CN109797210A - 一种y染色体微缺失的检测方法及其引物组 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，具体公开了一种用于检测Y染色体微缺失的方法及其引物组。本发明对AZFasY84、AZFasY86、AZFasY127、AZFasY134、AZFasY254、AZFasY255、SRYsY14这7个序列标签位点的核酸序列进行分析，设计相应的引物，对样本基因组DNA特定位点经过多重PCR扩增，最后以Ion Torrent半导体芯片测序技术进行检测。本发明的检测方法具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快等优点。为男性缺精、少精不育的遗传学方面的检测、测试、分析和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径，从而为该类疾病的临床诊断提供理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，涉及用分子生物学方法对Y染色体微缺失相关基因序列标签位点检测的引物组，特别涉及用Ion Torrent半导体芯片测序技术对Y染色体微缺失进行定性、定量检测的相关引物组及其试剂盒。
背景技术
男性不育的发病率很高，大约每20个男子中就有一个患男性不育的。究其原因，多为缺精、少精所致不育。按照WHO标准进行2次以上的精液常规分析，可分为无精症，严重少精症 (精子密度<5×106／m1)、少精症 (精子密度<20×106／m1)以及密度正常的弱精症(精子密度>20×106／ml，精子活率<50％)四大类。导致男性不育的病因很多，除了炎症引起的器质性病变，精索静脉曲张，隐睾，Klinefelter综合征以及阻塞性无精症等因素所致的缺精少精外，Y染色体上的精子生成因子（azoospermia factor，AZF）座位微缺失则是导致男性不育的一个重要的遗传因素。是继Klinefelter综合征之后导致男性不育的第二大高发因素。
精子生成因子AZF是一组位于Y染色体长臂上的基因家族，分为近端AZFa、中端AZFb、远端AZFc三个区域，其中任何一个区域的微缺失都能导致精子生成障碍。
根据欧洲男性科学学会（EAA）推荐的标准，确定AZF基因家族是否存在微缺失要设置6个序列标志位点（sequence tagged sites， STS）引物，每个区域位点分别有两个STS引物，分别是AZFa: sY84, sY86；AZFb: sY127, sY134；AZFc: sY254, sY255。同时还要设立一个确定男性性别的标志性基因SYR。
目前已报道的用于遗传性男性不育的检测主要是复合PCR及琼脂糖凝胶电泳的方法，存在假阴性的几率较高。
Ion Torrent半导体芯片测序技术是新一代的测序技术，它的核心技术是使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。在半导体芯片的微孔中的微球上固定DNA链，随后依次掺入单核苷酸dGTP、dCTP、dATP、dTTP。随着每个碱基的掺入，释放出H+，H+在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H+的检测，实时判读碱基。由于其化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度，一台仪器即可适合各种测序通量需求的科学研究，在较短的时间内获得真实可靠的实验结果。
Ion Torrent半导体芯片测序技术与传统Sanger法及二代测序技术比较，IonTorrent技术有以下优势：系统无激光光源，无光学系统，无照相系统；使用无标记的核苷酸及酶进行测序，本底干扰低；通过对 H+的检测，可以改善碱基判读准确性；测序通量大、速度快，完成1G通量的测序检测仅需2~3小时，是传统Sanger测序方法通量的数千倍以上，同时弥补了已有二代高通量测序方法工作时间过长的缺陷。
目前尚没有报道Ion Torrent半导体芯片测序技术专门用于Y染色体微缺失相关基因序列标签位点的检测。
发明内容
本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，提供针对Y染色体微缺失所进行的定性、定量检测的方法及其引物。
为解决上述问题，本发明采取以下技术方案。
利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的AZFasY84、AZFasY86、AZFasY127、AZFasY134、AZFasY254、AZFasY255、SRYsY14这7个序列标签位点，用Primer Express Software 5.0软件设计PCR引物。
用于检测AZFasY84的引物，是由序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成的引物对：
上游引物：5’- acagggaacgcctgatttcaccctttacagttta -3’ SEQ ID No: 1
下游引物：5’- gggagtaggaggtagagccac -3’ SEQ ID No: 2。
用于检测AZFasY86的引物，是由序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的引物对：
上游引物：5’- acagggaacgggtaatggcttcccagagttg -3’ SEQ ID No: 3
下游引物：5’- tcaaggactgtgagaatcaaggt -3’ SEQ ID No: 4。
用于检测AZFasY127的引物，是由序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的引物对：
上游引物：5’- acagggaacgttcatacccacaaaaagagaagaa -3’ SEQ ID No: 5
下游引物：5’- agaactttcacaaacatctggct -3’ SEQ ID No: 6。
用于检测AZFasY134的引物，是由序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的引物对：
上游引物：5’- acagggaacgcaggtcaaaggaaataaatagatgg -3’ SEQ ID No: 7
下游引物：5’- cagtcacagaacgcttcaagtaga -3’ SEQ ID No: 8。
用于检测AZFasY254的引物，是由序列表中SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10组成的引物对：
上游引物：5’- acagggaacggggtgttaccagaaggcaaa -3’ SEQ ID No: 9
下游引物：5’- gtcccacatcccattgttcat -3’ SEQ ID No:10。
用于检测AZFasY255的引物，是由序列表中SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成的引物对：
上游引物：5’- acagggaacggttacaggattcggcgtgat -3’ SEQ ID No: 11
下游引物：5’- ctcgtcatgtcatgtgcagccac -3’ SEQ ID No: 12。
用于检测SRYsY14的引物，是由序列表中SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14组成的引物对：
上游引物：5’- acagggaacgcattcatcgtgtggtctcgc -3’ SEQ ID No: 13
下游引物：5’- gccatttttcggcttcagta -3’ SEQ ID No: 14。
采用多重PCR的方法用上述引物组对待检测样本进行PCR扩增。
将PCR扩增产物进行扩增子文库的构建、ISP（Ion Sphere™ Particles, Ion微球）模板的制备，在Ion Torrent PGM系统上进行测序，并用软件对相关测序序列进行分析。
本发明利用多重PCR方法结合Ion Torrent半导体芯片测序技术同时对Y染色体微缺失相关基因序列标签位点——AZFasY84、AZFasY86、AZFasY127、AZFasY134、AZFasY254、AZFasY255、SRYsY14进行并行检测，其优势在于通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快的优点。
具体实施方式
本发明结合具体实施例做进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1、用于Y染色体微缺失相关基因序列标签位点检测引物组的设计。
利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的AZFasY84、AZFasY86、AZFasY127、AZFasY134、AZFasY254、AZFasY255、SRYsY14七种序列标签位点，用Primer Express Software 5.0软件设计PCR引物，引物序列为：
检测AZFasY84序列标签位点的引物：
上游引物：5’- acagggaacgcctgatttcaccctttacagttta -3’ SEQ ID No: 1
下游引物：5’- gggagtaggaggtagagccac -3’ SEQ ID No: 2
检测AZFasY86序列标签位点的引物：
上游引物：5’- acagggaacgggtaatggcttcccagagttg -3’ SEQ ID No: 3
下游引物：5’- tcaaggactgtgagaatcaaggt -3’ SEQ ID No: 4
检测AZFasY127序列标签位点的引物：
上游引物：5’- acagggaacgttcatacccacaaaaagagaagaa -3’ SEQ ID No: 5
下游引物：5’- agaactttcacaaacatctggct -3’ SEQ ID No: 6
检测AZFasY134序列标签位点的引物：
上游引物：5’- acagggaacgcaggtcaaaggaaataaatagatgg -3’ SEQ ID No: 7
下游引物：5’- cagtcacagaacgcttcaagtaga -3’ SEQ ID No: 8
检测AZFasY254序列标签位点的引物：
上游引物：5’- acagggaacggggtgttaccagaaggcaaa -3’ SEQ ID No: 9
下游引物：5’- gtcccacatcccattgttcat -3’ SEQ ID No:10
检测AZFasY255序列标签位点的引物：
上游引物：5’- acagggaacggttacaggattcggcgtgat -3’ SEQ ID No: 11
下游引物：5’- ctcgtcatgtcatgtgcagccac -3’ SEQ ID No: 12
检测SRYsY14序列标签位点的引物：
上游引物：5’- acagggaacgcattcatcgtgtggtctcgc -3’ SEQ ID No: 13
下游引物：5’- gccatttttcggcttcagta -3’ SEQ ID No: 14
每个检测位点的上游引物5’端均包含一段用于识别样本信息的barcode序列5’-acagggaacg-3’。
实施例2、 Y染色体微缺失相关基因的检测。
1）样本基因组DNA的获取
用细胞裂解法提取口腔黏膜脱落细胞中的DNA，悬浮于1mL生理盐水中，2000×g离心10min；弃上清，每管加1mL生理盐水重复洗涤1次，再2000×g离心10min；弃上清，每管加400μL细胞裂解缓冲液（10mmol/L Tris-HCl, PH8.0; 0.1mol EDTA, PH8.0; 0.5%SDS），放在50℃水浴中温育30min；然后冷却至室温，加等体积的酚—氯仿—异戊醇（体积比25:24:1），混匀，5000×g离心10min；转移上层水相到另一离心管中，重复抽提1次；再转移上层水相到另一Eppendorf管中，加1/10体积的3M NaAc(PH5.2)，混匀；加入2.5倍体积的95%冷乙醇，混匀，-20℃沉淀DNA30min；10000×g离心15min，弃上清；加1mL70%冷乙醇清洗沉淀，10000×g离心15min，弃上清；37℃温箱30min烘干；将DNA沉淀溶于20μL TE缓冲液中，加1μL RNA酶，37℃ 30min，置于-20℃保存。
2）PCR的扩增和测序
以步骤1）提取的样本基因组DNA为模板，在实施例1所述引物的引导下，进行多重PCR扩增(95℃ 5 min; 95℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环)，获得的扩增产物依次进行扩增子文库的构建，ISP（Ion Sphere™ Particles, Ion微球）模板的制备，以及芯片上样和在IonTorrent PGM系统上进行测序。
3）分析并获得结论
用IGV2.0软件对测序结果进行分析，统计以下七个序列标签位点的读序结果，每个位点reference序列中两个N之间的序列有扩增结果的话判为“II”，无检测结果判为DD：
1. AZFasY84
2. AZFasY86
3. AZFasY127
4. AZFasY134
5. AZFasY254
6. AZFasY255
7. SRYsY14。
进行序列标签位点的判断时，凡检测到任意一个位点结果为DD时（有两种原因导致此结果，1.确实缺失相应片段；2.实验差异导致）。此时需要进行复检（原因可能是PCR不好或模板差导致），复检可以采取将以上7个位点进行普通PCR，经扩增产物进行电泳的方式进行复检；使用复检来确认先前被检测到的位点为DD时，再导入结果。
SRYsY14是男性特有序列，为设置的内参序列，被检客户通常都应该为II型；复检后检测结果仍为DD的个体，可以导入结果，报告会出现“未检测到男性性别特征序列，被检个体可能非男性性别”结果。
本次检测共检测3个样本，检测结果及结论见下表。
序列表
<110> 上海联吉医学检验所有限公司
<120> 一种Y染色体微缺失的检测方法及其引物组
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acagggaacg cctgatttca ccctttacag ttta 34
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggagtagga ggtagagcca c 21
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acagggaacg ggtaatggct tcccagagtt g 31
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaaggactg tgagaatcaa ggt 23
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acagggaacg ttcataccca caaaaagaga agaa 34
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agaactttca caaacatctg gct 23
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acagggaacg caggtcaaag gaaataaata gatgg 35
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagtcacaga acgcttcaag taga 24
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acagggaacg gggtgttacc agaaggcaaa 30
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtcccacatc ccattgttca t 21
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acagggaacg gttacaggat tcggcgtgat 30
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctcgtcatgt catgtgcagc cac 23
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acagggaacg cattcatcgt gtggtctcgc 30
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gccatttttc ggcttcagta 20
Claims (3)
1.一种检测Y染色体微缺失的方法及其引物组，具体步骤为：
利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的AZFasY84、AZFasY86、AZFasY127、AZFasY134、AZFasY254、AZFasY255、SRYsY14这7个序列标签位点，用Primer Express Software 5.0软件设计PCR引物；
采用多重PCR的方法对待检测样本进行PCR扩增；
将PCR扩增产物进行扩增子文库的构建，ISP（Ion Sphere™ Particles, Ion微球）模板的制备，在Ion Torrent PGM系统上进行测序，并用软件对相关测序序列进行分析。
2.如权利要求1所述的一种检测Y染色体微缺失的方法及其引物组，其特征在于，所述的PCR引物组包括针对七种序列标签位点的引物，其序列分别为：SEQ ID No: 1-SEQ IDNo: 14：
5’- acagggaacgcctgatttcaccctttacagttta -3’ SEQ ID No: 1；
5’- gggagtaggaggtagagccac -3’ SEQ ID No: 2；
5’- acagggaacgggtaatggcttcccagagttg -3’ SEQ ID No: 3；
5’- tcaaggactgtgagaatcaaggt -3’ SEQ ID No: 4；
5’- acagggaacgttcatacccacaaaaagagaagaa -3’ SEQ ID No: 5；
5’- agaactttcacaaacatctggct -3’ SEQ ID No: 6；
5’- acagggaacgcaggtcaaaggaaataaatagatgg -3’ SEQ ID No: 7；
5’- cagtcacagaacgcttcaagtaga -3’ SEQ ID No: 8；
5’- acagggaacggggtgttaccagaaggcaaa -3’ SEQ ID No: 9；
5’- gtcccacatcccattgttcat -3’ SEQ ID No: 10；
5’- acagggaacggttacaggattcggcgtgat -3’ SEQ ID No: 11；
5’- ctcgtcatgtcatgtgcagccac -3’ SEQ ID No: 12；
5’- acagggaacgcattcatcgtgtggtctcgc -3’ SEQ ID No: 13；
5’- gccatttttcggcttcagta -3’ SEQ ID No: 14。
3.用于如权利要求1所述一种检测Y染色体微缺失的方法及其引物组，其特征在于，所述的引物组组成一种检测Y染色体微缺失的试剂盒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711137294.2A CN109797210A (zh) | 2017-11-16 | 2017-11-16 | 一种y染色体微缺失的检测方法及其引物组 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711137294.2A CN109797210A (zh) | 2017-11-16 | 2017-11-16 | 一种y染色体微缺失的检测方法及其引物组 |
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|---|---|
| CN109797210A true CN109797210A (zh) | 2019-05-24 |
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ID=66555467
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| CN201711137294.2A Pending CN109797210A (zh) | 2017-11-16 | 2017-11-16 | 一种y染色体微缺失的检测方法及其引物组 |
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|---|---|
| CN (1) | CN109797210A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113981067A (zh) * | 2021-11-04 | 2022-01-28 | 首都医科大学附属北京朝阳医院 | 一种无精少精症染色体变异检测试剂盒 |
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2017
- 2017-11-16 CN CN201711137294.2A patent/CN109797210A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113981067A (zh) * | 2021-11-04 | 2022-01-28 | 首都医科大学附属北京朝阳医院 | 一种无精少精症染色体变异检测试剂盒 |
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