30배 증가)과 비교시 FOS 또는 다른 조기 반응 유전자 또는 생물학적 스트레스 지표의 최소의 유도(3-5배)를 보일 수 있다.
본 발명의 방법들의 다른 이점은 그것들이 원 샘플에서 아주 적은 수의 세포를 사용할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 몇몇 실시예들에서, 처리된 응집된 세포 또는 고형 종양 세포의 총 수는 약 1×103 내지 1×107이다.
본 발명의 방법은 또한 신속한 샘플 처리를 가능하게 한다. 몇몇 실시예들에서, 분배된 생세포의 안정화는 대상물로부터의 샘플의 획득 후 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 또는 약 4시간 내에 완료된다. 이러한 놀라울 정도로 짧은 처리 시간은 높은 세포 생존율, 예를 들어 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상의 세포 생존율을 유지시키면서 세포 배양의 필요성을 없앤다. 몇몇 실시예들에서, 세포 생존율은 약 70% 또는 약 75%이다. 용어 "약"은 수, 예를 들어 백분율과 함께 사용될 때, 그 수의 플러스 또는 마이너스 10%를 의미한다. 예를 들어, 용어 "약 60%"는 54% 내지 66%를 포함한다.
A. 샘플 획득
본 명세서에 기재된 방법 및 장치에 사용되는 샘플은 다양한 방식으로 얻어질 수 있다. 샘플은 포유류(예컨대, 인간) 또는 다른 살아 있는 유기체와 같은 대상물로부터 취해진 생세포일 수 있다. 예를 들어, 샘플은 궁극적으로 정확한 임상 진단 및 치료 과정을 결정하는데 도움을 주도록 사용되는 분석을 위해서 임상 세팅에서 인간 환자로부터 취해지는 생검물일 수 있다.
샘플은 몇몇 실시예들에서 또한 연구 또는 임상 세팅에서 관심 대상인, 응집된 또는 탈응집된, 세포들의 임의의 군 또는 단일 세포일 수 있다. 예를 들어, 고형 종양뿐만 아니라 림프종과 같은 개별 세포 또는 본 명세서에 기재된 것과는 다른 수단, 예컨대 트립신을 사용하여 탈응집되었던 세포이다. 이들 샘플은 임상 진단을 제공하기 위해서와는 다른 이유로 검사되는 기존 세포주, 이종 이식물, 또는 환자 검체로부터의 것일 수 있다. 그러한 샘플은 세포들 및 특정 테스트 시약에 대한 그것들의 반응을 더욱 특징짓기 위해 분석될 수 있다. 이들 응용은 새로운 화합물을 식별하기 위해 또는 기존 화합물의 투여를 개선시키기 위해 약물 개발 및 선별 분석의 일부분으로서 유용할 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 본 명세서에 기재된 방법은 임의의 유형의 응집된 세포 또는 종양 세포와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 그것들은 암종 또는 육종을 테스트 및 처리할 수 있다. 본 방법에 의해 테스트될 수 있는 예시적인 암은 결장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 자궁 경부암, 폐암, 소세포 폐암종, 신장암, 간암, 뇌암, 피부암, 및 방광암을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 암은 인간, 다른 포유류, 또는 비-인간 포유류(예컨대, 쥐)로부터 제거된 인간 암세포의 이종이식물로부터의 것일 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 조직 샘플은 고형 종양의 일부분 또는 전체 종양이다. 본 발명에 사용되는 종양 세포를 함유한 그러한 조직 샘플은 당업계에 알려진 바와 같은 임의의 방법에 의해, 예를 들어 환자로부터 생검물을 취함으로써 얻어질 수 있다. 본 발명에 채용될 수 있는 적합한 생검은 절개 생검, 심부 생검, 펀치 생검 및 세침 흡인 생검뿐만 아니라 절제 생검을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 몇몇 실시예들에서, 생검물은 종양의 세침 흡인(FNA)에 의해 얻어진다.
세침 흡인(FNA) 생검은, 어떤 때는 주사기에 부착되고 어떤 때는 독립적으로 사용되는 세침에 의해 수행된다. 흡인 생검 또는 FNA는 암 샘플을 얻기 위해 본 발명에 채용될 수 있다. FNA 생검은 경피적(피부를 통한) 생검일 수 있거나, 또는 대안적으로 기관지, 식도, 위, 또는 장과 같은 기관의 루멘을 통한 생검일 수 있다. FNA 생검은 전형적으로 미세 게이지(fine gauge) 바늘(21 게이지 또는 그보다 미세함, 예컨대 22 게이지 또는 25 게이지)에 의해 달성된다. 해당 부위가 우선 세척되고, 이어서 일반적으로 국소 마취체로 마취된다. 바늘은 관심 대상 기관 또는 조직의 영역 내에 배치된다. 일단 바늘이 배치되면, 주사기에 의해 진공이 생성될 수 있거나, 또는 대안적으로 바늘 내에서의 모세관 작용이 단독으로 사용될 수 있으며, 바늘의 다중 진퇴 동작이 수행된다. 샘플추출될 세포는 바늘이 조직을 관통할 때 바늘의 사면의 마이크로-코어링(micro-coring) 작용을 통해 바늘의 루멘 내로 그리고 때로는 바늘의 허브 내로 도입된다. 보통 3개 내지 6개의 별개의 샘플이 만들어진다. 림프절과 같은 전이암 부위와 간은 FNA 생검에 우수한 후보이다. FNA 절차는 전형적으로 초음파 또는 컴퓨터 단층(CT) 촬영을 사용하여 수행된다.
심부 침생검(또는 심부 생검)은 작은 중공 바늘을 피부를 통해 기관 내로 삽입함으로써 수행된다. 바늘은 이어서 샘플 또는 심부를 분리시키기 위해 세포층 내로 전진된다. 바늘은 조직 샘플의 분리를 돕도록 절제 팁을 구비하여 구성될 수 있다. 심부 생검은 흔히 조직 샘플의 분리를 돕도록 스프링 장착식 건(gun)의 사용에 의해 수행된다. 심부 생검은 전형적으로 CT 촬영, 초음파 또는 유방 촬영과 같은 이미지 유도 하에서 수행된다. 바늘은 수동으로 또는 샘플추출 장치의 도움으로 배치된다. 충분한 조직을 얻기 위해 흔히 다중 삽입이 이루어지며, 다수의 샘플이 취해진다. 심부 생검은 때때로 진공 장치에 의해 보조되는 흡인이다(진공 보조 생검). 이 방법은 단지 1회의 바늘 삽입만으로 다수의 샘플의 분리를 가능하게 한다. 심부 생검과는 달리, 진공 보조 생검 프로우브는 단 한 번만 작은 피부 닉(nick)을 통해 조직 내로 삽입된다. 이어서, 샘플추출 바늘 구멍(개구)의 회전을 사용하여 그리고 흡인력의 도움으로 다수의 샘플이 취해진다. 따라서, 조직 샘플을 얻기 위해 심부 침생검 또는 진공 보조 침생검이 본 발명에 채용될 수 있다.
내시경 생검은 샘플을 얻기 위해 본 발명에 채용될 수 있는 일반적인 유형의 생검이다. 내시경 생검은 샘플추출 기구와 함께 신체 내로 삽입되는 내시경(신체 내부를 관찰하기 위한 광섬유 케이블)을 통해 수행된다. 내시경은 관심 대상 기관의 내면 상의 영역의 직접적인 가시화와; 샘플의 내시경 내부에서 연장되는 긴 케이블에 부착된 집게에 의한 조직의 작은 조각의 수집 또는 취출(pinching off)을 가능하게 한다. 내시경 생검은 자연적 신체 구멍 또는 작은 수술 절개부를 통해, 예를 들어 위장관(소화관 내시경 검사), 방광(방광경 검사), 복강(복강경 검사), 관절강(관절경 검사), 흉부의 중간-부분(종격동경 검사), 또는 기관 및 기관지계(후두경 검사 및 기관지경 검사)에 수행될 수 있다. 내시경 초음파-유도 세침 흡인 생검은 또한 경식도, 경위 또는 경십이지장 접근방식을 사용하여 폐 또는 종격동 림프절, 췌장, 또는 간에 수행될 수 있다.
표면 생검이 암 샘플을 얻기 위해 본 발명에 채용될 수 있다. 이 기술은 세포를 분리하기 위해 조직 또는 기관의 표면의 샘플추출 또는 스크레이핑을 포함한다. 표면 생검은 흔히 피부의 작은 조각을 분리하도록 수행된다.
B. 세포 분산 및
탈응집
처리를 위해 얻어진 샘플은, 세포들을 서로로부터 분리시킨 다음에(응집되어 있다면) 분리된 세포를 본 명세서에 기재된 카트리지 내에 또는 다른 적합한 컨테이너 내에 테스트 분취물로 분산시킴으로써 분석을 위해 준비될 수 있다. 이 공정은 분산 및 계수/생존율 분석을 비롯한 다수의 단계로 이루어질 수 있다.
수술적으로-절제된 종양으로부터의 샘플과 비교시, 본 발명의 방법에 사용되는 샘플은 비교적 적은 수의 세포(예컨대, 종양 세포)를 함유할 수 있으며, 이는 본 명세서에 기재된 방법의 부재시, 몇몇 경우들에서 많은 현재의 분자 진단 기술에서의 이들 작은 샘플의 활용을 제한할 수 있다. 또한, 다른 방법을 사용하여 얻어진 고형 종양 또는 고형 종양 세포로부터의 FNA 샘플은 세포들(500개 초과의 세포)의 아주 큰 군집체(clump)를 함유할 수 있으며, 이는 다수의 테스트 분리 용기 내로의 검체의 균일한 분배를 방해한다.
세포를 사멸시키지 않거나 또는 세포 내의 스트레스 반응 경로를 부당하게 활성화시키지 않고서 그러한 세포를 탈응집 및 분산시키는 것은 정밀한 방법 및 기술을 요하는 섬세한 공정이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 탈응집은 세포들을 분리시키는 것, 또는 세포를 함유한 샘플이 다수의 비교적 균일한 샘플로 분산될 수 있도록 세포의 대략 균질한 샘플을 제공하는 것을 의미한다. 예를 들어, 내피와 같은 부착-의존성 세포에서, 동맥 레벨에서의 지속적인 단방향 층류 전단력(10 내지 25 다인/㎠)은 1시간 미만에 강화된 FOS mRNA 및 FOS 단백질에 의해 신진대사[프로스타시클린 및 NO 생성(production)]의 급속한 변화뿐만 아니라 유전자 발현의 급속한 변화를 유발할 수 있다. CHO 및 HELA와 같은 몇몇 다른 세포주도 또한 단방향 전단 응력에의 지속적인 노출 후 FOS 유도를 나타낸다. 이들 연구는 전형적으로 세포가 표현형을 변화시키기 위해 수 분 내지 수 시간 내지 수 일간 전단 응력에 노출되는 유동 챔버를 전개한다. 예를 들어 다이아몬드 에스엘(Diamond SL), 에스킨 에스지(Eskin SG), 매킨타이어 엘브이(McIntire LV)를 참조하라. 유체 유동은 배양된 인체 내피 세포에 의해 조직 플라스미노겐 활성제 분비를 자극한다. 사이언스(Science), 1989년 3월 17일; 243(4897):1483-5. 유체 전단 연구와는 별개로, 기계적 섭동(기질 신장 또는 유도된 변형)은 신장-활성 이온 채널을 활성화시킬 수 있고, 칼슘 동원을 유발할 수 있다. 난류 전단 응력은 전형적으로 파열하는 산소 기포의 좌굴 필름과의 상호작용이 특히 세포용해성이라는 점에서 층류 전단 응력보다 더욱 유해하다. 플루로닉 F68 또는 소 혈청과 같은 첨가물은 세포보호성이지만, 세포가 기포와 결합되지 못하도록 하는 계면활성제 효과를 통해 부분적으로 작용한다.
본 발명자들은 놀랍게도 소정 크기의 층류 유체 전단 응력을 사용하는 것이, 세포를 사멸시키지 않고 세포에 단지 최소의 스트레스 반응만을 촉발시키거나 스트레스 반응을 전혀 촉발시키지 않고서 세포의 응집체를 효율적으로 분열시킬 수 있는 것을 확인하였다. 이러한 탈응집은 예를 들어 세포를 소정 크기의 바늘 또는 관 내로 흡입하여 세포를 예컨대 웰 내로 방출하고 필요한 만큼 반복함으로써 수행될 수 있다. 층류 전단 응력에의 노출 시간은 검체의 유체 역학적 분열 중 세포의 전단 활성화를 감소시키도록 최소화된다.
필요한 프로토콜 및 장비를 식별하기 위해 샘플의 탈응집을 위한 적절한 조건이 계산될 수 있다. 세포 시스템의 임의의 순간에서의 응집 상태는 그것의 개체군 크기 분포에 의해 규정된다. 시스템은 단분산성(예컨대, 모든 단일체 또는 응집체가 적은 수의 세포, 예를 들어 모두 20-mer 이하를 함유)일 수 있거나, 또는 응집체가 단일체와 일정 범위의 k-mer 사이의 범위에 있는 다분산성일 수 있으며, 여기에서 k는 예를 들어 20을 초과하는 큰 수이다. 세포 배양 라인에서, 응집체들은 동형이다. 그러나, FNA는 그것들이 다중 세포 유형을 포함한다는 점에서 이형이다. 시간에 따라 진화하는 응집 및 분화 공정의 수학적 처리가 잘 개발되어 있다. 복합도에 따라, 개체군 수지 방정식은 해석적으로(단순 동형 응집), 수치적으로(복합 동형 응집), 또는 몬테카를로 시뮬레이션에 의해(이형 응집/분화) 풀어질 수 있다. FNA 분열에 대해서, 기본 공정은 우세한 유동장, 응집체 크기, 및 완충제 조건에 의존하는 분화 커널 F에 의해 지시된다. 분화(각각의 입자가 2개의 보다 작은 입자로 파쇄되는 단일 구성요소)를 겪는 크기의 개체군에 대해서, 분화 수지는,
와 같이 표현될 수 있으며, 여기에서 ck(t)는 시간 t에서 k-크기 입자(또는 k-mer)의 농도이고, ak는 k-mer의 순 파쇄율이며, bi ｜k는 k-mer의 파쇄시 생성된 i-mer들의 평균 수이다. 따라서, Fij = ai + jbi ｜i+j/2는 (i+j)-mer가 i-mer 및 j-mer로 파쇄되는 순 비율을 제공한다. 분화 커널 F는 관 유동에서 공간 의존적이고(벽면 부근에서 높고, 중심에서 0임), 또한 관 직경에 대한 응집체 크기의 비율에 의존적이다. 생검 후 조작에서, FNA는 최소 입자의 벽면으로의 방사상 이동을 수반하는 현탁물 동특성(suspension dynamics)이 중요하지 않도록 고도로 희석될 것이다(세포 체적/샘플 체적 << 1). 응집체의 분화는 2분열로부터 순 분쇄(응집체로부터 단일체들의 상실)에까지 이를 수 있다. 분화 커널은 FNA에서 종양 응집체에 대해 알려져 있지 않다. 당업자라면 인식할 바와 같이, 전단 유동에서 클러스터에 대한 경험적 분화율은 평균 전단율 Gavg와 응집체 수력 반경 또는 충돌 반경 Rhyd에 기초한 멱-법칙 관계이다. 예를 들어, 일반적인 형태는 ai = A * (Gavg)y(Rhyd)γ이며, 여기에서 A와 y는 실험적으로 결정되고, γ=2이다. 각각의 세포가 반경 Ro를 갖는 i-세포의 종양 응집체에 대해서, Rhyd = Ro(i)1/ Df이고, 여기에서 Df는 프랙탈 차원이다(Df ~ 1.7 내지 2.5).
FNA 및 다른 세포 응집체는 다중 세포 유형 및 다양한 매트릭스 구성요소를 갖는 복합 물체일 수 있다. FNA의 분열을 고려하면, 환자로부터 유래된 큰 조직 샘플의 하위 개체군으로의 분화는 1차적으로 종양 세포들 사이의 접합의 붕괴의 결과이고, 2차적으로 종양 세포와 그 밑에 있는 매트릭스 사이의 인테그린-의존성 점착의 붕괴의 결과이다.
관에서 생검 샘플, 예컨대 FNA의 전단 유도 탈응집: 세포를 탈응집시키는 한가지 방법은 전단 응력의 사용을 통한 것이다. 전술된 바와 같이, 층류 전단 응력이 바람직하다. 층류 전단 응력은 관 내에 생성될 수 있다.
관 내의 층류 전단 유동(레이놀즈 수 < 2100)에 대해서, 유체가 단순히 하류로 유동 중인 경우에, 전단 응력은 관 벽면 부근에서 최대이고, 관의 중심에서 0이다. 벽면 전단 응력 tw와 통과 시간 ttransit은 단면적 A = πR2의 관을 통한 체적 유량 Q에 대해 tw(다인/㎠) = 4mQ/(πR3)과 ttransit = (L A)/Q로 정의될 수 있으며, 여기에서 Q[=]㎤/s, vavg[=]cm/s, 및 A[=]㎠에 대해 Q = vavgA이다. 관의 길이 L을 가로지르는 평균 통과 시간은 ttransit = L/vavg = L A/Q이도록 vavg = L/ttransit으로부터 정의된다. 물의 점도는 실온에서 0.01 포아즈이다. 글리세롤, 플루로닉 F68, 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 첨가제는 모두 유체상의 점도를 향상시킬 수 있다. 일정한 유량 및 기하학적 형상에서, 점도를 증가시키는 것은 전단력을 증가시킬 것이다. 작은 직경 관에서 입구 길이 효과는 명백히 최소이다. 일반적으로 사용되는 길이의 1" 주사기 및 주사기 게이지(G)와 물 관류 완충제(1 cP)에 대해서, 벽면 전단 응력(dpc, 다인/㎠) 및 통과 시간이 표 1에 주어진다.
1 mL/초로 물 완충액에 의해(점도 = 1 cP) 관류된 1" 바늘에 대한 바늘 게이지, 벽면 전단 응력(dpc, 다인/㎠), 및 통과 시간(msec)의 관계.
층류 관 유동이 중간 정도의 신장 유동의 일례이다. 거의 평탄한 표면으로 지향되는 관과 같은 충돌 유동이 고도로 신장성이다. 세포 현탁물은 낮은 전단 환경으로 유입되기 전에 관의 출구에서 짧은 시간 주기 동안 신장력을 받는다. 신장력의 크기는 관 직경, 유량, 및 평탄한 표면으로부터의 거리에 의해 쉽게 제어된다. 정기적 동작 제어 및 미세조작이 10 ㎛ 내의 정확도로 거리를 제어할 수 있다. 또한, 바늘 내로의 유체의 유입과 바늘로부터의 유체의 유출은 강한 신장 유동을 생성시킬 수 있다. 가변 길이 및 내경(게이지)의 사용에 의해, 벽면 전단 응력 노출로 인한 탈응집과 바늘 내로의 유입 또는 유출에 의해 유발되는 그것을 구별할 수 있다.
계산된 힘과 필요한 장비에 기초하여, 조직 샘플의 세포는 100-800 다인/㎠의 벽면 전단 응력을 생성하도록 10 내지 2000 마이크로리터의 체적을 사용하여 10 내지 500 ㎛의 직경을 갖는 관을 통과할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 세포는 22 게이지 또는 18 게이지 바늘을 통과한다. 몇몇 실시예들에서, 세포는 약 100 내지 약 800 다인/㎠의 층류 벽면 전단 응력, 약 300-약 500 다인/㎠의 층류 벽면 전단 응력, 또는 약 350-약 450 다인/㎠의 층류 벽면 전단 응력에 노출된다. 세포는 필요한 힘의 양 및 세포의 유형에 따라 약 10 밀리초 내지 약 500 밀리초 이상 동안 층류 벽면 전단 응력에 노출될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 적절한 전단력을 제공하기 위해 배지의 점도가 조절된다.
탈응집 단계는 분석에 적합한 샘플이 생성되었을 때까지 필요한 만큼 반복될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 세포의 적어도 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 90%를 초과하는 것이 1-100개 세포의 군집체로 분산된다. 이 군집체는 또한 5-100개 세포, 10-100개 세포, 10-25개 세포, 또는 5-25개 세포의 군일 수 있다. 바람직하게는, 군집체는 15개보다 적은 세포, 예를 들어 군집체당 1-10개 세포를 갖는다.
탈응집 단계는 또한 탈응집을 돕기 위한, 또는 세포에서의 스트레스 반응의 활성화를 방지하기 위한 화합물을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 다음의 것들 중 임의의 것이 탈응집 단계 중 세포에 첨가될 수 있다: 생리학적으로 허용가능한 항산화제; 점액용해제; 이황화 결합을 환원시킬 수 있는 제제, 예컨대 N-아세틸-L-시스테인 또는 디티오트레이톨; 생리학적으로 허용가능한 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 및/또는 비이온성 계면활성제와 같은 하나 이상의 막-보호 표면 활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에톡시화 지방산, 또는 산화에틸렌 및 산화프로필렌 블록 공중합체, 예를 들어 플루로닉 F-68[바스프(BASF)].
분산 공정은 또한 무혈청 생리 식염수, 예컨대 약 0.9% w/v 염화나트륨을 함유한 멸균수 내에 세포 또는 세포 군집체를 현탁시키는 것을 포함할 수 있고, 선택적으로 생리학적으로 허용가능한 완충제 및 염; 예컨대, 유산화 링거액, 초산염화 링거액, 인산염-완충 식염수, TRIS-완충 식염수, 행크(Hank) 평형 염액, 얼(Earle) 평형 염액, 표준 시트르산 식염수, HEPES-완충 식염수로부터 선택되는 식염수를 또한 포함한다.
당업자라면 인식할 바와 같이, 세포 탈응집 공정은 수동으로, 예를 들어 피펫 또는 바늘을 사용하는 사람에 의해, 또는 공기 또는 유체 구동식 자동화된 유체 처리 장치와 같은 자동화된 공정을 사용함으로써 수행될 수 있다. 수동 및 자동화된 탈응집 공정 둘 모두가 본 발명의 다양한 실시예들에 의해 포함된다.
몇몇 실시예들에서, 조직 샘플은 이에 한정되지는 않지만 세포 신호 전달 및 스트레스 반응 경로를 비롯한 반응 경로가 리간드 자극에 비해 활성화되지 않은 상태에서 탈응집 및 분산되며, 예를 들어 분산은 EGF 자극에 비해 FOS 발현을 활성화시키지 않는다.
C. 샘플 정제/부화
응집된 세포는 다수의 세포 유형으로 이루어질 수 있으며, 흔히 그들 세포 유형 중 단지 아주 적은 수만이 또는 하나가 검사 및 분석용 표적이다. 이들 경우에, 세포는 보다 작은 군집체 및/또는 개별 세포로 탈응집될 수 있고, 이어서 샘플을 정제하고 원 혼합된 세포 샘플에서보다 더욱 높은 백분율의 관심 대상 세포를 제공함으로써 샘플을 부화시키기 위해, 관심 대상이 아닌 세포를 비롯한 오염물질을 제거하도록 혼합물이 정제된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "정제" 또는 "부화"는 비-표적 세포 또는 분석을 방해할지도 모를 세포 부분의 수에 대한 표적 세포(예컨대, 종양 세포 또는 분석되는 다른 세포)의 수의 비율을 증가시키는 것을 의미한다.
예를 들어, 고형 종양으로부터의 생검 검체는 관심 대상 세포(예컨대, 종양 세포)와 오염 정상 세포 요소(조혈 세포, 간세포, 혈관계 등) 둘 모두를 포함하는 세포의 혼합물로 구성된다. 예시적인 실시예들에서, 오염 요소는 프로토콜에 따라, 오염 요소에 특이한 항체를 사용하여, 또는 표적 세포에 특이한 항체를 사용함으로써 제거된다. 항체는 관심 대상 세포로부터 오염 물질을 제거하기 위해, 기질, 예를 들어 플라스틱 표면, 예컨대 플레이트의 벽, 또는 플라스틱 또는 플라스틱-코팅된 비드, 예컨대 자기 비드에 직접 또는 제1 항체를 인지하는 제2 항체를 통해 결합될 수 있다.
D. 세포 분배
일단 세포가 탈응집되어 선택적으로 정제되면(단지 필요한 경우에만), 세포의 샘플은 본 발명의 카트리지 내의 하나 이상의 격리된 챔버(예컨대, 위에서 논의된 제2 격리된 챔버 중 하나 이상) 또는 다른 적합한 컨테이너 내로 분배된다.
관심 대상 세포는 원하는 경우에 위의 B에 기재된 바와 같은 기술을 사용하여 추가로 분산될 수 있으며, 이어서 그것들은 테스트 시약에의 노출 및/또는 다른 분석 및 테스트를 위해 분취물로 분배된다. 몇몇 실시예들에서, 분취물은 맞춤형 카트리지 내의 웰들의 일부 또는 전부 간에 분배된다. 몇몇 실시예들에서, 분취물은 세포 증식 및 신호 전달을 자극하기 위해 원하는 테스트 시약, 예를 들어 하나 이상의 리간드에 노출된다.
테스트를 위해 제2 격리된 챔버 또는 다른 기질로 분배되는 분취량은 필요한 세포의 수와 당업자에게 알려진 다른 실험 조건에 따라 변할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 테스트 분취물은 2 mL 미만, 200 μL 미만, 또는 1 μL 내지 200 μL의 체적을 갖는다. 당업자라면 인식할 바와 같이, 이 체적은 현탁물에서 테스트에 적합한 수의 세포가 입수가능하기만 하면, 필요한 경우에 이들 예시적인 범위를 넘어 변경될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 테스트 분취물을 수용한 적어도 하나의 격리된 챔버는 대조군(control)으로 지정된다. 이 대조군은 생존율 및 스트레스 레벨에 대해 재분석될 수 있거나, 세포 계수 공정을 받을 수 있거나, 또는 다른 챔버의 데이터 분석을 위한 양성 또는 음성 대조군을 제공하기 위해 추가적 시약 또는 대조 물질을 수용할 수 있다.
분배된 세포는 세포 유형에 적합한 임의의 배지 내에 현탁될 수 있다. 예를 들어, 분배된 세포의 테스트 분취물은 무혈청 최소 영양 배지 내에 있을 수 있다. 무혈청 최소 영양 배지는 필수 아미노산, 염(예컨대, 염화 칼륨, 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 및 인산 이수소 나트륨), 포도당 및 비타민(예컨대, 엽산, 니코틴아미드, 리보플라빈, B-12)과; 세포의 적절한 처리 또는 분석에 필요한 임의의 다른 성분을 가질 수 있다. 적합한 무혈청 영양 배지는 둘베코(Dulbecco)/포크트(Vogt) 변형 이글(Eagle)의 최소 필수 배지(DMEM) 또는 RPMI를 포함한다.
몇몇 실시예들에서, 테스트 분취물은 플라스틱 플레이트, 예컨대 96개 웰 플레이트의 웰 내로 분배되며, 웰의 벽면은 생리학적으로 허용가능한 하이드로겔 또는 오일, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 알지네이트, 또는 실리콘으로 코팅된다.
E. 테스트 시약 및
테스팅
테스트 분취물은 카트리지 내에서 또는 카트리지로부터 격리된 챔버 중 하나 이상을 분리시킨 후 다양한 테스트 시약에 노출될 수 있다. 본 명세서의 방법 및 장치의 이점은 테스트 시약이 환자 진료 지점에서 첨가될 수 있고, 및/또는 카트리지의 특정된 웰 내에 사전적재될 수 있다는 것이다. 이는 선택적으로 환자 진료 지점에서 생세포를 사용하여 체외 바이오마커의 테스트를 가능하게 한다. 이들 방법 및 장치는, 새로운 예측 바이오마커의 개발을 촉진시키고 특정 약제와 당업자가 인식할 다른 용도에 대한 세포 민감성을 모니터 및 결정하기 위해 샘플을 체외에서 조작하기 위한 특정 테스트 시약과 함께 사용될 수 있다.
예를 들어, 환자로부터의 고형 종양의 샘플은 환자 진료 지점에서 탈응집되어 분산된 다음에 현재 이용가능한 일단의 암 치료법들을 상대로 테스트된다. 샘플은 이어서 안정화 및/또는 필요한 경우에 고정되어 분석될 수 있다. 각각의 테스트 시약에 대한 결과에 따라, 의사는 어느 치료법이 환자 진료 지점에서 개별 환자의 종양에 가장 효과적일지를 신속히 결정할 수 있다. 이 개인화된 치료는 다수의 이익, 특히 표적화된 암 치료법 및 치료 계획의 신속한, 비용 효율적인 방식으로의 사용을 제공한다.
본 발명의 실시예들은 표적 체외 바이오마커 또는 생체분자에 대한 측정가능한 정량적 또는 정성적 효과를 생성하기 위해 적어도 하나의 제제를 투여함으로써 분배된 세포(예컨대, 암 세포)를 분석하는 것에 관한 것이다. 정량적 또는 정성적 효과는 세포 경로의 활성화 또는 억제일 수 있다. 예시적인 세포 경로는 대사 경로, 복제 경로, 세포 신호전달 경로, 종양유전자 신호전달 경로, 세포자멸사 경로, 및 신생혈관형성 경로를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 정량적 또는 정성적 효과는 G-단백질 결합 수용체 또는 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 및 하류 경로와 같은 티로신 키나제 수용체에 대한 작용 또는 길항 효과의 측정치일 수 있다.
측정된 정량적 또는 정성적 효과는 즉각적 또는 지연된 조기 유전자군 구성원과 같은 유전자의 발현 레벨일 수 있다. 적합한 즉각적 또는 지연된 조기 유전자군 구성원은 FOS, JUN 및 DUSP 1-28을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
테스트 시약의 존재 또는 부재의 효과는 또한 체외 바이오마커, 예를 들어 해독 후 변형된 단백질, 이온, 또는 효소를 검출함으로써 결정될 수 있다.
적합한 테스트 시약은 이에 한정되지는 않지만 다음의 것들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 약제, 화학적 화합물, 세포를 자극하기 위한 제제, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항체, Fab 분절, Fc 분절, RNA, miRNA, siRNA 및 인단백질. 위에서 논의된 바와 같이, 시약의 투여에 이어서 분산된 또는 분배된 세포의 표적 체외 바이오마커 또는 생체분자에 대한 정량적 또는 정성적 효과를 측정할 수 있다.
몇몇 분석 방법에 대해서, 테스트 시약은 검출가능한 제제일 수 있다. 이 검출가능한 제제는 개별적으로 사용될 수 있거나, 또는 다른 화합물(예컨대, 항체에 접합된 검출가능한 제제)에 접합되거나 달리 연결되어 사용될 수 있다. 적합한 검출가능한 제제는 효소, 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 방사성 물질, 양전자 방출 단층 촬영을 이용한 양전자 방출 금속, 또는 비방사성 상자성 금속 이온을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 적합한 테스트 시약은 성장 인자(예컨대, EGF, 인슐린, VEGF), 또는 호르몬, 예컨대 에스트로겐 또는 에스트로겐 화합물과 같은 종양-세포 자극 리간드를 포함한다.
본 방법 및 장치의 고형 종양 또는 다른 암 응용분야에 대해서, 테스트 시약은 예를 들어 항암 단일 클론 항체, 예컨대 트라스트주맙[허셉틴(Herceptin)®], 세툭시맙[얼비툭스(Erbitux)®], 베바시주맙[아바스틴(Avastin)®] 및 리툭시맙[리툭산(Rituxan)® 또는 맙테라(Mabthera)®]과 같은 표적화된 약제, 및 저분자 억제제, 예컨대 게피티닙[이레사(Iressa)®], 또는 엘로티닙[타세바(Tarceva)®] 또는 예를 들어 탁산[탁소테레(Taxotere)®], 대사 길항 물질(플루오로우라실), 알킬화제, 백금 제제 또는 안쓰라사이클린과 같은 세포독성 화학요법제를 포함할 수 있다. 이들 예시적인 약제는 개별적으로, 본 명세서에 개시된 다른 약제와 임의로 조합되어, 또는 다른 화합물과 조합되어 사용될 수 있다.
테스트 시약을 투여한 후, 테스트 시약이 하나 이상의 마커의 발현에 영향을 미치는지가 결정될 수 있으며, 그러한 발현의 존재, 부재, 또는 상대적 정도는 선택된 약제에 대한 세포의 감수성을 지시한다. 이들 마커는 mRNA, 마이크로RNA, cDNA, 단백질, 인단백질, 단백질의 해독 후 변형물, 또는 히스톤 또는 DNA 패키징의 변형물과 같은 다양한 체외 바이오마커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 마커는 약제에 대한 감수성과 관련된 조기 반응 유전자(예컨대, FOS 또는 JUN)에 대해 mRNA 또는 cDNA일 수 있다. 테스트 시약의 존재 하에서 마커의 조합의 발현의 존재, 부재, 또는 상대적 정도는 약제와 같은 선택된 테스트 시약에 대한 세포의 감수성을 지시할 수 있다.
F. 샘플 준비 및 안정화
본 명세서에 기재되고 도면에 도시된 바와 같이, 본 발명을 사용하여 처리되는 세포는 그것들에 다양한 세포 분석이 수행되도록 하기 위해 다수의 방식으로 준비 및 안정화될 수 있다. 예를 들어, 세포는 핵산 분석, 단백질 분석을 위해 준비될 수 있고, 및/또는 생세포 프로우브를 사용하여 분석될 수 있다.
핵산 분석을 위해서, RNA레이터(RNAlater)®, RNA 프로텍트 셀 리젠트(RNA Protect Cell Reagent)®[둘 모두 퀴아젠(Qiagen)으로부터 입수가능함], 또는 에탄올과 같은 안정화 시약이 세포에 첨가될 수 있다. 안정화된 세포는 이어서 선택적으로 용해될 수 있거나, 또는 관심 대상 핵산이 달리 추출될 수 있다. 추출된 및 정제된 핵산은 이어서 예를 들어 PCR 기술을 사용하여 분석될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 그리고 전술된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 방법은 추가 분석을 위해 핵산을 산출한다. 이들 샘플에 대해서, 분산 및 선택적 부화에 이어, 핵산은 높은 품질 및 수량의 핵산을 산출하기 위해 안정화 또는 추출될(선택적으로) 수 있다. 예를 들어 아래의 예 10과 도 13 및 도 14를 참조하라. 이는 예를 들어 테스트 시약에의 노출에 이어 원하는 세포를 용해한 다음에 역전사 효소 및 DNA 프라이머를 사용하여 cDNA를 얻음으로써 수행될 수 있다. DNA 프라이머는 폴리 A, 예컨대 올리고(dT)12 -18에 상보적인 비특이 프라이머 또는 관심 대상 mRNA 전사체에 상보적인 특이 프라이머를 포함할 수 있다. 당업자라면 인식할 바와 같이, 세포는 화학적 또는 기계적 수단과 같은 다양한 방법을 사용하여 용해될 수 있다.
선택적으로, 세포는 바이오마커 정보를 검출 및/또는 보존하기 위한 시약에 의해, 예컨대 cDNA 전사체를 얻기 위해 역전사 효소 및 DNA 프라이머를 사용하고 하류 분자 분석을 위해 RNA, DNA 및 단백질을 준비하여 안정화될 수 있다.
단백질 분석을 위해서, 전체 세포 또는 용해된 세포가 사용될 수 있다. 손대지 않은 전체 세포는 아래의 표 2에 기재된 것과 같은 폴리머로 고정 및 안정화될 수 있어, 샘플은 격리된 챔버, 예를 들어 유리 슬라이드에 부착된다. 이들 샘플은 이어서 분석, 예를 들어 면역조직화학적(IHC) 분석을 받을 수 있다. 용해된 또는 달리 파열된 세포는 웨스턴 블라츠(Western Blots)와 같은 분석에 사용될 수 있고, 안정화 또는 고정을 필요로 하지 않을 수 있다.
병리학자에 의한 형태 검토 및 IHC에 의한 단백질 분석을 위한 슬라이드 준비는 본 명세서에 기재된 방법의 산출물일 수 있다. 따라서, 세포는 또한 형태 및 면역조직화학의 분석을 위해 선택적으로 폴리머를 사용하여 유리 슬라이드 상에 준비될 수 있다. 예를 들어, 표 2에 개시된 혼합물은 표 3의 예시적인 프로토콜에 따라 사용될 수 있다. 막셈 제이. 에이.(Maksem J. A.), 브이. 단와다(V. Dhanwada) 등(2006)의 "500 씬프렙 경우로부터 잔류 세포 현탁물을 사용한 수동 액상 세포검사법에 의한 자동화된 액상 세포검사 샘플 테스트(Testing automated liquid-based cytology samples with a manual liquid-based cytology method using residual cell suspensions from 500 ThinPrep cases)" Diagn. Cytopathol 34(6): 391-6을 또한 참조하라.
| 예시적인 프로토콜 | |
| 1 | 15 ml의 탈이온수에 4.8 g의 PEG를 용해하고, 교반하면서 가열함 |
| 2 | 용액을 비등시까지 가열함으로써 15 ml의 탈이온수에 0.18 g의 아가로스를 용해시킴 |
| 3 | 용액이 광학적으로 투명할 때까지 강력한 혼합을 유지함 |
| 4 | 고온 아가로스 용액을 PEG 용액에 즉시 첨가함 |
| 5 | 용액을 133.2 ml의 물(고온)로 희석하고 실온으로 냉각시킴 |
| 6 | 76.8 ml의 시약 알코올을 용액에 첨가하여 혼합함 |
| 7 | 최종 체적을 240 ml로 탈이온수에 의해 조절함 |
| 8 | 250 ㎕의 폴리-L-리신 용액을 첨가함 |
| 9 | 50 ㎕의 IGEPAL CA-630을 첨가함 |
| 10 | 무명천을 사용하여 여과시키고, 사용 전 실온에서 적어도 72시간 동안 보관함 |
생세포 프로우브 분석은 세포가 살아 있는 경우에 세포를 처리하는 방법에서 분자 프로우브[예들에 기재된 바와 같은 미토트랙커(Mitotracker)®와 같은]를 임의의 지점에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 생세포 프로우브의 첨가는 세포의 고정 전에 또는 달리 세포가 사멸하게 하기 전에 이루어져야 한다. 예를 들어, 그러한 프로우브는 세포 안정화 전이나 후에, 그러나 세포 고정 전에 첨가될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 세포는 후속 분자 분석 및 마커의 검출을 가능하게 할 임의의 적합한 수단에 의해 안정화 및 고정될 수 있다. 일반적으로, 포르말린과 같은 가교 고착제는 바람직하지 않지만, 후속 분석을 방해하지 않을 소량으로 존재할 수 있다. 바이오마커가 특정 유전자 또는 유전자들의 발현인 경우에, 일 실시예에서, 세포는 세포에 mRNA 전사체의 cDNA 전사체를 생성시키기 위해 용해되어 역전사 효소 및 적합한 프라이머에 노출된다. 이는 cDNA가 mRNA보다 덜 열화되기 때문에 후속 분석을 용이하게 한다.
몇몇 실시예들에서, 다음의 것들 중 임의의 것 또는 전부를 안정화시키기 위해 1×104 이상의 세포가 처리된다: RNA, DNA, 단백질, 및/또는 인단백질.
몇몇 실시예들에서, 세포는 처리 후 고정될 수 있다. 임의의 적합한 고정 수단, 예를 들어 공기 건조 기술, 알코올과 같은 화합물, 예컨대 메탄올 또는 에탄올과 같은 저급 알칸올을 포함한 고착제의 첨가, 포르말린의 첨가, RN아제 억제제의 첨가, 아가로스의 첨가, 폴리에틸렌 글리콜의 첨가, 폴리 l-리신의 첨가, 또는 하나 이상의 킬레이트제 또는 항산화제의 첨가가 사용될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 고착제는 아가로스, 폴리에틸렌 글리콜, 옥틸페녹시-폴리에틸렌 글리콜, 폴리-l-리신, 시약 알코올 및 물을 포함한다.
본 발명의 방법의 다른 실시예는 예컨대 선택된 표적화된 약제에 대한 세포의 민감성의 결정을 위해, 대상물로부터 고형 조직 세포, 예컨대 고형 종양을 갖는 동물 또는 인간 대상물로부터 고형 종양 세포를 준비하기 위한 방법을 포함한다. 예시적인 방법은 (a) 대상물로부터 원하는 세포를 포함하는 고형 조직을 얻는 단계; (b) 조직을 단일 생세포 및/또는 100개 이하의 생세포, 예컨대 10 내지 100개의 세포의 응집체로 분산시키는 단계(예컨대, 전단력을 사용하여); (c) 샘플을 부화시키는 단계, 예컨대 생세포로부터 오염 물질을 제거시키는 단계; (d) 생세포를 격리된 챔버 내에 테스트 분취물로 분배하는 단계; (e) 생세포를 하나 이상의 테스트 시약에 노출시키는 단계; 및 (f) 추가 분석을 위해 종양 세포 및/또는 마커를 고정시키기 위해서 세포를 고착제 및/또는 안정화제(예컨대, RNA, DNA, 단백질 및/또는 인단백질을 안정화시키는 제제)로 처리하는 단계를 포함할 수 있으며, 종양 세포 및/또는 마커의 고정은 대상물로부터 조직을 자동화된 또는 수동 방식으로 분리한 후 4시간 내에 완료된다.
본 발명의 다른 실시예는, 고형 종양 세포가 포유류(예컨대, 인간 환자)로부터 분리되고 세포의 대부분, 예컨대 세포의 적어도 65%, 예컨대 세포의 적어도 75%가 생존가능하고 신체 외부에서 복제되지 않은 세포를 테스트하고, 체외에서 세포의 전부 또는 일부분을 하나 이상의 테스트 시약에 노출시키며, 선택적으로 DNA, RNA, 단백질, 및/또는 인단백질을 포함한 바이오마커 정보를 보존할 수 있는 고착제(예컨대, 폴리머)로 세포를 안정화시키는 방법을 제공한다. 이들 바이오마커는 당업계에 알려진 분자 분석을 사용하여, 또는 본 명세서에 개시된 새로운 체외 바이오마커 테스트를 사용하여 테스트될 수 있다.
다음의 예는 본 발명을 더욱 상세히 예시하지만, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
예 1: 생세포 처리
생세포 처리의 중요성은 생세포 분자 프로우브인 미토트랙커(MitoTracker)[캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수가능함]를 사용하여 실증되었다. 미토트랙커는 원형질 막을 가로지르는 수동 확산에 의해 생세포에 적용될 때 미토콘드리아에 국부화된다. 생세포는 미토트랙커 국부화를 안정시키도록 고정되었고, 형광 현미경 검사에 의해 분석되었다. 현재 이용가능한 생검 처리 방법과는 달리, 본 발명에 따른 방법, 장치 및 시스템은 분자 프로우브에 의한 생세포의 연구를 가능하게 한다. 이는 도 20 및 도 21에 도시되며, 여기에서 프로우브가 생세포에 인가될 때에는 미토콘드리아의 특정 세포질 국부화(입상 형광, 좌측 - 도 20a 및 도 21a)가 명확하게 보였지만, 종래 기술의 방법을 사용하여 고정된 세포에 인가될 때에는 정보 가치가 없었다(우측, 도 20b 및 도 21b).
예 2 - MCF-7 및 HCT-116 탈응집 연구
MCF-7(인체 유방 암종 세포 - ATCC#HTB-22) 및 HCT-116(인체 결장 암종 세포 - ATCC#CCL-247)은 반-자동화된 피펫팅 장치로 클러스터 크기, 생존력 및 세포 활성화에 대한 전단력의 영향을 검사하도록 사용되었다. 간단히 말하면, MCF-7 및 HCT-116 세포는 80% 융합률까지 조직 배양으로 성장된 다음에, 고무 폴리스맨(rubber policeman)으로 부드럽게 찰과시킴으로써 플레이트로부터 제거되어, 전형적 FNA 샘플의 세포 수 및 분절 크기를 모사하기 위해 성장 배지 내에 현탁되었다. 세포 현탁물의 하나의 분취물은 22G 바늘을 구비한 자동화된 피펫팅 기구[매사추세츠주 홀리스톤 소재 하바드 애퍼러투스(Harvard Apparatus)로부터의 하바드 피펫터(Harvard Pipetter)]를 통해 4회 통과되어(각각의 통과시 4.14 mL/분으로 인출/주입), 100-800 다인/㎠ 범위의 벽면 전단 응력 노출과 각각의 세포 또는 응집체에 대해 4회 통과 × 14밀리초/통과 = 56밀리초의 총 노출 시간을 형성하였다. 각각으로부터의 대표적인 샘플이 유리 슬라이드 상으로 세포원심분리되고, 95% 에탄올로 고정되며, 파파니콜로 염료로 염색된다. 대표적인 영역의 현미경 사진이 얻어졌다(배율 ×200). 전단력을 증가시킴에 따라 세포 클러스터 크기가 감소되는 것에 주목하라. 이들 결과가 도 22에 도시된다.
예 3 - 응집체 크기 분포
예 2의 방법을 사용한 후에, 이어서 세포 농도 및 세포 크기 분포를 측정하는 비-유동 이미지형성-기반 세포 계수기[매사추세츠주 로렌스 소재 넥셀롬(Nexcelom)으로부터의 셀로미터(Cellometer)®]의 사용을 통해 평균 클러스터 크기가 계측되었다. 100 다인/㎠에서, MCF-7 세포의 평균 클러스터 크기는 97±3 ㎛였고, HCT 세포는 51±6 ㎛였다(도 15). 이들 데이터는 생세포의 응집체를 분산시키는데 필요한 일정 범위의 재생가능한, 최적의 전단력을 제공한다.
예 4 - 분산으로부터의 생존율 분석
예 2의 방법을 사용한 후에, 반-자동화된 피펫터로부터 대등한 전단력에서 트리판 블루 배제 분석에 의해 생존율이 또한 검사되었다. 800 다인/㎠ 초과의 전단력은 생세포 조작 및 처리에 너무 가혹한 것으로 간주되는 생존율의 40% 초과의 감소를 초래하는 것으로 결론지어졌다. 얻어진 결과의 그래픽 도해에 대해 도 16을 참조하라.
예 5 - 분산으로부터의 활성화 분석
세포 활성화의 기능적 측정은 정량적 RT-PCR에 의해 결정된 FOS mRNA 유도를 포함한다. FOS는 EGFR 경로와 관련된 조기 반응 유전자이다. 실험에서, MCF-7 세포는 6개의 웰 플레이트 내에서 정상 성장 조건에서 80% 융합률까지 성장되었다. 세포는 부드럽게 찰과되었고, RNA 추출 전에 100 ng/ml의 EGF 리간드[시그마(Sigma)]의 존재 또는 부재 하에서 증가하는 배양 시간(0-45분) 외에 증가하는 전단력(하바드 피펫터를 통해 0-800 다인/㎠)에 노출되었다. FOS mRNA 유도는 30-45분에서 피크에 도달하고, 대략 60분 후에 기저 레벨로 복귀된다. FOS 유도는 또한 EGF 리간드에 의한 배양의 결과로서 자극된다. 중요하게도, 예비 결과는 반-자동화된 플랫폼 상에 생성된 100-800 다인/㎠ 분산의 전단력이 EGF 자극에 비해 현저한 세포 활성화를 유발하지 않음을 지시한다. 얻어진 결과의 그래픽 도해에 대해 도 17 및 도 18을 참조하라.
예 6: 기구
도 1은 예를 들어 조직의 탈응집을 수행하는 기능, 세포-계수기의 기능, 유전자 발현 약물 감수성 테스트의 기능, 및 추가 분석을 위해 샘플을 고정시키는 기능을 통합하기 위한 플랫폼을 제공하는 기구에 사용되는 예시적인 카트리지의 개략도를 도시한다. 도 1 내지 도 22는 본 명세서에 기재된 특징부의 특정 실시예들을 도시한다. 당업자라면 도면들이 본 기재와 함께 고려될 때 다양한 실시예들이 작용하는 방식을 인지할 것이다.
기구는 그것의 주 구성요소로서 다음의 것들을 포함한다: 기구 내에 삽입될 수 있거나 수동 처리를 위해 사용될 수 있는 보관 카트리지(1)로서, 예를 들어 카트리지 상에 분리가능하게 장착되는 96개-웰 플레이트 포맷(2) 내에 복수의 작은 컨테이너를 구비하는 카트리지와; 샘플로부터 오염 물질의 초기 수용, 분산 및 제거를 위한 복수의 컨테이너(3). 컨테이너(3)는, 도 2에 개략적으로 도시되고 이전에 본 명세서에 기재된 바와 같이 상이한 기능을 수행할 수 있다. 카트리지는 라벨(4)을 구비하고, 이 라벨은 샘플의 식별을 용이하게 하기 위해 바코팅될 수 있다. 컨테이너의 각각은 웰과, 내용물의 생물학적 봉입을 보장하고 바늘에 의해 천공가능하지만 바늘의 제거시 재밀봉가능한 시일을 포함한다. 환자로부터 조직 샘플, 전형적으로 샘플 조직을 카트리지(1) 상의 수용기 컨테이너(3) 내에 침착시키는 의사에 의해 세침(5)을 사용하여 흡인 생검물이 수집된다.
카트리지(1)는 이어서 기구 내로 활주되고, 밀폐 도어가 기구를 밀봉시켜, 카트리지(1)는 외부 환경으로부터 생물학적으로 밀봉되고 임의의 생물학적으로 유해한 조직 샘플의 방출에 대항하여 밀봉된다. 대안적인 실시예에서, 카트리지는 특정 시약을 함유한 플랫폼이고, 수동으로 처리될 수 있다.
카트리지(1)는 조직 샘플의 조작을 수행하는데 사용되는 원 물질의 보관 및 처분을 위한 하나 이상의 리셉터클(6)을 구비할 수 있다. 이들 원 물질은 바늘 헤드 및 시약을 포함한다. 바늘 헤드는 구멍, 첨단부, 구멍과 유체 연통되는 바늘 내의 환형부, 및 주사기를 구비한 바늘로 구성된다. 기구는 필요한 경우에 코드를 통해 공급될 수 있는 전류를 제외하고 완비된다.
카트리지는 전형적으로 내부에서 조직 검체를 혼합하기 위해 처리 조립체를 내장하는 수용기 컨테이너(2)를 포함할 수 있다. 수용기 컨테이너(3)는 선택적으로 킬레이트제, 항산화제, 및 점도 개질제를 추가로 포함하는 완충 식염수의 탈응집 용액과 함께 사전패키지되며, 이때 탈응집 용액은 프로테아제의 사용을 피하여야 하는 제약을 갖는다.
수용기 컨테이너(3)는 웰을 위한 시일 커버로 구성된다. 이 완비된 웰 및 처리 조립체 장치는 생체유해물질에 대한 인간 작업자 노출을 최소화시킨다. 맞물림 연장부가 시일 커버를 통해 돌출된다.
기구에는 바늘 헤드의 주사기를 작동시키기 위해, 그리고 수용기 컨테이너 상의 처리 조립체와 같은 기구 내의 몇몇 장치를 작동시키기 위해, 카트리지(1) 상의 보관 웰(6)로부터 바늘 헤드를 선택적으로 픽업할 수 있는 작동기 부재가 설치된다.
기구 내에서의 제1 작동에서, 작동기 부재는 바늘 헤드를 보관 웰(6)로부터 취출하고, 샘플 조직이 의사에 의해 침착되었고 탈응집 용액, 그러한 완충제, 킬레이트제 및 항산화제와 함께 사전패키지되는 수용기 컨테이너(3)에 대해 어느 한 위치로 이동시키며, 수용기 컨테이너(3) 상의 시일을 바늘 헤드로 천공하여 바늘 헤드 첨단부를 균질한 용액 혼합물 내에 액침시키고, 샘플의 일부분을 수용기 컨테이너(3)로부터 바늘 헤드의 주사기 내로 인출하며, 바늘 헤드 첨단부를 수용기 컨테이너 내의 소정의 위치로 이동시키고, 조직 샘플을 손대지 않은 종양 세포 및 오염 물질의 균질한 용액으로 탈응집시키기 위해 인출된 샘플을 동일 또는 제2 수용기 컨테이너(3) 내로 분배한다. 이 단계는 조직 샘플의 소정의 탈응집 레벨을 달성하는데 필요한 횟수만큼 반복된다. 도 3의 예컨대 도면 부호 309를 참조하라.
작동기 부재(또는 수동으로 조작되는 경우에 작업자)는 새로운 바늘 헤드를 카트리지 보관 웰(6)로부터 취출하고, 수용기 컨테이너(3)에 대해 어느 한 위치로 이동시키며, 선택된 수용기 컨테이너(3) 상의 시일을 바늘 헤드로 천공하여 바늘 헤드 첨단부를 균질한 용액 혼합물 내에 액침시키고, 샘플의 일부분을 수용기 컨테이너로부터 바늘 헤드의 주사기 내로 인출하며, 바늘을 수용기 컨테이너로부터 제거하고, 매트릭스 컨테이너에 대해 어느 한 위치로 이동시키며, 매트릭스 컨테이너 상의 시일을 바늘 헤드로 천공하고, 주사기로부터 샘플 부분을 매트릭스 컨테이너(3) 내에 침착시킨다. 도 2를 또한 참조하라. 매트릭스 컨테이너(3)는 수지 비드 베드 위에 위치되는 적재 챔버로 구성되고, 이 수지 비드 베드는 매트릭스 컨테이너의 하단에서 수집 챔버 위에 지지된다. 수지 베드에는 베드의 상단 표면으로부터 베드의 하단 표면까지 연장되는 플러그가 설치된다. 플러그는, 베드의 상단 표면에서 바늘 헤드에 의한 천공을 가능하게 하고 바늘이 하단 표면을 통해 수집 챔버 내로 연장되도록 하는 재료로 형성된다. 도 2를 또한 참조하라. 대안적으로, 수지 베드에는 적재 챔버의 상단 부근으로부터 수지 베드를 통해 수집 챔버의 하단 부근으로 연장되는 도관이 설치된다. 작동시, 침착된 샘플 용액은 수지 베드 위에 침착될 것이고, 중력 이송될 것이며, 또한 용액으로부터 오염물질을 제거하여 수집 챔버 내에 수집되는 수지 베드를 통해 흡입된다. 도관의 상단은 임의의 용액이 수집 챔버 내에 수집되기 전에 수지 베드를 우회하지 못하게 하도록 위치된다.
일 실시예에서, 샘플은 샘플 내에 분산되는 세포의 적절한 수를 보장하도록 검사된다. 작동기 부재는 바늘 헤드를 카트리지 보관 웰(6)로부터 취출하고, 수용기 컨테이너에 대해 어느 한 위치로 이동시키며, 수용기 컨테이너 상의 시일을 바늘 헤드로 천공하여 바늘 헤드 첨단부를 균질한 용액 혼합물 내에 액침시키고, 샘플의 소정의 부분을 수용기 컨테이너(3)로부터 바늘 헤드의 주사기 내로 인출하며, 바늘 헤드를 수용기 컨테이너(3)로부터 제거하고, 세포 계수기 모듈에 대해 어느 한 위치로 이동시키며, 샘플의 소정의 부분을 계수기 모듈 내에 침착시킨다. 바늘 헤드는 이어서 계수기 컨테이너로부터 후퇴되어 카트리지 상의 처분 컨테이너 내에 처분된다.
키트리지 상의 수용기 모듈(3) 중 하나일 수 있는 계수기 모듈은 계수기 컨테이너의 유지 챔버의 내부에 건성 염료와 함께 사전패키지된다. 계수기 컨테이너 내에서, 유지 챔버 내에 침착되었던 계수기 샘플 부분은 염료를 용해시키고, 이 염료는 다시 종양 세포를 염색한다. 소정의 샘플 부분은 계수기 관 내로 하향으로 이송되고, 이는 스캐너에 의한 세포 계수를 위해 광학적으로 스캔된다. 계수기 샘플 부분은 유지 웰 내에서 계수기 관 아래에 수집된다. 광학 스캐너는 계수치를 이 계수치가 성공적인 생검 샘플을 지시하는 소정의 계수치 크기를 충족하는지 또는 초과하는지를 결정하는 지시기로 중계한다. 이어서 분석 결과가 디스플레이 상에 표시되거나 및/또는 프린터에 의해 인쇄될 수 있다. 이 결과는 이어서 즉시 의사에게 추가 생검이 필요한지의 여부에 대해 안내한다. 샘플이 적합하면, 환자는 해방된다.
일단 세포가 분산되어 오염물질이 제거되면, 세포는 테스트 매트릭스(2), 전형적으로 96개 웰 플레이트 포맷 내에 배치되는 분취물로 분할된다. 전형적으로, 웰은 원하는 배지(완충된 식염수 및 테스트 시약)로 사전충진되었다. 작동기 부재는 카트리지로부터 다른 바늘을 픽업하고, 수용기 컨테이너(3)로부터 원하는 양의 분산된 및 오염물질 제거된 세포를 분리시키며, 일련의 밀봉된 샘플 웰(2)에 대해 어느 한 위치로 이동시키고, 각각의 웰 상의 시일을 순차적으로 천공하며, 소정량의 샘플 부분을 각각의 웰 내에 침착시키고, 바늘 헤드를 제거한다. 바늘 헤드는 처분 컨테이너(6) 내에 처분된다.
바람직하게는, 웰(2)은 투약제 및 제제의 각각에 대한 종양 세포의 감수성을 테스트하기 위해 다양한 투약량의 다양한 약제로 사전패키지된다. 웰을 유지시키기 위한 조건은 생리학적 조건에 근사하여야 한다. 웰 내에서의 배지의 pH는 생리학적 pH에 근사하여야 하며, 바람직하게는 pH 6-8이고, 더욱 바람직하게는 약 pH 7 내지7.8이며, 이때 pH 7.4가 가장 바람직하다. 생리학적 온도는 약 30 ℃ 내지 40 ℃ 범위이다. 세포는 바람직하게는 약 35 ℃ 내지 약 37 ℃의 온도로 유지된다. 유사하게, 세포는 공기 중 O2 농도에 비해 비교적 감소된 O2 레벨에서 배양될 수 있어, O2 농도는 공기 중 20% O2보다는 생리학적 레벨(1-6%)에 상당한다. 짧은 배양 시간을 가정하면, 일반적으로 세포에 산소를 공급할 필요가 없다.
소정 길이의 시간 동안 제제로 배양한 후에, 각각의 웰은 추후 분석을 위해 세포를 고정시키는 고착제와 지시제로 처리된다. 이 처리는 작동기 부재, 새로운 바늘 헤드 및 한 병의 고착제에 의해 달성된다.
고형 종양 세포는 또한 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해, 그것들이 필요해질 때까지 냉동보존될 수 있다. 세포는 특정 냉동보존제를 함유한 등장액, 바람직하게는 세포 배양 배지 내에 현탁된다. 그러한 냉동보존제는 디메틸 설폭사이드(DMSO), 글리세롤 등을 포함한다. 이들 냉동보존제는 5-15%, 바람직하게는 8-10%의 농도로 사용된다. 세포는 -10 ℃ 내지 -150 ℃, 바람직하게는 -20 ℃ 내지 -100 ℃. 더욱 바람직하게는 -150 ℃의 온도로 점차 동결된다.
그러나, 본 발명의 분야 및 범주로부터 벗어나지 않고서, 이상 기술된 기구(10) 및 방법에 대해 변형 및/또는 부가가 이루어질 수 있음은 명백하다. 예를 들어, 공정 조립체(34)의 작동 전에 수용기 컨테이너(14)로부터 직접 취해진 샘플에 계수기 컨테이너(46) 및 광학 스캐너(56)가 사용될 수 있다.
예 7: 탈응집 연구
MCF-7 인체 유방 암종 세포(ATCC#HTB-22)가 80% 융합률까지 조직 배양으로 성장된 다음에, 고무 폴리스맨으로 부드럽게 찰과시킴으로써 플레이트로부터 제거되어, 성장 배지 내에 현탁된다. 세포 현탁물의 하나의 분취물은 18G 바늘을 통해 2회 통과되어(각각의 통과시 1 mL/초로 인출/주입), 172 다인/㎠의 벽면 전단 응력 노출과 각각의 세포 또는 응집체에 대해 4회 통과 × 14밀리초/통과 = 56밀리초의 총 노출 시간을 형성한다. 제2 분취물이 18G 바늘을 통해 5회 통과된다(10회 통과 × 14밀리초/통과 = 140밀리초의 노출 시간). 각각으로부터의 대표적인 샘플이 유리 슬라이드 상으로 세포원심분리되고, 95% 에탄올로 고정되며, 파파니콜로 염료로 염색된다. 대표적인 영역의 현미경 사진이 얻어진다(배율 ×200). 비교를 위해, 전이성 유방암을 포함하는 것으로 밝혀진 비대 림프절의 초음파-유도 세침 흡인 생검(FNA)으로부터 다른 이미지가 얻어진다. 이 동일한 인체 샘플로부터의 다른 이미지는 여러 림프구의 배경에서 유방 암종 세포의 몇몇 군을 보였다. 1 mL/초에서 18G 바늘(1")을 통한 2회 인출/주입 사이클 또는 5회 사이클을 갖는 스크레이핑된 MCF-7 및 처리된 MCF-7. 원하지 않는 조건인, 샘플 C에서 5회 인출/주입 사이클은 세포용해 및 핵 유리를 유발하기에 충분한 것에 주목하라.
위의 실험에서, MCF-7 세포의 2회 인출 및 주입 사이클의 노출은 EDTA의 부재 하에서, 스크레이핑된 MCF-7 단층을 분산시키기 위한 작동 조건의 예비 추정을 나타낸다. 이 실험 조건은 tw(4ttransit) = 172 다인/㎠ × 0.056초 = 9.6 다인-초/㎠의 통합된 전단 노출을 제공한다.
예 8: EGFR 차단제에 대한 감수성을 위한 조기 마커로서의 상대적 FOS 발현
표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 지향하는 적어도 35개의 표적화된 암 약물이 승인되거나 임상 실험 중에 있다. 불행히도, EGFR 길항제에 대한 종양 민감성을 예측하는 바이오마커는 대부분의 암에 대해 알려져 있지 않다. EGFR 억제의 말단 효과로서 조기 반응 유전자 FOS의 발현의 변동이 평가될 수 있고, 항종양 효과, 즉 인간 암 세포주(A431, CAL27, HN11, HuCCT1, 및 Hep2)에서의 게피티닙 및 엘로티닙의 성장-억제 및 FOS-변조 효과에 대한 그것의 관계가 결정될 수 있다. 이어서, 이들 세포주는 쥐에 이종이식될 수 있고, 14일간 게피티닙(A431 및 HuCCT1) 또는 엘로티닙(CAL27, HN11, 및 Hep2)으로 처리된다. 종양의 세침 흡인 생검이 FOS 평가를 위해 치료 14일 후 기준에서 수행된다. 또한, 고형 종양을 갖는 환자에서의 게피티닙의 임상 실험으로부터 5쌍의 종양 샘플에서 이 마커를 분석할 가능성이 테스트될 수 있다. 배양시, 게피티닙과 엘로티닙은 감수성 세포주 A431, CAL27, 및 HN11에서 FOS mRNA 레벨을 감소시킨다. 게피티닙 또는 엘로티닙은 EGFR-민감성 A431, CAL27, 및 HN11 종양에서 체내 FOS 발현의 증가를 방해하지만 내성에 대해서는 그렇지 않다. 요약하면, FOS 발현의 변동은 체외 및 체내 모델에 대한 EGFR 억제제의 약리학적 작용을 반영한다. 예컨대 히메노 에이(Jimeno A), 쿨레스자 피(Kulesza P), 킨케이드 이(Kincaid E), 보어라우드 엔(Bouaroud N), 챈 에이(Chan A), 포라스티에 에이(Forastiere A), 브래머 제이(Brahmer J), 클라크 디피(Clark DP), 히달고 엠(Hidalgo M): 항-표피 성장 인자 수용체 효과의 마커로서 C-fos 평가(C-fos Assessment as a Marker of Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Effect), Cancer Res 2006, 66:2385-2390을 참조하라.
예 9: FNA의 신속하지만 적당한 분산을 위한 조건의 최적화
FNA에서 유방 종양 세포의 유사체로서 MCF-7의 선택
MCF-7 인체 유방암 세포가 호르몬 의존성 유방암을 위한 모델로서 광범위하게 연구되었다. 세포는 잘 특징지어진 에스트로겐 수용체(ER) 양성 세포주이고, 따라서 유방암 연구의 유용한 체외 모델이다. 안정된 상피 세포주는 전이성 질환을 갖는 여성 환자로부터의 흉막 삼출로부터 얻어진 인간 유방 암종 세포의 초대 배양으로부터 유래된다[소울(Soule), 1973]. 그때부터, MCF7 세포주는 이론의 여지가 있긴 하지만 대등한 임상적 속성의 결과로 수 천개의 인용문을 갖는 가장 널리 연구되는 유방암 모델이 되었다. 호르몬 의존성 ER-양성 유방암과 유사하게, MCF7 세포는 초기에 타목시펜 및 풀베스트란트와 같은 항-에스트로겐에 민감하다. MCF7 세포주는 또한 다수의 다른 유방암 모델의 유도에 대한 모세포주로서의 역할을 하였으며, 이는 임상 실험 결과를 반복적으로 예측하였다. 또한, MCF7 세포주의 유도체는 일차 호르몬 치료와 관련된 내성의 메커니즘에 대한 식견을 제공하였다.
MCF-7 인간 유방 암종 세포(ATCC#HTB-22)는 개질된 개선된 최소 필수 배지(캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠), 10% 우태 혈청[유타주 로간 소재의 하이클론(Hyclone)], 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(10,000 IU ea., 인비트로젠)에서 성장된다. 80% 융합률에 도달시, 세포는 10 mL의 DPBS에 의해 1회 세척되고, 고무 세포 스크레이퍼로 부드럽게 스크레이핑함으로써 플라스크로부터 분리된다. 세포는 10 mL의 성장 배지 내에 현탁되고, 복제 분취물로 분할된다. 이 프로토콜은 인간 유방암 FNA에 존재하는 종양 세포 클러스터의 대용물인 아주 큰 응집체를 생성하도록 검증되었다. 제1 분취물(3 mL의 현탁된 세포)이 이미지형성되고, 이미지 분석 및 쿨터 계수기에 의해 크기지어진다. 제1 분취물의 초기 크기 상태가 계수된 후, 샘플은 트립신화되고, 모든 세포가 계수된다.
전이성 결장 암종 FNA의 유사체로서 HCT-116 결장 암종 세포주의 선택
인간 결장 암종 세포주 HCT-116(ATCC# CCL-247)은 초기에 인간 남성 결장 선암으로부터 유래되고, 후속 연구에 널리 사용되었다. 그것의 형태는 전이성 결장 암종의 형태와 유사하고, 그것은 라스 원 종양 유전자의 코돈 13의 돌연변이를 비롯한 인간 결장 암종에 공통적인 유전자 특징을 갖는다. 그것은 약제 민감성에 대해 선별된 인간 암 세포주의 NCI-60 패널에 포함된다. 광범위한 cDNA 마이크로어레이 유전자 발현 데이터 및 상관적 약물 활성도 데이터가 이 세포주에 이용가능하다(http://discover.nci.nih.gov/).
HCT-116 배양: HCT-116 세포는 10% 우태 혈청을 갖는 맥코이(McCoy)의 5a 개질된 배지 내에서 증식되고, 37 C 플러스 5% CO2에서 배양된다. 배지는 매 2-3일마다 새것으로 교체되고, 세포는 트립신-EDTA 용액을 사용하여 대략 1:8의 계대배양 비율로 융합될 때 분할된다.
FOS 염색 방법: 세포 클러스터는 슬라이드를 2% 파라포름알데히드, 0.5% 트리톤 X-100을 함유한 용액 내에서 15분간 4 ℃로 배양함으로써 고정된다. 슬라이드는 이어서 3% BSA, PBS 내의 0.5% 트리톤 X-100으로 세척되고, FOS에 대해 50 ㎕의 면양 다클론 항체[델라웨어주 윌밍톤 소재의 캠브리지 리서치 인코포레이티드(Cambridge Research Inc.)]로 2시간 동안 1:20의 희석물(3% BSA, PBS 내의 0.5% 트리톤)에서 배양된다. 슬라이드는 이어서 5 ml의 3% BSA, PBS 용액 내의 0.5% 트리톤으로 3회 세척된다. 각각의 슬라이드는 50 ㎕의 플루오레세인 당나귀 항면양 IgG (H+L) 공액체[오리건주 유진 소재의 몰리큘러 프로우브즈 인코포레이티드(Molecular Probes Inc.)](1:20 희석)로 1시간 동안 배양되고, PBS로 4회 세척되며, 이미지형성된다.
트리판 블루 배제
이 간단한 시험은 세포의 막이 손대지 않은 그대로인 경우에 염료를 배제할 세포의 능력을 측정한다. 강도에 따라, 전단 노출은 막을 과도적으로 투과화시킬 수 있거나, 또는 세포의 원형질막을 영구적으로 손상시킬 수 있다. 분산 실험 후, 세포는 행크 평형 염액 내에 현탁될 것이다. 총 0.2 mL의 현탁물이 0.8 mL의 염색액[0.3 mL의 HBSS 내의 0.5 mL의 멸균 트리판 블루 용액 0.4%(시그마 T-8154)]에 첨가되고, 10분간 배양되며, 세포 수 및 사멸 세포 백분율을 얻기 위해 10 μL의 용액이 혈구계에 의해 계수된다.
생/사멸 염색
트리판 블루 배제가 간단하고 정확하지만, 세포 생존율 및 세포 수의 형광 결정이 더욱 쉽게 자동화되고 소형화되기 때문에 형광 염료의 사용이 테스트된다. 생/사멸 형광 염색은 2가지 염료를 사용한다: 칼세인 AM과 에티디움 호모다이머(EthD-1). 칼세인 AM은 비-형광, 세포 투과가능 염료이다. 그것은 세포내 에스테라제에 의해 생세포 내에서 형광 형체로 분열된다. 에티디움 호모다이머(EthD-1)는 DNA를 결합시키고, 염색체 계수기 염료이지만, 생세포에 침투하지 않고, 사멸 세포를 검출하도록 사용될 수 있다. 표준 키트가 액티브모티프(ActiveMotif)로부터 입수가능하다.
세포자멸사의 검출
노출의 강도에 따라, 유체 전단 응력은 괴사 또는 세포자멸사를 유발할 수 있다. 탈응집 프로토콜의 실행 후 0.5 내지 1시간의 시간에 비-고정된 세포의 세포자멸사를 측정하기 위해, 카스파제 3의 높은 DEVD아제 활성도의 이점을 취하는, 바이오튬(Biotium)으로부터 입수가능한 세포 투과성 누크뷰(NucView)-488 카스파제 3 기질이 사용된다. 카스파제 3은 세포자멸사의 일반적인 마커이다. 누크뷰™ 488 카스파제 3 기질은 형광생성 DNA 염료 및 DEVD 기질의 막 투과성 공액체이다. 세포내 카스파제 3에 의한 염료의 분열은 핵의 동시 염색을 위해 DNA 염료를 유리시킨다.
실험 데이터 A 유전 알고리즘(GA)으로부터 분화율의 결정은 실험의 각각의 인출/주입 사이클 후 얻어진 t1, t2, t3, t4, 및 t5에서 일련의 시계열의 실험적으로 측정된 크기 분포로부터 크기-의존성 분화 커널을 회귀시키기 위해 사용된다. GA는 소진화(교차, 무작위, 적응도-조정 선택)의 원리에 따라 커널 모델의 초기 무작위 개체군을 진화시킨다. 주사기를 통한 각각의 통과 후, 분화로의 이산된 시간에 크기 분포가 측정된다. 주어진 평균 관 전단율(Gavg)에서 얻어진 데이터에 대해서, 식 1(k개 ODE의 세트)은 각각 i-세포의 각각의 클러스터에 대해 ai = A * (Gavg)y(Rhyd)g에 대한 진화가능한 파라미터 세트[A(i,Gavg), y, g]를 포함하는 테스트 "염색체"의 적응도의 평가에 의해 회귀될 것이다. A(i,Gavg)는 세포주이고 완충제-의존성인 것에 주목하라.
MCF-7 및 HCT-116의 스크레이핑된 단층은 분산 특성을 평가하기 위해 10 밀리초 내지 100초의 다양한 시간 동안 멸균 주사기 바늘(5 내지 500 다인/㎠의 벽면 전단 응력) 내에서 포물선형 전단장을 받는다. 신장 유동은 100 ㎛ 내지 1000 ㎛ 범위의 갭 간격을 갖는 충돌 유동을 통해 테스트된다. 세포는 생존율에 대해 테스트된다. 크기 분포는 쿨터 계수기에 의해 얻어진다. 세포 활성화는 고레벨의 전단력에 의해 신속하게 상향조절될 수 있는 조기 반응 유전자인 FOS 면역염색에 의해 측정될 것이다. FOS 유도는 강한 핵 염색을 유발하고, 계수하는 핵에 기초하여 % 활성화로서 기록될 수 있다. 잠재적으로 중요한 세포 표면 단백질을 파괴하는 프로테아제의 사용을 피하는 제약을 갖고서, 킬레이트제 및 점도 개질제와 세포 보호제를 함유한 것들을 비롯한 다양한 완충제가 시험된다.
전단 붕괴 전에 기준 활성화를 확립하기 위해 MCF-7 단층에서의 FOS 염색 및 생존율이 평가되어 스크레이핑된 단층(FNA 유사체)에 대해 얻어진 그것들과 비교된다. 어느 정도까지는, 이는 분산 전 FNA 획득 중의 활성화를 모사한다. 각각의 세포주에 대해, 결정할 가장 중요한 파라미터는 샘플을 탈응집시키기 위한 최소 전단 노출 강도(벽면 전단 응력) 및 최소 전단 노출 시간(바늘을 통한 누적 통과 시간)이다. 분취물(스크레이핑된 세포의 0.2 내지 3 mL의 현탁물)이 컴퓨터-제어식 하바드 주사기 펌프를 사용하여 0.1 내지 5 mL/초의 유량으로 15 내지 21 G 바늘(0.5 내지 2-인치 길이)을 통해 1 내지 10 사이클 통과될 것이다. 10 ml 주사기의 각각의 사이클(인출/주입)은 하나의 사이클로 규정된다. 바늘은 자동화된 액체 취급 시스템용 구성요소의 고객 맞춤 제조업체인 포퍼 앤드 손즈(Popper & Sons)(www.popperandsons.com)로부터 입수된다. 샘플은 각각의 사이클 후 이미지형성된다. 상이한 게이지 바늘 및 상이한 바늘 길이와 상이한 유량의 사용에 의해, 벽면 전단 응력 및 누적 노출 시간은 독립적으로 변경될 수 있다. 벽면 전단 응력은 유량 Q와 선형 비례하지만, 반경의 세제곱과 비례한다.
10밀리초 내지 500밀리초의 시간 동안 10 내지 150 다인/㎠의 층류 벽면 전단 응력에의 노출은 일반적으로 5 내지 10개 세포/클러스터의 클러스터를 얻기 위해 샘플의 탈응집 상태를 제어하기에 충분하다. 일반적으로 스크레이핑된 샘플의 신뢰성 있는 분산에 2 내지 4 사이클이 최적이다. FOS 활성화 및 세포 생존율 연구를 위해서, 핵의 15% 미만이 FOS 발현에 양성이도록 스크레이핑된 단층을 분열시키기 위해 조건 및 전단-유도 FOS 발현이 모니터된다.
유입/유출 효과
샘플의 주사기 내로의 유입 및 주사기 외로의 유출 중 분산의 역할을 평가하기 위해 실험이 수행된다(현저한 신장 유동이 존재할 수 있는 경우에). 결과는 동일한 벽면 전단 응력 및 동일한 누적 전단 노출 시간, 그러나 상이한 수의 유입/유출 사건에 노출되는 샘플이 생성될 수 있도록, 동일한 게이지 바늘 및 동일한 유량, 그러나 상이한 바늘 길이(0.5-인치 대 1.0-인치 대 2.0-인치) 및 상이한 사이클 수와 비교된다. 일반적으로, 샘플 유입 및 유출은 현저한 탈응집을 유발하지 않는다.
각각의 인출/주입 사이클 후 탈응집의 시각적 분석을 위해서, 샘플은 즉각적 세포원심분리를 위해 얼음 상에 배치된다. 세포는 우선 각각의 샘플을 탁상용 원심분리기[헤티치 로티나(Hettich Rotina) 46S]로 2000 rpm에서 원심분리시킨 다음에 농축된 세포 펠릿을 500 ㎕의 평형 염액[노르모졸(Normosol)] 내에 재현탁시킴으로써 현미경 분석을 위해 준비될 것이다. 세포는 이어서 3분간 750 rpm으로 세포원심분리기[써모섄돈 사이토스핀(ThermoShandon Cytospin) 4]를 사용하여 유리 현미경 슬라이드에 인가될 것이다. 슬라이드는 즉시 95% 에탄올로 고정되고, 파파니콜로 염료로 염색될 것이다. 선택된 영역의 디지털 이미지가 어도비 포토샵(Adobe Photoshop)(v. 5.5) 및 디지털 카메라[콘트론 엘렉트로닉(Kontron Elektronik) Prog/Res/3012]가 설치된 광학 현미경[올림푸스(Olympus) BX40]을 사용하여 얻어진다. 세포는 입자 계수 이미지 분석[NIH 이미지(Image)]을 받고, 결과는 원 분취물에 대해 얻어진 세포 계수치와 비교된다.
충돌 유동 시스템
충돌 유동은 바늘의 종단부를 평탄한 플레이트 쪽으로 지향시킴으로써 신뢰성 있게 얻어질 수 있다. 액침된 관으로부터 유출되는 유체 제트가 소수의 관 직경 내에서 급속히 감쇠되기 때문에, S = k(내경)가 k = 0.5 내지 5이도록 갭 간격 S가 바늘 게이지(Ga)와 비례되는 것이 중요하다. 갭 간격은 수동 마이크로미터에 의해 제어된다. 큰 직경의 바늘이 사용되면, 벽면 전단 응력은 급속히 하락된다(표 1 참조). 작은 게이지 바늘(Ga = 10 내지 14)을 평탄한 하단 웰 쪽으로 지향시키고 보다 적은 유동(~ 0.1 mL/초)을 사용함으로써, 관 벽면 전단 응력이 1 다인/㎠ 미만으로 유지될 수 있다. 이 구성에서, 충돌 유동의 제어에 의해 탈응집이 유발된다. 충돌 유동은 세포가 매우 짧은 시간 주기 동안(마이크로초) 집중적인 신장 전단력을 경험하도록 한다. 응집체에 대한 충돌 유동은 분산을 위한 한계치가 한계치 부근일 수 있다는 점에서 더욱 "비선형"일 수 있다. FNA의 고착된 구조체(기질 조직)는 충돌 유동에 이어 표준 관 유동을 필요로 할 수 있다. 이는 컨테이너의 하단에 대한 바늘 위치를 제어하기 위해 스테퍼 모터의 사용에 의해서 자동화된 방식으로 쉽게 달성될 수 있다.
세포 활성화 연구
세포 샘플을 분열시키는 유체 조건을 결정하기 위한 1차 연구 후, 세포 클러스터는 막 완정성(트리판 블루 염색 및 생/사멸 염색), 세포 자멸사(세포 투과성 카스파제 3 형광생성 분석), 및 세포 활성화(FOS 염색)에 대해 분석된다. 양성 대조군으로서, 세포 생존율의 손실을 초래하는 조건이 MCF-7에 대해 이미 알려져 있다. 핵의 5% 미만이 스크레이핑된 단층에서 FOS 양성이다. 스크레이핑된 단층을 작은 클러스터로 분열시키기 위한 전단 조건은 FOS 양성 핵이 15% 미만인 것이다. 세포자멸사 연구를 위해서, 세포는 분산 후 세포자멸사의 발생을 평가하기 위해 분산 후 0.5 내지 1시간 동안 배양된다.
완충제 개질
분산 완충제는, 샘플 분산을 향상시키고 세포 활성화를 최소화시키기 위해 개질될 수 있다. EDTA에 의한 세포외 칼슘의 킬레이트화는 세포들을 함께 유지시키는 접합부의 분해를 용이하게 한다. EDTA 노출(5 mM, pH 7.4)에 이은 재석회화는 자체적으로 세포 자극제로서 테스트된다. 스크레이핑된 단층의 분산 중 활성 산소 생성은 또한 세포 활성화를 유발할 수 있다. N-아세틸-L-시스테인(NAC, 5 mM)은 세포 분산 중 FOS 유도를 감소시킬 수 있다. 마지막으로, 0.2%(w/v) 플루로닉 F68은 다른 막 시스템에서 세포막 상호작용을 통해 세포-보호제 활성도를 보였던 폴리머 첨가제이다.
예 10: 세포의 수량
400 다인/㎠를 사용하여 이전 예들에서와 같이 분산된 HCT-116 및 MCF-7 세포에 대해서, 핵산이 셀 프로텍트(Cell Protect)를 사용하여 안정화되었다. DNA와 RNA가 퀴아젠 추출 기술을 사용하여 추출되었다. 분석을 위한 적절한 RNA 및 DNA 레벨을 얻는데 필요한 세포의 수가 결정되었다. 세포로부터의 RNA가 RNA 완전성 평가(RIN), 광학 밀도 260/280, 및 총 ㎍ RNA를 사용하여 평가되었다. 이 실험은 예를 들어 100,000개 초과의 세포의 샘플 크기가 DNA 및 RNA 분석에 적합함을 확증한다.
이들 결과는 또한 도 13 및 도 14에 그래픽으로 도시된다.
예 11: 세포 계수
이전 예에서 분산된 샘플에 대해서(MCF-7 및 HCT-116), 세포 계수가 테스트되고, 이미지형성 챔버로 분배된 10 내지 100 μL 세포 현탁물 분취물로 검증된다. 이미지 계수치는 혈구계 및 쿨터 계수기 기록 둘 모두와 비교된다. 군집체의 분석을 위해, 트립신 및 단일 세포 계수를 사용하여 완전 분산을 위해 하위집합으로 분할되는 샘플을 사용해서 다양한 이미지형성-처리 알고리즘이 검증된다. 쿨터 계수기는 채널형성기의 사용을 통해 크기 분포를 얻도록 사용될 수 있다.
핵 계수 프로토콜 및 이미지 처리
핵의 형광 염색의 이점은 핵이 단층 배양 및 현탁 세포에서 쉽게 식별되는 아주 크고 이산된 세포 물체라는 것이다. 분리 또는 세척 없는 1-단계 세포 계수를 위한 이미지형성 방법의 검증시, 막 투과성 SYTO-11 및 SYTO-16(인비트로젠)을 비롯한 염료가 다음의 기준을 충족시키는지 테스트된다: (1) 복잡한 고정/세척/염색/세척 프로토콜의 필요 없이 세포에 적용될 수 있고; (2) 저비용 다이오드 또는 레이저에 의해 이용가능한 파장에서 쉽게 여기되며; (3) 높은 신호-대-배경 비율을 생성하고; (4) 세포의 신속한 염색을 생성함. uv-염료[DAPI, 회슈트(Hoescht) 33342]는 이들 기준 중 많은 것을 충족시키지만, uv 공급원을 필요로 하며, 이는 이미지형성 시스템이 소형화되고 경제적으로 사용되어야 할 때 양상 Ⅱ(Phase Ⅱ)에서의 단점이다. 세포는 챔버 슬라이드[랩-텍(Lab-Tek)™ 챔버 슬라이즈(Chamber Slides)™, 눈크(Nunc); 배양 면적: 0.4 ㎠/웰: 작업 체적 ㎕]에서의 이미지형성 전에 최대 5분간 10 mM SYTO11(S7573, 508 nm EX/527 nm EM) 또는 10μM SYTO-16(S7578, 488 nm EX/527 nm EM)에서 배양된다. 디지털 이미지가 어도비 포토샵(v. 5.5) 및 디지털 카메라(콘트론 엘렉트로닉 Prog/Res/3012)가 설치된 현미경(올림푸스)을 사용하여 얻어진다. 이미지는 시각 검사 및 이미지 분석 소프트웨어(NIH 이미지)에 의해 핵 계수치에 대해서 기록된다. 이들 계수치 기록은 혈구계 및 쿨터 계수치 기록 둘 모두와 비교된다. 목적은 100 μL의 세포 현탁물이 10 μL의 염색액에 첨가된 다음에 5분 배양 후 청색 여기/녹색 방출에 의해 이미지형성되는 신속하면서도 정확한 핵 계수 프로토콜을 개발하는 것이다. 선택된 2개가 부적당하면 SYTO 시리즈에서 몇몇 변형물이 입수가능하다. 유사하게, 투과성 핵 염색 CyTRAK 오렌지(Orange)[바이오스테이터스 리미티드(Biostatus Ltd.); 488 nm EX/615 nm EM]가 이들 용도로 테스트될 수 있다.
작은 클러스터에서의 핵의 정확한 계수는 세포 단층 또는 단일 세포 현탁물에서의 핵 계수보다 상당히 더 어렵다. 에지 검출 및 더욱 복잡한 배경은 이미지 분석 소프트웨어에서의 오차를 초래할 수 있다. 정확성 및 일관성을 보장하기 위하여, 어떠한 부정확성이 평균 클러스터 크기, 클러스터 크기 분포, 및 클러스터 밀도/이미지 면적의 함수로서 존재하는지를 결정하기 위해, 완전 트라이신(full trysin)/EDTA 분산에 의해 얻어진 세포 계수치와의 비교가 이루어진다. 필요한 경우에, 신호 범위, 배경 분리, 임계화(thresholding), 물체 검출, 및 입자 계수의 확립을 위해 크기 및 강도 표준물이 현탁물에 첨가된다.
이들 예는 본 발명의 가능한 실시예들을 설명한다. 본 발명이 특히 그것의 몇몇 실시예들과 관련하여 도시되고 설명되었지만, 당업자라면, 그것들이 제한적이 아닌 단지 예시적으로 제시되었고, 형태 및 세부사항에 있어 다양한 변경이 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않고서 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위 및 범주는 전술된 예시적인 실시예들 중 임의의 것에 의해 제한되지 않아야 하고, 오로지 다음의 특허청구범위 및 그 동등물에 따라서만 한정되어야 한다. 본 명세서에 사용된 임의의 표제는 특별히 지시되지 않는 한, 단지 구성적 목적을 위해서만 제공되고, 본 문헌에 임의의 구분이나 의미를 부여하도록 의도되지 않는다.
웹사이트, 학술지 논문 또는 요약문, 공개된 또는 대응하는 미국 또는 외국 특허 출원, 허여된 또는 외국 특허, 또는 임의의 다른 문헌을 비롯한 본 명세서에 인용된 모든 문헌은 그 인용된 문헌에 제시된 모든 데이터, 표, 도면, 및 본문을 포함하여 각각 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
Claims (40)
- 대상물로부터 얻은 응집된 생세포를 함유한 수용액을 탈응집시켜 제1 격리된 챔버 내에 적어도 하나의 테스트 분취물로 분산시키고, 이때 세포를 100 내지 800 다인/㎠의 층류 벽면 전단 응력을 사용하여 탈응집 및 분산시키는 것인 단계;
오염 세포를 제거함으로써 다른 오염 세포 유형에 대한 표적 세포의 백분율을 증가시키기 위해 분취물을 선택적으로 정제하는 단계;
상기 생세포를 세포 배양 없이 분석을 위해 하나 이상의 제2 격리된 챔버 내로 분배하는 단계;
세포 경로 내의 하나 이상의 표적 체외 생체분자에 대한 측정가능한 정량적 또는 정성적 효과를 생성하기 위해 적어도 하나의 테스트 시약을 상기 분배된 세포에 투여하는 단계; 및
상기 분배된 세포의 세포 분석 및 분자 분석 중 어느 하나 또는 양자 모두를 가능하게 하기 위해 분배된 세포를 고정 또는 사멸시켜 안정화시키는 단계
를 포함하는, 대상물로부터 응집된 세포의 조직 샘플을 처리 또는 준비하는 방법. - 제1항에 있어서, 세포는 최소의 세포 활성화 또는 스트레스에 의해 살아 있는 상태에서 처리되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 처리되는 응집된 세포의 총 수는 1000 내지 10×106인 방법.
- 제1항에 있어서, 응집된 세포는 고형 종양 생검물로서 대상물로부터 얻어진 생 암세포인 방법.
- 제4항에 있어서, 샘플은 세침 흡인 기술을 사용하여 얻어지는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 분배된 생세포의 안정화는 대상물로부터 샘플의 획득 후 4시간 내에 완료되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 정량적 또는 정성적 효과는, 대사 경로, 복제 경로, 세포 신호전달 경로, 종양유전자 신호전달 경로, 세포자멸사 경로, 및 신생혈관형성(pro-angiogenic) 경로로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 경로의 활성화 또는 억제인 방법.
- 제1항에 있어서, 정량적 또는 정성적 효과는 G-단백질 결합 수용체 또는 티로신 키나제 수용체에 대한 작용 효과 또는 길항 효과의 측정치인 방법.
- 제8항에 있어서, 티로신 키나제 수용체는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)인 방법.
- 제1항에 있어서, 측정된 정량적 또는 정성적 효과는 즉각적 또는 지연된 조기 유전자군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현 레벨인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 분배된 세포에 테스트 시약을 투여한 다음에, 분배된 세포의 표적 체외 생체분자에 대한 정량적 또는 정성적 효과를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 테스트 시약은 약제, 세포를 자극하기 위한 제제, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항체, Fab 분절, Fc 분절, RNA, siRNA 및 인단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 시약은, 효소, 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 방사성 물질, 양전자 방출 단층 촬영을 이용한 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 제제를 포함하는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 테스트 시약은 정제된 생 암세포를 하나 이상의 격리된 챔버 내로 분배하기 전에 격리된 챔버 중 적어도 하나 내에 사전적재되는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 대상물은 인간이고, 상기 방법은 현장 진료 지점에서 수행되는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 제2 격리된 챔버는 1,000,000개 미만의 정제된 세포를 함유하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 정제는 면역소실을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 분배된 세포의 적어도 일부를 유리 슬라이드 상에 폴리머로 고정시키는 것을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 분배된 세포의 일부에 용해제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 고형 종양으로부터 얻은 생 암세포를 탈응집시켜 적어도 하나의 제1 격리된 챔버 내에 적어도 하나의 테스트 분취물로 분산시키고, 이때 세포를 100 내지 800 다인/㎠의 층류 벽면 전단 응력을 사용하여 탈응집 및 분산시키는 것인 단계;
오염물질을 제거하도록 생 암세포를 선택적으로 정제하는 단계;
상기 생 암세포를 세포 배양 없이 분석을 위해 하나 이상의 제2 격리된 챔버 내로 분배하는 단계;
세포 경로 내의 하나 이상의 표적 체외 생체분자에 대한 측정가능한 정량적 또는 정성적 효과를 생성하기 위해 적어도 하나의 테스트 시약을 상기 분배된 세포에 투여하는 단계; 및
상기 분배된 세포의 세포 분석 및 분자 분석 중 어느 하나 또는 양자 모두를 가능하게 하기 위해 분배된 세포를 고정 또는 사멸시켜 안정화시키는 단계
를 포함하는, 고형 종양으로부터 암세포를 처리 또는 준비하는 방법. - 제19항에 있어서, 분배 단계는 수동으로 또는 자동화된 시스템을 사용하여 수행되는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 탈응집 단계는 고형 종양으로부터 암세포를 포함하는 유체를 소정 크기의 바늘 또는 피펫 팁을 통해 100 내지 800 다인/㎠의 힘으로 통과시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 분배된 생 암세포는 분배 전 유체 내의 생존가능한 암세포의 수에 비해 75% 이상의 생존율을 갖는 것인 방법.
- 카트리지 상의 소정 위치의 적어도 하나의 분리가능한 바이알; 및
서로로부터 분리될 수 있는 복수의 멸균 분리 용기
를 포함하고, 100 내지 800 다인/㎠의 벽면 전단 응력을 생성하도록 구성된 것인, 대상물의 종양으로부터 암세포를 처리 또는 준비하는데 사용되는 카트리지. - 삭제
- 카트리지 상의 소정 위치의 적어도 하나의 분리가능한 바이알; 및
세포를 분산시키기 위한 분리 용기 및 세포를 정제하기 위한 분리 용기를 포함하는 복수의 분리 용기
를 포함하고, 100 내지 800 다인/㎠의 벽면 전단 응력을 생성하도록 구성된 것인, 대상물로부터 응집된 세포의 조직 샘플 또는 고형 종양으로부터 암세포를 처리 또는 준비하는데 사용되는 카트리지. - 제25항에 있어서, 격리된 챔버인 분리 용기를 더 포함하는 카트리지.
- 제25항에 있어서, 바코드를 더 포함하는 카트리지.
- 제25항에 있어서, 세포 계수 시스템을 더 포함하는 카트리지.
- 제25항에 있어서, 복수의 분리 용기 중 적어도 하나는 천공가능한 밀봉부에 의해 덮여지는 것인 카트리지.
- 제25항에 있어서, 1개 내지 96개의 웰을 포함하는 카트리지.
- 제25항의 카트리지와 분석 장치를 포함하는 세포 처리 시스템.
- 제31항에 있어서, 상기 시스템은 현장 진료 지점에서 분석 결정을 생성하는 것인 시스템.
- 제25항의 카트리지를 포함하는 테스트 키트.
- 제33항에 있어서, 상기 키트는 현장 진료 지점에서 사용되는 것인 테스트 키트.
- 제33항에 있어서, 상기 키트는 연구 세팅으로 사용되는 것인 테스트 키트.
- 제33항에 있어서, 사용 설명서를 더 포함하는 테스트 키트.
- 제23항에 있어서, 10 내지 500 ㎛의 직경을 갖는 마이크로통로(micropassage)를 포함하는 카트리지.
- 제25항에 있어서, 10 내지 500 ㎛의 직경을 갖는 마이크로통로를 포함하는 카트리지.
- 삭제
- 삭제
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| US9228785B2 (en) | 2010-05-04 | 2016-01-05 | Alexander Poltorak | Fractal heat transfer device |
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| BR112013018656B1 (pt) | 2011-01-21 | 2021-03-02 | Labrador Diagnostics Llc | método para detectar a presença ou concentração de um analito numa amostra de fluido contido num recipiente, e, método de medição da concentração de analito numa amostra de fluido |
| EP2739587B1 (en) | 2011-08-01 | 2020-05-27 | Denovo Sciences | Cell capture system |
| US10466160B2 (en) | 2011-08-01 | 2019-11-05 | Celsee Diagnostics, Inc. | System and method for retrieving and analyzing particles |
| US9404864B2 (en) | 2013-03-13 | 2016-08-02 | Denovo Sciences, Inc. | System for imaging captured cells |
| US9632102B2 (en) | 2011-09-25 | 2017-04-25 | Theranos, Inc. | Systems and methods for multi-purpose analysis |
| US20140170735A1 (en) | 2011-09-25 | 2014-06-19 | Elizabeth A. Holmes | Systems and methods for multi-analysis |
| US9619627B2 (en) | 2011-09-25 | 2017-04-11 | Theranos, Inc. | Systems and methods for collecting and transmitting assay results |
| US9664702B2 (en) | 2011-09-25 | 2017-05-30 | Theranos, Inc. | Fluid handling apparatus and configurations |
| US8475739B2 (en) | 2011-09-25 | 2013-07-02 | Theranos, Inc. | Systems and methods for fluid handling |
| US10012664B2 (en) | 2011-09-25 | 2018-07-03 | Theranos Ip Company, Llc | Systems and methods for fluid and component handling |
| US9810704B2 (en) | 2013-02-18 | 2017-11-07 | Theranos, Inc. | Systems and methods for multi-analysis |
| JP2013185920A (ja) * | 2012-03-07 | 2013-09-19 | Pathology Institute | 組織アレイシートの製造方法およびその製造装置 |
| WO2013142393A1 (en) * | 2012-03-19 | 2013-09-26 | Hudson River Biolabs | Method and apparatus for collecting, transporting and maintaining live tumor specimens ex vivo |
| US10391490B2 (en) | 2013-05-31 | 2019-08-27 | Celsee Diagnostics, Inc. | System and method for isolating and analyzing cells |
| FR3009622B1 (fr) * | 2013-08-09 | 2015-08-07 | Novacyt | Procede et dispositif de lavage d'un dispositif de pipetage-distribution |
| CA2959992A1 (en) | 2014-09-04 | 2016-03-10 | Theranos, Inc. | Pathogen and antimicrobial resistance testing |
| KR102328995B1 (ko) * | 2014-11-26 | 2021-11-23 | 나노리소스 주식회사 | 폭발형 나노다이아몬드의 분리 방법 |
| US10852291B2 (en) | 2015-02-03 | 2020-12-01 | University Of Washington | Fluidic device and methods of use for processing tissue for pathology |
| US10542961B2 (en) | 2015-06-15 | 2020-01-28 | The Research Foundation For The State University Of New York | System and method for infrasonic cardiac monitoring |
| WO2017079674A1 (en) | 2015-11-04 | 2017-05-11 | Northeastern University | Systems for producing cellular immunotherapeutics and methods of use thereof |
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| WO2018085572A1 (en) * | 2016-11-02 | 2018-05-11 | University Of Iowa Research Foundation | Method and apparatus for selective removal of cells from a cell suspension by mechanical lysis |
| US10391493B2 (en) | 2017-08-29 | 2019-08-27 | Celsee Diagnostics, Inc. | System and method for isolating and analyzing cells |
| DE102018206454A1 (de) * | 2018-04-26 | 2019-10-31 | Robert Bosch Gmbh | System und Verfahren zum Einbringen von Probenmaterial |
| US10647954B1 (en) | 2018-11-15 | 2020-05-12 | Flaskworks, Llc | Dendritic cell generating apparatus and method |
| US20200319162A1 (en) * | 2019-01-23 | 2020-10-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Rapid analysis of live cells |
| US10633693B1 (en) | 2019-04-16 | 2020-04-28 | Celsee Diagnostics, Inc. | System and method for leakage control in a particle capture system |
| AU2020267743B2 (en) | 2019-05-07 | 2023-04-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System and method for automated single cell processing |
| US11273439B2 (en) | 2019-05-07 | 2022-03-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System and method for target material retrieval from microwells |
| KR20220033484A (ko) | 2019-06-14 | 2022-03-16 | 바이오 래드 래버러토리스 인코오포레이티드 | 자동화된 단일 세포 처리 및 분석을 위한 시스템 및 방법 |
| US11566217B2 (en) | 2019-08-13 | 2023-01-31 | Flaskworks, Llc | Duty cycle for cell culture systems |
| WO2021080847A1 (en) | 2019-10-21 | 2021-04-29 | Flaskworks, Llc | Systems and methods for cell culturing |
| JP7363390B2 (ja) * | 2019-11-08 | 2023-10-18 | Jsr株式会社 | 細胞凝集塊分散装置および細胞凝集塊分散方法 |
| WO2021104855A1 (en) * | 2019-11-27 | 2021-06-03 | Thermo Fisher Scientific (Bremen) Gmbh | Systems and methods for imaging and ablating a sample |
| US20210291181A1 (en) * | 2020-03-17 | 2021-09-23 | Detect, Inc. | Seal component for a rapid diagnostic test |
| KR102639140B1 (ko) * | 2020-08-14 | 2024-02-20 | 연세대학교 산학협력단 | 조직 검사 방법 및 조직 검사 장치 |
| JP2022071963A (ja) * | 2020-10-29 | 2022-05-17 | シスメックス株式会社 | 試料調製方法、細胞分析方法、試料調製装置および細胞分析装置 |
| WO2023135575A1 (en) * | 2022-01-14 | 2023-07-20 | Deepull Diagnostics S.L. | Systems, methods, and devices for pathogen identification |
| CN114518425B (zh) * | 2022-02-11 | 2023-03-10 | 中国科学技术大学 | 同时检测单个免疫细胞胞浆和细胞膜的代谢物的分析方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003027236A2 (en) * | 2001-09-21 | 2003-04-03 | Access Genetics, Llc | Systems, methods and kits for remote genetic analysis and consultation |
| US20040014097A1 (en) * | 2002-05-06 | 2004-01-22 | Mcglennen Ronald C. | Genetic test apparatus and method |
| US20050233309A1 (en) * | 2004-04-19 | 2005-10-20 | Hankins William D | Kinetic process for the detection, diagnosis, processing, and monitoring of clonal cell populations |
Family Cites Families (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3941317A (en) | 1973-10-26 | 1976-03-02 | Lnih, Inc. | Method and apparatus for tissue disaggregation |
| US4350768A (en) | 1980-09-19 | 1982-09-21 | Bristol Myers Company | Method for preparing single cell suspension |
| EP0262194A1 (en) * | 1986-03-20 | 1988-04-06 | Beckman Instruments, Inc. | Modular reservoir system |
| SE9201636L (sv) | 1992-05-27 | 1993-11-26 | Gambro Ab | Sätt att utföra respektive system för cytotoxicitetstest samt kit ingående i detta system |
| US5356814A (en) * | 1992-09-29 | 1994-10-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Disaggregation device for cytological specimens |
| JPH0751559A (ja) * | 1993-08-20 | 1995-02-28 | Rigoushiya:Kk | 液体試料の分配秤量装置 |
| JPH09506250A (ja) * | 1993-11-23 | 1997-06-24 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | Ｒｓｅと命名される蛋白チロシンキナーゼ |
| AU698975B2 (en) * | 1993-11-23 | 1998-11-12 | Genentech Inc. | Kinase receptor activation assay |
| JP3329093B2 (ja) * | 1994-09-22 | 2002-09-30 | スズキ株式会社 | 酵素免疫反応測定装置 |
| JP3923968B2 (ja) * | 1995-07-31 | 2007-06-06 | プレシジョン・システム・サイエンス株式会社 | 容器使用方法 |
| US5854009A (en) * | 1995-09-19 | 1998-12-29 | Immuna Care Corporation | Method of detecting estrogen-sensitive pathologies |
| JPH09196917A (ja) * | 1996-01-12 | 1997-07-31 | Suzuki Motor Corp | テストプレート用自動判定装置 |
| JPH1062436A (ja) * | 1996-08-21 | 1998-03-06 | Fujirebio Inc | 液体の分注方法とその装置 |
| US6077684A (en) * | 1996-11-14 | 2000-06-20 | Vanderbilt University | Automated assay for measuring apoptosis in cell culture |
| JP2003144149A (ja) * | 1997-03-31 | 2003-05-20 | Takara Holdings Inc | 分離装置及びその使用方法 |
| DE19729028C1 (de) * | 1997-07-08 | 1999-05-06 | Fraunhofer Ges Forschung | Vorrichtung sowie Verfahren zur Isolierung von Zellmaterial aus einem Gewebeverband und/oder einer Flüssigkeit |
| DE19804372A1 (de) * | 1998-02-04 | 1999-08-05 | Michael W Dr Dr Dahm | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit und dazu geeignete Testkits |
| JP3142521B2 (ja) * | 1998-11-04 | 2001-03-07 | 大成プラス株式会社 | 針刺し止栓とその製造方法 |
| JP2001000178A (ja) * | 1999-06-23 | 2001-01-09 | Asahi Medical Co Ltd | 細胞分離方法及び細胞分離装置 |
| AU2001243505B2 (en) * | 2000-03-08 | 2006-01-12 | Cytyc Corporation | Method and apparatus for preparing cytological specimens |
| RU2282196C2 (ru) * | 2001-05-09 | 2006-08-20 | Эксис-Шилд Аса | Устройство для анализа |
| US7133543B2 (en) * | 2001-06-12 | 2006-11-07 | Applied Imaging Corporation | Automated scanning method for pathology samples |
| JP2003294765A (ja) * | 2002-03-29 | 2003-10-15 | Nippon Soda Co Ltd | セプタム装着治具 |
| US20040157336A1 (en) * | 2002-11-14 | 2004-08-12 | Affymetrix, Inc. | Automated fluid control system and process |
| US7648678B2 (en) * | 2002-12-20 | 2010-01-19 | Dako Denmark A/S | Method and system for pretreatment of tissue slides |
| AU2004204820A1 (en) * | 2003-01-13 | 2004-07-29 | Emory University | Methods of detecting gene expression in normal and cancerous cells |
| AU2005237588B2 (en) * | 2004-04-28 | 2010-07-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Artificial immune system: methods for making and use |
| JP5237638B2 (ja) * | 2004-08-06 | 2013-07-17 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | バイオマーカーを用いたアッセイおよび方法 |
| JP4686682B2 (ja) * | 2004-12-02 | 2011-05-25 | 国立大学法人名古屋大学 | リガンド親和性複合タンパク質の取得方法、抗体スクリーニング方法、抗体スクリーニング用キット、医療方法、抗体医薬、非免疫反応性抗体医薬、投薬方法 |
| US20060183223A1 (en) * | 2005-01-21 | 2006-08-17 | King Michael R | Continuous flow chamber device for separation, concentration, and/or purification of cells |
| GB0505379D0 (en) * | 2005-03-16 | 2005-04-20 | Robio Systems Ltd | Cellular entity maturation and transportation systems |
| WO2007002579A2 (en) * | 2005-06-23 | 2007-01-04 | Bioveris Corporation | Assay cartridges and methods for point of care instruments |
| WO2007075440A2 (en) | 2005-12-16 | 2007-07-05 | Larry Mark Weisenthal | Microaggregates including endothelial cells |
| JP2008039551A (ja) * | 2006-08-04 | 2008-02-21 | Hitachi High-Technologies Corp | 検体処理システム |
-
2008
- 2008-10-24 JP JP2010531056A patent/JP2011501190A/ja active Pending
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-
2011
- 2011-01-07 HK HK11100121.9A patent/HK1145878A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2015
- 2015-07-30 JP JP2015151362A patent/JP6177841B2/ja active Active
- 2015-08-20 US US14/831,789 patent/US20150353880A1/en active Pending
-
2017
- 2017-07-12 JP JP2017136044A patent/JP6675355B2/ja active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003027236A2 (en) * | 2001-09-21 | 2003-04-03 | Access Genetics, Llc | Systems, methods and kits for remote genetic analysis and consultation |
| JP2005512023A (ja) | 2001-09-21 | 2005-04-28 | アクセス ジェネティックス エルエルシー | 遠隔遺伝子分析及び診察用のシステム、方法及びキット |
| US20040014097A1 (en) * | 2002-05-06 | 2004-01-22 | Mcglennen Ronald C. | Genetic test apparatus and method |
| US20050233309A1 (en) * | 2004-04-19 | 2005-10-20 | Hankins William D | Kinetic process for the detection, diagnosis, processing, and monitoring of clonal cell populations |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2018004651A (ja) | 2018-01-11 |
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| WO2009055052A2 (en) | 2009-04-30 |
| KR20100115341A (ko) | 2010-10-27 |
| US20090162853A1 (en) | 2009-06-25 |
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