CN1527720A - 利用蛋白组芯片全面分析蛋白活性 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白组芯片，它具有在一个物种中表达的所有蛋白的大部分的阵列。本发明还涉及制备蛋白组芯片的方法。本发明还涉及利用蛋白组芯片以高处理量的方式系统地分析一个物种中所有蛋白的相互作用的方法。本发明还涉及以高密度阵列方式制备和纯化嵌合蛋白的方法。本发明还涉及通过将双重标记的融合蛋白连接在固体支持物上制备蛋白阵列的方法。本发明还涉及用于确定一种信号是否是阳性的方法。

Description

利用蛋白组芯片全面分析蛋白活性
本发明是在政府支持下完成的，由国家卫生研究院(NIH)给予许可编号CA77808和GM62480。政府可拥有本发明的某些权利。
相关申请
本申请要求2001年5月11日提交的美国临时申请60/290,583和2001年7月26日提交的美国临时申请60/308,149的权益，上述每一份申请都被以全文形式引入本文作为参考。
1.发明领域
本发明涉及蛋白组芯片(proteome chips)，它包括具有在单一物种中表达的所有蛋白的大部分的阵列。本发明还涉及制备蛋白组芯片的方法。本发明还涉及利用蛋白组芯片以高处理量的方式系统地分析一个物种中所有蛋白相互作用的方法。
本发明还涉及以高密度阵列方式制备和纯化真核蛋白的方法。本发明还涉及通过将双重标记的融合蛋白连接在固体支持物上制备蛋白阵列的方法。本发明还涉及用于确定信号是否是阳性的方法。
2.背景技术
后基因组测序时代的一项繁重的任务是了解由基因组所编码的每一种蛋白的功能、修饰和调控(Fields等，1999，Proc Natl Acad Sci.96：8825；Goffeau等，1996，Science 274：563)。目前，人们致力于通过分析mRNA表达特征，基因破坏表型，双杂交相互作用和蛋白亚细胞定位研究基因，以及蛋白功能(Ross-Macdonald等，1999，Nature 402：413；DeRisi等，1997，Science 278：680；Winzeler等，1999，Science285：901；Uetz等，2000，Nature 403：623；Ito等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：1143)。尽管所述研究是有用的，转录特征不一定与细胞蛋白水平有太大的相关性。因此，生物化学活性的分析可以提供有关蛋白功能的信息，它能补充基因组分析，以便提供细胞工作的更全面的图象(Zhu等，2001，Curr.Opin.Chem.Biol.5：40；Martzen，等，1999，Science 286：1153；Zhu等，2000，Nat.Genet.26：283；MacBeath，2000，Science 289：1760；Caveman，2000，J.Cell Sci.113：3543)。
若干个研究小组最近业已披露了用于筛选蛋白活性的微阵列方案(Zhu等，2000，Nat.Genet.26：283；MacBeath等，2000，Science 289：1763；Arenkov等，2000，Anal.Biochem 278：123)。另外，业已制备了酵母蛋白的超量表达克隆的集合体，并且筛选了生物化学活性(Martzen等，1999，Science 286：1153)。不过，尚未能制备、排列和筛选接近整个蛋白组的数千种不同蛋白的多种活性(Caveman，2000，J.Cell Sci.113：3543)。
对整个蛋白组的筛选可能需要以高处理量的方式检测所生产的多种蛋白的生物化学活性，并且同时分析数百或数千个蛋白样品的功能(Zhu等，2000，Nat.Genet.26：283；MacBeath等，2000，Science 289：1763；Arenkov等，2000，Anal.Biochem 278：123)。筛选整个蛋白组阵列的努力业已遇到了重大障碍，包括不能制备必要的表达克隆，以及不能以高处理量的方式表达和纯化表达的蛋白。以前业已利用随机表达文库或合并物策略进行了体外分析，这两种方法都具有缺陷(Martzen等，1999，Science 286：1153；Bussow等，2000，Genomics 65：1)。具体地讲，随机表达文库的筛选是烦琐的，并且包括通常不是完整长度的克隆。另一个最近的方法是制备特定的阵列，并且利用合并策略筛选该阵列(Martzen等1999，Science 286：1153)。不过，所述合并方法限制了要筛选的蛋白的实际数量，并且当被鉴定的阳性克隆的数量庞大时该方法是繁重的。
可用于检测蛋白-蛋白相互作用的另一种方法是双杂交方法(Uetz等，2000，Nature 403：623；Ito等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：1143)。不过，可以用该方法检测的相互作用的类型是有限的，因为所述相互作用通常是在细胞核中检测的。
因此，本领域仍然需要大规模分析生物化学功能，这可能需要以高处理量方式制备并筛选由一个物种的基因组所编码的一整套蛋白。
在第二部分或在本申请的任何其他部分所引用的或确定的任何参考文献都不应当被认为是承认所述文献是在本发明以前可以获得的。
3.发明概述
本发明提供了可用于以高处理量方式对一个物种的蛋白相互作用进行全面分析的蛋白组芯片。本发明的方法和组合物是通过申请人对一种方法的新的和非显而易见的发现而成为可能的，所述方法是制备一整套包括一个基因组的蛋白编码序列的表达构建体，以高处理量的方式在宿主细胞中生产所述蛋白产物，并且利用微阵列以高处理量的方式分析多种蛋白的功能。
本发明涉及蛋白组芯片，它是包括多种蛋白的可定位寻址的阵列，每一种蛋白位于固体支持物的一个不同的位置上，其中，多种蛋白代表在单一物种内表达的所有蛋白的大部分，其中，一种开放读框的翻译产物被认为是一种蛋白。
使用阵列，而不是进行一个接一个地分析的优点是，具有可以同时鉴定和表征多种蛋白-探针相互作用的能力。另外，探针的复杂混合物可以与蛋白组芯片接触，以便例如在一种细胞的更具有代表性的环境中检测相互作用，并且快速评估多种潜在的结合化合物。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种包括多种蛋白的可定位寻址的阵列，每一种蛋白位于固体支持物的一个不同的位置上，其中，所述多种蛋白至少占在一个物种中表达的所有蛋白的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种可定位寻址的包括多种蛋白的阵列，每一种蛋白位于固体支持物的一个不同的位置上，其中，所述多种蛋白至少占在一个物种中表达的所有蛋白的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％或50％，其中，蛋白同种型和剪接变体被作为一种蛋白统计。在一种具体实施方案中，所述多种蛋白至少占在一个物种中表达的蛋白的50％，其中，蛋白同种型和剪接变体被作为一种蛋白统计。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种可定位寻址的包括多种蛋白的阵列，每一种蛋白位于固体支持物的一个不同的位置上，其中，所述多种蛋白包括在一个物种中表达的至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、100,000、500,000或1,000,000种蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种可定位寻址的包括多种蛋白的阵列，每一种蛋白位于固体支持物的不同的位置上，其中，所述多种蛋白总体上包括由同一物种中的至少1000种不同的已知基因编码的蛋白。
在另一个实施方案中，所述蛋白是按照蛋白的分类在所述阵列上组构的。所述分类可以根据丰度、功能、功能类型、酶促活性、同源生、蛋白家族、与特定代谢或信号传导途径的结合、与相关的代谢或信号传导途径的结合或翻译后修饰进行。
在另一个实施方案中，本发明提供了如上文所述的可定位寻址的阵列，其中，所述固体支持物包括玻璃、陶瓷、硝酸纤维素、非晶碳化硅、可浇铸的氧化物，聚酰亚胺，聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、或硅氧烷弹性体。
在另一个实施方案中，所述固体支持物包括有助于将多种蛋白结合在所述固体支持物上的材料。例如，所述固体支持物可以用一种能够与每一种蛋白上的亲和标记结合的材料包被。在一种具体实施方案中，所述固体支持物包括谷胱甘肽。在另一种具体实施方案中，所述固体支持物包被剂包括镍或硝酸纤维素。在另一种具体实施方案中，所述固体支持物包被剂包括谷胱甘肽和镍。在另一个实施方案中，所述固体支持物是镍包被的载玻片。在一种优选实施方案中，所述固体支持物是硝酸纤维素包被的载玻片。用于制备蛋白(和DNA)微阵列的硝酸纤维素包被的载玻片可以通过商业渠道获得(例如，从Schleicher& Schuell(Keene，NH)获得，该公司出售用硝酸纤维素基聚合物包被的载玻片(产品目录号10 484 182))。在一种具体实施方案中，用OMNIGRIDTM(GeneMachines，San Carlos，CA)将每一种蛋白点在硝酸纤维素包被的载玻片上。
蛋白组芯片上的蛋白优选是融合蛋白，它包括至少一种用于纯化和/或连接所述蛋白到蛋白组芯片上的亲和标记。
本发明还提供了用于制备蛋白组芯片的方法。因此，本发明提供了用于构建可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物的表面上，每一种蛋白位于所述固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白至少占在一个物种中表达的所有蛋白的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于制备可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物的表面上，每一种蛋白位于所述固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白至少占在一个物种中表达的所有蛋白的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％或50％，其中，蛋白的同种型和剪接变体被作为一种蛋白统计。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于构建可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物的表面上，每一种蛋白位于所述固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白至少包括一个物种中表达的1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、100,000、500,000或1,000,000种蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于制备可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物的表面上，每一种蛋白位于所述固体支持物的不同位置上，其中，多种蛋白总体上包括由一个物种中的至少一千种不同的已知基因所编码的蛋白。
本发明还提供了用于以可标度(scalable)的形式制备和分离病毒、原核或真核生物蛋白的方法，可用于高处理量分析。优选的方法包括以与自动化技术兼容的阵列方案合成和纯化蛋白。相应地，在一个实施方案中，本发明提供了用于制备和分离病毒、原核或真核生物蛋白的方法，包括以下步骤：生长用具有与调控序列可操作地连接的异源序列的载体转化过的真核细胞，让所述调控序列与能增强由所述异源序列编码的蛋白表这的诱导物接触，裂解所述细胞，让所述蛋白与一种结合制剂接触，以便形成所述蛋白和结合制剂的复合物，从细胞碎片中分离所述复合物，并且从所述复合物中分离所述蛋白，其中，每一个步骤都是在96孔平板上进行的。
所述蛋白优选是融合蛋白，以便所述异源序列包括感兴趣的蛋白的编码区和编码一种标记的序列，如亲和标记。所述标记可用于监测所述蛋白，从细胞碎片和污染试剂中分离融合蛋白和/或将所述蛋白结合在本发明的蛋白组芯片上。
本发明还提供了用于制备可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种融合蛋白结合在固体支持物的表面上，其中每一种蛋白位于所述固体支持物的不同位置上，其中，所述蛋白包括由一种生物体的基因组核酸编码的第一标记、第二标记和蛋白。在某些实施方案中，所述蛋白是用一种标记对该蛋白的氨基末端进行标记，而用另一种不同的标记对它的羧基末端进行标记。在其他实施方案中，所述蛋白是用两种标记对该蛋白的氨基末端进行标记，或者用两种标记对它的羧基末端进行标记。在其他实施方案中，所述蛋白是用一种或多种标记对所述蛋白的除了氨基或羧基末端以外的部位进行标记的。使用双标记蛋白的优点包括获得高纯度蛋白的能力，以及提供从细胞碎片中获得纯化蛋白的流水线方式，以及将所述蛋白结合在固体支持物上。
因此，在一种具体实施方案中，所述第一标记是谷胱甘肽S-转移酶标记(″GST标记″)，而第二标记是聚组氨酸标记(″His标记″)。在另一个实施方案中，所述GST标记和His标记被连接在所述蛋白的氨基末端。另外，所述GST标记和His标记被连接在所述蛋白的羧基末端。GST标记和His标记可以出现在所述蛋白的氨基末端或羧基末端。在某些实施方案中，GST标记被连接在所述蛋白的氨基末端，而His标记被连接在所述蛋白的羧基末端。在其他实施方案中，His标记被连接在所述蛋白的氨基末端，而GST标记被连接在羧基末端。
改变融合蛋白的亲和标记的位置，可能导致功能性二级结构、细胞外结构域的正确折叠和蛋白的合适的转运、定位、和/或分泌。例如，GST标记和His标记融合在所述蛋白的羧基末端可能在翻译起始密码子的上游区被封闭时避免不适当的折叠或表达。
本发明还提供了使用蛋白组阵列筛选脂类结合蛋白的方法。因此，在一个实施方案中，本发明是一种使用包括多种蛋白的可定位寻址的阵列的方法，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，该方法包括以下步骤：让一种探针与一种阵列接触，并且检测蛋白-探针相互作用，其中，所述探针包括一种脂类。在一种具体实施方案中，所述脂类包括磷脂，例如，但不局限于磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇。在另一种具体实施方案中，所述探针是包括感兴趣的磷脂的脂质体形式。
还提供了使用蛋白组芯片的方法。本发明的蛋白组芯片可用于分析一个物种或细胞内的几乎所有的蛋白-蛋白相互作用。所述蛋白组芯片还可用于系统分析一个物种的与一种测试化合物相互作用的所有蛋白。因此，使用本发明的蛋白组芯片，可以分析多种活性，以便得到大量信息，例如，但不局限于一种细胞或生物体对一种刺激的“指纹”或“标记”，表征一个物种的与感兴趣的探针相互作用的所有蛋白，表征两种或两种以上物种的与感兴趣的探针相互作用的所有蛋白，表征与一种生物学途径(例如，代谢或信号传导途径)或与相关的生物学途径相关的所有蛋白，表征一个物种的具有感兴趣的酶促活性(例如，激酶活性，蛋白酶活性，磷酸酶活性，糖苷酶活性，乙酰化酶活性和其他化学基团转移酶促活性)的所有蛋白，表征一个物种的具有感兴趣的翻译后修饰的所有蛋白，以及鉴定药物目标。在一种具体实施方案中，本发明的蛋白组芯片被用于表征一个物种的所有蛋白，例如，药物目标，它能与感兴趣的药物或药物候选物相互作用。
因此，本发明包括用于检测结合蛋白的方法，包括以下步骤：让一种探针与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白包括由一个物种内的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的已知基因编码的至少一种蛋白，并且检测所有蛋白-探针相互作用。
在另一个实施方案中，本发明包括一种用于检测结合蛋白的方法，包括以下步骤：让一种探针与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白包括在一个物种内表达的所有蛋白的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，其中，蛋白同种型和剪接变体被作为同一种蛋白统计，并且检测所有蛋白-探针相互作用。
在另一个实施方案中，本发明包括一种用于检测结合蛋白的方法，包括以下步骤：让一种探针与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白包括在一个物种中表达的至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、100,000、500,000或1,000,000种已知蛋白，并且检测所有蛋白-探针相互作用。
在另一个实施方案中，本发明包括一种用于检测结合蛋白的方法，包括以下步骤：让一种探针与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白总体上(the plurality of proteins in aggregate)包括一个物种中的至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、5000、10000、20000、30000、40000或50000种不同的已知基因，并且检测所有蛋白-探针相互作用。
在另一个实施方案中，本发明包括一种用于检测结合蛋白的方法，包括以下步骤：让一种探针与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中，多种蛋白总体上包括至少两个物种的至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、5000、10000、20000、30000、40000或50000种不同的已知基因，并且检测所有蛋白-探针相互作用。
在另一个实施方案中，本发明包括一种用于检测结合蛋白的方法，包括以下步骤：让一种探针与包括多种融合蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中，所述融合蛋白包括第一标记和第二标记和一个由一种生物体的基因组核酸编码的蛋白序列，并且检测所有蛋白-探针相互作用。如上文所述，在某些实施方案中，所述两种标记可以是His和GST。
本发明还提供了一种标记用于结合测定的蛋白的方法，包括以下步骤：在合适条件下让蛋白的单独等份样品(aliquots)与生物素-转运化合物接触一定时间，以便在不同的等份样品中产生生物素化程度不同的蛋白，并且，将不同的等份样品组合在一起，以便产生被不同地生物素化的蛋白的样品。
本发明还提供了一种用于检测结合蛋白的方法，包括以下步骤：让通过上述方法生产的生物素化蛋白的样品与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，并且检测所述阵列上所有蛋白-探针相互作用的位置，其中，在生物素化的蛋白和所述阵列上的蛋白之间发生了相互作用。
本发明包括一种用于检测结合蛋白的方法，包括以下步骤：让通过上述方法生产的生物素化蛋白的样品与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，让所述阵列与和荧光剂结合的链亲和素接触，并且检测所述阵列上出现荧光的位置，其中，所述荧光表示在生物素化的蛋白和所述阵列上的蛋白之间发生了相互作用。
本发明还提供了一种用于确定一种信号是否是阳性的方法。相应地，本发明的一个实施方案提供了一种用于确定使用蛋白微阵列在一种测定中获得的信号是否是阳性的方法，该信号能表明一种探针与一种相互作用剂的结合。
3.1定义
在本文中，术语“蛋白”表示完整长度蛋白、蛋白的一部分或肽。蛋白可以通过裂解较大的蛋白产生，或通过化学合成产生。蛋白优选是通过在与一个物种(例如，但不局限于细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞)中重组超量表达而制备的。放置在本发明蛋白微阵列上的蛋白优选是融合蛋白，更优选具有至少一种亲和标记，以有助于纯化和/或固定。
在本文中，术语“相互作用剂”表示在蛋白微阵列上的能与一种探针相互作用的蛋白。
在本文中，术语“探针”表示任何化学制剂，例如，但不局限于蛋白，核酸(例如DNA，RNA，寡核苷酸，多核苷酸)，小分子，底物，抑制剂，药物或药物候选物，受体，抗原，激素，甾醇，脂类，磷脂，脂质体，抗体，辅因子，细胞因子，谷胱甘肽，免疫球蛋白结构域，碳水化合物，麦芽糖，镍，二氢胰蛋白酶，钙调蛋白，生物素，凝集素和重金属，这些化学试剂可用于本发明的蛋白微阵列上，用于分析与所述微阵列上的蛋白的相互作用。
4.附图的简要说明
图1A-1B.使用蛋白芯片技术分析酵母蛋白组的方法。
A.通过重组方法将酵母ORFs克隆到双重标记的酵母GAL1表达载体上，并且通过测序，证实正确的身份。然后将每一种纯的质粒构建体重新导入酵母菌株，以便进行大规模的蛋白纯化。让酵母培养物在96孔平板上生长，并且通过添加半乳糖进行诱导。在高处理量纯化步骤之后，对纯化的蛋白进行分装，并且在-80℃下用甘油缓冲液保存，然后印刷。使用高精度微阵列仪，可以在一次实验中将6566种蛋白样品重复点在80个载玻片上。
B.从3毫升酵母培养物中纯化的蛋白的免疫印迹分析。
图2A-2C.用抗GST抗体检测的蛋白组芯片。
使用抗GST抗体通过印迹分析检查了60种样品；示出了19种代表性样品。80％以上的制剂能产生高产率的融合蛋白。
A.通过96孔方案纯化GST∷酵母融合蛋白。将代表5800种蛋白的6566个蛋白样品重复点在一个镍包被的显微镜载玻片上。用抗GST抗体检测该载玻片。
B.在该蛋白组芯片的右侧示出了48个区之一的放大图象。字母表示重复的蛋白样品，而数字表示源平板编号。发现了良好的分辨率和高的信噪比。
C.每一种ORF产品的重复斑点之间的误差分布。ε的单位是通过Axon扫描仪测定的信号强度。通过GST对照确定，10个单位相当于大约32fg蛋白。ε分布的中央为1.2个单位，并且所述样品的95％位于距离该中心10个单位以内。
图3A-3B.在蛋白组芯上进行不同测定的例子。
A.重复点滴包括6566种酵母蛋白的蛋白组芯片，并且与所标明的生物素化的探针一起培养。通过方框表示的阳性相互作用剂，是通过6个蛋白-脂质体相互作用测定(″PI(3)P″，″PI(4，5)p2.′，″PI(4)P″，″PI(3，4)P2″，″PI(3，4，5)P3″，″PC″)，一个钙调蛋白-结合测定(“钙调蛋白”)，和一个DNA-蛋白相互作用测定(“基因组DNA”)确定的。每一个区包括16×18个蛋白斑点。重复的阳性信号是水平地成对出现在底部图片中的。重复的点滴起着内部对照的作用，当所述信号相对背景而言较弱时，这种做法是重要的。上部图片表示用抗GST抗体(″α-GST″)检测的对照蛋白组芯片的相同的酵母蛋白制剂。如图中所表明的，强的信号通常出现在具有较低含量GST融合蛋白(“探针”)的样品中，这表明所述结合是敏感的，并且是专一性的。PI，磷脂酰肌醇。PC，磷脂酰胆碱。
B.通过寻找不同的钙调蛋白目标所拥有的氨基酸序列，确定推测的钙调蛋白结合基序(Zhu等2000，Nat.Genet.26：283)。39种阳性蛋白中的14种拥有一种基序，该基序的共有序列为I/L-Q-X-K-K/X-G-B(SEQ ID NO：1)，其中，X是任何残基，而B是碱性残基。在排列上方示出的字母的大小，表示所标明的氨基酸的相对频率。YFL003C/MSH4(SEQ ID NO：2)；YJR073C/OPI3(SEQ ID NO：3)；YBR050C/REG2(SEQID NO：4)；YNL202W/SPS 19(SEQ ID NO：5)；YOL016C/CMK2(SEQ IDNO：6)；BRO 11C/IPP1(SEQ ID NO：7)；YGR034W/RPL26B(SEQ IDNO：8)；YFR004W/RPN 11(SEQ ID NO：9)；YIL021W/RPB3(SEQ ID NO：10)；YGL063W/PUS2(SEQ ID NO：11)；YDR292C/SRP101(SEQ ID NO：12)；YFR014C/CMK1(SEQ ID NO：13)；YBR213W/MET8(SEQ IDNO：14)；YAL029C/MY04(SEQ ID NO：15)。
图4A-4D.磷脂酰肌醇-结合蛋白的分析。为了确定150种阳性蛋白的磷脂酰肌醇(″PI″)-结合专一性，将它们的结合信号相对磷脂酰胆碱(″PC″)的相应结合信号进行统一化。根据其比例(″PI/PC″)，将所述蛋白分成四类：(A)30种强的和专一性的，(B)43种强的和非专一性的，(C)19种弱的和专一性的，和(D)58种弱的和专一性的磷脂酰肌醇-结合专一性。强度表示PI/PC信号比，如在附图中通过尺度所表示的。位于PI/PC结合比例右侧用“10n”标明的柱，表示最大结合信号强度(空心方框)，以及它的置信间隔(实心水平线)；数字表示有关值的对数。位于置信间隔柱右侧的三个柱上的方框分别表示膜结合蛋白(“膜”)，激酶(“激酶”)和未表征的ORFs(“未知”)。
图5A-5C.通过蛋白组微阵列检测证实蛋白-脂类相互作用的常规方法(Casamayor等，1999，Curr.Biol.9：186；Guerra等，2000，Biosci.Rep.20：41)。
A.首先将PI(4，5)P2脂质体结合在硝酸纤维素膜上，该纤维素膜是通过BSA封闭的；利用Rim15p，Eno2p和Hxk1p和GST对照的稀释系列检测所述膜。用抗GST抗体和强化化学发光(“ECL”)试剂盒检测结合的蛋白。
B.进行相反的测定，以便测试蛋白-脂类相互作用。制备所述蛋白，并且通过系列稀释点滴在硝酸纤维素滤膜上，并且用6种不同的脂质体检测。作为对照，同样将6种脂质体添加到BSA封闭的膜上。在经过充分洗涤之后，利用HRP-结合的链亲和素和ECL试剂盒检测结合的脂质体。
C.在膜测定中，结合信号和Rim15p的数量的线性相关。当来自所述膜测定(图4B)的Rim15p的脂质体结合信号相对点滴的Rim15p的浓度梯度作图时，PI(4)P，PI(3，4)P2，PI(3)P，和PI(4，5)P2的结合信号与Rim15p的量线性相关。PI(4)P和Rim15p的相互作用表现出最高的亲和力，该亲和力比对照PC Rim15p的亲和力至少高3倍。
5.发明详述
本发明部分基于申请人的酵母蛋白组微阵列的构建，其包括在酵母中表达的所有蛋白的大约80％，代表任何物种的蛋白组阵列的第一说明。本发明的蛋白组芯片可用于对一个物种中的蛋白相互作用和活性进行全面分析。蛋白组芯片的使用与现有方法相比具有突出优点。本发明所提供的蛋白组微阵列技术的一个优点是，能够以高处理量方式，同时直接筛选大量不同蛋白的数百种甚至是数千种生物化学活性。例如，所述蛋白组芯片方法的一个优点是，可以在体外直接筛选蛋白的多种活性，包括，但不局限于蛋白-药物相互作用(例如，药物目标-药物相互作用)，蛋白-脂类相互作用和酶促测定。另外，可以方便地测试多种体外条件。另外，一旦制备了所述蛋白，蛋白组筛选明显更快并且更便宜，并且在多种微阵列方案中的快速数据分析与现有的设备和分析软件兼容。
5.1蛋白组阵列
本发明包括包括具有多种蛋白的可定位寻址的阵列，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白包括由一个物种的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的已知基因所编码的至少一种蛋白，即来自一种基因的所有蛋白同种型和剪接变体都被视为一种蛋白。
本发明包括包括具有多种蛋白的可定位寻址的阵列，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白包括在一个物种中表达的所有蛋白的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，其中，蛋白同种型和剪接变体都作为一种蛋白统计的。在一个实施方案中，所述多种蛋白占在一个物种中表达的所有蛋白的大约90％、95％或99％。在一种具体实施方案中，所述多种蛋白占在一个物种中表达的所有蛋白的大约93.5％。
本发明还包括包括具有多种蛋白的可定位寻址的阵列，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白包括在一个物种中表达的1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、100,000、500,000或1,000,000种蛋白。
本发明还包括包括具有多种蛋白的可定位寻址的阵列，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白总体上包括在一个物种中表达的1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、5000、10000、20000、30000、40000或50000种不同的已知基因。
本发明还包括结合在固体支持物的表面上的含有多种融合蛋白的可定位寻址的阵列，每一种蛋白位于所述固体支持物的不同位置上，其中，所述融合蛋白包括第一标记和第二标记，和由一种生物体的基因组核酸编码的蛋白序列。在另一个实施方案中，所述融合蛋白的蛋白序列不一定是由生物体的基因组核酸编码的，但是，它是鉴定结合蛋白的功能和/或活性所需要的序列。
可定位寻址的阵列提供了一种结构，以便每一种感兴趣的探针或蛋白位于所述位于所述固体支持物的已知位置上，以便能够根据它在所述阵列上的位置确定每一种探针或蛋白的身份。因此，阵列上的每一种蛋白优选位于固体支持物的已知的、预定的位置上，以便可以根据它在所述固体支持物的位置确定每一种蛋白的身份。
在一个实施方案中，所述物种是病毒。在另一个实施方案中，所述物种是原核生物。在另一个实施方案中，所述物种是真核生物。在另一个实施方案中，所述物种是脊椎动物。在另一个实施方案中，所述物种是哺乳动物。在一种具体实施方案中，所述物种是动物，包括，但不局限于昆虫、灵长类和啮齿类。在一种具体实施方案中，所述物种是猴子、果蝇、牛、马、绵羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、线虫或鱼。在一种优选实施方案中，所述物种是人类。在另一个实施方案中，所述物种是酵母。
本发明的蛋白组芯片的蛋白包括完整长度蛋白，完整长度蛋白的部分和肽，所述蛋白可以通过重组超量表达、裂解较大的蛋白或化学合成制备。例如，蛋白可以在来自酵母、细菌、昆虫、人类、或人哺乳动物，如小鼠、大鼠、猫、狗、猪、牛和马的细胞中超量表达。另外，可以使用包括与天然或合成蛋白结合的特定结构域的融合蛋白。可以在与所述芯片的固体支持物结合之前，对蛋白组芯片的蛋白进行纯化。另外，还可以在与蛋白组芯片结合期间，对所述蛋白组芯片的蛋白进行纯化或再纯化。
可以在与所述蛋白芯片结合之前或在结合的同时，将蛋白包埋在人工或天然膜(例如，脂质体，膜小泡)中。实际上，某些蛋白的合成可优选在存在人工或天然膜的条件下进行，以便，例如，促进蛋白折叠，蛋白加工，保留活性，和/或防止蛋白沉淀。
另外，可以将蛋白结合在蛋白组芯片的固体支持物上。另外，可以将蛋白输送到蛋白组芯片的孔中，在这里，它们保持不与蛋白组芯片的固体支持物结合。
本发明还涉及可用于本发明蛋白组芯片的固体支持物的化合物。所述固体支持物可以用各种材料制成，例如，但不局限于硅，玻璃，石英，聚酰亚胺，丙烯酸，聚甲基丙烯酸甲酯(LUCITE)，陶瓷，硝酸纤维素，非晶碳化硅，聚苯乙烯，和/或任何其他适合微制造、微蚀刻、或铸造的材料。例如，所述固体支持物可以是亲水性微量滴定板(例如，MILLIPORTM)或硝酸纤维素包被的载玻片。在一种优选实施方案中，所述固体支持物是硝酸纤维素包被的载玻片。用于制备蛋白(和DNA)微阵列的硝酸纤维素包被的载玻片，可以通过商业渠道获得(例如，从Schleicher & Schuell(Keene，NH)购买，该公司出售用基于硝酸纤维素的聚合物包被的载玻片(产品目录号10 484 182))，在一种具体实施方案中，用OMNIGRIDTM(GeneMachines，San Carlos，CA)将每一种蛋白点滴在硝酸纤维素包被的载玻片上。本发明涉及可用于制造蛋白芯片的其他固体支持物，其中的某些固体支持物披露于以下文献中，例如，共同未决的美国专利申请09/849,781，2001年5月4日提交，该申请被以全文形式引入本文作为参考。
在一种具体实施方案中，所述固体支持物包括硅酮弹性材料，例如，但不局限于聚二甲基硅酮(″PDMS″)。硅酮弹性材料的一个优点是它们的弹性。
在另一种具体实施方案中，所述固体支持物是硅晶片。可以对硅晶片进行成型和蚀刻(例如，参见G.Kovacs，1998，MicromachinedTransducers Sourcebook，Academic Press；M.Madou，1997，Fundamentalsof Microfabrication，CRC Press)。可以将蚀刻过的芯片用于铸造本发明的蛋白组芯片。
在一个实施方案中，本发明提供了包括固体支持物的蛋白组芯片，该支持物是平面的，例如，但不局限于载玻片。例如，可以在载玻片上生产密集的蛋白阵列，以便能够以高处理量的方式对蛋白的存在、数量和/或功能进行分析。
因此，在一个实施方案中，所述蛋白组芯片包括被涂在固体支持物表面上的多种蛋白，其中，涂敷蛋白的位点的密度为至少100个位点/平方厘米，1000个位点/平方厘米，10,000个位点/平方厘米，100,000个位点/平方厘米，1,000,000个位点/平方厘米，10,000,000个位点/平方厘米，25,000,000个位点/平方厘米，10,000,000,000个位点/平方厘米或10,000,000,000,000个位点/平方厘米。优选将每一种蛋白涂在所述芯片的一个独立的位点上。位于所述芯片的每一个位点上的蛋白的身份是已知的。
在另一个实施方案中，所述固体支持物具有一系列孔。可以利用微印刷和微机械加工制造技术(例如，参见未决美国专利申请09/849,781，2001年5月4日提交，该申请被以全文形式引入本文作为参考)产生孔的阵列，这些孔具有从数百微米至100纳米甚至更小的尺寸，孔的深度具有类似的尺寸。在一个实施方案中，对硅晶片进行微机械加工，并且被用作母模，以便浇铸间隔为200微米的直径为400微米的孔，孔的密度为每平方厘米大约277个孔，对于深度为100微米的孔来说，每一个孔的体积为大约30nl。
在另一个实施方案中，通过微印刷、微机械加工生产间隔1微米的直径为500纳米和275纳米的孔，以便分别得到每平方厘米超过4千4百万和超过6千1百万个孔的孔密度。通过较小的间隔，以及通过较小的直径，可以获得更高的密度。
在另一个实施方案中，可以利用精密激光微机械加工技术直接用丙烯酸树脂制造模具结构，其尺寸从高于1.5毫米至低于500微米，孔的间隔大约为500微米。这些孔的体积为50-500nl。
因此，在一个实施方案中，所述蛋白组芯片包括固体支持物表面上的多个孔，其中，所述孔的密度至少为100孔/平方厘米，1000孔/平方厘米，10,000孔/平方厘米，100,000孔/平方厘米，1,000,000孔/平方厘米，10,000,000孔/平方厘米，25,000,000孔/平方厘米，10,000,000,000孔/平方厘米或10,000,000,000,000孔/平方厘米。本发明涉及包括多个孔的蛋白芯片的变化形式，例如，这种变化形式披露于提交日为2001年5月4日的未决美国专利申请号09/849,781中，该专利申请被以全文形式引入本文作为参考。
本发明还涉及蛋白组芯片上的孔的形状、宽度与深度的比例和体积的变化，例如，这种变化披露于提交日为2001年5月4日的未决美国专利申请号09/849,781中，该专利申请被以全文形式引入本文作为参考。所述形状包括，但不局限于圆形、椭圆形、矩形、方形等。例如，所述孔还可以具有方形、圆形、V形或U形底部。
在一个实施方案中，所述固体支持物包括金。在一种优选实施方案中，所述固体支持物包括金包被的载玻片。在另一个实施方案中，所述固体支持物包括镍。在另一种优选实施方案中，所述固体支持物包括镍包被的载玻片。包括镍的固体支持物优选用于纯化和连接具有多组氨酸标记(″His标记″)的融合蛋白。在另一个实施方案中，所述固体支持物包括硝酸纤维素，在另一种优选实施方案中，所述固体支持物包括硝酸纤维素包被的载玻片。
本发明还涉及可用于对所述蛋白组芯片基质进行衍生化的化合物。所述蛋白可以直接结合在固体支持物上，或者可以通过接头分子或化合物结合在固体支持物上。所述接头可以是能够对固体支持物的表面进行衍生化，以便有利于蛋白与固体支持物表面结合的任何分子或化合物。所述接头可以将蛋白或探针共价或非共价结合在所述固体支持物上。另外，所述接头可以是无机或有机分子。在某些实施方案中，所述接头可以是硅烷，例如，sianosilane，硫代硅烷，氨基硅烷等。本发明涉及可用于对蛋白芯片进行衍生化的化合物，例如，某些这样的化合物披露于提交日为2001年5月4日的未决美国专利申请号09/849,781中，该专利申请被以全文形式引入本文作为参考。
相应地，在一个实施方案中，蛋白组芯片的蛋白非共价地结合在固体支持物上(例如，通过吸附结合)。与固体支持物非共价地结合的蛋白可以通过多种分子相互作用结合在固体支持物表面上，例如，氢键、范德华键、静电，或金属螯合物配合键。在一种具体实施方案中，蛋白结合在聚赖氨酸包被的固体支持物表面上。另外，如上文所述，在某些实施方案中，蛋白被结合在硅烷(例如，sianosilane，硫代硅烷，氨基硅烷等)包被的固体支持物表面上。
另外，可以将本领域公知的交联化合物，例如，纯合或杂合功能交联化合物(例如，二[硫代琥珀酰亚胺基]辛二酸，N-[γ-马来酰丁酰羟基]琥珀酰亚胺酯或1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺)通过共价或非共价相互作用将蛋白结合在所述固体支持物上。
在另一个实施方案中，所述蛋白组芯片的蛋白是共价结合在固体支持物上的。例如，所述蛋白可以通过受体-配体相互作用结合在固体支持物上，所述相互作用包括抗体和抗原，DNA结合蛋白和DNA，酶和底物，亲和素(或链亲和素)和生物素(或生物素化的分子)之间的相互作用，以及脂结合蛋白和磷脂(或膜，小泡或含有磷脂的脂质体)之间的相互作用。
可以利用本领域已知的多种方法将纯化的蛋白放置在阵列上。在一个实施方案中，将所述蛋白印刷在固体支持物上。在一个实施方案中，利用亲和标记将所述蛋白固体在固体支持物上。优选利用不同于用于纯化蛋白的亲和力标记，因为在建立所述蛋白阵列时实现了进一步的纯化。
相应地，在一种优选实施方案中，所述蛋白组芯片的蛋白是作为融合蛋白表达的，它具有至少一个异源结构域，该结构域对结合在固体支持物表面上的化合物具有亲和力。适用于将融合蛋白结合在固体支持物上的化合物(即起着结合配偶体的作用)包括，但不局限于胰蛋白酶/无水胰蛋白酶，谷胱甘肽，免疫球蛋白结构域，麦芽糖，镍或生物素及其衍生物，它们分别结合在牛胰腺胰蛋白酶抑制剂，谷胱甘肽-S-转移酶，蛋白A或抗原，麦芽糖结合蛋白，聚组氨酸(例如，HisX6标记)，和亲和素/链亲和素上。例如，蛋白A、蛋白G和蛋白A/G是能够结合在哺乳动物免疫球蛋白分子，特别是IgG的Fc部分的蛋白。例如，所述蛋白可以共价结合在Sepharose支持物上，以便提供纯化具有包括Fc结构域的标记的融合蛋白的有效方法。
在另一个实施方案中，所述蛋白直接结合在固体支持物上。在另一个实施方案中，所述蛋白通过接头结合在固体支持物上。在一种具体实施方案中，所述蛋白通过His标记结合在固体支持物上。在另一种具体实施方案中，所述蛋白通过3-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(″GPTS″)接头结合在固体支持物上。在一种具体实施方案中，所述蛋白通过His标记结合在固体支持物，其中，所述固体支持物包括一个平的表面。在一种优选实施方案中，所述蛋白通过His标记结合在固体支持物上，其中，所述固体支持物包括镍包被的载玻片。
本发明的蛋白组芯片的物理尺寸不受限制，并且可以具有任何可以使用的尺寸。所述蛋白组芯片优选具有与自动化技术兼容的阵列形式，以便能够进行快速数据分析。因此，在一种优选实施方案中，所述蛋白组微阵列方案是与实验室设备和/或分析软件兼容的。在另一种优选实施方案中，所述蛋白组芯片具有标准显微镜载玻片的大小。在另一种优选实施方案中，将蛋白芯片设计成适合安装到质谱仪的样品室中。
5.2以高密度阵列形式制备和纯化蛋白的方法。
本发明还涉及以便于标度、适合高处理量分析形式制备和分离病毒、原核生物或真核生物蛋白的方法。优选的方法包括以与自动化技术兼容的阵列方案合成并纯化蛋白。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种用于制备和分离真核生物蛋白的方法，包括以下步骤：生长用具有可操作地与调控序列连接的异源序列的载体转化真核细胞，让所述调控序列与能增强由所述异源序列编码的蛋白表达的诱导物接触，裂解所述细胞，让所述蛋白与一种结合制剂接触，以便在所述蛋白和结合制剂之间形成复合物，从细胞碎片中分离所述复合物，并且从所述复合物中分离所述蛋白，其中，每一个步骤都是以96孔方式进行的。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于制备可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物的表面上，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白包括由一个物种的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的已知基因所编码的至少一种蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于制备可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物的表面上，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白至少占在一个物种中表达的所有蛋白的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，其中，蛋白同种型和剪接变体是作为一种蛋白统计的。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于制备可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物的表面上，每一种蛋白位于所述固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白至少包括在一个物种中表达的1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、100,000、500,000或1,000,000种蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于制备可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物的表面上，每一种蛋白位于所述固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白总体上包括一个物种中的1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、5000、10000、20000、30000、40000或50000种不同的已知基因。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于制备可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物的表面上，每一种蛋白位于所述固体支持物的不同位置上，其中，所述蛋白是包括第一标记，第二标记，和由一种生物体的基因组核酸编码的蛋白的融合蛋白。
在一个实施方案中，合成和纯化方法的每一个步骤都是以能够快速自动化的阵列形式进行的。所述阵列可以包括固体支持物表面上的多个孔，其中，例如，所述孔的密度至少为10、20、30、40、50、100、1000、10,000、100,000或1,000,000孔/平方厘米，另外，所述阵列包括固体支持物表面上的多个位点，其中，例如，所述位点的密度至少为10、20、30、40、50、100、1000、10,000、100,000或1,000,000位点/平方厘米。
在一种具体实施方案中，真核蛋白是以96-阵列形式制备和纯化的(即进行处理的是所述固体支持物的每一个位点，在这里是96个位点中的一个)，例如，96孔微量滴定板。在一种优选实施方案中，所述固体支持物不与蛋白结合(例如，非蛋白-结合微量滴定板)。
在某些实施方案中，蛋白是按照本领域公知的方法通过体外翻译合成的。
任何具有能驱动蛋白合成的诱导型启动子的表达构建体，都可用于本发明的方法中。所述表达构建体优选是针对要用于转化的细胞类型而定制的。表达构建体和宿主细胞之间的兼容性，为本领域所公知，并且，本发明还包括它的变体的利用。
任何可以在培养物中生长的宿主细胞都可用于合成感兴趣的蛋白。所使用的宿主细胞优选能超量生产感兴趣的蛋白，导致正确的合成、折叠、和蛋白的翻译后修饰。所述蛋白加工优选能形成可用于分析、表征能够代表体内相互作用的体外分子相互作用的表位，活性位点，结合位点等。
因此，优选使用真核细胞(例如，酵母、人类细胞)合成真核蛋白。另外，优选能够稳定转化，并且具有选择标记以便鉴定和分离含有感兴趣的转化体的细胞的真核细胞。另外，具有一种基因产物缺陷的真核宿主细胞，是用能弥补所述缺陷的表达构建体转化的。可用于表达工程的病毒、原核或真核蛋白的细胞为本领域所公知，并且本领域普通技术人员可以理解所述细胞的变体。
例如，可以使用购自Invitrogen(Carlsbad，CA，产品目录号K800-01)的InsectSelect系统，它是一种非裂解的、单一载体昆虫表达系统，它简化了优质蛋白的表达，并且，消除了制备和扩增病毒原种的必要性。该系统中的优选载体是pIB/V5-His TOPO TA载体(产品目录号K890-20)。可以将聚合酶链式反应(″PCR″)产物直接克隆到该载体上，使用生产商所公开的方法，并且可以表达具有N-末端组氨酸标记的蛋白，该标记可用于纯化所表达的蛋白。
还可以使用建立在昆虫细胞中的另一种真核表达系统BAC-TO-BACTM系统(LIFETECHTM，Rockville，MD)。与使用同源重组不同，BAC-TO-BACTM系统通过在大肠杆菌中的位点专一性转座产生了重组杆状病毒。基因表达是通过高活性多角蛋白启动子启动的，因此，可以占感染的昆虫细胞的细胞蛋白的25％以上。
在一种具体实施方案中，将酵母培养物用于合成真核融合蛋白。优选将新的培养物用于有效诱导蛋白合成，特别是当蛋白合成是在小体积的培养基中进行时更是如此。另外，优选小心操作，以便避免酵母培养物的过度生长。另外，优选用大约3毫升或更少的酵母培养物产生用于纯化的足够的蛋白。为了改善培养物的通气性，可以将总体积分成若干个较小的体积(例如，可以制备4个0.75毫升的培养物，以便产生3毫升的总体积)。
然后让细胞与一种诱导物(例如，半乳糖)接触，并且收获。用冷的(即4℃至大约15℃)水洗涤诱导过的细胞，以便终止所述细胞的进一步生长，然后用冷的(即4℃至大约15℃)裂解缓冲液洗涤，以便除去培养基，并且使诱导过的细胞预先适应蛋白纯化。在蛋白纯化之前，可以冷冻保藏诱导过的细胞，以便防止所述蛋白降解。在一种具体实施方案中，以半干燥状态将诱导过的细胞保存在-80℃下，以便防止或抑制蛋白降解。
可以使用任何合适的机械装置将细胞从一个阵列转移到另一个阵列上。例如，可以用自动操作系统(例如，自动移液管)将感兴趣的细胞接种到装有生长培养基的阵列上。在一种具体实施方案中，可以用96-叉子(pronger)将酵母细胞接种到装有包括含有琼脂的生长培养基的96孔阵列上。类似地，可以使用自动化液体操作系统(例如，Q-FILLTM，Genetix，UK)，实现液体(例如，制剂)从一个阵列到另一种阵列的转移。
尽管可以在细胞周期的任何时间点上从细胞中收获蛋白，细胞优选是在对数期分离的，此时蛋白合成得到增强。例如，酵母细胞可以在OD600＝0.3和OD600＝1.5之间收获，优选在OD600＝0.5和OD600＝1.5之间收获。在一种具体实施方案中，蛋白是在对数中期之后的时间点从细胞中收获的。收获的细胞可以冷冻保存，以便将来操作。
可以用本领域已知的多种方法裂解收获的细胞，包括机械力，酶促消化，和化学处理。所述裂解方法应当适合宿主细胞的类型。例如，将含有新鲜的蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液添加到酵母细胞中，同时添加能破坏细胞壁的制剂(例如，沙子，玻璃珠，锆珠)，然后，用振荡器剧烈振荡所述混合物(例如，涡旋搅拌器，颜料振荡器(paintshaker))。
在一种特定实施方案中，让锆珠与酵母细胞接触，并且通过涡旋搅拌，通过机械破坏裂解细胞。在另一个实施方案中，酵母细胞在高密度阵列方案中的裂解，是使用颜料振荡器实现的。所述颜料振荡器具有一个平台，它能够稳定地保持分成三层的至少18个96孔盒子，以便对培养物进行高处理量加工。另外，颜料振荡器剧烈搅拌所述培养物，即使是在培养物完全解冻之前，也会导致细胞的有效破裂，同时减少蛋白的降解。实际上，通过显微镜观察确定，通过不到2分钟的振荡就可以将超过90％的酵母细胞裂解。
可以通过离心将所得到的细胞碎片从蛋白和/或其他感兴趣的分子中分离。另外，为了以高处理量形式提高蛋白样品的纯度，可以过滤富含蛋白的上清液，优选使用非蛋白结合固体支持物上的滤膜。为了从可溶性级份中分离含有感兴趣的蛋白的可溶性级份，优选使用过滤平板，以便减少或避免蛋白降解。另外，优选对含有细胞碎片的级份重复以上步骤，以便提高蛋白的产量。
然后，可以用本领域已知的多种亲和纯化方法，从富含蛋白的上清液中纯化蛋白。用于通过让具有结合配偶体的融合蛋白制剂与亲和标记接触，亲和纯化融合蛋白的亲和标记包括，但不局限于钙调蛋白，胰蛋白酶/无水胰蛋白酶，谷胱甘肽，免疫球蛋白结构域，麦芽糖，镍或生物素及其衍生物，它们分别结合在钙调蛋白-结合蛋白，牛胰腺胰蛋白酶抑制剂，谷胱甘肽-S-转移酶(″GST标记″)，抗原或蛋白A，麦芽糖结合蛋白，聚组氨酸(″His标记″)，和亲和素/链亲和素上。例如，其他亲和标记可以是myc或FLAG。融合蛋白可以使用合适的结合化合物(即结合配偶体，如谷胱甘肽珠)进行亲和纯化，并且通过，例如，将含有结合蛋白的复合物固定在非蛋白结合滤膜上进行分离。将一种亲和标记连接在蛋白的一端(例如羧基末端)，而将另一种亲和标记连接在蛋白的另一端(例如，氨基末端)，可有助于纯化完整长度的蛋白。
在特别的实施方案中，所述融合蛋白具有GST标记，并且是通过让该蛋白与谷胱甘肽珠接触进行亲和纯化的。在其他实施方案中，可以在96孔盒子中洗涤结合有融合蛋白的谷胱甘肽珠，而不使用过滤平板，以便简化样品操作，并且防止样品的交叉污染。
另外，可以用洗脱缓冲液从结合化合物(例如谷胱甘肽珠)中洗脱融合蛋白，以便提供需要的蛋白浓度。在一种具体实施方案中，融合蛋白是用30微升洗脱缓冲液从谷胱甘肽珠中洗脱的，以便提供需要的蛋白浓度。
为了纯化将均匀点滴在显微镜载玻片上的蛋白，将谷胱甘肽珠从纯化的蛋白中分离。优选除去所有谷胱甘肽珠，以避免堵塞用于将纯化的蛋白点滴在固体支持物上的微阵列针。在一种优选实施方案中，使用过滤器平板将谷胱甘肽珠从所述纯化蛋白中分离出来，优选包括非蛋白结合固体支持物。过滤含有纯化蛋白的洗脱液，能够得到该蛋白的超过90％的回收率。
所述洗脱缓冲液优选包括具有高粘度的液体，例如15％-50％的甘油，优选大约40％的甘油。甘油溶液能够将所述蛋白稳定在溶液中，并且防止在使用微阵列的印刷步骤期间蛋白溶液发生降解。
纯化的蛋白优选保存在一种介质中，该介质能稳定所述蛋白，并且防止样品的解离。例如，可以将纯化的蛋白保存在具有高粘度的液体中，例如，15％-50％的甘油，优选大约40％的甘油。优选分装含有纯化蛋白的样品，以便避免由冷冻/解冻循环所导致的蛋白活性的丧失。
技术人员可以理解的是，可以调整纯化方案，以便控制需要的蛋白纯度水平。在某些场合下，需要分离与感兴趣的蛋白结合的分子。例如，可以用本文所提供的纯化方法或它的改进方法分离包括感兴趣的超量生产的蛋白的双体、三体、或更高级别的同型或异型复合物。另外，可以用本领域已知方法(例如质谱法)分别分离并鉴定相关的分子。
5.3制备蛋白组阵列的方法。
本发明还涉及制备蛋白组芯片的方法。因此，本发明提供了用于构建可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物的表面上，每一种蛋白位于所述固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白包括一个物种中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的已知基因的至少一种代表性蛋白，其中，所述蛋白是源于一个基因的所有蛋白同种型和剪接变体。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于构建可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物的表面上，每一种蛋白位于所述固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白占在一个物种中表达的所有蛋白的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于构建可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物的表面上，每一种蛋白位于所述固体支持物的不同位置上，其中，所述多种蛋白包括在一个物种中表达的至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、100,000、500,000或1,000,000种蛋白。
本发明还涉及用于制备可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物的表面上，每一种蛋白位于所述固体支持物的不同位置上，其中，所述固体支持物是用微制造模具铸造的，并且，其中，所述多种蛋白占在一个物种中表达的所有蛋白的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，或包括在一个物种中表达的1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、100,000、500,000或1,000,000种蛋白，或包括一个物种中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的已知基因的至少一种代表性蛋白，其中，所述蛋白是来自一个基因的所有蛋白同种型和剪接变体。本发明涉及用一种微制造模具铸造的多种固体支持物，例如，某些固体支持物披露于2001年5月4日提交的共同未决美国专利申请09/849,781中，该申请被以全文形式引入本文作为参考。
本发明还涉及用于制备可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物的表面上，每一种蛋白位于所述固体支持物的不同位置上，其中，所述蛋白包括第一标记和第二标记。使用双重标记的蛋白的优点包括，可以获得高度纯化的蛋白的能力，以及提供了从细胞碎片中纯化蛋白的有效方式，并且将所述蛋白结合在固体支持物上。在一种具体实施方案中，所述第一标记是谷胱甘肽-S-转移酶标记(″GST标记″)，而第二标记是聚组氨酸标记(″His标记″)。在另一个实施方案中，GST标记和His标记连接在所述蛋白的氨基末端。另外，GST标记和His标记被连接在所述蛋白的羧基末端。
在另一个实施方案中，GST标记被连接在所述蛋白的氨基末端。在另一个实施方案中，His标记被连接在所述蛋白的羧基末端。在另一个实施方案中，His标记被连接在所述蛋白的氨基末端。在另一个实施方案中，GST标记被连接在所述蛋白的羧基末端。
在另一个实施方案中，所述蛋白包括GST标记和His标记，并且GST标记和His标记既不位于该蛋白的氨基末端又不位于该蛋白的羧基末端。在一种具体实施方案中，GST标记和His标记位于感兴趣的蛋白的编码区；优选位于该蛋白的不会影响感兴趣的结合结构域的区。
在一个实施方案中，所述第一标记被用于纯化融合蛋白。在另一个实施方案中，所述第二标记被用于将融合蛋白结合在固体支持物上。在另一种具体实施方案中，所述第一标记是GST标记，而第二标记是His标记。
所述蛋白优选是融合蛋白，以便杂合的序列包括感兴趣的蛋白的编码区，和编码一种标记，如亲和标记的序列。所述标记可用于监测所述蛋白，从细胞碎片和污染制剂中分离所述融合蛋白，和/或将所述蛋白结合在本发明的蛋白组芯片上。
诱导物的例子包括，但不局限于半乳糖，增强子结合蛋白，和其他转录因子。在一个实施方案中，半乳糖与包括半乳糖诱导型GAL1启动子的调控序列接触。
可用于本发明的结合制剂包括，但不局限于谷胱甘肽珠，镍-包被的固体支持物，和抗体。在一个实施方案中，所述复合物包括结合在谷胱甘肽珠上的具有GST标记的融合蛋白。在另一个实施方案中，所述复合物包括结合在镍包被的固体支持物上的具有His标记的融合蛋白。在另一个实施方案中，所述复合物包括结合在抗体，并且选择性结合在二级抗体上的感兴趣的蛋白。
5.4使用蛋白组阵列的方法
本发明还涉及使用蛋白组芯片分析存在于至少一种样品中的蛋白的存在、数量、和/或功能的方法。将本发明的蛋白组芯片、化学反应和测定方法用于大规模平行分析中，可以表征生物学状态或生物学反应，以及确定蛋白的存在、数量、和/或生物学活性。因此，本发明的蛋白组芯片可用于分析细胞、组织、器官、系统、或生物体中的几乎所有的蛋白-蛋白相互作用。
另外，本发明的蛋白组芯片可用于分析对宿主细胞(即用于生产融合蛋白的细胞)提供的特定刺激的生物学反应。例如，可以对用编码融合蛋白的表达载体转化过的酵母细胞进行刺激，然后纯化并且排列所述融合蛋白。然后可以通过例如，用任何结合剂检测表征所述排列的蛋白。然后将所得到的结合图案与用由未进行所述处理的酵母细胞或进行了不同刺激的酵母细胞所产生的相同的阵列进行比较。结合形式的差异，可以作为生物学反应的特征，并且可以鉴定针对所述生物学反应的感兴趣的专一性相互作用剂。
在一个实施方案中，用标记过的凝集素(例如，伴刀豆蛋白A)筛选用宿主细胞制备的蛋白组芯片，每一个芯片表示接受一种不同刺激的宿主细胞。对表示糖基化蛋白存在的蛋白-探针相互作用的形式进行比较，以便确定每一种刺激对蛋白组芯片的蛋白的糖基化状态的影响。
可以用本发明的蛋白组芯片确定的生物学活性包括，但不局限于酶促活性(例如，激酶活性，蛋白酶活性，磷酸酶活性，糖苷酶，乙酰化酶活性，和其他化学基团转移酶促活性)，核酸结合，激素结合等。高密度和小体积的化学反应可能有利于与使用本发明的蛋白组芯片相关的方法。
有关生物学状态或反应的其他信息可以用本发明的蛋白组芯片获得，其中，所述芯片上的蛋白是按照蛋白的分类组构的。所述分类可以根据丰度、功能、功能类型、酶促活性、同源性、蛋白家族、与特定代谢或信号传导途径的关系、与相关代谢或信号传导途径的关系、或翻译后修饰进行。
在本发明的蛋白组芯片的蛋白与一种或多种探针接触时，可以用本领域已知的多种技术分析蛋白-探针相互作用。例如，可以用能产生化学发光或荧光的标准酶促测定分析所述蛋白组芯片。例如，可以通过光致发光、化学发光、或使用非蛋白底物的荧光、酶促颜色形成、质谱特征标记、或寡核苷酸标记的扩增，检测各种蛋白修饰。
所述探针是用一种标记标记过的，以便可以通过本领域公知的方法直接或间接检测它的结合。本领域已知的任何标记都可以使用，包括，但不局限于诸如表位标记、半抗原，和亲和标记，抗体，标记物等，只要该标记与用于将该蛋白组芯片的蛋白结合在该芯片的固体支持物上的亲和标记或制剂不同就行。例如，如果将生物素用作将蛋白结合在蛋白组芯片阵列上的接头的话，就可以将不存在于该蛋白组芯片的蛋白上的另一种标记，例如His或GST用于标记探针，并且用于检测蛋白-探针相互作用。在某些实施方案中，使用了光致发光、化学发光、荧光或酶促标记。在其他实施方案中，使用了质谱特征标记。在其他实施方案中，使用了可扩增的寡核苷酸、肽或分子质量标记。
在一个特定实施方案中，本发明提供了一种用于检测蛋白-探针相互作用的方法，包括以下步骤：让标记过的探针的样品(例如标记过的蛋白)与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上；并且检测所述阵列上的任何位置，其中，在这些位置上发生了标记过的探针和阵列上的蛋白之间的相互作用。
相应地，蛋白-探针相互作用可以通过例如以下方式检测：1)使用放射性标记过的配体，通过放射自显影和/磷酸成像分析；2)结合半抗原，然后通过发光标记的或酶促标记的抗体或诸如生物素或链亲和素的高亲和力半抗原配体检测；3)质谱分析；4)原子力显微分析；5)荧光偏振方法；6)红外线标记过的化合物或蛋白；7)可扩增的寡核苷酸、肽或分子质量标记；8)刺激或抑制蛋白的酶促活性；9)滚动循环扩增-检测方法(Hatch等，1999，“固定在固体表面上的DNA的滚动循环扩增，及其在多突变检测中的应用”，Genet.Anal.15：35-40)；10)竞争PCR(Fini等，1999，“使用微型平板发光剂的用于检测和定量小病毒B19DNA的化学发光竞争PCR的开发”，Clin.Chem.45：1391-6；Kruse等，1999，“使用半嵌套竞争PCR测定检测并且定量测定转化生长因子β1(TGF-β1)基因表达”，Cytokine 11：179-85；Guenthner和Hart，1998，“使用基于显微平板的检测系统对HIV-1进行定量、竞争PCR测定”Biotechniques 24：810-6)；11)比色方法；和12)生物学测定(例如，测定病毒效价)。
在特别的实施方案中，蛋白-探针相互作用是通过直接质谱分析检测的。在另一个实施方案中，蛋白和/或探针的身份是通过质谱分析确定的。例如，可以将与蛋白组芯片的蛋白结合的一种或多种探针从所述阵列上解离下来，并且通过质谱分析进行鉴定(例如，参见WO98/59361)。在另一个例子中，可以检测所述蛋白组芯片上的蛋白的酶促裂解，并且可以通过质谱分析鉴定裂解的蛋白片段或其他释放的化合物。
在一个实施方案中，让所述蛋白组芯片上的每一种蛋白与一种探针结合，并且检测和定量蛋白-探针相互作用。在另一个实施方案中，让所述蛋白组芯片上的每一种蛋白与多种探针结合，并且检测和定量蛋白-探针相互作用。例如，可以用多种探针同时筛选所述蛋白组芯片，所述探针包括，但不局限于复合物(例如，细胞提取物)，完整的细胞成分(例如器官)，完整的细胞，和从若干来源收集的探针。然后检测并且定量蛋白-探针相互作用。可以通过使用探针混合物进行分析获得有用的信息，在某种程度上是因为本发明阵列的可定位寻址的性质，即通过将蛋白放置在蛋白芯片的已知位置上，可以表征与探针结合(“相互作用剂”)的蛋白。
本领域普通技术人员可以理解的是，通过使用探针筛选本发明的蛋白组芯片分析各种细胞相互作用的各种不同的实施方案。例如，用各种探针多次顺序筛选一个蛋白组芯片，可以确定与特定信号传导途径相关或与特定代谢途径相关的蛋白。另外，所述分析方法可用于诊断、预测和/或治疗目的。
根据本发明的方法，探针可以是细胞，细胞膜，亚细胞细胞器，含有蛋白的细胞材料，蛋白，寡核苷酸，多核苷酸，小分子(即分子量小于500的化合物)，底物，药物或药物候选物，受体，抗原，甾醇，磷脂，抗体，免疫球蛋白结构域，谷胱甘肽，麦芽糖，镍，二氢胰蛋白酶，凝集素或生物素。
用于与蛋白阵列接触的探针可以是生物素化的，以便检测蛋白-探针相互作用。弱生物素化的蛋白更可能用于保持感兴趣的生物学活性。因此，轻度的生物素化方法是优选的，以便保持该蛋白的结合活性或其他感兴趣的生物学活性。因此，在一种具体实施方案中，用生物素转运化合物将探针蛋白生物素化到不同的程度(例如，Sulfo-NHS-LC-LC-生物素；PIERCETM产品目录号21338，USA)。
另外，所述探针可以是酶底物或抑制剂。例如，所述探针可以是酶的底物或抑制剂，例如，但不局限于激酶，磷酸酶，蛋白酶，糖苷酶，乙酰化酶，和其他类型的转移酶。在将芯片上的蛋白与核酸或蛋白探针的组合物一起培养之后，可以鉴定结合的核酸或蛋白探针，例如，通过质谱分析(Lakey等，1998，“测定蛋白-蛋白相互作用”，Curr Opin Struct Biol.8：119-23)。
相应地，可以通过用完整细胞检测分析对与蛋白组芯片上的蛋白的相互作用的各种细胞反应。例如，可以让蛋白组芯片与淋巴细胞接触，并且分析各种方法的淋巴细胞激活作用，包括，但不局限于检测抗体合成，检测或测定3H-胸苷的整合，用抗体标记细胞表面分子，以便鉴定通过抗原识别和激活而诱导或抑制的分子(例如，CD23，CD38，IgD，C3b受体，IL-2受体，运铁蛋白受体，膜II型MHC分子，PCA-1分子，HLA-DR)，并且鉴定表达的和/或分泌的细胞因子。
在另一个例子中，可以通过与蛋白组芯片一起培养细胞确定一种特定细胞类型的促细胞分裂剂。例如，可以通过检测或测定细胞对3H-胸苷的整合测定有丝分裂活性。细胞可以具有相同的细胞类型(即，一致的群体)或可以具有不同的细胞类型。
在另一个例子中，可以通过与蛋白组芯片一起培养细胞测定特定细胞类型的分化因子。例如，可以通过肉眼检查，使用标记专一性抗体检测细胞表面分化标记，或鉴定分泌的分化标记确定细胞的分化。
在另一个例子中，可以通过与蛋白组芯片一起培养细胞测定特定细胞类型的细胞程序死亡因子。例如，可以通过肉眼检查，使用标记专一性抗体检测细胞表面细胞程序死亡标记，或鉴定分泌的标记或释放到培养基中的其他细胞成分分析细胞程序死亡。
在另一个例子中，可以通过与本发明的蛋白组芯片一起培养细胞分析细胞对蛋白组芯片上的蛋白的分泌反应。例如，可以通过检测培养基中的释放化合物分析分泌的蛋白和其他细胞化合物。
在另一个例子中，例如，可以通过与本发明的蛋白组芯片一起培养一种或多种细胞并且分析聚集作用，分析蛋白组芯片上的蛋白介导细胞聚集的能力。另外，举例来说，还可以通过与蛋白组芯片一起培养细胞和细胞外基质成分，并且分析所述细胞或细胞外基质成分与芯片上的蛋白的增强了的亲和力，分析所述蛋白介导与细胞外基质的亲和力的能力。例如，通过这种分析方法确定的相互作用剂，可能在癌、细胞转移、突触发生、树状生长、加工延长、或轴突延伸中发挥作用。
在另一个例子中，可以测定本发明蛋白组芯片的蛋白对离子转运，或其他小分子转运(例如ATP)的影响。例如，所述探针细胞可以是用放射性标记过的离子或其他小分子预先加载的，并且与本发明的蛋白组芯片一起培养。可以在所述细胞与所述蛋白组阵列的细胞接触的不同时间点上测定放射性标记的保留或释放。另外，可以用本领域已知的电生理学技术检测并且表征离子转运。
在另一个例子中，例如，可以通过与在芯片上具有放射性或荧光标记的蛋白的蛋白组芯片一起培养细胞，并且测定蛋白组芯片上信号的增强或减弱，或测定所述细胞对标记蛋白的摄取分析细胞对蛋白组芯片上的蛋白的摄取和/或加工。
另外，本发明的蛋白组芯片可以与细胞和感兴趣的标记过的化合物一起培养，以便检测和/或测定所述细胞对所述化合物的摄取和/或加工。
还可以通过用诸如，但不局限于ATP，GTP，cAMP，磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，和磷酸苏氨酸的小分子检测，在无细胞系统中分析小分子(即MW＜500的化合物＝与蛋白组芯片上的蛋白的相互作用。所述分析可以鉴定一个物种中能与感兴趣的小分子相互作用的所有蛋白。感兴趣的小分子可以包括，但不局限于药物、药物候选物、杀真菌剂、杀除草剂，杀虫剂，致癌剂和污染剂，被用作本发明方法的探针的小分子优选是非蛋白有机化合物。
在另一个实施方案中，可以通过让感兴趣的受体与本发明的蛋白组芯片接触，鉴定一个物种中特定配体或配体类型的所有受体。另外，通过特定受体或感兴趣的受体家族鉴定的一个物种的所有配体，可以通过让感兴趣的受体与本发明的蛋白组芯片接触鉴定。在另一个实施方案中，一个物种的能够抑制或阻止特定受体-配体复合物形成的所有蛋白可以通过让一种受体和它的配体与本发明的蛋白组芯片接触，并且确定与在没有所述芯片上的蛋白的条件下受体-配体相互作用的程度相比，受体-配体相互作用是否受到了抑制。受体-配体相互作用的检测和配体相互作用剂的鉴定，可以用本领域已知方法完成。
在另一个实施方案中，例如，一个物种的所有激酶目标可以用以下方法鉴定：在存在标记过的磷酸的条件下，让激酶与本发明的蛋白组芯片接触，用本领域已知的方法检测磷酸化的相互作用剂。另外，一个物种的几乎所有的激酶可以通过让可以被磷酸化的底物与本发明的蛋白组芯片接触，并且通过，例如，使用对磷酸化氨基酸专一的抗体分析磷酸化底物的存在和/或含量进行鉴定。在另一个实施方案中，可以通过让激酶和它的底物与本发明的蛋白组芯片接触，并且确定与在没有所述芯片的蛋白的情况下的磷酸化水平相比所述底物的磷酸化是否减弱了，鉴定一个物种的几乎所有激酶抑制剂。
激酶活性的检测方法为本领域所公知，并且包括，但不局限于使用放射性标记(例如，33P-ATP和35S-γ-ATP)或与磷酸氨基酸结合的荧光抗体探针标记。
类似地，可以进行分析，以便鉴定一个物种的所有磷酸酶，和磷酸酶的抑制剂。例如，尽管整合到蛋白中的放射性标记过的磷在一种测定中表示激酶活性，可以用另一种测定方法测定释放到培养基中的放射性标记过的磷，由它表示磷酸酶活性。
还可将本发明的蛋白组芯片用于区分不同的细胞类型(区分它的形态或功能)，例如，通过让蛋白组芯片与表示不同细胞群体的细胞或细胞提取物接触，并且比较在所述蛋白组芯片上的蛋白-探针相互作用的形式。该方法还可用于表征，例如，不同的细胞周期阶段，疾病状态，改变了的生理学状态(例如，缺氧)，在治疗(例如，药物治疗)之前或之后的生理学状态，代谢状态，分化阶段，发育阶段，对环境刺激(例如，光、热)的反应，对环境毒素(例如，杀虫剂，除草剂，污染)的反应，细胞-细胞相互作用，细胞专一性蛋白表达，和疾病专一性蛋白表达。
蛋白-蛋白相互作用的发展特征，可用于表征与各个发育阶段相关的信号传导途径、代谢途径等，并且说明发育阶段之间的过渡。通过该研究获得的大量信息可用于鉴定每个阶段的药物目标，和/或在发病过程中制定治疗方案。
本发明的蛋白组芯片可以与细胞提取物一起培养，以便表征特定的细胞类型，对刺激的反应，或生理学状态。因此，在一种典型实施方案中，可以将本发明的蛋白组芯片与来自用一种化合物(例如，药物)处理过的细胞，或来自细胞分化的特定阶段的细胞(例如，多能细胞)，或来自特定代谢状态的细胞(例如有丝分裂)的细胞提取物接触，并且分析例如，激酶，蛋白酶，糖苷酶，乙酰化酶，磷酸酶，和/或其他转移酶活性。
因此，蛋白组芯片上的蛋白-探针相互作用的形式，可以提供所述生物学状态的“标记”或“指纹”特征。例如，来自上述分析的结果比较了，例如，在有或没有药物的条件下的细胞，或在不同发育阶段的细胞，或处在不同代谢状态的细胞，这样可以提供每一种状态的标记，并且可以提供有关所述细胞在不同条件下的生理学变化的信息。
很显然，通过用多种探针(例如，已知的探针混合物，细胞提取物，亚细胞细胞器，细胞膜制剂，完整细胞等)筛选一个物种的蛋白组，所得到的蛋白-探针相互作用的分析可以构成鉴定一种细胞类型或细胞、组织、器官或系统的生理学状态的“指纹”或“标记”的基础。例如，所述信息可用于诊断、预测、药物测试、和药物发现。
相应地，本发明的蛋白组芯片可用于确定药物与该芯片上蛋白的相互作用。另外，本发明的蛋白组芯片可用于表征药物与复合蛋白混合物的作用，例如，完整细胞，细胞提取物或组织匀浆物。例如，可以让蛋白组芯片与复杂的蛋白混合物接触，并且分析了在有或没有药物的情况下，蛋白混合物与芯片上蛋白的相互作用的改变。
因此，可以通过用药物处理过的细胞、组织或提取物筛选一个或多个蛋白组芯片，分析一种药物的净作用(net effect)，然后可以提供所述药物治疗状态的“标记”，并且在与非治疗状态的“标记”比较时，可以预测有关例如，效力、毒性和副作用的结果。另外，例如，通过将所述药物添加到所述细胞、细胞提取物、组织匀浆物或完整生物体中，并且将在不同的处理时间点制备的药物处理过的细胞或提取物涂敷到蛋白组芯片上，可以分析一种药物的时间决定型作用。所述分析可用于疾病的诊断或预测。
具体地讲，本发明的蛋白组芯片可用于表征一种药物的作用模式，确定药物专一性，预测药物毒性，并且用于药物发现。例如，与一种药物结合的蛋白的身份，及其相对亲和力可以通过以下方法测定：在不同的测定条件下，让一种药物或药物候选物与蛋白组芯片一起培养，通过确定药物是否结合在所述阵列上确定药物专一性，并且测定每一种不同的蛋白结合的药物的数量。
本发明的蛋白组芯片可用于确定疾病状态，例如，包括让蛋白组芯片与病变细胞，来自病变组织的细胞提取物或组织匀浆物，或来自患有疾病的患者的体液接触，并且比较患者和健康对照的蛋白组芯片上的蛋白-探针相互作用的形式。所述分析可以提供所述病变状态的“标志”，并且在与健康状态的“标志”比较时，可以预测相对所述疾病诊断或预测的结果。另外，例如，可以通过在所述蛋白组芯片上分析不同发病阶段的生物学制剂，表征一种疾病的阶段。
还可以在相同的蛋白组芯片，或相同的第二个芯片上进行生物学活性的生物学测定，而不是结合测定。因此，使用本发明蛋白组芯片的所述类型的测定方法可用于研究药物专一性，预测药物的潜在副作用，并且对药物进行分类。
另外，本发明的蛋白组芯片适用于筛选药物候选物的复杂的文库。具体地讲，所述芯片上的蛋白可以与药物候选物文库一起培养，然后，可以鉴定结合的成分，例如，通过质谱分析鉴定，这样可以同时鉴定优先与特殊的蛋白亚型结合，或与所述芯片上的若干种蛋白结合的所有文库成分。另外，可以确定所述阵列上不同蛋白的药物候选物的相对亲和力。
另外，可以在存在潜在的抑制剂、催化剂、调节剂、或观察的相互作用的增强剂、酶促活性、或生物学反应的条件下，检测本发明的蛋白组芯片。使用本发明的蛋白组芯片，所述策略性筛选可以鉴定在一个物种中表达的蛋白，所述蛋白，例如，能抑制药物的结合，抑制病毒感染，具有抑菌活性，具有抗真菌活性，缓解寄生虫感染，或特殊类型蛋白的生理学效应物。
可以用本发明的蛋白组芯片进行酶促反应，并且测定酶促活性。在一种具体实施方案中，可以鉴定能调节芯片上蛋白的酶促活性的化合物，例如，可以通过将一种化合物或化合物的混合物与酶促反应混合物一起培养，以便产生一种信号(例如，在酶促活性作用下底物会发出荧光)，检测并且定量酶促活性水平的改变。可以表征在有和没有测试化合物的条件下的差异。另外，可以通过比较对蛋白组芯片内的样品的相对作用和芯片之间的相对作用检测化合物对酶促活性影响的差异。
使用本发明的蛋白组芯片的多种方法可用于确定各种蛋白的物理和功能特征。例如，可以通过用抗体检测将所述蛋白组芯片用于评估蛋白的存在和存在的数量。所述蛋白可以用标准检测分析方法检测，如发光、化学发光、荧光、化学荧光、或质谱分析。例如，针对感兴趣的蛋白的一级抗体可以由荧光标记的二级抗体识别，然后用一种仪器(例如，分子动态扫描器(Molecular Dynamics scanner))测定，该仪器能用一个光源激发荧光产物，并且随后检测荧光。为了获得更高的灵敏度，针对感兴趣的蛋白的一级抗体是由与诸如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶结合的二级抗体识别的。在存在发光底物(例如化学发光)或产荧光底物(例如化学荧光)的条件下，酶促裂解产生了强的发光或荧光产物，这些产物可以通过使用，例如，分子动态扫描器检测和定量。另外，可以用碱性磷酸酶结合的或辣根过氧化物酶结合的三级抗体放大荧光标记的二级抗体的信号。
在一个实施方案中，本发明的蛋白组芯片可以用针对一个物种的已知蛋白的抗体检测，以便可以鉴定另一个物种的蛋白组中具有识别表位的同源蛋白。可以获得相互作用剂的相同物种的同系物，例如，通过使用所述同源蛋白的DNA序列信号鉴定其他物种中的同系物。在具体实施方案中，所述抗体是针对细胞周期蛋白，激酶，GST，Clb5，Cla4，Ste20，Cdc42，PI(3，4)P2，PI(4)P，SPA2，CLB1，CLB2或Cdc11的。
在另一个实施方案中，本发明的含有第一个物种的本发明的蛋白组芯片可以用来自第二个物种的蛋白检测，以便鉴定相互作用剂。然后可以鉴定并且表征来自第一个物种的相互作用剂在第二个物种中的同系物，例如，通过核苷酸序列分析进行。因此，当所述蛋白组不能用于特定的物种时，该方法可用于寻找能与感兴趣的蛋白相互作用的相同种类的蛋白。
本发明的蛋白组芯片可用于鉴定存在于一个物种中的每一种酶的该物种中的几乎所有的底物。因此，可以在本发明的蛋白芯片上鉴定蛋白激酶，磷酸酶，蛋白酶，糖苷酶，乙酰化酶或其他基团转移酶的底物。
在一个实施方案中，可以通过使用标准测定方法(例如质谱分析，针对肽片段的荧光标记的抗体，或来自荧光标记的底物的荧光信号的消失)通过鉴定由蛋白酶活性产生的并且释放到培养基中的肽片段检测蛋白酶活性。因此，可以通过若干种方法，使用任何检测方式，方便地分析基团转移酶的活性，这些方法为本领域普通技术人员所了解。
本发明的蛋白组芯片可用于鉴定任何化合物在一个物种中几乎所有的结合蛋白。因此，可以将蛋白组芯片用于鉴定和表征能结合，例如，激酶，蛋白酶，激素，DNA，RNA，磷酸酶，蛋白酶，糖苷酶，乙酰化酶，或其他基团转移酶的几乎所有蛋白。因此，所述芯片可以用一种探针检测，并且分析蛋白-探针相互作用和/或分析需要的活性。例如，如果RNA结合是感兴趣的活性的话，用RNA检测所述蛋白组芯片，并且鉴定蛋白-RNA复合物。
例如，本发明的蛋白组芯片可用于鉴定一个物种的能与膜相关蛋白或其他膜相关化合物结合的几乎所有蛋白，包括让所述芯片与诸如完整细胞、质膜制剂、膜小泡、或含有感兴趣的膜成分的脂质体接触，并且检测蛋白-探针相互作用。在一种具体实施方案中，所述探针是含有一种或多种感兴趣的磷脂的脂质体形式的。所述蛋白-探针相互作用，可以用本领域已知技术检测。所述相互作用剂和/或探针的身份可以用本领域已知技术确定。另外，还可以用本领域已知技术检测生物学活性(例如，酶活性，细胞活化)。
被用作恢复或非恢复患者的免疫反应的抗原的来自病原体的靶蛋白(例如，传染性致病剂，如病毒、细菌、真菌、或寄生物)或来自其他异常细胞(例如，肿瘤细胞，病变细胞或受损细胞)的靶蛋白的身份，可以使用本发明的蛋白组芯片确定。例如，从患者体内分离的淋巴细胞可用于筛选包括所有病原体蛋白的芯片。一般，所述筛选包括让一个蛋白组芯片与多种淋巴细胞接触，其中，所述蛋白组芯片上的蛋白包括多种潜在的抗原，并且检测在所述芯片上出现淋巴细胞激活作用的位置。在一种具体实施方案中，让淋巴细胞与蛋白组芯片上的病原体蛋白接触，然后分析抗原或抗原组合物对B细胞或T细胞的激活作用，以便鉴定来自一种病原体的靶抗原。
另外，本发明的蛋白组芯片可用于表征免疫反应，例如，通过用患者的淋巴细胞筛选传染性生物体的蛋白组，以便鉴定患者B细胞和/或T细胞的目标。例如，B细胞可以与本发明的蛋白组芯片一起培养，以便鉴定体液型免疫的抗原性目标。
在另一个实施方案中，可以将本发明的蛋白组芯片用于检测并且表征自身免疫性或导致过敏的蛋白的物质。例如，可以用患者的淋巴细胞或患者的循环抗体筛选人类蛋白的蛋白组，以便鉴定患者B细胞和/或T细胞的目标。所述筛选可以表征自身免疫性或过敏反应，并且鉴定潜在的目标药物候选物。
在一个实施方案中，可以将本发明的蛋白组芯片用于鉴定能够激活B细胞和/或T细胞的物质。例如，让淋巴细胞与蛋白组芯片接触，并且分析淋巴细胞的激活，以便鉴定具有激活B细胞或T细胞或淋巴细胞亚群体(例如细胞毒性T细胞)的一般能力的物质。
可以通过各种方法分析由抗原识别诱导的B-细胞激活作用，所述方法包括，但不局限于检测或测定抗体合成，3H-胸苷的整合，标记过的抗体与新表达的或受到抑制的细胞表面分子的结合，以及表示B细胞激活的因子(例如，细胞因子)的分泌。类似地，使用本发明的蛋白芯片筛选的T细胞激活作用，可以通过各种分析方法确定。例如，铬(51Cr)释放分析，可以检测抗原的识别以及随后的细胞毒性T细胞的激活(例如，参见Palladino等，1987，Cancer Res.47：5074-9；Blachere等，1993，J.Immunotherapy 14：352-6)。
可以通过使用本发明的蛋白组芯片确定抗体制剂的专一性，包括让所述芯片与一种抗体制剂接触，并且检测在固体支持物上发生与抗体制剂中的抗体结合的位置。所述抗体制剂可以是，但不局限于Fab片段，抗血清，和多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，单链抗体，人源化抗体或合成抗体。在一个例子中，用单克隆抗体检测蛋白组芯片，以便表征它的结合强度和/或它的专一性。在具体实施方案中，所述抗体是针对细胞周期蛋白，激酶，GST，Clb5，Cla4，Ste20，Cdc42，PI(3，4)P2，PI(4)P，SPA2，CLB1，CLB2或Cdc11的。
本发明的蛋白组芯片可用于鉴定能结合感兴趣的特定生物学分子的蛋白，包括，但不局限于潜在配体分子的受体，病毒受体，和孤儿受体的配体。
所述蛋白组芯片还可用于检测DNA或RNA与所述芯片上的蛋白的结合，并且用于评估结合专一性和强度。所述DNA可以是单链或双链的。所述RNA可以是mRNA，hnRNA，polyA+RNA或总RNA。
本发明的蛋白组芯片可用于鉴定进行过翻译后修饰的蛋白。可以用本发明的方法检测的翻译后修饰包括，但不局限于甲基化，乙酰化，法尼化，生物素化，硬脂酰化，甲酰化，硫辛酸，肉豆蔻酰化，棕榈酰化，香叶基香叶酸化，聚乙二醇化，磷酸化，磷酸化，糖基化，糖修饰，脂化，脂修饰，遍在化，sumolation，二硫键，半胱氨酸化，氧化，谷胱甘肽化，焦谷氨酸，羧基化和脱氨基化。另外，还可以用戊糖，己胺，N-乙酰己胺，脱氧基己糖，己糖和唾液酸对蛋白进行翻译后修饰。
在一个实施方案中，可以用磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸检测本发明的蛋白组芯片，以便鉴定磷酸化相互作用剂。在另一个例子中，可以用凝集素(例如，小麦胚凝集素)检测本发明的蛋白组芯片，以便鉴定糖基化相互作用剂(例如，N-乙酰葡糖胺)。可以用本领域已知方法检测磷酸化或糖基化相互作用剂。
本发明的蛋白组芯片还可用于鉴定和表征在功能、配体结合或酶促活性方面表现出差别的蛋白同种型。在一种具体实施方案中，，本发明的蛋白组芯片被用于通过评估其彼此之间的相对活性，表征来自不同等位基因的蛋白同种型的不同的结合亲和力。
在一个实施方案中，可以用本发明的蛋白组芯片确定共有序列。例如，在用一种结合剂(它可以来自不同于芯片上的蛋白的物种的物种)筛选蛋白组芯片，可以比对相互作用剂的氨基酸序列，以便构建相互作用结构域的共有序列。例如，所述信息可用于设计结合剂-相互作用剂相互作用的抑制剂，或用于设计特定相互作用剂或相互作用剂的类型的新的和/或改进的结合剂。
在一种具体实施方案中，钙调蛋白-结合蛋白的共有序列是通过用钙调蛋白筛选蛋白组芯片确定的。在另一个实施方案中，钙调蛋白-结合蛋白的共有序列包括以下氨基酸序列I/L-Q-X-K-K/X-G-B(SEQ IDNO：1)。在另一个实施方案中，钙调蛋白-结合蛋白的共有序列包括以下氨基酸序列I/L-Q-X-K-K/X-G-B(SEQ ID NO：1)。在另一个实施方案中，钙调蛋白-结合蛋白的共有序列包括以下氨基酸序列I/L-Q-X-K-K/X-G-B(SEQID NO：1)，并且其长度小于10，15，30，50或100个氨基酸残基。
本发明的蛋白组芯片还可用于鉴定一类潜在的抗细菌、抗真菌、抗寄生虫或抗病毒化合物。例如，可以让细菌、真菌、寄生物或病毒的细胞裂解物或其他制剂与蛋白组阵列接触，并且检测和鉴定蛋白-探针相互作用。另外，通过比较从传染阶段和非传染阶段的传染性生物体中获得的相互作用形式，可以鉴定与有关宿主的感染相关的相互作用。
可以通过将一个文库与本发明的蛋白组芯片一起培养，实施噬菌体展示文库的筛选。与所述芯片上的蛋白结合的克隆的检测可以通过本领域已知的各种方法进行(例如，质谱分析)，以便确定感兴趣的克隆。然后，可以通过标准方法确定编码感兴趣的克隆的DNA(例如，参见Ames等，1995，J.Immunol.Methods 184：177-86；Kettleborough等，1994，Eur.J.Immunol.24：952-8；Persic等，1997，Gene 187：9-18)。这样，可将所述芯片用于筛选具有能结合所述芯片上的特殊蛋白的表面成分的细胞。
5.5试剂盒
本发明还提供了用于实施本发明分析方案的试剂盒。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包括本发明的一种或多种蛋白组芯片。所述试剂盒还可以在一个或多个容器中包括用于分析蛋白或分子的生物学活性的试剂，用于分析蛋白-探针相互作用的试剂，和/或一种或多种探针、蛋白或其他分子。所述用于分析蛋白或其他分子的生物学活性，或分析探针和蛋白或其他分子之间的相互作用的试剂可以添加在所述探针上，结合在蛋白组芯片上，或者容纳在蛋白组芯片的一个或多个孔中。所述试剂可以是溶液或固体形式的。所述试剂可以包括进行感兴趣的分析所需要的蛋白或其他分子和探针。
所述蛋白组芯片的蛋白可以结合在平的固体支持物的表面上，容纳在固体支持物的孔中，或结合在固体支持物上的孔的表面上。在一个实施方案中，所述试剂盒中的蛋白组芯片具有业已结合在固体支持物上的蛋白和/或探针。在另一个实施方案中，所述试剂盒中的蛋白组芯片具有可用于分析蛋白或其他分子的生物学活性，或用于分析探针和蛋白或业已结合在固体支持物上的孔上的其他分子的相互作用的试剂或反应混合物。在另一个实施方案中，所述试剂不与固体支持物的孔结合，而是容纳在所述孔中。在另一个实施方案中，所述试剂不与固体支持物的孔结合，而是容纳在一个或多个容器中，并且可以添加到所述固体支持物的孔中。在另一个实施方案中，所述试剂盒还包括一个或多个装有用于分析蛋白或分子的生物学活性的溶液反应混合物的容器。在另一个实施方案中，所述试剂盒提供了一种基质(例如，珠)，感兴趣的蛋白或分子，和/或用于进行一种或多种分析的其他试剂，可以与所述基质结合，然后，可以将具有结合的探针、蛋白、或其他试剂的基质放入芯片的孔中。
5.6阳性鉴定算法(positive identification algorithm)的设计。
本发明还提供了一种用于鉴定一种信号是否是阳性的方法。信号可以是任何可检测形式的，包括，但不局限于可见光，紫外线辐射，红外线辐射，X射线，荧光和比色观察。
在一种优选实施方案中，信号是通过质谱分析检测的。
另外，信号可以是任何排列的，并且是任何物理形式的，例如，但不局限于阵列，印迹，凝胶和筛网。信号优选是静态排列的斑点。
在另一种优选实施方案中，信号是通过荧光产生的，并且在一个阵列上排列成格栅形式。这样，就可以给信号确定一个相对行和列的位置坐标。所述行和列可以具有任何宽度。
过滤信号的第一个步骤是计算每一个斑点的局部主要信号和背景信号。所述局部主要信号是由实际斑点发射的，而所述局部背景信号是由紧靠所述斑点周围的边界部位发射的。将净信号(它是局部主要信号-局部背景信号)用于所有进一步的计算。所述局部主要信号和背景信号可以通过诸如GENEPIXTM的软件确定。
不过，芯片之间的差异——它体现了，例如，不同的脂结合实验和芯片上的局部波动(例如，由于基质的不均等的扩散)可能导致信号强度的进一步波动，导致了不同芯片的不同的净信号分布。为了纠正芯片之间的波动，来自不同芯片的净信号需要标度至一个共同的范围。选择若干个芯片中的一个作为参考芯片，并且其目标是将每一个芯片的净信号分布标度成所述参考芯片的净信号分布的范围和形状。
例如，可以计算每一个芯片的净信号分布的下部1/4，中间1/4和上部1/4的值。然后，对于每一个芯片来说，从每一个斑点的净信号中扣除所述中间净信号。另外，计算了每一个芯片的标度系数，它等于特定芯片的上部1/4和下部1/4之间的差和参考芯片的上部1/4和下部1/4之间的差的比例。这表明所述参考芯片的标度系数等于1。然后，用所述芯片专一性标度系数乘以每一个芯片的净标度信号，以便计算标度的净信号。
为了校正一个阵列上的局部波动，可以对每一个斑点进行“邻居扣除(neighborhood subtraction)”。例如，相邻部位可以被定义为一个信号斑点的上下两行和左右两列之间的区域。然后从该斑点信号中扣除所述中间信号，以便计算相对该斑点的相邻部位的剩余信号。在任何相邻区的具有高信号强度的斑点的数量都足够少，以便所述中间值不会显著影响，并且能很好地体现相邻区的背景信号。
对标度的净信号实施相邻扣除产生了标度的多余信号(scaledexcess signals)。在随后的步骤中，比较了平行样品的标度的剩余信号。如果两个平行样品的标度剩余信号的平均值和平行样品之一的标度剩余信号的差，大于所述标度剩余信号误差的标准差3倍以上的话，所述斑点就属于以上两个平行样品，并且被排除在进一步分析之外。然后将其余的斑点和它们的标度剩余信号提供在过滤信号组中。
可以按以下方法计算所述标度剩余信号的误差及其标准差的分布。对整套的平行样品进行线性回归，以便确定平行样品之间的总体线性关系。然后可以计算每一个平行样品的误差值：
εG＝|G2-Gm|，
其中，
G1和G2表示两个平行样品的两个标度的剩余信号。
Gm＝(G1+G2)/2，
而函数f(G1)＝a*G2+b是两个平行样品G1和G2之间的总体线性关系，参数a和b是通过线性回归确定的。
整套的误差值是所有平行样品的一套误差值，并且表示标度的剩余信号的误差值的分布。然后可以计算该分布的标准差。
最后，如果一对平行样品的过滤信号的平均值比标度的剩余值的误差的高3个标准差的话，就认为这一对平行样品是阳性的(注意，该阈值独立于确定平行样品是否应当被排除在过滤信号组之外的阈值)。
在所述过滤过程之后，用GST信号(R)将过滤的信号(G)统一化(normalized)，得到了比例r＝G/R，该比例可以衡量单位数量蛋白的结合，并可以比较不同蛋白的结合信号。所述特定的结合比例r对于G和R信号的误差εG和εR敏感。使用Monte-Carlo方法，可以计算该比例的90％和95％的置信间隔。R值的误差eG与εG和εR相关：
r+εR＝(G+εG)/(R+εR)
其中，εR表示比例r的误差。
对于Monte Carlo方法来说，εG和εR的分布必须是已知的。εG的分布可以按上述方法计算。εR的分布可以按计算εG的相同方法计算，使用平行样品的GST信号对作为输入数据。
Monte Carlo方法如下：
为了确定r+εR的置信度间距，需要计算r+eR的随机样品群体。所述样品可能来自εG和εR的随机样品。可以按以下方法计算εG的随机样品。用标准随机数字发生器计算在0和1之间均匀分布的随机数字的样品。通过εG的分布，用标准方法确定eG的逆累计分布函数。用随机数字的样品作为该函数的自变量产生了εG的一组随机样品。同样，可以计算εG的一组随机样品。这些εG和εR的随机样品可以组合成公式r+εR＝(G+εG)/(R+εR)，以便产生r+εR的一群随机样品的群体。
在一个实施方案中，本发明提供了用于确定一种信号是否是阳性的方法，包括以下步骤：确定每一个局部斑点的主要信号和背景信号，并且确定来自这两种信号的差的净信号，确定第一和第二净信号分布的下部1/4、中间和上部1/4值，从第一净信号分布中扣除第一中间值，并且从第二净信号分布中扣除第二中间值，以便分别获得第一和第二扣除值，用所述第一信号分布的上部和下部1/4值的差除所述第一扣除值，并且用所述上部和下部1/4值除所述第二标度值，以便分别获得第一和第二标度值，计算相邻区的标度信号分布的中间值，其中，所述相邻区包括在所述部位的多个位点；从标度信号中扣除局部中间值，以便获得标度的剩余值；并且如果所述样品值之一和它的平行值的差，超过所述标度的剩余值误差的3个标准差的话，就将标度剩余值的平行样品排除在外。
可以利用过滤值确定一种信号是否是阳性的。如果平行样品的过滤值的平均值大于标度剩余值误差的标准差3倍的话，该平行样品就被称为“阳性的”。可以用以下公式将过滤的阳性信号统一化：
r＝G/R，
其中，G是过滤值，R是GST信号，而r表示单位数量蛋白的信号，可以对不同斑点的信号进行比较。比例r对G和R的误差敏感。该敏感性可以通过计算r+εr＝G+εG/R+εR的置信度间隔评估。
εG是G的误差，εR是R的误差，而εr是r的误差。
在一个特定实施方案中，阳性信号表示蛋白-探针相互作用。在另一个特定实施方案中，相邻区位于有关信号上面两行，下面两行，左面两列和右面两列。在另一个特定实施方案中，将两个平行样品的数据点排除在进一步分析之外，其中，所述样品的标度剩余信号及其平均值之间的差，超过标度剩余信号误差3个标准差。如果数据点明显不真实的话，就将所述数据点排除在外。
6.实施例
用高处理量技术制备了来自芽殖酵母的超过5800种蛋白的特定组合，并且筛选了多种活性，包括蛋白-蛋白，蛋白-DNA，蛋白-RNA和蛋白-脂质体相互作用。鉴定了大量的新的活性，提供了有关已知的和以前未表征过的基因的新的信息。
为了便于研究酵母蛋白组，克隆并且超量表达了5800种开放读框，并且纯化了相应的蛋白。将所述蛋白以高空间密度的方式印刷在载玻片上，以便形成酵母蛋白组芯片微阵列，并且筛选其与蛋白和磷脂相互作用的能力。鉴定了多种新型钙调蛋白和磷脂-相互作用蛋白；鉴定了多种钙调蛋白-结合蛋白的共同的潜在结合基序。所述研究证实了可以制备整个真核生物基因组的微阵列，并且筛选大量的生物化学活性，导致了多种新型蛋白功能/相互作用的鉴定。还可以筛选所述微阵列，以便检测蛋白翻译后修饰。
6.1酵母培养物制备
1.用96-叉子将在-80℃下保存96孔平板上的酵母甘油原种接种到URA琼脂平板上(Omni，USA)。
2.在30℃下让所述培养物在琼脂上生长48小时，并且可以观察到可见菌落(直径2mm)。
3.用96-叉子将来自琼脂平板的酵母细胞接种到96孔2毫升盒子中，其中，每一个孔容纳有300μl URA-/棉子糖液体培养基和一个直径2毫升的玻璃球，它有助于均匀生长。
4.在30℃下剧烈摇晃(300rpm)培养16小时使O.D.600达到4.0之后，将15μl相同的菌株接种到在4个不同盒子中的750μl的URA-/棉子糖液体培养基中，以便获得3毫升培养物。同样，每一个孔装有相同的玻璃球，以便实现通气和均匀生长。所述细胞是在30℃下剧烈摇晃生长的。
5.在生长12-16小时之后，所述培养物的O.D.600应当达到0.6-0.8。如果OD超过1.0的话，就将培养物扔掉。使用自动液体处理装置(Q-Fill，Genetix，UK)将40％半乳糖母液添加到每一个孔中，达到2％的最终浓度，以便诱导细胞。在30℃下摇晃诱导所述培养物4小时。
6.通过以3000rpm的速度离心2-10分钟收获所述细胞，并且通过涡旋搅拌，将细胞沉淀重新悬浮在100-1000微升的冷水中。然后将来自4个孔的相同的菌株合并到一个孔中。通过离心收集细胞，并且重新悬浮在100-1500微升放置在冰上的不含蛋白酶抑制剂的冷的裂解缓冲液中。通过短时间的离心收集收获的细胞，并且扔掉裂解缓冲液。洗涤过的半干燥培养物马上保存在-80℃的冰箱中。该培养物可以保持数周时间。
6.2以96孔方式纯化蛋白
1.将96孔盒子中的冰冻培养物从-80℃转移到冰上，并且将10-300μl锆珠(直径0.5mm，购自BSP，德国)添加到每一个孔中。当所述培养物仍然冰冻时，添加新鲜蛋白酶抑制剂的100-500μl裂解缓冲液。用盖垫密封每一个孔。在冰上解冻所述培养物5-25分钟之后，在冰上对96孔盒子中的细胞进行涡旋搅拌3-6次，每次20-60秒，间隔1-5分钟。为了有效裂解酵母细胞壁，并且一次处理多个平板，用颜料振荡器(HARBILTM5G HD，36kg容量，可调压力和振动时间，固体速度为每分钟200次)剧烈搅拌所述样品。
2.在以3000rpm的速度离心2-10分钟之后，用广口吸头(Fisher，USA)收集上清液，并且转移到96孔过滤平板(Whatman，USA；Whatman UNIFILTERTM，产品目录号7700-1801，具有800μl孔容量的亲水性PVDF滤膜)上，该平板放置在96孔盒子的顶部。
3.为了获得更多的蛋白，将含有新的蛋白酶抑制剂的100-500μl裂解缓冲液添加细胞碎片中，并且重复步骤1和2。
4.合并细胞裂解液，并且在3000rpm的速度下，用10-30分钟时间通过所述过滤平板离心进入冷的、并且干净的96孔盒子中。每一个孔中的过滤裂解液的体积大致为200-1000μl。
5.同时，用不含蛋白酶抑制剂的冷的裂解缓冲液洗涤所需数量的谷胱甘肽珠(大体上为每个样品10-50μl的珠)(Amersham，USA)4次，并最终悬浮在5倍于它的原始体积的含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。
6.将100μl洗涤过的谷胱甘肽珠添加到每一个孔中，并且用盖垫紧密密封。将所述珠与裂解液一起放在转鼓上，在4℃下培养1小时。为了获得最佳混合，让所述盒子在转鼓上旋转360度。
7.通过以3000rpm的速度离心10-60秒收集所述珠，并且扔掉上清液。用200-800μl的含有蛋白酶抑制剂的缓冲液I洗涤所述珠1次，并且用不含抑制剂的缓冲液洗涤2次。
8.然后用200-800μl洗涤缓冲液II洗涤所述珠3次。在完全除去缓冲液之后，将20-50μl洗脱缓冲液添加到每一个孔中。用于洗脱步骤的过滤平板包括具有对蛋白的低亲和力的材料(MILLIPOREMULTISCREENTM，产品目录号MADVN6550，它具有容量为200μl孔的亲水性PVDF滤膜)。对所述盒子进行短时间的涡旋搅拌，以便重新悬浮所述珠，并且在4℃下在转鼓上培养1小时。
9.将洗脱液/珠混合物转移到冷的过滤平板上(Millipore，USA)上，并且通过在4℃下以3000rpm的速度通过所述过滤平板离心0.5-2分钟，将洗脱液收集到96孔PCR平板中。
10.将每一种纯化的蛋白分装到3个96孔PCR平板上，并且马上放入-80℃的冰箱保存。
裂解缓冲液
30-300mM      Tris pH 7.5
50-300mM      NaCl
0.1-10mM      EGTA
0.01-1.0％    TritonX-100
0.01-1％      β-巯基乙醇(″BME″)
0.1-3mM       苯甲基黄酰氟(″PMSF″)
Roche蛋白酶抑制剂片(含有EDTA)
BME，PMSF和抑制剂片是新添加的。
洗涤缓冲液I：
30-300mM      Tris pH 7.5
300-600mM     NaCl
0.1-10mM      EGTA
0.01-1.0％    TritonX-100
0.01-1％      β-巯基乙醇(″BME″)
0.1-3mM       PMSF
Roche蛋白酶抑制剂片(含有EDTA)
BME，PMSF和抑制剂片是新添加的。
洗涤缓冲液II：
50-200mM   HEPES  pH 7.5
50-300mM   NaCl
1-15％     甘油
洗脱缓冲液：
50-200mM   HEPES pH7.5
50-200mM   NaCl
20-40％    甘油
5-40mM     谷胱甘肽(还原形式的)
洗脱缓冲液的pH大约为pH7.5。
6.3以高处理量96阵列方式制备蛋白的方法
制备含有几乎所有酵母蛋白的酵母蛋白组微阵列，并且筛选多种生物化学活性。将5800种酵母ORFs(占总数量的93.5％)的优质群体克隆到酵母高拷贝表达载体上，使用重组克隆技术(Mitchell等，1993，Yeast 9：715)。所述酵母蛋白的氨基末端与GST-HisX6融合，并且在半乳糖诱导型GAL1启动子的控制下，在酵母中表达(Zhu等，2000，Nat.Genet.26：283；Mitchell等，1993 Yeast 9：715)。所述酵母表达菌株含有独立的质粒，其中，通过DNA测序证实正确的酵母ORFs业已以框内形式正确地与GST融合。简单地讲，通过PCR扩增酵母ORFs，并且随同所述载体一起共同转入酵母细胞，以便制备表达克隆。所述质粒是在大肠杆菌中挽救的，并且对载体-插入片段结合部分进行测序(图1A)。如果克隆的ORF不是感兴趣的ORF的话，或者检测到读框位移的话，就重复所述克隆循环。一旦证实了一种构建体，就将所述质粒DNA重新导入酵母和大肠杆菌，以便产生永久性原种用于进一步分析(Zhu等，2000，Nat Genet.26：283)。通过重复所述克隆循环，成功地克隆了5800种不同的酵母ORFs，它占总ORF的93.5％。
为了制备用于生物化学分析的纯化蛋白，开发并且优化了用于以96孔方式制备蛋白的可靠的和高处理量的纯化方法。使用谷胱甘肽-琼脂糖珠，制备了酵母提取物，并且纯化了融合蛋白(有关96孔方式蛋白纯化方案，来自所有实验的完整的结果，以及阳性鉴定算法的设计的细节可以访问公共网站spine.mbb.yale.edu/protein～chips/)。所述裂解缓冲液和最初的洗涤液含有0.1％Triton，以便确保纯化的蛋白不含脂类。使用本发明的方法，在10小时以内可以从细胞中制备至少1152个蛋白样品。
通过60个随机样品的免疫吸印分析，监测纯化蛋白的质量和数量(图1B)。超过80％的菌株产生了具有预期分子量的可检测数量的融合蛋白。用手工印刷工具将3nl的1152种纯化蛋白重复点滴到载玻片(19)上，并且用多克隆抗GST抗体检测蛋白。超过85％的样品表现出超过背景的可见信号，与免疫吸印分析的结果吻合。使用本发明的方法，可以用在两周以内从6144(64×96孔盒子)个酵母菌株中纯化融合蛋白。
6.4制备蛋白组微阵列的方法
为了制备蛋白组芯片，使用市场上销售的微阵列仪，将表示5800种不同酵母蛋白的6566种蛋白制剂重复印刷到载玻片上。作为对照，同样印刷了已知数量的GST。采用了两种类型的载玻片。将乙醛处理过的显微镜载玻片用于起始实验(MacBeath等，2000，Science 289：1760)中，在这种情况下，融合蛋白通过N-末端的伯胺或所述融合蛋白的其他残基结合在载玻片表面上，导致了所述蛋白在载玻片表面上的相对随机的取向。在随后的实验中，将蛋白点滴在镍包被的载玻片上。在这种情况下，融合蛋白是通过它们的His X6标记结合的，以便所述融合蛋白的克隆的酵母部分基本上均匀地远离所述表面取向的。尽管成功地使用了两种类型的载玻片，对于我们的特定蛋白制剂来说镍包被的载玻片提供了明显更好的信号(图2A)。
为了确定有多少融合蛋白共价结合在不同的玻璃表面上，并且评估所述蛋白结合的可再现性，用抗GST抗体检测芯片。超过93.5％的蛋白样品能产生显著高于背景的信号(即超过蛋白的大约10fg)。在载玻片上同样印刷了具有已知数量的GST的对照，表明大约90％的斑点含有大约10-950fg的蛋白。图2A表示用荧光标记的抗体检测蛋白组芯片上的蛋白是极其灵敏的，即，信噪比很高，尽管仅将来自3毫升培养物的1/10000的纯化蛋白点滴在所述载玻片上。以上结果表明，能够以很高的分辨率将13000个蛋白样品轻易地点滴在标准显微镜载玻片的1/2面积上(2.5cm×7.5cm)((图2A和2B)。为了检验所述蛋白点滴的可再现性，对照比较了来自每一对重复斑点的信号。正如图2C中的尖峰所表明的，95％的信号在5％的平均值范围内(10)。
6.5使用蛋白组微阵列的方法
通过检测若干种典型类型的生物学活性测试蛋白组芯片：蛋白-蛋白相互作用，蛋白-核酸相互作用和蛋白-脂类相互作用。
一般地，按以下方法制备用于分析的蛋白组芯片。通过将印刷过的载玻片缓慢浸入BSA(1-3％(w/w)BSA，溶解在PBS缓冲液中；SIGMA，USA)或甘氨酸封闭缓冲液(30-300mM甘氨酸；50-300mMTris，pH 6.5-8.5；50-300mM NaCl；SIGMATM，USA)中，使蛋白一侧向上，封闭所述蛋白组芯片。通过2微米滤膜装置过滤所述缓冲液，以便除去颗粒。在检测碳水化合物-结合蛋白时优选甘氨酸。在4℃下，在封闭缓冲液中培养所述载玻片过夜，而不进行任何摇晃(扰动封闭缓冲液有可能导致玻璃表面上的蛋白脱落)。
探针蛋白通常是按以下方法制备的。酵母蛋白是用标准方法使用谷胱甘肽珠从50毫升培养物中通过亲和柱纯化的，而不从所述珠上洗脱。用冷的PBS缓冲液(pH8.0)(SIGMATM，USA)洗涤蛋白珠3-5次。将以0.1-50毫克/毫升的浓度溶解在PBS(pH8.0)中的大约1毫升硫代-NHS-LC-LC-生物素(PIERCE，产品目录号21338，USA)添加到谷胱甘肽珠中，并且在4℃下培养2小时。用冷的PBS缓冲液(pH8.0)洗涤所述珠5次，并且用100-500毫升洗脱缓冲液(50-200mM，HEPES pH 7.5；50-200mM NaCl；20-40％甘油；5-40mM谷胱甘肽)洗脱。优选能产生更弱的生物素化蛋白的方法。合并被生物素化到不同程度的不同批次的蛋白，以便将来使用。
6.5.1钙调蛋白-相互作用蛋白的鉴定
为了测试蛋白-蛋白相互作用，用钙调蛋白检测了酵母蛋白组(11)。钙调蛋白是高度保守的钙结合蛋白，它参与多种钙调控的细胞过程，并且具有很多已知的物理配偶体(Hook等，2001，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.41：471)。钙调蛋白是生物素化的，并且用Cy3-标记的链亲和素检测结合探针。作为对照，单独用Cy3-标记的链亲和素检测酵母蛋白组。
一般，可以按以下方法分析蛋白-蛋白相互作用。用PBS缓冲液洗涤封闭的蛋白组芯片3-5次，并且通过将载玻片垂直放在KIMWIPETM上轻轻敲打，除去玻璃表面上多余的液体。将200微升生物素化的蛋白探针添加到蛋白组芯片上，并且马上用疏水性塑料盖玻片(GRACEBIO-LABSTM，USA)覆盖。除去滞留在它们之间的气泡，并且将所述芯片放置在潮湿的培养箱中，在室温(RT)下培养1小时。为了去掉盖玻片，将所述芯片浸泡在大体积PBS缓冲液(＞50ml)中，并且将盖玻片漂走。然后将所述芯片转移到第二种PBS溶液(＞50ml)中，并且在室温下通过振动洗涤3×5分钟。在除去芯片表面上的多余液体之后，将至少150微升的Cy3-或Cy5-结合的链亲和素(PIERCE，USA；1∶2000-1∶4000稀释液)添加到其表面，并且用疏水性塑料盖玻片(GRACE BIO-LABSTM，USA)覆盖。在室温遮光培养所述芯片30分钟以上。然后按上述方法洗涤芯片。为了完全除去芯片上的液体，在室温下以1500-2000rpm的速度离心5-10分钟，使其干燥。
如果蛋白组芯片要用抗体筛选的话，可以按以下方法测试蛋白-抗体相互作用。用PBS洗涤封闭的蛋白组芯片3-5次，并且通过在KIMWIPETM上垂直地轻轻敲打载玻片，除去玻璃表面上多余的液体。将200微升一级抗体(用含有1-3％的BSA或0.1％TritonX-100的PBS适当稀释过)添加到蛋白组芯片上，并且马上用疏水性塑料盖玻片(GRACE BIO-LABSTM，USA)覆盖。在将滞留的气泡除去之后，将所述芯片放置在潮湿的培养箱中在室温下培养1小时。为了去掉盖玻片，将所述芯片浸泡在大体积的PBS缓冲液(＞50ml)中，并且将盖玻片漂走。然后将所述芯片转移到第二种PBS溶液(＞50ml)中，并且在室温下通过振动洗涤3×5分钟。在除去芯片表面上的多余液体之后，将超过150微升的Cy3-或Cy5-结合的二级抗体(用含有1-3％的BSA和TritonX-100的PBS适当稀释过)添加到它的表面，并且用疏水性塑料盖玻片(GRACE BIO-LABSTM，USA)覆盖。在室温下遮光培养所述芯片30分钟以上。然后按上述方法洗涤芯片。为了完全除去芯片上的液体，在室温下以1500-2000rpm的速度离心5-10分钟，使其干燥。
当在有钙的条件下用生物素化的钙调蛋白检测蛋白组芯片时，鉴定了6种已知的钙调蛋白目标，即Cmk1p，Cmk2p，Cmp2p，Dst1p，Myo4p和Arc35p(图3A)。Cmk1p和Cmk2p是I和II型钙/钙调蛋白决定型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它们两者都参与了配合反应的信号传导途径(Hook等，2001，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.41)。Cmp2p(Cna2p)是两种酵母钙调硫酸酶之一，并且业已证实能在体内与钙调蛋白相互作用(Cyert等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：7376)，Dstlp在转录延伸中发挥作用(Stirling等，1994，EMBO J.13：4329)，Myo4p是ASH1转录物正确定位所需要的V型肌球蛋白重链(Bohl等，2000，EMBO J.19：5514；Bertrand等，1998，Mol.Cell 2：437)。Arc35p是Arp2/3肌动蛋白-组构复合体的一种成分，它参与肌动蛋白的组装和功能，并且参与胞吞作用(Winter等，1999，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.96：7288)。最近在双杂交研究中证实了Arc35p能与钙调蛋白相互作用(Schaerer-Brodbeck等，2000，Mol.Biol.Cell 11：1113)，因此证实了本发明的表明Arc35p和钙调蛋白在体外相互作用的结果。在没有检测的六种已知钙调蛋白目标中，有两种在该集合体中是不存在的，而其余四种在GST检测实验中是检测不到的。除了已知相互作用剂之外，钙调蛋白探针鉴定了33种其他相互作用剂。这些相互作用剂包括多种不同类型的蛋白(参见表1；公共网站bioinfo.mbb.yale.edu/proteinchip)，与钙调蛋白在多种不同的细胞中发挥作用吻合。
除了钙调蛋白结合目标之外，还鉴定了一种结合Cy3-标记的链亲和素的蛋白Pyc1p。Pyc1p编码丙酮酸羧化酶1同系物，这种酶包括高度保守的生物素结合区(Menendez等，1998，Yeast 14：647)。因此，正如通过其序列预测的，Pyc1p是在体内生物素化的；并且在使用链亲和素检测方法的所有实验中都鉴定到了。因此，蛋白组微阵列可用于鉴定蛋白的翻译后修饰。
6.5.2钙调蛋白结合基序的鉴定
为了鉴定推测的钙调蛋白结合结构域，确定了不同的钙调蛋白结合目标(即相互作用剂)所共同拥有的氨基酸序列(Zhu等，2000，Nat.Genet 26：283)。39种钙调蛋白-结合蛋白中的14种包括一个基序，它的共有序列为I/L-Q-X-X-K-K/X-G-B(SEQ ID NO：1)，其中，X是任何残基，而B是碱性残基(图3B)。以前业已证实了肌球蛋白上的相关序列I-Q-X-X-X-X-K-X-X-X-R(SEQ ID NO：16)与钙调蛋白结合(Homma等，2000，J.Biol.Chem 275)。以上结果表明，基序I-Q-X-X-X-X-K-X-X-X-R(SEQ ID NO：16)存在于多种钙调蛋白结合蛋白中。缺乏该基序的其他钙调蛋白结合相互作用剂可能具有其他钙调蛋白结合序列。
6.5.3 ATP/GTP-结合蛋白的鉴定
1.用冷的PBS缓冲液洗涤封闭的蛋白组芯片3-5次，并且通过在KIMWIPETM垂直地轻轻敲打载玻片，除去玻璃表面上多余的液体。
2.将100微升ATP和GTP溶液(0.5-5mM ATP-Cy3，0.5-5mMGTP-Cy5，100-400mM NaCl，1-30mM MgCl2，50-300mM Tris，pH 7-8.5)添加到蛋白组芯片上，并且马上用疏水性塑料盖玻片(GRACE BIO-LABSTM，OR，USA)覆盖。在除去滞留的气泡之后，将芯片放在潮湿的培养箱中，在4℃下培养1小时。
3.为了去掉盖玻片，将芯片浸泡在大体积(＞30ml)冷的缓冲液(100-400mM NaCl，1-30mM MgCl2，50-300mM Tris，pH 7-8.5)中，并且将盖玻片漂走。然后将芯片转移到第二种冷的洗涤溶液(＞50ml)中，并且在4℃下通过振动洗涤3×5分钟。
4.在除去芯片表面上的多余液体之后，在4℃下以1500-2500rpm的速度将芯片离心至干燥。
6.5.4DNA-结合蛋白的鉴定
对于诸如转录调控，染色体分离和维持，以及RNA转运和加工的多种基本生物学功能来说，蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用是重要的(Williamson，2000，Nat.Struct.Biol.7(10)：834-7)。为了揭示使用蛋白组芯片鉴定与DNA或RNA分子结合的蛋白的可能性，用Cy3-CTP和Klenow片段标记总的酵母基因组DNA，并且用生物素化的补骨脂素衍生物标记polyA+(31)。与每一种探针与不同的蛋白组芯片培养(图3A)。
按以下方法分析蛋白-核酸相互作用。按照Winzeler等(1999，Science 285：901)披露的方法标记核酸探针。用PBS缓冲液洗涤封闭的蛋白组芯片3-5次，并且通过在KIMWIPETM上垂直地轻轻敲打，除去玻璃表面上的剥离液体。将200微升标记过的核酸探针(50-200mM poly(dC/dG)；100-300mMNaCl；50-300mM HEPES，pH 7.0-8.5；10mMMgCl2)添加到蛋白组芯片上，并且马上用疏水性塑料盖玻片(GRACE BIO-LABSTM，USA)覆盖。在将滞留的气泡除去之后，在室温下在潮湿的培养箱中，遮光培养所述芯片培养1小时。为了去掉盖玻片，将芯片浸泡在大体积的PBS缓冲液(＞50ml)中，以便将盖玻片漂走。然后将芯片转移到第二种PBS溶液(＞50ml)中，并且在室温下通过遮光振动，洗涤3×5分钟。为了完全除去芯片表面上的液体，在室温下以1500-2000rpm的速度离心5-10分钟，使芯片干燥。
肉眼检查发现，所述基因组DNA探针鉴定了41种DNA-结合蛋白(参见表1)。其中包括8种以前已知的DNA-相关蛋白和2种推测的DNA-结合蛋白。在已知的DNA-结合蛋白中，我们发现了3种DNA-修复蛋白(即xrs2p，Cdc1p和Rad51p(Costanzo等，2001，Nucleic AcidsRes.29：75))，一种SWI-SNF总体转录激活剂复合成分(即Snfl 1p(Costanzo等2001，Nucleic Acids Res.29：75))，II型转录Bur6p的NC2(Drl/Drapl)抑制剂的α亚基(Sternberg.等，1987，Cell 48：567)，转录因子Spt2p(HO基因转录的负调节剂(Sternberg等，1987，Cell 48：567))和Met30p，它包括5个WD-重复，并且结合某些启动子区(Thomas等，1995，Mol.Cell Biol.15：6526)。我们还鉴定了Trm2p，它能结合DNA和RNA，并且参与DNA修复和RNA加工/修饰(Sadekova等，1996，Curr.Genet.30(1)：50-5.)。
被确定为核酸结合蛋白的8种蛋白具有未知功能。其中，根据它们的氨基酸序列和本分析的结果，3种有可能具有DNA结合活性。Ycr087c包括锌指结构域，它是一种常见的DNA结合基序。Yhr054c与转录因子Rsc3p拥有序列同源性(Costanzo等，2001，Nucleic AcidsRes.29：75)。Ybr025c被认为具有推测的核苷酸结合活性(Costanzo等，2001，Nucleic Acids Res.29：75)。本分析证实了这8种蛋白能在体外结合DNA，并且有可能在体内结合核酸。
                                           表1“-”表示标记为坏的斑点，在数据表中赋值为-10000。
ORF   区     列 行   PC   PI(3，4，5)P3  PI(3，4)P2   PI(3)P   PI(4，5)P2   PI(4)P
MPS1 7  13  17  4374.59  1864.12  4216.40  310.00  1084.79  6148.60
YGR052W 13  13  17  2177.02  666.22  2328.28  9.00  563.52  164.18
YLL023C 47  7  18  1798.73  635.18  390.40    -  1868.44  1712.76
SNF1 41  15  17  1774.37  560.70  298.26  202.00  423.73  1795.06
YFL068W 11  9  4  1541.05  369.22  890.06  82.75  190.96  931.28
GCN2 25  15  17  1087.04  975.60  232.01  26.50  505.60  1356.97
YFR053C 7  13  4  1077.95  235.69  713.77  238.75  613.81  991.38
CMK1 13  15  17  1073.54  699.07  1786.71  7.00  545.23  105.39
YGL059W 21  15  17  970.24  273.38  3088.36  91.50  299.61  924.10
CAK1 41  13  17  854.02  269.10  245.20  99.50  233.85  1431.44
BUD32 45  13  17  621.00  108.67  249.28  318.00  282.63  666.29
SPS1 17  13  17  557.02  389.70  1147.50  88.50  358.84  246.92
TOS3 37  15  17  535.89  623.47  766.36  167.00  685.45  2026.31
APG1 45  15  17  464.28  92.70  138.45  72.00  319.65  668.47
LYS1 14  1  6  255.33  61.20  81.94  3.50  22.21  198.15
YHR174W 34  5  6  250.34  80.55  274.24  19.25  47.69  192.48
OPY1 23  15  1  250.04  41.17  179.27  17.50  37.89  188.13
RIM15 5  15  17  244.76  1219.28  4941.00  52.50  687.19  2349.00
YBR028C 3  13  17  232.43  147.60  225.42  18.00  165.05  209.03
ORF     区     列 行     PC  PI(3，4，5)P3 PI(3，4)P2    PI(3)P PI(4，5)P2 PI(4)P
YCL075W     32  11  2  221.87  115.88 192.45     51.50     116.71  288.29
SLS1     17  7  6  220.99  166.05 230.60     17.00     -4.57  -
COX20     24  5  3  214.24  14.06 199.20     35.25     26.56  153.94
AKL1     11  13  17  207.20  93.38 132.49     19.50     57.48  189.44
HIS7 18 3 2 193.11 78.07 - 20.00 18.73 226.45
MET8     47  13  1  188.12  25.42 95.44     117.00     244.09  175.94
YMR172C-A     4  1  16  174.33  94.05 264.35     28.00     101.47  109.31
PAT1 30 7 17 160.24 56.47 10.05 - 66.63 158.95
YEL048C     2  11  4  140.58  87.75 76.13     17.75     45.07  68.81
GPM3     44  7  10  137.64  66.04 85.40     42.50     112.57  85.35
YOL117W     44  5  10  134.71  67.95 78.02     -0.50     123.90  88.84
DFGS     26  5  9  127.66  60.98 48.66     -     -  19.81
YFR020W     25  9  4  127.37  33.86 26.53     0.75     49.43  111.70
KCC4 7 15 17 123.26 65.47 234.84 33.50 67.06 84.92
ROT1     2  9  9  121.50  99.11 137.98     33.25     63.58  52.04
YDR288W     11  11  3  121.50  97.20 220.55     24.00     40.94  183.34
BTT1     38  13  3  120.33  37.12 28.26     -     -  135.44
ARP10     34  13  3  119.74  30.15 29.20     51.00     32.01  98.64
YLR022C     47  9  18  118.57  21.38 15.54     -     152.85  219.92
YDR070C     2  5  3  109.17  48.26 140.65     34.75     67.28  36.15
YBL107W-A     1  15  1  108.59  37.12 128.72     15.50     -  12.63
FBP26     21  9  4  107.41  25.31 48.51     5.75     47.90  62.06
 ORF   区     列 行     PC   PI(3，4，5)P3   PI(3，4)P2   PI(3)P   PI(4，5)P2   PI(4)P
  MY04  6  15  17  103.89  51.07  171.73  2.00  4.79  36.58
  YER152C  22  5  4  103.60  50.17  24.80  -3.75  20.47  104.95
  FUR1  4  11  6  95.67  72.22  210.19  112.25  111.70  148.94
  YPL280W  28  7  17  88.63  43.88  30.14  -  -  118.45
  YBR077C  17  13  1  86.58  -  129.98  4.75  21.12  66.85
  TAT2  12  7  10  83.93  68.29  62.48  60.50  85.79  51.39
  YIR041W  22  5  6  75.72  130.39  38.15  6.50  6.53  200.10
  YKL031W  32  11  18  75.72  39.71  69.38  36.25  58.14  165.48
  YGR242W  25  3  5  75.13  35.77  11.93  17.00  10.02  38.32
  HOR2  34  13  4  74.84  4.16  -3.30  11.00  7.19  68.15
  TAF25  4  7  17  73.37  54.67  110.51  -10.00  77.08  45.29
  YJL193W  33  13  6  72.78  -  21.03  97.00  27.65  103.43
  MIS1  16  7  17  71.02  43.65  86.34  3.50  -  65.32
  PEX4  16  5  5  69.85  21.49  8.63  1.75  28.31  57.48
  SUN4  46  9  9  69.55  33.19  20.88  -  66.41  60.75
  YOL073C  12  5  10  68.67  17.32  41.44  1.75  26.56  40.06
  A1  4  3  16  68.38  48.49  88.38  31.75  46.81  31.57
  YML058C-A  3  5  8  66.33  40.16  76.29  20.50  50.52  34.19
  RPG1  17  9  1  66.33  22.05  61.53  -2.25  -6.75  54.00
  VTC4  40  9  6  66.03  25.31  30.45  8.50  26.78  99.07
  YDR149C  16  11  3  65.74  24.86  73.62  37.50  37.02  46.81
  FRM2  2  15  17  63.39  16.88  59.34  3.50  75.34  12.63
ORF   区  列 行  PC  PI(3，4，5)P3  PI(3，4)P2  PI(3)P  PI(4，5)P2 PI(4)P1
WRS1  26  5  10  62.51  51.08  63.10  -  21.56  4.57
DPS1  47  15  18  62.22  13.05  25.12  -  41.81  99.29
PKR1  47  5  8  61.63  15.75  37.52  -  87.75  61.40
YDR067C  2  9  3  61.34  -29.47  29.83  32.75  47.90  17.42
YCR025C  8  5  2  60.46  73.58  174.24  60.00  68.37  54.87
APS2  47  15  6  58.70  15.97  56.51  39.50  103.65  159.82
RRP5  48  5  16  58.11  21.26  22.60  -  73.38  60.31
YMR148W  12  7  9  56.93  50.17  53.69  36.50  43.33  23.08
RPH1  14  13  2  56.93  9.90  90.73  6.00  18.73  66.19
RGD1  36  15  2  54.59  19.35  54.31  6.00  55.31  127.60
YMR244W  44  5  9  54.29  28.24  29.20  64.75  44.20  32.66
SAS3  6  3  17  54.00  18.68  55.57  2.00  17.85  16.55
SGA1  16  3  16  52.83  26.55  60.59  16.50  6.75  41.15
SXM1  30  11  13  51.95  23.40  19.15  -  27.22  30.48
MUM2  3  13  1  46.66  63.34  49.29  81.50  38.76  90.15
VMA13  4  5  17  45.78  28.12  44.27  11.50  34.40  16.55
YJL185C  9  11  5  45.49  50.96  127.47  -3.25  13.94  27.00
YOL119C  44  1  10  44.61  14.62  5.97  360.50  23.08  22.65
SPS2  47  11  3  44.61  25.31  54.63  18.50  64.02  47.47
YBL107C  3  15  1  44.02  65.93  23.86  104.50  34.84  40.50
THI13  2  11  3  43.14  39.04  75.66  13.75  64.67  55.09
KCS1  16  5  17  42.85  36.22  60.91  0.00  -  35.27
 ORF   区  列 行     PC   PI(3，4，5)P3   PI(3，4)P2   PI(3)P   PI(4，5)P2   PI(4)P
  APA2  16  15  16  42.26  40.05  31.40  22.50  34.84  43.98
  HYS2  7  3  6  41.97  33.41  70.80  3.50  15.90  50.30
  DRS1  39  7  18  39.62  11.02  10.67  0.25  20.69  35.71
  GPA2  44  3  4  39.33  13.05  119.93  -50.50  44.85  87.31
  SLT2  3  13  13  38.15  90.90  93.09  26.25  24.39  32.88
  HEM14  20  15  16  38.15  8.55  21.03  1.00  -  16.11
  TFB3  43  13  3  37.86  27.45  47.72  71.00  37.23  43.98
  PCL6  29  5  1  31.70  26.89  26.84  9.00  3.70  8.06
  YDL237W  4  15  3  31.10  39.15  46.47  132.50  40.06  31.35
  YHL041W  41  1  5  31.11  21.15  19.78  4.00  15.24  101.90
  YOL054W  44  11  10  29.05  19.12  32.81  -15.50  47.90  28.74
  YPL150W  47  7  17  28.76  16.20  0.31  -  34.84  38.76
  ARO4  28  15  2  28.17  29.25  34.53  87.50  20.47  42.24
  YGR176W  48  5  5  26.12  -4.05  -2.83  -  16.11  32.88
  MPD2  20  1  10  25.24  15.07  31.71  -  8.71  37.45
  GAD1  34  5  9  24.36  -  -  51.25  11.54  -1.96
  DTR1  24  15  17  24.07  13.72  2.83  23.00  3.05  -4.79
  ARG1  44  3  10  23.77  -6.08  1.73  213.00  3.48  -6.31
  PAU5  17  15  4  22.30  -  -5.02  -3.00  -1.31  31.35
  CCT8  30  1  6  22.30  33.97  7.53  -  -  23.52
  YPL275W  48  13  10  21.72  2.59  9.89  -  237.77  14.37
  DIN7  30  5  3  21.42  14.06  10.05  -  14.59  33.75
ORF 区     列  行     PC PI(3，4，5)P3 PI(3，4)P2  PI(3)P  PI(4，5)P2  PI(4)P
URA8 29  13  6  20.25 42.86 -2.83  11.50  23.95  34.40
YPL107W 28  15  11  18.78 14.62 27.00  21.50  10.45  5.23
CAM1 47  13  10  18.49 4.16 -0.16  -  25.69  21.99
KSS1 5  13  17  16.43 0.23 87.91  -11.50  -2.61  10.45
PET9 30  3  1  14.97 17.66 -5.81  -  26.13  -
YDR348C 41  15  3  14.67 27.00 53.69  43.50  25.69  57.92
KGD2 48  1  3  14.09 12.60 19.78  -  69.68  60.97
YGL165C 12  7  5  13.50 16.65 16.80  8.50  18.73  16.33
SSB1 39  15  16  12.91 4.27 6.28  -  1.31  16.98
MAG1 14  9  4  10.86 29.02 -2.20  6.50  5.23  21.34
ASF1 37  15  13  10.57 -13.05 1.57  49.00  14.81  5.66
YKL121W 37  13  13  10.27 29.92 7.53  66.00  16.33  -1.52
YOL053W 42  15  10  7.63 7.65 5.34  -  5.66  29.18
YLR020C 43  13  7  7.34 1.24 2.67  3.75  15.68  -5.66
PYK1 34  15  1  6.46 -1.12 -5.02  -9.00  -13.06  10.45
RPL9B 48  5  9  6.46 -0.45 7.38  -  1.96  12.85
APG7 34  15  6  5.87  0.45 -0.63  -22.50  59.23  18.29
SPO1 6  5  9  5.58 -9.22 18.99  -6.50  14.37  0.44
RTG3 48  5  1  5.58 -5.29 0.16  -  12.41  12.19
YEL064C 12  15  4  5.28 -0.90 -3.14  -5.00  6.53  -3.92
BPL1 48  7  17  5.28 8.77  6.59  -  22.21  25.26
GFD1 42  9  9  4.99 3.38 -0.78  -  -  -0.22
 ORF   区  列 行  PC  PI(3，4，5)P3 PI(3，4)P2  PI(3)P  PI(4，5)P2  PI(4)P
  YJR080C  7  1  6  3.52  32.17  78.17  -1.50  13.50  32.66
  YGR101W  40  15  5  3.52  -4.05  -  4.50  -11.76  -6.97
  MRP1  43  15  3  3.52  13.95  18.84  54.50  21.34  23.52
  YNL051W  40  9  9  3.23  25.31  21.19  -  35.06  34.40
  STP22  28  13  2  2.93  22.05  8.79  51.50  -8.27  10.89
  MUB1  29  9  8  2.64  9.79  9.89  -6.00  -4.79  19.38
  ATP1  48  13  1  0.29  26.44  11.93  -  46.38  28.09
  CSE4  44  11  7  -0.88  -8.66  -8.95  -47.75  -8.06  2.61
  VAC7  40  5  9  -1.17  13.16  19.62  28.75  21.99  28.74
  GFA1  38  9  18  -1.76  -6.53  -8.63  -  -7.62  3.05
  SDS22  43  11  18  -4.70  -2.14  4.71  2.00  14.15  13.28
  YER046W  18  9  4  -18.20  5.62  11.62  -  6.31  19.16
  YBR226C  2  11  2  -  55.35  65.93  42.00  87.97  56.61
  YBR025C  17  3  1  -  -39.15  -11.93  0.50  8.93  -9.15
  RFA3  17  5  6  -  71.10  106.12  5.25  3.27  32.66
MHR1 19 15 3 - 14.40 35.48 12.00 10.89 70.89
  ERV1  34  9  5  -  1.35  -  15.75  18.94  -3.27
  TOS6  37  3  9  -  34.31  15.85  -5.00  16.11  41.81
  YNR069C  37  5  9  -  18.79  4.55  -13.75  9.36  28.74
  SDS3  42  15  4  -  9.67  3.45  -  4.35  11.76
  YIL003W  42  13  6  -  14.29  15.54  -  34.40  36.58
6.5.5RNA结合蛋白的鉴定
除了Trm2p之外，鉴定了具有RNA结合活性的其他相互作用剂。例如，业已证实异亮氨酰-tRNA合成酶(Ilslp)和核糖体蛋白(Rpl41B)能结合RNA分子(Lanker等，1992，Cell 70：647；Suzuki等，1990，Curr.Genet 17：185)。参与翻译的其他蛋白在筛选诸如Rpl41b，Sqt1p和Gcdl1p的结合蛋白的测定中是阳性的。Rpl41b是大型核糖体亚基的一种成分。Sqt1p与Rpl10p相互作用，后者是一种RNA结合蛋白(Costanzo，2001，Nucleic Acids Res.29：75)。Gcd11p是翻译起始因子eIF2的γ亚基，它具有GTP结合活性，并且与Lsml-7复合物结合(U6-专一性snRNP)。正如通过双杂交分析所证实的(Fromont Racine等，2000，Yeast17：95)。能结合DNA探针，还能结合核苷酸的两种其他的蛋白目标，即Thil3p参与核苷酸代谢，而Ypt31p具有GTP-结合活性(Costanzo等，2001，Nucleic Acids Res.29：75)。用DNA探针鉴定的RNA结合和核苷酸结合蛋白可能反应了与DNA的低的亲和相互作用，或者可能表示对DNA的以前没有认识到的正常的亲和力。
用生物素标记来自指数生长细胞的RNA-polyA+，并且用于检测蛋白组微阵列。用Cy3-链亲和素检测阳性信号。鉴定了19种目标相互作用剂(参见表1)，包括U1 snRNP成分(Smdlp)，已知能结合mRNA输入蛋白的蛋白(Sxm8p)，C2-H2锌指蛋白(Azf1p)和Tos8p，根据它的序列推测它参与RNA剪接和加工(Schwikowski等，2000，Nat.Biot.18：1257)。除了有可能直接或间接与RNA相互作用的蛋白之外，我们发现了两种转录因子(Bur6p和Tos8p)，一种转录沉默子(Hst3p)，由已知ORFs编码的六种其他蛋白，以及来自未表征过的ORFs的七种蛋白。未知ORFs具有最强的信号(Yerl52c)。必须指出的是，只有一种相互作用剂Bur6p能同时结合DNA和RNA探针。其他相互作用剂只能用双链DNA探针或RNA探针检测到，这表明大部分蛋白可能专一性地结合DNA或RNA。
总之，在41种目标相互作用剂中，有18种是核酸相互作用蛋白；有11种是已知的或推测的DNA结合蛋白，有3种是RNA结合蛋白，并且有4种能结合核苷酸。
6.5.6脂结合蛋白的鉴定
本发明的蛋白组芯片可用于鉴定可能无法用其他实验方法获得的活性，例如，蛋白-药物相互作用和蛋白-脂类相互作用。实际上，与磷脂结合的基因组范围的蛋白分析，以前尚未应用于所有种类。将本发明的蛋白组芯片用于研究与磷脂酰肌醇(″PI″)的相互作用的蛋白。除了它们作为细胞膜成分的作用之外，磷脂酰肌醇是重要的二级信使，由它调控多种细胞过程，包括生长，分化，细胞骨骼重组，膜转运，并且存在于细胞核，液泡和质膜中(Odorizzi等，2000，TIBS 25：229；Fruman等，1998，Annu.Rev.Biochem.67：481；Martin，2000，Annu.Rev.Cell Dev.Bio.14：231；Wera等，2001，FEMS Yeast Res.1406：17)。因为它们通常只是短时间存在的，并且在细胞内的含量很少，尚未对酵母中的磷脂酰肌醇进行充分表征，因此，对有关与特定磷脂结合的蛋白的了解很少(Odorizzi等，2000，TIBS 25：229；Fruman等，1998，Annu.Rev.Biochem.67：229；Martin，2000，Annu.Rev.Cell Dev.Bio.14：231；Wera等，2001，FEMS Yeast Res.1406：1)。
为了鉴定酵母中的PI-结合蛋白，用脂质体作探针，因为脂质体提供了分析所述相互作用剂的最相关的生理学条件。使用了6种类型的脂质体。每一种脂质体包括磷脂酰胆碱(″PC″)和1％(w/w)N-(biotinoyl)-1，2-双十六酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，三乙铵盐(生物素DHPE)。生物素化的脂类起着一种标记的作用，这种标记可以通过Cy3-链亲和素检测(21)。除了PC之外，5种其他的脂质体含有5％(w/w)PI(3)P，PI(4)P，PI(3，4)P2，PI(4，5)P2或PI(3，4，5)P3(图3A)。除了PI(3，4，5)P3之外，上述每一种磷脂都已经在酵母中发现(Odorizzi等，2000，TIBS 25：229；Fruman等，1998，Annu.Rev.Biochem.67：481；Martin，2000，Annu.Rev.Cell Dev.Bio.14：231；Wera等，2001，FEMS Yeast Res.1406：1)。
按以下方法分析蛋白-脂质体相互作用。在氯仿中混合合适数量的每一种脂类，并且在氮气中干燥。通过涡旋搅拌将脂类混合物重新悬浮在PBS缓冲液中。通过超声波处理产生脂质体。用PBS缓冲液洗涤封闭的蛋白组芯片3-5次，并且通过在KIMWIPETM上轻轻敲击所述载玻片，除去玻璃表面上的多余的液体。将200微升脂质体溶液添加到蛋白组芯片上，并且马上用疏水性塑料盖玻片(GRACE BIO-LABSTM，USA)覆盖。在除去滞留的气泡之后，在室温下在潮湿培养箱中培养所述芯片1小时。为了去掉盖玻片，将所述芯片浸泡在大体积的PBS缓冲液(＞50ml)中，以便将盖玻片漂走。然后将所述芯片转移到第二种PBS溶液(＞50ml)中，并且在室温下通过振动洗涤3×5分钟。在除去芯片表面上的多余液体之后，将大约100微升Cy3或Cy5结合的链亲和素(PIERCETM，USA；1∶2000-1∶4000稀释度)添加到其表面，并且用疏水性塑料盖玻片(GRACE BIO-LABSTM，USA)覆盖。在室温下遮光培养所述芯片30分钟以上。然后按上述方法洗涤所述芯片。为了完全除去芯片上的液体，在室温下以1500-2000rpm的速度离心5-10分钟使所述芯片干燥。
6种脂质体一共鉴定了150种不同的相同作用剂，它们所产生的信号明显高于背景。设计了一种算法，以便帮助鉴定阳性信号(42)。52种(35％)的相互作用剂(即脂结合蛋白)相当于未鉴定的蛋白，因此确定了所述蛋白的第一种生物化学活性。上述结果还证实了以前未表征过的具有潜在的重要生物化学活性的蛋白。
在52种未表征过的蛋白中，推测13种(25％)与膜相关(Gerstein，1998，Proteins 33：518)。很多其他的蛋白包括碱性片段，它能介导与带负电荷的磷酸肌醇的静电相互作用。
在98种以前披露的相互作用剂中，业已研究了其中81种的亚细胞定位(Costanzo等，2001，Nucleic Acids Res.29：75)。大部分是膜相关蛋白或参与脂类代谢。更具体地讲，45种蛋白是膜相关的，并且具有已知的或推测的跨膜区(Gerstein，1998，Proteins 33：518)。鉴定的相互作用剂包括膜内在蛋白，具有脂修饰的蛋白(例如，糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白Tos6p和Sps2p(Costanzo等，2001，Nucleic Acids Res.29：75)，异戊二烯化蛋白Gpa2p和配合信息素a-因子(Ansari等，1999，J.Bio.Chem.274：30052)和外周相关蛋白(例如，Kcc4p和Myo4p，它们存在于芽颈部和/或细胞周围(Bohl，2000，EMBO J.19：5514；Bertrand等，1998，Mol.Cell 2：437))。八种其他的蛋白参与脂代谢(例如，Bpl1p)，肌醇环磷酸化(例如Kcs1p)，或推测与膜/脂功能相关(例如，Ylr02Ocp，它与三乙酰甘油脂酶有同源性)。
按若干种方法对相互作用剂(即磷脂结合蛋白)进行分类。首先，根据相对GST的磷脂结合信号，根据结合脂类的强弱对所述相互作用剂进行分类(图4)。相对弱结合蛋白(54％)(图4C和4D)表征了更多一些(72％)的强脂结合蛋白(图4A和4B)。很多强脂结合蛋白是膜相关的，或者推测与膜相关，而较少的弱结合蛋白似乎与膜相关(图4，“膜”栏)。令人吃惊的是，19种脂结合蛋白是激酶，而17种是蛋白激酶。另外，17种蛋白激酶中的13种与磷脂的结合极强。
还根据与磷脂酰胆碱相比它们是否能优先结合一种或多种磷脂酰肌醇，对所述蛋白进行分类。101种蛋白也能与磷脂酰胆碱结合，或者几乎与测试的磷脂酰肌醇脂类的结合一样好(PI/PC＜1.3)(图4B和4D)。不过，49种蛋白优选与一种或多种磷脂酰肌醇结合(PI/PC＞1.3)(图4A和4C)。分析强相互作用子(即磷脂酰肌醇结合蛋白)发现，有很多种专一性地结合特定磷脂酰肌醇的脂类。例如，Stp22p是温度敏感型质膜蛋白的液泡定向所需要的，如Ste2p和Can1p，能优先结合PI(4)P(Li等，1999，Mol.Cell Biol.19：3588)。有9种蛋白激酶能专一性地牢固结合PI(4)P和PI(3，4)P2，并且一种能很弱地结合上述成分。Atp 1p是线粒体内膜的F1-ATP合成酶的α亚基，它也能优先结合PI(3，4)P2(Arnold等，1999，J Biol.Chem)。Sps2p参与中期/晚期小孢子形成，并且定位于孢子前体膜上(Chu等，1998，Science 282：699)，它优先与PI(3)P相互作用。一种有趣的例子是Myo4p，它能优先结合PI(4，5)P2；也许这种脂类的结合是它在细胞皮层上的相互作用和/或它的调控作用的重要部分。尽管某些蛋白能同时结合这种脂类和其他脂类，没有发现能专一性结合PI(3，4，5)P3的强的脂类结合目标。以上结果表明，多种膜相关蛋白，包括膜内在蛋白和外周相关蛋白能优先在体内结合特定的脂类。
出人意料的是，很多蛋白参与葡萄糖代谢，包括葡萄糖代谢结合磷脂的调节剂。具体地讲，鉴定了参与糖酵解中的连续步骤的三种葡萄糖代谢酶，即磷酸甘油酸变位酶(Gpm3p)，烯醇化酶(Eno2p)和丙酮酸激酶(Cdc 19p/Pyk1p)。作为脂结合相互作用剂，还鉴定了能将葡萄糖转化成葡萄糖-6-磷酸的己糖激酶(Hxk1p)和两种已知是葡萄糖代谢的调节剂的蛋白激酶(即Snf1p和Rim15p)。最近业已证实Hxk1p能结合两性离子微团，这种结合能促进其活性(30)；业已证实Eno2p能够分泌，这表明它还可能与膜相互作用(31)。因此，在一个实施方案中，可以用磷脂调节与葡萄糖代谢相关的步骤。在另一个实施方案中，可以通过在磷脂支架上进行葡萄糖代谢的步骤，增强糖酵解步骤，例如，但不局限于在细胞膜上进行。
令人吃惊的是，包括磷脂的探针能识别多种预计与膜功能或脂信号传导不相关的蛋白。因此，用两种类型的标准分析方法进一步测试了六种蛋白的磷酸肌醇结合，这六种蛋白是Rim15p，Eno2p，Hxk1p，Sps1p，Ygl05 9wp和Gcn2p(Williamson，2000，Nat.Struct Biol.7(10)：834-7)。对于Rim15p，Eno2p和Hxk1p来说，首先将PI(4，5)P2脂质体结合在硝酸纤维素膜上，然后用BSA进行封闭；用不同量的GST融合蛋白和GST对照检测所述膜，并且用抗GST抗体检测结合蛋白。如图5A所示，每一种酵母融合蛋白紧密结合PI(4，5)P2，并且表现出剂量效应；GST本身则不能。我们还对四种GST融合蛋白Rim15p，Sps1p，Yg1059wp和Gcn2p进行了逆向分析(Guerra等，2000，Biosci.Rep.20：41)。将不同数量的所述纯化蛋白点滴在硝酸纤维素滤膜上，并且用六种不同的脂质体检测(图5B)。用辣根过氧化物酶(″HRP″)-结合的链亲和素检测结合的脂质体。对于使用蛋白组芯片的实验来说，脂质体能与每一种蛋白结合，而不能与BSA对照结合。Sps1p能几乎等同地结合五种含有磷酸肌醇的脂质体。Rim15p，Gcn2p和Yg1059wp对不同的脂质体具有不同的亲和力(对于Rim15p来说，参见图5B)。所有三种蛋白与PI(3)P和PI(4)P和PI(3，4)P2的结合最强。对于Rim15p来说，发现了在结合信号和Rim15p的含量之间存在线性相关性(图5C)。
另外，具有未知功能的若干种蛋白也表现出强的脂结合活性，表明它们可能结合细胞中的磷脂。可以用本领域技术人员所公知的常规分析方法，迅速筛选用蛋白组芯片鉴定的脂结合相互作用剂，以便确定在体内的脂结合活性。另外，根据本发明，可以用蛋白组芯片确定所述相互作用剂是否与磷脂代谢途径或信号传导途径相关。
总之，以上结果明确无误地证实，多种脂结合蛋白，包括以前未知的能结合脂类的蛋白，可以用本发明的蛋白组芯片检测和表征。另外，用本发明的蛋白组芯片鉴定的磷脂结合相互作用剂，可以通过常规分析方法证实为真正的脂结合蛋白。
另外，由于所述相互作用不能用酵母双杂交系统或DNA/寡聚体微阵列技术研究，本发明的蛋白组芯片及其使用方法是研究分子-蛋白相互作用的先进方法。
所述研究表明，它可以制备并且筛选真核生物的蛋白组芯片。所述若干种技术特征的新型和非显而易见的组合，对于实施本发明来说是必要的。首先，在本研究中分析的蛋白是用酵母表达克隆制备的，所述克隆是通过DNA测序验证的，并且含有纯的质粒。其次，它是以高处理量方式生产特定克隆和蛋白所必需的。本文所披露的方法提供了足够5000个蛋白芯片使用的蛋白。第三，所述蛋白是在真核宿主中生产的，因此，可以生产大量完整长度的蛋白，所述蛋白是正确折叠的，翻译后修饰的和/或与它的天然配偶体复合的。正如通过免疫吸印分析所证实的，至少80％的纯化融合蛋白是以完整长度蛋白形式表达。
很多相互作用剂可以通过结合蛋白与探针结合，而不直接结合。在某些场合下，相互作用剂可以是多聚体的一部分。不过，所述结合蛋白还可以用本发明的方法检测和鉴定。不过，通过本发明方法检测的相互作用剂有可能直接与一种探针相互作用，或者至少与一种能与探针相互作用的蛋白紧密结合。本发明的蛋白组芯片的蛋白是用严格条件(例如用0.5M NaCl洗涤)制备的，并且，考马斯染色仅发现了可以通过抗GST抗体检测的带，这表明其他蛋白的污染很少。
各种组装蛋白的集合体可能不足以代表具有正确折叠的细胞外结构域的分泌蛋白。GST标记和HisX6标记融合在翻译起始密码子上游，以便具有信号肽的膜蛋白不会输送到分泌途径中，并且不能适当地折叠或修饰。在筛选脂结合蛋白的过程中，鉴定了三种具有信号肽的蛋白，这表明至少产生了某些分泌蛋白，并且含有功能性结构域。
另外，由于并不是所有蛋白都能够通过高处理量方法超量生产和纯化的，并不是所有相互作用都能够检测。不过，估计所使用的蛋白阵列包括处在用于筛选的合理水平上的大约80％的完整长度的酵母蛋白，因此，预计大部分蛋白相互作用都可以检测。
以上结果表明，蛋白组芯片可以筛选生物化学活性，由此可以进行全面蛋白组分析。类似方法可用于制备具有10-100,000种蛋白的蛋白阵列，用于在人类和其他真核生物中进行全面的高处理量蛋白组分析。
参考文献和注释：
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9.D.A.Mitchell，T.K.Marshall，R.J.Deschenes，Yeast 9，715(1993)。表达载体pEGH是通过将RGS-HisX6表位标记插入pEG(KG)的GST基因和多克隆位点之间所形成的。用以前所披露的方法克隆酵母ORFs(5)，所不同的是每一个步骤是用96孔方式完成的。将通过DNA测序证实的质粒DNAs重新导入酵母(Y258)和大肠杆菌(DH5α)。所述文库包括5800种不同的ORFs。
10.有关96孔方式蛋白纯化方案、来自所有实验的完整的结果、以及阳性鉴定算法的设计的详细说明可以查阅公共网站bioinfo.mbb.yale.edu/proteinchip。
11.将用PBS缓冲液制备的浓度为0.02mg/ml的生物素化的钙调蛋白(CalBiochem，USA)与0.1mM的钙一起添加到蛋白组芯片上，并且在室温下在潮湿培养箱中培养1小时。在随后的所有步骤中，缓冲液中都含有0.1mM的钙。在室温下用PBS洗涤所述芯片3次。将Cy3-结合的链亲和素(Jackson IR，USA)(1∶5000稀释度)添加到所述芯片上，并且在室温下培养30分钟。在充分洗涤之后，通过离心使所述芯片干燥，并且用微阵列扫描仪扫描；然后用GENEPIXTM阵列密度测定软件(Axon，USA)获得数据。
12.S.S.Hook，A.R.Means，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.41，471(2001).
13.M.S.Cyert，R.Kunisawa，D.Kaim，J.Thorner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，7376(1991).
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15.F.Bohl，Kruse，EMBO J 19，5514(2000)；E.Bertrand等，Mol.Cell 2，437(1998).
16.D.C.Winter，E.Y.Choe，R.Li，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 96，7288(1999).
17.C.Schaerer-Brodbeck，H.Riezman，Mol.Biol.Cell 11，1113(2000).
18.K.Homma，J.Saito，R.Ikebe，M.Ikebe，R Biol.Chem.275，34766(2000).
19.J.Menendez，J.Delgado，C.Gancedo，Yeast 14，647(1998).
20.G.Odorizzi，M.Babst，S.D.Emr，TIBS 25，229(2000)；D.A.Fruman等.，Annu.Rev.Biochem.67，481(1998)；T.F.Martin，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.14，231(2000)；S.Wera，J.C.T.Bergsma，FEMS YeastRes.1406，1(2001).
21.用标准方法制备脂质体(52)。简单地讲，将溶解在氯仿中的合适数量的每一种脂混合并且在氮气下干燥。通过涡旋搅拌将所述液体混合物重新悬浮在TBS缓冲液中，通过超声波处理产生脂质体。为了检测所述蛋白组芯片，将60毫升不同的脂质体添加到不同的芯片上。在室温下在潮湿培养箱中培养所述芯片1小时。在用TBS缓冲液洗涤3次之后，将Cy3-结合的链亲和素(1∶5000稀释度)添加到所述芯片上，并且在室温下培养30分钟。
22.通过计算每一个斑点的局部强度背景的GenePix软件和我们所开发的一系列算法的组合鉴定阳性克隆。有关细节可以查阅公共网站bioinfo.mbb.yale.edu/proteinchip。
23.M.C.Costanzo等，Nucleic Acids Res.29，75(2001).
24.M.Gerstein，Proteins 33，518(1998).
25.K.Ansari等.，J Biol.Chem.274，30052(1999).
26.Y.Barral，M.Parra，S.Bidlingmaier，M.Snyder，Genes Dev.13，176(1999).
27.Y.Li，T.Kane，C.Tipper，P.Spatrick，D.D.Jenness，Mol.CellBiol.19，3588(1999).
28.I.Arnold等.，JBiol.Chem.274，36(1999).
29.S.Chu等，Science 282，699(1998).
30.A.Casamayor等，Curr.Biol.9，186(1999)；R.Guerra，M.L.Bianconi，Biosci.Rep.20，41(2000).
31.M.Pardo等，Yeast 15，459(1999).
7.所引用的参考文献
本文所引用的所有文献都以全文形式引入本文作为参考，并且是以相同的程度引用的，就如同每一份文献或专利或专利申请被专门和分别指明以全文形式引入本文作为参考一样。
8.等同方案
在不超出本发明构思和范围的前提下，可以对本发明进行多种改进和改变。本领域普通技术人员可以理解，或能够通过常规实验确定对本文所披露的本发明具体实施方案的各种改变、调整和改进，所有这样的改变都属于本发明的范围。相应地，要求保护的发明意在包括所有这样的等同方案。因此，本文所披露的具体实施方案仅仅是以举例形式提供的，并且，本发明不仅仅局限于所附权利要求书，同时也不局限于与所述权利要求书等同的全部范围。
                         序列表
<110>耶鲁大学
<120>利用蛋白组芯片全面分析蛋白活性
<130>6523-035-228
<140>待转让
<141>同此
<150>60/290,583
<151>2001-05-11
<150>60/308,149
<151>2001-07-26
<160>16
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>钙调蛋白结合蛋白的共有序列
<221>变体
<222>1
<223>Xaa＝Ile或Leu
<221>变体
<222>3
<223>Xaa＝任何氨基酸
<221>变体
<222>5
<223>Xaa＝Lys或任何氨基酸
<221>变体
<222>7
<223>Xaa＝碱性氨基酸
<400>1
Xaa Gln Xaa Lys Xaa Gly Xaa
 1               5
<210>2
<211>17
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>2
Leu Lys Glu Thr Leu Gln Ser Val Lys Ser Leu Lys Asp Ala Leu Asn
 1               5                  10                  15
Asp
<210>3
<211>17
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>3
His Ser Val Asp Leu Gln Ser Ser Lys Phe Gln Leu Ala Ile Val Cys
 1               5                  10                  15
Thr
<210>4
<211>17
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>4
Asp Glu His Phe Ile Gln Arg Leu Pro Ser Thr Arg Leu Asn Ser Thr
 1               5                  10                  15
Asp
<210>5
<211>17
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>5
Ala Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Gly Ser Thr Arg Asp Ile Ala Glu
 1               5                  10                  15
Ser
<210>6
<211>17
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>6
Asp Asp Leu Arg Leu Gln Ser Gln Lys Lys Gly Gly Glu Leu Thr Glu
 1               5                  10                  15
Glu
<210>7
<211>17
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>7
Leu Asn Pro Ile Ile Gln Asp Thr Lys Lys Gly Lys Leu Arg Phe Val
 1               5                  10                  15
Arg
<210>8
<211>13
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>8
Arg Lys Ala Leu Ile Gln Arg Lys Gly Gly Lys Leu Glu
 1               5                  10
<210>9
<211>17
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>9
Val Val Asp Pro Ile Gln Ser Val Lys Gly Lys Val Val Ile Asp Ala
 1               5                  10                  15
Phe
<210>10
<211>16
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>10
Gly His Pro Ile Ile Gln Asp Lys Glu Gly Asn Gly Val Leu Ile Cys
 1               5              10                      15
<210>11
<211>17
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>11
Arg Val Trp Gly Ile Gln Pro Val Asn Lys Lys Phe Asn Ala Arg Ser
 1               5                  10                  15
Ala
<210>12
<211>17
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>12
Leu Leu Arg Glu Ile Gln Ser Lys Arg Ser Lys Lys Asp Glu Glu Gly
 1               5                  10                  15
Lys
<210>13
<211>17
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>13
Leu Asn Met Lys Ile Gln Lys Leu Arg Asp Leu Tyr Leu Glu Gln Thr
 1               5                  10                  15
Glu
<210>14
<211>16
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>14
Asp Leu Phe Gly Ile Gln His Cys His Asn Ile Asp Val Lys Arg Leu
 1               5                  10                  15
<210>15
<211>17
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>15
Asn Gly Leu Leu Ile Gln Ser Ser Lys Phe Ile Ser Lys Val Leu Leu
 1               5                  10                  15
Thr
<210>16
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>出现在很多钙调蛋白结合蛋白中的基序
<221>变体
<222>3，4，5，6，8，9，10
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>16
Ile Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Arg
 1               5                  10

Claims (80)

1.一种包括多种蛋白的可定位寻址的阵列，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中所述多种蛋白包括由一个物种中的至少50％的已知基因编码的至少一种蛋白。
2.如权利要求1的阵列，其中所述多种蛋白包括由一个物种中的至少70％的已知基因编码的至少一种蛋白。
3.一种包括多种蛋白的可定位寻址的阵列，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中所述多种蛋白包括在一个物种中表达的所有蛋白的至少50％，其中蛋白的同种型和剪接变体是作为一种蛋白统计的。
4.一种包括多种蛋白的可定位寻址的阵列，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中所述多种蛋白包括在一个物种中表达的至少1000种蛋白。
5.一种包括多种蛋白的可定位寻址的阵列，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中所述多种蛋白总体上包括由一个物种中至少1000种不同的已知基因编码的蛋白。
6.如权利要求1、3、4或5的阵列，其中所述蛋白是按照蛋白的分类组构在所述阵列上的。
7.如权利要求6的阵列，其中所述分类是根据丰度、功能、酶促活性、同源性、蛋白家族、与特定代谢途径的关系或翻译后修饰进行的。
8.如权利要求1、3、4或5的阵列，其中所述蛋白通过His标记结合在固体支持物上。
9.如权利要求1、3、4或5的阵列，其中所述固体支持物包括镍。
10.如权利要求1、3、4或5的阵列，其中所述固体支持物包括镍包被的载玻片。
11.一种制备可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物的表面上，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中所述多种蛋白包括由一个物种中的至少50％的已知基因编码的至少一种蛋白。
12.一种制备可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物的表面上，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中所述多种蛋白包括在一个物种中表达的所有蛋白的至少50％，其中蛋白的同种型和剪接变体是作为一种蛋白统计的。
13.一种制备可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物上，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中所述多种蛋白包括在一个物种中表达的至少1000种蛋白。
14.一种制备可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种蛋白结合在固体支持物上，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中所述多种蛋白总体上包括由一个物种中的至少1000种不同的已知基因编码的蛋白。
15.一种制备可定位寻址的阵列的方法，包括以下步骤：将多种融合蛋白结合在固体支持物表面上，每一种融合蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中所述融合蛋白包括第一标记、第二标记和由一种生物体的基因组核酸编码的蛋白序列。
16.如权利要求15的方法，其中在所述结合步骤之前，是一个通过让所述蛋白与所述第一标记的结合配偶体接触而纯化所述蛋白的步骤，并且，在所述结合步骤中用所述第二标记将所述蛋白结合在固体支持物上。
17.如权利要求16的方法，其中所述第一标记是GST标记，而第二标记是His标记。
18.如权利要求15的方法，其中所述第一标记和第二标记存在于所述蛋白的氨基末端。
19.如权利要求15的方法，其中所述第一标记和第二标记存在于所述蛋白的羧基末端。
20.一种制备和分离多种纯化的蛋白样品的方法，包括以下步骤：在多位点阵列的多个位点的每一个位点上：
(a)生长具有与调控序列可操作地连接的异源核苷酸序列的真核细胞；
(b)让所述调控序列与诱导物接触，该诱导物能增强由所述异源核苷酸序列编码的蛋白的表达；
(c)裂解所述细胞，产生细胞裂解物；
(d)将所述细胞裂解物或来自它的含有蛋白的样品与一种结合制剂接触，形成所述蛋白和结合制剂的复合物；和
(e)从所述复合物中分离所述蛋白；
其中每一个步骤是以多阵列方式进行的。
21.如权利要求20的方法，其中每一个位点是一个孔。
22.如权利要求20的方法，其中所述蛋白是包括与所述结合制剂结合的亲和标记的融合蛋白。
23.如权利要求20的方法，其中所述细胞是酵母细胞。
24.如权利要求20的方法，其中所述裂解步骤是用颜料振荡器完成的。
25.一种检测脂结合蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)将包括脂类的探针与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上；和
(b)检测所有蛋白-探针相互作用，其中在所述固体支持物的一个位置上检测到相互作用，表明了在该位置上存在脂结合蛋白。
26.如权利要求25的方法，其中所述脂类是磷脂。
27.如权利要求26的方法，其中所述磷脂是磷脂酰胆碱或磷脂酰肌醇。
28.如权利要求25的方法，其中所述探针包括脂质体。
29.一种检测结合蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)将一种探针与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中所述多种蛋白包括由一个物种中的至少50％的已知基因所编码的至少一种蛋白；和
(b)检测所有蛋白-探针相互作用。
30.一种检测结合蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)将一种探针与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中所述多种蛋白包括在一个物种中表达的所有蛋白的至少50％，其中蛋白同种型和剪接变体作为一种蛋白统计；和
(b)检测所有蛋白-探针相互作用。
31.一种检测结合蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)将一种探针与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中所述多种蛋白包括在一个物种中表达的至少1000种蛋白；和
(b)检测所有蛋白-探针相互作用。
32.一种检测结合蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)将一种蛋白与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中多种蛋白总体上包括由一个物种中的至少1000种不同的已知基因编码的蛋白；和
(b)检测所有蛋白-探针相互作用。
33.一种检测结合蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)将一种探针与包括多种融合蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种融合蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中所述融合蛋白包括第一标记、第二标记和由一种生物体的基因组核酸所编码的蛋白序列；和
(b)检测所有蛋白-探针相互作用。
34.如权利要求29、30、31、32或33的方法，其中所述探针包括核酸、蛋白、小分子、药物候选物或脂类。
35.如权利要求34的方法，其中所述核酸包括RNA或DNA。
36.如权利要求34的方法，其中所述探针是酵母蛋白。
37.如权利要求36的方法，其中所述酵母蛋白是Myo2、Rho1、Rho2、Rho3、Rho4、Cdcl1、Cdcl2或Hsl7。
38.如权利要求34的方法，其中所述探针是抗体。
39.如权利要求38的方法，其中所述抗体是针对细胞周期蛋白，激酶，GST，Clb5，Cla4，Ste20，Cdc42，PI(3，4)P2，PI(4)P，SPA2，CLB1，CLB2或Cdcl1的。
40.如权利要求34的方法，其中所述探针是钙调蛋白。
41.如权利要求34的方法，其中所述探针包括选自下列的小分子：ATP，GTP，cAMP，磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸。
42.如权利要求34的方法，其中所述探针包括磷脂酰胆碱或磷脂酰肌醇。
43.如权利要求34的方法，其中所述探针包括脂质体。
44.如权利要求25、29、30、31、32或33的方法，其中所述探针来自哺乳动物。
45.如权利要求44的方法，其中所述哺乳动物是人。
46.如权利要求44的方法，其中所述多种蛋白是非人的。
47.如权利要求25、29、30、31、32或33的方法，其中所述多种蛋白通过His标记结合在固体支持物上。
48.如权利要求25、29、30、31、32或33的方法，其中所述固体支持物包括镍。
49.如权利要求25、29、30、31、32或33的方法，其中所述固体支持物包括镍包被的载玻片。
50.如权利要求34的方法，还包括确定一种探针的身份的步骤，在所述检测步骤中检测到了该探针与一种蛋白的相互作用。
51.如权利要求50的方法，其中所述相互作用表明被鉴定的探针是抗细菌、抗真菌或抗病毒蛋白。
52.一种标记用于结合实验中的蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)将所述蛋白的不同的等份样品与生物素转运化合物在一定条件下接触一定的时间，产生在不同的等份样品中被生物素化到不同程度的所述蛋白；和
(b)将不同的等份样品组合在一起，产生生物素化程度不同的蛋白的样品。
53.一种检测结合蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)将通过权利要求52的方法生产的生物素化蛋白的样品与包括多种融合蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上；和
(b)检测所述阵列上的所有位置，其中在生物素化的蛋白和所述阵列上的蛋白之间发生了相互作用。
54.一种检测结合蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)将通过权利要求52的方法生产的生物素化蛋白的样品与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上；
(b)将所述阵列与和荧光剂结合的链亲和素接触；和
(c)检测所述阵列上出现荧光的所有位置，其中所述荧光表示在生物素化的蛋白和阵列上的蛋白之间发生了相互作用。
55.一种确定与磷脂酰胆碱相比，一种蛋白是否优先结合磷脂酰肌醇的方法，包括以下步骤：
(a)将包括磷脂酰肌醇的探针与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上；
(b)检测蛋白-探针相互作用，其中在所述固体支持物的一个位置上的相互作用表示存在磷脂酰肌醇结合蛋白；
(c)将包括磷脂酰胆碱的探针与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，所述蛋白包括步骤(a)中的相同蛋白的至少一些，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上；
(d)检测蛋白-探针相互作用，其中在所述固体支持物的一个位置上的相互作用表示存在磷脂酰胆碱结合蛋白；和
(e)对于多种蛋白的每一种来说，比较步骤(b)和(d)的结果。
56.一种确定磷脂是否调节细胞中的代谢途径或信号传导途径，或所述代谢或信号传导途径是否出现在膜表面上的方法，包括以下步骤：
(a)将包括磷脂的探针与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中所述多种蛋白包括构成所述途径的至少一部分的一种或多种蛋白；和
(b)检测所述探针与所述途径中的一种蛋白的相互作用；
其中所述相互作用表示所述探针调节所述代谢途径或信号传导途径，或所述途径出现在膜表面上。
57.一种制备结合钙调蛋白的非天然存在的蛋白的方法，包括制备包括以下序列的非天然存在的蛋白：
I/L-Q-X-X-K-K/X-G-B(SEQ ID NO：1)，
其中X是任何氨基酸，而B是碱性氨基酸。
58.一种确定翻译后修饰在蛋白中的存在或缺乏的方法，包括以下步骤：
(a)将与所述翻译后修饰结合的探针与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上；和
(b)检测所述探针与蛋白的所有相互作用；其中在所述固体支持物的一个位置上的所述相互作用表明在所述位置上的蛋白具有翻译后修饰。
59.如权利要求58的方法，其中所述翻译后修饰是甲基化、磷酸化、生物素化、乙酰化、聚乙二醇化、糖基化、脂化、遍在化和sumolation。
60.一种制备酵母细胞培养物的方法，包括以下步骤：
(a)在生长培养基中将多个酵母细胞生长到OD600为0.3-1.0，其中所述多个酵母细胞包括可操作地与调控序列连接的异源核苷酸序列；
(b)将所述细胞与一种诱导物接触，该诱导物能增强由所述异源核苷酸序列编码的蛋白的表达；
(c)从所述培养基中分离所述细胞；
(d)将所述细胞与冷水接触；
(e)从所述冷水中分离所述细胞；
(f)将所述细胞与冷的裂解缓冲液接触；
(g)从所述裂解缓冲液中分离所述细胞；和
(h)冷冻所述细胞至半干以便保存。
61.一种从细胞中纯化蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)对于多个细胞样品的每一种来说，裂解每一个样品中的细胞，以便产生细胞裂解物，其中所述细胞包括具有亲和标记的融合蛋白，并且，其中所述裂解步骤是用颜料震动器完成的；
(b)将每一种裂解液分离成可溶性级份和不可溶性级份；
(c)将每一种可溶性级份转移到多位点阵列的不同位点上，其中所述转移步骤是用广口吸头完成的；
(d)将每一种可溶性级份与一种结合制剂接触，以便形成所述融合蛋白和结合制剂的复合物；
(e)从所述复合物中分离每一种融合蛋白；和
(f)将每一种融合蛋白保存在高粘度的缓冲液中。
62.鉴定一种信号是否是阳性的方法，包括以下步骤：
(a)确定每一个斑点的局部主要信号和背景信号，并且根据所述主要信号和背景信号之间的差确定净信号；
(b)确定第一和第二净信号分布的下部1/4、中间、和上部1/4值；
(c)从所述第一净信号分布中扣除第一中间值，并且从所述第二净信号分布中扣除第二中间值，以分别获得第一和第二扣除值；
(d)用所述第一信号分布的上部和下部1/4值的差来除所述第一扣除值，并且用上部和下部1/4值的差来除所述第二标度值，以分别获得第一和第二标度值；
(e)确定相邻区的标度信号分布的局部中间值，其中所述相邻区包括在所述部位上的多个位点；和
(f)从标度信号中扣除局部中间值，以获得标度的剩余值。
63.如权利要求62的方法，其中阳性信号表示蛋白-探针相互作用。
64.如权利要求62的方法，其中相邻区是所述信号上面两行，下面两行，左边两列，右边两列。
65.如权利要求62的方法，还包括当一个样品值和样品值的平均值之间的差大于标度剩余值的误差的三个标准差的话，将标度剩余值的平行样品排除在外的步骤。
66.一种确定用多个不同的阵列测定的信号中的阳性信号的方法，包括以下步骤：
(a)转化用不同阵列测定的信号，产生转化信号；
(b)通过一种方法校正每一个转化信号，所述方法包括从所述转化信号中扣除一个局部中间信号，得到校正过的转化信号，其中所述局部中间信号是相邻区上的中间信号，所述相邻区包括所述转化信号位点周围的一个或多个位点；和
(c)将每一个校正过的转化信号与一个阈值比较，当所述校正过的转化信号大于所述阈值时，将所述校正过的转化信号确定为阳性的；
其中所述阵列包括含有多种蛋白的可定位寻址的阵列，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上。
67.如权利要求66的方法，其中所述转化步骤包括以下步骤：
(a)确定用每一种不同阵列测定的信号的信号分布的下部1/4值、中间值、和上部1/4值；
(b)从用所述每一种不同阵列测定的信号中扣除所述中间值，获得所述阵列的翻译信号；和
(c)用所述阵列的上部和下部1/4值的差来除所述翻译信号，产生所述转化信号。
68.如权利要求66的方法，其中所述相邻区由在所述转化信号上面两行，下面两行，左侧两列和右侧两列的部位内的位点组成。
69.如权利要求66、67或68的方法，其中所述阳性信号表示蛋白-探针相互作用。
70.如权利要求66、67或68的方法，还包括去掉数据点的步骤，其中所述数据点在阵列的重复位点上测定；其中重复位点之间的偏差大于三个标准差。
71.如权利要求66、67或68的方法，还包括用以下公式对所述校正的转化信号进行统一化的步骤：
r+εr＝G+εG/R+εR
其中G是校正过的转化信号，R是GST信号，εG是G的误差，εR是R的误差，而εr是r的误差。
72.如权利要求20的方法，其中所述多位点阵列是96-位点阵列。
73.一种制备可定位寻址的阵列的方法，包括将多种融合蛋白结合在固体支持物表面上的步骤，每一种融合蛋白位于固体支持物的不同位置上，其中所述融合蛋白包括第一标记、第二标记和由一种生物体的基因组核酸编码的蛋白序列。
74.如权利要求62或65的方法，还包括以下步骤：
(a)对两个重复位点的信号的值加以平均，以便获得平均值；和
(b)确定所述平均值是否大于所述标度的剩余值的误差三个标准差，
其中如果所述平均值大于所述标度的剩余值的误差三个标准差，则所述斑点的信号是阳性的。
75.一种确定蛋白的酶促活性的存在或缺乏的方法，包括以下步骤：
(a)将一种作为所述酶促活性的底物的探针与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上；和
(b)检测所述固体支持物的一个位置上的所述底物的任何催化作用；
其中所述固体支持物的一个位置上的所述催化作用表示位于所述位置上的蛋白具有所述酶促活性。
76.确定一种酶底物在蛋白中的存在或缺乏的方法，包括以下步骤：
(a)将作为所述酶底物的酶的探针与包括多种蛋白的可定位寻址的阵列接触，每一种蛋白位于固体支持物的不同位置上；和
(b)检测所述固体支持物的一个位置上的所述底物的任何催化作用；
其中所述固体支持物的一个位置上的所述催化作用表示所述蛋白包括所述酶底物。
77.如权利要求1、3、4或5的阵列，其中所述蛋白通过生物素标记结合在固体支持物上。
78.如权利要求15的方法，其中第一标记存在于所述蛋白的羧基末端，而第二标记存在于所述蛋白的氨基末端。
79.如权利要求22的方法，其中亲和标记是生物素。
80.如权利要求1、3、4或5的阵列，其中所述固体支持物包括硝酸纤维素包被的载玻片。
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