BR112013018656B1 - método para detectar a presença ou concentração de um analito numa amostra de fluido contido num recipiente, e, método de medição da concentração de analito numa amostra de fluido - Google Patents

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Elizabeth Holmes
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Timothy Michael Kemp
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Abstract

SISTEMAS E MÉTODOS PARA MAXIMIZAÇÃO DE USO DE AMOSTRA Em algumas formas de realização, a presente invenção refere-se a ponto de cuidado e / ou dispositivos de ponto-de-serviço. Em algumas formas de realização, a presente invenção refere-se a sistemas, dispositivos, as interfaces de utilizador, e os métodos para ensaiar amostras usando um ponto de cuidado e / ou dispositivo de ponto-de-serviço. Em um aspecto, os dispositivos e os métodos aqui descritos são concebidos para identificar o tipo de amostra (plasma e sangue, contra etc.), para medir o volume de amostra suficientemente cedo no processo de ensaio para garantir que uma amostra adequada é usada é uma que se destina ensaio. Num outro aspecto, a presente invenção também permite que se possam corrigir os erros de volume significativos que ocorrem na realização de um ensaio.

Description

Referência cruzada
[001]Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente provisório No. US 61/435, 250, depositado em 21 de janeiro de 2011, pedido que e aqui inteiramente incorporado por referência.
Antecedentes da invenção
[002]A descoberta de um grande número de biomarcadores da doença, novas terapias e do estabelecimento de sistemas médicos miniaturizados abriram novos caminhos para a previsão, diagnóstico e acompanhamento do tratamento de doenças em um configuração "ponto de cuidado" ou outras configurações de teste distribuídos. Sistemas de ponto-de- cuidado pode entregar rapidamente os resultados dos testes para o pessoal médico, outros profissionais de saúde e pacientes. O diagnóstico precoce de uma doença ou progressão da doença e o monitoramento da terapia são muitas vezes essenciais para tratamento de doenças mortais, tais como certos tipos de câncer e doenças infecciosas.
[003]O diagnóstico e o tratamento de doenças pode tirar vantagem de medidas de biomarcadores multiplexados, que fornecem o conhecimento adicional do estado de um paciente. Por exemplo, quando a monitorização dos efeitos de uma droga, três ou mais biomarcadores pode ser medido em paralelo. Tipicamente, as placas de microtitulação e outros aparelhos semelhantes tem sido utilizados para realizar ensaios baseados multiplexados separação. Uma placa de microtítulo (por exemplo, uma placa de microtitulação 384) pode executar um grande número de ensaios em paralelo.
[004]Em um dispositivo de Ponto de Cuidado (POC), o número de ensaios que podem ser realizados em paralelo, e muitas vezes limitado pelo tamanho do dispositivo e o volume da amostra a ser analisada. Em muitos dispositivos POC, o número de ensaios realizados e de cerca de 1 a 10. Um dispositivo POC capaz de realizar ensaios multiplexados em uma pequena amostra seria desejável.
[005]Um problema de muitos dispositivos de ensaio POC multiplexados e o alto custo de fabricação dos componentes do dispositivo. Se o dispositivo e descartável, o custo dos componentes pode fazer a produção de um dispositivo de POC impraticável. Além disso, para os dispositivos de POC multiplexados que incorporam todos os reagentes necessários a bordo do dispositivo, se qualquer um dos reagentes exibe instabilidade, todo um lote de fabrico dos dispositivos pode ter que ser descartado, mesmo se todos os outros reagentes são ainda utilizáveis.
[006]Quando um cliente está interessado em personalizar um dispositivo POC para um determinado conjunto de analitos, os fabricantes de sistemas de ensaio POC multiplexados são muitas vezes confrontados com a necessidade de misturar e combinar os testes e reagentes do dispositivo. Um ensaio POC multiplexado adequado a cada cliente pode ser muito caro e difícil de calibrar, e difícil de manter o controle da qualidade.
[007]Os métodos POC tem provado ser muito valiosos no monitoramento da doença e tratamento (por exemplo, sistemas de glicose no sangue em terapia de diabetes, medição do tempo de protrombina na terapia anticoagulante com warfarina). Ao medir vários marcadores, acredita-se que as doenças complexas (como o câncer ), para os quais são necessárias terapias multidroga, podem ser melhor controladas e monitorizados.
[008]Não existe a necessidade de utilizar várias fontes de informação para monitorar o estado de saúde ou condição de doença de indivíduos, bem como tratamentos de várias doenças. Especialmente importante e a medição das concentrações de vários analitos selecionados (biomarcadores, anticorpos, os níveis de expressão de genes, metabólitos, as concentrações terapêuticas do fármaco e semelhantes) ao longo do tempo. Para tornar esse processo conveniente e maximamente eficaz, tecnologias que permitem a medição de todo e qualquer analito necessários (de qualquer tipo) com uma pequena amostra de sangue (gota de sangue obtida por picada no dedo) ou outra amostra adequada são particularmente valiosos. Essa tecnologia vai idealmente ser operada por usuários não-técnicos treinados em ambientes de teste distribuídos, por exemplo, casas, clínicas, consultórios médicos, farmácias e lojas de varejo. A presente invenção aborda estas questões e permite que um seja capaz de fazer tais medições rotineiramente na casa do paciente ou outro ambiente não- laboratorial.
[009]Não existe também a necessidade de fazer a maior utilização de amostras disponíveis, particularmente no caso em que as amostras (por exemplo, amostras de sangue) estão limitadas pelo tamanho da amostra. As amostras de sangue são utilizadas para a grande maioria dos testes médicos/clínicos. As células do sangue tem que ser separados a partir de plasma (ou soro), antes da maioria dos tipos de análise, uma vez a presença de células de comprometer as químicas de ensaio. Por exemplo, a glicose e o colesterol estão, frequentemente, medido pela químicas formadores de cor que seriam interferiram com a presença de elementos formados, especialmente em células vermelhas, ou de hemoglobina (a partir de glóbulos vermelhos lixados).
[0010] Um sistema de teste distribuído idealmente requer uma pequena amostra de sangue obtida por métodos fingerstick. Estas amostras podem ser tão pequenas como 20 microlitros (ul) (uma gota) ou menos. Amostras de maior volume (dizem que até 200 Ul) geralmente não podem ser tomadas por métodos fingerstick sem repetida, inconveniente ("ordenha") dos dedos. Alternativamente venoso amostras de vários mililitros (ml) podem ser tomadas, mas isso requer um flebotomista com formação medica.
[0011] E geralmente muito difícil de executar mais de um único ensaio com pequena amostra de sangue com 20 ul ou menos. isto e especialmente verdade quando a amostra de sangue tem de ser filtrado para remover as células e a recuperação de plasma utilizável a partir de tais pequenos volumes e ineficiente. Tipicamente, apenas cerca de 5 ul ou menos de plasma pode ser recuperado. Amostras grandes como 200 ul, podem ser eficazmente separadas por sistemas automáticos de POC (Abaxis, Biosite etc), mas isto não pode ser realizado de rotina, a menos que um técnico está disponível para extrair a amostra.
Sumario da invenção
[0012] Tendo em vista as limitações dos métodos atuais, existe uma grande necessidade de melhores métodos de separação automática de plasma e/ou outros materiais a partir de células do sangue. Ha também uma necessidade para melhorar a precisão destas medições sobre a concentração do analito. Nas medidas de biomarcadores e outros componentes do sangue para fins de monitorização da terapêutica e de diagnóstico, e importante que o volume correto da amostra seja usado. Em um ambiente de laboratório, isto e conseguido através da utilização de instrumentos automatizados complexos e funcionários profissionais qualificados. Em contraste em ambientes de "point- of-care", como casas, farmácias e lojas, e outros semelhantes, os métodos e equipamentos utilizados devem permitir que as pessoas não treinadas sejam tecnicamente confiáveis para obter e processar amostras.
[0013] A presente invenção responde as necessidades acima mencionadas e proporciona vantagens relacionadas.
[0014] Em algumas formas de realização, a presente invenção refere- se a ponto de cuidado e/ou dispositivos de ponto-de-serviço. Em algumas formas de realização, a presente invenção refere-se a sistemas, dispositivos, as interfaces de utilizador, e os métodos para ensaiar amostras usando um ponto de cuidado e/ou dispositivo de ponto-de-serviço.
[0015] Em um aspecto, os dispositivos e os métodos aqui descritos são concebidos para identificar o tipo de amostra (plasma e sangue, contra etc.), para medir o volume de amostra suficientemente cedo no processo de ensaio para garantir que uma amostra adequada e usada e uma que se destina ensaio. Num outro aspecto, a presente invenção também permite que se possam corrigir os erros de volume significativos que ocorrem na realização de um ensaio.
[0016] Em ainda outro aspecto, este invento permite a medição simultânea de vários analitos diferentes tipos, com alta precisão.
[0017] Um aspecto da invenção pode ser dirigido a um sistema automatizado para a separação de um ou mais componentes num fluido biológico. O sistema automatizado pode compreender uma ponta de pipeta ou tubo fechado adaptado para engatar com um aspirador em que a referida ponta de pipeta ou tubo compreende duas extremidades opostas, pelo menos uma das quais e fechada ou selada, e uma centrifugador configurada para receber a dita ponteira selada ou fechada do tubo para efetuar a referida separação de um ou mais componentes num fluido biológico. Numa forma de realização, o um ou mais componentes são selecionados do grupo constituído por plasma do sangue, soro do sangue, células sanguíneas, e as partículas. Numa outra forma de realização, quando a ponta da pipeta e engatada com o aspirador para efetuar um engate do fluido biológico. Numa outra forma de realização, a ponta da pipeta tem uma extremidade aberta, que forma uma vedação hermética com o aspirador. Numa outra forma de realização, o sistema compreende ainda um dispositivo de imagem, e pelo menos outra ponta da pipeta dimensionado para permitir a distribuição de um líquido para dentro da ponta da pipeta ou tubo de (a) ou para permitir a aspiração de líquido a partir da ponta da pipeta ou tubo de (a). Numa outra forma de realização, a ponta da pipeta ou tubo fechado e orientada verticalmente quando o centrifugador está em repouso. Numa outra forma de realização, a ponta da pipeta ou tubo fechado e orientada na horizontal quando o centrifugador está a girar a uma velocidade de rotação predeterminada.
[0018] Outro aspecto da invenção pode ser um método para o isolamento de componentes de uma amostra compreendendo uma ou mais das seguintes etapas: colocar uma amostra em uma ponta de pipeta ou de um tubo compreendendo duas extremidades opostas, pelo menos uma das quais e selável ou selada; selando a ponta da pipeta na pelo menos uma extremidade da ponta da pipeta; centrifugando a ponta da pipeta selada, formando-se assim uma região interfacial que separa a amostra num sobrenadante e um sedimento; imagiologia centrifugado a ponta da pipeta para determinar a localização da região interfacial, e aspirando o sobrenadante automaticamente com base na localização da região interfacial. Numa forma de realização, o método compreende ainda a determinação da localização do sobrenadante por a referida etapa de imagem e aspiração do sobrenadante automaticamente com base na localização do sobrenadante. Numa outra forma de realização, a determinação ocorre com o auxílio de um processador, o referido processador fornece instruções para um dispositivo de aspiração, que executa a etapa de aspiração automatizado. Numa outra forma de realização, a criação da imagem ocorre através da utilização de uma câmara que está configurada para capturar a imagem do perfil lateral da ponta da pipeta ou tubo. Numa outra forma de realização, o sobrenadante inclui um ou mais dos seguintes procedimentos: o plasma sanguíneo ou o soro do sangue. Noutra concretização, a pelete inclui um ou mais dos seguintes procedimentos: os glóbulos ou partículas.
[0019] Um método assistido por computador para a caracterização de um objeto de análise que se suspeita estar presente na amostra pode ser proporcionada, em conformidade com um aspecto adicional da invenção. O método assistido por computador pode compreender a obtenção de uma imagem digital da amostra, em que a imagem digital compreende, pelo menos, uma matriz bidimensional de pixels, e em que cada pixel compreende uma pluralidade de valores de intensidade, cada um dos quais corresponde a uma detecção espectral distinta região; correlacionando, com o auxílio de um dispositivo programável, os valores de intensidade obtidos com um conjunto predeterminado de valores que definem uma gama dinâmica de cada região espectral a detecção e previsão da presença e/ou quantidade do referido analito na amostra com base no referido correlacionando os valores de intensidade obtidos com um conjunto de valores pré-determinar. Numa forma de realização, a pluralidade de valores de intensidade compreendem valores de intensidade para o vermelho, verde e azul de detecção regiões espectrais. Numa outra forma de realização, o método compreende ainda a seleção de um comprimento de onda de iluminação, que ilumina a amostra e com a iluminação de comprimento de onda selecionada antes e/ou concomitantemente com a obtenção da imagem digital. Numa outra forma de realização, o método compreende ainda, após a obtenção da imagem digital, (a) selecionar outro comprimento de onda de iluminação, (b) iluminar a amostra com o outro comprimento de onda de iluminação selecionado, (c) a obtenção de uma outra imagem digital da amostra, em que a imagem digital compreende, pelo menos, uma matriz bidimensional de pixels, e em que cada pixel compreende uma pluralidade de valores de intensidade, cada um dos quais corresponde a uma detecção região espectral distinta, e (d) prever a presença e/ou quantidade do referido analito na amostra com base nos valores de intensidade obtidos a partir da imagem digital e disse outra imagem digital.
[0020] Além disso, um aspecto da invenção pode ser dirigido a um método de medição da concentração de analito numa amostra de fluido que compreende proporcionar a amostra contida num recipiente dimensionado com uma pluralidade de larguras distintas para permitir a transmissão de luz ao longo de uma pluralidade de diferentes trajetos que correspondem a uma pluralidade de larguras distintas, iluminando o recipiente ao longo de, pelo menos, um de uma pluralidade de comprimentos de percurso, e imagiologia do recipiente para medir uma primeira intensidade de luz transmitida através do dito, pelo menos, um de uma pluralidade de comprimentos de percurso, para o determinação da concentração da substancia a analisar com base naintensidade da luz medida primeiro.
[0021] De acordo com outro aspecto da invenção, um método para detectar a presença ou concentração de um analito numa amostra de fluido contido num recipiente (por exemplo, cuvete) pode compreender a iluminação do recipiente ao longo de uma primeira região tem um primeiro comprimento da trajetória para se obter uma primeira medição da intensidade da luz transmitida através do primeiro comprimento de percurso; deslocar o fluido da amostra para outra região do recipiente tendo outra se o comprimento do percurso primeira medição cai fora de um intervalo predeterminado dinâmico da intensidade de luz transmitida; iluminando o recipiente ao longo da outra região para proporcionar outra medição da intensidade da luz transmitida através do outro comprimento de percurso, e opcionalmente repetindo, segundo e terceiro passos até que a medição da intensidade da luz cai dentro da gama dinâmica pré-determinado, detectando deste modo a presença ou concentração da substancia a analisar. Numa forma de realização, o método compreende ainda desconvoluir uma linha de exploração da imagem, detectando deste modo a presença ou concentração de uma substancia a analisar. Numa outra forma de realização, a amostra e movida a partir de uma primeira região do recipiente tendo um primeiro comprimento caminho para uma segunda região do recipiente ter outro comprimento de percurso por aspiração da amostra. Numa outra forma de realização, uma extremidade do recipiente está ligada a uma pipeta que está configurada para aspirar a amostra. Numa outra forma de realização, a amostra e movida para cima ou para baixo do comprimento do recipiente. Numa outra forma de realização, o recipiente e uma ponta de pipeta. Numa outra forma de realização, o recipiente e de forma cônica. Numa outra forma de realização, o recipiente tem duas extremidades abertas. Numa outra forma de realização, uma primeira extremidade aberta tem um diâmetro maior do que uma segunda extremidade aberta. Numa outra forma de realização, o recipiente tem uma pluralidade de larguras distintas para permitir a transmissão de luz ao longo de uma pluralidade de diferentes comprimentos de caminho. Numa outra concretização, o volume do recipiente e inferior a 100 microlitros. Numa outra forma de realização, uma pluralidade de comprimentos de percurso diferentes são gravados simultaneamente.
[0022] Um método pode ser proporcionado como um aspecto adicional da invenção. O método pode ser fornecido para a caracterização de um objeto de análise que se suspeita estar presente numa amostra de fluido biológico, compreendendo o referido método: proporcionar a referida amostra de fluido biológico, permitindo que o referido analito para reagir com um ou mais reagentes que reagem especificamente com o referido analito para gerar um sinal opticamente detectável, e medir opticamente dito sinal detectável com uma pluralidade de regiões espectrais de detecção, em que a presença do referido sinal ótico detectável dentro de uma gama dinâmica de pelo menos uma região do espectro de detecção e indicador da concentração do referido analito na referida amostra biológica de fluido. Numa forma de realização a medição e feita por um dispositivo de imagiologia configurado para medir uma pluralidade de regiões espectrais de detecção. Numa outra forma de realização, o dispositivo de imagem e configurado para medir uma pluralidade de regiões espectrais de detecção em simultâneo. Numa outra forma de realização, o dispositivo de imagem está configurado para medir uma pluralidade de regiões espectrais de detecção sequencialmente.
[0023] Um aspecto da invenção proporciona um método para aumentar a precisão de um ensaio compreendendo uma amostra de imagem numa primeira ponta para determinar o volume do primeiro exemplo; imagiologia de um ou mais reagentes em uma segunda ponta para determinar o volume do um ou mais reagentes, mistura da amostra e dos um ou mais reagentes para formar uma mistura de reação, a mistura de reação de imagem; corrigir a calibração com base no referidos determinados volumes da amostra e dos um ou mais reagentes, e calculando uma concentração de um analito usando a calibração corrigida. Numa forma de realização, o método compreende ainda a mistura de reação de imagem para determinar o volume da mistura de reação. Numa outra forma de realização, a imagem da amostra na primeira ponta e conduzida usando uma câmara configurada para capturar um perfil lateral da primeira ponta. Numa outra forma de realização, a imagem latente de um ou mais reagentes na segunda ponta e conduzida usando uma câmara configurada para capturar um perfil lateral da segunda ponta. Numa outra forma de realização, a altura da amostra e dos um ou mais reagentes e calculada com base nos perfis capturados. Numa outra forma de realização, a determinação do volume e baseada na altura da amostra e os um ou mais reagentes e as áreas transversais conhecidos da amostra e um ou mais reagentes, respectivamente. Numa outra forma de realização, a calibração e também baseada no volume determinado de mistura de reação.
[0024] Outro aspecto da invenção proporciona uma configuração, compreendendo: um recipiente configurado para aceitar e confinar uma amostra, em que o recipiente compreende uma superfície interior, uma superfície exterior, uma extremidade aberta e uma extremidade fechada oposta, e uma ponta configurada para estender para dentro do recipiente através da extremidade aberta, em que a ponta compreende uma primeira extremidade aberta e a segunda extremidade aberta, em que a segunda extremidade aberta e inserida dentro do vaso, em que o recipiente ou a ponta compreende ainda uma característica de superfície saliente que impede a segunda extremidade aberta da ponta entre em contato com a parte inferior da superfície interior da extremidade fechada do recipiente. Numa forma de realização, a característica de superfície e integralmente formada na superfície interior do fundo do vaso. Numa outra forma de realização, a característica da superfície compreende uma pluralidade de saliências na superfície interior do fundo do vaso. Numa outra forma de realização, a característica de superfície esta saliente na ou perto da extremidade fechada.
[0025] Outro aspecto da invenção proporciona um aparelho de processamento de amostras que compreende uma estação de preparação da amostra, a estação de ensaio, e/ou a estação de detecção, uma unidade de controlo tendo comandos executáveis de computador para realizar um serviço de ponto-de-serviço no local designado com o auxílio de pelo menos uma da dita estação de preparação da amostra, a estação de ensaio e da estação de detecção, e pelo menos uma centrifugadora configurado para executar a centrifugação de uma amostra a partir de uma picada no dedo. Numa forma de realização, a centrífuga e contida dentro da estação de preparação da amostra e/ou a estação de ensaio. Numa outra forma de realização, os comandos executáveis computador são configurados para realizar o serviço de ponto de serviço num local selecionado do grupo consistindo de um distribuidor local, de origem do sujeito, ou uma avaliação/tratamento local de saúde.
[0026] Outro aspecto da invenção proporciona um método para a dinâmica de retorno, compreendendo o referido método: fazer uma medição inicial de uma amostra no interior de um recipiente utilizando um mecanismo de detecção, com base na dita medição inicial, determinando, utilizando um processador, se a concentração de amostra cai numa gama desejada, e determinando, utilizando um transformador, (a) um grau de diluição ser realizada se a concentração da amostra e maior que o intervalo desejado ou (b) um grau de concentração a ser realizado se a concentração de amostra e menor do que o intervalo desejado, e ajustando a concentração da amostra de acordo com o grau de diluição ou o grau de concentração determinada. Numa forma de realização, o método compreende ainda fazer uma subsequente medição da amostra no interior do recipiente. Numa outra forma de realização, o método compreende ainda, com base na medição subsequente determinação, utilizando um processador, se a concentração de amostra cai num intervalo desejado. Numa outra forma de realização, a medição subsequente e efetuada por meio do mecanismo de detecção. Numa outra forma de realização, o método compreende ainda a determinação de uma característica da amostra com base na medição subsequente. Numa outra forma de realização, a característica e selecionada entre um ou mais dos seguintes: a presença ou concentração de um analito, a presença ou concentração de uma célula, e a morfologia da célula. Numa outra forma de realização, a medição subsequente e efetuada por meio de um mecanismo de detecção separado do mecanismo de detecção inicial. Numa outra forma de realização, a medição inicial proporciona uma medição da concentração celular bruto da amostra. Numa outra forma de realização, a medição subsequente fornece uma medida da concentração de células da amostra de maior resolução do que a medição inicial. Numa outra forma de realização, a medição inicial e feita pela imagem da amostra. Numa outra forma de realização, o ajuste da concentração da amostra permite a detecção da substancia a analisar que, de outro modo ficam fora da gama desejada.
[0027] Outro aspecto da invenção proporciona um método para proporcionar o controlo de qualidade, o referido método compreendendo a captura de uma imagem de condições nas quais um mecanismo de detecção mede uma característica de uma amostra, e a determinação, usando um processador, com base na imagem se existem condições indesejáveis sob o qual o mecanismo de detecção e utilizada. Numa forma de realização, as condições indesejáveis inclui a presença de um ou mais materiais indesejáveis. Numa outra forma de realização, os materiais indesejáveis inclui um ou mais dos seguintes procedimentos: bolhas, partículas, fibras, detritos e precipitados, que interfere com a medição da característica da amostra. Numa outra forma de realização, o mecanismo de detecção e um mecanismo diferente a partir de um mecanismo utilizado para captar a imagem. Numa outra forma de realização, a imagem e capturada utilizando uma câmara. Numa outra forma de realização, o método compreende ainda o fornecimento um alerta se uma condição indesejável e detectada. Numa outra forma de realização, o método compreende ainda o ajustamento da amostra se é uma condição indesejável detectada. Numa outra forma de realização, a imagem inclui uma imagem da amostra. Numa outra forma de realização, a imagem inclui uma imagem de uma ou mais das seguintes características: o recipiente da amostra, do mecanismo de detecção.
[0028] Outro aspecto da invenção e um sistema automatizado para a separação de um ou mais componentes num fluido biológico que compreende uma centrífuga que compreende um ou mais recipientes configurados para receber um recipiente para efetuar a referida separação de um ou mais componentes de uma amostra de fluido, e do recipiente, em que o recipiente inclui uma ou mais características que a forma e complementar a uma estrutura em forma de recipiente. Numa forma de realização, a estrutura em forma de recipiente inclui uma ou mais prateleiras sobre as quais uma porção saliente do recipiente está configurada para descansar. Numa outra forma de realização, o recipiente está configurado para ser capaz de aceitar uma pluralidade de recipientes que tem configurações diferentes, e em que a estrutura em forma de recipiente inclui uma pluralidade de prateleiras, em que um primeiro recipiente tendo uma primeira configuração e configurada para assentar num primeiro prateleira, e um segundo recipiente com uma segunda configuração e configurado para repousar sobre uma segunda prateleira.
[0029] Outro aspecto da invenção proporciona uma unidade de ensaio compreendendo uma primeira extremidade e uma segunda extremidade, uma superfície exterior e uma superfície interior compreendendo um ou mais padrões selecionados cada um dos quais e imobilizada nela ou nele com um reagente de captura capaz de capturar um objeto de análise que se suspeita estar presente numa amostra biológica, em que a primeira extremidade e a segunda extremidade tem dimensões diferentes.
[0030] Outro aspecto da invenção proporciona uma unidade de ensaio compreendendo um identificador que é utilizado para determinar (a) a um ou mais reagentes de captura imobilizados na superfície interior e (b) da fonte da amostra biológica, se a unidade de ensaio contem disse amostra.
[0031] Outro aspecto da invenção proporciona uma unidade de ensaio compreendendo uma pluralidade de padrões selecionados, cada padrão da referida pluralidade compreende um agente de captura distinto.
[0032] Outros objetivos e vantagens da invenção serão ainda mais apreciados e entendidos quando considerados em conjunto com a seguinte descrição e desenhos anexos. Enquanto a descrição seguinte pode conter detalhes específicos descrevem formas de realização particulares da invenção, isto não deve ser interpretado como limitação para o âmbito da invenção, mas sim como uma exemplificação de formas de realização preferíveis. Para cada aspecto da invenção, são possíveis muitas variações, tal como aqui sugerido, que são conhecidos dos peritos na arte. Uma grande variedade de alterações e modificações podem ser feitas dentro do âmbito da invenção, sem nos afastarmos do espírito da mesma. Os vários compostos/dispositivos aqui descritos podem ser usados separadamente ou em qualquer combinação conjunta, por quaisquer métodos divulgados na presente invenção individualmente ou em quaisquer combinações.
Incorporação de referencia
[0033] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesta descrição são aqui incorporados por referência na mesma medida como se cada aplicação individual publicação, patente ou patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.
Breve descrição dos desenhos
[0034] As novas características da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações anexas. Uma melhor compreensão das características e vantagens da presente invenção será obtida com referência a seguinte descrição pormenorizada, que apresenta formas de realização ilustrativas, nas quais são utilizados os princípios da invenção, e o desenho anexo (s), dos quais:
[0035]A Figura1 mostra uma vista lateral de uma centrifugadora.
[0036]A Figura2 mostra uma face na vista de uma centrifugadora.
[0037]A Figura3 mostra uma vista em perspectiva da parte traseira deuma centrifugadora.
[0038]A Figura4 mostra uma vista de topo de uma ponta da amostra.
[0039]A Figura5 mostra uma vista lateral de uma ponta da amostra.
[0040]A Figura6 mostra uma vista em corte transversal de uma pontada amostra.
[0041] A Figura 7 mostra um diagrama de uma ponta de uma amostra posicionada no exemplo acima um plasma/interface globular.
[0042] A figura 8 mostra um gráfico do tempo de centrifugação, tal como uma função de rotações por minuto.
[0043] A Figura 9 mostra um gráfico do tempo de centrifugação, tal como uma função do raio do rotor da centrifugadora.
[0044] A Figura 10 mostra uma ponta vazia de amostra tampada.
[0045] A Figura 11 mostra uma ponta de amostra tampada contendo uma amostra de um fluido corporal, por exemplo, sangue.
[0046] A Figura 12 mostra uma ponta de amostra tampada contendo uma amostra de cerca de 23% de hematócrito sanguíneo após centrifugação.
[0047] A Figura 13 mostra uma ponta de amostra tapado contendo uma amostra de cerca de 31% de hematócrito no sangue, após a centrifugação.
[0048] A Figura 14 mostra uma ponta de amostra tapado contendo uma amostra de sangue de cerca de 40% de hematócrito após a centrifugação.
[0049] A Figura 15 mostra uma ponta de amostra tapado contendo uma amostra de cerca de 52% de hematócrito no sangue, após a centrifugação.
[0050] A Figura 16 mostra uma ponta de amostra tapado contendo uma amostra de sangue de 68% de hematócrito, após a centrifugação.
[0051] A Figura 17 mostra uma comparação de hematócritos medidos utilizando pelo sistema de imagens digitais de uma amostra centrifugada ("hematócrito, relatou%") e hematócrito medido pelo aparelho padrão micro- hematócrito ("hematócrito,% alvo").
[0052] A Figura 18 mostra um diagrama de uma ponta usada para reações e uma ponta usada para sangue/plasma (dimensões mostradas em mm).
[0053] A Figura 19 mostra um tubo capilar cilíndrico contendo uma amostra.
[0054] A Figura 20 mostra os ângulos e dimensões para o cálculo de volumes dentro de um recipiente cônico, por exemplo, um capilar.
[0055] A Figura 21 mostra os ângulos e dimensões para cálculo de volumes dentro de um recipiente cônico, por exemplo, um tubo capilar.
[0056] A Figura 22 mostra os ângulos e dimensões para calcular o volume de uma calota esférica.
[0057] A Figura 23 mostra as dimensões para o cálculo do volume de uma amostra contida dentro de uma ponta cilíndrica, em que a amostra tem um único menisco.
[0058] A Figura 24 mostra as dimensões para o cálculo do volume de uma amostra contida dentro de uma ponta cilíndrica, em que a amostra tem dois meniscos.
[0059] A Figura 25 mostra as dimensões para o cálculo do volume de uma amostra contida dentro e/ou em associação com uma ponta cilíndrica, em que a amostra tem dois meniscos e dos quais um e externo a ponta cilíndrica.
[0060] A Figura 26 mostra as dimensões para o cálculo do volume de uma amostra contida dentro de uma ponta cilíndrica, onde existe uma bolha na amostra.
[0061] A Figura 27 mostra as dimensões para o cálculo do volume de uma amostra contida dentro de uma ponta cilíndrica, onde existe uma bolha no exemplo que abrange a largura da ponta cilíndrica.
[0062] A Figura 28 mostra as dimensões para o cálculo do volume de uma amostra contida dentro e/ou em associação com uma ponta cilíndrica, em que a amostra inclui uma gota pendente de amostra fora da ponta cilíndrica.
[0063] A Figura 29 mostra as dimensões para o cálculo do volume de uma amostra residual contido dentro de uma ponta cilíndrica.
[0064] A Figura 30 mostra uma amostra de sangue dentro de uma ponta antes de ser misturada com um reagente magnético.
[0065]A Figura 31 mostra uma amostra de sangue a ser misturada comum reagente magnético.
[0066] A Figura 32 mostra uma amostra de sangue, misturado com um reagente.
[0067] A Figura 33 mostra uma amostra de sangue, misturado com um reagente magnético contido dentro de uma ponta.
[0068] A Figura 34 mostra uma amostra de sangue, misturado com um reagente magnético deslocado para uma posição selecionada dentro de uma ponta.
[0069] A Figura 35 mostra uma força magnética aplicada por um ima (M) para uma amostra de sangue, misturado com um reagente magnético.
[0070] A Figura 36 mostra uma amostra de sangue que tenha sido separado para um componente de glóbulos vermelhos e de um componente de plasma utilizando força magnética.
[0071] A Figura 37 mostra um bem posicionada por baixo de uma ponta que contém uma amostra de sangue que tenha sido separado para um componente de glóbulos vermelhos e de um componente de plasma.
[0072] A Figura 38 mostra uma representação de plasma sanguíneo a ser transferido a partir de uma ponta de um poço.
[0073]Figura 39 mostra uma ponta após dispensa de plasma sanguíneopara um poço.
[0074] Figura 40 mostra uma imagem de alto contraste de uma ponta cilíndrica contendo um líquido com baixa absorção.
[0075] A Figura 41 mostra uma imagem de uma ponta cônica, contendo um líquido com elevada absorvência.
[0076] A Figura 42 mostra uma ponta com um líquido de alta absorção mostrando dois meniscos na ponta.
[0077] A Figura 43 mostra uma ponta com uma amostra de líquido e as bolhas grandes que abrangem o diâmetro da ponta.
[0078] A Figura 44 mostra uma dica contendo agua mostrando um menisco superior claro em uma ponta transparente ou capilar.
[0079] A Figura 45 mostra um gráfico da concentração de proteína C- computada como uma função do volume de amostra.
[0080] A Figura 46 mostra uma imagem de um dispositivo de transferência de amostra com um capilar, habitação, embolo, groove, e apresentam elevado. O recurso elevado pode ajudar a localizar o embolo no alojamento.
[0081] A Figura 47 mostra um exemplo contido com o capilar de um dispositivo de transferência de amostras.
[0082] A Figura 48 mostra um dispositivo de transferência de amostra depois de uma amostra ter sido injetada por um embolo.
[0083] A Figura 49 mostra um dispositivo de transferência de amostra depois de uma amostra ter sido incompleta injetada.
[0084]A Figura 50 mostra uma ponta cônica que contém uma amostra,com a posição l3 indicado pela seta mostrada.
[0085] A Figura 51 mostra um gráfico da relação entre a distância entre ll e l2 e a distância entre l3 e lG como uma função do volume de amostra.
[0086] A Figura 52 mostra um esquema de uma reação química que produz um produto colorido.
[0087] A Figura 53 mostra um esquema de uma reação química que produz um produto de cor a partir do colesterol.
[0088] Figura 54 mostra um esquema de uma reação química que utiliza equivalentes redutores para a produção de um produto colorido.
[0089] A Figura 55 mostra um exemplo de um composto que muda de cor mediante a ser complexado com um fon de metal.
[0090] A Figura 56 mostra uma série de imagens de dicas com dupla concentração decrescente de albumina da direita para a esquerda, com exceção da mais à esquerda da ponta, que não tem albumina.
[0091] A Figura 57 mostra uma série de imagens de dicas com dupla concentração diminuição do colesterol, da direita para a esquerda, exceto para a ponta mais à esquerda, que não tem colesterol.
[0092] A Figura 58 mostra uma série de cavidades hemisféricas maquinado a partir de um bloco de plástico opaco branco, que cada poço ter duas vezes a concentração de analito a partir da diminuição da direita para a esquerda, com exceção para a esquerda mais bem, que não tem nenhum analito. Em algumas formas de realização, o analito pode ser cálcio.
[0093] A Figura 59 mostra uma série de cavidades hemisféricas maquinado a partir de um bloco de plástico opaco branco, que cada poço ter duas vezes a concentração de analito a partir da diminuição da direita para a esquerda, com exceção para a esquerda mais bem, que não tem nenhum analito. Em algumas formas de realizado, o analito pode ser magnésio.
[0094] A Figura 60 mostra uma série de cavidades hemisféricas maquinado a partir de um bloco de plástico opaco branco, que cada poço ter duas vezes a concentração de analito a partir da diminuição da direita para a esquerda, com exceção para a esquerda mais bem, que não tem nenhum analito. Em algumas formas de realizado, o analito pode ser ureia.
[0095] Figura 61 mostra uma série de dicas de soluções contendo azul de bromofenol.
[0096] Figura 62 e uma ilustração de dicas com uma pluralidade de comprimentos de percurso ótico distintas.
[0097] A Figura 63 mostra um percurso de luz através de uma tina retangular.
[0098] A Figura 64 mostra um percurso de luz através de um poço de microtitulação.
[0099] A Figura 65 mostra um percurso de luz através de uma tina de forma cônica.
[00100] A Figura 66 mostra um gráfico da intensidade da luz como uma função de localização, como medido nas pontas contendo amostras com diferentes concentrações de soluções de azul de bromofenol para o vermelho, o verde, e os canais de cor azul.
[00101] A Figura 67 mostra uma imagem das dicas que foram analisados na Figura 66.
[00102] A Figura 68 mostra um gráfico de sinal como uma função da concentração de azul de bromofenol como medido pelo vermelho, verde e os canais de cor azul. A densidade ótica pode ser medida a 589 nm.
[00103] A Figura 69 mostra um gráfico em escala logarítmica de resposta de sinal como uma função da concentração de azul de bromofenol como medido pelo azul (losangos) e vermelho (quadrados) canais de cor.
[00104] A Figura 70 mostra um gráfico da concentração medido por analise de cor das imagens digitais como uma função de concentração real.
[00105] A Figura 71 mostra um gráfico de resposta do sinal, medida pelo vermelho (quadrados), verde (losangos), e azul (triângulos) canais de cor em função da concentração de albumina.
[00106] A Figura 72 mostra três gráficos de resposta do sinal medido para o verde, vermelho, e os canais de cor azul para partículas de látex de poliestireno.
[00107] A Figura 73 mostra dicas que contem cada uma separadamente reagentes NADH, WST-1, PMS, e duas pontas que contém uma mistura dos reagentes.
[00108] A Figura 74 mostra uma imagem digital de dicas contendo dupla concentração decrescente de lactato desidrogenase (lDH) da esquerda para a direita.
[00109] A Figura 75 mostra um gráfico da densidade ótica medida a 450 nm como uma função da lDH.
[00110] A Figura 76 mostra as soluções de cloreto de potássio adicionados a tiras de doseamento de potássio.
[00111] Figura 77 mostra dicas contendo amostras de sangue misturado com reagentes de tipagem de sangue para Anti-A, Anti-B, Anti-D, e controle (da esquerda para a direita).
[00112] A Figura 78 mostra sinais medidos para o sinal em função da posição para o vermelho (coluna da esquerda), verde (coluna do meio) e azul (coluna da direita) para amostras misturadas com Anti-A, Anti-B, Anti-D, e reagentes de controlo.
[00113] A Figura 79 mostra o sinal normalizado em função da concentração relativa medida para comprimentos de trajeto estreitas e largas usando vermelho, verde, e os canais de cor azul.
[00114] A Figura 80 mostra um gráfico do log da concentração medida como uma função da concentração real, que ilustra a precisão do algoritmo de medição.
[00115] A Figura 81 mostra uma imagem de fluorescência de produtos em tubos de ensaio.
[00116] A Figura 82 mostra uma imagem dos produtos de reação em pontas. A Figura 83 mostra uma imagem dos produtos de reação em pontas. A Figura 84 mostra uma imagem dos produtos de reação em pontas. A Figura 85 mostra uma imagem dos produtos de reação em pontas. A Figura 86 mostra uma imagem dos produtos de reação em pontas. A Figura 87 mostra uma imagem dos produtos de reação em pontas.
[00117] A Figura 88 mostra uma imagem de cor de fundo obtida para a calibração.
[00118] A Figura 89 mostra uma imagem de fluorescência dos produtos de reação em dicas.
[00119] A Figura 90 mostra a resposta do canal de cores vermelho e azul e resposta de fluorescência em função do número de cópias de ADN.
[00120] A Figura 91 mostra o gráfico de transformada de sinal de 3 cor como uma função do sinal de fluorescência.
[00121] A Figura 92 mostra um gráfico de resposta do sinal do canal verde, em função da posição do pixel.
[00122] A Figura 93 mostra uma imagem de dicas contendo soluções de azul de bromofenol e agua.
[00123] A Figura 94 mostra uma imagem de dicas adicionais que podem conter soluções de azul de bromofenol e agua.
[00124]A Figura 95 mostra um diagrama esquemático de uma ponta quecontem misturas de reação para realizar ensaios múltiplos.
[00125] A Figura 96 mostra uma imagem de dicas contendo soluções de azul de bromofenol e agua.
[00126] A Figura 97 mostra um gráfico da resposta de sinal para a amostra, a agua, e controlo de entre múltiplos padrões.
[00127] As amostras podem ser calibradores aquosas contendo concentrações conhecidas de analito.
[00128] A Figura 98 mostra ensaios de pontas contendo tanto de Ca 2 + (região superior da ponta) e Mg 2 + (região inferior da ponta).
[00129] A Figura 99 mostra quatro pontas com vários tipos de amostras de soro: hemólise (de cor avermelhada), lipemicas (cinza), icterícias (de cor amarela), e normal (da esquerda para a direita).
[00130] A Figura 100 mostra um esquema de uma câmera e componentes óticos.
[00131] A figura 101 mostra uma vista em corte transversal de uma câmara e dos componentes óticos, incluindo uma fonte de luz branca, uma abertura, e um sensor.
[00132] A figura 102 mostra um diagrama esquemático de uma instalação de sinal ótico para a medição de luz, utilizando (a) um sensor que está posicionado para detectar a luz num angulo perpendicular a um feixe de excitação, e (B) um sensor que está posicionado em linha com um feixe de excitação.
[00133] A figura 103 mostra imagens obtidas usando (a) um feixe de excitação perpendicular a um sensor e (B) um feixe de excitação que está em linha com um sensor.
[00134] A figura 104 mostra uma matriz de tintas impressas que podem ser utilizadas para calibrar a configuração ótica.
[00135] A Figura 105 mostra um gráfico de sinal em função do volume da amostra.
[00136] Series 1-5 podem corresponder a diferentes concentrações de analitos, tais como 0, 20, 40, 60 e 80, respectivamente.
[00137] A Figura 106 mostra um gráfico de sinal em função do volume da amostra. Series 1-5 podem corresponder a diferentes concentrações de analitos, tais como 0, 20, 40, 60 e, respectivamente.
[00138] A Figura 107 mostra um gráfico de sinal em função do volume da amostra. Series 1-5 podem corresponder a diferentes concentrações de analitos, tais como 0, 20, 40, 60 e 80, respectivamente.
[00139] A Figura 108 mostra um gráfico da concentração do analito medido como uma função da concentração de analito real.
[00140] A Figura 109 mostra um gráfico da concentração do analito medido como uma função da concentração de analito real.
[00141] A Figura 110 ilustra esquematicamente um método exemplar para um ensaio EllSA. verticais.
[00142] A Figura 111 mostra um exemplo de um rotor em repouso comrecipientes
[00143] A Figura 112 mostra um exemplo de um rotor a uma velocidade de recipientes de um pequeno angulo em relação ao horizontal.
[00144] A Figura 113 mostra um exemplo de configuração de um recipiente.
[00145] A Figura 114 mostra um exemplo de um recipiente de centrifugação acasalada com o recipiente.
[00146] A Figura 115 mostra um exemplo de outro recipiente de centrifugação que pode ser acoplado com o recipiente.
[00147] A Figura 116 mostra um exemplo de um recipiente de centrifugação. A Figura 117 mostra um exemplo de uma dica de extração.
[00148] Figura 118 fornece um exemplo de como o vaso centrifugação e extração de ponta podem acasalar.
[00149] Figura 119 e uma imagem que foi tirada da mistura de reação original antes da centrifugação.
[00150] A figura 120 e outra imagem, que foi feita da mistura reacional inicial antes da centrifugação.
[00151] A figura 121 e uma imagem adicional que foi feita da mistura reacional inicial antes da centrifugação
[00152] Figura 122, Figura 123, Figura 124, Figura 125, Figura 126, Figura 127, Figura 128, Figura 129, Figura 130 relativas a exatidão, precisão, previsto para a concentração.
[00153] A Figura 131 mostra imagens recolhidas por uma câmera digital.
[00154] A Figura 132 ilustra exemplos de imagens tiradas do produto de reação.
[00155] A Figura 133 apresenta exemplos de imagens que foram analisadas antes de girar na centrífuga e, após girar na centrífuga.
[00156] A Figura 135 ilustra os espectros de diversas amostras de soro.
[00157] A Figura 136 ilustra um processo de detecção de exemplo da invenção utilizando uma matriz.
[00158] A Figura 137 ilustra um processo de detecção de exemplo da invenção utilizando perolas.
[00159] A Figura 138 ilustra um processo de detecção de exemplo da invenção utilizando aptameros etiquetados.
[00160] Figura 139 ilustra a detecção de ligação aptamer a uma sonda complementar.
[00161] A Figura 140 ilustra a ausência de ligação entre aptamer e uma sonda não-complementares.
[00162] A Figura 141 ilustra a especificidade de ligação de aptameros em um arranjo.
[00163] A Figura 142 mostra uma visão mais detalhada da detecção do analito em uma matriz.
[00164]A Figura 143 mostra uma matriz exemplo.
[00165]A Figura 144 mostra um gráfico de quimiluminescência contraa concentração para um ensaio de vitamina D.
[00166] A Figura 145 mostra um gráfico de quimiluminescência contra a concentração para um ensaio estradiol.
[00167] A Figura 146 mostra uma medição espectrofotométrica da concentração WBC. A figura 147 mostra parcelas de turvação como uma função do tempo.
[00168] Figura 148 e uma trama de pontos de inflexão para os três experimentos em 800 cópias/Ul e 80 cópias/ul.
[00169] A figura 149 e uma representação gráfica de um exemplo em que as esferas magnéticas são utilizadas para a análise de proteínas e de moléculas pequenas através de ensaios de EllSA.
[00170] A figura 150 e uma representação gráfica de um exemplo em que as esferas magnéticas são utilizadas para a análise de proteínas e demoléculas pequenas através de ensaios de EllSA.
Descrição detalhada da invenção
[00171] Enquanto formas de realização preferida da invenção tenham sido mostradas e descritas, será óbvio para os especialistas na matéria que tais concretizações são fornecidas apenas a título de exemplo. Numerosas variações, alterações e substituições agora ocorrerão aos peritos na arte sem se afastar do invento. Deve ser entendido que várias alternativas as formas de realização da invenção aqui descritas podem ser empregues na pratica da invenção.
[00172] A invenção fornece aplicações móveis para o sistema e métodos para o uso da amostra de maximização. Vários aspectos da invenção aqui descritos podem ser aplicados a qualquer uma das aplicações particulares apresentados abaixo, ou por quaisquer outros tipos de aplicações de diagnóstico ou terapêutico. O invento pode ser aplicado como um sistema independente ou método, ou como parte de uma aplicação pré-clínica integrada, clínico, de laboratório ou médico. Deve ser entendido que os diferentes aspectos da presente invenção podem ser apreciados individualmente, em conjunto, ou em combinação uns com os outros.
[00173] Os dispositivos e sistemas aqui descritos podem proporcionar um meio eficaz para a detecção em tempo real dos analitos no fluido corporal de um sujeito. Os métodos de detecção podem ser utilizados numa vasta variedade de circunstancias, incluindo a identificação e quantificação de analitos que estão associadas com os processos biológicos específicos, as condições fisiológicas, doenças ou estágios de desordens. Como tal, os sistemas tem um largo espectro de utilidade em, por exemplo, rastreio de drogas, o diagnóstico da doença, a classificação filogenética, identificação forense e parental, o início da doença e de recorrência, da resposta individual ao tratamento contra população de bases, e/ou monitorização da terapêutica. Os dispositivos e sistemas sujeitos também são particularmente uteis para o avanço da fase pré-clínica e clínica de desenvolvimento de terapêuticas, melhorando a adesão do paciente, monitorando ADRs associados a um medicamento prescrito, o desenvolvimento de medicina individualizada, o teste de sangue terceirização do laboratório central para a casa ou em uma receita base e/ou monitoramento de agentes terapêuticos após a aprovação regulatória. Os presentes dispositivos e sistema podem ser utilizados por externalização de testes de sangue a partir de um laboratório central. Os dispositivos e sistemas podem fornecer um sistema flexível para a medicina personalizada. Usando o mesmo sistema, um dispositivo pode ser alterado ou trocado, juntamente com um protocolo ou instruções para um processador programável dos sistemas para executar uma vasta variedade de ensaios, tal como descrito. Os sistemas e dispositivos aqui descritos, ao mesmo tempo que são muito menores e/ou portáteis, incorporam características novas e oferecem muitas funções de um instrumento de laboratório.
[00174] Em um aspecto, um sistema da invenção compreende um dispositivo que compreende as unidades de ensaio e unidades de reagentes, que incluem os reagentes, por exemplo, líquidos e/ou reagentes em fase sólida. Em algumas formas de realização, pelo menos um de todo o dispositivo, uma unidade de doseamento, uma unidade de reagente, ou uma sua combinação e descartável. Num sistema do invento, a detecção de uma substancia a analisar com o dispositivo objeto e tipicamente automatizada. Tal automatização pode ser efetuada por um protocolo embarcado ou um protocolo fornecido para o sistema pelo fabricante.
[00175] Os dispositivos e sistemas como descritos aqui podem oferecer muitos recursos que não estão disponíveis nos sistemas de POC ou análise de sistemas integrados existentes. Por exemplo, muitos cartuchos POC dependem de um sistema de circuito fechado ou de fluidos para manipular pequenos volumes de líquido de uma maneira eficiente. Os dispositivos fluídicos tais como cartuchos aqui descritos podem ter movimento de fluido aberta entre as unidades dentro de um dado cartucho. Por exemplo, um reagente pode ser armazenado numa unidade, uma amostra armazenada numa unidade de recolha de amostra, um diluente armazenado numa unidade de diluente, e a superfície de captura pode ser uma unidade de doseamento, em que num estado de cartucho, nenhum das unidades está em comunicação fluida com qualquer uma das outras unidades. As unidades podem ser móveis em relação as outras, a fim de trazer algumas unidades em comunicação de fluido com um dispositivo de transferência de fluido do sistema. Por exemplo, um dispositivo de transferência de fluido pode compreender uma cabeça que engata numa unidade de doseamento e da unidade de doseamento traz em comunicação fluídica com uma unidade de reagente. Em alguns casos, a cabeça e uma cabeça de pipeta que move a unidade de ensaio (por exemplo, topo) de fluido em comunicação com uma unidade de reagente.
[00176] Deste modo, numa forma de realização, a presente invenção proporciona um método para detectar e/ou medir a concentração de um analito num fluido corporal ou amostra de tecido, o método compreende, tipicamente, os passos de proporcionar uma amostra (por exemplo, sangue, urina, saliva, tecido), para um dispositivo ou sistema da invenção, permitindo que a amostra para reagir, pelo menos, dentro de uma unidade de doseamento do dispositivo, e detectar o sinal detectável gerado a partir da substancia a analisar na amostra de sangue.
[00177] Um aspecto da invenção fornece para a análise de amostras utilizando um dispositivo de ponto de cuidados que está configurado para maximizar a utilização da amostra. Por exemplo, mais do que cerca de 15, 25, 50, 75, ou 100 ensaios podem ser realizados em uma amostra com um volume de menos do que cerca de 1, 20, 50, 100, ou 500 μf. A amostra pode ser uma amostra de sangue colhida a partir de uma picada no dedo. A amostra pode ser coletada em uma ponta capilar ou lacrado. A amostra pode ser preparado por um ou mais ensaios, submetendo a amostra a uma separação (por exemplo, centrifugação) e/ou o processo de diluição. Os um ou mais ensaios, podem ser preparados através da combinação da amostra, o que pode ter sido separada e diluída com um ou mais reagentes numa câmara de reação . A câmara de reação pode ser uma ponta de pipeta, tubo de ensaio, um dispositivo de transferência das amostras, e/ou uma cuvete. Os um ou mais ensaios pode ser configurado de tal modo que se um sinal ótico pode ser medida, que é indicativa da concentração de um ou mais analitos na amostra. A câmara de reação pode conter uma pluralidade de ensaios, que podem ser separados espacialmente. Uma pluralidade de sinais óticos pode ser gerada dentro de uma única câmara de reação de um ensaio ou de uma pluralidade de ensaios separados espacialmente. Os um ou mais sinais óticos pode ser medida por uma câmara de imagem digital que pode medir uma pluralidade de regiões ou bandas espectrais de detecção de detecção, por exemplo, vermelho, verde e azul. O sinal ótico pode ser medido com o produto da reação do ensaio na câmara de reação, que pode ser uma ponta de pipeta ou de outros recipientes de amostra. Os sistemas, dispositivos e métodos podem ser totalmente automatizados ou semi-automatizados pela lógica programável.
[00178] Outro aspecto da invenção proporciona sistemas, dispositivos e métodos para a preparação de amostras para análise. As amostras podem ser preparadas para análise por um ou mais dispositivos de separação. Por exemplo, uma amostra pode ser preparada para a análise por centrifugação dentro de uma centrifugadora. Outros separações baseadas na carga, tamanho, hidrofobicidade/hidrofilicidade e/ou volatilidade pode também ser implementadas.
[00179] Um aspecto da invenção fornece para a amostra e a análise do produto de reação através da análise baseada em imagem. O sistema pode incluir uma câmara que pode medir um sinal ótico com uma ou mais regiões do espectro de detecção. Por exemplo, uma câmera pode medir um sinal ótico usando regiões do espectro de detecção azuis vermelho, verde.
[00180] O sinal de medição pode incluir os três valores medidos, que podem ser interpretados usando um ou mais algoritmos aqui descritos. A utilização de mais do que uma região do espectro de detecção pode aumentar a gama dinâmica de um ensaio e pode aumentar a precisão de uma medição, em comparação com medições usando uma única região do espectro de detecção.
[00181]A invenção também proporciona sistemas, dispositivos emétodos para a realização de medições óticas em amostras de ensaio e os produtos de reação que estão contidos dentro de câmaras de reação, cada um com uma pluralidade de comprimentos dos percursos distintos. As câmaras de reação podem ter uma pluralidade de comprimentos de percurso diferentes de tal forma que uma maior ou menor quantidade de absorção de luz e observada. A pluralidade de comprimentos de percurso diferentes (tais como, por exemplo, através da amostra e/ou a câmara de reação), permite um aumento da gama dinâmica de um protocolo do ensaio escolhido. A imagem da câmara de reação pode ser analisada tal como aqui descrito para obter informação sobre a amostra, ou os produtos de reação de ensaio. A combinação da utilização de uma pluralidade de comprimentos de caminho disponíveis dentro de uma única câmara de reação e a utilização de três regiões do espectro de canal de detecção aumenta significativamente o alcance dinâmico de cada ensaio.
[00182]Um sistema para realizar a preparação e análise da amostra pode incluir instrumentação, componentes descartáveis, e reagentes. O sistema pode aceitar amostras e realiza automaticamente uma pluralidade de ensaios sem intervenção do usuário. Quando desejado, a instrumentação pode incluir uma interface de utilizador gráfica, um mecanismo de introdução de cartuchos, que pode ser descartável, uma platina motorizada, que podem ter mobilidade em três dimensões, um ou mais dispositivos de cabeça única manipulação de líquidos, um ou mais multi-dispositivos de manuseio de líquidos da cabeça, um ou mais aparelhos para realizar a preparação da amostra, sensores óticos, que podem incluir um PMT e/ou um aparelho de imagem, controladores de temperatura, e dispositivos de comunicação. O componente descartável pode incluir um cartucho descartável que contem pontas de amostras, os selos da ponta, e dos reagentes. Em algumas formas de realização, o cartucho descartável pode também conter conjuntos neutralizantes configurados para absorver e neutralizar os produtos líquidos de ensaio.
[00183] A instrumentação, componentes descartáveis, e reagentes pode ser alojado dentro de um ambiente pode ser fechada, tal como uma caixa ou um armário. Em algumas formas de realização, o processo tem uma área de secção transversal menor do que cerca de 4 m2, 2 m2, 1 m2 de 0,5 m2, 0,1 m2, 0,05 m2, ou inferior. A invenção proporciona um sistema de teste distribuído, tais como um dispositivo de ponto-de-tratamento, o que pode incluir um ou mais dos seguintes aspectos: Eficiente separação (centrífuga) de sangue e recuperação do plasma separado A diluição da amostra de plasma de um ou mais níveis (por exemplo, 1: 10,: 100, 1: 1000) de modo a que cada ensaio pode ser realizado a uma diluição ótima Distribuição otimizada de exemplo para vários ensaios diferentes que podem envolver várias metodologias diferentes
Protocolos de ensaio ideal
[00184] O uso de cuvetes de extremidade aberta de seção circular para análise da amostra, misturando com reagentes, incubação e apresentação de sistemas óticos
[00185] Analise dos ensaios utilizando tecnologia de imagem (digitalização e/ou fotografia, e/ou microscopia)
[00186] Numa forma de realização, o dispositivo do invento e auto- contido e compreende todos os reagentes, reagentes de fase sólida-líquida e, necessários para realizar uma pluralidade de ensaios em paralelo. Quando desejado, o dispositivo e configurado para realizar, pelo menos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais ensaios. Um ou mais ensaios de controlo também podem ser incorporados no dispositivo a ser realizados em paralelo se desejado.
[00187] Calibradores também pode ser fornecidos para a calibração do sistema de ensaio. Alguns exemplos dos controles secos e calibradores uteis para a calibração do sistema de ensaio podem incluir soluções aquosas de analitos, soro, plasma ou amostras com níveis conhecidos de analitos, tais quantidades conhecidas de calibradores e controles podem também ser seco por liofilização, secagem sob vácuo, e fabricação de outros processos (e dissolvida durante o ensaio).
[00188] Ao incorporar estes componentes dentro de um sistema de ponto-de- tratamento, o doente ou o utilizador pode ter uma pluralidade de analitos, por exemplo, mais do que cerca de 10, 20, 30, 50, 75, 100, 150, ou 200 analitos quantificado em menos do que cerca de ,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 60, 120, 180, 240, 480 ou 600 minutos.
[00189] Os dispositivos e os sistemas de sujeitos podem ser utilizados para a realização de imune ensaios quantitativos, que podem ser concluídas num período de tempo curto. Outro tipo de ensaio pode ser realizado com um dispositivo da invenção, incluindo, mas não limitado a, as medições de sequencias de ácido nucleico e as medições de metabolito, tal como o colesterol ou eletrólitos, tais como magnésio e íons de cloreto. Em algumas concretizações, o ensaio e terminado em não mais do que uma hora, de preferência menos de 120, 60, 30, 15, 10, 5, 4, 3, 2 ou 1 minuto. Em outras concretizações, o ensaio e realizado em menos de 5 minutos. A duração do ensaio de detecção pode ser ajustado de acordo com o tipo de ensaio que é para ser realizado com um dispositivo da invenção. Por exemplo, se necessário para a maior sensibilidade de um ensaio pode ser incubada por mais de uma hora ou até mais do que um dia. Em alguns exemplos, os ensaios que requerem um longo período podem ser mais prático em outras aplicações, tais como POC usodoméstico, de em um ambiente clínico POC.
[00190] Em outras formas de realização da invenção, as unidades de reagente de um dispositivo sujeito está configurado para ser um conjunto de componentes de mistura e fósforo.
[00191] Uma unidade de reagente armazena tipicamente reagentes líquidos ou sólidos necessários para a realização de um ensaio que detecta um determinado analito. As unidades de ensaio podem, por vezes (ou, opcionalmente nem sempre) compreender pelo menos uma superfície de captura capaz de reagir com uma substancia a analisar a partir da amostra de fluido corporal. A unidade de doseamento pode ser uma ponta tubular com uma superfície de captura no interior da ponta.
[00192] Exemplos de dicas do invento são aqui descritos. Cada unidade de doseamento individual e reagentes pode ser configurada para funcionar de forma independente ensaio. Para a montagem de um dispositivo, as unidades podem ser montadas de uma forma just-in-time para utilização num dispositivo integrado, o qual pode tomar a forma de cartucho.
[00193] Um invólucro para um dispositivo do invento podem ser feitas de um material polimerico, um material metálico ou um material compósito, tal como, por exemplo, de alumínio, de poliestireno ou de outro plástico moldável ou maquinável, e pode ter definido para colocar locais de ensaio unidades e unidades de reagentes. O alojamento pode incluir um metal ou qualquer outro material. O alojamento pode incluir, parcial ou totalmente, as unidades de ensaio e/ou unidades de reagentes. O alojamento pode suportar o peso das unidades de ensaio e/ou unidades de reagentes. Numa forma de realização, o alojamento tem meios para secar dicas ou unidades de ensaio para remover o excesso de líquido. Os meios para a mata-borrão pode ser uma membrana porosa, tal como acetato de celulose, ou uma peça de material absorvente, tais como papel de filtro.
[00194] Em algumas formas de realização, pelo menos um dos componentes do dispositivo podem ser fabricados com materiais poliméricos. Exemplos não limitativos de materiais poliméricos incluem poliestireno, policarbonato, polipropileno, polidimetilsiloxanos (DMS), poliuretano, cloreto de polivinila (PVC), de polissulfona, de polimetilmetacrilato (PMMA), acrilonitrilo-butadieno-estireno (ABS), e vidro.
[00195] O dispositivo ou os subcomponentes do dispositivo podem ser fabricados por vários métodos, incluindo, sem limitação, a estampagem, moldagem por injeção, de gravação em relevo, moldagem, moldagem por sopro, de maquinagem, soldadura, soldadura ultrassônica, e ligação térmica. Numa forma de realização, um dispositivo em fabricados por moldagem por injeção, uma ligação térmica, e soldadura ultrassônica. Os subcomponentes do dispositivo podem ser fixados ao outro por uma ligação térmica, soldadura ultrassônica, encaixe de atrito (encaixe de pressão), adesivos ou, no caso de certos substratos, como por exemplo, vidro, ou semirrígida e substratos poliméricos não rígidos, uma adesão natural entre os dois componentes.
[00196] Um sistema como o descrito pode ser executado de uma variedade de ensaios, independentemente da substancia a analisar a ser detectada a partir de uma amostra de fluido corporal. Um protocolo dependente da identidade do dispositivo pode ser transferido a partir de um dispositivo externo, onde pode ser armazenado em um leitor, para permitir a montagem do conjunto leitor para a realização do protocolo específico no dispositivo. Em algumas concretizações, o dispositivo dispõe de um identificador (lD), que é lido ou detectado por um detector identificador aqui descrito. O identificador pode permitir a comunicação bidirecional entre o dispositivo e um sensor ou sistema de recepção. O detector de identificador pode comunicar-se com um módulo de comunicação através de um controlador que transmite o identificador para um dispositivo externo. Quando desejado, o dispositivo externo envia um protocolo armazenado no dispositivo externo para o módulo de comunicação com base no identificador. O protocolo a ser executado no sistema pode compreender instruções para o controlador do sistema para executar o protocolo, incluindo, mas não se limitando a um ensaio particular a ser executado e um método de detecção a ser executada. Uma vez que o ensaio e realizado pelo sistema, um sinal indicativo de uma substancia a analisar na amostra de fluido corporal e gerado e detectado por um conjunto de detecção do sistema. O sinal detectado, em seguida, pode ser comunicado para o conjunto de comunicações, em que pode ser transmitida para o dispositivo externo de processamento, incluindo, sem limitação, o cálculo da concentração de analito na amostra.
[00197] Os sistemas, dispositivos e métodos para efetuar a análise de amostras utilizando dispositivos de point-of-care e pontas que podem funcionar como câmaras de reação são descritos na Publicação de Patente EUA No. 2009/0088336 e Pedido Provisório dos EUA n °60/997, 460, cada um de que e aqui incorporado por referência na sua totalidade para todos os fins.
Manuseio de amostragem e câmaras de reação
[00198] As amostras, reagentes, e ensaios reunidos aqui descritos podem ser manuseado e contidos por uma variedade de tipos de câmara de reação. Um exemplo de dispositivo de uma câmara de reação e entregando pode ser um poço, um tubo ou uma ponta de extremidade aberta, a qual também pode ser uma cuvete. Como aqui utilizado, uma ponta pode também referida como uma ponta de amostragem, uma ponta de cuvete, uma câmara de reação, uma cuvete, um, um dispositivo de entrega de amostra capilar ou de um dispositivo de transferência de amostras. As amostras podem ser coletadas a partir de uma fonte em uma ponta ou um tubo. As pontas podem ser seladas. Tais vedações podem ser permanentes ou reversíveis. As amostras diluídas podem ser combinadas com um ou mais reagentes e misturadas (como descrito nos pedidos anteriores) dentro de "elementos de ensaio", tais como pontas (tinas abertas) ou poços aberta ou fechada. Uma vez que o ensaio e preparado para a leitura, o elemento de doseamento pode ser apresentado ao sistema ótico para análise de imagem ou outros tipos de leitura. Alternativamente, as misturas de reação do ensaio podem ser transferidas a partir de um tipo de elemento para outro. Por exemplo, os ensaios incubados em dicas podem ser transferidos para um meio de ensaios ou absorvente ou absorvente incubado em poços pode ser aspirado para dentro de pontas. Muitos ensaios podem ser processados em paralelo. leitura de ensaio pode ser serial ou simultânea, dependendo do protocolo do ensaio e/ou o tempo de incubação. Para os ensaios envolvendo a medição de uma taxa de variação, o elemento de doseamento pode ser apresentado ao sistema ótico mais de uma vez em ocasiões diferentes.
Fluido e dispositivos de transferência de materiais
[00199] Um dispositivo de transferência de fluido pode ser parte de um sistema. O dispositivo de transferência de líquido pode compreender uma pluralidade de cabeças. Qualquer número de cabeças conforme e necessário para detectar uma pluralidade de analitos numa amostra e concebida para um dispositivo de transferência de fluido da invenção. Em um exemplo, um dispositivo para transferência de fluidos dispõe de cerca de oito cabeças montadas em linha, separadas por uma distância. Numa forma de realização, as cabeças tem um bocal cônico que engata por encaixe de pressão com uma variedade de pontas, tal como o ensaio de unidade ou unidades de recolha de amostras, tal como aqui descrito. As pontas podem ter uma funcionalidade que permite que eles sejam removidos automaticamente pelo instrumento e colocado numa caixa dentro de um dispositivo tal como descrito, após a utilização. Numa forma de realização, as pontas de ensaio são claras e transparentes, e podem ser semelhantes a um cadinho no qual é executado um ensaio que pode ser detectada por um detector ótico tal como um tubo fotomultiplicador ou sensor.
[00200] Em um exemplo, um processador programável (por exemplo, uma unidade central de processamento CPU) de um sistema pode incluir, ou ser configurado para aceitar (tal como, por exemplo, a partir de uma localização de memória) instruções ou comandos e pode operar um dispositivo de transferência de fluido de acordo com as instruções para transferir amostras de líquido por qualquer retirada (para a aspiração de líquido a) ou que se estende (para expelir líquido) de um pistão para um espaço de ar fechado. O processador pode ser configurado para facilitar a aspiração e/ou de distribuição. Tanto o volume de ar deslocado e a velocidade do movimento podem ser controlados com precisão, por exemplo, pelo processador programável.
[00201] A mistura de amostras (ou reagentes) com os diluentes (ou outros reagentes) podem ser atingidas por aspiração de componentes a serem misturados dentro de um tubo de aspiração comum e, em seguida, várias vezes uma fração significativa do volume de líquido reunido para cima e para baixo para uma ponta. Dissolução de reagentes secos em um tubo pode ser feito de forma semelhante e. A incubação das amostras e reagentes líquidos, com uma superfície de captura no qual está ligado um reagente de captura (por exemplo, um anticorpo) pode ser conseguida puxando o líquido apropriado para dentro da ponta e mantendo-a durante um tempo predeterminado. A remoção de amostras e reagentes pode ser conseguida por expelir o líquido para dentro de um reservatório ou de uma almofada absorvente dentro de um dispositivo tal como descrito. Outro reagente pode em seguida ser colocada na ponta de acordo com as instruções do protocolo ou do processador programável.
[00202] Um sistema pode incluir um suporte ou engate para mover as unidades de análise ou dicas. Um engate pode incluir um conjunto vazio ou um conjunto projetado para caber confortavelmente em um chefe de uma unidade de ponta do ensaio. Por exemplo, um meio para deslocar as pontas podem ser movidos de uma forma semelhante a cabeça do dispositivo de transferência de fluidos. O dispositivo também pode ser movido sobre um palco de acordo com a posição de um ou engate titular.
[00203] Em uma forma de realizado, um instrumento para mover as pontas e a mesma como um instrumento para mover um volume de amostra, tal como um dispositivo para transferência de fluidos, tal como aqui descrito. Por exemplo, uma ponta de coleta de amostras pode ser caber em uma cabeça pipeta de acordo com o chefe na ponta coleção. A ponta de recolha pode, então, ser usado para distribuir o líquido ao longo do dispositivo e do sistema. Após o líquido ter sido distribuído, a ponta de recolha pode ser eliminada, e a cabeça da pipeta podem ser caber em uma unidade de doseamento de acordo com a saliência na unidade de doseamento.
[00204] A ponta do aparelho de ensaio pode então ser movida a partir da unidade de reagente para a unidade do reagente, e reagentes pode ser distribuído para a unidade de doseamento de acordo com a ação ou a aspiração do tipo pipeta fornecida pela cabeça da pipeta. A cabeça pipeta também pode realizar a mistura dentro de uma ponta de coleção, a unidade de análise, ou unidade de reagente por tipo seringa de aspiração ou ação.
[00205] Numa outra concretização, pontas contendo líquidos, incluindo misturas de reação do ensaio podem ser desligadas do dispositivo de pipetagem e "estacionadas" em locais específicos dentro do instrumento, ou dentro de uma unidade descartável. Se necessário, podem ser tapadas pontas utilizando um vedante (tal como utilizado na centrífuga) para evitar a drenagem de líquidos para fora. Em algumas formas de realização, o vedante pode ser um vedante de vinila.
Exemplares de pontas de Amostra
[00206] Uma variedade de formas de contentores podem ser utilizadas como pontas de exemplo, câmaras de reação, e tinas. Por exemplo, uma tina pode ser circular, cilíndrica, quadrada, retangular, cubica, cônica, piramidal ou qualquer outra forma capaz de conter uma amostra de líquido. Cuvetes retangulares, onde um feixe de luz incide perpendicularmente as superfícies de cuvetas como mostrado em planta e vistas em corte na Figura 63 podem ser empregues. Nesses cuvetes retangulares, a amostra líquida que e iluminado também e retangular e é definido por cuvete. Cuvetes com seções transversais circulares também podem ser usados. Por exemplo, alguns tipos de placas de micro titulação em que o volume da amostra e iluminada na parte definida pela amostra menisco, como mostrado abaixo em planta e vista em corte na Figura 64.
[00207] As cuvetes de comprimento de caminho variável pode ser utilizada para otimizar e prolongar a resposta do ensaio e minimizar o volume de amostra necessário para medir o ensaio. Cuvetes pode ser maior, em relação a sua secção transversal em pelo menos uma região. Em alguns casos, o comprimento da trajetória de uma cuvete pode ser selecionada com base na geometria da cuvete e/ou material. Diferentes cuvetes pode ser selecionadas para diferentes ensaios.
[00208] Na presente invenção, uma versão preferida da cuveta de ensaio tem uma seção transversal circular na direção do feixe de luz, como mostrado na Figura 65. O uso de uma cuvete com uma secção transversal circular, tem várias vantagens, incluindo, mas não limitado ao seguinte: A extensão de caminho ótico pode ser definida com precisão. Precisão dimensional de injeção de peças moldadas foram encontrados para ser melhor do que 1 -2% CV.
[00209] Em placas de poliestireno convencionais do menisco líquido irrestrito pode introduzir imprecisão na extensão de caminho.
[00210] O caráter aberto e seção circular das dicas confere excelentes características de manuseio de fluidos, fazendo com que a aspiração de líquidos muito preciso.
[00211] A imagem ótica das pontas prevê a capacidade de identificar a localização da ponta e dos limites da coluna de líquido e muito para localizar com precisão o centro da ponta, onde o sinal e máximo.
[00212] Mais do que uma amostra de líquido pode ser incubadas e analisadas da mesma ponta. Isto e porque na parte mais estreita da ponta, muito pouco material transferência ocorre (na direção axial) entre adjacentes "lesmas" de líquido.
[00213] Uma ponta exemplar pode ter as seguintes características gerais: Comprimento ponta: 0.5 - 4 cm OD: 0.2 - 1,0 centímetros Ponta lD: 0.1 - 0,5 centímetros Capacidade para líquidos da ponta: 5 - 50 ul Precisão dimensional da ponta: geralmente melhor do que 2% ou +/- 0,001 centímetros.
[00214] Configuração Dica: A ponta terá geralmente uma característica que engata com uma pipeta (cilíndrico), de modo a formar uma vedação estanque aos fluidos. Existe uma região geralmente cilíndrica ou cônica, que é usado para geração de imagens.
[00215] Em geral, a parte ótica da ponta vai ter pelo menos duas secções diferentes, com diferentes comprimentos de caminho. A extremidade inferior da ponta será tipicamente estreito, de modo a auxiliar na retenção de colunas de líquido verticais por gravidade
[00216] Material ponta: limpar ou uniformemente especular plástico (poliestireno, polipropileno, etc.) (transmissão de luz no visível> 80%)
[00217] Para fins de imagem, a ponta geralmente pode ser transparente ou translucido, mas as dicas não tem que ficar claro para funcionar bem como tinas de ensaio quando a análise de três cores e usado. Tinas ponta que aparecem "nublado" pode funcionar de forma semelhante ao limpar dicas. As pontas nubladas são feitas em moldes de injeção com superfícies não polidas
[00218]ou texturizada ou pela adição de algum material de espalhamento de luz para o plástico usado para fabricar as pontas. A intensidade da dispersão da luz de tais pontas turvas pode ser escolhida para não ser tão grande como a obscurecer o líquido de cor a ser medido. Em geral, os efeitos de dispersão de luz para a luz transmitida pode ser selecionado para ser inferior a 10, (20 e 30%) em relação ao impacto do material colorido. O efeito de dispersão de luz pode ser selecionada de tal modo que a dispersão de luz das pontas turvo e uniforme.
[00219] As extremidades e as câmaras de reação aqui descritas pode ser constituído por um eixo cilíndrico (ou cônica), cerca de 2 cm de comprimento e com um diâmetro interior de cerca de 1-5 mm que corresponde a uma capacidade de cerca de 10 - 50 ul.
[00220] Em um exemplo, na extremidade superior do cilindro e um cilíndrico truncado "boss" fluidicamente ligado ao cilindro e adaptada de modo a ser capaz de se envolver com o recurso cônico de um pipetador. A extremidade inferior da ponta pode ser reduzida para proporcionar uma funcionalidade que permite que a ponta para segurar os seus conteúdos líquidos quando orientado verticalmente e não ligado a pipeta. A ponta pode ser uma ponta. A forma externa da extremidade inferior da ponta e tipicamente também algo pontiagudo com o diâmetro, tendo sido reduzido a partir da parte principal do eixo cilíndrico para a extremidade de modo a ser capaz de ser fluidicamente selado com uma tampa flexível (vinila) em que o extremidade da ponta e adaptada por pressão. Pontas são normalmente feitas de plástico moldado (poliestireno, polipropileno e semelhantes). As pontas podem ser transparente ou translucido de tal forma que as informações sobre a amostra pode ser adquirido por imagem.
[00221] A Figura 4, Figura 5, e A Figura 6 mostra um exemplo de uma ponta. A dica e configurado com (1) um recurso superior que podem se engajar para formar um selo hermético com uma cabeça de pipeta, (2) um eixo basicamente cilíndrico (na verdade cônico com um projeto muito pequeno angulo) e um estreito, apontou ponta inferior. Esta ponta pode formar uma vedação estanque a líquidos com uma tampa. A forma pontiaguda auxilia na obtenção de boa conformidade com a tampa com força moderada. O material utilizado e o poliestireno moldada por injeção. As dimensões são: 32 mm de comprimento, cerca de 7,6 milímetros maior diâmetro externo, a capacidade útil de cerca de 20 ul. As dimensões da ponta podem ser dimensionadas para um volume maior. Por exemplo, para uma amostra de 50 ul, as identificações pode ser aumentada em cerca de 1,6 vezes.
[00222] A vedação pode ser conseguida usando uma tampa feita de vinila ou outro material que pode ser facilmente ajustadas por pressão para a parte mais estreita da amostra contenção meios utilizando a força gerada pelo movimento da fase de instrumento na direção z. Uma bolha de ar pode ficar presa dentro da ponta quando a ponta e limitado. Um passo de centrifugação pode ser usado para dirigir a bolha para o topo da coluna de sangue de forma a eliminar os efeitos da bolha. As dimensões da ponta e/ou as dimensões do titular da ponta numa centrífuga podem ser compensadas de tal modo que uma ponta pode ser assegurada por centrifugação.
Preparação de Amostras
[00223] A invenção proporciona sistemas, métodos e aparelhos para o tratamento e análise de amostras podem ser recolhidas a partir de uma variedade de fontes. Por exemplo, a amostra pode ser recolhida a partir de pacientes, animais ou para o ambiente. A amostra pode ser um fluido corporal. Quaisquer fluidos corporais que se suspeita conter um analito de interesse pode ser utilizado em conjunto com o sistema ou os dispositivos da invenção. Vulgarmente utilizados fluidos corporais incluem, mas não estão limitadas a sangue, soro, saliva, urina, fluido gástrico e digestivo, lagrimas, fezes, sêmen, secreções vaginais, fluido intersticial derivadas de tecido tumoral, e fluido cerebrospinal.
[00224] Em algumas concretizações, o fluido corporal e uma amostra de sangue de um paciente humano. A fonte de sangue pode ser recolhido a partir de uma picada no dedo e tem um volume de menos do que cerca de 0,5, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, ou 1000 Ul.
[00225] Um fluido corporal pode ser retirado de um doente e fornecido a um dispositivo de uma variedade de maneiras, incluindo, mas não limitado a, de punção, por injeção, ou pipetagem.
[00226] Tais como aqui utilizados, os termos "sujeito" e "doente" são aqui utilizados indiscriminadamente, e refere-se a um vertebrado, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um humano. Mamíferos incluem, mas não estão limitados a, murinos, símios, humanos, animais de quinta, animais e animais de estimação.
[00227] Numa forma de realização, uma lanceta perfura a pele e retirar uma amostra, utilizando, por exemplo, por gravidade, capilaridade ou aspiração força de vácuo. A lanceta pode ser parte integrante do dispositivo, ou de parte de um sistema ou de um componente independente. Sempre que necessário, a lanceta pode ser ativada por uma variedade de mecanismos de ativação conhecidos mecânica, elétrica, eletromecânica, ou de qualquer outra ou de uma combinação desses métodos. Numa outra forma de realização em que não e necessário qualquer mecanismo ativo, um paciente pode simplesmente proporcionar um fluido corporal para o dispositivo, como por exemplo, poderiam ocorrer com uma amostra de saliva. O fluido recolhido pode ser colocado na unidade de recolha de amostra dentro do dispositivo. Ainda numa outra forma de realização, o dispositivo compreende pelo menos uma micro agulha que perfura a pele.
[00228] O volume de fluido corporal a ser usado com um dispositivo pode ser inferior a cerca de 500 microlitros, tipicamente entre cerca de 1 a 100 microlitros. Quando desejado, uma amostra de 1 a 50 microlitros, 1 a 40 microlitros, de 1 a 30 microlitros, de 1 a 10 microlitros, ou mesmo de 1 a 3 microlitros pode ser usado para a detecção de uma substancia utilizando o dispositivo. Numa concretização, o volume de fluido corporal utilizada para detectar uma substancia a analisar utilizando os dispositivos ou sistemas sujeitos e de uma gota de fluido. Por exemplo, uma gota de sangue a partir de um dedo picado pode fornecer a amostra de fluido corporal a ser analisado, comum dispositivo, sistema ou método aqui descrito.
[00229] Uma amostra de fluido corporal podem ser recolhidas a partir de um sujeito diretamente a uma ponta do aqui descrito, ou pode ser depois transferido para uma ponta.
Diluição da Amostra
[00230] Em alguns casos, a configuração do processador de efeitos diretos de transferência de fluidos de um grau de diluição da amostra de fluido corporal na gama de unidades de ensaio para levar os sinais indicativos da pluralidade de analitos a ser detectados dentro de uma gama detectável, de tal modo que a dita pluralidade de analitos são detectáveis com o referido sistema. Em um exemplo, a amostra de fluido corporal compreende pelo menos dois analitos que estão presentes em concentrações que diferem em pelo menos 1, 2, 5, 10, 15, 50, 100, 500, 1000, 10000, 105 , 106 , 107 , 108 , 10, 9 , 10 ou 10 vezes. Em um exemplo, a amostra de fluido corporal e uma única gota de sangue. Numa concretização, as concentrações de pelo menos dois analitos numa amostra difere até 10 ordens de grandeza (por exemplo, um primeiro analito está presente em 0,1 pg / ml e um segundo analito está presente em 500 ug/ml). Em outro exemplo, alguns analitos proteicos são encontrados em concentrações superiores a 100 mg/ml, que pode estender a gama de interesse até cerca de doze ordens de magnitude. No caso da medição de analitos de ácido nucleico tais como o ADN e NA exponenciais utilizando métodos de amplificação tais como a reação da polimerase, o número de cópias do analito pode ser aumentada por um mil vezes antes da medição.
[00231] Caso seja desejado, um grau de diluição da amostra de fluido corporal pode trazer os sinais indicativos de pelo menos dois analitos no interior da gama detectável.
[00232] Como descrito, os sistemas e dispositivos aqui pode ativar muitas características de flexibilidade do ambiente de laboratório em um ambiente POC. Por exemplo, as amostras podem ser recolhidas e manipuladas automaticamente em um tampo de mesa ou de tamanho menor do dispositivo ou sistema. Um problema comum em dispositivos POC está a atingir diferentes faixas de diluição na realização de uma série de ensaios, onde os ensaios podem ter sensibilidade ou especificidade significativamente diferente. Por exemplo, pode haver dois analitos numa amostra, um analito, mas tem uma alta concentração na amostra e o outro analito
[00233] tem uma concentração muito baixa. Como previsto, os sistemas e dispositivos aqui descritos podem diluir a amostra a níveis significativamente diferentes, a fim de detectar ambos os analitos. Alternativamente, uma amostra pode ser dividida em duas ou mais amostras, o que pode permitir que os analitos individuais a serem detectados em vários níveis de diluição.
[00234] Por exemplo, se o analito está numa concentração elevada, uma amostra pode ser diluída em série para o intervalo de detecção adequado e fornecida a uma superfície de captura para a detecção. No mesmo sistema ou dispositivo, com uma amostra de um analito numa baixa concentração pode não necessitar de ser diluída. Deste modo, a gama de doseamento dos dispositivos e sistemas aqui proporcionadas POC podem ser expandidos a partir de muitos dos atuais dispositivos POC.
[00235] Em sistemas de ensaio POC utilizando cartuchos descartáveis que contém o diluente não e muitas vezes estabelecido um limite prático para a extensão da diluição. Por exemplo, se uma pequena amostra de sangue e obtido por picada no dedo (por exemplo, cerca de 20 microlitros) e para ser diluído e o volume máximo de diluente que pode ser colocado num tubo e
[00236] de 250 microlitros, o limite prático de diluição da amostra inteira e cerca de 10 vezes. Num exemplo aqui, um sistema pode aspirar um volume menor da amostra (por exemplo, cerca de 2 microlitros) fazendo com que o fator de diluição máxima de cerca de 100 vezes. Para muitos ensaios, tais fatores de diluição são aceitáveis, mas para um ensaio semelhante ao da CP (como descrito nos exemplos), existe uma necessidade para diluir a amostra muito mais. Os ensaios ELISA baseados na separação podem ter uma limitação intrínseca na capacidade da superfície de captura para se ligar ao analito (por exemplo, cerca de algumas centenas de ng/ml para um analito de proteína típica). Alguns analitos estão presentes no sangue em centenas de microgramas/ml. Mesmo quando diluídos por 100 vezes, a concentração do analito pode estar fora do intervalo de calibração. Em uma forma de realização exemplar de um sistema, dispositivo e dispositivo de transferência de fluido, diluições múltiplas pode ser conseguida através da realização de múltiplas transferências de fluido do diluente para uma unidade de ensaio individual ou unidade de recolha de amostra. Por exemplo, se a concentração de um analito e muito elevada numa amostra, tal como descrito acima, a amostra pode ser diluída várias vezes, até que a concentração do analito está dentro de um intervalo de detecção aceitável. Os sistemas e métodos desta invenção podem proporcionar medições precisas ou estimativas das diluições, a fim de calcular a concentração original da substancia a analisar.
Separação de amostra
[00237] Em algumas formas de realização da invenção, uma amostra pode ser preparada, para análise por um passo inicial de separação. Por exemplo, se o ensaio consiste em analisar o DNA, um passo de separação do ADN pode ser utilizado para eliminar ou reduzir os contaminantes ou materiais de origem não desejada. O passo de separação pode utilizar cromatografia, centrifugação, extração líquido-líquido, extração sólido-líquido, a afinidade de ligação, ou quaisquer outros mecanismos conhecidos para um perito na arte.
[00238] Em algumas formas de realizado, uma amostra de sangue a ser analisada e processada em primeiro lugar, separando a componente de plasma a partir da amostra de sangue. Esta etapa pode ser realizada utilizando uma variedade de técnicas, tais como filtração, centrifugação, e a afinidade de ligação. A centrifugação pode ser um método eficiente para a separação dos componentes da amostra de sangue, e pode ser empregue na presente invenção. A separação do plasma.
[00239] O sangue pode ser introduzido numa extremidade próxima ou encerrado selável numa variedade de maneiras, por exemplo, as amostras podem ser fornecidas em um tubo e uma ponta passível de ser vedado pode receber a amostra do tubo através de uma ação capilar ou por força pneumática. Um meio preferido de introdução e o uso de ação capilar.
[00240] Alternativamente, o recipiente utilizado para armazenar a amostra para a separação centrífuga pode ser configurada com apenas uma abertura, como numa centrífuga convencional.
[00241] A ponta, uma vez cheios de sangue, pode ser transferida automaticamente para um local de um cartucho descartável, onde existe um elemento de vedação. O elemento de vedação pode ser uma pequena "taça", feita de um material deformável (flexível) (vinila, silicone ou semelhantes) conformada para se encaixar na extremidade inferior da ponta e sela-lo. A ponta e pressionada para dentro da vedação pelo instrumento, formando assim uma junção estanque aos líquidos. A extremidade selada e então movido para uma pequena centrífuga (tipicamente localizado na e formando parte do instrumento) e encaixada num elemento de posicionamento do rotor da centrifugadora tal que a extremidade inferior (selado) das extremidades da ponta até uma prateleira rígida que suporta a ponta durante a etapa de centrifugação.
[00242] O rotor centrífugo pode ser circular com cerca de 10 cm de diâmetro. A massa da ponta contendo sangue e ou (1) pequena em relação a do rotor, ou (2), onde for desejado, em relação ao peso de um contador localizado na parte oposta do rotor de tal modo que qualquer vibração durante o passo de centrifugação e minimizado. Um exemplar da orientação do rotor de centrífuga e vertical (eixo horizontal de rotação). O rotor e montado no veio de acionamento com um e acionado por um motor elétrico.
[00243] A centrifugação pode ser conseguido ao rodar o rotor a cerca de 15.000 rpm durante 5 minutos. Durante este processo, os elementos particulares no sangue (glóbulos vermelhos e glóbulos brancos) para o sedimento extremidade selada da ponta, e formar uma coluna de forma compacta com plasma de célula livre separados na parte da extremidade distal do selo.
[00244] A ponta contendo a amostra separada pode então ser colocados verticalmente num local acessível para um dispositivo de manipulação de fluido composto por uma ponteira estreita ("ponta a aquisição da amostra") montados sobre um dispositivo de pipetagem, por sua vez montados sobre uma fase xyz.
[00245] O plasma pode agora ser eficientemente recuperados a partir da amostra centrifugada. Isto e conseguido movendo a ponta da aquisição de amostras verticalmente ao longo do eixo da ponta de centrífuga de modo que ele entra em contato com o fluido com o plasma e pode tirar para cima utilizando o plasma, por exemplo, meios pneumáticos.
[00246] Opcionalmente, esta operação pode ser controlada por meio de uma câmara ou de outro dispositivo de imagem que pode ser utilizado tanto para medir o hematócrito da amostra e para proporcionar informação sobre a localização do plasma/limite da célula vermelha para o controlador de fase/pipeta. Com o auxílio das imagens separadas do sangue, uma ponta de pipeta estreita montada uma pipeta e lentamente movida verticalmente para baixo, de tal modo que a ponta se dirige axialmente para baixo a contenção da amostra significa até tocar no plasma. A ponta e em seguida deslocada mais até que esteja perto (dentro de menos do que cerca de 3, 2, 1, 0,5, ou 0,1 mm) da interface de hematócrito. Ao mesmo tempo, o plasma e aspirada para a ponta da pipeta estreita sob controlo do computador. O plasma pode ser aspirado simultaneamente, movendo a ponta da pipeta estreita em coluna de plasma de modo a que o plasma não se deslocado para a parte superior dos meios de confinamento da amostra. A aspiração pode ser controlada para evitar o ar aser aspirado durante o passo de remoção do plasma.
[00247] Em geral, a ponta da pipeta com uma extremidade muito estreita, tais como aqueles usados para aplicar um sistema de amostras para eletroforese, podem ser usadas para aspirar o plasma a partir da ponta da amostra centrifugada. A ponta estreita e tipicamente cônica ou cônica e tem dimensões 1-3 x 0,1-0,5 cm (comprimento x diâmetro) e feito de qualquer um de uma variedade de materiais (polipropileno, poliestireno, etc.) O material pode ser transparente ou translucida, no visível. Uma extremidade da ponta do encaixe com um dispositivo de pipetagem. A outra e muito estreita (0,05-0,5 mm de diâmetro externo), de tal modo que ele pode mover-se para a ponta da amostra, sem tocar na superfície interior da ponta da amostra. Mesmo que exista contato entre a ponta de aspiração de plasma e a ponta de amostragem, a aspiração de plasma não é prejudicada.
[00248] Um esquema do processo de aspiração de plasma na fase em que a ponta de aspiração de plasma situa-se acima da interface de células plasmáticas-embaladas durante o passo de aspiração e mostrado na Figura 7.
[00249] Deste modo, verificou-se que quase todo o plasma pode ser removido, deixando por exemplo, tão pouco como 1 ul na ponta da amostra centrifugada. Isto corresponde a cerca de 11 ul de plasma (90% de recuperação) de 20 ul de sangue com um hematócrito de 40%. Além disso, a qualidade da amostra de plasma (com respeito a hemólise, lipemia e lcteria) pode ser determinada a partir de uma imagem da amostra centrifugada.
[00250] O plasma aspirado pode ser transferido para outros locais para a diluição e mistura com os reagentes do ensaio de modo que os ensaios para a indústria de analitos mas não limitados a, eletrólitos, metabolitos biomarcadores de proteínas, medicamentos e ácidos nucleicos pode ser realizada.
A separação dos glóbulos brancos
[00251] Outra utilização da invenção e isolar e concentrar as células brancas do sangue. Num aspecto da invenção, a amostra de sangue e primeiro sujeita a um processo que lisa os glóbulos vermelhos (e, opcionalmente, fixa as células brancas) por adição de um reagente (por exemplo, BD Pharmlyse M 555.899 ou BD FACS M Solução de lise 349202) _to o sangue e de mistura. Após uma breve incubação, a amostra e sujeita a lisada centrifugação, tal como descrito acima tal que as células brancas são concentrados na extremidade vedada da ponta sangue. A solução de glóbulos vermelhos lisados podem em seguida ser removida por aspiração.
[00252] Recuperação das células brancas e alcançada por qualquer uma das (1) a adição de uma pequena quantidade de uma solução tampão e repetiu- se a aspiração e para baixo para re-suspender as células, seguido por deslocamento para um receptáculo ou (2) a remoção do selo e deslocamento descendente dos eritrócitos no receptáculo utilizando pressão de ar.
[00253] Um esquema alternativo permite a recuperação das células brancas sem lise das células vermelhas. Após centrifugação do sangue (tal como e bem conhecido), os glóbulos brancos formar uma camada na parte superior das hemácias conhecidas como Buffy Coat. Após a remoção da maior parte do plasma (como acima), os glóbulos brancos, podem ser eficazmente recuperada por (1), opcionalmente, a adição de um pequeno volume (por exemplo, cerca de 5 ul) de solução tampão isotônica, ou (2) utilizando um plasma residual e re-suspendendo a células brancas por aspiração repetida e/ou agitação mecânica utilizando a ponta de aquisição de amostra. Uma vez suspenso, a mistura resultante de glóbulos brancos, juntamente com uma pequena proporção de células vermelhas também re-suspensas pode ser adquirida através de aspiração para análise dos glóbulos brancos. Deste modo a maior parte dos glóbulos brancos (tipicamente todos) pode ser recuperada com apenas uma pequena quantidade de glóbulos vermelhos (normalmente menos de 5% do inicial) (contaminante).
Centrifugas
[00254] A Figura 1, Figura 2 e Figura 3 perspectivas escala mostra de uma centrífuga (Figura 1 - vista lateral, Figura 2 - Vista face frontal, Figura 3 - retrovisor) que podem ser integrados ao sistema. A centrífuga pode conter um motor elétrico capaz de rodar o rotor a 15.000 rpm. Um tipo de rotor de centrífuga e de forma semelhante a uma lamina de ventilador e montado no eixo do motor, num plano vertical. Afixada ao rotor e um elemento que contém a amostra que prende meio (topo) e proporciona um ressalto ou prateleira em que o extremo da ponta distal dos apoios do eixo do motor e que proporciona apoio durante a centrifugação, de modo a que a amostra não possa escapar. A ponta pode ser ainda apoiada na sua extremidade proximal por um batente mecânico no rotor. Isto pode ser fornecido de modo que a força gerada durante a centrifugação não causa a ponta de cortar através da tampa de vinila macia. A ponta pode ser inserido e retirado através de mecanismos "pick and place" padrão, mas de preferência por uma pipeta. O rotor e de uma única peça de acrílico (ou outro material) forma a minimizar a vibração e ruído durante o funcionamento da centrifugadora. O rotor e (opcionalmente) uma forma de modo que, quando ele e orientado em ângulos específicos, para os outros componentes móveis verticais em que o instrumento pode mover-se após a centrifugação. A amostra que prende os meios são por centrifugação em relação ao contador de massas sobre o lado oposto do rotor de tal modo que o centro de rotação da inercia e relativo axial para o motor. O motor de centrifugação pode fornecer dados de posicionamento para um computador, que pode, em seguida, controlar a posição de repouso do rotor (tipicamente vertical antes e após a centrifugação).
[00255] Conforme pode ser visto a partir dos dois gráficos na Figura 8 e na Figura 9, para minimizar o tempo de centrifugação (sem gerar muito estresse mecânico durante a centrifugação) de acordo com as normas publicadas (DlN 58933-1; para os EUA o padrão ClSl H07- A3 "Processo para a Determinação do hematócrito pelo Método microhematocrito"; Approved Standard - Terceira Edição) dimensões convenientes para o rotor está na gama de cerca de 5 - 10 cm, que giram a aproximadamente 0 - 20.000 rpm, dando um tempo para arrumar as células vermelhas de cerca de 5 min.
[00256] Um exemplo de equação para calcular a força de centrifugação e mostrado abaixo:
Figure img0001
[00257] Em algumas formas de realização, uma centrifugadora pode ser uma centrífuga orientada horizontalmente com um desenho de recipiente oscilante. Em algumas formas de realização preferíveis, o eixo de rotação da centrifugadora e vertical. Em concretizações alternativas, o eixo de rotação pode ser horizontal ou segundo qualquer angulo. A centrífuga pode ser capaz de girar simultaneamente dois ou mais vasos e pode ser concebida para ser inteiramente integrado num sistema automatizado utilizando pipetas controladas por computador.
[00258] Em algumas formas de realização, os vasos podem ser próximos do fundo. O desenho basculante pode permitir que os recipientes de centrifugação ser passivamente orientada numa posição vertical, quando parado, e girar fora de um angulo fixo durante a centrifugação. Em algumas concretizações, as recipientes de vaivém podem permitir que os recipientes de centrifugação a girar para fora para uma orientação horizontal. Em alternativa, podem girar para qualquer ângulo entre uma posição vertical e horizontal (por exemplo, cerca de 15, 30, 45, 60 ou 75 graus da vertical. Balançar a centrífuga com cartão recipiente pode atender a requisitos de precisão posicional e repetibilidade de um sistema robótico um certo número de sistemas de posicionamento são empregues.
[00259] Um sistema de controle baseado em computador pode usar informações de posição de um codificador ótico, a fim de girar o rotor em velocidades lentas controladas. Porque um motor apropriado poderia ser projetado para desempenho de alta velocidade, as posições precisas estáticos não precisam ser realizadas usando retorno de posição sozinho. Em algumas formas de realização, uma câmara, em combinação com uma alavanca acuada por solenoide, pode ser empregue para atingir muito precisas e estáveis parando em um determinado número de posições. Utilizando um sistema de controle separado e retorno a partir de sensores de efeito Hall, montada no motor, a velocidade do rotor pode ser controlada com muita precisão a alta velocidade.
[00260] Uma vez que um número de instrumentos sensíveis deve funcionar simultaneamente dentro do sistema de instrumentos de ensaio, a concepção da centrífuga, de preferência minimiza ou reduz a vibração. O rotor pode ser aerodinâmicamente com um exterior liso - encerrando completamente os recipientes quando eles estão na sua posição horizontal. Além disso, o amortecimento de vibrações pode ser empregue em vários locais na concepção do processo.
Rotor
[00261] Um rotor centrífugo pode ser um componente do sistema, que pode segurar e girar o recipiente de centrifugação (s). O eixo de rotação pode ser vertical e, portanto, o próprio rotor pode estar posicionado horizontalmente. No entanto, em formas de realização alternativas, os diferentes eixos de rotação do rotor e as posições podem ser empregues. Existem dois componentes conhecidos como recipientes posicionadas simetricamente em ambos os lados do rotor, que seguram os recipientes de centrifugação. Configurações alternativas são possíveis em que recipientes são orientadas com a simetria radial, por exemplo, três segmentos orientados a 120 graus. Pode ser proporcionado qualquer número de recipientes, incluindo, mas não limitado a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais recipientes. Os recipientes podem ser espaçados uma da outra. Por exemplo, se n recipientes são fornecidas em que n e um número inteiro, em seguida, os recipientes podem ser espaçadas de cerca de 360/«graus de distância uns dos outros. Em outras formas de realização, os recipientes não precisam ser espaçados uniformemente em torno de outro ou com simetria radial.
[00262] Quando o rotor está parado, estes recipientes, influenciados pela força da gravidade, podem cair de forma passiva, como posicionar os vasos verticalmente e torna-los acessíveis para a pipeta. A Figura 111 mostra um exemplo de um rotor em repouso com recipientes verticais. Em algumas concretizações, os recipientes podem passivamente cair para um angulo pré- determinado, que pode ou não ser vertical. Quando o rotor gira, os recipientes são forçados para uma posição quase horizontal, ou a um angulo pré- determinado por forças centrífugas. A Figura 112 mostra um exemplo de um rotor a uma velocidade de recipientes de um pequeno angulo em relação ao horizontal. Não pode haver paradas rígidas físicas para ambas as posições verticais e horizontais que atuam para fazer valer a sua precisão e repetibilidade de posição.
[00263] O rotor pode ser aerodinâmicamente com uma forma de disco e, como algumas características físicas quanto possível a fim de minimizar a vibração causada pela turbulência do ar. Para conseguir isto, a geometria exterior do recipiente podem corresponder exatamente ao do rotor tal que, quando o rotor está a girar e o recipiente pode ser forçado horizontal do recipiente e rotor podem ser perfeitamente alinhados.
[00264] Para facilitar a extração do plasma, o rotor pode ser inclinado para baixo em direção ao chão em relação ao horizonte. Por causa do angulo da pá pode ser combinada com a do rotor, este pode impor um angulo de rotação fixo para o recipiente. O sedimento resultante de tal configuração poderia ser inclinado em relação ao recipiente, quando colocado na posição vertical. Uma ponta de extração estreita pode ser utilizada para aspirar o plasma a partir do topo do recipiente de centrifugação. Ao colocar a ponta de extração perto da parte inferior da rampa criada pelo angulo de sedimento, o volume final de plasma pode ser mais eficientemente extraído sem perturbar o sensívelbuffy coat.
[00265] Uma variedade de modelos de tubos pode ser acomodada nos recipientes do dispositivo. Em algumas concretizações, os vários modelos de tubos podem ser fechados terminou. Alguns são em forma de tubos de centrífuga convencionais com fundo cônico. Outros projetos do tubo podem ser cilíndricos. Os tubos com uma baixa relação entre a altura e a área da secção transversal pode ser favorecida para transformação celular. Os tubos com uma grande proporção (> 10: 1) pode ser adequado para a medição precisa das necessidades de imagem de hematócrito e outros. No entanto, qualquer altura a razão da área da secção transversal pode ser empregue. Os recipientes podem ser feitas de qualquer um de vários plásticos (poliestireno, polipropileno), ou de qualquer outro material discutido noutras partes deste documento. Recipientes tem capacidades que variam de alguns microlitros de cerca de um mililitro. Os tubos podem ser inseridos e removidos da centrífuga, usando um mecanismo de "pegue e posicione".
Sistema de Controle
[00266] Devido aos requisitos de fiação e posicionamento do dispositivo de centrífuga, pode ser usada uma abordagem de sistema de controle duplo. Para o índice de rotação do rotor, a orientações específicas, um sistema de controle baseado em posição pode ser implementada. Em algumas concretizações, o sistema de controle pode empregar um PlD (Proporcional lntegral Derivativo) sistema de controle. Outros sistemas de controlo de realimentação conhecidos na arte podem ser empregues. O retorno posicional para o controlador de posição pode ser proporcionado por um codificador ótico de alta resolução. Para operar a centrífuga de baixo para altas velocidades, um controlador de velocidade pode ser implementada, ao empregar um sistema de controle PlD sintonizado para controle de velocidade. Realimentação taxa de rotação para o controlador de velocidade pode ser proporcionado por um conjunto de sensores de efeito Hall simples colocado no eixo do motor. Cada sensor pode gerar uma onda quadrada em um ciclo por rotação do eixo do motor.
Mecanismo de parada
[00267] A forma consistente e posicionar firmemente o rotor numa posição particular, um mecanismo de interrupção física podem ser empregues. Numa concretização, o mecanismo de paragem pode utilizar um excêntrico, acoplado ao rotor, juntamente com uma alavanca atuada por solenoide. A carne pode ser em forma de um disco circular com uma série de "C" entalhes de formato maquinados em torno do perímetro. Para posicionar o rotor da centrifugadora, a sua velocidade de rotação pode ser primeiramente reduzida a, no máximo, 30rpm. Em outras formas de realização, a velocidade de rotação pode ser reduzido a qualquer outra quantidade, incluindo, mas não limitado a cerca de 5 rpm, 10 rpm, 15 rpm, 20 rpm, 25 rpm, 35 rpm, a 40 rpm ou 50 rpm quando a velocidade e suficientemente retardar, a alavanca pode ser acionada. Na extremidade da alavanca e um seguidor de excêntrico que pode deslizar ao longo do perímetro da câmara, com o mínimo de atrito. Uma vez que o seguidor de excêntrico atinge o centro de um entalhe em particular na câmara, a força da alavanca de solenoide atuado pode superar a do motor e do rotor pode ser trazido para uma paragem. Nesse ponto, o motor pode ser travado eletronicamente, e, em combinação com o mecanismo de paragem de uma posição de rotação pode ser de forma muito precisa e firmemente mantida indefinidamente.
Recipientes Centrifuga
[00268] Os recipientes da centrífuga podem ser configurados para acomodar diferentes tipos de tubos de centrífuga. Em concretizações preferíveis, os vários tipos de tubos podem ter um colar ou flange na sua parte superior (aberta) final. Esta característica pode colar ou flange repousa sobre a extremidade superior do recipiente e suporta o tubo durante a centrifugação. Como se mostra nas Figuras 113, 114, e 115, tubos cônicos e cilíndricos de diferentes comprimentos e os volumes podem ser acomodados. Figuras 113, 114, e 115 fornecem exemplos de recipientes e outros modelos de recipiente podem ser empregues. Por exemplo, a Figura 113, mostra um exemplo de configuração de um recipiente. O recipiente pode ter porções laterais que acasalar com a centrífuga e permitir que o recipiente para mover-se livremente. O recipiente pode ter uma parte inferior fechada e uma abertura na parte superior. A Figura 114 mostra um exemplo de um recipiente de centrifugação acoplado com o recipiente. Como mencionado anteriormente, o recipiente pode ser conformado para aceitar várias configurações de recipientes de centrifugação. O vaso centrifugação pode ter um ou mais membros salientes que possam descansar sobre o recipiente. O recipiente de centrifugação pode ser moldado com uma ou mais características que podem acoplar-se com o recipiente de centrifugação. O recurso pode ser uma característica em forma de vaso ou um ou mais protrusão. A Figura 115 mostra um exemplo de um outro recipiente de centrifugação que pode ser acoplado com o recipiente. Como descrito anteriormente, o recipiente pode ter uma ou mais características que a forma pode permitir diferentes configurações de recipientes de centrifugação para acasalar com o recipiente.
[00269] Tubos de centrifuga e meios de extração de prova: O tubo de centrífuga e ponta de extração pode ser fornecida individualmente e podem ser acopladas em conjunto para a extração de material após centrifugação. A ponta do tubo de centrifugação e de extração pode ser concebida para lidar com processos complexos de um sistema automatizado. A Figura 116 mostra um exemplo de um recipiente de centrifugação. A Figura 117 mostra um exemplo de uma ponta de extração. Figura 118 fornece um exemplo de como o vaso centrifugação e extração de ponta podem acasalar. As dimensões são fornecidas apenas a título de exemplo, e as outras dimensões do mesmo ou de diferentes proporções podem ser utilizados.
[00270] O sistema pode permitir um ou mais dos seguintes: Transformação rápida de pequenas amostras de sangue (tipicamente 5 - 50 ul) do sangue)
A medição precisa de hematócrito A remoção eficiente de plasma
[00271] Eficiente re-suspensão de elementos formados (células vermelhas e brancas A concentração de glóbulos brancos (a seguir marcação com anticorpos fluorescentes e de fixação além de análise de glóbulos vermelhos) Confirmação ótica de lise de glóbulos vermelhos e de recuperação de glóbulos brancos.
Retorno centrifugação e Visão da ponta de extração
[00272] Um recipiente personalizado de ponta e pode ser utilizado para o funcionamento da centrifugadora, a fim de satisfazer as diversas restrições impostas no sistema. O recipiente de centrifugação pode ser um tubo de fundo fechado concebido para ser girado na centrífuga. Em algumas formas de realização, o recipiente de centrifugação pode ser o recipiente ilustrado na figura 116, ou pode ter uma ou mais características ilustradas na Figura 116. Ele pode ter uma série de características únicas que permitem a ampla gama de funcionalidades necessárias, incluindo a medição do hematócrito, BC lise, pellet re-suspensão e extração de plasma eficiente. A ponta de extração pode ser concebida para ser inserido dentro do recipiente de centrifugação para a extração de fluido precisa, e re-suspensão da pelota. Em algumas concretizações, a ponta de extração pode ser a ponta ilustrada na Figura 117, ou pode ter uma ou mais características ilustradas na Figura 117.
[00273] Especificações exemplificativas para cada ponta são aqui discutidas.
Vaso de centrifugação
[00274] O vaso de centrifugação pode ser projetado para lidar com dois cenários de uso separados, cada um associado a um volume de sangueanticoagulante e totalmente diferente.
[00275]Um primeiro cenário de uso pode exigir que 40ul de sangue total com heparina seja sedimentada, o volume máximo de plasma ser recuperado, e os hematócritos medidos utilizando visão por computador. No caso de 60% de hematócrito, ou abaixo do volume de plasma necessário ou preferível pode ser de cerca de 40ul * 40% = 16ul.
[00276] Em algumas formas de realização, não será possível a recuperação de 100% do plasma porque a cobertura amarelada não devem ser perturbados, assim, uma distância mínima deve ser mantida entre a base da ponta e o topo da pelete. Esta distância pode ser determinada experimentalmente, mas o volume (V), sacrificado como uma função da distância de segurança requerido (d) pode ser estimada usando: V (d) = d * 7il 0,25 milímetros 2 . Por exemplo, para uma distância de 0,25 milímetro a segurança requerida, o volume pode ser sacrificado 1.23ul para o caso de 60% de hematócrito. Este volume pode ser reduzido diminuindo o raio interno da parte de hematócrito do retorno de centrifugação.
[00277] No entanto, porque em algumas concretizações, a porção estreita deve acomodar totalmente o raio exterior da ponta de extração que pode ser menor que 1,5 mm, as dimensões atuais do recipiente de centrifugação pode ser perto do mínimo.
[00278] Junto com a extração do plasma, em algumas modalidades, também pode ser necessário que o hematócrito ser medido utilizando visão por computador. Para facilitar este processo, a altura total para um dado volume de hematócrito pode ser maximizada minimizando o diâmetro interno da porção estreita do recipiente. Ao maximizar a altura, a relação entre as alterações no volume do hematócrito e da mudança física na altura da coluna pode ser otimizado, aumentando assim o número de pixels que podem ser utilizadas para a medição. A altura da parte estreita do vaso pode também ser suficiente para acomodar o cenário de pior caso de 80% de hematócrito, deixando ainda uma pequena porção de plasma na parte superior da coluna para permitir a extração eficiente. Assim, 40ul* 80% = 32ul pode ser a capacidade do volume necessário para a medição precisa do hematócrito. O volume da porção estreita da ponta pode ser projetada como sobre 35.3ul que podem permitir algum volume de plasma permanecem, mesmo no pior caso.
[00279] Um segundo cenário de uso e muito mais envolvido, e pode exigir um, mais ou todos os seguintes: sangue total peletizado extraído plasma pelete re-suspenso em tampão de lise e mancha glóbulos brancos restantes (leucócitos) peletizadas sobrenadante removido glóbulos brancos re-suspenso suspensão WBC totalmente extraído.
[00280] A fim de totalmente re-suspender um pelete embalado, experiencias mostraram um pode perturbar fisicamente o sedimento com uma ponta capaz de atingir completamente o fundo do recipiente contendo o sedimento. Uma geometria preferível do fundo do recipiente utilizando para re- suspensão parece ser uma forma hemisférica, semelhante a tubos de PC padrão comercial. Em outras formas de realização, podem ser utilizadas outras formas de fundo do vaso.
[00281] O recipiente de centrifugação, juntamente com a ponta da extração, podem ser concebidos para facilitar o processo de re-suspensão, aderindo a estas exigências geométricas ao mesmo tempo, permitindo que a ponta de extração contatar fisicamente a parte inferior.
[00282] Durante as experiencias de re-suspensão manuais notou-se que o contato físico entre o fundo do recipiente, e a parte inferior da ponta pode criar uma vedação que impede o movimento do fluido. Um espaçamento delicado pode ser utilizado a fim de, tanto perturbar completamente o sedimento, enquanto que permite o escoamento do fluido. Para facilitar este processo em um sistema robótico, uma característica física pode ser adicionada a parte inferior do retorno de centrifugação. Em algumas formas de realização, esta característica pode compreender quatro pequenas saliências hemisféricas colocadas em torno do perímetro da porção de fundo da embarcação. Quando a ponta de extração e totalmente inserida no recipiente e deixou-se fazer um contato físico, a fim de a ponta pode repousar sobre as protuberâncias, e o fluido e deixado fluir livremente entre as protuberâncias. Isto pode resultar em uma pequena quantidade de volume (0,25 ~ Ul) perdido nas lacunas.
[00283] Durante o processo de lise, em algumas implementações, o volume máximo de fluido e esperado 60ul, que, juntamente com 25ul deslocada pela ponta de extração pode exigir uma capacidade de volume total de 85ul. Um projeto com um volume máximo atual de l00 ul pode exceder esse requisito. Outros aspectos do segundo cenário de uso exigem características de ponta semelhantes ou já foi discutido.
[00284] A geometria superior do recipiente de centrifugação podem ser concebidos para acoplar-se com um bico de pipeta. Qualquer bocal pipeta aqui descrito ou conhecido na arte pode ser utilizado. A geometria externa da porção superior do vaso pode corresponder exatamente a de uma ponta de reação que tanto o injetor de corrente e do cartucho pode ser concebido em torno. Em algumas formas de realização, um pequeno cume pode circunscrever a superfície interna da porção superior. Este cume pode ser um marcador visual da altura máxima de líquidos, destinados a facilitar a detecção automática de erros usando o sistema de visão computacional.
[00285] Em algumas formas de realização, a distância entre a parte inferior do bico completamente encaixados para o início da linha de fluido máximo e de 2,5 mm. Esta distância e inferior a 1,5 milímetros a 4 milímetros distancia recomendada aderido por a ponta de extração. Esta diminuição da distância pode ser motivado pela necessidade de minimizar o comprimento da ponta de extração enquanto respeitando os requisitos mínimos de volume. A justificação para esta diminuição da distância resulta da utilização particular do vaso. Porque, em algumas implementações, o fluido pode ser trocado com o vaso a partir de apenas a parte superior, o líquido máxima que nunca terá enquanto acoplado com o bocal e a quantidade máxima de sangue total esperado a qualquer momento (40ul). A altura deste fluido pode ser bem abaixo da parte inferior do bocal. Outra preocupação e que em outras vezes o volume de líquido no recipiente pode ser muito maior do que esta e molhar as paredes até a altura do bico. Em algumas concretizações, será até aqueles que utilizam o vaso para garantir que o menisco de quaisquer fluidos contidos no interior do recipiente não excede a altura máxima do fluido, mesmo que o volume total e menor do que o máximo especificado. Em outras formas de realização, outros recursos podem ser fornecidos para manter o fluido contido dentro do vaso.
[00286] As dimensões, tamanhos, volumes, ou distancias fornecidas neste documento são fornecidas por meio de único exemplo. Qualquer outra dimensão, o tamanho, o volume ou a distância pode ser utilizada que pode ser ou pode não ser proporcional aos valores mencionados.
[00287] O recipiente de centrifugação pode ser submetido a um certo número de forças durante o processo de troca de fluidos e rápida inserção e remoção de pontas. Se o recipiente não está limitado, e possível que estas forças vão ser suficientemente fortes para levantar ou deslocar de outro modo o recipiente da centrífuga. A fim de impedir o movimento, o vaso deve ser protegido, de alguma forma. Para realizar isto, um pequeno anel que circunscreve a parte externa inferior do recipiente foi adicionado. Este anel pode ser facilmente acoplado com uma característica mecânica compatível sobre o recipiente. Enquanto a força de retenção da saliência e maior do que as forças experimentadas durante as manipulações de fluido, mas menos do que a força de atrito, quando acoplado com o bocal, o problema e resolvido.
Extração Ponta
[00288] A extração da ponta pode ser projetada para interface com o recipiente de centrifugação, extração eficiente de plasma, e re-suspender as células peletizadas. Quando desejado, o seu comprimento total (por exemplo, 34,5 mm) pode corresponder exatamente ao da outra ponta do sangue incluindo, mas não limitado as descritas no EUA. N ° de Serie 12/244, 723 (aqui incorporada por referência), mas pode ser suficientemente longo para tocar fisicamente o fundo do recipiente de centrifugação. A capacidade para tocar no fundo da embarcação pode ser necessária em algumas formas de realização, tanto para o processo de re-suspensão, e para a recuperação completa da suspensão de glóbulos brancos.
[00289] O volume necessário da ponta de extração pode ser determinada pelo volume máximo que é esperado para aspirar a partir do retorno de centrifugação em qualquer dado momento. Em algumas formas de realização, este volume pode ser aproximadamente de 60ul, o que pode ser menos do que a capacidade máxima da ponta que é 85ul. Em algumas formas de realização, pode ser proporcionada uma ponta de maior volume do que o volume requerido. Tal como com o recipiente de centrifugação, uma característica interna que circunscreve o interior da porção superior da ponta pode ser usado para marcar a altura do volume máximo. A distância entre a linha de volume máximo e a parte superior do bico acoplado pode ter 4,5 milímetros, o que pode ser considerado uma distância segura, para evitar a contaminação do bico. Qualquer uma distância suficiente para impedir a contaminação do bico pode ser utilizada.
[00290] A centrifugadora pode ser utilizado para sedimento precipitado de lDl- colesterol. Imagem pode ser utilizada para verificar se o sobrenadante e claro, indicando a remoção completa do precipitado.
[00291] Em um exemplo, o plasma pode ser diluído (por exemplo, 1: 10) para uma mistura de sulfato de dextrano (25mg/dl) e sulfato de magnésio (l00mM), e pode ser, em seguida, incubou-se durante 1 minuto, para precipitar lDl-colesterol. O produto da reação pode ser aspirado para dentro do tubo de centrifugação, em seguida, tampado e centrifugada a 3000 rpm, durante três minutos. Figuras 119, 120 e 121 são imagens que foram tiradas da mistura reacional inicial antes da centrifugação (mostrando-se o precipitado branco), após centrifugação (exibindo um sobrenadante límpido), e o pellet de lDl-colesterol (após remoção da tampa), respectivamente.
[00292] Outros exemplos de centrifugadores que podem ser empregues na presente invenção são descritos na Patente dos EUA N ° s 5.693.233, 5.578.269, 6.599.476 e Publicação da Patente EUA n ° s 2004/0230400, 2009/0305392, e 2010/0047790, que são incorporadas por referência na sua totalidade para todos os fins.
Exemplos de protocolos
[00293] Muitas variações de protocolo podem ser utilizadas para o processamento e centrifugação. Por exemplo, um protocolo típico para a utilização da centrífuga para processar e concentrar as células brancas de citometria pode incluir um ou mais dos seguintes passos. As etapas podem ser proporcionadas em diferentes ordens ou outros passos podem ser substituídos por qualquer um dos passos abaixo:Recebe 10 ul de sangue anti-coagulado com EDTA (pipeta injeta o sangue para o fundo do recipiente da centrífuga)Sedimentar as células vermelhas e brancas por centrifugação (<5 min x 10.000 g).Medir hematócrito por imagemRemover plasma lentamente por aspiração na pipeta (4 ul correspondente ao cenário de pior caso [de 60% de hematócrito]), sem perturbar o pellet celular.
[00294] Re-suspender o sedimento, após a adição de 20 ul de um coquetel apropriado de até cinco anticorpos marcados com fluorescência 1 dissolvido em solução salina tamponada de BSA (1 mg/ml) (volume de reação total de cerca de 26 ul de 2 ).
[00295] lncubar durante 15 minutos a 37C.
[00296]7. Prepare o reagente de lise/fixador misturando solução de lise de células vermelhas (cloreto de amônio/bicarbonato de potássio) com o branco reagente fixador celular (formaldeído).
[00297] Adicionar 30 ul de lise/reagente fixador (volume total de reação de cerca de ul
[00298] lncubar 15 minutos a 37 ° C.
[00299] Sedimentos os leucócitos por centrifugação (5 min, 10000 g).
[00300] Retire o hemolisado sobrenadante (cerca de 57 Ul).
[00301] Re-suspender as células brancas, acrescentando buffer de 8 ul (isotônica salina)
[00302] Medir o volume com precisão.
[00303] Entregar amostra (c 10 ul) para citometria.
[00304] Os passos podem incluir receber uma amostra. A amostra pode ser um fluido corporal, tal como sangue, ou de qualquer outra amostra aqui descrito noutro lado. A amostra pode ser um pequeno volume, tal como qualquer das medições de volume descritos noutras partes deste documento. Em alguns casos, a amostra pode ter um anti-coagulante.
[00305] Concentração será ajustada para lidar adequadamente com a relação de volume diferente em relação ao método padrão de laboratório (especificamente cerca de 5 x mais baixo)
[00306] Se necessário, este volume pode ser maior para ter a coloração ideal, mas não mais de 50 ul.
[00307] Pode ocorrer uma etapa de separação. Por exemplo, pode ocorrer uma separação baseada em densidade. Esta separação pode ocorrer através de centrifugação, separação magnética, a lise, ou qualquer outra técnica de separação conhecida na arte. Em algumas formas de realização, a amostra pode ser de sangue, e as células vermelhas e brancas do sangue podem ser separadas.
[00308] A medição pode ser feita. Em alguns casos, a medição pode ser feita por meio de imagem, ou de qualquer outro mecanismo de detecção descrito noutras partes deste documento. Por exemplo, o hematócrito de uma amostra de sangue separada pode ser feita por imagem. lmagem pode ocorrer através de uma câmara digital ou qualquer outro dispositivo de captura de imagens aqui descrito.
[00309] Um ou mais componentes de uma amostra pode ser removida. Por exemplo, se a amostra e separado em componentes sólidos e líquidos, o componente líquido pode ser movido. O plasma de uma amostra de sangue pode ser removido. Em alguns casos, o componente líquido, tal como o plasma, pode ser removido por meio de uma pipeta. O componente líquido pode ser removido sem perturbar o componente sólido. A imagem pode auxiliar na remoção do componente líquido, ou qualquer outro componente selecionado da amostra. Por exemplo, a imagem pode ser usada para determinar onde se situa o plasma e pode ajudar na colocação da pipeta para remover o plasma.
[00310] Em algumas formas de realização, um reagente ou outros materiais podem ser adicionados a amostra. Por exemplo, a porção sólida da amostra podem ser ressuspensas. Um material pode ser adicionado com um rótulo. Pode ocorrer um ou mais passos de incubação. Em alguns casos, pode ser adicionada uma lise e/ou de um reagente fixador. Pode ocorrer separação adicional e/ou etapas ressuspensão. Conforme necessário podem ocorrer, diluição e/ou concentração de passos.
[00311] O volume da amostra pode ser medido. Em alguns casos, o volume da amostra pode ser medido de uma forma exata e/ou precisos. O volume da amostra pode ser medido num sistema com um baixo coeficiente de variação, como o coeficiente de variação dos valores descritos noutras partes deste documento. Em alguns casos, o volume da amostra pode ser medida usando imagens. Uma imagem da amostra possa ser capturada e o volume da amostra pode ser calculado a partir da imagem.
[00312] A amostra pode ser entregue a um processo desejado. Por exemplo, a amostra pode ser entregue por citometria.
[00313] Em outro exemplo, um protocolo típico que podem ou não podem fazer uso da centrifugação para purificação de ácido nucleico pode incluir uma ou mais das seguintes etapas. O sistema pode permitir que o ADN/ARN de extração de entregar ácido nucleico molde para reações de amplificação exponencial para detecção. O processo pode ser concebido para extrair os ácidos nucleicos a partir de uma variedade de amostras, incluindo, mas não se limitando a sangue, soro, media de transferência viral, amostras de tecido humano e de animais, as amostras de alimentos, e as culturas bacterianas. O processo pode ser totalmente automatizado e pode extrair o ADN/ARN de uma forma consistente e quantitativa. As etapas podem ser proporcionadas em diferentes ordens ou outros passos podem ser substituídos por qualquer um dos passos abaixo: Amostra de lise. As células na amostra pode ser lisadas utilizando um tampão de-sal caotrópico. O tampão caotrópico-sal pode incluir um ou mais dos seguintes procedimentos: chão trópico sal, tal como, mas não se limitando a, cloridrato de guanidina 3-6 M de guanidina ou tiocianato, sulfato de dodecil de sódio (SDS) a uma concentração típica de 0,1-5% v/v, o ácido etilenodiaminotetracetico (EDTA) para uma concentração típica de l- 5mM, lisozima a uma concentração típica de 1 mg/ml, de proteinase-K, a uma concentração típica de 1 mg/nil, e o pH pode ser ajustado a 7 - 7,5 utilizando um tampão, tal como HEPES. Em algumas formas de realização, a amostra pode ser incubada no tampão a temperatura típica de 20-95 ° C durante 0-30 minutos. O isopropanol (50% -100% v/v) pode ser adicionado a mistura após a lise.
[00314] Superfície de carga. Amostra de lisado pode ser exposta a uma superfície funcionalizada (frequentemente sob a forma de um leito empacotado de esferas), tais como, mas não limitados a, um suporte de resina embalada em uma coluna de cromatografia de estilo, esferas magnéticas misturadas com a amostra num modelo lote maneira, bombeado através de uma amostra de resina suspensa num modo de leito fluidizado, e amostra bombeada através de um canal fechado de um modo tangencial ao longo da superfície. A superfície pode ser funcionalizada de modo a ligar os ácidos nucleicos (por exemplo, DNA, RNA, DNA/NA híbrido) na presença do tampão de lise. Tipos de superfície podem incluir sílica e grupos funcionais de troca iônica, como dietilaminoetanol (DEAE). A mistura lisada pode ser exposta a superfície e os ácidos nucleicos se ligam.
[00315] A superfície sólida e lavada com uma solução de sal tal como cloreto de sódio M e etanol 0-2 (20-80% v/v), a pH 7,0-7,5. A lavagem pode ser feita da mesma maneira como o carregamento.
[00316] A eluição. Os ácidos nucleicos podem ser eluídos a partir da superfície, expondo a superfície de agua ou tampão com pH 7-9. A eluição pode ser realizada da mesma maneira como o carregamento.
[00317] Muitas variações destes protocolos ou outros protocolos podem ser utilizados pelo sistema. Tais protocolos podem ser utilizados em combinação ou na zona de quaisquer protocolos ou métodos aqui descritos.
[00318] Em algumas formas de realização, e importante ser capaz de recuperar as hemácias e concentradas por centrifugação para citometria. Em algumas formas de realização, isto pode ser conseguido através da utilização do dispositivo de pipetagem. líquidos (tipicamente isotônica salina tamponada, um agente de lise, uma mistura de um agente de lise e um fixador ou um coquetel de anticorpos marcados, em tampão) pode ser dispensada para o recipiente de centrífuga e repetidamente aspirada e re-dispensado. A ponta da pipeta podem ser forçados para dentro das células embaladas a fim de facilitar o processo. A análise de imagem, ajuda no processo de verificação objetiva deque todas as células foram novamente suspensas.
[00319] A utilização da pipeta e centrifugar para processar amostras antes da análise: De acordo com uma concretização do invento, o sistema pode ter pipetagem, pegue e posicione e capacidades centrífugos. Estas capacidades podem permitir quase qualquer tipo de pre-tratamento de amostras e procedimentos de ensaio complexos a serem executadas de forma eficiente com muito pequenos volumes de amostra.
[00320] Em particular, o sistema pode permite a separação dos elementos figurados (glóbulos vermelhos e brancos) do plasma. O sistema também pode permitir a re-suspensão de elementos figurados. Em algumas concretizações, o sistema pode permitir que a concentração de células brancas do sangue lisadas fixa e hemo. O sistema também pode permitir a lise das células para libertar os ácidos nucleicos. Em algumas concretizações, purificação e concentração de ácidos nucleicos, por filtração através de pontas (tipicamente embalados com frisado) reagentes em fase sólida (por exemplo, sílica) pode ser ativado pelo sistema. O sistema também pode permitir a eluição dos ácidos nucleicos purificados após extração em fase sólida. A remoção e recolha do precipitado (por exemplo, precipitado de lDl-colesterol utilizando polietileno glicol) podem também ser ativado pelo sistema.
[00321] Em algumas concretizações, o sistema pode permitir a purificação de afinidade. Pequenas moléculas tal como a vitamina D e a serotonina pode ser adsorvido em contas (partículas) de substratos hidrófobos, e depois eluída utilizando solventes orgânicos. Os antígenos podem ser fornecidos sobre substratos revestidos com anticorpo e eluída com um ácido. Os mesmos métodos podem ser utilizados para concentrar os analitos foram encontrados em concentrações baixas, tais como 6-ceto-prostaglandina Fla Os antígenos do tromboxano B2 e pode ser proporcionado para anticorpos ou substratos revestidos aptamero e depois eluído.
[00322] Em algumas concretizações, o sistema pode permitir a modificação química dos analitos antes do ensaio. Para ensaio de serotonina (5-hidroxitriptamina), por exemplo, pode ser necessária para converter a substancia a analisar para um derivado (tal como uma forma acetilada), utilizando um reagente (tal como anidrido acético). Isto pode ser feito para produzir uma forma do analito que pode ser reconhecido por um anticorpo.
[00323] Os líquidos podem ser movidos usando a pipeta (aspiração e bombeamento). A pipeta pode ser limitada a pressões positiva e negativa relativamente baixas (cerca de 0,1-2,0 atmosferas). Uma centrífuga pode ser usada para gerar pressões muito mais elevadas quando necessário para forçar líquidos através de meios de fase sólida frisados. Por exemplo, utilizando- se um rotor com um raio de 5 cm a uma velocidade de 10.000 rpm, forças de cerca de 5000 x g (cerca de 7 atmosferas) pode ser gerado, o suficiente para forçar o líquido através dos meios resistivos, tais como leitos embalados. Qualquer um dos modelos de centrífuga e configurações discutidas noutras partes deste documento ou conhecido na arte pode ser utilizado.
[00324] A medição do hematócrito, com volumes muito pequenos de sangue podem ocorrer. Por exemplo, as câmeras digitais baratas são capazes de fazer boas imagens de pequenos objetos, mesmo quando o contraste e pobre. Fazendo uso desta capacidade, o sistema da presente invenção pode permitir a medição do hematócrito automatizado com um pequeno volume de sangue.
[00325] Por exemplo, 1 ul de sangue podem ser utilizadas em um vidro microcap capilar. O capilar pode então ser selado com um adesivo curável, e, em seguida, sujeita a centrifugação a 10.000 xg durante 5 minutos. O hematócrito pode ser facilmente medido e o menisco do plasma (indicado por uma seta) pode também ser visível para o hematócrito pode ser medido com precisão. Isto pode permitir que o sistema não perca um volume relativamente grande de sangue para fazer esta medição. Em algumas modalidades, a câmera pode ser usada "como e" sem operação com um microscópio para fazer uma imagem maior. Em outras formas de realização, um microscópio ótico ou outras técnicas podem ser utilizadas para ampliar a imagem. Numa implementação, o hematócrito foi determinada utilizando a câmara digital sem interferência ótica adicional e medido o hematócrito era idêntica a determinada através de um método convencional de laboratório microhematocrito exigindo muitas microlitros de amostra. Em algumas formas de realização, o comprimento da coluna e da amostra a coluna de eritrócitos pode ser medido com grande precisão (+/- <0,05 mm). Dado que a coluna de amostra do sangue pode ser de cerca de 10 - 20 mm, o desvio padrão de hematócrito pode ser muito melhor do que 1%, correspondente a obtida por métodos convencionais de laboratório.
[00326] O sistema pode permitir a medição da taxa de sedimentação de eritrócitos (ES).
[00327] A capacidade de câmeras digitais para medir distancias muito pequenas e as taxas de variação das distancias pode ser explorada para medir a ESR. Em um exemplo, três amostras de sangue (15 ul) foram aspirados em "Dicas de reação". As imagens foram capturadas mais de uma hora com intervalos de dois minutos. A análise de imagem foi usada para medir o movimento da interface entre as células vermelhas e plasma. A Figura 122 mostra os resultados como a distância da interface do menisco do plasma.
[00328] A precisão da medição pode ser estimada por ajuste dos dados a uma função polinomial e calculando o desvio padrão da diferença entre os dados e a curva ajustada (para todas as amostras). No exemplo, esta foi determinada como sendo 0,038 milímetro ou <2% CV quando relacionado com a distância percorrida durante uma hora. Por conseguinte, o VHS pode ser medido precisamente por este método. Outro método para determinação de VHS e medir a inclinação máxima da relação de distância em função do tempo. Preparação Ensaio
[00329] Em algumas formas de realização, pontas pode ser concebido para acomodar uma pluralidade de reações ou ensaios. A medição simultânea de várias misturas de ensaio diferentes e um ou mais controles ou um ou mais calibradores que podem ser feitas dentro de uma ponta da presente invenção. Ao fazer isso, explorar a capacidade de experimentar diversas fontes de líquidos por aspiração sequencial de líquidos na mesma ponta. Segmentação eficaz e separação dos líquidos e grandemente melhorada por aspiração na sequência de um pequeno volume de ar e uma pequena quantidade de uma solução de lavagem que limpa a superfície das pontas antes da aspiração do líquido próximo de interesse.
[00330] Conforme descrito acima, pontas podem ter formas cônicas. Em algumas formas de realizado, um ensaio pode necessitar de oxigênio como reagente. Em tais reações, aumentando a disponibilidade de oxigênio dentro de uma reação pode ser conseguido ao mover a amostra e/ou a mistura de ensaio a uma grande parte da ponta ao aumentar a área de superfície em relação ao volume.
[00331] Na Figura 93 e Figura 94, as soluções de azul de bromofenol foram aspirados em pontas. Os segmentos superior (aspirado primeiro) 6 ul são a partir de uma série de diluição de duas vezes (a concentração máxima (0,0781 mg / ml) para a direita da imagem, com a exceção de a ponta extrema esquerda, que é uma peça em bruto de agua). Em seguida, o ar (2 ul), uma solução de lavagem (2 ul), respectivamente, foram aspirados seguido de um volume de 6 ul de uma solução de controlo de concentração fixa (0,625 mg/ml).
[00332] Com esta abordagem várias configurações do ensaio alternativas pode ser conseguido, por exemplo: Medição simultânea de reagente e/ou amostra em branco e ensaio Medição simultânea de amostra, branco e controle Calibração intra-ponta do ensaio Caso 2 e mostrado na Figura 95.
[00333] Medidas seriadas da solução em branco, amostra, controles e calibradores também podem ser feita com dicas simples. Neste cenário, a ponta e preenchida com a primeira solução, em seguida, ler esvaziado. A ponta pode ser recarregada e ler com outras amostras óticas, em sequência. O impacto de "transferência" de produto de cor de uma amostra para a próxima e minimizado por uma ou ambas: ler a coluna de líquido na porção media bem afastada da parte que entra primeiro em contato com a amostra anteriorlavar a ponta entre as amostras.
[00334] A fim de medir o grau de 'carry-over "de um segmento de líquido para o outro, se o seguinte procedimento for realizado. Uma pequena quantidade (por exemplo, 6 ul) de uma elevada concentração de azul de bromofenol (por exemplo, 0,625 mg/ml) foi aspirada para dicas, seguido por 2 ul de ar e 2 ul da solução de lavagem. Finalmente 6 ul de diluições em série de duas vezes de azul de bromofenol e aspirado com os seguintes resultados (maior concentração (0,0781 mg/ml) para a direita, mais à esquerda dica e um branco de agua).
[00335] Conforme pode ser visto a partir das imagens mostradas na Figura 96 e na análise de 3 cores mostrado na Figura 97, quantidades mensuráveis de a solução de concentração elevada e transferida para a solução de lavagem.
[00336] Média de carry-over (de controle de alta concentração para a lavagem da agua) e calculada em 1,4%. Uma vez que, com efeito, a zona dianteira (proximal ao lesma anteriormente) de uma bala depois do líquido age como segunda etapa de lavagem e a leitura da cor e feita em um local remoto a partir desta zona de ataque (tipicamente a uma zona central da lesma) , a transição eficaz de um espaçador para o outro e normalmente muito inferior a 1% e, por conseguinte, geralmente insignificante. Quando a série de diluição e medido utilizando amostras de serie único de diluição para preencher as pontas, os resultados são idênticos aos obtidos anteriormente. A descrição acima representa um "teste de estresse", projetado para avaliar a extensão do carry-over.
[00337] A Figura 98 mostra uma ponta contendo produtos de reação de dois ensaios disponíveis comercialmente para o cálcio ionizado, Ca2 + (segmento superior) e magnésio Mg2 + (segmento inferior), que foram aspirados em dicas para a medição. As concentrações de Ca2 + utilizados nesta experiencia são 0, 2,5, 5, 10, 20, e 40 mg/dl, de Mg2 +, são 0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 mg/dl. As misturas de reação de ensaio (6 ul de [Ca2 +] e 4 ul [Mg 2 +]) são bem separados utilizando 2 ul de ar, 3 ul de lavagem e mais 4 ul de ar. Os resultados de cada ensaio lido desta forma são essencialmente idênticos aqueles medidos tendo apenas uma mistura de reação do ensaio por ponta.
[00338] Conforme indicado acima, a presente invenção permite a avaliação simultânea de uma pluralidade de ensaios. As imagens podem ser feitas de muitas cuvetes de ensaio no mesmo campo de visão. Especificamente, a avaliação simultânea dos ensaios e controlos na mesma cuvette ensaio pode ser realizado. Avaliação simultânea de vários ensaios na mesma cuvette ensaio pode também ser realizada.
Reação em Meio Ambiente
[00339] Um sistema pode compreender um bloco de aquecimento para o aquecimento da unidade de ensaio ou de ensaio e/ou para o controlo da temperatura do ensaio. O calor pode ser utilizado no passo de incubação de uma reação do ensaio para promover a reação e encurtar o tempo necessário para o passo de incubação. Um sistema pode compreender um bloco de aquecimento configurado para receber uma unidade de ensaio da invenção. O bloco de aquecimento pode ser configurado para receber uma pluralidade de unidades de doseamento a partir de um dispositivo da invenção. Por exemplo, se são desejados ensaios de 8 a ser executado em um dispositivo, o bloco de aquecimento pode ser configurado para receber oito unidades de ensaio. Em algumas formas de realização, as unidades de ensaio podem ser movidas em contato térmico com o bloco de aquecimento usando os meios para mover as unidades de ensaio. O aquecimento pode ser realizado por um meio de aquecimento conhecidos na técnica.
Protocolo de Otimização
[00340] Protocolos de ensaio para análise de amostras podem ser otimizados de várias maneiras. Quando múltiplos ensaios devem ser executados em uma amostra, todos os protocolos podem ser otimizadas para as condições de reação mais rigorosas, ou cada um dos protocolos de ensaio podem ser otimizadas com base no desempenho desejado de um ensaio particular.
[00341] Em algumas modalidades, um único protocolo que pode ser projetado para atender os requisitos de teste em todas as possíveis casos de uso. Por exemplo, em um cartucho de multiplex, um único protocolo pode ser especificada com base no caso em que todos os ensaios sobre o cartucho e ser executada (ou seja, o caso limite). Este protocolo pode ser desenhado para satisfazer os requisitos mínimos do teste, tais como a precisão e alcance dinâmico de cada ensaio no cartucho. No entanto, esta abordagem pode ser sub- ótima para os casos de utilização alternada, por exemplo, quando apenas um subconjunto de ensaios com o cartucho está a ser executada. Nestes casos, por exemplo a utilização de mais, alguns ensaios pode conseguir um melhor desempenho em termos de sensibilidade e precisão. Pode haver um trade-off entre a quantidade de amostra e atribuída a um ensaio e a sensibilidade do ensaio. Por exemplo, um ensaio que tem uma sensibilidade de 1 unidade/ml quando a amostra e diluída 1: 100 pode ser capaz de detectar a 0,1 unidades/ml, se o fator de diluição e aumentado até 1: 10. Uma desvantagem da utilização de um fator de diluição, menor em um sistema de ensaio multiplexado com o volume da amostra pode ser restrita que a fração da amostra necessária para este ensaio e aumentada em 10 vezes, mesmo quando se utiliza o volume mínimo para efetuar o ensaio. Do mesmo modo, a precisão do ensaio pode ser melhorada utilizando uma concentração mais elevada de amostra. Por exemplo, um ensaio que resulta em um sinal de (digamos) absorvancia de 0,1 +/- 0,02 (20% de imprecisão de sinal) no seu limite de detecção pode ser melhorada através da utilização de 10 vezes a concentração da amostra de tal modo que o sinal produzido e 10 vezes maior do que dá um sinal de 0,1 +/1 0,02 OD a uma concentração de dez vezes menor do analito e no sinal de 1,0 +/- 0,02 a imprecisão e agora de apenas 2%. A razão pela qual este e o caso, e tipicamente o sinal de ensaio (na gama inferior das concentrações de analito) e diretamente proporcional a concentração de analito (e, por conseguinte, a concentração da amostra), enquanto que a imprecisão de sinal pode ser geralmente relacionada com a raiz quadrada do sinal e então aumenta à medida que a raiz quadrada da concentração do analito (e concentração da amostra). Assim, o coeficiente de variação (CV) do sinal pode ser inversamente proporcional a raiz quadrada do sinal, de tal modo que um aumento de 10 vezes no sinal corresponde a aproximadamente três vezes a redução do sinal de CV. Desde CV concentração e tipicamente diretamente relacionado com o sinal CV, o CV concentração irá diminuir com o aumento da concentração da amostra (diminuição da diluição).
[00342] Os protocolos podem ser otimizados para casos de uso específicos ao invés da típico abordagem um tamanho serve para todos descrita acima. Por exemplo, o protocolo pode ser otimizado para melhorar a precisão de cada teste a ser realizado no dispositivo multiplex. Além disso, alguns testes podem ser priorizados em relação a outros testes para otimização. Protocolo de otimização pode ser pre-computados para os casos de uso que são conhecidos a priori. Protocolo de otimização pode também ser executada em tempo real para os novos casos de utilização não são conhecidos a priori. Sistema de validação pode ser realizado para medir o conjunto de casos de utilização.
[00343] Um exemplo de protocolo de otimização e descrito abaixo comparando dois casos de usos. Para ambos os casos de uso, 8 ul de amostra não diluída está disponível para executar os testes necessários. Neste exemplo, o cartucho de multiplex tem 20 ensaios em placa, onde 5 dos testes requerem 1: 5 de diluição e 15 dos testes requerem 1: 25 de diluição.
[00344] No primeiro caso de uso, todos os testes são necessários para ser executado na amostra. O protocolo neste caso de uso (caso Usar B) e o seguinte: Prepare 1: 5 de diluição (8 ul + 32 ul de amostra diluente) Prepare 1: 25 de diluição (15ul 1: 5 + 60 ul diluente de amostra) para cada ensaio (n = 20), misturar com 5 ul de amostra adequadamente diluída com 10 ul do reagente Isto resulta em concentração imprecisão de 10% CV para todos os 20 testes de protocolo e que satisfaz os requisitos mínimos. O uso de amostra e de 1 ul de cada um: ensaio de diluição 5 e 0,2 ul para cada um: 25 ensaio de diluição (de um total de 5 * 1 * 15 + 0,2 = 8 ul, utilizando toda a amostra disponível).
[00345] No segundo caso de uso (de caso de uso "B") com o mesmo tipo de cartucho, apenas 10 testes são necessários para ser executado para a amostra, nem todos os 20. Além disso, todos estes ensaios 10 iria ser efetuados a relação de 1: 25 de nível de diluição em caso de uso A. O protocolo foi otimizado para este caso de utilização para maximizar a precisão para todos os ensaios utilizando uma diluição menor (1: 5). O protocolo otimizado para a utilização específica neste caso, e a seguinte: Prepare 1: 5 de diluição (8 ul + 32 ul de amostra diluente) Para cada ensaio (n = 10), misturar com 4 ul de amostra diluída com 11 ul de reagente Exemplo de uso e de 0,8 amostra não diluída ul por ensaio para um total de 8 ul. Uma vez que a concentração da amostra no ensaio e aumentada por 5 vezes em relação ao caso de uso para A, a sensibilidade do ensaio e melhorada por um fator de 5 e a imprecisão de ensaio e reduzido em cerca de 2,4 (5 /\ 0,5) vezes a cerca de 4,5 %.
[00346] Por re-otimização do protocolo, em caso de uso B emprega cinco vezes o máximo da amostra original para cada teste, melhorando assim o desempenho geral. Note-se que a discussão acima não leva em conta qualquer imprecisão devido a erros na medição de volumes, mas apenas endereços erros devido a imprecisão na medida do sinal ótico. De caso de uso B teria uma imprecisão menor devido a imprecisão nos volumes, uma vez que usa menos passos de pipetagem. Por exemplo, se o volume de imprecisão introduz 5% imprecisão na concentração do analito avaliado em ambos os casos de utilização, haveria um total de imprecisão analito de 11,2% (10 /\ 2 + 5 /\ 2) /\ 0,5 no caso de uso A comparado com 6,5% ( 4.5 /\ 2 +5 /\ 2) /\ 0,5 em caso de uso B (supondo, como e geralmente verdade, que os fatores que causam imprecisão em ensaios de agregados como a raiz quadrada da soma dos quadrados de cada fonte de imprecisão).
[00347] Os efeitos ilustrados acima podem ser mais facilmente vistos, no caso de ensaios baseados em luminescência em que o sinal de ensaio e expresso como um número de fótons emitidos por unidade de tempo. Como é o caso para a contagem das emissões radioativas, por exemplo, radioimunoensaio, a imprecisão do sinal e igual a raiz quadrada do sinal e, portanto, o sinal e de 100 CV/(raiz quadrada do sinal). Por exemplo, um sinal de 10.000 contagens terá um CV de 1%. Em muitos ensaios de fótons (que produzem, por exemplo, imunoensaios de quimiluminescência, o sinal e quase exatamente proporcional a concentração do analito, pelo menos no intervalo de concentração mais baixo). Assim, as escalas de imprecisão analitos medidos com /1(raiz quadrada do sinal) para concentrações significativamente superior ao limite de detecção. Nos ensaios que utilizam a diluição da amostra, a imprecisão analito medido ira, por conseguinte, intensificar a 1/(a diluição da amostra). Por exemplo, um ensaio utilizando uma diluição 1: 100 de diluição da amostra terá sinal e concentração CVs cerca de 3,2 vezes (10 /\ 0,5) maior do que um ensaio utilizando uma diluição 1: 10 (e também tem uma sensibilidade de cerca de 10 vezes maior).
[00348] Uma variedade de ensaios pode ser realizada em um dispositivo de fluidos de acordo com a presente invenção para detectar um analito de interesse numa amostra. Sempre que um rótulo e utilizado no ensaio, pode-se escolher entre uma ampla diversidade de rótulos está disponível na arte que pode ser empregue para a realização de ensaios de sujeitos. Em algumas concretizações rótulos são detectáveis por meios químicos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, eletroquímica, imunoquímicos ou outro. Por exemplo, etiquetas uteis incluem ácidos nucleicos, os corantes fluorescentes, reagentes densos em elétrons, e enzimas. Uma vasta variedade de marcadores apropriados para a marcação de componentes biológicos são conhecidos e são extensivamente relatados tanto na literatura científica e de patentes, e são geralmente aplicáveis ao presente invento, para a etiquetagem de componentes biológicos. Os marcadores adequados incluem, enzimas, unidades fluorescentes, unidades quimioluminescentes, etiquetas bioluminescentes ou etiquetas coloridas. Reagentes que definem a especificidade do ensaio, opcionalmente, incluir, por exemplo, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, aptameros, proteínas, as sondas de ácido nucleico ou outros polímeros, tais como matrizes de afinidade, hidratos de carbono ou lipídios. A detecção pode proceder por qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos, incluindo o controle de espectrofotometria ou ótico de marcadores fluorescentes ou luminescentes, ou outros métodos que seguem uma molécula com base no tamanho, carga ou afinidade. A porção detectável pode ser de qualquer material tendo uma propriedade física ou química detectável. Tais marcadores detectáveis tem sido bem desenvolvidos no campo da eletroforese em gel, cromatografia de coluna, substratos sólidos, técnicas espectroscópicas, e semelhantes, e, em geral, as etiquetas uteis em tais métodos pode ser aplicada ao presente invento. Assim, uma etiqueta inclui, sem limitação, qualquer composição detectável por, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, ácido nucleico espectroscópica baseada sonda, elétrico, ótico térmica, ou por outros meios químicos.
[00349] Em algumas formas de realização da etiqueta (tal como um composto de cor, flúor ou enzima) e acoplado diretamente ou indiretamente com uma molécula a ser detectada, de acordo com métodos bem conhecidos na arte. Em outras concretizações, a etiqueta está ligada a um receptor para o analito (por exemplo, um anticorpo, sonda de ácido nucleico, aptamero etc.) Como indicado acima, uma vasta variedade de marcadores são usados, com a escolha da etiqueta, dependendo da sensibilidade necessária, facilidade de conjugação do composto, requisitos de estabilidade e instrumentação disponível, e disposições de escoamento. Rótulos não radioativos são frequentemente presos por meios indiretos. Geralmente, um receptor específico para o analito está ligado a uma porção de geração de sinais. Por vezes, o receptor de analito está ligado a uma molécula de adaptador (tal como biotina ou avidina) e o conjunto reagente de ensaio inclui uma porção de ligação (tal como um reagente de biotina ou avidina) que se liga ao adaptador e para o analito. A substancia a analisar liga-se a um receptor específico no local de reação. Um reagente marcado pode formar um complexo de sanduíche no qual o analito e no centro. O reagente pode também competir com o analito para os receptores no local de reação, ou se ligam a receptores vagos no local da reação não ocupado pelo analito. A etiqueta ou é detectável inerentemente ou ligada a um sistema de sinal, tal como uma enzima detectável, um composto fluorescente, um composto quimioluminescente, ou uma entidade quimioluminogênica tal como uma enzima com um substrato luminogênic. Uma serie de ligandos e anti-ligandos podem ser usados. Sempre que um ligando tenha um anti-ligando natural, por exemplo, biotina, tiroxina, digoxigenina, e cortisol, ele pode ser utilizado em conjunto com rotulados, anti- ligandos. Como alternativa, qualquer composto haptenico ou antigenico pode ser usado em combinação com um anticorpo.
[00350] As enzimas de interesse como rótulos será principalmente hidrolases, principalmente fosfatases, esterases e glicosidases, ou oxidoredutases, particularmente peroxidases. Os compostos fluorescentes incluem fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, grupos dansilo, umbeliferona e. Os compostos quimioluminescentes incluem esteres de acridinio, dioxetanos, luciferina e 2,3-dihydroftalazinadiones, tais como luminol.
[00351] Os métodos de detecção de rótulos são bem conhecidos dos peritos na arte. Assim, por exemplo, em que a etiqueta e fluorescente, pode ser detectado por excitar o fluorocromo com luz de um comprimento de onda adequado e a detecção da fluorescência resultante, por exemplo, microscopia, a inspeção visual, por meio de um filme fotográfico, pelo uso de detectores eletrônicos tais como câmeras digitais, dispositivos de carga acoplada (CCDs) ou fotomultiplicadoras e fototubos ou outros dispositivos de detecção. Da mesma forma, marcadores enzimáticos são detectados, proporcionando substratos apropriados para a enzima e detectando o produto resultante da reação espectroscopicamente ou através da imagem digital (o objeto do presente invento). Finalmente, as etiquetas colorimétricas simples são frequentemente detectadas simplesmente observando a cor associada com a etiqueta. Por exemplo, sóis de ouro coloidal, muitas vezes aparecem rosa, enquanto várias esferas dopadas com corantes são fortemente coloridas.
[00352] Em algumas concretizações, o sinal detectável pode ser fornecida por fontes de luminescência.
[00353] A luminescência e o termo geralmente utilizado para se referir a emissão de luz a partir de uma substancia por qualquer outra razão que não um aumento na sua temperatura. Em geral, os átomos ou moléculas emitem fótons de energia eletromagnética (por exemplo, luz) quando a transição de um estado animado para um estado de energia mais baixo (usualmente o estado do solo). Se o agente e um excitante de fótons, o processo de luminescência e referido como foto luminescência ou fluorescência. Se a causa excitante e um elétron, o processo de luminescência pode ser referido como eletroluminescência. Mais especificamente, os resultados eletroluminescência da injeção direta e remoção de elétrons para formar um par elétron-buraco, e posterior recombinação do par elétron-buraco para emitir um fóton. luminescência, que resulta de uma reação química e normalmente referido como quimiluminescência. A luminescência produzida por um organismo vivo, e normalmente referido como bioluminescência. Se fotoluminescência e o resultado de uma rotação permitida de transição (por exemplo, uma transição, transição tripleto-tripleto único singuleto), o processo de fotoluminescência e normalmente referido como fluorescência. Tipicamente, as emissões de fluorescência não persistem após a causa excitante e removido como resultado de estados excitados de curta duração que podem relaxar rapidamente através de tais transições permitidas de spin. Se fotoluminescência e o resultado de uma transição proibido de rotação (por exemplo, uma transição de tripleto- singuleto), o processo de fotoluminescência e normalmente referido como fosforescência. Tipicamente, as emissões de fosforescência longo persistir após a causa excitante e removido como resultado de estados excitados de longa duração o qual pode relaxar apenas através de tais transições spin-proibidos. Um rótulo luminescente pode ter qualquer uma das propriedades acima descritas.
[00354] As fontes quimioluminescentes adequados incluem um composto que se torna- se eletronicamente excitado por uma reação química e pode então emitir luz que serve como sinal detectável ou doa energia a um aceitador fluorescente. Um número diverso de famílias de compostos, foram encontrados para fornecer quimiluminescência sob uma variedade de condições. Uma família de compostos e 2,3-di-hidro-l ,4-ftalazinadiona. Um composto utilizado e o luminol, que é o composto 5-amino. Outros membros da família incluem o 5-amino-6, 7, 8-trimetoxi e o dimetilamino [ca] benz analógico. Estes compostos podem ser feitos de luminescência com peróxido de hidrogênio em meio alcalino ou hipoclorito de cálcio e de base. Outra família de compostos e o 2,4,5-trifenilimidazoles, com lophine como o nome comum para o produto parente.
[00355] Os análogos quimioluminescentes incluem para-dimetilamino e-metoxi substituintes. Quimiluminescência pode também ser obtido com oxalatos, esteres ativos, normalmente de oxalilo, por exemplo, p-nitrofenilo e um peróxido tal como peróxido de hidrogênio, sob condições básicas. Outros compostos quimioluminescentes uteis que também são conhecidos incluem-N- alquil-esteres e dioxetanos acridinum. Alternativamente, luciferinas podem ser utilizados em conjunção com a luciferase para proporcionar lucigenins ou bioluminescencia. Fontes quimioluminescentes Especialmente preferidos são "luminogênic" substratos de enzimas, tais como os esteres de fosfato- dioxetano. Estes não são luminescentes, mas produzem produtos luminescentes, quando tida em conta pelos fosfatases tais como a fosfatase alcalina. O uso de substratos para as enzimas luminogênic e particularmente preferida porque a enzima atua como um amplificador capaz de converter de milhares de moléculas de substrato por segundo para produto. Os métodos de luminescência também são preferidos porque o sinal (a luz) podem ser detectados ao mesmo tempo muito sensível e mais uma enorme gama dinâmica usando PMT.
[00356] Os analitos duração, tal como aqui utilizado, inclui, sem limitação, drogas pró- fármacos, agentes farmacêuticos, metabolitos de drogas, tais como biomarcadores de proteínas expressas e marcadores de célula, anticorpos, proteínas do soro, colesterol e outros metabolitos, eletrólitos, fons metálicos, polissacarídeos, ácidos nucleicos , analitos biológicos, biomarcadores, genes, proteínas, hormônios ou qualquer combinação destes. Os analitos podem ser combinações de polipeptídios, glicoproteínas, polissacáridos, lipídios e ácidos nucleicos.
[00357] O sistema pode ser utilizado para detectar e/ou quantificar uma grande variedade de analitos. Por exemplo, os analitos que podem ser detectados e/ou quantificados incluem albumina, fosfatase alcalina, AlT, AST, bilirrubina (direta), bilirrubina (total), azoto da ureia no sangue (BUN), de cálcio, cloreto, colesterol, dióxido de carbono (C0 2 ), creatinina, ácido gama- glutamil-transpeptidase (GGT), globulina, Glicose, HDl-colesterol, hemoglobina, homocistefna, Ferro de Engomar, desidrogenase lactica, magnésio, fósforo, potássio, sódio, proteína total, triglicérides e ácido úrico. A detecção e/ou quantificação destes analitos pode ser realizada utilizando óticas, elétricas, ou de qualquer outro tipo de medições.
[00358] De particular interesse são os biomarcadores, que estão associados com uma doença em particular ou com uma fase da doença específica. Tais analitos incluem, mas não estão limitadas as que estão associadas com doenças auto-imunes, obesidade, hipertensão, diabetes, neuronais e/ou de doenças degenerativas musculares, doenças cardíacas, distúrbios endócrinos, distúrbios metabólicos, inflamação, doenças cardiovasculares, sepsia, angiogênese, cânceres, Doença de Alzheimer, complicações atléticas, e quaisquer combinações destes.
[00359] De interesse são também os biomarcadores que estão presentes em abundancia variando em um ou mais dos tecidos do corpo, incluindo coração, fígado, próstata, pulmão, rim, medula óssea, do sangue, da pele, da bexiga, do cérebro, músculos, nervos, e selecionados tecidos que são afetados por diversas doenças, tais como diferentes tipos de câncer (maligno ou não- metastático), doenças auto-imunes, doenças inflamatórias ou degenerativas.
[00360] Também de interesse são os analitos que são indicativos de um microrganismo, vírus ou Chlamydiaceae. Exemplos de microrganismos incluem, mas não estão limitados a bactérias, vírus, fungos e protozoários. Os analitos que podem ser detectadas pelo presente método incluem agentes patogênicos nascidos no sangue selecionados a partir de um grupo não limitativo, que consiste de Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), Staphylococcus aureus, Staphylococcus hominis, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus capitis, Staphylococcus warneri, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae, Simulans Staphylococcus, Streptococcus pneumoniae e Candida albicans.
[00361] Os analitos que podem ser detectadas pelo presente método também englobam uma variedade de doenças sexualmente transmissíveis, selecionados a partir do seguinte: gonorreia (Neisseria gonorrhoeae), sífilis (Treponena pallidum), clamídia (Clamyda tracomitis), uretrite não gonocócica (Ureaplasm urealyticum) infecção por fungos (Candida albicans), câncer mole (Haemophilus ducreyi), tricomonfase (Trichomonas vaginalis), herpes genital (HSV do tipo l e ll), HlV l, HlV ll e hepatite A, B, C, G, bem como a hepatite causada por TTV.
[00362] Os analitos que podem ser detectadas pelos métodos sujeitos englobam uma diversidade de patogenios respiratórios, incluindo, mas não limitados a Pseudomonas aeruginosa resistentes a meticilina Staphlococccus aureus (MRSA), Klebsiella pneumoniae, Haemophilis influenzae Staphlococcus aureus, Stenotrophomonas maltophilia, Haemophilis parainfluenzae, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Serratia marcescens, parahaemolyticus Haemophilis, Enterococcus cloacae, Candida albicans, Moraxiella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Citrobacter freundii, Enterococcus faecium , Klebsella oxitoca, Pseudomonas fluorscens, Neiseria meningitidis, Streptococcus pyogenes, Pneumocystis carinii, Klebsella pneumoniae, legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, e Mycobacterium tuberculosis. listados abaixo estão os marcadores exemplificativos adicionais de acordo com a presente invenção: Teofilina, PCR, CK-MB, PSA, mioglobina, CA125, Progesterona, TxB2, 6-ceto-PGF-l- alfa, e teofilina, hormona de Estradiol, lutenizante, trigliceridos , Tryptase, lDl- colesterol, colesterol HDl, colesterol, lGFR.
[00363] Exemplos de marcadores hepáticos incluem, sem limitação, lDH, (lD5), alanina aminotransferase (AlT), Arginase 1 (tipo fígado), alfa- fetoproteína (AFP), fosfatase alcalina, desidrogenase lactica e bilirrubina.
[00364] Exemplos de marcadores renais incluem, sem limitação, o TNFa receptor, cistatina C, lipocalin tipo prostaglandina D urinaria, synthatase (lPGDS), receptor do fator de crescimento do hepatócito, policistina 2, policistina 1, Fibrocystin, Uromodulin, alanina, a aminopeptidase, a N-acetil- proteína BD-glucosaminidase, albumina e Retinol (RBP).
[00365] Exemplos de marcadores cardíacos incluem, sem limitação, a troponina l (TNl), troponina T (TnT), dinase creatina (CK), CK-MB, mioglobina, proteína de ligação de ácidos graxos (FABP), proteína C-reativa (PCR), fibrinogênio D- dímero, proteína S-100, o peptídeo natriurético cerebral (BNP), NT-proBNP, PAPP-A, mieloperoxidase (MPO), glicogênio fosforilase isoenzima BB (GPBB), trombina inibidor Activatable fibrinólise (TAFl), fibrinogênio, albumina modificada pela isquemia (lMA ), cardiotrofina-1, e MlC-l (Cadeia leve de miosina-l).
[00366] Exemplos de marcadores de pancrease incluem, sem limitação, amilase, proteína Pancreatite-Associado (PAP-1), e as proteínas Regeneratein (REG).
[00367] Exemplos de marcadores de tecido muscular incluem, sem limitação, miostatina. (EPO).
[00368] Exemplos de marcadores sanguíneos incluem, sem limitação Erythopoeitin
[00369] Exemplos de marcadores ósseos incluem, sem limitação, reticulado N-telopeptídeos de osso tipo l colágeno (NTx), carboxiterminal telopeptido cross-linking de colágeno ósseo, lisil-piridinolina (Desoxipiridinolina), Piridinolina, resistente ao tartarato de fosfatase acida,
[00370] tipo Procollagen lC propeptido, Tipo de procolageno lN propeptido, osteocalcina (osso gla- proteína), fosfatase alcalina, catepsina K, COMP (Cartilagem Oligimeric Matrix Protein), Osteocrin, osteoprotegerina (OPG), RANKl, sRANK, TRAP 5 (TRACP 5), Osteoblast fator específico 1 ( OSF-1, Pleiotrophin), moléculas de adesão de células solúveis, sTtR, sCD4, sCD8, sCD44, e osteoblastos fator específico 2 (OSF-2, periostin).
[00371] Em algumas concretizações marcadores de acordo com a presente invenção são específicos da doença. Exemplos de marcadores de câncer incluem, sem limitação, o PSA (antígeno específico de próstata total), creatinina, fosfatase acida prostática, os complexos PSA, específicos de gene de Prostrate-1, CA 12-5, antígeno carcino-embrionario (CEA), alfa feto proteína (AFP), hCG ( gonadotrofina corionica humana), lnibina, ovário CAA C1824, CA 27,29, CA 15-3, mama CAA Cl 924, Her-2, pancreas, CA 19-9, pancreas CAA, enolase neuronio-específica, Angiostatin DcR3 (receptor chamariz solúvel 3), Endostatina, Ep-CAM (MK-1), a imunoglobulina livre cadeia kappa, lmunoglobulina livre Cadeia leve lambda, Herstatin, cromogranina A, Adrenomedulina, integrina, o receptor do fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento epidérmico tirosina-quinase do receptor, Pro- adrenomedullin peptídeo N-terminal 20, fator de crescimento endotelial vascular, receptor do fator de crescimento endotelial vascular, receptor de células-tronco fator, c-kit/KDR, KDR, e Midkine.
[00372] Exemplos de condições de doenças infecciosas incluem, sem limitação: viremia, bacteremia, sepse e marcadores: PMN elastase, elastase PMN/complexo al-Pl, surfactante proteína D (SP-D), o antígeno HBVc, HBVs antígeno, Anti-HBVc, Anti-HlV, t-supressor de antígenos das células, a razão de antígeno de células T, o antígeno das células T-helper, anti- HCV, pirogenios, antígeno p24-Muramil dipeptídeo.
[00373] Exemplos de marcadores de diabetes incluem, sem limitação de peptídeo C, Ale hemoglobina, albumina glicada, produtos finais de glicosilação avançada (AGEs), 1,5-anidroglucitol, polipeptídeo inibitório gástrico, glicose, hemoglobina Ale, ANGPTl3 e 4.
[00374] Exemplos de marcadores de inflamação incluem, sem limitação, fator reumatoide (FR), Antinuclear Anticorpo (ANA), proteína C- reativa (CRP), Clara celular Protein (Uteroglobin).
[00375] Exemplos de marcadores de alergia exemplificativos incluem, sem limitação, lgE total e lgE específica.
[00376] Exemplos de marcadores do autismo exemplares incluem, sem limitação Ceruloplasmina, Metalothioneine, Zinco, Cobre, BÓ, B12, glutationa, fosfatase alcalina, e ativação de apo-fosfatase alcalina.
[00377] Exemplos de marcadores de distúrbios de coagulação incluem, sem limitação, b-Tromboglobulina, fator plaquetário 4, fator de von Willebrand.
[00378] Em algumas formas de realização pode ser um marcador específico da terapia. Marcadores indicativos da ação de inibidores de COX incluem, sem limitação, TxB2 (COX-1), 6- ceto-PGF l alfa (COX-2), 11- desidro-TxB-la (COX-1).
[00379] Outros marcadores da presente invenção incluem, sem limitação, a leptina, receptor de leptina, e Procalcitonina, Brain proteína S100, Substancia P, 8-iso-PGF-2a.
[00380] Exemplos de marcadores geriátricos incluem, sem limitação, a enolase específica dos neurónios, GFAP e S100B.
[00381] Exemplos de marcadores do estado nutricional incluem, sem limitação, pre- albumina, albumina, proteína Retinol (RBP), transferrina, proteína estimulante de acilação (ASP), adiponectina, Proteína Relacionada a Agouti (AgRP), Angiopoietin-como proteína 4 (ANGPTl4 , FlAF), peptídeo- C, AFABP (adipócito Fatty Acid Binding Protein, FABP4), proteína estimulante de acilação (ASP), EFABP (Epidermic Fatty Acid Binding Protein, FABP5), glicentina, glucagon, glucagon-like peptide-1, o glucagon -like Peptide-2, grelina, insulina, leptina, receptor de leptina, PYY, RElMs, resistina, amd sTfR (receptor solúvel de transferrina).
[00382] Exemplos de marcadores do metabolismo dos lipídios incluem, sem limitação, Apo-lipoproteínas (vários), Apo-Al, Apo-B, Apo-C-Cll,-Apo D, Apo-E.
[00383] Exemplos de marcadores do estado de coagulação incluem, sem limitação Fator l: fibrinogênio, Fator ll: Protrombina, o Fator lll: O fator tecidual, o Fator lV: Calcio, Fator V: Proaccelerin, Fator Vl, o Fator Vll: Proconvertina, Fator Vlll, Fator Anti-hemolftica, Fator lX: fator de Natal, o Fator X: fator Stuart-Prower,
[00384] Fator Xl: Plasma tromboplastina antecedente, o Fator Xll: fator Hageman, Fator Xlll: fator estabilizador de fibrina, Precalicrefna, quininogenio de elevado peso molecular, a proteína C, proteína S, D-dimer, activador de plasminogenio de tecido, Plasminogenio, a2- antiplasmin, ativador do plasminogenio 1 (PAH).
[00385] Exemplos de anticorpos monoclonais s incluem aqueles para EGF, ErbB2, e lGF1R.
[00386] Os inibidores da tirosina quinase Abl exemplificativos incluem, sem limitação, Kit, PDGFR, Src, ErbB2, ErbB 4 EGFR, EphB, VEGFR1- 4, PDGFRB, FlT3, FGFR, PKC, Met, Tie2, RAF, e TrkA.
[00387] Exemplos de serina/treonina quinase inibidores incluem, sem limitação, AKT, Aurora A/B/B, CDK, CDK (pan), CDKl-2, VEGFR2, PDGFRB, CDK4/6, MEK1-2, mTOR, e PKC- beta.
[00388] Alvos GPCR incluem, sem limitação de receptores de histamina, serotonina, Receptores da Angiotensina, Receptores adrenérgicos, receptores de acetilcolina muscarínicos, receptores de GnRH, os receptores dedopamina, Receptores de prostaglandina, e Receptores ADP.
Colesterol
[00389] A medição dos metabolitos pode ser efetuada pela produção de um produto corado utilizando-oxidases (por exemplo, colesterol oxidase) (para fazer H202) e peroxidase de rabano, além de um cromogênio (tal como N-etil- N-(2-hidroxi- 3-sulfopropil) -3,5-dimetoxianilina, sal de sódio ["DAOS" mais anti-pireno-amino] para formar um produto colorido como um corante de Trinder). Um exemplo de tal química e apresentado na Figura 52 e Figura 53. NADH ou NADPH
[00390] Produção ou consumo de NADH ou NADPH são frequentemente utilizados em ensaios clínicos. lsso ocorre porque essas coenzimas são substratos comuns de enzimas. Por exemplo, a medição de enzimas de interesse clínico, tais como desidrogenase de lactato (lDH), pode ser medido pela taxa de produção de NADH. Desde NADH absorve a luz no máximo a 340 nm e (1) de poliestireno e outros plásticos transmitir luz mal no próximo UV, (2) Branco fontes de luz produzem pouca luz no UV próximo e (3) sensores de câmera e scanner tem baixa sensibilidade ao próximo da luz UV, não e prático para medir NADH por três analise de imagem a cores. Para lidar com este problema de NADH pode ser convertido num produto corado usando sais de tetrazólio, tais como tetrazol agua soluble tetrazolium (egWST- 1 (Dojindo tecnologias moleculares), mais um "mediador de elétrons", tal como 1-Methoxifenazina metossulfato (PMS).
[00391] Em algumas formas de realização, os ensaios que produzem ou consomem NADH ou NADPH, pode ser combinado com outras reações que permitem a medição colorimétrica. Por exemplo, o NADH ou NADPH e usado para reduzir os compostos tais como 2 - (4-lodofenil) -3 - (4-nitrofenil) -5 - (2,4-dissulfofenil)-2H-tetrazólio, sal monossódico (WST-1 ) a um corante colorido formezan como mostrado abaixo com o uso de metossulfato de fenazina como mediador de elétrons, tal como mostrado na Figura 54.
[00392] Conforme mostrado na Figura 73, quando o NADH, o WST-1 e PMS são combinadas em concentrações milimolares, um produto amarelo (mostrado nas pontas indicadas como mistura) e formado.
[00393] Usando esta química, um ensaio para a lDH foi criado. lactato (mM), NAD (mM) e de lDH foram combinadas e incubadas a 37 ° C durante 10 minutos antes da adição de WST-1 e PMS. Uma boa dose-resposta para a lDH foi obtido como mostrado na Figura 74, para duas diluições em série de lDH (1000 Ul/l) (da esquerda para a direita), correspondendo aos valores de OD a 450 nm mostrados no gráfico da Figura 75.
Fosfatase Alcalina
[00394] Em outras formas de realizado, os ensaios, utilizando enzimas tais como a fosfatase alcalina pode ser medida utilizando um substrato cromogênico tal como o fosfato de p- nitrofenilo. A reação enzimática pode fazer p-nitrofenol que é amarelo, em condições alcalinas.
Os íons metálicos
[00395] As medições também podem ser realizadas em ensaios que formam um complexo colorido, tal como entre um fon metálico de um corante quelante que muda de cor na ligação. Por exemplo, o-cresolftalefna Complexona (mostrado na Figura 55) que forma um complexo com o cálcio, que tem uma cor diferente da do reagente. O regime geral de tais ensaios e: corante quelante (cor 1) + M + N <-> dye Chelating: M + N : (Cor 2)
[00396] Sinais óticos também pode ser medida por ensaios de íons metálicos utilizando enzimas dependentes de metais. Por exemplo, os íons de sódio pode ser determinada por via enzimática por meio de atividade dependente -galactosidase de sódio, com o-nitro-fenil galactósido (ONPG) como o substrato. A absorvência a 405 nm do produto o-nitrofenol e proporcional a concentração de sódio.
ELISA
[00397] Os ensaios podem ser realizados para analitos por EllSAs formadores de cor.
[00398] Muitos métodos de ELISA são conhecidos que geram cor utilizando enzimas tais como a peroxidase de rabano, fosfatase alcalina e galactosidase com substratos cromogênicos, tais como o-fenilenodiamina, p- nitrofenil fosfato, e o galactoside-nitrofenilo, respectivamente. Tais ensaios podem ser facilmente realizados e lido pelo invento sujeito.
lmunoensaios luminogênicos
[00399] Imunoensaios luminogênicos também podem ser realizadas. Os ensaios podem utilizar entidades quimioluminogênicas, tais como uma enzima com um substrato luminogênica. Por exemplo, os compostos quimioluminescentes incluem esteres de acridinio, dioxetanos, luciferina e 2,3- dihidroftalazinadionas, tais como luminol.
[00400] Além disso, as fontes quimioluminescentes adequados incluem um composto que se torna-se eletronicamente excitado por uma reação química e pode então emitir luz que serve como sinal detectável ou doa energia a um aceitador fluorescente. Um número diverso de famílias de compostos, foram encontrados para fornecer quimiluminescência sob uma variedade de condições. Uma família de compostos e 2,3-di-hidro-l ,4-ftalazinadione. Um composto utilizado e o luminol, que é o composto 5-amino. Outros membros da família incluem o 5-amino-6, 7, 8- trimetoxi e o dimetilamino [ca] benz analógico. Estes compostos podem ser feitos de luminescência com peróxido de hidrogênio em meio alcalino ou hipoclorito de cálcio e de base. Outra família de compostos e o 2,4,5-trifenilimidazoles, com lophine como o nome comum para o produto parente.
[00401] Os análogos quimioluminescentes incluem para-dimetilamino e-metoxi substituintes. Quimiluminescência pode também ser obtido com oxalatos, esteres ativos, normalmente de oxalilo, por exemplo, p-nitrofenilo e um peróxido tal como peróxido de hidrogênio, sob condições básicas. Outros compostos quimioluminescentes uteis que também são conhecidas e incluem esteres dioxetanos acridinum N-alquilo. Alternativamente, luciferinas podem ser utilizados em conjunção com a luciferase para proporcionar lucigenins ou bioluminescencia.
A amplificação do ácido nucleico
[00402] Os ensaios que podem ser executados incluem a amplificação do ácido nucleico. Entre estes ensaios, a amplificação isotérmica e Ensaios amplificação isotérmica mediados por laço(lAMP) são exemplos. Amplificação de ácidos nucleicos pode ser utilizada para produzir produtos de reação de ensaio visivelmente turvas, fluorescente ou corado para analitos como alvos de ácidos nucleicos (genes, etc.) Tecnologia de amplificação de ácidos nucleicos podem ser utilizados para a amplificação isotérmica de alvos de DNA e RNA específica. lnformação adicional sobre a amplificação isotérmica de ácidos nucleicos está descrita em Goto et aí. ", Detecção colorimétrica da reação de amplificação isotérmica lacete mediada usando hidroxi naftol azul", BioTechniques, vol. 46, No. 3, março de 2009, 167-172.
[00403] A amplificação do ácido nucleico pode ser utilizado para medir o ADN, e, juntamente com a utilização de transcriptase reversa, RNA. Uma vez que tenha ocorrido a reação, o produto amplificado pode ser detectado opticamente utilizando corantes intercalantes ou reagentes cromogênicos que reagem com pirofosfato libertado gerado como um produto secundário da amplificação.
[00404] A reação pode ser visualizada por alterações (aumentos) em cor, fluorescência ou turbidez. Muito pequeno número de cópias de DNA pode ser detectado em menos de uma hora. Esta tecnologia pode, vantajosamente, ser lidos no presente invento usando analise de imagem de três cores. Como mostrado abaixo, as imagens dos produtos da reação de amplificação isotérmica de ácidos nucleicos de ensaio pode ser medido por (1) para trás iluminou- iluminação (ótica de transmissão) medindo a absorvancia da luz, (2) as imagens capturadas por uma câmara digital de luz transmitida através de um produto de reação ou (3) as imagens fluorescentes gerados pela iluminação dos produtos de reação com uma fonte de UV (ou qualquer outra fonte de luz adequada) captada por uma câmara digital.
[00405] O ensaio de amplificação de ácido nucleico realiza-se geralmente num formato de "one-pot" onde a amostra e os reagentes são combinados num tubo selado, e incubado a uma temperatura elevada. Em alguns formatos, a reação pode ser monitorado em tempo real por alterações nas propriedades óticas. Em outros formatos de ensaio, a reação e interrompida e os produtos de reação visualizados após adição de um reagente cromogênico ou fluorogênico. A presente invenção permite a leitura dos produtos de amplificação de ácidos nucleicos de ensaio diretamente no recipiente de reação ou depois de aspiração para as dicas aqui descritas.
Turbidez
[00406] A invenção também proporciona para ensaios turbidimricos óticos. Por exemplo, os imunoensaios podem ser configurados por medição da aglutinação de partículas de látex pequenos (50-300 nm). Nestes ensaios as partículas podem ser revestidas com um antígeno e/ou o anticorpo e a aglutinação ocorre quando um homólogo de ligação na amostra como o anticorpo ou antígeno e adicionado. Os ensaios podem ser configurados como direta (por exemplo, anticorpo sobre a partícula reage com uma proteína multi- epftopos ou biomarcadores) no modo competitivo (eg hapten droga sobre a partícula reage com o anticorpo anti-droga em concorrência com o fármaco livre na amostra) ou. A dispersão de látex se torna mais turva e a turvação pode ser medido como a diminuição da transmissão da luz usando ótica de 3 cores.
[00407] De igual modo, os ensaios baseados na aglutinação de partículas de látex grandes (diâmetro de cerca de 1 um) ou de células vermelhas do sangue podem ser medidos. Ensaio de configuração e semelhante a ensaios turbidimricos como revelados acima, mas a medição pode ser feita por analise de imagem (scanner ou medição de câmara) usando o software para interpretaro número e tamanho dos aglutinados.
[00408] Os reagentes para a execução de reações químicas podem ser incluídas nos cartuchos aqui descritos, tais como na ponteira. Os reagentes podem ser armazenados na forma de líquidos ou em formas secas, liofilizada ou vítreo.
Reagentes localizadas
[00409] Em algumas formas de realização, a localização e configuração de um local de reação e um elemento importante para um dispositivo de doseamento. A maioria, se não todos, os dispositivos de imunoensaio descartáveis foram configurados com a sua superfície de captura como parte integrante do dispositivo.
[00410] Em uma forma de realizado, uma unidade de ensaio de plástico moldado e comercialmente disponíveis ou podem ser feitos por moldagem por injeção, com formas e tamanhos precisos. Por exemplo, a dimensão característica pode ser um diâmetro de 0,05-3 mm, ou pode ser um comprimento de 3 a 30 mm. As unidades podem ser revestidos com reagentes de captura e utilizando o método semelhante aquelas usadas para revestimento de placas de microtitulação, mas com a vantagem de que eles podem ser processados em grandes quantidades, colocando-os num recipiente grande, a adição dos reagentes de revestimento e tratamento usando crivos, suportes, e semelhantes para recuperar os pedaços e lave-os conforme necessário.
[00411] A unidade de ensaio (por exemplo, envolvendo a ponta aqui revelados, pontas, vasos, ou quaisquer outros recipientes) pode oferecer um suporte rígido no qual um reagente pode ser imobilizado. A unidade de ensaio e também escolhida para proporcionar as características adequadas no que diz respeito a interação com a luz. Por exemplo, a unidade de ensaio pode ser feita de um material, tal como vidro funcionalizado, Si, Ge, GaAs, GAP, Si02, SiN4, modificado de silicone, ou de qualquer uma de uma ampla variedade de géis ou polímeros, tais como (poli) tetrafluoroetileno, (poli) vinylidenedifluoride, poliestireno, policarbonato, polipropileno, polimetilmetacrilato (PMMA), acrilonitrilo-butadieno-estireno (ABS), ou combinações dos mesmos. Numa forma de realização, compreende uma unidade de ensaio de poliestireno. Em algumas concretizações, a unidade de doseamento pode ser formada a partir de um material homogêneo, material heterogêneo, material revestido, revestido com o material, o material impregnado, e/ou material incorporado. Outros materiais adequados podem ser utilizados em conformidade com a
[00412] presente invenção. Um local de reação transparente, pode ser vantajoso. Além disso, no caso em que há uma janela permitindo opticamente transmissivo de luz atinja um detector ótico, a superfície pode ser, vantajosamente, opaca e/ou de dispersão, preferencialmente, de luz. Em algumas concretizações, a unidade de doseamento pode ser formada a partir de um material transparente. Alternativamente, uma parte da unidade de doseamento pode ser formada a partir de um material transparente.
[00413] A unidade de ensaio pode ter um reagente nela revestido e/ou nela impregnado. Em algumas concretizações, o reagente pode ser um reagente de captura capaz de imobilizar um reagente sobre uma superfície de captura. O reagente pode ser uma célula e/ou o analito, ou de qualquer outro reagente aqui descrito noutro lado. Em algumas concretizações, o reagente pode ser uma molécula que pode ser um agente de captura de células. Um agente de captura celular pode ancorar a superfície de células desejadas, durante o transporte do fluido. Em algumas formas de realização, os reagentes de captura pode ser um anticorpo, peptido, molécula orgânica (por exemplo, o que pode ter uma cadeia, molécula lipofílica lipídica), a matriz de polímero, proteína, composta de proteína, glicoproteína, que podem interagir com a membrana celular. Reagentes de captura podem ser moléculas, moléculas de ligação cruzada, nanopartículas, nanoestruturas, e/ou andaimes. Em algumas formas de realização, pode ser proporcionado microestruturas que pode tornar-se um mecanismo de análise num vaso. Reagentes de captura (que podem incluir estruturas de captura formadas pelo material de unidade de teste) pode permitir que as células a ser presa, ligado, e/ou preso.
[00414] Os reagentes de captura podem imobilizar um reagente, tal como uma célula, durante o processamento. Técnicas de captura podem ser químicos, físicos, elétricos, magnéticos, mecânicos, tamanho relacionado, relacionado com a densidade, ou qualquer combinação destes. Em algumas formas de realização, os reagentes de captura podem ser utilizados para concentrar os reagentes, tais como células, numa localização desejada. Por exemplo, uma unidade de ensaio podem ser revestidas com os reagentes de captura, o que pode levar as células a ser capturado na superfície da unidade de ensaio, assim, a concentração das células na superfície capturado. Os reagentes de captura podem manter o reagente capturado imobilizada na superfície da célula. Isto pode ajudar a manter os reagentes (por exemplo, células, analitos) estacionários durante o exame.
[00415] lmobilizar os reagentes podem ser uteis para aplicações em que pode haver ocasiões em longos aquisição para reações e/ou detecção. Por exemplo, um certo número de aplicações de imagiologia pode exigir tempos de exposição prolongados (~ 1 min) ou de imagem de objetos pequenos (<lum) que pode ter movimento Browniano significativo.
[00416] Em algumas formas de realização, os reagentes de captura podem ser formadas a partir de materiais que podem fornecer pouca ou nenhuma formação de imagem. Em alguns casos, o material da unidade de doseamento pode fornecer pouco ou nenhum fundo para a imagem latente. Os reagentes de captura podem ser escolhidos de modo que eles não interfiram com, ou tem apenas uma pequena interferência com, imagem e/ou de detecção.
[00417]Um reagente imobilizado na superfície de captura pode ser algo útil para a detecção de um analito de interesse numa amostra de fluido corporal. Por exemplo, tais reagentes incluem, sem limitação, as sondas de ácidos nucleicos, anticorpos, receptores de membrana celular, anticorpos monoclonais e anti-soros reativos com aptameros um analito específico. Vários reagentes disponíveis comercialmente, tais como um conjunto de anticorpos policlonais e monoclonais especificamente desenvolvidos para analitos específicos podem ser usados.
[00418] Um especialista na arte irão apreciar que existem muitas maneiras de imobilização vários reagentes sobre um suporte onde reação pode ter lugar. A imobilização pode ser covalente ou não covalente, através de uma porção ligante, ou amarrara-los a uma porção imobilizada. Não limitativas porções de ligação para fixação exemplares tanto de ácidos nucleicos ou de moléculas proteicas, tais como os anticorpos a um suporte sólido incluem estreptavidina ou avidina/biotina ligações, as ligações carbamato, ligações éster, amida, thiolester, tioureia (N)- funcionalizado, maleimida, amino funcionalizado , dissulfureto, amida, as ligações hidrazona, entre outros. Além disso, uma porção sililo pode ser ligada a um ácido nucleico diretamente a um substrato tal como o vidro usando métodos conhecidos na arte. Superfície de imobilização pode também ser conseguida por meio de um tirante de lisina de poli-l, que fornece uma carga de acoplamento de carga para a superfície.
[00419] As unidades de ensaio pode ser seca após o último passo de incorporação de uma superfície de captura. Por exemplo, a secagem pode ser realizada por exposição passiva para uma atmosfera seca, ou através da utilização de um distribuidor de vácuo e/ou a aplicação de ar seco e limpo através de um coletor ou por liofilização.
[00420] Uma superfície de captura pode ser aplicada a uma unidade de teste, utilizando qualquer técnica. Por exemplo, a superfície de captura pode ser pintada, impressa, eletroborrifada, embebida no material, a impregnação do material, ou qualquer outra técnica. Os reagentes de captura podem ser revestidos com o material de unidade de doseamento, incorporadas no material, a co-penetrar o material, ou pode ser formado a partir do material. Por exemplo, um reagente, tal como um reagente de captura pode ser incorporada numa matriz de polímero que pode ser usado como um sensor. Em algumas formas de realização, uma ou mais partículas pequenas, tais como uma das nanopartículas, uma micropartícula, e/ou um cordão, pode ser revestido e/ou impregnado com os reagentes. Em algumas formas de realização, os reagentes de captura pode ser parte do próprio material da unidade de ensaio, ou pode ser algo que é adicionada ao material.
[00421] Em muitas formas de realizado, uma unidade de ensaio foi concebido para permitir que a unidade seja fabricado num volume elevado, os processos de fabrico rápido. Por exemplo, pontas podem ser montados em conjuntos de grande escala para o revestimento da superfície de captura em lote ou na ponta. Em outro exemplo, pontas podem ser colocadas numa correia em movimento rotativo ou mesa para processamento em série. Ainda noutro exemplo, uma grande variedade de sugestões pode ser ligado a vácuo e/ou coletores de pressão para processamento simples.
[00422] Um reagente de captura pode ser aplicado a uma unidade de ensaio durante qualquer ponto do processo. Por exemplo, o reagente de captura pode ser aplicado a unidade de ensaio durante a fabricação. O reagente de captura pode ser aplicado a unidade de ensaio antes do envio da unidade de ensaio para um destino. Alternativamente, o reagente de captura pode ser aplicado a unidade de ensaio após a unidade de ensaio foi enviada. Em alguns casos, o reagente de captura pode ser aplicado a unidade de ensaio a um ponto de utilização, tal como um ponto de localização de serviço.
[00423] Em algumas formas de realização, o reagente de captura pode cobrir toda a superfície ou de uma zona da unidade de ensaio. O reagente de captura pode ser proporcionado numa superfície interior da unidade de ensaio. Em algumas concretizações, o reagente de captura pode cobrir porções ou secções de uma unidade de superfície de ensaio. O reagente de captura pode ser fornecido em uma superfície em um padrão. A unidade pode ter porções da superfície que possuem uma captura de reagente nela aplicada, e as porções da superfície que não tem um reagente de captura aplicada nela. Por exemplo, pode haver regiões revestidas e não revestidas. Um reagente de captura pode ser aplicado em uma superfície de acordo com uma escolha geométrica da forma como o reagente de captura e para ser aplicada. Por exemplo, o reagente de captura pode ser aplicado em pontos, linhas, colunas, matrizes regiões, círculos, anéis, ou qualquer outra forma ou padrão. Os reagentes de captura podem ser aplicados em posições desejadas da superfície.
[00424] Uma pluralidade de reagentes de captura pode, opcionalmente, ser aplicado a uma unidade de ensaio. Em algumas formas de realização, a pluralidade de reagentes de captura pode ser aplicado de modo que os diferentes reagentes de captura não se sobrepõem (por exemplo, os diferentes reagentes de captura não são aplicados para a mesma região ou zona). Alternativamente, eles podem sobrepor-se (por exemplo, os diferentes reagentes de captura podem ser aplicados para a mesma região ou região). Espaço sem quaisquer reagentes de captura podem ou não podem ser fornecidos entre as regiões com diferentes reagentes de captura. Os vários reagentes de captura podem ser utilizados para imobilizar diferentes reagentes. Por exemplo, os diferentes reagentes de captura podem ser utilizados para imobilizar células diferentes e/ou analitos na superfície da captura. Ao utilizar uma pluralidade de reagentes de captura estampados em regiões selecionadas, de uma pluralidade de reagentes podem ser detectados a partir da mesma unidade de ensaio. Em algumas formas de realizado, dois ou mais, ou mais de três, quatro ou mais, cinco ou mais, de sete ou mais, dez ou mais, ou mais de quinze, vinte ou mais, ou mais de trinta, quarenta ou mais, ou mais de cinquenta, setenta ou mais, 100 ou mais, 150 ou mais, 200 ou mais, ou 300 ou mais diferentes reagentes de captura pode ser aplicada a uma superfície de uma unidade de doseamento. Os vários reagentes de captura podem ser aplicados em qualquer padrão ou forma. Por exemplo, os diferentes reagentes de captura podem ser aplicados como uma matriz ou uma série de anéis sobre uma superfície interna de uma unidade de doseamento. Por exemplo, os diferentes reagentes de captura podem ser aplicados sobre uma superfície interna da ponta de um, recipiente, contentor, cuvetes ou outro recipiente aqui descrito noutro lado.
[00425] A localização dos diferentes reagentes de captura sobre a unidade de doseamento pode ser conhecida antes da detecção dos reagentes capturados. Em algumas concretizações, a unidade de doseamento pode ter um identificador que pode indicar o tipo de unidade de dosagem e/ou o padrão de agentes de captura das mesmas. Alternativamente, a localização dos diferentes reagentes de captura da unidade de ensaio não pode ser conhecida antes da detecção dos reagentes capturados. A localização dos diferentes reagentes de captura pode ser determinada com base em padrões de reagentes capturados detectados.
[00426] Os reagentes de captura podem ser aplicados utilizando qualquer técnica, tal como os descritos neste documento. Em alguns casos, as técnicas litográficas de mascaramento ou pode ser utilizada para aplicar diferentes reagentes de captura.
[00427] Qualquer descrição aqui de um reagente de captura e/ou o revestimento aplicado a uma unidade de ensaio podem ser aplicadas a quaisquer outras unidades ou recipientes descritos noutras partes deste documento, incluindo, mas não se limitando as pontas, vasos, tinas, ou unidades de reagentes.
Conjuntos de reagentes
[00428] Em muitas formas de realização da invenção, as unidades de reagentes são modulares. A unidade de reagentes podem ser concebidos para permitir que a unidade seja fabricada num volume elevado, os processos de fabrico rápido. Por exemplo, muitas unidades de reagentes podem ser cheio e selado em um processo em larga escala em simultâneo. As unidades de reagentes pode ser preenchidas de acordo com o tipo de ensaio ou ensaios a serem executados pelo dispositivo. Por exemplo, se um utilizador deseja que os diferentes ensaios de outro utilizador, as unidades de reagentes podem ser fabricados de acordo com as preferências de cada utilizador, sem a necessidade de fabricar um dispositivo inteiro. Noutro exemplo, as unidades de reagentes podem ser colocadas em uma correia em movimento rotativo ou mesa para processamento em série.
[00429] Em outra forma de realização, as unidades de reagentes estão alojadas diretamente para dentro das cavidades do invólucro de um dispositivo. Nesta forma de realização, um vedante pode ser feito em áreas de habitação em torno das unidades.
[00430] Os reagentes de acordo com a presente invenção incluem, sem limitação tampões de lavagem, substratos de enzimas, tampões de diluição, e os conjugados, os conjugados enzima-rotulados, amplificadores de amostra de ADN, diluentes, soluções de lavagem, reagentes de pre-tratamento da amostra, incluindo aditivos tais como detergentes, polímeros agentes quelantes, reagentes albumina de ligação, inibidores da enzima, enzimas, anticoagulantes, agentes aglutinantes de células vermelhas, anticorpos, ou outros materiais necessários para executar um ensaio em um dispositivo. Um conjugado marcado com enzima pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal marcado com um enzima que pode produzir um sinal detectável após reação com um substrato apropriado. Exemplos não limitativos de tais enzimas são a fosfatase alcalina e peroxidase de rabano. Em algumas formas de realização, os reagentes compreendem os reagentes de imunoensaio. Em geral, os reagentes, especialmente aqueles que são relativamente instáveis quando misturados com o líquido, são confinadas separadamente em uma região definida (por exemplo, uma unidade de reagente) no interior do dispositivo.
[00431] Em algumas formas de realizado, uma unidade de reagente contem cerca de cerca de 5 microlitros e cerca de 1 mililitro de líquido. Em algumas concretizações, a unidade pode conter cerca de 20-200 microlitros de líquido. Numa outra forma de realização, a unidade do reagente contem 100 microlitros de fluido. Numa forma de realizado, uma unidade de reagente contem cerca de 40 microlitros de fluido. O volume de líquido numa unidade de reagente pode variar, dependendo do tipo de ensaio a ser executado, ou a amostra de fluido corporal fornecida. Numa forma de realização, os volumes dos reagentes não são necessariamente pré-determinados, mas devem ser mais do que um mínimo conhecido. Em algumas formas de realização, os reagentes são armazenados inicialmente secos e dissolveu-se após o início do ensaio a ser executado no dispositivo.
[00432] Em uma forma de realização, as unidades de reagentes podem ser preenchidas com um sifão, um funil, uma pipeta, uma seringa e uma agulha, ou uma combinação destes. As unidades de reagentes podem ser cheias com líquido, usando um canal de enchimento e um canal do vácuo. As unidades de reagentes podem ser preenchidas individualmente ou como parte de um processo de fabrico em massa.
[00433] Em uma forma de realizado, uma unidade de reagente individuais compreende um reagente diferente, como um meio de isolar os reagentes uns com os outros. As unidades de reagentes podem também ser usadas para conter uma solução de lavagem ou de um substrato. Além disso, as unidades de reagentes podem ser usadas para conter um substrato luminogênico. Numa outra forma de realização, uma pluralidade de reagentes está contida dentro de uma unidade de reagente.
[00434] Em alguns casos, a instalação do dispositivo permite que a capacidade de pre- calibração das unidades de ensaio e as unidades de reagentes antes da montagem de artigos descartáveis do dispositivo sujeito.
Ensaios de ligação Aptamer
[00435] A presente invenção permite que uma variedade de métodos de ensaio baseados no uso de elementos de ligação que se ligam especificamente a um ou mais analitos numa amostra. Em geral, um elemento de ligação e um membro de um par de ligação capaz de se ligar seletivamente e especificamente para o outro membro do par de ligação na presença de uma pluralidade de moléculas diferentes. Exemplos de elementos de ligação incluem, mas não estão limitados a anticorpos, antigenes, ligandos de ligação a metais, as sondas de ácidos nucleicos e iniciadores, os receptores e os reagentes tal como aqui descritos e aptameros. Em algumas formas de realização, um elemento de ligação usados para detectar uma substancia a analisar e um aptamero. O termo "aptamero" e utilizado para se referir a um peptido, de ácido nucleico, ou uma sua combinação, que e selecionado para a capacidade de se ligarem especificamente um ou mais analitos alvo. Peptídeos aptameros são agentes de afinidade que compreendem geralmente um ou mais domínios de loop variável exibida na superfície de uma proteína de andaime. Um aptamero ácido nucleico e um oligonucleótido de ligação específica, que e um oligonucleótido que e capaz de seletivamente formar um complexo com um analito alvo pretendido. A complexação e específico do alvo, no sentido de que os outros materiais, tais como outros analitos que podem acompanhar o analito alvo, não para o aptamero complexo com uma afinidade tão grande. Reconhece-se que a complexação de afinidade e são uma questão de grau, contudo, neste contexto, significa "específicos"-alvo que o aptamero liga ao alvo com um grau muito mais elevado do que a afinidade que se liga ao material contaminante. O significado de especificidade neste contexto e, portanto, semelhante ao significado de especificidade quando aplicada a anticorpos, por exemplo. O aptamero podem ser preparados por qualquer método conhecido, incluindo os métodos de síntese, recombinante e purificação. Além disso, o termo "aptamero" também inclui "aptameros secundarias" que contenham uma sequência de consenso derivada de comparar duas ou mais aptameros conhecidas para um determinado alvo.
[00436] Em geral, os aptameros de ácido nucleico são de cerca de 9 a cerca de 35 nucleotídeos de comprimento. Em algumas concretizações, um aptamero de ácido nucleico e de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 100 ou mais resíduos de comprimento. Embora os oligonucleótidos dos aptameros são geralmente de cadeia simples ou de cadeia dupla, e contemplado que podem, por vezes, aptameros assumir estruturas de cadeia tripla ou quadrupla de cadeia simples. Em algumas concretizações, um aptamero de ácido nucleico e circular, como na patente US20050176940. Os oligonucleótidos de ligação específicos dos aptameros deve conter o que confere especificidade de sequência, mas pode ser alargada com regiões flanqueando e derivatizado ou modificado de outra forma. Os aptameros encontrados para se ligar a um analito alvo podem ser isolados, sequenciados, e em seguida, re-sintetizadas como fragmentos de ADN ou ARN convencional, ou podem ser modificados oligómeros. Estas modificações incluem, mas não estão limitados a incorporação de: formas modificadas ou análogas de açucares (por exemplo, ribose e desoxirribose), (2) grupos de ligação alternativos, ou (3) formas análogas de bases de purina e pirimidina.
[00437] Os aptameros de ácido nucleico podem compreender ADN, ARN, funcionalizados ou modificados de bases de ácido nucleico, análogos de ácidos nucleicos, químicas backbone modificados ou alternativa, ou combinações dos mesmos. Os oligonucleótidos dos aptameros podem conter as bases convencionais para adenina, guanina, citosina e timina ou uridina. incluídos dentro dos aptameros prazo são aptameros sintéticas que incorporam formas análogas de purinas e pirimidinas. Formas “análogos" de purinas e pirimidinas são os geralmente conhecidos na arte, muitas das quais são utilizadas como agentes quimioterapeuticos. Exemplos não limitativos de formas de análogos de purinas e pirimidinas (isto e, análogos de base) incluem aziridinylcytosine, 4-acetilcitosina, 5-fluorouracilo, 5-bromo uracilo, 5- carboximethylaminomethyl-2- tiouracilo, 5-carboximetil-aminomethyluracil, inosina, NÓ- isopenteniladenina, 1 - metiladenina, 1- methylpseudouracil, 1- metilguanina, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-metiladenina, 2- metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, NÓ-metiladenina, 7- metilguanina, 5-metilaminometil- uracilo, 5-Metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-mannosylqueosine, 5-methoxiuracil, 2- metil-tio- NÓ- isopenteniladenina, ido uracil-5-oxiacetico éster metílico, pseudouracil, queosine, 2- thiocytosine, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5- metiluracilo, 5-uracilo ácido oxiacetico, 5-pentinilo-uracilo, e 2,6- diaminopurina. A utilização de uracilo como substituto de uma base de timina no ácido desoxirribonucleico (a seguir referido como "dU") e considerada como uma forma de "analogo" de pirimidina com a presente invenção.
[00438] Os oligonucleótidos aptameros podem conter formas análogas de açucares ribose ou desoxirribose que são conhecidos na arte, incluindo, mas não limitado a 2 'açucares substituídos tais como 2'-0-metil-, 2'-0-alilo, 2'- fluoro-ou 2 '-azido-ribose, análogos de açúcar carbociclico, açucares alfa- anomericos, açucares epimericos, tais como arabinose, xiloses ou lyxoses, açucares piranose, açucares furanose, sedoheptuloses, ácidos nucleicos fechados (lNA), o ácido nucleico peptídico (PNA) , análogos acíclicos e análogos de nucleósidos abásicos, tais como metil-ribósido.
[00439] Aptameros pode também incluir intermediários na sua síntese. Por exemplo, qualquer um dos grupos hidrocarbonetos de Xil normalmente presentes pode ser substituído por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por um grupo protetor padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais aos nucleotídeos adicionais ou substratos. A 5 'do terminal OH e convencionalmente livre, mas pode ser fosforilada; substituintes OH no terminal 3' pode também ser fosforilado. Os hidroxilos podem também ser derivatizados para grupos de proteção padrão.
[00440] Uma ou mais ligações fosfodiester pode ser substituído por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem, mas não estão limitados as formas de realização em que P (0) 0 e substituído por P (0) S ("tioato"), P (S) S ("Dithioate"), P (0) N 2 ("amidato"), P (0) R, P (0) OR ', CO ou CH2 ("formacetal"), em que cada R ou R' e independentemente H ou substituído ou não substituído, alquilo (1-20C). contendo opcionalmente um eter (- O-) de ligação, arilo, alcenilo, cicloalquilo, cicloalcenilo ou aralquilo.
[00441] Uma forma de realização particular de aptameros que são uteis na presente invenção baseia-se em aptameros de ARN tal como descrito na Patente dos EUA. N ° s 5.270.163 e 5.475.096, que são aqui incorporadas por referência. As patentes acima mencionadas descrevem o método de SElEX, que envolve a seleção de uma mistura de oligonucleidos candidatos e iterações escalonadas de ligação, partição e amplificação, utilizando o mesmo esquema de seleção geral, para atingir virtualmente qualquer critério pretendido de afinidade e seletividade de ligação. A partir de uma mistura de ácidos nucleicos, que compreende de preferência um segmento de sequência aleatória, o método SElEX inclui etapas de colocar em contato a mistura com um alvo, tal como um analito alvo, sob condições favoráveis para ligação, partição dos ácidos nucleicos não ligados os ácidos nucleicos que se ligaram especificamente as moléculas alvo, dissociação dos complexos de ácido nucleico-alvo, amplificação dos ácidos nucleicos dissociados dos complexos de ácido nucleico-alvo para obter uma mistura enriquecida com ligante de ácidos nucleicos e, em seguida, retomando as etapas de ligação, de particionamento, dissociação e amplificação através de muitos ciclos, conforme desejado, para se obter ligandos de ácidos altamente específicos de elevada afinidade nucleicos com a molécula alvo. Em algumas formas de realizado, o rastreio negativo e empregue em que uma pluralidade de aptameros são expostos a analitos ou de outros materiais susceptíveis de ser encontrados, juntamente com os analitos alvo numa amostra a ser analisada, e apenas aptameros que não se ligam ficam retidos.
[00442] O método SElEX engloba a identificação dos ligandos de afinidade elevada de ácidos nucleicos contendo nucleotídeos modificados que conferem características melhoradas no ligando, tal como estabilidade in vivo melhorada ou características de entrega melhoradas.
[00443] Exemplos de tais modificações incluem substituições químicas na ribose e/ou fosfato e/ou posições de base. Em algumas formas de realizado, dois ou mais aptameros são unidas para formar uma única molécula de aptamero, multivalente. Moléculas aptamer polivalentes podem conter várias cópias de um aptamer, cada cópia visando o mesmo analito, dois ou mais aptameros diferentes destinados a diferentes analitos, ou combinações destes.
[00444] Aptameros podem ser usadas como reagentes de diagnóstico e prognóstico, como reagentes para a descoberta de novas terapêuticas, como reagentes de controlo em resposta a droga particulares, e, como reagentes para a descoberta de novos alvos terapêuticos. Aptameros pode ser usado para detectar, modificar a função de, ou inibir ou interferir com a função de um ou mais analitos alvo. O termo "analito", como aqui utilizado, inclui, sem limitação, drogas pró-fármacos, agentes farmacêuticos, metabolitos de drogas, tais como biomarcadores de proteínas expressas e marcadores de célula, anticorpos, proteínas do soro, colesterol e outros metabolitos, eletrólitos, íons metálicos, polissacarídeos, ácidos nucleicos, analitos biológicos, biomarcadores, genes, proteínas, hormônios ou qualquer combinação destes. Os analitos podem ser combinações de polipeptídios, glicoproteínas, polissacáridos, lipídios e ácidos nucleicos.
[00445] Aptameros pode inibir a função de produtos de genes, por qualquer um de, mas não limitado apenas, os seguintes mecanismos: (i) a modulação da afinidade da interação proteína-proteína, (ii)modular a expressão de uma proteína a um nível de transcrição; (iii)a modulação da expressão de uma proteína a um nível pós- transcricional, (iv)modular a atividade de uma proteína, e (v), a modulação da localização de uma proteína. O mecanismo preciso de ação de aptameros de peptídeos pode ser determinada por meios bioquímicos e genéticos para determinar a sua função específica no contexto da sua interação com outros genes e produtos de genes.
[00446] Aptameros pode ser usado para detectar um analito, de qualquer dos esquemas de detecção aqui descritos. Numa concretização, aptameros são covalentemente ou não covalentemente acoplado a um substrato. Exemplos não limitativos de substratos aos quais podem ser acoplados aptameros incluem micro arranjos, microesferas, pontas de pipeta, dispositivos de transferência de amostras, tinas, tubos capilares ou outro, câmaras de reação, ou qualquer outro formato adequado compatível com o sistema de detecção de objeto. Produção Biochip microarray pode empregar diversas técnicas de fabricação de semicondutores, tais como a química em fase sólida, química combinatória, a biologia molecular, e robótica. Um processo utilizado e tipicamente um processo de fabricação para a produção de micro arranjos photolithographic com milhões de sondas num único chip. Alternativamente, se as sondas são pre- sintetizados, eles podem ser ligados a uma superfície de matriz, utilizando técnicas tais como micro-canal de bombagem", de jacto de tinta" spotting, modelo-estampagem, ou de fotorreticulação. Um processo exemplar photolithographic começa por revestimento de uma pastilha de quartzo com um composto químico sensível a luz para evitar que o acoplamento entre a pastilha de quartzo e o primeiro nucleotídeo da sonda de DNA a ser criado. Uma máscara litográfica e usado para inibir ou permitir a transmissão de luz em localizações específicas da superfície da bolacha. A superfície e em seguida posto em contato com uma solução que pode conter adenina, timina, citosina ou guanina, e o acoplamento ocorre apenas nas regiões sobre o vidro que foram desprotegidos através de iluminação. O nucleotídeo acoplado suporta um grupo protetor sensível a luz, permitindo que o ciclo pode ser repetido. Desta maneira, o microarray e criada como as sondas são sintetizadas através de ciclos repetidos de desproteção e acoplamento. O processo pode ser repetido até que as sondas de atingir o seu comprimento total.
[00447] Matrizes comercialmente disponíveis são tipicamente fabricados a uma densidade de mais de 1,3 milhões de características únicas por matriz.
[00448] Dependendo das exigências da experiencia e o número de testes necessários por matriz, cada pastilha, pode ser cortada em dezenas ou centenas de matrizes individuais.
[00449] Outros métodos podem ser usados para produzir o biochip. O biochip pode ser uma película de langmuir-Bodgett, vidro funcionalizada, germânio, silicone, PTFE, poliestireno, arsenieto de gálio, ouro, prata, membrana, nylon, PVP, ou qualquer outro material conhecido na técnica que e capaz de ter grupos funcionais tais como amino, carboxilo, de Diels-Alder reagentes, tiol ou hidroxilo incorporadas na sua superfície. Estes grupos podem, então, ser ligado de forma covalente a agentes de reticulação, de modo que a ligação subsequente dos ligandos de ácidos nucleicos e a sua interação com as moléculas-alvo irá ocorrer em solução, sem impedimento a partir do biochip. Grupos de reticulação típicos incluem o etileno-glicol oligômero, diaminas e aminoácidos. Alternativamente, aptameros podem ser acoplados a uma matriz utilizando procedimentos enzimáticos, tais como os descritos em US20100240544.
[00450] Em algumas formas de realização, aptameros são acoplados a superfície de uma microperola. Microbeads uteis no acoplamento de oligonucleótidos são conhecidos na arte, e incluem as esferas magnéticas, magnetizável, e não-magnético. Microbeads pode ser marcado com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais corantes para facilitar a codificação dos grânulos e a identificação de um aptamero a ela unida. Codificação das microesferas pode ser usado para distinguir pelo menos 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 5000, ou mais diferentes microesferas num único ensaio, cada Microbead correspondente a um aptamero diferente com especificidade para um analito diferente.
[00451] Em algumas formas de realização, os reagentes são acoplados a superfície de uma câmara de reação, tal como uma ponta. Por exemplo, a superfície interior de uma ponta pode ser revestida com um aptamero específico para um único analito. Alternativamente, a superfície interior de uma ponta pode ser revestida com duas ou mais diferentes aptameros específicos para diferentes analitos. Quando dois ou mais diferentes aptameros são acoplados a mesma superfície da ponta interior, cada um dos diferentes aptameros podem ser acoplados em diferentes localizações conhecidas, tais como a formação de anéis ou bandas distintas ordenados em diferentes posições ao longo do eixo de uma ponta. Neste caso, múltiplos analitos diferentes, podem ser analisadas na mesma amostra extraindo uma amostra de uma ponta e permitindo que os analitos contidos na amostra para se ligar com os aptameros revestidas em posições sucessivas ao longo da ponta. Eventos de ligação pode então ser visualizado como aqui descrito, com a localização de cada banda num padrão de bandas correspondendo a um analito específico conhecido.
[00452] Em algumas formas de realização, a ligação de um ou mais aptameros para um ou mais analitos alvo e detectada através de um elemento ótico. Em algumas formas de realização, o elemento ótico e fluorescência. Em algumas formas de realizado, uma amostra contendo os analitos a ser analisado e tratado com um composto de rotulagem para conjugar os analitos com uma marcação fluorescente. A ligação pode então ser avaliada por fluorescência para detectar a presença e opcionalmente a quantidade de um ou mais analitos, tais como a ilustrada na Figura 136, em combinação com aptameros acoplados a uma matriz, e na Figura 137, em combinação com aptameros acoplados a esferas codificadas. Em algumas formas de realização, a amostra e tratada com um composto de rotulagem para conjugar os analitos com um ligante. Após a ligação do ligante e funcionalizado com um marcador fluorescente e o evento positivo e medida por fluorescência. Em algumas concretizações, o domínio de ligação de um aptamero analito e parcialmente hibridado com uma sonda complentary que e marcado por fluorescência. Após se ligar ao analito, a sonda complementar e libertado, o que resulta em uma diminuição mensurável na opticamente sinal fluorescente. Em algumas concretizações, um aptamero e marcado por fluorescência e parcialmente hibridado com uma sonda complementar marcado com um supressor que está em proximidade com o marcador fluorescente. Após se ligar ao analito, a sonda complementar e libertado, resultando num aumento mensurável na fluorescência do marcador conjugado com o aptamero. Em algumas concretizações, o aptamero e parcialmente hibridado com uma sonda complementar, o que provoca a oclusão de hibridação contendo um domínio de uma estrutura secundaria. Após se ligar ao analito, a sonda complementar e libertado, e a estrutura secundaria e disponibilizada a um corante de intercalação usado para produzir um sinal mensurável. Etiquetas uteis na detecção da ligação entre uma apatamer e um analito num par de ligação podem incluir, por exemplo, fluoresceína, tetrametilrodamina, vermelho do Texas, ou qualquer outra molécula fluorescente conhecido na técnica. O nível de marcador detectada em cada endereço na biochip irá variar de acordo com a quantidade de analito alvo na mistura a ser testada.
[00453] Em algumas formas de realização, a sonda complementar deslocada e conjugado com um membro de um par de afinidade, tais como bio estanho. Uma molécula detectável e então conjugado com o outro membro do par de afinidade, por exemplo, a avidina. Depois da mistura de ensaio e aplicada ao biochip, e adicionado o conjugado molécula detectável. A quantidade de molécula detectável em cada local no biochip variara inversamente com a quantidade de molécula alvo presente na mistura de ensaio. Numa outra forma de realização, a sonda complementar deslocada será marcado com biotina, e podem ser detectados através da adição de avidina marcada com fluorescência, a própria avidina irá então ser ligada a outra marcado por fluorescência, o composto conjugado com biotina. O grupo de biotina no oligonucleótido deslocados também pode ser usado para ligar uma enzima repórter ligada a avidina, a enzima ira catalisar uma reação que conduz a deposição de um composto detectável. Alternativamente, a enzima repórter vai catalisar a produção de um produto insolúvel que irá extinguir localmente a fluorescência de um biochip intrinsecamente fluorescente. Numa outra forma de realização do ensaio de deslocamento, a sonda complementar deslocada será marcado com uma sonda imunologicamente detectáveis, tais como a digoxigenina. A sonda complementar deslocada será então ligado por um primeiro conjunto de anticorpos que reconhecem especificamente a sonda. Estes primeiros anticorpos, então, ser reconhecido e ligado por um segundo conjunto de anticorpos que são marcados com fluorescência, ou conjugado com uma enzima repórter. Muitas variações destes exemplos são agora conhecidos ou ocorrerão aos peritos na arte. Ensaios análogos aos testes EllSA "duplo- sanduíche" também pode ser configurado usando combinações de anticorpos e aptameros como receptores. Por exemplo, uma superfície de captura pode ser funcionalizado com um aptamero e o reagente de detecção pode ser um anticorpo marcado com enzima. Por outro lado, o anticorpo pode estar na superfície de captura e o reagente de detecção marcando um aptamero.
[00454] Em algumas formas de realizado, uma amostra contendo um analito a ser analisado e dispersa numa matriz de hidrogel tridimensional. A matriz de hidrogel pode ser ativado para armadilha covalenly proteínas e pequenas moléculas. Após uma lavagem do excesso de amostra e não acoplado, aptameros marcadas por fluorescência podem ser introduzidos para a detecção dos analitos específicos presentes, como ilustrado na Figura 138. Em algumas formas de realização, a matriz de hidrogel tridimensional e dividida em pequenos subconjuntos ou microcavidades em que um único aptamero podem ser adicionados se submeter a uma análise específica do analito presente. Em algumas concretizações, aptameros são rotulados com um conjunto de pontos de quantum codificados ou marcações fluorescentes correspondentes a uma única assinatura. Em algumas concretizações, aptameros marcadas são adicionadas a matriz tridimensional, simultaneamente com a amostra.
[00455] Em algumas formas de realização, um aptamero e usado em vez de um anticorpo de um ensaio de EllSA. Em geral, uma amostra e exposta a uma superfície e, especificamente, ou não especificamente, acoplado ao mesmo. Num EllSA sanduíche, um analito esta especificamente ligado a um ligando de superfície de primeiro anticorpo, que e acoplada a superfície. Num EllSA típico, o analito, se ligou-se especificamente ou não-especificamente, e então detectada por ligação a um segundo anticorpo transportando um marcador. Em um aptamero EllSA, o primeiro anticorpo, o segundo anticorpo, ou ambos são substituídos com aptameros específicos para um analito.
Analise de Imagem de amostras, ensaio de reação de produtos
[00456] Em algumas formas de realização da invenção, a análise das amostras e os produtos de reação de ensaio pode ser realizado utilizando a imagem digital. As cuvetes de ensaio pode ser alinhada para a medição e digitalizada ou trabalhada em uma única operação. No sistema instrumentados da invenção isto e conseguido automaticamente pelos componentes mecânicos. Tinas de ensaio estão localizados em locais definidos em um cartucho e se mudou para o scanner mantendo a mesma orientação e espaçamento. O gráfico mostrado na Figura 92 corresponde a resposta do canal verde ao longo da largura da tina. Como está representado, os bordos das cuvetes são bem definidos, como o local correspondente ao meio da cuvete.
[00457] As imagens obtidas por varrimento ou a imagem pode ser uma matriz bidimensional de pixels, em que cada pixel compreende uma pluralidade de valores de intensidade correspondem a uma região de detecção espectral distinta (por exemplo, vermelho, azul, verde). As imagens podem ser interpretados pela linha-scans, que pode corresponder a uma porção horizontal de uma ponta. Se a ponta e de forma circular, em seguida, uma absorvancia eficaz pode ser determinada por deconvolução da linha de varrimento através de uma função apropriada. Exemplo funções incluem funções parabólicas e funções para círculos. Em algumas formas de realizado, as imagens podem ser dados em média ao longo de várias imagens tiradas de uma ponta ou uma amostra durante um intervalo de localizações físicas.
[00458] Em uma forma de realização, e proporcionado um sensor para localizar uma unidade de ensaio relativamente a um detector quando e detectado num ensaio.
[00459] Conforme mostrado na Figura 61 e na Figura 62, as soluções de azul de bromofenol foram aspiradas para um conjunto de pontas cônicas e fotografada com iluminação face frontal (fonte de luz e o detector no mesmo lado do objeto). Pequenos volumes (5 ul) de diluições em série de uma solução a 0,78 mg/ml, foram utilizados com a concentração mais elevada na parte superior da imagem. Na Figura 61, a esquerda dicas tem a amostra localizada na posição a mais larga na ponta cônica enquanto dicas sobre o direito tem a amostra a parte mais estreita. A imagem na Figura 61 foi feita utilizando um sistema de digitalização ótica.
[00460] A Figura 62 mostra dicas que foram fotografados usando uma configuração de retro-iluminado (fonte de luz e o detector em lados opostos do objeto digitalizado). A configuração de retro-iluminado pode ser preferida por causa da qualidade de imagem mais elevada.
[00461] Conforme mostrado na Figura 61 e na Figura 62, o comprimento do percurso ótico efetivo de uma solução de cor pode ser variado mudando-se projetam ponta. Em particular, o comprimento da trajetória pode ser variada dentro de uma única ponta para aumentar a sensibilidade da medição da absorvancia de luz (de longo comprimento de trajetória) ou para aumentar a gama dinâmica de medição. O comprimento da trajetória pode seralterado, por exemplo, alterando o diâmetro da ponta.
[00462] Uma característica adicional da concepção da ponta pode ser a de que permite que os ensaios a serem lidos com um volume muito pequeno de produto da reação de ensaio requer um volume muito pequeno da amostra. Tipicamente, as misturas de reação de ensaio são incubados numa parte estreita de uma ponta que proporciona uma elevada proporção de área superficial líquido/ar ao volume, minimizando assim a evaporação. O pequeno volume pode então ser transferido para uma grande parte da ponta para a medição do produto colorido maximizando assim o comprimento da trajetória ótica disponível (e aumentando deste modo a absorção de luz) para um dado volume de mistura de reação.
[00463] Por exemplo, na tabela abaixo, que compara a leitura de uma mistura de reação do ensaio de 10 ul em que uma amostra de 1 ul e diluída 1: 10. Nas pontas do corrente invento, a incubação de uma mistura de ensaio pode ser alcançada em um mm de comprimento da região da ponta com um diâmetro de um milímetro, em seguida, ser transferida para uma região 3 mm de diâmetro para medição de cor 13. Em comparação com o uso de uma placa de micro titulação de dimensões normalizadas (típica de placas de 384 poços) a incubar e ler o mesmo ensaio, a área de superfície do líquido exposto ao ar (permitindo a evaporação) e cerca de 5 vezes menor e o comprimento da trajetória ótica e de cerca duas vezes maior.
Otimizando o comprimento do percurso ótico
[00464] Medições espectroscópicas de solutos coloridas são tradicionalmente medido por registro da fração de luz transmitida através de uma cuvete no comprimento de onda máximo de absorvancia. Os dados são então transformadas para dar absorvancia (A) ou os valores de densidade ótica (OD). De acordo com a lei de Beer, A (max) = EM * l * Concentração onde EM e o produto de extinção molar (l/Mole.cm), 1 e o comprimento da trajetória ótica (cm) e a concentração e em unidades molares. OD = A por 1 = 1. Isto e feito para proporcionar uma medida, A, que e diretamente proporcional a concentração do soluto.
[00465] Ha duas limitações significativas de medidas de absorbância para dosagens de soluto. Em baixas concentrações, a mudança na transmissão e pequeno e, por conseguinte impreciso, devido as variações no fundo (ou branco) de transmissão. Na transmissão de alta concentração e muito baixa (por exemplo, em A = 3, a luz transmitida e de 1/1000 o da luz de entrada. Qualquer "perdidos" leves ou outras formas de sinal de ruído tem um efeito significativo sobre a medição e a resposta ao concentração se torna não-linear e imprecisa. Tipicamente, as medições de absorvancia são considerados como exato e preciso ao longo de um intervalo de cerca de 0,1 a cerca de 2,0 (de uma escala de 20 vezes).
[00466]O método da presente invenção ultrapassa estes problemas, numgrau significativo, permitindo medições fáceis de cor ao longo de uma vasta gama dinâmica (até 1000 vezes):1. Em diferentes comprimentos dos caminhos: baixas concentrações pode ser medido em comprimento do caminhos longas e altas concentrações de comprimento do caminhos curtas.
[00467]. Em diferentes canais de cor: concentrações baixas pode sermedido no canal de cor melhor correspondência e elevadas concentrações, em canais de cores não correspondentes a cor.
[00468] Esta situação e ilustrada pelos dados apresentados na Figura 79. Soluções azul de bromofenol diluído em série a partir de um mg/ml stock 5 foram analisados utilizando o método de três cores em dicas em dois locais, um deles com uma extensão de caminho máximo (também "comprimento do caminho" aqui) de cerca de 5 mm ("grande"), o outro de cerca de 1 mm ("estreito"). Os sinais dos três canais de cor foram normalizadas para os níveis mais altos e mais baixos como mostrado no gráfico seguinte. Um algoritmo para extrair de forma otimizada a concentração do analito (azul de bromofenol) foi estabelecido da seguinte forma:
[00469] Para os sinais normalizados no intervalo de 10% no máximo <sinal de <90% no máximo, calcular um valor de concentração = a + b * log (sinal) + c * (log (sinal)) A 2, onde B e C são constantes arbitrarias. Esta operação foi executada para cada cor em ambas comprimento dos caminhos.
[00470] Usando uma otimização de rotina bem conhecida (por exemplo, "Solver" no Microsoft Excel), calcular os valores de melhor ajuste de a, b e c para todas as cores e comprimento do caminho.
[00471] Os valores médios de concentração calculados para todas as cores e o comprimento do caminho.
[00472] Conforme mostrado na Figura 80, o método produziu resultados precisos através de uma gama de concentração de 1000 vezes. Quando o algoritmo foi usado para calcular os valores de concentração para medições repetidas (n = 3), o CV médio foi de 3,5%.
[00473] As medições podem ser feitas em várias comprimento do caminhos. Em alguns casos, comprimento dos caminhos são pelo menos parcialmente dependente do recipiente (por exemplo, cuvete, ponta, frasco) geometria. A geometria do recipiente e/ou recursos do container, tais como características de dispersão, pode afetar o caminho ótico e comprimento do caminho no recipiente.
[00474] A análise multicor Scanners e câmeras tem detectores que podem medir uma pluralidade de diferentes regiões do espectro de detecção de canal cores (por exemplo, vermelho, verde e azul). Devido a largura espectral de cada um destes canais e ampla e químicas cor produzir produtos coloridos com larguras de banda larga, os produtos de reação coloridos podem ser detectados utilizando uma pluralidade de espectros de detecção de canal. Por exemplo, a Figura 71 mostra a resposta de glóbulos vermelhos (quadrados), verde (losangos), e azul (triângulos) de canal de detecção de espectros em função da concentração de analito. Os sinais produzidos por cada detector correspondem a intensidade da luz dentro de cada espectro e de detecção são tipicamente expressa como um número de 0 a 255. Quando a luz branca e transmitida através de uma tina de secção circular, contendo um soluto de cor, como mostrado acima, a luz e absorvida e a intensidade de luz reduzida de forma a que as respostas do detector mudar.
[00475] Por exemplo, quando o azul de bromofenol, dissolvido em tampão alcalino, em concentrações que variam de 0 a 5 mg/nil e digitalizados no local indicado "C3" na Figura 62, os sinais mostrados na Figura 66, que são as respostas do detector media durante uma zona correspondente a sete pixels ao longo do comprimento da cuvete. Os sinais foram registrados em um scanner Epson backlit. A Figura 66 mostra as respostas de três cores de um conjunto de 11 cuvetes contendo duas series de diluições de uma solução "em branco" (dispostos da esquerda para a direita na imagem) a 5 mg/ml de solução de azul de bromofenol e. A imagem das pontas digitalizados e mostrado na Figura 67. O sinal em cada canal que corresponde a solução e reduzida a um ponto relacionado com o percurso ótico. Por conseguinte, a variação máxima do sinal e considerado no centro da tina. Quando os sinais na região central da tina-se a media (relativamente a zona indicada pelos pequenos retângulos para a quarta tina a partir da esquerda) e plotados contra a concentração de azul de bromofenol, foi observada a curva dose-resposta mostrados Figura 68. Em cada "canal" cor do sinal caiu bem com a concentração. O sinal verde mudou mais e o sinal azul menos. Densidades óticas correspondentes medidos num espectrômetro de M5 (Molecular Devices) ao comprimento de onda de absorvancia máxima (por exemplo, 589 nm) também são mostrados. Em concentrações mais elevadas, a resposta espectrofotômetro torna-se não linear e muda muito pouco com a concentração. Um efeito semelhante foi observado no scanner respostas verde e vermelho do canal. A resposta do canal azul em contraste, e muito pequena até que as concentrações mais elevadas.
[00476] De acordo com a lei de Beer, absorção de uma solução e igual a eM *Concentração* caminho ótico. Absorvancia e definido como loglO (Transmissão/Transmissão em branco), em que a transmissão em branco e a correspondente a do solvente. Estritamente lei de Beer aplica-se a um feixe paralelo de luz monocromática (na pratica, uma largura de banda de poucos nm) passa normalmente através de uma tina retangular. Espectrofotômetros responder linearmente a concentração até valores de absorção de cerca de 1,5. Na maior absorvência, resposta do aparelho torna-se não linear devido a "luz difusa" e outros efeitos. A densidade ótica e definida como a absorvancia para um comprimento de trajetória ótica um centímetro.
[00477] Quando os dados do sinal de cor a partir da experiencia anterior foi transformado de acordo com uma expressão que lineariza transmissão ótica de modo a obter um valor de absorvência proporcional a concentração em espectrofotometria convencional (-log (sinal/placa de sinal), o gráfico mostrado na Figura 69 foi obtido para os canais verde (praças) e vermelho (diamantes).
[00478] Os dados do canal verde seguido lei de Beer, mas os dados do canal de vermelho não se atingindo um nível estável de uma amostra com cerca de 2 mg/nil de uma forma semelhante ao da resposta do OD do espectrofotômetro.
[00479] Melhor utilização do ensaio por meio de análise de três cores e otimização do comprimento do percurso ótico.
[00480] Resultados do ensaio de configurações de reação que de outra forma fornecem dados não interpretáveis podem ser recuperados usando o presente invento. A presente invenção permite uma maior gama dinâmica e sensibilidade dos testes pela combinação de otimização do comprimento da trajetória ótica e análise de três cores. A incapacidade de recuperar dados atormentados pela reduzida gama dinâmica e um grande problema na gestão de ensaio, especialmente no contexto de amostras a ser avaliados para efeitos de gestão de diagnóstico ou de terapia e que os ensaios tem uma gama dinâmica limitada ou gama limitada de valores de analitos que podem ser relatadas com boa confiança. Ha duas razões principais pelas quais um resultado do ensaio pode não estar disponível a partir de sistemas de ensaio em laboratório ou de situações de teste distribuídos. Ou seja, o valor do analito e muito alto ou muito baixo para ser relatado. Isto pode, em certas circunstancias, ser retificada em laboratórios clínicos, por reanalise de uma porção de uma amostra mantida utilizando uma diluição diferente. Em testes distribuídos normalmente, não há recurso, mas para lembrar o paciente, obter uma nova amostra e usar um método diferente (laboratório). Isto e porque os sistemas de ensaio utilizam protocolos fixos e níveis fixos de diluição da amostra. Em qualquer situação, e muito inconveniente e caro para corrigir o problema. Além disso, a informação pertinente para valioso diagnóstico correto e/ou gestão da terapia pode ser perdido com dano resultante para o paciente.
[00481] No sistema da presente invenção, estes problemas são eliminados por monitorização dos ensaios durante a sua execução, reconhecendo qualquer problema e alterar quer a extensão de caminho ótico usado para medir o produto de ensaio, ou fazendo uso de diferentes níveis de sensibilidade dos três canais de cor para o ensaio de cor e por sua vez com a sensibilidade do analito.
[00482] Em particular, quando o produto da reação do ensaio e medido, se o sinal medido e demasiado elevado ou demasiado baixo, o sistema pode responder por: 1. fazendo a medição com um comprimento de trajetória diferente (movendo-se a cuvete ótica relativa ao sistema ótico de modo que o comprimento da trajetória ou e maior ou menor). Isto pode ser realizado através de (a) fazer uma medição em um, primeiro local padrão,
[00483](b) apresentar o resultado para o software de gestão do ensaio (no aparelho e/ou no servidor remoto), (c), que reconhece uma condição problema e (d) que modifica a posição de leitura e uma segunda tomada de medição e/ou; enfatizando um canal mais ou menos sensível a cor da análise do sinal. Isto pode ser executado automaticamente por algoritmos de análise de ensaio adequado.
Calibração de cores
[00484] As respostas de sinais podem ser calibradas para permitir o cálculo da concentração das espécies coloridas a partir de dados de imagem. Para se obter um conjunto de dados preditivos de transformar a concentração do soluto de cor, o seguinte procedimento pode ser usado. Em outras formas de realização, podem também ser utilizados outros métodos.
[00485] Para cada canal para todas as concentrações, a transformada-log (sinal/sinal do branco) foi calculado e designado por "A".
[00486] Para todas as concentrações, uma outra transformação ("C") foi calculado como a * b * A + A A 2 + C * A A 3 (inicialmente valores para a, b e c foram estabelecidos em valores arbitrários).
[00487] Para todas as concentrações, os valores de C para os três canais de cor foram somadas e designada Cestimate.
[00488] A soma das diferenças quadradas entre o alvo (conhecido) concentração e Cestimate foi calculado sobre todas as concentrações.
[00489] Os valores de a, b e c de parâmetros para todos os canais foram obtidos por um algoritmo conhecido que minimiza a soma dos quadrados das diferenças.
[00490] Os resultados mostrados na Figura 70 demonstram uma calibração precisa da resposta do digitalizador ao longo de todo o intervalo de concentração.
[00491] Outros algoritmos de calibração automatizados foram desenvolvidos e considerados igualmente eficazes. Por exemplo, o seguinte e um exemplo de calibração para um ensaio de colesterol executada numa ponta de reação.
[00492] O sinal medido e decomposto em Vermelho (R), Verde (G) e azul (B), os canais de cor.
[00493] Equações de calibração são calculados para otimizar a exatidão, precisão e alcance dinâmico de acordo com os requisitos de concepção do ensaio.
[00494] Neste exemplo ensaio, apenas os canais vermelho e verde são utilizados para calcular a concentração. Estes dois sinais são transformados para calcular uma variável de intermediário (F), como se segue:F = pl + p2^ G + p3^ G2 + p4^ R + p5^ R2 , onde p t são parâmetros de calibração.
[00495] E usado para calcular a concentração de (C), através de uma transformação linear: em que C e a concentração calculada, e pe e pj são os parâmetros de calibração, neste caso, representando os parâmetros de uma relação linear interceptar e encosta, respectivamente.
[00496] Quando a mesma abordagem foi seguida por um grande conjunto de ensaios para uma variedade de analitos que produziram produtos coloridos, que abrange todo o espectro visível, de -700 a 400 nm), foram obtidos resultados comparáveis.
[00497] Em medições espectrofotométricas convencionais de transmissão, um valor de "vazio" e utilizada para normalizar as medições. Método (1) em branco são tipicamente construídos através da medição de uma amostra que e equivalente a amostra, mas não tem qualquer componente a ser medido. A medição e tipicamente feito na mesma tina como a que irá ser utilizada para a amostra, ou uma cuvete opticamente equivalente. Assim, em um ensaio espectrofotométrico, seria combinar todos os reagentes nas mesmas concentrações que utilizam o mesmo protocolo substituindo uma solução de analito zero para a amostra. O método (2) utiliza um processo em duas etapas fazendo medições contra uma referência absoluta, tal como ar (que nunca irão variar de absorvancia) e medindo tanto em branco e amostra contra a referência absoluto. A absorvancia da amostra e então calculada por subtração do valor em branco a partir da amostra. O método (3), para recolher os espectros da amostra ou do produto da reação de ensaio e de referência a absorvancia medida (ou transmissão) a um comprimento de onda ideal (que geralmente se a absorvancia máxima para a espécie medidos) contra a absorvancia a um comprimento de onda, onde a espécie e medido e conhecido por ter a absorvancia zero. A absorvência e a diferença entre os registrados nos dois comprimentos de onda.
[00498] A imagem digital e de análise de três cores pode ser empregue, mas, em algumas formas de realização pode ser modificada de acordo com o caractere digitais (granulada) do sinal de ensaio. A saber: Para cada pixel da imagem, para cada cor e um padrão branco e trabalhada e as intensidades de sinal ajustada para um valor correspondente a ausência de absorvancia. Isto pode ser feito através do seguinte procedimento de exemplo: a. ajustando a intensidade da fonte luminosa ajustar a sensibilidade do detector (preferido), ou software de ajustamento (não preferido por si só).
[00499] Uma abordagem preferida e a de uma combinação de (b) e (c) acima. Em primeiro lugar, ajustar o detector no âmbito analógico, e depois afinar o resultado no reino digital.
[00500] Para o ajustamento analógico, e o ganho dos amplificadores de deslocamento entre os sensores de luz e da secção de analógico para digital são ajustadas para assegurar uma resolução máxima da digitalização. A extremidade inferior da faixa de luz de interesse vai ser ajustada para zero e a extremidade superior da gama será ajustada até abaixo de saturação do sensor.
[00501] Posteriormente, as imagens podem ser ajustadas no domínio digital. A abordagem preferida, especificamente, seria usar o que e chamado de "calibração de dois imagem" para uma imagem mxn. O mecanismo e a primeira a coletar uma imagem em preto, bloqueando toda a luz ao detector. Vamos chamar esta imagem PRETO [m, n]. A segunda imagem de calibração e gravado composto por uma luz no fim máximo da gama de sensibilidade.
[00502] Vamos chamar esta imagem BRANCO [m, n]. Assim, uma imagem corrigida a [m, n] pode ser construído, pixel-wise, como: ric \ m, n] - BlA CK \ m, n] a[m, n \ = l ' J 1 l-ATJ- WHlTE[m, n] - BlA CK[m, n]
[00503] Note que essa correção digital não melhorar a gama dinâmica dos dados digitalizados, mas ajusta os valores de modo que o total de referências de brancos e negros são consistentes.
[00504] Uma imagem de uma estrutura física de uma ponta pode ser utilizado como um pixel por pixel e cor a cor branco. A peça em bruto pode ser: Ar; Agua; Produto da reação do ensaio em branco (sem analito); Amostra em branco (sem reagentes de ensaio), ou Uma combinação dos acima; O sinal proveniente de um canal de cor, onde há uma resposta nula ou fraco pode ser usado para normalizar os sinais provenientes de outros canais.
[00505] Um outro método de controlo e normalizando a ótica e a imagem de um conjunto de padrões físicos (estáveis), antes ou durante um ensaio. Por exemplo, uma matriz de tintas impressas (mostrado na Figura 104) pode ser feitas para um conjunto correspondente de cores padrão, com intensidades normalizadas (semelhante a cor padrão "rodas" utilizados para calibrar as câmeras e scanners).
[00506] Tais padrões podem ser medidos utilizando a refletância a partir de uma superfície opaca, ou (de preferência) por transmissão através de uma película transparente.
[00507] De acordo com a estabilidade do sistema ótico, calibração e normalização da ótica pode ser (1) um exercício de uma só vez, (2), realizado em intervalos regulares, ou (3) realizadas para cada ensaio.
Calibração de uma gama Digital lmager
[00508] Em algumas modalidades, podem ser fornecidos métodos para calibrar uma câmara digital usada para densidades óticas de imagem.
[00509] Em ensaios de densidade ótica de uma substancia a analisar, pode ser desejável fazer uso tanto de todo o intervalo dinâmico do gerador de imagens possível. Sob condições normais de uso, a instalação pode compreender um fundo relativamente homogêneo com iluminação branca, o gerador de imagens e o analito a ser ensaiado em uma cuvete transparente entre elas. Operacionalmente, o teste pode compreender a colocação da cuba entre o gerador de imagens e a fonte de luz de fundo branco e medir a quantidade de luz absorvida pela substancia a analisar presente na célula. Para maximizar a gama dinâmica do sensor, o fundo pode ser detectado como a intensidade máxima mensurável. Pode ser desejável que tomar cuidado para não saturar o sensor, porque então a informação pode ser perdida uma vez que quando o sensor e saturado, e atenuação não pode ser medida corretamente. O sistema pode ser configurado para maximizar a eficiência dos valores medidos da luz de fundo, minimizando o número de pixels saturados.
[00510] O fundo iluminado pode emitir luz branca de igual intensidade ao longo de toda a sua superfície. A emissão de luz pode variar um pouco, produzindo uma distribuição normal de intensidades de pixel, como detectado pelo sensor de imagem. lsso e ilustrado pelas curvas mostradas na Figura 128. Para este exemplo, o sensor pode devolver um valor de 0 a 256 de cada pixel como um indicador da quantidade de luz que recebe. Cada pixel pode saturar a um valor de
[00511] Ou seja, independentemente de aumentar ainda mais a intensidade da luz ou a sensibilidade do sensor, apenas um valor de 256 pode ser gravado. Serie 1 na Figura 128, a linha a tracejado, indica onde a luz e muito intensa, cortando a curva normal. Serie 3, a linha a tracejado, indica que todos os pixels são de leitura correta intensidade, mas a sensibilidade do gerador de imagens que e menor do que poderia ser de gama dinâmica máxima. A maioria dos pixels que estão a um valor inferior a 200. Serie 2 representa as configurações desejadas, em que a média da distribuição e tão alta quanto possível, mas suficientemente pequena para que um número de pixels são saturados.
[00512] Numa forma de realização, a intensidade da iluminação pode ser mantida constante enquanto que as configurações do reprodutor de imagem pode ser ajustada. Para efeitos de sensibilidade sensor, podem ser usados dois controles: tempo de exposição e de ganho. Tempo de exposição pode ser a quantidade de tempo em que os pixels dos sensores são autorizados a recolher o valor antes de fótons e lido. Para uma determinada quantidade de luz, o valor da leitura pode ser maior do que o tempo de exposição e feita mais. Esse controle pode ser o controle "grosso" para a aplicação. Ganho pode ser o controlo ajustando a quantidade de amplificação aplicado ao sinal do sensor. Aumento do ganho pode aumentar o valor do sinal do sensor. Ganho pode ser o controle "fino".
[00513] Um procedimento exemplar para definir parâmetros de sensibilidade do gerador de imagens pode incluir uma ou mais das seguintes etapas:
[00514] Definir o tempo de exposição ao valor conhecido para estar abaixo da saturação. Definir a ganhar maior valor utilizável.
[00515] Busca binaria ajustar para cima a partir do tempo de exposição ao encontrar a configuração em que nem todos os pixels na região de interesse da imagem são saturados. Esta pode ser detectada por observação do ponto em que o valor médio do pixel torna-se menos do que 256.
[00516] Voltar ganhar até de forma incremental até que não são suficientemente alguns pixels que estão no limite de saturação. O número de pixels com um nível aceitável será determinada pela forma da distribuição. Desvio padrão Produto irá aumentar o número de pixels a ser tolerados saturados.
[00517] Em seguida, o balanço de branco pode ser corrigido. Existem três grupos de sensores em uma câmara digital. Os membros de cada grupo de coletar a luz de um comprimento de onda diferente, vermelho, verde ou azul. Ao detectar a luz branca, os sensores se preferenciam ver valores iguais ou vermelho, verde e azul. O controle de equilíbrio de branco ajusta os ganhos relativos do canal de vermelho e azul. Uma vez que a luz que vem da luz de fundo e definida como branco, o procedimento seria a de simplesmente ajustar o balanço de branco até os canais de ler os mesmos valores. Na pratica, o canal verde e tipicamente deixado não corrigido, e os canais de vermelho e azul são alterados em direções opostas umas às outras, como o controlo e alterado. No entanto, em outras formas de realização, outro canal, tal como o canal de vermelho ou azul canal pode ser deixada não corrigida, enquanto os outros dois canais podem ser alterados.
[00518] Por fim, as imagens podem ser ajustadas no domínio digital. Uma abordagem preferida, especificamente, seria utilizar o que e chamado de "calibração de duas imagens" para um m X «imagem, tal como descrito anteriormente.
[00519] Ensaios de fazer uma variedade de produtos coloridos foram analisados na presente invenção. Cores daqueles com baixo comprimento de onda de absorção máxima (amarelo) para comprimento de onda de alta máxima (azul) foram medidos com sucesso. Comprimento de onda máximo de alguns ensaios representativos foi: 405, 450, 500, 510, 540, 570, 612 e 620 nm, demonstrando a capacidade de leitura de cor ao longo de todo o espectrovisível.
[00520] As cores podem ser quantificados usando dados médios para muitos pixels (tipicamente cerca de 1000). Um parâmetro (f), que produz um bom ajuste (por exemplo, maior de R 2 ) com os dados de dose-resposta pode ser selecionado. O parâmetro pode ser montada com a primeira forma de bl ai + * R * R + cl 2 + b2 * G+ c2 * G 2 + b3 * B * B + C2 2 , onde a, b, c são constantes e R, G e B são valores de intensidade de cor para vermelho, verde e azul canais, respectivamente. O parâmetro f pode então ser derivado, forçando- o para ter um valor máximo de 1, e um valor mínimo de 0. Parâmetro f e relacionada com a transmissão de luz através do produto de reação colorido. Como seria de esperar, f pode estar estreitamente relacionado com o parâmetro de densidade ótica (OD) utilizado em espectrofotometria para quantificar uma espécie de absorção. Quando 1 - f medido por imagem 3-cor e representada em função OD medido no máximo de absorção para os mesmos produtos de reação de ensaio em um micro titerplate num espectrofotómetro, pode-se observar que 1 - f e essencialmente linearmente relacionado com o diâmetro externo. Na Figura 129, e apresentada esses dados para cinco ensaios. OD pode ser normalizada por "parente OD" = (OD - OD min)/(ODmax - OD min). Em alguns casos, existe uma relação ligeiramente curvado mas o coeficiente de correlação (R) e geralmente> 0,99.
[00521] O parâmetro f pode ser utilizado para calibrar os ensaios medidos por analise de imagem de 3 cores. Quando plotados contra a concentração da substancia a analisar, uma relação de calibração suave pode ser mostrado na Figura 130, para um ensaio de colesterol representativa. Uma equação da concentração formam = a + b + c * f * f 2 (onde a, b e c são constantes), relativa a concentração de f e derivado e, como mostrado na Figura 130, a concentração calculada e essencialmente idêntico ao do (esperado, desejado) valor "nominal" (linha de regressão encosta perto de 1.0, interceptar perto de 0,0 e R 2 = 0,998. Também e mostrado na Figura 130 são gráficos de precisão de ensaio e precisão. Precisão e de quase 100% (média de 100,2% ) e de imprecisão (representada por% CV) e baixo (inferior a 10%, media CV 3,9%).
Imagiologia simultânea de ensaios
[00522] Conforme mostrado na Figura 56, Figura 57, Figura 58, Figura 59 e Figura 60, vários elementos de ensaio (pontas, poços, manchas) pode ser trabalhada em paralelo. Em geral, os elementos podem ser colocados em locais conhecidos em um cartucho ou montado em um subsistema do instrumento, de modo que um elemento particular pode estar associada a um ensaio particular. Mesmo que os elementos não são perfeitamente orientada ou localizada, a análise da imagem pode ser utilizada para corrigir tal posicionamento falhada, localizando as características dos elementos de ensaio.
[00523] Os ensaios comercialmente disponíveis para albumina (Figura 56) e de colesterol (Figura 57) foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante. Uma série de concentrações de analito na gama de interesse clínico, foi medida utilizando um conjunto de calibradores em que a concentração do analito foi reduzido duas vezes a partir da concentração mais elevada. Na Figura 56 e Figura 57, a concentração do analito foi mais elevada do lado direito e do lado esquerdo mais distante da ponta correspondeu a zero analito. O volume da mistura de reação do ensaio aspirado para as pontas era de 20 ul.
[00524] A Figura 58, Figura 59 e Figura 60 mostram que os poços podem ser visualizados em paralelo. Um conjunto de poços rasos hemisféricas foi feito por maquinagem de um bloco de plástico opaco branco. Três ensaios comercialmente disponíveis, que formam cor foram realizadas nesses poços e os produtos de reação trabalhada. Como dito acima, os poços para a extrema direita tem a maior concentração de analito e cada bem ao lado tem uma menor concentração de duas vezes, exceto o mais à esquerda assim que tem analito zero. Sete ul do produto da reação do ensaio foram introduzidas em cada poço.
[00525] Os produtos da reação também pode ser trabalhada após a secagem los para membranas porosas ou papel e de imagem, uma vez que o líquido embebido no meio. Também e possível utilizar qualquer um de uma variedade de químicas de ensaio impregnados em papel ou membranas e para a imagem dos produtos resultantes da reação após a adição da amostra.
Analisando Turbidez
[00526] Turbidimetria e realizado através da medição da redução da intensidade da luz incidente depois de passar através da amostra que está sendo medido. Esta técnica e utilizada em que o resultado do ensaio e um precipitado disperso que aumenta a opacidade do líquido.
[00527] Turbidimetria pode ser medida em ensaios de aglutinação em látex. Como um modelo de respostas do ensaio de aglutinação de látex, partículas de látex de poliestireno (1 um de diâmetro) foram dispersos em tampão aos referidos (w/v) e sujeito a concentrações de três cores de análise de imagem. Como pode ser visto na Figura 72, uma boa resposta foi observada em todos os três canais e pode ser utilizado para medir a concentração de partículas de látex e de aglutinação de látex.
Analisando Aglutinação
[00528] Do mesmo modo que a análise de turvação, o sistema pode ser utilizado para medir a aglutinação, hemaglutinação e na inibição da mesma.
[00529] O sistema pode ser usado para realizar tipagem sanguínea por aglutinação de glóbulos vermelhos do sangue. O sangue foi diluído e misturado com os reagentes de tipagem de sangue (anti-A e anti-B, anti-D) a partir de um kit de tipagem comercial. Tal como mostrado abaixo para um B + sangue, as respostas de aglutinação adequadas pode facilmente ser visto, quando as misturas são gravadas. Além disso, quando as imagens mostradas na Figura 77 foram verificados ao longo do eixo vertical das pontas, uma medida quantitativa de aglutinação pode ser obtida através da medição da variação dos sinais de três cores, como mostrado na Figura 78. Mais variância indicou aglutinação e pode ser detectada em cada canal de cor. É evidente que o métodopode ser utilizado para medir a extensão de tais reações de aglutinação.
Forma de Reconhecimento
[00530] As imagens podem ser analisadas quanto a forma de reconhecimento. O reconhecimento de formas pode ser realizado com uma ampliação de normal e a muito alta ampliação. Na análise de imagem de alta ampliação pode ser utilizado para reconhecer a forma e tamanho das células. Essas técnicas são vulgarmente utilizados na contagem de células para determinar as concentrações relativas dos glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plaquetas. Abaixo de tamanho normal, o reconhecimento da forma e utilizada para observar o estado da amostra. Métodos de reconhecimento de defeito da bolha e outros são usados para garantir que os montantes líquidos medidos são aspirados e dispensados corretamente.
Analisando amostras de substratos de fase sólida
[00531] A imagem digital com iluminação frontal face pode também ser usado para ler as respostas de ensaio sobre suportes em fase sólida, como mostrado na Figura 76. Soluções de cloreto de potássio (0, 2, 4 e 8 mm) foram adicionados a eflotronTM tiras de doseamento de potássio (Boehringer- Mannheim/Roche) concebidos para utilização num sistema de análise de refletância.
Analisando a qualidade da amostra
[00532] Certas características da amostra podem tornar os resultados do ensaio invalido. Por exemplo, a hemólise causa fons de potássio a fuga de glóbulos vermelhos no plasma fazendo com que o plasma medido ou concentrações de fons de potássio sérico de ser falsamente alto. Da mesma forma, lcteria e lipemia pode interferir com vários produtos químicos formadores de cor, alterando as absorbâncias medidas. Na presente invenção, pode-se detectar e quantificar tais substancias interferentes, utilizando analise de imagem. Os ensaios que dão resultados falsos então pode ser qualquer um (1) eliminado da lista de resultados fornecidos pelo sistema analítico ou (2) sinais óticos podem ser corrigidos para ter em conta o nível medido de interferente. Uma imagem de diferentes tipos de amostras de soro e mostrada na Figura 99 (a partir da esquerda para a direita: hemolisados, lipemicos icterica (amarelo) e "normal").
Analise de dados Digital
[00533] Os métodos convencionais para a geração de dados de calibração e os métodos de ensaio que geram e/ou mudar a cor tipicamente medir um sinal analógico representando a mudança nas características de absorvência de uma mistura de ensaio gerado por mistura de uma amostra com os reagentes. Uma parte da mistura de reação e iluminada e a luz transmitida através ou refletida a partir de que colide com uma porção do detector e avaliada como um sinal analógico. A qualidade do ensaio tal como determinada pelo volume e a qualidade da amostra, tratamento da amostra, o conjunto de ensaio para a mistura de ensaio e do elemento material utilizado para apresentar a mistura para o sistema ótico de contar com uma qualidade assumida do sistema físico utilizado.
[00534] Na presente invenção, podemos imagem (1) na amostra, (2) os processos de processamento da amostra, e (3) a mistura de ensaio e recolher os dados como um conjunto de uma ou mais imagens digitais. Cada pixel da imagem da mistura de ensaio representa uma fração muito pequena do total, mas a média do sinal de 3 pixels de cor de muitos, se recolher um sinal de ensaio, pelo menos, tão bom quanto o obtido pelos métodos analógicos convencionais. Onde no entanto, os métodos convencionais perdem a informação através da média, a presente invenção ambos os agregados da informação e mantem o detalhe perdido por métodos convencionais. Neste contexto, os ensaios de cor baseados incluem ensaios para: metabolitos, eletrólitos, enzimas, Biomarkers (usando imunoensaio), drogas (por imunoensaio), e metas de ácidos nucleicos (usando a tecnologia de "lAMP"). Os mesmos princípios podem ser aplicados a ensaios utilizando fluorescênciae/ou luminescência.
Confirmação de volume e correção
[00535] O volume de uma amostra, ou de qualquer outro material, tal como um líquido ou um sólido, pode ser determinado opticamente. Isto pode ser realizado por imagiologia de um recipiente cujas dimensões internas são conhecidos e matematicamente determinar o volume da amostra a partir do segmento observada do recipiente ocupada. Sólido medições são usadas principalmente para medir os sólidos que são centrifugadas. O caso mais comum e a leitura do volume de células vermelhas do sangue centrifugado para determinar o nível de hematócrito. Exemplos 6-11 e 16 descrevem a utilização de análise de imagens para calcular o volume da amostra e outras medições. Isto pode permitir uma melhoria dos resultados do ensaio. Por exemplo, se o volume alvo a ser utilizada e de 10 ul e a tecnologia da invenção determina que o volume real e de 8 ul, o sistema de ensaio pode corrigir os resultados para o volume (neste exemplo, a concentração de analitos no calculado presunção de uma amostra de 10 ul seria multiplicado por 10/8).
[00536] O conhecimento da amostra real e os volumes de reagentes pode ser realizada pela imagem da amostra e os reagentes e podem ser utilizadas para corrigir os cálculos utilizados para detectar e/ou quantificar os analitos na amostra.
[00537]Conforme demonstrado em muitos exemplos acima, a utilização de imagens permite que as amostras e as misturas de ensaio a ser avaliado para a qualidade e resposta do ensaio. Além disso, a imagem de "pontas" utilizadas como vasos de reação e os métodos de aquisição de amostras permite (1) a medição exata e precisa do volume da amostra e de reagentes e (2) o uso de tais dados para corrigir quaisquer imprecisões e ou imprecisões nos resultados do ensaio devido aos erros de volume. Para alcançar este objetivo, podem ter pontas com precisão e precisamente conhecida geometria (como e o caso para pontas feitas por moldagem por injeção). replicar medições de dicas utilizando imagiologia demonstrou que as suas dimensões são precisos para melhor do que cerca de 1%. E assim possível medir o volume de amostras líquidas e reagentes nessas dicas com precisão correspondente. Se a pipetagem das amostras e reagentes e menos exato e preciso, a correção dos resultados conhecendo os volumes reais (por medição de imagem) e possível.
[00538] Por exemplo, considere um ensaio em que a resposta e diretamente proporcional a concentração de analito (como e verdadeiro para muitos dos ensaios aqui discutidos). Um volume de amostra de erro de 10% não induz a um erro de 10% do valor relatado pelo sistema analítico. Se, contudo, o volume da amostra de forma imprecisa dispensada e medido com precisão (por exemplo para dentro de 2% do valor real), a resposta do sistema pode ser corrigida de modo a reduzir o erro de 10% a 2%. Correções correspondentes pode ser feita para os erros de volume dos volumes de reagentes. O algoritmo de correção pode depender da resposta do sistema de ensaio para o volume ou o conhecimento de cada componente do ensaio (de amostra, os reagentes), mas esta informação pode ser facilmente determinada, durante o desenvolvimento e a validação do ensaio.
[00539] Deste modo, a invenção proporciona uma variedade de vantagens sobre as técnicas convencionais. Na geração do "sinal do ensaio", a presente invenção pode detectar defeitos físicos na cuvete de teste, defeitos na mistura de ensaio (bolhas e semelhantes). Uma vez que estes defeitos são identificados (analise de imagem), o resultado do ensaio pode ser rejeitado de modo a que os resultados falsos não ocorram ou (de preferência) o efeito do defeito pode ser eliminado e um sinal de ensaio exata calculada.
[00540] No conjunto da mistura de ensaio, todos e quaisquer defeitos pode ser detectada incluindo: tipo incorreto da amostra (por exemplo, sangue contra plasma), volume da amostra incorreta, para uma amostra de sangue, a incapacidade de separar o plasma dos elementos figurados (vermelho e branco células), fatores de exemplo que podem comprometer a qualidade do resultado do ensaio (por exemplo, lipemia lcteria, hemólise, a presença de precipitados, ou outro não identificado no homogeneidades), defeitos na montagem de mistura de ensaio (por exemplo, a presença de bolhas, insuficiência misturar adequadamente (não uniformidade da cor)), os mecanismos para avaliar a qualidade retrospectiva e preservação de informação detalhada de arquivo, os mecanismos de medição de volumes de amostra e reagente (e para corrigir erros e/ou de imprecisões em tais volumes).
Avaliar Agentes Terapêuticos
[00541] Em uma forma de realização separada, dispositivos e métodos para controlar mais do que um parâmetro farmacológico útil para avaliar a eficácia e/ou a toxicidade de um agente terapêutico e fornecido. Por exemplo, um agente terapêutico pode incluir quaisquer substancias que tenham utilidade terapêutica e/ou potenciais. Essas substancias incluem, mas não estão limitados a, compostos químicos ou biológicos, tais como moléculas simples ou complexo orgânico ou inorgânico, peptídeos, proteínas (por exemplo, anticorpos) ou uma polinucleótidos (por exemplo, antessentido). Uma vasta gama de compostos podem ser sintetizados, por exemplo, polímeros, tais como polipeptídios e polinucleótidos, e orgânicos sintéticos
[00542] Compostos com base em várias estruturas do núcleo, e estes também podem ser incluídos como agentes terapêuticos. Além disso, as várias fontes naturais podem proporcionar compostos para o rastreio, tais como extratos de plantas ou de animais, e outros semelhantes.
[00543] Deve ser compreendido, embora nem sempre afirmado explicitamente, que o agente e utilizado isoladamente ou em combinação com outro agente, com a mesma ou diferente atividade biológica como agentes identificados pela tela inventiva. Os agentes e os métodos também se destinam a ser combinados com outras terapias. Por exemplo, os fármacos de moléculas pequenas estão, frequentemente, medido por espectrometria de massa que podem ser imprecisos. EllSA (a base de anticorpos), ensaios podem ser muitomais exata e precisa.
[00544] Os parâmetros fisiológicos de acordo com a presente invenção incluem, sem limitação de parâmetros, tais como a taxa de temperatura, ritmo cardíaco/pulso, a pressão sanguínea, e das vias respiratórias. Parâmetros farmacodinâmicos incluem concentrações de biomarcadores, tais como proteínas, ácidos nucleicos, células, e marcadores de células. Os biomarcadores podem ser indicativos de doença ou pode ser um resultado da ação de um medicamento. Os parâmetros farmacocinéticos (PK) de acordo com a presente invenção incluem, sem limitação drogas e concentração metabolito da droga. ldentificar e quantificar os parâmetros farmacocinéticos em tempo real a partir de um volume de amostra e extremamente desejável para a segurança adequada e eficácia dos medicamentos. Se as concentrações de droga e metabolito estão fora de uma gama desejada e/ou metabolitos inesperadas são gerados devido a uma reação inesperada com o fármaco, pode ser necessária para garantir a segurança do paciente, uma ação imediata. Da mesma forma, se nenhum dos parâmetros farmacodinâmicos (PD) cair fora do intervalo desejado durante um regime de tratamento, uma ação imediata pode ter de ser feita também.
[00545] A capacidade de controlar a taxa de variação da concentração de um analito ou os parâmetros de PD ou PK durante um período de tempo num sujeito, ou a realização de análise de tendência para a concentração, PD, ou os parâmetros farmacocinéticos, se eles são concentrações de drogas ou seus metabólitos, pode ajudar a evitar situações potencialmente perigosas. Por exemplo, se a glicose foram o analito de interesse, a concentração de glicose numa amostra num dado tempo, bem como a taxa de alteração da concentração de glicose, ao longo de um dado período de tempo, pode ser muito útil na previsão e evitando, por exemplo, eventos hiperglicêmicos. Tal analise de tendência tem implicações benéficas generalizados em regime de dosagem de drogas. Quando várias drogas e seus metabólitos estão em causa, a capacidade de detectar uma tendência e tomar medidas proativas e muitas vezes desejável.
[00546] Em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método comercial de auxiliar o clínico em fornecer um tratamento médico individualizado. Um método de negócio pode incluir monitorização pós prescrição da terapia medicamentosa, monitorando tendências de biomarcadores ao longo do tempo. O método comercial pode compreender a recolha de pelo menos um parâmetro farmacológico, de um indivíduo a receber uma medicação, recolha dito passo e efetuada por tratamento de uma amostra de fluido corporal para os reagentes contidos num dispositivo de fluidos, que e fornecida ao referido indivíduo a produzir um sinal detectável indicativa do dito pelo menos um parâmetro farmacológico, e referencias cruzadas com o auxílio de um computador registros médicos do referido indivíduo com pelo menos um parâmetro do referido indivíduo farmacológico, auxiliando assim no fornecimento clínico disse tratamento médico individualizado.
[00547] Os dispositivos, sistemas e métodos aqui permitem a quantificação automática de um parâmetro farmacológica de um paciente, bem como comparação automática do parâmetro com, por exemplo, os registros médicos do paciente, que podem inclui um histórico do parâmetro monitorado, ou prontuários médicos de um outro grupo de sujeitos. Acoplamento de monitorização em tempo real do analito com um dispositivo externo, que pode armazenar dados, bem como realizar qualquer tipo de algoritmo de processamento de dados ou, por exemplo, proporciona um dispositivo que pode ajudar no tratamento do paciente típico, que pode incluir, por exemplo, comparando os dados atuais de doentes com os dados do paciente anteriores. Portanto, também aqui fornecidas e um método de negócio que efetivamente realiza, pelo menos, parte do monitoramento de um paciente que está sendo realizado pela equipe medica.
Configuração ótica para amostra e Reação Produtos de Imagem
[00548] A amostra e a análise do produto da reação pode ser realizada utilizando uma configuração ótica. A configuração ótica pode inclui uma fonte de luz, uma abertura, e um sensor ou de um detector. Um diagrama esquemático de uma configuração ótica e mostrado na Figura 100 e na Figura 101. Em algumas formas de realização, a câmara pode ser um logitech CÓ00 Webcamera, o sensor da câmara pode ser de 1/3 "2,0 MP (1600x1200) CMOS: vidro (lM-2010-S), a lente pode ser com um objeto a distância da lente da webcam padrão (distância da lente-to- Object: 35mm). A fonte de luz pode ser um Moritex borda branca lluminador MEBl-Cw25 (branco) operando a 9.4 volts As imagens da câmera podem ser tomadas em uma sequência em que 1, 2, 3 4 ou mais. dicas são movidos por uma fase xyz no caminho ótico.
[00549] Em uma forma de realização, o detector e um conjunto de alojamento de um conjunto de leitor de detecção para detectar um sinal produzido por pelo menos um ensaio no dispositivo. O conjunto de detecção pode estar acima do dispositivo ou a uma orientação diferente em relação ao dispositivo de base, por exemplo, do tipo de ensaio a ser realizado e o mecanismo de detecção a ser empregue. O conjunto de detecção pode ser movido para a comunicação com o aparelho de ensaio ou a unidade de doseamento pode ser movido para a comunicação com o conjunto de detecção.
[00550] Os sensores podem ser PMT, ampla gama de fotos diodos, fotodiodos de avalanche, diodos de fotos única frequência, sensores de imagem, chips CMOS, e CCDs. As fontes de iluminação pode ser lasers, lEDs de cor única, ampla frequência de luz de lâmpadas fluorescentes ou lEDs, matrizes de lED, misturas de vermelho, verde, e fontes de luz azuis, fósforos ativados por um lED, lâmpadas fluorescentes, lâmpadas incandescentes, e fontes de arco, tal como um tubo flash.
[00551] Em muitos casos, um detector ótico e fornecido e utilizado como o dispositivo de detecção. Exemplos não limitativos incluem um fotodiodo, tubo fotomultiplicador (PMT), detector de contagem de fótons, fotodiodo de avalanche, ou dispositivo de carga acoplada (CCD). Em algumas formas de realização pode ser utilizado um pino de diodo. Em algumas formas de realização de um pino de diodo pode ser acoplado a um amplificador de criar um dispositivo de detecção com uma sensibilidade comparável a um PMT. Alguns ensaios podem gerar luminescência, tal como aqui descrito. Em algumas formas de realização e detectada por quimiluminescência. Em algumas formas de realização de um conjunto de detecção pode incluir uma pluralidade de cabos de fibras óticas conectadas como um feixe para um detector de CCD ou uma matriz de PMT. O feixe de fibras óticas pode ser construído de fibras discretas ou de muitas pequenas fibras fundidas em conjunto para formar um pacote sólido. Tais pacotes de sólidos encontram-se comercialmente disponíveis e facilmente interligados para detectores CCD.
[00552] Um detector pode também compreender uma fonte de luz, tal como uma lâmpada ou diodo emissor de luz (lED). A fonte de luz pode iluminar um ensaio para detectar os resultados. Por exemplo, o ensaio pode ser um ensaio de fluorescência ou um ensaio de absorção, tal como são vulgarmente utilizados com os ensaios de ácidos nucleicos. O detector também pode compreender ótica para proporcionar a fonte de luz para o ensaio, tal como uma lente ou de fibra ótica.
[00553] Em algumas formas de realização, o sistema de detecção pode compreender detectores não-óticas ou sensores para a detecção de um parâmetro específico de um sujeito. Tais sensores podem incluir a temperatura, a condutividade, potenciômetros, sinais e sinais amperometricos, para os compostos que são oxidados ou reduzidos, por exemplo, 02, H2 02, e l2, ou compostos orgânicos oxidáveis/redutíveis.
[00554] A iluminação pode ser retroiluminado, frente acesa, e oblíqua (lateral) aceso. Voltar a iluminação pode ser utilizada em química geral com a finalidade de detectar, quer a absorção de luz (colorimétrica) ou espalhamento (turbidez). O arranjo assume duas formas, uma ampla e campo traseira uniformemente iluminado, e um feixe especificamente forma que e interrompida pelo sujeito. lit iluminação frontal pode ser usada para excitação de fluorescência e de refletância. Em reflexão, um tema e iluminado de frente por uma fonte de luz são medidos através da observação da luz refletida do objeto. As cores absorvida produzem a mesma informação de um líquido iluminado por uma luz traseira. Em reflexão, um assunto também pode ser iluminado com luz oblíqua. O uso de iluminação oblíqua (lateral) dá a aparência de uma imagem 3-dimensional e características de outro modo pode- se destacar invisíveis. Uma técnica mais recente com base neste método e o contraste de modulação Hoffman, um sistema encontrado em microscópios invertidos para utilização na cultura de células. iluminação oblíqua sofre das mesmas limitações como microscopia de campo brilhante (baixo contraste de muitas amostras biológicas; baixa resolução aparente devido a fora de foco objetos), mas pode-se destacar as estruturas de outra forma invisíveis.
[00555] Em excitação de fluorescência, os indivíduos podem ser iluminadas a partir da parte dianteira para fins de iluminação de fluorescência. Estes são geralmente luzes de cor única, mais comumente lasers. O Confocal laser Scanning Microscope e uma realização comum deste. iluminação oblíqua pode também ser utilizado em excitação de fluorescência. Em citometria de fluorescência, os indivíduos são frequentemente excitados em um angulo,normalmente a 90 graus, a partir da qual os fótons deterioração aparece. Esta forma de iluminação permite a detecção de dispersão diretamente por detras do sujeito (iluminado para trás), bem como as emissões de fluorescência que saem a partir do lado.
[00556] Em algumas formas de realização, a luz fluorescente e fotografada em 90 graus em relação ao feixe de excitação. Na Figura 102a, uma fonte de fótons (S), tipicamente um diodo emissor de luz de alta intensidade, passa através de um feixe de difusor (D) e uma lente de moldagem (ll), produzindo um feixe de excitação ou lentamente divergente colimado. O feixe de excitação passa através de um filtro passa-banda (Fl) e ilumina a amostra, que consiste em um recipiente (tubo, cuvete, ou ponta de pipeta) contendo uma solução com uma amostra marcada com fluorescência. Fluorescência isotrópica-emitido e separado do espectro de luz de excitação com um filtro de longa ou band-pass (F2) apropriado para passar fluorescência Stokes deslocados. A luz e então fotografada através de uma lente (l2) para uma câmara digital (C) ou outro detector. A intensidade da fluorescência e extraída a partir das imagens resultantes através de análise de imagem.
[00557] lmagens tiradas com a configuração ótico mostrado na Figura 102A produz imagens de um único tubo (como mostrado na Figura 103 A. experiencias sucessivas mostrar a diferença na intensidade de fluorescência a partir de experiencias negativas e positivas lAMP usando corante intercalando.
[00558] Em outras formas de realização, a luz transmitida e trabalhada após a filtragem ótica para remover a luz no comprimento de onda excitante. Na Figura 102B, uma fonte de fótons (S), tipicamente um diodo emissor de luz de alta intensidade, passa através de um feixe de difusor (D) e uma lente de moldagem(ll), produzindo-se lentamente divergente, feixe de excitação elíptica. O feixe de excitação passa através de um filtro passa-banda (Fl) e ilumine as amostras, apresentados como uma série de vasos de amostra (tubo, cuvete, ou ponta de pipeta), cada um contendo uma solução com uma amostra marcada com fluorescência. Fluorescência isotrópica-emitido e separado do espectro de luz de excitação com um filtro de longa ou band-pass (F2) apropriado para passar fluorescência Stokes deslocados. A luz e então fotografada através de uma lente de câmara (l2) para uma câmara digital (C). A intensidade da fluorescência e extraída a partir das imagens resultantes através de análise de imagem. A configuração ótica mostrado na Figura 103 pode ser utilizado para produzir imagens de matriz de tubos múltiplos simultaneamente (como mostrado na Figura 103B).
[00559] Para colorimetria, a modalidade preferida para a detecção e a luz de fundo o assunto com luz branca com o resultado percebido por um sensor de imagem. Neste caso, a absorção de cor e medida transmissivo.
[00560] Para Turbidimetria, a modalidade preferida para a detecção e a luz de fundo o assunto com luz branca com o resultado percebido por um sensor de imagem. Para turbidimetria, a redução da intensidade da luz emitida e medida.
[00561] A luminometria utiliza nenhum método de iluminação como o sujeito emite seus próprios fótons. A luz emitida pode ser fraca e pode ser a detecção utilizando um sensor extremamente sensível, tais como um tubo fotomultiplicador (PMT).
[00562] Em algumas formas de realizado, a imagem pode ocorrer através de fluorescência, darkiield iluminação, a iluminação de campo claro ou. Esta imagem pode ser utilizada para outras aplicações ou citometria. iluminação de epi-fluorescencia pode ser conseguida através da utilização de três fontes de iluminação, de diferentes comprimentos de onda. Além disso, duas fontes diferentes podem ser usados simultaneamente, se necessário. Por conseguinte, a plataforma de imagem pode ser usada para a imagem de uma grande variedade de corantes fluorescentes. A combinação de fontes de iluminação, ótica de emissão pode ser configurado para atingir uma pluralidade de canais de espectro independentes de imagem.
[00563] A iluminação de campo escuro podem ser alcançados pela utilização de um ringlight (localizado acima ou abaixo da amostra), um campo escuro Abbe condensador, um condensador de campo escuro, com um espelho de formato circular, um condensador de epi-darkfield construído dentro de uma manga em torno da lente da objetiva , ou uma combinação de ringlight com um condensador equipado com uma fase de paragem escura. Fundamentalmente, estes componentes óticos criar um cone de luz da abertura numérica (NA) maior do que a AN do objetivo a ser utilizado. A escolha do sistema de iluminação depende de uma série de considerações, tais como a ampliação necessária, as considerações de projeto mecânico, o tamanho do sensor de imagem, etc Um sistema de iluminação baseado ringlight geralmente oferece uma iluminação de campo escuro uniforme sobre uma área mais ampla e, ao mesmo tempo, proporcionando flexibilidade suficiente em design mecânico do sistema global.
[00564] Brightfield iluminação pode ser conseguida pelo uso de uma fonte de luz branca, juntamente com uma fase de condensador para criar iluminação Koehler.
[00565] Em algumas formas de realizado, uma roda de filtro automático pode ser empregue. A roda de filtro automático permite o controle do caminho ótico de imagem para permitir imagens de vários fluoróforos no mesmo campo de visão.
[00566] Em algumas modalidades, a imagem baseada em auto-focagem pode ter lugar. Um algoritmo baseado em imagem pode ser utilizado para controlar a posição Z (por exemplo, a posição vertical) de um objetivo (isto e, a sua distância a partir da amostra) para alcançar a auto- focagem. Resumidamente, uma pequena imagem (por exemplo, 128x128 pixels) e capturado em um ritmo rápido usando darkfield iluminação. Esta imagem pode ser analisada para obter a função de auto-foco, que e a medida de nitidez da imagem. Com base num algoritmo de busca rápida e calculado o seguinte z localização do objetivo. O objetivo pode ser transferida para o novo local de z e outra imagem pequena pode ser capturado. Este sistema em circuito fechado, não requer a utilização de qualquer outro equipamento para a focagem. A platina do microscópio pode ser ligado a um computador controlado por motores de passo para permitir a tradução em direções X e Y (por exemplo, os sentidos horizontais). Em cada localização, o número desejado de imagens e capturado e a fase e movido para a posição seguinte XY.
[00567] De imagem ou de outros detecção pode ser realizada com o auxílio de um detector. Um detector pode incluir uma câmara ou de outro dispositivo de detecção configurada para converter a radiação eletromagnética num sinal eletrônico. Em um exemplo, uma câmera pode ser uma carga acoplada (CCD) ou elétron-multiplicação câmera CCD (EMCCD). O detector pode ser um sensor, tal como um sensor de pixel ativo ou o sensor CMOS. Um detector pode incluir um tubo fotomultiplicador para a detecção de um sinal.
[00568] O detector pode estar em comunicação ótica com um recipiente de amostra (por exemplo, cuvete, ponta, frasco). Em alguns casos, o detector e, em linha direta de visão do recipiente da amostra. Em outros casos, o detector está em comunicação ótica com o recipiente da amostra, com o auxílio de um ou mais óticas, tais como lentes, espelhos, colimadores, ou suas combinações.
[00569] A contagem celular pode ser realizada utilizando imagiologia e citometria. Em situações em que o paciente pode ser iluminado de campo brilhante, a forma de realização preferida e a de iluminar as matérias a partir da frente com uma luz branca e para detectar se as células com um sensor de imagem. Processamento digital subsequente irá contar as células. Quando as células são raras ou são pequenos, a modalidade preferida e de anexar um marcador fluorescente e iluminando o campo do assunto com um laser. lmagem confocal de varredura e o preferido. Para a citometria de fluxo, os sujeitos foram marcados com marcadores fluorescentes e fluiu passado o dispositivo de detecção. Existem dois tipos de sensores, uma posição tal que e o sujeito e iluminado para trás, da dispersão de feixe para determinar a presença de uma célula. O outro sensor, alinhados de modo que a iluminação e a partir do lado, mede a luz fluorescente emitida a partir dos sujeitos marcadas. Descrição mais detalhada e fornecida a seguir, relativas a metodologia de citometria de imagem.
Sistemas do usuário final
[00570] Pode ser fornecido depois de fabrico um dispositivo e do sistema, para o utilizador final, em conjunto ou individualmente o dispositivo ou sistema do invento pode ser embalado com um manual ou instruções de utilização. Numa forma de realização, o sistema da invenção e genérico para o tipo de testes realizados em dispositivos diferentes. Como os componentes do dispositivo podem ser modular, de um utilizador apenas pode precisar de um sistema e de uma variedade de dispositivos ou unidades de ensaio ou unidades de reagentes para executar uma série de ensaios em um ponto de atendimento ou outro ambiente de teste distribuída. Neste contexto, um sistema pode ser usado repetidamente com vários dispositivos, e pode ser necessário dispor de sensores, tanto sobre o dispositivo e o sistema para detectar tais alterações durante o transporte, por exemplo. Durante a mudança do transporte, da pressão ou da temperatura pode afetar o desempenho de um número de componentes do presente sistema, e como tal um sensor localizado sobre o dispositivo ou sistema pode retransmitir essas alterações, por exemplo, o dispositivo externo de modo que os ajustamentos podem ser feito durante a calibração ou durante o processamento no dispositivo externo de dados. Por exemplo, se a temperatura de um dispositivo de fluidos e alterada para um determinado nível durante o transporte, um sensor localizado no dispositivo pode detectar esta mudança e transmitir esta informação para o sistema quando o dispositivo e inserido no sistema pelo utilizador. Pode haver um dispositivo de detecção adicional no sistema para executar estas tarefas, ou um tal dispositivo pode ser incorporado um outro componente do sistema. Em algumas formas de realização a informação pode ser transmitida sem fios para o sistema ou o dispositivo externo, tal como um computador pessoal ou um aparelho de televisão. Da mesma forma, um sensor em que o sistema pode detectar alterações semelhantes. Em algumas concretizações, pode ser desejável ter um sensor na embalagem de transporte, bem como, ou em vez de os componentes do sistema, ou em adição aos mesmos. Por exemplo, condições adversas que tornariam um cartucho de teste ou sistema invalido que pode ser detectada podem incluir a exposição a uma temperatura mais elevada do que a de tal modo que a penetração máxima tolerável ou quebra da integridade do cartucho de umidade.
[00571] Em uma forma de realização, o sistema compreende um conjunto de comunicação capaz de transmitir e receber informações sem fios a partir de um dispositivo externo. Tal comunicação sem fio pode ser Bluetooth ou RTM tecnologia. Vários métodos de comunicação podem ser utilizadas, tais como a conexão dial-up com fio com um modem, uma ligação direta, como um Tl, lSDN, ou linha de cabo. Em algumas modalidades, a conexão sem fio e estabelecida por meio de redes sem fio exemplares como celular, satélite ou pager redes, GPRS, ou um sistema de transporte de dados local, como Ethernet ou Token Ring em uma rede de área local. Em algumas modalidades a informação e criptografada antes de ser transmitida através de uma rede sem fio. Em algumas concretizações, o módulo de comunicação pode conter um componente de comunicação infravermelho sem fio para enviar e receber informações. O sistema pode incluir placas gráficas integradas para facilitar a exibição de informação.
[00572] Em algumas formas de realização o módulo de comunicação pode ter uma memória ou outro dispositivo de armazenamento, por exemplo, localizada RAM, em que a informação recolhida pode ser guardada. Um dispositivo de armazenamento pode ser necessário se a informação não pode ser transmitida em um determinado momento, devido a, por exemplo, uma incapacidade temporária para conectar sem fios a uma rede. A informação pode ser associada com o identificador de dispositivo no dispositivo de armazenamento. Em algumas formas de realização o módulo de comunicação pode repetir o envio da informação armazenada depois de certo período de tempo.
[00573] Em algumas configurações de um dispositivo externo se comunica com o módulo de comunicação dentro do conjunto leitor. Um dispositivo externo pode, sem fios ou fisicamente se comunicar com um sistema, mas também pode se comunicar com terceiros, incluindo, sem limitação, a paciente, a equipe medica, médicos, pessoal de laboratório, ou outros na indústria de cuidados de saúde.
[00574] Em algumas concretizações, o sistema pode compreender um dispositivo externo, tal como um sistema de computador, servidor ou outro dispositivo eletrônico capaz de armazenar informação ou informação de processamento. Em algumas configurações do dispositivo externo inclui um ou mais sistemas de computadores, servidores ou outros dispositivos eletrônicos capazes de armazenar informações ou processamento de informações. Em algumas formas de realização de um dispositivo externo pode incluir uma base de dados de informação do paciente, por exemplo, mas não limitado a os registros médicos ou a história do doente, os registros de ensaios clínicos, ou registros de ensaios pré-clínicos. Um dispositivo externo pode armazenar protocolos a serem executados em um sistema que pode ser transmitida para a montagem de um sistema de comunicação em que recebeu um identificador que indica qual o dispositivo foi inserido no sistema. Em algumas formas de realização de um protocolo pode ser dependente de um identificador de dispositivo. Em algumas concretizações, o dispositivo externo armazena mais do que um protocolo para cada dispositivo. Em outras formas de realização de dados do paciente no dispositivo externo inclui mais do que um protocolo. Em alguns casos, o servidor armazena externos algoritmos matemáticos para processar uma contagem de fótons enviado a partir de um módulo de comunicação e, em algumas formas de realização para o cálculo da concentração de analito numa amostra de fluido corporal.
[00575] Em algumas formas de realização, o dispositivo externo pode incluir um ou mais servidores, como são conhecidos na arte e estão comercialmente disponíveis. Estes servidores podem proporcionar o equilíbrio de carga, tarefas de gestão, e capacidade de apoio, em caso de falha de um ou mais dos servidores ou outros componentes do dispositivo externo, para melhorar a disponibilidade do servidor. Um servidor pode também ser implementado numa rede de distribuição de unidades de armazenamento e um processador, tal como conhecidos na arte, em que o processamento de dados de acordo com a presente invenção reside em estações de trabalho, tais como computadores, eliminando assim a necessidade de um servidor.
[00576] Um servidor pode inclui um banco de dados e sistema de processos. Um banco de dados pode residir no servidor, ou pode residir em outro sistema do servidor que está acessível ao servidor. Como as informações em um banco de dados pode conter informação sensível, um sistema de segurança pode ser implementado que impede que usuários não autorizados obtenham acesso ao banco de dados.
[00577] Uma vantagem de algumas das características aqui descritas e que a informação pode ser transmitida de um dispositivo externo para trás, não só para a montagem leitor, mas para outras partes ou outros dispositivos externos, por exemplo, sem limitação, um PDA ou telefone celular. Essa comunicação pode ser realizada através de uma rede sem fios, tal como aqui divulgado. Em algumas formas de realização uma concentração do analito calculada paciente ou outra informação pode ser enviada para, por exemplo, mas não limitado a, o pessoal médico ou o paciente.
[00578] Deste modo, os dados gerados com a utilização dos dispositivos e sistemas de sujeitos pode ser utilizado para a realização de uma análise de tendência da concentração de uma substancia a analisar num sujeito que muda ao longo do tempo.
[00579] Outra vantagem como descrito aqui e que os resultados do ensaio podem ser substancialmente imediatamente comunicados a terceiros que possam beneficiar a obtenção dos resultados. Por exemplo, uma vez que a concentração do analito e determinada no dispositivo externo, que pode ser transmitida para um pessoal de pacientes ou médicos que podem precisar tomar novas medidas. A etapa de comunicação a terceiros pode ser realizada sem fios como descrito aqui, e transmitir os dados a mão de um terceiro realizado dispositivo, o terceiro pode ser notificado do ensaio resulta praticamente a qualquer hora e em qualquer lugar. Assim, em um cenário sensível ao tempo, o paciente pode ser contatado imediatamente em qualquer lugar se pode ser necessária uma intervenção medica urgente.
[00580] Conforme aqui descrito, a imagem pode ser utilizada para a detecção. lmagiologia pode ser utilizado para detectar uma ou mais características de uma amostra. Por exemplo, a imagem pode ser utilizada para detectar a presença ou ausência de uma amostra. A imagem pode ser utilizada para detectar a localização, a colocação, o volume ou a concentração de uma amostra. A imagem pode ser utilizada para detectar a presença, ausência, e/ou concentração de um ou mais analitos na amostra.
[00581] Em algumas formas de realização, uma única medição pode ser utilizada para capturar várias informações sobre uma amostra e/ou analitos. Por exemplo, uma única medição pode ser utilizada para captar informações sobre o volume de uma amostra e a concentração de um analito na amostra. Uma única medição pode ser usada para capturar informação sobre a presença e/ou concentração de uma multiplicidade de analitos e/ou tipos de analitos no interior da amostra. Uma única imagem pode ser usada para capturar informações relativas a um, dois, ou mais da informação ou tipos de informação aqui descrita.
[00582] Esta imagiologia e ensaios de detecção podem proporcionar mais precisas e exatas, que podem ser vantajosos em situações com pequenos volumes de amostra, tais como os descritos neste documento. Outros exemplos de volumes de amostra podem incluir μf 500 ou menos, 250 μf ou menos, 200 μf ou menos, 175 μf ou menos, 150 μf ou menos, com 100 μf ou menos, 80 ou menos μf, μf 70 ou menos, 60 μf ou menos, 50 ou menos μf, μf 30 ou menos, 20 ou menos μf, μf 15 ou menos, 10 ou menos μf, 8 μf ou menos, 5 ou menos μf, 1 μf ou menos, 500 nl ou inferior, 300 nl ou menos, com 100 nl ou inferior, 50 nl ou menos, 10 nl ou menos, 1 nl ou inferior, 500 pl ou menos, 250 pl ou menos, com 100 pl ou menos, 50 pl ou menos, 10 pl ou menos, 5 Pl ou menos, ou de 1 pl ou menos. Em algumas concretizações, o volume da amostra pode incluir menos do que ou igual a cerca de 3 gotas de uma picada no dedo, inferior ou igual a cerca de 2 gotas a partir de uma picada no dedo, ou menos do que ou igual a cerca de 1 gota de uma picada no dedo. Estes pequenos volumes poderão ser uteis em aplicações de ponto de serviço.
[00583] Essa imagem e/ou detecção pode produzir ensaios com baixo coeficiente de variação. Um coeficiente de variação pode ser a relação entre o desvio padrão e um valor absoluto da média. Numa forma de realização, uma reação e/ou de ensaio pode ter um coeficiente de variação (CV) (também "desvio padrão relativo" aqui), inferior ou igual a cerca de 20%, 15%, 12%, 10%, 9%, 8 %, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, ou 0,1%. Uma única reação e/ou de ensaio ou um procedimento com uma pluralidade de reações e/ou os ensaios podem ter um coeficiente de variação de menos do que ou igual a cerca de 20%, 15%, 12%, 10%, 9%, 8% , 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, ou 0,1%. Em algumas formas de realização, um passo de imagem e/ou de detecção, ou um procedimento com uma pluralidade de imagens e/ou detecção de passos podem ter um coeficiente de variação de menos do que ou igual a cerca de 20%, 15%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, ou 0,1%.
[00584] Em algumas formas de realização, o uso da imagem com um dispositivo que pode ser colocado num ponto de localização de serviço pode melhorar o desempenho global do dispositivo. A precisão e/ou precisão pode ser melhorada e/ou o coeficiente de variação pode ser reduzida. O desempenho do dispositivo pode ser melhorada quando o tratamento de pequenas amostras tais como aquelas aqui descritas volumes. A imagem pode ser utilizada em combinação com outros sistemas de detecção, em combinação com outros processos, ou como um sistema independente. Melhoria do desempenho pode incluir uma redução do coeficiente de variação de cerca de 15%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, ou 0,1%.
[00585] lmagem pode ser útil para vários tipos de detecção de um ou mais tipos de ensaios ou procedimentos de manuseio das amostras. Exemplos de tais ensaios ou procedimentos de manuseamento de amostras podem incluir centrifugação, separação, citometria de imunoensaio, EllSA, ensaio de ácido nucleico, ensaio enzimático, colorimetria, ou qualquer outro tipo de ensaio ou reação descrito noutras partes deste documento.
[00586] Os sistemas de imagem pode fornecer várias vantagens sobre outros métodos de coleta de dados, processamento de dados e interpretação dos resultados. Sistemas de imagem podem maximizar ou aumentar a eficiência do, o uso de pequenas amostras e melhorar o desempenho em nível de sistema. Sistemas de imagem pode ser usada para a detecção como sistemas independentes ou podem ser utilizados em combinação com outros sistemas de detecção ou mecanismos.
[00587] Em alguns sistemas, sensores e sistemas podem ser usados (como fotodiodos e tubos fotomultiplicadores e ótica/dispositivos associados), que normalmente não fornecem qualquer informação espacial sobre a amostra que está sendo interrogado. Em vez disso, esses sistemas podem recolher informações sobre a amostra após a informação ter sido espacialmente integrados, geralmente a perda de informações espaciais relacionadas com a amostra. Enquanto que integra o sinal do espaço a partir da amostra pode aumentar os níveis de sinal a ser detectado pelo sensor, os avanços na sensibilidade dos sensores óticos e outros pode anular a necessidade de tal integração. lmagiologia para a detecção podem ser utilizados no lugar de tais sensores, ou podem ser utilizados em conjunção com tais sensores.
[00588] Sistemas de imagem podem ser utilizados que podem vantajosamente ter uma ou mais das seguintes características. Sensores de imagem pode ter sensibilidade e faixa dinâmica que se encontram e/ou superior ao de sensores não-convencionais de imagem. Dispositivos de imagem podem manter os aspectos espaciais da amostra que está sendo interrogado, fornecendo capacidade significativa para o pós-processamento. PÓs-processamento pode incluir QA/QC (por exemplo, controle de qualidade, tais como detecção de erros automatizada e/ou revisão por patologista), e /ou analise de imagens para extrair características de amostras específicas. O dispositivo de imagem pode utilizar 3D, 2D, lD (sensores de linha), e /ou sensores de pontos com um meio para converter a amostra relativamente a ótica de recolha/sensor, para permitir a reconstrução espacial da amostra. Os dados obtidos a partir do dispositivo de imagem pode ser processada para extrair informações muito específicas, tais como as características morfológicas da amostra (tais como a contagem de células), dados selecionados a partir de regiões da imagem (pico de fluorescência através de uma amostra ou numa célula dentro da imagem). Os dados obtidos a partir do dispositivo de imagem pode ser processada para melhorar a sensibilidade e resolução da medição. Os dados coletados a partir do dispositivo de imagem pode permitir a avaliação da variação do sinal em toda a amostra a ser trabalhada. Os dados podem ser pós processadas para calcular média, desvio padrão, máximo, mínimo e/ou outras estatísticas aplicáveis em toda a amostra, ou dentro de qualquer regiões de interesse identificadas nas imagens de amostra. Dispositivos de imagem permitem a exploração de variações na amostra ao longo do tempo através da recolha de imagens múltiplas e comparando a variação das imagens ao longo do tempo e espaço, tal como seria evidente numa processos de agregação (por exemplo, para um ensaio do tempo de protrombina) ou outros (p.ex, alterações elétricas, morfológicas) da amostra ao longo do tempo e do espaço químico, físico, biológico,. Dispositivos de imagem pode permitir a aquisição de matrizes, seções de tecido, e outras configurações de ensaio/amostra de dados mais rápida.
Aplicação Citometria
[00589] Em algumas formas de realizado, qualquer uma das formas de realização aqui descritas podem ser adaptadas para permitir que o sistema para realizar a citometria. Citometria (por exemplo, contagem e análise da função das células) no sistema pode ser realizado utilizando analise de imagem. O sangue pode ser processado, utilizando a pipeta e centrifugar tal como anteriormente descrito neste documento. Tipicamente, um volume conhecido de sangue medido (1-50 ul) pode primeiro ser centrifugado e a fração de plasma removido. A fração de células pode ENTÃO ser ressuspenso em tampão de utilização da pipeta repetidamente para distribuir e aspirar. Um coquetel de anticorpos fluorescentes pode ser dirigido para marcadores celulares selecionadas (tais como CD45, CD4, etc.) Após uma breve incubação, um reagente que pode atuar como um fixador para as células brancas e um agente de lise de glóbulos vermelhos podem ser adicionados. Após outra incubação de células brancas podem ser recolhidas por centrifugação e o sobrenadante foi removido hemolisado por aspiração. Os glóbulos brancos corados podem ser re-suspensas num volume medido de solução tampão (normalmente menos do que o volume original de sangue (por exemplo 1 - 20. Ul) e distribuídas em canais capilares transparentes para análise de imagem tipicamente até três ou mesmo cinco ou mais células tipos podem ser visualizados utilizando anticorpos com diferentes etiquetas fluorescentes ou e/ou anticorpos marcados com diferentes racios de flúor/proteína. quando mais tipos de células tem de ser contadas ou analisado, mais do que uma mistura de reação pode ser usado. Em algumas formas de realização, uma mistura de reação pode ser usado para contar ou analisar vários números de tipos de células.
[00590] Em algumas formas de realização, os canais capilares são tipicamente de cerca de 10 - 100 urna profunda, 0,5 - 2 mm de largura e 0,5 - 5 cm de comprimento. Os canais capilares podem ter outras dimensões, incluindo mas não limitado a outras dimensões descritas aqui noutro sítio. A dispersão de células coradas pode encher o canal normalmente por ação capilar e as células podem ser deixadas assentar sobre a superfície inferior do canal. Os canais podem ser iluminadas com uma ou mais lasers ou outras fontes de luz (por exemplo, lEDs). O trem ótico pode ter um ou mais elementos óticos, tais como lentes ou espelhos dicroicos, e pode ou pode não aumentar o campo de visão. Em algumas formas de realizado, o campo de visão pode ser ampliada 2-100 vezes. Uma série de imagens pode ser recolhida normalmente representar um campo de visão de cerca de 1 mm x 0,5 mm, e que compreende 1 - 10.000 células (de preferência, de 300 células de interesse) fotografada para um sensor tendo uma área de cerca de 1000 x 1000 pixels (1 milhão no total).
[00591] Uma série de imagens que representam seções adjacentes do canal pode ser coletado. Uma fase mecânica pode ser usada para mover os canais em relação a fonte de luz. Em alguns casos, um servomecanismo pode mover-se a fase de uma direção vertical, de modo a focar a imagem. Em algumas formas de realização, a fonte de luz ou de um ou mais elementos óticos podem mover em relação a fase de focar a imagem. As imagens são geralmente feitas utilizando um ou mais combinações de fontes de luz e filtros óticos. As fontes de luz podem ser ligados e desligados e os filtros movido para o percurso da luz quando necessário. De preferência, até 1000 células de um determinado tipo, podem ser contadas. Em outras formas de realização, vários números de células de qualquer tipo podem ser contados, incluindo, mas não limitado a mais do que, menos do que, ou igual a cerca de 1 célula, 5 células, 10 células, 30 células, 50 células, as células 100, 150 células, 200 células, 300 células, 500 células, 700 células, as células 1000, 1500, células 2000, 3000, 5000 células. As células podem ser contadas usando algoritmos disponíveis contagem. As células podem ser reconhecidos pela sua fluorescência característica, o tamanho e forma. Algoritmos de reconhecimento de padrão podem ser empregues para excluir debris celulares coradas e na maioria dos casos em que existem células que são agregados ou estes podem ser excluídos da análise ou interpretados como agregados.
[00592] A plataforma de citometria pode ser um dispositivo de microscopia automatizada integrada capaz de as seguintes tarefas em um ambiente totalmente automatizado e controlado. Uma ou mais das seguintes tarefas podem ocorrer em citometria aplicações. As tarefas a seguir podem ocorrer na ordem em que aparecem ou em ordens alternadas ou outras tarefas podem ser substitutas, conforme apropriado.
lsolamento de células do sangue do tipo desejado
[00593] A marcação das células com corantes e/ou esferas fluorescentes e/ou colorida Confinamento de suspensão de células numa cuvete opticamente compatível lmagem de células utilizando microscopia de fluorescência, a iluminação de campo escuro e/ou a iluminação de campo claro Analise automática de imagens para extrair atributos desejados celulares Analise automatizada de informações extraídas através de métodos estatísticos e classificação avançadas para obter informações clinicamente reportáveis.
[00594] Nas seções seguintes, cada uma dessas tarefas e discutida em maiores detalhes, as imagens e esboços são fornecidos sempre que for necessário.
[00595] lsolamento de células do sangue do tipo desejado. As células do sangue de um tipo desejado podem ser isoladas de acordo com uma ou mais formas de realização descritas aqui noutro sítio. Por exemplo, tal isolamento pode ocorrer como referido nas descrições anteriores relacionadas com a citometria ou a centrífuga.
[00596] A marcação das células com corantes e/ou esferas fluorescentes e/ou coloridas.
[00597] Corantes fluorescentes específicos podem ser empregues. Células de interesse podem ser incubadas com as soluções de pre-alíquotas de ligantes marcados com fluorescência (por exemplo, anticorpos, aptameros, etc), que são específicos para marcadores sobre essas células. Uma consideração importante pode ser o emparelhamento "brilhante" ou maior coeficiente de extinção e rendimento quântico elevado Fluor com marcadores de células para as quais tem uma capacidade de ligação inferior, E vice-versa, por exemplo, o marcador CD22 pode ser expresso em linfócitos B em cerca de um decimo o nível de CD45. Dada esta expressão relativa, CD22 podem ser rotulados com um corante "brilhante" e CD45 podem ser rotulados com o corante "dimmer." Os marcadores de ser rotulados com esta técnica pode ser tanto marcadores intracelulares ou da superfície celular. A sensibilidade de detecção e de quantificação pode ser melhorada através de um sistema de rotulagem de expressão secundaria para marcadores de baixo. Resumidamente, um ligante primário podem ser conjugados com outra molécula que pode ser reconhecido especificamente por um ligante secundário. Um ligante secundário marcado com um maior número de fluoróforos pode então ligar o ligante primário in situ e melhorar o sinal de fluorescência. Um esquema para a realização esta pode ser a utilização de biotina anticorpo anti- CD22 conjugado que por sua vez pode ser reconhecida por um anticorpo antibiótica, que e marcada com isotiocianato de fluoresceína (lTCF). A utilização pode melhorar dramaticamente o sinal de fluorescência. Figura 123 constitui um exemplo de uma micrografia de fluorescência mostrando leucócitos marcados. O exemplo ilustra uma micrografia de fluorescência Alexa Fluor- 647-anti-CD45 de leucócitos humanos marcados em uma amostra de sangue lisada fixo. O esquema de pseudo e usado para aumentar a percepção da diferença entre células 'brilhantes' (com elevada expressão de CD45) e células 'dim' (com baixa expressão de CD45).
[00598] Manchas cor de esfregaços de células podem também ser empregues dentro do sistema. Por exemplo, o procedimento indicado no manual de Sto ' Faça M Wright-Giemsa (Polysciences lnc.) pode ser automatizado e lido nos dispositivos da presente invenção.
[00599] Em algumas formas de realização, corantes fluorescentes não- específicos podem ser usados. Para os efeitos de diferenciação subpopulações de leucócitos, a plataforma pode também utilizar corantes fluorescentes, que podem se ligar a ácidos nucleicos (por exemplo, SYTO, Hoechst) ou membranas de lipídios (por exemplo, Dil, DiD, FM-4-64).
[00600] Confinamento de suspensão de células numa cuvete opticamente compatível.
[00601] Em algumas formas de realização, cuvetes de citometria pode ser concebida para confinar um volume fixo de suspensão de células pre- rotulados para um «canal» fabricado de modo a proporcionar um material opticamente transparente imagiologia acima e abaixo das células. Amostra pode ser introduzida no interior do canal através de uma porta de entrada de amostra. A alguma distancia a partir da porta de entrada de amostra, uma purga de ar pode permitir a libertação de pressão do ar e do fluxo da amostra no interior do canal.
[00602] As dimensões de canal podem ser concebido para conter um volume conhecido previamente definida de fluido, independentemente do volume dispensado no porto de entrada da amostra. Cada cuvete pode ter múltiplos canais de mesmos e/ou diferentes volumes, cada uma com pelo menos uma porta de entrada de amostra e pelo menos um respiradouro de ar.
[00603] A concentração de células de interesse na amostra pode ser ajustada durante a preparação da amostra de tal modo que depois do parto, na cuvete, um número desejado de células por campo de visão do sistema de imagiologia pode ser alcançado. Um método para fazer isto pode ser para a imagem de um recipiente com a dispersão de células e medida da turbidez. Utilizando uma relação pre-estabelecida entre turbidez e contagem de células, pode ser calculada a densidade celular. Normalmente, a dispersão de células será feita num volume de tampão tal que, com o menor número de células susceptíveis, e a concentração de células será maior do que ideal para a contagem de células com base em imagem. Mais tampão pode então ser adicionada para trazer a dispersão para o nível ótimo.
[00604] A área de imagem e da cuvete pode ser concebido de modo a proporcionar um número suficiente de células para a aplicação de interesse. Por exemplo, a contagem dos glóbulos vermelhos abundantes pode exigir apenas a contagem de células de 1000-2000 e, consequentemente, uma amostra diluída e apenas uma pequena área da imagem em cuvete. Porém, contando mieloblastos raras podem exigir, em alguns casos, a capacidade de imagem mais do que 100.000 (total), as células. Em tal situação, o sistema pode concentrar-se a suspensão de células de modo a que 100.000 células pode ser trabalhada com um razoável número de campos de visão. Portanto, o canal dedicado da cuvete com a RBC imagem vai ser menor do que a uma dedicada a mieloblastos imagem.
[00605] A cuvete pode ser concebido para ser retirado através de um mecanismo de pipetagem padrão de forma automatizada para permitir a transferência da tina para a plataforma de imagem. Ponta ejetor do mecanismo de pipetagem pode ejetar o cadinho do mecanismo de pipetagem para a plataforma de imagem. Registro de cuba para a plataforma de imagem pode ocorrer em duas etapas. Após a transferência da tina para a plataforma de imagens, as características de registro estáticos na interface cuvete pode, com características de acasalamento na plataforma de imagem para alinhar a cuvete paralelo ao eixo ótico da plataforma de imagem (X, Y de registro). O registro pode então ser completada por um mecanismo localizado na plataforma de imagem. Este mecanismo pode influenciar na célula contra uma superfície plana perpendicular ao eixo ótico da plataforma de imagem (Z registro), restringindo assim a amostra dentro da faixa focal da plataforma de imagem.
[00606] lmagem de células usando fluorescência, iluminação darkfield, iluminação de campo claro. O método de imagiologia nas células pode também ser aplicado a outras aplicações do invento aqui descrito noutro lado. As técnicas de imagem, como descritas anteriormente, podem ser usados para outros usos de imagem.
[00607] A capacidades de iluminação: A plataforma de citometria pode ser projetado para ter três tipos de sistemas de iluminação: epi-fluorescencia, campo escuro e campo claro. A natureza modular da configuração também permite a integração de contraste de fase e contraste de interferência diferencial (DlC).
[00608] A epi-fluorescencia de iluminação pode ser alcançada através da utilização de três linhas de laser (por exemplo, 488 nm, 532nm e 640nm), mas a natureza modular do sistema também permite a integração de outras fontes de luz, tais como outras fontes de laser, os lEDs e padrão de lâmpadas de arco (por exemplo, Xenon, Mercury e halogenio). Além disso, duas fontes diferentes podem ser usados simultaneamente, se necessário. Por conseguinte, a plataforma de citometria pode ser utilizada para a imagem de uma grande variedade de corantes fluorescentes. A combinação de fontes de iluminação, ótica de emissão pode ser configurado para conseguir vários números (por exemplo, 3-5) espectralmente canais independentes de imagem.
[00609] A iluminação de campo escuro podem ser alcançados pela utilização de um ringlight (localizado acima ou abaixo da amostra), um campo escuro Abbe condensador, um condensador de campo escuro, com um espelho de formato circular, um condensador de epi- darkfield construído dentro de uma manga em torno da lente da objetiva , ou uma combinação de ringlight com um condensador equipado com uma fase de paragem escura. Fundamentalmente, estes componentes óticos podem criar um cone de luz da abertura numérica (NA) maior do que a AN do objetivo a ser utilizado. A escolha do regime de iluminação depende de uma série de considerações, tais como a ampliação necessária, as considerações de projeto mecânico, ou o tamanho do sensor de imagem. Um esquema de iluminação ringlight base proporciona geralmente uniforme de iluminação de campo escuro sobre uma área maior, enquanto ao mesmo tempo proporciona flexibilidade suficiente na concepção mecânica do sistema global. Figura 124 fornece um exemplo de padrões intracelulares usando imagens campo escuro. O exemplo mostra diferentes padrões intracelulares em imagens de campo escuro dos leucócitos humanos, (a) um forte padrão de espalhamento devido a presença de grânulos de eosinófilos, (b) de neutrófilos polimorfonucleares com os lóbulos de nucléolos característicos e (c) as células que não fazem a dispersão de luz para um grau significativo (linfócitos ou basófilos) iluminação Brightfield pode ser conseguida pelo uso de uma fonte de luz branca, juntamente com uma fase de condensador para criar iluminação Koehler. A Figura 126 constitui um exemplo de imagens de campo claro de sangue total humano. O exemplo mostra que as imagens de campo claro de um esfregaço de sangue inteiro humano corado com o método de coloração de Wright-Giemsa. Padrões característicos de coloração dos leucócitos humanos são aparentes. Os glóbulos vermelhos, caracteristicamente, em forma também podem ser identificados nestas imagens.
[00610] Roda filtro automático: Uma roda de filtro automático pode permitir o controle do trajeto ótico de imagem para permitir imagens de vários fluoróforos no mesmo campo de visão.
[00611] A imagem com base auto-focagem: A plataforma de citometria pode usar um algoritmo baseado em imagem para controlar a posição Z (por exemplo, a posição vertical) do objetivo (isto e, a sua distância a partir da amostra) para alcançar a auto-focagem. Resumidamente, uma pequena imagem (por exemplo, 128x128 pixels) pode ser capturada com uma taxa rápida usando iluminação de campo escuro. Esta imagem pode ser analisada para obter a função de auto-foco, que pode ser usado para medir de nitidez da imagem. Com base num algoritmo de busca rápida pode ser calculada a próxima z localização do objetivo. A amostra pode ser transferida para o novo local de z e outra imagem pequena pode ser capturado. Em algumas formas de realização, este sistema de circuito fechado não requer a utilização de qualqueroutro equipamento para a focagem.
[00612] A tradução da etapa: A platina do microscópio pode ser ligado a um computador controlado por motores de passo para permitir a tradução em direções X e Y (por exemplo, os sentidos horizontais). Em cada localização, o número desejado de imagens podem ser capturadas e a etapa pode ser movido para a posição seguinte XY.
[00613] Sensor de imagem: uma câmara com um CCD, EMCCD, CMOS ou, em alguns casos, um tubo fotomultiplicador pode ser usado para detectar o sinal.
[00614] A análise de imagens para extrair atributos celulares desejados.
[00615] A plataforma de citometria pode utilizar diferentes técnicas de iluminação para adquirir imagens que revelam diversas propriedades e características das células. A marcação com marcadores de células-ligantes específicos podem revelar o grau de expressão do que o marcador particular na superfície da célula ou na célula. lmagem de campo escuro podem revelar as propriedades de dispersão de luz das células. As características internas e externa da célula que dispersam a luz aparece mais brilhante e as características de dispersão, que menores quantidades de luz aparecem mais escuras de uma imagem de campo escuro. Células como os granulócitos tem grânulos internos da faixa de tamanho (100-500nm), que pode espalhar quantidade significativa de luz e, geralmente, aparecem em imagens de campo escuro brilhante. Além disso, o limite exterior de qualquer célula pode dispersão de luz e pode aparecer como um anel de luz brilhante. O diâmetro do anel pode dar diretamente o tamanho da célula. Lmagens Brightfield de células podem revelar o tamanho da célula, o material de fase densa no interior das células e as características de cor da célula, se as células tiverem sido previamente coradas.
[00616] Uma biblioteca de processamento de imagem pode extrair um ou mais dos seguintes elementos de informação para cada célula (mas não se limitam aos seguintes):
Tamanho da célula
[00617] Medida quantitativa da granularidade da célula (também popularmente chamado de dispersão lateral, com base em citometria de fluxo linguagem) Medida quantitativa da fluorescência em cada canal espectral da imagem, depois de compensar a diafonia entre canais espectrais Formato da célula, tal como quantificado por atributos padrão e personalizados forma tais como relação de aspecto, diâmetro Feret, curtose, momento de inercia, a circularidade, solidez, etc Cor, distribuição de cor e forma da célula, nos casos em que as células foram coradas com os corantes (não ligados a anticorpos ou outros tipos de receptor).
[00618] Os padrões de coloração intracelular ou dispersão ou de cores que são definidos como medidas quantitativas de uma característica biológica, por exemplo, a densidade dos grânulos dentro das células em uma imagem de campo escuro, ou o número e tamanho dos lóbulos de nucléolos de uma imagem manchada com Giemsa de Wright polimorfonuclear neutrófilos, etc. Co-localização de características da célula revelado em imagens separadas
[00619] Os algoritmos de processamento de imagem utilizados nesta etapa pode usar combinações de filtragem de imagem, detecção de borda, combinando modelo, limiarização automática, as operações morfológicas e análise de forma dos objetos.
[00620]. Analise de informações extraídas através de métodos estatísticos e classificação avançadas para obter informações clinicamente reportáveis.
[00621] Qualquer número de medida atribuído pode ser extraído a partir de imagens das células. Por exemplo, os atributos de cada célula de medição extraída a partir das imagens podem variar 7-15, criando assim um espaço de 7 a 15 tridimensional no qual cada célula e um ponto. Se n atributos medidos são extraídos a partir das imagens, pode ser proporcionado um espaço n- dimensional, em que cada célula e um ponto.
[00622] Com base em dados obtidos por um grande número de células (por exemplo, células 100-100,000) um conjunto de dados dispersos n- dimensional complexo pode ser gerado.
[00623] Os métodos estatísticos podem ser utilizados para o agrupamento de células separadas em populações individuais neste espaço n- dimensional. Estes métodos também podem usar o conhecimento do estado da técnica de biologia celular e hematologia para auxiliar no agrupamento e identificação da população celular.
[00624] A Figura 125 constitui um exemplo de aquisição de parâmetros múltiplos de dados a partir de amostras de células marcadas. leucócitos humanos foram marcados com o marcador panleucocitario anti-CD45-Alexa Fluor 700 (mostrado a verde) e o marcador de células B de anti-CD22-APC (mostrado em vermelho). Os canais individuais mostram diferentes padrões de CD45, CD22 expressão e dispersão lateral. As células que são positivas para CD22 e CD45 (linfócitos B) mostram a característica de baixa dispersão lateral. Sobre as outras células mão, como neutrófilos e eosinófilos, que tem alta dispersão lateral não apresentou marcação para CD22.
[00625] A Figura 127 constitui um exemplo de aquisição de dados multi-quantitativa e analise paramétrica. Por exemplo, um histograma pode ser proporcionado o qual pode mostrar a distribuição da intensidade de CD45 nos leucócitos humanos. Quaisquer outras técnicas de distribuição de dados de gráficos pode ser empregue para mostra a distribuição. Em algumas formas de realização, pode ser proporcionado um diagrama de dispersão, de dispersão de lado. A dispersão lateral pode ser determinada por análise da imagem de campo escuro contra CD45 intensidade de fluorescência de uma amostra de leucócitos humanos. O gráfico de dispersão lado pode mostrar duas populações principais de granulócitos (canto superior esquerdo) e linfócitos (canto inferior direito).
[00626] Nas seções anteriores, descrevem os principais componentes e as capacidades da plataforma de citometria e aplicações. Com base nesses recursos, uma ampla gama de ensaios baseados em células pode ser projetada para trabalhar nesta plataforma. Por exemplo, pode ser proporcionado um ensaio para a realização de um 5-parte diferencial de leucócitos. Os reportáveis neste caso podem ser o número de células.

Claims (14)

1.Método para detectar a presença ou concentração de um analito numa amostra de fluido contido num recipiente, caracterizado por compreender: iluminar o recipiente ao longo de uma primeira região tendo um primeiro comprimento do percurso para se obter uma primeira medição da intensidade da luz transmitida através do primeiro comprimento de percurso; mover o fluido de amostra para outra região do recipiente tendo outro comprimento de percurso se primeira medição cair fora de um intervalo dinâmico predeterminado da intensidade de luz transmitida; iluminar o recipiente ao longo da outra região, para se obter outra medição da intensidade da luz transmitida através do outro comprimento de percurso, e opcionalmente repetir os passos (b) e (c) até obter uma medição da intensidade da luz cair dentro do intervalo dinâmico predeterminado, detectando deste modo a presença ou concentração do analito.
2.Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a deconvolução de uma linha examinada da imagem, detectando deste modo a presença ou concentração de analito.
3.Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a amostra ser movida de uma primeira zona do recipiente que tem um primeiro comprimento do percurso para uma segunda região do recipiente tendo outro comprimento de percurso por aspiração da amostra.
4.Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por uma extremidade do recipiente estar ligada a uma pipeta que está configurada para aspirar a amostra.
5.Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a amostra ser movida para cima ou para baixo no comprimento do recipiente.
6.Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por em que o recipiente ser uma ponta de pipeta.
7.Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o recipiente ter forma cônica.
8.Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o recipiente ter uma pluralidade de larguras distintas para permitir a transmissão de luz ao longo de uma pluralidade de diferentes comprimentos de caminho.
9.Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o volume do recipiente ser inferior a 100 microlitros.
10.Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por uma pluralidade de comprimentos de percursos diferentes serem refletidos simultaneamente.
11.Método de medição da concentração de analito numa amostra de fluido caracterizado por compreender: proporcionar a amostra contida num recipiente dimensionado com uma pluralidade de larguras distintas para permitir a transmissão de luz ao longo de uma pluralidade de diferentes comprimentos de caminho que correspondem a pluralidade de larguras distintas; iluminar o recipiente ao longo de pelo menos um da pluralidade de comprimentos de percurso, refletir o recipiente para medir uma primeira intensidade de luz transmitida através do dito pelo menos um de uma pluralidade de comprimentos de percurso, para a determinação da concentração do analito com base na primeira intensidade da luz medida, refletir o recipiente para medir uma segunda intensidade de luz transmitida através de outro comprimento de percurso correspondente a outra largura distinta do recipiente; comparar a primeira intensidade da luz e a segunda intensidade de luz; e determinar uma concentração de analito com base na etapa de comparação.
12.Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender selecionar um comprimento de caminho de detecção desejado por um ou mais dos seguintes: (a)mover uma fonte de luz em relação a amostra, (b)mover um detector em relação a amostra, ou (c)mover a amostra dentro do recipiente em relação a fonte de luz.
13.Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a iluminação ser proporcionada por uma fonte de luz e a captação e proporcionada por um detector, onde a fonte de luz e o detector estão em lados opostos do recipiente.
14.Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a iluminação ser proporcionada por uma fonte de luz e a captação e proporcionada por um detector, onde a fonte de luz e o detector estão no mesmo lado do recipiente.
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