CN110592208A - 地中海贫血症三类亚型的捕获探针组合物及其应用方法和应用装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种地中海贫血症三种亚型的捕获探针组合物及其应用方法和应用装置。其中，地中海贫血症三类亚型的捕获探针组合物的制备方法包括：将地中海贫血症三类亚型相关基因的全长区域，按照预设长度分隔成不同的小片段；将每个小片段比对到人参考基因组上，得到第一单一比对区域集和多比对区域集；将多比对区域集在人参考基因组上向前或者向后移动长度kbp，k≤100，将移动后的新区域与人参考基因组进行再次比对，得到第二单一比对区域集；从第一单一比对区域集和第二单一比对区域集中进行探针设计，得到捕获探针组合物。本方法得到的捕获探针组合物不仅能标志整个区域并且能将三种不同地中海贫血症类型进行区分，使检测更准确。
Description
技术领域
本发明涉及基因突变检测领域，具体而言，涉及一种地中海贫血症三种亚型的捕获探针组合物及其应用方法和应用装置。
背景技术
地中海贫血，又称海洋性贫血，是一种常见的单基因遗传性溶血性血液疾病，呈现常染色体隐性遗传规律。由于遗传性珠蛋白基因缺陷(突变、缺失等)引起的一种或多种珠蛋白肽链生物合成减少或完全不能合成，导致珠蛋白肽链间的正常平衡不能维持，同时成人型Hb(HbA：α2β2)合成降低的一种遗传性血红蛋白病。
具体来说，可分为α﹣地中海贫血和β-地中海贫血两类，分别由α-珠蛋白基因或β-珠蛋白基因缺失、突变等缺陷导致相应珠蛋白链的合成受到抑制或其功能丧失。该病在东南亚各国及我国南方的广西、广东、海南、四川及贵州等省较为常见。
α-地中海贫血主要由α-珠蛋白基因大片段缺失引起，这类α-地中海贫血称为缺失型α-地中海贫血；同时少部分是由于α-珠蛋白基因点突变而引起，这类α-地中海贫血称为非缺失型α-地中海贫血。我国已报道缺失型α-地中海贫血基因突变类型不少于10种，其中最常见的是东南亚型缺失(--SEA/，缺失1个α1基因及1个α2基因)、左侧缺失(-α4.2/，缺失1个α2基因)和右侧缺失(-α3.7/，缺失1个α1基因)，东南亚型缺失是中国人最常见的α-地中海贫血，左侧缺失和右侧缺失是中国人最常见的α+-地中海贫血，三种缺失所占比例在95％以上。
正常情况下人类带有四个α-基因，分别为2个α2基因和2个α1基因。α-地中海贫血的表型与受累α-珠蛋白基因的个数密切相关。1个α-基因发生缺陷，其基因型为-α/αα，通常无血液学异常表现；2个α-基因发生缺陷，其基因型为-α/-α、--/αα，则表现出小细胞低色素性贫血；3个α-基因发生缺陷，其基因型为--/-α，则表现为中度贫血的Hb H病，可检测到HbH带。4个α-基因发生缺陷，其基因型为--/--，表现为Hb Bart’s胎儿水肿综合征，胎儿在孕晚期或出生后不久死亡。
总的来说，东南亚型缺失、左侧缺失和右侧缺失是最常见的三种缺失型α地中海贫血症致病突变。被检者检出SEA缺失，说明其四个α珠蛋白基因有两个失去，另两个正常。被检者检出-α4.2缺失,说明其缺失1个α2基因。检出-α3.7，则说明其缺失1个α1基因。
据出生缺陷监测网的数据推算，我国出生缺陷种发生率为73.07/万～142.1/万，这些肉眼可见的出生缺陷加上出生后数月或数年才显现出来的缺陷，全国每年出生的先天残疾儿童约占每年出生人口总数的4％～6％。由此可见，在我国出生缺陷的现状成为一个严重的公共卫生问题。而新生儿疾病筛查即是指运用基因测序手段对新生儿进行全面、综合的基因体检，以降低出生缺陷率。
而现有的新生儿地中海贫血筛查，通常采用专用的Gap-PCR方法和相关诊断试剂盒进行检测并能够区分不同的地中海贫血症类型，其中，Gap-PCR诊断地中海贫血症的原理是通过设计跨越断点式引物对样本进行扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。其局限性在于检测结果不稳定，在一些样本中结果导致偏差或区分不明显，可能产生假阴/阳性问题，另外此方法需要操作人员十分熟悉普通PCR反应全过程，因为每一个步骤对结果的影响都非常大，因此对临床遗传专业人员的实验操作水平要求很高。
在地中海贫血筛查领域中，干滤纸血片收集的标本通过多重PCR结合DNA芯片技术，也可对地中海贫血进行基因诊断。不过这些方法多应用于产前诊断领域，对新生儿领域的应用还鲜有涉足。具体的方法是首先提取孕妇外周血，从孕妇外周血中提取游离胎儿DNA，然后进行PCR扩增并上机测序，将测序的结果与阳性对照样本和阴性对照样本对比，从而确认婴儿是否患有地中海贫血。我们的方法不需要提供对照样本，同时针对的是新生儿并不是胎儿，胎儿的DNA需要从孕妇外周血提取分离，而新生儿本身就是新生儿的足底血不需要分离。
因此，对批量样本筛查而言，现有技术中还没有成本较低的检测方案。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种地中海贫血亚型的分类方法及分类装置，以适用于大批量低成本的新生儿筛查。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种地中海贫血症三类亚型的捕获探针组合物的制备方法,该制备方法包括：将地中海贫血症三类亚型相关基因的全长区域，按照预设长度分隔成不同的小片段；将每个小片段比对到人参考基因组上，得到第一单一比对区域集和多比对区域集；将多比对区域集在人参考基因组上向前或者向后移动长度kbp，k≤100，将移动后的新区域与人参考基因组进行再次比对，得到第二单一比对区域集；从第一单一比对区域集和第二单一比对区域集中进行探针设计，得到捕获探针组合物。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种地中海贫血症三类亚型的捕获探针组合物，该捕获探针组合物通过上述制备方法制备而成。
根据本发明的第三个方面，提供了一种地中海贫血症三类亚型检测试剂盒，该试剂盒包括用于检测地中海贫血亚型的捕获探针组合物，该探针组合物为上述捕获探针组合物。
根据本发明的第四个方面，提供了一种地中海贫血症三类亚型的标志探针组合区域的筛选方法，该筛选方法包括：分别获取阴性样本和阳性样本的杂交捕获文库的测序数据，杂交捕获文库通过采用上述捕获探针组合捕获得到；利用阴性样本的测序数据与人参考基因组的阴性比对结果，得到地中海贫血症三类亚型相关基因的覆盖深度参考基线；利用阳性样本的测序数据与人参考基因组的阳性比对结果，根据覆盖深度参考基线，获得唯一标志地中海贫血症三类亚型的标志探针组合区域。
根据本发明的第五个方面，提供了一种地中海贫血症三种亚型的分类方法，该分类方法包括：对阳性样本中唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域的覆盖深度进行标准化处理，得到标准化标志区域覆盖深度；将标准化标志区域覆盖深度与覆盖深度的参考基线相比，得到参考比值；将大于等于参考比值的数值作为对地中海贫血症的三种亚型进行分类的检测阈值；其中，唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域通过上述任一种筛选方法筛选得到。
根据本发明的第六个方面，提供了一种地中海贫血症三种亚型的检测方法，该检测方法包括：获取待检样本在唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域的覆盖深度，得到待检覆盖深度；对待检覆盖深度进行标准化处理，得到标准化待测覆盖深度；将标准化待检覆盖深度与覆盖深度的参考基线相比，得到待检比值；将待检比值与检测阈值进行比较，若待检比值低于检测阈值，则判定待检样本为缺失阳性，并根据判定为缺失阳性的待检比值对应的标志探针所在区域，确定待检样本的缺失阳性的亚型；检测阈值为上述地中海贫血症三种亚型的分类方法中的检测阈值。
根据本发明的第七个方面，提供了一种地中海贫血症三类亚型的标志探针组合区域的筛选装置，该筛选装置包括：第一获取模块，用于分别获取阴性样本和阳性样本的杂交捕获文库的测序数据，杂交捕获文库通过采用上述的捕获探针组合捕获得到；第一比对模块，用于利用阴性样本的测序数据与人参考基因组的阴性比对结果，得到地中海贫血症三类亚型相关基因的覆盖深度参考基线；第二比对模块，用于利用阳性样本的测序数据与人参考基因组的阳性比对结果，根据覆盖深度参考基线，获得唯一标志地中海贫血症三类亚型的标志探针组合区域。
根据本发明的第八个方面，提供了一种地中海贫血症三种亚型的分类装置，该分类装置包括：第一标准化模块，用于对阳性样本中唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域的覆盖深度进行标准化处理，得到标准化标志区域覆盖深度；其中，唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域通过权利要求上述的筛选装置筛选得到；第一参比模块，用于将标准化标志区域覆盖深度与覆盖深度的参考基线相比，得到参考比值；阈值模块，用于将大于等于参考比值的数值作为对地中海贫血症的三种亚型进行分类的检测阈值。
根据本发明的第九个方面，提供了一种地中海贫血症三种亚型的检测装置，该检测装置包括：第二获取模块，用于获取待检样本在唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域的覆盖深度，得到待检覆盖深度；其中，唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域通过上述任一筛选装置筛选得到；第二标准化模块，用于对待检覆盖深度进行标准化处理，就得到标准化待测覆盖深度；第二参比模块，用于将标准化待检覆盖深度与覆盖深度的参考基线相比，得到待检比值；检测判断模块，用于将待检比值与检测阈值进行比较，若待检比值低于检测阈值，则判定待检样本为缺失阳性，并根据判定为缺失阳性的待检比值对应的标志探针所在区域，确定待检样本的缺失阳性的亚型；其中，检测阈值为上述地中海贫血症三种亚型的分类装置中的检测阈值。
应用本发明的技术方案，本申请的方法得到的捕获探针组合物，不仅能标志整个区域并且能将三种不同地中海贫血症类型进行区分，利于成功构建捕获文库，并获得能够唯一标志三种不同亚型的探针组合区域，从而实现利用能够唯一标志三种不同亚型的探针组合区域对待测样本进行检测具有检测准确性和易拓展性的优势。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明的实施例3中提供的地中海贫血症三类亚型的标志探针组合区域的筛选方法流程示意图；以及
图2示出了根据本发明的实施例4中提供的利用本申请的地中海贫血症三类亚型的标志探针组合区域检测和确认已知缺失类型的阳性样本的变异类型及CN值的流程示意图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
BED文件格式是一个描述注释的数据。有3个要求的字段和9个额外的可选字段。3个要求的字段分别是:1.Chrom,染色体或Scafflold的名字，比如，chr 3/chr2-random/scaffold0671等。2.ChromStart染色体或Scafflold的起始位置，第一个染色体的起始位置为0。3.ChromEn染色体或Scafflold的结束位置。9个额外的可选字段包括：4.name，定义bed的名字。5.Score,0-1000的分值。6.Strand，定义链的+或-。7.thick Start开始的位置。
CN值：拷贝数变异值。根据阴性样本的覆盖度比如为10，而阳性样本的覆盖度为5，则为变异类型为缺失。若阳性样本的覆盖度为20，则变异类型为重复。CN值即为阳性样本的覆盖度与参考基线(阴性覆盖度)的比值。将该比值与阈值相比，若在阈值范围内，则认为它是一个缺失类型或是扩增类型。
如背景技术所提到的，现有技术难以实现新生儿地中海贫血的批量检测，为了改善这一问题，发明人对现有的方法进行了研究和改进，并认为实现批量需要利用高通量测序技术的优势，而实现高通量测序需要建立相应的测序文库，而如何建好文库并使得测序后所得的有效数据量较高，也是目前地中海贫血症没有实现高通量测序筛查的一个原因。因为地中海贫血相关基因在基因组中具有较高的重复度，因此，合理的设计覆盖地中海贫血三种亚型的捕获探针便成为成功构建文库的关键所在。
由于东南亚型缺失、左侧缺失和右侧缺失是最常见的三种缺失型α地中海贫血症致病突变，其中，SEA缺失，说明其四个α珠蛋白基因有两个失去，另两个正常。若-α4.2缺失，说明缺失1个α2基因。若-α3.7缺失，则说明其缺失1个α1基因。
发明人在这三种缺陷相关基因的基因组区域内合理的设计探针，要求这些探针尽量能标志整个区域并且能将三种不同地中海贫血症类型进行区分。然后利用这些能够代表地中海贫血症三种亚型的基因序列区域区分开来的捕获探针组合，进行捕获文库构建，不仅成功构建了测序文库。而且利用阴性样本作为基线，阳性样本作为参考，得到了所有阳性样本的预处理结果，通过该结果发现三种不同的地中海贫血亚型样本的区域都有一些共有区域和相近的明确边界，根据这些区域和边界进行整合分析和训练，最终筛选出了一个能够明确区分三种不同亚型的三亚型区域，从而获得可以唯一标志三种不同亚型的探针组合区域。
进一步地，以这些唯一标志三种不同亚型的探针组合区域对一批待测样本进行检测，发现能够检测出待测样本中地中海贫血三种亚型之间的基因拷贝数缺失状态，并且经过验证与金标准结果一致。表明所得到的唯一标志三种不同亚型的探针组合区域具有检测准确性和易拓展性的优势。
基于上述研究结果，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种地中海贫血症三类亚型的捕获探针组合物的制备方法，该制备方法包括：将地中海贫血症三类亚型相关基因的全长区域，按照预设长度(比如可以是120bp、150bp或者其他合适的长度)分隔成不同的小片段；将每个小片段比对到人参考基因组上，得到第一单一比对区域集和多比对区域集；将多比对区域集在人参考基因组上向前或者向后移动长度kbp，k≤100，将移动后的新区域与人参考基因组进行再次比对，得到第二单一比对区域集；从第一单一比对区域集和第二单一比对区域集中进行探针设计，得到捕获探针组合物。
上述方法得到的捕获探针组合物，不仅能标志整个区域并且能将三种不同地中海贫血症类型进行区分，利于成功构建捕获文库，并获得能够唯一标志三种不同亚型的探针组合区域，从而实现利用能够唯一标志三种不同亚型的探针组合区域对待测样本进行检测具有检测准确性和易拓展性的优势。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种地中海贫血症三类亚型的捕获探针组合物，该捕获探针组合物通过上述制备方法制备而成。
在优选实施例中，捕获探针组合物包括下表所示的71条捕获探针序列：
表1：
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种地中海贫血症三类亚型检测试剂盒，试剂盒包括用于检测地中海贫血亚型的捕获探针组合物，探针组合物为上述捕获探针组合物。上述捕获探针组合物能够捕获得到中海贫血症三种亚型的基因序列区域，从而形成捕获文库。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种地中海贫血症三类亚型的标志探针组合区域的筛选方法，该筛选方法包括：分别获取阴性样本和阳性样本的杂交捕获文库的测序数据，杂交捕获文库通过采用上述捕获探针组合物捕获得到；利用阴性样本的测序数据与人参考基因组的阴性比对结果，得到地中海贫血症三类亚型相关基因的覆盖深度参考基线；利用阳性样本的测序数据与人参考基因组的阳性比对结果，根据覆盖深度参考基线，获得唯一标志地中海贫血症三类亚型的标志探针组合区域。
利用上述能够代表地中海贫血症三种亚型的基因序列区域区分开来的捕获探针组合，进行捕获文库构建，然后利用阴性样本作为基线，阳性样本作为参考得到所有阳性样本的预处理结果，从阳性样本的测序数据中筛选出三种不同的地中海贫血亚型样本所共有的区域和相近的明确边界，从而得到唯一标志地中海贫血症三类亚型的标志物组合区域。
在一种优选的实施例中，利用阴性样本的测序数据与人参考基因组的阴性比对结果，得到地中海贫血症三类亚型相关基因的覆盖深度参考基线包括：将阴性样本的测序数据与人参考基因组进行比对，得到阴性比对结果；计算阴性比对结果中各捕获探针目标区域的覆盖度，得到对应的阴性初覆盖度；对各阴性初覆盖度进行GC校正，得到对应的阴性校正覆盖度；对各阴性校正覆盖度进行均一化，得到地中海贫血症三类亚型相关基因的覆盖深度参考基线。
在一种优选的实施例中，获得唯一标志地中海贫血症三类亚型的标志探针组合区域包括：将阳性样本的测序数据与人参考基因组进行比对，得到阳性比对结果；利用捕获探针组合物对阳性比对结果中捕获探针目标区域的覆盖度进行计算，得到各探针目标区域的阳性初覆盖度；将各阳性初覆盖度与覆盖深度参考基线进行比对，得到各差异覆盖度；对各差异覆盖度依次进行标准化和GC校正，得到各探针目标区域的拷贝数变异值；根据各探针目标区域的拷贝数变异值，计算地中海贫血症三类亚型的所有捕获探针区域整体的拷贝数变异值；根据所有捕获探针区域整体的拷贝数变异值，从所有捕获探针区域中筛选出唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域。
上述GC校正、均一化及标准化采用现有的方法进行即可。
在一种优选的实施例中，根据所有捕获探针区域整体的拷贝数变异值，从所有捕获探针区域中筛选出唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域包括：根据所有捕获探针区域整体的拷贝数变异值，找到每种地中海贫血症亚型共有的区域和边界，并对每种地中海贫血症亚型共有的区域和边界进行整合分析和训练，从而获得唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域。
在本申请第五种典型的实施方式中，提供了一种地中海贫血症三种亚型的分类方法，该分类方法包括：对阳性样本中唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域的覆盖深度进行标准化处理，得到标准化标志区域覆盖深度；将标准化标志区域覆盖深度与覆盖深度的参考基线相比，得到参考比值；将大于等于参考比值的数值作为对地中海贫血症的三种亚型进行分类的检测阈值；其中，唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域通过上述任一种筛选方法筛选得到。
利用上述筛选方法筛选到的能够唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域，对阳性样本在该区域内的覆盖深度与阴性样本建立的参考基线相比，从而获得参考比值，大于等于该参考比值的数值即可作为上述三种亚型进行分类的阈值。
在本申请第六种典型的实施方式中，提供了一种地中海贫血症三种亚型的检测方法，该检测方法包括：获取待检样本在唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域的覆盖深度，得到待检覆盖深度；对待检覆盖深度进行标准化处理，就得到标准化待测覆盖深度；将标准化待检覆盖深度与覆盖深度的参考基线相比，得到待检比值；将待检比值与检测阈值进行比较，若待检比值低于检测阈值，则判定待检样本为缺失阳性，并根据判定为缺失阳性的待检比值对应的标志探针所在区域，确定待检样本的缺失阳性的亚型。该方法利用能够唯一标志三种不同亚型的探针组合区域对待测样本进行检测具有检测准确性和易拓展性的优势。
通过以上的实施方式的描述，本领域的技术人员可以清楚地了解到根据上述实施例的方法可借助软件加必需的通用硬件平台的方式来实现，当然也可以通过硬件，但很多情况下前者是更佳的实施方式。基于这样的理解，本发明的技术方案本质上或者说对现有技术做出贡献的部分可以以软件产品的形式体现出来，该计算机软件产品存储在一个存储介质(如ROM/RAM、磁碟、光盘)中，包括若干指令用以使得一台终端设备(可以是手机，计算机，服务器，或者网络设备等)执行本发明各个实施例所述的方法。
在本申请第七种典型的实施方式中，提供了一种地中海贫血症三类亚型的标志探针组合区域的筛选装置，该筛选装置包括：第一获取模块，用于分别获取阴性样本和阳性样本的杂交捕获文库的测序数据，杂交捕获文库通过采用上述捕获探针组合捕获得到；第一比对模块，用于利用阴性样本的测序数据与人参考基因组的阴性比对结果，得到地中海贫血症三类亚型相关基因的覆盖深度参考基线；第二比对模块，用于利用阳性样本的测序数据与人参考基因组的阳性比对结果，根据覆盖深度参考基线，获得唯一标志地中海贫血症三类亚型的标志探针组合区域。
在一种优选的实施例中，第一比对模块包括：第一比对单元，用于将阴性样本的测序数据与人参考基因组进行比对，得到阴性比对结果；第一计算单元，用于计算阴性比对结果中各捕获探针目标区域的覆盖度，得到对应的阴性初覆盖度；第一校正单元，用于对各阴性初覆盖度进行GC校正，得到对应的阴性校正覆盖度；第一均一化单元，用于对各阴性校正覆盖度进行均一化，得到地中海贫血症三类亚型相关基因的覆盖深度参考基线。
在一种优选的实施例中，第二比对模块包括：第二比对单元，用于将阳性样本的测序数据与人参考基因组进行比对，得到阳性比对结果；第二计算单元，用于利用捕获探针组合物对阳性比对结果中捕获探针目标区域的覆盖度进行计算，得到各探针目标区域的阳性初覆盖度；第三比对单元，用于将各阳性初覆盖度与覆盖深度参考基线进行比对，得到各差异覆盖度；第二校正单元，用于对各差异覆盖度依次进行标准化和GC校正，得到各探针目标区域的拷贝数变异值；第三计算单元，用于根据各探针目标区域的拷贝数变异值，计算地中海贫血症三类亚型的所有捕获探针区域整体的拷贝数变异值；筛选单元，用于根据所有捕获探针区域整体的拷贝数变异值，从所有捕获探针区域中筛选出唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域。
在一种优选的实施例中，筛选单元包括：查找子单元，用于根据所有捕获探针区域整体的拷贝数变异值，找到每种地中海贫血症亚型共有的区域和边界，整合训练子单元，用于对每种地中海贫血症亚型共有的区域和边界进行整合分析和训练，从而获得唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域。
在本申请第八种典型的实施方式中，提供了一种地中海贫血症三种亚型的分类装置，该分类装置包括：第一标准化模块，用于对阳性样本中唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域的覆盖深度进行标准化处理，得到标准化标志区域覆盖深度；其中，唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域通过上述任一种筛选装置筛选得到；第一参比模块，用于将标准化标志区域覆盖深度与覆盖深度的参考基线相比，得到参考比值；阈值模块，用于将大于等于参考比值的数值作为对地中海贫血症的三种亚型进行分类的检测阈值。
在本申请第八种典型的实施方式中，提供了一种地中海贫血症三种亚型的检测装置，该检测装置包括：第二获取模块，用于获取待检样本在唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域的覆盖深度，得到待检覆盖深度；其中，唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域通过上述任一种筛选装置筛选得到；第二标准化模块，用于对待检覆盖深度进行标准化处理，就得到标准化待测覆盖深度；第二参比模块，用于将标准化待检覆盖深度与覆盖深度的参考基线相比，得到待检比值；检测判断模块，用于将待检比值与检测阈值进行比较，若待检比值低于检测阈值，则判定待检样本为缺失阳性，并根据判定为缺失阳性的待检比值对应的标志探针所在区域，确定待检样本的缺失阳性的亚型；其中，检测阈值为上述分类装置中的检测阈值。
下面将结合具体的实施例来进一步详细说明本申请的有益效果。
实施例1捕获探针设计
首先选择SEA缺失、-α4.2缺失及-α3.7缺失三种地中海贫血类型的基因的全长区域，按照120bp的长度分隔成不同的小片段，将每个小片段用blast比对到人hg19参考基因组上，得到部分唯一比对区域和部分多比对区域。
对多比对区域进行调整。调整方式是将这些区域在基因组上向前或者向后移动小于100bp，将移动后的新区域与hg19进行比对，最终选择上述两个步骤产生的唯一比对结果的区域进行探针设计。具体的探针设计规则是：1)地缺失区域内探针必须只有唯一比对结果；2)均匀覆盖在三个不同的缺失区域。最终确定了71条唯一比对的探针(具体如表1所示)作为最终的目标区域捕获探针。
实施例2利用阴性样本集建立阴性样本的覆盖深度参考基线
对收集来的25例阴性样本进行DNA提取建库，目标区域捕获，然后进行上机测序。
测序数据经过去接头和去index标签，获得的原始数据(raw Data，以FASTQ格式存储)，通过质量控制过滤掉低质量数据，得到有效数据(clean Data)。
将有效数据(clean Data)通过通用的比对软件(如BWA)，把序列比对到人参考基因组hg19上，得到比对结果的bam文件。
根据已有的阴性样本构建用于后续判定是否存在拷贝数缺失的基线：利用上面比对得到对结果bam文件，利用捕获探针区域的bed文件，计算出捕获探针目标区域的覆盖深度。
利用以上25例所有阴性样本的覆盖度文件和hg19人类参考基因组，对这些阴性的目标区域进行GC校正和覆盖度的均一化，得到最终的地中海贫血症三种亚型的覆盖深度参考基线。
实施例3利用上述阴性样本建立的覆盖深度参考基线和阳性样本集建立唯一标志三种不同亚型的探针组合区域
按照如图1所示的分析步骤，对收集来的56例三种不同地中海贫血症类型的阳性样本进行DNA提取建库、目标区域捕获，然后进行上机测序。测序数据经过去接头和去index标签，获得的原始数据(raw Data，以FASTQ格式存储)，通过质量控制过滤掉低质量数据，得到有效数据(clean Data)。
利用测序得到的有效数据(clean Data)进行通用的比对软件BWA进行序列比对，以hg19人类参考基因组进行比对，得到比对结果的bam文件。
基于上面阴性样本构建的覆盖深度参考基线，在56例已知具有三种不同类型的地中海贫血症缺失样本中，获得相应的缺失区域(缺失区域是已知的，根据相关发表文献确定)。
首先将测序得到的56例阳性样本的有效数据(clean Data)进行BWA比对，得到比对结果bam文件，利用捕获探针区域的bed文件，计算出捕获探针目标区域的覆盖度。
然后通过与上面构建的参考基线进行对比，并进行覆盖度的标准化和GC校正，会得到捕获探针区域的覆盖度变异值，然后根据地中海贫血症区域可以计算出地中海贫血症区域的覆盖度变异值。
根据这56例样本的结果发现，三种不同地中海贫血症类型样本的区域都有各自的一致性规律，每种类型的样本都有一些共有区域和相近的明确边界，因此根据这些区域和边界进行整合分析和训练，最终确定了一个能够明确可以区分三种不同类型的区域，从而得到能够唯一标志三种不同亚型的探针组合区域。此处简单举例说明，例如有5个SEA缺失样本，样本的SEA缺失区域分别是(217049-219029；217049-218089；219049-219082；217649-219059；217949-219089)，那么将定义SEA的探针组合区域为219049-219089，这个区域为5样本都包含的共有缺失区域。
实施例4确定缺失状态及对应亚型
采用上面得到的可以唯一标识三种不同亚型的标志探针组合区域，通过根据上面的25例阴性样本构建的基线进行地中海贫血缺失状态的检测，经过GC校正等通用手段处理得到标准化后的上述探针组合对应的覆盖深度，通过与上述基线对比，给出的区域检测结果并进行处理和计算得到最终分析结果，以确定缺失状态和区分具体的地中海贫血症类型。
该实施例是为了得到待测56样本的缺失状态的CN值(拷贝数变异值)及亚型的类型，这些样本的缺失状态和亚型都是已知的金标准，此处确认的目的是为了验证是否与已知金标准结果一致，并获得样本的CN值，得到了CN值以后实施例5利用该CN值再做阈值划分)，具体分析流程如下图2。
实施例5根据已知的56例阳性样本确定不同地中海贫血类型的检测阈值。
利用已知的56例地中海贫血症阳性样本的测序及上述分析结果，会得到每个样本对应的CN值，根据不同地中海贫血类型的计算结果，我们确定三种不同地中海贫血类型的检测最高CN值为1.28，因此我们最终将阈值定到1.3。
实施例6确定每一个待测样本中地中海贫血三种不同亚型之间的基因拷贝数缺失状态
通过以上划定阈值，可以明确的区分以上25例阴性样本和56例三种不同地中海贫血症类型的阳性样本，共计81阴阳性样本的地中海贫血症缺失状态和对应类型，与金标准一致的结果，证明了我们划定的区分区域以及检测计算方法的准确性和易拓展性。
由上述实施例可知，本申请首先根据多个阴性样本为基线，多个阳性样本为参考，得到了所有阳性样本的预处理结果，通过这个结果发现三种不同地中海贫血症类型样本的区域都有一些共有区域和相近的明确边界，根据这些区域和边界进行整合分析和训练，最终选定了一个可以明确可以区分三种不同类型的三个类型区域，从而获得可以唯一标识三种不同亚型的探针组合区域。
根据以上定义的三个区域，通过各自样本得到的三个不同类型区域中部分片段的覆盖度变异值，进行一个加权平均计算，最终得到这些部分区域组合的最终覆盖度变异值结果，从而使其可以代表三个对应完整区域，根据我们划定的覆盖度变异值的阈值，可以在多个阳性样本的检测中得到了与金标准一致的结果，从而证明了该方法的准确性。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
1)利用二代测序和本流程对样本进行测序和分析，整个步骤易操作且稳定性高，不会出现因不同人员操作导致的结果差异。
2)通过本申请的方法所获得的结果准确可靠且能明确区分阴阳性并给出缺失类型，没有无法区分的模糊地带。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京诺禾致源科技股份有限公司
天津诺禾致源生物信息科技有限公司
天津诺禾医学检验所有限公司
<120> 地中海贫血症三种亚型的捕获探针组合物及其应用方法和应用装置
<130> PN105922TJNH
<160> 71
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
gaccgaaaaa taccgctgag ccctgtgctg cgcaggcctt ggtctgtgcc tgtcaataaa 60
cagaggcccg aaccatctgc ccctgcctgt gtggtctttg gggagctagc aaagcgaggt 120
c 121
<210> 2
<211> 121
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
cactattgtt ggccagtgaa gctcagggac ctaaaaggag cctcctagaa ctctcaaatg 60
cgccccaccc ccggaggttt gtcctcccat ggcgaggagt gcgatggggc agagggagca 120
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<210> 3
<211> 121
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
ctgtgatgtg gcgggggtag ggagggtggc cttcgacttc aacccttgaa tcgggcttcc 60
aaccatactg ttcgcaaagc acttccccat tcacgcattt attcattcat tctccctcca 120
t 121
<210> 4
<211> 121
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
tccccacttc ctgctgggac ctgtagatgc taatcctggc cctttttgca gagagatgca 60
gaaactgagg tcccagagcc aaatgtgcaa cctaattcgt tggcccagag cagagggctc 120
c 121
<210> 5
<211> 121
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
cgcagacctg ttcctttccc cttccttccc ccatggacac ttcctcagtg gcaaacctgc 60
gctagcctgg ttagccctcc ctgtgaccct gcagccctgg ggatgaggtc gggaggaagt 120
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<210> 6
<211> 121
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
cctcagtggc cacaatttgg cagacagagc aggtttagtc ttccagcctg ctcaatgaca 60
agctgtgcga ccctgggcgt gtcccagagc tctcaggcct ttacctatcg aatagaaaaa 120
c 121
<210> 7
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
caacgtccaa ctcacgagat ttttgaaata atttttgaaa tcataacaca gggtgggtgc 60
ctgcagggtc gttgccaccc cacccctcca cccagcccca gctgccgtgt ctcaatctct 120
g 121
<210> 8
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
gcaggtgccc aggccaaggc actcccttcc ccaggttccc tcttctccct ccccaggact 60
gggaagggaa tcttagggct ccaccccagg cttttcagac aaagaatagg ggctgaggaa 120
a 121
<210> 9
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
agagtgggac cttggaggtc tccaaaccct gaatagggtt ggctctgggt tggccatcct 60
gggtctgtgt ggggagcact ggaccaggcc tggcacccag gtctgacctg gcagtcagca 120
a 121
<210> 10
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
acgaggtctg aagagagctg ctggaagtgg agccctgact gtgagtcggc caaactcccc 60
ccagcagtca gtgccagtga cctgttgccc tgcactgcct gggaccccag cccggtagtt 120
t 121
<210> 11
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
tggagaactt ggccccacgt tatctacatc ccccaactgt ttttttgttt ttgggggttt 60
tttttttttt tgctttgttt ttgtttttga gataggccct tgctctgaca ccccggctgg 120
a 121
<210> 12
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
acacccagcc cccgcaactg tttacatgga taattaacag ctttttgtcc caggcagagt 60
ttggtgtgaa agcagcttat gtttcacttt ggaaaaactg tgctcttctc cccatccagg 120
a 121
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
aagctgcctg ggtctgggcc atatgtggat accttatggg tataagctgc tcaggaccct 60
gtgtggaagc tcaggacaat gccagcggga aggctaccat gtggagagct ggtctctgtt 120
t 121
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<400> 14
tgggcaggac taagagacgc agggcagcct tgggcaacct gtctactctc actcactcct 60
cctccccttt cctgtgccag gcacctcctg gcaacttgcc agccaatgac cctgcatccc 120
a 121
<210> 15
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
aggcataaga gctcctactc tcccccacct ttcacttttg agcttacaca gactcagaaa 60
taagctgccg tggtgctgtc tcctgaggac aaggctaaca ccaaggcggt ctgggagaaa 120
g 121
<210> 16
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
gttggcaacc acactgctgg ctatgccacg gaggccctgg agaggcaaga accctcctct 60
ccctgctcac accttgggtc caacgcccac tccagggctc cactggccac ccctaactat 120
t 121
<210> 17
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
tcttaccctg gacccagccc ccagcccctc actctttgct tccccctgaa gcatgttcct 60
gaccttcctc tcacttggcc ctgagttatg gctcagccca gatcaagaaa caatgcaagt 120
a 121
<210> 18
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
aggtggccga cacgctgacc aatgccgtgg tccacttaga tgacatgccc aatgatgtgt 60
ctgagctgag gaagctgcat gtccacgagc tgtgggtgga cccaggcaac atcagggaga 120
g 121
<210> 19
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
gctttgggct gggaggaatc tagggtgtgg gggcagctgg ccttcctcat aggacagacc 60
ctcccacgcg ttcagggagg tggagcacag gtggcagtag tatctgcatc ccctgactct 120
c 121
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ctctccacag ttcctgggta aatgcctgct ggtgacctag gcctgccaca cccttcccag 60
tttacccatg tggtgcctcc atggacaaat tatttgcttt tgtgagtgct gtgttgacct 120
a 121
<210> 21
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
aaaaacacca ttaagctaga gcattggtgg tcatgccccc tgcctgctgg gcctcccacc 60
aggccctcct cccctccctg ccccagcact tcctgatctt tgaatgaagt ccgagtaggc 120
a 121
<210> 22
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<400> 22
agcagcctgt gtgtgcctgg gttctctctg tcccggaatg tgccaacagt ggaggtgttt 60
acctgtctca gaccaaggac ctctctgcag ctgcatgggg ctggggaggg agaactgcag 120
g 121
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
cagggttcta ctcagggagt cccagcatcg ccaccctcct ttgaaatctc cctggttgaa 60
cccagttaac atacgctctc catcaaaaca aaacgaaaca aaacaaacta gcaaaatagg 120
c 121
<210> 24
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
ctgtccccaa tgcaagtgca ggtgccagaa catttctctc attctcaccc cttcctgcca 60
gagggtaggt ggctggagtg agggtgctgg ccctactcac acttcctgtg tcatggtgac 120
c 121
<210> 25
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
ctgcagtttg taaggtgcat tcagaactca ctgtgtgccc agccctgagc tcccagctaa 60
ttgccccacc cagggcctct gggacctcct ggtgcttctg cttcctgtgc tgccagcaac 120
t 121
<210> 26
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
ttctggaaac gtccctgtcc ccggtgctga agtcctggaa tccatgctgg gaagttgcac 60
agcccatctg gctctcagcc agcctaggaa cacgagcagc acttccagcc cagcccctgc 120
c 121
<210> 27
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<400> 27
cccacagcaa gcctccccct ccacactcac agtactgaat tgagctttgg gtagggtgga 60
gaggaccctg tcaccgcttt tcttctggac atggacctct ctgaattgtt ggggagttcc 120
c 121
<210> 28
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
ctccccctct ccaccaccca ctcttcctgt gcctcacagc ccagagcatt gttatttcaa 60
cagaaacact ttaaaaaata aactaaaatc cgacaggcac ggtggctcac acctgtaatc 120
c 121
<210> 29
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
aaactccgtc tcaaaaaata aataaataaa taaataaata aactaaaatc tatccatgct 60
ttcacacaca cacacacaca cacacacaca cacccttttt tgtgttactt aaagtaggag 120
a 121
<210> 30
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<400> 30
agtgtctctc tttcctgtct cctcacaccc acccccagaa gagaccaaaa tgaagggttt 60
ggaactcagc ccatgggccc catcccatgc tgagggaaca cagctacatc tacaactact 120
g 121
<210> 31
<211> 121
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
gccacaggct ctctttttgg acaaaaatac catcatactg tagatacctg tgtacaactt 60
cctattctca gtgaagtgtc tcccctgcat ccctttcagc cagttcattc agctctgcgc 120
c 121
<210> 32
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<400> 32
cattccacag tctcactgat tattactatg tttccatcat gatcccccca aaaaatcatg 60
actttatttt tttattttta ttattattat tttttttttt ttttttgtga cggagtctcg 120
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cgccccccac tacgcctggc taattttttc tatttttaat agagacagag tttcactgca 60
ttagcgagga tggtctcgat ctcctgacct cgcatctgcc cgcctcagcc tcccaatgtg 120
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<212> DNA
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gcacccactg gcactcctgc acctcccacc ctccccctcg ccaagtccac cccttccttc 60
ctcaccccac atcccctcac ctacattctg caaccacagg ggccttctct cccctgtcct 120
t 121
<210> 35
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
ttccctaccc agagccaagt ttgtttatct gtttacaacc agtatttacc tagcaagtct 60
tccatcagat agcatttgga gagctggggg tgtcacagtg aaccacgacc tctaggccag 120
t 121
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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cagccccgtg ctttttgcgt cctggtgttt gttccttccc ggtgcctgtc actcaagcac 60
actagtgact atcgccagag ggaaagggag ctgcaggaag cgaggctgga gagcaggagg 120
g 121
<210> 37
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
ggctctgcgc agaaattctt ttgagttcct atgggccagg gcgtccgggt gcgcgcattc 60
ctctccgccc caggattggg cgaagccctc cggctcgcac tcgctcgccc gtgtgttccc 120
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
cctggccccc gccccgcgtg cacccccagg ggaggccgag cccgccgccc ggccccgcgc 60
aggccccgcc cgggactccc ctgcggtcca ggccgcgccc cgggctccgc gccagccaat 120
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gcgccagcca atgagcgccg cccggccggg cgtgcccccg cgccccaagc ataaaccctg 60
gcgcgctcgc gggccggcac tcttctggtc cccacagact cagagagaac ccaccatggt 120
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
gagcgccgcc cggccgggcg tgcccccgcg ccccaagcat aaaccctggc gcgctcgcgg 60
gccggcactc ttctggtccc cacagactca gagagaaccc accatggtgc tgtctcctgc 120
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<400> 41
gcgctcgcgg gccggcactc ttctggtccc cacagactca gagagaaccc accatggtgc 60
tgtctcctgc cgacaagacc aacgtcaagg ccgcctgggg taaggtcggc gcgcacgctg 120
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<213> 智人(Homo sapiens)
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ccgacgcgct gaccaacgcc gtggcgcacg tggacgacat gcccaacgcg ctgtccgccc 60
tgagcgacct gcacgcgcac aagcttcggg tggacccggt caacttcaag gtgagcggcg 120
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
cctgagcgac ctgcacgcgc acaagcttcg ggtggacccg gtcaacttca aggtgagcgg 60
cgggccggga gcgatctggg tcgaggggcg agatggcgcc ttcctctcag ggcagaggat 120
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ggccgggagc gatctgggtc gaggggcgag atggcgcctt cctctcaggg cagaggatca 60
cgcgggttgc gggaggtgta gcgcaggcgg cggctgcggg cctgggccgc actgaccctc 120
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cacgcgggtt gcgggaggtg tagcgcaggc ggcggctgcg ggcctgggcc gcactgaccc 60
tcttctctgc acagctccta agccactgcc tgctggtgac cctggccgcc cacctccccg 120
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ccgagttcac ccctgcggtg cacgcctccc tggacaagtt cctggcttct gtgagcaccg 60
tgctgacctc caaataccgt taagctggag cctcggtagc cgttcctcct gcccgctggg 120
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ctgacctcca aataccgtta agctggagcc tcggtagccg ttcctcctgc ccgctgggcc 60
tcccaacggg ccctcctccc ctccttgcac cggcccttcc tggtctttga ataaagtctg 120
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cctcccaacg ggccctcctc ccctccttgc accggccctt cctggtcttt gaataaagtc 60
tgagtgggca gcagcctgtg tgtgcctggg ttctctctat cccggaatgt gccaacaatg 120
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agtgggcagc agcctgtgtg tgcctgggtt ctctctatcc cggaatgtgc caacaatgga 60
ggtgtttacc tgtctcagac caaggacctc tctgcagctg catggggctg gggagggaga 120
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aggcatccag ggttctactc agggagtccc agcatcgcca ccctcctttg aaatctccct 60
ggttgaaccc agttaacata cgctctccat caaaacaaaa cgaaacaaaa caaactagca 120
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<400> 51
aaataggctg tccccagtgc aagtgcaggt gccagaacat ttctctcatt cccacccctt 60
cctgccagag ggtaggtggc tggagtgagg gtgctggccc tactcacact tcctgtgtca 120
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cggtgaccct ctgagagcag cccagtcagt ggggaaggag gaaggggctg ggatgctcac 60
agccggcagc ccacacctgg ggagactctt cagcagagca ccttgcggcc ttactcctgc 120
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
acgtctcctg cagtttgtaa ggtgcattca gaactcactg tgtgcccagc cctgagctcc 60
cagctaattg ccccacccag ggcctctggg acctcctggt cttctgcttc ctgtgctgcc 120
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agcaacttct ggaaacgtcc ctgtccccgg tgctgaagtc ctggaatcca tgctgggaag 60
ttgcacagcc catctggctc tcagccagcc taggaacatg agcagcactt ccaacccagt 120
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ccctgcccca cagcaagcct ccccctccac actcacagta ctggattgag ctttggggag 60
ggtggagagg accctgtcac tgctttcctt ctggacatgg acctctctga attgttgggg 120
a 121
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agttccctcc cctctccacc acccgctctt cctgcgcctc acagcccaga gcattgttat 60
ttcagcagaa acactttaaa aaataaacta aaatccgaca ggcacggtgg ctcacgcctg 120
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ctccgcctca aaaaaaaaaa agcccccaca tcttatcttt tttttttcct tcaggctgtg 60
ggcagagtca gaagagggtg gcagacaggg aggggaaatg agaagatcca acgggggaag 120
c 121
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cattgctaag ctggtcggag ctacttcctt ctctgcccaa ggcagcttac cctggcttgc 60
tcctggacac ccagggcagg gcctgagtaa gggcctgggg agacagggca gggagcaggc 120
t 121
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tgaagggtgc tgacctgatg cactcctcaa agcaagatct tctgccagac ccccaggaaa 60
tgacttatca gtgatttctc aggctgtttt ctcctcagta ccatcccccc aaaaaacatc 120
a 121
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acttttcatg cacagggatg cacccactgg cactcctgca cctcccaccc ttccccagaa 60
gtccacccct tccttcctca ccctgcagga gctggccagc ctcatcaccc caacatctcc 120
c 121
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ccacctccat tctccaacca cagggccctt gtctcctctg tcctttcccc tccccgagcc 60
aagcctcctc cctcctccac ctcctccacc taatacatat ccttaagtct cacctcctcc 120
a 121
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aggaagccct cagactaacc ctggtcacct tgaatgcctc gtccacacct ccagacttcc 60
tcagggcctg tgatgaggtc tgcacctctg tgtgtacttg tgtgatggtt agaggactgc 120
c 121
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ctacctccca gaggaggttg aatgctccag ccggttccag ctattgcttt gtttacctgt 60
ttaaccagta tttacctagc aagtcttcca tcagatagca tttggagagc tgggggtgtc 120
a 121
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gtctgaatct ggagccgccc ccagcccagc cccgtgcttt ttgcgtcctg gtgtttattc 60
cttcccggtg cctgtcactc aagcacacta gtgactatcg ccagagggaa agggagctgc 120
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aggaagcgag gctggagagc aggaggggct ctgcgcagaa attcttttga gttcctatgg 60
gccagggcgt ccgggtgcgc gcattcctct ccgccccagg attgggcgaa gcctcccggc 120
t 121
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gagtggcggg tggagggtgg agacgtcctg gcccccgccc cgcgtgcacc cccaggggag 60
gccgagcccg ccgcccggcc ccgcgcaggc cccgcccggg actcccctgc ggtccaggcc 120
g 121
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gcgccccggg ctccgcgcca gccaatgagc gccgcccggc cgggcgtgcc cccgcgcccc 60
aagcataaac cctggcgcgc tcgcggcccg gcactcttct ggtccccaca gactcagaga 120
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aacgcgctgt ccgccctgag cgacctgcac gcgcacaagc ttcgggtgga cccggtcaac 60
ttcaaggtga gcggcgggcc gggagcgatc tgggtcgagg ggcgagatgg cgccttcctc 120
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gcagggcaga ggatcacgcg ggttgcggga ggtgtagcgc aggcggcggc tgcgggcctg 60
ggccctcggc cccactgacc ctcttctctg cacagctcct aagccactgc ctgctggtga 120
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ccctggccgc ccacctcccc gccgagttca cccctgcggt gcacgcctcc ctggacaagt 60
tcctggcttc tgtgagcacc gtgctgacct ccaaataccg ttaagctgga gcctcggtgg 120
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ccatgcttct tgccccttgg gcctcccccc agcccctcct ccccttcctg cacccgtacc 60
cccgtggtct ttgaataaag tctgagtggg cggcagcctg tgtgtgcctg agttttttcc 120
c 121
Claims (16)
1.一种地中海贫血症三类亚型的捕获探针组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将地中海贫血症三类亚型相关基因的全长区域，按照预设长度分隔成不同的小片段；
将每个小片段比对到人参考基因组上，得到第一单一比对区域集和多比对区域集；
将所述多比对区域集在所述人参考基因组上向前或者向后移动长度kbp，k≤100，将移动后的新区域与所述人参考基因组进行再次比对，得到第二单一比对区域集；
从所述第一单一比对区域集和所述第二单一比对区域集中进行探针设计，得到所述捕获探针组合物。
2.一种地中海贫血症三类亚型的捕获探针组合物，其特征在于，所述捕获探针组合物通过权利要求1所述的制备方法制备而成。
3.根据权利要求2所述的捕获探针组合物，其特征在于，所述捕获探针组合物包括序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:71所示的71条捕获探针序列。
4.一种地中海贫血症三类亚型检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测地中海贫血亚型的捕获探针组合物，所述探针组合物为权利要求2或3所述的捕获探针组合物。
5.一种地中海贫血症三类亚型的标志探针组合区域的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括：
分别获取阴性样本和阳性样本的杂交捕获文库的测序数据，所述杂交捕获文库通过采用权利要求2或3所述的捕获探针组合捕获得到；
利用所述阴性样本的测序数据与人参考基因组的阴性比对结果，得到地中海贫血症三类亚型相关基因的覆盖深度参考基线；
利用所述阳性样本的测序数据与所述人参考基因组的阳性比对结果，根据所述覆盖深度参考基线，获得唯一标志所述地中海贫血症三类亚型的标志探针组合区域。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，利用所述阴性样本的测序数据与人参考基因组的阴性比对结果，得到地中海贫血症三类亚型相关基因的覆盖深度参考基线包括：
将所述阴性样本的所述测序数据与所述人参考基因组进行比对，得到所述阴性比对结果；
计算所述阴性比对结果中各捕获探针目标区域的覆盖度，得到对应的阴性初覆盖度；
对各所述阴性初覆盖度进行GC校正，得到对应的阴性校正覆盖度；
对各所述阴性校正覆盖度进行均一化，得到所述地中海贫血症三类亚型相关基因的所述覆盖深度参考基线。
7.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，获得唯一标志所述地中海贫血症三类亚型的标志探针组合区域包括：
将所述阳性样本的所述测序数据与所述人参考基因组进行比对，得到所述阳性比对结果；
利用捕获探针组合物对所述阳性比对结果中捕获探针目标区域的覆盖度进行计算，得到各所述探针目标区域的阳性初覆盖度；
将各所述阳性初覆盖度与所述覆盖深度参考基线进行比对，得到各差异覆盖度；
对各所述差异覆盖度依次进行标准化和GC校正，得到各所述探针目标区域的拷贝数变异值；
根据各所述探针目标区域的拷贝数变异值，计算所述地中海贫血症三类亚型的所有捕获探针区域整体的拷贝数变异值；
根据所述所有捕获探针区域整体的拷贝数变异值，从所述所有捕获探针区域中筛选出唯一标志所述地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域。
8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，根据所述所有捕获探针区域整体的拷贝数变异值，从所述所有捕获探针区域中筛选出唯一标志所述地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域包括：
根据所述所有捕获探针区域整体的拷贝数变异值，找到每种所述地中海贫血症亚型共有的区域和边界，
并对每种所述地中海贫血症亚型共有的区域和边界进行整合分析和训练，从而获得唯一标志所述地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域。
9.一种地中海贫血症三种亚型的分类方法，其特征在于，所述分类方法包括：
对阳性样本中唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域的覆盖深度进行标准化处理，得到标准化标志区域覆盖深度；
将所述标准化标志区域覆盖深度与所述覆盖深度的参考基线相比，得到参考比值；
将大于等于所述参考比值的数值作为对所述地中海贫血症的三种亚型进行分类的检测阈值；
其中，唯一标志所述地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域通过权利要求5至8中任一项所述的筛选方法筛选得到。
10.一种地中海贫血症三种亚型的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
获取待检样本在唯一标志所述地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域的覆盖深度，得到待检覆盖深度；
对所述待检覆盖深度进行标准化处理，就得到标准化待测覆盖深度；
将所述标准化待检覆盖深度与所述覆盖深度的参考基线相比，得到待检比值；
将所述待检比值与检测阈值进行比较，若所述待检比值低于所述检测阈值，则判定所述待检样本为缺失阳性，并根据判定为缺失阳性的所述待检比值对应的标志探针所在区域，确定所述待检样本的缺失阳性的亚型；
所述检测阈值为权利要求9中所述的地中海贫血症三种亚型的分类方法中的所述检测阈值。
11.一种地中海贫血症三类亚型的标志探针组合区域的筛选装置，其特征在于，所述筛选装置包括：
第一获取模块，用于分别获取阴性样本和阳性样本的杂交捕获文库的测序数据，所述杂交捕获文库通过采用权利要求2或3所述的捕获探针组合捕获得到；
第一比对模块，用于利用所述阴性样本的测序数据与人参考基因组的阴性比对结果，得到地中海贫血症三类亚型相关基因的覆盖深度参考基线；
第二比对模块，用于利用所述阳性样本的测序数据与所述人参考基因组的阳性比对结果，根据所述覆盖深度参考基线，获得唯一标志所述地中海贫血症三类亚型的标志探针组合区域。
12.根据权利要求11所述的筛选装置，其特征在于，所述第一比对模块包括：
第一比对单元，用于将所述阴性样本的所述测序数据与所述人参考基因组进行比对，得到所述阴性比对结果；
第一计算单元，用于计算所述阴性比对结果中各捕获探针目标区域的覆盖度，得到对应的阴性初覆盖度；
第一校正单元，用于对各所述阴性初覆盖度进行GC校正，得到对应的阴性校正覆盖度；
第一均一化单元，用于对各所述阴性校正覆盖度进行均一化，得到所述地中海贫血症三类亚型相关基因的所述覆盖深度参考基线。
13.根据权利要求11所述的筛选装置，其特征在于，所述第二比对模块包括：
第二比对单元，用于将所述阳性样本的所述测序数据与所述人参考基因组进行比对，得到所述阳性比对结果；
第二计算单元，用于利用捕获探针组合物对所述阳性比对结果中捕获探针目标区域的覆盖度进行计算，得到各所述探针目标区域的阳性初覆盖度；
第三比对单元，用于将各所述阳性初覆盖度与所述覆盖深度参考基线进行比对，得到各差异覆盖度；
第二校正单元，用于对各所述差异覆盖度依次进行标准化和GC校正，得到各所述探针目标区域的拷贝数变异值；
第三计算单元，用于根据各所述探针目标区域的拷贝数变异值，计算所述地中海贫血症三类亚型的所有捕获探针区域整体的拷贝数变异值；
筛选单元，用于根据所述所有捕获探针区域整体的拷贝数变异值，从所述所有捕获探针区域中筛选出唯一标志所述地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域。
14.根据权利要求13所述的筛选装置，其特征在于，所述筛选单元包括：
查找子单元，用于根据所述所有捕获探针区域整体的拷贝数变异值，找到每种所述地中海贫血症亚型共有的区域和边界，
整合训练子单元，用于对每种所述地中海贫血症亚型共有的区域和边界进行整合分析和训练，从而获得唯一标志所述地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域。
15.一种地中海贫血症三种亚型的分类装置，其特征在于，所述分类装置包括：
第一标准化模块，用于对阳性样本中唯一标志地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域的覆盖深度进行标准化处理，得到标准化标志区域覆盖深度；其中，唯一标志所述地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域通过权利要求11至14中任一项所述的筛选装置筛选得到
第一参比模块，用于将所述标准化标志区域覆盖深度与所述覆盖深度的参考基线相比，得到参考比值；
阈值模块，用于将大于等于所述参考比值的数值作为对所述地中海贫血症的三种亚型进行分类的检测阈值。
16.一种地中海贫血症三种亚型的检测装置，其特征在于，所述检测装置包括：
第二获取模块，用于获取待检样本在唯一标志所述地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域的覆盖深度，得到待检覆盖深度；其中，唯一标志所述地中海贫血症三种亚型的标志探针组合区域通过权利要求11至14中任一项所述的筛选装置筛选得到；
第二标准化模块，用于对所述待检覆盖深度进行标准化处理，就得到标准化待测覆盖深度；
第二参比模块，用于将所述标准化待检覆盖深度与所述覆盖深度的参考基线相比，得到待检比值；
检测判断模块，用于将所述待检比值与检测阈值进行比较，若所述待检比值低于所述检测阈值，则判定所述待检样本为缺失阳性，并根据判定为缺失阳性的所述待检比值对应的标志探针所在区域，确定所述待检样本的缺失阳性的亚型；其中，所述检测阈值为权利要求15中所述的地中海贫血症三种亚型的分类装置中的所述检测阈值。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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