CN106932362A - 一种血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，步骤一、配制若干个含有不同尿素氮含量和肌酐含量的血清标定液；步骤二、用近红外光谱仪对每个血清标定液进行光谱采集；步骤三、根据血清标定液的近红外光谱以及尿素氮和肌酐的含量，分别建立尿素氮鉴别模型和肌酐鉴别模型；步骤四、用近红外光谱仪对待检测的血清样品进行光谱采集，将血清样品的光谱分别与尿素氮鉴别模型和肌酐鉴别模型对比，获得血清样品中的尿素氮含量和肌酐含量。本发明具有检测时间短、检测效率高、检测准确性高等优点。
Description
技术领域
本发明属于血液检测领域，涉及一种血清中尿素氮肌酐含量的测定方法，尤其涉及一种血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法。
背景技术
尿素是人体蛋白质代谢的主要终末产物，肌酐是肌肉在人体内代谢的产物，尿素和肌酐均主要由肾小球滤过排出体外，故可用作肾小球滤过功能的诊断和过筛指标，当肾小球滤过功能减低时，血肌酐和尿素氮因滞留而增高。
目前，临床实验室血和尿中肌酐的测定常用酶法或碱性苦味酸法(Jaffe法)。其中，Jaffe法虽然试剂较便宜，重复性、准确性也较好，但易受血清中其他假性肌酐物质的干扰，尤其是当血清胆红素值≥165.5μmol/L时开始出现负偏差。此外，头孢类和维生素C及多巴胺等药物也使其结果出现较大干扰。
酶法利用肌酐在肌酐酰氨基水解酶、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶等酶及显色剂和水、氧的共同作用下生成醌亚胺(红色)，在505nm波长下测定其吸光度A，其A值的大小和样品中肌酐的含量成正比。由于酶本身具有的特性，肌酐酰氨基水解酐在反应中仅针对肌酐而不受其他物质的干扰，这使得测定结果接近于真实值。
血清(或血浆)中的尿素氮，在尿素氮试剂的酸性环境中与二乙酰-肟(DAM)共沸后，可缩合成一红色化合物，称为fearon反应。其颜色的深浅与血清(或血浆)中尿素氮的含量成正比，与同样处理的尿素氮标准液比色，即可测算出血清(或血浆)中尿素氮的含量。由于此方法干扰性大，目前临床实验室多采用尿素酶偶联法，用尿素酶分解尿素产生氨，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下使NADH氧化为NAD+时，通过340nm吸光度的降低值可计算出尿素氮含量。
发明内容
本发明提供一种血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，以克服现有技术的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，步骤一、配制若干个含有不同尿素氮含量和肌酐含量的血清标定液；步骤二、用近红外光谱仪对每个血清标定液进行光谱采集；步骤三、根据血清标定液的近红外光谱以及尿素氮和肌酐的含量，分别建立尿素氮鉴别模型和肌酐鉴别模型；步骤四、用近红外光谱仪对待检测的血清样品进行光谱采集，将血清样品的光谱分别与尿素氮鉴别模型和肌酐鉴别模型对比，获得血清样品中的尿素氮含量和肌酐含量。
其中，步骤一中，血清标定液是指已知其尿素氮含量和肌酐含量的血清样品，若干个血清样品之间尿素氮含量彼此不同，若干个血清样品之间肌酐含量彼此不同。同时，血清标定液的数量需满足建立模型的要求。
步骤三中，尿素氮鉴别模型是指血清标定液的光谱与血清标定液中尿素氮含量之间的对应关系，肌酐鉴别模型是指血清标定液的光谱与血清标定液中肌酐含量之间的对应关系。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一是采用生化分析仪或检测试剂盒测定血清中的尿素氮含量和肌酐含量，并配制出不同尿素氮含量和肌酐含量的血清标定液。
其中，上述血清可以为采集而来的多份血清，用以配制血清标定液。生化分析仪是指可检测血液中尿素氮和肌酐含量的仪器，检测试剂盒是指市售的可检测血液中尿素氮和肌酐含量的产品。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤二和步骤四中，使用近红外光谱仪检测血清标定液和血清样品时，还采用配合近红外光谱仪的液体检测装置；液体检测装置包括通光孔、半透半反镜片和样品通道探测器；通光孔、半透半反镜片和样品通道探测器设于同一直线上，形成样品测试光路。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，还可以具有这样的特征：其中，液体检测装置还包括空气通道探测器；空气通道探测器设于半透半反镜片的一侧，与样品测试光路垂直的方向，用于接收半透半反镜片的反射光。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，还可以具有这样的特征：其中，液体检测装置还包括样品试管；样品试管放置在半透半反镜片和样品通道探测器之间，位于样品测试光路上；进行近红外光谱采集时，血清标定液或待检测的血清样品均放入样品试管中。
检测时，近红外光线通过通光孔，射至半透半反镜片上，一部分近红外光线由半透半反镜片反射进入空气通道探测器；另一部分近红外光线透过半透半反镜片照射样品试管，透过样品试管及其内部的测试液体(血清标定液或血清样品)射入样品通道探测器，光线在透过测试液体时发生吸收现象。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，还可以具有这样的特征：其中，样品试管呈长方体，测试光线与样品试管的管壁垂直。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，还可以具有这样的特征：其中，若干个血清标定液的尿素氮含量的范围为2-7mmol/L、肌酐含量的范围为20-200umol/L。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，还可以具有这样的特征：其中，血清标定液的数量至少为30个。
此外，步骤一还可以采用尿素氮肌酐双项定量检测方法测定血清中的尿素氮含量和肌酐含量，以配制出若干个含有不同尿素氮含量和肌酐含量的血清标定液。
上述尿素氮肌酐双项定量检测方法的具体步骤为：步骤Ⅰ、在待检测尿素氮和肌酐含量的血清中取出两份相同的血清。步骤Ⅱ、将试剂a和试剂b同时分别加入到两份血清中，混合均匀，并于36～38℃温浴3-6min。试剂a由磷酸盐缓冲液30～70nmol/L、尿素酶4000～6000U/L、谷氨酸脱氢酶8000～10000U/L、α-酮戊二酸140～180nmol/L、NADH2.0～4.0nmol/L、防腐剂150～250μl/L混合制成。试剂b由磷酸盐缓冲液30～70nmol/L、尿素酶4000～6000U/L、谷氨酸脱氢酶8000～10000U/L、α-酮戊二酸140～180nmol/L、NADH2.0～4.0nmol/L、防腐剂150～250μl/L、肌酐酰氨基水解酶5～7KU/L、肌酸脒基水解酶5～17KU/L混合制成。一份血清与试剂a的体积比为1:70～80；一份血清与试剂b的体积比为1:70～80。步骤Ⅲ、在340nm波长处测量试剂a和血清的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算获得血清中尿素氮的含量；步骤Ⅳ、在340nm波长处测量试剂b和血清的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算获得血清中尿素氮和肌酐的总含量，再减去步骤Ⅲ获得的尿素含量，得到血清中肌酐的含量。
其中，“与相同处理的尿素氮标准液比较”是指：配置尿素氮标准液，加入试剂a(b)，混合均匀并温浴，其中，尿素氮标准液与一份血清等量，试剂a(b)的加入量与其加入至血清中的量相等，温浴温度和时间也与血清的处理条件相同。然后，在340nm波长处测量试剂a(b)和尿素氮标准液的混合液中NADH的吸光度下降速率，由于尿素氮标准液的浓度已知，通过计算可知血清中尿素氮(尿素氮和肌酐)的含量。并且，尿素氮标准液可以与样品同时处理，以使检测结果更加准确并节省检测时间。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，采集若干个不同尿素氮含量和肌酐含量的血清的近红外光谱，分别建立尿素氮含量与光谱相对应的鉴别模型、和肌酐含量与光谱相对应的鉴别模型，当需要检测其他血清样品的尿素氮含量时，仅需采集该血清样品的近红外光谱，并将其与上述鉴别模型分别对比，即可获得该血清样品中的尿素氮含量和肌酐含量。与传统的标准检测方法相比，首先，本方法的待检测血清样品无需预处理，不使用任何化学试剂，无环境污染、成本低；其次，检测所需的血清样品量少，且每份样品的检测时间约为近红外光谱的采集时间，检测时间短、效率高；此外，本方法避免了人为操作的误差，提高检测准确率。
具体实施方式
实施例一
本实施例提供一种血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法：
步骤一、采用生化分析仪或检测试剂盒测定血清中的尿素氮含量和肌酐含量，并配制出若干个含有不同尿素氮含量和肌酐含量的血清标定液。
其中，血清标定液的数量需满足建立模型的要求。优选的，血清标定液的数量至少为30个。
若干个血清标定液的尿素氮含量的范围为2-7mmol/L、肌酐含量的范围为20-200umol/L。
步骤二、用近红外光谱仪对每个血清标定液进行光谱采集。
步骤三、根据血清标定液的近红外光谱以及尿素氮和肌酐的含量，分别建立尿素氮鉴别模型和肌酐鉴别模型。其中，尿素氮鉴别模型是指血清标定液的光谱与血清标定液中尿素氮含量之间的对应关系，肌酐鉴别模型是指血清标定液的光谱与血清标定液中肌酐含量之间的对应关系。
步骤四、用近红外光谱仪对待检测的血清样品进行光谱采集，将血清样品的光谱分别与尿素氮鉴别模型和肌酐鉴别模型对比，获得血清样品中的尿素氮含量和肌酐含量。
其中，步骤二和步骤四中，使用近红外光谱仪检测血清标定液和血清样品时，还采用配合近红外光谱仪的液体检测装置。该液体检测装置包括通光孔、半透半反镜片、样品试管、样品通道探测器和空气通道探测器。
通光孔、半透半反镜片和样品通道探测器设于同一直线上，形成样品测试光路。空气通道探测器设于半透半反镜片的一侧，与样品测试光路垂直的方向，用于接收半透半反镜片的反射光。样品试管放置在半透半反镜片和样品通道探测器之间，位于样品测试光路上，进行近红外光谱采集时，血清标定液或待检测的血清样品均放入样品试管中。样品试管呈长方体，测试光线与样品试管的管壁垂直。
检测时，近红外光线通过通光孔，射至半透半反镜片上，一部分近红外光线由半透半反镜片反射进入空气通道探测器；另一部分近红外光线透过半透半反镜片照射样品试管，透过样品试管及其内部的测试液体(血清标定液或血清样品)射入样品通道探测器，光线在透过测试液体时发生吸收现象。
实施例二
本实施例提供一种血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，与实施例一的方法基本相同，区别仅在于：步骤一采用尿素氮肌酐双项定量检测方法测定血清中的尿素氮含量和肌酐含量，以配制出若干个含有不同尿素氮含量和肌酐含量的血清标定液。
上述尿素氮肌酐双项定量检测方法的具体步骤为：
步骤Ⅰ、在待检测尿素氮和肌酐含量的血清中取出两份相同的血清。
步骤Ⅱ、将试剂a和试剂b同时分别加入到两份血清中，混合均匀，并于37℃温浴5min。
本实施例中，温浴温度还可以为36℃，相应的，温浴时间为5min；或者，温浴温度还可以为38℃，相应的，温浴时间为3min。
其中，试剂a由磷酸盐缓冲液30nmol/L、尿素酶4000U/L、谷氨酸脱氢酶8000U/L、α-酮戊二酸140nmol/L、NADH2.0nmol/L、防腐剂150μl/L混合制成。一份血清与试剂a的体积比为1:70。试剂b由磷酸盐缓冲液30nmol/L、尿素酶4000U/L、谷氨酸脱氢酶8000U/L、α-酮戊二酸140nmol/L、NADH2.0nmol/L、防腐剂150μl/L、肌酐酰氨基水解酶5KU/L、肌酸脒基水解酶5KU/L混合制成。一份血清与试剂b的体积比为1:70。
本实施例中，试剂a还可以由磷酸盐缓冲液70nmol/L、尿素酶6000U/L、谷氨酸脱氢酶10000U/L、α-酮戊二酸180nmol/L、NADH4.0nmol/L、防腐剂250μl/L混合制成，一份血清与试剂a的体积比为1:80；相应的，试剂b由磷酸盐缓冲液70nmol/L、尿素酶6000U/L、谷氨酸脱氢酶10000U/L、α-酮戊二酸180nmol/L、NADH4.0nmol/L、防腐剂250μl/L、肌酐酰氨基水解酶7KU/L、肌酸脒基水解酶17KU/L混合制成，一份血清与试剂b的体积比为1:80。或者，试剂a还可以由磷酸盐缓冲液50nmol/L、尿素酶5000U/L、谷氨酸脱氢酶9000U/L、α-酮戊二酸160nmol/L、NADH3.0nmol/L、防腐剂200μl/L混合制成，一份血清与试剂a的体积比为1:75；试剂b由磷酸盐缓冲液50nmol/L、尿素酶5000U/L、谷氨酸脱氢酶9000U/L、α-酮戊二酸160nmol/L、NADH3.0nmol/L、防腐剂200μl/L、肌酐酰氨基水解酶6KU/L、肌酸脒基水解酶11KU/L混合制成，一份血清与试剂b的体积比为1:75。
步骤Ⅲ、在340nm波长处测量试剂a和血清的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算可获得血清中尿素氮的含量。
步骤Ⅳ、在340nm波长处测量试剂b和血清的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算可获得血清中尿素氮和肌酐的总含量，再减去步骤Ⅲ获得的尿素氮含量，得到血清中肌酐的含量。
其中，尿素氮标准液的具体处理方法为：配制已知浓度的尿素氮标准液，在尿素氮标准液中加入试剂a(b)，混合均匀并温浴，其中，尿素氮标准液与一份血清等量，试剂a(b)的加入量与其加入至血清中的量相等，温浴温度和时间也与血清的处理条件相同。然后，在340nm波长处测量试剂a(b)和尿素氮标准液的混合液中NADH的吸光度下降速率，由于尿素氮标准液的浓度已知，通过计算可知样品中尿素氮(尿素氮和肌酐)的含量。
Claims (8)
1.一种血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，其特征在于：
步骤一、配制若干个含有不同尿素氮含量和肌酐含量的血清标定液；
步骤二、用近红外光谱仪对每个所述血清标定液进行光谱采集；
步骤三、根据所述血清标定液的近红外光谱以及尿素氮和肌酐的含量，分别建立尿素氮鉴别模型和肌酐鉴别模型；
步骤四、用所述近红外光谱仪对待检测的血清样品进行光谱采集，将所述血清样品的光谱分别与所述尿素氮鉴别模型和所述肌酐鉴别模型对比，获得所述血清样品中的尿素氮含量和肌酐含量。
2.根据权利要求1所述的血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，其特征在于：
其中，步骤一是采用生化分析仪或检测试剂盒测定血清中的尿素氮含量和肌酐含量，并配制出不同尿素氮含量和肌酐含量的所述血清标定液。
3.根据权利要求1所述的血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，其特征在于：
其中，步骤二和步骤四中，使用近红外光谱仪检测所述血清标定液和所述血清样品时，还采用配合近红外光谱仪的液体检测装置；
所述液体检测装置包括通光孔、半透半反镜片和样品通道探测器；
所述通光孔、所述半透半反镜片和所述样品通道探测器设于同一直线上，形成样品测试光路。
4.根据权利要求3所述的血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，其特征在于：
其中，所述液体检测装置还包括空气通道探测器；
所述空气通道探测器设于所述半透半反镜片的一侧，用于接收所述半透半反镜片的反射光。
5.根据权利要求3所述的血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，其特征在于：
其中，所述液体检测装置还包括样品试管；
所述样品试管放置在所述半透半反镜片和所述样品通道探测器之间，位于所述样品测试光路上；
进行近红外光谱采集时，所述血清标定液或待检测的所述血清样品均放入所述样品试管中。
6.根据权利要求5所述的血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，其特征在于：
其中，所述样品试管呈长方体，测试光线与所述样品试管的管壁垂直。
7.根据权利要求1所述的血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，其特征在于：
其中，若干个所述血清标定液的尿素氮含量的范围为2-7mmol/L、肌酐含量的范围为20-200umol/L。
8.根据权利要求1所述的血清中尿素氮肌酐含量近红外光谱测定方法，其特征在于：
其中，所述血清标定液的数量至少为30个。
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