CN114262708B - 一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒及其方法 - Google Patents
一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒及其方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒及其方法。所述的试剂盒中含有FecB‑pegRNA的体外转录模板质粒、FecB‑sgRNA的体外转录模板质粒以及PE2mRNA的体外转录模板质粒，以FecB‑pegRNA的体外转录模板质粒、FecB‑sgRNA的体外转录模板质粒为模板经PCR扩增得到的FecB‑pegRNA体外转录模板序列如SEQ ID No.4所示，FecB‑sgRNA体外转录模板序列如SEQ ID No.5所示。将体外转录获得的pegRNA、sgRNA及PE2mRNA纯化后混合，注射入绵羊受精卵细胞质中，受精卵体外培养后移植入同种雌性绵羊输卵管中，生产的后代经检测后获得FecB基因g.A746G定点突变绵羊。本发明模拟自然界中存在的FecB基因g.A746G绵羊，同时与传统CRISPR/Cas技术相比极大地避免了随机突变、bystander突变、脱靶突变及基因组损伤，因此安全性更高。本发明为绵羊的精确基因编辑提供了重要技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒及其方法，特别地，涉及一种利用新型基因编辑系统Prime Editing生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒及其方法。属于动物基因工程和遗传修饰技术领域。
背景技术
CRISPR/Cas系统是在细菌和古细菌中发现的一种获得性免疫系统，能特异性地靶向并切割噬菌体DNA以抵御入侵。经人工改造后的CRISPR/Cas9技术借助sgRNA与基因组DNA序列的特异性识别与结合作用，能够实现对靶基因的定点切割，在生物学相关领域应用广泛，涉及到生物、医学和农业等。
单核苷酸多态性(SNP)是哺乳动物中最常见的遗传变异类型。据报道，大量单碱基突变与人类疾病及生产性状相关。单碱基编辑技术是目前常用的基因组定点突变方法，其能够实现A→G与C→T的点突变，但不能实现4种碱基的任意变换，同时在全基因组范围内存在着一定的脱靶效应。最近报道的一种新的基因编辑技术Prime Editing(PE)不仅保持了精准编辑，还大幅度减少了脱靶效应，同时能够实现4种碱基的任意变换。该技术是在dCas9蛋白上融合了一个反转录原件，同时在sgRNA的基础上又加入了两段新的序列——引物结合序列(Primer binding site，PBS)以及转录模板序列(RT template including edit，RT)。其基本工作原理如下：原有的sgRNA序列仍结合PAM序列后的约20个碱基，打开DNA双链，引导改造后的dCas9蛋白。PBS序列则在解螺旋的另一条单链上与设计位点结合，起到一个类似PCR过程中引物结合DNA单链后引导后续链合成的作用，引导后续的RT序列在反转录原件作用下的反转录过程，一般情况下，靶向编辑位点的编辑信息包含在RT序列中。
FecB基因是最早发现的控制绵羊高繁殖力的主效基因，对排卵数的影响呈加性效应，对产羔数的影响呈部分显性效应。一个FecB拷贝可增加1.3～1.6枚排卵数，0.9～1.2只产羔数，两个FecB拷贝可增加2.7～3.0枚排卵数，1.1～1.7只产羔数。研究表明，FecB基因的定点突变(g.A746G，p.Q249R)致使其高度保守区域中的谷氨酰胺突变为精氨酸，丧失部分生物学活性，降低其配体BMP4和GDF5对类固醇生成的抑制作用，加速颗粒细胞分化，促进卵泡发育及排卵，提高动物的繁殖性能。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒。
本发明的目的之二是提供一种利用所述的试剂盒生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
第一方面，本发明提出了一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒，所述的试剂盒中含有FecB-pegRNA的体外转录模板质粒、FecB-sgRNA的体外转录模板质粒以及PE2 mRNA的体外转录模板质粒，以FecB-pegRNA的体外转录模板质粒、FecB-sgRNA的体外转录模板质粒为模板经PCR扩增得到的FecB-pegRNA体外转录模板序列如SEQ ID No.4所示，FecB-sgRNA体外转录模板序列如SEQ ID No.5所示。
其中，优选的，所述的FecB-pegRNA的体外转录模板质粒是通过以下方法构建得到：
(1)合成靶向FecB基因序第746位碱基的Space、Scaffold、RT-PBS的寡核苷酸序列：
(2)将Space、Scaffold、RT-PBS寡核苷酸链进行退火，分别得到Space退火产物、Scaffold退火产物以及RT-PBS退火产物；
(3)以pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin质粒为模板，使用以下引物进PCR扩增，得到构建体外转录模板的骨架：
F1：AGCTAGGTCTCCTTTTTTTAAAGAATTCTCGACCTCGAGAC
R1：TCTCTCGGTCTCACGGTGTTTCGT
(4)将体外转录模板骨架进行纯化回收，回收产物使用Bsa I限制性内切酶酶切后进行纯化回收，与Space退火产物、Scaffold退火产物、RT-PBS退火产物连接；
(5)将连接产物转化至DH5α感受态细胞，将测序结果正确的菌液扩大培养并提取质粒，得到的质粒为FecB-pegRNA体外转录模板质粒；
其中，优选的，所述的FecB-sgRNA的体外转录模板质粒是通过以下方法构建得到：
(1)合成位于Space附近sgRNA的寡核苷酸序列：
sgRNA-Up：accgTTCTGTCTCTCGGAACCAGC
sgRNA-Down：aaacGCTGGTTCCGAGAGACAGAA
(2)将sgRNA寡核苷酸链退火，得到sgRNA退火产物；
(3)将pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin使用BsaI限制性内切酶进行线性化，纯化回收线性化的pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin，并将其与sgRNA退火产物连接；
(5)将连接产物转化至DH5α感受态细胞，将测序结果正确的菌液扩大培养并提取质粒，即FecB-sgRNA体外转录模板质粒；
其中，优选的，所述的PE2 mRNA的体外转录模板质粒为pCMV-PE2质粒。
其中，优选的，所述的试剂盒还包括用于通过PCR扩增得到FecB-pegRNA体外转录模板序列的引物F2/R2以及用于通过PCR扩增得到FecB-sgRNA体外转录模板序列的引物F3/R3，所述的引物序列如下：
F2：gatccctaatacgactcactataggTCACTACAGAGGAGGCCAGC
R2：AAAAAAAATACAGAGGAGGCCAGCTGGT
F3：atccctaatacgactcactataggTTCTGTCTCTCGGAACCAGC
R3：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC。
其中，优选的，所述的试剂盒还包括用于扩增包含用于检测FecB基因g.A746G定点突变绵羊的PCR引物，若PCR扩增产物的第163位碱基为G，则羔羊为FecB基因g.A746G定点突变绵羊；
正向引物F：5’-AGGTCCAGAGGACGATAGCA-3’；
反向引物R：5’-AGGAAACCCTGAACATCGCTAA-3’。
进一步的，本发明还提供了所述的试剂盒在制备FecB基因g.A746G定点突变绵羊的受精卵中的用途。
另一方面，本发明还提出了一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊受精卵的方法，包括：首先分别以本发明试剂盒中所述的FecB-pegRNA的体外转录模板质粒、FecB-sgRNA的体外转录模板质粒为模板通过PCR的方法获得FecB-pegRNA体外转录模板序列以及FecB-sgRNA的体外转录模板序列；然后分别以获得的FecB-pegRNA体外转录模板序列、FecB-sgRNA的体外转录模板序列以及PE2 mRNA的体外转录模板质粒为模板通过体外转录获得进行绵羊FecB基因g.A746G定点突变的FecB-pegRNA、FecB-sgRNA和PE2 mRNA；最后将获得的FecB-pegRNA、FecB-sgRNA和PE2 mRNA混合后注射入绵羊受精卵细胞质中，获得FecB基因g.A746G定点突变的绵羊受精卵。
其中，优选的，以所述的FecB-pegRNA的体外转录模板质粒为模板，使用引物F2/R2通过PCR的方法获得FecB-pegRNA体外转录模板序列；以所述的FecB-sgRNA的体外转录模板质粒为模板，使用引物F3/R3通过PCR的方法获得FecB-sgRNA体外转录模板序列，所述的引物序列如下：：
F2：gatccctaatacgactcactataggTCACTACAGAGGAGGCCAGC
R2：AAAAAAAATACAGAGGAGGCCAGCTGGT
F3：atccctaatacgactcactataggTTCTGTCTCTCGGAACCAGC
R3：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC。
其中，优选的，FecB-pegRNA、FecB-sgRNA、PE2 mRNA混合后，终浓度为PE2 mRNA100ng/μL，FecB-pegRNA 40ng/μL，FecB-sgRNA 10ng/μL。
其中，优选的，所述的受精卵为处于原核期受精卵。
其中，优选的，所述的绵羊为滩羊。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒及其使用方法。使用本发明的试剂盒生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊能够模拟绵羊群体中本身存在的自然突变，同时与传统的基因编辑技术相比，基于新型基因编辑系统Prime Editing的定点突变技术避免了随机突变、bystander突变、脱靶突变及基因组损伤，因此安全性更高，本发明为绵羊的精确基因编辑提供了重要技术支撑。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明实施例一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊时FecB基因特异性靶位点的序列图；
图2是本发明制备FecB-pegRNA的流程图；
图3是本发明阳性个体靶向深度测序结果示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
pCMV-PE2载体：Addgene，货号：132775。
pCMV-PE2载体中，由T7启动子介导PE2 mRNA的体外转录。
pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin载体：Addgene，货号：#51133。
实施例1：利用生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒生产FecB基因g.A746G定点突变滩羊
根据绵羊自然群体中FecB基因序列存在的g.A746G突变，将定点突变的位点定位在FecB基因第8外显子，所在外显子的序列如SEQ ID No.1所示。
一、FecB-pegRNA和FecB-sgRNA的制备
1.设计靶向FecB基因第746位碱基的pegRNA的转录模板DNA序列，如SEQ ID No.2所示；设计靶向FecB基因第746位碱基的sgRNA的转录模板DNA序列，如SEQ ID No.3所示。生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊时FecB基因特异性靶位点序列如图1所示。
2.构建FecB-pegRNA的体外转录模板，包括以下步骤：
(1)设计并合成制备靶向FecB基因序列第746位碱基的Space、Scaffold、RT-PBS的寡核苷酸序列(表1)，其中序列中的小写字母为接头部分，下划线部分为FecB基因第746位碱基引入的A到T的定点突变。
表1 制备Space、Scaffold、RT-PBS的寡核苷酸序列
(2)配置退火使用的Buffer缓冲液，配方如下所示：
NaCl 0.08766g
10mM Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5) 0.2 mL
ddH2O 30mL
(3)将Scaffold寡核苷酸链进行退火，得到Scaffold退火产物，退火体系及程序如下所示。
退火体系：
退火程序：
(4)将Space、RT-PBS寡核苷酸链进行退火，分别得到Space退火产物、RT-PBS退火产物，退火体系及程序如下所示。
退火体系：
退火程序：
(5)以pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin质粒为模板，使用表2中引物进PCR扩增，得到构建体外转录模板质粒的骨架，扩增体系及程序如下所示。
表2 获得体外转录模板骨架的引物
| 引物名称 | 引物序列 |
| F1 | AGCTAGGTCTCCTTTTTTTAAAGAATTCTCGACCTCGAGAC |
| R1 | TCTCTCGGTCTCACGGTGTTTCGT |
PCR扩增体系：
PCR扩增程序：
(6)将体外转录模板质粒的骨架进行纯化回收，回收产物使用Bsa I限制性内切酶于37℃酶切8h，酶切体系如下所示。
(7)将酶切后的体外转录模板质粒的骨架进行纯化回收，使用T4 DNA Ligase将Space退火产物、Scaffold退火产物、RT-PBS退火产物和体外转录模板骨架于25℃过夜连接，连接体系如下所示。
(8)将连接产物转化至DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行Sanger测序。将测序结果正确的菌液扩大培养并提取质粒，得到的质粒为FecB-pegRNA体外转录模板质粒。FecB-pegRNA的构建流程图如图2所示。
(9)以FecB-pegRNA体外转录模板质粒为模板，使用带有T7 promoter接头的引物(表3，小写字母为T7 promoter)进行PCR扩增并纯化回收，回收后的扩增产物为FecB-pegRNA体外转录模板(SEQ ID NO.4所示)，PCR扩增体系同构建体外转录模板的骨架，程序如下所示。
表3 制备FecB-pegRNA体外转录模板的引物
| 引物名称 | 引物序列 |
| F2 | gatccctaatacgactcactataggTCACTACAGAGGAGGCCAGC |
| R2 | AAAAAAAATACAGAGGAGGCCAGCTGGT |
PCR扩增程序：
3.构建FecB-sgRNA的体外转录模板，包括以下步骤：
(1)设计并合成位于Space附近sgRNA的寡核苷酸序列(表4)，其中小写字母为接头部分。
表4 制备sgRNA的寡核苷酸序列
| 寡核苷酸链名称 | 序列 |
| sgRNA-Up | accgTTCTGTCTCTCGGAACCAGC |
| sgRNA-Down | aaacGCTGGTTCCGAGAGACAGAA |
(2)将sgRNA寡核苷酸链退火，得到sgRNA退火产物，退火程序同Scaffold，退火体系如下所示。
sgRNAUp(10μM) 5μL
sgRNA-Down(10μM) 5μL
总体系 10μL
(3)将pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin使用Bsa I限制性内切酶进行线性化，酶切体系及条件同FecB-pegRNA体外转录模板质粒的骨架。
(4)纯化回收线性化的pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin，并将其与sgRNA退火产物于25℃过夜连接，连接体系如下所示。
(5)将连接产物转化至DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序。将测序结果正确的菌液扩大培养并提取质粒，即FecB-sgRNA体外转录模板质粒。
(6)以FecB-sgRNA体外转录模板质粒为模板，使用带有T7 promoter接头的引物(表5，小写字母为T7 promoter)进行PCR扩增及纯化回收，回收后的扩增产物为FecB-sgRNA的体外转录模板(SEQ ID NO.5所示)，PCR扩增体系及程序同构建FecB-pegRNA的体外转录模板中的(9)。
表5 制备FecB-sgRNA体外转录模板的引物
| 引物名称 | 引物序列 |
| F3 | atccctaatacgactcactataggTTCTGTCTCTCGGAACCAGC |
| R3 | AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC |
4.FecB-pegRNA和FecB-sgRNA的体外转录，包括以下步骤：
(1)分别24μL FecB-pegRNA和FecB-sgRNA体外转录模板中加入25×RNA secure 1μL，60℃孵育10min，以灭活体系中的RNA酶。
(2)用MEGAshortscript kit试剂盒按照说明书进行FecB-pegRNA、FecB-sgRNA的体外转录，反应体系如下所示，充分混匀后37℃孵育2h。
(3)转录结束后向上述反应体系中加入1μL DNAase，充分离心混匀后37℃孵育15min，以去体系中残留的DNA片段。
(4)使用RNeasyMini Kit试剂盒按照说明书进行FecB-pegRNA、FecB-sgRNA的纯化，纯化后的FecB-pegRNA、FecB-sgRNA可用于显微注射。
5.PE2 mRNA的体外转录，包括以下步骤：
(1)将pCMV-PE2质粒使用Pme I限制性内切酶于37℃孵育8h进行线性化，反应体系如下所示。
(2)纯化回收线性化质粒，向24μL线性化质粒中加入25×RNA secure 1μL，60℃孵育10min，以灭活体系中的RNA酶。
(3)依照mMESSAGE mMACHINE TM T7ULTRA TranscriptionKit试剂盒说明书进行PE2 mRNA的体外转录，反应体系如下所示，充分混匀后37℃孵育2h。
(4)向上述反应体系中加入1μL DNAase，充分离心混匀后PCR仪中37℃孵育15min，热盖设为50℃，以去除体系中残留的DNA片段。
(5)按照mMESSAGE mMACHINE TM T7 ULTRA TranscriptionKit说明书对获得的转录产物添加poly A尾，反应体系如下所示，充分离心混匀后37℃金孵育40min。
(6)使用RNeasy Mini Kit试剂盒按照说明书纯化体外转录产物，获得PE2mRNA。
二、FecB基因g.A746G定点突变滩羊的制备
1.生产羔羊
(1)使用超微量核酸分析仪分别测定FecB-pegRNA、FecB-sgRNA和PE2 mRNA的浓度，并按照PE2 mRNA 100ng/μL、FecB-pegRNA 40ng/μL、FecB-sgRNA 10ng/μL的终浓度将上述三个组分混合，制备显微注射混合物。
(2)从经过同期发情和自然交配的供体雌性滩羊体内通过外科手术法收集处于原核期受精卵。
(3)利用显微注射仪将预混好的FecB-pegRNA、FecB-sgRNA和PE2 mRNA混合物注射入收集的受精卵细胞质中。
(4)注射后的受精卵转移至Quinn’s Advantage Cleavage Medium中37℃培养24h。
(5)将体外培养后的受精卵移植至受体母羊输卵管壶腹部与峡部连接处，经一个自然妊娠期后获得F0代羔羊。
2.FecB基因g.A746G定点突变滩羊的鉴定
(1)F0代羔羊长1周龄时采集血样，提取血液基因组DNA。
(2)以羔羊血液基因组DNA为模版，以扩增产物包含FecB基因g.A746G位点的特异性引物进行PCR扩增，引物序列见表6，对获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和产物体系回收，回收后的PCR产物进行靶向深度测序分析，若产物的第163位碱基为G，则羔羊为FecB基因g.A746G定点突变滩羊。本实施例中得到的7只F0代羔羊中5只为FecB基因g.A746G定点突变滩羊(测序结果如SEQ ID NO.6所示)，突变滩羊该位点的基因型如图3所示。
表6 FecB基因g.A746G定点突变滩羊检测引物
| 引物名称 | 引物序列 |
| 正向引物F | AGGTCCAGAGGACGATAGCA |
| 反向引物R | AGGAAACCCTGAACATCGCTAA |
上述通过新型碱基编辑系统Prime Editing生产FecB基因g.A746G定点突变滩羊，模拟自然界中存在的FecB基因g.A746G绵羊，同时与传统CRISPR/Cas技术相比极大地避免了随机突变、bystander突变、脱靶突变及基因组损伤，因此安全性更高。本发明为绵羊的精确基因编辑研究提供重要技术支撑。
上文虽然已对本发明及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对相应的条件等做进一步的改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒及其方法
<141> 2021-12-21
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<212> DNA
<213> Procapra przewalski
<400> 1
gtccagagga cgatagcaaa gcaaattcag atggtgaaac agattggaaa aggtcgctat 60
ggggaagttt ggatgggaaa gtggcgtggc gaaaaggtag ctgtgaaagt gttcttcact 120
acagaggagg ccagctggtt ccgagagaca gaaatatatc agacggtgtt gatgaggcat 180
gaaaacatct tgg 193
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
accgtcacta cagaggaggc cagcgtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct 60
agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc gtccgatata tttctgtctc 120
tcggaaccag ctggcctcct ctgtatttt 149
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
ttctgtctct cggaaccagc 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 4
gatccctaat acgactcact ataggtcact acagaggagg ccagcgtttt agagctagaa 60
atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg 120
cgtccgatat atttctgtct ctcggaacca gctggcctcc tctgtatttt tttt 174
<210> 5
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 5
atccctaata cgactcacta taggttctgt ctctcggaac cagcgtttta gagctagaaa 60
tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc 120
ttttttt 127
<210> 6
<212> DNA
<213> Procapra przewalski
<400> 6
aggtccagag gacgatagca aagcaaattc agatggtgaa acagattgga aaaggtcgct 60
atggggaagt ttggatggga aagtggcgtg gcgaaaaggt agctgtgaaa gtgttcttca 120
ctacagagga ggccagctgg ttccgagaga cagaaatata tcagacggtg ttgatgaggc 180
atgaaaacat cttgggtgag tataagtctg tattagcgat gttcagggtt tcct 234
Claims (5)
1.一种利用基因编辑系统Prime Editing生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊受精卵的方法，其特征在于，首先分别以FecB-pegRNA的体外转录模板质粒、FecB-sgRNA的体外转录模板质粒为模板通过PCR的方法获得FecB-pegRNA体外转录模板序列以及FecB-sgRNA的体外转录模板序列,以FecB-pegRNA的体外转录模板质粒、FecB-sgRNA的体外转录模板质粒为模板通过PCR扩增得到的FecB-pegRNA体外转录模板序列如SEQ ID No.4所示，FecB-sgRNA体外转录模板序列如SEQ ID No.5所示；然后分别以获得的FecB-pegRNA体外转录模板序列、FecB-sgRNA的体外转录模板序列以及PE2 mRNA的体外转录模板质粒为模板通过体外转录获得进行绵羊FecB基因g.A746G定点突变的FecB-pegRNA、FecB-sgRNA和PE2 mRNA；最后将获得的FecB-pegRNA、FecB-sgRNA和PE2 mRNA混合后注射入绵羊受精卵细胞质中，获得FecB基因g.A746G定点突变的绵羊受精卵；
所述的FecB-pegRNA的体外转录模板质粒是通过以下方法构建得到：
(1)合成靶向FecB基因序第746位碱基的Space、Scaffold、RT-PBS的寡核苷酸序列：
(2)将Space、Scaffold、RT-PBS寡核苷酸链进行退火，分别得到Space退火产物、Scaffold退火产物以及RT-PBS退火产物；
(3)以pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin质粒为模板，使用以下引物进PCR扩增，得到构建体外转录模板质粒的骨架：
F1：AGCTAGGTCTCCTTTTTTTAAAGAATTCTCGACCTCGAGAC R1：TCTCTCGGTCTCACGGTGTTTCGT
(4)将体外转录模板质粒骨架进行纯化回收，回收产物使用Bsa I限制性内切酶酶切后进行纯化回收，与Space退火产物、Scaffold退火产物、RT-PBS退火产物连接；
(5)将连接产物转化至DH5α感受态细胞，将测序结果正确的菌液扩大培养并提取质粒，得到的质粒为FecB-pegRNA体外转录模板质粒；
所述的FecB-sgRNA的体外转录模板质粒是通过以下方法构建得到：
(1)合成位于Space附近sgRNA的寡核苷酸序列：
sgRNA-Up：accgTTCTGTCTCTCGGAACCAGC
sgRNA-Down：aaacGCTGGTTCCGAGAGACAGAA
(2)将sgRNA寡核苷酸链退火，得到sgRNA退火产物；
(3)将pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin使用BsaI限制性内切酶进行线性化，纯化回收线性化的pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin，并将其与sgRNA退火产物连接；
(4)将连接产物转化至DH5α感受态细胞，将测序结果正确的菌液扩大培养并提取质粒，即FecB-sgRNA体外转录模板质粒；
所述的PE2 mRNA的体外转录模板质粒为pCMV-PE2质粒；
以FecB-pegRNA的体外转录模板质粒为模板，使用引物F2/R2通过PCR的方法获得FecB-pegRNA体外转录模板序列；以FecB-sgRNA的体外转录模板质粒为模板，使用引物F3/R3通过PCR的方法获得FecB-sgRNA体外转录模板序列，所述的引物序列如下：
F2：gatccctaatacgactcactataggTCACTACAGAGGAGGCCAGC
R2：AAAAAAAATACAGAGGAGGCCAGCTGGT
F3：atccctaatacgactcactataggTTCTGTCTCTCGGAACCAGC
R3：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括使用以下引物检测检测绵羊的FecB基因g.A746G定点突变，若PCR扩增产物的第163位碱基为G，则羔羊为FecB基因g.A746G定点突变绵羊；
正向引物F：5’-AGGTCCAGAGGACGATAGCA-3’；
反向引物R：5’-AGGAAACCCTGAACATCGCTAA-3’。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，FecB-pegRNA、FecB-sgRNA、PE2 mRNA混合后，终浓度为PE2 mRNA 100ng/μL，FecB-pegRNA 40ng/μL，FecB-sgRNA 10ng/μL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的受精卵为处于原核期受精卵。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的绵羊为滩羊。
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| Highly efcient generation of sheep with a defned FecBB mutation via adenine base Editing;Shiwei Zhou et al.;《Genetics Selection Evolution》;20210701;第52卷(第35期);第1页摘要，第2页右栏第2段，第3页左栏第2段、右栏第1段，第4页左栏第2段，补充材料表S3 * |
| Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA;Andrew V. Anzalone et al.;《Nature》;20191231;第576卷(第7785期);第4页第3-4段、第5页第4段、第6页第2-3段、第8页第4段、第17页第1段、第23页扩展图3a、补充材料第8页第5行、补充材料第33-37页 * |
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