WO2006129881A1 - 骨・関節疾患の予防・治療剤およびそのスクリーニング方法 - Google Patents

骨・関節疾患の予防・治療剤およびそのスクリーニング方法 Download PDF

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WO2006129881A1
WO2006129881A1 PCT/JP2006/311470 JP2006311470W WO2006129881A1 WO 2006129881 A1 WO2006129881 A1 WO 2006129881A1 JP 2006311470 W JP2006311470 W JP 2006311470W WO 2006129881 A1 WO2006129881 A1 WO 2006129881A1
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nrf
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substance
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PCT/JP2006/311470
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Yukio Yoneda
Eiichi Hinoi
Takeshi Takarada
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National University Corporation Kanazawa University
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Definitions

  • the present invention relates to a cell differentiation regulator, a method for screening a substance capable of regulating cell differentiation, a method for identifying a mutation such as a polymorphism causing a change in cell differentiation, the biological state of an animal with respect to cell differentiation or cell differentiation efficiency
  • a determination method a cell having a bone / cartilage-forming ability in which gene expression is regulated.
  • N rf 2 is a basic leucine zipper transcription factor, which is hemoxygenase 1 (HO— 1), peroxyredoxin I (P r X ⁇ 1, also known as MS P 23), and is known as a factor responsible for transcriptional regulation of stress response related genes such as A 1 70.
  • N rf 2 remains in the cytoplasm in a state bound to Ke ap 1, which is the actin-binding protein, but dissociates from Ke ap 1 by oxidative stress and moves into the nucleus, where it is transferred to Ma f and heterodimer. After formation, ARE (antioxidant response element) t binding will initiate transcription of the target gene.
  • N r f 2 is also stabilized by oxidative stress and its protein oxy levels are dramatically increased.
  • nrf 2 is one of several genes that are positively regulated by elevated phosphate in MC 3 T 3-El cells, and phosphate It has been described that multiple genes that are regulated by elevated levels can be associated with osteoblast differentiation. On the other hand, it is described that the increase in n r f2 expression in osteoblast differentiation can be a response to a severe environment (ie, cytoprotective response) that occurs as mineralization proceeds.
  • nrf 2 is a factor that can suppress differentiation into osteoblasts and chondrocytes
  • nrf 2 is involved in the action of run X 2, which is a master regulator of osteoblast and chondrocyte differentiation.
  • run X 2 is a master regulator of osteoblast and chondrocyte differentiation.
  • the present invention is useful for providing a drug or reagent having a new action mechanism for various diseases based on the knowledge obtained by functional analysis of n rf 2, and for developing a drug or reagent. Its purpose is to provide means.
  • nrf 2 is also expressed in bone and cartilage tissues and can negatively regulate bone and cartilage differentiation.
  • the present inventors also show that nrf 2 can repress osteocalcin transcriptional activity dependently on run X 2 (master regulator of osteoblast and chondrocyte differentiation). It was found that this could be caused by the inhibition of runx 2 by nrf 2. Therefore, the expression or function of rf 2 It is considered that the regulation makes it possible to regulate osteoblasts, chondrocytes and other bone / cartilage-forming cells, or bone / cartilage formation.
  • screening for substances that regulate the expression or function of nrf 2 has the ability to regulate the differentiation of cells that have the ability to form bone and cartilage, and / or drugs and research reagents for diseases that are caused by abnormal bone and cartilage formation. Based on the above, the present inventors have completed the present invention. That is, the present invention is as follows:
  • a regulator of osteoblast or chondrocyte differentiation comprising a substance that regulates n r f 2 expression or function;
  • n r f 2 The agent of [1] above, wherein the substance that regulates the expression or function of n r f 2 is an n r f 2 protein or an n r f 2 expression vector;
  • Substances that regulate nrf 2 expression or function include antisense nucleic acids, ribozymes, RNA i-inducible nucleic acids, decoy nucleic acids, targeting vectors, nrf 2 antibodies, nrf 2 dominant negative mutants, and The agent of [1] above, selected from the group consisting of:
  • a screening method for a substance capable of regulating osteoblast or chondrocyte differentiation comprising evaluating whether or not a test substance can regulate the expression or function of n r f 2;
  • a screening method for a substance capable of preventing or treating bone / joint disease comprising evaluating whether or not the test substance can regulate nrf 2 expression or function;
  • a method for screening for a substance capable of regulating run X 2 recruitment or osteocalcin expression comprising assessing whether it can regulate nrf 2 expression or function;
  • a method for identifying an n r f 2 mutation that causes a change in osteoblast or chondrocyte differentiation comprising analyzing an effect of a specific mutation of n r f 2 on osteoblast or chondrocyte differentiation;
  • a diagnostic agent for the biological state of an animal for osteoblast or chondrocyte differentiation comprising a reagent for measuring the expression level of n r f 2;
  • a diagnostic agent for a biological state of an animal for osteoblast or chondrocyte differentiation comprising a reagent for measuring a polymorphism of n r f 2;
  • a diagnostic agent for osteoblast or chondrocyte differentiation efficiency comprising a substance that regulates the expression or function of n r f 2;
  • Kit including: (a) and (b) below: (a) a substance that regulates nrf 2 expression or function, and / or a reagent for measuring the expression level or polymorphism of nrf 2;
  • n r f 2 expression vector specific for osteoblasts or chondrocytes [2 4] n r f 2 expression vector specific for osteoblasts or chondrocytes
  • a method for regulating osteoblast or chondrocyte differentiation comprising administering to a subject an effective amount of a substance that modulates nrf2 expression or function;
  • a method for preventing or treating bone / joint disease comprising administering to a subject an effective amount of a substance that modulates n r f 2 expression or function;
  • the regulator of the present invention can be useful for regulating differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage, and for preventing and treating bone-related diseases.
  • the screening method of the present invention is useful for the development of a bone / cartilage-forming cell differentiation regulator, and a preventive / therapeutic agent for bone / joint diseases.
  • the diagnostic agent of the present invention allows the expression or function of nrf 2 to be evaluated in the biological state of an animal with respect to differentiation of cells capable of forming bone and cartilage, or in the treatment of patients with bone and joint diseases. This is useful because it allows predicting the therapeutic effect of the modulating substance in the patient.
  • Figure 1 shows nrf 2 expression in bone.
  • A Hematoxylin and eosin staining of postnatal-aged dd Y mouse tibia
  • B Postnatal-aged dd Y mouse tibia In-situ hybridization
  • the upper panel shows an overview, and the lower panel shows the expansion of bone tissue.
  • FIG. 2 shows n r f 2 expression in chondrocytes. Expression was confirmed by in situ hybridization using E 15.5 mouse tibia.
  • FIG. 3 shows the expression of n r f 2 / ma f signaling molecules in 3 T 3 -E 1 cells. Expression was confirmed by RT_PCR. The numerical value at the bottom of the panel indicates the number of days of culture of MC 3T 3—E 1 cells.
  • FIG. 4 shows the expression of n r f 2 / ma f signaling molecules in ATDC5 cells. Expression was confirmed by RT-PC R. The numbers at the bottom of the panel indicate the number of days of culture of ATDC 5 cells.
  • Figure 5 shows confirmation of nrf 2 expression in established MC 3T3—E 1 and ATDC 5 cells (Wt indicates wild type, and so on)
  • A R T-PCR
  • B Immunoblotting
  • FIG. 6 shows inhibition of differentiation of ATDC5 cells into chondrocytes by overexpression of nrf2.
  • A Alcian blue staining
  • B RT-PCR
  • FIG. 7 shows inhibition of AT DC 5. cell differentiation into chondrocytes by overexpression of n.rf2.
  • FIG. 8 shows the inhibition of chondrocyte differentiation in the ATDC5 cells by overexpression of nrf2.
  • A Semi-quantitative RT-PCR
  • FIG. 10 shows inhibition of differentiation of MC 3 T 3—E 1 cells into osteoblasts by overexpression of nrf 2.
  • Figure 1 1 shows inhibition of the expression of osteoblast differentiation markers in MC 3 T 3—E 1 cells by overexpression of nrf 2.
  • A Semi-quantitative RT-PCR
  • FIG. 12 shows inhibition of r u n x 2 dependent OG 2 reporter activity by n r f 2.
  • FIG. 13 shows the non-change in the nuclear localization of r u n x 2 due to overexpression of n r f 2.
  • A shows the intracellular localization of both transcription factors when r u n x 2 and n r f 2 are co-expressed in COS7 cells.
  • B shows the intracellular localization of runX2 when nrf2 is expressed in MC3T3-E1 cells.
  • FIG. 14 shows the reduction of r u n x 2 recruitment due to overexpression of n r f 2 in MC 3 T 3—E 1 cells.
  • A shows the recruitment of r u n x 2 onto the osteocalcin promoter when n r f 2 and r u n x 2 are coexpressed in MC 3 T 3 _E 1 cells.
  • FIG. 15 shows the binding of N rf 2 to the ARE-like 2 sequence in the osteocalcin promoter.
  • A Nucleotide sequence of osteocalcin promoter
  • B Gel shift results using two ARE-like sequences present on the osteocalcin promoter as probes.
  • FIG. 16 shows inhibition of OG 2 reporter activity by nrf 2.
  • A Nucleotide sequence of OG 2 reporter (wild type, mutant type) used for assembly
  • FIG. 17 shows inhibition of r u n 2 -dependent 6 X O SE 2 reporter activity by n r f 2.
  • FIG. 18 shows increased expression of n r f 2 in the bones of OVX mice.
  • A Bone density measurement by micro CT
  • C nrf in bone tissue by in situ hybridization method Expression of 2
  • FIG. 19 shows growth inhibition and non-induction of apoptosis by overexpression of n r f 2 in MC 3T3-E 1 cells.
  • the present invention relates to a regulator of differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage, a regulator of run X 2 recruitment or osteocalcin expression, or a prevention or treatment of bone or joint diseases, which contains a substance that regulates nrf 2 expression or function.
  • a substance that regulates nrf 2 expression or function Provide the agent.
  • the present invention also provides a substance itself that regulates the expression or function of n r f 2.
  • n r f 2 (p 45 NF-E 2 related factor 2) is a human n r f 2 (for example,
  • nrf 2 ortho The log is not particularly limited, and may be derived from animals such as mammals (for example, rabbits, hidges, pigs, goats, monkeys, rabbits, rats, hamsters, guinea pigs, mice).
  • nrf 2 can maintain its function to the extent that it is useful for bone / chondrogenic cell differentiation regulation or prevention / treatment of bone / joint diseases, or as long as it can sufficiently reduce run X 2 recruitment
  • an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 may have one or more amino acid mutations (eg, deletion, substitution, addition, insertion).
  • nrf 2 represents a gene
  • N rf 2 represents a protein. In the present specification, these are used interchangeably.
  • the agent that modulates n r f 2 expression or function may be a substance that promotes n r f 2 expression.
  • n r f 2 means that a translation product (ie, protein) from n r f 2 is produced and functionally localized at the site of action. Therefore, the substance that promotes the expression of n r f 2 may act at any stage of n r f 2 transcription, post-transcriptional regulation, translation, post-translational modification, localization, and protein folding. As used herein, promotion of n r f 2 expression includes replenishment of n r f 2 (protein) itself.
  • nrf 2 protein
  • nrf 2 expression vector an expression vector containing a nucleic acid encoding nrf 2 (nrf 2 expression vector)
  • a thiol 'thione compound eg, 1,2-dithio 1 Rheo 3-thione (D 3 T); see Mol. Cell. Biol. Vol. 22: 2883-2892 (2002).
  • nrf 2 can be a natural protein or a recombinant protein.
  • nrf 2 can be prepared by a method known per se, for example, a) nrf 2 may be recovered from a biological sample (eg, bone, cartilage) containing nrf 2, and b) a host cell (eg, Escherichia) Fungus, 'Bacillus spp., Yeast, insect cells, insects, animal cells) nrf 2 expression vector (See below) may be used to prepare a transformant and recover nrf 2 produced by the transformant.
  • Nrf 2 may be synthesized by cell lines.
  • nrf 2 is a method that utilizes solubility such as salting-out solvent precipitation method; a method that mainly uses difference in molecular weight such as dialysis method, ultrafiltration method, gel filtration method, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis method; Method using differential charge such as ion-exchange chromatography; Method using specific affinity such as absorptivity chromatography and use of nrf 2 antibody; Hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography A method utilizing the difference between the above; a method utilizing the difference between the isoelectric points such as isoelectric focusing; and a method of combining them appropriately.
  • an agent that modulates n r f 2 expression or function may be a substance that inhibits n r f 2 expression.
  • the substance that suppresses the expression of n r f 2 may act at any stage of n r f 2 transcription, post-transcriptional regulation, translation, post-translational modification, localization, and protein folding.
  • nrf 2 transcripts examples of substances that suppress the expression of nrf 2 are nrf 2 transcripts, in particular antisense nucleic acids against mRNA or early transcripts.
  • An antisense nucleic acid consists of a base sequence that can hybridize with the target mRNA (initial transcript) under physiological conditions of a cell that expresses the target mRNA (early transcript), and the target mRNA in a state of being hybridized.
  • the type of the antisense nucleic acid may be DNA or RNA, or may be a DNAZRNA chimera.
  • Other important factors in the design of antisense nucleic acids include increased water solubility and cell membrane permeability. These include dosage forms such as the use of ribosomes and microspheres. It can be overcome by the ingenuity.
  • the length of the antisense nucleic acid is not particularly limited as long as it can specifically hybridize with the nrf 2 transcript.
  • the short one is about 15 bases long, and the long one is complementary to the entire mRNA (initial transcript) sequence. Such a sequence may be included.
  • oligonucleotides comprising about 15 bases or more, preferably about 15 to about 30 bases, more preferably about 18 bases to about 30 bases are exemplified.
  • antisense nucleic acids not only hybridize with nrf 2 transcripts to inhibit translation, but also bind to double-stranded DNA to form triplex and inhibit transcription to mRNA. It may be obtained.
  • nrf 2 transcript specifically mRNA or the initial transcript, within the coding region (including the intron in the case of the initial transcript). It is a ribozyme that can cleave specifically.
  • Lipozyme is an RNA having an enzyme activity that cleaves nuclear acid.
  • an oligo DNA having a base sequence of the enzyme active site also has a nucleic acid cleavage activity. In the present invention, as long as it has sequence-specific nucleic acid cleavage activity, it is used as a concept including DNA.
  • RNAs found in infectious RNAs such as viroids and violinoids
  • hammerhead and hairpin types are known.
  • a hybrid ribozyme further linked with a tRNA-modified sequence is added to facilitate its transfer to the cytoplasm.
  • RNAI-inducible nucleic acid refers to a polynucleotide that can induce the RNAi effect by being introduced into a cell, and is preferably RNA.
  • the RNAi effect is a phenomenon in which a double-stranded RNA containing the same nucleotide sequence (or a partial sequence thereof) as mRNA suppresses the expression of the mRNA.
  • RNA having a double-stranded structure having the same nucleotide sequence (or a partial sequence thereof) as at least 20 or more consecutive target mRNAs For example, it is preferable to use RNA having a double-stranded structure having the same nucleotide sequence (or a partial sequence thereof) as at least 20 or more consecutive target mRNAs.
  • the double-stranded structure may be composed of different strands, or may be a double-stranded structure provided by a single RNA stem loop structure.
  • RNAi-inducible nucleic acids include siRNA, stRNA, miRNA, and the like.
  • Decoy nucleic acid refers to a polynucleotide that mimics the region to which transcriptional regulators bind
  • decoy nucleic acid as a substance that suppresses nrf 2 expression is a nucleic acid molecule that mimics the region to which the transcriptional activator for nrf 2 binds May be included.
  • the decoy nucleic acid is not limited as long as it contains a region to which a transcriptional activator for n r f2 binds. For example, it can contain about 2 kbp upstream of the gene.
  • the decoy nucleic acid examples include an oligonucleotide (s-oligo) having a thiophosphate diester bond in which the oxygen atom of the phosphodiester bond portion is replaced with a sulfur atom, or a methyl phosphate group having no phosphodiester bond charge. And oligonucleotides modified to make the oligonucleotide less susceptible to degradation in vivo.
  • the decoy nucleic acid may be completely coincident with the region to which the transcriptional activator binds, but it is sufficient that the decoy nucleic acid retains the identity sufficient to allow the transcriptional activator to bind to nrf2.
  • the length of the decoy nucleic acid is not particularly limited as long as a transcriptional activator binds. Moreover, the decoy nucleic acid may contain the same region repeatedly.
  • the targeting vector used in the present invention comprises a first polynucleotide and a second polynucleotide homologous to the nrf 2 gene capable of inducing homologous recombination of the nrf 2 gene, and, if necessary, a selection marker.
  • the first and second polynucleotides are polynucleotides having sufficient sequence identity and length to produce homologous recombination with genomic DNA containing nrf2.
  • the first and second polynucleotides are in genomic DNA containing the nrf 2 gene, Selection is made such that deletion of the genomic DNA partial region present between the two regions homologous to the first and second polynucleotides results in a functional defect of the nrf 2 gene.
  • Selectable markers include positive selectable markers (eg, neomycin resistance gene, hygromycin B phosphotransferase (BP H) gene, blasticidin S deaminase gene, puromycin resistance gene), negative selectable markers (eg, simple herpes Virus (HSV) thymidine kinase (tk) gene, diphtheria toxin A fragment (DTA) gene).
  • positive selectable markers eg, neomycin resistance gene, hygromycin B phosphotransferase (BP H) gene, blasticidin S deaminase gene, puromycin resistance gene
  • negative selectable markers eg, simple herpes Virus (HSV)
  • the targeting vector can include either a positive selection marker, a negative selection marker, or both.
  • the targeting vector also includes two or more recombinase target sequences (eg, 1 ox P sequence used in the CreZ 1 o XP system from Bacteriophage P 1, FRT sequence used in the FLP / FRT system from yeast) ) 'May be included.
  • a substance that modulates n r f 2 expression or function may be a substance that inhibits n r f 2 function.
  • the substance that suppresses the function of nrf 2 is not particularly limited as long as it can interfere with the action of nrf 2.
  • nrf 2 inhibitory proteins eg, nrf 2 dominant negative mutant, nrf 2 antibody, Ke ap 1 (Genes Dev. 13 (1): 76-86 (1999)
  • a decoy nucleic acid containing an nrf 2 binding site eg, ARE-like 2, OSE 2
  • an expression vector containing a nucleic acid encoding them eg, ARE-like 2, OSE 2
  • the antibody against nrf 2 may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be prepared by a well-known immunological technique.
  • the antibody may be an antibody fragment (for example, Fab, F (ab ′) 2 ) or a recombinant antibody (for example, a single chain antibody).
  • a polyclonal antibody is commercially available using nrf 2 or a fragment thereof (if necessary, a complex cross-linked to a carrier protein such as ushiserum anolevmin or KLH (Keyhole Limpet Heraocyanin)) as an antigen.
  • Aju Administered with a bunt eg, complete or incomplete Freund's adjuvant
  • a bunt about 2 to 4 times subcutaneously or intraperitoneally in animals every 2 to 3 weeks (the antibody titer of the partially collected serum is measured by a known antigen-antibody reaction)
  • the increase can be confirmed) by collecting whole blood about 3 to about 103 after the final immunization and purifying the antiserum.
  • animals to which the antigen is administered include mammals such as rats, mice, rabbits, goats, guinea pigs, and hamsters.
  • Monoclonal antibodies can also be produced by cell fusion methods (for example, Takeshi Watanabe, principles of cell fusion methods and preparation of monoclonal antibodies, Akira Taniuchi, Toshitada Takahashi, “Monoclonal Antibodies and Cancer Basics and Clinical I”, 2- 14 pages, Science Forum Publishing, 1985).
  • mice are administered the factor 2-4 times subcutaneously or intraperitoneally with a commercially available adjuvant, and spleen or lymph nodes are collected approximately 3 days after the final administration, and leukocytes are collected.
  • the leukocytes and myeloma cells are fused to obtain a hybridoma that produces a monoclonal antibody against the factor.
  • Cell fusion may be the PEG method [J. Immunol. Methods, 81 (2): 223-228 (1985)] or the voltage pulse method [Hybridoma, 7 (6): 627-633 (1988)].
  • a hybridoma producing a desired monoclonal antibody can be selected by detecting an antibody that specifically binds to an antigen from the culture supernatant using a well-known EIA or RIA method.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody can be cultured in vitro, or in vivo, such as mouse or rat, preferably mouse ascites, and the antibody can be obtained from the culture supernatant of the hybridoma and the ascites of the animal, respectively.
  • the antibody of the present invention may be a chimeric antibody, humanized or human antibody.
  • Chimeric antibodies include, for example, “Experimental Medicine (Special Issue), Vol. 6, No. 10, 1988”, Japanese Patent Publication No. 3-73280, and human antibodies include, for example, Japanese National Publication No. Hei 4-506458.
  • human antibodies such as “Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997”, “Nature Genetics, Vol. 7, p. 13-21, 1994” ”Special Publication No.
  • a dominant negative mutant of n r f 2 is one whose activity has been reduced by introducing a mutation to n r f 2.
  • the dominant negative mutant can indirectly inhibit its activity by competing with natural n r f 2.
  • the dominant negative mutant can be prepared by introducing a mutation into a nucleic acid encoding n r f 2. Examples of the mutation include an amino acid mutation (for example, deletion of one or more amino acids, substitution, carotenization) at a functional site that causes a decrease in the function of the site.
  • the dominant negative mutant can be prepared by a method known per se using PCR or a known kit. Examples of the functional site of n r f 2 include the N e h 1 domain, which is a DNA binding domain.
  • the agent of the present invention can also contain an expression vector containing a nucleic acid molecule encoding the nucleic acid molecule or protein molecule as an active ingredient.
  • the oligonucleotide or polynucleotide encoding the above-mentioned nucleic acid molecule must be operably linked to a promoter capable of exhibiting promoter activity in mammalian cells to be administered.
  • the promoter used is not particularly limited as long as it can function in the mammal to be administered.
  • SV 40-derived early-stage motor cytomegaloinoless LTR, laus meat Jffi Winores LTR, M o Virus promoters such as mu Lv-derived LTR and adenovirus-derived early promoters, and mammalian component protein gene promoters such as the 0-actin gene promoter, PGK gene promoter, and transferrin gene promoter.
  • a promoter to be used a promoter specific for cells having an ability to form bone and cartilage (for example, osteoblasts, chondrocytes) may be used. Such promoters are specific to cells with the ability to form bone and cartilage It can be the promoter of any gene that is expressed.
  • the osteoblast-specific promoter is a type I collagen, osteocalcin gene-derived promoter, and the chondrocyte-specific promoter is a type II collagen gene.
  • a promoter can be used.
  • the present invention also provides an expression vector having such a promoter.
  • the expression vector preferably contains a transcription termination signal, that is, a terminator region downstream of the oligo (poly) nucleotide encoding the nucleic acid molecule.
  • a transcription termination signal that is, a terminator region downstream of the oligo (poly) nucleotide encoding the nucleic acid molecule.
  • selectable marker genes for selection of transformed cells such as genes that confer resistance to drugs such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, hygromycin, phosphinothricin, and genes that complement auxotrophic mutations. It can also be included.
  • the basic skeleton vector used as the expression vector may be a plasmid or a viral vector, but suitable vectors for administration to mammals such as humans include adenowinoles, retroviruses, adeno-associated winoles, and herpes.
  • suitable vectors for administration to mammals include adenowinoles, retroviruses, adeno-associated winoles, and herpes.
  • viral vectors such as pesvirus, vaccinia uinoles, box uinoles, polio uinoles, Sindbis Winores, Sendai virus, and Epstein Barr Winores.
  • the agent of the present invention can contain any carrier, for example, a pharmaceutically acceptable carrier, in addition to the substance that regulates the expression or function of nrf2.
  • a pharmaceutically acceptable carrier include sucrose, starch, mannitol, sonorebit, lactose, dalcoose, cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate and other excipients, cellulose, methylcellulose, and hydroxypropyl.
  • Preparations suitable for oral administration include solutions in which an effective amount of substance is dissolved in a diluent such as water or physiological saline, capsules, sachets or tablets containing the effective amount of the substance as solids or granules.
  • a diluent such as water or physiological saline
  • capsules, sachets or tablets containing the effective amount of the substance as solids or granules.
  • a suspension in which an effective amount of a substance is suspended in an appropriate dispersion medium an emulsion in which a solution in which an effective amount of a substance is dissolved is dispersed and emulsified in an appropriate dispersion medium, or a powder, granule, etc. is there.
  • Formulations suitable for parenteral administration include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions, which include antioxidants Buffer solution, antibacterial agent, tonicity agent and the like may be contained.
  • Aqueous and non-aqueous sterile suspensions can also be mentioned, which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like.
  • the preparation can be enclosed in a unit dose or multiple doses like ampoules and vials.
  • the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be lyophilized and dissolved or suspended in a suitable sterilized vehicle immediately before use, and stored in a state.
  • the dosage of the agent of the present invention includes the activity and type of the active ingredient, the mode of administration (for example, oral or parenteral), the severity of the disease, the animal species to be administered, the drug acceptability of the administered subject, body weight, age
  • the amount of active ingredient per day for an adult is usually about 0.OO lmg to about 2.O g.
  • the agent of the present invention is useful, for example, as a pharmaceutical or research reagent.
  • a pharmaceutical or research reagent for example, bone or cartilage cancer, bone or cartilage dysplasia, osteoporosis (for example, postmenopausal osteoporosis), rheumatoid arthritis
  • It can be used as a prophylactic or therapeutic agent for bone diseases such as arthritis, arthritis, synovitis, osteoarthritis, osteomarcular disease, or an inducer of the disease model.
  • the agent of the present invention contains a substance that promotes the expression or function of nrf 2, it is useful as an agent for inhibiting differentiation of cells having osteo / chondrogenic activity (for example, osteoblasts, chondrocytes).
  • nrf 2 is a factor capable of suppressing the differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage. Therefore, the substance that promotes the expression or function of nrf 2 suppresses the differentiation of cells that have the ability to form bone and cartilage, and therefore may reduce the number of cells or suppress the formation of bone and cartilage. It is done.
  • the agent of the present invention can be used for the prevention / treatment of diseases in which inhibition of bone / cartilage formation is desired, the decrease in the number of cells having the ability to form bone / cartilage, or the disease model in which bone / cartilage formation is suppressed.
  • diseases in which inhibition of bone / cartilage formation is desired include bone or cartilage cancer, dysplasia of bone or cartilage, and bone marble disease.
  • the disease in which bone / cartilage formation is suppressed in the disease model in which bone / cartilage formation is suppressed can be the same as the disease described later in which promotion of bone / cartilage formation is desired.
  • the agent of the present invention contains a substance that suppresses the expression or function of nrf 2, it can be useful as an agent for promoting differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage.
  • the present inventors have found that nrf 2 is a factor that can suppress the differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage. Therefore, by using a substance that suppresses the expression or function of nrf 2, the inhibition of differentiation of cells having the ability to form bone / cartilage by nrf 2 is released (that is, the differentiation of cells having the ability to form bone / cartilage is promoted). ) It is thought that it can cause an increase in the number of cells, or promote bone-cartilage formation.
  • the agent of the present invention can be used for diseases in which bone and / or chondrogenesis is desired, an increase in the number of bone / cartilage-forming cells, or a disease model (eg, , Animals) (hereinafter, abbreviated as “prophylaxis or treatment of diseases in which promotion of chondrogenesis is desired” as necessary).
  • Diseases for which promotion of bone and cartilage formation is desired examples thereof include osteoporosis (for example, postmenopausal osteoporosis), rheumatoid arthritis, arthritis, synovitis, and osteoarthritis.
  • the disease in which bone and cartilage formation is promoted can be the same as the above-mentioned diseases in which suppression of bone and cartilage formation is desired.
  • the agent of the present invention may contain other substances as active ingredients (for example, bone 'chondrogenic cell differentiation regulators, bone' joint disease prevention Therapeutic agents), they can be provided together (eg, stored as a mixture in the same container) or isolated from each other (eg, stored in different containers).
  • active ingredients for example, bone 'chondrogenic cell differentiation regulators, bone' joint disease prevention Therapeutic agents
  • the present invention also provides a method for regulating differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage, which may be a form of in vitro use of the agent of the present invention.
  • the method includes, for example, culturing so as to regulate the expression or function of n r f 2 in cells having the ability to form bone and cartilage using a substance that regulates the expression or function of n r f 2.
  • Bone and cartilage-forming cells can be derived from any animal, such as birds, mammals (eg, ushi, hidge, pig, goat, monkey, human, rabbit, rat, hamster, guinea pig, mouse) Cell.
  • the cell may be a cell induced to differentiate from a stem cell such as an embryonic stem cell or a somatic stem cell.
  • cells suitable for allogeneic transplantation can be obtained by using cells derived from the same species as the animal intended for transplantation. By using cells derived from these cells, cells suitable for allogeneic transplantation can be obtained.
  • the cells can be obtained by a method known per se (for example, F A C S) using a single marker molecule (described later).
  • the medium used for cell culture is not particularly limited as long as it is suitable for the differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage.
  • minimal essential medium MEM
  • Danolecco modified include minimal essential medium (DM EM), F 12 medium or RPMI 16 40 medium, or a mixed medium thereof as a basic medium.
  • additives to the medium include various amino acids, various inorganic salts, various vitamins, and various antibiotics. Substances, buffering agents, etc.
  • the culture conditions are also appropriately determined.
  • the pH of the culture medium is about 6 to about 8, and the culture temperature is usually about 30 to about 40 ° C.
  • the medium may or may not contain serum, but when cell transplantation is intended, a serum-free medium is preferable from the viewpoint of preventing contamination of unidentified components and reducing the risk of infection.
  • the cells obtained by the method of the present invention can be used for cell therapy (transplantation).
  • the substances and materials used in the culture are the same as those of the subject receiving cell therapy from the viewpoint of allogeneic transplantation. It is preferable to unify substances and materials derived from the same species.
  • the regulation method of the present invention can further include isolating a cell whose differentiation is regulated (for example, a cell whose differentiation is promoted or suppressed) from a cell having the ability to form bone and cartilage. Isolation of cells can be performed by a method known per se using a cell marker.
  • the regulation method of the present invention can also include further regulating the differentiation of cells induced to differentiate from cells having the ability to form bone and cartilage.
  • the method of further differentiating cells induced to differentiate from cells having the ability to form bone and cartilage is not particularly limited. For example, in the presence of a substance that regulates nrf 2 expression or function and another differentiation regulator. And a method of using another differentiation regulator after culturing cells having the ability to form bone and cartilage in the presence of a substance that regulates the expression or function of nrf2.
  • the regulation method of the present invention can regulate, for example, differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage, or more specifically differentiate cells other than cells having the ability to form bone and cartilage from stem cells.
  • differentiation efficiency can be increased by inhibiting the differentiation into cells having the ability to form bone and cartilage.
  • the present invention relates to a substance capable of regulating the differentiation of cells having osteochondrogenic ability, run X 2 recruitment or osteocalcin, comprising evaluating whether a test substance can regulate nrf 2 expression or function. Screening methods for substances that can regulate expression, or substances that can prevent or treat bone / joint diseases, and the screening And a differentiation regulator or preventive / therapeutic agent containing the substance.
  • test substance to be subjected to the screening method may be any known compound and novel compound, such as a nucleic acid (eg, nucleoside, oligonucleotide, polynucleotide), carbohydrate (eg, monosaccharide, disaccharide).
  • a nucleic acid eg, nucleoside, oligonucleotide, polynucleotide
  • carbohydrate eg, monosaccharide, disaccharide
  • Oligosaccharides, polysaccharides), lipids (eg, saturated or unsaturated linear, branched and / or cyclic fatty acids), amino acids, proteins (eg, oligopeptides, polypeptides), organic low molecular weight compounds, combinatorial Examples include compound libraries prepared using chemistry techniques, random peptide libraries prepared by solid phase synthesis or phage display methods, or natural components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, and the like.
  • the screening method of the present invention can be carried out in any form as long as it can be evaluated whether or not the test substance can regulate the expression or function of n r f 2.
  • the screening method of the present invention includes 1) measurement of nrf 2 expression level using cells capable of measuring nrf 2 expression, 2) measurement of nrf 2 expression level using non-human animals, 3) nrf 2 function can be measured using a reconstitution system (non-cell system) capable of measuring nrf 2 function, and 4) nrf 2 function measurement using nrf 2 expressing cells.
  • the screening method using cells capable of measuring n r f 2 expression may include, for example, the following steps (a) to (c):
  • step (a) of the above method the test substance is brought into contact with cells capable of measuring nrf 2 expression.
  • Contacting the test substance with cells capable of measuring nrf 2 expression can be done in 'medium.
  • a cell capable of measuring nrf 2 expression refers to a cell capable of directly or indirectly evaluating the expression level of an nrf 2 product (eg, a transcription product or a translation product).
  • the cell that can directly evaluate the expression level of the nrf 2 product can be an nrf 2 expressing cell, whereas the cell that can indirectly evaluate the expression level of the nrf 2 product is the nrf 2 transcriptional regulatory region.
  • the cell capable of measuring the expression of nrf 2 can be an animal cell, for example, a mammalian cell such as a mouse, rat, hamster, guinea pig, rabbit, inu, monkey or human.
  • the nrf2-expressing cell is not particularly limited as long as it can potentially express nrf2.
  • Such cells can be easily identified by those skilled in the art, and primary cultured cells, cell lines derived from the primary cultured cells, commercially available cell lines, cell lines available from cell banks, and the like can be used.
  • cells having the ability to form bone and cartilage for example, osteoblasts, chondrocytes
  • a cell that enables reporter assembly for the nrf2 transcriptional regulatory region is a cell that contains a nrf2 transcriptional regulatory region and a reporter gene operably linked to the region.
  • the n r f2 transcriptional regulatory region, reporter gene can be inserted into an expression vector.
  • the nrf 2 transcription regulatory region is not particularly limited as long as it is a region capable of controlling nrf 2 expression.For example, the region from the transcription start point to about 2 kbp upstream, or 1 or more in the nucleotide sequence of the region And a region having the ability to control the transcription of nrf 2 and the like.
  • the reporter gene may be any gene that encodes a detectable protein or an enzyme that produces a detectable substance. For example, a GFP (green fluorescent protein) gene, a GUS (single-darc mouth nidase) gene, an LUC peroxidase ) Gene, CAT (chloramphenicol acetyl transferase) gene and the like.
  • the expression level of the reporter gene can be quantitatively analyzed as long as the nrf2 transcriptional regulatory function can be evaluated. As long as there is no particular limitation. However, since a physiological transcriptional regulatory factor for nrf 2 is expressed and considered to be more appropriate for evaluation of nrf 2 expression regulation, nrf 2 expressing cells are preferable as the introduced cells.
  • the medium in which the test substance is contacted with cells capable of measuring nrf 2 expression is appropriately selected according to the type of cells used. For example, about 5 to 20% urine fetal serum is used. Including minimal essential medium (MEM), Dulbecco's modified minimal essential medium (DM EM), RPMI 1640 medium, 19.9 medium, and the like.
  • the culture conditions are also appropriately determined according to the type of cells used. For example, the pH of the medium is about 6 to about 8, and the culture temperature is usually about 30 to about 40 ° C. The culture time is about 12 to about 72 hours.
  • step (b) of the above method first, the expression level of nrf 2 in the cell contacted with the test substance is measured.
  • the expression level can be measured by a method known per se in consideration of the type of cells used. For example, when nrf2-expressing cells are used as cells capable of measuring nrf2 expression, the expression level can be measured by a method known per se for nrf2 products such as transcripts or translation products.
  • the expression level of the transcription product can be measured by preparing total RNA from cells and performing RT-PCR, Northern blotting, or the like.
  • the expression level of the translation product can be measured by preparing an extract from the cells and immunologically.
  • a radioactive isotope immunoassay (RIA method), an ELISA method (Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)), a fluorescent antibody method, and the like can be used.
  • RIA method radioactive isotope immunoassay
  • ELISA method Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)
  • fluorescent antibody method and the like
  • the expression level can be measured based on the signal intensity of the reporter.
  • the amount of nrf 2 in the nucleus ie, the amount of nrf 2 transferred from the cytoplasm into the nucleus
  • the intracellular localization can be measured by a method known per se.
  • nrf 2 fused with a reporter gene is introduced into an appropriate cell, cultured in the medium in the presence of the test substance, and then confocal microscopic.
  • the fluorescence signal in the cell or nucleus or the signal ratio thereof may be measured with a mirror.
  • the intracellular localization of nrf 2 can also be measured by immunostaining using an nrf 2 antibody.
  • the expression level of n r f 2 in the cells contacted with the test substance is compared with the expression level of n r f 2 in the control cells not contacted with the test substance.
  • the comparison of expression levels is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the expression level of nrf 2 in the control cells not contacted with the test substance is the expression level measured at the same time, even if the expression level was measured in advance, compared to the expression level of nrf 2 in the cells contacted with the test substance.
  • the amount may be an expression level, but is preferably an expression level measured simultaneously from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment.
  • a test substance that regulates the expression level of n r f 2 is selected.
  • a test substance that increases the expression level of n r f 2 promotes the expression
  • the test substance that reduces the expression level of n r f 2 can be used for the prevention / treatment of diseases in which the promotion of bone / cartilage formation is desired.
  • the screening method of the present invention using a non-human animal includes, for example, the following steps (a) to (c):
  • step (a) of the above method for example, animals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, monkeys such as monkeys, and birds such as birds are used.
  • animals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, monkeys such as monkeys, and birds such as birds are used.
  • a bone / joint disease model animal can also be used.
  • Administration of a test substance to an animal can be performed by a method known per se.
  • step (b) of the above method the expression level of nrf 2 is measured by a method known per se Can be done.
  • the expression level in bone or cartilage tissue is measured as the expression level of nrf2.
  • the comparison of the expression level in this step (b) and the step (c) of the above method can be performed in the same manner as the screening method using cells capable of measuring the expression of nrf2.
  • a reconstitution system that can measure the function of nrf 2 is a non-cellular system that can evaluate the ability of the test substance to regulate the function of nrf 2, including nrf 2 (protein) and other factors.
  • the screening method using a reconstruction system capable of measuring the function of n r f 2 can be performed in various forms.
  • such screening methods include: 3 a) a method that includes assessing whether a test substance can modulate the formation of a complex containing nrf 2 and its coupling factor; 3 b) nrf 2 A method comprising evaluating whether a test substance can regulate the binding of a test substance to a DNA containing a cis-acting element existing upstream of the nrf 2 target gene, 3 c) phosphorylation of nrf 2 by PKC'S A method comprising evaluating whether the test substance can be regulated.
  • method 3a) above may include, for example, the following steps (a) to (c):
  • Ke ap 1 Ma f (for example, Ma f F, Ma f G, Ma f K), CBP (C RE B binding protein) are nrf 2 coupling factors. Can be used. Contacting can be performed in a solution that allows formation of the complex.
  • step (b) of the above method first, the compound formed when the test substance is brought into contact with The amount of coalescence is measured.
  • the amount of complex can be measured, for example, using surface plasmon resonance (eg using Biacore), immunological methods (eg immunoprecipitation), Quartz Crystal Microbalance (QCM) And a method for detecting energy transfer.
  • the amount of the complex formed when the test substance is contacted is compared with the amount of the complex when the test substance is not contacted.
  • the comparison of complex amounts is preferably performed based on the presence or absence of significant differences.
  • the amount of the complex when the test substance is not contacted may be the amount of the complex measured in advance or the amount of the complex measured simultaneously with respect to the measurement of the amount of the complex when the test substance is contacted. Although it is good, it is preferably the amount of complex measured simultaneously from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment.
  • a test substance that regulates the amount of the complex is selected. For example, increase the amount of complex containing nrf 2 and nrf 2 coupling factors such as Ma f (to promote complex formation), or nrf 2 and nrf 2 cofactors such as Ke ap 1 and CB P
  • the test substance can be used for prevention / treatment of diseases in which inhibition of bone / cartilage formation is desired.
  • test substances that increase the amount of complex containing nrf 2 and nrf 2 conjugate factors such as Ke apl and CBP, or decrease the amount of complex containing nrf 2 and nrf 2 conjugate factors such as Ma f Can be used for prevention / treatment of diseases in which promotion of bone / cartilage formation is desired.
  • the method of 3b) above may include, for example, the following steps (a) to (c):
  • step (c) A step of selecting a test substance that regulates the formation of the complex based on the comparison result of (b) above.
  • AR E-like 2 and OS E 2 existing upstream of osteocalcin which is the nr f.2 target gene found by the present inventors, can be used as cis-acting elements.
  • substances that inhibit the binding of ARE-like 2 or OSE 2 to nrf 2 are often considered to be able to inhibit the binding of other nrf 2 target genes, such as cis-acting elements, to nrf 2.
  • HO-1, Prx-1, A170, glutathione 1 S-transferase (GSTs), NAD (P) H nrf 2 binding found upstream of genes such as quinonoxide reductase I Sites can also be used (see, for example, Advances in Pharmacology 38, 293-328, 1997, Free Radical Research 31, 273-300, 1999). However, since it is more appropriate to directly evaluate the effect on the point of action, ARE-like 2 and OSE 2 are preferred as cis-acting elements. Contacting can be performed in a solution that allows the formation of a protein-DNA complex.
  • step (b) of the above method the measurement and comparison of the amount of protein-DNA complex can be performed by the same methodology as the measurement of the amount of complex containing nrf 2 and nrf 2 conjugate factor.
  • the method include EMS A (Electrophoretic Mobility Shift Assay) or gel shift assay.
  • ARE-like 2 and / or OS E 2 When ARE-like 2 and / or OS E 2 is used as a cis-acting element, it binds only to ARE-like 2 and Z or OS E 2 in order to select a substance with higher specificity from the test substances. However, you can confirm that it does not bind to other nrf 2 binding sites.
  • a test substance that regulates the amount of protein-DNA complex is selected.
  • a test substance that increases the amount of the complex (accelerates complex formation) can be used for prevention / treatment of a disease in which inhibition of bone / cartilage formation is desired.
  • a test substance that reduces the amount of the complex can be used for the prevention / treatment of diseases in which the promotion of bone / cartilage formation is desired.
  • the method of 3c) can include, for example, the following steps (a) to (c): (a) contacting the test substance, and n r.f 2 (protein) and P KC ⁇ ;
  • step (a) of the above method the test substance, n r f 2 and PKC ⁇ are contacted in an Atsy system that allows phosphorylation of n r f 2 by PKC S.
  • n r f 2 is promoted to dissociate from Ke a ⁇ 1 when the 40 th Ser is phosphorylated by protein kinase C ⁇ (PKC ⁇ ).
  • PKC ⁇ protein kinase C ⁇
  • step (b) of the above method the phosphorylation level is measured by a method known per se, for example, an immunological technique using an anti-phosphorylated serine antibody.
  • the comparison of the phosphate level in this step (b) can be performed in the same manner as in the above method 1) or 3a).
  • a test substance that regulates the amount of phosphorylated n r f 2 is selected. For example, increasing the amount of phosphorylated nrf 2 (promoting phosphorylation) The test substance suppresses r un x 2 dependent osteocalcin expression through promoting the dissociation of nrf 2 from Ke ap 1 obtain. Therefore, such a test substance can be used for the prevention or treatment of diseases in which suppression of bone / cartilage formation is desired. On the other hand, the test substance that decreases the amount of phosphoric acid nrf 2 (suppresses phosphorylation) can release the suppression of runcalcin-dependent osteocalcin expression (that is, promote osteocalcin expression). ⁇ Can be used to prevent or treat diseases where promotion of cartilage formation is desired.
  • the screening method using n r f 2 expressing cells can include, for example, the following steps (a) to (c):
  • step (a) of the above method the test substance is brought into contact with nrf2-expressing cells.
  • Contact of the test substance with n rf2 expressing cells can be performed in a medium.
  • the nrf2-expressing cells used here can be cells that can express nrf2 to the extent that nrf2 assembly can be performed at the protein level.
  • step (b) of the above method first, the functional level of n r f 2 in the cell contacted with the test substance is measured.
  • the functional level of n r f 2 can be measured and evaluated using, for example, the amount of phosphorylated n r f 2 in cells, the degree of r nx 2 recruitment, the expression level of osteocalcin, or its promoter activity as an index. These measurements can be performed by a method known per se, for example, the amount of phosphorylated nrf 2 is determined by an immunological technique using an anti-phosphorylated serine antibody, and the degree of run X 2 recruitment is determined by Ch IP assay. Osteocalcin expression can be measured by immunological techniques, PCR and Northern plotting, and promoter activity can be measured by reporter assay. In addition, the comparison of the function level in this process (b) can be performed similarly to the comparison mentioned above.
  • a test substance that modulates the functional level is selected. For example, the amount of phosphorylated nrf 2 is increased (promoted), the level of r un X 2 recruitment, the expression level of osteocalcin or its promoter activity is decreased (suppressed). It can be used for prevention / treatment of diseases in which suppression of cartilage formation is desired. On the other hand, test substances having these opposite effects can be used for the prevention / treatment of diseases in which the promotion of bone / cartilage formation is desired.
  • the screening method of the present invention comprises a substance capable of regulating the differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage, a substance capable of treating bone 'preventing joint diseases', or It is possible to screen for substances that can regulate the expression of ortocalcin. Therefore, the screening method of the present invention is useful for the development of pharmaceuticals or research reagents.
  • the present invention includes analyzing the effect of specific mutations of nrf 2 on the differentiation of cells having the ability to form bone and chondrogenesis, or the effect on the risk of developing bone and joint diseases.
  • the n r f 2 mutation is an arbitrary mutation in n r f 2, and includes an n r f 2 polymorphism and an artificial mutation of n r f 2.
  • An nrf 2 polymorphism is a nucleotide sequence variation that is found at a certain frequency in genomic DNA containing the nrf 2 gene in a population, and replacement of one or more DNAs in the genomic DNA containing the nrf 2 gene Deletions, additions (eg, SNPs, haplotypes), as well as repeats, inversions, translocations, etc. of partial regions in the genomic DNA.
  • the type of nrf 2 polymorphism identified by the method of the present invention is a nucleotide sequence mutation that can cause a change in the differentiation efficiency of cells having the ability to form bone and chondrogenic among all types of polymorphisms in nrf 2.
  • it may be a nucleotide sequence variation that differs in frequency between animals affected and unaffected by a given disease (eg, bone / joint disease).
  • the animals to be analyzed for the n r f 2 polymorphism are not particularly limited as described above, but humans are preferable.
  • the analysis can be performed by a method known per se. For example, when there is a significant difference in the frequency of occurrence of a specific polymorphism depending on the frequency of occurrence of the disease (eg, bone or joint disease) and severity as a result of an analysis method such as linkage analysis, the polymorphism of that type Can be determined as a polymorphism that changes the differentiation of bone and cartilage-forming cells, or changes the risk of developing bone and joint diseases. Analysis can also be performed in vitro.
  • culturing cells with bone and cartilage forming ability into which an nrf 2 expression vector containing a specific mutation (eg, polymorphism) has been introduced, and introducing its differentiation efficiency into a control rv rf 2 expression vector Mutations can be analyzed by comparing the efficiency with the control cells obtained.
  • a specific mutation eg, polymorphism
  • a DNA sample prepared from a biological sample derived from a mammal is subjected to sequencing, and a new type of nrf 2 polymorphism is determined, or by introducing a nucleotide mutation, nrf 2 It may further include a step of artificially producing the mutant.
  • Biological samples include nr f 2 expressing tissues (eg, bone, cartilage) or cells (eg, osteoblasts, chondrocytes) or other samples (eg, blood) as well as hair, nails, skin Any tissue containing genomic DNA such as mucosa can be used.
  • the biological sample is preferably hair, nails, skin, mucous membrane, blood, plasma, serum, saliva and the like.
  • Polymorphisms can be determined by analyzing a large number of nucleotide sequences of genomes or transcripts contained in biological samples of different origins and identifying mutations found at a certain frequency in the determined nucleotide sequences.
  • the identification method of the present invention includes, for example, identification of a polymorphism that can affect the risk of developing a predetermined disease, or nrf 2 mutant (for example, a mutant in which differentiation regulation ability or specific activity is enhanced or suppressed). It is useful for the production of
  • the present invention provides a method for determining the biological state of an animal with respect to differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage (and Z or bone and joint diseases) based on measurement of the expression level of n r f 2.
  • the determination method of the present invention includes the following steps (a) and (b):
  • step (a) of the above method the expression level of nrf 2 is measured in a biological sample collected from an animal.
  • the animal is not particularly limited as described above, but human is preferable.
  • the biological sample is not particularly limited as long as it is a sample capable of measuring the expression level of nrf 2.
  • Examples include bone and cartilage. Measurement of the expression level of nrf 2 can be performed in the same manner as the screening method of the present invention.
  • step (b) of the above method the biological state of the animal with respect to differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage can be evaluated based on the expression level of n r f2.
  • the measured expression level of n r f 2 is compared with the expression level of n r f 2 in an animal without the abnormality of differentiation or in a normal animal.
  • the comparison of expression levels is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the expression level of n r f2 in an animal without abnormal differentiation or in a normal animal can be determined by a method known per se.
  • the animal has an abnormality in differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage, or that the animal may be suffering from a predetermined disease. It can be determined whether there is a sex or whether it is more or less likely to be affected in the future. From the results of this Example, when the expression level of nrf 2 is high, the differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage is further suppressed, whereas when the expression level of nrf 2 is low, the ability to form bone and cartilage is suppressed. It is considered that the differentiation of cells having a potential can be further promoted.
  • n r f 2 changes in the expression level of a specific gene related to the disease are often observed before and after the onset of the specific disease.
  • increased expression of n r f 2 has also been confirmed in postmenopausal osteoporosis model animals. Therefore, by analyzing the expression level of n r f 2, it is considered possible to determine abnormalities in differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage and / or the onset or risk of onset of a predetermined disease.
  • the present invention also provides a diagnostic agent capable of the above determination, comprising a reagent for measuring the expression level of n r f 2.
  • the reagent for measuring the expression level of nrf 2 is not particularly limited as long as nrf 2 expression can be quantified.
  • the above-described antibody against nrf 2, the nucleic acid probe for nrf 2 transcript, or the nrf 2 transcript It may contain multiple primers that can be amplified. These may or may not be labeled with a labeling substance.
  • the diagnostic agent of the present invention is used for the labeling.
  • a substance can also be included.
  • labeling substances include fluorescent substances such as FITC and FAM, luminescent substances such as luminol, luciferin, and lucigenin, radioisotopes such as 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, and 123 I, piotin, Examples include affinity substances such as streptavidin.
  • the nucleic acid probe for the n r f 2 transcript may be either DNA or RNA. DNA is preferable in consideration of force stability and the like.
  • the probe may be either single-stranded or double-stranded.
  • the size of the probe is not particularly limited as long as the nrf2 transcript can be detected, but is preferably about 15 to 1000 bp, more preferably about 50 to 500 bp.
  • the probe may be provided in a fixed form on a substrate like a microarray.
  • a plurality of primers capable of amplifying n r f 2 are selected such that a detectable size nucleotide fragment is amplified.
  • the detectable size of the nucleotide fragment is not particularly limited, and may have a length of, for example, about 100 bp or more, preferably about 200 bp or more, more preferably about 400 bp or more.
  • the size of the primer is not particularly limited as long as n r f 2 can be amplified, but may be preferably about 15 to: L 00 bp, more preferably about 18 to 50 bp, and even more preferably about 20 to 30 bp.
  • the diagnostic agent of the present invention can further contain a reverse transcriptase.
  • the E determination method and diagnostic agent of the present invention can determine, for example, abnormal differentiation of cells having the ability to form bone / soft bone, the onset or risk of developing bone / joint disease in a predetermined subject, or a predetermined It is possible to determine that the abnormality or disease in the subject is caused by the suppression or promotion of nrf 2 expression. Therefore, it is possible to determine the treatment guidelines for the predetermined disease in the subject, It is useful for improving lifestyle habits for the purpose of prevention.
  • the present invention provides a method for determining the biological state of an animal against the differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage ('and Z or bone and joint diseases) based on the measurement of the polymorphism of nrf 2. Provide.
  • the determination method of the present invention includes the following steps (a) and (b):
  • step (a) of the above method a polymorphism of n r f 2 is measured in a biological sample collected from an animal.
  • the animal is not particularly limited as described above, but human is preferable.
  • the biological sample may be the same as that described above in the identification method of the present invention.
  • the polymorphic type can be measured by a method known per se. For example, TaqM an PCR method, invader method, RF L P (restriction fragment length polymorphism) method, PCR—S S C P (—strand DN A conformation polymorphism analysis) method, A SO (Allele
  • step (b) of the above method based on the polymorphism of nrf 2, the biological state of the animal with respect to the differentiation of cells having the ability to form bone / cartilage can be evaluated. Specifically, whether an animal may have cell differentiation abnormalities (eg, excessive promotion or suppression), or is more likely or less likely to suffer from a given disease in the future. It can be judged how.
  • cell differentiation abnormalities eg, excessive promotion or suppression
  • nrf 2 contains a polymorphism that enhances its function
  • differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage is further suppressed, while nrf 2 decreases its function. It is considered that differentiation can be promoted more when such polymorphisms are included.
  • nrf 2 contained in the open reader frame (ORF) is represented by SEQ ID NO: 4.
  • the resulting polymorphism can be such a polymorphism.
  • the polymorphism that can be measured can be obtained, for example, by the identification method of the present invention.
  • the present invention also provides a diagnostic agent comprising the n r f 2 polymorphism measuring reagent that enables the determination.
  • the reagent for measuring the polymorphism of nrf 2 is not particularly limited as long as the type of polymorphism can be determined.
  • An antibody specific to a partial peptide containing a polymorphic site, nrf 2 having a specific type of polymorphism It may be a nucleic acid probe that can be specifically measured, or a plurality of primers that can specifically amplify nrf 2 having a specific type of polymorphism.
  • Nucleic acid probes, primers can be for genomic DNA containing n r f 2 or n r f 2 transcripts.
  • the reagent may be labeled with a labeling substance.
  • the diagnostic agent of the present invention can further contain the labeling substance.
  • the diagnostic agent of the present invention may also contain a nucleic acid probe, a primer, a transcript, or a reagent for extracting genomic DNA.
  • An antibody specific to a partial peptide containing a polymorphic site is not particularly limited as long as it recognizes and recognizes nrf 2 containing the polymorphism more selectively than nrf 2 not containing the polymorphism.
  • Generation of a specific antibody against a partial peptide containing a polymorphic site can be performed by appropriately selecting a partial peptide to be used as an antigen.
  • a partial peptide having a shorter size including the polymorphic site is preferably used in order to enhance recognition of a specific polymorphism.
  • the size of the partial peptide is not particularly limited as long as it has immunogenicity, and can be, for example, a peptide composed of 8, 10 or 12 or more consecutive amino acids.
  • the nucleic acid probe capable of specifically measuring nrf 2 having a specific type of polymorphism is not particularly limited as long as nrf 2 having a specific type of polymorphism can be selected.
  • the probe may be either DNA or RNA, but DNA is preferable in consideration of stability and the like.
  • the probe may be either single-stranded or double-stranded.
  • the probe size should be as short as possible so that nrf 2 having a given SNP can be selected, for example, about 15 to 30 bp in size. .
  • the probe enables, for example, an ASO (Allele Specific Oligonucleotide) hybridization method.
  • a plurality of primers capable of specifically amplifying n r f 2 having a particular type of polymorphism are selected such that a measurable size nucleotide fragment is amplified.
  • Such a plurality of primers is designed to include a polymorphic site at the 3 ′ end of any one of the primers, for example.
  • the measurable size of the nucleotide fragment and the size of the primer may be the same as described above.
  • the diagnostic agent of the present invention can further contain a reverse transcriptase.
  • examples of the n r f 2 polymorphism measuring reagent include those containing a restriction enzyme that recognizes a specific polymorphic site. According to such a reagent, polymorphism analysis by R F L P becomes possible.
  • the determination method and diagnostic agent of the present invention can determine, for example, abnormal differentiation of cells having bone / soft bone formation ability, risk of developing bone / joint disease in a predetermined subject, or predetermined subject It is possible to determine that the abnormality or disease in is caused by suppression or promotion of nrf 2 expression. Therefore, the purpose is to determine a treatment guideline for a predetermined disease in the subject or to prevent a predetermined disease or the like. It is useful for improving lifestyle habits.
  • the present invention uses a substance that modulates the expression or function of nrf2, Provided is a method for determining the differentiation efficiency of cells having an ability.
  • the determination method of the present invention includes the following steps (a) and (b): (a) bone / cartilage collected from an animal using a substance that regulates the expression or function of nrf 2 Culturing cells having ability to form;
  • step (b) A step of evaluating the differentiation efficiency of the cells based on the characteristics of the cultured cells.
  • cells having the ability to form bone and cartilage collected from animals in the presence of a substance that regulates the expression or function of nrf 2 for example, bones such as osteoblasts and chondrocytes) Or cartilage-derived cells
  • Force Can be cultured in a medium.
  • the substance that modulates the expression or function of n r f 2 can be as described above, but the n r f 2 expression vector is preferred.
  • the animal may also be as described above, but preferably a subject for which it is desired to determine the differentiation efficiency of cells capable of forming bone and cartilage (for example, treatment with a substance that modulates nrf 2 expression or function). Cells collected from subjects under study) can be used.
  • step (b) of the above method differentiation efficiency can be evaluated based on the analysis result of the characteristics of cells cultured using a substance that regulates the expression or function of nrf2.
  • the analysis of cell traits is not particularly limited as long as it can characterize cells with the ability to form bone and cartilage, for example, acid mucopolysaccharide content, deposited Ca 2+ content, alkaline phosphatase activity, osteoblasts Specific marker molecules (eg type I collagen, osteocalcin), chondrocyte specific marker molecules (eg aggrecan, type II collagen, type X collagen), etc. This can be done by measuring the expression level of a specific marker molecule.
  • the evaluation of differentiation efficiency is carried out from the viewpoint of whether or not it is sufficient to affirm the usefulness of treatment for a given disease using a substance that regulates nrf 2 expression or function. Also good.
  • the differentiation efficiency of cells cultured with a substance that modulates nrf 2 expression or function depends on the differentiation efficiency of control cells (eg, normal cells) cultured with the substance. May be compared. Comparison of differentiation efficiency is performed based on, for example, the presence or absence of a significant difference in parameters for a trait.
  • the differentiation efficiency of control cells For the measurement of the differentiation efficiency of cells collected from the cells and cultured using the substance, the efficiency measured in advance or the efficiency measured at the same time may be used.
  • the present invention also provides a diagnostic agent capable of the above determination, which comprises a substance that modulates the expression or ⁇ ability of n r f2.
  • the determination method and diagnostic agent of the present invention can determine, for example, abnormal differentiation of cells having the ability to form bone and soft bone in a predetermined subject, or regulate the expression or function of nrf 2 in a predetermined subject. Therefore, it is useful for determining treatment guidelines for a predetermined disease in the subject.
  • kits The present invention provides a kit (a set or combination of components) containing components such as any substance, reagent, etc. mentioned in the present specification.
  • the kit of the present invention comprises the following (a), (b):
  • the substance that regulates the expression or function of n r f 2, the expression level of n r f 2, or the reagent for measuring the polymorphism is as described above.
  • the reagent for analyzing cells having the ability to form bone and cartilage is not particularly limited as long as it contains a component that enables analysis of the cell-specific character.
  • staining reagent for cells with bone and cartilage forming ability e.g., Arizarinreddo staining, alcian blue staining reagent comprises a component that allows quantification of the deposition C a 2 + quantity
  • cells with bone and cartilage forming ability Reagents for measuring specific activity (for example, alkaline phosphatase activity), reagents for identifying cells with bone / chondrogenic ability (for example, the above-mentioned osteoblast or chondrocyte specific markers, antibodies against one molecule Or a nucleic acid probe capable of producing or quantifying the marker molecule, or a reagent comprising a plurality of primers).
  • the reagent for regulating the differentiation of cells having the ability to form bone / cartilage is a substance that can regulate the differentiation of cells having the ability to form bone / cartilage (for example, the above-mentioned substances that can regulate the differentiation of osteoblasts or chondrocytes). May be included.
  • the kit of the present invention is useful because the preparation of the agent of the present invention and the determination method of the present invention can be carried out easily.
  • the present invention provides a cell having the ability to form bone and cartilage in which the expression of n r f2 is regulated.
  • the cell of the present invention can be any cell having the ability to form bone and cartilage, and examples thereof include osteoblasts and chondrocytes.
  • the cell of the present invention can also be an nrf2-expressing cell into which a substance that regulates the expression or function of nrf2 (for example, an nrf2 expression vector) has been introduced.
  • the cells of the present invention further include, for example, mammals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, cats, rabbits, horses, hidges, goats, pigs, sanorets, humans, chickens, etc. Among them, cells derived from mammals are preferred among the forces that can be derived from animals such as birds.
  • the cells of the present invention can also be, for example, primary cultured cells or cell lines (for example, cell lines derived from primary cultured cells, commercially available cell lines, cell lines available from cell banks), preferably cell lines It is.
  • osteoblast cell lines and chondrocyte cell lines are preferred as the cells having the ability to form bone and cartilage.
  • MC3T3-E1 cells are preferable among MC3T3-E1 cells, SV-HFO cells, TE-85 cells, and U2OS cells.
  • Examples of the chondrocyte cell line into which the gene is introduced include ATDC 5 cells, HCS-28 cells, and C 20 // A4 cells. Among them, ATDC 5 cells are preferable.
  • the cell of the present invention can be, for example, a cell that can transiently or stably express the above-mentioned gene, preferably a cell that can stably express the gene.
  • “Stable expression” means that the expression of the target gene is not transient.
  • cell culture for example, This means that the activity level of the target gene is maintained after passage and / or even after cryopreservation of the cells.
  • the cells of the present invention can be those whose differentiation is suppressed or promoted, and exhibit various specific traits.
  • differentiation into osteoblasts can be suppressed or promoted, and the amount of acid mucopolysaccharide, the amount of deposited Ca 2+ , alkaline phosphatase activity, and the expression level of the marker molecule described above are decreased or increased.
  • the cells of the present invention can be inhibited or promoted to differentiate into soft cells, and the amount of acidic mucopolysaccharide, alkaline phosphatase activity, and the expression level of the above marker molecule can be decreased or increased.
  • the cell of the present invention can be produced by a method known per se, for example, the above-described culture method.
  • the cells of the present invention are useful, for example, for screening for substances that can regulate the differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage, or substances that can prevent bone “joint diseases” (described above).
  • the cells of the present invention can also be used for screening of bone and joint disease pathological marker genes, screening for bone and Z or chondrocyte marker genes, analysis of pathological mechanisms of bone and joint diseases, and differentiation of bone and Z or chondrocytes. This is useful for analyzing the mechanism. These can be performed by expression profile analysis using, for example, a microarray, a protein chip (for example, an antibody chip or a non-antibody chip such as a chip manufactured by Cyphergen) or the like.
  • dd Y mouse was purchased from Sankyo Lab Service (Tokyo).
  • MC 3 T 3—E 1 cells and ATDC 5 cells are purchased from RIKEN BioResource Center (Tsukuba). I entered.
  • the ECL TM detection reagent, peroxidase-labeled anti-rabbit IgG antibody was purchased from Amhersh am Life Science (Bukkinghams hire, England).
  • Taq polymerase and various restriction enzymes were purchased from Ta kara Biotech (Otsu).
  • Q uantum Pref reeze DNA Gel extraction spin column and Bio-Rad protein assembly reagent were purchased from Bio_Rad Laboratories (Hercules, CA, USA).
  • DIG RNA labeling kit and anti-DIG antibody were purchased from Roche Diagnostics (Mannheim, Germany).
  • P 1 us reagent and lipophectamine reagent were purchased from Invitrogen (San Diego, CA, USA).
  • pRL—TK, pRL-SV40 and dual luciferase reporter assembly system were purchased from Progaga (Madison, Wis., USA).
  • ⁇ -Minimum Essential Medium ⁇ -MEM
  • Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM
  • Minimum Essential Medium MEM
  • MC3T3- E 1 cells during ⁇ containing 10% FB S 2. seeded to each plate at a density of 5 X 10 3 cells cm 2, and cultured at 37 ° C, 5% C0 2 conditions. On the next day, the medium was replaced with 10% FB S- ⁇ containing 50 g mL ascorbic acid and 5 mM] 3-glycose phosphate, and this time was designated as day 0 of culture. The medium was changed every two days and several cultures were performed. - ATDC 5 cells are seeded on each plate at a density of 2.5 X 10 3 cells cm 2 in DMEM ⁇ F 1 2 (1: 1) containing 5% FBS, 37 ° C, 5% C ⁇ Incubated under 2 conditions.
  • the medium 1 0 ⁇ g / mL insulin, 1 0 / gZmL trans Feline was replaced with 5% FB S-DMEM / F 1 2 containing 3 X 1 0- 8 M selenite Natoriumu, the point On day 0 of culture.
  • the medium was changed every 2 days and cultured for several days.
  • MC 3 T 3 E 1 cells and ATDC 5 cells cultured for several days were washed twice with GPBS. Thereafter, total RNA was extracted using ISOGEN. Total RNA 1 / g extracted from cells and tissues is compared to DNa se (1 u / ⁇ l P ome ga) l / L, l O x DNa se nofer l / x L, RNase inhibitor (40 UZ L , Prome ga) 0.5 // L was added and reacted at 37 ° C for 20 minutes. Thereafter, 0.2M EDTA (pH 8.0, Prome ga) was added to stop the reaction.
  • oligo (dT) 18 primer 50/1 M, si gma genosys 1 // L, 10 mM d NTP mix (T akara Bio) 3.6 ⁇ DE PC water 2.4 ⁇ L
  • M—ML V reverse transcriptase (20 0 u / ( ⁇ L, invitrogen) 1.5 ⁇ L was added and reacted at 37 ° C. for 50 minutes.
  • the cDNA obtained by the reverse transcription reaction in which the reverse transcriptase was inactivated by heating at 70 ° C. for 15 minutes was used for PCR.
  • 10 X buffer (T akara) in PCR tube 500 mM KC 1, 15 mM Mg C 1 2 containing 10 OmM Tris HC 1 [pH 8.3] buffer) 2.5 / L
  • DNTP mix 2 // L
  • DNA polymerase PCR was performed by adding 0.125 / i L and adding ultrapure water to a total volume of 25 L.
  • the PCR product was electrophoresed on a 2% agarose / TBE gel, stained with ethidium bromide, and DNA was detected with UV.
  • MC 3 T 3 -E 1 cells are seeded in 24 welps at a density of 4 X 10 4 cells / mL, cultured at 37 ° C, 5% CO 2 , and transferred to the transfection 24 hours later.
  • the plasmid DNA to be introduced was diluted with Opti-MEM, mixed with PLUS reagent, and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. After that, it was mixed with lipofuctamine diluted with Opti-MEM and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. Plasmid DNA-lipofectamine complex was added to cells washed with Opti-MEM and transfected for an appropriate time. Thereafter, the medium was replaced with a medium containing serum and cultured for 20 hours.
  • the cells after stimulation were washed twice with cold GPB S, collected using a P a s s i ve 1 y s i s buffer (P rome g a), and stored at 80 ° C. until measurement. Noresiferase activity was measured using a dual luciferase reporter assembly system (Promomega).
  • the obtained supernatant was recovered as a whole cell soluble fraction, quantified by Bradford method, and stored frozen at 80 ° C.
  • SDS treatment buffer ⁇ OmM Tris containing 10% Glyceal Mole, 2% SDS, 0.01% Bromophenol Blue and 5% 2-Mercaptoethanol— HC 1 buffer ( ⁇ 6.8) was added at a volume ratio of 4: 1 and heated at 100 ° C. for 10 minutes.
  • electrophoresis (15 mAZ plate) was performed at room temperature using a polyacrylamide gel (concentration gel concentration 4.5%, separation gel concentration 7.5%).
  • the gel after SDS electrophoresis was blotted at 95 mA for 30 minutes on a PVDF membrane previously activated with 100% methanol. After blotted completion, dissolved in the film 5 0/0 skim ⁇ l 37mM Na C l Oyobi 0. 05% Twe en 20 a including 20mM T ris- HC 1 buffer (TBST) (pH7. 5) ⁇ Blocked for 1 hour.
  • This PVDF membrane was allowed to stand at 4 ° C. with anti-nrf 2 antibody diluted with 1% skim milk (dissolved in TBST) as the primary antibody. The next day, it was washed 3 times for 5 minutes each with TB ST.
  • a peroxidase-labeled anti-rabbit IgG antibody diluted with 1% skim milk (dissolved in TBST) was allowed to react as a secondary antibody for 1 hour at room temperature, and then 3 times for 10 minutes each using TBST. Washed. This PVDF membrane was reacted with an ECL TM detection reagent for 1 minute, and then exposed to an X-ray film to detect an antibody positive blot.
  • d dY mouse tibias were fixed with 4% paraformaldehyde, then decalcified with 20% EDT A PBS and dehydrated with 30% sucrose PBS. After dehydration, the sample was frozen with a dry ice, and a section with a thickness of 5 ⁇ was prepared using a cryostat and attached to a glass slide coated with silane. The sections were fixed with 4% paraformaldehyde (middle) for 10 minutes and then washed twice with ⁇ ⁇ 0.1 M phosphate buffer ( ⁇ ), 0.1% Tween ⁇ for 5 minutes. Next, it was treated with P roK (10 gZmL P roK in PBT) for 10 minutes, and washed twice with PBT for 5 minutes.
  • the sample was further fixed with 4% paraformaldehyde for 5 minutes and washed twice with PBT for 5 minutes. Then TEAZ0 .. 25% acetic anhydride for 15 minutes And washed twice with PBT for 5 minutes. Finally, it was rinsed lightly with DE PC water and air-dried at room temperature for 30 minutes. Probe with a concentration of 1 00 nL 1.5 // While diluting L with hybridization buffer 3 00 ⁇ L and allowing the sections to air dry 8
  • TNE buffer 37 ° C, 10 minutes
  • 2 XSSC 65 ° C, 20 minutes
  • 0.2 XSSC 65 ° C, 20 minutes
  • TNE Buffer 37 ° C
  • the reacted sections were reacted twice with MABT buffer (room temperature, 5 minutes) and NTMT buffer (room temperature, 10 minutes) containing levamisole, and ⁇ , ⁇ CIP was mixed 50 times with NTMT buffer containing levamisole.
  • the diluted solution was dropped on a piece to develop color. After color development, the mixture was reacted with NTMT buffer at room temperature for 3 minutes, washed lightly with PBS, sealed with 50% glyceride, and observed under a microscope.
  • MC 3 T 3 E 1 cells and ATDC 5 cells are seeded in 6 well dishes at a concentration of 4 ⁇ 10 4 / mL 3 7. And cultured at C, 5% C0 2 incubator. Cells that became 80%-90% confluent after 24 hours were used for the following gene transfer
  • FBS-free opti—MEM medium 500 ⁇ L with D'NA 2 jug and Plus test The drug 8 / i L was added and mixed, allowed to stand at room temperature for 15 minutes, mixed with 500 ⁇ L of opti-MEM medium containing Lipofuectamine 12 / z L, and further left for 15 minutes. This was added to cells cultured on a 6-well petri dish and cultured at 37 ° C for 1 hour. Thereafter, the medium was changed to the normal medium for each cell, and after 48 hours, the cells were treated with 0.25% trypsin for 5 minutes. The recovered cells were diluted to 100, 200 and 400 fold again seeded in de Itsushu were cultured at 37 ° C, 5% C0 2 incubator. After 24 hours, G418 (final concentration 600 / gZmL) was added and further cultured for about 2 weeks.
  • Chromatin immunoprecipitation (Ch IP) Atsey kit (Up statebiotechnology) was used. 10% 10% formaldehyde / PBS was added to the cells, and fixed at 37 ° C for 15 minutes at a final concentration of 1%. After 15 minutes, the medium was discarded and washed with ice-cold PBS (1 mM PMSF, 1 ⁇ g / m 1 aprotinin). 1 Lm l PBS was added to the O cm dish, the cells were scraped, and centrifuged in a 1.5 ml tube at 700 X g, 4 ° C for 3 minutes.
  • Lysis buffer 1% SDS, 1 OmM EDT A, 50 mM Tris-HC1, H8.1, 1 mM PMS F, lg / m1aprotune
  • 1 50 1 Bare vortex and stir on ice for 10 minutes. Sampnore was placed on ice, sonicated for 10 seconds, then 20 seconds apart, and sonicated a total of 4 times.
  • a total of 22 base pair synthetic double-stranded oligonucleotides containing the ARE sequence on the osteocalcin promoter were prepared.
  • the probe following radiolabeling with [ ⁇ _ 32 ⁇ ] Dokishi _CT P using Klenow fragment of DNA polymerase I, and purified using a spin column.
  • the proteoprotein complex and the free probe were run at 80 V in a buffer solution for electrophoresis [50 mM Tris, 0.38 M glycine, 2 mM EDTA, pH 8.5]. And separation at 4 ° C for 1.5 to 2.5 hours. After electrophoresis, the genome was dried with a gel dryer, and the radioactivity in the gel was detected by the autoradiogram method.
  • Example 1 nrf2 expression in bone and cartilage
  • n r f 2 is expressed in bone and cartilage.
  • Example 2 Expression of nrf2 / Maf signal transduction molecules in MC3T3-E1 and ATDC5 cells
  • nrf 2 / M af signaling mechanism in osteoblasts and chondrocytes, the expression of nrf 2 / Ma f signal transduction molecules in MC 3 T 3 -E 1 and ATDC 5 cells was determined by RT-PC. It was examined by R.
  • Example 3 stable expression of n r f 2 MC 3 T 3—E 1 and ATDC 5 cell lines established Ji! ⁇
  • nrf 2 expression plasmid containing the EF promoter was prepared, and nrf 2 stable expression MC 3T 3— E 1 and ATDC 5 cell lines were established.
  • FIG. 5 (A) and (B) The results are shown in FIG.
  • n r f 2 is expressed and functions in established cell lines.
  • nrf 2 stably expressing ATDC 5 cells was analyzed. Analysis was performed by Alcian blue staining, 'Al force phosphatase activity measurement, and semi-quantitative RT-PC R method. I got it.
  • n r f 2 is a factor that inhibits chondrocyte differentiation
  • Example 5 Analysis of n r f 2 stable (over) expressing MC 3 T 3—E 1 cells
  • n r f 2 stably expressing MC 3 T 3—E 1 cells were analyzed.
  • nrf 2 stable expression cell line not only showed a decrease in alizarin red staining (Fig. 9 (A)), but also a decrease in alkaline phosphatase activity (Fig. 9 (C), Fig. 10 (A)). . A decrease in the amount of accumulated calcium was also observed (Fig. 9 (D), Fig. 10 (B)).
  • n r f 2 is a factor that inhibits osteoblast differentiation
  • the osteocalcin promoter an osteoblast-specific gene, is significantly increased in activity by run X2, a master regulator of osteoblast differentiation. Therefore, in order to analyze the effect of nrf 2 on run X 2 -dependent osteoblast differentiation, a reporter study was conducted to determine whether nrf 2 can regulate OG 2 expression in a run X 2 dependent manner. did.
  • Example 7 Effect of n r f 2 on the intracellular localization of r u n X 2
  • nrf 2's osteoblast differentiation-inhibiting action is caused by the intracellular localization of r un x 2 by nrf 2
  • does nrf 2's expression affect the localization of runx 2 in the nucleus Whether or not was determined by immunocytochemistry using COS 7 cells and MC3T3-E1 cells.
  • n r f 2 does not affect the localization of r u n X 2 in the nucleus.
  • Example 8 Effect of n r f 2 on the binding of r u n X 2 on the osteocalcin promoter
  • Ch IP assembly was used to determine the run X 2 osteocalcin promoter. We considered the combination above.
  • n r f 2 is a factor that reduces r u n X 2 recruitment.
  • n r f 2 is the osteocalcin promoter ARE (
  • Example 10 Examination of the involvement of A R E -like 2 in the inhibitory effect of n r f 2 on the increase of r u nx 2 dependent OG 2 activity
  • Example 1 Involvement of n r f 2 in OSE 2 reporter activity
  • Example 12 nrf2 expression analysis in bone tissue of ovariectomized model mice
  • n r f 2 In order to examine the expression of n r f 2 in the bone tissue of ovariectomized mice, which are postmenopausal osteoporosis model mice, the expression of n r f 2 mRNA was examined by the semi-quantitative RT-PCR method and the in situ hybridization method.
  • Example 13 Effect of n r f 2 on osteoblast proliferation and cell death
  • n r f 2 did not show cell death-inducing action but suppressed cell proliferation.
  • nrf 2 is also expressed in bone and cartilage tissues, and that it negatively regulates bone and cartilage differentiation by regulating osteoblast and chondrocyte differentiation by runx 2 .
  • the regulator of the present invention makes it possible to regulate the differentiation of bone and cartilage-forming cells, and to prevent and treat bone and joint diseases.
  • the screening method of the present invention makes it possible to develop a differentiation regulator for cells having the ability to form bone and soft bone, and a preventive / therapeutic agent for bone / joint diseases.
  • the diagnostic agent of the present invention makes it possible to evaluate the biological state of an animal with respect to the differentiation of cells having the ability to form bone and cartilage, and to regulate the expression or function of nrf 2 in the treatment of patients with bone and joint diseases Enables prediction of therapeutic effects of the substance in the patient.

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Abstract

本発明は、新規作用機序を有する、骨芽細胞または軟骨細胞分化の調節剤、あるいは骨・関節疾患の予防または治療剤を提供する。より詳細には、本発明は、ｎｒｆ２の発現または機能を調節する物質を含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化の調節剤、あるいは骨・関節疾患の予防または治療剤；被験物質がｎｒｆ２の発現または機能を調節し得るか否かを評価することを含む、骨芽細胞または軟骨細胞分化を調節し得る物質、あるいは骨・関節疾患を予防または治療し得る物質のスクリーニング方法；骨芽細胞または軟骨細胞分化に変化をもたらすｎｒｆ２変異の同定方法；骨芽細胞または軟骨細胞分化に対する動物の生体状態の診断剤；骨芽細胞または軟骨細胞分化効率の診断剤；ｎｒｆ２の発現が調節された骨芽細胞または軟骨細胞などを提供する。

Description

明 細 書
骨 ·関節疾患の予防 ·治療剤およびそのスクリーニング方法 技術分野
本発明は、 細胞分化調節剤、 細胞分化を調節し得る物質のスクリ一二ング方法 、 細胞分化に変化をもたらす多型等の変異の同定方法、 細胞分化に対する動物の 生体状態または細胞分化効率の判定方法、 遺伝子発現が調節された骨 ·軟骨形成 能を有する細胞などを提供する。 背景技術
p 4 5 NF— E 2関連因子 2 (N r f 2) は、 塩基性ロイシンジッパー転写 因子であり、 ヘムォキシゲナーゼ一 1 (HO— 1) 、 ペルォキシレドキシン I ( P r X - 1 , MS P 23としても知られる） 、 A 1 70などのス トレス応答関連 遺伝子の転写調節を担う因子として知られている。 N r f 2は、 ァクチン結合タ ンパク質である Ke a p 1と結合した状態で細胞質に留まっているが、 酸化スト レスにより Ke a p 1から解離して核内に移行し、 Ma f とへテロダイマーの形 成後、 ARE (antioxidant response element) tこ結合すること【こより、 その標 的遺伝子の転写を開始する。 N r f 2はまた、 酸化ス トレスにより安定化され、 そのタンパク氧レベルが劇的に増加する。
n r f 2と骨芽細胞または骨との関連を示す知見として、 これまでに以下が知 られている。
Beck et al. , Cell Growth & Differentiation vol.12： 61-83 (2001) には、 588個の c DNAが固定化されたマウス遺伝子アレイパネルを用いて、 MC 3 T 3 -E 1細胞株の骨芽細胞様表現型への分化の間における遺伝子発現の変化を 解析した結果、 酸化ス トレスにより誘導される A 1 70およびその転写因子 n r f 2の発現上昇が観察されたことが記載されている。
Aono et al. , Biochemical and Biophysical Research Communications vol. 305 : 271-277 (2003) には、 MC 3 T 3— E 1細胞において、 ヒ素が n r f 2を活性化し、 引き続いてその標的遺伝子である H O— 1、 P r x— Iおよび A 1 7 0の転写を活性化させたことが記載されている。
Experimental Cell Research vol. 288 : 288-300 (2003) には、 MC 3 T 3 - E l細胞において、 ホスフェートの上昇により正に調節される複数の遺伝子の一 つに n r f 2があること、 ならびにホスフェートの上昇により調節される複数の 遺伝子が骨芽細胞分化と関連し得ることが記載されている。 一方で、 骨芽細胞分 化における n r f 2の発現上昇は、 ミネラル化 （mineralization) の進行に伴い 生じる過酷な環境に対する応答 （即ち、 細胞保護応答） であり得ることが記載さ れている。
しかしながら、 n r f 2が骨芽細胞、 軟骨細胞への分化を抑制し得る因子であ ること、 ならびに n r f 2が、 骨芽細胞および軟骨細胞分化のマスターレギユレ 一ターである r u n X 2の作用に干渉し得る因子であることなどについては何ら 報告がない。 発明の開示
遺伝子の機能解析は、 種々の疾患に対する新たな作用機序を有する医薬、 また は試薬の開発などにつながる。 本発明は、 n r f 2の機能解析により得られた知 見に基づき、 種々の疾患に対し新たな作用機序を有する医薬、 または試薬を提供 すること、 ならびに医薬または試薬の開発などに有用な手段を提供することなど を目的とする。
本発明者らは、 鋭意検討した結果、 n r f 2は骨 ·軟骨組織においても発現が 認められること、 ならびに骨，軟骨分化を負に調節し得ることを見出した。 本発 明者らはまた、 n r f 2が r u n X 2 (骨芽細胞および軟骨細胞分化のマスター レギュレーター） 依存的にォステオカルシン転写活性を抑制し得ることから、 n r f 2による骨 '軟骨分化の負 調節は、 n r f 2による r u n x 2の阻害に起 因し得るものであることなどを見出した。 従って、 ひ r f 2の発現または機能の 調節により、 骨芽細胞、 軟骨細胞を始めとする骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分 ィ匕、 あるいは骨 ·軟骨形成を調節することが可能になると考えられる。 また、 n r f 2の発現または機能を調節する物質のスクリーニングは、 骨 ·軟骨形成能を 有する細胞の分化調節能を有する、 ならびに あるいは骨 ·軟骨形成の異常に起 因する疾患に対する医薬および研究用試薬の開発などに有用であると考えられる 以上に基づき、 本発明者らは、 本発明を完成するに至った。 即ち、 本発明は下 記の通りである：
〔1〕 n r f 2の発現または機能を調節する物質を含む、 骨芽細胞または軟骨細 胞分化の調節剤；
〔2〕 n r f 2の発現または機能を調節する物質が、 n r f 2タンパク質または n r f 2発現ベクターである、 上記 〔1〕 の剤；
〔3〕 n r f 2の発現または機能を調節する物質が、 アンチセンス核酸、 リボザ ィム、 R N A i誘導性核酸、 デコイ核酸、 ターグティングベクター、 n r f 2抗 体、 n r f 2 ドミナントネガティブ変異体、 およびそれらの発現べクタ一からな る群より選ばれる、 上記 〔1〕 の剤；
〔 4〕 骨芽細胞または軟骨細胞分化の抑制剤である、 上記 〔 2〕 の剤； 〔5〕 骨芽細胞または軟骨細胞分化の促進剤である、 上記 〔3〕 の剤； 〔6〕 n r f 2の発現または機能を調節する物質を含む、 骨■関節疾患の予防ま たは治療剤；
〔7〕 被験物質が n r f 2の発現または機能を調節し得るか否かを評価すること を含む、 骨芽細胞または軟骨細胞分化を調節し得る物質のスクリーニング方法；
〔8〕 被験物質および n r f 2の発現を測定可能な細胞を用いて、 被験物質が該 細胞における n r f 2の発現を調節し得るか否かを評価することを含む方法であ る、 上記 〔7〕 の方法；
〔9〕 被験物質および非ヒ ト動物を用いて、 被験物質が該動物における n r f 2 の発現を調節し得るか否かを評価することを含む方法である、 上記 〔7〕 の方法 〔1 0〕 被験物質および n r f 2の機能を測定可能な再構成系を用いて、 被験物 質が該再構成系において n r f 2の機能を調節し得るか否かを評価することを含 む方法である、 上記 〔7〕 の方法；
〔1 1〕 被験物質および n r f 2発現細胞を用いて、 被験物質が該細胞において n r f 2の機能を調節し得るか否かを評価することを含む方法である、 上記 〔7 〕 の方法；
〔1 2〕 発現または機能の調節が発現または機能の促進である、 上記 〔7〕 の方 法；
〔1 3〕 発現または機能の調節が発現または機能の抑制である、 上記 〔7〕 の方 法；
〔1 4〕 被験物質が n r f 2の発現または機能を調節し得るか否かを評価するこ とを含む、 骨 ·関節疾患を予防または治療し得る物質のスクリーニング方法； 〔1 5〕 被験物質が n r f 2の発現または機能を調節し得るか否かを評価するこ とを含む、 r u n X 2リクルートまたはォステオカルシン発現を調節し得る物質 のスクリーニング方法；
〔1 6〕 n r f 2の特定の変異が骨芽細胞または軟骨細胞分化に及ぼす影響を解 析することを含む、 骨芽細胞または軟骨細胞分化に変化をもたらす n r f 2変異 の同定方法；
〔1 7 ) 変異が多型である、 上記 〔1 6〕 の方法；
〔1 8〕 n r f 2の発現量の測定用試薬を含む、 骨芽細胞または軟骨細胞分化に 対する動物の生体状態の診断剤；
〔1 9〕 n r f 2の多型の測定用試薬を含む、 骨芽細胞または軟骨細胞分化に対 する動物の生体状態の診断剤；
[ 2 0 ] n r f 2の発現または機能を調節する物質を含む、 骨芽細胞または軟骨 細胞分化効率の診断剤；
〔2 1〕 以下 （a ) および （b ) を含む、 キット ： · ( a ) n r f 2の発現または機能を調節する物質、 ならびに あるいは n r f 2 の発現量または多型の測定用試薬；
( b ) 骨芽細胞または軟骨細胞の同定用試薬、 ならびに あるいは骨芽細胞また は軟骨細胞の分化調節用試薬 （但し、 （a ) の物質を含む試薬を除く） ； 〔2 2〕 n r f 2の発現が調節された骨芽細胞または軟骨細胞；
〔2 3〕 骨芽細胞または軟骨細胞が、 n r f 2安定発現骨芽細胞株または軟骨細 胞株である、 上記 〔2 2〕 の細胞；
〔2 4〕 骨芽細胞または軟骨細胞特異的な n r f 2発現ベクター；
〔2 5〕 n r f 2の発現または機能を調節する物質の有効量を被験体に投与する ことを含む、 骨芽細胞または軟骨細胞分化の調節方法；
〔2 6〕 n r f 2の発現または機能を調節する物質の有効量を被験体に投与する ことを含む、 骨 ·関節疾患の予防または治療方法；
〔2 7〕 骨芽細胞または軟骨細胞分化の調節剤の作製における、 n r f 2の発現 または機能を調節する物質の使用；
〔2 8〕 骨 '関節疾患の予防または治療剤の作製における、 n r f 2の発現また は機能を調節する物質の使用。
本発明の調節剤は、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化調節、 ならびに骨 '関 節疾患の予防 ·治療などに有用であり得る。 本発明のスクリーニング方法は、 骨 •軟骨形成能を有する細胞の分化調節剤、 ならびに骨 ·関節疾患に対する予防 · 治療剤の開発などに有用である。 本発明の診断剤は、 骨 ·軟骨形成能を有する細 胞の分化に対する動物の生体状態の評価を可能とするため、 あるいは骨 ·関節疾 患の患者の治療に際して、 n r f 2の発現または機能を調節する物質の当該患者 における治療効果の予測を可能とするため、 有用である。 図面の簡単な説明
図 1は、 骨における n r f 2の発現を示す。 （A) 生後ー 齢の d d Yマウス 脛骨.のへマトキシリン .ェォシン染色 （B ) 生後ー 齢の d d Yマウス脛骨にお けるインサイチュハイブリダイゼーション 上パネルは全体像を、 下パネルは骨 組織の拡大を示す。
図 2は、 軟骨細胞における n r f 2の発現を示す。 発現は、 E 15. 5マウス 脛骨を用いてインサイチュハイプリダイゼーシヨンにより確認した。
図 3は、 3 T 3 -E 1細胞における n r f 2/m a f シグナル伝達分子の 発現を示す。 発現は RT_ PC Rにより確認した。 パネル下の数値は、 MC 3T 3— E 1細胞の培養日数を示す。
図 4は、 ATDC5細胞における n r f 2 /ma f シグナル伝達分子の発現を 示す。 発現は RT— PC Rにより確認した。 パネル下の数値は、 ATDC 5細胞 の培養日数を示す。
図 5は、 樹立された MC 3T3— E 1および ATDC 5細胞における n r f 2 発現の確認を示す （Wtは野生型 （wild type) を示す。 以下同様。 ） （A) R T-PCR (B) ィムノブロッテイング （C) HO— 1プロモーターを用いたレ ポーターアツセィ （n = 4, **P< 0. 01)
図 6は、 n r f 2の過剰発現による A T D C 5細胞の軟骨細胞への分化の阻害 を示す。 （A) アルシアンブルー染色 （B) RT-PCR (C) アルカリフォス ファターゼ （ALP) 活性 （n = 4, **P<0. 01) (D) アルシアンブル 一染色の定量 （n = 4, **P< 0. 01)
図 7は、 n .r f 2の過剰発現による AT DC 5.細胞の軟骨細胞への分化の阻害 を示す。 （A) アルカリフォスファターゼ活性の経時的変化 （n = 4， **P< 0. 01) (B) 経時的なアルシアンブルー染色の定量 （n = 4, **P< 0. 01)
図 8は、 n r f 2の過剰発現による、 A T D C 5細胞における軟骨細胞分化マ 一力一の発現の阻害を示す。 （A) 半定量 RT— PCR (B) AT DC細胞培養 28日後における RT— PCRによる各マーカーの定量 （n = 4, **P< 0. 01)
図 9は、 n r f 2の過剰発現による MC 3 T 3— E'l細胞の骨芽細胞への分化 の阻害を示す。 （A) ァリザリンレッド染色 （B) RT-PCR (C) アルカリ フォスファターゼ （ALP) 活性 （n = 4, **P< 0. 01) (D) C a 2+含 量 （n = 4, **P< 0. 01)
図 10は、 n r f 2の過剰発現による MC 3 T 3— E 1細胞の骨芽細胞への分 化の阻害を示す。 （A) アルカリフォスファターゼ活性の経時的変化 （n = 4， **P< 0. 01) (B) C a 2+含量の経時的変化 （n = 4， **P< 0. 01) 図 1 1は、 n r f 2の過剰発現による、 MC 3 T 3— E 1細胞における骨芽細 胞分化マーカーの発現の阻害を示す。 （A) 半定量 RT— PCR (B) MC 3T 3—E 1細胞培養 28日後における RT— PC Rによる各マーカーの定量 （n = 4, **P< 0. 01)
図 1 2は、 n r f 2による r u n x 2依存的 OG 2レポーター活性の阻害を示 す。 （A) COS 7細胞を用いたレポーター活性の測定 （n = 4， **P< 0. 01) (B) MC3T 3—E 1細胞を用いたレポ一ター活性の測定 （n = 4, * *P< 0. 01)
図 1 3は、 n r f 2の過剰発現による r u n x 2の核局在の非変化を示す。 （ A) は、 C O S 7細胞において r u n x 2と n r f 2を共発現した時の両転写因 子の細胞内局在を示す。 （B) は、 MC 3 T 3— E 1細胞において n r f 2を発 現させた時の r u n X 2の細胞内局在を示す。
図 14は、 MC 3 T 3— E 1細胞における n r f 2の過剰発現による r u n x 2リクルートの低減を示す。 （A) は、 MC 3 T 3 _E 1細胞において n r f 2 と r u n x 2を共発現させた時のォステオカルシンプロモーター上への r u n x 2のリクルートを示す。 （B) は、 （A) の結果を定量化した結果を示す （n = 4, **P< 0. 01)
図 15は、 ォステオカルシンプロモーター中の ARE様 2配列に対する N r f 2の結合を示す。 （A) ォステオカルシ プロモーターのヌクレオチド配列 （B ) ォステオカルシンプロモーター上に存在する 2箇所の ARE様配列をプローブ としてゲルシフトを行った結果を示す。 - 図 16は、 n r f 2による OG 2レポーター活性の阻害を示す。 （A) アツセ ィに用いた OG 2レポーター （野生型、 変異型） のヌクレオチド配列 （B) CO S 7細胞を用いたレポーター活性の測定 （n = 4， **P<0. 01) (C) M C 3 T 3_E 1細胞を用いたレポーター活性の測定 （n = 4, **Pく 0. 01 )
図 1 7は、 n r f 2による r u n X 2依存的 6 X〇SE 2レポーター活性の阻 害を示す。 （A) COS 7細胞を用いたレポーター活性の測定 （n = 4， **P < 0. 01) (B) MC 3T 3_E 1細胞を用いたレポーター活性の測定 （n = 4， **P< 0. 01)
図 18は、 OVXマウスの骨における n r f 2の発現上昇を示す。 （A) マイ クロ CTによる骨密度測定 （B) 半定量 RT— PCRによる n r f 2の発現 （n =3， *P< 0. 05) (C) インサイチュハイブリダィゼーシヨン法による骨 組織における n r f 2の発現
図 19は、 MC 3T3— E 1細胞での n r f 2の過剰発現による増殖阻害およ びアポトーシスの非誘導を示す。 （A) B r dU取り込み （n = 4， **P< 0 . 01) (B) サイクリン D 1プロモーター活性 （n = 4， **P< 0. 01) (C) TUNE L染色による陽性細胞の割合 （n = 4) 発明を実施するための最良の形態
( 1. 分化調節剤、 予防 ·治療剤）
本発明は、 n r f 2の発現または機能を調節する物質を含む、 骨 ·軟骨形成能 を有する細胞の分化調節剤、 r u n X 2リクルートまたはォステオカルシン発現 の調節剤、 あるいは骨 ·関節疾患の予防 ·治療剤を提供する。 また、 必要に応じ て、 本発明は、 n r f 2の発現または機能を調節する物質自体も提供する。 n r f 2 (p 45 NF-E 2関連因子 2 ) は、 ヒ ト n r f 2 (例えば、
GenBankァクセッション番号：雇— 006164参照） またはそのオルソログ、 あるいは それらの変異体 （SNP、 ハプロタイプを含む） であ.り得る。 n r f 2のオルソ ログは特に限定されず、 例えば哺乳動物 （例えば、 ゥシ、 ヒッジ、 ブタ、 ャギ、 サル、 ゥサギ、 ラット、 ハムスター、 モルモット、 マウス） 等の動物に由来する ものであり得る。 n r f 2は、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化調節、 または 骨 ·関節疾患の予防 ·治療に有用な程度にその機能を保持し得る限り、 あるいは r u n X 2リクルートを十分に低減し得る限り、 または n r f 2結合部位 （例え ば、 A R E様 2、 O S E 2 ) に十分に結合し得る限り、 そのコードするアミノ酸 配列 （例えば、 配列番号 4で表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミ ノ酸配列、 あるいは配列番号 5で表されるアミノ酸配列） において 1以上のアミ ノ酸の変異 （例えば、 欠失、 置換、 付加、 挿入） を有していてもよい。 なお、 通 常、 n r f 2は遺伝子を、 N r f 2はタンパク質を示すが、 本明細書ではこれら は交換可能に使用される。
一実施形態では、 n r f 2の発現または機能を調節する物質は、 n r f 2の発 現を促進する物質であり得る。
n r f 2の発現とは、 n r f 2からの翻訳産物 （即ち、 蛋白質） が産生され且 つ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。 従って、 n r f 2の発現 を促進する物質は、 n r f 2の転写、 転写後調節、 翻訳、 翻訳後修飾、 局在化お よび蛋白質フォールディング等の、 いかなる段階で作用するものであってもよい 。 なお、 本明細書で使用される場合、 n r f 2の発現の促進としては、 n r f 2 (蛋白質） 自体の補充をも含むものとする。
n r f 2の発現を促進する物質の例は、 n r f 2 (タンパク質） 、 または n r f 2をコードする核酸を含む発現ベクター （n r f 2発現ベクター） 、 チオール 'チオン系化合物 （例えば、 1， 2—ジチォ一ルー 3—チオン （D 3 T ) ； Mol. Cell. Biol. vol. 22 : 2883-2892 (2002) 参照） であり得る。
n r f 2は、 天然蛋白質または組換え蛋白質であり得る。 n r f 2は、 自体公 知の方法により調製でき、 例えば、 a ) n r f 2を含む生体試料 （例えば、 骨、 軟骨） から n r f 2を回収してもよく、 b ) 宿主細胞 （例えば、 ェシエリ ヒア属 菌、'バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞） に n r f 2発現ベクター (後述） を導入することにより.形質転換体を作製し、 該形質転換体により産生さ れる n r f 2を回収してもよく、 c ) ゥサギ網状赤血球ライセート、 コムギ胚芽 ライセート、 大腸菌ライセート等を用いる無細胞系により n r f 2を合成しても よい。 n r f 2は、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、 限 外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法など の主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷 電の差を利用する方法；アブイ二ティークロマトグラフィー、 n r f 2抗体の使 用などの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体ク口マトグラフィ一などの 疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法 ；これらを組合せた方法などにより適宜精製される。
別の実施形態では、 n r f 2の発現または機能を調節する物質は、 n r f 2の 発現を抑制する物質であり得る。 n r f 2の発現を抑制する物質は、 n r f 2の 転写、 転写後調節、 翻訳、 翻訳後修飾、 局在化および蛋白質フォールデイング等 の、 いかなる段階で作用するものであってもよい。 '
n r f 2の発現を抑制する物質の例は、 n r f 2の転写産物、 詳細には m R N Aもしくは初期転写産物に対するアンチセンス核酸である。 アンチセンス核酸と は、 標的 m R N A (初期転写産物） を発現する細胞の生理的条件下で該標的 m R N A (初期転写産物） とハイブリダィズし得る塩基配列からなり、 且つハイプリ ダイズした状態で該標的 m R N A (初期転写産物） にコードされるポリぺプチド の翻訳を阻害し得るポリヌクレオチドをいう。 アンチセンス核酸の種類は D N A であっても R N Aであってもよいし、 あるいは D N AZR N Aキメラであっても よい。 また、 天然型のアンチセンス核酸は、 細胞中に存在する核酸分解酵素によ つてそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、 本発明のアンチセンス 核酸は、 分解酵素に安定なチォリン酸型 （リン酸結合の P = Oを P = Sに置換） や 2， -0-メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成もできる。 アンチセンス 核酸の設計に重要な他の要素として、 水溶性および細胞膜透過性を高めること等 が挙げられるが、 これらはリボソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形 の工夫によっても克服できる。 アンチセンス核酸の長さは、 n r f 2の転写産物 と特異的にハイブリダィズし得る限り特に制限はなく、 短いもので約 1 5塩基程 度、 長いもので mRNA (初期転写産物） の全配列に相補的な配列を含むような 配列であってもよい。 合成の容易さや抗原性の問題等から、 例えば約 15塩基以 上、 好ましくは約 1 5〜約 30塩基、 より好ましくは約 18塩基〜約 30塩基か らなるオリゴヌクレオチドが例示される。 さらに、 アンチセンス核酸は、 n r f 2の転写産物とハイプリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、 二本鎖 DNAと 結合して三重鎖 （トリプレックス） を形成し、 mRNAへの転写を阻害し得るも のであってもよい。
n r f 2の発現を抑制する物質の別の例は、 n r f 2の転写産物、 詳細には m RN Aもしくは初期転写産物を、 コード領域の内部 （初期転写産物の場合はイン トロン部分を含む） で特異的に切断し得るリボザィムである。 リポザィムとは核 酸を切断する酵素活性を有する RN Aをいうが、 最近では当該酵素活性部位の塩 基配列を有するオリゴ DNAも同様に核酸切断活性を有することが明らかになつ ているので、 本発明では配列特異的な核酸切断活性を有する限り DN Aをも包含 する概念として用いるものとする。 リボザィムとして最も汎用性の高いものとし ては、 ウイロイドゃウイノレソィド等の感染性 RN Aに見られるセルフスプライシ ング RNAがあり、 ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。 また、 リ ボザィムを、 それをコードする DNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合 には、 細胞質への移行を促進するために、 t RNAを改変した配列をさらに連結 したハイプリッドリボザィムとすることもできる [Nucleic Acids Res. , 29(13)： 2780-2788 (2001)] 。
η r f 2の発現を抑制する物質の別の例は、 RNA i誘導性核酸である。 RN A i誘導性核酸とは、 細胞内に導入されることにより、 RNA i効果を誘導し得 るポリヌクレオチドをいい、 好ましくは RNAである。 RNA i効果とは、 mR NAと同一のヌクレオチド配列 （またはその部分配列） を含む 2本鎖構造の RN Aが、 当該 mRNAの発現を抑制する現象をいう。 R.NA i効果を得るには、 例 えば、 少なくとも 2 0以上の連続する標的 m R N Aと同一のヌクレオチド配列 （ またはその部分配列） を有する 2本鎖構造の R N Aを用いることが好ましい。 2 本鎖構造は、 異なるス トランドで構成されていてもよいし、 一つの R N Aのステ ムループ構造によって与えられる 2本鎖であってもよい。 R N A i誘導性核酸と しては、 例えば s i R N A, s t R NA, m i R N Aなどが挙げられる。
n r f 2の発現を抑制する物質の別の例は、 デコイ核酸である。 デコイ核酸と は、 転写調節因子が結合する領域を模倣するポリヌクレオチドをいい、 n r f 2 の発現を抑制する物質としてのデコイ核酸は、 n r f 2に対する転写活性化因子 が結合する領域を模倣する核酸分子を含むものであり得る。 デコイ核酸は、 n r f 2に対する転写活性化因子が結合する領域を含むものである限り限定されない 力 例えば、 遺伝子上流約 2 k b pを含むものであり得る。 デコイ核酸としては 、 例えば、 リン酸ジエステル結合部分の酸素原子を硫黄原子で置換したチォリン 酸ジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド （s—オリゴ） 、 またはリン酸ジ エステル結合を電荷を持たないメチルホスフエ一ト基で置換したオリゴヌクレオ チド等、 生体内でオリゴヌクレオチドが分解を受けにくくするために改変したォ リゴヌクレオチド等が挙げられる。 デコイ核酸は転写活性化因子が結合する領域 と完全に一致していてもよいが、 n r f 2に対する転写活性化因子が結合し得る 程度の同一性を保持していればよい。 デコイ核酸の長さは転写活性化因子が結合 する限り特に制限されない。 また、 デコイ核酸は、 同一領域を反復して含んでい てもよい。
n r f 2の発現を抑制する物質の別の例は、 ターゲテイングベクターである。 本発明で用いられるターグティングベクターは、 n r f 2遺伝子の相同組換えを 誘導し得る n r f 2遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌ クレオチド、 ならびに必要に応じて選択マーカーを含む。 第一および第二のポリ ヌクレオチドは、 n r f 2を含むゲノム D N Aに対して、 相同組換えを生じるの に十分な程度の配列同一性および長さを有するポリヌクレオチドである。 第一お よび第二のポリヌクレオチドは、 n r f 2遺伝子を含むゲノム D N Aにおいて、 第一および第二のポリヌクレオチドに対して相同な 2つの領域の間に存在するゲ ノム DN A部分領域が欠失すると、 n r f 2遺伝子の機能的欠損がもたらされる ように選択される。 選択マーカーとしては、 ポジティブ選択マーカー （例えば、 ネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン Bホスホトランスフェラーゼ （BP H) 遺伝子、 ブラステイシジン Sデアミナーゼ遺伝子、 ピューロマイシン耐性遺 伝子） 、 ネガティブ選択マーカー （例えば、 単純へルぺスウィルス （HSV) の チミジンキナーゼ （t k) 遺伝子、 ジフテリア毒素 Aフラグメント （DTA) 遺 伝子） などが挙げられる。 ターグティングベクターは、 ポジティブ選択マーカー 、 ネガティブ選択マーカーのいずれか一方、 または両方を含むことができる。 タ ーゲティングべクターはまた、 2以上のリコンピナーゼ標的配列 （例えば、 バク テリオファージ P 1由来の C r eZ 1 o X Pシステムで用いられる 1 o x P配列 、 酵母由来の F L P/FRTシステムで用いられる FRT配列） を'含んでいても よい。
別の実施形態では、 n r f 2の発現または機能を調節する物質は、 n r f 2の 機能を抑制する物質であり得る。 n r f 2の機能を抑制する物質としては、 n r f 2の作用を妨げ得る物質である限り特に限定されないが、 n r f 2阻害タンパ ク質 （例えば、 n r f 2 ドミナントネガティブ変異体、 n r f 2抗体、 Ke a p 1 (Genes Dev. 13(1) :76- 86 (1999)) 、 n r f 2結合部位 （例えば、 ARE様 2、 OSE 2) を含むデコイ核酸、 これらをコードする核酸を含む発現ベクター が例示される。
n r f 2に対する抗体は、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体のいずれ であってもよく、 周知の免疫学的手法により作製できる。 また、 該抗体は、 抗体 のフラグメント （例えば、 Fab、 F(ab' )2) 、 組換え抗体 （例えば、 単鎖抗体） であってもよレヽ。
例えば、 ポリクローナル抗体は、 n r f 2あるいはそのフラグメント （必要に 応じて、 ゥシ血清ァノレブミン、 KLH (Keyhole Limpet Heraocyanin) 等のキヤ リア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる） を抗原として、 市販のアジュ バント （例えば、 完全または不完全フロイントアジュバント） とともに、 動物の 皮下あるいは腹腔内に 2〜 3週間おきに 2〜 4回程度投与し （部分採血した血清 の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、 その上昇を確認しておく） 、 最終 免疫から約 3〜約 1 0 3後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得で きる。 抗原を投与する動物としては、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ャギ、 モルモッ ト、 ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
また、 モノクローナル抗体は、 細胞融合法 （例えば、 渡邊武、 細胞融合法の原 理とモノクローナル抗体の作成、 谷内昭、 高橋利忠編、 「モノクローナル抗体と がん一基礎と臨床一」 、 第 2- 14頁、 サイエンスフォーラム出版、 1985年） により 作成することができる。 例えば、 マウスに該因子を市販のアジュバントと共に 2 〜 4回皮下あるいは腹腔内に投与し、 最終投与の約 3日後に脾臓あるいはリンパ 節を採取し、 白血球を採取する。 この白血球と骨髄腫細胞 （例えば、 NS-1, P3X63Ag8など） を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハ イブリ ドーマを得る。 細胞融合は P E G法 [J. Immunol. Methods, 81 (2)： 223- 228 (1985) ] でも電圧パルス法 [Hybridoma, 7 (6)： 627-633 (1988) ] であって もよい。 所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリ ドーマは、 周知の E I A または R I A法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、 培養上清中から検出 することにより選択できる。 モノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマの培 養は、 インビトロ、 またはマウスもしくはラット、 好ましくはマウス腹水中等の インビボで行うことができ、 抗体はそれぞれハイブリ ドーマの培養上清および動 物の腹水から取得できる。
し力 しながら、 ヒ トにおける治療効果と安全性を考慮すると、 本発明の抗体は 、 キメラ抗体、 ヒ ト化またはヒ ト型抗体であってもよい。 キメラ抗体は、 例えば 「実験医学 （臨時増刊号） ， Vol. 6, No. 10, 1988」 、 特公平 3-73280号公報等を 、 ヒ ト化抗体は、 例えば特表平 4- 506458号公報、 特開昭 62-296890号公報等を、 ヒ ト抗体は、 例えば 「Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997」 、 「Nature Genetics, Vol. 7， p. 13-21， 1994」 、 特表平 4- 504365号公報、 国際出願公開 TO94/25585号公報、 「日経サイエンス、 6月号、 第 40〜第 50頁、 1995年」 、 「 Nature, Vol. 368, p. 856-859, 1994」 、 特表平 6-500233号公報等を参考にそれぞ れ作製することができる。
n r f 2のドミナントネガティブ変異体とは、 n r f 2に対する変異の導入に よりその活性が低減したものをいう。 該ドミナントネガティブ変異体は、 天然の n r f 2と競合することで間接的にその活性を阻害することができる。 該ドミナ ントネガティブ変異体は、 n r f 2をコードする核酸に変異を導入することによ つて作製することができる。 変異としては、 例えば、 機能性部位における、 当該 部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異 （例えば、 1以上のアミ ノ酸の欠失、 置換、 付カロ） が挙げられる。 ドミナントネガティブ変異体は、 P C Rや公知のキットを用いる自体公知の方法により作製できる。 n r f 2の機能性 部位としては、 例えば、 D N A結合ドメインである N e h 1 ドメインが挙げられ る。
n r f 2の発現または機能を調節する物質が、 核酸分子または蛋白質分子であ る場合、 本発明の剤は、 核酸分子または蛋白質分子をコードする核酸分子を含む 発現ベクターを有効成分とすることもできる。 当該発現ベクターは、 上記の核酸 分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが、 投与対象で ある哺乳動物の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に 連結されてい.なければならない。 使用されるプロモータ一は、 投与対象である哺 乳動物で機能し得るものであれば特に制限されず、 例えば、 S V 4 0由来初期プ 口モーター、 サイトメガロウイノレス L T R、 ラウス肉 Jffiウイノレス L T R、 M o M u L V由来 L T R、 アデノウィルス由来初期プロモーター等のウィルスプロモー ター、 ならびに 0—ァクチン遺伝子プロモーター、 P G K遺伝子プロモーター、 トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモー ターなどが挙げられる。 また、 使用されるプロモーターとしては、 骨 ·軟骨形成 能を有する細胞 （例えば、 骨芽細胞、 軟骨細胞） に特異的なプロモーターを用い てもよレ、。 このようなプロモーターは、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞に特異的に 発現している任意の遺伝子のプロモーターであり得るが、 例えば、 骨芽細胞特異 的プロモーターとしては、 I型コラーゲン、 ォステオカルシン遺伝子由来プロモ 一ターを、 軟骨細胞特異的プロモーターとしては、 I I型コラーゲン遺伝子由来 プロモーターを使用できる。 本発明はまた、 このようなプロモーターを有する発 現ベクターを提供する。
発現ベクターは、 好ましくは核酸分子をコードするオリゴ （ポリ） ヌクレオチ ドの下流に転写終結シグナル、 すなわちターミネータ一領域を含む。 さらに、 形 質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子 （テトラサイクリン、 アンピシリン 、 カナマイシン、 ハイグロマイシン、 ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗 性を付与する遺伝子、 栄養要求性変異を相補する遺伝子等） をさらに含むことも できる。
発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターは、 プラスミ ドまたはウイ ルスベクターであり得るが、 ヒ ト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとして は、 アデノウイノレス、 レトロウイルス、 アデノ随伴ウイノレス、 ヘルぺスウィルス 、 ワクシニアゥイノレス'、 ボックスゥイノレス、 ポリオゥイノレス、 シンドビスウイノレ ス、 センダイウィルス、 ェプスタイン .バー . ウイノレス等のウィルスベクターが 挙げられる。
本発明の剤は、 n r f 2の発現または機能を調節する物質に加え、 任意の担体 、 例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。 医薬上許容され得る担体 としては、 例えば、 ショ糖、 デンプン、 マンニッ ト、 ソノレビット、 乳糖、 ダルコ ース、 セルロース、 タルク、 リン酸カルシウム、 炭酸カルシウム等の賦形剤、 セ ルロース、 メチルセルロース、 ヒ ドロキシプロピルセルロース、 ポリプロピルピ ロリ ドン、 ゼラチン、 アラビアゴム、 ポリエチレングリコール、 ショ'糖、 デンプ ン等の結合剤、 デンプン、 カルボキシメチルセルロース、 ヒ ドロキシプロピルス ターチ、 ナトリウム一グリコール一スターチ、 炭酸水素ナトリウム、 リン酸力ノレ シゥム、 クェン酸カルシウム等の崩壊剤、 ステアリン酸マグネシウム、 エアロジ ル、'タルク、 ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、 クェン酸、 メントール、 グリシ ルリシン .アンモニゥム塩、 グリシン、 オレンジ粉等の芳香剤、 安息香酸ナトリ ゥム、 亜硫酸水素ナトリウム、 メチルパラベン、 プロピルパラベン等の保存剤、 クェン酸、 クェン酸ナトリウム、 酢酸等の安定剤、 メチルセルロース、 ポリビニ ルピロリ ドン、 ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、 界面活性剤等の分散剤、 水、 生理食塩水、 オレンジジュース等の希釈剤、 カカオ脂、 ポリエチレングリコ ール、 白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、 それらに限定されるもの ではない。
経口投与に好適な製剤は、 水、 生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶 解させた液剤、 有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、 サッシ ェ剤または錠剤、 適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、 有効量 の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、 あるいは 散剤、 顆粒剤等である。
非経口的な投与 （例えば、 静脈内注射、 皮下注射、 筋肉注射、 局所注入など） に好適な製剤としては、 水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、 これ には抗酸化剤、 緩衝液、 制菌剤、 等張化剤等が含まれていてもよい。 また、 水性 および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、 これには懸濁剤、 可溶化剤、 増粘剤 、 安定化剤、 防腐剤等が含まれていてもよい。 当該製剤は、 アンプルやバイアル のように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。 ま た、 有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、 使用直前に適当な無 菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよレ、状態で保存することもできる。
本発明の剤の投与量は、 有効成分の活性や種類、 投与様式 （例えば、 経口、 非 経口） 、 病気の重篤度、 投与対象となる動物種、 投与対象の薬物受容性、 体重、 年齢等によって異なり一概に云えないが、 通常、 成人 1日あたり有効成分量とし て約 0 . O O l m g〜約 2 . O gである。
本発明の剤は、 例えば、 医薬または研究用試薬として有用である。 本発明の剤 が医薬または研究用試薬として使用される場合、 例えば、 骨または軟骨の癌、 骨 または軟骨の形成異常、 骨粗鬆症 （例えば、 閉経後骨粗鬆症） 、 慢性関節リウマ チ、 関節炎、 滑膜炎、 変形性関節症、 骨大理石病などの骨 '関節疾患の予防 -治 療剤、 または該疾患モデルの誘発剤として使用することができる。 詳細には、 本 発明の剤が n r f 2の発現または機能を促進する物質を含む場合、 骨 ·軟骨形成 能を有する細胞 （例えば、 骨芽細胞、 軟骨細胞） の分化抑制剤として有用である 。 本発明者ちは、 n r f 2が骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化を抑制し得る因 子であることを見出した。 従って、 n r f 2の発現または機能を促進する物質は 、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化を抑制し、 以つてその細胞数の減少、 ある いは骨 ·軟骨形成の抑制を引き起こし得ると考えられる。 この場合、 本発明の剤 は、 骨 ·軟骨形成の抑制が所望される疾患の予防 ·治療、 骨 ·軟骨形成能を有す る細胞数の減少、 あるいは骨 ·軟骨形成が抑制された疾患モデル （例えば、 細胞 、 動物） の作製 （本明細書中以下、 必要に応じて 「骨 ·軟骨形成の抑制が所望さ れる疾患の予防 '治療など」 と省略する。 ） のために使用され得る。 骨 '軟骨形 成の抑制が所望される疾患としては、 例えば、 骨または軟骨の癌、 骨または軟骨 の形成異常、 骨大理石病が挙げられる。 骨 '軟骨形成が抑制された疾患モデルに おける骨 ·軟骨形成が抑制された疾患は、 骨 ·軟骨形成の促進が所望される後述 の疾患と同様であり得る。
一方、 本発明の剤が n r f 2の発現または機能を抑制する物質を含む場合、 骨 •軟骨形成能を有する細胞の分化促進剤として有用であり得る。 本発明者らは、 n r f 2が骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化を抑制し得る因子であることを見 出した。 従って、 n r f 2の発現または機能を抑制する物質を用いることで、 n r f 2による骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化抑制を解除し （即ち、 骨 ·軟骨 形成能を有する細胞の分化を促進し） 、 以つてその細胞数の増加、 あるいは骨 - 軟骨形成の促進を引き起こし得ると考えられる。 この場合、 本発明の剤は、 骨 ' 軟骨形成の促進が所望される疾患、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞数の増加、 ある いは骨 ·軟骨形成が促進された疾患モデル （例えば、 細胞、 動物） の作製 （本明 細書中以下、 必要に応じて 「骨 .軟骨形成の促進が所望される疾患の予防 '治療 など」 と省略する。 ） に使用され得る。 骨 ·軟骨形成の促進が所望される疾患と しては、 例えば、 骨粗鬆症 （例えば、 閉経後骨粗鬆症） 、 慢性関節リウマチ、 関 節炎、 滑膜炎、 変形性関節症が挙げられる。 骨，軟骨形成が促進された疾患モデ ルにおける骨 ·軟骨形成が促進された疾患は、 骨 ·軟骨形成の抑制が所望される 上述の疾患と同様であり得る。
本発明の剤が、 n r f 2の発現または機能を調節する上述の物質に加え、 有効 成分として他の物質 （例えば、 骨 '軟骨形成能を有する細胞の分化調節薬、 骨 ' 関節疾患の予防 ·治療薬） を含む場合、 それらは一緒になつた形態 （例えば、 同 一容器中に混合物として格納） 、 あるいは互いに隔離された形態 （例えば、 異な る容器に格納） で提供され得る。
本発明はまた、 本発明の剤のインビトロ使用の一形態であり得る、 骨 '軟骨形 成能を有する細胞の分化調節方法を提供する。 本方法は、 例えば、 n r f 2の発 現または機能を調節する物質を用いて、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞における n r f 2の発現または機能を調節するように培養することを含む。
骨 ·軟骨形成能を有する細胞は、 任意の動物、 例えば鳥類、 哺乳動物 （例えば 、 ゥシ、 ヒッジ、 ブタ、 ャギ、 サル、 ヒ ト、 ゥサギ、 ラット、 ハムスター、 モル モット、 マウス） に由来する細胞であり得る。 該細胞は、 胚性幹細胞、 体性幹細 胞等の幹細胞から分化誘導される細胞であり得る。 また、 本発明の方法により得 られる細胞の移植を意図する場合、 移植が意図される動物と同種動物由来の細胞 を用いることで、 同種移植に好適な細胞が得られ、 移植が意図される個体由来の 細胞を用いることで、 同種同系移植に好適な細胞が得られる。 該細胞は、 マーカ 一分子 （後述） を利用する自体公知の方法 （例えば、 F A C S ) により入手でき る。
細胞培養に用いられる培地は、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化に適切であ る限り特に限定されず適宜選択されるが、 例えば、 最少必須培地 （M EM) 、 ダ ノレべッコ改変最少必須培地 （DM E M) 、 F 1 2培地または R P M I 1 6 4 0培 地、 あるいはそれらの混合培地を基本培地として含むものなどである。 培地への 添加剤としては、 例えば、 各種アミノ酸、 各種無機塩、 各種ビタミン、 各種抗生 物質、 緩衝剤などが挙げられる。 培養条件もまた適宜決定されるが、 例えば、 培 地の p Hは約 6〜約 8であり、 培養温度は通常約 3 0〜約 4 0 °Cである。 培地は 、 血清を含んでも含まなくともよいが、 細胞移植を意図する場合、 未同定成分の 混入の防止、 感染リスクの軽減などの観点から、 無血清培地が好ましい。 なお、 本発明の方法により得られた細胞は、 細胞治療 （移植） に用いることができるが 、 この場合、 培養で使用する物質、 材料は、 同種移植という観点から、 細胞治療 を受ける被験体と同種動物由来の物質、 材料で統一するのが好ましい。
本発明の調節方法は、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞から分化調節された細胞 （ 例えば、 分化が促進または抑制された細胞） を単離することをさらに含むことが できる。 細胞の単離は、 細胞マーカーを利用する自体公知の方法等により行うこ とができる。
本発明の調節方法はまた、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞から分化誘導された細 胞をさらに分化調節することを含むこともできる。 骨 ·軟骨形成能を有する細胞 から分化誘導された細胞をさらに分化させる方法は特に限定されるものではない 力 例えば、 n r f 2の発現または機能を調節する物質と他の分化調節物質との 共存下で細胞を培養する方法、 n r f 2の発現または機能を調節する物質の存在 下での骨 ·軟骨形成能を有する細胞の培養後に他の分化調節物質を使用する方法 が挙げられる。
本発明の調節方法は、 例えば、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化を調節する ことができるため、 あるいは骨，軟骨形成能を有する細胞以外の細胞を幹細胞か らより特異的に分化させる際に、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞への分化を抑制す ることによりその分化効率を高めることができるため有用である。
( 2 . スクリーニング方法）
本発明は、 被験物質が n r f 2の発現または機能を調節し得るか否かを評価す ることを含む、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化を調節し得る物質、 r u n X 2リクルートまたはォステオカルシン発現を調節し得る物質、 あるいは骨 ·関節 疾患'を予防 ·治療し得る物質のスクリーニング方法、 ならびに当該スクリーニン グ方法により得られる物質、 および当該物質を含む分化調節剤あるいは予防 ·治 療剤を提供する。
スクリーニング方法に供される被験物質は、 いかなる公知化合物および新規化 合物であってもよく、 例えば、 核酸 （例えば、 ヌクレオシド、 オリゴヌクレオチ ド、 ポリヌクレオチド） 、 糖質 （例えば、 単糖、 二糖、 オリゴ糖、 多糖） 、 脂質 (例えば、 飽和または不飽和の直鎖、 分岐鎖および/または環を含む脂肪酸） 、 アミノ酸、 蛋白質 （例えば、 オリゴペプチド、 ポリペプチド） 、 有機低分子化合 物、 コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー 、 固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブ ラリー、 あるいは微生物、 動植物、 海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。 本発明のスクリーニング方法は、 被験物質が n r f 2の発現または機能を調節 し得るか否かを評価可能である限り、 如何なる形態でも行われ得る。 例えば、 本 発明のスクリーニング方法は、 1 ) n r f 2の発現を測定可能な細胞を用いた n r f 2の発現量の測定、 2 ) 非ヒ ト動物を用いた n r f 2の発現量の測定、 3 ) n r f 2の機能を測定可能な再構成系 （非細胞系） を用いた n r f 2の機能の測 定、 4 ) n r f 2発現細胞を用いた n r f 2の機能の測定などに基づき行われ得 る。
上記 1 ) において、 n r f 2の発現を測定可能な細胞を用いるスクリーニング 方法は、 例えば、 下記の工程 （a ) 〜 （c ) を含み得る ：
( a ) 被験物質と n r f 2の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程；
( b ) 被験物質を接触させた細胞における n r f 2の発現量を測定し、 該発現量 を被験物質を接触させない対照細胞における n r f 2の発現量と比較する工程；
( c ) 上記 （b ) の比較結果に基づいて、 n r f 2の発現量を調節する被験物質 を選択する工程。
上記方法の工程 （a ) では、 被験物質が n r f 2の発現を測定可能な細胞と接 触条件下におかれる。 n r f 2の発現を測定可能な細胞に対する被験物質の接触 は、'培地中で行われ得る。 - n r f 2の発現を測定可能な細胞とは、 n r f 2の産物 （例えば、 転写産物、 翻訳産物） の発現レベルを直接的または間接的に評価可能な細胞をいう。 n r f 2の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、 n r f 2発現細胞であり得 、 一方、 n r f 2の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、 n r f 2転 写調節領域についてレポーターアツセィを可能とする細胞であり得る。 n r f 2 の発現を測定可能な細胞は、 動物細胞、 例えばマウス、 ラット、 ハムスター、 モ ルモッ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 サル、 ヒ ト等の哺乳動物細胞であり得る。
n r f 2発現細胞は、 n r f 2を潜在的に発現するものである限り特に限定さ れない。 かかる細胞は、 当業者であれば容易に同定でき、 初代培養細胞、 当該初 代培養細胞から誘導された細胞株、 市販の細胞株、 セルバンクより入手可能な細 胞株などを使用できる。 また、 n r f 2発現細胞としては、 骨 ·軟骨形成能を有 する細胞 （例えば、 骨芽細胞、 軟骨細胞） を使用することもまた好ましい。 n r f 2転写調節領域についてレポーターアツセィを可能とする細胞は、 n r f 2転写調節領域、 当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細 胞である。 n r f 2転写調節領域、 レポーター遺伝子は、 発現ベクター中に挿入 され得る。 n r f 2転写調節領域は、 n r f 2の発現を制御し得る領域である限 り特に限定されないが、 例えば、 転写開始点から上流約 2 k b pまでの領域、 あ るいは該領域の塩基配列において 1以上の塩基が欠失、 置換若しくは付加された 塩基配列から.なり、 且つ n r f 2の転写を制御する.能力を有する領域などが挙げ られる。 レポーター遺伝子は、 検出可能な蛋白質または検出可能な物質を生成す る酵素をコードする遺伝子であればよく、 例えば G F P (緑色蛍光蛋白質） 遺伝 子、 G U S ( 一ダルク口ニダーゼ） 遺伝子、 L U C ひレシフェラーゼ） 遺伝子 、 C A T (クロラムフエニコルァセチルトランスフェラーゼ） 遺伝子等が挙げら れる。
n r f 2転写調節領域、 当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が 導入される細胞は、 n r f 2転写調節機能を評価できる限り、 即ち、 該レポータ 一遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。 しかしなが ら、 n r f 2に対する生理的な転写調節因子を発現し、 n r f 2の発現調節の評 価により適切であると考えられることから、 該導入される細胞としては、 n r f 2発現細胞が好ましい。
被験物質と n r f 2の発現を測定可能な細胞とが接触される培地は、 用いられ る細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、 例えば、 約 5〜 2 0 %のゥシ胎仔 血清を含む最少必須培地 （M E M) 、 ダルベッコ改変最少必須培地 （DM E M) 、 R P M I 1 6 4 0培地、 1 9 9培地などである。 培養条件もまた、 用いられる 細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、 例えば、 培地の p Hは約 6〜約 8で あり、 培養温度は通常約 3 0〜約 4 0 °Cであり、 培養時間は約 1 2〜約 7 2時間 である。
上記方法の工程 （b ) では、 先ず、 被験物質を接触させた細胞における n r f 2の発現量が測定される。 発現量の測定は、 用いた細胞の種類などを考慮し、 自 体公知の方法により行われ得る。 例えば、 n r f 2の発現を測定可能な細胞とし て、 n r f 2発現細胞を用いた場合、 発現量は、 n r f 2の産物、 例えば、 転写 産物または翻訳産物を対象として自体公知の方法により測定できる。 例えば、 転 写産物の発現量は、 細胞から total R NAを調製し、 R T— P C R、 ノザンブロ ッティング等により測定され得る。 また、 翻訳産物の発現量は、 細胞から抽出液 を調製し、 免疫学的手法により測定され得る。 免疫学的手法としては、 放射性同 位元素免疫測定法 （R I A法） 、 E L I S A法 （Methods in Enzymol. 70： 419- 439 (1980) ) 、 蛍光抗体法などが使用できる。 一方、 n r f 2の発現を測定可能 な細胞として、 n r f 2転写調節領域についてレポーターアツセィを可能とする 細胞を用いた場合、 発現量は、 レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る また、 n r f 2を発現可能な細胞を用いた場合、 核内 n r f 2量 （即ち、 細胞 質から核内に移行した n r f 2量） を測定してもよレ、。 細胞内局在は、 自体公知 の方法により測定できる。 例えば、 レポーター遺伝子と融合させた n r f 2を適 切な細胞に導入し、 被験物質の存在下において培地中で培養した後、 共焦点顕微 鏡により細胞内または核内における蛍光シグナルまたはそれらのシグナル比を測 定すればよい。 また、 n r f 2抗体を用いる免疫染色によっても、 n r f 2の細 胞内局在を測定できる。
次いで、 被験物質を接触させた細胞における n r f 2の発現量が、 被験物質を 接触させない対照細胞における n r f 2の発現量と比較される。 発現量の比較は 、 好ましくは、 有意差の有無に基づいて行なわれる。 被験物質を接触させない対 照細胞における n r f 2の発現量は、 被験物質を接触させた細胞における n r f 2の発現量の測定に対し、 事前に測定した発現量であっても、 同時に測定した発 現量であってもよいが、 実験の精度、 再現性の観点から同時に測定した発現量で あることが好ましい。
上記方法の工程 （c ) では、 n r f 2の発現量を調節する被験物質が選択され る。 例えば、 n r f 2の発現量を増加させる （発現を促進する） 被験物質は、 骨 •軟骨形成の抑制が所望される疾患の予防 ·治療などのために使用され得る。 一 方、 n r f 2の発現量を減少させる （発現を抑制する） 被験物質は、 骨 ·軟骨形 成の促進が所望される疾患の予防 ·治療などのために使用され得る。
上記 2 ) において、 非ヒト動物を用いる本発明のスクリーニング方法は、 例え ば、 下記の工程 ( a ) 〜 （ c ) を含む：
( a ) 被験物質を動物に投与する工程；
( b ) 被験物質を投与した動物における n r f 2の発現量を測定し、 該発現量を 被験物質を投与しない対照動物における n r f 2の発現量と比較する工程；
( c ) 上記 （b ) の比較結果に基づいて、 n r f 2の発現量を調節する被験物質 を選択する工程。
上記方法の工程 （a ) では、 動物として、 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスタ 一、 モルモット、 ゥサギ、 ィヌ、 サル等の非ヒト哺乳動物、 およびニヮトリ等の 鳥類などの動物が使用される。 動物としてはまた、 骨 ·関節疾患モデル動物が使 用され得る。 被験物質の動物への投与は自体公知の方法により行われ得る。 上記方法の工程 （b ) では、 n r f 2の発現量は、 ·自体公知の方法により測定 され得る。 例えば、 n r f 2の発現量として、 骨または軟骨組織における発現量 が測定される。 本工程 （b) における発現量の比較および上記方法の工程 （c) は、 n r f 2の発現を測定可能な細胞を用いるスクリーニング方法と同様に行わ れ得る。
上記 3) において、 n r f 2の機能を測定可能な再構成系とは、 n r f 2 (タ ンパク質） およびその他の因子を含む、 被験物質による n r f 2の機能調節能を 評価可能な非細胞系をいう。 n r f 2の機能を測定可能な再構成系を用いるスク リーユング方法は、 種々の形態で行われ得る。 例えば、 このようなスクリーニン グ方法としては、 3 a) n r f 2およびその共役因子を含む複合体の形成を被験 物質が調節し得るか否かを評価することを含む方法、 3 b) n r f 2と n r f 2 標的遺伝子の上流に存在するシス作用性エレメントを含む DN Aとの結合を被験 物質が調節し得るか否かを評価することを含む方法、 3 c) PKC'Sによる n r f 2のリン酸化を被験物質が調節し得るか否かを評価することを含む方法が挙げ られる。
詳細には、 上記 3 a) の方法は、 例えば、 下記の工程 （a) 〜 （c) を含み得 る：
(a) 被験物質ならびに n r f 2およびその共役因子を接触させる工程；
(b) 被験物質を接触させた場合に形成された、 n r f 2およびその共役因子を 含む複合体量を測定し、 該複合体量を被験物質を接触させない場合に形成された 複合体量と比較する工程；
(c) 上記 （b) の比較結果に基づいて、 複合体の形成を調節する被験物質を選 択する工程。
上記方法の工程 （a) では、 n r f 2共役因子として、 例えば、 Ke a p 1、 Ma f (例えば、 Ma f F、 Ma f G、 Ma f K) 、 CBP (C RE B結合タン パク質） が使用できる。 接触は、 複合体の形成を可能とするような溶液中で行わ れ得る。
上記方法の工程 （b) では、 先ず、 被験物質を接触 'させた場合に形成された複 合体量が測定される。 複合体量の測定は、 例えば、 表面プラズモン共鳴を利用す る方法 （例えば、 B i a c o r eの使用） 、 免疫学的方法 （例えば、 免疫沈降法 ) 、 水晶振動子マイクロバランス （Quartz Crystal Microbalance： QCM) 法、 ェ ナジ一トランスファーを検出する方法が挙げられる。
次いで、 被験物質を接触させた場合に形成された複合体量が、 被験物質を接触 させない場合における複合体量と比較される。 複合体量の比較は、 好ましくは、 有意差の有無に基づいて行なわれる。 被験物質を接触させない場合における複合 体量は、 被験物質を接触させた場合における複合体量の測定に対し、 事前に測定 した複合体量であっても、 同時に測定した複合体量であってもよいが、 実験の精 度、 再現性の観点から同時に測定した複合体量であることが好ましい。
上記方法の工程 （c) では、 複合体量を調節する被験物質が選択される。 例え ば、 n r f 2と Ma f 等の n r f 2共役因子とを含む複合体量を増加させる （複 合体形成を促進する） 、 あるいは n r f 2と Ke a p 1、 CB P等の n r f 2共 役因子とを含む複合体量を減少させる （複合体形成を抑制する） 被験物質は、 骨 ·軟骨形成の抑制が所望される疾患の予防 ·治療などのために使用され得る。 一 方、 n r f 2と Ke a p l、 C B P等の n r f 2共役因子とを含む複合体量を増 加させる、 あるいは n r f 2と Ma f 等の n r f 2共役因子とを含む複合体量を 減少させる被験物質は、 骨 ·軟骨形成の促進が所望される疾患の予防 ·治療など のために使用され得る。
上記 3 b) の方法は、 例えば、 下記の工程 （a) 〜 （c) を含み得る ：
(a) 被験物質ならぴに n r f 2および n r f 2標的遺伝子の上流に存在するシ ス作用性エレメントを含む DN Aを接触させる工程；
(b) 被験物質を接触させた場合に形成された、 n r f 2および該 DNAを含む タンパク質— D N A複合体量を測定し、 該複合体量を被験物質を接触させない場 合に形成された複合体量と比較する工程；
(c) 上記 （b) の比較結果に基づいて、 複合体の形成を調節する被験物質を選 択する工程。 - 上記方法の工程 （a) では、 シス作用性エレメントとして、 例えば、 本発明者 らが見出した n r f.2標的遺伝子であるォステオカルシンの上流に存在する AR E様 2および OS E 2が使用できる。 また、 ARE様 2または OSE 2と n r f 2との結合を阻害する物質はしばしば、 他の n r f 2標的遺伝子のシス作用性ェ レメントど n r f 2との結合をも阻害し得ると考えられるため、 シス作用性エレ メントとして HO— 1、 P r x— 1、 A170、 グルタチオン一 S—トランスフ エラーゼ （GST s) 、 NAD (P) H：キノンォキシドレダクターゼ I等の遺 伝子上流に見出される n r f 2結合部位もまた使用できる （例えば、 Advances in Pharmacology 38， 293 - 328, 1997、 Free Radical Research 31， 273-300, 1999参照)。 しカゝし、 作用点に対する影響を直接的に評価することがより適切で あるため、 シス作用性エレメントとしては ARE様 2および OS E 2が好ましい 。 接触は、 タンパク質一 DNA複合体の形成を可能とするような溶液中で行われ 得る。
上記方法の工程 （b) では、 タンパク質一 DNA複合体量の測定、 比較は、 n r f 2と n r f 2共役因子とを含む複合体量の測定と同様の方法論により行われ 得るが、 測定の他の方法論としては、 例えば、 EMS A (Electrophoretic Mobility Shift Assay) またはゲルシフトアツセィが挙げられる。 なお、 シス作 用性エレメントとして ARE様 2および/または OS E 2を使用する場合、 被験 物質の中からより特異性が高い物質を選択するため、 ARE様 2および Zまたは OS E 2にのみ結合し、 それ以外の n r f 2結合部位には結合しないことを確認 してもよレ、。
上記方法の工程 （c) では、 タンパク質一 DN A複合体量を調節する被験物質 が選択される。 例えば、 複合体量を増加させる （複合体形成を促進する） 被験物 質は、 骨 ·軟骨形成の抑制が所望される疾患の予防 ·治療などのために使用され 得る。 一方、 複合体量を減少させる被験物質は、 骨 ·軟骨形成の促進が所望され る疾患の予防 ·治療などのために使用され得る。
上記 3 c) の方法は、 例えば、 下記の工程 （a) 〜 （c) を含み得る ： (a) 被験物質、 ならびに n r. f 2 (タンパク質） および P KC δを接触させる 工程；
(b) 被験物質を接触させた場合のリン酸化 n r f 2量を測定し、 該量を被験物 質を接触させない場合の量と比較する工程；
(c) 上記 （b) の比較結果に基づいて、 PKC δによる n r f 2のリン酸化を 調節する被験物質を選択する工程。
上記方法の工程 （a) では、 PKC Sによる n r f 2のリン酸化が可能である アツセィ系において、 被験物質、 n r f 2および PKC δが接触される。 n r f 2は、 40番目の S e rがプロテインキナーゼ C δ (PKC δ) によりリン酸化 されると、 Ke a ρ 1からの解離が促進される。 本アツセィ系は、 PKC Sの触 媒活性に必要な補因子を含んで構成される。
上記方法の工程 （b) では、 リン酸化レベルの測定は、 自体公知の方法、 例え ば、 抗リン酸化セリン抗体を用いる免疫学的手法により測定される。 本工程 （b ) におけるリン酸ィヒレベルの比較は、 上記 1) または 3 a) の方法と同様に行わ れ得る。
上記方法の工程 （c) では、 リン酸化 n r f 2量を調節する被験物質が選択さ れる。 例えば、 リン酸化 n r f 2量を増加させる （リン酸ィ匕を促進する） 被験物 質は、 Ke a p 1からの n r f 2の解離の促進を通じて、 r un x 2依存的なォ ステオカルシン発現を抑制し得る。 従って、 このような被験物質は、 骨 ·軟骨形 成の抑制が所望される疾患の予防 '治療などのために使用され得る。 一方、 リン 酸ィ匕 n r f 2量を減少させる （リン酸化を抑制する） 被験物質は、 r u n X 2依 存的なォステオカルシン発現の抑制を解除 （即ち、 ォステオカルシン発現を促進 ) し得ることから、 骨 ·軟骨形成の促進が所望される疾患の予防 ·治療などのた めに使用され得る。
上記 4) において、 n r f 2発現細胞を用いるスクリーニング方法は、 例えば 、 下記の工程 （a) 〜 （c) を含み得る ：
(a) 被験物質と n r f 2発現細胞とを接触させる工程； (b) 被験物質を接触させた細胞における n r f 2の機能レベルを測定し、 該機 能レベルを被験物質を接触させなレ、対照細胞における機能レベルと比較する工程
(c) 上記 （b) の比較結果に基づいて、 n r f 2の機能レベルを調節する被験 物質を選択する工程。
上記方法の工程 （a) では、 被験物質が n r f 2発現細胞と接触条件下におか れる。 n r f 2発現細胞に対する被験物質の接触は、 培地中で行われ得る。 ここ で用いられる n r f 2発現細胞は、 タンパク質レベルでの n r f 2のアツセィが 可能な程度に n r f 2を発現し得る細胞であり得る。
上記方法の工程 （b) では、 先ず、 被験物質を接触させた細胞における n r f 2の機能レベルが測定される。 n r f 2の機能レベルは、 例えば、 細胞における リン酸化 n r f 2量、 r u n x 2リクルートの程度、 ォステオカルシン発現量ま たはそのプロモーター活性を指標にして測定、 評価できる。 これらの測定は、 自 体公知の方法により行うことができ、 例えば、 リン酸化 n r f 2量は抗リン酸化 セリン抗体を用いた免疫学的手法により、 r u n X 2リクルートの程度は C h I Pアツセィにより、 ォステオカルシン発現量は免疫学的手法、 PCR法、 ノザン プロッティングにより、 プロモーター活性はレポーターアツセィにより測定でき る。 なお、 本工程 （b) における機能レベルの比較は、 上述した比較と同様に行 われ得る。
上記方法の工程 （c) では、 機能レベルを調節する被験物質が選択される。 例 えば、 リン酸化 n r f 2量を増加させる （促進する） 、 あるレ、は r un X 2リク ルートの程度、 ォステオカルシン発現量またはそのプロモーター活性を減少させ る （抑制する） 被験物質は、 骨 ·軟骨形成の抑制が所望される疾患の予防 ·治療 などのために使用され得る。 一方、 これらの反対の作用を有する被験物質は、 骨 ·軟骨形成の促進が所望される疾患の予防 ·治療などのために使用され得る。 本発明のスクリーニング方法は、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化を調節し 得る物質、 骨 '関節疾患を予防'治療し得る物質、 あるいは r un X 2リクルー トまたはォステオカルシン発現を調節し得る物質などのスクリーニングを可能と する。 従って、 本発明のスクリーニング方法は、 医薬または研究用試薬の開発な どに有用である。
( 3 . n r f 2変異の同定方法）
本発明は、 n r f 2の特定の変異が骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化に及ぼ す影響、 あるいは骨 ·関節疾患の発症リスクに及ぼす影響を解析することを含む 、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化に変化をもたらす、 あるいは骨 ·関節疾患 の発症リスクに変化をもたらす n r f 2変異の同定方法、 当該方法により同定さ れる n r f 2変異を含むタンパク質 ·核酸分子を提供する。
n r f 2変異は、 n r f 2における任意の変異であり、 n r f 2の多型、 n r f 2の人工変異を含む。 n r f 2の多型とは、 ある母集団において、 n r f 2遺 伝子を含むゲノム D N Aに一定頻度で見出されるヌクレオチド配列の変異を意味 し、 n r f 2遺伝子を含むゲノム D N Aにおける 1以上の D N Aの置換、 欠失、 付加 （例えば、 S N P、 ハプロタイプ） 、 ならびに該ゲノム D N A中の部分領域 の反復、 逆位、 転座などであり得る。 本発明の方法により同定される n r f 2の 多型のタイプは、 n r f 2における全てのタイプの多型のうち、 骨 '軟骨形成能 を有する細胞の分化効率に変化をもたらし得るヌクレオチド配列の変異、 あるい は所定の疾患 （例えば、 骨 ·関節疾患） に罹患した動物と罹患していない動物と の間で頻度が異なるヌクレオチド配列の変異であり得る。 なお、 n r f 2多型の 解析対象となる動物は上述の通り特に限定されないが、 ヒ トが好ましい。
解析は、 自体公知の方法により行われ得る。 例えば、 連鎖解析等の解析方法の 結果、 疾患 （例えば、 骨 ·関節疾患） の発症頻度、 重症度に応じて特定の多型の 保有頻度に有意差が認められたとき、 そのタイプの多型は、 骨，軟骨形成能を有 する細胞の分化、 あるいは骨 ·関節疾患の発症リスクに変化をもたらす多型であ ると判定され得る。 また、 解析はインビトロで行うことも可能である。 例えば、 特定の変異 （例えば、 多型） を含む n r f 2発現ベクターを導入した骨 ·軟骨形 成能を有する細胞を培養し、 その分化効率を、 対照 rv r f 2発現べクタ一を導入 した対照細胞での効率と比較することで、 変異が解析され得る。
本発明の同定方法は、 哺乳動物由来の生体試料から調製された D N Aサンプル をシークェンシング （sequencing) に供し、 n r f 2多型の新たなタイプを決定 する工程、 あるいはヌクレオチド変異の導入により n r f 2変異体を人工的に作 製する工程をさらに含むこともできる。 生体試料は、 n r f 2の発現組織 （例え ば、 骨、 軟骨） または細胞 （例えば、 骨芽細胞、 軟骨細胞） あるいはその他の試 料 （例えば、 血液） のみならず、 毛髪、 爪、 皮膚、 粘膜等のゲノム D N Aを含む 任意の組織も使用できる。 入手の容易性、 人体への負担等を考慮すれば、 生体試 料は、 毛髪、 爪、 皮膚、 粘膜、 血液、 血漿、 血清、 唾液などが好ましい。 多型の 決定は、 由来が異なる生体試料に含まれるゲノムまたは転写産物のヌクレオチド 配列を多数解析し、 決定されたヌクレオチド配列中に一定頻度で見出される変異 を同定することで行われ得る。
本発明の同定方法は、 例えば、 所定の疾患の発症リスクに影響を及ぼし得る多 型の同定、 あるいは n r f 2変異体 （例えば、 分化調節能または特定の活性が増 強または抑制された変異体） の作製などに有用である。
( 4 . 判定方法および診断剤）
( 4 . 1 . 発現量の測定に基づく判定方法および診断剤）
本発明は、 n r f 2の発現量の測定に基づく、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の 分化 （ならび.に Zあるいは骨 ·関節疾患） に対する動物の生体状態の判定方法を 提供する。
一実施形態では、 本発明の判定方法は、 以下の工程 （a ) 、 ( b ) を含む：
( a ) 動物から採取された生体試料において n r f 2の発現量を測定する工程；
( b ) n r f 2の発現量に基づき、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化 （ならび に Zあるいは骨 ·関節疾患） に対する動物の生体状態を評価する工程。
上記方法の工程 （a ) では、 動物から採取した生体試料において n r f 2の発 現量が測定される。 動物は上述の通り特に限定されないが、 ヒ トが好ましい。 生 体試料は、 n r f 2の発現量を測定可能な試料である'限り特に限定されず、 例え ば骨、 軟骨が挙げられる。 n r f 2の発現量の測定は、 本発明のスクリーニング 方法と同様に行われ得る。
上記方法の工程 （b ) では、 n r f 2の発現量に基づき、 骨 ·軟骨形成能を有 する細胞の分化に対する動物の生体状態が評価され得る。 詳細には、 先ず、 測定 された n r f 2の発現量が、 該分化の異常を伴わない動物または正常動物におけ る n r f 2の発現量と比較される。 発現量の比較は、 好ましくは、 有意差の有無 に基づいて行われる。 該分化の異常を伴わない動物または正常動物における n r f 2の発現量は、 自体公知の方法により決定できる。
次いで、 n r f 2の発現量の比較結果より、 動物が骨 ·軟骨形成能を有する細 胞の分化の異常を有している可能性があるか否か、 あるいは所定の疾患に罹患し ている可能性があるか否か、 または将来的に罹患する可能性が高いか低いかが判 断され得る。 本実施例の結果より、 n r f 2の発現量が高い場合には骨 ·軟骨形 成能を有する細胞の分化がより抑制され、 一方、 n r f 2の発現量が低い場合に は骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化がより促進され得ると考えられる。 また、 特定の疾患の発症前後に、 当該疾患に関連する特定の遺伝子の発現量の変化がし ばしば観察されることが知られている。 例えば、 後述の実施例でも、 閉経後骨粗 鬆症モデル動物において n r f 2の発現上昇が確認されている。 従って、 n r f 2の発現量の解析より、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化の異常、 ならびに あるいは所定の疾患の発症または発症リスクを判定することが可能であると考え られる。
本発明はまた、 n r f 2の発現量の測定用試薬を含む、 上記判定を可能とする 診断剤を提供する。
n r f 2の発現量の測定用試薬は、 n r f 2の発現を定量可能である限り特に 限定されないが、 例えば、 上述した n r f 2に対する抗体、 n r f 2転写産物に 対する核酸プローブ、 または n r f 2転写産物を増幅可能な複数のプライマーを 含むものであり得る。 これらは、 標識用物質で標識されていても標識されていな くともよレ、。 標識用物質で標識されていない場合、 本発明の診断剤は、 該標識用 物質をさらに含むこともできる。 標識用物質としては、 例えば、 F I TC、 FA M等の蛍光物質、 ルミノール、 ルシフェリン、 ルシゲニン等の発光物質、 3H、 14C、 32 P、 35 S、 123 I等の放射性同位体、 ピオチン、 ス トレプトアビジン 等の親和性物質などが挙げられる。
n r f 2転写産物に対する核酸プローブは、 DNA、 RNAのいずれでもよい 力 安定性等を考慮すると DNAが好ましい。 また、 該プローブは、 1本鎖また は 2本鎖のいずれであってもよい。 該プローブのサイズは、 n r f 2の転写産物 を検出可能である限り特に限定されないが、 好ましくは約 15〜 1000 b p、 より好ましくは約 50〜500 b pである。 該プローブは、 マイクロアレイのよ うに基板上に固定された形態で提供されてもよい。
n r f 2を増幅可能な複数のプライマー （例えば、 プライマー対） は、 検出可 能なサイズのヌクレオチド断片が増幅されるように選択される。 検出可能なサイ ズのヌクレオチド断片は特に限定されないが、 例えば約 100 b p以上、 好まし くは約 200 b p以上、 より好ましくは約 400 b p以上の長さを有し得る。 プ ライマーのサイズは、 n r f 2を増幅可能な限り特に限定されないが、 好ましく は約 15〜： L 00 b p、 より好ましくは約 18〜50 b p、 さらにより好ましく は約 20〜30 b pであり得る。 n r f 2転写産物を定量可能な手段がプライマ 一である場合、 本発明の診断剤は、 逆転写酵素をさらに含むことができる。 本発明の上 E判定方法および診断剤は、 例えば、 所定の被験体における骨 ·軟 骨形成能を有する細胞の分化異常、 骨 ·関節疾患の発症または発症リスクなどを 判定し得るため、 あるいは所定の被験体における該異常または疾患が n r f 2の 発現の抑制または促進に起因するものであると判定し得るため、 該被験体におけ る所定の疾患に対する治療指針の決定、 あるいは所定の疾患等の予防を目的とす る生活習慣改善などに有用である。
(4. 2. 多型の測定に基づく判定方法および診断剤）
本発明は、 n r f 2の多型の測定に基づく、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分 ィ匕 （'ならびに Zあるいは骨 ·関節疾患） に対する動物の生体状態の判定方法を提 供する。
一実施形態では、 本発明の判定方法は、 以下の工程 （a) 、 (b) を含む：
(a) 動物から採取された生体試料において n r f 2の多型を測定する工程；
(b) n r f 2の多型に基づき、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化に対する動 物の生体状態を評価する工程。
上記方法の工程 （a) では、 動物から採取された生体試料において n r f 2の 多型が測定される。 動物は上述の通り特に限定されないが、 ヒ トが好ましい。 生 体試料は、 本発明の同定方法で上述したものと同様であり得る。
多型のタイプの測定は、 自体公知の方法により行われ得る。 例えば、 T a qM a n PCR法、 インベーダー法、 RF L P (制限酵素切断断片長多型） 法、 P CR— S S C P (—本鎖 DN A高次構造多型解析） 法、 A SO (Allele
Specific Oligonucleotide) ハイプリダイゼーシヨン法、 ダイレク トシークェン ス法、 ARMS (Amplification Refracting Mutation System) 法など力 S使用で さる。
上記方法の工程 （b) では、 n r f 2の多型に基づき、 骨 ·軟骨形成能を有す る細胞の分化に対する動物の生体状態が評価され得る。 詳細には、 動物が細胞分 化異常 （例えば、 過剰な促進または抑制） を有している可能性があるか否か、 あ るいは所定の疾患に将来的に罹患する可能性が高いか低いかが判断され得る。 本 実施例の結果,より、 n r f 2がその機能を増強させるような多型を含む場合には 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化がより抑制され、 一方、 n r f 2がその機能 を低下させるような多型を含む場合には分化がより促進され得ると考えられる。 また、 特定の疾患を発症しやすい動物では、 当該疾患に関連する遺伝子に特定の タイプの多型をしばしば有することが知られている。 従って、 n r f 2の機能を 増強または低下させるような多型を含む動物は、 骨■関節疾患を発症する可能性 が相対的に高いと考えられる。 従って、 多型の解析より、 所定の疾患の発症可能 性を判断することが可能であると考えられる。 なお、 例えば、 オープンリーディ ンダフレーム （ORF) 内に含まれる n r f 2の多型として、 配列番号 4で表さ れるヌクレオチド配列において、 3 2 7番目のアデニンがグァニンに置換された もの、 1 6 6 3番目のアデニンがグァニンに置換されたものが報告されており （ JBIRC H-Invitational Database参照） 、 測定対象となり得る多型はこのような 多型であり得る。 また、 測定対象となり得る多型は、 例えば、 本発明の同定方法 により得られたものであり得る。
本発明はまた、 n r f 2の多型の測定用試薬を含む、 上記判定を可能とする診 断剤を提供する。
n r f 2の多型の測定用試薬は、 多型のタイプを決定可能である限り特に限定 されず、 多型部位を含む部分ペプチドに対する特異的な抗体、 特定のタイプの多 型を有する n r f 2を特異的に測定可能である核酸プローブ、 あるいは特定のタ イブの多型を有する n r f 2を特異的に増幅可能である複数のプライマーを含む ものであり得る。 核酸プローブ、 プライマーは、 n r f 2を含むゲノム D N Aま たは n r f 2転写産物に対するものであり得る。 該試薬は、 標識用物質で標識さ れていてもよい。 また、 該試薬が標識用物質で標識されていない場合、 本発明の 診断剤は、 該標識用物質をさらに含むこともできる。 本宪明の診断剤はまた、 核 酸プローブ、 プライマー、 転写産物またはゲノム D N Aの抽出用試薬を含んでい てもよい。
多型部位を含む部分ペプチドに対する特異的な抗体は、 該多型を含まない n r f 2よりも、 該多型を含む n r f 2をより選択的に認、識するものである限り特に 限定されない。 多型部位を含む部分ペプチドに対する特異的な抗体の作製は、 抗 原として使用する部分ペプチドを適切に選択することにより行われ得る。 例えば 、 特定の多型に対する認識性を高めるため、 多型部位を含むサイズがより短い部 分ぺプチドが好ましく使用される。 部分ぺプチドのサイズは、 免疫原性を有する 限り特に限定されず、 例えば 8、 1 0または 1 2以上の連続するアミノ酸からな るペプチドであり得る。 また、 多型部位を含むサイズがより短い部分ペプチドに ついてハプテン化し、 免疫原性を持たせることも可能であるため、 部分ペプチド のサイズは、 必ずしも上記サイズに限定されるものではなレ、。 特定のタイプの多型を有する n r f 2を特異的に測定可能である核酸プローブ は、 特定のタイプの多型を有する n r f 2を選別可能である限り特に限定されな い。 該プローブは D N A、 R N Aのいずれでもよいが、 安定性等を考慮すると D N Aが好ましい。 また、 該プローブは、 1本鎖または 2本鎖のいずれであっても よい。 例えぱ、 多型が S N Pである場合、 該プローブのサイズは、 所定の S N P を有する n r f 2を選別可能とするため短ければ短いほどよく、 例えば、 約 1 5 〜3 0 b pのサイズであり得る。 該プローブにより、 例えば A S O (Allele Specific Oligonucleotide) ハイブリダィゼーシヨン法が可能となる。
特定のタイプの多型を有する n r f 2を特異的に增幅可能である複数のプライ マー （例えば、 プライマー対） は、 測定可能なサイズのヌクレオチド断片が増幅 されるように選択される。 このような複数のプライマーは、 例えば、 いずれか一 方のプライマーの 3 ' 末端に多型部位を含むように設計される。 測定可能なサイ ズのヌクレオチド断片、 プライマーのサイズは、 上述と同様であり得る。 n r f 2の多型を測定し得る手段が n r f 2転写産物に対する複数のプライマーである 場合、 本発明の診断剤は、 逆転写酵素をさらに含むことができる。
また、 n r f 2の多型の測定用試薬として、 特定の多型部位を認識する制限酵 素を含むものを挙げることもできる。 このような試薬によれば、 R F L Pによる 多型解析が可能となる。
本発明の上記判定方法および診断剤は、 例えば、 所定の被験体における骨 ·軟 骨形成能を有する細胞の分化異常、 骨 ·関節疾患の発症リスクなどを判定し得る ため、 あるいは所定の被験体における該異常または疾患が n r f 2の発現の抑制 または促進に起因するものであると判定し得るため、 該被験体における所定の疾 患に対する治療指針の決定、 あるいは所定の疾患等の予防を目的とする生活習慣 改善などに有用である。
( 4 . 3 . n r f 2の発現または機能を調節する物質を用いる判定方法および診 断剤）
本発明は、 n r f 2の発現または機能を調節する物質を用いる、 骨 .軟骨形成 能を有する細胞の分化効率の判定方法を提供する。
一実施形態では、 本発明の判定方法は、 以下の工程 （a ) 、 ( b ) を含む： ( a ) n r f 2の発現または機能を調節する物質を用いて、 動物から採取された 骨 ·軟骨形成能を有する細胞を培養する工程；
( b ) 培養された該細胞の形質に基づき、 該細胞の分化効率を評価する工程。 上記方法の工程 （a ) では、 n r f 2の発現または機能を調節する物質の存在 下において、 動物から採取された骨 ·軟骨形成能を有する細胞 （例えば、 骨芽細 胞、 軟骨細胞等の骨または軟骨由来細胞） 力 培地中で培養され得る。 n r f 2 の発現または機能を調節する物質は上述の通りであり得るが、 n r f 2発現べク ターが好ましい。 動物もまた上述の通りであり得るが、 好ましくは、 骨，軟骨形 成能を有する細胞の分化効率の判定が所望される被験体 （例えば、 n r f 2の発 現または機能を調節する物質による治療が検討されている被験体） から採取され た細胞が使用され得る。
上記方法の工程 （b ) では、 n r f 2の発現または機能を調節する物質を用い て培養された細胞の形質の解析結果に基づき、 分化効率が評価され得る。 細胞の 形質の解析は、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞を特徴付けることができる限り特に 限定されず、 例えば、 酸性ムコ多糖量、 沈着 C a 2 +量、 アルカリフォスファタ ーゼ活性、 骨芽細胞特異的なマーカー分子 （例えば、 I型コラーゲン、 ォステオ カルシン） 、 軟骨細胞特異的なマーカー分子 （例えば、 ァグレカン （aggrecan) 、 I I型コラーゲン、 X型コラーゲン） 等の骨 ·軟骨形成能を有する細胞に特異 的なマーカー分子の発現量の測定によりなされ得る。 また、 分化効率の評価は、 n r f 2の発現または機能を調節する物質を用いる所定の疾患の予防 '治療の有 用性を肯定する程度に十分なものであるか否かの観点から行われてもよい。 さら に、 必要に応じて、 n r f 2の発現または機能を調節する物質を用いて培養され た細胞の分化効率は、 該物質を用いて培養された対照細胞 （例えば、 正常細胞） の分化効率と比較されてもよい。 分化効率の比較は、 例えば、 形質についてのパ ラメータの有意差の有無に基づいて行なわれる。 対照細胞の分化効率は、 動物か ら採取され、 且つ該物質を用いて培養された細胞の分化効率の測定に対し、 事前 に測定した効率であつても、 同時に測定した効率であつてもよい。
本発明はまた、 n r f 2の発現または ^能を調節する物質を含む、 上記判定を 可能とする診断剤を提供する。
本発明の上記判定方法および診断剤は、 例えば、 所定の被験体における骨 ·軟 骨形成能を有する細胞の分化異常を判定し得るため、 あるいは所定の被験体に n r f 2の発現または機能を調節する物質を用いる予防 ·治療の効果を予測し得る ため、 該被験体における所定の疾患に対する治療指針の決定などに有用である。
( 5 . キット） 、 本発明は、 本明細書中で言及した任意の物質、 試薬等の構成要素を含むキット (構成要素のセットまたは組合せ） を提供する。
一実施形態では、 本発明のキットは、 以下 （a ) 、 ( b ) を含む：
( a ) n r f 2の発現または機能を調節する物質、 ならびに あるいは n r f 2 の発現量または多型の測定用試薬；
( b ) 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の形質解析用試薬、 ならびに/あるいは骨 - 軟骨形成能を有する細胞の分化調節用試薬。
上記キットの構成要素 （a ) において、 n r f 2の発現または機能を調節する 物質、 n r f 2の発現量または多型の測定用試薬は、 上述の通りである。
上記キットの構成要素 （b ) において、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の形質解 析用試薬は、 該細胞特異的な形質の解析を可能とする成分を含むものである限り 特に限定されず、 例えば、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の染色用試薬 （例えば、 ァリザリンレッド染色、 アルシアンブルー染色、 沈着 C a 2 +量の定量を可能と する成分を含む試薬） 、 あるいは骨 ·軟骨形成能を有する細胞に特異的な活性 （ 例えば、 アルカリフォスファターゼ活性） の測定用試薬、 骨 ·軟骨形成能を有す る細胞の同定用試薬 （例えば、 上述した骨芽細胞または軟骨細胞特異的なマーカ 一分子に対する抗体、 あるいは該マーカー分子を 出または定量可能な核酸プロ ーブまたは複数のプライマーを含む試薬） が挙げられる。 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化調節用試薬は、 骨 ·軟骨形成能を有する細 胞の分化を調節し得る物質 （例えば、 上述した骨芽細胞または軟骨細胞の分化を 調節し得る物質） を含むものであり得る。
本発明のキットは、 本発明の剤の作製、 ならびに本発明の判定方法などを簡便 に行い得るため有用である。
(6. 細胞）
本発明は、 n r f 2の発現が調節された、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞を提供 する。
本発明の細胞は、 骨，軟骨形成能を有する任意の細胞であり得、 例えば、 骨芽 細胞、 軟骨細胞が挙げられる。 本発明の細胞はまた、 例えば、 n r f 2の発現ま たは機能を調節する物質 （例えば、 n r f 2発現ベクター） が導入された n r f 2発現細胞であり得る。 本発明の細胞はさらに、 例えばマウス、 ラツト、 ハムス ター、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 ゥシ、 ゥマ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 サ ノレ、 ヒ ト等の哺乳動物、 ニヮトリ等の鳥類などの動物に由来する細胞であり得る 力 なかでも哺乳動物由来の細胞が好ましい。 本発明の細胞はまた、 例えば初代 培養細胞または細胞株 （例えば、 初代培養細胞から誘導された細胞株、 市販の細 胞株、 セルバンクより入手可能な細胞株） であり得るが、 好ましくは細胞株であ る。
本発明では 骨 ·軟骨形成能を有する細胞として、 骨芽細胞株、 軟骨細胞株が 好ましい。 骨芽細胞株としては、 例えば MC 3 T 3— E 1細胞、 SV— HFO細 胞、 TE— 85細胞、 U 2 OS細胞が挙げられる力 なかでも MC3T3— E 1 細胞が好ましい。 遺伝子が導入される軟骨細胞株としては、 例えば ATDC 5細 胞、 HCS— 2 8細胞、 C 20//A4細胞が挙げられるが、 なかでも ATDC 5細胞が好ましい。
本発明の細胞は、 例えば、 上述の遺伝子を一過的または安定発現し得る細胞で ある力 好ましくは安定発現し得る細胞であり得る。 なお、 「安定発現」 とは、 目的遺伝子の発現が一過性ではないことをいい、 詳細には、 細胞の培養 （例えば 継代） 後、 および/または細胞の凍結保存後でも、 目的遺伝子の活性レベルが保 持されることを意味する。
本発明の細胞は、 その分化が抑制または促進されたものであり得、 特異的な種 々の形質を示す。 例えば、 本発明の細胞は、 骨芽細胞への分化が抑制または促進 され得、 酸性ムコ多糖量、 沈着 C a 2 +量、 アルカリフォスファターゼ活性、 上 述のマーカー分子の発現量が減少または増加し得る。 また、 本発明の細胞は、 軟 骨細胞への分化が抑制または促進され得、 酸性ムコ多糖量、 アルカリフォスファ ターゼ活性、 上述のマ一カー分子の発現量が減少または増加し得る。
本発明の細胞は、 自体公知の方法、 例えば上述の培養方法により作製できる。 本発明の細胞は、 例えば、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の分化を調節し得る物 質、 あるいは骨 '関節疾患を予防 '治療し得る物質のスクリーニング （上述） に 有用である。 本発明の細胞はまた、 骨 ·関節疾患の病態マーカー遺伝子のスクリ 一ユング、 骨および Zまたは軟骨細胞マーカー遺伝子のスクリーニング、 骨 '関 節疾患の病態メカニズムの解析、 骨および Zまたは軟骨細胞の分化メカニズムの 解析などに有用である。 これらは、 例えば、 マイクロアレイ、 プロテインチップ (例えば、 抗体チップ、 またはサイファージェン社製チップ等の非抗体チップ） 等を用いた発現プロファイル解析により行われ得る。
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載 された内容は、 本明細書での引用により、 その全てが明示されたと同程度に本明 細書に組み込まれるものである。
以下に実施例を挙げ、 本発明を更に詳しく説明するが、 本発明は下記実施例等 に何ら制約されるものではない。 実施例
[ 1 ] 試薬
d d Yマウスは三協ラボサービス （東京） より購入した。 MC 3 T 3—E 1細 胞および A T D C 5細胞は理化学研究所バイオリソースセンター （筑波） より購 入した。 ECLTM検出試薬、 ペルォキシダーゼ標識抗ゥサギ I gG抗体は、 レヽ ずれも Am e r s h am L i f e S c i e n c e (Bu c k i n g h ams h i r e, En g l a n d) より購入した。 T a qポリメラーゼ、 各種制限酵素 は Ta k a r a B i o c h em i c a l (大津） より購入した。 Q u a n t u m P r e p F r e e z e DNA Ge l抽出スピンカラムおよび B i o― R a dタンパク質アツセィ試薬は、 B i o_r a d L a b o r a t o r i e s (He r c u l e s, CA, USA) より購入した。 D I G RNA標識キット および抗 D I G抗体は R o c h e D i a g n o s t i c s (Ma n n h e i m , Ge rma ny) より購入した。 P 1 u s試薬およびリポフエクタミン試薬は I n v i t r o g e n (S a n D i e g o, C A, US A) より購入した。 p RL— TK、 pRL-SV40およびデュアル一ルシフェラーゼレポーターアツ セィシステムは P r ome g a (M a d i s o n, W I , USA) より購入した 。 α—最小必須培地 （α— MEM) 、 ダルベッコ改変イーグル培地 （DMEM) 、 最小必須培地 （MEM) 、 Op t i—MEM 1低減血清培地、 ダルベッコ改変 イーグル培地 栄養混合ハム F— 12 = 1 ： 1、 リン酸緩衝化生理食塩水 （ P B S) およびェチジゥムブロマイド溶液は G i b c o BRL (Ga i t h e r s b u r g, MD， USA) より購入した。 オリゴヌクレオチドはシグマジエノシ スジャパン （北海道） より購入した。 トランスフェリン、 インスリン、 亜セレン 酸ナトリウムは S i gma A l d r i c h (S t. Lo u i s, MO, USA ) より購入した。 I SOG ENは和光純薬工業 （大阪） より購入した。 その他の 化合物は市販の特級品を用いた。
[2] MC3T3— E 1細胞および ATDC 5細胞の培養
MC3T3— E 1細胞は、 10%FB Sを含む αΜΕΜ中、 2. 5 X 103細 胞 cm2の密度で各プレートに播種し、 37°C、 5%C02条件下で培養した 。 翌日、 培地を 50 g mLァスコルビン酸および 5mM ]3—グリセ口ホス フェートを含む 10%FB S— αΜΕΜに交換し、 この時点を培養 0日目とした 。 培地は 2日おきに交換し、 各 数培養した。 - ATDC 5細胞は、 5%FB Sを含む DMEM ^F 1 2 ( 1 ： 1 ) 中、 2. 5 X 1 03細胞 cm2の密度で各プレートに播種し、 3 7°C、 5%C〇2条件下で 培養した。 翌日、 培地を、 1 0 μ g/mLインスリン、 1 0 / gZmL トランス フェリン、 3 X 1 0— 8M亜セレン酸ナトリゥムを含む 5% FB S-DMEM/ F 1 2に交換し、 この時点を培養 0日目とした。 培地は 2日おきに交換し、 各日 数培養した。
[3] RT-PCR
各日数培養した MC 3 T 3— E 1細胞および ATDC 5細胞は GPB Sを用い て 2回洗浄した。 その後、 I SOGENを用いてトータル RNAを抽出した。 細 胞および組織から抽出したトータル RNA 1 / gに対し、 DNa s e (1 u/ μレ P r ome g a) l / L、 l O xDNa s eノ ッファー l /x L、 RN a s eインヒビター （40 UZ L、 P r ome g a) 0. 5 // Lをカロえ、 3 7°Cで 20分間反応させた。 その後、 0. 2M EDTA (pH8. 0、 P r ome g a) を 加え、 反応を停止させた。 そこに、 オリゴ （dT) 18プライマー (50 /1 M、 s i gma g e n o s y s) 1 // L、 1 0 mM d N T Pミック ス （T a k a r a B i o) 3. 6 μ DE PC水 2. 4 μ Lを加え、 6 5°C 、 5分間加熱し、 すぐに氷令した。 そこに 5 X F i r s t -S t r a n dバッフ ァー ( i n v i t r o g e n) 6 ju L、 0. 1 M DTT ( i n v i t r o g e n) 3 L、 RN a s eインヒビター 1. 5 μ L、 M— ML V逆転写酵素 （20 0 u/μ L、 i n v i t r o g e n) 1. 5 μ Lを加え、 3 7°C、 50分間反応 させた。 続いて 70°C、 1 5分間加熱することにより、 逆転写酵素を失活させた 逆転写反応で得られた c DN Aを PC Rに用いた。 PCR用チューブに 1 0 X バッファー （T a k a r a ) (500 mM KC 1、 1 5 mM M g C 1 2を含 む 1 0 OmM T r i s一 HC 1 〔pH8. 3〕 緩衝液） 2. 5 / L、 dNTP ミックス 2 // L、 c DNA 1 μ L、 1 0 μ Mのセンスプライマーおよびアンチ センスプライマーをそれぞれ 1 μ L、 5 ////乙組換ぇ丁3 DNAポリメラ ーゼ （T a k a r a) 0. 1 25 /i L加えて総量 25 Lになるよう超純水を加 えて PCRを行った。 PCR産物は 2%ァガロース/ TBEゲルで電気泳動を行 レ、、 ェチジゥムブロマイドにより染色し、 UVで DNAを検出した。
[4] レポーターアツセィ
MC 3 T 3 -E 1細胞を 4 X 1 04細胞 /mL密度で 24ゥェルプ ^一トに播 種し、 3 7°C、 5% CO 2条件下で培養し 24時間後トランスフエクシヨンに用 いた。 導入するプラスミ ド DNAを O p t i —MEMで希釈し P LUS試薬と混 和後 1 5分間室温で静置した。 その後 Op t i一 MEMで希釈したリポフエクタ ミンと混和し 1 5分間室温で静置した。 Op t i一 MEMで洗浄した細胞にプラ スミ ド DNA—リポフエクタミン複合体を添加し適当時間トランスフエク トした 。 その後、 血清を含む培地に交換し、 20時間培養した。
刺激後の細胞は冷 GPB Sで 2回洗浄後、 P a s s i v e 1 y s i sバッフ ァー （P r ome g a) を用いて回収し、 測定まで一 80 °Cで保存した。 ノレシフ エラーゼ活性はデュアルルシフェラーゼレポーターアツセィシステム （P r om e g a) を用いて測定した。
[5] ィムノブロッテイング
特定期間培養した細胞を冷 PB Sで 2回洗浄して冷 PB Sで細胞を回収し、 8 000 g、 5分間遠心した。 沈殿にバッファー C { 5 OmM T r i s— HC 1 [p H 7. 5〕 、 40 OmM Na C l、 1 mM EDTA、 1 mM EGTA 、 1 0%グリセロール、 および 1 /i gZmL各種プロテアーゼインヒビター 〔 （ p—アミジノフエ二ノレ） メタンスノレフォニノレフノレオリ ド、 ベンズアミジン、 ロイ ぺプチン、 アンチパイン （antipain) 〕 、 フォスファターゼンヒビター （ 5 mM DTT、 1 OmM Na F、 1 OmM ]3—グリセ口フォスフェート） } 4 5 μ Lおよび 1 0 % No n i d e t P 40 5 ^ Lを加え、 超音波破砕機で懸濁し 、 氷上で 30分間静置後、 20000 g、 5分間遠心分離した。 得られた上清を 細胞全可溶画分として回収し、 B r a d f o r d法により蛋白定量後、 一 80°C で凍結保存した。 - 調製した細胞全可溶画分に、 S D S処理用緩衝液 { 10 %グリセ口ール、 2 % SDS、 0. 01%ブロモフエノールブルーおよび 5% 2—メルカプトエタノ ールを含む l OmM T r i s— HC 1緩衝液 （ρΗ6. 8) } を容量比 4 ： 1 で添加して 100°C、 10分間加熱した。 ついでポリアクリルアミドゲル （濃縮 用ゲル濃度 4. 5%、 分離用ゲル濃度 7. 5%) を用いて室温で電気泳動 （1 5 mAZプレート） した。
S D S電気泳動後のゲルを、 予め 100 %メタノールで活性化した P VD F膜 に、 95mAで 30分間ブロッテイングした。 ブロッテイング終了後、 同膜を 5 0/0スキムミルク { l 37mM Na C lぉょび0. 05% Twe e n 20を含 む 20mM T r i s— HC 1緩衝液 （TBST) (pH7. 5) に溶解 } 中で 1時間ブロッキングを行った。 この PVDF膜を、 1%スキムミルク （TB ST に溶解） で希釈した抗 n r f 2抗体を 1次抗体として、 4°Cでー晚静置した。 翌 日、 TB STを用いて 5分間ずつ 3回洗浄した。 次に、 ペルォキシダーゼ標識さ れた抗ゥサギ I gG抗体を 1%スキムミルク （TBSTに溶解） で希釈したもの を、 2次抗体として室温で 1時間反応させたのち、 TBSTを用いて 10分ずつ 3回洗浄した。 この PVDF膜を ECLTM検出用試薬と 1分間反応させたのち 、 X線フィルムに感光させて抗体陽性ブロットを検出した。
[6] インサイチュハイプリダイゼーシヨン
d dYマウス脛骨を 4%パラホルムアルデヒ ドで固定し、 次いで 20%EDT Aの PBSで脱灰し、 30%スクロースの P.B Sで脱水した。 脱水後、 ドライア イスで凍結させ、 クライオスタツトを用いて 5 μπιの厚さの切片を作製し、 シラ ンコーティングしたスライドガラスに貼り付けた。 この切片を 4%パラホルムァ ルデヒ ド （ΡΒΤ中） により 10分間固定したのち、 ΡΒΤ {0. 1Mホスフエ —トバッファー （ΡΒ) 、 0. 1% Twe e n} で 5分間、 2回洗浄した。 次 いで P r oK (10 gZmL P r oK i n P B T) で 10分間処理し、 PBTで 5分間、 2回洗浄した。 さらに 4%パラホルムアルデヒドで 5分間固定 し、 . PBTで 5分間、 2回洗浄した。 次に TEAZ0.. 25%無水酢酸で 1 5分 間処理し、 P BTで 5分間、 2回洗浄した。 最後に DE P C水で軽くすすぎ、 室 温で 30分間風乾した。 1 00 n Lの濃度のプローブ 1. 5 // Lをハイブ リダィゼーションバッファー 3 00 μ Lで希釈し、 切片を風乾させている間に 8
5°C、 1 0分間加熱し、 その後急冷した。 これを風乾させた切片に滴下し、 5 0 %ホルムアミド、 5 X S S Cで湿らせた湿箱中に置き、 6 5°Cで一晩放置した。 翌日、 切片を 5 X S S C (6 5。C、 2分） 、 1 X S S C、 5 0%ホルムアミ ド （
6 5°C、 3 0分） 、 TNEバッファー （3 7°C、 1 0分） 、 2 X S S C (6 5°C 、 20分） 、 0. 2 X S S C (6 5。C、 20分） 、 T N Eバッファー （ 3 7 °C、
1 0分） 、 RN a s e A ( 1 0mg /m L RN a s e A i n TNEバッフ ァー、 3 7。C、 3 0分） 、 TNEバッファー （3 7°C、 1 0分） 、 2 X S S C (
6 5°C、 20分） 、 0. 2 X S S C (6 5°C、 2 0分） 、 1 XMABTバッファ 一 （室温、 5分） 、 ブロッキング試薬 （1. 5 % i n 1 XMABTバッファ 一、 室温、 2時間） 、 1 XMABTバッファー （室温、 2分） の順に反応させた 。 その後、 アルカリフォスファターゼ標識された抗 D I G抗体 （1 00 0倍希釈 、 0. 1 5 %ブロッキング試薬 i n 1 XMAB Tバッファー） と 4°Cで 1 6 時間反応させた。 この反応させた切片を MABTバッファー （室温、 5分） を 2 回、 レバミゾール （levamisole) 入り NTMTバッファー （室温、 1 0分） で反 応させ、 ΝΒΤ,Β C I Pをレバミゾール入り NTMTバッファーで 5 0倍に希 釈した溶液を^片上に滴下し発色させた。 発色後、 NTMTバッファーで室温、 3分反応させ、 P B Sで軽く洗浄後、 5 0 %グリセ口ールで封入し、 顕微鏡下で 観察した。
[7] 安定発現細胞株の樹立
MC 3 T 3— E 1細胞および ATDC 5細胞を 4 X 1 04/mLの濃度で 6ゥ エルシャーレに播種し、 3 7。C、 5%C02インキュベーターで培養した。 24 時間後に 8 0 - 9 0%コンフルェントになった細胞を以下の遺伝子導入に用いた
F B S非含有 o p t i —MEM培地 5 00 μ Lに D'NA 2 ju gと P l u s試 薬 8 /i Lを加え混和し、 室温で 1 5分間放置し、 リポフエクタミン 12 /z Lを含 む 500 μ Lの o p t i— MEM培地を混合し、 さらに 1 5分間放置した。 これ を 6ゥヱルシャーレ上に培養した細胞に加え、 37°C、 1時間培養した。 その後 培地を各細胞の通常培地に交換し、 48時間後に、 0. 25%トリプシンを細胞 で 5分間処理した。 回収した細胞を 100、 200および 400倍に希釈してデ イツシュに播き直し、 37°C、 5%C02インキュベーターで培養した。 24時 間後に G418 (最終濃度 600 / gZmL) を加え、 これを約 2週間さらに培 養した。
約 2週間後に顕微鏡下でコロニーを確認し、 その位置に印を付けた。 単一コロ ニーにペニシリンキャップを付け、 0. 25%トリプシンを加え、 細胞を回収し 、 10 % F B Sを含む各培養液に移し、 G 418存在下で培養した。
コンフルェントに達した細胞をさらに 6ゥエルシャーレに播き直し、 6ゥエル に播き直した細胞からタンパク質を調製し、 抗 n r f 2抗体を用いてィムノブ口 ッティングによりタンパク質の発現を検討することによりスクリーニングを行つ た。
[8] 免疫細胞化学法
細胞を PB Sで 2回洗浄し、 4%パラホルムアルデヒ ドで 10分間、 細胞を固 定した。 P B Sで 2回洗浄したのち、 ブロッキング溶液 （l%T r i t o n X- 100を含む 10%B S A) で細胞をプロッキングした。 1時間後に 10倍希釈 のブロッキング溶液に希釈した一次抗体を 4 °Cでー晚反応させた。 翌日 10倍希 釈のプロッキング溶液に希釈した蛍光標識二次抗体を室温で一時間反応させたの ち、 共焦点レーザー顕微鏡によって観察した。
[9] Ch i Pアツセィ
クロマチン免疫沈降 （Ch I P) アツセィキット （Up s t a t e b i o t e c h n o l o g y) を用いた。 細胞に 10 %ホルムアルデヒ ト /P B Sを 1 10量添加し、 終濃度 1%で 37°C、 15分間固定した。 1 5分後に培地を捨て 、 氷冷 PBS ( 1 mM PMSF, 1 μ g/m 1ァプロチニン） で洗浄した。 1 O cmディッシュに lm l P B Sを加え、 細胞をかき取って 1. 5m lチュー ブで 700 X g， 4°C、 3分間遠心した。 上清を捨て、 ライシス （Lysis) バッ ファー （1%SDS， 1 OmM EDT A, 50 mM T r i s -HC 1 , H 8. 1, 1 mM PMS F, l g /m 1ァプロチュン） 1 50 1をカ卩え、 ボ ルテックズで撹拌し、 氷上で 10分間した。 サンプノレを氷上に置き、 10秒ソニ ケートした後 20秒間隔を取り、 合計 4回ソニケートした。 サンプノレを Ch I P 希釈バッファー （0. 01%SDS, 1. 1 %T r i t o nX- 100, 1. 2 mM EDTA, 16. 7 mM T r i s -HC 1 , pH8. 1， 167 mM N a C 1 , 1 mM PMS F, 1 g Zm 1ァプロチニン） で 10倍希釈した。 これに 4 Om 1プロテイン Aァガロース （ 1. 5m lビーズ w i t h 600 μ gのソニケートしたサケ精子 DN A, 1. 5mg BSA, 4. 5 m g組換え プロテイン A/:!. 5m 1ノ ッファー； 1 OmM T r i s— HC 1 , H8. 0， 1 mM EDTA, 0. 05%アジ化ナトリウム） を加え、 4°C， 30分間 インキュベートした。 遠心 1500 r pm, 15秒， 4 °Cで上清を移し、 抗体 1 μ g (200 /z gZm 1の場合 5 μ 1 ) を入れ、 4 °Cで 6時間からー晚インキュ ベ一トした。 また、 目的タンパク質が I gGに非特異的に結合する可能性がある ので、 ネガティブコントロールとして同一サンプルを I gGとインキュベートし た。 翌日、 50 1プロテイン Aァガロースを加え、 4°Cで 1時間インキュベー 卜した。 次にプロテイン Aァガロースを、 4段階かけて洗浄した。 それぞれ、 4 。Cで 3分間インキュベートした。 （1) 低塩 （Low Salt) バッファ一 （0. 1% SDS, 1 %T r i t o nX- 100, 2 mM EDTA, 2 OmM T r i s -HC 1 , pH8. 1, 150 mM N a C 1 ) 、 (2) 高塩 （High Salt) ノ ッファー （0. 1%SDS， l%T r i t o nX- 100, 2 mM EDTA, 2 OmM T r i s -HC 1 , pH8. 1, 50 OmM Na C 1 ) 、 (3) L i C lノ ッファー （0. 25M L i C l , 1 %NP 40, 1%デォキシコレー ト， ImM EDTA, 1 OmM T r i s— HC 1 , pH8. 1) 、 (4) T Eバッファー （l OmM T r i s -HC 1 , 1 mM EDTA, pH8. 0) X 2回。 洗浄後、 50 / 1溶出バッファー （ 1 OmM DTT, 1%SDS， 0 . 1M N a HC03) ， 常温， 15分で溶出した。 遠心で上清を取り、 レジン に再び 50 1溶出バッファーを加えてもう一度く り返した。 サンプノレ （100 μ 1 ) に対し 5 Na C lを加え、 65°C, 6時間インキュベートし た。 2 μ Γ 0. 5Μ EDTA, 4 μ 1 1 M T r i s _HC l， p H 6. 5， 0. 6 μ 1 6mgノ m 1プロティナーゼ Kを加え、 45°Cで 1時間インキ ュベー卜した。 フエノール一クロ口ホルム法により DNAを抽出し、 50 μ 1の 精製水で溶出した。 このうちの 10 μ 1を PC Rに用いた。
[10] ゲルシフトアツセィ
プローブとして、 ォステオカルシンプロモータ一上の ARE配列を含む合計 2 2塩基対の合成 2本鎖オリゴヌクレオチドを作製した。 このプローブを、 DNA ポリメラーゼ Iのクレノーフラグメントを用いて [α_32Ρ] デォキシ _CT Pで放射標識後、 スピンカラムを用いて精製した。 標品 （2〜5 /z gタンパク質 ) を、 放射性プローブ （20 f mo l、 l〜2 X 105c pm) 、 ポリ （ d I - d C) 、 16 OmM KC 1、 1 mM EDTA, 1 mM EGTA、 1 0%グリセロール、 5mM DTT、 1 OmM Na F、 1 OmM b_GPお よび 1 /x g/mL各種蛋白質分解酵素阻害剤を含む 5 OmM T r i s— HC 1 緩衝液 （pH7. 5) 中で、 25°C、 30分間反応させた。 反応後、 6%ポリア クリルアミ ド.ゲルを用いて、 プローブノ蛋白質複合体と遊離プローブを泳動用緩 衝液 [50mM T r i s、 0. 38Mグリシン、 2 mM EDTA, pH8. 5] 中で、 80V定電圧、 4°C、 1. 5〜2. 5時間泳動分離した。 泳動後、 ゲ ノレをゲルドライヤーで乾燥し、 ゲル中の放射能をオートラジオグラム法により検 出した。
実施例 1 ：骨および軟骨での n r f 2の発現
骨組織および軟骨組織における n r f 2ZMa f シグナリング機構の存在確認 のため、 骨および軟骨での n r f 2の発現を検討した。
結果を図 1、 2に示す。 軟骨細胞層に n r f 2の mRN A発現が認められると ともに、 骨梁表面に存在する骨芽細胞においても発現が認められた。
以上より、 骨および軟骨において n r f 2が発現していることが示された。 実施例 2 ： MC 3 T 3— E 1および ATDC 5細胞での n r f 2/Ma f シグナ ノレ伝達分子の発現
骨芽細胞および軟骨細胞における n r f 2 /M a f シグナリング機構の存在の 確認のため、 MC 3 T 3 -E 1および ATDC 5細胞での n r f 2/Ma f シグ ナル伝達分子の発現を、 RT— PC Rにより検討した。
結果を図 3、 4に示す。 骨芽細胞株 MC 3 T 3— E 1細胞と軟骨細胞株 AT D C 5細胞においては n r f 2、 Ke a p l、 Ma f F、 Ma f G、 Ma f Kの n r f 2/Ma f シグナリング分子の発現が認められた。
以上より、 骨芽細胞および軟骨細胞ともに n r f 2 a f シグナリング機構 が存在することが示された。
実施例 3 ： n r f 2安定発現 MC 3 T 3— E 1および ATDC 5細胞株の樹立 丁ー？じ！^法にょり発現の確認された r f 2が骨 ·軟骨細胞分化に及ぼす 影響を検討するため、 EFプロモーターを有する n r f 2発現プラスミ ドを作製 し、 上述の方法により n r f 2安定発現 MC 3T 3— E 1および ATDC 5細胞 株を樹立した。
結果を図 5に示す。 樹立した細胞株では、 n r f 2 mRNAおよびタンパク 質が発現していた （図 5 (A) 、 （B) ) 。 また、 これらの細胞株では、 n r f 2による HO_ 1プロモーターに対する転写調節活性が確認された （図 5 (C)
) o
以上より、 樹立した細胞株において n r f 2が発現かつ機能していることが示 された。
実施例 4 ： n r f 2安定 （過剰） 発現 ATDC 5細胞の解析
n r f 2が軟骨細胞の増殖、 分化または成熟に及ぼす影響について検討するた め、 n r f 2安定発現 ATDC 5細胞を解析した。 解析は、 アルシアンブルー染 色、'アル力リフォスファターゼ活性測定、 および半定量 RT— PC R法により行 つた。
結果を図 6〜 8に示す。 n r f 2安定発現細胞株ではァルシアンブルー染色性 の低下 （図 6 (A) 、 （D) 、 図 7 (B) ) が認められただけでなく、 アルカリ フォスファターゼ活性の低下 （図 6 (C) 、 図 7 (A) ) も認められた。 さらに コラーゲン I I、 コラーゲン X、 ォステオボンチンの発現低下が認められた （図 6 (B) 、 図 8 (A) 、 （B) ) 。
以上より、 n r f 2は、 軟骨細胞分化を阻害する因子であることが示唆された 実施例 5 ： n r f 2安定 （過剰） 発現 MC 3 T 3— E 1細胞の解析
n r f 2が軟骨細胞の増殖、 分化または成熟に及ぼす影響について検討するた め、 n r f 2安定発現 MC 3 T 3— E 1細胞を解析した。
結果を図 9〜 1 1に示す。 n r f 2安定発現細胞株ではァリザリンレツド染色 性の低下 （図 9 (A) ) が認められただけでなく、 アルカリフォスファターゼ活 性の低下 （図 9 (C) 、 図 10 (A) ) も認められた。 また、 カルシウム蓄積量 の低下も同時に認められた （図 9 (D) 、 図 10 (B) ) 。 さらにコラーゲン I
、 ォステオカルシンの発現低下が認められた （図 9 (B) 、 図 1 1 (A) 、 (B
) ) 0
以上より、 n r f 2は、 骨芽細胞分化を阻害する因子であることが示唆された 実施例 6 ： OG 2プロモーターへの n r f 2の影響の解析
骨芽細胞特異的な遺伝子であるォステオカルシンのプロモーターは骨芽細胞分 化のマスターレギュレーターである r u n X 2によってその活性が有意に上昇す る。 したがって、 r u n X 2依存的な骨芽細胞分化に対する n r f 2の影響につ いて解析するため、 n r f 2が r u n X 2依存的に OG 2の発現を調節し得るか 否かをレポ一ターアツセィにより検討した。
結果を図 12に示す。 COS 7および MC 3 T 3— E 1の両細胞において r u n x 2による OG 2プロモーターの活性上昇を n r f'2は有意に抑制した。 以上より、 n r f 2は、 r u n x 2依存的に OG 2の発現を阻害することが示 唆された。
実施例 7 ： r u n X 2の細胞内局在に対する n r f 2の影響
n r f 2の骨芽細胞分化抑制作用が n r f 2による r un x 2の細胞内局在変 化に起因するか検討するため、 n r f 2の発現が r u n x 2の核への局在に影響 を及ぼすか否かを COS 7細胞および MC3T3— E 1細胞を用いた免疫細胞化 学法により検討した。
結果を図 13に示す。 COS 7細胞においては n r f 2と r u n X 2の共発現 により両遺伝子の細胞内局在変動は認められなかった （図 1 3 (A) ) 。 また、 MC 3 T 3— E 1細胞においても n r f 2の過剰発現により内在性の r u n x 2 の細胞内局在に変化は認められなかった （図 13 (B) ) 。
以上より、 n r f 2は、 r u n X 2の核への局在に影響を及ぼざないことが示 唆された。
実施例 8 ：ォステオカルシンプロモーター上への r u n X 2の結合への n r f 2 の影響
n r f 2による r u n x 2依存的な O G 2活性上昇の抑制が r u n x 2のォス テオカルシンプロモーター上への結合抑制に起因するかを検討するため、 Ch I Pアツセィにより r u n X 2のォステオカルシンプロモーター上への結合を検討 した。
結果を図 14に示す。 n r f 2と r u n X 2の共発現により r u n X 2のォス テオカルシンプロモーター上への結合は有意に抑制された。
以上より、 n r f 2は、 r u n X 2リクルートを低減させる因子であることが 示唆された。
実施例 9 ： n r f 2のォステオカルシンプロモーター上への結合能の解析
n r f 2による骨芽細胞分化抑制作用が n r f 2の D N A結合能に起因するか を検討するため、 ォステオカルシンプロモータ一上に存在する n r f 2結合様サ ィ トをプローブとしたゲルシフトアツセィ法により n'r f 2のォステオカルシン プロモーター上への DN A結合能を検討した。
結果を図 1 5に示す。 ォステオカルシンプロモーター上には ARE様 1と AR E様 2の二箇所の n r f 2結合様サイトが認められた （図 15 (A) ) 。 そのう ち ARE様 2への n r f 2の結合が認められた （図 15 (B) ) 。
5 以上より、 n r f 2は、 ォステオカルシンプロモーターの ARE (
antioxidant responsive element) に結合することカ¾不 れた。
実施例 10 : n r f 2による r u n x 2依存的 O G 2活性上昇抑制作用の A R E 様 2の関与の検討
一 n r f 2の r u n x 2依存的なォステオカルシンプロモーター活性上昇に対す 10 る抑制効果がォステオカルシンプロモーター上に存在する n r f 2結合サイ卜の ARE様 2を介する反応であるかを検討するため、 ARE様 2変異型 OG 2を用 いて r u n X 2依存的 OG 2活性上昇に対する n r f 2の影響を検討した。 結果を図 16に示す。 C O S 7細胞および MC 3 T 3— E 1細胞ともに変異型 OG2の r u n x 2依存的活性上昇は n r f 2により完全に阻害されなかった。 15 以上より、 n r f 2による r u n X 2依存的 OG 2活性上昇抑制作用は一部分 ' はォステオカルシンプロモーター上に存在する n r f 2結合サイト ARE様 2へ の r f 2の結合が関与していることが示された。
実施例 1 1 ： OSE 2レポーター活性に対する n r f 2の関与
r u n x 2依存的なォステオカルシンプロモーター活性上昇に対する n r f 2 20 の抑制効果がォステオカルシンプロモーター上に存在する r un x 2結合サイト OS E 2を介する反応であるかを検討するため、 r u n x 2結合配列である OS E 2のレポーターベクターを用いて r u n x 2依存的 O S E 2活性上昇に対する n r f 2の影響を検討した。
結果を図 1 7に示す。 COS 7細胞および MC 3 T 3— E 1細胞ともに OSE 25 2レポーターの r u n X 2依存的活性上昇は n r f 2により一部分阻害された。
以上より、 n r f 2による r u n x 2依存的 O G 2活性上昇抑制作用は一部分 はォステオカルシンプロモーター上に存在する n r f'2結合サイト OSE 2が関 与していることが示された。 .
実施例 1 2 ：卵巣摘出モデルマウスの骨組織における n r f 2発現解析
閉経後骨粗鬆症モデルマウスである卵巣摘出マウスの骨組織における n r f 2 の発現を検討するため、 半定量 RT— PC R法およびインサイチュハイブリダイ ゼーシヨン法により n r f 2の mRN A発現を検討した。
結果を図 1 9に示す。 卵巣摘出マウスではマイクロ CT解析により骨梁の減少 が認められた （図 19 (A) ) 。 この条件下において n r f 2の mRNA発現は 卵巣摘出マウスにおいては有意に上昇していることが確認された （図 1 9 (B) 、 （C) ) 。
以上より、 卵巣摘出マウスにおける骨芽細胞分化抑制機構に n r f 2発現上昇 が関与している可能性が示された。
実施例 13 ： n r f 2の骨芽細胞増殖性および細胞死への影響
n r f 2の骨芽細胞の増殖性あるいは細胞死に対する影響を検討するため、 B r dU取り込み、 サイクリン D 1プロモータ一活性および TUNE L染色への n r f 2の影響を検討した。
結果を図 20に示す。 n r f 2により B r dU取り込み （図 20 (A) ) およ びサイクリン D 1プロモーター活性 （図 1 9 (B) ) は有意に減少することが明 らかとなつた。 一方、 n r f 2は TUNE L染色陽性を示す細胞数には影響を与 えな力つた。 .
以上より、 n r f 2は細胞死誘導作用を示さなかったのに対して、 細胞増殖性 を抑制することが示された。
(^n pfffl)
以上の結果により、 n r f 2は骨 '軟骨組織においても発現が認められ、 r u n x 2による骨芽 ·軟骨細胞の分化作用を調節することにより、 骨 ·軟骨分化を 負に制御することが示唆された。 産業上の利用可能性 本発明の調節剤は、 骨，軟骨形成能を有する細胞の分化調節、 ならびに骨，関 節疾患の予防 ·治療などを可能とする。 本発明のスクリーニング方法は、 骨 '軟 骨形成能を有する細胞の分化調節剤、 ならびに骨■関節疾患に対する予防 ·治療 剤の開発などを可能とする。 本発明の診断剤は、 骨 ·軟骨形成能を有する細胞の 分化に対する動物の生体状態の評価を可能とし、 また、 骨 ·関節疾患の患者の治 療に際して、 n r f 2の発現または機能を調節する物質の当該患者における治療 効果の予測を可能とする。
本出願は、 2005年 6月 3日に日本で出願された特願 2005- 16486 0を基礎としており、 その内容は本明細書中に援用される。

Claims

請求の範囲
I . n r f 2の発現または機能を調節する物質を含む、 骨芽細胞または軟骨細胞 分化の調節剤。
2 . n r f 2の発現または機能を調節する物質が、 n r f 2タンパク質または n r f 2発現ベクターである、 請求項 1記載の剤。
3 . n r f 2の発現または機能を調節する物質が、 アンチセンス核酸、 リボザィ ム、 R N A i誘導性核酸、 デコイ核酸、 ターゲテイングベクター、 n r f 2抗体 、 n r f 2ドミナントネガティブ変異体、 およびそれらの発現ベクターからなる 群より選ばれる、 請求項 1記載の剤。
4 . 骨芽細胞または軟骨細胞分化の抑制剤である、 請求項 2記載の剤。
5 . 骨芽細胞または軟骨細胞分化の促進剤である、 請求項 3記載の剤。
6 . n r f 2の発現または機能を調節する物質を含む、 骨 ·関節疾患の予防また は治療剤。
7 . 被験物質が n r f 2の発現または機能を調節し得るか否かを評価することを 含む、 骨芽細胞または軟骨細胞分化を調節し得る物質のスクリーニング方法。
8 . 被験物質および n r f 2の発現を測定可能な細胞を用いて、 被験物質が該細 胞における n r f 2の発現を調節し得るか否かを評価することを含む方法である 、 請求項 7記荦の方法。
9 . 被験物質および非ヒト動物を用いて、 被験物質が該動物における n r f 2の 発現を調節し得るか否かを評価することを含む方法である、 請求項 7記載の方法
1 0 . 被験物質および n r f 2の機能を測定可能な再構成系を用いて、 被験物質 が該再構成系において n r f 2の機能を調節し得るか否かを評価することを含む 方法である、 請求項 7記載の方法。
I I . 被験物質および n r f 2発現細胞を用いて、 被験物質が該細胞において n r f 2の機能を調節し得るか否かを評価することを含 方法である、 請求項 7記 載の方法。
1 2. 発現または機能の調節が発現または機能の促進である、 請求項 7記載の方 法。
1 3. 発現または機能の調節が発現または機能の抑制である、 請求項 7記載の方 5 法。
14. 被験物質が n r f 2の発現または機能を調節し得るか否かを評価すること を含む、 骨 ·関節疾患を予防または治療し得る物質のスクリーニング方法。
1 5. 被験物質が n r f 2の発現または機能を調節し得るか否かを評価すること を含む、 r u n X 2リクルートまたはォステオカルシン発現を調節し得る物質の0 スクリーニング方法。
1 6. n r f 2の特定の変異が骨芽細胞または軟骨細胞分化に及ぼす影響を解析 することを含む、 骨芽細胞または軟骨細胞分化に変化をもたらす n r f 2変異の 同定方法。
1 7. 変異が多型である、 請求項 1 6記載の方法。
5 1 8. n r f 2の発現量の測定用試薬を含む、 骨芽細胞または軟骨細胞分化に対 ' する動物の生体状態の診断剤。
1 9. n r f 2の多型の測定用試薬を含む、 骨芽細胞または軟骨細胞分化に対す る動物の生体状態の診断剤。
20. n r f 2の発現または機能を調節する物質を含む、 骨芽細胞または軟骨細0 胞分化効率の診断剤。
2 1. 以下 （a) および （b) を含む、 キット ：
(a) n r f 2の発現または機能を調節する物質、 ならびに Zあるいは n r f 2 の発現量または多型の測定用試薬；
(b) 骨芽細胞または軟骨細胞の同定用試薬、 ならびに Zあるいは骨芽細胞また5 は軟骨細胞の分化調節用試薬 （但し、 （a) の物質を含む試薬を除く） 。
22. n r f 2の発現が調節された骨芽細胞または軟骨細胞。
23·. 骨芽細胞または軟骨細胞が、 n r f 2安定発現骨芽細胞株または軟骨細胞 株である、 請求項 2 2記載の細胞。
2 4 . 骨芽細胞または軟骨細胞特異的な n r f 2発現ベクター。
2 5 . n r f 2の発現または機能を調節する物質の有効量を被験体に投与するこ とを含む、 骨芽細胞または軟骨細胞分化の調節方法。
2 6 . n r f 2の発現または機能を調節する物質の有効量を被験体に投与するこ とを含む、 骨 ·関節疾患の予防または治療方法。
2 7 . 骨芽細胞または軟骨細胞分化の調節剤の作製における、 n r f 2の発現ま たは機能を調節する物質の使用。
2 8 . 骨 .関節疾患の予防または治療剤の作製における、 n r f 2の発現または 機能を調節する物質の使用。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009144704A3 (en) * 2008-04-15 2010-05-27 Quark Pharmaceuticals, Inc. siRNA COMPOUNDS FOR INHIBITING NRF2
US8410069B2 (en) 2007-03-21 2013-04-02 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotide inhibitors of Nrf2 and methods of use thereof for treatment of cancer
WO2014129550A1 (ja) * 2013-02-21 2014-08-28 国立大学法人熊本大学 骨分化誘導方法及び骨化促進・抑制分子のスクリーニング方法
JP2019059709A (ja) * 2017-09-28 2019-04-18 学校法人 川崎学園 ｍｉＲ−１４０−３ｐによる骨芽細胞からのオステオカルシン産生促進

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AONO J. ET AL.: "Activation of Nrf2 and accumulation of ubiquitinated A170 by arsenic in osteoblasts", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 305, 2003, pages 271 - 277, XP003002979 *
BECK G.R. ET AL.: "Gene array analysis of osteoblast differentiation", CELL GROWTH & DIFFERENTIATION, vol. 12, 2001, pages 61 - 83, XP002286918 *
BECK G.R. ET AL.: "Inorganic phosphate regulates multiple genes during osteoblast differentiation, including Nrf2", EXP. CELL RES., vol. 288, 2003, pages 288 - 300, XP001182433 *
HINOI E. ET AL.: "Nrf2 expressed by bone and cartilage", J. PHARMACOL. SCI., vol. 100, no. SUPPL. 1, February 2006 (2006-02-01), pages 269P (ABSTRACT P3L-28), XP003002980 *
HINOI E. ET AL.: "Nrf2 ngeatively regulates osteoblast differentiation via interfering with Runx2-dependent transcriptional activation", J. BIOL. CHEM., vol. 281, 30 June 2006 (2006-06-30), pages 18015 - 18024, XP003002981 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8410069B2 (en) 2007-03-21 2013-04-02 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotide inhibitors of Nrf2 and methods of use thereof for treatment of cancer
WO2009144704A3 (en) * 2008-04-15 2010-05-27 Quark Pharmaceuticals, Inc. siRNA COMPOUNDS FOR INHIBITING NRF2
US8278287B2 (en) 2008-04-15 2012-10-02 Quark Pharmaceuticals Inc. siRNA compounds for inhibiting NRF2
WO2014129550A1 (ja) * 2013-02-21 2014-08-28 国立大学法人熊本大学 骨分化誘導方法及び骨化促進・抑制分子のスクリーニング方法
JPWO2014129550A1 (ja) * 2013-02-21 2017-02-02 国立大学法人 熊本大学 骨分化誘導方法及び骨化促進・抑制分子のスクリーニング方法
JP2019059709A (ja) * 2017-09-28 2019-04-18 学校法人 川崎学園 ｍｉＲ−１４０−３ｐによる骨芽細胞からのオステオカルシン産生促進

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