ES2895518T3 - Sistemas y métodos para la maximización del uso de muestras - Google Patents

Abstract

Un sistema automatizado para separar uno o más componentes en una muestra de fluido biológico que comprende: (a) un aspirador que tiene una pluralidad de cabezales; (b) una punta de pipeta adaptada para acoplarse con un cabezal del aspirador en donde dicha punta de pipeta comprende dos extremos opuestos, al menos uno de los cuales puede sellarse; (c) un sello para sellar el extremo sellable de la punta de la pipeta para proporcionar una punta de pipeta sellada; y (d) una centrífuga configurada para recibir dicha punta de pipeta sellada para efectuar dicha separación de uno o más componentes en un fluido biológico; en donde el aspirador está configurado para insertar y retirar la punta de pipeta sellada dentro y fuera de la centrífuga.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistemas y métodos para la maximización del uso de muestras

Antecedentes de la invención

El descubrimiento de un gran número de biomarcadores de enfermedades, las nuevas terapias y el establecimiento de sistemas médicos miniaturizados han abierto nuevas vías para la predicción, el diagnóstico y el seguimiento del tratamiento de enfermedades en un punto de atención o en otros entornos de pruebas distribuidas. Los sistemas de punto de atención pueden suministrar rápidamente los resultados de las pruebas al personal médico, a otros profesionales médicos y a los pacientes. El diagnóstico temprano de una enfermedad o la progresión de la enfermedad y el seguimiento de la terapia suelen ser fundamentales para el tratamiento de afecciones mortales como ciertos cánceres y enfermedades infecciosas.

El diagnóstico y el tratamiento de enfermedades pueden aprovechar las mediciones de biomarcadores multiplexados, que proporcionan un conocimiento adicional del estado de un paciente. Por ejemplo, al monitorear los efectos de un fármaco, pueden medirse tres o más biomarcadores en paralelo. Típicamente, se han usado placas de microtitulación y otros aparatos similares para realizar ensayos basados en separación multiplexados. Una placa de microtitulación (por ejemplo, una placa de microtitulación de 384 pocillos) puede realizar una gran cantidad de ensayos en paralelo.

En un dispositivo de Puntos de Atención (POC), el número de ensayos que pueden realizarse en paralelo se limita frecuentemente por el tamaño del dispositivo y el volumen de la muestra que se va a analizar. En muchos dispositivos de POC, el número de ensayos realizados es de aproximadamente 1 a 10. Sería conveniente un dispositivo de POC capaz de realizar ensayos multiplexados en una muestra pequeña.

Una deficiencia de muchos dispositivos de ensayo POC multiplexados es el alto costo de fabricación de los componentes del dispositivo. Si el dispositivo es desechable, el costo de los componentes puede hacer que la fabricación de un dispositivo de POC no sea práctica. Además, para los dispositivos de POC multiplexados que incorporan todos los reactivos necesarios a bordo del dispositivo, si alguno de esos reactivos presenta inestabilidad, es posible que deba desecharse un lote completo de dispositivos fabricados incluso si todos los demás reactivos aún pueden usarse.

Cuando un cliente se interesa en personalizar un dispositivo POC para un conjunto particular de analitos, los fabricantes de sistemas de ensayo POC multiplexados se enfrentan frecuentemente a la necesidad de mezclar y combinar los ensayos y reactivos del dispositivo. Un ensayo POC multiplexado adecuado para cada cliente puede ser muy caro, difícil de calibrar y difícil de mantener el control de calidad.

Los métodos POC han demostrado ser muy valiosos en el monitoreo de la enfermedad y la terapia (por ejemplo, sistemas de glucosa en sangre en la terapia de la diabetes, medición del tiempo de protrombina en la terapia anticoagulante mediante el uso de warfarina). Al medir múltiples marcadores, se cree que las enfermedades complejas (como el cáncer) para las que se requieren terapias con múltiples fármacos pueden monitorearse y controlarse mejor.

Existe la necesidad de usar múltiples fuentes de información para controlar el estado de salud o el estado de la enfermedad de los individuos, así como los tratamientos de diversas enfermedades. Es especialmente importante la medición de concentraciones de varios analitos seleccionados (biomarcadores, anticuerpos, niveles de expresión génica, metabolitos, concentraciones de fármacos terapéuticos y similares) a lo largo del tiempo. Para que este proceso sea conveniente y de máxima eficacia, las tecnologías que permiten la medición de todos y cada uno de los analitos necesarios (de cualquier tipo) usando una pequeña muestra de sangre (gota de sangre obtenida por punción en el dedo) u otra muestra adecuada son particularmente valiosas. Idealmente, dicha tecnología la podrán utilizar usuarios sin formación técnica en entornos de prueba distribuidos, por ejemplo, hogares, clínicas, consultorios médicos, farmacias y tiendas minoristas. La presente invención aborda estos problemas y permite que uno pueda realizar tales mediciones de forma rutinaria en el hogar del paciente o en otro entorno que no sea de laboratorio.

También existe la necesidad de hacer el mayor uso de las muestras disponibles, particularmente en el caso en el que las muestras (por ejemplo, muestras de sangre) estén limitadas por el tamaño de la muestra. Las muestras de sangre se usan para la gran mayoría de las pruebas médicas/clínicas. Las células sanguíneas deben separarse del plasma (o suero) antes de la mayoría de los tipos de análisis, ya que la presencia de células comprometería la química del ensayo. Por ejemplo, la glucosa y el colesterol a menudo se miden mediante químicas formadoras de color que se verían interferidas por la presencia de elementos formados, especialmente glóbulos rojos, o hemoglobina (de glóbulos rojos lisados).

Los sistemas de análisis distribuidos idealmente requieren una pequeña muestra de sangre obtenida mediante métodos de punción digital. Tales muestras pueden ser tan pequeñas como 20 microlitros (uL) (una gota) o menos.

Las muestras de mayor volumen (digamos hasta 200 uL) generalmente no pueden tomarse con métodos de punción digital sin repetidos e inconvenientes ("ordeños") de los dedos. Alternativamente, pueden tomarse muestras venosas de varios mililitros (ml), pero esto requiere un flebotomista con formación médica.

Por lo general, es muy difícil realizar más de un ensayo usando una pequeña muestra de sangre con 20 uL o menos. Esto es especialmente así cuando la muestra de sangre debe filtrarse para eliminar células y la recuperación de plasma utilizable de volúmenes tan pequeños es ineficaz. Normalmente, solo pueden recuperarse aproximadamente 5 uL o menos de plasma. Las muestras de hasta 200 uL pueden separarse de manera eficiente mediante sistemas POC automatizados (Abaxis, Biosite, etc.), pero esto no puede hacerse de forma rutinaria a menos que haya un técnico disponible para extraer la muestra. El documento US 2008/0179301 A1 divulga sistemas y métodos para grabar materiales con un láser y para leer las marcas resultantes con un segundo láser. El documento US 2009/0088336 A1 divulga dispositivos, sistemas y usos modulares de punto de atención de los mismos, en particular un cartucho para la detección automática de un analito en una muestra de fluido corporal.

Resumen de la invención

En vista de las limitaciones de los métodos actuales, existe una necesidad urgente de métodos mejorados para separar automáticamente el plasma y/u otros materiales de las células sanguíneas. También existe la necesidad de mejorar la precisión de estas mediciones sobre la concentración de analito. En las mediciones de biomarcadores y otros componentes de la sangre con el fin de controlar la terapia y el diagnóstico, es importante que se utilice el volumen correcto de muestra. En un entorno de laboratorio, esto se logra mediante la utilización de instrumentos automatizados complejos y miembros del personal profesional capacitado. Por el contrario, en entornos de "puntos de atención", como hogares, farmacias minoristas y tiendas, y similares, los métodos y equipos usados deben permitir que personas sin formación técnica obtengan y procesen muestras de forma fiable.

La presente invención aborda las necesidades mencionadas anteriormente y proporciona ventajas relacionadas. En algunos ejemplos, la presente invención se refiere a dispositivos de punto de atención y/o punto de servicio. En algunos ejemplos, la presente invención se refiere a sistemas, dispositivos, interfaces de usuario y métodos para analizar muestras usando un dispositivo de punto de atención y/o punto de servicio.

En un aspecto, los dispositivos y métodos divulgados en el presente documento están diseñados para identificar el tipo de muestra (sangre frente a plasma, etc.) para medir el volumen de muestra lo suficientemente temprano en el procedimiento de ensayo para asegurar que se usa una muestra adecuada en un ensayo previsto. En otro aspecto, la presente invención también permite que uno pueda corregir los errores de volumen significativos que se producen al realizar un ensayo.

En otro aspecto más, esta invención permite mediciones simultáneas en varios analitos de diferentes tipos con alta precisión.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un sistema automatizado para separar uno o más componentes en un fluido biológico. El sistema automatizado puede comprender (a) un aspirador que tiene una pluralidad de cabezales, (b) una punta de pipeta adaptada para acoplarse con un aspirador en donde dicha punta de pipeta comprende dos extremos opuestos, al menos uno de los cuales es sellable; (c) un sello para sellar el extremo sellable de la punta de la pipeta para proporcionar una punta de pipeta sellada; y (d) una centrífuga configurada para recibir dicha punta de pipeta sellada para efectuar dicha separación de uno o más componentes en un fluido biológico donde el aspirador está configurado para insertar y retirar la punta de pipeta sellada dentro y fuera de la centrífuga. En un ejemplo, el uno o más componentes se seleccionan del grupo que consiste en plasma sanguíneo, suero sanguíneo, células sanguíneas y partículas. En otro ejemplo, la punta de la pipeta se acopla con el aspirador para efectuar una aspiración del fluido biológico. En otro ejemplo, la punta de la pipeta tiene un extremo abierto que forma un sello hermético con el aspirador. En otro ejemplo, el sistema comprende además un dispositivo de formación de imágenes; y al menos otra punta de pipeta dimensionada para permitir la aspiración de un líquido de la punta de la pipeta de (b). En otro ejemplo, la punta de la pipeta está orientada verticalmente cuando la centrífuga está en reposo. En otro ejemplo, la punta de la pipeta está orientada horizontalmente cuando la centrífuga gira a una velocidad de rotación predeterminada.

Otro aspecto de la invención puede ser un método para aislar componentes en una muestra que comprende uno o más de los siguientes pasos: cargar una muestra en la punta de una pipeta escalando la punta de la pipeta con el sello en el extremo escalable de la punta de la pipeta; insertar con el aspirador la punta de la pipeta sellada en la centrífuga; centrifugar la punta de la pipeta sellada, formando así una región interfacial que separa la muestra en un sobrenadante y un sedimento; obtener imágenes de la punta de la pipeta centrifugada para determinar la ubicación de la región interfacial; y aspirar automáticamente el sobrenadante basándose en la ubicación de la región interfacial. En un ejemplo, el método comprende además determinar la ubicación del sobrenadante mediante dicho paso de formación de imágenes y aspirar automáticamente el sobrenadante basándose en la ubicación del sobrenadante. En otro ejemplo, la determinación se produce con la ayuda de un procesador, y dicho procesador proporciona instrucciones a un dispositivo de aspiración que realiza el paso de aspiración automática. En otro ejemplo, la formación de imágenes se produce mediante el uso de una cámara que está configurada para capturar la imagen del perfil lateral de la punta de la pipeta. En otro ejemplo, el sobrenadante incluye uno o más de los siguientes: plasma sanguíneo o suero sanguíneo. En otro ejemplo, el sedimento incluye uno o más de los siguientes: células sanguíneas o partículas. El método puede comprender además sellar la punta de la pipeta ajustando a presión el extremo sellable de la punta de la pipeta en el sello.

Se describe un método asistido por ordenador para caracterizar un analito que se sospecha que está presente en una muestra. El método asistido por ordenador puede comprender obtener una imagen digital de la muestra, en donde la imagen digital comprende al menos una matriz bidimensional de píxeles, y en donde cada píxel comprende una pluralidad de valores de intensidad, cada uno de los cuales corresponde a una región espectral de detección distinta; correlacionar, con la ayuda de un dispositivo programable, los valores de intensidad obtenidos con un conjunto predeterminado de valores que definen un intervalo dinámico de cada región espectral de detección; y predecir la presencia y/o cantidad de dicho analito en la muestra basándose en dicha correlación de los valores de intensidad obtenidos con un conjunto predeterminado de valores. En un ejemplo, la pluralidad de valores de intensidad comprende valores de intensidad para las regiones espectrales de detección de rojo, verde y azul. En otro ejemplo, el método comprende además seleccionar una longitud de onda de iluminación e iluminar la muestra con la longitud de onda de iluminación seleccionada antes y/o simultáneamente con la obtención de la imagen digital. En otro ejemplo, el método comprende además, después de obtener la imagen digital, (a) seleccionar otra longitud de onda de iluminación; (b) iluminar la muestra con la otra longitud de onda de iluminación seleccionada; (c) obtener otra imagen digital de la muestra, en donde la imagen digital comprende al menos una matriz bidimensional de píxeles, y en donde cada píxel comprende una pluralidad de valores de intensidad, cada uno de los cuales corresponde a una región espectral de detección distinta; y (d) predecir la presencia y/o cantidad de dicho analito en la muestra en base a los valores de intensidad obtenidos de la imagen digital y dicha otra imagen digital.

Además, se divulga un método para medir una concentración de analito en una muestra de fluido que comprende proporcionar la muestra contenida en un contenedor dimensionado con una pluralidad de anchos distintos para permitir la transmisión de luz a lo largo de una pluralidad de longitudes de trayectoria variables que corresponden a la pluralidad de anchos distintos; iluminar el contenedor a lo largo de al menos una de la pluralidad de longitudes de trayectoria; y obtener imágenes del contenedor para medir una primera intensidad de luz transmitida a través de dicha al menos una de la pluralidad de longitudes de trayectoria, para la determinación de la concentración del analito en base a la primera intensidad de luz medida.

De acuerdo con otra divulgación, un método para detectar la presencia o concentración de un analito en una muestra de fluido contenida en un contenedor (por ejemplo, una cubeta) puede comprender iluminar el contenedor a lo largo de una primera región que tiene una primera longitud de trayectoria para producir una primera medición de intensidad de la luz transmitida a través de la primera longitud de trayectoria; mover la muestra de fluido a otra región en el contenedor que tiene otra longitud de trayectoria si la primera medición cae fuera de un intervalo dinámico predeterminado de intensidad de luz transmitida; iluminar el contenedor a lo largo de la otra región para producir otra medición de la intensidad de la luz transmitida a través de la otra longitud de trayectoria; y, opcionalmente, repetir el segundo y tercer pasos hasta que una medición de la intensidad de la luz caiga dentro del intervalo dinámico predeterminado, detectando así la presencia o concentración del analito. En un ejemplo, el método comprende además la deconvolución de un escaneo de líneas de la imagen, detectando así la presencia o concentración de un analito. En otro ejemplo, la muestra se mueve desde una primera región del contenedor que tiene una primera longitud de trayectoria a una segunda región del contenedor que tiene otra longitud de trayectoria aspirando la muestra. En otro ejemplo, un extremo del contenedor se une a una pipeta que está configurada para aspirar la muestra. En otro ejemplo, la muestra se mueve hacia arriba o hacia abajo a lo largo del contenedor. En otro ejemplo, el contenedor es una punta de pipeta. En otro ejemplo, el contenedor tiene forma cónica. En otro ejemplo, el contenedor tiene dos extremos abiertos. En otro ejemplo, un primer extremo abierto tiene un diámetro mayor que un segundo extremo abierto. En otro ejemplo, el contenedor tiene una pluralidad de anchuras distintas para permitir la transmisión de luz a lo largo de una pluralidad de longitudes de trayectoria variables. En otro ejemplo, el volumen del contenedor es inferior a 100 microlitros. En otro ejemplo, se obtienen imágenes de una pluralidad de longitudes de trayectoria distintas simultáneamente.

En otra divulgación, puede proporcionarse un método para caracterizar un analito que se sospecha que está presente en una muestra de fluido biológico, comprendiendo dicho método: proporcionar dicha muestra de fluido biológico; permitir que dicho analito reaccione con uno o más reactivos que reaccionen específicamente con dicho analito para generar una señal ópticamente detectable; y medir dicha señal ópticamente detectable con una pluralidad de regiones espectrales de detección, en donde la presencia de dicha señal ópticamente detectable dentro de un intervalo dinámico de al menos una región espectral de detección es indicativa de la concentración de dicho analito en dicha muestra de fluido biológico. En un ejemplo, la medición se realiza mediante un dispositivo de formación de imágenes configurado para medir una pluralidad de regiones espectrales de detección. En otro ejemplo, el dispositivo de formación de imágenes está configurado para medir la pluralidad de regiones espectrales de detección simultáneamente. En otro ejemplo, el dispositivo de formación de imágenes está configurado para medir secuencialmente la pluralidad de regiones espectrales de detección.

Otra divulgación proporciona un método para aumentar la precisión de un ensayo que comprende obtener imágenes de una muestra en una primera punta para determinar el volumen de la primera muestra; formar imágenes de uno o más reactivos en una segunda punta para determinar el volumen de uno o más reactivos; mezclar la muestra y uno o más reactivos para formar una mezcla de reacción; formación de imágenes de la mezcla de reacción; corregir una calibración basada en dichos volúmenes determinados de la muestra y en uno o más reactivos; y calcular una concentración de un analito usando la calibración corregida. En un ejemplo, el método comprende además formar imágenes de la mezcla de reacción para determinar el volumen de la mezcla de reacción. En otro ejemplo, la formación de imágenes de la muestra en la primera punta se realiza usando una cámara configurada para capturar un perfil lateral de la primera punta. En otro ejemplo, la formación de imágenes de uno o más reactivos en la segunda punta se realiza usando una cámara configurada para capturar un perfil lateral de la segunda punta. En otro ejemplo, la altura de la muestra y uno o más reactivos se calcula basándose en los perfiles capturados. En otro ejemplo, la determinación del volumen se basa en la altura de la muestra y en uno o más reactivos y las áreas de sección transversal conocidas de la muestra y en uno o más reactivos respectivamente. En otro ejemplo, la calibración también se basa en el volumen determinado de la mezcla de reacción.

Otra divulgación proporciona una configuración, que comprende: un recipiente configurado para aceptar y confinar una muestra, en donde el recipiente comprende una superficie interior, una superficie exterior, un extremo abierto y un extremo cerrado opuesto; y una punta configurada para extenderse dentro del recipiente a través del extremo abierto, en donde la punta comprende un primer extremo abierto y un segundo extremo abierto, en donde el segundo extremo abierto se inserta en el recipiente, en donde el recipiente o la punta comprende además una característica de superficie sobresaliente que evita que el segundo extremo abierto de la punta entre en contacto con el fondo de la superficie interior del extremo cerrado del recipiente. En un ejemplo, la característica de la superficie está formada integralmente en la superficie interior del fondo del recipiente. En otro ejemplo, la característica de la superficie comprende una pluralidad de protuberancias en la superficie interior del fondo del recipiente. En otro ejemplo, la característica de superficie que sobresale está en o cerca del extremo cerrado.

Otra divulgación proporciona un aparato de procesamiento de muestras que comprende una estación de preparación de muestras, una estación de ensayo y/o una estación de detección; una unidad de control que tiene comandos ejecutables por ordenador para realizar un servicio de punto de servicio en una ubicación designada con la ayuda de al menos una de dichas estaciones de preparación de muestras, estaciones de análisis y estaciones de detección; y al menos una centrífuga configurada para realizar la centrifugación de una muestra de una punción digital. En un ejemplo, la centrífuga está contenida dentro de la estación de preparación de muestras y/o la estación de ensayo. En otro ejemplo, los comandos ejecutables por ordenador están configurados para realizar el servicio de punto de servicio en un sitio seleccionado del grupo que consiste en un sitio minorista, el hogar del sujeto o una ubicación de evaluación/tratamiento de salud.

Otra divulgación proporciona un método para la retroalimentación dinámica, comprendiendo dicho método: tomar una medida inicial de una muestra dentro de un contenedor usando un mecanismo de detección; en base a dicha medición inicial, determinar, usando un procesador, si la concentración de la muestra cae en un intervalo deseado, y determinar, usando un procesador, (a) un grado de dilución a realizar si la concentración de la muestra es mayor que el intervalo deseado o (b) un grado de concentración a realizar si la concentración de la muestra es menor que el intervalo deseado; y ajustar la concentración de la muestra de acuerdo con el grado de dilución determinado o el grado de concentración determinado. En un ejemplo, el método comprende además tomar una medición posterior de la muestra dentro del contenedor. En otro ejemplo, el método comprende además, en base a la determinación de la medición posterior, usando un procesador, si la concentración de la muestra cae en un intervalo deseado. En otro ejemplo, la medición posterior se realiza usando el mecanismo de detección. En otro ejemplo, el método comprende además determinar una característica de la muestra basándose en la medición posterior. En otro ejemplo, la característica se selecciona de una o más de las siguientes: la presencia o concentración de un analito, la presencia o concentración de una célula y la morfología de la célula. En otro ejemplo, la medición posterior se realiza usando un mecanismo de detección separado del mecanismo de detección inicial. En otro ejemplo, la medición inicial proporciona una medición bruta de la concentración celular de la muestra. En otro ejemplo, la medición posterior proporciona una medición de la concentración celular de la muestra de mayor resolución que la medición inicial. En otro ejemplo, la medición inicial se toma formando imágenes de la muestra. En otro ejemplo, el ajuste de la concentración de la muestra permite la detección de analito que, de otro modo, quedaría fuera del intervalo deseado.

Otra divulgación proporciona un método para proporcionar control de calidad, comprendiendo dicho método capturar una imagen de las condiciones en las que un mecanismo de detección mide una característica de una muestra; y determinar, usando un procesador, basándose en la imagen, si existen condiciones indeseables bajo las cuales se opera el mecanismo de detección. En un ejemplo, las condiciones indeseables incluyen la presencia de uno o más materiales indeseables. En otro ejemplo, los materiales indeseables incluyen uno o más de los siguientes: burbujas, partículas, fibras, desechos y precipitados que interfieren con la medición de las características de la muestra. En otro ejemplo, el mecanismo de detección es un mecanismo diferente de un mecanismo usado para capturar la imagen. En otro ejemplo, la imagen se captura con una cámara. En otro ejemplo, el método comprende además proporcionar una alerta si se detecta una condición indeseable. En otro ejemplo, el método comprende además ajustar la muestra si se detecta una condición indeseable. En otro ejemplo, la imagen incluye una imagen de la muestra. En otro ejemplo, la imagen incluye una imagen de uno o más de los siguientes: el contenedor de muestra o el mecanismo de detección.

Otra divulgación es un sistema automatizado para separar uno o más componentes en un fluido biológico que comprende una centrífuga que comprende uno o más cubos configurados para recibir un contenedor para efectuar dicha separación de uno o más componentes en una muestra de fluido; y el contenedor, en donde el contenedor incluye una o más características de forma que son complementarias a una característica de forma del cubo. En un ejemplo, la característica de forma del cubo incluye uno o más soportes sobre los que está configurado para descansar una parte sobresaliente del contenedor. En otro ejemplo, el cubo está configurado para ser capaz de aceptar una pluralidad de contenedores que tienen diferentes configuraciones, y en donde la característica de forma del cubo incluye una pluralidad de estantes, en donde un primer contenedor que tiene una primera configuración está configurado para descansar sobre un primer soporte, y un segundo contenedor que tiene una segunda configuración está configurado para descansar sobre un segundo soporte.

Otra divulgación es una unidad de ensayo que comprende un primer extremo y un segundo extremo; una superficie exterior; y una superficie interior que comprende uno o más patrones seleccionados, cada uno de los cuales está inmovilizado sobre el mismo o dentro con un reactivo de captura capaz de capturar un analito sospechoso de estar presente en una muestra biológica, en donde el primer extremo y el segundo extremo son de diferentes dimensiones.

Otra divulgación es una unidad de ensayo que comprende un identificador que se usa para determinar (a) uno o más reactivos de captura inmovilizados en la superficie interna; y (b) la fuente de la muestra biológica si la unidad de ensayo contiene dicha muestra.

Otra divulgación es una unidad de ensayo que comprende una pluralidad de patrones seleccionados, cada patrón de dicha pluralidad comprende un agente de captura distinto.

Otros objetivos y ventajas de la invención se apreciarán y comprenderán mejor cuando se consideren junto con la siguiente descripción y los dibujos adjuntos. Si bien la siguiente descripción puede contener detalles específicos que describen ejemplos particulares de la invención, esto no debe interpretarse como limitaciones al alcance de la invención, sino más bien como una ejemplificación de ejemplos preferibles. Para cada aspecto de la invención, son posibles muchas variaciones como se sugiere en el presente documento que son conocidas por los expertos en la técnica. Pueden realizarse una variedad de cambios y modificaciones dentro del alcance del conocimiento del experto en la técnica. Los diversos compuestos/dispositivos divulgados en el presente documento pueden usarse por separado o conjuntamente en cualquier combinación, para cualquier método divulgado en el presente documento solo o en cualquier combinación.

Breve descripción de los dibujos

Las características novedosas de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención por referencia a la siguiente descripción detallada que establece ejemplos ilustrativos, en los que se utilizan los principios de la invención y los dibujos adjuntos de los cuales:

La Figura 1 muestra una vista lateral de una centrífuga.

La Figura 2 muestra una vista frontal de una centrífuga.

La Figura 3 muestra una vista en perspectiva de la parte trasera de una centrífuga.

La Figura 4 muestra una vista superior de una punta de muestra.

La Figura 5 muestra una vista lateral de una punta de muestra.

La Figura 6 muestra una vista en sección transversal de una punta de muestra.

La Figura 7 muestra un diagrama de una punta de muestra colocada en una muestra encima de una interfaz de plasma/célula empaquetada.

La Figura 8 muestra un gráfico del tiempo de centrifugación en función de revoluciones por minuto.

La Figura 9 muestra un gráfico del tiempo de centrifugación en función del radio del rotor de la centrífuga.

La Figura 10 muestra una punta de muestra tapada vacía.

La Figura 11 muestra una punta de muestra tapada que contiene una muestra de un fluido corporal, por ejemplo, sangre.

La Figura 12 muestra una punta de muestra tapada que contiene una muestra de sangre con un hematocrito de aproximadamente un 23 % después de la centrifugación.

La Figura 13 muestra una punta de muestra tapada que contiene una muestra de aproximadamente un 31 % de sangre con hematocrito después de la centrifugación.

La Figura 14 muestra una punta de muestra tapada que contiene una muestra de aproximadamente 40 % de sangre con hematocrito después de la centrifugación.

La Figura 15 muestra una punta de muestra tapada que contiene una muestra de aproximadamente 52 % de sangre con hematocrito después de la centrifugación.

La Figura 16 muestra una punta de muestra tapada que contiene una muestra de sangre con hematocrito al 68 % después de la centrifugación.

La Figura 17 muestra una comparación del hematocrito medido usando un sistema de imagen digital de una muestra centrifugada ("hematocrito, % reportado") y el hematocrito medido por un aparato de microhematocrito estándar ("hematocrito, % objetivo")

La Figura 18 muestra un diagrama de una punta usada para reacciones y una punta usada para sangre/plasma (las dimensiones se muestran en mm).

La Figura 19 muestra un capilar cilíndrico que contiene una muestra.

La Figura 20 muestra ángulos y dimensiones para calcular volúmenes dentro de un contenedor cónico, por ejemplo, un capilar.

La Figura 21 muestra ángulos y dimensiones para calcular volúmenes dentro de un contenedor cónico, por ejemplo, un capilar.

La Figura 22 muestra ángulos y dimensiones para calcular el volumen de un casquete esférico.

La Figura 23 muestra las dimensiones para calcular el volumen de una muestra contenida dentro de una punta cilíndrica, donde la muestra tiene un solo menisco.

La Figura 24 muestra las dimensiones para calcular el volumen de una muestra contenida dentro de una punta cilíndrica, donde la muestra tiene dos meniscos.

La Figura 25 muestra las dimensiones para calcular el volumen de una muestra contenida dentro y/o asociada con una punta cilíndrica, donde la muestra tiene dos meniscos y uno de los cuales es externo a la punta cilíndrica.

La Figura 26 muestra las dimensiones para calcular el volumen de una muestra contenida dentro de una punta cilíndrica, donde hay una burbuja en la muestra.

La Figura 27 muestra las dimensiones para calcular el volumen de una muestra contenida dentro de una punta cilíndrica, donde hay una burbuja en la muestra que abarca el ancho de la punta cilíndrica.

La Figura 28 muestra las dimensiones para calcular el volumen de una muestra contenida dentro y/o asociada con una punta cilíndrica, donde la muestra incluye una gota colgante de muestra fuera de la punta cilíndrica. La Figura 29 muestra las dimensiones para calcular el volumen de una muestra residual contenida dentro de una punta cilíndrica.

La Figura 30 muestra una muestra de sangre dentro de una punta antes de mezclarla con un reactivo magnético. La Figura 31 muestra una muestra de sangre que se mezcla con un reactivo magnético.

La Figura 32 muestra una muestra de sangre mezclada con un reactivo magnético.

La Figura 33 muestra una muestra de sangre mezclada con un reactivo magnético contenido dentro de una punta.

La Figura 34 muestra una muestra de sangre mezclada con un reactivo magnético movido a una posición seleccionada dentro de una punta.

La Figura 35 muestra una fuerza magnética aplicada por un imán (M) a una muestra de sangre mezclada con un reactivo magnético.

La Figura 36 muestra una muestra de sangre que se ha separado en un componente de glóbulos rojos y un componente de plasma usando fuerza magnética.

La Figura 37 muestra un pocillo colocado debajo de una punta que contiene una muestra de sangre que se ha separado en un componente de glóbulos rojos y un componente de plasma.

La Figura 38 muestra una representación de plasma sanguíneo que se transfiere desde una punta a un pocillo. La Figura 39 muestra una punta después de dispensar plasma sanguíneo a un pocillo.

La Figura 40 muestra una imagen de alto contraste de una punta cilíndrica que contiene un líquido con baja absorbancia.

La Figura 41 muestra una imagen de una punta cónica que contiene un líquido con alta absorbancia.

La Figura 42 muestra una punta con un líquido de alta absorbancia que muestra dos meniscos dentro de la punta.

La Figura 43 muestra una punta con una muestra de líquido y grandes burbujas que abarcan el diámetro de la punta.

La Figura 44 muestra una punta que contiene agua que muestra un menisco superior claro en una punta transparente o capilar.

La Figura 45 muestra un gráfico de la concentración de Proteína C calculada en función del volumen de la muestra.

La Figura 46 muestra una imagen de un dispositivo de transferencia de muestras con capilar, carcasa, émbolo, ranura y característica elevada. La característica elevada puede ayudar a ubicar el émbolo en la carcasa.

La Figura 47 muestra una muestra contenida con el capilar de un dispositivo de transferencia de muestras. La Figura 48 muestra un dispositivo de transferencia de muestras después de que una muestra ha sido expulsada por un émbolo.

La Figura 49 muestra un dispositivo de transferencia de muestras después de que una muestra se ha expulsado de forma incompleta.

La Figura 50 muestra una punta cónica que contiene una muestra, con la posición L3 indicada por la flecha mostrada.

La Figura 51 muestra un gráfico de la relación de la distancia entre L2 y L1 y la distancia entre L3 y L1 en función del volumen de la muestra.

La Figura 52 muestra un esquema de una reacción química que produce un producto coloreado.

La Figura 53 muestra un esquema de una reacción química que produce un producto coloreado a partir del colesterol.

La Figura 54 muestra un esquema de una reacción química que usa equivalentes reductores para producir un producto coloreado.

La Figura 55 muestra un ejemplo de un compuesto que cambia de color al formarse un complejo con un ion metálico.

La Figura 56 muestra una serie de imágenes de puntas con una concentración de albúmina que disminuye al doble de derecha a izquierda, excepto la punta más a la izquierda, que no tiene albúmina.

La Figura 57 muestra una serie de imágenes de puntas con una concentración de colesterol que disminuye al doble de derecha a izquierda, excepto la punta más a la izquierda, que no tiene colesterol.

La Figura 58 muestra una serie de pocillos hemisféricos maquinados a partir de un bloque de plástico blanco opaco, cada pocillo tiene una concentración de analito decreciente al doble de derecha a izquierda, excepto el pocillo más a la izquierda, que no tiene analito. En algunas modalidades, el analito puede ser calcio.

La Figura 59 muestra una serie de pocillos hemisféricos maquinados a partir de un bloque de plástico blanco opaco, cada pocillo tiene una concentración de analito decreciente al doble de derecha a izquierda, excepto el pocillo más a la izquierda, que no tiene analito. En algunas modalidades, el analito puede ser magnesio.

La Figura 60 muestra una serie de pocillos hemisféricos maquinados a partir de un bloque de plástico blanco opaco, cada pocillo tiene una concentración de analito decreciente al doble de derecha a izquierda, excepto el pocillo más a la izquierda, que no tiene analito. En algunas modalidades, el analito puede ser urea.

La Figura 61 muestra una serie de puntas que contienen soluciones de azul de bromofenol.

La Figura 62 es una ilustración de puntas que tienen una pluralidad de longitudes de trayectoria óptica distintas.

La Figura 63 muestra una trayectoria de luz a través de una cubeta rectangular.

La Figura 64 muestra una trayectoria de luz a través

un pocillo de microtitulación.

La Figura 65 muestra una trayectoria de luz a través de una cubeta de forma cónica.

La Figura 66 muestra un gráfico de la intensidad de la luz en función de la ubicación medida en puntas que contienen muestras con una concentración variable de soluciones de azul de bromofenol para los canales de color rojo, verde y azul.

La Figura 67 muestra una imagen de las puntas que se analizaron en la Figura 66.

La Figura 68 muestra un gráfico de la señal en función de la concentración de azul de bromofenol medida por los canales de color rojo, verde y azul. La densidad óptica puede medirse a 589 nm.

La Figura 69 muestra un gráfico a escala logarítmica de la respuesta de la señal en función de la concentración de azul de bromofenol medida por los canales de color azul (diamantes) y rojo (cuadrados).

La Figura 70 muestra un gráfico de concentración medida por análisis de color de imágenes digitales como una función de concentración real.

La Figura 71 muestra un gráfico de la respuesta de la señal medida por los canales de color rojo (cuadrados), verde (diamantes) y azul (triángulos) en función de la concentración de albúmina.

La Figura 72 muestra tres gráficos de respuesta de señal medida para canales de color verde, rojo y azul para partículas de látex de poliestireno.

La Figura 73 muestra puntas que contienen por separado los reactivos NADH, WST-1, PMS y dos puntas que contienen una mezcla de los reactivos.

La Figura 74 muestra una imagen digital de puntas que contienen una concentración decreciente de dos veces de lactato deshidrogenasa (LDH) de izquierda a derecha.

La Figura 75 muestra un gráfico de densidad óptica medida a 450 nm en función de LDH.

La Figura 76 muestra soluciones de cloruro de potasio añadidas a tiras de ensayo de potasio.

La Figura 77 muestra puntas que contienen muestras de sangre mezcladas con reactivos de tipificación sanguínea para Anti-A, Anti-B, Anti-D y Control (de izquierda a derecha).

La Figura 78 muestra las señales medidas para la señal en función de la posición del rojo (columna izquierda), verde (columna central) y azul (columna derecha) para muestras mezcladas con reactivos Anti-A, Anti B, Anti-D y Control.

La Figura 79 muestra la señal normalizada en función de la concentración relativa medida para longitudes de trayectoria angostas y anchas usando canales de color rojo, verde y azul.

La Figura 80 muestra un gráfico de logaritmo de la concentración medida en función de la concentración real, que ilustra la precisión del algoritmo de medición.

La Figura 81 muestra una imagen de fluorescencia de productos de ensayo en tubos.

La Figura 82 muestra una imagen de productos de reacción en puntas.

La Figura 83 muestra una imagen de productos de reacción en puntas.

La Figura 84 muestra una imagen de productos de reacción en puntas.

La Figura 85 muestra una imagen de productos de reacción en puntas.

La Figura 86 muestra una imagen de productos de reacción en puntas.

La Figura 87 muestra una imagen de los productos de reacción en puntas.

La Figura 88 muestra una imagen de color de fondo obtenida para la calibración.

La Figura 89 muestra una imagen de fluorescencia de los productos de reacción en puntas.

La Figura 90 muestra la respuesta del canal de color rojo y azul y la respuesta de fluorescencia en función del número de copias de ADN.

La Figura 91 muestra el gráfico de la señal de 3 colores transformada en función de la señal de fluorescencia. La Figura 92 muestra un gráfico de la respuesta de la señal del canal verde en función de la posición del píxel.

La Figura 93 muestra una imagen de puntas que contienen soluciones de azul de bromofenol y agua.

La Figura 94 muestra una imagen de puntas adicionales que pueden contener soluciones de azul de bromofenol y agua.

La Figura 95 muestra un esquema de una punta que contiene mezclas de reacción para realizar múltiples ensayos.

La Figura 96 muestra una imagen de puntas que contienen soluciones de azul de bromofenol y agua.

La Figura 97 muestra un gráfico de respuesta de señal para muestra, agua y control en múltiples estándares. Las muestras pueden ser calibradores acuosos que contienen concentraciones conocidas de analito.

La Figura 98 muestra puntas que contienen ensayos para Ca2+ (región superior de la punta) y Mg2+ (región inferior de la punta).

La Figura 99 muestra cuatro puntas con varios tipos de muestras de suero: hemolizado (de color rojizo), lipémico (gris), ictérico (de color amarillo) y normal (de izquierda a derecha).

La Figura 100 muestra un esquema de una cámara y componentes ópticos.

La Figura 101 muestra una vista en sección transversal de una cámara y componentes ópticos que incluyen una fuente de luz blanca, una apertura y un sensor.

La Figura 102 muestra un esquema de una configuración óptica para medir la señal de luz usando (A) un sensor que está posicionado para detectar luz en un ángulo perpendicular a un haz de excitación, y (B) un sensor que está posicionado en línea con un haz de excitación.

La Figura 103 muestra imágenes tomadas usando (A) un rayo de excitación perpendicular a un sensor y (B) un rayo de excitación que está en línea con un sensor.

La Figura 104 muestra una matriz de colorantes impresos que pueden usarse para calibrar la configuración óptica.

La Figura 105 muestra un gráfico de la señal en función del volumen de la muestra. Las series 1-5 pueden corresponder a diferentes concentraciones de analito, como 0, 20, 40, 60 y 80 respectivamente.

La Figura 106 muestra un gráfico de la señal en función del volumen de la muestra. Las series 1-5 pueden corresponder a diferentes concentraciones de analito, como 0, 20, 40, 60 y 80 respectivamente.

La Figura 107 muestra un gráfico de la señal en función del volumen de la muestra. Las series 1-5 pueden corresponder a diferentes concentraciones de analito, como 0, 20, 40, 60 y 80 respectivamente.

La Figura 108 muestra un gráfico de la concentración de analito medida en función de la concentración de analito real.

La Figura 109 muestra un gráfico de la concentración de analito medida en función de la concentración de analito real.

La Figura 110 ilustra esquemáticamente un método ilustrativo para un ensayo ELISA.

La Figura 111 muestra un ejemplo de un rotor en reposo con cubos verticales.

La Figura 112 muestra un ejemplo de un rotor a una velocidad con cubos en un ángulo pequeño con respecto a la horizontal.

La Figura 113 muestra un ejemplo de una configuración de cubo.

La Figura 114 muestra un ejemplo de un recipiente de centrifugación acoplado con el cubo.

La Figura 115 muestra un ejemplo de otro recipiente de centrifugación que puede acoplarse al cubo.

La Figura 116 muestra un ejemplo de un recipiente de centrifugación.

La Figura 117 muestra un ejemplo de una punta de extracción.

La Figura 118 proporciona un ejemplo de cómo el recipiente de centrifugación y la punta de extracción pueden coincidir.

La Figura 119 es una imagen que se tomó de la mezcla de reacción original antes de la centrifugación.

La Figura 120 es otra imagen que se tomó de la mezcla de reacción original antes de la centrifugación.

La Figura 121 es una imagen adicional que se tomó de la mezcla de reacción original antes de la centrifugación. La Figura 122 muestra los resultados como la distancia de la interfaz del menisco plasmático.

La Figura 123 proporciona un ejemplo de una micrografía de fluorescencia que muestra leucocitos marcados. La Figura 124 proporciona un ejemplo de patrones intracelulares usando imágenes de campo oscuro.

La Figura 125 proporciona un ejemplo de adquisición de múltiples parámetros de datos de muestras de células marcadas.

La Figura 126 proporciona un ejemplo de imágenes de campo claro de sangre humana completa.

La Figura 127 proporciona un ejemplo de adquisición y análisis de datos multiparamétricos cuantitativos.

La Figura 128 muestra la variación en la distribución de la luz.

La Figura 129 muestra datos de cinco ensayos.

La Figura 130 muestra un parámetro trazado frente a la concentración del analito, así como gráficos relacionados con la exactitud, precisión y concentración predicha.

La Figura 131 muestra imágenes recolectadas por una cámara digital.

La Figura 132 ilustra ejemplos de imágenes tomadas del producto de reacción.

La Figura 133 proporciona ejemplos de imágenes que se analizaron antes de girar en la centrífuga y después de girar en la centrífuga.

La Figura 134 ilustra ejemplos de imágenes tomadas del producto de reacción.

La Figura 135 ilustra los espectros de varias muestras de suero.

La Figura 136 lustra un ejemplo de proceso de detección de la invención usando una matriz.

La Figura 137 ilustra un ejemplo de proceso de detección de la invención usando perlas.

La Figura 138 ilustra un ejemplo de proceso de detección de la invención usando aptámeros marcados.

La Figura 139 ilustra la detección de la unión del aptámero a una sonda complementaria.

La Figura 140 ilustra la ausencia de unión entre el aptámero y una sonda no complementaria.

La Figura 141 ilustra la especificidad de unión de aptámeros en una matriz.

La Figura 142 muestra una vista más detallada de la detección de analitos en una matriz.

La Figura 143 muestra una matriz de ejemplo.

La Figura 144 muestra un gráfico de quimioluminiscencia frente a concentración para un ensayo de vitamina D. La Figura 145 muestra un gráfico de quimioluminiscencia frente a concentración para un ensayo de estradiol. La Figura 146 muestra una medición espectrofotométrica de la concentración de WBC.

La Figura 147 muestra gráficos de turbidez en función del tiempo.

La Figura 148 es un gráfico de puntos de inflexión para tres experimentos a 800 copias/uL y 80 copias/uL.

La Figura 149 es un gráfico de un ejemplo en donde se usan perlas magnéticas para el análisis de proteínas y moléculas pequeñas mediante ensayos ELISA.

La Figura 150 es un gráfico de un ejemplo en donde se usan perlas magnéticas para el análisis de proteínas y moléculas pequeñas mediante ensayos ELISA.

Descripción detallada de la invención

Aunque se han mostrado y descrito en la presente ejemplos preferidos de la invención, será obvio para los expertos en la técnica que tales ejemplos se proporcionan sólo a modo de ejemplo. Ahora se les ocurrirán numerosas variaciones, cambios y sustituciones a los expertos en la técnica sin apartarse de la invención. Debe entenderse que varias alternativas a los ejemplos de la invención descritos en la presente pueden ser empleadas en la práctica de la invención.

Se divulgan aplicaciones móviles para el sistema y los métodos para la maximización del uso de la muestra. Varios aspectos de la invención descrita en el presente documento pueden aplicarse a cualquiera de las aplicaciones particulares expuestas a continuación o para cualquier otro tipo de aplicaciones diagnósticas o terapéuticas. La invención puede aplicarse como un sistema o método autónomo, o como parte de una aplicación integrada preclínica, clínica, de laboratorio o médica. Se entenderá que diferentes aspectos de la invención pueden apreciarse individualmente, colectivamente o en combinación entre sí.

Los dispositivos y sistemas en la presente descripción pueden proporcionar un medio eficaz para la detección en tiempo real de analitos presentes en un fluido corporal de un sujeto. Los métodos de detección pueden usarse en una amplia variedad de circunstancias, incluida la identificación y cuantificación de analitos que están asociados con procesos biológicos específicos, condiciones fisiológicas, trastornos o etapas de trastornos. Como tales, los sistemas tienen un amplio espectro de utilidad en, por ejemplo, tamizaje de fármacos, diagnóstico de enfermedades, clasificación filogenética, identificación parental y forense, aparición y recurrencia de enfermedades, respuesta de los individuos al tratamiento frente a bases de población y/o el monitoreo de la terapia. Los dispositivos y sistemas del sujeto también son especialmente útiles para avanzar en la fase preclínica y clínica del desarrollo de terapias, mejorar el cumplimiento de los pacientes, controlar las reacciones adversas asociadas a un medicamento recetado, desarrollar una medicina individualizada, externalizar los análisis de sangre del laboratorio central al domicilio o por prescripción médica, y/o controlar los agentes terapéuticos tras su aprobación reglamentaria. Los dispositivos y el sistema del sujeto pueden utilizarse por los pagadores que subcontratan los análisis de sangre de un laboratorio central. Los dispositivos y sistemas pueden proporcionar un sistema flexible para la medicina personalizada. Mediante el uso del mismo sistema, un dispositivo puede cambiarse o intercambiarse junto con un protocolo o instrucciones a un procesador programable de los sistemas para realizar una amplia variedad de ensayos como se describen. Los sistemas y dispositivos descritos en el presente documento, aunque son mucho más pequeños y/o portátiles, incorporan características novedosas y ofrecen muchas funciones de un instrumento de laboratorio.

En un aspecto, un sistema comprende un dispositivo que comprende unidades de ensayo y unidades de reactivo, que incluyen reactivos, por ejemplo, reactivos en fase líquida y/o sólida. En algunos ejemplos, al menos uno del dispositivo completo, una unidad de ensayo, una unidad de reactivos o una de sus combinaciones es desechable. En un sistema de la invención, la detección de un analito con el dispositivo del sujeto es típicamente automatizada. Dicha automatización puede realizarse mediante un protocolo incorporado o un protocolo proporcionado al sistema por el fabricante.

Los dispositivos y sistemas que se describen en la presente pueden ofrecer muchas características que no están disponibles en los sistemas de POC existentes o en los sistemas de análisis integrados. Por ejemplo, muchos cartuchos de POC se basan en un sistema o lazo de fluidos cerrado para manejar pequeños volúmenes de líquido de manera eficiente. Los dispositivos fluídicos tales como cartuchos descritos en el presente documento pueden tener un movimiento de fluido abierto entre unidades dentro de un cartucho dado. Por ejemplo, un reactivo puede almacenarse en una unidad, una muestra almacenarse en una unidad de recogida de muestras, un diluyente almacenarse en una unidad de diluyente, y la superficie de captura puede estar en una unidad de ensayo, donde en un estado de cartucho, ninguna de las unidades está en comunicación fluida con ninguna de las otras unidades. Las unidades pueden ser móviles entre sí para poner algunas unidades en comunicación fluida mediante un dispositivo de transferencia de fluidos del sistema. Por ejemplo, un dispositivo de transferencia de fluidos puede comprender un cabezal que se acopla a una unidad de ensayo y pone la unidad de ensayo en comunicación continua con una unidad de reactivos. En algunos casos, el cabezal es un cabezal de pipeta que mueve la unidad de ensayo (por ejemplo, la punta) en comunicación fluida con una unidad de reactivo.

Se divulga un método para detectar y/o medir la concentración de un analito en una muestra de tejido o fluido corporal, el método generalmente comprende los pasos de proporcionar una muestra (por ejemplo, sangre, orina, saliva, tejido) a un dispositivo o sistema de la invención, permitiendo que la muestra reaccione dentro de al menos una unidad de ensayo del dispositivo, y detectando la señal detectable generada a partir del analito en la muestra de sangre.

Un aspecto de la invención proporciona el análisis de muestras usando un dispositivo de punto de atención que está configurado para maximizar la utilización de la muestra. Por ejemplo, pueden realizarse más de aproximadamente 15, 25, 50, 75 o 100 ensayos en una muestra que tenga un volumen de menos de aproximadamente 1, 20, 50, 100 o 500 |jl. La muestra puede ser una muestra de sangre extraída de un pinchazo en el dedo. La muestra puede recolectarse en un capilar o punta sellable. La muestra puede prepararse para uno o más ensayos sometiendo la muestra a un proceso de separación (por ejemplo, centrifugación) y/o dilución. Uno o más ensayos pueden prepararse combinando la muestra, que puede haber sido separada y diluida, con uno o más reactivos en una cámara de reacción. La cámara de reacción puede ser una punta de pipeta, un vial, un dispositivo de transferencia de muestras y/o una cubeta. Uno o más ensayos pueden configurarse de manera que pueda medirse una señal óptica que sea indicativa de la concentración de uno o más analitos en la muestra. La cámara de reacción puede contener una pluralidad de ensayos, que pueden estar separados espacialmente. Puede generarse una pluralidad de señales ópticas dentro de una única cámara de reacción de un ensayo, o de una pluralidad de ensayos separados espacialmente. Una o más señales ópticas pueden medirse mediante una cámara de formación de imágenes digitales que puede medir una pluralidad de regiones espectrales de detección o bandas de detección, por ejemplo, rojo, verde y azul. La señal óptica puede medirse en el producto de reacción del ensayo en la cámara de reacción, que puede ser una punta de pipeta u otros contenedores de muestra. Los sistemas, dispositivos y métodos pueden ser completamente automatizados o semiautomatizados mediante lógica programable.

Otro aspecto de la invención proporciona sistemas, dispositivos y métodos para preparar muestras para análisis. Las muestras pueden prepararse para su análisis mediante uno o más dispositivos de separación. Por ejemplo, puede prepararse una muestra para su análisis mediante centrifugación dentro de una centrífuga. También pueden implementarse otras separaciones basadas en carga, tamaño, hidrofobicidad/hidrofobicidad y/o volatilidad.

Un aspecto de la invención proporciona el análisis de muestras y productos de reacción usando análisis basado en imágenes. El sistema puede incluir una cámara que puede medir una señal óptica usando una o más regiones del espectro de detección. Por ejemplo, una cámara puede medir una señal óptica usando regiones del espectro de detección rojo, verde y azul. La señal medida puede incluir tres valores medidos que pueden interpretarse usando uno o más algoritmos descritos en el presente documento. El uso de más de una región del espectro de detección puede aumentar el intervalo dinámico de un ensayo y puede aumentar la precisión de una medición en comparación con las mediciones que usan una única región del espectro de detección.

La invención también proporciona sistemas, dispositivos y métodos para realizar mediciones ópticas en muestras y productos de reacción de ensayos que están contenidos dentro de las cámaras de reacción, cada uno con una pluralidad de longitudes de trayectoria distintas. Las cámaras de reacción pueden tener una pluralidad de longitudes de trayectoria distintas de modo que se observe una cantidad mayor o menor de absorbancia de luz. La pluralidad de trayectorias distintas (como, por ejemplo, a través de la muestra y/o la cámara de reacción) permite un aumento en el intervalo dinámico de un protocolo de ensayo seleccionado. La imagen de la cámara de reacción puede analizarse como se describe en el presente documento para obtener información sobre la muestra o los productos de reacción del ensayo. La combinación de utilizar la pluralidad de longitudes de trayectoria disponibles dentro de una única cámara de reacción y el uso de regiones de espectro de detección de tres canales mejora enormemente el intervalo dinámico de un ensayo dado.

Un sistema para realizar la preparación y el análisis de muestras puede incluir instrumentación, componentes desechables y reactivos. El sistema puede aceptar muestras y realiza automáticamente una pluralidad de ensayos sin la intervención del usuario. Cuando se desee, la instrumentación puede incluir una interfaz gráfica de usuario, un mecanismo de introducción de cartuchos, que puede ser desechable, una platina motorizada, que puede tener movilidad en tres dimensiones, uno o más dispositivos de manipulación de líquidos de un solo cabezal, uno o más dispositivos de manipulación de líquidos de múltiples cabezales, uno o más dispositivos para realizar la preparación de muestras, sensores ópticos, que pueden incluir un PMT y/o un dispositivo de formación de imágenes, controladores de temperatura y dispositivos de comunicación. El componente desechable puede incluir un cartucho desechable que contiene puntas de muestra, sellos de puntas y reactivos. En algunos ejemplos, el cartucho desechable también puede contener ensambles neutralizantes configurados para absorber y neutralizar productos de ensayo líquidos.

La instrumentación, los componentes desechables y los reactivos pueden almacenarse en un entorno que pueda cerrarse, como una caja o un armario. En algunos ejemplos, la caja tiene un área de sección transversal menor de aproximadamente 4 m2, 2 m2, 1 m2, 0,5 m2, 0,1 m2, 0,05 m2 o menos. La invención proporciona un sistema de prueba distribuido, como un dispositivo de punto de atención, que puede incluir uno o más de los siguientes aspectos:

1. Separación eficiente (centrífuga) de sangre y recuperación del plasma separado

2. Dilución de la muestra de plasma a uno o más niveles (por ejemplo 1:10, 1:100, 1:1000) para que cada ensayo pueda realizarse con una dilución óptima

3. Distribución optimizada de la muestra a varios ensayos diferentes que pueden involucrar varias metodologías diferentes

4. Protocolos de ensayo óptimos

5. Uso de cubetas de sección circular de extremo abierto para análisis de muestras, mezcla con reactivos, incubación y presentación a sistemas ópticos

6. Análisis de ensayos usando tecnología de imágenes (escaneo y/o fotografía y/o microscopía)

En un ejemplo, el dispositivo de la invención está contenido y comprende todos los reactivos, reactivos en fase líquida y sólida, necesarios para realizar una pluralidad de ensayos en paralelo. Cuando se desea, el dispositivo se configura para realizar al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 o más ensayos. Además, pueden incorporarse uno o más ensayos de control en el dispositivo para realizarlos en paralelo si se desea. También pueden proporcionarse calibradores para la calibración del sistema de ensayo. Algunos ejemplos de controles y calibradores secos útiles para la calibración del sistema de ensayo pueden incluir soluciones acuosas de analitos, suero o muestras de plasma con niveles conocidos de analitos; cantidades conocidas de dichos calibradores y controles también pueden secarse mediante liofilización, secado al vacío y otros procesos de fabricación (y disuelto durante el ensayo).

Al incorporar estos componentes dentro de un sistema de punto de atención, un paciente o usuario puede tener una pluralidad de analitos, por ejemplo más de aproximadamente 10, 20, 30, 50, 75, 100, 150 o 200 analitos, cuantificados en menos de aproximadamente 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 60, 120, 180, 240, 480 o 600 minutos. Los dispositivos y sistemas del sujeto pueden usarse para realizar inmunoensayos cuantitativos, que pueden completarse en un corto período de tiempo. Puede realizarse otro tipo de ensayo con un dispositivo de la invención que incluye, pero no se limita a, mediciones de secuencias de ácidos nucleicos y mediciones de metabolitos, tales como el colesterol o electrolitos, como los iones magnesio y cloruro. En algunos ejemplos, el ensayo se completa en no más de una hora, preferentemente, menos de 120, 60, 30, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 minuto. En otros ejemplos, el ensayo se realiza en menos de 5 minutos. La duración de la detección del ensayo puede ajustarse de acuerdo con el tipo de ensayo que se va a llevar a cabo con un dispositivo de la invención. Por ejemplo, si es necesario para una mayor sensibilidad, un ensayo puede incubarse durante más de una hora o hasta más de un día. En algunos ejemplos, los ensayos que requieren una larga duración pueden ser más prácticos en otras aplicaciones de POC, tal como el uso doméstico, que en un entorno de POC clínico.

Las unidades de reactivo de un dispositivo del sujeto pueden configurarse para que sean un conjunto de componentes de mezclar y combinar. Una unidad de reactivos almacena típicamente los reactivos líquidos o sólidos necesarios para realizar un ensayo que detecta un analito determinado. Las unidades de ensayo pueden a veces (u opcionalmente no siempre) comprender al menos una superficie de captura capaz de reaccionar con un analito de la muestra de fluido corporal. La unidad de ensayo puede ser una punta tubular con una superficie de captura dentro de la punta. En el presente documento se describen ejemplos de puntas de la invención. Cada unidad de ensayo individual y de reactivos puede configurarse para la función de ensayo de forma independiente. Para ensamblar un dispositivo, las unidades pueden ensamblarse de manera justo a tiempo para su uso en un dispositivo integrado, que puede tomar el formato de cartucho.

Una carcasa para un dispositivo de la invención puede estar hecha de un material polimérico, un material metálico o un material compuesto, como, por ejemplo, aluminio, poliestireno u otro plástico moldeable o mecanizable, y puede tener lugares definidos para colocar las unidades de ensayo y las unidades de reactivos. La carcasa puede incluir un metal o cualquier otro material. La carcasa puede encerrar parcial o totalmente las unidades de ensayo y/o las unidades de reactivos. La carcasa puede soportar el peso de las unidades de ensayo y/o las unidades de reactivos. La carcasa puede tener medios para secar puntas o unidades de ensayo para eliminar el exceso de líquido. Los medios para secar pueden ser una membrana porosa, tal como acetato de celulosa, o un pedazo de material absorbente, tal como papel de filtro.

Al menos uno de los componentes del dispositivo puede estar construido con materiales poliméricos. Ejemplos no limitantes de materiales poliméricos incluyen el poliestireno, el policarbonato, el polipropileno, los polidimetilsiloxanos (PDMS), el poliuretano, el policloruro de vinilo (PVC), la polisulfona, el polimetilmetacrilato (PMMA), el acrilonitrilobutadieno-estireno (ABS) y el vidrio.

El dispositivo o los subcomponentes del dispositivo pueden fabricarse mediante una variedad de métodos lo que incluye, sin limitación, estampado, moldeo por inyección, grabado, fundición, moldeo por soplado, mecanizado, soldadura, soldadura ultrasónica y unión térmica. Por ejemplo, el dispositivo se fabrica mediante moldeo por inyección, unión térmica y soldadura ultrasónica. Los subcomponentes del dispositivo pueden fijarse entre sí mediante unión térmica, soldadura por ultrasonidos, ajuste por fricción (ajuste a presión), adhesivos o, en el caso de ciertos sustratos, por ejemplo, vidrio, o sustratos poliméricos semirrígidos y no rígidos, una adherencia natural entre los dos componentes.

Un sistema como el descrito puede ejecutar una variedad de ensayos, independientemente del analito que se detecta en una muestra de fluido corporal. Un protocolo que depende de la identidad del dispositivo puede transferirse desde un dispositivo externo donde puede almacenarse en un ensamble de lector para permitir que el ensamble de lector lleve a cabo el protocolo específico en el dispositivo. El dispositivo puede tener un identificador (ID) que es detectado o leído por un detector de identificadores descrito en la presente. El identificador puede permitir la comunicación bidireccional entre el dispositivo y un sensor o sistema de recepción. El detector de identificador puede comunicarse con un ensamble de comunicación a través de un controlador que transmite el identificador a un dispositivo externo. Cuando se desea, el dispositivo externo envía un protocolo almacenado en el dispositivo externo al ensamble de comunicación basado en el identificador. El protocolo que se ejecutará en el sistema puede comprender instrucciones para el controlador del sistema para realizar el protocolo, lo que incluye, pero no se limita a, un ensayo particular a ejecutar y un método de detección a realizar. Una vez que el sistema realiza el ensayo, se genera una señal indicativa de un analito en la muestra de fluido corporal y se detecta mediante un ensamble de detección del sistema. La señal detectada puede entonces comunicarse al ensamble de comunicaciones, donde puede transmitirse al dispositivo externo para su procesamiento, incluyendo, sin limitación, el cálculo de la concentración de analito en la muestra.

Los sistemas, dispositivos y métodos para realizar análisis de muestras usando dispositivos y puntas en el punto de atención que pueden funcionar como cámaras de reacción se describen en la publicación de patente de Estados Unidos núm. 2009/0088336 y la solicitud provisional de Estados Unidos núm. 60/997,460.

Cámaras de Reacción y Manipulación de Muestras

Las muestras, los reactivos y el ensamble de ensayos descritos en el presente documento pueden manipularse y contenerse mediante una variedad de tipos de cámaras de reacción. Un dispositivo de manipulación de muestras y una cámara de reacción pueden ser un pocillo, un tubo o una punta abierta, que también puede ser una cubeta. Como se usa en el presente documento, una punta también puede denominarse punta de muestra, punta de cubeta, cámara de reacción, cubeta, capilar, dispositivo de manipulación de muestras o dispositivo de transferencia de muestras. Las muestras pueden recolectarse de una fuente en una punta o un tubo. Las puntas pueden estar selladas. Dichos sellos pueden ser permanentes o reversibles. Las muestras diluidas pueden combinarse con uno o más reactivos y mezclarse (como se describe en aplicaciones anteriores) dentro de "elementos de ensayo" como puntas (cubetas abiertas) o pocillos abiertos o cubiertos. Una vez que el ensayo está listo para la lectura, el elemento del ensayo puede presentarse al sistema óptico para el análisis de imágenes u otros tipos de lectura. Alternativamente, las mezclas de reacción de ensayo pueden transferirse de un tipo de elemento a otro. Por ejemplo, los ensayos incubados en las puntas pueden ser absorbidos en un medio absorbente o biblia o los ensayos incubados en los pocillos pueden ser aspirados en las puntas. Muchos ensayos pueden procesarse en paralelo. La lectura del ensayo puede ser en serie o simultánea dependiendo del protocolo del ensayo y/o el tiempo de incubación. Para ensayos que implican la medición de una tasa de cambio, el elemento de ensayo puede presentarse al sistema óptico más de una vez en diferentes momentos.

Dispositivos de Transferencia De Fluidos y Materiales

Un dispositivo de transferencia de fluidos puede formar parte de un sistema. El dispositivo de transferencia de fluidos puede comprender una pluralidad de cabezales. Se prevé cualquier número de cabezales que sea necesario para detectar una pluralidad de analitos en una muestra para un dispositivo de transferencia de fluidos de la invención. En un ejemplo, un dispositivo de transferencia de fluidos tiene aproximadamente ocho cabezales montados en línea y separados por una distancia. En un ejemplo, los cabezales tienen una boquilla cónica que se acopla por ajuste a presión con una variedad de puntas, tales como unidades de ensayo o unidades de recolección de muestras como se describe en el presente documento. Las puntas pueden tener un elemento que permite que el instrumento las retire automáticamente y las coloque en una carcasa de un dispositivo como se describe después de su uso. En un ejemplo, las puntas de ensayo son claras y transparentes y pueden ser similares a una cubeta dentro de la cual se realiza un ensayo que puede ser detectado por un detector óptico como un tubo fotomultiplicador o un sensor de cámara.

En un ejemplo, un procesador programable (por ejemplo, una unidad central de procesamiento, CPU) de un sistema puede comprender o estar configurado para aceptar (como, por ejemplo, desde una ubicación de memoria) instrucciones o comandos y puede operar un dispositivo de transferencia de fluido de acuerdo con las instrucciones para transferir muestras de líquido, ya sea retirando (para atraer líquido) o extendiendo (para expulsar líquido) un pistón en un espacio de aire cerrado. El procesador puede configurarse para facilitar la aspiración y/o dispensación. Tanto el volumen de aire movido como la velocidad de movimiento pueden controlarse con precisión, por ejemplo, mediante el procesador programable.

La mezcla de muestras (o reactivos) con diluyentes (u otros reactivos) puede lograrse al aspirar los componentes para ser mezclados en un tubo común y después aspirar repetidamente una fracción significativa del volumen de líquido combinado hacia arriba y hacia abajo en una punta. La disolución de los reactivos secos en un tubo puede realizarse de manera similar. La incubación de muestras líquidas y reactivos con una superficie de captura sobre la que se une un reactivo de captura (por ejemplo, un anticuerpo) puede lograrse al extraer el líquido apropiado en la punta y mantenerlo allí durante un tiempo predeterminado. La extracción de muestras y reactivos puede lograrse al expulsar el líquido hacia un depósito o una almohadilla absorbente en un dispositivo como se describe. A continuación, puede extraerse otro reactivo en la punta de acuerdo con las instrucciones o el protocolo del procesador programable.

Un sistema puede comprender un soporte o acoplador para mover las unidades o puntas de ensayo. Un acoplador puede comprender un ensamble de vacío o un ensamble diseñado para ajustar de manera ceñida en una protuberancia de la punta de una unidad de ensayo. Por ejemplo, un medio para mover las puntas puede moverse de manera similar a los cabezales del dispositivo de transferencia de fluidos. El dispositivo también puede moverse sobre una base de acuerdo con la posición de un acoplador o sujetador.

En un ejemplo, un instrumento para mover las puntas es el mismo que un instrumento para mover un volumen de muestra, como un dispositivo de transferencia de fluidos como se describe en el presente documento. Por ejemplo, puede colocarse una punta de recolección de muestras en un cabezal de pipeta de acuerdo con la protuberancia de la punta de recolección. La punta de recolección puede usarse a continuación para distribuir el líquido por todo el dispositivo y el sistema. Después de distribuir el líquido, la punta de recolección puede ser dispuesta, y el cabezal de la pipeta puede ser ajustado en una unidad de ensayo de acuerdo con el jefe de la unidad de ensayo. A continuación, la punta de la unidad de ensayo puede moverse de la unidad de reactivos a otra unidad de reactivo, y los reactivos pueden distribuirse a la unidad de ensayo de acuerdo con la acción de tipo aspiración o pipeta proporcionada por el cabezal de la pipeta. El cabezal de la pipeta también puede realizar la mezcla dentro de una punta de recolección, unidad de ensayo o unidad de reactivos mediante una acción de tipo aspiración o jeringa. En otro ejemplo, las puntas que contienen líquidos que incluyen mezclas de reacción de ensayo pueden desconectarse del dispositivo de pipeteo y "estacionarse" en ubicaciones específicas dentro del instrumento o dentro de una unidad desechable. Si es necesario, las puntas pueden taparse con un sello (como el que se usa en la centrífuga) para evitar que los líquidos se escurran. En algunas modalidades, el sello puede ser un sello de vinilo. Puntas de Muestra Ilustrativas

Pueden utilizarse una variedad de formas de contenedor como puntas de muestra, cámaras de reacción y cubetas. Por ejemplo, una cubeta puede ser circular, cilíndrica, cuadrada, rectangular, cúbica, cónica, piramidal o de cualquier otra forma capaz de contener una muestra de fluido. Pueden emplearse cubetas rectangulares donde un haz de luz incide en ángulo recto con las superficies de la cubeta, como se muestra en las vistas en planta y en sección de la Figura 63. En tales cubetas rectangulares, la muestra de líquido que se ilumina también es rectangular y está definida por la cubeta. También pueden usarse cubetas con secciones transversales circulares. Por ejemplo, algunos tipos de placas de microtitulación donde el volumen de muestra iluminado está definido en parte por el menisco de muestra, como se muestra a continuación en la vista en planta y en sección de la Figura 64.

Pueden usarse cubetas de paso variable para optimizar y ampliar la respuesta del ensayo y minimizar el volumen de muestra necesario para medir el ensayo. Las cubetas pueden ser más largas en relación con su sección transversal en al menos una región. En algunos casos, la longitud de la trayectoria de una cubeta puede seleccionarse en función de la geometría y/o el material de la cubeta. Pueden seleccionarse diferentes cubetas para diferentes ensayos.

En la presente invención, una versión preferida de la cubeta de ensayo tiene una sección transversal circular en la dirección del haz de luz como se muestra en la Figura 65. El uso de una cubeta con una sección transversal circular tiene varias ventajas, que incluyen, entre otras, las siguientes:

1. La longitud de la trayectoria óptica puede definirse con precisión. Se ha encontrado que la precisión dimensional de las piezas moldeadas por inyección es mejor que 1-2 % CV. En las placas de microtitulación convencionales, el menisco líquido no restringido puede introducir imprecisión en la longitud de la trayectoria.

2. El carácter abierto y la sección circular de las puntas confieren excelentes características de manejo de fluidos, lo que hace que la aspiración de líquidos sea muy precisa.

3. La imagen óptica de las puntas permite identificar la ubicación de la punta y los límites de la columna de líquido y ubicar con mucha precisión el centro de la punta donde la señal es máxima.

4. Puede incubarse y analizarse más de una muestra líquida en la misma punta. Esto se debe a que en la parte estrecha de la punta, se produce muy poca transferencia de material (en la dirección axial) entre "porciones" de líquido adyacentes.

Una punta ilustrativa puede tener las siguientes características generales:

Longitud de la punta: 0,5 - 4 cm

Diámetro exterior de la punta: 0,2 -1,0 cm

ID de la punta: 0,1 - 0,5 cm

Capacidad de la punta para líquidos: 5 - 50 uL

Precisión dimensional de la punta: generalmente mejor que 2 % o /- 0,001 cm

Configuración de la punta: la punta generalmente tendrá una característica que se acopla con una pipeta (cilíndrica) para formar un sello hermético a los fluidos. Hay una región generalmente cilíndrica o cónica que se usa para la formación de imágenes. Generalmente, la parte óptica de la punta tendrá al menos dos secciones diferentes con diferentes longitudes de trayectoria. El extremo inferior de la punta será típicamente estrecho para ayudar a retener las columnas de líquido verticales bajo gravedad

Material de la punta: Plástico transparente o uniformemente especular (poliestireno, polipropileno, etc.) (transmisión de luz en lo visible > 80 %)

Para fines de obtención de imágenes, la punta generalmente puede ser transparente o translúcida, pero no es necesario que las puntas sean transparentes para que funcionen bien como cubetas de ensayo cuando se usa un análisis de tres colores. Las cubetas con puntas que parecen "turbias" pueden funcionar de manera similar a las puntas transparentes. Las puntas turbias se fabrican en moldes de inyección con superficies texturizadas o no pulidas o agregando algún material de dispersión de luz al plástico usado para fabricar las puntas. La intensidad de dispersión de la luz de tales puntas turbias puede elegirse para que no sea tan grande como para oscurecer el líquido coloreado que se va a medir. En general, el impacto de la dispersión de la luz sobre la luz transmitida puede seleccionarse para que sea inferior al 10 (20 y 30 %) en relación con el impacto del material coloreado. El efecto de dispersión de la luz puede seleccionarse de manera que la dispersión de la luz de las puntas turbias sea uniforme. Las puntas y cámaras de reacción descritas en el presente documento pueden comprender un eje cilíndrico (o cónico) de aproximadamente 2 cm de longitud y que tiene un diámetro interior de aproximadamente 1-5 mm correspondiente a una capacidad de aproximadamente 10-50 uL.

En un ejemplo, en el extremo superior del cilindro hay un "saliente" cilíndrico truncado conectado de manera fluida al cilindro y adaptado para poder acoplarse con la característica ahusada de una pipeta. El extremo inferior de la punta puede estrecharse para proporcionar una característica que permita que la punta mantenga su contenido líquido cuando está orientada verticalmente y no está unida al pipeteador. La punta puede ser puntiaguda. La forma externa del extremo inferior de la punta es típicamente también algo puntiaguda con el diámetro que se reduce desde la parte principal del eje cilíndrico hacia el extremo para poder ser sellado de manera fluida con una tapa flexible (de vinilo) en la que el extremo de la punta se ajusta a presión. Las puntas suelen estar hechas de plástico moldeado (poliestireno, polipropileno y similares). Las puntas pueden ser claras o translúcidas, de modo que pueda obtenerse información sobre la muestra mediante imágenes.

La Figura 4, la Figura 5 y la Figura 6 muestran un ejemplo de una punta. La punta está configurada con (1) una característica superior que puede acoplarse para formar un sello hermético con un cabezal de pipeta, (2) un eje básicamente cilíndrico (en realidad cónico con un ángulo de tiro muy leve) y una punta inferior estrecha y puntiaguda. Esta punta puede formar un sello hermético con una tapa. La forma puntiaguda ayuda a lograr un buen ajuste con la tapa con una fuerza moderada. El material usado es poliestireno moldeado por inyección. Las dimensiones totales son: 32 mm de largo, aproximadamente 7,6 mm de diámetro exterior más grande, capacidad útil de aproximadamente 20 uL. Las dimensiones de la punta pueden escalarse a un volumen mayor. Por ejemplo, para una muestra de 50 uL, las ID pueden aumentarse en aproximadamente 1,6 veces.

El sellado puede lograrse usando una tapa hecha de vinilo u otros materiales que se ajusta fácilmente a presión en el extremo estrecho de los medios de contención de la muestra usando la fuerza generada por el movimiento de la platina del instrumento en la dirección z. Una burbuja de aire puede quedar atrapada dentro de la punta cuando la punta está tapada. Puede usarse un paso de centrifugación para llevar la burbuja a la parte superior de la columna de sangre para eliminar los efectos de la burbuja. Las dimensiones de la punta y/o las dimensiones del soporte de la punta en una centrífuga pueden combinarse de modo que pueda asegurarse una punta para centrifugación.

Preparación de la muestra

La invención proporciona sistemas, métodos y dispositivos para el procesamiento y análisis de muestras que pueden recolectarse de una variedad de fuentes. Por ejemplo, la muestra puede recolectarse de pacientes, animales o el medio ambiente. La muestra puede ser un fluido corporal. Cualquier fluido corporal que se sospeche que contiene un analito de interés puede usarse junto con el sistema o dispositivos de la invención. Los fluidos corporales comúnmente empleados incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, saliva, orina, fluido gástrico y digestivo, lágrimas, heces, semen, fluido vaginal, fluidos intersticiales derivados de tejido tumoral y fluido cerebroespinal.

En algunas modalidades, el fluido corporal es una muestra de sangre de un paciente humano. La fuente de sangre puede extraerse de un pinchazo en el dedo y tiene un volumen de menos de aproximadamente 0,5, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500 o 1000 uL.

Puede extraerse un fluido corporal de un paciente y proporcionarlo a un dispositivo de diversas formas, lo que incluye, pero no se limita a, punción, inyección o pipeteo.

Como se usa en el presente documento, los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un vertebrado, preferentemente, un mamífero, con mayor preferencia, un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, murinos, simios, humanos, animales de granja, animales deportivos y mascotas.

En una modalidad, una lanceta perfora la piel y extrae una muestra mediante el uso de, por ejemplo, gravedad, acción capilar, aspiración o fuerza de vacío. La lanceta puede ser parte del dispositivo, o parte de un sistema, o un componente independiente. Cuando sea necesario, la lanceta puede activarse mediante una variedad de mecanismos de activación mecánicos, eléctricos, electromecánicos o cualquier otro mecanismo de activación conocido o cualquier combinación de tales métodos. En otra modalidad en donde no se requiere un mecanismo activo, un paciente puede simplemente proporcionar un fluido corporal al dispositivo, como podría producirse, por ejemplo, con una muestra de saliva. El fluido recolectado puede colocarse en la unidad de recolección de muestras dentro del dispositivo. En aún otra modalidad, el dispositivo comprende al menos una microaguja que perfora la piel. El volumen de fluido corporal que se usará con un dispositivo puede ser menos de aproximadamente 500 microlitros, típicamente, entre aproximadamente 1 a 100 microlitros. Cuando se desee, puede usarse una muestra de 1 a 50 microlitros, 1 a 40 microlitros, 1 a 30 microlitros, 1 a 10 microlitros o incluso 1 a 3 microlitros para detectar un analito mediante el uso del dispositivo. En una modalidad, el volumen de fluido corporal usado para detectar un analito mediante el uso de los dispositivos o sistemas del sujeto es una gota de fluido. Por ejemplo, una gota de sangre de un dedo pinchado puede proporcionar la muestra de fluido corporal a analizar con un dispositivo, sistema o método descrito en el presente documento.

Puede recolectarse una muestra de fluido corporal de un sujeto directamente en una punta de la descrita en el presente documento, o puede transferirse posteriormente a una punta.

Dilución de la Muestra

En algunos casos, la configuración del procesador para dirigir la transferencia de fluidos realiza un grado de dilución de la muestra de fluido corporal en la matriz de unidades de ensayo para llevar las señales indicativas de la pluralidad de analitos que se detectan dentro de un intervalo detectable, de manera que dicha pluralidad de los analitos es detectable con dicho sistema. En un ejemplo, la muestra de fluido corporal comprende al menos dos analitos que están presentes en concentraciones que difieren en al menos 1, 2, 5, 10, 15, 50, 100, 500, 1000, 10 000, 105, 106, 107, 108, 109, o 1010 veces. En un ejemplo, la muestra de fluido corporal es una sola gota de sangre. En una modalidad, las concentraciones de al menos dos analitos presentes en una muestra difieren hasta en 10 órdenes de magnitud (por ejemplo, un primer analito está presente a 0,1 pg/mL y un segundo analito está presente a 500 ug/mL). En otro ejemplo, algunos analitos de proteínas se encuentran en concentraciones superiores a 100 mg/mL, lo que puede extender el intervalo de interés a aproximadamente doce órdenes de magnitud. En el caso de la medición de analitos de ácido nucleico, como el ADN y el ARN, usando métodos de amplificación exponencial, como la reacción de la polimerasa, el número de copias del analito puede aumentarse mil millones de veces antes de la medición.

Si se desea, un grado de dilución de la muestra de fluido corporal puede hacer que las señales indicativas de los al menos dos analitos estén dentro del intervalo detectable.

Como se describe, los sistemas y dispositivos en el presente documento pueden permitir muchas características de la flexibilidad de un entorno de laboratorio en un entorno de POC. Por ejemplo, las muestras pueden recolectarse y manipularse automáticamente en un dispositivo o sistema de tamaño de mesa o más pequeño. Un problema común en los dispositivos de POC es lograr diferentes intervalos de dilución cuando se realizan una pluralidad de ensayos, en donde los ensayos pueden tener una sensibilidad o especificidad significativamente diferente. Por ejemplo, puede haber dos analitos en una muestra, pero un analito tiene una concentración alta en la muestra y el otro analito tiene una concentración muy baja. Como se proporciona, los sistemas y dispositivos en el presente documento pueden diluir la muestra a niveles significativamente diferentes para detectar ambos analitos. Alternativamente, una muestra puede dividirse en dos o más muestras, lo que puede permitir la detección de analitos individuales a varios niveles de dilución.

Por ejemplo, si el analito se encuentra en una concentración alta, una muestra puede diluirse en serie hasta el intervalo de detección apropiado y proporcionarse a una superficie de captura para su detección. En el mismo sistema o dispositivo, es posible que no sea necesario diluir una muestra con un analito en baja concentración. De esta manera, el intervalo de ensayo de los dispositivos y sistemas de POC proporcionados en el presente documento puede ampliarse a partir de muchos de los dispositivos de POC actuales.

En los sistemas de ensayo POC que usan cartuchos desechables que contienen el diluyente, existe frecuentemente un límite práctico para el grado de dilución. Por ejemplo, si una pequeña muestra de sangre que se obtiene por punción digital (por ejemplo, unos 20 microlitros) se va a diluir, y el volumen máximo de diluyente que puede colocarse en un tubo es de 250 microlitros, el límite práctico de dilución de toda la muestra es de aproximadamente 10 veces. En un ejemplo en el presente documento, un sistema puede aspirar un volumen más pequeño de la muestra (por ejemplo, aproximadamente 2 microlitros) lo que hace que el factor de dilución máximo sea aproximadamente 100 veces. Para muchos ensayos, dichos factores de dilución son aceptables, pero para un ensayo como el de CRP (como se describe en los ejemplos en el presente documento) es necesario diluir mucho más la muestra. Los ensayos ELISA basados en separación pueden tener una limitación intrínseca en la capacidad de la superficie de captura para unirse al analito (por ejemplo, aproximadamente unos pocos cientos de ng/mL para un analito proteico típico). Algunos analitos están presentes en la sangre a cientos de microgramos/ml. Incluso cuando se diluye 100 veces, la concentración de analito puede estar fuera del intervalo de calibración. En una modalidad de ejemplo de un sistema, dispositivo y dispositivo de transferencia de fluidos en el presente documento, pueden lograrse múltiples diluciones al realizar múltiples transferencias de fluidos del diluyente hacia una unidad de ensayo individual o unidad de recolección de muestras. Por ejemplo, si la concentración de un analito es muy alta en una muestra cómo se describió anteriormente, la muestra puede diluirse varias veces hasta que la concentración del analito esté dentro de un intervalo de detección aceptable. Los sistemas y métodos en el presente documento pueden proporcionar mediciones o estimaciones precisas de las diluciones para calcular la concentración original del analito.

Separación de Muestras

En algunas modalidades de la invención, puede prepararse una muestra para su análisis mediante un paso de separación inicial. Por ejemplo, si el ensayo es para analizar ADN, puede emplearse un paso de separación de ADN para eliminar o reducir contaminantes o material fuente no deseado. El paso de separación puede utilizar cromatografía, centrifugación, extracción líquido-líquido, extracción sólido-líquido, unión por afinidad o cualquier otro mecanismo conocido por un experto en la técnica.

En algunas modalidades, una muestra de sangre a analizar se procesa primero separando el componente de plasma de la muestra de sangre. Este paso puede realizarse usando una variedad de técnicas, como filtración, centrifugación y unión por afinidad. La centrifugación puede ser un método eficaz para la separación de componentes de muestras de sangre y puede emplearse en la presente invención.

Separación de plasma

La sangre puede introducirse en una punta cerrada o sellable de diversas formas, por ejemplo, las muestras pueden proporcionarse en un tubo y una punta sellable puede recibir la muestra del tubo mediante acción capilar o mediante fuerza neumática. Un medio de introducción preferido es el uso de acción capilar. Alternativamente, el contenedor usado para contener la muestra para la separación centrífuga puede configurarse con una sola abertura como en una centrífuga convencional.

La punta, una vez llena de sangre, puede moverse automáticamente a una ubicación en un cartucho desechable donde hay un elemento de sellado. El elemento de sellado puede ser una pequeña "copa" hecha de un material deformable (flexible) (vinilo, silicona o similar) conformado para encajar en el extremo inferior de la punta y sellarlo. El instrumento presiona la punta en el sello formando así una unión hermética a los líquidos. Luego, la punta sellada se mueve a una pequeña centrífuga (generalmente ubicada dentro y forma parte del instrumento) y se ajusta a presión en una función de posicionamiento en el rotor de la centrífuga de modo que el extremo inferior (sellado) de la punta se asiente a un soporte rígido que apoyará la punta durante el paso de centrifugación.

El rotor de la centrífuga puede ser circular y tener aproximadamente 10 cm de diámetro. La masa de la punta que contiene sangre es (1) pequeña en relación con el rotor o (2), cuando se desee, equilibrada por un contrapeso ubicado en la parte opuesta del rotor de modo que se minimice cualquier vibración durante el paso de centrifugación. Una orientación ilustrativa del rotor de la centrífuga es vertical (eje de rotación horizontal). El rotor está montado en un eje de transmisión impulsado por un motor eléctrico.

La centrifugación puede lograrse girando el rotor a aproximadamente 15000 rpm durante 5 minutos. Durante este proceso, los elementos particulares de la sangre (glóbulos rojos y glóbulos blancos) sedimentan en el extremo sellado de la punta y forman una columna compacta con plasma libre de células separado en la parte de la punta distal del sello.

La punta que contiene la muestra separada puede colocarse luego verticalmente en una ubicación accesible a un dispositivo de manejo de fluidos compuesto por una punta de pipeta estrecha ("punta de adquisición de muestras") montada en un dispositivo de pipeteo montado a su vez en una platina x-y-z.

El plasma ahora puede recuperarse de manera eficiente de la muestra centrifugada. Esto se logra moviendo la punta de adquisición de muestras verticalmente a lo largo del eje de la punta de la centrífuga para que entre en contacto fluido con el plasma y pueda extraer el plasma hacia arriba usando, por ejemplo, medios neumáticos.

Opcionalmente, esta operación puede monitorearse usando una cámara u otro dispositivo de formación de imágenes que puede usarse tanto para medir el hematocrito de la muestra como para proporcionar información sobre la ubicación del límite de plasma/glóbulos rojos al controlador de platina/pipeta. Con la ayuda de la formación de imágenes de la sangre separada, una punta de pipeta estrecha acoplada a una pipeta se mueve lentamente verticalmente hacia abajo, de modo que la punta se dirige axialmente hacia abajo del medio de contención de la muestra hasta que entra en contacto con el plasma. Luego, la punta se mueve más hasta que está cerca (dentro de menos de aproximadamente 3, 2, 1, 0,5 o 0,1 mm) de la interfaz de la célula empaquetada. Al mismo tiempo, el plasma se aspira en la punta de pipeta estrecha bajo el control del ordenador. El plasma puede aspirarse simultáneamente mientras se mueve la punta de pipeta estrecha hacia la columna de plasma para que el plasma no se desplace hacia la parte superior del medio de contención de la muestra. La aspiración puede controlarse para evitar que se aspire aire durante el paso de extracción de plasma.

En general, puede usarse una punta de pipeta con un extremo muy estrecho, como las que se utilizan para aplicar muestras a un sistema de electroforesis, para aspirar el plasma de la punta de muestra centrifugada. La punta estrecha es típicamente cónica o ahusada y tiene dimensiones de 1 - 3 x 0,1 - 0,5 cm (longitud x diámetro) y está hecha de una variedad de materiales (polipropileno, poliestireno, etc.). El material puede ser transparente o traslúcido en lo visible. Un extremo de la punta se acopla con un dispositivo de pipeteo. El otro es muy estrecho (0,05 - 0,5 mm de diámetro exterior) de modo que puede moverse hacia la punta de la muestra sin tocar la superficie interna de la punta de la muestra. Incluso si hay contacto entre la punta de aspiración de plasma y la punta de muestra, la aspiración de plasma no se ve obstaculizada.

En la Figura 7 se muestra un esquema del proceso de aspiración de plasma en la etapa en donde la punta de aspiración de plasma se encuentra justo encima de la interfaz plasma-célula empaquetada durante el paso de aspiración.

De esta manera, hemos descubierto que casi todo el plasma puede eliminarse dejando tan solo, como por ejemplo, 1 uL en la punta de la muestra centrifugada. Esto corresponde a aproximadamente 11 uL de plasma (recuperación del 90 %) de 20 uL de sangre con un hematocrito del 40 %. Además, la calidad de la muestra de plasma (con respecto a hemólisis, lipemia e icteria) puede determinarse a partir de una imagen de la muestra centrifugada.

El plasma aspirado puede moverse a otras ubicaciones para diluirlo y mezclarlo con reactivos de ensayo, de modo que puedan realizarse ensayos para la industria de analitos, pero sin limitarse a, metabolitos, electrolitos, biomarcadores de proteínas, fármacos y ácidos nucleicos.

Separación de glóbulos blancos

Otro uso de la invención es aislar y concentrar los glóbulos blancos de la sangre. En un aspecto de la invención, la muestra de sangre se somete primero a un proceso que lisa los glóbulos rojos (y opcionalmente fija los glóbulos blancos) agregando un reactivo (por ejemplo, BD Pharmlyse™ 555899 o BD FA^c S™ Lysing Solution 349202)_a la sangre y la mezcla. Después de una breve incubación, la muestra lisada se somete a centrifugación como se describe anteriormente, de modo que los glóbulos blancos se concentran en el extremo sellado de la punta de sangre. La solución de glóbulos rojos lisada puede eliminarse por aspiración. La recuperación de los glóbulos blancos se logra mediante (1) la adición de una pequeña cantidad de una solución tampón y la aspiración repetida hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender las células, seguido de su desplazamiento a un receptáculo o (2) la eliminación del sello y el desplazamiento hacia abajo de las células empaquetadas en un recipiente usando presión de aire.

Un esquema alternativo permite la recuperación de glóbulos blancos sin lisis de los glóbulos rojos. Tras la centrifugación de la sangre (como es bien sabido), los glóbulos blancos forman una capa sobre los glóbulos rojos empaquetados conocida como Capa Leucocítica. Después de la eliminación de la mayor parte del plasma (como se ha indicado anteriormente), los glóbulos blancos pueden recuperarse de manera eficiente (1) agregando opcionalmente un pequeño volumen (por ejemplo, aproximadamente 5 uL) de tampón isotónico, o (2) usando el plasma residual y volviendo a suspender los glóbulos blancos mediante aspiración repetida y/o agitación mecánica usando la punta de adquisición de muestras. Una vez suspendida, la mezcla resultante de glóbulos blancos junto con una pequeña proporción de glóbulos rojos también re-suspendidos puede adquirirse por aspiración para el análisis de los glóbulos blancos. De esta manera, la mayoría de los glóbulos blancos (generalmente todos) pueden recuperarse con solo una pequeña cantidad (contaminante) de glóbulos rojos (generalmente menos del 5 % del original).

Centrífugas

La Figura 1, la Figura 2 y la Figura 3 muestran perspectivas a escala de una centrífuga (Figura 1 - vista lateral, Figura 2 - vista frontal, Figura 3 - vista posterior) que puede integrarse en el sistema. La centrífuga puede contener un motor eléctrico capaz de hacer girar el rotor a 15000 rpm. Un tipo de rotor de centrífuga tiene la forma de una paleta de ventilador montada en el eje del motor en un plano vertical. Fijado al rotor hay un elemento que sostiene los medios de sujeción de la muestra (punta) y proporciona un saliente o soporte en el que descansa el extremo de la punta distal al eje del motor y que proporciona soporte durante la centrifugación para que la muestra no pueda escapar. La punta puede estar soportada además en su extremo proximal por un tope mecánico en el rotor. Esto puede proporcionarse para que la fuerza generada durante la centrifugación no haga que la punta corte la tapa de vinilo suave. La punta puede insertarse y quitarse mediante mecanismos estándar de recoger y colocar, pero preferentemente con una pipeta. El rotor es una sola pieza de acrílico (u otro material) con forma para minimizar la vibración y el ruido durante el funcionamiento de la centrífuga. El rotor tiene (opcionalmente) una forma de modo que cuando se orienta en ángulos particulares a la vertical, otros componentes móviles en el instrumento pueden moverse más allá de la centrífuga. Los medios de sujeción de la muestra están equilibrados centrífugamente por contrapesos en el lado opuesto del rotor, de manera que el centro de inercia rotacional es axial con respecto al motor. El motor de la centrífuga puede proporcionar datos de posición a un ordenador que luego puede controlar la posición de reposo del rotor (típicamente vertical antes y después de la centrifugación).

Como puede verse en los dos gráficos de la Figura 8 y la Figura 9, para minimizar el tiempo de centrifugación (sin generar demasiada tensión mecánica durante la centrifugación) de acuerdo con las normas estándar publicadas (DIN 58933-1; para Estados Unidos, la norma CLSI H07-A3 "Procedure for Determining Packed Cell Volume by the Microhematocrit Method"; Estándar aprobado - Tercera edición) las dimensiones convenientes para el rotor están en el intervalo de aproximadamente 5 - 10 cm girando a aproximadamente 10 - 20 mil rpm, lo que da un tiempo para empacar los glóbulos rojos de aproximadamente 5 minutos.

A continuación se muestra una ecuación ilustrativa para calcular la fuerza de centrifugación:

Donde:

g es la aceleración gravitacional de la Tierra,

r es el radio de rotación,

N es la velocidad de rotación, medida en revoluciones por unidad de tiempo.

Donde:

T cm es el radio de rotación medido en centímetros (cm),

Nrpm es la velocidad de rotación medida en revoluciones por minuto (RPM).

RCF = 1,118 x l<r5rc„JVfPM

En algunos ejemplos, una centrífuga puede ser una centrífuga orientada horizontalmente con un diseño de cubo oscilante. En algunos ejemplos preferibles, el eje de rotación de la centrífuga es vertical. En ejemplos alternativos, el eje de rotación puede ser horizontal o en cualquier ángulo. La centrífuga puede ser capaz de girar simultáneamente dos o más recipientes y puede diseñarse para integrarse completamente en un sistema automatizado que emplee pipetas controladas por ordenador. En algunos ejemplos, los recipientes pueden tener el fondo cerrado. El diseño del cubo oscilante puede permitir que los recipientes de centrifugación se orienten pasivamente en una posición vertical cuando estén detenidos y giren en un ángulo fijo cuando giren. En algunos ejemplos, los cubos oscilantes pueden permitir que los recipientes de centrifugación giren hacia una orientación horizontal. Alternativamente, pueden girar en cualquier ángulo entre una posición vertical y horizontal (por ejemplo, aproximadamente a 15, 30, 45, 60 o 75 grados desde la vertical). La centrífuga con diseño de cubo oscilante puede cumplir con los requisitos de precisión posicional y repetibilidad de un sistema robótico donde se emplean varios sistemas de posicionamiento. Un sistema de control basado en ordenador puede usar información de posición de un codificador óptico para hacer girar el rotor a velocidades lentas controladas. Debido a que se podría diseñar un motor apropiado para un rendimiento de alta velocidad, no es necesario mantener posiciones estáticas precisas usando solo la retroalimentación de posición. En algunos ejemplos, puede emplearse una leva en combinación con una palanca accionada por solenoide para lograr una parada muy precisa y estable en un número fijo de posiciones. Mediante un sistema de control independiente y la retroalimentación de los sensores de efecto Hall integrados en el motor, la velocidad del rotor puede controlarse con mucha precisión a altas velocidades.

Debido a que varios instrumentos sensibles deben funcionar simultáneamente dentro del sistema de instrumentos de ensayo, el diseño de la centrífuga preferiblemente minimiza o reduce la vibración. El rotor puede tener un diseño aerodinámico con un exterior liso, que encierra completamente los cubos cuando están en su posición horizontal. Además, la amortiguación de vibraciones puede emplearse en múltiples ubicaciones en el diseño de la carcasa. Rotor

Un rotor de centrífuga puede ser un componente del sistema que puede contener y hacer girar los recipientes de centrifugación. El eje de rotación puede ser vertical y, por lo tanto, el propio rotor puede colocarse horizontalmente. Sin embargo, en ejemplos alternativos, pueden emplearse diferentes ejes de rotación y posiciones del rotor. Hay dos componentes conocidos como cubos colocados simétricamente a cada lado del rotor que sostienen los recipientes de centrifugación. Son posibles configuraciones alternativas en las que los cubos están orientados con simetría radial, por ejemplo, tres cubos orientados a 120 grados. Puede proporcionarse cualquier número de cubos, incluidos, entre otros, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más cubos. Los cubos pueden espaciarse uniformemente entre sí. Por ejemplo, si se proporcionan n cubos donde n es un número entero, entonces los cubos pueden estar espaciados unos 360/n grados entre sí. En otros ejemplos, los cubos no necesitan estar espaciados uniformemente entre sí o con simetría radial.

Cuando el rotor está parado, estos cubos, influenciados por la gravedad, pueden caer pasivamente de modo que coloquen los recipientes verticalmente y los hagan accesibles a la pipeta. La Figura 111 muestra un ejemplo de un rotor en reposo con cubos verticales. En algunos ejemplos, los cubos pueden caer pasivamente a un ángulo predeterminado que puede ser vertical o no. Cuando el rotor gira, los cubos son forzados a una posición casi horizontal o a un ángulo predeterminado por fuerzas centrífugas. La Figura 112 muestra un ejemplo de un rotor a una velocidad con cubos en un ángulo pequeño con respecto a la horizontal. Puede haber paradas físicas fuertes para las posiciones vertical y horizontal que actúan para hacer cumplir su precisión y repetibilidad posicional.

El rotor puede diseñarse aerodinámicamente con forma de disco y la menor cantidad posible de características físicas para minimizar la vibración causada por la turbulencia del aire. Para lograr esto, la geometría exterior del cubo puede coincidir exactamente con la del rotor, de modo que cuando el rotor está girando y el cubo puede forzarse a horizontal, el cubo y el rotor pueden alinearse perfectamente.

Para facilitar la extracción de plasma, el rotor puede inclinarse hacia el suelo en relación con el horizonte. Debido a que el ángulo del cubo puede coincidir con el del rotor, esto puede imponer un ángulo de giro fijo para el cubo. El sedimento resultante de tal configuración podría inclinarse con respecto al recipiente cuando se coloca en posición vertical. Puede usarse una punta de extracción estrecha para aspirar plasma de la parte superior del recipiente de centrifugación. Al colocar la punta de extracción cerca de la parte inferior de la pendiente creada por el sedimento angular, el volumen final de plasma puede extraerse de manera más eficiente sin alterar la sensible capa leucocítica. Pueden acomodarse una variedad de diseños de tubos en los cubos del dispositivo. En algunos ejemplos, los distintos diseños de tubos pueden tener extremos cerrados. Algunos tienen la forma de tubos de centrífuga convencionales con fondos cónicos. Otros diseños de tubos pueden ser cilíndricos. Los tubos con una baja relación entre la altura y el área de la sección transversal pueden ser preferidos para el procesamiento celular. Los tubos con una relación grande (>10:1) pueden ser adecuados para la medición precisa del hematocrito y otros requisitos de imagen. Sin embargo, puede emplearse cualquier relación entre la altura y el área de la sección transversal. Los cubos pueden estar hechos de cualquiera de varios plásticos (poliestireno, polipropileno) o cualquier otro material discutido en otra parte del presente documento. Los cubos tienen capacidades que van desde unos pocos microlitros hasta aproximadamente un mililitro. Los tubos pueden insertarse y retirarse de la centrífuga mediante un mecanismo de "recoger y colocar".

Sistema de control

Debido a los requisitos de giro y posicionamiento del dispositivo centrífugo, puede usarse un enfoque de sistema de control dual. Para indexar el rotor a orientaciones de rotación específicas, puede implementarse un sistema de control basado en la posición. En algunos ejemplos, el sistema de control puede emplear un sistema de control PID (Proporcional Integral Derivativo). Pueden emplearse otros sistemas de control de retroalimentación conocidos en la técnica. La retroalimentación de posición para el controlador de posición puede ser proporcionada por un codificador óptico de alta resolución. Para operar la centrífuga a velocidades bajas a altas, puede implementarse un controlador de velocidad, mientras se emplea un sistema de control PID ajustado para control de velocidad. La retroalimentación de la tasa de rotación para el controlador de velocidad puede ser proporcionada por un conjunto de sensores de efecto Hall simples colocados en el eje del motor. Cada sensor puede generar una onda cuadrada en un ciclo por rotación del eje del motor.

Mecanismo de Parada

Para colocar de manera consistente y firme el rotor en una posición particular, puede emplearse un mecanismo de parada física. En un ejemplo, el mecanismo de parada puede usar una leva, acoplada al rotor, junto con una palanca accionada por solenoide. La leva puede tener la forma de un disco circular con una serie de muescas en forma de "C" mecanizadas alrededor del perímetro. Para colocar el rotor de la centrífuga, primero puede reducirse su velocidad de rotación a, como máximo, 30 RPM. En otros ejemplos, la velocidad de rotación puede reducirse a cualquier otra cantidad, incluyendo, pero sin limitarse a, aproximadamente 5 rpm, 10 rpm, 15 rpm, 20 rpm, 25 rpm, 35 rpm, 40 rpm o 50 rpm. Una vez que la velocidad es lo suficientemente lenta, puede accionarse la palanca. En el extremo de la palanca hay un seguidor de leva que puede deslizarse a lo largo del perímetro de la leva con una fricción mínima. Una vez que el seguidor de leva alcanza el centro de una muesca particular en la leva, la fuerza de la palanca accionada por solenoide puede superar la del motor y el rotor puede detenerse. En ese punto, el motor puede frenarse electrónicamente y, en combinación con el mecanismo de parada, puede mantener una posición de rotación con mucha precisión y firmeza de forma indefinida.

Cubos de centrífuga

Los cubos oscilantes de la centrífuga pueden configurarse para adaptarse a diferentes tipos de tubos de centrífuga. En ejemplos preferentes, los diversos tipos de tubos pueden tener un collar o brida en su extremo superior (abierto). Esta característica de collar o brida puede descansar en el extremo superior del cubo y soportar el tubo durante la centrifugación. Como se muestra en las Figuras 113, 114 y 115, pueden acomodarse tubos cónicos y cilíndricos de varias longitudes y volúmenes. Las Figuras 113, 114 y 115 proporcionan ejemplos de cubos y pueden emplearse otros diseños de cubos. Por ejemplo, la Figura 113 muestra un ejemplo de una configuración de cubo. El cubo puede tener partes laterales que se acoplan a la centrífuga y permiten que el cubo se mueva libremente. El cubo puede tener un fondo cerrado y una abertura en la parte superior. La Figura 114 muestra un ejemplo de un recipiente de centrifugación acoplado con el cubo. Como se mencionó anteriormente, el cubo puede tener una forma que acepte varias configuraciones de recipientes de centrifugación. El recipiente de centrifugación puede tener uno o más elementos sobresalientes que pueden descansar sobre el cubo. El recipiente de centrifugación puede tener una forma con una o más características que pueden coincidir con el cubo de centrifugación. La característica puede ser una característica de forma del recipiente o una o más protuberancias. La Figura 115 muestra un ejemplo de otro recipiente de centrifugación que puede acoplarse al cubo. Como se describió anteriormente, el cubo puede tener una o más características de forma que pueden permitir que diferentes configuraciones de recipientes de centrifugación se acoplen con el cubo.

Tubos de centrífuga y medios de extracción de muestras:

El tubo de centrífuga y la punta de extracción pueden proporcionarse individualmente y pueden acoplarse para la extracción de material después de la centrifugación. El tubo de centrifugación y la punta de extracción pueden diseñarse para hacer frente a procesos complejos en un sistema automatizado. La Figura 116 muestra un ejemplo de un recipiente de centrifugación. La Figura 117 muestra un ejemplo de una punta de extracción. La Figura 118 proporciona un ejemplo de cómo el recipiente de centrifugación y la punta de extracción pueden coincidir. Cualquier dimensión se proporciona a modo de ejemplo únicamente, y pueden utilizarse otras dimensiones de proporciones iguales o diferentes.

El sistema puede habilitar uno o más de los siguientes:

1. Procesamiento rápido de pequeñas muestras de sangre (típicamente de 5 - 50 uL)

2. Medición exacta y precisa del hematocrito

3. Eliminación eficiente de plasma

4. Re-suspensión eficiente de los elementos formados (glóbulos rojos y blancos)

5. Concentración de glóbulos blancos (después del marcaje con anticuerpos fluorescentes y fijación más lisis de glóbulos rojos)

6. Confirmación óptica de lisis de glóbulos rojos y recuperación de glóbulos blancos

Descripción general del recipiente de centrifugación y la punta de extracción

Puede usarse un recipiente y una punta personalizados para el funcionamiento de la centrífuga con el fin de satisfacer la variedad de restricciones impuestas al sistema. El recipiente de centrifugación puede ser un tubo de fondo cerrado diseñado para girar en la centrífuga. En algunas modalidades, el recipiente de centrifugación puede ser el recipiente ilustrado en la Figura 116 o puede tener una o más características ilustradas en la Figura 116. Puede tener una serie de características únicas que permiten la amplia gama de funciones requeridas, incluida la medición del hematocrito, la lisis de glóbulos rojos, la re-suspensión de sedimentos y la extracción de plasma eficiente. La punta de extracción puede diseñarse para insertarse en el recipiente de centrifugación para una extracción precisa del fluido y la re-suspensión del sedimento. En algunas modalidades, la punta de extracción puede ser la punta ilustrada en la Figura 117 o puede tener una o más características ilustradas en la Figura 117. En el presente documento se describen especificaciones ilustrativas para cada punta.

Recipiente de Centrifugación

El recipiente de centrifugación puede diseñarse para manejar dos escenarios de uso separados, cada uno asociado con un anticoagulante diferente y un volumen de sangre completa.

Un primer escenario de uso puede requerir que se sedimenten 40 uL de sangre completa con heparina, se recupere el volumen máximo de plasma y se mida el hematocrito mediante visión por ordenador. En el caso de un hematocrito del 60 % o menos, el volumen de plasma requerido o preferible puede ser de aproximadamente 40 uL*40 %=16 uL. En algunas modalidades, no será posible recuperar el 100 % del plasma porque no se debe alterar la capa leucocítica, por lo que se debe mantener una distancia mínima entre la parte inferior de la punta y la parte superior del sedimento. Esta distancia mínima puede determinarse experimentalmente, pero el volumen (V) sacrificado en función de la distancia de seguridad requerida (d) puede estimarse usando: V(d) = d*n1,25 mm2 Por ejemplo, para una distancia de seguridad requerida de 0,25 mm, el volumen sacrificado podría ser 1,23 uL para el caso de hematocrito al 60 %. Este volumen puede disminuirse disminuyendo el radio interno de la porción de hematocrito del recipiente de centrifugación. Sin embargo, debido a que en algunas modalidades, esa porción estrecha debe adaptarse completamente al radio exterior de la punta de extracción, que no puede ser menor de 1,5 mm, las dimensiones existentes del recipiente de centrifugación pueden ser cercanas al mínimo.

Junto con la extracción de plasma, en algunas modalidades también puede ser necesario que el hematocrito se mida usando visión por ordenador. Para facilitar este proceso, la altura total para un volumen dado de hematocrito puede maximizarse minimizando el diámetro interno de la parte estrecha del recipiente. Al maximizar la altura, puede optimizarse la relación entre los cambios en el volumen del hematocrito y el cambio físico en la altura de la columna, aumentando así el número de píxeles que pueden usarse para la medición. La altura de la parte estrecha del recipiente también puede ser lo suficientemente larga para adaptarse al peor de los casos de 80% de hematocrito, dejando una pequeña porción de plasma en la parte superior de la columna para permitir una extracción eficiente. Por lo tanto, 40 uL*80 % = 32 uL puede ser la capacidad de volumen requerida para una medición precisa del hematocrito. El volumen de la parte estrecha de la punta, tal como se diseñó, puede ser de aproximadamente 35,3 uL, lo que puede permitir que quede algo de volumen de plasma, incluso en el peor de los casos.

Un segundo escenario de uso es mucho más complicado y puede requerir uno, más o todos los siguientes:

• sangre entera sedimentada

• plasma extraído

• sedimento re-suspendido en tampón de lisis y tinción

• glóbulos blancos restantes (WBC) sedimentados

• sobrenadante eliminado

• WBC resuspendidos

• Suspensión de WBC completamente extraída

Para volver a suspender completamente un sedimento empaquetado, los experimentos han demostrado que puede alterarse físicamente el sedimento con una punta capaz de llegar completamente al fondo del recipiente que contiene el sedimento. Una geometría preferible del fondo del recipiente que se usa para la re-suspensión parece ser una forma hemisférica similar a los tubos de PCR comerciales estándar. En otras modalidades, pueden usarse otras formas de fondo de recipiente. El recipiente de centrifugación, junto con la punta de extracción, puede diseñarse para facilitar el proceso de re-suspensión cumpliendo estos requisitos geométricos y, al mismo tiempo, permitiendo que la punta de extracción entre en contacto físico con el fondo.

Durante los experimentos de re-suspensión manual, se observó que el contacto físico entre el fondo del recipiente y el fondo de la punta puede crear un sello que prohíbe el movimiento del fluido. Puede usarse un espacio delicado para perturbar completamente el sedimento y permitir el flujo de fluido. Para facilitar este proceso en un sistema robótico, puede agregarse una característica física al fondo del recipiente de centrifugación. En algunas modalidades, esta característica puede comprender cuatro pequeñas protuberancias hemisféricas colocadas alrededor del perímetro de la parte inferior del recipiente. Cuando la punta de extracción está completamente insertada en el recipiente y se permite que haga contacto físico, el extremo de la punta puede descansar sobre las protuberancias y se permite que el fluido fluya libremente entre las protuberancias. Esto puede resultar en una pequeña cantidad de volumen (~.25uL) perdidos en los espacios vacíos.

Durante el proceso de lisis, en algunas implementaciones, el volumen de fluido máximo esperado es de 60 uL, que, junto con los 25 uL desplazados por la punta de extracción, pueden demandar una capacidad de volumen total de 85 uL. Un diseño con un volumen máximo actual de 100 uL puede superar este requisito. Otros aspectos del segundo escenario de uso requieren características de punta similares o ya discutidas.

La geometría superior del recipiente de centrifugación puede diseñarse para acoplarse con una boquilla de pipeta. Puede usarse cualquier boquilla de pipeta descrita en otra parte de este documento o conocida en la técnica. La geometría externa de la parte superior del recipiente puede coincidir exactamente con la de una punta de reacción alrededor de la cual pueden diseñarse tanto la boquilla de corriente como el cartucho. En algunas modalidades, una pequeña cresta puede circunscribir la superficie interna de la parte superior. Esta cresta puede ser un marcador visual de la altura máxima del fluido, destinado a facilitar la detección automática de errores mediante el sistema de visión por ordenador.

En algunas modalidades, la distancia desde la parte inferior de la boquilla completamente acoplada hasta la parte superior de la línea de fluido máxima es de 2,5 mm. Esta distancia es 1,5 mm menor que la distancia recomendada de 4 mm a la que se adhiere la punta de extracción. Esta distancia reducida puede deberse a la necesidad de minimizar la longitud de la punta de extracción mientras se cumplen los requisitos de volumen mínimo. La justificación de esta distancia reducida se deriva del uso particular del recipiente. Debido a que, en algunas implementaciones, el líquido puede intercambiarse con el recipiente solo desde la parte superior, el líquido máximo que tendrá mientras esté acoplado con la boquilla es la cantidad máxima de sangre total esperada en un momento dado (40 uL). La altura de este fluido puede estar muy por debajo del fondo de la boquilla. Otra preocupación es que en otras ocasiones el volumen de fluido en el recipiente puede ser mucho mayor que éste y mojar las paredes hasta la altura de la boquilla. En algunas modalidades, dependerá de quienes usen el recipiente asegurarse de que el menisco de cualquier fluido contenido dentro del recipiente no exceda la altura máxima del fluido, incluso si el volumen total es menor que el máximo especificado. En otras modalidades, pueden proporcionarse otras características para mantener el fluido contenido dentro del recipiente.

Todas las dimensiones, tamaños, volúmenes o distancias proporcionados en el presente documento se proporcionan solo a modo de ejemplo. Puede utilizarse cualquier otra dimensión, tamaño, volumen o distancia que puede ser o no proporcional a las cantidades mencionadas en el presente documento.

El recipiente de centrifugación puede someterse a una serie de fuerzas durante el proceso de intercambio de fluidos y la inserción y extracción rápida de puntas. Si el recipiente no está restringido, es posible que estas fuerzas sean lo suficientemente fuertes como para levantar o desalojar el recipiente del cubo de la centrífuga. Para evitar el movimiento, el recipiente debe asegurarse de alguna manera. Para lograr esto, se agregó un pequeño anillo que circunscribe el exterior del fondo del recipiente. Este anillo puede acoplarse fácilmente con una función mecánica compatible en el cubo. Siempre que la fuerza de retención de la protuberancia sea mayor que las fuerzas experimentadas durante las manipulaciones del fluido, pero menor que la fuerza de fricción cuando se acopla con la boquilla, entonces el problema está resuelto.

Punta de extracción

La punta de extracción puede diseñarse para interactuar con el recipiente de centrifugación, extrayendo plasma de manera eficiente y re suspendiendo las células sedimentadas. Cuando se desee, su longitud total (por ejemplo, 34,5 mm) puede coincidir exactamente con la de otra punta de sangre, incluidas, entre otras, las descritas en la patente de Estados Unidos Número de serie 12/244,723 pero puede ser lo suficientemente larga como para tocar físicamente el fondo del recipiente de centrifugación. La capacidad de tocar el fondo del recipiente puede ser necesaria en algunas modalidades, tanto para el proceso de re-suspensión como para la recuperación completa de la suspensión de glóbulos blancos.

El volumen requerido de la punta de extracción puede determinarse por el volumen máximo que se espera que aspire del recipiente de centrifugación en un momento dado. En algunas modalidades, este volumen puede ser de aproximadamente 60 uL, que puede ser menor que la capacidad máxima de la punta, que es de 85 uL. En algunas modalidades, puede proporcionarse una punta de mayor volumen que el volumen requerido. Al igual que con el recipiente de centrifugación, puede usarse una característica interna que circunscribe el interior de la parte superior de la punta para marcar la altura de este volumen máximo. La distancia entre la línea de volumen máximo y la parte superior de la boquilla acoplada puede ser de 4,5 mm, lo que puede considerarse una distancia segura para evitar la contaminación de la boquilla. Puede usarse cualquier distancia suficiente para evitar la contaminación de la boquilla. La centrífuga puede usarse para sedimentar el colesterol LDL precipitado. Pueden usarse imágenes para verificar que el sobrenadante es transparente, lo que indica la eliminación completa del precipitado.

En un ejemplo, el plasma puede diluirse (por ejemplo, 1:10) en una mezcla de sulfato de dextrano (25 mg/dL) y sulfato de magnesio (100 mM), y luego puede incubarse durante 1 minuto para precipitar el colesterol LDL. El producto de reacción puede aspirarse en el tubo de la centrífuga, taparse luego y centrifugarse a 3000 rpm durante tres minutos. Las Figuras 119, 120 y 121 son imágenes que se tomaron de la mezcla de reacción original antes de la centrifugación (que muestra el precipitado blanco), después de la centrifugación (que muestra un sobrenadante transparente) y del sedimento de colesterol LDL (después de retirar la tapa), respectivamente.

Otros ejemplos de centrifugadoras que pueden emplearse en la presente invención se describen en las patentes de Estados Unidos núms. 5,693,233, 5,578,269, 6,599,476 y las publicaciones de patente de Estados Unidos núm.

2004/0230400, 2009/0305392 y 2010/0047790.

Protocolos de ejemplo

Pueden usarse muchas variaciones de protocolo para la centrifugación y el procesamiento. Por ejemplo, un protocolo típico para el uso de la centrífuga para procesar y concentrar glóbulos blancos para citometría puede incluir uno o más de los siguientes pasos. Los pasos a continuación pueden proporcionarse en diferentes órdenes o pueden sustituirse otros pasos por cualquiera de los pasos a continuación:

1. Recibir 10 uL de sangre anticoagulada con EDTA (la pipeta inyecta la sangre en el fondo del cubo de la centrífuga)

2. Sedimentar los glóbulos rojos y blancos por centrifugación (< 5 min x 10000 g).

3. Medir el hematocrito por imágenes

4. Retirar el plasma lentamente por aspiración en la pipeta (4 uL correspondiente al peor de los casos [60% de hematocrito]) sin alterar el sedimento celular.

5. Re-suspender el sedimento después de agregar 20 uL de un cóctel apropiado de hasta cinco anticuerpos marcados con fluorescencia1 disueltos en solución salina tamponada bSa (1 mg/mL) (volumen de reacción total aproximadamente 26 uL2).

1 La concentración se ajustará apropiadamente para lidiar con la diferente relación de volumen en relación con el método de laboratorio estándar (específicamente alrededor de 5 veces más bajo)

2 Si es necesario, este volumen puede ser mayor para lograr una tinción óptima, pero no más de 50 uL.

6. Incubar durante 15 minutos a 37 °C.

7. Preparar el reactivo de lisis/fijador mezclando la solución de lisis de glóbulos rojos (cloruro de amonio/bicarbonato de potasio) con el reactivo de fijador de glóbulos blancos (formaldehído).

8. Agregar 30 uL de reactivo de lisis/fijador (volumen total de reacción alrededor de 60 uL).

9. Incubar 15 minutos a 37 °C

10. Sedimentar los glóbulos blancos por centrifugación (5 min, 10000 g).

11. Retirar el hemolizado sobrenadante (aproximadamente 57 uL).

12. Re-suspender los glóbulos blancos agregando 8 uL de tampón (solución salina tamponada isotónica).

13. Medir el volumen con precisión.

14. Entregar la muestra (c 10 uL) a la citometría.

Los pasos pueden incluir recibir una muestra. La muestra puede ser un fluido corporal, como sangre, o cualquier otra muestra descrita en otra parte del presente documento. La muestra puede ser un volumen pequeño, como cualquiera de las medidas de volumen descritas en otra parte de este documento. En algunos casos, la muestra puede tener un anticoagulante.

Puede ocurrir un paso de separación. Por ejemplo, puede producirse una separación basada en la densidad. Tal separación puede ocurrir mediante centrifugación, separación magnética, lisis o cualquier otra técnica de separación conocida en la técnica. En algunas modalidades, la muestra puede ser sangre y los glóbulos rojos y blancos pueden separarse.

Puede realizarse una medición. En algunos casos, la medición puede realizarse mediante formación de imágenes o cualquier otro mecanismo de detección descrito en otra parte del presente documento. Por ejemplo, el hematocrito de una muestra de sangre separada puede obtenerse mediante formación de imágenes. La formación de imágenes puede producirse a través de una cámara digital o cualquier otro dispositivo de captura de imágenes descrito en el presente documento.

Pueden eliminarse uno o más componentes de una muestra. Por ejemplo, si la muestra se separa en componentes sólidos y líquidos, el componente líquido puede moverse. Puede extraerse el plasma de una muestra de sangre. En algunos casos, el componente líquido, como el plasma, puede eliminarse mediante una pipeta. El componente líquido puede eliminarse sin alterar el componente sólido. La formación de imágenes puede ayudar a eliminar el componente líquido o cualquier otro componente seleccionado de la muestra. Por ejemplo, la formación de imágenes puede usarse para determinar dónde se encuentra el plasma y puede ayudar en la colocación de la pipeta para eliminar el plasma.

En algunas modalidades, puede añadirse un reactivo u otro material a la muestra. Por ejemplo, la parte sólida de la muestra puede re-suspenderse. Puede agregarse un material con un marcador. Pueden ocurrir uno o más pasos de incubación. En algunos casos, puede añadirse un reactivo de lisis y/o fijador. Pueden ocurrir pasos adicionales de separación y/o re-suspensión. Según sea necesario, pueden ocurrir pasos de dilución y/o concentración.

Puede medirse el volumen de la muestra. En algunos casos, el volumen de la muestra puede medirse de forma precisa y/o exacta. El volumen de la muestra puede medirse en un sistema con un coeficiente de variación bajo, como los valores del coeficiente de variación descritos en otra parte del presente documento. En algunos casos, el volumen de la muestra puede medirse mediante formación de imágenes. Puede capturarse una imagen de la muestra y puede calcularse el volumen de la muestra a partir de la imagen.

La muestra puede entregarse a un proceso deseado. Por ejemplo, la muestra puede entregarse para citometría. En otro ejemplo, un protocolo típico que puede hacer uso o no de la centrífuga para la purificación de ácidos nucleicos puede incluir uno o más de los siguientes pasos. El sistema puede permitir la extracción de ADN/ARN para entregar una plantilla de ácido nucleico a reacciones de amplificación exponencial para la detección. El proceso puede diseñarse para extraer ácidos nucleicos de una variedad de muestras que incluyen, entre otras, sangre completa, suero, medio de transferencia viral, muestras de tejido humano y animal, muestras de alimentos y cultivos bacterianos. El proceso puede estar completamente automatizado y puede extraer ADN/ARN de manera consistente y cuantitativa. Los pasos a continuación pueden proporcionarse en diferentes órdenes o pueden sustituirse otros pasos por cualquiera de los pasos a continuación:

1. Lisis de la Muestra. Las células de la muestra pueden lisarse usando un tampón de sal caotrópica. El tampón de sal caotrópica puede incluir uno o más de los siguientes: sal caotrópica tal como, pero sin limitarse a, clorhidrato de guanidina 3-6 M o tiocianato de guanidinio; dodecilsulfato de sodio (SDS) a una concentración típica de 0,1-5 % v/v; ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a una concentración típica de 1-5 mM; lisozima a una concentración típica de 1 mg/mL; proteinasa-K a una concentración típica de 1 mg/mL; y el pH puede establecerse en 7-7,5 usando un tampón como HEPES. En algunas modalidades, la muestra puede incubarse en el tampón a una temperatura típica de 20 a 95 °C durante 0 a 30 minutos. Puede añadirse isopropanol (50 % -100 % v/v) a la mezcla después de la lisis.

2. Carga Superficial. La muestra lisada puede exponerse a una superficie funcionalizada (a menudo en forma de un lecho empacado de perlas) como, pero sin limitarse a ello, un soporte de resina empacado en una columna de estilo cromatográfico, perlas magnéticas mezcladas con la muestra de manera de manera discontínua, la muestra se bombea a través de una resina suspendida en un modo de lecho fluidizado, y la muestra se bombea a través de un canal cerrado en forma de flujo tangencial sobre la superficie. La superficie puede funcionalizarse para unir ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN, híbrido de ADN/ARN) en presencia del tampón de lisis. Los tipos de superficie pueden incluir sílice y grupos funcionales de intercambio iónico como dietilaminoetanol (DEAE). La mezcla lisada puede exponerse a la superficie y los ácidos nucleicos se unen.

3. Lavado. La superficie sólida se lava con una solución salina tal como cloruro de sodio 0-2 M y etanol (20-80 % v/v) a pH 7,0 - 7,5. El lavado puede realizarse de la misma manera que la carga.

4. Elución. Los ácidos nucleicos pueden eluirse de la superficie exponiendo la superficie a agua o tampón a pH 7-9. La elución puede realizarse de la misma manera que la carga.

El sistema puede emplear muchas variaciones de estos protocolos u otros protocolos. Dichos protocolos pueden usarse en combinación o en lugar de cualquier protocolo o método descrito en el presente documento.

En algunas modalidades, es importante poder recuperar las células empaquetadas y concentradas mediante centrifugación para citometría. En algunas modalidades, esto puede lograrse mediante el uso del dispositivo de pipeteo. Los líquidos (típicamente solución salina tamponada isotónica, un agente de lisis, una mezcla de un agente de lisis y un fijador o un cóctel de anticuerpos marcados en tampón) pueden dispensarse en el cubo de centrífuga y pueden aspirarse y volver a dispensarse repetidamente. La punta de la pipeta puede introducirse en las células empaquetadas para facilitar el proceso. El análisis de imágenes ayuda al proceso al verificar objetivamente que todas las células se han re-suspendido.

Uso de la pipeta y la centrífuga para procesar muestras antes del análisis:

De acuerdo con una modalidad de la invención, el sistema puede tener capacidades de pipeteo, recogida y colocación y centrifugación. Dichas capacidades pueden permitir que casi cualquier tipo de pretratamiento de muestras y procedimientos de análisis complejos se realicen de manera eficiente con volúmenes de muestra muy pequeños.

Específicamente, el sistema puede permitir la separación de los elementos formados (glóbulos rojos y blancos) del plasma. El sistema también puede permitir la re-suspensión de elementos formados. En algunas modalidades, el sistema puede permitir la concentración de glóbulos blancos de sangre fijada y hemolizada. El sistema también puede permitir la lisis de células para liberar ácidos nucleicos. En algunas modalidades, el sistema puede permitir la purificación y concentración de ácidos nucleicos mediante filtración a través de puntas empaquetadas con reactivos en fase sólida (típicamente en forma de perlas) (por ejemplo, sílice). El sistema también puede permitir la elución de ácidos nucleicos purificados después de la extracción en fase sólida. El sistema también puede permitir la eliminación y recogida de precipitados (por ejemplo, colesterol LDL precipitado usando polietilenglicol).

En algunas modalidades, el sistema puede permitir la purificación por afinidad. Las moléculas pequeñas como la vitamina D y la serotonina pueden adsorberse sobre sustratos hidrófobos en forma de perlas (partículas) y luego eluirse usando disolventes orgánicos. Los antígenos pueden proporcionarse sobre sustratos recubiertos de anticuerpos y eluirse con ácido. Pueden usarse los mismos métodos para concentrar analitos que se encuentran en concentraciones bajas, como tromboxano-B2 y 6-ceto-prostaglandina F1a. Los antígenos pueden proporcionarse sobre anticuerpos o sustratos recubiertos con aptámeros y luego eluirse.

En algunas modalidades, el sistema puede permitir la modificación química de los analitos antes del ensayo. Para analizar la serotonina (5-hidroxitriptamina), por ejemplo, puede ser necesario convertir el analito en un derivado (como una forma acetilada) usando un reactivo (como anhídrido acético). Esto puede hacerse para producir una forma del analito que pueda ser reconocido por un anticuerpo.

Los líquidos pueden moverse con la pipeta (aspiración al vacío y bombeo). La pipeta puede estar limitada a presiones positivas y negativas relativamente bajas (aproximadamente 0,1 - 2,0 atmósferas). Puede usarse una centrífuga para generar presiones mucho más altas cuando sea necesario para forzar líquidos a través de medios en fase sólida con perlas. Por ejemplo, usando un rotor con un radio de 5 cm a una velocidad de 10000 rpm, pueden generarse fuerzas de aproximadamente 5000 x g (aproximadamente 7 atmósferas), suficientes para forzar líquidos a través de medios resistivos como lechos empaquetados. Puede usarse cualquiera de los diseños y configuraciones de centrífugas discutidos en otra parte de este documento o conocidos en la técnica.

Puede ocurrir la medición del hematocrito con volúmenes muy pequeños de sangre. Por ejemplo, las cámaras digitales económicas son capaces de obtener buenas imágenes de objetos pequeños incluso cuando el contraste es deficiente. Haciendo uso de esta capacidad, el sistema de la presente invención puede permitir la medición automatizada del hematocrito con un volumen muy pequeño de sangre.

Por ejemplo, puede extraerse 1 uL de sangre en un capilar de vidrio de microcapas. A continuación, el capilar puede sellarse con un adhesivo curable y luego someterse a centrifugación a 10000 x g durante 5 minutos. El volumen de células empaquetadas puede medirse fácilmente y el menisco plasmático (indicado por una flecha) también puede ser visible, por lo que el hematocrito puede medirse con precisión. Esto puede permitir que el sistema no desperdicie un volumen relativamente grande de sangre para realizar esta medición. En algunas modalidades, la cámara puede usarse "tal cual" sin operar con un microscopio para hacer una imagen más grande. En otras modalidades, puede usarse un microscopio u otras técnicas ópticas para ampliar la imagen. En una implementación, el hematocrito se determinó usando la cámara digital sin interferencia óptica adicional, y el hematocrito medido fue idéntico al determinado por un método de laboratorio de microhematocrito convencional que requiere muchos microlitros de muestra. En algunas modalidades, la longitud de la columna de muestra y la de la columna de glóbulos rojos empaquetados pueden medirse con mucha precisión (+/- < 0,05 mm). Dado que la columna de la muestra de sangre puede ser de aproximadamente 10 a 20 mm, la desviación estándar del hematocrito puede ser mucho mejor que la coincidencia del 1 % que se obtiene con los métodos estándar de laboratorio.

El sistema puede permitir la medición de la velocidad de sedimentación globular (VSG). La capacidad de las cámaras digitales para medir distancias muy pequeñas y las tasas de cambio de distancias puede aprovecharse para medir la ESR. En un ejemplo, se aspiraron tres muestras de sangre (15 uL) en "puntas de reacción". Las imágenes se capturaron durante una hora a intervalos de dos minutos. El análisis de imágenes se usó para medir el movimiento de la interfaz entre los glóbulos rojos y el plasma. La Figura 122 muestra los resultados como la distancia de la interfaz del menisco plasmático.

La precisión de la medición puede estimarse ajustando los datos a una función polinomial y calculando la desviación estándar de la diferencia entre los datos y la curva ajustada (para todas las muestras). En el ejemplo, se determinó que era 0,038 mm o < 2 % CV cuando se relacionaba con la distancia recorrida durante una hora. En consecuencia, la ESR puede medirse con precisión mediante este método. Otro método para determinar la ESR es medir la pendiente máxima de la relación distancia versus tiempo.

Preparación del ensayo

En algunas modalidades, las puntas pueden diseñarse para adaptarse a una pluralidad de reacciones o ensayos. Puede realizarse la medición simultánea de varias mezclas de ensayo diferentes y uno o más controles o uno o más calibradores dentro de una punta de la presente invención. Al hacer esto, aprovechamos la capacidad de tomar muestras de varias fuentes de líquido mediante la aspiración secuencial de líquidos en la misma punta. La segmentación y separación efectivas de los líquidos se mejora enormemente aspirando en secuencia un pequeño volumen de aire y un pequeño volumen de una solución de lavado que limpia la superficie de las puntas antes de la aspiración del siguiente líquido de interés.

Como se describió anteriormente, las puntas pueden tener formas cónicas. En algunas modalidades, un ensayo puede requerir oxígeno como reactivo. En tales reacciones, puede lograrse una mayor disponibilidad de oxígeno dentro de una reacción moviendo la muestra y/o la mezcla de ensayo a una parte amplia de la punta para aumentar la relación de área superficial a volumen.

En la Figura 93 y la Figura 94, se aspiraron soluciones de azul de bromofenol en las puntas. Los segmentos superiores (aspirados primero) 6 uL son de una serie de dilución doble (concentración más alta (0,0781 mg/mL) a la derecha de la imagen, con la excepción de la punta más a la izquierda que es un blanco de agua). A continuación, se aspiraron aire (2 uL), solución de lavado (2 uL), respectivamente, seguido de un volumen de 6 uL de una solución de control de concentración fija (0,625 mg/mL).

Con este enfoque pueden lograrse varias configuraciones de ensayo alternativas, por ejemplo:

1. Medición simultánea de reactivo y/o blanco de muestra y ensayo

2. Medición simultánea de muestra, blanco y control

3. Calibración del ensayo dentro de la punta

La siguiente tabla ilustra algunos "tipos multiplex" en los que las combinaciones preferidas de ensayos, controles y calibradores se ensamblan dentro de una punta.

El caso 2 se muestra en la Figura 95.

También pueden realizarse mediciones en serie de soluciones en blanco, muestras, controles y calibradores con puntas individuales. En este escenario, la punta se llena con la primera solución, se lee y luego se vacía. A continuación, la punta puede rellenarse y leer con otras muestras, etc. en secuencia. El impacto del "arrastre" de producto coloreado de una muestra a la siguiente se minimiza mediante uno o ambos:

1. Leer la columna de líquido en la parte media lejos de la parte que primero entra en contacto con la muestra anterior

2. Lavado de la punta entre muestras.

Para medir la extensión del "arrastre" de un segmento líquido al siguiente, se llevó a cabo el siguiente procedimiento. Se aspiró una pequeña cantidad (por ejemplo, 6 uL) de una alta concentración de azul de bromofenol (por ejemplo, 0,625 mg/mL) en las puntas, seguido de 2 uL de aire y 2 uL de solución de lavado. Finalmente, se aspiran 6 uL de diluciones seriadas dobles de azul de bromofenol con los siguientes resultados (concentración más alta (0,0781 mg/mL) a la derecha; la punta más a la izquierda es un blanco de agua).

Como puede verse en las imágenes que se muestran en la Figura 96 y el análisis de 3 colores que se muestra en la Figura 97, cantidades medibles de la solución de alta concentración se transfieren a la solución de lavado.

El arrastre promedio (del control de alta concentración al lavado con agua) se calcula en 1,4 %. Dado que, en efecto, la zona principal (proximal a la porción anterior) de una porción posterior de líquido actúa como segundo paso de lavado y la lectura del color se toma en un lugar alejado de esta zona principal (típicamente en una zona central de la porción), el arrastre efectivo de una porción a la siguiente es típicamente mucho menos del 1% y, por lo tanto, generalmente insignificante. Cuando la serie de dilución se mide usando solo muestras de la serie de dilución para llenar las puntas, los resultados son idénticos a los obtenidos anteriormente. Lo anterior representa una "prueba de esfuerzo" diseñada para evaluar el alcance del arrastre.

La Figura 98 muestra una punta que contiene productos de reacción para dos ensayos disponibles comercialmente para calcio ionizado, Ca2+ (segmento superior) y magnesio Mg2+ (segmento inferior) que se aspiraron en puntas para medición. Las concentraciones de Ca2+ usadas en este experimento son 0, 2,5, 5, 10, 20 y 40 mg/dL; las concentraciones de Mg2+ son 0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 mg/dL. Las mezclas de reacción de ensayo (6 uL [Ca2+] y 4 uL [Mg2+]) se separan bien usando 2 uL de aire, 3 uL de lavado y 4 uL más de aire. Los resultados para cada ensayo leído de esta manera son esencialmente idénticos a los medidos con solo una mezcla de reacción de ensayo por punta.

Como se señaló anteriormente, la presente invención permite la evaluación simultánea de una pluralidad de ensayos. Pueden obtenerse imágenes de muchas cubetas de ensayo en el mismo campo de visión. Específicamente, puede realizarse la evaluación simultánea de ensayos y controles en la misma cubeta de ensayo. También puede realizarse la evaluación simultánea de varios ensayos en la misma cubeta de ensayo.

Ambiente de reacción

Un sistema puede comprender un bloque de calentamiento para calentar el ensayo o la unidad de ensayo y/o para controlar la temperatura del ensayo. Puede usarse calor en el paso de incubación de una reacción de ensayo para promover la reacción y acortar la duración necesaria para el paso de incubación. Un sistema puede comprender un bloque de calentamiento configurado para recibir una unidad de ensayo de la invención. El bloque de calentamiento puede configurarse para recibir una pluralidad de unidades de ensayo desde un dispositivo de la invención. Por ejemplo, si se desea ejecutar 8 ensayos en un dispositivo, el bloque de calentamiento puede configurarse para recibir 8 unidades de ensayo. En algunas modalidades, las unidades de ensayo pueden moverse hacia el contacto térmico con un bloque de calentamiento mediante el uso de los medios para mover las unidades de ensayo. El calentamiento puede realizarse mediante un medio de calentamiento conocido en la técnica.

Optimización de protocolo

Los protocolos de ensayo para analizar muestras pueden optimizarse de diversas formas. Cuando se van a ejecutar varios ensayos en una muestra, todos los protocolos pueden optimizarse para las condiciones de reacción más estrictas, o cada protocolo de ensayo puede optimizarse en función del rendimiento deseado de un ensayo en particular.

En algunas modalidades, un único protocolo puede diseñarse para cumplir con los requisitos de prueba en todos los casos de uso posibles. Por ejemplo, en un cartucho multiplex, puede especificarse un único protocolo basado en el caso en el que se van a realizar todas las pruebas en el cartucho (es decir, el caso límite). Este protocolo puede diseñarse para cumplir con los requisitos mínimos de prueba, como la precisión y el intervalo dinámico para cada prueba en el cartucho. Sin embargo, este enfoque puede ser subóptimo para casos de uso alternativos, por ejemplo, cuando solo se va a realizar un subconjunto de pruebas en el cartucho. En estos casos, al usar más muestra, algunos ensayos pueden lograr un rendimiento mejorado en términos de sensibilidad y precisión. Puede haber una compensación entre la cantidad de muestra asignada a un ensayo y la sensibilidad del mismo. Por ejemplo, un ensayo que tiene una sensibilidad de 1 unidad/mL cuando la muestra se diluye 1:100 puede detectar 0,1 unidad/mL si el factor de dilución aumenta a 1:10. Una desventaja de usar un factor de dilución más bajo en un sistema de ensayo multiplexado con un volumen de muestra restringido puede ser que la fracción de la muestra requerida para este ensayo se incrementa 10 veces incluso cuando se usa el volumen mínimo para realizar el ensayo. Asimismo, la precisión del ensayo puede mejorarse mediante el uso de una mayor concentración de muestra. Por ejemplo, un ensayo que da como resultado una señal de (digamos) 0,1 de absorbancia /- 0,02 (20 % de imprecisión de la señal) en su límite de detección puede mejorarse mediante el uso de 10 veces la concentración de la muestra, de modo que la señal producida sea 10 veces mayor dando una señal de 0,1 /- 0,02 OD a una concentración de analito diez veces menor y con una señal de 1,0, /- 0,02 la imprecisión es ahora solo del 2 %. La razón por la que este es el caso, es que típicamente la señal del ensayo (en el intervalo más bajo de concentraciones de analito) es directamente proporcional a la concentración de analito (y por lo tanto a la concentración de la muestra) mientras que la imprecisión de la señal puede estar relacionada típicamente con la raíz cuadrada de la señal y así aumenta como la raíz cuadrada de la concentración del analito (y la concentración de la muestra). Por tanto, el coeficiente de variación (CV) de la señal puede ser inversamente proporcional a la raíz cuadrada de la señal; de manera que un aumento de 10 veces en la señal corresponde a una disminución de aproximadamente tres veces en el CV de la señal. Dado que el CV de la concentración normalmente está directamente relacionado con el CV de la señal, el CV de la concentración disminuirá con el aumento de la concentración de la muestra (disminución de la dilución).

Los protocolos pueden optimizarse para casos de uso específicos en lugar del enfoque típico de talla única descrito anteriormente. Por ejemplo, el protocolo puede optimizarse para mejorar la precisión de cada prueba que se realiza en el dispositivo multiplex. Además, algunas pruebas pueden tener prioridad en relación con otras pruebas para la optimización. La optimización del protocolo puede calcularse previamente para casos de uso que se conocen a priori. La optimización del protocolo también puede realizarse en tiempo real para nuevos casos de uso que no se conocen a priori. La validación del sistema puede realizarse para abarcar el conjunto de casos de uso.

Un ejemplo de optimización de protocolo se describe a continuación comparando dos casos de uso. Para ambos casos de uso, 8 uL de muestra sin diluir están disponibles para ejecutar las pruebas requeridas. En este ejemplo, el cartucho multiplex tiene 20 pruebas a bordo, donde 5 de las pruebas requieren una dilución 1:5 y 15 de las pruebas requieren una dilución 1:25.

En el primer caso de uso, todas las pruebas deben ejecutarse en la muestra. El protocolo en este caso de uso (caso de uso B) es el siguiente:

1) Preparar una dilución 1:5 (8 uL de muestra 32 uL de diluyente)

2) Preparar una dilución 1:25 (15 uL de muestra 1:5 60 uL de diluyente)

3) Para cada prueba (n = 20), mezclar 5 uL de muestra adecuadamente diluida con 10 uL del reactivo. Este protocolo da como resultado una imprecisión de concentración del 10 % del CV para las 20 pruebas, cumpliendo con los requisitos mínimos. El uso de muestra es 1 uL por cada ensayo de dilución 1:5 y 0,2 uL por cada ensayo de dilución 1:25 (para un total de 5*1 15*0,2 = 8 uL, usando toda la muestra disponible).

En el segundo caso de uso (caso de uso "B") con el mismo tipo de cartucho, solo se requieren 10 pruebas para la muestra, no las 20. Además, todas estas 10 pruebas se realizarían al nivel de dilución 1:25 en el caso de uso A. El protocolo está optimizado para este caso de uso para maximizar la precisión de todas las pruebas mediante el uso de una dilución menor (1:5). El protocolo optimizado para este caso de uso específico es el siguiente:

1) Preparar una dilución 1:5 (8 uL de muestra 32 uL de diluyente)

2) Para cada prueba (n = 10), mezclar 4 uL de muestra diluida con 11 uL de reactivo

El uso de muestra es de 0,8 uL de muestra sin diluir por ensayo para un total de 8 uL. Dado que la concentración de la muestra en el ensayo aumenta 5 veces en relación con la del caso de uso A, la sensibilidad del ensayo mejora en un factor de 5 y la imprecisión del ensayo se reduce aproximadamente 2,4 (5A0,5) veces a aproximadamente 4,5 %.

Al volver a optimizar el protocolo, en el caso de uso B se emplea 5 veces más muestra original para cada prueba, lo que mejora el rendimiento general. Nótese que la discusión anterior no tiene en cuenta ninguna imprecisión debida a errores en la medición de volúmenes, sino que solo aborda los errores debidos a la imprecisión en la medición de la señal óptica. El caso de uso B tendría una imprecisión menor debido a la imprecisión en los volúmenes, ya que usa menos pasos de pipeteo. Por ejemplo, si la imprecisión del volumen introduce un 5 % de imprecisión en la concentración de analito reportada en ambos casos de uso, habría una imprecisión total del analito del 11,2 % (10A2 5A2)A0,5 en el caso de uso A en comparación con el 6,5 % (4,5A2+5A2)^a0,5 en el caso de uso B (asumiendo, como es generalmente cierto, que los factores que causan imprecisión en los ensayos se agregan como la raíz cuadrada de la suma de cuadrados de cada fuente de imprecisión).

Los efectos ilustrados anteriormente pueden verse más fácilmente en el caso de ensayos basados en luminiscencia en los que la señal del ensayo se expresa como un número de fotones emitidos por unidad de tiempo. Como es el caso del recuento de emisiones radiactivas en, por ejemplo, radioinmunoensayo, la imprecisión de la señal es igual a la raíz cuadrada de la señal y, por tanto, la el CV de la señal es 100/(raíz cuadrada de la señal). Por ejemplo, una señal de 10 000 recuentos tendrá un CV del 1 %. En muchos ensayos que producen fotones (por ejemplo, inmunoensayos de quimioluminiscencia, la señal es casi exactamente proporcional a la concentración del analito, al menos en el intervalo de concentración más bajo). Por tanto, la imprecisión del analito medido se escala con 1/(raíz cuadrada de la señal) para concentraciones significativamente por encima del límite de detección. En los ensayos que utilizan la dilución de la muestra, la imprecisión del analito medido se escalará, por tanto, como 1/(dilución de la muestra). Por ejemplo, un ensayo que usa una dilución de muestra 1:100 tendrá un CV de la señal y la concentración de aproximadamente 3,2 veces (10A0,5) más altos que un ensayo que usa una dilución 1:10 (y también tendrá una sensibilidad aproximadamente 10 veces mayor).

Químicas de reacción

Pueden realizarse una variedad de ensayos en un dispositivo de fluidos para detectar un analito de interés en una muestra. Cuando se utiliza un marcador en el ensayo, se puede elegir entre una amplia diversidad de marcadores en la técnica que pueden emplearse para realizar los ensayos del sujeto. En algunas ejemplos, los marcadores pueden detectarse por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, electroquímicos, inmunoquímicos u otros medios químicos. Por ejemplo, los marcadores de ácidos nucleicos útiles incluyen los colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones y enzimas. Se conoce una amplia variedad de marcadores adecuados para marcar componentes biológicos y se reportan ampliamente tanto en la literatura científica como en la de patentes, y son generalmente aplicables a la presente invención para el marcado de componentes biológicos. Los marcadores adecuados incluyen enzimas, restos fluorescentes, restos quimioluminiscentes, marcadores bioluminiscentes o marcadores de colores. Los reactivos que definen la especificidad del ensayo incluyen opcionalmente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, aptámeros, proteínas, sondas de ácido nucleico u otros polímeros tales como matrices de afinidad, carbohidratos o lípidos. La detección puede proceder mediante cualquiera de una variedad de métodos conocidos, lo que incluye el rastreo espectrofotométrico u óptico de marcadores fluorescentes o luminiscentes, u otros métodos que rastrean una molécula basado en el tamaño, la carga o la afinidad. Un grupo detectable puede ser de cualquier material que tenga una propiedad física o química detectable. Dichos marcadores detectables se han desarrollado mucho en el campo de la electroforesis en gel, cromatografía en columna, sustratos sólidos, técnicas espectroscópicas y similares, y en general, los marcadores útiles en dichos métodos pueden aplicarse a la presente invención. De esta forma, un marcador incluye, sin limitación, cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, basados en sondas de ácido nucleico, eléctricos, térmicos ópticos u otros medios químicos.

En algunos ejemplos, el marcador (como un compuesto coloreado, un fluoruro o una enzima) se acopla directa o indirectamente a una molécula a detectar, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. En otros ejemplos, el marcador se une a un receptor del analito (como un anticuerpo, sonda de ácido nucleico, aptámero, etc.). Como se indicó anteriormente, se usa una amplia variedad de marcadores, y la elección del marcador depende de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación del compuesto, los requisitos de estabilidad, la instrumentación disponible y las disposiciones de eliminación. Los marcadores no radiactivos frecuentemente se adhieren por medios indirectos. Generalmente, un receptor específico del analito se vincula a una fracción generadora de señales. A veces, el receptor del analito se vincula a una molécula adaptadora (tal como biotina o avidina) y el conjunto de reactivos de ensayo incluye un resto de unión (tal como un reactivo biotinilado o avidina) que se une al adaptador y al analito. El analito se une a un receptor específico en el sitio de reacción. Un reactivo marcado puede formar un complejo sándwich en el que el analito está en el centro. El reactivo también puede competir con el analito por los receptores en el sitio de reacción o unirse a receptores vacíos en el sitio de reacción no ocupado por el analito. El marcador es inherentemente detectable o se une a un sistema de señales, tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente o una entidad de quimioluminiscencia tal como una enzima con un sustrato de luminiscencia. Pueden usarse varios ligandos y antiligandos. Cuando un ligando tiene un antiligando natural, por ejemplo, biotina, tiroxina, digoxigenina y cortisol, pueden usarse junto con antiligandos marcados. Alternativamente, puede usarse cualquier compuesto hapténico o antigénico en combinación con un anticuerpo.

Las enzimas de interés como marcadores serán principalmente hidrolasas, particularmente fosfatasas, esterasas y glicosidasas, u oxidorreductasas, particularmente peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, grupos dansilo y umbeliferona. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen dioxetanos, ésteres de acridinio, luciferina y 2,3-dihidroftalazinedionas, tales como luminol.

Los expertos en la técnica conocen bien los métodos de detección de marcadores. Así, por ejemplo, cuando el marcador es fluorescente, puede detectarse al excitar el fluorocromo con luz de una longitud de onda adecuada y detectar la fluorescencia resultante mediante, por ejemplo, microscopía, inspección visual, mediante película fotográfica, mediante el uso de detectores electrónicos tales como cámaras digitales, dispositivos de carga acoplada (CCD) o fotomultiplicadores y fototubos, u otros dispositivos de detección. De manera similar, los marcadores enzimáticos se detectan proporcionando sustratos apropiados para la enzima y detectando el producto de reacción resultante espectroscópicamente o mediante imágenes digitales (del sujeto de la presente invención). Finalmente, los marcadores colorimétricos simples a menudo se detectan simplemente observando el color asociado con el marcador. Por ejemplo, los soles de oro coloidal a menudo aparecen de color rosa, mientras que varias perlas dopadas con colorantes tienen un color intenso.

En algunos ejemplos, la señal detectable puede ser proporcionada por fuentes de luminiscencia. Luminiscencia es el término usado comúnmente para referirse a la emisión de luz desde una sustancia por cualquier motivo que no sea un aumento de su temperatura. En general, los átomos o moléculas emiten fotones de energía electromagnética (por ejemplo, luz) cuando pasan de un estado excitado a un estado de menor energía (generalmente el estado fundamental). Si el agente excitante es un fotón, el proceso de luminiscencia se denomina fotoluminiscencia o fluorescencia. Si la causa de la excitación es un electrón, el proceso de luminiscencia puede denominarse electroluminiscencia. Más específicamente, la electroluminiscencia se produce como resultado de la inyección directa y la eliminación de electrones para formar un par electrón-hueco, y la posterior recombinación del par electrón-hueco para emitir un fotón. La luminiscencia que se produce como resultado de una reacción química se denomina generalmente quimioluminiscencia. La luminiscencia producida por un organismo vivo se denomina generalmente bioluminiscencia. Si la fotoluminiscencia es el resultado de una transición de espín permitida (por ejemplo, una transición simple-singlete, una transición triplete-triplete), el proceso de fotoluminiscencia suele denominarse fluorescencia. Típicamente, las emisiones de fluorescencia no persisten después de que se elimina la causa excitante como resultado de estados excitados de corta duración que pueden relajarse rápidamente a través de tales transiciones con espín permitido. Si la fotoluminiscencia es el resultado de una transición de espín prohibida (por ejemplo, una transición triplete-singlete), el proceso de fotoluminiscencia suele denominarse fosforescencia. Típicamente, las emisiones de fosforescencia persisten mucho después de que se elimina la causa excitante como resultado de estados excitados de larga duración que pueden relajarse solo a través de tales transiciones de espín prohibido. Un marcador luminiscente puede tener cualquiera de las propiedades descritas anteriormente.

Las fuentes quimioluminiscentes adecuadas incluyen un compuesto que se excita electrónicamente mediante una reacción química y luego puede emitir luz que sirve como señal detectable o dona energía a un aceptor fluorescente. Se ha encontrado que un número diverso de familias de compuestos proporcionan quimioluminiscencia en una variedad de condiciones. Una familia de compuestos es la 2,3-dihidro-1,4-ftalazindiona. Un compuesto de uso frecuente es el luminol, que es un compuesto de 5-amino. Otros miembros de la familia incluyen el 5-amino-6, 7, 8-trimetoxi y el análogo del dimetilamino[ca]benz. Estos compuestos pueden hacerse luminiscentes con peróxido de hidrógeno alcalino o hipoclorito de calcio y una base. Otra familia de compuestos son los 2,4,5-trifenilimidazoles, con lofina como nombre común del producto original. Los análogos quimioluminiscentes incluyen sustituyentes paradimetilamino y -metoxi. La quimioluminiscencia también puede obtenerse con oxalatos, normalmente ésteres oxalil activos, por ejemplo, p-nitrofenilo y un peróxido como el peróxido de hidrógeno, en condiciones básicas. Otros compuestos quimioluminiscentes útiles que también se conocen incluyen ésteres de -N-alquil acridinio y dioxetanos. Alternativamente, las luciferinas pueden usarse junto con luciferasa o lucigeninas para proporcionar bioluminiscencia. Las fuentes quimioluminiscentes especialmente preferidas son sustratos enzimáticos luminógenos tales como ésteres de dioxetano-fosfato. Estos no son luminiscentes pero producen productos luminiscentes cuando actúan sobre fosfatasas como la fosfatasa alcalina. Se prefiere particularmente el uso de sustratos luminógenos para enzimas porque la enzima actúa como un amplificador capaz de convertir miles de moléculas de sustrato por segundo en producto. También se prefieren los métodos de luminiscencia porque la señal (luz) puede detectarse de forma muy sensible y en un amplio intervalo dinámico usando PMT.

El término analitos, como se usa en el presente documento incluye, sin limitación, fármacos, profármacos, agentes farmacéuticos, metabolitos de fármacos, biomarcadores tales como proteínas expresadas y marcadores celulares, anticuerpos, proteínas séricas, colesterol y otros metabolitos, electrolitos, iones metálicos, polisacáridos, ácidos nucleicos, analitos biológicos, biomarcadores, genes, proteínas, hormonas o cualquiera de sus combinaciones. Los analitos pueden ser combinaciones de polipéptidos, glicoproteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos.

El sistema puede usarse para detectar y/o cuantificar una variedad de analitos. Por ejemplo, los analitos que pueden detectarse y/o cuantificarse incluyen Albúmina, Fosfatasa Alcalina, ALT, AST, Bilirrubina (Directa), Bilirrubina (Total), Nitrógeno Ureico en Sangre (BUN), Calcio, Cloruro, Colesterol, Dióxido de Carbono (CO²), Creatinina, Gammaglutamil-transpeptidasa (GGT), Globulina, Glucosa, Colesterol HDL, Hemoglobina, Homocisteína, Hierro, Lactato Deshidrogenasa, Magnesio, Fósforo, Potasio, Sodio, Proteína Total, Triglicéridos y Ácido Úrico. La detección y/o cuantificación de estos analitos puede realizarse mediante mediciones ópticas, eléctricas o de cualquier otro tipo. Son de particular interés los biomarcadores asociados con una enfermedad particular o con una etapa específica de la enfermedad. Dichos analitos incluyen, pero no se limitan a, aquellos asociados con enfermedades autoinmunes, obesidad, hipertensión, diabetes, enfermedades neuronales y/o musculares degenerativas, enfermedades cardíacas, trastornos endocrinos, trastornos metabólicos, inflamación, enfermedades cardiovasculares, sepsis, angiogénesis, cánceres, enfermedad de Alzheimer, complicaciones atléticas y cualquiera de sus combinaciones. También son de interés los biomarcadores que están presentes en abundancia variable en uno o más de los tejidos corporales, incluidos corazón, hígado, próstata, pulmón, riñón, médula ósea, sangre, piel, vejiga, cerebro, músculos, nervios y tejidos seleccionados que son afectados por diversas enfermedades, como diferentes tipos de cáncer (maligno o no metastásico), enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias o degenerativas.

También son de interés los analitos indicativos de un microorganismo, virus o Chlamydiaceae. Los microorganismos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, bacterias, virus, hongos y protozoos. Los analitos que pueden detectarse mediante el método del sujeto también incluyen patógenos de origen sanguíneo seleccionados de un grupo no limitante que consiste en Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MSRA), Staphylococcus aureus, Staphylococcus hominis, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus capitis, Staphylococcus warneri, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus simulans, Streptococcus pneumoniae y Candida albicans.

Los analitos que pueden detectarse mediante el método del sujeto también abarcan una variedad de enfermedades de transmisión sexual seleccionadas entre las siguientes: gonorrea (Neisseria gorrhoeae), sífilis (Treponena pallidum), clamidia (Clamyda tracomitis), uretritis no gonocócica (Ureaplasm urealyticum), infección por levaduras (Candida albicans), chancroide (Haemophilus ducreyi), tricomoniasis (Trichomonas vaginalis), herpes genital (VHS tipo I y II), VIH I, VIH II y hepatitis A, B, C, G, así como hepatitis causada por TTV.

Los analitos adicionales que pueden detectarse mediante los métodos del sujeto abarcan una diversidad de patógenos respiratorios que incluyen, entre otros, Pseudomonas aeruginosa, Staphlococccus aureus resistente a la meticilina (MSRA), Klebsiella pneumoniae, Haemophilis influenzae, Staphlococcus aureus, Stenotrophomonas maltophilia, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Serratia marcescens, Haemophilis parahaemolyticus, Enterococcus cloacae, Candida albicans, Moraxiella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Citrobacter freundii, Enterococcus faecium, Klebsella oxytoca, Pseudomonas fluorscens, Neiseria meningitidis, Streptococcus pyogenes, Pneumocystis carinii, Klebsella pneumoniae Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae y Mycobacterium tuberculosis.

A continuación se enumeran marcadores ilustrativos adicionales: teofilina, CRP, CKMB, PSA, mioglobina, CA125, progesterona, TxB2, 6-ceto-PGF-1-alfa y teofilina, estradiol, hormona luteinizante, triglicéridos, triptasa, colesterol de lipoproteínas de baja densidad, colesterol de lipoproteínas de alta densidad, colesterol, IGFR.

Los marcadores hepáticos ilustrativos incluyen, sin limitación, LDH, (LD5), alanina-aminotransferasa (ALT), arginasa 1 (tipo hígado), alfa-fetoproteína (AFP), fosfatasa alcalina, lactato deshidrogenasa y bilirrubina.

Los marcadores renales ilustrativos incluyen, sin limitación, receptor de TNFa, cistatina C, prostaglandina D urinaria de tipo lipocalina, sintatasa (LPGDS), receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, policistina 2, policistina 1, fibrocistina, uromodulina, alanina, aminopeptidasa, N-acetilidasa-BD-glucosamina, albúmina y proteína de unión a retinol (RBP).

Los marcadores cardíacos ilustrativos incluyen, sin limitación, troponina I (TnI), troponina T (TnT), quinasa creatina CK, CKMB, mioglobina, proteína de unión a ácidos grasos (FABP), proteína C-reactiva (CRP), dímero D fibrinógeno, proteína S-100, péptido natriurético cerebral (BNP), NT-proBNP, PAPP-A, mieloperoxidasa (MPO), isoenzima BB de glucógeno fosforilasa (GPBB), inhibidor de fibrinólisis activable por trombina (TAFI), fibrinógeno, albúmina modificada por isquemia (IMA), cardiotrofina-1 y MLC-I (cadena ligera de miosina I).

Los marcadores de páncreas ilustrativos incluyen, sin limitación, amilasa, proteína asociada a pancreatitis (PAP-1) y proteínas regeneradoras (REG).

Los marcadores de tejido muscular ilustrativos incluyen, sin limitación, miostatina.

Los marcadores sanguíneos ilustrativos incluyen, sin limitación, eritropoyetina (EPO).

Ejemplos de marcadores óseos incluyen, sin limitación, N-telopéptidos reticulados de colágeno de tipo I óseo (NTx) telopéptido de reticulación carboxiterminal de colágeno óseo, lisilpiridinolina (desoxipiridinolina), piridinolina, fosfatasa ácida resistente al tartrato, propéptido de procolágeno tipo IC, procolágeno tipo IN propéptido, osteocalcina (proteína gla ósea), fosfatasa alcalina, catepsina K, COMP (proteína de matriz oligimérica de cartílago), osteocrina osteoprotegerina (OPG), RANKL, sRANK, TRAP 5 (TRa Cp 5), factor específico de osteoblastos 1 (OSF) -1, pleiotrofina), moléculas de adhesión celular solubles, sTfR, sCD4, sCD8, sCD44 y factor 2 específico de osteoblastos (OSF-2, periostina).

En algunos ejemplos, los marcadores son específicos de una enfermedad. Los marcadores de cáncer ilustrativos incluyen, sin limitación, PSA (antígeno prostático específico total), creatinina, fosfatasa de ácido prostático, complejos de PSA, gen 1 específico de próstata, CA 12-5, antígeno carcinoembrionario (CEA), alfa feto proteína (AFP), hCG (Gonadotropina coriónica humana), inhibina, CAA ovárico C1824, CA 27.29, CA 15-3, CAA de mama C1924, Her-2, pancreático, CA 19-9, antígeno carcinoembrionario, CAA pancreático, enolasa específica de neurona, angiostatina DcR3 (señuelo soluble receptor 3), endostatina, Ep-CAM (MK-1), inmunoglobulina libre de cadena ligera Kappa, inmunoglobulina libre de cadena ligera Lambda, herstatina, cromogranina A, adrenomedulina, integrina, receptor del factor de crecimiento epidérmico, receptor del factor de crecimiento epidérmico-tirosina quinasa, Pro -Péptido de adrenomedulina N-terminal 20, factor de crecimiento endotelial vascular, receptor del factor de crecimiento endotelial vascular, receptor del factor de células madre, c-kit/KDR, KDR y Midkine.

Las condiciones de enfermedades infecciosas ilustrativas incluyen, sin limitación: viremia, bacteremia, sepsis y marcadores: PMN elastasa, PMN elastasa/complejo a1-PI, proteína tensioactiva D (SP-D), antígeno HBVc, antígeno HBVs, anti-HBVc, anti-VIH, antígeno de células T supresoras, relación de antígenos/células T, antígeno de células T auxiliares, anti-HCV, pirógenos, antígeno p24, muramildipéptido.

Los marcadores de diabetes ilustrativos incluyen, sin limitación, péptido C, hemoglobina A1c, albúmina glicosilada, productos finales de glicosilación avanzada (AGE), 1,5-anhidroglucitol, polipéptido inhibidor gástrico, glucosa, hemoglobina A1c, ANGPTL3 y 4.

Los marcadores de inflamación ilustrativos incluyen, sin limitación, factor reumatoide (RF), anticuerpo antinuclear (ANA), proteína C reactiva (CRP), proteína de células Clara (Uteroglobina).

Los marcadores de alergia ilustrativos incluyen, sin limitación, IgE total e IgE específica.

Los marcadores de autismo ilustrativos incluyen, sin limitación, ceruloplasmina, metalotioneína, zinc, cobre, B6, B12, glutatión, fosfatasa alcalina y activación de fosfatasa apoalcalina.

Los marcadores de trastornos de la coagulación ilustrativos incluyen, sin limitación, b-tromboglobulina, factor plaquetario 4, factor de von Willebrand.

En algunos ejemplos, un marcador puede ser específico de la terapia. Los marcadores indicativos de la acción de los inhibidores de COX incluyen, pero sin limitarse a, TxB2 (Cox-1), 6-ceto-PGF-1-alfa (Cox 2), 11-Dehydro-TxB-1a (Cox-1).

Otros marcadores incluyen, sin limitación, Leptina, receptor de Leptina y Procalcitonina, proteína S100 del cerebro, Sustancia P, 8-Iso-PGF-2a.

Los marcadores geriátricos ilustrativos incluyen, sin limitación, enolasa específica de neurona, GFAP y S100B. Los ejemplos de marcadores del estado nutricional incluyen, sin limitación, prealbúmina, albúmina, proteína de unión al retinol (RBP), transferrina, proteína estimulante de la acilación (ASP), adiponectina, proteína relacionada con agouti (AgRP), proteína 4 similar a angiopoyetina (ANGPTL4, FIAF), Péptido C, AFABP (proteína de unión a ácidos grasos de adipocitos, FABP4) proteína estimulante de la acilación (ASP), EFABP (proteína de unión de ácidos grasos epidérmicos, FABP5), glicentina, glucagón, péptido similar al glucagón-1, péptido similar al glucagón- 2, Grelina, Insulina, Leptina, Receptor de Leptina, PYY, RELM, Resistina y sTfR (Receptor de Transferrina soluble). Los marcadores ilustrativos del metabolismo de los lípidos incluyen, sin limitación, Apolipoproteínas (varias), Apo-A1, Apo-B, Apo-C-CII, Apo-D, Apo-E.

Ejemplos de marcadores del estado de la coagulación incluyen, sin limitación, Factor I: Fibrinógeno, Factor II: Protrombina, Factor III: Factor tisular, Factor IV: Calcio, Factor V: Proacelerina, Factor VI, Factor VII: Proconvertina, Factor VIII:, Factor anti-hemolítico, Factor IX: factor Christmas, factor X: factor Stuart-Prower, factor XI: antecedente de tromboplastina plasmática, factor XII: factor de Hageman, factor XIII: factor estabilizador de fibrina, precalicreína, cininógeno de alto peso molecular, proteína C, proteína S, Dímero D, activador tisular del plasminógeno, plasminógeno, a2-antiplasmina, inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI1).

Los anticuerpos monoclonales ilustrativos incluyen los de EGFR, ErbB2 e IGF1R.

Los inhibidores de tirosina cinasa ilustrativos incluyen, sin limitación, Ab1, Kit, PDGFR, Src, ErbB2, ErbB 4, EGFR, EphB, VEGFR1-4, PDGFRb, FLt3, FGFR, PKC, Met, Tie2, RAF y TrkA.

Los inhibidores de Serina/Treolina Cinasa ilustrativos incluyen, sin limitación, AKT, Aurora A/B/B, CDK, CDK (pan), CDK1-2, VEGFR2, PDGFRb, CDK4/6, MEK1-2, mTOR y PKC-beta.

Los blancos de GPCR incluyen, sin limitación, receptores de histamina, receptores de serotonina, receptores de angiotensina, Adrenorreceptores, Receptores Muscarínicos de Acetilcolina, Receptores de GnRH, Receptores de Dopamina, Receptores de Prostaglandinas y Receptores de ADP.

Colesterol

La medición de metabolitos puede realizarse mediante la producción de un producto coloreado usando oxidasas (como colesterol oxidasa) (para producir H2O2) y peroxidasa de rábano picante más un cromógeno (como N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3, 5-dimetoxianilina, sal sódica ["DAOS" más amino antipireno] para formar un producto coloreado como un colorante Trinder). Un ejemplo de dicha química se muestra en la Figura 52 y la Figura 53. NADH o NADPH

La producción o el consumo de NADH o NADPH se usan con frecuencia en ensayos clínicos. Esto se debe a que estas coenzimas son sustratos comunes para las enzimas. Por ejemplo, la medición de enzimas de interés clínico como la lactato deshidrogenasa (LDH) puede medirse mediante la tasa de producción de NADH. Dado que el NADH absorbe la luz al máximo a 340 nm y (1) el poliestireno y otros plásticos transmiten la luz de manera deficiente en los rayos ultravioleta cercanos, (2) las fuentes de luz blanca producen poca luz en los rayos ultravioleta cercanos y (3) los sensores de la cámara y el escáner tienen baja sensibilidad a la luz ultravioleta cercana, no es práctico medir NADH mediante análisis de imágenes de tres colores. Para hacer frente a este problema, el NADH puede convertirse en un producto coloreado usando sales de tetrazolio como el tetrazolio soluble en agua (por ejemplo, WST-1 (Dojindo Molecular Technologies) más un "mediador electrónico" como el metosulfato de 1-metoxifenazina (PMS).

En algunos ejemplos, los ensayos que producen o consumen NADH o NADPH pueden combinarse con otras reacciones que permiten la medición colorimétrica. Por ejemplo, puede usarse NADH o NADPH para reducir compuestos tales como 2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio, sal monosódica (WST-1) a un tinte de formezan coloreado como se muestra a continuación con el uso de metosulfato de fenazina como mediador de electrones, como se muestra en la Figura 54.

Como se muestra en la Figura 73, cuando NADH, WST-1 y PMS se combinan en concentraciones milimolares, se forma un producto amarillo (que se muestra en las puntas indicadas como Mezcla).

Usando esta química, se estableció un ensayo para LDH. Se combinaron lactato (mM), NAD (mM) y LDH y se incubaron a 37 °C durante 10 minutos antes de la adición de WST-1 y PMS. Se obtuvo una buena dosis-respuesta a LDH como se muestra en la Figura 74 para diluciones en serie de dos veces de LDH (1000 UI/L) (de izquierda a derecha) correspondientes a los valores de DO 450 nm que se muestran en el gráfico de la Figura 75.

Fosfatasa Alcalina

En otros ejemplos, los ensayos que utilizan enzimas tales como fosfatasa alcalina pueden medirse usando un sustrato cromogénico tal como p-nitrofenil fosfato. La reacción enzimática puede producir p-nitrofenol que es amarillo en condiciones alcalinas.

Iones de metal

Las mediciones también pueden realizarse en ensayos que forman un complejo coloreado, como entre un ión metálico y un colorante quelante que cambia de color al unirse. Por ejemplo, la o-cresolftaleína Complexone (que se muestra en la Figura 55) forma un complejo con calcio, que tiene un color diferente al del reactivo. El esquema general de tales ensayos es: Colorante quelante (color 1) MN+ <-> Colorante quelante: MN+: (Color 2)

Las señales ópticas también pueden medirse para ensayos de iones metálicos usando enzimas dependientes de metales. Por ejemplo, los iones de sodio pueden determinarse enzimáticamente a través de la actividad pgalactosidasa dependiente de sodio con o-nitrofenil galactósido (ONPG) como sustrato. La absorbancia a 405 nm del producto o-nitrofenol es proporcional a la concentración de sodio.

ELISA

Pueden realizarse ensayos para analitos mediante ELISA de formación de color. Se conocen muchos métodos ELISA que generan color usando enzimas tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y p galactosidasa con sustratos cromogénicos tales como o-fenilendiamina, p-nitrofenil fosfato y o-nitrofenil galactósido, respectivamente. Dichos ensayos pueden realizarse y leer fácilmente mediante la presente invención.

Inmunoensayos luminógenos

También pueden realizarse inmunoensayos luminógenos. Los ensayos pueden utilizar entidades quimioluminógenas como una enzima con un sustrato luminógeno. Por ejemplo, los compuestos quimioluminiscentes incluyen dioxetanos, ésteres de acridinio, luciferina y 2,3-dihidroftalazinedionas, tales como luminol.

Además, las fuentes quimioluminiscentes adecuadas incluyen un compuesto que se excita electrónicamente mediante una reacción química y luego puede emitir luz que sirve como señal detectable o donar energía a un aceptor fluorescente. Se ha encontrado que un número diverso de familias de compuestos proporcionan quimioluminiscencia en una variedad de condiciones. Una familia de compuestos es la 2,3-dihidro-1,4-ftalazindiona. Un compuesto de uso frecuente es el luminol, que es un compuesto de 5-amino. Otros miembros de la familia incluyen el 5-amino-6, 7, 8-trimetoxi y el análogo del dimetilamino[ca]benz. Estos compuestos pueden hacerse luminiscentes con peróxido de hidrógeno alcalino o hipoclorito de calcio y una base. Otra familia de compuestos son los 2,4,5-trifenilimidazoles, con lofina como nombre común del producto original. Los análogos quimioluminiscentes incluyen sustituyentes para-dimetilamino y -metoxi. La quimioluminiscencia también puede obtenerse con oxalatos, normalmente ésteres oxalil activos, por ejemplo, p-nitrofenilo y un peróxido como el peróxido de hidrógeno, en condiciones básicas. Otros compuestos quimioluminiscentes útiles que también se conocen incluyen ésteres de -N-alquil acridinio y dioxetanos. Alternativamente, las luciferinas pueden usarse junto con luciferasa o lucigeninas para proporcionar bioluminiscencia.

Amplificación de Ácidos Nucleicos

Los ensayos que pueden realizarse también incluyen la amplificación de ácidos nucleicos. Entre estos ensayos, la amplificación isotérmica y los ensayos de amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) son ejemplos. La amplificación de ácido nucleico puede usarse para producir productos de reacción de ensayo visiblemente turbios, fluorescentes o coloreados para analitos tales como objetivos de ácido nucleico (genes, etc.). La tecnología de amplificación de ácidos nucleicos puede usarse para la amplificación isotérmica de objetivos específicos de ADN y ARN. Se describe información adicional sobre la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos en Goto y otros, "Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue", BioTechniques, vol. 46, Núm. 3, marzo de 2009, 167-172.

La amplificación de ácidos nucleicos puede usarse para medir el ADN y, junto con el uso de transcriptasa inversa, el ARN. Una vez que se ha producido la reacción, el producto amplificado puede detectarse ópticamente usando colorantes intercalados o reactivos cromogénicos que reaccionan con el pirofosfato liberado generado como un producto secundario de la amplificación.

La reacción puede visualizarse mediante cambios (aumentos) de color, fluorescencia o turbidez. Pueden detectarse cantidades muy pequeñas de copias de ADN en menos de una hora. Esta tecnología puede leerse ventajosamente en la presente invención usando análisis de imágenes de tres colores. Como se muestra a continuación, las imágenes de los productos de reacción del ensayo de amplificación de ácido nucleico isotérmico pueden medirse mediante (1) iluminación a contraluz (óptica de transmisión) midiendo la absorbancia de la luz, (2) imágenes capturadas por una cámara digital de luz transmitida a través de un producto de reacción o (3) imágenes de luz fluorescente generadas por la iluminación de productos de reacción con una fuente de luz ultravioleta (o cualquier otra fuente de luz apropiada) capturadas por una cámara digital.

El ensayo de amplificación de ácido nucleico se realiza generalmente en un formato de "un recipiente" en el que la muestra y los reactivos se combinan en un tubo sellado y se incuban a temperatura elevada. En algunos formatos, la reacción puede controlarse en tiempo real mediante cambios en las propiedades ópticas. En otros formatos de ensayo, la reacción se detiene y los productos de reacción se visualizan después de agregar un reactivo cromogénico o fluorogénico. La presente invención permite la lectura de productos de ensayo de amplificación de ácido nucleico directamente en el recipiente de reacción o después de la aspiración en las puntas descritas en el presente documento.

Turbiedad

La invención también proporciona ensayos turbidimétricos ópticos. Por ejemplo, pueden prepararse inmunoensayos midiendo la aglutinación de pequeñas partículas de látex (50 - 300 nm). En estos ensayos, las partículas pueden recubrirse con un antígeno y/o anticuerpo y se produce la aglutinación cuando se añade una contraparte de unión en la muestra, como un anticuerpo o un antígeno. Los ensayos pueden establecerse como directos (por ejemplo, anticuerpo en la partícula que reacciona con una proteína o biomarcador multiepítopo) o en modo competitivo (por ejemplo, el hapteno del fármaco en la partícula reacciona con el anticuerpo antifármaco en competencia con el fármaco libre en la muestra). La dispersión del látex se vuelve más turbia y la turbidez puede medirse como una disminución de la transmisión de la luz usando ópticas de 3 colores.

De manera similar, pueden medirse ensayos basados en la aglutinación de partículas grandes de látex (diámetro de aproximadamente 1 um) o glóbulos rojos. La configuración del ensayo es similar a los ensayos turbidimétricos divulgados anteriormente, pero la medición puede realizarse mediante análisis de imagen (medición con escáner o cámara) usando software para interpretar el número y tamaño de los aglutinados.

Los reactivos para realizar reacciones químicas pueden incluirse en los cartuchos que se describen aquí, como en las puntas de pipeta. Los reactivos pueden almacenarse como líquidos o en formas secas, liofilizadas o vidriosas. Reactivos localizados

En algunos ejemplos, la ubicación y configuración de un sitio de reacción es un elemento importante en un dispositivo de ensayo. La mayoría, si no todos, los dispositivos de inmunoensayo desechables se han configurado con su superficie de captura como parte integral del dispositivo.

En un ejemplo, una unidad de ensayo de plástico moldeado está disponible comercialmente o puede fabricarse mediante moldeo por inyección con formas y tamaños precisos. Por ejemplo, la dimensión característica puede ser un diámetro de 0,05 - 3 mm o puede ser una longitud de 3 a 30 mm. Las unidades pueden recubrirse con reactivos de captura mediante el uso de un método similar a los usados para recubrir placas de microtitulación, pero con la ventaja de que pueden procesarse masivamente al colocarlos en un recipiente grande, añadir reactivos de recubrimiento y procesarlas mediante el uso de tamices, soportes y similares para recuperar las piezas y lavarlas según sea necesario.

La unidad de ensayo (por ejemplo, que abarca la punta divulgada en el presente documento, puntas, recipientes o cualquier otro contenedor) puede ofrecer un soporte rígido sobre el que puede inmovilizarse un reactivo. La unidad de ensayo también se elige para proporcionar características apropiadas con respecto a las interacciones con la luz. Por ejemplo, la unidad de ensayo puede fabricarse de un material, tal como vidrio funcionalizado, Si, Ge, GaAs, GaP, Siܲ, SiN⁴, silicio modificado o cualquiera de una amplia variedad de geles o polímeros tales como (poli)tetrafluoroetileno, (poli)vinilidendifluoruro, poliestireno, policarbonato, polipropileno, polimetilmetacrilato (PMMA), acrilonitrilo-butadieno-estireno (ABS), o sus combinaciones. En un ejemplo, una unidad de ensayo comprende poliestireno. En algunos ejemplos, la unidad de ensayo puede formarse a partir de un material homogéneo, material heterogéneo, material revestido, material recubierto, material impregnado y/o material incrustado. Pueden usarse otros materiales apropiados. Puede resultar ventajoso un sitio de reacción transparente. Además, en el caso de que exista una ventana ópticamente transmisiva que permita que la luz llegue a un detector óptico, la superficie puede ser ventajosamente opaca y/o, preferentemente, dispersora de la luz. En algunos ejemplos, la unidad de ensayo puede formarse a partir de un material transparente. Alternativamente, una parte de la unidad de ensayo puede formarse a partir de un material transparente.

La unidad de ensayo puede tener un reactivo recubierto y/o impregnado en ella. En algunos ejemplos, el reactivo puede ser un reactivo de captura capaz de inmovilizar un reactivo en una superficie de captura. El reactivo puede ser una célula y/o analito, o cualquier otro reactivo descrito en otra parte del presente documento. En algunos ejemplos, el reactivo puede ser una molécula que puede ser un agente de captura celular. Un agente de captura de células puede anclarse a la superficie de las células deseadas durante el transporte de fluidos. En algunos ejemplos, los reactivos de captura pueden ser un anticuerpo, péptido, molécula orgánica (por ejemplo, que puede tener una cadena lipídica, molécula lipofílica), matriz polimérica, proteína, compuesto proteico, glicoproteína, que puede interactuar con la membrana celular. Los reactivos de captura pueden ser moléculas, moléculas reticuladas, nanopartículas, nanoestructuras y/o andamiajes. En algunos ejemplos, pueden proporcionarse microestructuras que pueden convertirse en un mecanismo de análisis en un recipiente. Los reactivos de captura (que pueden incluir estructuras de captura formadas por el material de la unidad de ensayo) pueden permitir que las células sean atadas, unidas y/o atrapadas.

Los reactivos de captura pueden inmovilizar un reactivo, como una célula, durante el procesamiento. Las técnicas de captura pueden ser químicas, físicas, eléctricas, magnéticas, mecánicas, relacionadas con el tamaño, relacionadas con la densidad o cualquier combinación de las mismas. En algunos ejemplos, los reactivos de captura pueden usarse para concentrar reactivos, como células, en una ubicación deseada. Por ejemplo, una unidad de ensayo puede recubrirse con los reactivos de captura, lo que puede hacer que las células se capturen en la superficie de la unidad de ensayo, concentrando así las células en la superficie capturada. Los reactivos de captura pueden mantener el reactivo capturado inmovilizado en la superficie celular. Esto puede ayudar a mantener estacionarios los reactivos (por ejemplo, células, analitos) durante la formación de imágenes.

La inmovilización de los reactivos puede ser útil para aplicaciones en las que puede haber tiempos de adquisición prolongados para reacciones y/o detección. Por ejemplo, varias aplicaciones de imágenes pueden requerir tiempos de exposición prolongados (~1 min) o imágenes de objetos pequeños (<1 um) que pueden tener un movimiento browniano significativo.

En algunos ejemplos, los reactivos de captura pueden formarse a partir de materiales que pueden proporcionar poco o ningún fondo para la formación de imágenes. En algunos casos, el material de la unidad de ensayo puede proporcionar poco o ningún fondo para la formación de imágenes. Los reactivos de captura pueden seleccionarse de modo que no interfieran con, o solo tengan una pequeña interferencia con, la formación de imágenes y/o la detección.

Un reactivo inmovilizado en la superficie de captura puede ser cualquier cosa útil para detectar un analito de interés en una muestra de fluido corporal. Por ejemplo, tales reactivos incluyen, sin limitación, sondas de ácido nucleico, anticuerpos, receptores de membrana celular, anticuerpos monoclonales, antisueros y aptámeros reactivos a un analito específico. Pueden usarse diversos reactivos disponibles comercialmente, tales como una gran cantidad de anticuerpos policlonales y monoclonales desarrollados específicamente para analitos específicos.

Un experto en la técnica apreciará que hay muchas formas de inmovilizar diversos reactivos sobre un soporte donde puede tener lugar la reacción. La inmovilización puede ser covalente o no covalente, a través de un resto enlazador, o mediante su unión a un resto inmovilizado. Los restos de unión ilustrativos no limitantes para unir ya sea ácidos nucleicos o moléculas proteínicas tales como anticuerpos a un soporte sólido incluyen estreptavidina o enlaces avidina/biotina, enlaces carbamato, enlaces éster, amida, tioléster, tiourea (N)-funcionalizada, maleimida funcionalizada, amino, enlaces disulfuro, amida, hidrazona y entre otros. Además, puede unirse un resto sililo a un ácido nucleico directamente a un sustrato tal como vidrio mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. La inmovilización en la superficie también puede lograrse mediante un enlace de poli-L lisina, que proporciona un acoplamiento carga-carga a la superficie.

Las unidades de ensayo pueden secarse después del último paso de incorporar una superficie de captura. Por ejemplo, el secado puede realizarse mediante exposición pasiva a una atmósfera seca o mediante el uso de un múltiple al vacío y/o la aplicación de aire limpio y seco a través de un múltiple o mediante liofilización.

Puede aplicarse una superficie de captura a una unidad de ensayo usando cualquier técnica. Por ejemplo, la superficie de captura puede pintarse, imprimirse, electropulverizarse, incrustarse en el material, impregnar el material o cualquier otra técnica. Los reactivos de captura pueden recubrirse con el material de la unidad de ensayo, incorporarse en el material, co-penetrar en el material o pueden formarse a partir del material. Por ejemplo, un reactivo, como un reactivo de captura, puede incrustarse en una matriz de polímero que puede usarse como sensor.

En algunos ejemplos, una o más partículas pequeñas, como una nanopartícula, una micropartícula y/o una perla, pueden recubrirse y/o impregnarse con reactivos. En algunos ejemplos, los reactivos de captura pueden ser parte del material de la unidad de ensayo en sí, o pueden ser algo que se agrega al material.

En muchos ejemplos, una unidad de ensayo se diseña para permitir que la unidad se fabrique en procesos de fabricación rápidos y de gran volumen. Por ejemplo, las puntas pueden montarse en matrices a gran escala para el recubrimiento por lotes de la superficie de captura en o sobre la punta. En otro ejemplo, las puntas pueden colocarse en una cinta móvil o en una mesa giratoria para su procesamiento en serie. En aún otro ejemplo, pueden conectarse una gran cantidad de puntas a colectores al vacío y/o presión para su procesamiento simple.

Puede aplicarse un reactivo de captura a una unidad de ensayo durante cualquier punto del proceso. Por ejemplo, el reactivo de captura puede aplicarse a la unidad de ensayo durante la fabricación. El reactivo de captura puede aplicarse a la unidad de ensayo antes de enviar la unidad de ensayo a un destino. Alternativamente, el reactivo de captura puede aplicarse a la unidad de ensayo después de que se haya enviado la unidad de ensayo. En algunos casos, el reactivo de captura puede aplicarse a la unidad de ensayo en un punto de uso, como una ubicación de punto de servicio.

En algunos ejemplos, el reactivo de captura puede cubrir toda una superficie o región de la unidad de ensayo. El reactivo de captura puede proporcionarse en una superficie interna de la unidad de ensayo. En algunos ejemplos, el reactivo de captura puede cubrir porciones o secciones de la superficie de una unidad de ensayo. El reactivo de captura puede proporcionarse sobre una superficie siguiendo un patrón. Una unidad puede tener partes de la superficie que tengan un reactivo de captura aplicado sobre la misma, y partes de la superficie que no tengan un reactivo de captura aplicado. Por ejemplo, puede haber regiones recubiertas y no recubiertas. Puede aplicarse un reactivo de captura en una superficie de acuerdo con una elección geométrica de cómo se va a aplicar el reactivo de captura. Por ejemplo, el reactivo de captura puede aplicarse en puntos, filas, columnas, matrices, regiones, círculos, anillos o cualquier otra forma o patrón. Los reactivos de captura pueden aplicarse en las posiciones deseadas de la superficie.

Opcionalmente, puede aplicarse una pluralidad de reactivos de captura a una unidad de ensayo. En algunos ejemplos, la pluralidad de reactivos de captura puede aplicarse de modo que los diferentes reactivos de captura no se solapen (por ejemplo, los diferentes reactivos de captura no se aplican a la misma región o área).

Alternativamente, pueden solaparse (por ejemplo, los diferentes reactivos de captura pueden aplicarse a la misma región o área). Puede proporcionarse o no espacio sin reactivos de captura entre regiones con diferentes reactivos de captura. Los diferentes reactivos de captura pueden usarse para inmovilizar diferentes reactivos. Por ejemplo, pueden usarse diferentes reactivos de captura para inmovilizar diferentes células y/o analitos en la superficie de captura. Usando una pluralidad de reactivos de captura modelados en regiones seleccionadas, puede detectarse una pluralidad de reactivos de la misma unidad de ensayo. En algunos ejemplos, pueden aplicarse dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, siete o más, diez o más, quince o más, veinte o más, treinta o más, cuarenta o más, cincuenta o más, setenta o más, 100 o más, 150 o más, 200 o más, o 300 o más reactivos de captura diferentes a una superficie de una unidad de ensayo. Los diferentes reactivos de captura pueden aplicarse en cualquier patrón o forma. Por ejemplo, pueden aplicarse diferentes reactivos de captura como una matriz o serie de anillos en una superficie interna de una unidad de ensayo. Por ejemplo, pueden aplicarse diferentes reactivos de captura en una superficie interior de una punta, recipiente, contenedor, cubeta o cualquier otro contenedor descrito en otra parte del presente documento.

La ubicación de los diferentes reactivos de captura en la unidad de ensayo puede conocerse antes de la detección de los reactivos capturados. En algunos ejemplos, la unidad de ensayo puede tener un identificador que puede indicar el tipo de unidad de ensayo y/o el patrón de agentes de captura que contiene. Alternativamente, la ubicación de los diferentes reactivos de captura de la unidad de ensayo puede no conocerse antes de la detección de los reactivos capturados. La ubicación de los diferentes reactivos de captura puede determinarse basándose en patrones detectados de reactivos capturados.

Los reactivos de captura pueden aplicarse usando cualquier técnica, como las descritas en otra parte del presente documento. En algunos casos, pueden usarse técnicas de enmascaramiento o litográficas para aplicar diferentes reactivos de captura.

Cualquier descripción en el presente documento de un reactivo de captura y/o recubrimiento aplicado a una unidad de ensayo puede aplicarse a cualquier otra unidad o contenedor descrito en otra parte del presente documento, incluidas, entre otras, puntas, recipientes, cubetas o unidades de reactivo.

Conjuntos de reactivos

En muchos ejemplos de la invención, las unidades de reactivos son modulares. La unidad de reactivos puede diseñarse para permitir que la unidad se fabrique en procesos de fabricación rápidos y de gran volumen. Por ejemplo, muchas unidades de reactivos pueden llenarse y sellarse en un proceso a gran escala simultáneamente. Las unidades de reactivos pueden llenarse de acuerdo con el tipo de ensayo o ensayos a ejecutarse mediante el dispositivo. Por ejemplo, si un usuario desea ensayos diferentes a los de otro usuario, las unidades de reactivo pueden fabricarse de acuerdo con las preferencias de cada usuario, sin la necesidad de fabricar un dispositivo completo. En otro ejemplo, las unidades de reactivos pueden colocarse en una cinta móvil o en una mesa giratoria para el procesamiento en serie.

En otro ejemplo, las unidades de reactivos se alojan directamente en cavidades en la carcasa de un dispositivo. En este ejemplo, puede fabricarse un sello en áreas de la carcasa que rodean las unidades.

Los reactivos pueden incluir, sin limitación, tampones de lavado, sustratos de enzimas, tampones de dilución, conjugados, conjugados marcados con enzimas, amplificadores de ADN, diluyentes de muestras, soluciones de lavado, reactivos de pretratamiento de muestras lo que incluye aditivos tales como detergentes, polímeros, agentes quelantes, reactivos de unión a albúmina, inhibidores de enzimas, enzimas, anticoagulantes, agentes aglutinantes de glóbulos rojos, anticuerpos u otros materiales necesarios para ejecutar un ensayo en un dispositivo. Un conjugado marcado con enzima puede ser ya sea un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal marcado con una enzima que puede producir una señal detectable tras la reacción con un sustrato apropiado. Ejemplos no limitantes de tales enzimas son la fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rábano picante. En algunos ejemplos, los reactivos comprenden reactivos de inmunoensayo. En general, los reactivos, especialmente aquellos que son relativamente inestables cuando se mezclan con líquido, se confinan por separado en una región definida (por ejemplo, una unidad de reactivos) dentro del dispositivo.

En algunos ejemplos, una unidad de reactivos contiene de aproximadamente 5 microlitros a aproximadamente 1 mililitro de líquido. En algunos ejemplos, la unidad puede contener aproximadamente 20-200 microlitros de líquido. En un ejemplo adicional, la unidad de reactivos contiene 100 microlitros de fluido. En un ejemplo, una unidad de reactivos contiene aproximadamente 40 microlitros de fluido. El volumen de líquido en una unidad de reactivos puede variar en dependencia del tipo de ensayo que se ejecuta o de la muestra de fluido corporal proporcionada. En un ejemplo, los volúmenes de los reactivos no tienen que predeterminarse, pero deben ser más que un mínimo conocido. En algunos ejemplos, los reactivos se almacenan inicialmente secos y se disuelven tras el inicio del ensayo que se ejecuta en el dispositivo.

En un ejemplo, las unidades de reactivos pueden llenarse mediante el uso de un sifón, un embudo, una pipeta, una jeringa, una aguja o una de sus combinaciones. Las unidades de reactivos pueden llenarse con líquido mediante el uso de un canal de llenado y un canal de extracción por vacío. Las unidades de reactivos pueden llenarse individualmente o como parte de un proceso de fabricación masivo.

En un ejemplo, una unidad de reactivos individual comprende un reactivo diferente como un medio para aislar los reactivos entre sí. Las unidades de reactivos también pueden usarse para contener una solución de lavado o un sustrato. Además, las unidades de reactivos pueden usarse para contener un sustrato luminógeno. En otro ejemplo, una pluralidad de reactivos se contiene dentro de una unidad de reactivos.

En algunos casos, la configuración del dispositivo permite la capacidad de precalibrar las unidades de ensayo y las unidades de reactivos antes de ensamblar los desechables del dispositivo del sujeto.

Ensayos de unión a aptámeros

La presente invención permite una variedad de métodos de ensayo basados en el uso de elementos de unión que se unen específicamente a uno o más analitos en una muestra. En general, un elemento de unión es un miembro de un par de unión capaz de unirse específica y selectivamente al otro miembro del par de unión en presencia de una pluralidad de moléculas diferentes. Los ejemplos de elementos de unión incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, antígenos, ligandos de unión a metales, cebadores y sondas de ácido nucleico, receptores y reactivos como se describe en el presente documento, y aptámeros. En algunos ejemplos, un elemento de unión usado para detectar un analito es un aptámero. El término aptámero se usa para referirse a un péptido, ácido nucleico o una combinación de los mismos que se selecciona por su capacidad para unirse específicamente a uno o más analitos objetivo. Los aptámeros peptídicos son agentes de afinidad que generalmente comprenden uno o más dominios de bucle variable presentados en la superficie de una proteína de andamiaje. Un aptámero de ácido nucleico es un oligonucleótido de unión específico, que es un oligonucleótido que es capaz de formar selectivamente un complejo con un analito objetivo deseado. La complejación es específica del objetivo en el sentido de que otros materiales, como otros analitos que pueden acompañar al analito objetivo, no forman complejos con el aptámero con una afinidad tan grande. Se reconoce que la complejación y la afinidad son una cuestión de grado; sin embargo, en este contexto, "específico del objetivo" significa que el aptámero se une al objetivo con un grado de afinidad mucho mayor que el que se une a los materiales contaminantes. El significado de especificidad en este contexto es, por tanto, similar al significado de especificidad aplicado a anticuerpos, por ejemplo. El aptámero puede prepararse mediante cualquier método conocido, incluidos los métodos sintéticos, recombinantes y de purificación. Además, el término "aptámero" también incluye "aptámeros secundarios" que contienen una secuencia consenso derivada de la comparación de dos o más aptámeros conocidos con un objetivo dado.

En general, los aptámeros de ácido nucleico tienen una longitud de aproximadamente 9 a aproximadamente 35 nucleótidos. En algunos ejemplos, un aptámero de ácido nucleico es al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 100 o más residuos de longitud. Aunque los oligonucleótidos de los aptámeros generalmente son monocatenarios o bicatenarios, se contempla que los aptámeros a veces pueden asumir estructuras de cadena triple o cuádruple. En algunas modalidades, un aptámero de ácido nucleico es circular, como en el documento US20050176940. Los oligonucleótidos de unión específica de los aptámeros deben contener la especificidad que confiere la secuencia, pero pueden extenderse con regiones flanqueantes y derivatizarse o modificarse de otro modo. Los aptámeros que se unen a un analito objetivo pueden aislarse, secuenciarse y luego volver a sintetizarse como restos de ADN o ARN convencionales, o pueden ser oligómeros modificados. Estas modificaciones incluyen, pero no se limitan a la incorporación de: (1) formas modificadas o análogas de azúcares (por ejemplo, ribosa y desoxirribosa); (2) grupos de enlace alternativos; o (3) formas análogas de bases de purina y pirimidina.

Los aptámeros de ácido nucleico pueden comprender ADN, ARN, bases de ácido nucleico funcionalizadas o modificadas, análogos de ácido nucleico, químicas de la cadena principal modificadas o alternativas, o combinaciones de los mismos. Los oligonucleótidos de los aptámeros pueden contener las bases convencionales adenina, guanina, citosina y timina o uridina. Incluidos dentro del término aptámeros están los aptámeros sintéticos que incorporan formas análogas de purinas y pirimidinas. Las formas "análogas" de purinas y pirimidinas son las generalmente conocidas en la técnica, muchas de las cuales se usan como agentes quimioterapéuticos. Ejemplos no limitantes de formas análogas de purinas y pirimidinas (es decir, análogos de bases) incluyen aziridinilcitosina, 4-acetilcitosina, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluraladenina6, inospentecilo, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5-metoxiuracilo, 2-metil-tio-N6-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ácido uracil-5-oxiacético, 5-pentinil-uracilo y 2,6-diaminopurina. El uso de uracilo como base sustituta de timina en ácido desoxirribonucleico (en lo sucesivo denominado "dU") se considera una forma "análoga" de pirimidina en esta invención.

Los oligonucleótidos de aptámero pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que se conocen en la técnica, incluyendo pero no limitándose a azúcares 2' sustituidos como la 2-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares alfa-anoméricos, azúcares epiméricos como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosa, azúcares furanosa, sedoheptulosas, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácido peptídico nucleico (PNA), análogos acíclicos y análogos de nucleósidos básicos tales como metil ribósido.

Los aptámeros también pueden incluir intermedios en su síntesis. Por ejemplo, cualquiera de los grupos hidroxilo normalmente presentes puede reemplazarse por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse con un grupo protector estándar o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleótidos o sustratos adicionales. El terminal 5' de OH está convencionalmente libre pero puede estar fosforilado; los sustituyentes OH en el extremo 3' también pueden fosforilarse. Los hidroxilos también pueden derivatizarse a grupos protectores estándar. Pueden reemplazarse uno o más enlaces fosfodiéster por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, entre otros, ejemplos en donde P(O) se reemplaza por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), P(O)NR 2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH 2 ("formacetal"), en donde cada R o R' es independientemente H o alquilo (1-20C.) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o aralquilo.

Un ejemplo particular de aptámeros que son útiles se basa en aptámeros de ARN como se divulga en la patente de Estados Unidos núm. 5,270,163 y 5,475,096. Las patentes mencionadas anteriormente describen el método SELEX, que implica la selección de una mezcla de oligonucleótidos candidatos e iteraciones escalonados de unión, partición y amplificación, usando el mismo esquema de selección general, para lograr virtualmente cualquier criterio deseado de afinidad y selectividad de unión. Partiendo de una mezcla de ácidos nucleicos, que comprende preferiblemente un segmento de secuencia aleatoria, el método SELEX incluye pasos de poner en contacto la mezcla con un objetivo, como un analito objetivo, en condiciones favorables para la unión, dividiendo los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se han unido específicamente a moléculas objetivo, disociando los complejos de ácido nucleico-objetivo, amplificando los ácidos nucleicos disociados de los complejos de ácido nucleico-objetivo para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida con ligandos, luego reiterando los pasos de unión, partición, disociación y amplificación a través de tantos ciclos como se desee para producir ligandos de ácido nucleico de alta afinidad y altamente específicos para la molécula objetivo. En algunos ejemplos, se emplea un cribado negativo en el que una pluralidad de aptámeros se exponen a analitos u otros materiales que probablemente se encuentren junto con los analitos objetivo en una muestra a analizar, y solo se retienen los aptámeros que no se unen.

El método SELEX abarca la identificación de ligandos de ácido nucleico de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas al ligando, tales como estabilidad in vivo mejorada o características de administración mejoradas. Ejemplos de tales modificaciones incluyen sustituciones químicas en las posiciones de ribosa y/o fosfato y/o base. En algunos ejemplos, se unen dos o más aptámeros para formar una única molécula de aptámero multivalente. Las moléculas de aptámeros multivalentes pueden comprender múltiples copias de un aptámero, cada copia se dirige al mismo analito, dos o más aptámeros diferentes se dirigen a diferentes analitos, o combinaciones de estos.

Los aptámeros pueden usarse como reactivos de diagnóstico y pronóstico, como reactivos para el descubrimiento de nuevas terapias, como reactivos para monitorear la respuesta a fármacos en individuos y como reactivos para el descubrimiento de nuevos objetivos terapéuticos. Los aptámeros pueden usarse para detectar, modificar la función o interferir o inhibir la función de uno o más analitos objetivo. El término "analitos", como se usa en el presente documento incluye, sin limitación, fármacos, profármacos, agentes farmacéuticos, metabolitos de fármacos, biomarcadores tales como proteínas expresadas y marcadores celulares, anticuerpos, proteínas séricas, colesterol y otros metabolitos, electrolitos, iones metálicos, polisacáridos, ácidos nucleicos, analitos biológicos, biomarcadores, genes, proteínas u hormonas, o cualquiera de sus combinaciones. Los analitos pueden ser combinaciones de polipéptidos, glicoproteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos. Los aptámeros pueden inhibir la función de los productos génicos mediante cualquiera de los siguientes mecanismos, pero sin limitarse a ellos: (i) modular la afinidad de una interacción proteína-proteína; (ii) modular la expresión de una proteína a nivel transcripcional; (iii) modular la expresión de una proteína a un nivel postranscripcional; (iv) modular la actividad de una proteína; y (v) modular la ubicación de una proteína. El mecanismo de acción preciso de los aptámeros peptídicos puede determinarse por medios bioquímicos y genéticos para determinar su función específica en el contexto de su interacción con otros genes y productos génicos.

Los aptámeros pueden usarse para detectar un analito en cualquiera de los esquemas de detección descritos en el presente documento. En un ejemplo, los aptámeros se acoplan de forma covalente o no covalente a un sustrato. Los ejemplos no limitantes de sustratos a los que pueden acoplarse aptámeros incluyen microarreglos, microperlas, puntas de pipeta, dispositivos de transferencia de muestras, cubetas, tubos capilares u otros tubos, cámaras de reacción o cualquier otro formato adecuado compatible con el sistema de detección del sujeto. La producción de microarreglos de biochip puede emplear diversas técnicas de fabricación de semiconductores, como la química de fase sólida, la química combinatoria, la biología molecular y la robótica. Un proceso que se usa típicamente es un proceso de fabricación fotolitográfica para producir microarreglos con millones de sondas en un solo chip. Alternativamente, si las sondas están pre-sintetizadas, pueden unirse a la superficie de una matriz usando técnicas tales como bombeo de micro-canales, manchado por "chorro de tinta", estampado de plantillas o fotorreticulación. Un proceso fotolitográfico ilustrativo comienza recubriendo una oblea de cuarzo con un compuesto químico sensible a la luz para evitar el acoplamiento entre la oblea de cuarzo y el primer nucleótido de la sonda de ADN que se crea. Se usa una máscara litográfica para inhibir o permitir la transmisión de luz en ubicaciones específicas de la superficie de la oblea. A continuación, la superficie se pone en contacto con una solución que puede contener adenina, timina, citosina o guanina, y el acoplamiento se produce sólo en aquellas regiones del vidrio que se han desprotegido mediante la iluminación. El nucleótido acoplado lleva un grupo protector sensible a la luz, lo que permite que el ciclo pueda repetirse. De esta manera, el microarreglo se crea a medida que las sondas se sintetizan mediante ciclos repetidos de desprotección y acoplamiento. El proceso puede repetirse hasta que las sondas alcancen su longitud total. Las matrices disponibles comercialmente se fabrican normalmente con una densidad de más de 1,3 millones de características únicas por matriz. Dependiendo de las demandas del experimento y del número de sondas requeridas por matriz, cada oblea puede cortarse en decenas o cientos de matrices individuales.

Pueden usarse otros métodos para producir el biochip. El biochip puede ser una película de Langmuir-Bodgett, vidrio funcionalizado, germanio, silicio, PTFE, poliestireno, arseniuro de galio, oro, plata, membrana, nailon, PVP o cualquier otro material conocido en la técnica que sea capaz de tener grupos funcionales tales como amino, carboxilo, reactivos de Diels-Alder, tiol o hidroxilo incorporado en su superficie. A continuación, estos grupos pueden unirse covalentemente a agentes de reticulación, de modo que la posterior unión de los ligandos de ácido nucleico y su interacción con las moléculas objetivo se producirán en solución sin impedimentos del biochip. Los grupos de reticulación típicos incluyen oligómeros de etilenglicol, diaminas y aminoácidos. Alternativamente, los aptámeros pueden acoplarse a una matriz usando procedimientos enzimáticos, como se describe en el documento US20100240544.

En algunos ejemplos, los aptámeros se acoplan a la superficie de una microperla. Las microperlas útiles en el acoplamiento a oligonucleótidos son conocidas en la técnica e incluyen perlas magnéticas, magnetizables y no magnéticas. Las microperlas pueden marcarse con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más colorantes para facilitar la codificación de las perlas y la identificación de un aptámero unido a las mismas. La codificación de microperlas puede usarse para distinguir al menos 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 5000 o más microperlas diferentes en un solo ensayo, cada microperla correspondiente a un aptámero diferente con especificidad para un analito diferente.

En algunos ejemplos, los reactivos se acoplan a la superficie de una cámara de reacción, como una punta. Por ejemplo, la superficie interior de una punta puede recubrirse con un aptámero específico para un solo analito. Alternativamente, la superficie interior de una punta puede recubrirse con dos o más aptámeros diferentes específicos para diferentes analitos. Cuando dos o más aptámeros diferentes se acoplan a la misma superficie interior de la punta, cada uno de los diferentes aptámeros puede acoplarse en diferentes ubicaciones conocidas, como formando anillos o bandas ordenados distintos en diferentes posiciones a lo largo del eje de una punta. En este caso, pueden analizarse múltiples analitos diferentes en la misma muestra extrayendo una muestra por una punta y permitiendo que los analitos contenidos en la muestra se unan con los aptámeros recubiertos en posiciones sucesivas a lo largo de la punta. Los eventos de unión pueden visualizarse entonces como se describe en el presente documento, con la ubicación de cada banda en un patrón de bandas correspondiente a un analito conocido específico.

En algunos ejemplos, la unión de uno o más aptámeros a uno o más analitos objetivo se detecta usando una característica óptica. En algunos ejemplos, la característica óptica es la fluorescencia. En algunos ejemplos, una muestra que contiene analitos a analizar se trata con un compuesto de marcaje para conjugar los analitos con un marcador fluorescente. La unión puede medirse luego por fluorescencia para detectar la presencia y opcionalmente la cantidad de uno o más analitos, como se ilustra en la Figura 136 en combinación con aptámeros acoplados a una matriz, y en la Figura 137 en combinación con aptámeros acoplados a perlas codificadas. En algunos ejemplos, la muestra se trata con un compuesto marcador para conjugar los analitos con un enlazador. Tras la unión, el enlazador se funcionaliza con un marcador fluorescente y el evento positivo se mide por fluorescencia. En algunos ejemplos, el dominio de unión al analito de un aptámero se hibrida parcialmente con una sonda complementaria que está marcada con fluorescencia. Tras la unión al analito, se libera la sonda complementaria, lo que da como resultado una disminución ópticamente medible de la señal fluorescente. En algunos ejemplos, un aptámero se marca con fluorescencia y se hibrida parcialmente con una sonda complementaria marcada con un atenuador que se encuentra en las proximidades del marcador fluorescente. Tras la unión al analito, la sonda complementaria se libera dando como resultado un aumento medible de la fluorescencia del marcador conjugado con el aptámero. En algunos ejemplos, el aptámero se hibrida parcialmente con una sonda complementaria, cuya hibridación ocluye un dominio que contiene una estructura secundaria. Tras la unión al analito, se libera la sonda complementaria y la estructura secundaria se pone a disposición de un colorante intercalante usado para producir una señal medible. Los marcadores útiles en la detección de la unión entre un aptámero y un analito en un par de unión pueden incluir, por ejemplo, fluoresceína, tetrametilrodamina, rojo Texas o cualquier otra molécula fluorescente conocida en la técnica. El nivel de marcador detectado en cada dirección del biochip variará entonces con la cantidad de analito objetivo en la mezcla que se está analizando.

En algunos ejemplos, la sonda complementaria desplazada se conjuga con un miembro de un par de afinidad, como la biotina. A continuación, se conjuga una molécula detectable con el otro miembro del par de afinidad, por ejemplo, avidina. Después de aplicar la mezcla de prueba al biochip, se agrega la molécula detectable conjugada. La cantidad de molécula detectable en cada sitio del biochip variará inversamente con la cantidad de molécula objetivo presente en la mezcla de prueba. En otro ejemplo, la sonda complementaria desplazada estará marcada con biotina y puede detectarse mediante la adición de avidina marcada con fluorescencia; la avidina misma se unirá luego a otro compuesto conjugado con biotina marcado con fluorescencia. El grupo biotina en el oligonucleótido desplazado también puede usarse para unir una enzima informadora ligada a avidina; la enzima luego catalizará una reacción que conducirá a la deposición de un compuesto detectable. Alternativamente, la enzima informadora catalizará la producción de un producto insoluble que apagará localmente la fluorescencia de un biochip intrínsecamente fluorescente. En otro ejemplo del ensayo de desplazamiento, la sonda complementaria desplazada se marcará con una sonda detectable inmunológicamente, como digoxigenina. La sonda complementaria desplazada se unirá entonces a un primer conjunto de anticuerpos que reconocen específicamente la sonda. A continuación, estos primeros anticuerpos serán reconocidos y unidos por un segundo conjunto de anticuerpos que se marcan con fluorescencia o se conjugan con una enzima informadora. Se conocen muchas variaciones de estos ejemplos o se les ocurrirán ahora a los expertos en la técnica. También pueden establecerse ensayos análogos a los ELISA de "doble sándwich" usando combinaciones de anticuerpos y aptámeros como receptores. Por ejemplo, una superficie de captura puede funcionalizarse con un aptámero y el reactivo de detección puede ser un anticuerpo marcado con enzima. Por el contrario, el anticuerpo puede estar en la superficie de captura y el reactivo de detección en un aptámero marcado.

En algunos ejemplos, una muestra que contiene un analito a analizar se dispersa en una matriz de hidrogel tridimensional. La matriz de hidrogel puede activarse para atrapar de forma covalente proteínas y moléculas pequeñas. Después de un lavado del exceso de muestra no unida, pueden introducirse aptámeros marcados con fluorescencia para la detección de los analitos específicos presentes, como se ilustra en la Figura 138. En algunos ejemplos, la matriz de hidrogel tridimensional se divide en pequeños subconjuntos o micropocillos a los que puede añadirse un único aptámero para someterse a un análisis específico del analito presente. En algunos ejemplos, los aptámeros se marcan con un conjunto de puntos cuánticos codificados o marcadores fluorescentes correspondientes a una firma única. En algunos ejemplos, los aptámeros marcados se agregan a la matriz tridimensional simultáneamente con la muestra.

En algunos ejemplos, se usa un aptámero en lugar de un anticuerpo en un ensayo ELISA. En general, una muestra se expone a una superficie y se acopla específica o inespecíficamente a la misma. En un ELISA tipo sándwich, un analito se acopla específicamente a una superficie uniéndose al primer anticuerpo que se acopla a la superficie. En un ELISA típico, el analito, ya sea unido de manera específica o no específica, se detecta luego uniéndose a un segundo anticuerpo que lleva un marcador. En un ELISA de aptámero, el primer anticuerpo, el segundo anticuerpo o ambos se reemplazan por aptámeros específicos para un analito.

Análisis de imágenes de muestras y productos de reacción de ensayo

En algunas modalidades de la invención, el análisis de la muestra y los productos de la reacción del ensayo pueden realizarse usando imágenes digitales. Las cubetas de ensayo pueden alinearse para la medición y escanear u obtener imágenes en una sola operación. En el sistema instrumentado de la invención esto se consigue automáticamente mediante componentes mecánicos. Las cubetas de ensayo se ubican en ubicaciones definidas en un cartucho y se mueven al escáner manteniendo la misma orientación y espaciado. El gráfico que se muestra en la Figura 92 corresponde a la respuesta del canal verde sobre el ancho de la cubeta. Como se muestra, los bordes de las cubetas están bien definidos, al igual que la ubicación correspondiente al centro de la cubeta.

Las imágenes obtenidas mediante escaneo o formación de imágenes pueden ser una matriz bidimensional de píxeles, donde cada píxel comprende una pluralidad de valores de intensidad correspondientes a una región espectral de detección distinta (por ejemplo, rojo, azul, verde). Las imágenes pueden interpretarse mediante escaneos de líneas, que pueden corresponder a una parte horizontal de una punta. Si la punta tiene forma circular, entonces puede determinarse una absorbancia efectiva desconvolucionando la línea de barrido sobre una función apropiada. Las funciones de ejemplo incluyen funciones parabólicas y funciones para círculos. En algunas modalidades, las imágenes pueden promediarse sobre múltiples imágenes tomadas de una punta o una muestra en una variedad de ubicaciones físicas.

En una modalidad, se proporciona un sensor para localizar una unidad de ensayo con respecto a un detector cuando se detecta un ensayo.

Como se muestra en la Figura 61 y la Figura 62, las soluciones de azul de bromofenol se aspiraron en un conjunto de puntas cónicas y se tomaron imágenes con iluminación de la cara frontal (fuente de luz y detector en el mismo lado del objeto). Se usaron pequeños volúmenes (5 uL) de diluciones seriadas de una solución de 0,78 mg/mL con la concentración más alta en la parte superior de la imagen. En la Figura 61, las puntas de la izquierda tienen la muestra ubicada en la ubicación más ancha de la punta cónica, mientras que las puntas de la derecha tienen la muestra en la parte más estrecha. La imagen de la Figura 61 se tomó usando un sistema óptico de escaneo.

La Figura 62 muestra puntas que fueron fotografiadas usando una configuración retroiluminada (fuente de luz y detector en lados opuestos del objeto fotografiado). Puede preferirse la configuración retroiluminada debido a la mayor calidad de imagen.

Como se muestra en la Figura 61 y la Figura 62, la longitud de la trayectoria óptica efectiva de una solución coloreada puede variarse cambiando el diseño de la punta. En particular, la longitud de la trayectoria puede variarse dentro de una sola punta para aumentar la sensibilidad de la medición de la absorbancia de la luz (longitud de la trayectoria larga) o para aumentar el intervalo dinámico de la medición. La longitud de la trayectoria puede cambiarse, por ejemplo, cambiando el diámetro de la punta.

Una característica adicional del diseño de la punta puede ser que permite leer los ensayos con un volumen muy pequeño de producto de reacción del ensayo que requiere un volumen muy pequeño de muestra. Normalmente, las mezclas de reacción de ensayo se incuban en una parte estrecha de una punta que proporciona una alta relación de área de superficie de líquido/aire a volumen, minimizando así la evaporación. A continuación, el pequeño volumen puede moverse a una parte ancha de la punta para medir el producto coloreado, maximizando así la longitud de la trayectoria óptica disponible (y aumentando así la absorbancia de la luz) para un volumen de mezcla de reacción dado.

Por ejemplo, en la siguiente tabla, comparamos la lectura de una mezcla de reacción de ensayo de 10 uL en la que una muestra de 1 uL se diluye 1:10. En las puntas de la presente invención, la incubación de una mezcla de ensayo puede lograrse en una longitud de 13 mm de la región de la punta que tiene un diámetro de 1 mm y luego puede moverse a una región de 3 mm de diámetro para la medición del color. En comparación con el uso de una placa de microtitulación de dimensiones estándar (típica de las placas de 384 pocillos) para incubar y leer el mismo ensayo, el área de la superficie del líquido expuesta al aire (que permite la evaporación) es aproximadamente 5 veces menor y la longitud de la trayectoria óptica es aproximadamente el doble de grande.

Optimización de la longitud de la trayectoria óptica

Las mediciones espectroscópicas de solutos coloreados se miden tradicionalmente registrando la fracción de luz transmitida a través de una cubeta en el máximo de longitud de onda de absorbancia. A continuación, los datos se transforman para dar valores de absorbancia (A) o densidad óptica (DO). De acuerdo con la ley de Beer, A(Amax) = ^eM*1'Concentración donde ^eM es el producto de extinción molar (L/Mole.cm), 1 es la longitud de la trayectoria óptica (cm) y la Concentración está en unidades molares. OD = A para 1 = 1. Esto se hace para proporcionar una medida, A, que es directamente proporcional a la concentración de soluto.

Hay dos limitaciones importantes de las mediciones de absorbancia para analizar las concentraciones de solutos. A bajas concentraciones, el cambio en la transmisión es pequeño y, por lo tanto, impreciso debido a las variaciones en la transmisión de fondo (o en blanco). A altas concentraciones, la transmisión es muy baja (por ejemplo, en A = 3, la luz transmitida es 1/1000 de la luz de entrada. Cualquier luz "parásita" u otras formas de ruido de señal tienen un efecto significativo en la medición y la respuesta a la concentración se vuelve no lineal e imprecisa. Normalmente, las mediciones de absorbancia se consideran precisas y exactas en un intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,0 (un intervalo de 20 veces).

El método de la presente invención supera estos problemas en un grado significativo al permitir mediciones fáciles de color en un intervalo dinámico muy amplio (hasta 1000 veces):

1. En diferentes trayectorias: pueden medirse concentraciones bajas en trayectorias largas y concentraciones altas en trayectorias cortas.

2. En diferentes canales de color: pueden medirse concentraciones bajas en el canal de color que mejor coincide y concentraciones altas en los canales de color que no coinciden con el color.

Esto se ilustra con los datos que se muestran en la Figura 79. Las soluciones de azul de bromofenol diluidas en serie a partir de una solución madre de 5 mg/mL se analizaron usando el método de tres colores en puntas en dos ubicaciones, una con una longitud de trayectoria máxima (también "longitud de trayectoria" en el presente documento) de aproximadamente 5 mm ("ancho"), el otro de aproximadamente 1 mm ("estrecho"). Las señales en los tres canales de color se normalizaron a sus niveles más alto y más bajo, como se muestra en el gráfico a continuación. Se estableció un algoritmo para extraer de manera óptima la concentración del analito (azul de bromofenol) de la siguiente manera:

1. Para señales normalizadas en el intervalo 10 % máximo < señal < 90 % máximo, calcular un valor de concentración = a b*Log(señal) c* (Log(señal))A2 donde a b y c son constantes arbitrarias. Esta operación se realizó para cada color en ambos trazados.

2. Con una rutina de optimización conocida (por ejemplo, "Solver" en Microsoft Excel), calcular los valores de mejor ajuste de a, b y c para todos los colores y longitudes de trayectoria.

3. Promediar los valores de concentración calculados para todos los colores y ambas longitudes de trayectoria. Como se muestra en la Figura 80, el método produjo resultados precisos en un intervalo de concentración de 1000 veces. Cuando se usó el algoritmo para calcular los valores de concentración para las mediciones repetidas (N = 3), el CV promedio fue del 3,5 %.

Las mediciones pueden realizarse en varias longitudes de trayectoria. En algunos casos, las longitudes de trayectoria dependen al menos parcialmente de la geometría del contenedor (por ejemplo, cubeta, punta, vial). La geometría del contenedor y/o las características en el contenedor, como las características de dispersión, pueden afectar la trayectoria óptica y la longitud de la trayectoria en el contenedor.

Análisis multicolor

Los escáneres y las cámaras tienen detectores que pueden medir una pluralidad de regiones del espectro de detección de canales de diferentes colores (por ejemplo, rojo, verde y azul). Debido a que el ancho espectral de cada uno de estos canales es amplio y las químicas de color producen productos coloreados con anchos de banda amplios, los productos de reacción coloreados pueden detectarse usando una pluralidad de espectros de detección de canales. Por ejemplo, la Figura 71 muestra la respuesta de los espectros del canal de detección rojo (cuadrados), verde (diamantes) y azul (triángulos) en función de la concentración de analito. Las señales producidas por cada detector corresponden a la intensidad de la luz dentro de cada espectro de detección y normalmente se expresan como un número de 0 a 255. Cuando la luz blanca se transmite a través de una cubeta de sección circular que contiene un soluto de color como se muestra arriba, la luz se absorbe y la intensidad de la luz se reduce de modo que las respuestas del detector cambian.

Por ejemplo, cuando el azul de bromofenol se disuelve en tampón alcalino en concentraciones que van de 0 a 5 mg/mL y se escanea en la ubicación indicada "C3" en la Figura 62, las señales que se muestran en la Figura 66, que son las respuestas del detector promediadas sobre una zona correspondiente a siete píxeles a lo largo de la cubeta. Las señales se registraron en un escáner retroiluminado Epson. La Figura 66 muestra las tres respuestas de color para un conjunto de 11 cubetas que contienen diluciones seriadas al doble de una solución de azul de bromofenol de 5 mg/mL y una solución "en blanco" (dispuestas de izquierda a derecha en la imagen). La imagen de las puntas escaneadas se muestra en la Figura 67. La señal en cada canal correspondiente a la solución se reduce en una medida relacionada con la trayectoria óptico. Por consiguiente, el cambio máximo de señal se ve en el centro de la cubeta. Cuando se promediaron las señales en la región central de la cubeta (sobre la zona mostrada por los pequeños rectángulos para la cuarta cubeta desde la izquierda) y se representaron frente a la concentración de azul de bromofenol, se observaron las respuestas a la dosis que se muestran en la Figura 68. En cada "canal" de color, la señal declinó suavemente con la concentración. La señal verde cambió más y la señal azul menos. También se muestran las densidades ópticas correspondientes medidas en un espectrómetro M5 (Molecular Devices) a la longitud de onda de absorbancia máxima (por ejemplo, 589 nm). A las concentraciones más altas, la respuesta del espectrofotómetro se vuelve no lineal y cambia muy poco con la concentración. Se observó un efecto similar en las respuestas de los canales verde y rojo del escáner. La respuesta del canal azul en contraste, es muy leve hasta las concentraciones más altas.

De acuerdo con la ley de Beer, la absorbancia de una solución es igual a £M*Concentración*longitud de trayectoria. La absorbancia se define como Log10 (Transmisión/Transmisión en blanco), donde la transmisión en blanco es la correspondiente a la del disolvente. Estrictamente, la ley de Beer se aplica a un haz paralelo de luz monocromática (en la práctica, un ancho de banda de unos pocos nm) que pasa normalmente a través de una cubeta rectangular. Los espectrofotómetros responden linealmente a la concentración hasta valores de absorbancia de aproximadamente 1,5. A mayor absorbancia, la respuesta del instrumento se vuelve no lineal debido a la "luz parásita" y otros efectos. La densidad óptica se define como la absorbancia para una longitud de trayectoria óptica de un cm.

Cuando los datos de la señal de color del experimento anterior se transformaron de acuerdo con una expresión que linealiza la transmisión óptica para obtener un valor de absorbancia proporcional a la concentración en espectrofotometría convencional (-Log (señal/señal en blanco), se obtuvo el gráfico que se muestra en la Figura 69 para los canales verde (cuadrados) y rojo (diamantes).

Los datos del canal verde siguieron la ley de Beer, pero los datos del canal rojo no alcanzaron un nivel de meseta para una muestra que tenía aproximadamente 2 mg/mL de una manera similar a la respuesta de DO del espectrofotómetro.

Utilización mejorada del ensayo mediante análisis de tres colores y optimización de la longitud de la trayectoria óptica

Los resultados del ensayo de configuraciones de reacción que de otro modo proporcionarían datos no interpretables pueden recuperarse usando la presente invención. La presente invención permite aumentar el intervalo dinámico y la sensibilidad de los ensayos mediante la combinación de optimización de la longitud de trayectoria óptica y análisis de tres colores. La incapacidad para recuperar datos plagados de un intervalo dinámico reducido es un problema importante en la gestión de ensayos, especialmente en el contexto de muestras que se evalúan con fines de gestión de diagnóstico o terapia, es que los ensayos tienen un intervalo dinámico limitado o un intervalo limitado de valores de analitos que pueden informarse con buena confianza. Hay dos razones principales por las que el resultado de un ensayo puede no estar disponible en los sistemas de ensayo de laboratorio o en situaciones de prueba distribuidas. Es decir, el valor del analito es demasiado alto o demasiado bajo para informarlo. En algunas circunstancias, esto puede rectificarse en laboratorios clínicos volviendo a analizar una parte de una muestra retenida con una dilución diferente. En las pruebas distribuidas normalmente no hay otro recurso que recuperar al paciente, obtener una nueva muestra y usar un método (de laboratorio) diferente. Esto se debe a que los sistemas de ensayo usan protocolos fijos y niveles fijos de dilución de la muestra. En cualquier situación, es muy inconveniente y costoso rectificar el problema. Además, puede perderse información valiosa pertinente para un diagnóstico y/o tratamiento adecuados con el consiguiente daño para el paciente.

En el sistema de la presente invención, estos problemas se eliminan mediante el seguimiento de los ensayos durante su ejecución, reconociendo cualquier problema y modificando la trayectoria óptica usada para medir el producto del ensayo o haciendo uso de los diferentes niveles de sensibilidad de los tres canales de color al color del ensayo y, a su vez, a la sensibilidad del analito.

Específicamente, cuando se mide el producto de reacción del ensayo si la señal medida es demasiado alta o demasiado baja, el sistema puede responder de la siguiente manera:

1. realizar la medición con una longitud de trayectoria diferente (moviendo la cubeta óptica en relación con el sistema óptico de manera que la longitud de trayectoria sea mayor o menor). Esto puede realizarse (a) realizar una medición en una primera ubicación estándar, (b) informar el resultado al software que gestiona el ensayo (en el instrumento y/o en un servidor remoto), (c) reconocer una condición de problema, y (d) modificar la posición de lectura y realizar una segunda medición; y/o

2. enfatizar un canal de color más o menos sensible en el análisis de señales. Esto puede implementarse automáticamente mediante algoritmos de análisis de ensayo adecuados.

Calibración de color

Las respuestas de la señal pueden calibrarse para permitir el cálculo de la concentración de las especies coloreadas a partir de datos de imágenes. Para obtener una transformada de datos predictiva de la concentración del soluto coloreado, puede usarse el siguiente procedimiento. En otras modalidades, también pueden usarse otros métodos.

1. Para cada canal para todas las concentraciones, se calculó la transformada -Log (señal/señal en blanco) y se designó "A".

2. Para todas las concentraciones, se calculó una transformación adicional ("C") como un*A b*AA2 c*AA3 (inicialmente los valores para a, b y c se establecieron en valores arbitrarios).

3. Para todas las concentraciones, los valores de C para los tres canales de color se sumaron y se denominaron Cestimate.

4. Se calculó la suma de las diferencias cuadradas entre la concentración objetivo (conocida) y Cestimate para todas las concentraciones.

5. Los valores de los parámetros de la banda c para todos los canales se obtuvieron mediante un algoritmo bien conocido que minimizó la suma de las diferencias cuadradas.

Los resultados que se muestran en la Figura 70 demuestran una calibración precisa de la respuesta del escáner en todo el intervalo de concentración.

Se han desarrollado otros algoritmos de calibración automatizados y se ha encontrado que son igualmente efectivos. Por ejemplo, el siguiente es un ejemplo de calibración para un ensayo de colesterol realizado en una punta de reacción.

La señal medida se descompone en canales de color Rojo (R), verde (G) y Azul (B). Las ecuaciones de calibración se calculan para optimizar la exactitud, precisión e intervalo dinámico de acuerdo con los requisitos de diseño del ensayo.

En este ejemplo de ensayo, solo se usan los canales Rojo y Verde para calcular la concentración. Estas dos señales se transforman para calcular una variable intermedia (F) de la siguiente manera:

F = px + p2 ■ G /?3 • G2 + p4 ■ R ps ■ R2,

donde p, son los parámetros de calibración.

Finalmente, la señal F se utiliza para calcular la concentración (C) mediante una transformación lineal:

CJ F-Pe)/ ,

/ P l

donde C es la concentración calculada y p6 y p7 son parámetros de calibración, en este caso, representan los parámetros de intersección y pendiente de una relación lineal, respectivamente.

Cuando se siguió el mismo enfoque para un gran conjunto de ensayos para una variedad de analitos que produjeron productos coloreados que abarcaban todo el espectro visible (Amax desde 400-700 nm), se obtuvieron resultados comparables.

En las mediciones espectrofotométricas de transmisión convencionales, se usa un valor "en blanco" para normalizar la medición. Método (1) Los espacios en blanco se construyen típicamente midiendo una muestra que es equivalente a la muestra pero que no tiene ninguno de los componentes a medir. La medición se realiza típicamente en la misma cubeta que se usará para la muestra o una cubeta ópticamente equivalente. Por tanto, en un ensayo espectrofotométrico, se combinarían todos los reactivos en las mismas concentraciones usando el mismo protocolo sustituyendo la muestra por una solución de analito cero. El método (2) usa un proceso de dos pasos que realiza mediciones frente a una referencia absoluta como el aire (que nunca variará en absorbancia) y mide tanto la muestra como el blanco frente a la referencia absoluta. La absorbancia de la muestra se calcula luego restando el valor del blanco del de la muestra. El método (3) consiste en recolectar los espectros de la muestra o del producto de reacción del ensayo y hacer referencia a la absorbancia (o transmisión) medida a una longitud de onda óptima (generalmente la de la absorbancia máxima para las especies medidas) frente a la absorbancia a una longitud de onda en la que se sabe que las especies a medir tienen una absorbancia cero. La absorbancia es la diferencia entre las registradas en las dos longitudes de onda.

Pueden emplearse imágenes digitales y análisis de tres colores, pero en algunas modalidades pueden modificarse de acuerdo con el carácter digital (pixelado) de la señal de ensayo. A saber:

1. Para cada píxel de la imagen y para cada color, se obtiene una imagen de un patrón blanco y las intensidades de la señal se ajustan a un valor correspondiente a la ausencia de absorbancia. Esto puede hacerse mediante el siguiente procedimiento de ejemplo:

a. ajustar la intensidad de la fuente de luz

b. ajustar la sensibilidad del detector (preferido), o

c. ajuste de software (no preferido por sí mismo)

Un enfoque preferido es una combinación de (b) y (c) anteriores. Primero, ajustar el detector en el ámbito analógico y luego afinar el resultado en el ámbito digital.

Para el ajuste analógico, la ganancia y el desplazamiento de los amplificadores entre los sensores de luz y la sección de analógico a digital se ajustan para garantizar la máxima resolución de la digitalización. El extremo inferior del intervalo de luz de interés se establecerá en cero y el extremo superior del intervalo se establecerá justo por debajo de la saturación del sensor.

Posteriormente, las imágenes pueden ajustarse en el dominio digital. Un enfoque preferido, específicamente, sería usar lo que se denomina "calibración de dos imágenes" para una imagen m x n. El mecanismo consiste en recoger primero una imagen negra bloqueando toda la luz del detector. Llamaremos a esta imagen NEGRO [m,n]. Se graba una segunda imagen de calibración que consta de luz en el extremo máximo del intervalo de sensibilidad. A esta imagen la llamaremos BLANCO[m,n]. Por lo tanto, una imagen corregida a[m,n] podría construirse, en píxeles, como:

c[tit,n]— NEGRO [m, n]

Nótese que esta corrección digital no mejora el intervalo dinámico de los datos digitalizados, pero ajusta los valores para que las referencias completas en blanco y negro sean consistentes.

2. Una imagen de un blanco físico en una punta puede usarse como un blanco píxel por píxel y color por color. El blanco puede ser:

a. Aire;

b. Agua;

c. Producto de reacción de ensayo en blanco (sin analito);

d. Blanco de muestra (sin reactivos de ensayo); o

e. Alguna combinación de lo anterior;

3. La señal de un canal de color donde hay una respuesta débil o nula puede usarse para normalizar las señales de los otros canales.

Un método adicional para controlar y normalizar la óptica es obtener imágenes de un conjunto de estándares físicos (estables) antes o durante un ensayo. Por ejemplo, puede hacerse una matriz de colorantes impresos (que se muestra en la Figura 104) correspondiente a un conjunto de colores estándar con intensidades estándar (similar a las "ruedas" de colores estándar usadas para calibrar cámaras y escáneres).

Tales estándares pueden medirse usando reflectancia de una superficie opaca o (preferiblemente) por transmisión a través de una película transparente.

Dependiendo de la estabilidad de la óptica, la calibración y normalización de la óptica puede ser (1) un ejercicio único, (2) realizada a intervalos regulares o (3) realizada para cada ensayo.

Calibrar el intervalo de un generador de imágenes digital

En algunas modalidades, pueden proporcionarse métodos para calibrar un generador de imágenes digitales usado para obtener imágenes de densidades ópticas.

Al probar la densidad óptica de un analito, puede ser deseable hacer uso de la mayor cantidad posible del intervalo dinámico del generador de imágenes. En condiciones de uso normal, la configuración puede comprender un fondo blanco iluminado relativamente homogéneo, el generador de imágenes y el analito a analizar en una cubeta transparente entre ellos. Desde el punto de vista operativo, la prueba puede comprender colocar la cubeta entre el generador de imágenes y la fuente de luz de fondo blanca y medir la cantidad de luz absorbida por el analito en la cubeta. Para maximizar el intervalo dinámico completo del sensor, el fondo puede detectarse como la máxima intensidad medible. Puede ser deseable tener cuidado de no saturar el sensor porque entonces se podría perder información ya que cuando el sensor está saturado, y la atenuación podría no medirse correctamente. El sistema puede configurarse para maximizar de manera eficiente los valores medidos de la luz de fondo mientras se minimiza el número de píxeles saturados.

El fondo iluminado puede emitir luz blanca de igual intensidad en toda su superficie. La salida de luz puede variar algo, produciendo una distribución normal de las intensidades de píxeles detectadas por el generador de imágenes. Esto se ilustra mediante las curvas que se muestran en la Figura 128. Para este ejemplo, el sensor puede devolver un valor de 0 a 256 de cada píxel como indicador de la cantidad de luz que recibe. Cada píxel puede saturarse a un valor de 256. Es decir, independientemente del aumento adicional de la intensidad de la luz o la sensibilidad del sensor, solo puede registrarse un valor de 256. La serie 1 en la Figura 128, la línea de puntos, muestra dónde la luz es demasiado intensa, cortando la curva normal. La serie 3, la línea discontinua, muestra que todos los píxeles están leyendo correctamente la intensidad, pero que la sensibilidad del generador de imágenes es menor de lo que podría ser para el intervalo dinámico máximo. La mayoría de los píxeles tienen un valor inferior a 200. La serie 2 representa la configuración deseada, donde la media de la distribución es lo más alta posible, pero que se satura un número suficientemente pequeño de píxeles.

En una modalidad, la intensidad de la luz de fondo puede mantenerse constante mientras pueden ajustarse las configuraciones del generador de imágenes. A los efectos de la sensibilidad del generador de imágenes, pueden usarse dos controles: tiempo de exposición y ganancia. El tiempo de exposición puede ser la cantidad de tiempo en que los píxeles del sensor pueden recolectar fotones antes de leer el valor. Para una determinada cantidad de luz, el valor de lectura puede ser mayor cuando el tiempo de exposición se alarga. Este control puede ser el control "grueso" de la aplicación. La ganancia puede ser el control que ajusta la cantidad de amplificación aplicada a la señal del sensor. El aumento de la ganancia puede aumentar el valor de la señal del sensor. La ganancia puede ser el control "fino".

Un procedimiento ilustrativo para configurar los parámetros de sensibilidad del generador de imágenes puede incluir uno o más de los siguientes pasos: 12

1. Establecer el tiempo de exposición en un valor que se sepa que está por debajo de la saturación. Establecer la ganancia en el valor utilizable más alto.

2. La búsqueda binaria que comienza hacia arriba ajusta el tiempo de exposición para encontrar la configuración en la que no todos los píxeles en la región de interés de la imagen están saturados. Esto puede detectarse observando el punto en el que el valor medio de píxeles se vuelve inferior a 256.

3. Retroceder la ganancia de forma incremental hasta que haya suficientes píxeles en el límite de saturación. El número de píxeles a un nivel aceptable vendrá determinado por la forma de la distribución. La desviación estándar amplia aumentará el número de píxeles que se permite saturar.

A continuación, puede corregirse el balance de blancos. Hay tres grupos de sensores en un generador de imágenes digitales. Los miembros de cada grupo recogen luz de una longitud de onda diferente, roja, verde o azul. Al detectar luz blanca, los sensores verían preferiblemente valores iguales o rojo, verde y azul. El control de balance de blancos ajusta las ganancias relativas de los canales rojo y azul. Dado que la luz que proviene de la luz de fondo se define como blanca, el procedimiento sería simplemente ajustar el balance de blancos hasta que los canales lean los mismos valores. En la práctica, el canal verde normalmente se deja sin ajustar y los canales rojo y azul se cambian en direcciones opuestas entre sí a medida que se cambia el control. Sin embargo, en otras modalidades, otro canal, como el canal rojo o el canal azul, puede dejarse sin ajustar mientras que los otros dos canales pueden cambiarse.

Finalmente, las imágenes pueden ajustarse en el dominio digital. Un enfoque preferible, específicamente, sería usar lo que se denomina "calibración de dos imágenes" para una imagen m * n, como se describió anteriormente.

En la presente invención se han analizado ensayos que producen una variedad de productos coloreados. Se han medido con éxito los colores desde aquellos con máximos de absorción de longitud de onda baja (amarillo) hasta máximos de longitud de onda alta (azul). Los máximos de longitud de onda para algunos ensayos representativos fueron: 405, 450, 500, 510, 540, 570, 6 l2 y 620 nm, lo que demuestra la capacidad de leer el color en todo el espectro visible.

Los colores pueden cuantificarse usando datos promedio para muchos píxeles (típicamente alrededor de 1000). Un parámetro (f) que produce un buen ajuste (por ejemplo, mayor R2) a los datos de dosis-respuesta puede ser seleccionado. El parámetro puede ajustarse primero a la forma a1+b1*R+c1*R2+b2*G+c2*G2+b3*B+c2*B2 donde a, b, c son constantes y R, G y B son valores de intensidad de color para los canales rojo, verde y azul, respectivamente. El parámetro f puede entonces derivarse forzándolo a tener un valor máximo de 1 y un valor mínimo de 0. El parámetro f está relacionado con la transmisión de luz a través del producto de reacción coloreado. Como era de esperar, f puede estar estrechamente relacionado con el parámetro de densidad óptica (DO) usado en espectrofotometría para cuantificar una especie absorbente. Cuando 1 - f medido por imágenes de 3 colores se traza frente a la DO medida en el máximo de absorción para los mismos productos de reacción del ensayo en una placa de microtitulación en un espectrofotómetro, puede observarse que 1 - f está esencialmente relacionado de forma lineal con la DO. En la Figura 129, se presentan estos datos para cinco ensayos. La OD puede normalizarse como "OD relativa" = (OD - OD mín)/(OD máx - OD mín). En algunos casos, existe una relación algo curva, pero el coeficiente de correlación (R) suele ser > 0,99.

El parámetro f puede usarse para calibrar ensayos medidos mediante análisis de imágenes de 3 colores. Cuando se representa gráficamente frente a la concentración del analito, puede mostrarse una relación de calibración uniforme en la Figura 130 para un ensayo de colesterol representativo. Una ecuación de la forma concentración = a b*f c f (donde a, b y c son constantes) que relaciona la concentración a f se deriva y, como se muestra en la Figura 130, la concentración calculada es esencialmente idéntica a la del valor "nominal" (esperado, deseado) (pendiente de la línea de regresión cercana a 1,0, intersección cercana a 0,0 y R2 = 0,998. En la Figura 130 también se muestran gráficos de exactitud y precisión del ensayo. La precisión es cercana al 100 % (media del 100,2 %) y la imprecisión (representada por el CV %) es baja (menos del 10 %, CV medio del 3,9 %).

Imágenes simultáneas de ensayos

Como se muestra en la Figura 56, Figura 57, Figura 58, Figura 59 y Figura 60, pueden obtenerse imágenes de varios elementos de ensayo (puntas, pocillos, transferencias) en paralelo. En general, los elementos pueden colocarse en ubicaciones conocidas en un cartucho o montarse en un subsistema del instrumento, de modo que un elemento particular pueda asociarse con un ensayo particular. Incluso si los elementos no están perfectamente orientados o ubicados, el análisis de imágenes puede usarse para rectificar cualquier posicionamiento erróneo localizando características de los elementos de ensayo.

Se usaron ensayos disponibles comercialmente para albúmina (Figura 56) y colesterol (Figura 57) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se midieron una serie de concentraciones de analito en el intervalo de interés clínico usando una serie de calibradores en los que la concentración de analito se redujo dos veces desde la concentración más alta. En la Figura 56 y la Figura 57, la concentración de analito fue más alta a la derecha y la punta más alejada a la izquierda correspondió a analito cero. El volumen de la mezcla de reacción del ensayo aspirada en las puntas fue de 20 uL.

La Figura 58, la Figura 59 y la Figura 60 muestran pocillos de los que pueden obtenerse imágenes en paralelo. Se hizo un conjunto de pocillos hemisféricos poco profundos mecanizando un bloque de plástico blanco opaco. Se realizaron tres ensayos de formación de color disponibles comercialmente en estos pocillos y se obtuvieron imágenes de los productos de reacción. Como se indicó anteriormente, los pocillos del extremo derecho tienen la concentración de analito más alta y cada pocillo adyacente tiene una concentración dos veces menor, excepto el pocilio del extremo izquierdo, que tiene cero analito. Se introdujeron siete uL de producto de reacción de ensayo en cada pocillo.

También pueden obtenerse imágenes de los productos de reacción después de secarlos sobre membranas porosas o papel y obtener imágenes una vez que el líquido se ha empapado en el medio. También es posible utilizar cualquiera de una variedad de químicas de ensayo impregnadas en papel o membranas y obtener imágenes de los productos de reacción resultantes después de la adición de la muestra.

Analizar la turbidez

La turbidimetría se realiza midiendo la reducción en la intensidad de la luz incidente después de que pasa a través de la muestra que se está midiendo. Esta técnica se usa cuando el resultado del ensayo es un precipitado disperso que aumenta la opacidad del líquido.

La turbidimetría puede medirse en ensayos de aglutinación de látex. Como modelo de las respuestas del ensayo de aglutinación de látex, se dispersaron partículas de látex de poliestireno (1 um de diámetro) en tampón a las concentraciones dadas (p/v) y se sometieron a análisis de imágenes de tres colores. Como puede verse en la Figura 72, se encontró una buena respuesta en los tres canales y podría usarse para medir la concentración de partículas de látex y la aglutinación del látex.

Analizando la aglutinación

De manera similar al análisis de turbidez, el sistema puede usarse para medir la aglutinación, hemaglutinación y su inhibición.

El sistema puede usarse para realizar la tipificación sanguínea mediante la aglutinación de glóbulos rojos. La sangre se diluyó y se mezcló con reactivos de tipificación sanguínea (anti-A, anti-B, anti-D) de un kit de tipificación comercial. Como se muestra a continuación para una sangre B+, las respuestas de aglutinación apropiadas pueden verse fácilmente cuando se obtienen imágenes de las mezclas. Además, cuando las imágenes que se muestran en la Figura 77 se escanearon a lo largo del eje vertical de las puntas, se pudo obtener una medida cuantitativa de la aglutinación midiendo la varianza de las señales de tres colores, como se muestra en la Figura 78. Una mayor varianza indica aglutinación y puede detectarse en cada canal de color. Es evidente que el método puede usarse para medir el alcance de tales reacciones de aglutinación.

Reconocimiento de formas

Las imágenes pueden analizarse para el reconocimiento de formas. El reconocimiento de formas puede realizarse con un aumento normal y con un aumento muy alto. El análisis de imágenes con gran aumento puede usarse para reconocer el tamaño y la forma de las células. Estas técnicas se utilizan comúnmente en el recuento celular para determinar las concentraciones relativas de glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas. Con aumento normal, se utiliza el reconocimiento de forma para observar el estado de la muestra. Los métodos de reconocimiento de burbujas y otros defectos se usan para garantizar que las cantidades de líquido medidas se aspiran y dispensan correctamente.

Análisis de muestras en sustratos en fase sólida

Las imágenes digitales con iluminación de la cara frontal también pueden usarse para leer las respuestas del ensayo en sustratos en fase sólida, como se muestra en la Figura 76. Se añadieron soluciones de cloruro de potasio (0, 2, 4 y 8 mM) a las tiras de ensayo de potasio ReflotronTM (Boehringer-Mannheim/Roche) diseñadas para su uso en un sistema de ensayo de reflectancia.

Analizar la calidad de la muestra

Ciertas características de la muestra pueden invalidar los resultados del ensayo. Por ejemplo, la hemólisis hace que los iones de potasio se filtren de los glóbulos rojos al plasma, lo que hace que las concentraciones de iones de potasio en plasma o suero medidas sean falsamente altas. De manera similar, la icteria y la lipemia pueden interferir con varias químicas formadoras de color al alterar las absorbancias medidas. En la presente invención, podemos detectar y cuantificar dichas sustancias interferentes usando análisis de imágenes. Los ensayos que darían resultados falsos pueden entonces (1) eliminarse de la lista de resultados entregados por el sistema analítico o (2) las señales ópticas pueden corregirse para tener en cuenta el nivel medido de interferente. En la Figura 99 se muestra una imagen de diferentes tipos de muestras de suero (de izquierda a derecha: hemolizado, lipémico, ictérico (amarillo) y "normal").

Análisis de datos digitales

Los métodos convencionales para la generación de datos y calibración en métodos de ensayo que generan y/o cambian de color típicamente miden una señal analógica que representa el cambio en las características de absorbancia de una mezcla de ensayo generada al mezclar una muestra con reactivos. Una parte de la mezcla de reacción se ilumina y la luz transmitida a través o reflejada desde esa parte incide en un detector y se evalúa como una señal analógica. La calidad del ensayo determinada por el volumen y la calidad de la muestra, el procesamiento de la muestra, el ensamble del ensayo en la mezcla del ensayo y el elemento físico usado para presentar la mezcla al sistema óptico se basan en una supuesta calidad del sistema físico usado.

En la presente invención, podemos obtener imágenes de (1) la muestra, (2) los procesos de procesamiento de la muestra y (3) la mezcla del ensayo y recopilar los datos como un conjunto de una o más imágenes digitales. Cada píxel de la imagen de la mezcla de ensayo representa una fracción muy pequeña del total, pero al promediar la señal de 3 colores de muchos píxeles, recopilamos una señal de ensayo al menos tan buena como la obtenida por métodos analógicos convencionales. Sin embargo, cuando los métodos convencionales pierden información al promediar, la presente invención agrega la información y retiene el detalle perdido por los métodos convencionales. En este contexto, los ensayos basados en color incluyen ensayos para: metabolitos, electrolitos, enzimas, biomarcadores (mediante inmunoensayo), fármacos (mediante inmunoensayo) y objetivos de ácido nucleico (usando tecnología "LAMP"). Pueden aplicarse los mismos principios a los ensayos que usan fluorescencia y/o luminiscencia. Confirmación y corrección de volumen

El volumen de una muestra, o de cualquier otro material, como un líquido o un sólido, puede determinarse ópticamente. Esto puede realizarse formando imágenes de un contenedor cuyas dimensiones internas son conocidas y determinando matemáticamente el volumen de muestra a partir del segmento observado del contenedor ocupado. Las mediciones de sólidos se utilizan principalmente para medir los sólidos que se centrifugan. El caso más común es leer el volumen de glóbulos rojos centrifugados para determinar el nivel de hematocrito. Los ejemplos 6-11 y 16 describen el uso de análisis de imágenes para calcular volúmenes de muestra y otras mediciones. Esto puede permitir mejores resultados del ensayo. Por ejemplo, si el volumen objetivo que se usará es 10 uL y la tecnología de la invención determina que el volumen real es 8 uL, el sistema de ensayo puede corregir los resultados para el volumen (en este ejemplo, la concentración de analitos calculada en la presunción de una muestra de 10 uL se multiplicaría por 10/8).

El conocimiento de los volúmenes reales de muestra y reactivo puede realizarse mediante la obtención de imágenes de la muestra y los reactivos y puede usarse para corregir los cálculos usados para detectar y/o cuantificar los analitos en la muestra.

Como se muestra en muchos ejemplos anteriores, el uso de imágenes permite evaluar la calidad y la respuesta del ensayo en muestras y mezclas de ensayo. Además, la obtención de imágenes de "puntas" usadas como recipientes de reacción y métodos de adquisición de muestras permite (1) la medición exacta y precisa de los volúmenes de muestra y reactivo y (2) el uso de dichos datos para corregir cualquier inexactitud o imprecisión en los resultados del ensayo debido a errores de volumen. Para lograr esto, las puntas pueden tener una geometría conocida con exactitud y precisión (como es el caso de las puntas fabricadas mediante moldeo por inyección). La replicación de mediciones de puntas usando imágenes ha demostrado que sus dimensiones son precisas en más de aproximadamente el 1%. Por tanto, es posible medir el volumen de muestras líquidas y reactivos en tales puntas con la precisión correspondiente. Si el pipeteo de muestras y reactivos es menos exacto y preciso, es posible corregir los resultados conociendo los volúmenes reales (por medición de imagen).

Por ejemplo, considere un ensayo en el que la respuesta es directamente proporcional a la concentración de analito (como ocurre con muchos de los ensayos que se describen en el presente documento). Un error en el volumen de muestra del 10 % daría lugar a un error del 10 % en el valor reportado por el sistema analítico. Sin embargo, si el volumen de muestra dispensado incorrectamente se mide con precisión (digamos dentro del 2 % del valor real), la respuesta del sistema puede corregirse para reducir el error del 10 % al 2 %. Pueden realizarse las correcciones correspondientes para errores de volumen en los volúmenes de reactivo. El algoritmo de corrección puede depender de la respuesta del sistema de ensayo al volumen o al conocimiento de cada componente del ensayo (muestra, reactivos), pero esta información puede determinarse fácilmente durante el desarrollo y la validación del ensayo. Por tanto, la invención proporciona una variedad de ventajas sobre las técnicas convencionales. En la generación de la "señal de ensayo", la presente invención puede detectar defectos físicos en la cubeta de ensayo, defectos en la mezcla de ensayo (burbujas y similares). Una vez que se identifican estos defectos (análisis de imagen), el resultado del ensayo puede rechazarse para que no se produzcan resultados falsos o (preferiblemente) puede eliminarse el efecto del defecto y calcular una señal de ensayo exacta.

En el ensamblaje de la mezcla de ensayo, pueden detectarse todos y cada uno de los defectos, incluidos: tipo de muestra incorrecto (por ejemplo, sangre frente a plasma), volumen de muestra incorrecto, para una muestra de sangre, falla en la separación del plasma de los elementos formados (glóbulos rojos y blancos), factores de muestra que pueden comprometer la calidad del resultado del ensayo (por ejemplo, lipemia, ictericia, hemólisis, presencia de precipitados u otras in-homogeneidades no identificadas), defectos en el ensamble de la mezcla del ensayo (por ejemplo, presencia de burbujas, falta de mezcla adecuada (falta de uniformidad de color)), mecanismos para la evaluación retrospectiva de la calidad y la preservación de información detallada de archivo, mecanismos para medir los volúmenes de muestras y reactivos (y para corregir inexactitudes y/o imprecisiones en dichos volúmenes).

Evaluación de agentes terapéuticos

En una modalidad separada, se proporcionan dispositivos y métodos para monitorear más de un parámetro farmacológico útil para evaluar la eficacia y/o toxicidad de un agente terapéutico. Por ejemplo, un agente terapéutico puede incluir cualesquiera sustancias que tengan utilidad y/o potencial terapéutico. Dichas sustancias incluyen, pero no se limitan a, compuestos biológicos o químicos tales como moléculas orgánicas o inorgánicas simples o complejas, péptidos, proteínas (por ejemplo, anticuerpos) o polinucleótidos (por ejemplo, antisentido). Puede sintetizarse una amplia gama de compuestos, por ejemplo, polímeros, tales como polipéptidos y polinucleótidos, y compuestos orgánicos sintéticos basados en diversas estructuras centrales, y estos también pueden incluirse como agentes terapéuticos. Además, diversas fuentes naturales pueden proporcionar compuestos para el tamizaje, tales como extractos de plantas o animales, y similares. Debe entenderse, aunque no siempre se indica explícitamente, que el agente se usa solo o en combinación con otro agente, que tiene la misma o diferente actividad biológica que los agentes identificados por la exploración inventiva. Los agentes y métodos también se destinan a combinarse con otras terapias. Por ejemplo, los fármacos de moléculas pequeñas se miden frecuentemente mediante espectrometría de masas, que puede ser imprecisa. Los ensayos ELISA (basados en anticuerpos) pueden ser mucho más precisos y exactos.

Los parámetros fisiológicos de acuerdo con la presente invención incluyen, sin limitación, parámetros tales como temperatura, frecuencia/pulso cardíaco, presión sanguínea y frecuencia respiratoria. Los parámetros farmacodinámicos incluyen concentraciones de biomarcadores tales como proteínas, ácidos nucleicos, células y marcadores celulares. Los biomarcadores podrían ser indicativos de enfermedad o podrían ser el resultado de la acción de un fármaco. Los parámetros farmacocinéticos (PK) de acuerdo con la presente invención incluyen, sin limitación, el fármaco y la concentración de metabolito del fármaco. La identificación y cuantificación de los parámetros farmacocinéticos en tiempo real a partir de un volumen de muestra es extremadamente deseable para la seguridad y eficacia adecuadas de los medicamentos. Si las concentraciones de fármaco y metabolito están fuera del intervalo deseado y/o se generan metabolitos inesperados debido a una reacción inesperada al fármaco, puede ser necesaria una acción inmediata para garantizar la seguridad del paciente. De manera similar, si alguno de los parámetros farmacodinámicos (PD) cae fuera del intervalo deseado durante un régimen de tratamiento, es posible que también deba tomarse una acción inmediata.

Ser capaz de monitorear la tasa de cambio de la concentración de un analito o de parámetros de PD o PK durante un período de tiempo en un solo sujeto, o realizar análisis de tendencias sobre la concentración, los parámetros de PD o PK, ya sea concentraciones de fármacos o sus metabolitos, puede ayudar a prevenir situaciones potencialmente peligrosas. Por ejemplo, si la glucosa fuera el analito de interés, la concentración de glucosa en una muestra en un momento dado, así como también la tasa de cambio de la concentración de glucosa durante un período de tiempo dado, podrían ser muy útiles para predecir y evitar, por ejemplo, eventos hipoglucémicos. Dicho análisis de tendencias tiene implicaciones beneficiosas generalizadas en el régimen de dosificación de fármacos. Cuando se trata de múltiples fármacos y sus metabolitos, a menudo es deseable la capacidad de detectar una tendencia y tomar medidas proactivas.

En algunos ejemplos, la divulgación proporciona un método comercial para ayudar a un médico a proporcionar un tratamiento médico individualizado. Un método comercial puede comprender el rastreo posterior a la prescripción de la terapia con fármacos mediante el rastreo de las tendencias de los biomarcadores en el tiempo. El método comercial puede comprender recolectar al menos un parámetro farmacológico a partir de un individuo que recibe un medicamento, dicho paso de recolección se efectúa al someter una muestra de fluido corporal a reactivos contenidos en un dispositivo de fluidos, que se proporciona a dicho individuo para producir una señal indicativa detectable de dicho al menos un parámetro farmacológico; y hacer referencias cruzadas con la ayuda de un ordenador del historial médico de dicho individuo con el al menos un parámetro farmacológico de dicho individuo, lo que ayuda de esta manera a dicho médico a proporcionar un tratamiento médico individualizado.

Los dispositivos, sistemas y métodos en el presente documento permiten la cuantificación automatizada de un parámetro farmacológico de un paciente, así como también la comparación automatizada del parámetro con, por ejemplo, los registros médicos del paciente, que pueden incluir un historial del parámetro monitoreado o registros médicos de otro grupo de sujetos. Acoplar el seguimiento de analitos en tiempo real con un dispositivo externo que puede almacenar datos y realizar cualquier tipo de procesamiento de datos o algoritmo, por ejemplo, proporciona un dispositivo que puede ayudar con la atención típica del paciente que puede incluir, por ejemplo, comparar datos actuales del paciente con datos de pacientes anteriores. Por lo tanto, también se proporciona en el presente documento un método comercial que realiza de manera eficaz al menos parte del monitoreo de un paciente que realiza actualmente el personal médico.

Configuración óptica para la obtención de imágenes de muestras y productos de reacción

El análisis de la muestra y del producto de reacción puede realizarse usando una configuración óptica. La configuración óptica puede incluir una fuente de luz, una apertura y un sensor o detector. En la Figura 100 y la Figura 101 se muestra un esquema para una configuración óptica. En algunas modalidades, la cámara puede ser una cámara Web Logitech C600, el sensor de la cámara puede ser un CMOS de 1/3" 2.0 MP (1600x1200): (MI-2010-SOC), la lente puede ser de vidrio con una lente de cámara Web de distancia de objeto estándar (Distancia de lente a objeto: 35 mm). La fuente de luz puede ser un Iluminador de Borde Blanco Moritex MEBL-Cw25 (blanco) que funciona a 9,4 voltios. Las imágenes de la cámara pueden tomarse en una secuencia en la que una etapa x-y-z mueve 1, 2, 34 o más puntas hacia la trayectoria óptica.

En un ejemplo, el detector es un ensamble de lector que aloja un ensamble de detección para detectar una señal producida por al menos un ensayo en el dispositivo. El ensamble de detección puede estar por encima del dispositivo o en una orientación diferente con relación al dispositivo basado en, por ejemplo, el tipo de ensayo que se realiza y el mecanismo de detección que se emplea. El ensamble de detección puede ponerse en comunicación con la unidad de ensayo o la unidad de ensayo puede ponerse en comunicación con el ensamble de detección. Los sensores pueden ser PMT, fotodiodos de amplio rango, fotodiodos de avalancha, fotodiodos de frecuencia única, sensores de imagen, chips CMOS y CCD. Las fuentes de iluminación pueden ser láseres, LED de un solo color, luz de frecuencia amplia de lámparas fluorescentes o LED, matrices de LED, mezclas de fuentes de luz roja, verde y azul, fósforos activados por un LED, tubos fluorescentes, luces incandescentes y fuentes de arco, como un tubo de flash.

En muchos casos, se proporciona un detector óptico y se usa como dispositivo de detección. Los ejemplos no limitantes incluyen un fotodiodo, tubo fotomultiplicador (PMT), detector de recuento de fotones, fotodiodo de avalancha o dispositivo de carga acoplada (CCD). En algunos ejemplos puede usarse un diodo pin. En algunos ejemplos, puede acoplarse un diodo pin a un amplificador para crear un dispositivo de detección con una sensibilidad comparable a un PMT. Algunos ensayos pueden generar luminiscencia como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos se detecta quimioluminiscencia. En algunos ejemplos, un ensamble de detección podría incluir una pluralidad de cables de fibra óptica conectados como un haz a un detector CCD o a una matriz PMT. El haz de fibra óptica podría construirse de fibras discretas o de muchas fibras pequeñas fusionadas para formar un haz sólido. Dichos haces sólidos están disponibles comercialmente y se conectan fácilmente a los detectores CCD.

Un detector también puede comprender una fuente de luz, tal como una bombilla o un diodo emisor de luz (LED). La fuente de luz puede iluminar un ensayo para detectar los resultados. Por ejemplo, el ensayo puede ser un ensayo de fluorescencia o un ensayo de absorbancia, como se usan comúnmente con ensayos de ácidos nucleicos. El detector puede comprender, además, elementos ópticos para suministrar la fuente de luz al ensayo, tal como una lente o fibra óptica.

En algunos ejemplos, el sistema de detección puede comprender detectores o sensores no ópticos para detectar un parámetro particular de un sujeto. Dichos sensores pueden incluir temperatura, conductividad, señales potenciométricas y señales amperométricas, para compuestos que se oxidan o se reducen, por ejemplo, O², H²O² e I², o compuestos orgánicos oxidables/reducibles.

La iluminación puede ser retroiluminada, frontal y oblicua (lateral). La retroiluminación puede usarse en química general con el fin de detectar la absorción de luz (colorimetría) o la dispersión (turbidez). La disposición adopta dos formas, un campo trasero amplio y uniformemente iluminado, y un rayo de forma específica que es interrumpido por el sujeto. La iluminación frontal puede usarse para la excitación de reflectancia y fluorescencia. En reflectancia, un sujeto se ilumina desde el frente mediante una fuente de luz que se mide observando la luz reflejada por el sujeto. Los colores absorbidos producen la misma información que un líquido iluminado por una luz de fondo. En reflectancia, un sujeto también puede iluminarse mediante iluminación oblicua. El uso de iluminación oblicua (lateral) le da a la imagen una apariencia tridimensional y puede resaltar características que de otro modo serían invisibles. Una técnica más reciente basada en este método es el contraste de modulación de Hoffmann, un sistema que se encuentra en microscopios invertidos para su uso en cultivo celular. La iluminación oblicua adolece de las mismas limitaciones que la microscopía de campo brillante (bajo contraste de muchas muestras biológicas; baja resolución aparente debido a objetos desenfocados), pero puede resaltar estructuras que de otro modo serían invisibles.

En la excitación por fluorescencia, los sujetos pueden iluminarse desde el frente con el propósito de iluminación de fluorescencia. Suelen ser luces de un solo color, más comúnmente láseres. El Microscopio de Barrido Láser Confocal es una modalidad común de esto. La iluminación oblicua también puede usarse en la excitación de fluorescencia. En la citometría de fluorescencia, los sujetos a menudo se excitan en un ángulo, generalmente de 90 grados, a partir del cual aparecerán los fotones de desintegración. Esta forma de iluminación permite la detección de dispersión directamente detrás del sujeto (contraluz), así como las emisiones de fluorescencia que salen por los lados.

En algunas modalidades, la luz fluorescente se forma a 90 grados con respecto al haz de excitación. En la Figura 102A, una fuente de fotones (S), típicamente un LED de alta intensidad, pasa a través de un difusor de haz (D) y una lente modeladora (L1), produciendo un haz de excitación colimado o que diverge lentamente. El haz de excitación pasa a través de un filtro pasa banda (F1) e ilumina la muestra, que consiste en un recipiente (tubo, cubeta o punta de pipeta) que contiene una solución con una muestra marcada con fluorescencia. La fluorescencia emitida isotrópicamente se separa espectralmente de la luz de excitación con un filtro de paso largo o pasa banda (F2) apropiado para pasar la fluorescencia desplazada de Stokes. Luego, la luz se proyecta a través de una lente (L2) en una cámara digital (C) u otro detector. La intensidad de la fluorescencia se extrae de las imágenes resultantes mediante análisis de imágenes.

Las imágenes tomadas con la configuración óptica que se muestra en la Figura 102A producen imágenes de un solo tubo (como se muestra en la Figura 103A. Los experimentos sucesivos muestran la diferencia en la intensidad de la fluorescencia de los experimentos LAMP negativos y positivos que utilizan un colorante intercalante.

En otras modalidades, la luz transmitida se obtiene después del filtrado óptico para eliminar la luz en la longitud de onda de excitación. En la Figura 102B, una fuente de fotones (S), típicamente un LED de alta intensidad, pasa a través de un difusor de haz (D) y una lente moldeadora (L1), produciendo un haz de excitación elíptico lentamente divergente. El haz de excitación pasa a través de un filtro pasa banda (F1) e ilumina las muestras, presentadas como una matriz de recipientes de muestra (tubo, cubeta o punta de pipeta), cada uno de los cuales contiene una solución con una muestra marcada con fluorescencia. La fluorescencia emitida isotrópicamente se separa espectralmente de la luz de excitación con un filtro de paso largo o pasa banda (F2) apropiado para pasar la fluorescencia desplazada de Stokes. A continuación, se proyecta la luz a través de la lente de una cámara (L2) en una cámara digital (C). La intensidad de la fluorescencia se extrae de las imágenes resultantes mediante análisis de imágenes. La configuración óptica que se muestra en la Figura 103 puede usarse para producir imágenes de matriz de varios tubos simultáneamente (como se muestra en la Figura 103B).

Para la colorimetría, la modalidad preferida para la detección es la retroiluminación del sujeto con luz blanca y el resultado es detectado por un sensor de formación de imágenes. En este caso, se mide la absorción de color transmisiva.

Para la turbidimetría, el ejemplo preferido de detección es la retroiluminación del sujeto con luz blanca y el resultado es detectado por un sensor de imágenes. Para la turbidimetría, se mide la reducción de la intensidad de la luz transmitida.

La luminometría no utiliza ningún método de iluminación ya que el sujeto emite sus propios fotones. La luz emitida puede ser débil y puede detectarse usando un sensor extremadamente sensible como un tubo fotomultiplicador (PMT).

En algunos ejemplos, la formación de imágenes puede producirse mediante fluorescencia, iluminación de campo oscuro o iluminación de campo claro. Dicha formación de imágenes puede usarse para citometría u otras aplicaciones. La iluminación de epifluorescencia puede lograrse mediante el uso de tres fuentes de iluminación de diferentes longitudes de onda. Además, pueden usarse dos fuentes diferentes simultáneamente, si es necesario. En consecuencia, la plataforma de formación de imágenes puede usarse para obtener imágenes de una gran variedad de colorantes fluorescentes. La combinación de fuentes de iluminación y ópticas de emisión puede configurarse para lograr una pluralidad de canales de formación de imágenes espectralmente independientes.

La iluminación de campo oscuro puede lograrse mediante el uso de un anillo de luz (ubicado encima o debajo de la muestra), un condensador abbe de campo oscuro, un condensador de campo oscuro con un espejo toroidal, un condensador de campo oscuro epi construido dentro de una manga alrededor de la lente del objetivo, o una combinación de anillo de luz con un condensador de escenario equipado con un tope oscuro. Básicamente, estos componentes ópticos crean un cono de luz de apertura numérica (NA) mayor que la NA del objetivo que se está usando. La elección del esquema de iluminación depende de una serie de consideraciones, como el aumento requerido, las consideraciones de diseño mecánico, el tamaño del sensor de imagen, etc. Un esquema de iluminación basado en anillo de luz generalmente proporciona una iluminación uniforme de campo oscuro en un área más amplia y, al mismo tiempo, proporciona suficiente flexibilidad en el diseño mecánico del sistema general.

La iluminación de campo claro puede lograrse mediante el uso de una fuente de luz blanca junto con un condensador de escenario para crear la iluminación de Koehler.

En algunos ejemplos, puede emplearse una rueda de filtros automática. La rueda de filtro automática permite el control de la trayectoria óptica de la imagen para permitir la obtención de imágenes de múltiples fluoróforos en el mismo campo de visión.

En algunos ejemplos, puede tener lugar un enfoque automático basado en imágenes. Puede usarse un algoritmo basado en imágenes para controlar la posición z (por ejemplo, la posición vertical) de un objetivo (es decir, su distancia de la muestra) para lograr el enfoque automático. En resumen, se captura una imagen pequeña (por ejemplo, 128x128 píxeles) a una velocidad rápida usando iluminación de campo oscuro. Esta imagen puede analizarse para obtener la función de enfoque automático, que es una medida de la nitidez de la imagen. Basado en un algoritmo de búsqueda rápida, se calcula la siguiente ubicación z del objetivo. El objetivo puede moverse a la nueva ubicación z y puede capturarse otra imagen pequeña. Este sistema de circuito cerrado no requiere el uso de ningún otro hardware para enfocar. La platina del microscopio puede conectarse a motores paso a paso controlados por ordenador para permitir la traslación en las direcciones X e Y (por ejemplo, direcciones horizontales). En cada ubicación, se captura el número deseado de imágenes y el escenario se mueve a la siguiente posición XY.

La formación de imágenes u otra detección puede realizarse con la ayuda de un detector. Un detector puede incluir una cámara u otro aparato sensor configurado para convertir la radiación electromagnética en una señal electrónica. En un ejemplo, una cámara puede ser una cámara de carga acoplada (CCD) o una cámara CCD de multiplicación de electrones (EMCCD). Un detector puede ser un sensor, como un sensor de píxeles activo o un sensor CMOS. Un detector puede incluir un tubo fotomultiplicador para detectar una señal.

El detector puede estar en comunicación óptica con un contenedor de muestra (por ejemplo, cubeta, punta, vial). En algunos casos, el detector está directamente a la vista del contenedor de la muestra. En otros casos, el detector está en comunicación óptica con el contenedor de la muestra con la ayuda de una o más ópticas, tales como lentes, espejos, colimadores o combinaciones de los mismos.

El recuento de células puede realizarse mediante imágenes y citometría. En situaciones en las que los sujetos pueden estar iluminados con un campo brillante, la modalidad preferida es iluminar a los sujetos desde el frente con una luz blanca y detectar las células con un sensor de formación de imágenes. El procesamiento digital posterior contará las células. Cuando las células son poco frecuentes o pequeñas, la modalidad preferida es unir un marcador fluorescente y luego iluminar el campo del sujeto con un láser. Se prefieren las imágenes de exploración confocal. Para la citometría de flujo, los sujetos se marcan con marcadores fluorescentes y pasan por el dispositivo sensor. Hay dos tipos de sensores, uno es de posición tal que el sujeto está retroiluminado, midiendo la dispersión del haz para determinar la presencia de una célula. El otro sensor, alineado para que la iluminación sea lateral, mide la luz fluorescente emitida por los sujetos marcados. A continuación se proporciona una descripción adicional relacionada con la metodología de formación de imágenes para citometría.

Sistemas de usuario final

Un dispositivo y un sistema pueden, después de la fabricación, enviarse al usuario final juntos o individualmente. El dispositivo o sistema puede empaquetarse con un manual de usuario o instrucciones de uso. En un ejemplo, el sistema de la invención es genérico para el tipo de ensayos ejecutados en diferentes dispositivos. Debido a que los componentes del dispositivo pueden ser modulares, puede que un usuario solo necesite un sistema y una variedad de dispositivos o unidades de ensayo o unidades de reactivos para ejecutar una multitud de ensayos en un entorno de punto de atención u otro ambiente de pruebas distribuidas. En este contexto, un sistema puede usarse repetidamente con múltiples dispositivos, y puede ser necesario tener sensores tanto en el dispositivo como en el sistema para detectar dichos cambios durante el envío, por ejemplo. Durante el envío, los cambios de presión o temperatura pueden afectar el rendimiento de varios componentes del presente sistema y, como tal, un sensor ubicado ya sea en el dispositivo o en el sistema puede transmitir estos cambios, por ejemplo, al dispositivo externo para que los ajustes puedan realizarse durante la calibración o durante el procesamiento de datos en el dispositivo externo. Por ejemplo, si la temperatura de un dispositivo de fluidos se cambia hacia un cierto nivel durante el envío, un sensor ubicado en el dispositivo podría detectar este cambio y transmitir esta información al sistema cuando el usuario inserte el dispositivo en el sistema. Puede existir un dispositivo de detección adicional en el sistema para realizar estas tareas, o dicho dispositivo puede incorporarse a otro componente del sistema. En algunos ejemplos, la información puede transmitirse de forma inalámbrica ya sea al sistema o al dispositivo externo, tal como un ordenador personal o un televisor. Igualmente, un sensor en el sistema puede detectar cambios similares. En algunos ejemplos, puede ser deseable tener un sensor también en el embalaje de envío, ya sea en lugar de en los componentes del sistema o además de los mismos. Por ejemplo, las condiciones adversas que harían inválido un cartucho de ensayo o un sistema que pueden detectarse pueden incluir la exposición a una temperatura más alta que la máxima tolerable o la ruptura de la integridad del cartucho de manera que la humedad penetre.

En un ejemplo, el sistema comprende un ensamble de comunicaciones capaz de transmitir y recibir información de forma inalámbrica desde un dispositivo externo. Dicha comunicación inalámbrica puede ser tecnología Bluetooth o RTM. Pueden utilizarse varios métodos de comunicación, como una conexión por cable de acceso telefónico con un módem, un enlace directo como T1, ISDN o línea de cable. En algunos ejemplos, se establece una conexión inalámbrica mediante el uso de redes inalámbricas ilustrativas tales como redes celulares, satelitales o de localizadores, GPRS o un sistema de transporte de datos local tal como Ethernet o Token Ring sobre una red de área local. En algunos ejemplos, la información se cifra antes de transmitirse a través de una red inalámbrica. En algunos ejemplos, el ensamble de comunicación puede contener un componente de comunicación inalámbrica por infrarrojos para enviar y recibir información. El sistema puede incluir tarjetas gráficas integradas para facilitar la visualización de la información.

En algunos ejemplos, el ensamble de comunicación puede tener una memoria o un dispositivo de almacenamiento, por ejemplo, RAM localizada, en donde puede almacenarse la información recopilada. Es posible que se requiera un dispositivo de almacenamiento si la información no puede transmitirse en un momento dado debido, por ejemplo, a una incapacidad temporal para conectarse de forma inalámbrica a una red. La información puede asociarse con el identificador del dispositivo en el dispositivo de almacenamiento. En algunos ejemplos, el ensamble de comunicaciones puede volver a intentar enviar la información almacenada después de un cierto período de tiempo. En algunos ejemplos, un dispositivo externo se comunica con el ensamble de comunicación dentro del ensamble de lector. Un dispositivo externo puede comunicarse de forma inalámbrica o física con un sistema, pero también puede comunicarse con un tercero, lo que incluye, sin limitación, un paciente, personal médico, médicos, personal de laboratorio u otros en la industria de la atención médica.

En algunos ejemplos, el sistema puede comprender un dispositivo externo tal como un sistema informático, servidor u otro dispositivo electrónico capaz de almacenar información o procesar información. En algunos ejemplos, el dispositivo externo incluye uno o más sistemas informáticos, servidores u otros dispositivos electrónicos capaces de almacenar información o procesar información. En algunos ejemplos, un dispositivo externo puede incluir una base de datos de información del paciente, por ejemplo, pero sin limitarse a, registros médicos o historial del paciente, registros de ensayos clínicos o registros de ensayos preclínicos. Un dispositivo externo puede almacenar protocolos que se ejecutarán en un sistema que pueden transmitirse al ensamble de comunicaciones de un sistema cuando ha recibido un identificador que indica qué dispositivo se ha insertado en el sistema. En algunos ejemplos, un protocolo puede depender de un identificador de dispositivo. En algunos ejemplos, el dispositivo externo almacena más de un protocolo para cada dispositivo. En otros ejemplos, la información del paciente en el dispositivo externo incluye más de un protocolo. En algunos casos, el servidor externo almacena algoritmos matemáticos para procesar un recuento de fotones enviado desde un ensamble de comunicación y en algunos ejemplos, para calcular la concentración de analito en una muestra de fluido corporal.

En algunos ejemplos, el dispositivo externo puede incluir uno o más servidores como se conocen en la técnica y están disponibles comercialmente. Dichos servidores pueden proporcionar equilibrio de carga, administración de tareas y capacidad de respaldo en caso de falla de uno o más de los servidores u otros componentes del dispositivo externo, para mejorar la disponibilidad del servidor. También puede implementarse un servidor en una red distribuida de unidades de almacenamiento y procesamiento, como se conoce en la técnica, en donde el procesamiento de datos reside en estaciones de trabajo tales como ordenadores, eliminando así la necesidad de un servidor.

Un servidor puede incluir una base de datos y procesos del sistema. Una base de datos puede residir dentro del servidor o puede residir en otro sistema de servidor que sea accesible para el servidor. Como la información de una base de datos puede contener información sensible, puede implementarse un sistema de seguridad que evite que usuarios no autorizados accedan a la base de datos.

Una ventaja de algunos de los elementos descritos en el presente documento, es que la información puede transmitirse desde el dispositivo externo de vuelta no solo al ensamble de lector, sino a otras partes u otros dispositivos externos, por ejemplo, sin limitación, un PDA o un teléfono celular. Tal comunicación puede lograrse a través de una red inalámbrica como se divulga en el presente documento. En algunos ejemplos, puede enviarse una concentración de analito calculada u otra información del paciente, por ejemplo, pero sin limitarse, al personal médico o al paciente.

En consecuencia, los datos generados con el uso de los dispositivos y sistemas del sujeto pueden utilizarse para realizar un análisis de tendencias sobre la concentración de un analito en un sujeto que cambia con el tiempo.

Otra ventaja, como se describe en el presente documento, es que los resultados del ensayo pueden comunicarse de forma sustancialmente inmediata a cualquier tercero que pueda beneficiarse de la obtención de los resultados. Por ejemplo, una vez que se determina la concentración del analito en el dispositivo externo, puede transmitirse a un paciente o al personal médico que puede necesitar tomar medidas adicionales. El paso de comunicación a un tercero puede realizarse de forma inalámbrica como se describe en el presente documento, y al transmitir los datos al dispositivo portátil de un tercero, el tercero puede ser notificado de los resultados del ensayo prácticamente en cualquier momento y en cualquier lugar. Por lo tanto, en un escenario sensible al tiempo, puede contactarse a un paciente de inmediato en cualquier lugar si se requiere una acción médica urgente.

Como se describe en otra parte del presente documento, la formación de imágenes puede usarse para la detección. La formación de imágenes puede usarse para detectar una o más características de una muestra. Por ejemplo, pueden usarse imágenes para detectar la presencia o ausencia de una muestra. Las imágenes pueden usarse para detectar la ubicación, la colocación, el volumen o la concentración de una muestra. La formación de imágenes puede usarse para detectar la presencia, ausencia y/o concentración de uno o más analitos en la muestra.

En algunos ejemplos, puede usarse una sola medición para capturar información diversa sobre una muestra y/o analitos. Por ejemplo, puede usarse una sola medición para capturar información sobre el volumen de una muestra y la concentración de un analito dentro de la muestra. Puede usarse una única medición para capturar información sobre la presencia y/o concentración de una pluralidad de analitos y/o tipos de analitos dentro de la muestra. Puede usarse una sola imagen para capturar información relacionada con una, dos o más de la información o tipos de información descritos en el presente documento.

Dicha formación de imágenes y detección puede proporcionar ensayos más precisos y exactos, que pueden ser ventajosos en situaciones con pequeños volúmenes de muestra, como los descritos en otra parte del presente documento. Ejemplos adicionales de volúmenes de muestra pueden incluir 500 pL o menos, 250 pL o menos, 200 |jL o menos, 175 pL o menos, 150 pL o menos, 100 pL o menos, 80 pL o menos, 70 pL o menos, 60 pL o menos, 50 pL o menos, 30 pL o menos, 20 pL o menos, 15 pL o menos, 10 pL o menos, 8 pL o menos, 5 pL o menos, 1 pL o menos, 500 nL o menos, 300 nL o menos, 100 nL o menos, 50 nL o menos, 10 nL o menos, 1 nL o menos, 500 pL o menos, 250 pL o menos, 100 pL o menos, 50 pL o menos, 10 pL o menos, 5 pL o menos, o 1 pL o menos. En algunos ejemplos, el volumen de la muestra puede incluir menos de o igual a aproximadamente 3 gotas de una punción en el dedo, menos de o igual a aproximadamente 2 gotas de una punción en el dedo, o menos o igual a aproximadamente 1 gota de una punción en el dedo. Estos pequeños volúmenes pueden resultar útiles en aplicaciones de punto de servicio.

Tal formación de imágenes y/o detección puede producir ensayos con un bajo coeficiente de variación. Un coeficiente de variación puede ser la relación entre la desviación estándar y un valor absoluto de la media. En un ejemplo, una reacción y/o ensayo puede tener un coeficiente de variación (CV) (también "desviación estándar relativa" en el presente documento) menor o igual a aproximadamente 20 %, 15 %, 12 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,3 % o 0,1 %. Una sola reacción y/o ensayo, o un procedimiento con una pluralidad de reacciones y/o ensayos pueden tener un coeficiente de variación menor o igual a aproximadamente 20 %, 15 %, 12 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,3 % o 0,1 %. En algunos ejemplos, un paso de formación de imágenes y/o detección, o un procedimiento con una pluralidad de pasos de formación de imágenes y/o detección puede tener un coeficiente de variación menor o igual a aproximadamente 20 %, 15 %, 12 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,3 % o 0,1 %.

En algunos ejemplos, el uso de imágenes con un dispositivo que puede colocarse en un punto de ubicación de servicio puede mejorar el rendimiento general del dispositivo. Puede mejorarse la exactitud y/o precisión y/o puede reducirse el coeficiente de variación. El rendimiento del dispositivo puede mejorarse cuando se manipulan muestras pequeñas, como los volúmenes descritos en el presente documento. La formación de imágenes puede usarse en combinación con otros sistemas de detección, en combinación con otros procesos o como un sistema autónomo. La mejora en el rendimiento puede incluir una disminución en el coeficiente de variación de aproximadamente 15 %, 12 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,3 % o 0,1 %.

La formación de imágenes puede ser útil para varios tipos de detección para uno o más tipos de ensayos o procedimientos de manipulación de muestras. Los ejemplos de tales ensayos o procedimientos de manipulación de muestras pueden incluir centrifugación, separación, citometría, inmunoensayo, ELISA, ensayo de ácido nucleico, ensayo enzimático, colorimetría o cualquier otro tipo de ensayo o reacción descrito en otra parte del presente documento.

Los sistemas de imágenes pueden proporcionar múltiples ventajas sobre otros métodos para la recopilación de datos, el procesamiento de datos y la interpretación de resultados. Los sistemas de imágenes pueden maximizar o aumentar la eficiencia del uso de muestras pequeñas y mejorar el rendimiento a nivel del sistema. Los sistemas de formación de imágenes pueden usarse para la detección como sistemas independientes o pueden usarse en combinación con otros sistemas o mecanismos de detección.

En algunos sistemas, pueden usarse sensores y sistemas (como fotodiodos y tubos fotomultiplicadores y dispositivos/óptica asociada) que normalmente no proporcionan ninguna información espacial sobre la muestra que se está interrogando. Más bien, estos sistemas pueden recopilar información sobre la muestra después de que la información se haya integrado espacialmente, perdiendo típicamente información espacial relacionada con la muestra. Si bien la integración de la señal en el espacio de la muestra puede aumentar los niveles de señal detectados por el sensor, los avances en la sensibilidad de los sensores ópticos y de otro tipo pueden invalidar la necesidad de dicha integración. La formación de imágenes para la detección puede usarse en lugar de tales sensores, o puede usarse junto con tales sensores.

Pueden usarse sistemas de formación de imágenes que pueden tener ventajosamente una o más de las siguientes características. Los sensores de imágenes pueden tener una sensibilidad y un intervalo dinámico que igualen o superen a los de los sensores convencionales que no son de imágenes. Los dispositivos de formación de imágenes pueden mantener los aspectos espaciales de la muestra que se está interrogando, lo que proporciona una capacidad significativa para el procesamiento posterior. El posprocesamiento puede incluir QA/QC (por ejemplo, control de calidad, como detección automática de errores y/o revisión por parte del patólogo) y/o análisis de imágenes para extraer características específicas de la muestra. El dispositivo de formación de imágenes puede utilizar 3D, 2D, 1D (sensores de línea) y/o sensores puntuales con un medio para trasladar la muestra en relación con la óptica/sensor de recogida para permitir la reconstrucción espacial de la muestra. Los datos recopilados del dispositivo de imágenes pueden procesarse para extraer información muy específica, como características morfológicas de la muestra (como recuentos de células), datos de regiones seleccionadas de la imagen (pico de fluorescencia en una muestra o en una célula dentro de la imagen). Los datos recopilados del dispositivo de imágenes pueden procesarse para mejorar la sensibilidad y la resolución de la medición. Los datos recopilados del dispositivo de imágenes pueden permitir la evaluación de la variación de la señal en la muestra en la que se están tomando imágenes. Los datos pueden procesarse posteriormente para calcular la media, la desviación estándar, el máximo, el mínimo y/u otras estadísticas aplicables en la muestra o dentro de cualquier región de interés identificada en las imágenes de muestra. Los dispositivos de imágenes permiten la exploración de cambios en la muestra a lo largo del tiempo mediante la recopilación de múltiples imágenes y la comparación de cambios en las imágenes en el tiempo y el espacio, como sería evidente en un proceso de agregación (como para un ensayo de tiempo de protrombina) u otro (por ejemplo, cambios químicos, físicos, biológicos, eléctricos, morfológicos) en la muestra a lo largo del tiempo y el espacio. Los dispositivos de imágenes pueden permitir una adquisición de datos más rápida de matrices, secciones de tejido y otras configuraciones de ensayo/muestra.

Aplicación de citometría

En algunos ejemplos, cualquiera de los ejemplos descritos en el presente documento puede adaptarse para permitir que el sistema realice citometría. La citometría (por ejemplo, el análisis de enumeración y función de las células) en el sistema puede realizarse usando análisis de imágenes. La sangre puede procesarse usando la pipeta y la centrífuga como se describe anteriormente en el presente documento. Normalmente, puede centrifugarse primero un volumen de sangre medido conocido (1 - 50 uL) y extraer la fracción de plasma. A continuación, la fracción celular puede resuspenderse en tampón mediante el uso de la pipeta repetidamente para dispensar y aspirar. Puede dirigirse un cóctel de anticuerpos fluorescentes a marcadores celulares seleccionados (tales como CD45, CD4, etc.). Tras una breve incubación, puede añadirse un reactivo que puede actuar como fijador de los glóbulos blancos y un agente de lisis para los glóbulos rojos. Después de otra incubación, los glóbulos blancos pueden recolectarse por centrifugación y el hemolizado sobrenadante puede eliminarse por aspiración. Los glóbulos blancos teñidos pueden resuspenderse en un volumen medido de tampón (generalmente menos que el volumen de sangre original (digamos 1 - 20 uL) y dispensarse en canales capilares transparentes para el análisis de imágenes. Normalmente, pueden obtenerse imágenes de hasta tres o incluso cinco o más tipos de células usando anticuerpos que tienen diferentes marcadores fluorescentes o y/o anticuerpos marcados con diferentes proporciones de flúor/proteína. Cuando es necesario contar o analizar más tipos de células, puede usarse más de una mezcla de reacción. En algunos ejemplos, puede usarse una mezcla de reacción para contar o analizar varios números de tipos de células.

En algunos ejemplos, los canales capilares tienen típicamente alrededor de 10 -100 um de profundidad, 0,5 - 2 mm de ancho y 0,5 - 5 cm de largo. Los canales capilares pueden tener otras dimensiones, que incluyen, pero se limitan a, otras dimensiones descritas en otra parte del presente documento. La dispersión de células teñidas puede llenar el canal normalmente por acción capilar y puede permitirse que las células se asienten en la superficie inferior del canal. Los canales pueden iluminarse con uno o más láseres u otras fuentes de luz (por ejemplo, LED). El tren óptico puede tener uno o más elementos ópticos, como espejos o lentes dicroicos, y puede o no ampliar el campo de visión. En algunos ejemplos, el campo de visión puede ampliarse de 2 a 100 veces. Puede recopilarse una serie de imágenes que representan típicamente un campo de visión de aproximadamente 1 mm x 0,5 mm y que contiene 1 -10 000 células (idealmente, 300 células de interés) en un sensor que tiene un área de aproximadamente 1000 x 1000 píxeles (1 millón en total).

Puede recopilarse una serie de imágenes que representan secciones adyacentes del canal. Puede usarse una platina mecánica para mover los canales en relación con la fuente de luz. En algunos casos, un servomecanismo puede mover el escenario en dirección vertical para enfocar la imagen. En algunos ejemplos, la fuente de luz o uno o más elementos ópticos pueden moverse con relación al escenario para enfocar la imagen. Las imágenes generalmente se hacen usando una o más combinaciones de fuentes de luz y filtros ópticos. Las fuentes de luz pueden encenderse y apagarse y los filtros pueden moverse a la trayectoria de la luz según sea necesario. Preferiblemente, pueden contarse hasta 1000 células de cualquier tipo dado. En otros ejemplos, pueden contarse varios números de células de cualquier tipo dado, incluidos, entre otros, más, menos o igual a aproximadamente 1 célula, 5 células, 10 células, 30 células, 50 células, 100 células, 150 células, 200 células, 300 células, 500 células, 700 células, 1000 células, 1500 células, 2000 células, 3000 células, 5000 células. Las células pueden contarse usando los algoritmos de recuento disponibles. Las células pueden reconocerse por su fluorescencia, tamaño y forma característicos. Pueden emplearse algoritmos de reconocimiento de patrones para excluir los desechos celulares teñidos y, en la mayoría de los casos, cuando hay células que están agregadas, estas pueden excluirse del análisis o interpretarse como agregados.

Una plataforma de citometría puede ser un dispositivo de microscopía automatizado integrado capaz de las siguientes tareas en un entorno controlado y totalmente automatizado. Una o más de las siguientes tareas pueden ocurrir en aplicaciones de citometría. Las siguientes tareas pueden ocurrir en el orden en que aparecen o en órdenes alternos u otras tareas pueden ser sustituidas según corresponda.

1. Aislamiento de glóbulos del tipo deseado

2. Marcado de células con colorantes y/o perlas fluorescentes y/o coloreadas

3. Confinamiento de la suspensión celular en una cubeta ópticamente compatible

4. Obtención de imágenes de células mediante microscopía de fluorescencia, iluminación de campo oscuro y/o iluminación de campo claro

5. Análisis automatizado de imágenes para extraer los atributos celulares deseados

6. Análisis automatizado de la información extraída usando métodos estadísticos y de clasificación avanzados para derivar información clínicamente notificable.

En las siguientes secciones, cada una de estas tareas se analiza en mayor detalle; se proporcionan imágenes y bocetos siempre que se considere necesario.

1. Aislamiento de glóbulos del tipo deseado. Las células sanguíneas de un tipo deseado pueden aislarse de acuerdo con uno o más ejemplos descritos en otra parte del presente documento. Por ejemplo, tal aislamiento puede ocurrir como se indica en descripciones previas relacionadas con la citometría o la centrífuga.

2. Marcado de células con colorantes y/o perlas fluorescentes y/o coloreadas.

Pueden emplearse colorantes fluorescentes específicos. Las células de interés pueden incubarse con soluciones pre-alícuotas de aglutinantes marcados con fluorescencia (por ejemplo, anticuerpos, aptámeros, etc.) que son específicos de los marcadores de estas células. Una consideración clave puede ser el emparejamiento de flúores "brillantes" o de alto coeficiente de extinción y de alto rendimiento cuántico con marcadores para los cuales las células tienen una menor capacidad de unión, y viceversa. Por ejemplo, el marcador CD22 puede expresarse en linfocitos B a aproximadamente una décima parte del nivel de CD45. Dada esta expresión relativa, CD22 puede marcarse con un colorante "brillante" y CD45 puede marcarse con el colorante "más tenue". Los marcadores que se marcarán usando esta técnica pueden ser marcadores intracelulares o de superficie celular. La sensibilidad de detección y cuantificación puede mejorarse usando un esquema de marcado secundario para marcadores de baja expresión. Brevemente, un aglutinante primario puede conjugarse con otra molécula que puede ser reconocida específicamente por un aglutinante secundario. Un aglutinante secundario marcado con un mayor número de fluoróforos puede unirse al aglutinante primario in situ y mejorar la señal de fluorescencia. Un esquema para lograr esto puede ser el uso de anticuerpo anti-CD22 conjugado con biotina que a su vez puede ser reconocido por un anticuerpo anti-biotina que está marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC). El uso de este puede mejorar drásticamente la señal de fluorescencia. La Figura 123 proporciona un ejemplo de una micrografía de fluorescencia que muestra leucocitos marcados. El ejemplo ilustra una micrografía de fluorescencia de leucocitos humanos marcados con Alexa-Fluor 647-anti-CD45 en una muestra de sangre fijada y lisada. El esquema de pseudocolor se usa para mejorar la percepción de la diferencia entre las células "brillantes" (con alta expresión de CD45) y las células "tenues" (con baja expresión de CD45).

También pueden emplearse colorantes de color de frotis de células dentro del sistema. Por ejemplo, el procedimiento manual dado en Sta/nRITE™ Wright-Giemsa Stain (Polysciences Inc.) puede automatizarse y leer en los dispositivos.

En algunos ejemplos, pueden usarse colorantes fluorescentes no específicos. Con el fin de diferenciar subpoblaciones de leucocitos, la plataforma también puede usar colorantes fluorescentes que pueden unirse a ácidos nucleicos (por ejemplo, SYTO, Hoechst) o membranas lipídicas (por ejemplo, Dil, DiD, ^f M-4-64).

3. Confinamiento de la suspensión celular en una cubeta ópticamente compatible.

En algunos ejemplos, las cubetas de citometría pueden diseñarse para confinar una suspensión de células premarcadas de volumen fijo en un 'canal' fabricado para proporcionar un material de formación de imágenes ópticamente transparente por encima y por debajo de las células. La muestra puede introducirse en el canal a través de un puerto de entrada de muestra. A cierta distancia del puerto de entrada de la muestra, una ventilación de aire puede permitir la liberación de presión de aire y el flujo de la muestra hacia el canal.

Las dimensiones del canal pueden diseñarse para contener un volumen de fluido conocido predefinido, independientemente del volumen dispensado en el puerto de entrada de la muestra. Cada cubeta puede tener múltiples canales de volúmenes iguales y/o diferentes, cada uno con al menos un puerto de entrada de muestra y al menos un orificio de ventilación.

La concentración de células de interés en la muestra puede ajustarse durante la preparación de la muestra de modo que después del confinamiento en la cubeta, pueda lograrse un número deseado de células por campo de visión en el sistema de formación de imágenes. Un método para hacer esto puede ser obtener una imagen de un contenedor con la dispersión celular y medir la turbidez. Usando una relación preestablecida entre turbidez y recuento de células, puede calcularse la densidad de células. Normalmente, la dispersión de células se realizará en un volumen de tampón tal que con el recuento de células más bajo probable, y la concentración de células será mayor que la óptima para el recuento de células basado en imágenes. Luego puede agregarse más tampón para llevar la dispersión al nivel óptimo.

El área de formación de imágenes de la cubeta puede diseñarse para proporcionar un número suficiente de células para la aplicación de interés. Por ejemplo, el recuento de glóbulos rojos abundantes puede requerir el recuento de solo 1000-2000 células y, por lo tanto, una muestra diluida y solo una pequeña área de imagen en la cubeta. Sin embargo, el recuento de mieloblastos raros puede requerir en algunos casos la capacidad de obtener imágenes de más de 100000 células (en total). En tal escenario, el sistema puede concentrar la suspensión de células de modo que puedan obtenerse imágenes de 100000 células con un número razonable de campos de visión. Por lo tanto, el canal de la cubeta dedicado a la obtención de imágenes de glóbulos rojos será más pequeño que el dedicado a la obtención de imágenes de mieloblastos.

La cubeta puede diseñarse para ser recogida por un mecanismo de pipeteo estándar de forma automatizada para permitir la transferencia de la cubeta a la plataforma de formación de imágenes. El eyector de puntas del mecanismo de pipeteo puede expulsar la cubeta del mecanismo de pipeteo a la plataforma de imágenes. El registro de la cubeta en la plataforma de imágenes puede realizarse en dos pasos. Tras la transferencia de la cubeta a la plataforma de imágenes, las características de registro estático en la cubeta pueden interactuar con las características de acoplamiento en la plataforma de imágenes para alinear la cubeta paralela al eje óptico de la plataforma de imágenes (registro X, Y). A continuación, el registro puede completarse mediante un mecanismo ubicado en la plataforma de imágenes. Este mecanismo puede desviar la cubeta contra una superficie plana perpendicular al eje óptico de la plataforma de imagen (registro Z), restringiendo así la muestra dentro del intervalo focal de la plataforma de imagen.

4. Obtención de imágenes de células mediante fluorescencia, iluminación de campo oscuro, iluminación de campo claro. El método de formación de imágenes de las células también puede aplicarse a otras aplicaciones de la invención descritas en otra parte del presente documento. Las técnicas de formación de imágenes, como se describió anteriormente, pueden usarse para otros usos de formación de imágenes.

Capacidades de iluminación: la plataforma de citometría puede diseñarse para tener tres tipos de esquemas de iluminación: epi-fluorescencia, campo oscuro y campo claro. La naturaleza modular de la configuración también permite la integración de contraste de fase y contraste de interferencia diferencial (DIC).

La iluminación de epifluorescencia puede lograrse mediante el uso de tres líneas láser (por ejemplo, 488 nm, 532 nm y 640 nm), pero la naturaleza modular del sistema también permite la integración de otras fuentes de luz, como otras fuentes láser, LED y lámparas de arco estándar (por ejemplo, xenón, mercurio y halógeno). Además, pueden usarse dos fuentes diferentes simultáneamente, si es necesario. En consecuencia, la plataforma de citometría puede usarse para obtener imágenes de una gran variedad de colorantes fluorescentes. La combinación de fuentes de iluminación y óptica de emisión puede configurarse para lograr varios números (por ejemplo, 3-5) canales de formación de imágenes espectralmente independientes.

La iluminación de campo oscuro puede lograrse mediante el uso de un anillo de luz (ubicado encima o debajo de la muestra), un condensador abbe de campo oscuro, un condensador de campo oscuro con un espejo toroidal, un condensador de campo oscuro epi construido dentro de una manga alrededor de la lente del objetivo, o una combinación de anillo de luz con un condensador de escenario equipado con un tope oscuro. Básicamente, estos componentes ópticos pueden crear un cono de luz de apertura numérica (NA) mayor que la NA del objetivo que se está usando. La elección del esquema de iluminación depende de una serie de consideraciones, como el aumento requerido, las consideraciones de diseño mecánico o el tamaño del sensor de imagen. Un esquema de iluminación basado en anillo de luz generalmente proporciona una iluminación uniforme de campo oscuro en un área más amplia y, al mismo tiempo, proporciona suficiente flexibilidad en el diseño mecánico del sistema general. La Figura 124 proporciona un ejemplo de patrones intracelulares usando imágenes de campo oscuro. El ejemplo muestra diferentes patrones intracelulares en imágenes de campo oscuro de leucocitos humanos. (a) Un patrón de dispersión fuerte debido a la presencia de sedimentos en los eosinófilos, (b) un neutrófilo polimorfonuclear con lóbulos nucleolares característicos y (c) células que no dispersan la luz en un grado significativo (linfocitos o basófilos)

La iluminación de campo claro puede lograrse mediante el uso de una fuente de luz blanca junto con un condensador de escenario para crear la iluminación de Koehler. La Figura 126 proporciona un ejemplo de imágenes de campo claro de sangre humana completa. El ejemplo muestra imágenes de campo claro de un frotis de sangre humana entera teñido con el método de tinción de Wright-Giemsa. Son evidentes los patrones característicos de tinción de leucocitos humanos. Los glóbulos rojos de forma característica también pueden identificarse en estas imágenes.

Rueda de filtro automática: una rueda de filtro automática puede permitir el control de la trayectoria óptica de la imagen para permitir la imagen de múltiples fluoróforos en el mismo campo de visión.

Autoenfoque basado en imágenes: la plataforma de citometría puede usar un algoritmo basado en imágenes para controlar la posición z (por ejemplo, posición vertical) del objetivo (es decir, su distancia desde la muestra) para lograr el autoenfoque. En resumen, puede capturarse una imagen pequeña (por ejemplo, 128x128 píxeles) a una velocidad rápida usando iluminación de campo oscuro. Esta imagen puede analizarse para obtener la función de enfoque automático que puede usarse para medir la nitidez de la imagen. Basándose en un algoritmo de búsqueda rápida, puede calcularse la siguiente ubicación z del objetivo. La muestra puede moverse a la nueva ubicación z y puede capturarse otra imagen pequeña. En algunas modalidades, este sistema de circuito cerrado no requiere el uso de ningún otro hardware para enfocar.

Traslación de la platina: La platina del microscopio puede conectarse a motores paso a paso controlados por ordenador para permitir la traslación en las direcciones X e Y (por ejemplo, direcciones horizontales). En cada lugar, puede capturarse el número deseado de imágenes y el escenario puede moverse a la siguiente posición XY.

Sensor de imagen: puede usarse una cámara con CCD, EMCCD, CMOS o, en algunos casos, un tubo fotomultiplicador para detectar la señal.

5. Análisis de imágenes para extraer los atributos celulares deseados.

La plataforma de citometría puede usar diferentes técnicas de iluminación para adquirir imágenes que revelen diversas propiedades y características de las células. El marcado con ligantes específicos de marcadores celulares puede revelar el grado de expresión de ese marcador particular en la superficie celular o en la célula. La imagen de campo oscuro puede revelar las propiedades de dispersión de luz de la célula. Las características internas y externas de la célula que dispersan más luz aparecen más brillantes y las características que dispersan cantidades menores de luz aparecen más oscuras en una imagen de campo oscuro. Las células como los granulocitos tienen sedimentos internos de tamaño (100-500 nm) que pueden dispersar una cantidad significativa de luz y generalmente aparecen más brillantes en imágenes de campo oscuro. Además, el límite exterior de cualquier célula puede dispersar la luz y puede aparecer como un anillo de luz brillante. El diámetro de este anillo puede dar directamente el tamaño de la célula. Las imágenes de campo claro de las células pueden revelar el tamaño de la célula, el material denso en fase dentro de las células y las características coloreadas en la célula si las células se han teñido previamente.

Una biblioteca de procesamiento de imágenes puede extraer una o más de la siguiente información para cada célula (pero no se limita a lo siguiente):

1. Tamaño de la célula

2. Medida cuantitativa de la granularidad celular (también conocida como dispersión lateral, basada en el lenguaje de la citometría de flujo)

3. Medida cuantitativa de la fluorescencia en cada canal espectral de imagen, después de compensar la diafonía entre canales espectrales

4. Forma de la célula, cuantificada por atributos de forma estándar y personalizados como relación de aspecto, diámetros de Feret, curtosis, momento de inercia, circularidad, solidez, etc.

5. Color, distribución del color y forma de la célula, en los casos en que las células hayan sido teñidas con colorantes (no adheridos a anticuerpos u otros tipos de receptores).

6. Patrones intracelulares de tinción o dispersión o color que se definen como métricas cuantitativas de una característica biológica, por ejemplo, densidad de sedimentos dentro de las células en una imagen de campo oscuro, o el número y tamaño de los lóbulos nucleolares en una imagen teñida de Giemsa-Wright de neutrófilos polimorfonucleares, etc.

7. Co-localización de características de la célula reveladas en imágenes separadas

Los algoritmos de procesamiento de imágenes utilizados en este paso pueden usar combinaciones de filtrado de imágenes, detección de bordes, coincidencia de plantillas, establecimiento de umbrales automático, operaciones morfológicas y análisis de forma de objetos.

6. Análisis de la información extraída usando métodos estadísticos y de clasificación avanzados para derivar información clínicamente notificable.

Puede extraerse cualquier número de atributos medidos a partir de imágenes de células. Por ejemplo, los atributos medidos de cada célula extraída de las imágenes pueden variar de 7 a 15, creando así un espacio dimensional de 7 a 15 dentro del cual cada célula es un punto. Si se extraen n atributos medidos de las imágenes, puede proporcionarse un espacio de n dimensiones, dentro del cual cada célula es un punto.

En base a los datos adquiridos para un gran número de células (por ejemplo, 100-100000 células) puede generarse un conjunto complejo de datos dispersos en n dimensiones.

Pueden usarse métodos estadísticos para agrupar células en poblaciones individuales separadas en este espacio n-dimensional. Estos métodos también pueden usar el conocimiento más avanzado de la biología celular y la hematología para ayudar en la identificación de la población celular y la agrupación.

La Figura 125 proporciona un ejemplo de adquisición de múltiples parámetros de datos de muestras de células marcadas. Los leucocitos humanos se marcaron con el marcador pan-leucocitario anti-CD45-Alexa Fluor 700 (se muestra aquí en verde) y el marcador de células B anti-CD22-APC (se muestra aquí en rojo). Los canales individuales muestran diferentes patrones de expresión de CD45, CD22 y dispersión lateral. Las células que son positivas para CD22 y CD45 (linfocitos B) muestran la dispersión lateral característicamente baja. Por otro lado, las células como los neutrófilos y los eosinófilos que tienen una alta dispersión lateral no muestran marcaje para CD22.

La Figura 127 proporciona un ejemplo de adquisición y análisis de datos multiparamétricos cuantitativos. Por ejemplo, puede proporcionarse un histograma que puede mostrar la distribución de la intensidad de CD45 en leucocitos humanos. Puede emplearse cualquier otra técnica de distribución de datos gráficos para mostrar la distribución. En algunos ejemplos, puede proporcionarse un diagrama de dispersión de la dispersión lateral. La dispersión lateral puede determinarse mediante análisis de imágenes de campo oscuro frente a la intensidad de fluorescencia de CD45 para una muestra de leucocitos humanos. El gráfico de dispersión lateral puede mostrar dos poblaciones principales de granulocitos (arriba a la izquierda) y linfocitos (abajo a la derecha).

Las secciones anteriores describen los principales componentes y capacidades de la plataforma y aplicaciones de citometría. Sobre la base de estas capacidades, puede diseñarse una amplia gama de ensayos basados en células para que funcionen en esta plataforma. Por ejemplo, puede proporcionarse un ensayo para realizar un diferencial de leucocitos de 5 partes. Los reportables en este caso pueden ser el número de células por microlitro de sangre para los siguientes tipos de leucocitos: monocitos, linfocitos, neutrófilos, basófilos y eosinófilos. La estrategia básica para el desarrollo de este ensayo en la plataforma de citometría puede ser convertir esto en un problema en el que se miden algunos atributos de los leucocitos, como la dispersión lateral, la intensidad de fluorescencia de CD45 o la intensidad de fluorescencia de CD20, de modo que los leucocitos puedan segregarse en (por ejemplo, 5) diferentes poblaciones en este espacio n-dimensional. Las regiones que se forman alrededor de un grupo de células pueden colocarse en un diagrama de dispersión en un espacio bidimensional y se denominan "puertas" en el lenguaje de la citometría de flujo. Un ejemplo de estrategia de marcado y "puertas" es la siguiente:

La plataforma de citometría y el sistema de análisis descritos en el presente documento pueden permitir ventajosamente la preparación y ejecución de muestras automatizadas en base a la muestra ordenada. Los sistemas y métodos descritos también pueden permitir la identificación específica de células en oposición a VCS (volumen, conductividad y dispersión), lo que puede aumentar la confianza en la identificación y reducir los casos de pruebas de confirmación. El análisis de imágenes descrito en el presente documento también puede permitir la conservación de imágenes de células para su posterior confirmación, análisis como se requiera. Ventajosamente, también puede haber disponibilidad de características morfológicas de la célula. En algunas modalidades, puede proporcionarse un ajuste dinámico de la preparación de la muestra y los parámetros de formación de imágenes para tratar con muestras de células de una amplia gama de concentraciones.

En algunos ejemplos, la centrífuga puede usarse para preparar y concentrar poblaciones de células. Un método puede incluir el uso de la centrífuga para la preparación de células y el sistema de formación de imágenes y análisis descrito en otra parte del presente documento.

En algunos ejemplos, puede usarse una combinación de formación de imágenes de campo oscuro y formación de imágenes de células teñidas con múltiples anticuerpos fluorescentes. Tal combinación puede dar el equivalente al análisis FACS en un dispositivo mucho más simple y menos costoso que otras técnicas.

De acuerdo con algunos ejemplos, los sistemas y métodos descritos en el presente documento pueden habilitar una o más de las siguientes características. Tales características pueden resultar ventajosas para diversas aplicaciones. En algunos ejemplos, puede habilitarse la inspección y el procesamiento automatizados de muestras. Dicha inspección y procesamiento de muestras puede incluir uno o más de los siguientes: calidad de la muestra, medición del volumen de la muestra, dilución (y medición de los factores de dilución) y separación de los glóbulos rojos y blancos del plasma.

También puede emplearse un proceso automatizado relacionado con el ensayo/químico. Esto puede incluir precipitación, mezcla o sedimentación.

En algunos ejemplos, puede haber una medición automatizada de todos y cada uno de los ensayos que producen luminiscencia o cambian la luz (por ejemplo, química del color). Estos pueden incluir uno o más de los siguientes: espectrofotometría, fluorimetría, luminometría, turbidimetría, nefelometría, refractometría, análisis de imágenes de 3 colores, polarimetría, medición de aglutinación, análisis de imágenes (que pueden emplear uno o más de los siguientes: cámara, cámara digital, escáner, fotografía sin lentes, fotografía en 3-D, fotografía de video) o microscopía.

El control de calidad automatizado y/o la calibración de ensayos también pueden proporcionarse dentro de los sistemas y métodos descritos en el presente documento.

En algunos ejemplos, puede proporcionarse comunicación bidireccional. Dicha comunicación puede permitir el mantenimiento de registros de todos los pasos del ensayo. La comunicación bidireccional también puede permitir cambios en los protocolos de ensayo para optimizar o aumentar la finalización de múltiples ensayos.

Control de calidad/aplicaciones complementarias

En algunos ejemplos, la formación de imágenes puede usarse junto con una o más de otras medidas o pasos de detección. La formación de imágenes puede ser complementaria a otras técnicas, procedimientos, reacciones y/o ensayos. Por ejemplo, la formación de imágenes puede usarse para realizar una o más comprobaciones o pasos de control de calidad para cualquier otra acción, como una preparación de muestras, un ensayo o un paso de detección. Las imágenes pueden usarse para facilitar otras detecciones. Las imágenes pueden usarse para mejorar la exactitud y/o precisión de los datos recopilados. La formación de imágenes puede ser un aspecto de control de calidad para verificar datos, resultados y/o cualquier medida. La formación de imágenes puede ser un mecanismo de control o un mecanismo de mejora. Las imágenes pueden usarse para detectar una o más condiciones que pueden afectar los datos recopilados y/o la exactitud y/o precisión de los datos. Por tanto, la formación de imágenes puede mejorar los procedimientos de preparación, ensayo y/o detección de muestras. Esto puede ser particularmente ventajoso en situaciones en las que hay pequeños volúmenes de muestra, como los volúmenes descritos en otra parte del presente documento.

En un ejemplo, puede ocurrir un paso de detección para determinar la presencia y/o concentración de un analito. Puede producirse la detección de una o más señales que pueden ser representativas de datos que pueden ser útiles para una evaluación cualitativa y/o cuantitativa posterior. La detección puede incluir o no la detección de luz visible. La detección puede incluir la medición de energía desde cualquier lugar a lo largo del espectro electromagnético (por ejemplo, infrarrojos, microondas, ultravioleta, rayos gamma, rayos X, luz visible). La detección puede ocurrir usando cualquier tipo de sensor, que puede incluir un sensor óptico, sensor de temperatura, sensor de movimiento, sensor de presión, sensor de electricidad, sensor acústico, sensor químico, espectrómetro o cualquier otro sensor descrito en otra parte de este documento, o cualquier combinación de los mismos. En algunos ejemplos, la detección puede incluir o no una distribución espacial de luz y/o energía. En algunos casos, la detección puede incluir o no una distribución de densidad de energía.

La formación de imágenes puede ser capaz de detectar una o más condiciones bajo las cuales tiene lugar la detección. La formación de imágenes puede usarse para detectar el estado de una muestra, reactivo, contenedor, parte del dispositivo que puede usarse en la detección. En algunos ejemplos, las imágenes pueden ser imágenes visibles. Por ejemplo, la creación de imágenes puede incluir la captura de una instantánea, una foto y/o una imagen. La formación de imágenes puede incluir capturar una distribución espacial de energía a lo largo del espectro electromagnético. La energía a lo largo del espectro electromagnético puede incluir luz visible o puede incluir otros rangos (por ejemplo, infrarrojos, ultravioleta o cualquier otro descrito en el presente documento). Por ejemplo, una distribución espacial de luz visible puede incluir una imagen bidimensional. En algunos ejemplos, la formación de imágenes puede incluir el uso de un dispositivo de captura de imágenes, que se describe con mayor detalle en otra parte de este documento. Algunos ejemplos de dispositivos de captura de imágenes pueden incluir una cámara, como una cámara sin lente (computacional) (por ejemplo, Frankencamera) o una cámara de código abierto. Un dispositivo de captura de imágenes puede ser capaz de capturar señales que pueden ser capaces de generar una representación unidimensional, bidimensional o tridimensional del elemento del que se forma la imagen. En algunos casos, un dispositivo de captura de imágenes puede ser un dispositivo de entrada de detección de movimiento configurado para proporcionar una representación tridimensional o pseudo tridimensional de un objeto.

La técnica de formación de imágenes puede ser la misma o puede ser diferente del mecanismo de detección utilizado. En algunos casos, se usan diferentes tipos de mecanismos de detección entre el paso de detección y el paso de formación de imágenes de control de calidad. En algunos casos, la detección puede incluir una evaluación de la banda de energía o una distribución de la densidad de energía, como la de un espectrómetro, mientras que las imágenes de control de calidad pueden incluir una distribución espacial de la luz visible, como la de una cámara. La detección sensible puede lograrse mediante imágenes. Por ejemplo, un dispositivo de imágenes puede capturar una imagen con una precisión de 1 mm, 500 micrómetros (um), 200 um, 100 um, 75 um, 50 um, 25 um, 15 um, 10 um, 7 um, 5 um, 1 um, 800 nanómetros (nm), 700 nm, 500 nm, 300 nm, 100 nm, 50 nm, 30 nm, 10 nm, 5 nm, 1 nm, 500 picómetros (pm), 300 pm o 100 pm. En un ejemplo, la imagen puede lograrse con una cámara que puede tener una resolución mayor o igual a aproximadamente 2 megapíxeles, 4 megapíxeles, 6 megapíxeles, 8 megapíxeles, 10 megapíxeles, 12 megapíxeles, 15 megapíxeles, 20 megapíxeles, 25 megapíxeles, 30 megapíxeles, 40 megapíxeles o 50 megapíxeles o más.

Las imágenes pueden usarse para detectar un error u otro estado de falla. Las imágenes pueden usarse para determinar una condición que puede aumentar la probabilidad de un error y/o resultar en inexactitudes y/o imprecisiones. Por ejemplo, la formación de imágenes puede usarse para determinar la presencia y/o ausencia de uno o más materiales indeseables. Los ejemplos de materiales indeseables pueden incluir burbujas, partículas, fibras, desechos, precipitados u otro material que pueda afectar una medición. En otro ejemplo, la formación de imágenes puede usarse para determinar si un volumen de muestra, reactivo u otro material cae dentro de un intervalo deseado, o si una muestra, reactivo u otro material está ubicado en una ubicación deseada. La formación de imágenes puede usarse para determinar la concentración de una muestra, reactivo u otro material, o si la muestra, reactivo u otro material cae en un intervalo de concentración deseado.

En un ejemplo, puede realizarse un ensayo enzimático en un pequeño volumen de muestra. Pueden proporcionarse ejemplos de valores de volumen en otra parte de este documento. Puede usarse un espectrómetro u otro método o mecanismo de detección descrito en el presente documento para realizar un paso de detección para el ensayo enzimático. Puede producirse un paso de formación de imágenes para determinar las condiciones en las que se produce la detección. Por ejemplo, el paso de formación de imágenes puede determinar si hay partículas no deseadas, como burbujas, o cualquier otra condición no deseada. El paso de obtención de imágenes puede verificar si el ensayo está funcionando como debería. El paso de formación de imágenes puede confirmar si las condiciones operativas en las que se está realizando el ensayo y/o se está realizando la detección se encuentran dentro de las tolerancias deseadas o las condiciones optimizadas. En algunos ejemplos, las imágenes pueden incluir la toma de una instantánea de una reacción que ocurre en un contenedor. La imagen capturada puede analizarse en busca de condiciones indeseables y/o deseables. En algunos casos, la imagen capturada puede analizarse automáticamente en un método asistido por ordenador. Uno o más procesadores pueden ayudar con el análisis de la imagen capturada, en algunos casos usando una o más rutinas implementadas por medio de código ejecutable por máquina almacenado en una ubicación de memoria. Las imágenes pueden usarse para el control de calidad sin requerir la intervención de un ser humano.

Las imágenes pueden proporcionar inteligencia para un sistema. El paso de formación de imágenes puede proporcionar información sobre las condiciones en las que se produce la preparación, el ensayo y/o la detección de la muestra. Los métodos de detección pueden proporcionar mediciones más fiables, exactas y/o precisas desde un dispositivo de punto de servicio o componente del dispositivo, cuando se utiliza la formación de imágenes en un procedimiento de control de calidad. El control de calidad puede resultar beneficioso cuando se utilizan volúmenes pequeños.

Retroalimentación dinámica

En algunos ejemplos, puede proporcionarse retroalimentación dinámica durante un paso de procesamiento de la muestra. Por ejemplo, la retroalimentación dinámica puede ocurrir durante un paso de preparación de la muestra, paso de ensayo y/o paso de detección. En algunos ejemplos, la retroalimentación dinámica puede proporcionarse a través de imágenes. Alternativamente, la retroalimentación dinámica puede ocurrir a través de cualquier otro mecanismo de detección, como los descritos en otra parte del presente documento. En algunos ejemplos, un mecanismo de retroalimentación dinámica puede utilizar detección óptica, electromecánica, impedancia, electroquímica, microfluídica o cualquier otro mecanismo o combinación de los mismos.

La retroalimentación dinámica puede utilizar opcionalmente la formación de imágenes u otros mecanismos de detección. La retroalimentación dinámica puede estar involucrada en la toma de decisiones automatizada para un sistema. Por ejemplo, puede capturarse una imagen y pueden capturarse datos que pueden considerarse en la determinación de un paso. Un sensor, como un sensor de formación de imágenes, puede capturar información física que puede utilizarse en la determinación de un paso o procedimiento posterior. Dichos pasos o procedimientos posteriores pueden determinarse sobre la marcha de forma automatizada.

En un ejemplo, puede ocurrir una dilución dinámica. Un contenedor, como una cubeta o cualquier otro contenedor descrito en el presente documento, puede tener una muestra en su interior. Un mecanismo de retroalimentación dinámica (por ejemplo, formación de imágenes, espectrofotómetro u otro mecanismo de detección) puede determinar la concentración de una muestra. En algunos ejemplos, la determinación puede ser una determinación aproximada o burda. La determinación inicial puede ser una determinación estimada que puede proporcionar retroalimentación que puede poner la muestra en una condición para una detección y/o análisis más precisos o afinados. En un ejemplo, el mecanismo de retroalimentación dinámica puede ser un método de formación de imágenes que puede usar una detección de fluorescencia inicial para realizar la estimación inicial de la concentración.

El mecanismo de retroalimentación dinámica puede determinar si la concentración de la muestra cae dentro de un intervalo aceptable. En un ejemplo, la concentración puede ser una concentración celular. Puede realizarse un recuento celular aproximado para determinar la concentración celular. Pueden usarse una o más señales del mecanismo de retroalimentación dinámica para el recuento de células. En algunos ejemplos, las células pueden proporcionarse en una amplia gama de concentraciones. En algunos casos, las concentraciones pueden variar en más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más órdenes de magnitud. En algunos ejemplos, dependiendo de la célula o analito a medir y/o analizar, pueden proporcionarse diferentes concentraciones dentro de la misma muestra. En base a la concentración determinada, la muestra puede diluirse o concentrarse y/o amplificarse. Por ejemplo, si la concentración es superior a un intervalo deseado, la muestra puede diluirse. Si la concentración es menor que un intervalo deseado, la muestra puede concentrarse y/o amplificarse. El grado de dilución y/o concentración/amplificación puede determinarse sobre la marcha, basándose en la concentración estimada.

El grado de dilución y/o concentración/amplificación puede determinarse de forma automatizada. La retroalimentación dinámica puede estar automatizada. El mecanismo de retroalimentación dinámica (por ejemplo, formación de imágenes u otro mecanismo de detección) puede proporcionar datos que pueden analizarse para determinar una condición operativa. Por ejemplo, la concentración de una muestra puede determinarse basándose en el mecanismo de retroalimentación dinámica. Puede proporcionarse un procesador, capaz de recibir y/o procesar una o más señales del mecanismo de retroalimentación dinámica. Basándose en las señales recibidas, el procesador puede determinar la concentración y si la concentración cae dentro de un intervalo deseado. Si la concentración cae dentro del intervalo deseado, el procesador puede determinar que no se necesita más dilución o concentración/amplificación. Si la concentración es mayor que el intervalo deseado, el procesador puede determinar que se necesita dilución. El procesador puede determinar el grado de dilución necesario basándose en qué tan lejos la concentración cae fuera del intervalo deseado. Si la concentración es menor que el intervalo deseado, el procesador puede determinar que se necesita concentración (o amplificación). El procesador puede determinar el grado de amplificación necesario en función de cuánto cae la concentración por debajo del intervalo deseado. Tales determinaciones pueden basarse en medios legibles por ordenador tangibles que pueden incluir código, lógica o instrucciones para realizar uno o más pasos. Tales determinaciones pueden automatizarse y, por tanto, realizarse sin necesidad de la intervención de un ser humano. Esto puede aplicarse a cualquier condición operativa y no es necesario limitarse a la concentración de la muestra, como la concentración celular.

En algunos ejemplos, después de una medición de retroalimentación inicial y un paso de dilución o concentración/amplificación, puede tomarse una medición más precisa. Por ejemplo, puede producirse una medición más precisa del recuento de células después de que se determine que la muestra está en un intervalo deseable. En algunos ejemplos, una muestra puede alcanzar un intervalo deseable después de un solo paso de dilución y/o concentración/amplificación. En otros ejemplos, pueden producirse pasos de retroalimentación adicionales y pueden proporcionarse pasos adicionales de dilución y/o concentración/amplificación, como sea necesario. Por ejemplo, si una determinación inicial da como resultado que una muestra tiene una concentración alta, puede ocurrir un paso de dilución. Después del paso de dilución, puede ocurrir opcionalmente un paso de retroalimentación adicional. Si la concentración de la muestra no cae dentro del intervalo deseado (o predeterminado de otro modo), puede ocurrir un paso adicional de dilución o concentración/amplificación, dependiendo de si la concentración medida está por encima o por debajo del intervalo deseado, respectivamente. Esto puede repetirse tantas veces como sea necesario para que la muestra entre en el intervalo deseado. Alternativamente, los pasos de retroalimentación pueden repetirse o no, o pueden repetirse un número fijo de veces. En algunos ejemplos, cada paso de retroalimentación puede ocurrir con un mayor grado de precisión. Alternativamente, puede utilizarse el mismo grado de precisión en cada uno de los pasos de retroalimentación.

En algunos ejemplos, cuando la concentración de una muestra (por ejemplo, concentración celular, concentración de analito) cae en un intervalo deseado, la muestra puede analizarse de manera eficaz. Por ejemplo, la concentración de la célula de muestra puede tener un intervalo deseado que puede ser beneficioso para la formación de imágenes. Puede proporcionarse un número deseado de células por campo de visión.

La cuantificación y enumeración de células mediante imágenes puede mejorarse controlando la densidad de las células durante la obtención de imágenes, lo que limita el hacinamiento y la agrupación de células. En consecuencia, el intervalo de concentración de analito sobre el que el ensayo es lineal puede maximizarse o aumentarse. Para extender el intervalo lineal del ensayo, el sistema dinámico puede realizar una medición previa no destructiva en la muestra usando un método que tiene un intervalo dinámico alto para proporcionar una concentración de células aproximada en la muestra. Luego, un algoritmo puede calcular la relación de dilución requerida para llevar la concentración celular al intervalo aceptable para la medición principal. En consecuencia, puede proporcionarse dilución y/o concentración/amplificación, proporcionando así una dilución y/o concentración dinámicas.

Dicha retroalimentación dinámica, como la dilución dinámica, puede ser ventajosa en sistemas que utilizan pequeños volúmenes. En algunas modalidades, un volumen de muestra total puede incluir cualquiera de los volúmenes descritos en otra parte del presente documento. En algunos casos, los volúmenes para una porción particular de una muestra a analizar pueden tener cualquiera de los volúmenes descritos en otra parte de este documento. La dilución dinámica puede ayudar a proporcionar un bajo coeficiente de variación. Por ejemplo, un coeficiente de variación para una preparación de muestra, ensayo y/o paso de detección puede tener un valor de coeficiente de variación como se describe en otra parte del presente documento. Esto puede ser ventajoso en dispositivos de punto de servicio, que pueden utilizar pequeños volúmenes y/o tener bajos coeficientes de variación.

La retroalimentación dinámica puede permitir ventajosamente un ensayo no destructivo de una muestra. Esto puede resultar ventajoso en sistemas que utilizan volúmenes pequeños. Puede usarse la misma muestra para la detección de retroalimentación inicial y para las detecciones posteriores. La misma muestra puede ser detectada por retroalimentación inicial y posteriores detecciones dentro del mismo contenedor (por ejemplo, cubeta, vial, punta). Puede proporcionarse un recipiente con una muestra que esté fuera de un intervalo deseado y/o detectable en su estado inicial. Por ejemplo, una concentración de uno o más analitos y/o células puede caer inicialmente fuera de un intervalo de concentración deseado y/o detectable. La misma muestra puede medirse dentro del intervalo en el mismo recipiente. En algunos ejemplos, la concentración de uno o más analitos y/o células puede caer más tarde dentro de un intervalo deseado y/o detectable en el mismo recipiente. En algunos ejemplos, pueden realizarse uno o más pasos intermedios, tales como dilución y/o concentración/amplificación en la muestra con el fin de llevar la muestra al intervalo deseado y/o detectable. Dichos pasos intermedios pueden realizarse de forma automatizada. En algunos ejemplos, puede proporcionarse dilución a la muestra de forma automatizada. Por ejemplo, puede dispensarse un diluyente en un contenedor que contiene la muestra y mezclar con la muestra para lograr un nuevo volumen de muestra. En algunos casos, el diluyente incluye un solo diluyente. En otros casos, el diluyente incluye una pluralidad de diluyentes. El diluyente puede dispensarse en el contenedor con la ayuda de un sistema de bombeo, válvulas y/o canales de flujo de fluido para facilitar el flujo, tal como un sistema de microfluidos que tiene uno o más canales de microfluidos y/o una o más bombas de microfluidos. El sistema de microfluidos puede incluir uno o más componentes mecánicos y/o electromecánicos, tales como un sistema de bombeo mecánico que tiene una o más válvulas accionadas (por ejemplo, accionadas neumáticamente) para facilitar el flujo de un fluido. El sistema de bombeo en algunos casos incluye una bomba mecánica configurada para facilitar el flujo de fluido. El sistema de bombeo puede incluir uno o más sensores para medir y transmitir parámetros operativos, tales como caudal de fluido, concentración, temperatura y/o presión, a un sistema de control. En un ejemplo, el diluyente se distribuye en el contenedor con la ayuda de un sistema de microfluidos que tiene una bomba mecánica acoplada a un canal de microfluidos que pone el contenedor en comunicación fluida con un depósito de diluyente.

En algunos casos, se proporciona un sistema de bombeo para liberar un diluyente basado en una dilución de muestra medida. La dilución de la muestra puede medirse con ayuda de un sensor, como por ejemplo un sensor de luz. En un ejemplo, el sensor de luz se acopla con una fuente de luz para dirigir un haz de luz a través de la muestra y, posteriormente, medir la dilución de la muestra basándose, al menos en parte, en la dispersión de la luz a través de la muestra. Si la concentración de la muestra medida (por ejemplo, célula, tejido) está por encima de un límite predeterminado (o umbral), entonces el sistema de bombeo dirige un diluyente (por ejemplo, agua) desde un depósito de diluyente a un contenedor que contiene la muestra.

En algunos ejemplos, la dilución dinámica se automatiza electrónicamente con la ayuda de un sistema de flujo de fluido que tiene una bomba (por ejemplo, bomba de microfluidos) en comunicación fluida con un canal de flujo de fluido (por ejemplo, canal de microfluidos), y además incluye una o más válvulas para regular el flujo de fluido. La automatización de la dilución puede usarse para probar y/o ajustar la configuración de calibración, como los volúmenes de líquido de dilución predeterminados que se usan para lograr una concentración deseada.

En algunas situaciones, la bomba comprende una o más válvulas, como válvulas accionadas neumáticamente. La bomba, el canal de flujo de fluido y una o más válvulas incorporan un depósito de diluyente en comunicación fluida con un contenedor configurado para contener una muestra. La una o más válvulas y/o la bomba pueden estar en comunicación eléctrica con un sistema de control que tiene un procesador para regular el flujo de diluyente desde el depósito de diluyente al para regular la concentración de la muestra.

La retroalimentación dinámica permite ventajosamente la regulación automatizada de la concentración de la muestra mientras minimiza, si no elimina, la participación del usuario. En algunos casos, la concentración de una muestra se regula automáticamente (por ejemplo, diluida o amplificada) sin la participación del usuario. Tal participación mínima del usuario puede proporcionar un bajo coeficiente de variación en la formación de imágenes y el uso general del sistema, como se describe en otra parte del presente documento.

En un ejemplo, el sistema de retroalimentación dinámica se usa para regular la concentración de células en una muestra de fluido usando imágenes. Con la muestra proporcionada en un contenedor de muestra, como una cubeta, la imagen se usa para medir la concentración de células en la muestra de líquido. La concentración medida puede ser una medida aproximada (o estimada) de concentración. El sistema de retroalimentación dinámica luego diluye la muestra de fluido proporcionando un diluyente en el contenedor de la muestra. Esto puede minimizar, si no eliminar, cualquier alteración (o destrucción de) las células tras la dilución. A continuación, puede realizarse una medición opcional de la concentración de células en la muestra de fluido para medir la concentración después de la dilución. En algunas situaciones, después de la dilución, puede tener lugar una reacción en el mismo contenedor de muestra que se usó para diluir la muestra. En algunas situaciones, la reacción puede tener lugar en casos en los que la dilución no sea óptima.

En algunos casos, durante la retroalimentación dinámica, se realiza una medición aproximada de la concentración de la muestra con la ayuda de un espectrómetro, y se realiza una medición más precisa de la concentración de la muestra con la ayuda de un dispositivo de formación de imágenes. El dispositivo de formación de imágenes puede incluir una fuente de luz (por ejemplo, luz coherente, como un láser, o luz incoherente) y una cámara, como una cámara con dispositivo de carga acoplada (CCD). En un ejemplo, después de la medición aproximada, el sistema de retroalimentación dinámica ajusta la concentración de la muestra proporcionando el diluyente y posteriormente realiza la medición más precisa. La concentración de la muestra puede ajustarse aún más proporcionando volúmenes más pequeños de un diluyente (es decir, ajuste fino) en relación con el volumen del diluyente proporcionado durante el ajuste grueso. Alternativamente, la medición aproximada de la concentración de la muestra se realiza con la ayuda de un dispositivo de formación de imágenes, y la medición más precisa se realiza con la ayuda de un espectrómetro. Ajuste grueso y fino

Los sistemas de retroalimentación dinámica proporcionados en el presente documento pueden configurarse para concentrar/amplificar (es decir, aumentar la concentración de) una muestra, como las células en una muestra de fluido. En algunos casos, esto se logra con la ayuda de centrifugación o separación inducida por campo (por ejemplo, separación de campo eléctrico, separación magnética).

En algunas situaciones, la concentración de una muestra se realiza usando un dispositivo de formación de imágenes, con la ubicación del dispositivo de formación de imágenes seleccionada para seleccionar una longitud de trayectoria deseada y/o un punto focal. En algunos casos, la ubicación de una o más ópticas asociadas con el dispositivo de formación de imágenes se ajusta para proporcionar una longitud de trayectoria deseada y/o un punto focal. En algunos casos, se usa una cámara sin lente para la captura de imágenes, que puede proporcionar análisis de imágenes computacionalmente y varios puntos focales.

La dilución dinámica puede realizarse en varios volúmenes de muestra. En algunos casos, si un volumen de muestra está por encima de un límite predeterminado, la muestra puede distribuirse en múltiples contenedores de muestra (por ejemplo, cubetas) para procesamiento secuencial o paralelo y/o formación de imágenes.

Auto-aprendizaje

El mecanismo de retroalimentación dinámica puede resultar en un auto-aprendizaje por parte del sistema. Por ejemplo, para un sistema dinámico de dilución/concentración, puede realizarse una medición de retroalimentación inicial. Según la medición de retroalimentación, la muestra puede no tener acción, puede diluirse o concentrarse/amplificarse. Pueden producirse mediciones y/o detecciones posteriores. Las mediciones y/o la detección posteriores pueden ser o no mediciones de retroalimentación adicionales. Con base en las mediciones posteriores, puede determinarse si la acción tomada (por ejemplo, ninguna acción, dilución, concentración/amplificación) fue correcta y/o si se tomó el grado de acción correcto (por ejemplo, suficiente dilución o concentración/amplificación). Por ejemplo, un mecanismo de retroalimentación inicial puede determinar que la concentración de la muestra es alta y necesita ser diluida. La muestra puede diluirse en una cantidad determinada. Puede tomarse una medición posterior (por ejemplo, puede tomarse una imagen de la muestra). Si el grado de dilución no lleva la muestra al intervalo deseado (por ejemplo, la dilución fue demasiado o muy poca), el sistema puede recibir una indicación de que para diluciones/concentraciones dinámicas posteriores con los mismos o similares mecanismos de retroalimentación inicial, puede usarse un grado de dilución diferente. Si el grado de dilución lleva la muestra al intervalo deseado, el sistema puede recibir una confirmación de que la cantidad de dilución debe usarse para diluciones posteriores para el mismo tipo o similar de medición de retroalimentación inicial. Los puntos de datos pueden recopilarse en función de las condiciones iniciales y las acciones posteriores, lo que puede ayudar a determinar las acciones apropiadas a tomar en situaciones de retroalimentación dinámica posteriores. Esto puede hacer que el sistema aprenda por sí mismo con el tiempo los pasos a seguir en situaciones dinámicas particulares. El auto-aprendizaje puede aplicarse a situaciones individualizadas. Por ejemplo, el sistema de auto-aprendizaje puede aprender que un individuo en particular de quien se extrae la muestra, puede requerir diferentes grados de dilución/concentración que otro individuo. El auto-aprendizaje puede aplicarse a grupos de individuos que tengan una o más características. Por ejemplo, el sistema de auto-aprendizaje puede aprender que un individuo que usa un tipo particular de medicamento puede requerir diferentes grados de dilución/concentración que otro individuo. El sistema de auto-aprendizaje también puede generalizarse. Por ejemplo, el sistema puede darse cuenta de un patrón en el que las personas de un grupo demográfico particular o que tienen características particulares pueden requerir o no diferentes grados de dilución y/o concentración. El sistema puede basarse en puntos de datos pasados, registros de personas, registros de otras personas, información de salud general, información pública, datos y estadísticas médicas, información de seguros u otra información. Parte de la información puede estar disponible públicamente en Internet (por ejemplo, sitios web, artículos, revistas, bases de datos, estadísticas médicas). Opcionalmente, el sistema puede rastrear sitios web o bases de datos para obtener actualizaciones de la información. En algunos ejemplos, el auto-aprendizaje puede ocurrir en el dispositivo, la nube o un dispositivo externo. A medida que se recopilan datos adicionales, pueden cargarse en la nube o en un dispositivo externo, y el sistema de auto-aprendizaje puede acceder a ellos.

Dispositivos de captura y/o manipulación de imágenes

En algunas modalidades, la preparación, procesamiento y/o análisis de muestras se realiza con la ayuda de dispositivos de captura y/o manipulación de imágenes, incluidos dispositivos de captura y/o manipulación de radiación electromagnética (o luz), tales como dispositivos de formación de imágenes o espectrómetros. En algunos casos, puede usarse un dispositivo de formación de imágenes en asociación con un espectrómetro. Puede usarse un espectrómetro para medir las propiedades de la luz en una parte seleccionada del espectro electromagnético, que puede usarse para análisis espectroscópicos, como el análisis de materiales. Puede usarse un dispositivo de formación de imágenes (o captura de imágenes) para medir la concentración, composición, temperatura, turbidez, velocidad de flujo y/o viscosidad de la muestra.

En un ejemplo, un dispositivo de captura de imágenes puede ser una cámara digital. Los dispositivos de captura de imágenes también pueden incluir dispositivos de carga acoplada (CCD) o fotomultiplicadores y fototubos, o fotodetectores u otro dispositivo de detección, como un microscopio de barrido, ya sea con iluminación de fondo o con iluminación frontal. En algunos casos, las cámaras pueden usar CCD, CMOS, pueden ser cámaras sin lente (computacionales) (por ejemplo, Frankencamera), cámaras de código abierto o pueden usar cualquier otra tecnología de detección visual conocida en la técnica. En algunos casos, un dispositivo de formación de imágenes puede incluir un elemento óptico que puede ser una lente. Por ejemplo, el elemento óptico es una lente que captura la luz del plano focal de una lente en el detector. Las cámaras pueden incluir uno o más elementos ópticos que pueden enfocar la luz durante el uso, o pueden capturar imágenes que luego pueden enfocarse. En algunas modalidades, los dispositivos de imágenes pueden emplear imágenes en 2-d, imágenes en 3-d y/o imágenes en 4-d (incorporando cambios a lo largo del tiempo). Los dispositivos de imágenes pueden capturar imágenes estáticas o dinámicas (por ejemplo, video). Las imágenes estáticas pueden capturarse en uno o más puntos en el tiempo. Los dispositivos de formación de imágenes también pueden capturar vídeo y/o imágenes dinámicas. Las imágenes de video pueden capturarse continuamente durante uno o más períodos de tiempo.

En algunos casos, un dispositivo de captura de imágenes es una cámara computacional que se usa para medir la concentración de una pluralidad de muestras en un período de tiempo relativamente corto, por ejemplo de una vez. En algunas modalidades, la cámara computacional puede tener una óptica que puede ser diferente de una lente. En un ejemplo, la cámara de cálculo es una cámara sin lente que toma una fotografía de una pluralidad de muestras en contenedor de muestras escalonados (por ejemplo, cubetas). La concentración de una muestra en un contenedor de muestra en particular puede calcularse, por ejemplo, renderizando matemáticamente la imagen para seleccionar un punto focal en o adyacente a una parte de la imagen que tiene el contenedor de muestra particular, y derivando la concentración de la muestra a partir de la imagen renderizada. Tal manipulación matemática de una imagen, que puede adquirirse con la ayuda de una cámara sin lente, puede proporcionar otra información en varios puntos en el espacio dentro del campo de visión de la cámara sin lente, que puede incluir puntos en el espacio que pueden ser extrapolados de la luz dispersa. En algunas modalidades, la señal final puede analizarse mediante algoritmos complejos. Un ejemplo de tal configuración es una cámara computacional con elementos ópticos que puede producir una imagen transformada de Fourier en el detector. La "imagen" resultante puede analizarse para extraer la información requerida. Tal detector permitiría obtener una rica información del sujeto fotografiado. La obtención de diferentes características de la imagen, por ejemplo, información a una distancia focal diferente, se podría realizar únicamente a través del software, simplificando el hardware de imágenes y proporcionando una adquisición de datos más rápida e informativa.

Los dispositivos de captura y/o manipulación de radiación electromagnética pueden usarse en diversas aplicaciones proporcionadas en el presente documento, tales como medir la concentración de la muestra, incluida la dilución dinámica. En un ejemplo, un dispositivo de captura y/o manipulación de luz incluye una fuente de luz, como una fuente de luz coherente (por ejemplo, láser), junto con un sensor de luz, como una cámara CCD, para capturar la luz dispersa, que puede emanar de una muestra sobre la fuente de luz que se dirige a través de la muestra. Esto puede usarse para medir la concentración de la muestra. El sensor de luz puede configurarse para capturar (o detectar) varias longitudes de onda de luz, como rojo, verde y azul, u otras combinaciones de colores, como combinaciones de rojo, naranja, amarillo, verde, azul, índigo y violeta, por nombrar algunos ejemplos. En algunas situaciones, el sensor de luz está configurado para detectar la luz que tiene longitudes de onda iguales o superiores al infrarrojo o cercano al infrarrojo, o inferior o igual al ultravioleta, además del espectro de luz visible.

Los dispositivos de captura y/o manipulación de luz pueden usarse para recopilar información en puntos particulares en el tiempo, o en varios momentos, que pueden usarse para construir videos que tengan una pluralidad de imágenes fijas y/o sonido (u otros datos, como datos textuales) asociados con las imágenes.

Los dispositivos de captura y/o manipulación de luz, incluidas las cámaras computacionales (o sin lentes), pueden usarse para capturar imágenes bidimensionales o imágenes y/o vídeo tridimensionales (o pseudo tridimensionales). En algunas modalidades, un dispositivo de captura y/o manipulación de imágenes perturba un objeto y mide una respuesta en vista de la perturbación. La perturbación puede ser por medio de luz (por ejemplo, rayos X, luz ultravioleta), sonido, un campo electromagnético, un campo electrostático o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la perturbación por sonido puede usarse en imágenes acústicas. Las imágenes acústicas pueden usar principios similares a los de la ecografía de diagnóstico que se usan en medicina. Las imágenes acústicas pueden funcionar de manera similar a un microscopio normal, pero pueden usar ondas acústicas. Una fuente de ultrasonido puede producir ondas que pueden viajar a través de la muestra y reflejarse/dispersarse debido a las heterogeneidades en las propiedades elásticas de la muestra. Las ondas reflejadas pueden ser "captadas" por un sensor. Una variante de este método puede incluir la "formación de imágenes fotoacústicas" en la que las ondas acústicas que viajan a través de la muestra pueden causar compresión local y extensión de la muestra. Esta compresión/extensión puede provocar un cambio en el índice de refracción del material de muestra que puede detectarse midiendo/formando imágenes de la reflexión de un rayo láser por la muestra.

En algunas situaciones, puede usarse un dispositivo de imágenes para medir el volumen de una célula. En un ejemplo, la combinación de una fuente de luz y una cámara CCD se usa para capturar una imagen fija de una célula. Un sistema informático digitaliza la imagen fija y dibuja una línea a través de la célula, por ejemplo, a través del centro de la célula. Luego, el sistema informático mide la distancia entre los puntos en los que la línea cruza los límites de la célula (o la pared celular o la membrana) para proporcionar una estimación del diámetro de la célula, que puede usarse para estimar el volumen de la célula.

El dispositivo de formación de imágenes puede utilizar microscopía de barrido de líneas para permitir la iluminación de la muestra con una línea delgada o un punto de luz láser coherente, de modo que la energía de la fuente pueda concentrarse en un área pequeña dando altas densidades de energía. La geometría del detector puede coincidir con la línea o el punto. Luego, la línea/el punto puede escanearse a través de la muestra para que puedan obtenerse imágenes de diferentes partes. Cada línea escaneada puede concatenarse para formar la imagen completa (por ejemplo, de manera similar a un escáner de documentos). Este método puede ser ventajoso como método analítico/de formación de imágenes por una o más de las siguientes razones: (1) alta densidad de potencia de iluminación, (2) pueden obtenerse velocidades relativamente altas del escaneo de líneas en oposición al escaneo puntual, (aunque ambos puede ser más lento que las imágenes de fotograma completo o clásicas), (3) alta precisión y/o exactitud de las mediciones analíticas en la muestra, como fluorescencia, absorbancia, luminiscencia, (4) combinación con imágenes espectrales o hiperespectrales de manera que puede adquirirse un espectro completo de la muestra para cada píxel, (5) ajuste de resolución sobre la marcha, (es decir, sin cambiar ningún elemento, una muestra puede escanearse a baja o alta resolución lateral según se desee), o (6) puede proporcionarse una gran profundidad de campo para permitir la obtención de imágenes de muestras de tejido.

En algunas modalidades, un dispositivo de formación de imágenes está configurado para detectar la luz que emana de un evento de ionización (fluorescencia o luminiscencia), como por medio de centelleo. En un ejemplo, un centelleador se recubre o se incrusta en un material que comprende un contenedor de muestra. Cuando una muestra se une a (o interactúa de otro modo con el centelleador), el centelleador emana luz (por ejemplo, luz fluorescente) que es detectada por un detector del dispositivo de formación de imágenes. Esto puede usarse para medir la desintegración radiactiva (por ejemplo, desintegración alfa y/o beta) de ciertas muestras.

En algunas situaciones, un dispositivo de imágenes es un transistor de efecto de campo para detectar partículas cargadas, como iones. Alternativamente, el dispositivo de formación de imágenes puede ser un detector térmico para medir un cambio de calor, que puede usarse para construir un mapa de calor, por ejemplo.

En algunas situaciones, un contenedor de muestra comprende uno o más pocillos para inmovilizar una muestra. El contenedor de muestra puede acoplarse a un dispositivo de formación de imágenes para obtener imágenes de una muestra inmovilizada en uno o más pocillos. La inmovilización de la muestra puede facilitarse con la ayuda de perlas que tengan agentes aglutinantes superficiales (por ejemplo, anticuerpos) o agentes aglutinantes superficiales, que pueden disponerse, por ejemplo, en las porciones del fondo de los pocillos. Los pocillos pueden tener diámetros del orden de nanómetros a micrómetros o más.

En algunas modalidades, la detección y/o análisis de muestras se facilita con la ayuda de especies de mejora de imagen, tales como colorantes. Un colorante puede unirse a una muestra y proporcionar una señal óptica, eléctrica u optoelectrónica que puede ser detectada por un detector de un dispositivo de formación de imágenes. En un ejemplo, un colorante se une a una célula y emite fluorescencia, lo que es registrado por un detector. Midiendo la fluorescencia, puede medirse la distribución espacial y/o la concentración de células. Las especies de mejora de imágenes pueden ayudar a lograr una mejor relación señal-ruido durante la adquisición (o captura) de imágenes. Un colorante puede unirse a una célula con la ayuda de receptores de superficie y/o anticuerpos.

En algunos casos, el uso de colorantes puede generar fluorescencia de fondo, lo que puede distorsionar una imagen, la muestra de fluorescencia puede ser difícil de resolver a partir del fondo fluorescente. En tal caso, la adquisición de imágenes puede mejorarse poniendo en contacto una muestra en un fluido con un colorante fluorescente. El colorante no unido se elimina con la ayuda de una centrífuga (o separación magnética o eléctrica), que separa la muestra del colorante no unido. La centrífuga puede estar integrada en un dispositivo de punto de servicio que tiene el dispositivo de formación de imágenes. A continuación, la muestra puede re-suspenderse en un fluido y posteriormente puede obtenerse una imagen con la ayuda del dispositivo de formación de imágenes.

En algunos casos, la adquisición de imágenes puede mejorarse mediante el uso de retroalimentación dinámica además de, o en lugar de, el uso de especies de mejora de imágenes. En un ejemplo, la concentración de la muestra se optimiza con la ayuda de dilución y/o amplificación antes de la adquisición de imágenes.

La separación de muestras puede facilitarse con la ayuda de una centrífuga. Como alternativa, la separación de la muestra puede realizarse con la ayuda de un campo magnético o eléctrico. Por ejemplo, una partícula magnética puede unirse a una célula, que en presencia de un campo magnético puede usarse para atraer la célula hacia la fuente de atracción magnética.

Los sistemas y métodos proporcionados en el presente documento pueden aplicarse a varios tipos de muestras, tales como células que pueden derivarse de tejido (por ejemplo, piel, sangre), saliva u orina. En un ejemplo, la retroalimentación dinámica y/o la formación de imágenes pueden aplicarse a muestras de tejido o muestras de células derivadas de dichas muestras de tejido.

Ejemplos

Ejemplo 1: Amplificación de ácido nucleico mediante amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP)

Para evaluar la capacidad del método de análisis de imágenes de tres colores, tanto para la fluorescencia como para la absorción, para leer los ensayos LAMP, se realizaron los siguientes experimentos.

Condiciones de reacción de la lámpara

La reacción LAMP se llevó a cabo en un volumen total de 25 pL en tubos de PCR de 500 pL (VWR, West Chester, PA). La mezcla de reacción incluía 0,8 pM de cebador 1 y cebador 2, 0,2 pM de cebador 3 y cebador 4, 400 pM cada uno de dNTP (Invitrogen, Carlsbad, CA), betaína 1 M (Sigma, St. Louis, MO), tampón Thermopol 1X (New England Biolabs, Ipswitch, MA), MgSO42 mM (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA), fragmento grande de ADN polimerasa 8U Bst (New England Biolabs, Ipswitch, MA) y una cantidad determinada de ADN molde (variando entre ~10 y —10A9 copias). En el caso del control negativo, se agregaron aproximadamente 10A9 copias de ADN irrelevante.

Condiciones de reacción

La reacción se incubó a 65 °C durante 1 hora en tubos sellados. A continuación, se inactivó la polimerasa calentando el producto de reacción a 80 °C durante 5 minutos.

Detección y visualización de productos

La solución madre de tinción SYBR Green I (Invitrogen, Carlsbad, CA) se diluyó 100 veces, se mezclaron 5 pl con 10 pl del producto de reacción LAMP completo mezclado y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se leyeron los productos de reacción de la siguiente manera:

Lectura de fluorescencia: tubos de PCR o puntas de pipeta que contenían la mezcla, se iluminaron con luz UV de 302 nm y emisión fluorescente (Amax — 524 nm) fotografiado por una cámara digital (Canon EOS T1i, 18-55 mm, Canon, Lake Success, NY).

Lectura de color: los productos de reacción se aspiraron en puntas y se tomaron imágenes con una cámara digital Resultados:

En la Figura 81 se muestra una imagen de fluorescencia de los productos del ensayo en tubos.

En la Figura 89 se muestra una imagen de fluorescencia del producto de ensayo en las puntas.

Las imágenes en color de los productos del ensayo en las puntas se muestran en la Figura 82, Figura 83, Figura 84, Figura 85, Figura 86 y Figura 87. La Figura 88 muestra una imagen de color de fondo obtenida para la calibración. La Figura 90 muestra una comparación de las respuestas a las dosis de LAMP obtenidas mediante la medición de la fluorescencia "en masa" (fluorometría convencional) y las respuestas para dos canales de color obtenidas con la cámara. Como es evidente, el método del color muestra una respuesta comparable a la de la fluorimetría.

Cuando las imágenes en color se analizaron y calibraron de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento usando todos los canales de color, la estrecha correspondencia de la señal de color calibrada con la señal de fluorescencia es evidente, como se muestra en la Figura 91.

Ejemplo 2: Sistema que maximiza la utilización de la muestra

Un sistema para maximizar la utilización de la muestra puede tener las siguientes características:

1. Separación eficiente de sangre en plasma y recuperación eficiente del plasma

a. La separación se logra mediante centrifugación en un tubo capilar

2. Dilución del plasma a unos pocos niveles preestablecidos apropiados para ensayos de alta y baja sensibilidad 3. Minimizar el volumen de cada mezcla de reacción de ensayo necesaria para cada ensayo

a. Uso de una cubeta de bajo volumen con extremos abiertos adecuada para incubaciones de ensayo, evitando la evaporación

i. La cubeta es larga en relación con el ancho

b. Dentro de dichas cubetas de bajo volumen, lo que permite aumentar la sensibilidad de la señal de ensayo modificando la longitud de la trayectoria óptica

i. La cubeta es cónica o tiene características en las que el ancho es ancho y estrecho c. Cuando sea necesario, lograr dicho aumento en la sensibilidad de la señal del ensayo moviendo el producto de reacción (que no llena la cubeta) a ubicaciones seleccionadas que tengan una mayor longitud de trayectoria en el momento de la medición óptica

i. El volumen interno de la cubeta es mucho mayor que el volumen de la mezcla de ensayo 4. Uso de análisis de canal de 3 colores o de longitud de trayectoria variable o ambos para aumentar el intervalo dinámico útil de los ensayos

Ejemplo 3: Dispositivo de ensayo en el punto de atención

Un dispositivo de ensayo en el punto de atención puede incluir cartuchos desechables de un solo uso, un instrumento que procesa muestras y opera los ensayos y un servidor remoto del instrumento, el sistema de medición y detección que comprende:

• Un cartucho desechable que contiene

- Métodos de medición y adquisición de muestras (como una punta de muestra)

• Una carcasa de instrumento que contiene

- Un sensor de imágenes de luz (como la cámara de un teléfono celular que tiene una fuente de luz (por ejemplo, un flash) y un dispositivo de recolección de imágenes CCD)

- Un mecanismo para mover dicha punta a una ubicación donde dicho sensor de imágenes de luz pueda adquirir imágenes

• Cargar dichas imágenes de forma inalámbrica (o por otros métodos) a un servidor remoto del instrumento

• Software de interpretación de imágenes capaz de:

- Medición de volúmenes a partir de imágenes bidimensionales

- Distinguir tipos de muestras

• Usar dicho tipo de muestra y/o datos de volumen como parte de un algoritmo operativo para:

- Proporcionar indicaciones a los usuarios del sistema sobre la integridad de la muestra

- Proporcionar las indicaciones necesarias para proporcionar una muestra aumentada o de reemplazo - Interpretar los datos de la señal de dicho instrumento en términos de resultados del ensayo, teniendo en cuenta el tipo de muestra y/o el volumen de la muestra

El sistema puede incluir opcionalmente mecanismos adicionales para procesar y/o formar imágenes de las muestras adquiridas por los usuarios en un "dispositivo de adquisición de muestras (capilar)" que comprende:

• Mecanismos para aceptar el capilar en una ubicación definida y mover dicho capilar a otra ubicación definida donde puede adquirirse una imagen

• Mecanismos para expulsar sustancialmente toda la muestra en dicho cartucho en una ubicación definida Ejemplo 4: Análisis de un capilar que contiene una muestra de sangre

Los usuarios adquieren las muestras tocando el extremo distal del capilar con una gota de sangre (normalmente como una punción en el dedo). El capilar normalmente se llena por acción capilar siempre que haya suficiente sangre. En una versión, el usuario coloca el capilar en una ubicación de enganche en el cartucho, luego inserta el cartucho en un portaobjetos en el instrumento y luego activa un ensayo presionando un botón de pantalla en la GUI del instrumento. Todos los pasos posteriores del ensayo están automatizados. El instrumento mueve el cartucho dentro de su carcasa y cierra la puerta por la que se insertó el cartucho. En esta versión, el instrumento mueve un componente para agarrar el capilar y moverlo a una ubicación frente a una cámara digital equipada con una fuente de luz de flash y un CCD. Se toma una imagen del capilar usando iluminación flash y se envía de forma inalámbrica al servidor que interpreta la imagen en términos de tipo, ubicación y cantidad de muestra. Si se cumplen los criterios preestablecidos, el servidor indica al instrumento que continúe con el ensayo. Si la muestra no es apropiada, el capilar se devuelve al cartucho que se expulsa y el servidor hace que la GUI muestre un mensaje apropiado. El usuario puede entonces (1) agregar más muestra o (2) obtener una muestra nueva y usar un capilar nuevo. Una vez que el usuario indica mediante la GUI que se ha tomado una acción correctiva y que se ha vuelto a insertar el capilar/cartucho en el instrumento, el servidor indica al instrumento que reanude el procesamiento del ensayo. El criterio para el volumen apropiado de muestra suele ser que el volumen sea mayor que el mínimo requerido para el ensayo. Por lo tanto, en algunos ensayos, por ejemplo, pueden usarse 10 uL de muestra, por lo que normalmente la muestra se considera adecuada si el volumen medido es > 12 uL.

En una segunda versión que puede implementarse sola o en combinación con la primera, la adquisición de imágenes se usa para medir el volumen de muestra tomado de la muestra original por el instrumento. En la secuencia del ensayo, la muestra es expulsada del capilar a un pocillo de muestra en el cartucho, ya sea (1) por el usuario o (2) por el instrumento. Luego, se toma un volumen exacto del pocillo de muestra usando una segunda punta, ya sea por acción capilar o por métodos neumáticos (preferidos). En esta etapa, se mide el tipo de submuestra y el volumen de la submuestra (como se indicó anteriormente) mediante la formación de imágenes de la punta. Si el tipo de muestra y el volumen son aceptables (objetivo /- < 5 %), el ensayo continúa. De lo contrario, es posible que se cancele el ensayo y se le solicite al usuario que tome medidas correctivas. Los tipos de muestras que pueden discriminarse son sangre y plasma o suero y otros. El sistema de imágenes hace la distinción al observar un contraste mucho mayor entre la sangre (opaca) y la punta (transparente) que en el caso del plasma y el suero. En el caso de que el volumen de la muestra, aunque no esté en el nivel objetivo, sea suficiente para que el ensayo dé resultados satisfactorios (en el ejemplo anterior, un volumen > 5 uL sería aceptable si el volumen objetivo es 10 uL). El algoritmo de ensayo que calcula la concentración de analito usa una función de corrección Conc. (verdadero) = Conc. (observado asumiendo el volumen objetivo) 'Volumen objetivo/Volumen medido.

La sangre puede detectarse fácilmente y puede medirse su volumen creando un mapa de píxeles de la punta y contando los píxeles oscuros y luego comparándolos con un número previamente establecido para el volumen objetivo. Aunque los tipos de muestra de suero y plasma (y otras muestras acuosas que no son de sangre) son transparentes, el sistema de imágenes aún puede detectar la presencia de muestra debido al cambio en la refracción que ocurre sobre el menisco de la muestra y la diferencia en el índice de refracción entre el material de la punta y la muestra. Alternativamente, puede agregarse un colorante a la muestra proporcionando una formulación de colorante seca recubierta dentro del capilar que se disuelve con la muestra.

Otros métodos para medir el volumen de muestra incluyen ubicar la parte superior e inferior de cada menisco y usar técnicas geométricas simples (como se describe en el presente documento). Las burbujas dentro de la columna de líquido de muestra pueden reconocerse y medirse mediante los métodos descritos anteriormente y puede restarse el volumen apropiado del volumen total ocluido por la muestra.

Los métodos dados anteriormente miden la muestra dentro del capilar de muestra o pendiente desde el extremo del capilar (como se describe en el presente documento). Una vez que la muestra es medida y aceptada por el sistema, se expulsa mediante métodos de pipeteo/neumáticos dentro del instrumento. Una vez que esto ha sucedido, puede volverse a tomar imágenes de la punta y medir cualquier muestra residual. El volumen que realmente se usa en el ensayo es la diferencia entre el volumen total y el volumen residual.

Otro problema particular en los sistemas de ensayo POC, especialmente cuando los usan usuarios sin formación técnica, es la presencia de muestra en el exterior del capilar de muestra.

Esto puede obtenerse y medirse usando la invención y puede pedirse al usuario que elimine el exceso de sangre.

La eficacia de la adquisición y entrega de muestras en los dispositivos de ensayo depende de las técnicas de manipulación de líquidos usadas. Los dispositivos automatizados pueden usar (1) aspiración y expulsión neumáticas (como en muchos dispositivos de pipeteo de un solo canal o multicanal de laboratorio que usan puntas desechables; los métodos neumáticos pueden usar presión positiva o negativa (vacío)), (2) desplazamiento positivo (como en un jeringa), tecnología de inyección de tinta y similares. Las muestras y otros líquidos, como los reactivos, pueden (3) extraerse de los depósitos por capilaridad o (4) absorberlos en medios porosos. Los líquidos (muestras y/o reactivos) pueden expulsarse con o sin contacto con otros líquidos. Por ejemplo, si la muestra se va a diluir, la punta de la muestra puede sumergirse en el diluyente o desplazarse al aire para que caiga en un pocillo seco o en un pocillo que contenga diluyente. El rendimiento de todos los sistemas y métodos anteriores puede verificarse y/o medirse usando la invención.

En otros ejemplos, un usuario puede obtener imágenes del capilar fuera del instrumento con una cámara externa. Las medidas de volumen pueden escalarse al tamaño del capilar. Una cámara orientada externamente de este tipo puede usarse para el reconocimiento del usuario/paciente, de modo que los resultados puedan atribuirse de forma más fiable al paciente correcto. El método también puede usarse para verificar que se esté usando la medicación apropiada (imagínese el contenedor de la píldora o la píldora o, alternativamente, el lector de código de barras en el instrumento puede usarse para este propósito).

La invención también puede usarse para medir la ubicación y los volúmenes de reactivo aspirado en las puntas de ensayo. En algunos casos, pueden agregarse colorantes a los reactivos para que sean más fáciles de visualizar (contraste mejorado).

En ensayos en los que el plasma se separa de la sangre, la invención puede usarse para verificar la eficacia de la eliminación de glóbulos rojos y el volumen de plasma disponible. Una alternativa a mover la punta que contiene la muestra es mover la cámara

Tal sistema puede tener las siguientes ventajas:

1. Medición cuantitativa de muestra

2. Capacidad para identificar el tipo de muestra

3. Creación de un registro objetivo y cuantitativo del volumen de la muestra

4. Permite que los ensayos den resultados cuando el volumen de la muestra no es correcto

5. Mejora la confiabilidad del sistema de ensayo

Ejemplo 5: Puntas

La Figura 18 muestra diagramas de puntas usadas para aspirar muestras y reactivos (dimensiones en mm).

Ejemplo 6: Medidas de geometría de un capilar cilíndrico

La Figura 19 muestra las dimensiones de un capilar cilíndrico que contiene una muestra.

R = radio

L1 = distancia desde el extremo inferior del cilindro hasta el menisco de la muestra inferior

L2 = distancia desde el extremo inferior hasta el menisco superior inferior

Volumen introducido = n * (RA2) * (L2 - L l}

Ejemplo 7: Medidas de geometría de un capilar cónico

La Figura 20 y la Figura 21 muestran las dimensiones de un capilar cónico.

Rb = radio en la base del cono

L = longitud

L¹ = distancia desde la parte superior (proyectada) del cono hasta el menisco de muestra inferior

L² = distancia desde la parte superior (proyectada) del cono hasta el menisco superior inferior

Volumen introducido = t * (Eb/L)A2 i-[(10 *3 - (L: ) A3]/3

Tan 6 = Ftb/L

Ejemplo 8: Efectos del menisco líquido

Como es bien sabido, los líquidos en los capilares típicamente tienen un menisco curvo. Dependiendo del ángulo de contacto, el menisco puede curvarse hacia adentro o hacia afuera con respecto al líquido. Cuando no se aplica presión externa neta, si la superficie capilar es hidrófila (ángulo de contacto < n/2), el menisco se dirige hacia adentro o hacia afuera si la superficie es hidrófoba (ángulo de contacto > n/2). Cuando se aplica presión neta a la columna de líquido (capilar orientado verticalmente o presión neumática aplicada por el instrumento), el menisco inferior puede proyectarse por debajo del extremo inferior del capilar. En capilares de diámetro pequeño, las fuerzas de tensión superficial son fuertes en relación con la fuerza gravitacional pequeña a través de un menisco. La presión de tensión superficial a través de un menisco en un capilar circular orientado verticalmente es 2n*R*Y*cos9 donde y es la tensión superficial y 9 es el ángulo de contacto. La presión a través de un menisco causada por la gravedad es pgAL/(n*RA2) donde p es la densidad del líquido y AL es la distancia a través del menisco y g es la constante gravitacional. En consecuencia, la superficie del menisco es esférica. El volumen de líquido en los segmentos ocupados por el menisco (meniscos) puede calcularse de la siguiente manera y usarse para obtener una estimación más precisa del volumen.

Distancias definidas desde el fondo del capilar de muestra

L1 = distancia hasta la parte inferior del menisco inferior

L2 = distancia a la parte superior del menisco inferior

L3 = distancia hasta la parte inferior del menisco superior

L4 = distancia hasta la parte superior del menisco superior

Volumen de un casquete esférico

wfe.(3a2 fr ') / 'f i

Las dimensiones de un casquete esférico se muestran en la Figura 22.

Pueden surgir varias situaciones diferentes definidas por el número y la ubicación de los meniscos. Nótese que las fórmulas que se dan a continuación se refieren a meniscos curvados hacia adentro y hacia afuera.

Caso 1: el menisco superior está curvado, el inferior es horizontal (como se muestra en la Figura 23)

Sustituyendo: a = R, h = L⁴ - L³

Volumen entre L³ y L⁴ = n*(L⁴-L³)*(³ *(R^{) 2} + (L⁴-L^{3 )2 ) /6}

Volumen total = n*((R²)*L³ + (L⁴-L³)*(³ *(R⁾² + (L⁴-L³)²)/⁶ )

Caso 2: Ambos meniscos están dentro del capilar y son curvos (como se muestra en la Figura 24)

Volumen total = n*((R²)*L³ -(L² - L,)*(3*(R^{) 2} + (L² - Li^{) 2 ) /6} + (L⁴ - L³)*(3*(R^{) 2} + (L⁴ - L^{3 )2 ) /6}

Caso 3: Hay dos meniscos curvos. El inferior curvado y por debajo del extremo inferior del capilar (como se muestra en la Figura 25)

Volumen total = n*((R²)*L³ + (L|)*(3*(R^{) 2} + (Li^{) 2) /6} + (L⁴ - L³)*(3*(R^{) 2} + (L⁴ - L³)²)/⁶ )

Ejemplo 9: Burbujas

Las burbujas en las muestras líquidas o los reactivos provocan reducciones variables en el volumen del líquido medido. En los capilares pequeños, las burbujas, cuando son más pequeñas que la sección transversal del capilar, son esféricas. Cuando son más grandes ocupan un espacio cilindrico (en un capilar cilindrico) y tienen extremos hemisféricos.

Caso 1: la burbuja no es lo suficientemente grande para abarcar el ancho del capilar (como se muestra en la Figura 26)

Restar el volumen de la burbuja = (4/3)*n*r³

Caso 2: la burbuja ocluye todo el ancho del capilar (como se muestra en la Figura 27)

Restar el volumen de la burbuja = 4n*R³ + n*R2*L

Ejemplo 10: Sangre fuera de la punta del capilar

Caso 1: La sangre colgante o los reactivos fuera de un capilar vertical pueden causar problemas importantes en los ensayos, ya que representan una situación fuera de control. Como se muestra en la Figura 28, las imágenes pueden reconocer fácilmente esta situación.

Caso 2: Sangre fuera del capilar que no sea colgante

La sangre residual fuera del capilar también es problemática ya que es una fuente potencial de contaminación de los reactivos y de volumen extra. Una vez más, las imágenes pueden reconocer la situación.

Ejemplo 11: Sangre residual dentro del capilar una vez que ha ocurrido la dispensación de la muestra

Esto puede solucionarse estimando el volumen residual y restando del volumen total de la muestra. La Figura 29 muestra un ejemplo de un capilar con sangre residual.

Volumen residual = n*R2*L

Ejemplo 12: Evaluación de la separación de glóbulos rojos de muestras de sangre

En muchos ensayos, es deseable eliminar los glóbulos rojos de la muestra para producir plasma. Cuando se hace esto, es deseable, especialmente en dispositivos POC, saber que la separación fue efectiva y determinar que hay suficiente plasma para realizar el ensayo.

Figura 30 - Figura 39 muestra un esquema de una modalidad preferida de eliminación de glóbulos rojos adecuada para dispositivos POC de la presente invención. Las partículas magnetizables tienen anticuerpos contra los glóbulos rojos mezclados con anticuerpos libres contra los glóbulos rojos que se proporcionan como una preparación seca en el pocillo que recibirá una muestra de sangre, como se muestra en la Figura 30. Cuando se agrega una muestra de sangre al pocillo (que se muestra en la Figura 31) y se mezcla con el reactivo magnético (que se muestra en la Figura 32, Figura 33 y Figura 34), los glóbulos rojos se aglutinan con las partículas magnéticas y pueden eliminarse colocando el pocillo que contiene sangre en las proximidades de un imán potente (que se muestra en la Figura 35). Al mover adecuadamente el pocillo en relación con el imán, los glóbulos rojos se separan del plasma (que se muestra en la Figura 36), que luego puede expulsarse a un pocillo receptor para su uso en un ensayo (que se muestra en la Figura 37, Figura 38 y Figura 39). Es evidente que el análisis de imágenes puede determinar la eficacia con la que se efectuó la separación y estimar el volumen de plasma disponible para el ensayo.

Ejemplo 13: Imágenes de muestras líquidas en capilares

La Figura 40 muestra una imagen de alto contraste de una punta cilindrica que contiene un líquido con baja absorbancia.

La Figura 41 muestra una imagen de una punta cónica que contiene un líquido con alta absorbancia.

La Figura 42 muestra una punta con un líquido de alta absorbancia que muestra dos meniscos dentro de la punta. La Figura 43 muestra una punta con una muestra de líquido y grandes burbujas que abarcan el diámetro de la punta. La Figura 44 muestra una punta que contiene agua que muestra un menisco superior claro en una punta transparente o capilar.

En la Figura 41 se analizó la longitud de la columna de líquido (correspondiente a 5 uL) y la resolución del menisco líquido superior (Definición de la posición del menisco con > 90 % de confianza). La precisión de la ubicación del menisco correspondió a < 1 % de la longitud de la columna de líquido.

Ejemplo 14: Efecto de un volumen de muestra insuficiente en el resultado del ensayo

El sistema se usó para medir la proteína C en sangre. El volumen de muestra insertado en el sistema fue diseñado para ser de 20 uL cuando el dispositivo de transferencia de muestras se usó correctamente. El instrumento se configuró para usar 10 uL de sangre de esta muestra. La concentración de analito calculada por el sistema se muestra en la Figura 45, ya que el volumen de la muestra se redujo deliberadamente desde el nivel objetivo. El resultado fue esencialmente constante hasta que el volumen de la muestra fue menor que el volumen requerido. Ejemplo 15: Dispositivo de transferencia de muestras

La Figura 46 muestra un ejemplo de un dispositivo de transferencia de muestras. El dispositivo consta de (a) un capilar (hecho de vidrio o plástico) opcionalmente recubierto con un anticoagulante u otro reactivo adecuado para el tratamiento preanalítico de muestras, (b) una carcasa que sujeta el capilar provisto de (c) un émbolo (pistón) que puede deslizarse dentro de la carcasa y tiene una característica elevada que se desliza dentro de una ranura en la carcasa, (d) una ranura en la carcasa que se acopla con la característica del pistón y limita el movimiento axial del émbolo de modo que su movimiento se detenga una vez que la muestra se ha desplazado y (e) un respiradero en la carcasa normalmente abierto que se bloquea cuando se activa el émbolo (movido hacia el extremo distal del dispositivo) para desplazar cualquier líquido en el capilar.

La Figura 47 muestra un dispositivo de transferencia de muestras con su capilar lleno de muestra. Se indica la ubicación "llenar hasta".

La Figura 48 muestra un dispositivo de transferencia de muestras con la muestra desplazada por el movimiento del émbolo.

La Figura 49 muestra un dispositivo de transferencia de muestras después de que una muestra se ha expulsado de forma incompleta.

Ejemplo 16: Medición de volumen mediante análisis de imágenes

Se aspiraron volúmenes conocidos de una muestra líquida en puntas de muestra usando un dispositivo de pipeteo. Las imágenes de las puntas se recopilaron usando un escáner de superficie plana comercial (Dell) y se midieron las distancias (a) desde el extremo distal de la punta hasta el menisco y (b) desde el extremo distal de la punta hasta la característica marcada en la imagen de abajo. La orientación de la punta y su posición con respecto a la platina del escáner no se controlaron ya que la imagen se analizó midiendo la relación entre la distancia (a) y la distancia (b) como una medida del volumen de la muestra. Las ubicaciones de la punta, el menisco y las características se midieron usando un software de imagen comercial (Jasc). La imagen se orientó horizontalmente usando el software antes de que se registraran las ubicaciones y se podía leer directamente en una escala proporcionada por el software. La Figura 50 muestra una imagen ilustrativa.

La distancia L1 fue la ubicación de la punta.

La distancia L2 fue la ubicación del menisco.

La distancia L3 fue la ubicación de la flecha indicada en la Figura 50.

Como se muestra en la Figura 51, el volumen se relacionó simplemente con la relación de distancias y se pudo calcular. El volumen estimado estuvo dentro de menos del 2 % del volumen real en promedio.

Ejemplo 17: Imágenes de sangre centrifugada en una punta

Los hematocritos se determinaron a partir de imágenes digitales midiendo la relación de longitud de la columna de glóbulos rojos empaquetados y la columna de líquido total (punta a menisco). Esto se logra fácilmente mediante un software de reconocimiento de características que orienta la punta en una dirección conocida y cuenta los píxeles entre las características. Para las puntas anteriores, las distancias correspondían a varios cientos de píxeles, lo que permitía una medición precisa.

La Figura 10 muestra una punta de muestra tapada vacía.

La Figura 11 muestra una punta de muestra tapada que contiene una muestra de sangre.

La Figura 12 muestra una punta de muestra tapada que contiene una muestra de sangre con hematocrito al 23 % después de la centrifugación.

La Figura 13 muestra una punta de muestra tapada que contiene una muestra de sangre con hematocrito al 31 % después de la centrifugación.

La Figura 14 muestra una punta de muestra tapada que contiene una muestra de sangre con hematocrito al 40 % después de la centrifugación.

La Figura 15 muestra una punta de muestra tapada que contiene una muestra de sangre con hematocrito al 52 % después de la centrifugación.

La Figura 16 muestra una punta de muestra tapada que contiene una muestra de sangre con hematocrito al 68 % después de la centrifugación.

La Figura 17 muestra una comparación del hematocrito medido mediante el sistema de formación de imágenes digital de una muestra centrifugada (hematocrito, % reportado) y el hematocrito medido mediante técnicas estándar (hematocrito, % objetivo). Un ejemplo de una técnica estándar de medición de hematocrito puede incluir la medición de microhematocrito en un capilar de vidrio usando una centrífuga de laboratorio estándar y midiendo la longitud del lecho de glóbulos rojos empaquetados y la longitud total del capilar ocupado por la muestra.

Ejemplo 18: Sistema que incluye componentes para la separación de sangre

Un sistema diseñado para la separación de sangre puede incluir las siguientes características:

1. Diseño de la forma de la punta.

a. Relación de aspecto de aproximadamente 20:1 longitud: diámetro que proporciona longitudes convenientes para la medición de muestras, células empaquetadas y volúmenes de plasma

b. Las puntas con forma permiten un sellado hermético con una tapa de vinilo y una fácil extracción de la tapa si es necesario.

c. La forma cónica de ángulo de tiro leve de la parte principal de la punta y la sección superior cónica más ancha de la punta son óptimas para la inserción de los medios de recuperación de plasma. Nótese que el diseño "contrarradial" (la punta es más estrecha en el extremo distal al eje de rotación) es inusual.

d. La sección superior cónica más ancha de la punta está configurada para acomodarse en una etapa automatizada de pipeteo y movimiento x-y-z. Se facilita la conexión para formar una conexión hermética a los fluidos y una fácil extracción cuando sea necesario.

2. Uso de una etapa x-y-z muy precisa y exacta para mover la punta de recuperación de plasma.

3. Uso de tecnología de imágenes automáticamente para controlar las operaciones de centrifugación y recuperación de plasma. Movimiento de la punta de recuperación de plasma a menos de un milímetro de la interfaz empaquetada de células y plasma.

Ejemplo 19: Uso de la medición de imágenes de volúmenes de líquido para mejorar la calibración del ensayo Los dispositivos de pipeteo automático son generalmente exactos y precisos hasta aproximadamente el 5 % o más en el intervalo (digamos) de 5 a 50 uL. En muchos ensayos, la exactitud del volumen y la precisión tienen que ser muy buenas (digamos < 2 %) para obtener la exactitud y precisión requeridas de la medición del analito. Medición y suministro de (1) líquidos en volúmenes inferiores a 5 uL (muy deseable cuando se requiere el uso máximo de una muestra de pequeño volumen) y (2) líquidos que tienen propiedades físicas "problemáticas" (como soluciones viscosas, soluciones que contienen detergentes, etc.) a menudo puede tener poca precisión y exactitud, lo que compromete la exactitud de los resultados del ensayo. Una solución inventiva a estos problemas es usar el análisis de imágenes de los líquidos para medir el volumen de líquidos (muestras, diluyentes, reactivos, calibradores y controles) y luego corregir la función de calibración del ensayo para permitir desviaciones (hasta [digamos] 20 %) del volumen previsto. Hemos demostrado que en las puntas de pipeta que tienen dimensiones muy precisas, pueden medirse volúmenes tan pequeños como 5 uL con muy buena exactitud y precisión (< 2 %). A continuación, documentamos (1) la exactitud y precisión de la medición de volumen y (2) el uso de relaciones conocidas entre los volúmenes de las soluciones usadas en los ensayos (muestras, reactivos, etc.) y la respuesta del ensayo para corregir la calibración de los ensayos.

(1) Precisión de la medición de volumen mediante análisis de imágenes:

En la siguiente tabla, se aspiraron volúmenes conocidos de una solución de azul de bromofenol en puntas cónicas. Las soluciones se colocaron en la parte media de la punta y se tomaron imágenes usando un escáner. La orientación y la posición de la punta se determinaron mediante métodos estándar. La orientación de la punta se ajustó mediante un algoritmo y se midió la longitud de la columna de líquido. Usando las dimensiones internas conocidas de la punta, se calculó el volumen de líquido. Se tomaron cuatro imágenes replicadas para cuatro alícuotas en cuatro puntas. Por lo tanto, el error que se indica a continuación refleja la reproducibilidad de la imagen y la precisión y exactitud dimensional de la punta.

Nótese que la medición de volumen no se basa en colocar con precisión el líquido en la punta. El análisis de imágenes proporciona información sobre la ubicación del líquido en la punta. Conociendo las dimensiones de la punta, siempre puede calcularse el volumen de la parte de la punta ocupada por el líquido donde sea que esté. (2) Corrección de la calibración del ensayo mediante la incorporación de la medición del volumen de líquido Esto se logra como se ilustra en la siguiente simulación. Considere un ensayo en el que una muestra se combina con dos reactivos (llamados 1 y 2). El volumen objetivo para la muestra, el reactivo 1 y el reactivo 2 es de 10 uL. El resultado del ensayo se calcula a partir de una curva estándar que relaciona la señal medida con la concentración de analito. Como parte del proceso de calibración del ensayo, pueden realizarse experimentos en los que los volúmenes usados para la muestra y los reactivos se cambian a 8 y 12 uL además de 10 uL y los resultados del ensayo se calculan basándose en la calibración apropiada para volúmenes de 10 uL. En la Figura 105, Figura 106 y Figura 107, los resultados se representaron frente a los volúmenes reales. Para el volumen de la muestra, el resultado del ensayo es esencialmente directamente proporcional al volumen usado (que se muestra en la Figura 105). Para los reactivos, se observaron respuestas algo no rectilíneas (se muestran en la Figura 106 y la Figura 107). Estas respuestas se basan en ensayos "típicos" bien conocidos en el campo, y la magnitud de los cambios con el volumen son representativos.

Luego simulamos una evaluación en la que hemos impuesto un grado de error aleatorio (alrededor del 5 %, para reflejar una "situación del mundo real") en los resultados del ensayo, además de los efectos del uso de volúmenes inapropiados. Incluimos resultados en los que los volúmenes de muestra, reactivo 1 y reactivo 2 se establecen en 8, 10 y 12 uL en todas las combinaciones. Cuando los resultados de este ejercicio se grafican como se muestra en la Figura 108 sin corrección por errores de volumen, como era de esperar, hay un error significativo en el resultado reportado debido a que se ignora el hecho de que los volúmenes reales usados eran diferentes de los usados para la calibración del ensayo.

Sin embargo, cuando permitimos las variaciones de volumen de los valores objetivo usando la respuesta conocida del ensayo a los volúmenes y graficamos los valores de analito corregidos, obtenemos el resultado mucho mejor que se muestra en la Figura 109. Esto se logró mediante un análisis de regresión múltiple de los datos.

Las estadísticas resumidas que comparan los resultados calculados con y sin corrección de volumen se presentan en la siguiente tabla y reflejan una mejora significativa en todas las métricas mediante el uso de la corrección de volumen. SEE es el error estándar de la estimación.

Ejemplo 20: Ensayo de inhibición de la hemaglutinación leído usando microscopía y análisis de imágenes:

En solución salina tamponada con fosfato (100 uL), que contenía 0,3 % p/v de glóbulos rojos de pavo estabilizados con glutaraldehído y 0,5 mg/mL de albúmina de suero bovino y, cuando se indicaba, 2 unidades de hemaglutinación de virus de la influenza inactivado y 15 ug de anticuerpos policlonales anti-influenza B de cabra, se incubaron durante 15 minutos en un tubo de pCr de fondo cónico a temperatura ambiente. El producto de reacción del fondo del tubo se transfirió a un portaobjetos transparente iluminado con luz blanca y se fotografió con un aumento de 4 veces usando una cámara digital. Como puede verse en la Figura 131, la aglutinación causada por la reacción de los glóbulos rojos con la hemoaglutinina del virus (Figura 131 muestra 3) es fácilmente observable en comparación con un control no aglutinado (Figura 131 muestra 1). Cuando también estaba presente un exceso de anticuerpos contra el virus, la aglutinación se inhibía por completo. Se destacan dos efectos de la reacción de aglutinación: (1) en las muestras aglutinadas, hay más glóbulos rojos debido a la sedimentación más rápida de los aglutinados en comparación con el control y (2) cada glóbulo rojo está en promedio más agrupado con otros glóbulos rojos. La reacción de aglutinación puede cuantificarse siguiendo un software de reconocimiento de imágenes para identificar, localizar y contar glóbulos rojos y aglutinados.

La Figura 131 muestra 1, muestra un control no aglutinado (sin virus, sin anticuerpos). La Figura 131 muestra 2, muestra una muestra no aglutinada (virus más anticuerpo). La Figura 131 muestra 3, muestra un aglutinado (virus, sin anticuerpo).

Ejemplo 21: Preparación de la muestra, examen de la calidad del sobrenadante y estimación de la calidad del precipitado de LDL

El plasma se diluyó (1:10) en una mezcla de sulfato de dextrano (25 mg/dL) y sulfato de magnesio (100 mM) y luego se incubó durante 1 minuto para precipitar el colesterol LDL. El producto de reacción se aspiró en el tubo de una centrífuga, se tapó y luego se centrifugó a 3000 rpm durante tres minutos. Se tomaron imágenes de la mezcla de reacción original antes de la centrifugación (que muestra el precipitado blanco), después de la centrifugación (que muestra un sobrenadante transparente) y del sedimento de colesterol LDL (después de retirar la tapa). Por ejemplo, las Figuras 132, 134 ilustran ejemplos de imágenes tomadas del producto de reacción.

Las imágenes del producto de reacción de precipitación de LDL se analizaron como sigue. Los niveles de color de los píxeles se trazaron en función de su posición vertical. Se midió la varianza de los valores y se sumaron los valores de los tres colores. Debido a las partículas de LDL precipitadas, que dispersan fuertemente la luz, el valor de precipitado (1154) fue mucho mayor que (672) el del sobrenadante transparente. La comparación del valor del sobrenadante con el de un control no expuesto al reactivo de precipitación permite evaluar la calidad de la centrifugación (datos no mostrados). La Figura 133 proporciona ejemplos de imágenes que se analizaron antes de girar en la centrífuga y después de girar en la centrífuga.

Después de retirar la tapa de vinilo negra, se tomó una imagen del precipitado de LDL. Su volumen puede medirse con bastante precisión, conociendo la geometría de la punta y el tamaño de un píxel en la imagen. En este experimento, el volumen del precipitado se estimó en 0,155 /- 0,015 uL.

Ejemplo 22: Mejora del rendimiento de un ensayo de alanina aminotransferasa (ALT) mediante el uso de supresión de imágenes de 3 colores de señales ópticas debido a la muestra

La ALT en suero puede medirse en un ensayo en el que la enzima convierte alanina en piruvato que a su vez se usa para producir peróxido de hidrógeno con oxígeno y piruvato oxidasa. El peróxido se usa luego para hacer un producto coloreado por la enzima peroxidasa de rábano picante, aminoantipireno y N-etil-N-(3-sulfopropil) anilina. El producto coloreado se absorbe al máximo a 560 nm.

Se encontró que algunas muestras de suero tienen una absorbancia significativa a esta longitud de onda, como se muestra en la Figura 135 y, en consecuencia, interferían con el ensayo. En particular, cuando se usan concentraciones de muestra relativamente altas (como una dilución final en el ensayo de 1:10), el análisis de imágenes de 3 colores del ensayo de ALT dio malos resultados con muestras clínicas.

La Figura 135 ilustra los espectros de varias muestras de suero diluidas 1:10 en tampón; La DO se representa frente a la longitud de onda (nm). La gran variación de la DO se ilustra en la Figura 135.

En la espectroscopia convencional, este problema se resuelve tomando una lectura en blanco de la muestra sin agregar los ingredientes del ensayo y restando el blanco de la señal generada por el ensayo. En el análisis de imágenes de 3 colores como en la presente invención, se ha encontrado que puede usarse un método análogo. Pueden tomarse imágenes de la muestra diluida y extraer valores de tres colores. El algoritmo de calibración del ensayo puede cambiarse luego para incluir las señales de la muestra sin reaccionar. Específicamente en este caso, el algoritmo original (sin incluir la señal del blanco de la muestra) fue la concentración de ALT = a b*R c*G d*B e*R2, donde a, b, c, d y e se derivan empíricamente constantes y R, G, B son los valores de señal en los canales rojo, verde y azul respectivamente. El algoritmo mejorado fue: concentración de ALT = a b*R c*G d*B e*Rs, f*Rs2 donde Rs es la señal del blanco de muestra en el canal rojo (nótese que los valores derivados empíricamente de a, b, c, d y e eran diferentes de los del algoritmo original).

Cuando se midieron 21 muestras de suero con actividad ALT de 0 a 250 U/L por triplicado y se compararon los resultados del análisis de imágenes de 3 colores con los proporcionados por un método de laboratorio clínico (Teco), se obtuvieron las siguientes estadísticas de regresión que indican resultados muy mejorados.

Ejemplo 23: Aceleración y análisis objetivo de un ensayo de inhibición de la hemaglutinación para anticuerpos anti­ influenza

Las mezclas de reacción preparadas como se describe en el Ejemplo 20, se incubaron durante solo un minuto y luego se introdujeron en tres microcanales separados (como se describe para los ejemplos de citometría anteriores) y se formaron imágenes. Se toman alrededor de 5-10 imágenes para cada muestra, con el fin de obtener estadísticas adecuadas. En promedio, cada imagen consta de alrededor de 800-900 células. El proceso de aglutinación puede evaluarse objetivamente midiendo la distribución radial de células alrededor de una selección representativa de células individuales usando la función.

Las imágenes se procesaron para obtener las posiciones de los centroides de las células individuales en el espacio 2D. Las posiciones 2D se usaron para calcular una función de distribución radial (RDF), también conocida como función de correlación de pares. La función de distribución radial, g(r) cuantifica la probabilidad de encontrar una célula a una distancia r de la célula seleccionada. Matemáticamente,

g{r)=p{r)l p,

donde p(r)2nrdr es el número de células que se encuentran a una distancia r de una célula en particular y po es la densidad celular promedio en toda la ventana de la imagen. El valor g(r) se calcula como un promedio de todas las partículas de la imagen y de varias imágenes, para garantizar un resultado estadísticamente significativo.

Resultados

El valor del primer pico de g(r) cuantifica el número de dobletes en la muestra. Por lo tanto, el g(r) de la muestra aglutinada debería ser mayor en magnitud en comparación con las otras dos muestras. El valor de g aumenta rápidamente de 0 a un máximo en una distancia de aproximadamente 20 píxeles (correspondiente a aproximadamente 12 um aproximadamente el doble del diámetro de un glóbulo rojo) y luego disminuye a aproximadamente 1,0. Como se muestra a continuación, la aglutinación debida al virus se distinguió de la no aglutinación cuando el virus está ausente o el anticuerpo inhibe la aglutinación inducida por el virus.

Ejemplo 24: Preparación de sistemas de detección de analitos usando aptámeros

Se diseñaron dos aptámeros de oligo ADN para capturar selectivamente proteínas (trombina e insulina). El aptámero de oligo ADN estaba compuesto por un sitio de unión que tenía una secuencia seleccionada de datos publicados, una porción inerte para extender el sitio de unión desde la superficie de la perla o microarreglo y un grupo reactivo para inmovilizar químicamente el aptámero en la superficie. El aptámero 1 (específico para trombina) tenía la siguiente secuencia: 5'-Am-(T)45GGTTGGTGTGGTTGG-3'. El aptámero 2 (específico para insulina) tenía la siguiente secuencia: 5'-Am-(T)32ACAGGGGTGTGGGGACAGGGGTGTGGGG-3'. La "Am" al comienzo de cada secuencia representa un grupo amino.

Los dos aptámeros se inmovilizaron sobre perlas de poliestireno (5 pm) funcionalizadas con grupos carboxilo. A continuación, se lavaron las perlas y se eliminó el exceso de reactivo. A continuación, las perlas se mezclaron con sondas de oligo ADN marcadas con fluorescencia y complementarias a los sitios de unión de los aptámeros. La hibridación de las sondas con los aptámeros se detectó mediante emisión de fluorescencia. Solo la sonda complementaria mostró un evento de hibridación positivo, medido por la emisión media de fluorescencia. La especificidad de la hibridación se ilustra mediante la comparación de la Figura 139, que muestra perlas después de la hibridación con sonda complementaria, con la Figura 140, que muestra perlas después de la hibridación con sonda no complementaria. La detección se realizó con una excitación láser a 635 nm y la emisión se filtró a 650 nm (±10 nm) en una cámara CCD, después de la deposición de las perlas sobre el sustrato de análisis. Se usó un procedimiento similar en una superficie de vidrio recubierta con epoxisilano para inmovilizar los aptámeros 1 y 2. La matriz se hibridó con la sonda fluorescente y se midió el reconocimiento específico del sitio de unión del aptámero mediante detección de emisión de fluorescencia con una configuración de cámara CCD y un escáner de matriz (Inopsys). La Figura 141 ilustra la especificidad de unión de los aptámeros en la matriz, con más detalles ilustrados en la Figura 142. La Figura 143 muestra un ejemplo de escaneo de matriz.

Ejemplo 25: Detección de analito usando aptámeros

Se preparó una matriz que comprende Aptámero 1 hibridado con sonda complementaria marcada con fluorescencia como en el Ejemplo 24. Se introdujo trombina en la matriz a una concentración de aproximadamente 100 nM y se dejó reaccionar con el complejo Aptámero 1-sonda. La señal de emisión fluorescente de Aptámero 1 en la matriz se redujo en 2,5 veces, lo que indica el desplazamiento de la sonda por la unión de Aptámero 1 y trombina.

Ejemplo 26: aglutinantes

Se biotinilan dos tipos de aglutinantes y se usan para crear superficies de captura en una unidad de ensayo en fase sólida recubierta con avidina. Los resultados del ensayo de producción de reactivo de ensayo y lectura de luminiscencia se obtienen usando (1) aptámeros y (2) fragmentos de anticuerpo Fv monocatenario (SCFV) en placas de microtitulación. El aptámero y los SCFV como aglutinantes para ensayos basados en luminiscencia son adaptables a puntas y sistemas y dispositivos de imagen proporcionados en el presente documento. Los analitos pueden analizarse y leerse usando cámaras para medir el color cambiando el reactivo generador de señal de fosfatasa alcalina a, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante con un sustrato cromogénico o usando fosfatasa alcalina con un sustrato cromogénico. Las puntas en placa de microtitulación (u otros formatos) pueden leerse en cualquier formato de cartucho (unidad de ensayo).

Ejemplo 27: Ensayo de vitamina D con aptámeros de ADN en una placa de microtitulación

En este ejemplo, se realiza un ensayo de vitamina D usando aptámeros de ADN monocatenario. Los aptámeros de ADN biotinilados se recubren sobre una superficie de poliestireno recubierta con ultravidina de una placa de microtitulación que tiene una pluralidad de pocillos. Antes del recubrimiento, los aptámeros se desnaturalizan y renaturalizan rápidamente calentándolos a unos 95 grados Celsius y luego se enfrían inmediatamente en hielo. A continuación, se añaden aproximadamente 15 microlitros de los aptámeros de ADN de vitamina D biotinilados replegados en Tris 25 mM, que contiene NaCl, MgCl2, etanol al 10 %, pH 7,5, a cada pocillo para formar la superficie de captura. Después del recubrimiento, los pocilios se lavan y se bloquean con aproximadamente 100 uL de un reactivo de bloqueo para reducir la unión inespecífica.

El analito para el ensayo (vitamina D) se diluye en Tris, NaCl, MgC12, etanol al 10 %, pH 7,5, y se mezcla con una solución de conjugado de vitamina D-fosfatasa alcalina a diferentes concentraciones en el intervalo de ensayo deseado, y se suministra a la unidad de ensayo durante 10 minutos de incubación a temperatura ambiente. A continuación, la unidad de ensayo se lava tres veces con 100 uL de tampón de lavado. Se añaden aproximadamente 40 uL de sustrato para la fosfatasa alcalina a cada pocillo de ensayo y se recogen los datos de quimioluminiscencia (tabla siguiente) después de aproximadamente 10 minutos. La Figura 144 es un gráfico de quimioluminiscencia frente a la concentración (ng/mL) de vitamina D.

Ejemplo 28: Ensayo de estradiol en placa de microtitulación

En este ejemplo, se realiza un ensayo para una hormona esteroidea (estradiol) usando fragmentos variables de cadena sencilla (scfv). En este ensayo, la superficie interior de la unidad de ensayo se recubre con scFv biotinilado sobre una superficie de poliestireno recubierta con ultravidina de una placa de microtitulación que tiene una pluralidad de pocillos. Se añadieron aproximadamente 15 microlitros de scFv biotinilado 1 ug/mL en solución salina tamponada con Tris, pH 8, BSA al 0,03 %, Thimerasol al 0,05 % a cada unidad de ensayo. Después del lavado, cada unidad de ensayo se fija con 100 uL de reactivo fijador seguido de un secado durante la noche con aire seco y se almacena desecado.

El analito para el ensayo (estradiol libre) se diluye en solución salina tamponada con Tris, pH 8, BSA, Thimerasol, se mezcla con un conjugado de estradiol-fosfatasa alcalina, en estabilizador de Biostab, y se suministra a la unidad de ensayo recubierta con scfv durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, los pocillos de ensayo se lavan 5 veces con 100 uL de tampón de lavado. Después de los lavados, se añaden 40 uL de sustrato luminógeno para fosfatasa alcalina (KPL PhosphaGlo) a cada unidad de ensayo y se recogen los datos de quimioluminiscencia (tabla siguiente) después de aproximadamente 10 minutos. La Figura 145 es un gráfico de quimioluminiscencia frente a la concentración (pg/mL) de estradiol.

Ejemplo 29: Recuento de glóbulos blancos y ensayo diferencial

La concentración de glóbulos blancos (WBC) en la sangre periférica de sujetos humanos puede variar de aproximadamente 1000 células/uL a 100000 células/uL. Sin embargo, en algunos casos, el intervalo del sistema de formación de imágenes es más limitado, por ejemplo, de aproximadamente 4000 células/uL a 7000 células/uL. Si la concentración de células es menor de 4000 células/uL, es posible que el sistema no pueda enumerar un objetivo de 10000 células, como puede ser requerido por el ensayo. Si la concentración de células en la muestra es superior a 7000 células/uL, cada campo de visión puede estar demasiado saturado para realizar una segmentación de imágenes y una enumeración de células precisas. A continuación se proporciona un enfoque ilustrativo para la obtención de imágenes de WBC.

En un ejemplo, se proporciona un sistema de formación de imágenes (por ejemplo, citómetro) configurado para espectrofotometría de fluorescencia. El sistema usa espectrofotometría de fluorescencia para medir la concentración de células en la muestra. La muestra se marca con anticuerpos conjugados con fluorescencia para formación de imágenes (por ejemplo, AF647-CD45) y también con un marcador de ácido nucleico fluorescente (por ejemplo, DRAQ5). Una lectura de fluorescencia cuantitativa en el módulo de espectrofotómetro proporciona una medida de la concentración de WBC a baja sensibilidad (LLOQ de aproximadamente 5000 células/uL) pero a alto intervalo dinámico (por ejemplo, 5000-100 000 células/uL). Una concentración medida en el espectrofotómetro permite el cálculo de la relación de dilución óptima de manera que la concentración final de la suspensión celular esté entre 4000-7000 células/uL.

La Figura 146 muestra el alto intervalo dinámico de fluorescencia en la medición espectrofotométrica de la concentración de WBC. Los glóbulos blancos marcados con anti-CD45 marcado con fluorescencia y otros anticuerpos se excitaron con luz roja que tenía una longitud de onda de aproximadamente 640 nm y se recogió el espectro de emisión de fluorescencia cuantitativa. La fluorescencia integrada se representa en el eje y.

Ejemplo 30: detección de estreptococos del grupo A mediante amplificación isotérmica

La amplificación isotérmica de muestras genómicas específicas puede detectarse por turbidez. En este ejemplo, una muestra genómica extraída de las células del grupo Streptococcus A (StrepA) (concentración madre = 2x108 org/mL de Mi Biosource) fue amplificado por amplificación isotérmica y el progreso de la reacción medida por la turbidez. Aproximadamente 5 uL de células bacterianas madre y 45 uL de agua de grado RT PCR (dilución 10X de la madre) se trataron térmicamente a aproximadamente 95 grados Celsius durante aproximadamente 8 a 10 minutos (la célula se rompe y libera el ADN). La muestra genómica se diluyó y se introdujo en un volumen de muestra de aproximadamente 25 uL en un tubo de PCR que contenía reactivos para amplificación (por ejemplo, ADN polimerasa, cebadores, tampón). El tubo de PCR se incubó a aproximadamente 61 grados Celsius durante aproximadamente 60 minutos mientras se registraba el progreso de la reacción mediante la turbidez. Los resultados son los siguientes, y la Figura 147 muestra gráficos de turbidez en función del tiempo:

Se realizaron tres experimentos separados a 800 copias/uL y 80 copias/uL. El Experimento A se realizó usando StrepA que tiene una plantilla de ADN genómico sintético (de Genescript). El Experimento B se realizó diluyendo StrepA madre 10 veces seguido de inactivación por calor a 95 grados Celsius desde aproximadamente 8 a 10 min, y seguido de dilución en serie de StrepA madre diluido diez veces inactivado por calor. El Experimento C se realizó usando una concentración variable de StrepA madre (células bacterianas inactivadas) seguido de inactivación por calor a 95 grados Celsius durante aproximadamente 10 min. Los puntos de inflexión de cada experimento se muestran en la Figura 148. Para cada 800 copias/uL y 80 copias/uL, una agrupación de tres gráficos incluye el Experimento A a la izquierda, el Experimento B en el medio y el Experimento C a la derecha. Los puntos de inflexión promedio se proporcionan en la siguiente tabla:

Ejemplo 31: uso de perlas magnéticas

En este ejemplo, las perlas magnéticas se usan para el análisis de proteínas y moléculas pequeñas mediante ensayos ELISA. La Figura 110 ilustra esquemáticamente un método ilustrativo para el ensayo ELISA. Los ensayos incluyen dos proteínas, Proteína 1 y Proteína 2. La proteína 1 tiene una dilución de muestra de aproximadamente 150 veces (protocolo de punta = 30 veces), un volumen de muestra de aproximadamente 0,007 uL, un volumen de muestra diluida de aproximadamente 1 uL, un volumen de reacción de aproximadamente 3 uL y un tiempo de reacción de aproximadamente 10 minutos (min) (incubación de la muestra e incubación del sustrato). Los resultados de la proteína 1 se muestran en la siguiente tabla. Los resultados de la Prueba 2 para la Proteína 1 se muestran en la Figura 149.

La proteína 2 tiene una dilución de muestra de aproximadamente 667 veces, un volumen de muestra de aproximadamente 0,0015 uL, un volumen de muestra diluida de aproximadamente 1 uL, un volumen de reacción de aproximadamente 3 uL y un tiempo de reacción de aproximadamente 10 min (incubación de la muestra e incubación de sustrato). Los resultados de la Proteína 2 se muestran en la siguiente tabla. Los resultados de la Prueba 1 para la Proteína 2 se muestran en la Figura 150.

Debe entenderse por lo anterior que, aunque se han ilustrado y descrito implementaciones particulares, pueden hacerse varias modificaciones a las mismas y se contemplan en el presente documento. Tampoco se pretende que la invención esté limitada por los ejemplos específicos proporcionados dentro de la especificación. Si bien la invención se ha descrito con referencia a la especificación mencionada anteriormente, las descripciones e ilustraciones de las modalidades preferidas en el presente documento no deben interpretarse en un sentido limitante. Además, se entenderá que todos los aspectos de la invención no se limitan a las representaciones, configuraciones o proporciones relativas específicas establecidas en el presente documento que dependen de una variedad de condiciones y variables. Varias modificaciones en la forma y los detalles de las modalidades de la invención serán evidentes para una persona experta en la técnica.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un sistema automatizado para separar uno o más componentes en una muestra de fluido biológico que comprende:

(a) un aspirador que tiene una pluralidad de cabezales;

(b) una punta de pipeta adaptada para acoplarse con un cabezal del aspirador en donde dicha punta de pipeta comprende dos extremos opuestos, al menos uno de los cuales puede sellarse;

(c) un sello para sellar el extremo sellable de la punta de la pipeta para proporcionar una punta de pipeta sellada; y

(d) una centrífuga configurada para recibir dicha punta de pipeta sellada para efectuar dicha separación de uno o más componentes en un fluido biológico;

en donde el aspirador está configurado para insertar y retirar la punta de pipeta sellada dentro y fuera de la centrífuga.

2. El sistema de la reivindicación 1, en donde la punta de la pipeta se acopla con un cabezal del aspirador.

3. El sistema de la reivindicación 2, en donde la punta de la pipeta tiene un extremo abierto que forma un sello hermético con un cabezal del aspirador.

4. El sistema de la reivindicación 1, que comprende además un dispositivo de formación de imágenes; y al menos otra punta de pipeta dimensionada para permitir la aspiración de un líquido de la punta de pipeta de (b).

5. El sistema de la reivindicación 1, en donde la punta de la pipeta está orientada verticalmente cuando la centrífuga está en reposo.

6. El sistema de la reivindicación 5, en donde la punta de la pipeta está orientada horizontalmente cuando la centrífuga está girando a una velocidad de rotación predeterminada.

7. El sistema de la reivindicación 1, en donde la punta de la pipeta se sella al taparse con el sello.

8. Un método para aislar componentes en una muestra usando el sistema de la reivindicación 1, que comprende:

(a) cargar una muestra en la punta de la pipeta;

(b) sellar la punta de la pipeta con el sello en el extremo sellable de la punta de la pipeta;

(c) insertar con el aspirador la punta de la pipeta sellada en la centrífuga;

(d) centrifugar la punta de la pipeta sellada, formando así una región interfacial que separa la muestra en un sobrenadante y un sedimento;

(f) obtener imágenes de la punta de la pipeta centrifugada para determinar la ubicación de la región interfacial; y

(g) aspirar automáticamente el sobrenadante en función de la ubicación de la región interfacial.

9. El método de la reivindicación 8, que comprende además determinar la ubicación del sobrenadante mediante dicho paso de formación de imágenes y aspirar automáticamente el sobrenadante basándose en la ubicación del sobrenadante.

10. El método de la reivindicación 9, en donde dicha determinación se produce con la ayuda de un procesador, y dicho procesador proporciona instrucciones al aspirador que realiza el paso de aspiración automática.

11. El método de la reivindicación 8, en donde la formación de imágenes se produce mediante el uso de una cámara que está configurada para capturar una imagen de un perfil lateral de la punta de la pipeta o del tubo.

12. El método de la reivindicación 8, en donde el sobrenadante incluye uno o más de los siguientes: plasma sanguíneo o suero sanguíneo.

13. El método de la reivindicación 9, en donde el sedimento incluye uno o más de los siguientes: células sanguíneas o partículas.

14. El método de la reivindicación 8, en donde el paso (b) comprende sellar la punta de la pipeta ajustando a presión el extremo sellable de la punta de la pipeta en el sello.