CN106062560A - 使用特异性抗体检测蛋白质修饰的方法 - Google Patents

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Abstract

用于分析被分析物的修饰的方法、试剂盒和组合物，其使用与不同染料相连的修饰位点特异性抗体结合被分析物的目标特异性修饰位点，同时使用特异于未经修饰的被分析物的抗体（其与另一种染料结合）以测定所述被分析物浓度，用于对相同样品中的经修饰的被分析物进行定量。

Description

使用特异性抗体检测蛋白质修饰的方法
发明领域
本发明的主题是将用于检测特定被分析物的夹心-ELISA技术与用于识别不同样品基质（例如细胞裂解产物、组织匀浆物、体液）中罕见量的被分析物的Luminex –xMAP检测技术相结合的测定法。所述检测系统允许在一个腔中测量最高达500种不同被分析物。
发明背景
伴随新兴序列数据库的可用性，基因组应用需要更快速和更高效的方法用于细胞中蛋白质表达的总体筛选。然而，如果还考虑到蛋白质翻译后修饰，则细胞蛋白质组的复杂性大幅提升。
蛋白质的动态翻译后修饰对于维持和调节蛋白质结构和功能是重要的。在迄今为止表征的数百种不同类型的翻译后修饰中，蛋白质磷酸化起显著作用。酶催化的蛋白质磷酸化和去磷酸化是活细胞中的关键调节事件。复杂的生物过程（例如细胞周期、细胞生长、细胞分化和代谢）是精心编排的且受可逆磷酸化事件紧密控制，所述可逆磷酸化事件调节蛋白质活性、稳定性、相互作用和定位。蛋白质的磷酸化状态中的扰动（例如通过生成组成性激活或失活的蛋白质激酶和磷酸酶的突变）在癌发生中起显著作用。与那些蛋白质中的磷酸化位点的准确定位相结合的磷蛋白的综合分析和识别（‘磷酸化蛋白质组学’）是理解导致疾病的复杂生物系统和分子特征的先决条件。
蛋白质磷酸化代表用于共价修饰的最普遍机制之一。据估计，哺乳动物细胞中存在的所有蛋白质的三分之一是磷酸化的，并且激酶（负责该磷酸化的酶）占所表达基因组的约1-3%。生物体使用蛋白质的可逆磷酸化来控制许多细胞过程，包括信号转导、基因表达、细胞周期、细胞骨架调节和细胞凋亡。磷酸基团可以修饰丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酸和天冬氨酸残基。然而，在丝氨酸（90%）、苏氨酸（10%）或酪氨酸（0.05%）残基处的羟基的磷酸化是最普遍的，并且其涉及代谢、细胞分裂、细胞生长和细胞分化及其他过程。由于磷酸化在生命调节中的中心作用，许多努力已集中于用于表征蛋白质磷酸化的方法的开发。许多这些磷酸化位点调节关键的生物过程，并且可以证明是用于分子医学的重要的诊断或治疗靶标。例如，在迄今为止识别出的超过100种显性致癌基因中，46种是蛋白质激酶。
许多癌症的特征在于细胞信号传导通路遭到破坏，这导致不受控制的癌细胞生长和增殖。受体酪氨酸激酶（RTK）在这些信号传导通路中起关键作用，将细胞外分子信号传递到细胞的细胞质和/或核内。实际上所有组织类型的细胞均表达具有固有酪氨酸激酶活性的跨膜受体分子，通过所述受体分子，各种生长和分化因子介导一系列生物效应（在Aaronson，Science 254: 1146-52（1991）中综述）。
酪氨酸激酶的催化活性通过称为活化区段的激酶结构域的区域内的自磷酸化被频繁地刺激（Weinmaster等人（1984）Cell 37，559-568），并且事实上，这已被视为活化RTK的主要机制（Hubbard和Till（2000）Annu. Rev. Biochem. 69，373-398以及Hubbard,（1997）EMBO J. 16，5572-5581）。对若干种受体的分离的激酶结构域的结构分析已揭示了该活化区段如何阻遏激酶活性，以及磷酸化通过其释放这种自抑制的方式。在失活胰岛素受体的情况下，活化区段中的Tyr 1162突入到活性位点内，并且活化区段阻断对ATP结合位点的接近（Hubbard等人，（1994）Nature 372，746-754）。Tyr 1162和两个邻近酪氨酸残基的自磷酸化使活化区段复位，从而释放活性位点，以接合外源底物并将催化所需的残基重新组织成为功能性构象（Hubbard（1997）EMBO J. 16，5572-5581）。相比之下，成纤维细胞生长因子（FGF）受体的活化区段是相对活动的，并且在受体活化后变得磷酸化的酪氨酸不占据活性位点。然而，FGFR1活化区段的C末端端部似乎会阻断对底物的接近（Mohammadi等人（1996）Cell 86，577-587）。
在本发明范围内的受体酪氨酸激酶包括但不限于表皮生长因子受体（EGFR）、PDGF受体、胰岛素受体酪氨酸激酶（IRK）、Met受体酪氨酸激酶、成纤维细胞生长因子（FGF）受体、胰岛素受体、胰岛素生长因子（IGF-1）受体、TrkA受体、TIE-1、Tek/Tie2、Flt-1、Flk、VEGFR3、EGFR（HER-1、ERBB2（HER-2）、ERBB3（HER-3）、ERBB4（HER-4）、Ret、Kit、Alk、Axl1、FGFR1、FGFR2、FGFR3和Eph受体。
已知各种人恶性肿瘤和生长因子-RTK信号通路中的破坏之间存在生物关系。例如，在各种侵袭性人上皮癌（例如乳腺、膀胱、肺和胃的那些）中频繁观察到EGFR-家族受体的过表达（参见例如Neal等人，Lancet 1: 366-68（1985）；Sainsbury等人，Lancet 1:1398- 1402（1987））。类似地，也已将HER2的过表达与其他人类癌症相关联，包括胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、膀胱癌和肺癌（参见例如Yokota等人，Lancet 1: 765-67（1986）；Fukushigi等人，Mol. Cell. Biol. 6: 955-58（1986））。此类RTK的磷酸化活化其细胞质结构域激酶功能，其继而活化下游活信号传导分子。RTK通常在多个不同位点（例如不同的酪氨酸残基处）被磷酸化。这些酶作为用于癌症治疗的潜在药物靶而日益普及。例如，IressaTM，一种EGFR抑制剂，近来已进入用于治疗膀胱癌的临床试验。类似地，GleevecTM，一种BCR/ABL抑制剂，目前被广泛用于治疗CML。靶向治疗剂（其寻求改变单一蛋白质活性）极大地优于常规化学毒性或放射疗法之处在于它们特异性靶向失调细胞，并且因此将不会具有目前疗法中所见的广泛细胞毒性和不良副作用。细胞的异常增殖、分化和/或功能障碍被视为许多疾病的成因。蛋白质激酶和相关分子在控制这些细胞中起重要作用，使得它们是非常重要的药物靶标。
蛋白质激酶是细胞信号传导级联的关键组分，所述细胞信号传导级联控制细胞增殖和对外部刺激的其他应答。通过抑制激酶而调节这些细胞信号传导级联有可能影响许多疾病和状况包括癌症、炎症、糖尿病和中风。
癌症是西方世界的第二大死亡原因。尽管诊断和治疗在进展，但患者的总体存活仍然不佳。近年来的科学进展已加强了我们对癌症生物学的理解。人蛋白质酪氨酸激酶（PTK）在人类癌发生中起关键作用，并且已成为有希望的新靶标。已开发了若干种抑制酪氨酸激酶的方法。这些试剂已在临床前研究中表现出令人印象深刻的抗癌效应，并且成为临床中有希望的试剂。BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼（GleevecTM）在慢性髓样白血病治疗中的显著成功已特别刺激了该领域中的深入研究。至少30种抑制剂处于癌症临床开发的各个阶段中，并且约120个临床试验正在全世界进行。需要创新方法来充分评估这些试剂的潜力，并且国际协同努力将有希望帮助在不久的将来将这些抑制剂整合到癌症治疗中。
因此，蛋白质激酶已成为用于药物开发的最突出的靶标家族之一。因此，迫切需要开发更新更有效的疗法以改善患者结果。
近年来的快速科学进展已增进了我们对癌症生物学的理解。因而，已识别出若干种新型靶标。酪氨酸激酶已成为用于癌症治疗的新的有希望的靶标。许多小分子激酶抑制剂目前正处于开发中，并且GleevecTM（Novartis；白血病，胃肠肿瘤）和Iressa™（AstraZeneca；肺癌）的批准已印证了抑制激酶是极具潜力的治疗策略。
人类基因组序列分析已识别出约518种人蛋白质激酶（占所有人基因的约1.7%）。在这个大型蛋白质激酶组成内，已识别出至少90种酪氨酸激酶基因（58种受体酪氨酸激酶（RTK，表1）和32种非受体酪氨酸激酶（NRTK，表2））。它们起始的细胞信号传导通路是复杂的（Schlessinger J.等人Cell 103（2000），第211–225页）。简言之，受体酪氨酸激酶（RTK）含有氨基末端细胞外配体结合结构域（通常为糖基化的）、疏水性跨膜螺旋和细胞质结构域，其含有保守的蛋白质酪氨酸激酶核和另外的调节序列（其含有关键的C末端酪氨酸残基和受体调节基序）。与细胞外结构域（ECD）的配体结合（HGF、IGF、EGF、TGF-及其他）导致受体二聚化/寡聚化，导致细胞质酪氨酸激酶活性的活化和酪氨酸残基的磷酸化（Schlessinger等人，Neuron（1992）9:383-391）。自磷酸化的酪氨酸残基充当信号转导蛋白质（例如含有SH2（Src同源区2）和PTB（磷酸酪氨酸结合）结构域的蛋白质）的特定集合的识别和召募的平台，所述信号转导蛋白质调节多种细胞信号传导应答。非受体酪氨酸激酶具有含有模块化N末端的共同的保守催化结构域（类似于RTK），其具有不同的衔接子蛋白质基序。酪氨酸激酶在基础细胞过程的调节中起关键作用，所述基础细胞过程包括细胞发育、分化、增殖、存活、生长、细胞凋亡、细胞成形、粘附、迁移、细胞周期控制、T细胞和B细胞活化、血管生成、对细胞外刺激的应答、神经递质信号传导、血小板活化、转录和葡萄糖摄取（Hunter T.Philos.Trans. R. Soc. Lond.，B Biol. Sci. 353（1998），第583–605页）。考虑到其在正常稳态中的关键作用，可能并不意外的是它们已涉及若干种人类病症，包括发育异常（颅缝早闭综合征及其他）、免疫缺陷（重症联合免疫缺陷病（SCID）、遗传性无γ球蛋白血症）、非胰岛素依赖型糖尿病（NIDDM）、动脉粥样硬化、银屑病、肾脏疾病、神经系统疾病、白血病和实体瘤（Madhusudan S.和Ganesan TS. Clin Biochem. 2004 Jul；37（7）:618-35）。
表1
表2.
酪氨酸激酶在细胞的致癌性转化中起关键作用。这以几种方式实现（Blume-Jensen P.等人Nature 411（2001），第355–365页）。PTK的基因扩增和/或过表达（例如，在几种癌症中常见的EGFR和HER-2过表达）引起增强的酪氨酸激酶活性，伴随定量和定性改变的下游信号传导。基因组重排（如染色体易位）可以导致具有组成性激活的激酶活性的融合蛋白（例如在慢性髓样白血病中可见的p210BCR-ABL融合蛋白）。在激酶结构域或细胞外结构域内PTK的功能获得（GOF）突变或缺失导致组成性激活的酪氨酸激酶（例如缺乏细胞外结构域的氨基酸6-273的EGFRvIII突变体是组成性激活的，并且可见于实体瘤中）。通过配体过表达的自分泌-旁分泌刺激导致持续的酪氨酸激酶刺激（例如TGF-在成胶质细胞瘤以及头颈癌中过表达（Grandis J.R.等人J. Cell. Biochem. 69（1998），第55–62页）。最后，与失调的结构变化伴发的对应于PTK的原癌基因的逆转录病毒转导是致癌性转化通过其在动物（啮齿类动物和鸡）中发生的常见机制（Blume-Jensen P.等人Nature 411（2001），第355–365页）。
相当多的酪氨酸激酶（受体和非受体型两者皆有）与癌症相关。临床研究显示酪氨酸激酶的过表达/失调可以在患者中具有预后/预测价值（即，可以指示侵袭性肿瘤生物学或可以预测对疗法的应答不佳和更短的存活）。酪氨酸激酶的EGFR家族是最广泛研究的。EGFR（HER-1）过表达与卵巢癌、头与颈癌、食管癌、宫颈癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌和子宫内膜癌中的预后不良相关（Nicholson R.I等人Eur. J. Cancer 37 Suppl. 4（2001），第S9–S15页）。HER-2过表达与患有乳腺癌（Tandon A.K.等人A.K. Clin. Oncol. 7（1989），第1120–1128页）、卵巢癌（Meden H.等人Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod.Biol. 71（1997），第173–179页）、前列腺癌（Sadasivan R.等人J. Urol. 150（1993），第126–131页）、肺癌（Selvaggi G.等人Cancer 94（2002），第2669–2674页）和骨癌（Zhou H.等人J. Pediatr. Hematol. Oncol. 25（2003），第27–32页）的患者中的更差结果相关。C-KIT酪氨酸激酶中的突变与患有胃肠道间质瘤的患者中的更低存活相关（Taniguchi M.等人Cancer Res. 59（1999），第4297–43页），并且不利地影响急性髓样白血病中的复发率（CareR. S.等人Br. J. Haematol. 121（2003），第775–777页）。在小细胞肺癌中，C-KIT表达与低存活有关（Naeem M.等人Hum. Pathol. 33（2002），第1182–1187页）。IGF-1R连同IGF-1和IGF-2一起的表达可以在结肠直肠癌患者亚集中具有预后价值（Peters G.等人VirchowsArch.（2003）。在急性髓样白血病中，FLT 3突变预测更高的复发率和更短的无事件存活（Schnittger S.等人Blood 100（2002），第59–66页）。VEGF是关键的生长因子，其驱动肿瘤血管发生且是实体瘤中重要的预后标记物（Fox S. B.等人Lancet Oncol. 2（2001），第278–289页）。近期研究显示肺癌中的VEGFR 3表达与显著更低的存活率相关（Arinaga M.等人Cancer 97（2003），第457–464页），并且在结肠直肠癌中，它可以具有预后意义（Parr C.等人Int. J. Oncol. 23（2003），第533–539页）。Trk酪氨酸激酶是针对成神经细胞瘤（NB）的重要标记物。TrkA存在于具有有利的生物学特征的NB中，并且与患者存活高度关联，而TrkB主要在具有MYCN扩增的不利的侵袭性NB上表达（Eggert A.等人Klin. Padiatr. 212（2000），第200–205页）。HGFR（Met）过表达与早期浸润性宫颈癌中的疾病进展、复发和低存活相关（Baycal C.等人Gynecol. Oncol. 88（2003），第123–129页），与滑膜肉瘤中的预后不良关联（Oda Y.等人Hum. Pathol. 31（2000），第185–192页），并且预测肝细胞癌中显著更短的5年存活（Ueki T.等人Hepatology 25（1997），第862–866页）。Axl酪氨酸激酶表达与急性髓样白血病中的不良结果相关（Rochlitz C.等人Leukemia 13（1999），第1352–1358页）。Tie-1激酶表达与胃癌（Lin W. C.等人Clin. Cancer Res. 5（1999），第1745–1751页）和早期慢性期慢性髓样白血病（Verstovsek S.等人Cancer 94（2002），第1517–1521页）中的存活负相关。可溶性Tie-2受体水平独立地预测头颈鳞状细胞癌中的局部区域复发（Homer J.J.等人Head Neck 24（2002），第773–778页）。ALK蛋白质表达是独立的存活预测指标，并且充当间变性大细胞淋巴瘤（ALCL，Gascoyne R. D.等人Blood 93（1999），第3913–3921页）谱内的特定疾病实体的有用的生物标记物。Src酪氨酸激酶是所有阶段的人结肠癌中的临床预后不良的独立指标（Aligayer H.等人Cancer 94（2002），第344–351页）。BCR-ABL酪氨酸激酶具有预后价值，并且预测对血液恶性肿瘤疗法的应答，所述血液恶性肿瘤包括慢性髓样白血病（Olavarria E.等人Blood 97（2001），第1560–1565页和O'Dwyer M.,等人Oncologist 7 Suppl. 1（2002），第30–38页），以及急性成淋巴细胞性白血病（GleissnerB.等人Blood 99（2002），第1536–1543页）。FAK过表达与食管鳞状细胞癌中的肿瘤浸润性和淋巴结转移相关（Miyazaki，T.等人Br. J. Cancer 89（2003），第140–145页），并且Syk基因的表达减少与乳腺癌中的预后不良相关（Toyama T.等人Cancer Lett. 189（2003），第97–102页）。
已开发了几种靶向酪氨酸激酶的方法。酪氨酸激酶结构域抑制剂、酪氨酸激酶受体阻断剂（例如单克隆抗体）、配体调节剂（例如单克隆抗体）、RNA干扰和反义技术、基因治疗策略、Src酪氨酸激酶抑制剂、BCR-ABL抑制剂、下游信号转导通路抑制剂是用于癌症治疗的潜在策略。此类抑制剂根据其作用模式分类汇总于表3中。受体酪氨酸激酶是多结构域蛋白质。催化结构域（Mg-ATP复合结合位点）已成为近年来用于药物设计的最有希望的靶标。化合物文库的随机筛选最初识别了催化结构域的小分子化学抑制剂。组合化学、电子克隆、基于结构的药物设计和计算化学目前已成为这些抑制剂的前导化合物识别和优化中必不可少的工具。已开发了用于筛选抑制剂的高度灵敏、精确和可靠的高通量测定（包括闪烁接近测定、荧光偏振测定、均相时间分辨荧光测定以及非均相时间分辨解离增强荧光技术）（F.A. Al-Obeidi和K.S. Lam，Oncogene 19（2000），第5690–5701页）。关于蛋白质激酶的三级结构的知识已扩展，并且已分辨出了超过50种蛋白质激酶的X射线晶体结构。对‘ATP结合位点’的各个部分（腺嘌呤区、糖区、疏水口袋、疏水通道和磷酸结合区）的分子相互作用的理解已加快了药物开发（Fabbro D.等人. Pharmacol. Ther. 93（2002），第79–98页）。
表3.
尽管ATP结合位点在酪氨酸激酶中是高度保守的，但激酶结构域体系结构中的微小差异已允许开发高度选择性的抑制剂（Levitzki A. Eur. J. Cancer 38 Suppl. 5（2002），第S11–S18页）。近期公开了EGFR与其抑制剂OSI-774（Tarceva™）共结晶的数据，并且提供了对这种化合物的作用机制的重要线索（Stamos J.等人J. Biol. Chem. 277（2002），第46265–46272页）。临床开发中的大多数小分子在其靶激酶的ATP结合位点附近结合，使用其支架的一部分来模拟ATP的腺嘌呤部分的结合。此类ATP模拟物是催化结构域内的底物结合位点的竞争性抑制剂（Laird A.D.等人Expert Opin. Invest. Drugs 12（2003），第51–64页和Fry D.W. Exp. Cell Res. 284（2003），第131–139页），并且与内源ATP（通常以毫摩尔水平存在于细胞中）竞争。早期有效的前导化合物可溶性差，并且需要延长的多重给药方案来达到并维持患者中最佳靶标抑制所需的足够血浆水平。为了提高可溶性，生成了新化合物，但它们与激酶结构域的亲和力降低。为了避开这些问题，正在开发不可逆抑制剂，希望选择性抑制剂与激酶结构域的共价附接将完全消除催化活性，并且将转化为强效药（Denny W.A.等人Pharmacol. Ther. 93（2002），第253–261页）。两种此类抑制剂正处于后期开发中（CI-1033）（Pfizer）和EKB-569（Wyeth），其分别与EGFR和HER-2不可逆地结合（Laird A.D.等人Expert Opin. Invest. Drugs 12（2003），第51–64页）。还已开发了靶向不止一种酪氨酸激酶的小分子，并且其具有阻断多个通路的潜力，并且产生增强的抗癌效应（表3）。PKI-166抑制EGFR和HER-2（Mellinghoff I.K.等人Cancer Res. 62（2002），第5254–5259CI-1033页），是泛ErbB抑制剂（Slichenmyer，W.J.等人Semin. Oncol.28（2001），第80–85页），SU6668抑制VEGFR、PDGFR和FGFR（Hoekman K.等人7 Cancer J.Suppl. 3（2001），第S134–S13页），而STI 571抑制BCR-ABL、C-KIT、PDGFR和ARG（Buchdunger，E.等人Eur. J. Cancer 38 Suppl. 5（2002），第S28–S36页和Nishimura N.等人Oncogene 22（2003），第4074–4082页）。
在二十世纪八十年代，报道了首批天然酪氨酸激酶抑制剂槲皮素和染料木黄酮（Akiyama T.等人J. Biol. Chem. 262（1987），第5592–5595页和J. Mendelsohn J. J.Clin. Oncol. 20（2002），第1S–13S页）。
自那以后，数目庞大的天然和合成小分子抑制剂已得到描述。酪氨酸激酶抑制剂可被宽泛地分类为天然产物和相关衍生物（槲皮素、染料木素、星形孢菌素、erbastatins、clavilactones）；喹唑啉、吡啶并嘧啶和相关杂环（例如ZD1839）；苯基氨基嘧啶（例如STI571）；tryphostins和类似物（例如SU1498、SU101、SU0020）；吲哚和氧化吲哚（例如SU5416、SU6668、SU5402；F.A. Al-Obeidi和K.S. Lam，Oncogene 19（2000），第5690–5701页）。
小分子激酶抑制剂开发中的主要困难之一是特异性（McMahon等人（1998）Curr.Op. in Drug Discovery and Dev.1（2），131-146）。目前大多数化合物靶向激酶的高度保守的ATP结合位点，并且因此趋于结合并抑制该类别中的不止一种酶。由于存在超过500种人蛋白质激酶（Manning等人，Science（2002）298，1912），并且抑制多种激酶（或“错误”激酶）可能导致不良反应，所以评价化合物特异性是关键的。然而，问题是大多数“脱靶”相互作用是无法预测的，并且针对激酶的常规实验活性测定的开发是非常耗时和资源密集的。因此，尽管评价化合物特异性是非常重要的，但全面系统地实现这点是非常困难的（如果并非不可能的）。蛋白质激酶是真核细胞中的大多数细胞信号传导通路的关键调节剂。已开发了许多蛋白质激酶抑制剂，以研究激酶在信号传导通路中以及作为潜在治疗试剂的特定功能（Cohen，P.（2002）Nat. Rev. Drug Discov. 1，309-315）。由于蛋白质激酶超家族的规模大（>500种，人类的）以及大多数激酶抑制剂在高度保守的ATP结合口袋中结合的事实，所以公认的是激酶抑制剂抑制不止一种靶标（Davies，S. P.，Reddy，H.，Caivano，M. & Cohen，P.（2000）Biochem. J. 351，95-105）。因此，用作化学工具以探测通常知之甚少的激酶在信号传导通路中的作用的抑制剂具有自相矛盾的不完全表征的特异性。对于激酶激活剂同样如此。本发明还可用于平行剖析一个腔中的多种激酶的激酶激活剂。
发明的优选实施方案
以上提到的困难通过测定形式得到解决，所述测定形式允许针对很大一组人激酶（一个腔中最高达500种）测试多种化合物。腔可以是微量滴定板、小瓶、培养皿或可以进行方法中所述的测定的另一种容器。测定使得能够有效、定量、全面和系统地评价特异性。不再需要基于仅针对少量激酶的测试粗略地估计化合物特异性。特异性剖析可以更早地结合到药物开发过程中，并且贯穿整个开发路径，并且可以系统且快速地评价更多种化合物的特异性。这种前所未有的能力允许药物化学和分子测试之间的紧密回馈。效力和特异性可以平行优化，在少得多的时间内得到更高质量的临床前候选物。
针对现有晚期候选物或药物全面评估特异性还可以揭示这些成熟化合物的先前未知的靶标。在一些情况下，识别新靶可以显示新指征，并且在其他情况下，可以揭示已知的主要靶标无法解释的副作用的成因。
本发明的主题是特异性剖析的新型方法，其解决小分子激酶抑制剂或激活剂开发中的主要瓶颈之一，并且有希望对这个重要的新药类别的开发具有重大影响。
本发明的主题是将用于检测酪氨酸激酶的自磷酸化的夹心-ELISA（酶联免疫吸附测定）技术与用于识别组织样品中的特定蛋白质的LuminexTM-xMAP检测系统相结合的测定法。组织样品意指但不限于细胞裂解产物、活检匀浆物、肿瘤活检匀浆物、疾病组织匀浆物、血细胞裂解产物。
Luminex –xMAP技术是成熟的多路平台，其使用精确比率的三种荧光染料来产生500个不同的微珠或微球体集合，所述集合各自携带通过独特的内部荧光染料比率表征的每一种染料。这种染料比率用作各个微球体集合的识别码。为此，每个微球体集合可以分别进行测量，并且因此可以用于同时识别独特被分析物。这意味着在理想情况下，5可以在一个腔或样品中同时测量00种被分析物。
微珠或微球体用作固相，其可以在其表面上结合对被分析物具有特异性的独特捕获分子（例如抗体、肽、受体蛋白质）。在被分析物与特异性捕获分子结合后，使用靶向该被分析物的另一个结合位点的第二被分析物特异性分子进行检测。该第二分子可以直接缀合至读出标记或偶联至生物素，其进一步通过高度特异性链霉亲和素缀合的读出标记进行检测。第四种荧光染料（藻红蛋白）一般用作读出标记，其可以区别于用于微球体识别的内部染料。
该测定允许在存在针对不同激酶中的最高达500个不同磷酸化位点的潜在激酶抑制剂的情况下，检测RTK或NTK的自磷酸化的存在或不存在，所述不同激酶包括来自例如一个腔中的细胞裂解产物的非磷酸化激酶的总数。测定形式通过检测一个腔内的磷酸化状态，允许对于不同酪氨酸激酶中的最高达500个不同磷酸化位点的潜在激酶抑制剂进行剖析。例如，该测定允许在96孔板中针对每孔的不同激酶中的最高达500个不同磷酸化位点的组合，对来自HTS的96种不同潜在激酶抑制剂在夹心-ELISA中进行剖析。例如，可以在一种激酶中同时测量最高达8个不同的磷酸化位点。
用于测量目标酪氨酸激酶受体的活化（即自磷酸化）的测定在EP0730740中有述，并且包括下述步骤：
a）第一固相用来自细胞培养或动物材料的基本上同质的细胞群体包被，使得细胞粘附至所述第一固相。细胞具有内源酪氨酸激酶，或已用编码酪氨酸激酶的DNA转化，并且DNA已经过表达，使得酪氨酸激酶构建体存在于细胞的细胞膜或细胞溶质中。b）随后将配体加入具有粘附细胞的固相，使得酪氨酸激酶暴露于配体。c）在暴露于配体后，使粘附细胞溶解，从而释放细胞裂解产物。d）第二固相用作为特异性抗体的捕获试剂进行包被，所述捕获试剂与酪氨酸激酶特异性结合，或在受体构建体的情况下，与多肽表位附加标记特异性结合。e）将步骤c）中获得的细胞裂解产物加入含有粘附的捕获试剂的孔中，以便将酪氨酸激酶捕获至孔中。f）随后进行洗涤步骤，以便去除未结合的细胞裂解产物，留下捕获的酪氨酸激酶。g）使捕获的酪氨酸激酶构建体暴露于经标记的抗磷酸酪氨酸抗体，所述抗体识别酪氨酸激酶中的磷酸化残基。h）测量抗磷酸酪氨酸抗体与捕获的酪氨酸激酶的结合。
用于本发明的、允许在一个孔中平行检测最高达500种酪氨酸激酶的自磷酸化状态的捕获试剂来源于Luminex™-xMap技术。捕获试剂可以是结合蛋白包被的微珠或微球体。结合蛋白最通常是生物分子（例如蛋白质或多核苷酸）。生物分子可任选为天然、重组或合成的生物分子。抗体或抗体片段作为蛋白质捕获试剂是高度合适的。结合蛋白还可以是适体或antikalin或任何其他结合分子。Luminex™-xMap技术是成熟的多路平台，其使用精确比率的两种荧光染料来产生100个不同的微珠或微球体集合，所述集合各自携带通过两种荧光染料的比率表征的每一种染料。每个集合根据它的两种不同染料的内部荧光染料比率加以区别，并且因此可以作为针对特定酪氨酸激酶的特异性抗体或单克隆抗体结合独特的生物试剂。与微珠或微球体表面结合的抗体充当先前提及的夹心ELISA测试中的捕获试剂。特异于不同激酶的不同抗体结合至具有不同荧光染料比率的微珠表面导致各特异性抗体－微球体复合物具有不同颜色。荧光颜色可以分配至充当特异性抗体的抗原的特定激酶，所述特异性抗体识别并结合确定激酶的特定表位。
一般而言识别磷酸化酪氨酸的磷酸特异性抗体用于测量酪氨酸激酶的自磷酸化。磷酸特异性抗体是生物素酰化的，并且可以通过链霉亲和素偶联的第二荧光标记（例如藻红蛋白）进行检测，所述第二荧光标记可以区别于微球体的荧光染料。
修饰位点和非修饰位点特异性抗体是广泛商购可得的（例如来自Cell SignalingTechnology，Epitomics，R&D Systems,.；BioSource，Inc.；Santa Cruz；Biotechnology，Inc.；Merck Millipore），并且还可以通过本领域众所周知的技术产生。由于其独特的靶特异性，来自兔和小鼠的单克隆抗体作为捕获抗体应是优选的。
迄今为止，用于检测未加工样品中的经修饰的被分析物（例如磷酸化的、甲基化的）的唯一可用测定形式（指定为‘标准测定形式’）使用对于微球体上的总被分析物具有特异性的抗体（其与未经修饰的和经修饰的被分析物同等结合）进行捕获，以及通过目标修饰位点特异性的抗体或非靶特异性泛磷酸酪氨酸检测抗体进行检测。这种测定形式中的检测阈值是样品中的被分析物总浓度与未经修饰的和经修饰的被分析物之间的比率的组合。由于大多数样品中经修饰的被分析物的低丰度，结合的被分析物中的大多数处于未经修饰的状态。为此，可能无法检测少量捕获的经修饰的被分析物。由于捕获分子对于经修饰的或未经修饰的被分析物两者事实上等同，所以不同被分析物形式的测量必须在两个独立的腔或测定中进行。因此不可能在一份样品中同时测量，并且结果可以受两种不同的测定设置（稀释、处理）影响。
优选的反向测定形式使用修饰位点特异性抗体，以仅使具有其特异性目标修饰位点的被分析物与微球体结合。具有另一个修饰位点的相同被分析物或未经修饰的被分析物在该微珠集合上不被捕获。为了检测微球体上的所捕获的被分析物，使用与被分析物上的非修饰位点特异性区结合的抗体，其可以直接缀合至读出标记或偶联至生物素。如先前描述的标准测定形式中，生物素进一步通过链霉亲和素缀合的读出标记进行检测。该第四种荧光染料（藻红蛋白）一般用作可区别于用于微球体识别的内部染料的读出标记。由于使用修饰位点特异性分子的特异性捕获，与具有另一种识别码的第二微球体的组合有可能结合相同但未经修饰的被分析物。由于这种反向测定形式，未经修饰的和经修饰的被分析物可以在一个腔中同时进行测量，而无需加工样品。此外，在该相同被分析物上的其他修饰位点可以在第三、第四或更多个微球体集合上可进行比较测量，并且可以在相同样品中彼此区别。这允许未来关注的个别被分析物是活化状态的更复杂分析，所述活化状态严格依赖于其不同的修饰位点。除独特的多路化可能性之外，用于经修饰的被分析物的新的反向测定形式的灵敏度在与常规标准测定形式的直接比较中呈急剧增加。这种改善的检测阈值将允许未来测量极小样品尺寸（如针吸活检），而这目前在EP0730740和US7981699B1中所述的现有技术的标准测定形式（指定为‘标准测定形式’）中是不可能的。
每种捕获的激酶的自磷酸化通过仪器进行分析，所述仪器能够检测所有独特的荧光染料着色微球体以及链霉亲和素偶联的荧光标记物，其结合生物素酰化的抗磷酸酪氨酸抗体。这些仪器是现有技术中众所周知的。Luminex™仪器检测不同的荧光报道分子信号。在Luminex™仪器中，微珠快速穿过两个激光束，其中高速数字信号处理器分辨具有两种荧光信号（来自微球体的信号和抗磷酸酪氨酸抗体信号）或一种荧光信号（仅来自微球体的信号）的微珠。在自磷酸化事件的情况下，磷酸特异性抗体能够结合磷酸化的激酶，其被与特定微珠相连的特异性抗体捕获，并且可以检测两种荧光信号。在缺乏自磷酸化事件的情况下，仅微球体信号可被激光器检测。在这三种不同的可用的Luminex™仪器内，在高性能分析器中的FlexMAP 3D被构建用于测量最高达500个不同的微球体集合。这种仪器还被构建为测量除标准96孔板之外的384孔板。原始Luminex-200 ™仪器能够区别100个不同的微球体集合，而MAGPIX仅适合于50个不同的磁性微球体集合。这种新的台式分析器适合于例如在临床研究中的更小型的测定形式。
被加入的特定激酶抑制剂（其将阻断自磷酸化）所抑制的测试细胞裂解产物中的所有激酶仅显示微球体信号，并且可以被识别为被所测试的激酶抑制剂抑制的酪氨酸激酶。所测试的激酶抑制剂不抑制同时显示两种信号（来自微球体的信号和抗磷酸酪氨酸抗体信号）的激酶。在不含激酶抑制剂的相同对照细胞裂解产物中，在测试裂解产物中仅显示一种信号的激酶同时显示两种信号。这些激酶是细胞裂解产物中的激酶组，其被所测试的特定抑制剂进行抑制。
活化细胞中的激酶是广泛用于组织培养实验室中的众所周知的技术。胎牛血清或其他血清的耗尽将使细胞饥饿。在饥饿后，加入胎牛血清（FCS）或其他血清诱导激酶的活化。活化还可以由生长因子和细胞因子如例如EGF、VEGF、PDGF、HGF、TGF、NGF、FGF、胰岛素、各种白细胞介素和干扰素诱导。生长因子和细胞因子必须以混合物（cocktail）形式应用，用于诱导多种激酶。活化导致不同激酶的自磷酸化。
主要实施方案是用于检测待分析的样品的被分析物中的蛋白质或多肽的修饰位点的方法，所述样品包含所述蛋白质或多肽，其中所述修饰位点选自磷酸化、自磷酸化、甲基化、羟基化、糖基化、泛素化、乙酰化、异戊烯化、酰胺化或N末端甲硫氨酸检测，所述方法包括：
（a）提供第一捕获抗体，所述第一捕获抗体特异于所述修饰位点或与之结合，并且所述第一捕获抗体与充当检测标记物的染料缀合或相连，以及
（b）提供第二抗体，所述第二抗体特异于所述蛋白质上的位点或表位或与之结合，所述位点或表位不同于所述修饰位点，并且所述第二抗体与可区别于步骤（a）的所述染料的检测标记物缀合或相连，
（c）提供第三捕获抗体，所述第三捕获抗体特异于如（a）中所用的另一个修饰位点或与之结合，并且所述第三捕获抗体与充当可区别于步骤（a）和（b）的所述染料的检测标记物的染料缀合或相连。
另一个优选实施方案是这样的方法，其中所述由本发明分析的修饰是但不限于与确认MetAP1和MetAP2酶活性相关的磷酸化、自磷酸化、甲基化、羟基化、糖基化、泛素化、乙酰化、异戊烯化、酰胺化或N末端甲硫氨酸检测。所述由本发明分析的修饰是但不限于磷酸化、甲基化、羟基化、糖基化、泛素化、乙酰化、异戊烯化或酰胺化。
本发明的另一个优选实施方案是用于在存在和不存在所述激酶抑制剂的情况下，用上文提到的方法比较分析一种或多种激酶的自磷酸化的方法，所述方法包括步骤：
（a）通过血清耗尽使细胞饥饿，
（b）在存在和不存在激酶抑制剂的情况下，通过添加血清、生长因子和/或细胞因子诱导激酶自磷酸化活性，
（c）使细胞溶解，从而从中释放细胞裂解产物，
（d）通过添加与不同染料缀合的不同的磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和非修饰位点特异性结合蛋白，捕获所述细胞裂解产物中的激酶，
其中每种不同的结合蛋白与独特染料相连，
（e）通过抗体识别来自d）的具有独特染料的自磷酸化酪氨酸激酶，所述抗体与所述激酶上的非修饰位点特异性区域结合，所述激酶直接缀合至读出标记或偶联至生物素，其中如用于d）的结合蛋白，所述抗体必须与所述激酶中的另一个非修饰位点特异性区域结合，
（f）将在存在激酶抑制剂的情况下诱导所得的来自e）的自磷酸化酪氨酸激酶与在不存在所述激酶抑制剂的情况下诱导所得的来自e）的自磷酸化酪氨酸激酶进行比较，并且将来自e）的自磷酸化激酶在与每个单独腔中的未经修饰的激酶水平进行直接比较，这使得能够对每种单独的被分析物进行标准化。
另一个优选实施方案是上文描述的方法，其中所分析的修饰检测确认MetAP1和MetAP2酶活性。
所使用的染料优选但不限于荧光或发光染料。
本发明的另一个部分是这样的方法，其中在步骤b）下测试激酶激活剂而非激酶抑制剂。
本发明的另外的实施方案是用于测量受体酪氨酸激酶下游的一种或多种蛋白质激酶的磷酸化的方法。这些磷酸化是上游激酶的自磷酸化或磷酸化。激酶可以是但不限于丝氨酸激酶、苏氨酸激酶或组氨酸激酶。
本发明的另外的实施方案是用于在存在和不存在所述激酶抑制剂的情况下，比较测量受体酪氨酸激酶下游的一种或多种蛋白质激酶的磷酸化和/或自磷酸化的方法，所述方法包括步骤：
（a）通过血清耗尽使细胞饥饿，
（b）在存在和不存在激酶抑制剂的情况下，通过添加血清、生长因子和/或细胞因子诱导激酶自磷酸化活性，
（c）使细胞溶解，从而从中释放细胞裂解产物，
（d）通过添加与不同微球体缀合的不同磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和非修饰位点特异性结合蛋白，捕获所述细胞裂解产物中的激酶，
其中每种不同的结合蛋白与独特染料相连，
（e）通过抗体识别来自d）的具有独特染料的自磷酸化酪氨酸激酶，所述抗体与激酶上的非修饰位点特异性区域结合，所述激酶直接缀合至读出标记或偶联至生物素，其中如用于d）的结合蛋白，所述抗体必须与激酶中的另一个非修饰位点特异性区域结合。
（f）将在存在激酶抑制剂的情况下诱导所得的来自e）的自磷酸化酪氨酸激酶与在不存在所述激酶抑制剂的情况下诱导所得的来自e）的自磷酸化酪氨酸激酶进行比较，并且将来自e）的自磷酸化激酶在与每个单独腔中的未经修饰的激酶水平进行直接比较，这使得能够对每种单独的被分析物进行标准化。
染料和标记物分别是发光和/或荧光染料或标记物。
在不存在激酶抑制剂的情况下，用于剖析酪氨酸激酶的磷酸化状态的上述方法用于诊断和肿瘤分期，
其中权利要求1 c）的裂解产物来自于肿瘤样本、受疾病影响的组织或具有可比性的动物材料。
在本发明的另一个实施方案中，在细胞饥饿前使用编码蛋白质的多肽的核酸进行转化，所述蛋白质的多肽能够诱导磷酸化或其本身即是细胞中的激酶。
细胞可以是真核细胞，并且在一个优选实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。
另一个优选实施方案是上述方法用于就其结合特定激酶的特异性剖析激酶抑制剂和激酶激活剂的用途。
另一个优选实施方案是用于剖析激酶抑制剂的特异性的上述方法的试剂盒，其包括：
（a）具有与不同捕获抗磷酸抗体相连的1- 500种独特染料的微球体组合物，所述捕获抗磷酸抗体结合磷酸化激酶，和
（b）特异于激酶的、用于识别磷酸化激酶的抗体，所述激酶用染料（其可区别于a）中的染料）标记。
本发明的另一个部分是上述试剂盒，用于剖析激酶激活剂而非激酶抑制剂。
本发明的另一个部分是在上述方法中使用的试剂盒，用于剖析激酶抑制剂的特异性，其包括：
（a）具有与不同抗磷酸抗体相连的1- 500种独特染料的组合物，和
（b）用染料（其可区别于a）中的染料）标记的抗激酶抗体。
本发明的另一个部分是在上述方法中使用的试剂盒，用于剖析激酶激活剂的特异性，其包括：
（a）具有与不同抗磷酸抗体相连的1- 500种独特染料的组合物，和
（b）用染料（其可区别于a）中的染料）标记的抗激酶抗体。
在试剂盒中使用的染料和标记物分别是发光和/或荧光染料或标记物。
本发明的另一个方面是含有1- 500种独特染料的组合物，所述染料各自与一种不同捕获抗体相连，所述捕获抗体与激酶中的确定修饰或非修饰位点特异性结合，所述激酶具有所述捕获抗体可以与之特异性结合的表位，所述组合物与不同磷酸化位点结合用于平行测量来自1-500种不同激酶的自磷酸化。
独特染料的数目可以为1至500，其与不同磷酸化位点结合用于平行测量来自1-500种不同激酶的自磷酸化。
可以平行测量的个体激酶的优选数目为1-20、1- 40、1-60和1-80种激酶等等。或者，激酶A中的三个不同位点、激酶B中的五个不同位点、激酶C中的六个不同位点可以与激酶Y中另外的X个不同位点组合，而激酶中的靶位点在蛋白质中的不同位置处可以是未经修饰的或经修饰的。
本发明的另一个实施方案是具有1-100或1-200或1-300或1-400种独特荧光染料着色的微球体的上述组合物。
所述方法、试剂盒和组合物可以如下方式而被用于每种潜在激酶抑制剂的特异性剖析：在存在激酶抑制剂的情况下，平行测量来自1-500种不同激酶的自磷酸化，并在不存在激酶抑制剂的情况下，平行测量来自1-500种不同激酶的自磷酸化，将两者进行比较。Luminex™仪器可以用于测量自磷酸化。激酶抑制剂可以抑制仅在不存在激酶抑制剂的情况下表现出自磷酸化的激酶。
该方法可以在微量滴定板中进行。
本发明的方法的另一个用途是肿瘤样本中的各种激酶的自磷酸化状态的剖析。来自各种激酶的活性状态为诊断和治愈患者的合适治疗策略提供了反馈性提示（Espina V.等人（2005）Cancer Invest，23（1），第36-46页）。在这种特定情况下，待分析的样品将是来自肿瘤样本或受疾病影响的组织（活检或激光捕获显微解剖）的裂解产物或者具有可比性的动物材料。分析可以在不存在激酶抑制剂的情况下如上所述完成。
实施例
实施例1：细胞测定的描述
肿瘤细胞系以100000至200000细胞/孔的密度在24孔板中铺平板，并且在生长培养基中培养24小时。在该时期后，细胞用含有0.05% BSA的饥饿培养基洗涤两次，以去除生长培养基中存在的所有生长因子。细胞在饥饿培养基（一般为不含任何添加剂的基础培养基）的存在下培养另外20小时过夜，以减少目标靶被分析物的磷酸化状态。对于抑制剂温育，将饥饿培养基更换为含有具有指示浓度的抑制剂的饥饿培养基，并且在24℃下在细胞培养箱中温育1小时。为了诱导目标靶被分析物的磷酸化，细胞用最佳浓度的生长因子或细胞因子进行刺激，所述生长因子或细胞因子能够在存在预温育的抑制剂的情况下诱导其活化。必要刺激时间对于每个通路是特异性的，并且必须经过预评估。在刺激后，温育培养基被完全去除，并且细胞在含有不同蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中在4℃下进行裂解。将细胞裂解产物收获且在-80℃下以小等分试样贮存直至最终分析。对于细胞的最大刺激/磷酸化的计算，在每块单独的24孔板上均包括对照，其不与抑制剂一起温育，并且未经处理或仅用刺激物进行刺激。
对于c-Met的分析，不同细胞系用重组人HGF进行刺激，以诱导c-Met磷酸化。细胞在刺激前用渐增浓度的抑制剂处理1小时。对照细胞仅用溶剂进行处理，并且用于计算对照%（经HGF刺激的）。为了证实在饥饿期后减少的磷酸化基础水平，用溶剂处理的细胞不用HGF进行额外刺激（无抑制剂/无HGF）。如果自分泌细胞系在这种设置下进行分析，则此类对照是绝对必要的，因为这些细胞能够产生HGF，其可以在抑制剂温育前诱导显著的磷酸化水平。
实施例2：反向c-Met Luminex多路测定的描述
所述用于c-Met激酶的反向测定形式使用与三种或四种不同荧光染料着色微球体偶联的3种或4种不同捕获抗体。这些抗体之一针对受体酪氨酸激酶c-Met的细胞外结构域（ECD），而其他抗体结合细胞内激酶结构域中的不同磷酸化位点（例如Y1234Y1235、Y1349和Y1003）。可替代地，还可以使用针对c-Met的细胞内结构域（ICD）的抗体检测总c-Met量，如果这种抗体不干扰检测ICD中的磷酸化位点的抗体。这种方法允许平行测量由于不同磷酸化位点的检测而具有其活化状态的相同样品中的c-Met总量。对于捕获，样品在4℃下在连续搅动下在微板振荡器上在系列稀释中与不同抗体偶联的微球体的混合物一起温育20小时，其允许同时测量高和低被分析物浓度（如果测量的动态范围不足够）。在使用微板洗涤机洗涤三个循环后，捕获了被分析物的微球体在22℃下在连续搅动下在微板振荡器上与检测抗体一起温育一小时。这种检测抗体针对c-Met的ECD，但结合与所使用的用于总c-Met的捕获抗体不同的表位。因此，避免了这两种抗体之间的竞争效应。可替代地，可以使用针对c-Met的ECD的多克隆抗体，因为它与不同表位结合，并且不受已经结合的捕获ECD特异性抗体影响。最后，所使用的检测抗体必须与生物素缀合，因为抗物种抗体缀合物不是有用的替代物，由于针对来自不同物种的捕获抗体的可能的交叉反应性。在与检测抗体一起温育后，微球体再次如先前描述的洗涤三次，并且与链霉亲和素-藻红蛋白缀合物一起温育。链霉亲和素以高亲和力与生物素结合，并且用报告染料藻红蛋白标记所有具有结合的检测抗体的微球体。在再两个洗涤步骤后，将采集缓冲液加入微球体中用于测量。结合的藻红蛋白的量等价于个体微球体上的结合的检测抗体和被分析物的量，并且可以在Luminex分析器中进行测量。在测量期间，每个单独的微球体显示依赖于结合被分析物的量的个体藻红蛋白报告信号，并且由于其单独的分类信号，可以区别于其他荧光染料着色的微球体。
对于样品中测量的c-Met水平的准确定量，将重组c-Met标准蛋白质用于测定总c-Met浓度。这种标准蛋白质在稀释系列中与样品并排进行测量（在每块单独的板上），并且确定测定的整个动态范围。基于样品稀释中测量的c-Met浓度，不同磷酸化位点的值可以针对MFI（中值荧光强度 = Luminex仪器的读出）/ ng c-Met进行标准化。
所述测定是基于96孔板形式开发的，所述96孔板形式使用50或25µL样品体积。在测定转移至用于在FlexMAP 3D Luminex分析器上测量的384孔板形式后，样品体积可以进一步减少至总共10-12µL，其首次允许测量有限的人活检样品材料。另外，由于这种尺度降低，也可以节省所有其他试剂（如捕获微球体、检测抗体和缀合物）。
附图说明
图1：具有c-Met激酶抑制剂的测定设置的比较
U87-MG神经胶质瘤细胞在体外用重组人HGF进行刺激，以诱导c-Met磷酸化。细胞在刺激前用渐增浓度的两种c-Met激酶抑制剂（黑色圆圈/黑色三角形）处理1小时。对照细胞仅用溶剂进行处理，并且用于计算对照%（黑色正方形）。细胞裂解产物在两种不同测定设置中用相同稀释度进行分析。标准单路设置（上图）使用c-Met捕获抗体与磷酸c-Met检测抗体，而反向测定设置是4路测定（下图），含有针对磷酸化位点Y1234Y1235、Y1349和Y1003的三种不同磷酸c-Met捕获抗体，以及特异于受体的细胞外结构域的总蛋白质c-Met捕获抗体和用于检测的另一种不同的ECD特异性c-Met抗体。虽然标准测定设置中的两种不同磷酸c-Met抗体必须用两种不同测定并排进行测量（一种被分析物 = 一个腔），但对于反向测定设置，相同磷酸c-Met抗体在一个测定中以4路形式进行测量（四种被分析物 = 一个腔）。两种测定设置均发现了两种c-Met激酶抑制剂针对两个c-Met磷酸化位点c-Met Y1234Y1235（图1a）和 c-Met Y1349（图1b）的具有高可比性的IC50值，而由于U87-MG的低c-Met表达水平，磷酸化位点Y1003的检测是不可能的，。平行测量的c-Met总蛋白质在c-Met激酶抑制剂的所有浓度下均未显示影响。另外，这些c-Met值可以用于使测量的磷酸c-Met值标准化。
图2：在用不同通路激酶抑制剂抑制后，c-Met磷酸蛋白质检测的特异性
A431癌细胞如图1中所述在体外用重组人HGF进行刺激，以诱导c-Met磷酸化，并且如图1中所述，与不同的特异性激酶抑制剂一起温育。细胞裂解产物在c-Met 4路测定中进行分析，所述c-Met 4路测定包括总c-Met（黑色圆圈）、磷酸c-Met Y1234Y1235（黑色正方形）、磷酸c-Met Y1349（向上的白色三角形）和磷酸c-Met Y1003（向下的白色三角形），以评估通路特异性抑制剂的影响。仅c-Met激酶抑制剂显示所有c-Met磷酸化位点Y1234Y1235、Y1349和Y1003的剂量依赖性抑制（图2a上图），而针对PI3K（磷酸肌醇3-激酶；图2a下图）和Mek（MAPK激酶或Erk激酶；图2b上图）、Src（细胞和肉瘤激酶；图2b下图）的抑制剂对c-Met磷酸化没有影响。
图3：在用不同通路激酶抑制剂抑制后，EGF-R磷酸蛋白质检测的特异性
A431癌细胞如图1中所述在体外用重组人EGF进行刺激，以诱导EGF-R磷酸化，并且如图1中所述，与不同的激酶抑制剂一起温育。细胞裂解产物在EGF-R 5路测定中进行分析，所述EGF-R 5路测定包括总EGF-R（黑色圆圈）、以及EGF-R磷酸化位点Y845（向下的黑色三角形）、Y998（黑色正方形）、Y1086（白色正方形）和Y1173（向下的白色三角形），以评估通路特异性抑制剂的影响。EGF-R（图3a上图）和双重EGF-R/ErbB2抑制剂（图3b上图）显示所有EGF-R磷酸化位点Y845、Y998、Y1086和Y1173的剂量依赖性抑制，而针对Mek（MAPK或Erk激酶；图3a下图）和PI3K（磷酸肌醇3-激酶；图3b下图）的抑制剂没有作用。作为靶特异性抑制剂，Src（细胞和肉瘤激酶；图3c）抑制剂也在明显更高的浓度范围内对EGF-R磷酸化具有抑制作用，并且可以用EGF-R和Src之间的横向信号传导充分解释（Dulak等人: 2011；Oncogene. 2011 August18；30（33）: 3625–3635）。使用的所有抑制剂均显示对5路测定中的总EGF-R测量没有影响，并且总EGF-R水平可以用于磷酸化位点值的准确标准化。
图4：肿瘤活检中的磷酸-c-Met抑制
在患者治疗前和治疗中的肿瘤活检样品中定量测量磷酸-c-Met，使用384孔形式的反向3路c-Met测定。小型化允许在具有小于0.5mg的活检材料的一个样品中测量三种不同的靶特异性测定。分析两个c-Met磷酸化位点Y1234Y1235和Y1349，并且用在相同样品中测量的总c-Met浓度进行定量标准化。示出了自磷酸化位点Y1234Y1235的结果，而下游信号传导位点Y1349显示具有可比性的结果，伴随略微更低的靶抑制。在19/21个可评估患者中观察到了这种靶标抑制。在R3（每天一次连续给药）中，剂量≥300 mg，在所有可活检评估的患者中均观察到≥90%磷酸c-Met抑制。

Claims (22)

1.用于检测待分析样品的被分析物中的蛋白质或多肽的修饰位点的方法，所述样品包含所述蛋白质或多肽，其中所述修饰位点选自磷酸化、自磷酸化、甲基化、羟基化、糖基化、泛素化、乙酰化、异戊烯化、酰胺化或N末端甲硫氨酸检测，所述方法包括：
（a）提供第一捕获抗体，所述第一捕获抗体特异于所述修饰位点或与之结合，并且所述第一捕获抗体与充当检测标记物的染料缀合或相连，以及
（b）提供第二抗体，所述第二抗体特异于所述蛋白质上的位点或表位或与之结合，所述位点或表位不同于所述修饰位点，并且所述第二抗体与可区别于步骤（a）的所述染料的检测标记物缀合或相连，
（c）提供第三捕获抗体，所述第三捕获抗体特异于如（a）中所用的另一个修饰位点或与之结合，并且所述第三捕获抗体与充当可区别于步骤（a）和（b）的所述染料的检测标记物的染料缀合或相连。
2.用于比较分析一种或多种激酶的自磷酸化的方法，所述自磷酸化通过权力要求1的方法检测，在存在和不存在所述激酶抑制剂的情况下进行，所述方法包括步骤：
（a）通过血清耗尽使细胞饥饿，
（b）在存在和不存在激酶抑制剂的情况下，通过添加血清、生长因子和/或细胞因子诱导激酶自磷酸化活性，
（c）使所述细胞溶解，从而从中释放细胞裂解产物，
（d）通过添加与不同染料缀合的不同的磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和非修饰位点特异性结合蛋白，捕获所述样品中的所述激酶，
其中每种不同的结合蛋白与独特的染料相连，
（e）通过抗体识别来自（d）的具有独特染料的自磷酸化酪氨酸激酶，所述抗体与所述激酶上的非修饰位点特异性区域结合，所述激酶直接缀合至读出标记或偶联至生物素，其中如用于d）的结合蛋白，所述抗体必须与所述激酶中的另一个非修饰位点特异性区域结合，
（f）将在存在激酶抑制剂的情况下诱导所得的来自（e）的磷酸化或自磷酸化酪氨酸激酶与在不存在所述激酶抑制剂的情况下诱导所得的来自（e）的磷酸化或自磷酸化酪氨酸激酶进行比较，并且将来自（e）的磷酸化/自磷酸化激酶在与每个单独腔中的未经修饰的激酶水平进行直接比较，这使得能够对每种单独的被分析物进行标准化。
3.权利要求2的方法，其中所述经分析的修饰检测确认MetAP1和MetAP2酶活性。
4.权利要求2的方法，其用于在不存在激酶抑制剂的情况下剖析酪氨酸激酶的磷酸化状态，所述方法用于诊断和肿瘤分期，
其中权利要求2（c）中的裂解产物来自于肿瘤样本、受疾病影响的组织或具有可比性的动物材料。
5.权利要求3的方法，其中在步骤（b）中测试激酶激活剂。
6.权利要求1 – 5的方法，其中所述染料是荧光或发光染料。
7.权利要求1 – 5的方法，其中所述标记物是荧光或发光标记物。
8.权利要求2的方法，其中所述细胞在细胞饥饿（a）之前用编码多肽的核酸进行转化，所述多肽代表目标被分析物，由于过表达或由于所述细胞中的激酶自身的重组肽中的自活化突变，使得所述目标被分析物能够诱导磷酸化。
9.权利要求2的方法，其中所述细胞是真核细胞。
10.权利要求2的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
11.权利要求1和2的方法在剖析激酶抑制剂的其结合激酶的特异性上的用途。
12.权利要求1和2的方法在剖析激酶激活剂的其结合激酶的特异性上的用途。
13.用于权利要求11和12中任一项的方法中的试剂盒，用于剖析激酶抑制剂的特异性，其包括：
（a）具有与不同的捕获抗磷酸抗体相连的1- 500种独特染料的微球体组合物，所述捕获抗磷酸抗体结合磷酸化激酶，和
（b）特异于激酶的、用于识别所述磷酸化激酶的抗体，所述激酶用染料（其可区别于（a）中的染料）标记。
14.用于权利要求13中任一项的方法中的试剂盒，用于剖析激酶激活剂的特异性，其包括：
（a）具有与不同的捕获抗磷酸抗体相连的1- 500种独特染料的微球体组合物，所述捕获抗磷酸抗体结合磷酸化激酶，和
（b）特异于激酶的、用于识别所述磷酸化激酶的抗体，所述激酶用染料（其可区别于（a）中的染料）标记。
15.用于权利要求13中任一项的方法中的试剂盒，用于剖析激酶抑制剂的特异性，其包括：
（a）具有与不同的抗磷酸抗体相连的1- 500种独特染料的组合物，
（b）用染料（其可区别于（a）中的染料）标记的抗激酶抗体。
16.用于权利要求13中任一项的方法中的试剂盒，用于剖析激酶激活剂的特异性，其包括：
（a）具有与不同的抗磷酸抗体相连的1- 500种独特染料的组合物，
（b）用染料（其可区别于（a）中的染料）标记的抗激酶抗体。
17.权利要求13-16的试剂盒，其中所述染料是荧光或发光染料。
18.组合物，其含有各自与不同的抗激酶抗体相连的1- 500种独特染料，所述抗激酶抗体与明确的激酶特异性结合，所述激酶已被特异性结合磷酸化激酶的抗体所捕获。
19.权利要求18的组合物，其具有1-100种独特荧光染料着色的微球体。
20.权利要求18的组合物，其具有1-200种独特荧光染料着色的微球体。
21.权利要求18的组合物，其具有1-300种独特荧光染料着色的微球体。
22.权利要求18的组合物，其具有1-400种独特荧光染料着色的微球体。
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