CN110904216A - 检测CHD7基因c.1670-98和c.2375+49位点突变的引物和方法 - Google Patents

检测CHD7基因c.1670-98和c.2375+49位点突变的引物和方法 Download PDF

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陈雪青
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Abstract

本发明公开了检测CHD7基因的c.1670‑98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT碱基突变的引物；采用Sanger测序技术，可用于快速检测遗传性CHARGE综合征患者体内CHD7基因的c.1670‑98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点突变情况。利用本发明完成的检测结果准确，对遗传性CHARGE综合征的临床鉴别诊断有重要的参考意义。

Description

检测CHD7基因c.1670-98和c.2375+49位点突变的引物和方法
技术领域
本发明属于生命科学和生物技术领域，特别涉及检测CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点突变的引物，采用普通PCR结合Sanger测序技术，可用于快速检测遗传性CHARGE综合征患者体内CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点的突变情况。
背景技术
CHARGE综合征是一种常染色体显性遗传疾病,具有先天性、罕见、散发的特点。该病在新生儿的发病率大约为1/15 000到1/10 000,30％的患者在5岁前死亡。CHARGE综合征又叫Hall-Hittner综合征,以疾病的英文首字母命名本病,即眼组织缺损(coloboma，C)、心脏疾病(heart disease，H)、后鼻孔闭锁(atresia choanae，A)、生长迟滞和(或)中枢神经系统异常(retarded growthand retarded development and/or central nervoussystem anomalies，R)、生殖系统发育不良(genital hypoplasia,G)，以及耳形态异常和(或)耳聋(ear anomalies and/ordeafness,E)。研究表明CHD7基因突变是发生CHARGE综合征的主要原因,基因分析有助于提高CHARGE综合征患者的检出率。
研究表明，大约有60％～70％的CHARGE综合征患者存在CHD7基因突变。人CHD7基因位于8q12.1,基因组全长188kb，其蛋白包含2997个氨基酸。CHD7属于ATP依赖的染色质重塑包括染色质域解旋酶DNA结合蛋白家族，包含多个结构域,以此与其他分子协同作用发挥染色质重塑功能。CHD7广泛表达于胚胎和成体多种组织,它不仅影响神经系统、神经嵴和生殖系统发育,还影响嗅球、耳、心脏、骨骼等器官发育,故而CHARGE综合征患者的表型具有异质性与复杂性。
检索PubMed数据库发现3例中国CHARGE综合征患者。检索万方、维普和中国知网数据库9篇文献报道共13例。这16例中国患者中11例做了基因分析,其中10例发现CHD7突变,1例未发现CHD7突变。
CHD7基因突变类型主要包括无义(44％)、移码(34％)、剪切(11％)、错义(8％)、大段缺失和重复(2％)、转位(<1％)和小部分缺失(<1％)。中国患者以移码突变为主,约占60％。其余为无义和剪切突变,各占20％。
文献报道了CHD7，7号外显子区域重复；10号内含子发生新生错义突变c.2836-15C>G；11号外显子移码突变c.2916 2917del,p.Gln972HisfsX22；14号外显子移码突变c.34623471delTCGCTTCCCT；31号外显子移码突变c.63726374het delCTT；21号外显子移码突变c.4656dupT；2号外显子无义突变c.718C>T(p.Gln240＊)；36号外显子无义突变c.7957C>T(p.Arg2653＊)；29号内含子剪切突变c5894.+2，T>G；htz。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点突变的引物，采用PCR技术，可用于快速检测遗传性胃癌家系成员体内CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点的突变情况。所述检测CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点突变情况的引物，包括：
扩增CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点的引物，其碱基序列为：
CHD7-3-F：GGCTTAGTCTTGGTGCTGTTT
CHD7-3-R：CCAGGGAAGTCATCTTTACCAA
CHD7-5-F：CATGTTAGCCAGGATGGTCTC
CHD7-5-R：ATGTTCCCCTGCTGAAAGTCC。
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，引物序列CHD7-3-1-F和CHD7-3-1-R是扩增CHD7基因c.1670-98位碱基的引物，引物序列CHD5-1-F和CHD5-1-R是扩增CHD7基因c.2375+49位碱基的引物。
本发明还提供了检测CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点突变情况的方法，包括以下步骤：
1.抽提外周血或肌肉组织中的基因组DNA；
2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
3.对步骤2中的扩增产物进行测序；
4.对测序结果进行判断，确定CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
扩增CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点的引物，其碱基序列为：
CHD7-3-F：GGCTTAGTCTTGGTGCTGTTT
CHD7-3-R：CCAGGGAAGTCATCTTTACCAA
CHD7-5-F：CATGTTAGCCAGGATGGTCTC
CHD7-5-R：ATGTTCCCCTGCTGAAAGTCC。
进一步地，测序引物碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
本发明还提供了一种检测CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点突变的试剂盒，包括：
(i)血液/组织DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液：包括扩增CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点的引物，其碱基序列为：
CHD7-3-F：GGCTTAGTCTTGGTGCTGTTT
CHD7-3-R：CCAGGGAAGTCATCTTTACCAA
CHD7-5-F：CATGTTAGCCAGGATGGTCTC
CHD7-5-R：ATGTTCCCCTGCTGAAAGTCC；
(iii)测序体系试剂：包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
有益效果：本发明通过设计2对引物，可分别检测CHD7基因c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT 2个突变，高效简便。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用测序技术检测患者c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT突变热点的方法，可以将CHD7基因c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT的突变检测出来，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计3个探针，成本高，检测难度大。
附图说明
图1为样本检测CHD7 c.1670-98delGTATAGA位点的阳性测序截图结果。
图2为样本检测CHD7 c.2375+49dupTGGACT位点的阳性测序截图结果。
具体实施方式
实施例1
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
一种检测CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点突变的引物，该引物是针对CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT突变位点所设计的特异性扩增引物，包括：
扩增CHD7基因c.1670-98和c.2375+49位碱基的引物，其碱基序列分别为：
CHD7-3-F：GGCTTAGTCTTGGTGCTGTTT
CHD7-3-R：CCAGGGAAGTCATCTTTACCAA
CHD7-5-F：CATGTTAGCCAGGATGGTCTC
CHD7-5-R：ATGTTCCCCTGCTGAAAGTCC
一种检测CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点突变的试剂盒，包括
(i)血液/组织DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR反应液；
(iii)测序体系试剂；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
其中，血液/组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。
检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；CHD7上、下游引物(10μM)。
测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT的上、下游引物(3.2μm)。
实施例2
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的组织DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：
X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：加入检测体系PCR反应液中2μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
Figure BDA0002321328930000061
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
Figure BDA0002321328930000062
其中，引物序列为：
Figure BDA0002321328930000063
注：F为上游引物，R为下游引物
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，凝胶成像系统观察。
如图1所示，即为20例血液样本以相应的引物扩增后所得产物的电泳图谱。通过电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带清晰。
(6)Sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
Figure BDA0002321328930000071
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
Figure BDA0002321328930000072
测序反应程序：
Figure BDA0002321328930000073
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl CBL后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与CHD7(NG_007009)阴性参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取20例临床外周血样品，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系PCR反应液中2μl。测序后发现c.1670-98delGTATAGA位点基因突变情况为样本18号无突变，其余样本全部突变；c.2375+49dupTGGACT位点样本全部突变。样本1-20的突变情况见下表，阳性测序图如图1-图2所示。
c.1670-98delGTATAGA c.2375+49dupTGGACT
1 + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 + +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 + +
15 + +
16 + +
17 + +
18 - +
19 + +
20 + +
序列表
<110> 南京艾迪康医学检验所有限公司
<120> 检测CHD7基因c.1670-98和c.2375+49位点突变的引物和方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcttagtct tggtgctgtt t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccagggaagt catctttacc aa 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catgttagcc aggatggtct c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgttcccct gctgaaagtc c 21
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacagctatg accatg 16

Claims (6)

1.检测CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点突变情况的引物，其特征在于，包括：
扩增CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点的引物，其碱基序列为：
CHD7-3-F：GGCTTAGTCTTGGTGCTGTTT
CHD7-3-R：CCAGGGAAGTCATCTTTACCAA
CHD7-5-F：CATGTTAGCCAGGATGGTCTC
CHD7-5-R：ATGTTCCCCTGCTGAAAGTCC。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
3.如权利要求1所述的引物，其特征在于，引物序列CHD7-3-1-F和CHD7-3-1-R是扩增CHD7基因c.1670-98位碱基的引物，引物序列CHD5-1-F和CHD5-1-R是扩增CHD7基因c.2375+49位碱基的引物。
4.检测CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点突变情况的方法，包括以下步骤：
(1)抽提外周血或肌肉组织中的基因组DNA；
(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；
(4)对测序结果进行判断，确定CHD7基因的c.1670-98和c.2375+49位点是否发生突变；
其中扩增c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点突变的PCR扩增引物分别为：
CHD7-3-F：GGCTTAGTCTTGGTGCTGTTT
CHD7-3-R：CCAGGGAAGTCATCTTTACCAA
CHD7-5-F：CATGTTAGCCAGGATGGTCTC
CHD7-5-R：ATGTTCCCCTGCTGAAAGTCC。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，测序引物碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
6.一种检测CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(i)血液/组织DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液：包括扩增CHD7基因的c.1670-98delGTATAGA和c.2375+49dupTGGACT位点的引物，其碱基序列分别为：
CHD7-3-F：GGCTTAGTCTTGGTGCTGTTT
CHD7-3-R：CCAGGGAAGTCATCTTTACCAA
CHD7-5-F：CATGTTAGCCAGGATGGTCTC
CHD7-5-R：ATGTTCCCCTGCTGAAAGTCC；
(iii)测序体系试剂：包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
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