JP2017513002A - 修飾特異的バインダーを使用することによる分析物を分析するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の主題は、特異的な分析物の検出のためのサンドイッチELISA技法を、種々のサンプルマトリックス(例として細胞ライセート(lysate)、組織ホモジネート、体液)中の微量(rare amounts)の分析物の同定のためのLuminex-xMAP検出技術と組み合わせるアッセイである。検出システムによって、1キャビティ中、最大500個までの異なる分析物の測定が可能になる。
急成長している配列データベースを使用できるようになったことに伴い、ゲノムへの適用によって、細胞中のタンパク質発現のグローバルスクリーニングのための、より早く、かつ、より効率的な方法が要求されている。しかしながら、細胞プロテオームの複雑性は、タンパク質の翻訳後修飾も考慮すると、実質的に拡大している。
それ以来、圧倒的な数の天然および合成の小分子インヒビターが記載されている。チロシンキナーゼインヒビターは、天然の産物および関連誘導体(ケルセチン、ゲニステイン、スタウロスポリン、エルバスタチン(erbastatins)、クラビラクトン(clavilactones));キナゾリン、ピリドピリミジンおよび関連複素環(例としてZD1839);フェニルアミノ−ピリミジン(例としてSTI571);チロホスチンおよび類似体(例としてSU1498、SU101、SU0020);インドールおよびオキシインドール(例としてSU5416、SU6668、SU5402;F.A. Al-ObeidiおよびK.S. Lam, Oncogene 19 (2000), pp. 5690-5701)へ、広範囲に分類され得る。
上で留意された困難性は、ヒトキナーゼの大変大きな一団(1キャビティ中、最大500個まで)に対して多くの化合物を試験することを可能にするアッセイ形式(format)によって解決される。キャビティは、マイクロタイタープレート、バイアル、ペトリディッシュまたは方法に記載のアッセイが実施され得る別の容器であり得る。アッセイによって、特異性を効率的、定量的、包括的および体系的に査定することが可能になる。たった少数のキナーゼに対する試験に基づき化合物の特異性を著しく見積もることは、もはや不要である。特異性プロファイリングは、創薬プロセスの早期におよび開発全体の経路に沿って組み込まれ得、特異性は、多くのより多くの化合物に対して体系的かつ迅速に査定され得る。この空前の技量(ability)によって、医薬品化学と分子試験との間の密接なフィードバックが可能となる。有効性および特異性が並行して最適化され得ることで、より短い時間でより質の高い前臨床候補がもたらされる。
本発明の主題は、チロシンキナーゼの自己リン酸化の検出のためのサンドイッチELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)技法を、組織サンプル中の特定タンパク質の同定のためのLuminex(商標)-xMAP検出システムと組み合わせるアッセイである。組織サンプルは、これらに限定されないが、細胞ライセート、生検ホモジネート、腫瘍生検ホモジネート、疾患組織ホモジネート、血液細胞のライセートを意味する。
a)第1固相が、細胞培養物または動物材料からの実質的に均一な細胞集団を用いて、細胞が第1固相へ付着するように、コートされる。細胞は、内因性チロシンキナーゼを有しているか、あるいは、チロシンキナーゼコンストラクトが細胞膜中または細胞の細胞質中に提示されるように、チロシンキナーゼをコードするDNAで形質転換されてDNAが発現されているか、のいずれかである。b)次いでリガンドが、チロシンキナーゼがリガンドに露出されるように、付着している細胞を有する固相へ加えられる。c)リガンドへの露出の後、付着細胞が可溶化され、それによって細胞ライセートが放出される。d)第2固相が、チロシンキナーゼに対してまたは受容体コンストラクトの場合はポリペプチドエピトープタグに対して特異的に結合する特異抗体としての捕捉剤でコートされる。e)ステップc)で得られた細胞ライセートが、付着している捕捉剤を含有するウェルへ、チロシンキナーゼを捕捉するためにウェルへ加えられる。f)次いで洗浄ステップが、結合しない細胞ライセートを除去するために行われ、捕捉されたチロシンキナーゼが放出される。g)捕捉されたチロシンキナーゼコンストラクトは、チロシンキナーゼ中のリン酸化された残基を同定する標識抗ホスホチロシン抗体へ露出される。h)抗ホスホチロシン抗体の、捕捉されたチロシンキナーゼへの結合が測定される。
(a)該修飾部位に特異的であるかまたはそれへ結合し、かつ、検出マーカーとして働く色素と接合されているかまたはそれに結び付けられている、一次捕捉抗体を提供すること、ならびに、
(b)該修飾部位とは異なる部位またはエピトープにおいて、該タンパク質に特異的であるかまたはそれへ結合し、かつ、ステップ(a)の該色素とは識別可能な検出マーカーと接合されているかまたはそれに結び付けられている、二次抗体を提供すること、
(c)(a)で使用されたのとは別の修飾部位に特異的であるかまたはそれへ結合し、かつ、ステップ(a)および(b)の該色素とは識別可能な検出マーカーとして働く色素と接合されているかまたはそれに結び付けられている、三次捕捉抗体を提供すること。
(a)血清枯渇によって細胞を飢餓にすること、
(b)キナーゼインヒビターの存在下および不在下において、血清、成長因子および/またはサイトカインを加えることによって、キナーゼの自己リン酸化活性を誘導すること、
(c)細胞を可溶化すること、それによって、細胞ライセートをそこから放出させること、
(d)種々のホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホスレオニンと、種々の色素と接合された非修飾部位特異的結合タンパク質とを加えることによって、細胞ライセート中のキナーゼを捕捉すること、
(e)読出し標識と直接接合されているかまたはビオチンと直接カップリングされているキナーゼ上の非修飾部位特異的領域へ結合する抗体によって、特有の色素を有する自己リン酸化されたチロシンキナーゼを、d)から同定すること、ここで、抗体が、d)で使用された結合タンパク質とは別の、キナーゼ中の非修飾部位特異的領域へ結合する必要があり、
(f)キナーゼインヒビターの存在下での誘導の結果として生じるe)からの自己リン酸化されたチロシンキナーゼを、該キナーゼインヒビターの不在下での誘導の場合と比較すること、ならびに、個々のキャビティにおける非修飾キナーゼレベルとの直接比較において、e)からの自己リン酸化されたキナーゼを比較すること、これにより、個々の分析物の規格化が可能となる。
使用される色素は好ましくは、これらに限定さないが、蛍光色素またはルミネセンス色素である。
本発明の別の部分は、ステップb)の下で、キナーゼインヒビターの代わりにキナーゼアクチベーターが試験される方法である。
(a)血清枯渇によって細胞を飢餓にすること、
(b)キナーゼインヒビターの存在下および不在下において、血清、成長因子および/またはサイトカインを加えることによって、キナーゼの自己リン酸化活性を誘導すること、
(c)細胞を可溶化すること、それによって、細胞ライセートをそこから放出させること、
(d)種々のホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホスレオニンと、種々のミクロスフェアと接合された非修飾部位特異的結合タンパク質とを加えることによって、細胞ライセート中のキナーゼを捕捉すること、
(e)読出し標識と直接接合されているかまたはビオチンと直接カップリングされているキナーゼ上の非修飾部位特異的領域へ結合する抗体によって、特有の色素を有する自己リン酸化されたチロシンキナーゼを、d)から同定すること、ここで、抗体が、d)で使用された結合タンパク質とは別の、キナーゼ中の非修飾部位特異的領域へ結合する必要がある。
(f)キナーゼインヒビターの存在下での誘導の結果として生じるe)からの自己リン酸化されたチロシンキナーゼを、該キナーゼインヒビターの不在下での誘導の場合と比較すること、ならびに、個々のキャビティにおける非修飾キナーゼレベルとの直接比較において、e)からの自己リン酸化されたキナーゼを比較すること、これにより、個々の分析物の規格化が可能となる。
キナーゼインヒビターの不在下で、チロシンキナーゼのリン酸化状態をプロファイリングするための上述の方法であって、
ここで請求項1c)のライセートは、腫瘍試料、疾患に冒された組織、または、同等な動物材料に由来するが、
前記方法は、診断および腫瘍の病期分類のためのものである。
細胞は真核細胞であり得、好ましい態様において細胞は、哺乳動物細胞である。
別の好ましい態様は、キナーゼインヒビターおよびキナーゼアクチベーターを、特定のキナーゼに結合するというそれらの特異性についてプロファイリングするための上の方法の使用である。
(a)リン酸化されたキナーゼに結合する種々の捕捉抗ホスホ抗体に結び付けられている1〜500個の特有の色素を持つミクロスフェアの組成物、および、
(b)リン酸化されたキナーゼの同定のためのa)における色素とは識別可能な色素で標識されたキナーゼに特異的な抗体。
本発明の別の部分は、キナーゼインヒビターの特異性をプロファイリングするための上述の方法における使用のためのキットであって、以下を含む:
(a)種々の抗ホスホ抗体に結び付けられている1〜500個の特有の色素の組成物、
(b)a)における色素とは識別可能な色素で標識された抗キナーゼ抗体。
(a)種々の抗ホスホ抗体に結び付けられている1〜500個の特有の色素の組成物、
(b)a)における色素とは識別可能な色素で標識された抗キナーゼ抗体。
キットに使用される色素およびマーカーは夫々、ルミネセンスおよび/または蛍光の色素あるいはマーカーである。
特有の色素の数は、種々のリン酸化部位と組み合わせて1〜500個の種々のキナーゼからの自己リン酸化を並行して測定するために、1個と500個との間であり得る。
本発明の別の態様は、1〜100個または1〜200個または1〜300個または1〜400個の特有の蛍光色素で着色されたミクロスフェアを持つ上述の組成物である。
Luminex(商標)機器は、自己リン酸化の測定のために使用され得る。キナーゼインヒビターは、キナーゼインヒビターの不在下でしか自己リン酸化を示さないキナーゼを阻害し得る。
本発明の方法のための別の使用は、腫瘍試料中の様々なキナーゼの自己リン酸化状態のプロファイリングである。様々なキナーゼからの活性の状態によって、診断と、患者を治すための好適な治療戦略とに対する思慮深いヒントが与えられる(Espina V. et al. (2005) Cancer Invest, 23(1), pp.36-46)。この特定の場合において、分析される必要のあるサンプルは、腫瘍試料または疾患に冒された組織(生検またはレーザー捕捉顕微解剖)または同様に同等な動物材料からのライセートであろう。分析は、キナーゼインヒビターの不在下で上記のとおりになされ得る。
例1:細胞のアッセイの説明
腫瘍細胞株を、24ウェルプレートに1ウェルあたり100000〜200000細胞の密度で播き、成長培地中で24時間培養した。その期間の後、細胞を、0.05%BSAを含有する飢餓培地で2回洗浄して、成長培地中に存在するすべての成長因子を除去した。細胞を、飢餓培地(一般にいずれの添加物もない基本培地)の存在下で、もう20時間終夜培養して、対象の標的分析物のリン酸化状態を低減させた。インヒビターをインキュベーションするため、飢餓培地を、指示濃度のインヒビターを含有する飢餓培地に変え、細胞培養インキュベーター中24℃にて1時間インキュベートする。対象の標的分析物のリン酸化を誘導するために、細胞を、事前にインキュベートされたインヒビターの存在下でその活性化を誘導することができる最適濃度の成長因子またはサイトカインで刺激した。必要な刺激時間は、各経路に特異的であり、予め見積もる必要がある。刺激後、インキュベーション培地を完全に除去し、細胞を、種々のプロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターを含有する溶解緩衝液中4℃にて溶解させた。細胞ライセートを収集し、最終分析まで、少量のアリコートで−80℃にて保管した。細胞の最大刺激/リン酸化の算出のため、インヒビターとともにはインキュベートせず、かつ、未処置のままかまたは刺激物のみで刺激する対照を、個別の24ウェルプレート上に含ませた。
c−Metキナーゼのために説明する逆アッセイ形式は、3または4個の異なる蛍光色素で着色されたミクロスフェアとカップリングした3または4個の異なる捕捉抗体を使用する。これらの抗体の1つは、受容体チロシンキナーゼc−Metの細胞外ドメイン(ECD)に対して向けられたものであるが、他の抗体は、細胞内キナーゼドメイン中の種々のリン酸化部位(例としてY1234Y1235、Y1349およびY1003)に結合する。代わりに、c−Metの細胞内ドメイン(ICD)に対して向けられた抗体はまた、この抗体がICD中のリン酸化部位を検出する抗体を妨害しない場合、総(total)c−Met量の検出のためにも使用し得る。
Claims (22)
- タンパク質またはポリペプチドを含む分析されるべきサンプルの分析物中の該タンパク質またはポリペプチドの修飾部位を検出するための方法であって、修飾部位が、リン酸化、自己リン酸化、メチル化、ヒドロキシル化、グリコシル化、ユビキチン化、アセチル化、プレニル化、アミド化またはN末端メチオニン検出からなる群から選択され、方法が、
(a)該修飾部位に特異的であるかまたはそれへ結合し、かつ、検出マーカーとして働く色素と接合されているかまたはそれに結び付けられている、一次捕捉抗体を提供すること、ならびに、
(b)該修飾部位とは異なる部位またはエピトープにおいて、該タンパク質に特異的であるかまたはそれへ結合し、かつ、ステップ(a)の該色素とは識別可能な検出マーカーと接合されているかまたはそれに結び付けられている、二次抗体を提供すること、
(c)(a)で使用されたのとは別の修飾部位に特異的であるかまたはそれへ結合し、かつ、ステップ(a)および(b)の該色素とは識別可能な検出マーカーとして働く色素と接合されているかまたはそれに結び付けられている、三次捕捉抗体を提供すること
を含む、前記方法。 - キナーゼインヒビターの存在下における、請求項1に記載の方法によって検出される1以上のキナーゼのリン酸化および自己リン酸化を、該キナーゼインヒビターの不在下と比較して、分析するための方法であって、方法は以下のステップ:
(a)血清枯渇によって細胞を飢餓にすること、
(b)キナーゼインヒビターの存在下および不在下において、血清、成長因子および/またはサイトカインを加えることによって、キナーゼの自己リン酸化活性を誘導すること、
(c)細胞を可溶化すること、それによって、細胞ライセートをそこから放出させること、
(d)種々のホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホスレオニンと、種々の色素と接合された非修飾部位特異的結合タンパク質とを加えることによって、サンプル中のキナーゼを捕捉すること、
ここで、種々の各結合タンパク質は、特有の色素に結び付けられており、
(e)読出し標識と直接接合されているかまたはビオチンと直接カップリングされているキナーゼ上の非修飾部位特異的領域へ結合する抗体によって、特有の色素を有する自己リン酸化されたチロシンキナーゼを、d)から同定すること、ここで、抗体が、d)で使用された結合タンパク質とは別の、キナーゼ中の非修飾部位特異的領域へ結合する必要があり、
(f)キナーゼインヒビターの存在下での誘導の結果として生じるe)からのリン酸化されたかまたは自己リン酸化されたチロシンキナーゼを、該キナーゼインヒビターの不在下での誘導の場合と比較すること、ならびに、個々のキャビティにおける非修飾キナーゼレベルとの直接比較において、e)からのリン酸化された/自己リン酸化されたキナーゼを比較すること、これにより、個々の分析物の規格化が可能となること
を含む、前記方法。 - 分析された修飾が、MetAP1およびMetAP2酵素活性の確認を検出する、請求項2に記載の方法。
- 診断および腫瘍の病期分類のための、
キナーゼインヒビターの不在下で、チロシンキナーゼのリン酸化状態をプロファイリングするための方法であって、
請求項2のc)のライセートが、腫瘍試料、疾患に冒された組織、または、同等な動物材料に由来する、請求項2に記載の方法。 - ステップ(b)において、キナーゼアクチベーターを試験する、請求項3に記載の方法。
- 色素が、蛍光色素またはルミネセンス色素である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- マーカーが、蛍光マーカーまたはルミネセンスマーカーである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、対象の分析物を表すポリペプチドをコードする核酸で、細胞飢餓(a)に先立ち形質転換され、前記分析物が、過剰発現によるかまたは該細胞中のキナーゼそれ自体の組み換えペプチドにおける自己活性化突然変異のため、リン酸化を誘導することができる、請求項2に記載の方法。
- 細胞が、真核細胞である、請求項2に記載の方法。
- 真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項2に記載の方法。
- キナーゼインヒビターを、キナーゼに結合するというそれらの特異性について、プロファイリングするための、請求項1または2に記載の方法の使用。
- キナーゼアクチベーターを、キナーゼに結合するというそれらの特異性について、プロファイリングするための、請求項1または2に記載の方法の使用。
- キナーゼインヒビターの特異性をプロファイリングするための請求項11または12に記載の方法における使用のためのキットであって、以下:
(a)リン酸化されたキナーゼに結合する種々の捕捉抗ホスホ抗体に結び付けられている1〜500個の特有の色素を持つミクロスフェアの組成物、および、
(b)リン酸化されたキナーゼの同定のためのa)における色素とは識別可能な色素で標識されたキナーゼに特異的な抗体
を含む、前記キット。 - キナーゼアクチベーターの特異性をプロファイリングするための請求項13に記載の方法における使用のためのキットであって、以下:
(a)リン酸化されたチロシンキナーゼに結合する種々の捕捉抗ホスホ抗体に結び付けられている1〜500個の特有の色素を持つミクロスフェアの組成物、および、
(b)リン酸化されたキナーゼの同定のためのa)における色素とは識別可能な色素で標識されたキナーゼに特異的な抗体
を含む、前記キット。 - キナーゼインヒビターの特異性をプロファイリングするための請求項13に記載の方法における使用のためのキットであって、以下:
(a)種々の抗ホスホ抗体に結び付けられている1〜500個の特有の色素の組成物、
(b)a)における色素とは識別可能な色素で標識された抗キナーゼ抗体
を含む、前記キット。 - キナーゼアクチベーターの特異性をプロファイリングするための請求項13に記載の方法における使用のためのキットであって、以下:
(a)種々の抗ホスホ抗体に結び付けられている1〜500個の特有の色素の組成物、
(b)a)における色素とは識別可能な色素で標識された抗キナーゼ抗体
を含む、前記キット。 - 色素が、蛍光色素またはルミネセンス色素である、請求項13〜16のいずれか一項に記載のキット。
- 種々の抗キナーゼ抗体に各々結び付けられている1〜500個の特有の色素を含有する組成物であって、前記抗体が、リン酸化されたキナーゼに特異的に結合する抗体によって捕捉された、一定のキナーゼに特異的に結合する、前記組成物。
- 1〜100個の特有の蛍光色素で着色されたミクロスフェアを持つ、請求項18に記載の組成物。
- 1〜200個の特有の蛍光色素で着色されたミクロスフェアを持つ、請求項18に記載の組成物。
- 1〜300個の特有の蛍光色素で着色されたミクロスフェアを持つ、請求項18に記載の組成物。
- 1〜400個の特有の蛍光色素で着色されたミクロスフェアを持つ、請求項18に記載の組成物。
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