CN115927300A - 靶向HBA基因的sgRNA及食蟹猴HBA基因敲除的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及靶向HBA基因的sgRNA及食蟹猴HBA基因敲除的方法。本发明通过设计、构建、筛选，体外合成本发明所述的靶向敲除HBA基因的sgRNA，并将其与Cas9mRNA混合注射入食蟹猴胚胎，得到HBA基因敲除的食蟹猴胚胎。本发明经敲除效果检测鉴定，能有效在食蟹猴胚胎上实现HBA基因的基因敲除，为建立非人灵长类α地中海贫血动物模型奠定了坚实基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，公开了靶向HBA基因的sgRNA及食蟹猴HBA基因敲除的方法。
背景技术
α地中海贫血(简称α地贫)是由于HBA基因缺失或功能缺陷，导致α珠蛋白合成障碍的一种溶血性贫血。目前已经报道了超过120种突变导致α地中海贫血，HBA基因突变分为缺失型α地中海贫血和非缺失型α地中海贫血两种类型，缺失型α地中海贫血是由于HBA基因大片段的缺失引起，缺失片段长度为3～100kb不等。α地中海贫血除了主要由HBA基因缺失引起外，也有部分是由于HBA基因点突变、小片段缺失或碱基插入引起，这类α地中海贫血称为非缺失型α地中海贫血。由上可知，敲除食蟹猴HBA基因能降低食蟹猴α珠蛋白的表达，有可能为制造非人灵长类α地中海贫血动物模型提供新的有效方法，为相关疾病的分子机制和重要靶点挖掘和验证提供机遇，同时也为基因治疗、干细胞治疗以及精准治疗提供重要工具。
动物疾病模型是研究疾病十分重要的工具之一，目前有报道过小鼠α地中海贫血的动物模型，但缺少非人类灵长类动物的α地中海贫血模型。研究人员希望通过基因敲除技术制备HBA基因敲除的非人类灵长类胚胎模型，能为建立非人灵长类α地中海贫血模型提供思路。
综上所述，制备HBA基因敲除的非人类灵长类胚胎模型，对于建立α地中海贫血动物模型具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种靶向HBA基因的sgRNA，其中HBA基因来自食蟹猴。
本发明的另一目的在于提供一种食蟹猴HBA基因敲除的方法，该方法为食蟹猴胚胎上的基因敲除方法，为建立非人灵长类α地中海贫血模型提供思路。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种靶向敲除HBA基因的sgRNA，所述sgRNA为HBA-sgRNA3或/和HBA-sgRNA6，其核苷酸序列如下所示：
HBA-sgRNA3:5’-GCACAAGCTTCGGGTGGACC(CGG)-3’；
HBA-sgRNA6:5’-GAAGGACAGGAACATCCTGC(GGG)-3’。
其中，括号内为PAM位点NGG，sgRNA识别位点。
本发明提供所述的靶向敲除HBA基因的sgRNA在HBA基因敲除领域中的应用。
本发明还提供所述的食蟹猴HBA基因敲除的方法，包括如下步骤：体外合成本发明所述的靶向敲除HBA基因的sgRNA，与Cas9 mRNA混合后体外注射入食蟹猴胚胎，得到HBA基因敲除的食蟹猴胚胎。
优选地，所述体外合成靶向敲除HBA基因的sgRNA的具体操作步骤如下：
(1)根据本发明所述的靶向敲除HBA基因的sgRNA，设计合成引物X，然后以px459载体为模板，进行PCR扩增，得到转录DNA模板；
(2)将步骤(1)制得的转录DNA模板转录，得到所述sgRNA。
具体处理是将sgRNA和Cas9 mRNA以及无酶水进行混合，使sgRNA终浓度为50ng/μL，Cas9 mRNA终浓度为100ng/μL。将混合后的载体通过显微注射技术注射进食蟹猴受精卵中，每个受精卵注射4～10皮升，至看到受精卵种有明显的细胞质流动。食蟹猴胚胎使用HECM-9培养液进行培养，隔天换液，正常三天生长到八细胞，五天生长到桑椹胚，七天生长到囊胚。
更具体地，所述引物X核苷酸序列如下所示：
sgRNA-F:
5’-TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；
gRNA-R:5’-AGCACCGACTCGGTGCCACTT-3’；
其中，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN为sgRNA序列，不包括PAM序列。
更优选地，所述的引物X的核苷酸序列如下所示：
HBA-sgRNA3-F:5’-TAATACGACTCACTATAGGCACAAGCTTCGGGTGGACCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；
HBA-sgRNA3-R:5’-AGCACCGACTCGGTGCCACTT-3’；
HBA-sgRNA6-F:5’-TAATACGACTCACTATAGGAAGGACAGGAACATCCTGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；
HBA-sgRNA6-R:5’-AGCACCGACTCGGTGCCACTT-3’。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明针对食蟹猴HBA基因提供了2个高效的敲除靶点。
(2)本发明经敲除效果检测鉴定，能有效在食蟹猴胚胎上实现HBA基因的基因敲除，为建立非人灵长类α地中海贫血动物模型奠定了坚实基础。
附图说明
图1是sgRNA体外靶位点活性检测酶切结果图；
图2是突变型胚胎测序峰图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
为了更清楚、详细地解释本发明的技术方案，以下提供一些实施例和对比例作进一步的说明。
实施例1
本实施例为HBA基因靶点效率检测
(1)设计靶点
针对食蟹猴HBA基因，在食蟹猴HBA基因第二外显子处设计sgRNA，使用CRISPR在线网站(http://crispr.mit.edu/)根据评分系统，根据食蟹猴HBA基因的DNA序列(gatgttcctg tccttcccca ccaccaagac ctacttcccc cacttcgacc tgagccacgg ctctgcccaggttaagggcc acggcaagaa ggtggccgac gcgctgaccc tcgccgtggg gcacgtggac gacatgccccaagcgctgtc cgcgctgagc gacctgcacg cgcacaagct tcgggtggac ccggtcaact tcaag)，设计了8个靶序列，其中4个靶序列的核苷酸序列如下所示：
HBA-sgRNA3：5’-GCACAAGCTTCGGGTGGACC(CGG)-3’；
HBA-sgRNA4：5’-GCACGCGCACAAGCTTCGGG(TGG)-3’；
HBA-sgRNA5：5’-GGAAGGACAGGAACATCCTG(CGG)-3’；
HBA-sgRNA6：5’-GAAGGACAGGAACATCCTGC(GGG)-3’。
(2)制备模板DNA
提取野生型食蟹猴血浆的DNA作为模板，设计合成针对上述靶点所在基因片段的引物，进行PCR扩增，纯化得到用于酶切的DNA片段，其中扩增引物序列如下所示：
HBA-F1:5’-CTTCTGGTCCCCACAGACTC-3’；
HBA-R1:5’-CCGCCCACTCAGACTTTATTCA-3’。
(3)体外转录合成sgRNA
根据上述靶点设计合成扩增引物，以px459载体为模板，进行PCR扩增(扩增体系见表1)，纯化得到转录DNA模板，进一步通过北京唯尚立德T7体外快速转录试剂盒转录(转录体系见表2)，得到sgRNA，其中扩增引物的核苷酸序列如下所示：
sgRNA-F:5’
-TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；
sgRNA-R:5’-AGCACCGACTCGGTGCCACTT-3’；
其中，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN为sgRNA靶点；
表1 PCR扩增体系
表2 sgRNA体外转录体系
(4)靶点体外活性检测
按照表3的体外靶位点活性检测体系，混匀后，37℃反应1h，再65℃反应5min，加入DNA Loading Buffer，采用质量分数为2％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，根据胶图，选择活性较好的sgRNA。
表3体外靶位点活性检测体系
sgRNA体外靶位点活性检测酶切结果如图1所示。
实施例2
本实施例是食蟹猴胚胎HBA基因的敲除
1.体外转录合成sgRNA
根据实施例1中检测的活性，选择2个sgRNA：HBA-sgRNA3和HBA-sgRNA6。设计引物并合成，引物的核苷酸序列如下所示：
sgRNA-F:
5’-TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAG CTAGAAATAGC-3’；
sgRNA-R:5’-AGCACCGACTCGGTGCCACTT-3’；
其中，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN为sgRNA靶点；
以px459载体为模板，用上述引物进行PCR扩增，得到转录DNA模板，其中，PCR扩增体系同表1；
将上述制得的转录DNA模板通过纯化，转录后得到sgRNA，其中转录体系同表2。
2.食蟹猴胚胎载体注射
用胚胎显微操作技术将sgRNA：50ng/μL(混合后终浓度)和Cas9 mRNA(市购)100ng/μL(混合后终浓度)混合注射进8枚食蟹猴胚胎中(制备方法参照Functionaldisruption of the dystrophin gene in rhesus monkey using CRISPR/Cas9)。
3.验证胚胎靶位点敲除情况
在胚胎中加入10μL蛋白酶K裂解液，混匀瞬离后按表4的程序于PCR仪中反应(顶盖温度为70℃)。
表4胚胎裂解反应程序
取上述反应所得到的裂解液作为模板，进行PCR扩增(扩增体系见表5)，所用引物核苷酸序列如下所示：
HBA-F1:5’-CTTCTGGTCCCCACAGACTC-3’；
HBA-R1:5’-CCGCCCACTCAGACTTTATTCA-3’。
表5 PCR扩增体系
取上述PCR产物作为模板，进行第二次PCR扩增(扩增体系同表5，将裂解液换为上一步PCR扩增的产物)，所用引物核苷酸序列如下所示：
HBA-F2:5’-AGACTCAGAAAGAACCCACCA-3’；
HBA-R2:5’-TGCAGAGAAGAGGGTCAGTG-3’。
将最终PCR产物进行测序，结果如图2所示，根据测序情况可以明确知道HBA-sgRNA3和HBA-sgRNA6在胚胎中工作，使目的基因发生敲除。其中4个胚胎出现较大片段缺失(约200bp)，2个胚胎有小片段缺失或插入，1个胚胎在HBA-sgRNA6处开始出现双峰。
综上，实验结果表明，本发明针对食蟹猴HBA基因提供了2个高效的敲除靶点；经敲除效果检测鉴定，能有效在食蟹猴胚胎上实现HBA基因的基因敲除，为建立非人灵长类α地中海贫血动物模型奠定了坚实基础。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (5)
1.一种靶向敲除HBA基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA为HBA-sgRNA3或/和HBA-sgRNA6，其核苷酸序列如下所示：
HBA-sgRNA3:5’-GCACAAGCTTCGGGTGGACC(CGG)-3’；
HBA-sgRNA6:5’-GAAGGACAGGAACATCCTGC(GGG)-3’。
2.一种sgRNA的应用，其特征在于，所述sgRNA为权利要求1所述的靶向敲除HBA基因的sgRNA，所述应用为sgRNA在HBA基因敲除领域中的应用。
3.一种食蟹猴HBA基因敲除的方法，其特征在于，包括如下步骤：
体外合成权利要求1所述的靶向敲除HBA基因的sgRNA，与Cas9 mRNA混合后体外注射入食蟹猴胚胎，得到HBA基因敲除的食蟹猴胚胎。
4.如权利要求3所述的食蟹猴HBA基因敲除的方法，其特征在于，
所述体外合成靶向敲除HBA基因的sgRNA的操作步骤如下：
(1)根据权利要求1所述的靶向敲除HBA基因的sgRNA，设计合成引物X，然后以px459载体为模板，进行PCR扩增，得到转录DNA模板；
(2)将步骤(1)制得的转录DNA模板转录，得到所述sgRNA。
5.如权利要求4所述的食蟹猴HBA基因敲除的方法，其特征在于，所述的引物X的核苷酸序列如下所示：
HBA-sgRNA3-F:5’-TAATACGACTCACTATAGGCACAAGCTTCGGGTGGACCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；
HBA-sgRNA3-R:5’-AGCACCGACTCGGTGCCACTT-3’；
HBA-sgRNA6-F:5’-TAATACGACTCACTATAGGAAGGACAGGAACATCCTGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；
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