BR112019020322A2 - vetores e composições para o tratamento de hemoglobinopatias - Google Patents

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Abstract

a invenção fornece vetores, composições e métodos de terapia genética aprimorados.

Description

“VETORES E COMPOSIÇÕES PARA O TRATAMENTO DE HEMOGLOBINOPATIAS”
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [001]Este pedido reivindica o benefício de acordo com 35 USC § 119 (e) do Pedido Provisório n° 62/489.149, depositado em 29 de abril de 2017, e do Pedido Provisório n° 62/478.375, depositado em 29 de março de 2017, cada um dos quais está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
DECLARAÇÃO RELATIVA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [002]A Lista de Sequências associada a este pedido é fornecida em formato de texto, em vez de uma cópia em papel, e é incorporada a título de referência ao relatório descritivo. O nome do arquivo de texto que contém a listagem de sequências é BLBD_08 5_02WO_ST25. txt. O arquivo de texto tem 12 KB, foi criado em 28 de março de 2018 e está sendo enviado eletronicamente via EFS-Web, simultaneamente com o preenchimento do relatório descritivo.
ANTECEDENTES
CAMPO TÉCNICO [003]A presente revelação geralmente refere-se, em parte, a vetores de terapia genética melhorados, composições e métodos para produzir os mesmos.
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA [004]As hemoglobinopatias são um grupo diversificado de doenças hereditárias do sangue monogenético que resultam de variações na estrutura e/ou síntese da hemoglobina. As hemoglobinopatias mais comuns são doença falciforme (DF), atalassemia e β-talassemia. Aproximadamente 5% da população mundial carrega uma mutação no gene da globina. A Organização Mundial da Saúde estima que mais de 300.000 crianças nascem a cada ano com os principais distúrbios da hemoglobina. As hemoglobinopatias manifestam manifestações clínicas altamente variáveis, que variam de anemia hipocrômica leve a doença hematológica moderada a
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2/89 anemia grave, dependente da transfusão, ao longo da vida e com envolvimento de vários órgãos.
[005]0 único tratamento potencialmente curativo disponível para hemoglobinopatias é o transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas. No entanto, estima-se que os transplantes HSC compatíveis com HLA estejam disponíveis para menos de 20% dos indivíduos afetados e as toxicidades a longo prazo sejam substanciais. Além disso, os transplantes de HSC também estão associados a mortalidade e morbidade significativas em indivíduos com DF ou talassemias graves. A significativa mortalidade e morbidade é devida, em parte, à sobrecarga de ferro relacionada à transfusão pré-transplante de HSC, doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) e altas doses de quimioterapia/radiação necessárias para o condicionamento pré-transplante do indivíduo, entre outros.
[006]Progressos recentes no campo da terapia gênica aumentaram a esperança de que pacientes afetados por hemoglobinopatias como β-talassemia e anemia falciforme se beneficiem de novas abordagens terapêuticas. Cavazzana-Calvo et al., Nature 2010. O transplante de células hematopoiéticas (HSCs) modificadas com vetores lentivirais portadores do gene da β-globina resultou na correção a longo prazo de vários modelos de camundongos de distúrbios da hemoglobina, por exemplo, Imren et al., Proc Natl Acad Sei USA. 2002; 99 (22): 14380-14385; Malik et al., Ann NY Acad Sei. 2005; 1054: 238-249; May et al., Nature. 2000; 406 (6791): 82-86; Pawliuk et al., Science. 2001; 294 (5550): 2368-2371). No entanto, a Food and Drug Administration (FDA) ainda não aprovou nenhum produto de terapia genética humana para venda. A terapia genética atual é experimental e teve resultados mistos em ensaios clínicos. Ginn et al., J Gene Med 2013 e Naldini etal., Nature Review 2015.
BREVE SUMÁRIO [007]Vetores de terapia gênica melhorados, composições e métodos de uso dos mesmos para tratar, prevenir ou melhorar pelo menos um sintoma de uma he
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3/89 moglobinopatia são contemplados no presente documento.
[008]Em várias modalidades, é contemplado um vetor lentiviral de HIV-1 que compreende um promotor específico para eritroide operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um shmiR que compreende uma sequência anti-sense que hibridiza em um mRNA de BCL11A humano.
[009]Em várias modalidades, um vetor lentiviral da cepa NL4-3 do HIV-1 que compreende uma repetição terminal longa 5’(LTR), um promotor específico da eritroide operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um shmiR que compreende uma sequência anti-sense que hibridiza em um mRNA de BCL11A humano, e uma cepa de HIV-1 NL4-3 3’LTR é contemplada.
[010]Em modalidades particulares, o vetor lentiviral compreende de 5’a 3’, um sinal de empacotamento de Psi (Ψ); um elemento do trato polipurina central lentiviral (cPPT)/FLAP; um elemento de exportação de RNA; e uma sequência aceitadora de splice de HIV-1 env.
[011]Em modalidades particulares, o vetor lentiviral compreende de 5’a 3’, um sinal de empacotamento de Psi (Ψ); um elemento do trato polipurino central da cepa NL4-3 HIV-1 (cPPT)/FLAP; um elemento de exportação de RNA; e uma sequência aceitadora de splice de HIV-1 env.
[012]Em certas modalidades, o vetor lentiviral compreende uma repetição terminal longa 5’modificada (LTR) e uma LTR SIN HIV-1 3’.
[013]Em algumas modalidades, o vetor lentiviral compreende uma 5’ LTR modificada, em que o promotor da 5’ LTR modificada é substituído por um promotor de CMV; e um HIV-1 3’ SIN LTR.
[014]Em várias modalidades, um vetor lentiviral que compreende: uma repetição terminal longa (LTR) de cepa de HIV-1 NL4-3 5’; um sinal de empacotamento da cepa NL4-3 Psi (Ψ) do HIV-1; um elemento do trato polipurino central da cepa NL4-3 HIV-1 (cPPT)/FLAP; um elemento de exportação de RNA; uma sequência
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4/89 aceitadora de splice da cepa NL4-3 HIV-1; um promotor específico para eritroide operativamente ligado a um shmiR que codifica uma sequência anti-sense que hibridiza em um mRNA de BCL11A humano; e uma cepa de HIV-1 NL4-3 3’LTR é contemplada.
[015]Em várias modalidades, um vetor lentiviral que compreende: uma repetição terminal longa (LTR) do HIV-1 5’; um sinal de empacotamento de Psi (Ψ); um elemento do trato polipurina central lentiviral (cPPT)/FLAP; um elemento de exportação de RNA; uma sequência aceitadora de splice de HIV-1 env; um promotor específico para eritroide operativamente ligado a um shmiR que codifica uma sequência anti-sense que hibridiza em um mRNA de BCL11A humano; e uma LTR de HIV-1 3’ é contemplada.
[016]Em modalidades particulares, o vetor lentiviral compreende uma 5’ LTR modificada, em que o promotor da 5’ LTR modificada é substituído por um promotor de CMV; e um HIV-1 3’ SIN LTR.
[017]Em modalidades particulares, o vetor lentiviral compreende um elemento de exportação de RNA RRE.
[018]Em modalidades particulares, o vetor lentiviral compreende um elemento de exportação de RNA RRE isolado da cepa HXB3 do HIV-1.
[019]Em modalidades adicionais, o promotor específico da eritroide compreende um promotor de β-globina.
[020]Em outras modalidades, o promotor específico da eritroide compreende um promotor da β-globina humana.
[021 ]Em algumas modalidades, o vetor lentiviral compreende uma LCR de βglobina.
[022]Em certas modalidades, o vetor lentiviral compreende uma LCR de βglobina humana.
[023]Em várias modalidades, um vetor lentiviral de auto-inativação (SIN) que
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5/89 compreende: uma repetição terminal longa (LTR) da linhagem de HIV-1 modificada NL4-3 5’(LTR), em que o promotor da 5’ LTR modificada é substituído por um promotor de CMV; um sinal de empacotamento da cepa NL4-3 Psi (Ψ) do HIV-1; um elemento cPPT/FLAP da cepa HIV-1 NL4-3; um elemento de exportação de RNA HXB3 RRE da cepa HIV-1; uma sequência aceitadora de splice da cepa NL4-3 HIV1; um promotor de β-globina operacionalmente ligado a um shmiR que codifica uma sequência anti-sense que hibridiza em um mRNA de BCL11A humano; uma LCR de p-globina; e uma cepa de HIV-1 NL4-3 3’ SIN LTR é contemplada.
[024]Em várias modalidades, um vetor lentiviral de auto-inativação (SIN) que compreende: uma repetição terminal longa 5’ modificada (LTR), em que o promotor da 5’ LTR modificada é substituído por um promotor CMV; um sinal de empacotamento de Psi (Ψ); um elemento do trato polipurina central lentiviral (cPPT)/FLAP; um elemento de exportação de RNA RRE; uma sequência aceitadora de splice de HIV-1 env; um promotor de β-globina operacionalmente ligado a um shmiR que codifica uma sequência anti-sense que hibridiza em um mRNA de BCL11A humano; uma LCR de p-globina; e um HIV-1 3’ SIN LTR é contemplado.
[025]Em modalidades particulares, o vetor lentiviral compreende uma LCR de β-globina humana que compreende sítios de hipersensibilidade à DNAse I HS3 e HS2.
[026]Em algumas modalidades, o vetor lentiviral compreende uma LCR de βglobina humana que compreende sítios de hipersensibilidade à DNAse I HS3 e HS2, mas sem um sítio de hipersensibilidade à DNAse I HS4.
[027]Em certas modalidades, o vetor lentiviral compreende um polinucleotídeo de cerca de 459 nucleotídeos que codifica uma proteína gag.
[028]Em modalidades particulares, o vetor lentiviral compreende um polinucleotídeo que codifica a proteína gag compreende uma ou mais sequências ATG mutadas.
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6/89 [029]Em modalidades adicionais, o vetor lentiviral compreende uma sequência aceitadora de emendas ao HIV-1 env de cerca de 176 nucleotídeos.
[030]Em outras modalidades, o vetor lentiviral compreende um elemento cPPT/FLAP de cerca de 381 nucleotídeos.
[031 ]Em algumas modalidades, o vetor lentiviral compreende um sítio hipersensível à HS2 DNAse I de cerca de 638 nucleotídeos.
[032]Em modalidades particulares, o vetor lentiviral compreende um sítio hipersensível à HS3 DNAse I de cerca de 847 nucleotídeos.
[033]Em modalidades particulares, o vetor lentiviral compreende uma sequência poli (A) sintética disposta entre uma sequência aceitadora de splice de HIV1 env e o shmiR.
[034]Em certas modalidades, o shmiR codifica a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1.
[035]Em outras modalidades, o shmiR compreende a sequência de cordão guia estabelecida na SEQ ID NO: 2.
[036]Em modalidades particulares, o shmiR compreende uma sequência de cadeia de guia que hibridiza em a sequência-alvo estabelecida na SEQ ID NO: 3.
[037]Em algumas modalidades, um cassete de expressão que compreende o promotor específico da eritroide e o polinucleotídeo que codifica o shmiR estão na orientação reversa em comparação com a transcrição do RNA genômico lentiviral.
[038]Em várias modalidades, é contemplado um vetor de transferência lentiviral que compreende a sequência polinucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 4.
[039]Em várias modalidades, é fornecida uma célula que compreende um vetor lentiviral contemplado no presente documento.
[040]Em certas modalidades, é fornecida uma célula que compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam gag e pol de HIV-1, VSV-G e um vetor lentiviral contemplado no presente documento.
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7/89 [041 ]Em modalidades particulares, é fornecida partícula de vetor lentiviral produzida a partir de uma célula que compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam gag e pol de HIV-1, VSV-G e um vetor lentiviral contemplado no presente documento.
[042]Em várias modalidades, é fornecida uma célula transduzida com um vetor lentiviral contemplado no presente documento.
[043]Em algumas modalidades, a célula é transduzida na presença de uma quantidade eficaz de um poloxero selecionado do grupo que consiste em poloxâmero 288, poloxâmero 335, poloxâmero 338, e poloxâmero 407 e agonista do receptor de PGE2.
[044]Em várias modalidades, é fornecida uma célula transduzida com a partícula de vetor lentiviral contemplada no presente documento.
[045]Em certas modalidades, a célula é transduzida na presença de uma quantidade eficaz de um poloxero selecionado do grupo que consiste em poloxâmero 288, poloxâmero 335, poloxâmero 338, e poloxâmero 407 e um agonista do receptor de PGE2.
[046]Em modalidades particulares, a célula é uma célula-tronco hematopoiética ou célula progenitora hematopoiética.
[047]Em certas modalidades, a célula é uma célula-tronco hematopoiética ou célula progenitora.
[048]Em outras modalidades, a célula é CD34+.
[049]Em certas modalidades, a célula é CD133+.
[050]Em modalidades particulares, a célula é CD34+ CD38LoCD90+CD45RA·.
[051 ]Em modalidades adicionais, a célula compreende um dos alelos de βglobina mais mutados associados a uma hemoglobinopatia.
[052]Em algumas modalidades, a célula compreende um dos alelos de βglobina mais mutados selecionados do grupo que consiste em: βΕ/β°, β°/β°, β°/β°,
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8/89 βΕ/βΕ, β°/β+, βΕ/β+, β°/β+, β+/β+, β°/β°, βΕ/βδ, βο/βδ, β°/β8, β+/β8 e β8/β8.
[053]Em certas modalidades, a célula compreende um dos alelos de βglobina mais mutados selecionados do grupo que consiste em: βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, βΕ/β+, β°/βΕ, β°/β+, β°/β+ e β+/β+.
[054]Em modalidades particulares, a célula compreende um dos alelos de βglobina mais mutados selecionados do grupo que consiste em: βΕ/βδ, β°/βδ, β°/βδ, β+/β8 e β8/β8.
[055]Em várias modalidades, é fornecida uma população de células que compreende uma pluralidade de células contempladas no presente documento.
[056]Em várias modalidades, é fornecida uma composição que compreende uma população de células que compreende uma pluralidade de células contempladas no presente documento.
[057]Em várias modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende um carreador farmaceuticamente aceitável e uma população de células que compreende uma pluralidade de células contempladas no presente documento.
[058]Em várias modalidades, um método de transdução de uma população de células hematopoiéticas que compreende cultivar as células em um meio de cultura, na presença de um vetor lentiviral contemplado no presente documento; um poloxâmero; e um agonista do receptor de PGE2 é fornecido.
[059]Em algumas modalidades, 0 poloxâmero é selecionado do grupo que consiste em: poloxâmero 288, poloxâmero 335, poloxâmero 338 e poloxâmero 407.
[060]Em modalidades particulares, 0 agonista do receptor de PGE2 é selecionado do grupo que consiste em: 15d-PGJ2; deitai 2-PGJ2; Ácido 2hidroxiheptadecatrienoico (HHT); Tromboxano A2; Tromboxano B2; lloprost; Treprostinil; Travoprost; Carboprost trometamina; Tafluprost; Latanoprost; Bimatoprost; Unoprostona isopropil; Cloprostenol; Estrofano; Superfano; Misoprostol; Butaprost; Ácido linoleico; 13(s)-HODE; LY171883; Ácido de hidromel; Ácido eicosatrienoico;
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Ácido epoxieicosatrienoico; ONO-259; Cay1039; um agonista do receptor de PGE2; 16,16-dimetil PGE2; 19(R)-hidroxi PGE2; 16,16-dimetil PGE2 p-(pacetamidobenzamido) éster de fenila; 11-desoxi-16,16-dimetil PGE2; 9-desoxi-9metileno-16,16-dimetil PGE2; -9-desoxi-9 metileno PGE2; Sulprostona; PGE2 serinol amida; PGE2 éster de metila; 16-tetranor fenil PGE2; 15 (S)-15-metil-PGE2; e 15(R)-
15-metil PGE2.
[061 ]De acordo com outras modalidades, 0 agonista do receptor de PGE2 é PGE2 ou 16,16-dimetil PGE2.
[062]Em certas modalidades, 0 vetor lentiviral está presente em um MOI de cerca de 10 a cerca de 30 ou em um MOI de cerca de 10 a cerca de 25.
[063]Em modalidades particulares, 0 vetor lentiviral está presente em um MOI de cerca de 10 a cerca de 20.
[064]Em algumas modalidades, 0 vetor lentiviral está presente em um MOI de cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24, cerca de 25, cerca de 26, cerca de 27, cerca de 28, cerca de 29 ou cerca de 30.
[065]Em várias modalidades, é fornecido um método de tratamento de uma hemoglobinopatia em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma população de células, uma composição ou uma composição farmacêutica contemplada no presente documento.
[066]Em várias modalidades, é fornecido um método para melhorar pelo menos um sintoma de uma hemoglobinopatia em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma população de células, uma composição ou uma composição farmacêutica contemplada no presente documento.
[067]Em modalidades particulares, os alelos de β-globina do indivíduo são βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, β°/β+, βΕ/β+, β°/+ β, β+Λ β, β°/β°’ β θ/8 β, ρ °/ρ s’ β°/β8’ β+/β8
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10/89 e β8/β8.
[068]Em várias modalidades, é fornecido um método de tratamento de uma talassemia em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma população de células, uma composição ou uma composição farmacêutica contemplada no presente documento.
[069]Em modalidades adicionais, a talassemia é uma a-talassemia.
[070]Em certas modalidades, a talassemia é uma β-talassemia.
[071 ]Em certas modalidades, os alelos de β-globina do indivíduo são βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, βΕ/β+, β°/βΕ, β°/β+, β°/β+ e β+/β+.
[072]Em várias modalidades, é fornecido um método de tratamento da doença das células falciformes em um indivíduo que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma população de células, uma composição ou uma composição farmacêutica contemplada no presente documento.
[073]Em algumas modalidades, os alelos de β-globina do indivíduo são βΕ/βδ, β°/βδ, β°/βδ, β+/β8 e β8/β8.
[074]Em várias modalidades, é fornecido um método de tratamento de uma β-talassemia em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma população de células, uma composição ou uma composição farmacêutica contemplada no presente documento.
[075]Em modalidades particulares, os alelos de β-globina do indivíduo são βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, βΕ/β+, β°/βΕ, β°/β+, β°/β+ e β+/β+.
[076]Em certas modalidades, a população de células-tronco hematopoiéticas é administrada por via intravenosa, via intramedular ou via intra-óssea.
[077]Em modalidades particulares, a população de células-tronco hematopoiéticas é administrada por via intravenosa.
BREVE DESCRIÇÃO DE VÁRIAS VISTAS DOS DESENHOS [078]A Figura 1 mostra mapas vetoriais dos vetores lentivirais D12G5 e
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BB694.
[079]A Figura 2 mostra VCNs representativos de células saudáveis normais de doador e SCD CD34+ transduzidas sob várias condições e após 6 dias em cultura líquida.
[080]A Figura 3A mostra a análise clonogênica de células CD34+ doadoras saudáveis normais, transduzidas sob várias condições e após 14 dias em cultura de metilcelulose.
[081 ]A Figura 3B mostra a análise clonogênica de células SCD CD34+ transduzidas sob várias condições e após 14 dias em cultura de metilcelulose.
[082]A Figura 4 mostra o VCN de colônias reunidas de doador saudável normal e células SCD CD34+ transduzidas sob várias condições e após 14 dias em cultura de metilcelulose.
[083]A Figura 5 mostra os níveis de HbF e HbA de células CD34+de doadores saudáveis normais, transduzidas sob várias condições e após o dia 14 cultura de diferenciação eritroide (painéis esquerdos). A Figura 5 também mostra os níveis de HbF e HbS das células SCD CD34+ transduzidas sob várias condições e após o dia 14 da cultura de diferenciação eritroide (painéis à direita).
[084]A Figura 6 mostra percentagens de colônias eritroides positivas em vetor a partir do dia 14 de culturas de diferenciação eritroide a partir de células CD34+ normais de doador saudável e de células falciformes transduzidas sob várias condições.
[085]A Figura 7 mostra a porcentagem de indução de HbF de colônias individuais de BFUe de células CD34+ normais de doador saudável e falciforme transduzidas sob várias condições.
[086]A Figura 8 mostra a análise clonogênica de células CD34+ de doador saudável normais transduzidas simuladas ou células CD34+ transduzidas com bb694 depois de 14-16 dias em cultura de metil-celulose.
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12/89 [087]A Figura 9 mostra VCN e percentual de colônias positivas para LVV de colônias eritroides a partir de células hCD34+ arrancadas simuladas transduzidas ou células hCD34+ transduzidas com o vetor lentiviral bb694.
[088]A Figura 10 mostra a análise da cadeia de globina de células eritroides a partir de células hCD34+ diferenciadas simuladas transduzidas ou células hCD34+ transduzidas com vetor lentiviral BB694.
[089]A Figura 11 mostra a porcentagem de células hCD45+ a partir de medula óssea de camundongos NSG transplantados com células hCD34+ transduzidas simuladas ou células hCD34+ transduzidas com vetor lentiviral BB694.
[090]A Figura 12 mostra a porcentagem de células CD19+ CD45+ e a porcentagem de células CD33+ CD45+ a partir da medula óssea de camundongos NSG transplantados com células hCD34+ transduzidas simuladas ou células hCD34+ células transduzidas com vetor lentiviral BB694.
[091 ]A Figura 13 mostra a avaliação quantitativa por PCR (qPCR) do DNA genômico coletado das células da medula óssea quatro meses após o transplante.
BREVE DESCRIÇÃO DOS IDENTIFICADORES DE SEQUÊNCIA [092]SEQ ID NO: 1 define a sequência polinucleotídica de um shmirR.
[093]SEQ ID NO: 2 conjuntos para a sequência polinucleotídica de uma fita guia shmirR.
[094]SEQ ID NO: 3 define a sequência polinucleotídica de uma sequênciaalvo shmirR.
[095]SEQ ID NO: 4 define a sequência polinucleotídica do vetor lentiviral BB694.
DESCRIÇÃO DETALHADA
A. VISÃO GERAL [096]A presente revelação geralmente se refere a, em parte, vetores, composições e métodos de terapia genética melhorados para o tratamento, prevenção
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13/89 ou melhora de pelo menos um sintoma de uma hemoglobinopatia. Sem desejar aterse a nenhuma teoria em particular, as composições de terapia gênica contempladas no presente documento são usadas para aumentar a quantidade de hemoglobina fetal em uma célula para tratar, prevenir ou melhorar os sintomas associados a várias hemoglobinopatias. Dessa forma, as composições contempladas no presente documento oferecem uma solução potencialmente curativa para indivíduos que têm uma hemoglobinopatia.
[097]A hemoglobina adulta normal compreende um complexo tetramérico de duas proteínas alfa-(a)globina e duas proteínas beta-(3-)globina. No desenvolvimento, o feto produz hemoglobina fetal (HbF), que compreende duas proteínas gama(Y)globina em vez das duas proteínas β-globina. Em algum momento do desenvolvimento perinatal, ocorre uma “troca de globina”; os eritrócitos regulam negativamente a expressão da γ-globina e passam a produzir predominantemente a β-globina. Essa troca resulta principalmente da diminuição da transcrição dos genes da γglobina e do aumento da transcrição dos genes da β-globina. A proteína-1 de ligação ao GATA (GATA-1) é um fator de transcrição que influencia a troca de globina. O GATA-1 transaciona diretamente a expressão do gene da β-globina e indiretamente reprime ou suprime a expressão do gene da γ-globina através da transativação da expressão do gene CLL de célula B/linfoma 11A (BCL11 A). A manipulação farmacológica ou genética do interruptor representa uma estratégia terapêutica atraente para pacientes que sofrem de β-talassemia ou doença das células falciformes devido a mutações no gene da β-globina.
[098]Em várias modalidades, os vetores de terapia gênica contemplados no presente documento são vetores lentivirais melhorados que codificam um polinucleotídeo que diminui a expressão de BCL11A em células eritroides. Sem desejar ater-se a nenhuma teoria em particular, é contemplado que a redução ou eliminação da expressão de BCL11A nas células eritroides resultaria na reativação ou desrepressão
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14/89 da expressão do gene da γ-globina e na diminuição da expressão do gene da βglobina, aumentando assim a expressão do HbF para efetivamente tratar e/ou melhorar um ou mais sintomas associados a indivíduos com hemoglobinopatia.
[099]Em várias modalidades, as composições de terapia gênica compreendem uma ou mais células que compreende um vetor lentiviral que codifica um RNA inibidor projetado para ligar e clivar um mRNA de BCL11 A. Em modalidades particulares, um vetor lentiviral codifica um siRNA, um shRNA, um piRNA, um miRNA ou uma combinação dos mesmos. Em modalidades preferenciais, um vetor lentiviral codifica um shRNA incorporado em um andaime miRNA, isto é, um shmiR. Em outras modalidades preferenciais, um vetor lentiviral compreende um shRNA direcionado contra BCL11A que é incorporado em um andaime hsa-miR-223. Em modalidades particulares, as sequências LTRs do vetor lentiviral, cPPT/FLAP e env S/A são isoladas da cepa NL4-3 do HIV-1. Em modalidades particulares, o elemento de exportação de RNA lentiviral é um elemento RRE isolado da cepa HXB3 do HIV-1.
[0100]Em várias outras modalidades, é fornecida uma população de células que compreende uma ou mais células hematopoiéticas transduzidas com um vetor lentiviral contemplado no presente documento. Em modalidades preferenciais, as células compreendem um ou mais alelos de β-globina mutados associados a uma hemoglobinopatia. Sem desejar ater-se a nenhuma teoria em particular, é contemplado que células hematopoiéticas modificadas, que compreende um ou mais alelos de β-globina mutados associados a uma hemoglobinopatia e que compreende ainda um vetor lentiviral contemplado neste documento, tenham diminuído a expressão de BCL11 A, diminuído β-globina com defeito expressão e aumento da expressão de γglobina, fornecendo assim uma composição celular terapêutica.
[0101]Em modalidades particulares, são contemplados métodos para o tratamento de um indivíduo diagnosticado com, ou com uma hemoglobinopatia, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de células modificadas
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15/89 com um ou mais vetores lentivirais contemplados no presente documento.
[0102]Várias modalidades contempladas neste documento empregarão, a menos que indicado especificamente o contrário, métodos convencionais de química, bioquímica, química orgânica, biologia molecular, microbiologia, técnicas de DNA recombinante, genética, imunologia e biologia celular que estão dentro das habilidades da arte, muitas dos quais são descritos abaixo para fins de ilustração. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura. Consulte, por exemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a Edição, 2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2- Edição, 1989); Maniatis etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley e Sons, atualizado em julho de 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates e Wiley-lnterscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I e II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes (Academic Press, Nova York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Perbal, A Praticai Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow e Lane, Anticorpos, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998) Current Protocols in Immunology QE Coligan, AM Kruisbeek, DH Margulies, EM Shevach e W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; bem como monografias em periódicos como Advances in Immunology.
B. DEFINIÇÕES [0103]A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usado no presente documentos têm o mesmo significado que é comumente entendido pelos versados na técnica a que a invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos no presente documento descritos possam ser utilizados na prática ou no teste de modalidades particulares, modalidades preferenciais de composições, métodos e materiais são no presente documento
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16/89 descritas. Para os fins da presente revelação, os seguintes termos são definidos abaixo.
[0104]0s artigos “um”, “uma” e “o/a” são usados neste documento para se referir a um ou mais de um (ou seja, a pelo menos um ou a um ou mais) objetos gramaticais do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou um ou mais elementos.
[0105]O uso da alternativa (por exemplo, “ou”) deve ser entendido como significando uma, ambas ou qualquer combinação das alternativas.
[0106]O termo “e/ou” deve ser entendido como significando uma ou ambas as alternativas.
[0107]Conforme usado neste documento, o termo “aproximadamente” ou “aproximadamente” se refere a uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso, comprimento ou comprimento que varia em até 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1% a uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, dimensão, tamanho, quantia, peso ou comprimento de referência. Em modalidades particulares, os termos “cerca de” ou “aproximadamente” ao preceder um valor numérico indicam o valor mais ou menos um intervalo de 15%, 10%, 5% ou 1%.
[0108]Conforme usado no presente documento, o termo “substancialmente” se refere a uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantia, peso ou comprimento que é de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou superior em comparação com uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, dimensão, tamanho, quantia, peso ou comprimento de referência. Em uma modalidade, “substancialmente o mesmo” se refere a uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento que produz um efeito, por exemplo, um efeito fisiológico, aproximadamente o mesmo que uma
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17/89 quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento de referência.
[0109]Em toda esta especificação, a menos que o contexto exija de outra forma, os termos “compreende”, “compreender” e “que compreende” serão entendidos como implicando a inclusão de uma etapa ou elemento declarado ou grupo de etapas ou elementos, mas não a exclusão de qualquer outra etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos. Conforme usado neste documento, os termos “incluir” e “compreender” são usados como sinônimos. Por “consistindo de” significa-se incluir, e limitado a, o que segue a frase “que consiste em”. Dessa forma, a frase “que consiste em” indica que os elementos listados são obrigatórios ou obrigatórios e que nenhum outro elemento pode estar presente. Por “que consiste essencialmente em” significa incluir quaisquer elementos listados após a frase e limitados a outros elementos que não interferem ou contribuem para a atividade ou ação especificada na revelação para os elementos listados. Dessa forma, a frase “que consiste essencialmente em” indica que os elementos listados são obrigatórios ou obrigatórios, mas que nenhum outro elemento está presente que afeta materialmente a atividade ou ação dos elementos listados.
[0110]A referência ao longo desta especificação a “uma modalidade”, “uma modalidade”, “uma modalidade específica”, “uma modalidade relacionada”, “uma certa modalidade”, “uma modalidade adicional” ou “outra modalidade” ou combinações dos mesmos significa que uma característica, estrutura ou característica particular descrita em conexão com a modalidade é incluída em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Dessa forma, as aparências das frases anteriores em vários lugares ao longo desta especificação não estão necessariamente todas se referindo à mesma modalidade. Além disso, os recursos, estruturas ou características particulares podem ser combinados de qualquer maneira adequada em uma ou mais modalidades. Entende-se também que a recitação positiva de uma característi
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18/89 ca em uma modalidade, serve como base para excluir a característica em uma modalidade específica.
[0111]O termo “vetor” é usado no presente documento para se referir a uma molécula de ácido nucleico capaz de transferir ou transportar outra molécula de ácido nucleico. O ácido nucleico transferido é geralmente ligado a, por exemplo, inserido na molécula de ácido nucleico do vetor. Um vetor pode incluir sequências que direcionam a replicação autônoma em uma célula ou pode incluir sequências suficientes para permitir a integração no DNA da célula hospedeira. Os vetores úteis incluem, por exemplo, plasmídeos (por exemplo, plasmídeos de DNA ou plasmídeos de RNA), transposons, cosmídeos, cromossomos artificiais bacterianos e vetores virais. Os vetores virais úteis incluem, por exemplo, vetores lentivirais.
[0112]Como será evidente para um versado na técnica, o termo “vetor viral” é amplamente usado para se referir a uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um plasmídeo de transferência) que inclui elementos de ácido nucleico derivados de vírus que normalmente facilitam a transferência de a molécula de ácido nucleico ou integração no genoma de uma célula ou em uma partícula viral que medeia a transferência de ácido nucleico. As partículas virais normalmente incluem vários componentes virais e, às vezes, também componentes da célula hospedeira, além de ácido(s) nucleico(s).
[0113]0 termo “vetor viral” pode se referir a um vírus ou partícula viral capaz de transferir um ácido nucleico para uma célula ou para o próprio ácido nucleico transferido. Os vetores virais e plasmídeos de transferência contêm elementos genéticos estruturais e/ou funcionais derivados principalmente de um vírus. O termo “vetor lentiviral” se refere a um vetor retroviral ou plasmídeo contendo elementos genéticos estruturais e funcionais, ou porções dos mesmos, incluindo LTRs derivados principalmente de um lentivírus.
[0114]Os termos “vetor lentiviral” e “vetor de expressão lentiviral” podem ser
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19/89 usados para se referir a plasmídeos de transferência lentiviral e/ou partículas lentivirais infecciosas em modalidades particulares. Onde no presente documento é feita referência a elementos como sítios de clonagem, promotores, elementos reguladores, ácidos nucleicos heterólogos, etc., deve-se entender que as sequências desses elementos estão presentes na forma de RNA nas partículas lentivirais contempladas no presente documento e estão presentes em Forma de DNA nos plasmídeos de DNA contemplados no presente documento.
[0115]O termo “repetição terminal longa (LTR)” se refere a domínios de pares de bases localizados nas extremidades de DNAs retrovirais que, em seu contexto natural de sequência, são repetições diretas e contêm regiões U3, R e U5. As LTRs geralmente fornecem funções fundamentais para a expressão de genes retrovirais (por exemplo, promoção, iniciação e poliadenilação de transcritos de genes) e para replicação viral. O LTR contém inúmeros sinais regulatórios, incluindo elementos de controle transcricional, sinais de poliadenilação e sequências necessárias para replicação e integração do genoma viral. A LTR viral é dividida em três regiões chamadas U3, R e U5. A região U3 contém os elementos potenciadores e promotores. A região U5 é a sequência entre o sítio de ligação do iniciador e a região R e contém a sequência de poliadenilação. A região R (repetição) é flanqueada pelas regiões U3 e U5. A LTR é composta pelas regiões U3, R e U5 e aparece nas extremidades 5’e 3’ do genoma viral. Adjacentes à 5’ LTR estão as sequências necessárias para a transcrição reversa do genoma (o sítio de ligação do iniciador de tRNA) e para o empacotamento eficiente do RNA viral em partículas (o sítio Psi). As inserções provirais compreendem duas cópias da LTR viral 3’, uma cópia que substitui a LTR viral 5’ e a LTR viral 3’.
[0116]Como usado no presente documento, o termo “sinal de empacotamento” ou “sequência de empacotamento” se refere a sequências localizadas dentro do genoma retroviral necessárias para a inserção do RNA viral no capsídeo ou partícula
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20/89 viral, consulte, por exemplo, Clever et al. 1995. J. of Virology, vol. 69, n° 4; 21012109. Vários vetores retrovirais usam o sinal de empacotamento mínimo (também chamado de sequência psi [Ψ] ou [Ψ+]) necessário para a encapsidação do genoma viral. Dessa forma, como usado no presente documento, os termos “sequência de empacotamento”, “sinal de empacotamento”, “psi” e o símbolo “Ψ” são usados em referência à sequência não codificante necessária para a encapsidação de fitas de RNA retrovirais durante a formação de partículas virais.
[0117]Como usado no presente documento, o termo “LTR modificada” se refere a uma ou mais adições, deleções ou substituições de nucleotídeos nas LTRs nativas de HIV-1 5’e/ou 3’ LTRs. O versado na técnica seria capaz de determinar se um LTR é modificado por comparação com um LTR de referência.
[0118]Como usado no presente documento, o termo “defeituoso à replicação” se refere a um lentivírus que compreende um 5’ LTR e/ou 3’ modificado que melhora a segurança do sistema lentiviral, tornando o replicador defeituoso com defeito.
[0119]Os vetores “autoinativação” (SIN) se referem a vetores com defeito de replicação, por exemplo, vetores retrovirais ou lentivirais, nos quais a região promotora de estimulador de LTR (3’) direita, conhecida como região U3, foi modificada (por exemplo, por exclusão ou substituição) para impedir a transcrição viral além da primeira rodada de replicação viral. A auto-inativação é preferencialmente alcançada através da introdução de uma deleção na região U3 da 3’ LTR do DNA do vetor, isto é, o DNA usado para produzir o RNA do vetor. Dessa forma, durante a transcrição reversa, essa deleção é transferida para a 5’ LTR do DNA proviral. No caso de lentivetores baseados no HIV, foi descoberto que esses vetores toleram deleções U3 significativas, incluindo a remoção da caixa LTR TATA (por exemplo, deleções de 418 a -18), sem reduções significativas nos títulos de vetores.
[0120]Como usado no presente documento, o termo “5TR L quimérico” se
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21/89 refere a um 5TR LTR em que a região U3 foi substituída por um promotor heterólogo, por exemplo, promotor CMV, para conduzir a transcrição do genoma viral durante a produção de partículas virais. Os promotores são capazes de conduzir altos níveis de transcrição de maneira independente de Tat. Essa substituição reduz a possibilidade de recombinação para gerar vírus competentes para replicação porque não existe uma sequência U3 completa no sistema de produção de vírus.
[0121 ]O termo “TAR” se refere ao elemento genético da “resposta de transativação” localizado na região R das LTRs lentivirais (por exemplo, HIV). Esse elemento interage com o elemento genético transativador lentiviral (tat) para melhorar a replicação viral. No entanto, este elemento não é necessário em modalidades em que a região U3 da 5’ LTR é substituída por um promotor heterólogo.
[0122]A “região R” se refere à região dentro de LTRs retrovirais começando no início do grupo de nivelamento (ou seja, o início da transcrição) e terminando imediatamente antes do início do trato poli A. A região R também é definida como sendo flanqueada pelas regiões U3 e U5. A região R desempenha um papel durante a transcrição reversa ao permitir a transferência de DNA nascente de uma extremidade do genoma para a outra.
[0123]Como usado no presente documento, o termo “elemento FLAP” se refere a um ácido nucleico cuja sequência inclui o trato polipurino central e as sequências de terminação central (cPPT e CTS) de um retrovirus, por exemplo, HIV-1 ou HIV-2. Em algumas modalidades, os termos “elemento FLAP” e “cPPT/FLAP” são usados de forma intercambiável para se referir ao elemento FLAP anterior. Elementos FLAP adequados são descritos na Patente n° US 6.682.907 e em Zennou, et al., 2000, Cell, 101: 173. Durante a transcrição reversa do HIV-1, o início central do DNA da fita positiva no trato polipurino central (cPPT) e a terminação central na sequência de terminação central (CTS) levam à formação de uma estrutura de DNA de três fitas: o HIV-1 retalho central de DNA. Embora não deseje ater-se a nenhuma teoria, o
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22/89 retalho de DNA pode atuar como um determinante cis-ativo da importação nuclear do genoma lentiviral e/ou pode aumentar o título do vírus. Em uma modalidade, um vetor da invenção compreende um elemento FLAP isolado da cepa NL4-3 do HIV-1.
[0124]O termo “elemento de exportação” se refere a um elemento regulador pós-transcricional de ação cis que regula o transporte de um transcrito de RNA do núcleo para o citoplasma de uma célula. Exemplos de elementos de exportação de RNA incluem, mas não estão limitados a, o elemento de resposta rev (VRE) do vírus da imunodeficiência humana (HIV) (consulte, por exemplo, Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053; e Cullen et al., 1991. Cell 58: 423) e o elemento regulador póstranscricional do vírus da hepatite B (HPRE). Geralmente, o elemento de exportação de RNA é colocado dentro da UTR 3’ de um gene e pode ser inserido como uma ou várias cópias.
[0125]Conforme usado neste documento, os termos “elemento regulador pós-transcricional” ou “PRE” se referem a um elemento de ação cis que regula a expressão no nível do mRNA, por exemplo, regulando o capeamento, a emenda, a adição de cauda de poli (A) e a estabilidade do mRNA. Exemplos ilustrativos de TEP incluem, mas não se limitam a, elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite por marmota (WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73: 2886); o elemento regulador pós-transcricional presente no vírus da hepatite B (HPRE) (Huang e Yen, 1995, Mol. Célula. Biol. 5: 3864); e similares (Liu etal., 1995, Genes Dev., 9: 1766).
[0126]O termo “sítio poli (A)” ou “sequência poli (A)”, conforme usado no presente documento, denota uma sequência de DNA que direciona tanto a terminação quanto a poliadenilação do transcrito de RNA nascente pela RNA polimerase II. As sequências de poliadenilação podem promover a estabilidade do mRNA pela adição de uma cauda poli (A) na extremidade 3’ da sequência de codificação e, assim, contribuir para o aumento da eficiência da tradução. A divagem e a poliadenilação são direcionadas por uma sequência poli (A) no RNA. A sequência central de poli (A)
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23/89 para pré-mRNAs de mamíferos possui dois elementos de reconhecimento que flanqueiam um sítio de clivagem-poliadenilação. Tipicamente, um hexâmero AAUAAA quase invariante repousa 20-50 nucleotídeos a montante de um elemento mais variável rico em resíduos U ou GU. A divagem do transcrito nascente ocorre entre esses dois elementos e é acoplada à adição de até 250 adenosinas ao produto de divagem 5’. Em modalidades particulares, a sequência central de poli (A) é uma sequência sintética de poli (A) (por exemplo, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA). Exemplos ilustrativos de sequências poli (A) incluem, mas não se limitam a uma sequência de SV40 poli (A), uma sequência de hormona de crescimento bovina poli (A) (BGHpA), uma sequência poli (A) de coelho β-globina (^gpA), ou outra sequência poli (A) heteróloga ou endógena adequada conhecida na técnica.
[0127]“Transfecção” se refere ao processo de introdução de DNA nu nas células por métodos não virais.
[0128]“lnfecção” se refere ao processo de introdução de DNA estranho nas células com o uso de um vetor viral.
[0129]“Transdução” se refere à introdução de DNA estranho no genoma de uma célula com o uso de um vetor viral.
[0130]“Número de cópia de vetor” ou “VCN” se refere ao número de cópias de um vetor, ou parte dele, no genoma de uma célula. O VCN médio pode ser determinado a partir de uma população de células ou de colônias de células individuais. Métodos exemplificadores para determinar VCN incluem reação em cadeia da polimerase (PCR) e citometria de fluxo.
[0131]“Eficiência de transdução” se refere à porcentagem de células transduzidas com pelo menos uma cópia de um vetor. Por exemplo, se 1 x 106 células são expostas a um vírus e 5 x 106 células são determinadas a ter pelo menos uma cópia de pelo menos um vírus no seu genoma, em seguida, a eficácia de transdução é de 50%. Métodos exemplificadores para determinar a eficiência da transdução in
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24/89 cluem PCR e citometria de fluxo.
[0132]Uma “molécula pequena”, “molécula orgânica pequena” ou “composto de molécula pequena” se refere a um composto de baixo peso molecular que tem um peso molecular menor que cerca de 5 kD, menor que cerca de 4 kD, menor que cerca de 3 kD, menor superior a cerca de 2 kD, inferior a cerca de 1 kD ou inferior a cerca de 0,5 kD. Em modalidades particulares, pequenas moléculas podem incluir ácidos nucleicos, peptídeos, peptidomiméticos, peptoides, outros pequenos compostos orgânicos ou fármacos e similares. Bibliotecas de misturas químicas e/ou biológicas, como extratos de fungos, bactérias ou algas, são conhecidas na técnica e podem ser rastreadas com qualquer um dos ensaios da invenção. Exemplos de métodos para a síntese de bibliotecas moleculares podem ser encontrados em: (Carell et al., 1994a; Carell et al., 1994b; Cho et al., 1993; DeWitt et al., 1993; Gallop et al., 1994; Zuckermann etal., 1994).
[0133]O termo “análogo” ou “derivado” se refere a uma molécula que é semelhante a outra substância química em estrutura e função, muitas vezes diferindo estruturalmente por um único elemento ou grupo, mas pode diferir diferindo pela modificação de mais de um grupo (por exemplo, 2, 3 ou 4 grupos) se reter a mesma função que o produto químico parental. Tais modificações são rotineiras para os versados na técnica e incluem, por exemplo, porções químicas adicionais ou substituídas, como ésteres ou amidas de um ácido, grupos de proteção, como um grupo benzil para álcool ou tiol, e grupos terc-butoxilcarbonil para uma amina. Também estão incluídas modificações nas cadeias laterais de alquil, como substituições de alquil (por exemplo, metil, dimetil, etil etc.), modificações no nível de saturação ou insaturação das cadeias laterais e a adição de grupos modificados, como fenil e fenoxi substituídos. Os derivados também podem incluir conjugados, como porções de biotina ou avidina, enzimas como peroxidase de rábano silvestre e similares, e incluindo porções radiomarcadas, bioluminescentes, quimioluminescentes ou fluorescen
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25/89 tes. Além disso, porções podem ser adicionadas aos agentes no presente documento descritos para alterar suas propriedades farmacocinéticas, como aumentar a meia-vida in vivo ou ex vivo, ou aumentar suas propriedades de penetração celular, entre outras propriedades desejáveis. Também estão incluídos os pró-fármacos, que são conhecidos por melhorar inúmeras qualidades desejáveis dos produtos farmacêuticos (por exemplo, solubilidade, biodisponibilidade, fabricação etc.) (consulte, por exemplo, o documento WO/2006/047476 para pró-fármacos agonistas de exemplo, que são incorporados a título de referência para sua revelação de tais agonistas).
[0134]Conforme usado no presente documento, os termos “polinucleotídeo” ou “ácido nucleico” se referem a ácido desoxirribonucleico (DNA), ácido ribonucleico (RNA) e híbridos de DNA/RNA. Os polinucleotídeos podem ser de fita simples ou dupla e recombinantes, sintéticos ou isolados. Os polinucleotídeos incluem, mas não estão limitados a: RNA pré-mensageiro (pré-mRNA), RNA mensageiro (mRNA), RNA, RNA interferente curto (siRNA), RNA hairpin curto (shRNA), microRNA (miRNA), microRNA incorporado ao shRNA (shmiR) ribozimas, RNA genômico (RNAm), mais RNA de cadeia (RNA (+)), RNA de cadeia negativa (RNA (-)), tracrRNA, crRNA, RNA guia único (sgRNA), RNA sintético, mRNA sintético, DNA genômico (gDNA), DNA amplificado por PCR, DNA complementar (cDNA), DNA sintético ou DNA recombinante. De preferência, os polinucleotídeos da invenção incluem polinucleotídeos ou variantes com pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de referência no presente documento descritas (consulte, por exemplo, SEQ ID NO: 1-4), normalmente onde a variante mantém pelo menos uma atividade biológica da sequência de referência. Em várias modalidades ilustrativas, são contempladas sequências e composições de vetor viral e de polinucleotídeo de plasmídeo de transferência e composições que compreende o mesmo.
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Em modalidades particulares, são contemplados polinucleotídeos que codificam um ou mais polipeptídeos terapêuticos e/ou outros genes de interesse. Em modalidades particulares, os vetores lentivirais contemplados no presente documento compreendem um RNA inibidor que hibridiza em um mRNA de BCL11A, consulte, por exemplo, SEQ ID NO: 1-2.
[0135]Como usado no presente documento, os termos “variante polinucleotídica” e “variante” e similares se referem a polinucleotídeos que exibem identidade substancial de sequência com uma sequência polinucleotídica de referência ou polinucleotídeos que hibridam com uma sequência de referência sob condições rigorosas definidas a seguir. Esses termos incluem polinucleotídeos nos quais um ou mais nucleotídeos foram adicionados ou excluídos ou substituídos por diferentes nucleotídeos em comparação com um polinucleotídeo de referência. A este respeito, é bem entendido na técnica que certas alterações, incluindo mutações, adições, deleções e substituições, podem ser feitas a um polinucleotídeo de referência, pelo qual o polinucleotídeo alterado retém a função ou atividade biológica do polinucleotídeo de referência.
[0136]Como usado no presente documento, o termo “isolado” significa material, por exemplo, um polinucleotídeo, um polipeptídeo, uma célula que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham em seu estado nativo. Em modalidades particulares, o termo “obtido” ou “derivado” é usado como sinônimo de isolado. Por exemplo, um “polinucleotídeo isolado”, como usado no presente documento, se refere a um polinucleotídeo que foi purificado das sequências que o flanqueiam em um estado natural, por exemplo, um fragmento de DNA que foi removido das sequências que normalmente são adjacentes para o fragmento.
[0137]Conforme usado no presente documento, os termos “shRNA” ou “RNA em gancho de cabelo curto” se referem à estrutura de fita dupla que é formada por
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27/89 uma única fita de RNA auto-complementar.
[0138]Conforme usado no presente documento, os termos “miRNA” ou “microRNA” se referem a pequenos RNAs não codificadores de 20 a 22 nucleotídeos, tipicamente excisados de ~ 70 estruturas precursoras de RNA foldback de nucleotídeos conhecidas como pré-miRNAs. Os miRNAs regulam negativamente seus alvos de uma de duas maneiras, dependendo do grau de complementaridade entre o miRNA e o alvo. Primeiro, os miRNAs que se ligam com complementaridade perfeita ou quase perfeita às sequências de mRNAs que codificam proteínas, induzem a via de interferência mediada por RNA (RNAi). Os miRNAs que exercem seus efeitos regulatórios ligando-se a sítios complementares imperfeitos dentro das regiões 3’ não traduzidas (UTRs) de seus alvos de mRNA, reprimem a expressão do gene alvo pós-transcricionalmente, aparentemente ao nível da tradução, através de um complexo RISC semelhante a, ou possivelmente idêntico ao que é usado para a via RNAi. Consistentes com o controle de tradução, os miRNAs que usam esse mecanismo reduzem os níveis de proteína de seus genes-alvo, mas os níveis de mRNA desses genes são apenas minimamente afetados.
[0139]Conforme usado neste documento, os termos “miRNA incorporado ao shRNA”, “shmiR” e “schmir” são usados de forma intercambiável e se referem a um shRNA cujos fios de sentido e anti-sense são incorporados a um andaime de miRNA, que retém as regiões de flanco do miRNA e o loop. Por exemplo, em uma modalidade, o versado na técnica pode projetar um RNA em gancho de cabelo curto expresso a partir de um transcrito primário do miR-223. Esse projeto adiciona um sítio de processamento de Drosha à construção shRNA e demonstrou aumentar significativamente a eficiência de knockdown (Pusch etal., 2004). Em modalidades particulares, a haste em gancho de cabelo de um shmir compreende 21-nt de dsRNA e uma alça de 15-nt de um miRNA humano. A adição das sequências miR NA de loop e flanqueamento em um ou em ambos os lados do gancho de cabelo resulta em um
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28/89 aumento superior a 10 vezes no processamento de Drosha e Dicer dos ganchos de cabelo expressos, quando comparado com os designs de shRNA convencionais sem microRNA. O aumento do processamento de Drosha e Dicer se traduz em maior produção de siRNA/miRNA e maior potência para grampos de cabelo expressos. Em modalidades preferenciais, um shmir compreende uma fita guia de 21 nt, em que cerca de 17 nt corresponde a um RNA anti-sense que liga um mRNA alvo e cerca de 4 nt correspondem a sequências ricas em GC, por exemplo, GCGC, que melhoram 3’- termine a estabilidade termodinâmica no RNA duplex e promova o carregamento RISC preferencial da fita-guia pretendida. Veja, por exemplo, SEO ID NO: 1-3. Em uma modalidade, o polinucleotídeo codifica um shmiR. Em várias outras modalidades, um polinucleotídeo compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo um shmiR.
[0140]Cs termos que descrevem a orientação dos polinucleotídeos incluem: 5’ (normalmente a extremidade do polinucleotídeo com um grupo fosfato livre) e 3’ (normalmente a extremidade do polinucleotídeo com um grupo hidroxila livre (OH)). As sequências polinucleotídicas podem ser anotadas na orientação 5 ’para 3’ ou na orientação 3’ para 5’.
[0141]Cs termos “complementar” e “complementaridade” se referem a polinucleotídeos (isto é, uma sequência de nucleotídeos) relacionados pelas regras de emparelhamento de bases. Por exemplo, a cadeia complementar da sequência de DNA 5’ AGTCATG 3’ é 3’ TCAGTAC 5’. A última sequência é frequentemente escrita como o complemento inverso com a extremidade 5’à esquerda e a extremidade 3’ à direita, 5’ CATGACT 3’. Uma sequência que é igual ao seu complemento reverso é considerada uma sequência palindrômica. A complementaridade pode ser “parcial”, na qual apenas algumas das bases dos ácidos nucleicos são correspondidas de acordo com as regras de emparelhamento de bases. Ou pode haver complementaridade “completa” ou “total” entre os ácidos nucleicos.
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29/89 [0142]O termo “cassete de ácido nucleico” ou “cassete de expressão”, conforme usado no presente documento, se refere a sequências genéticas dentro do vetor que podem expressar um polinucleotídeo. Em uma modalidade, o cassete de ácido nucleico contém um polinucleotídeo(s) de interesse. Em outra modalidade, o cassete de ácido nucleico contém uma ou mais sequências de controle de expressão, por exemplo, um promotor, intensificador, sequência poli(A) e um polinucleotídeo(s) de interesse. Os vetores podem compreender um, dois, três, quatro, cinco ou mais cassetes de ácido nucleico. A cassete de ácido nucleico é orientada posicionalmente e sequencialmente dentro do vetor, de modo que o ácido nucleico no cassete possa ser transcrito para o RNA. De preferência, o cassete tem as suas extremidades 3’e 5’ adaptadas para inserção imediata em um vetor, por exemplo, possui sítios de endonuclease de restrição em cada extremidade. Em uma modalidade preferencial, o cassete de ácido nucleico uma ou mais sequências de controle de expressão operacionalmente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um RNA terapêutico, por exemplo, um shmiR e/ou um polipeptídeo, que podem ser usadas para tratar, prevenir ou melhorar um distúrbio genético. A cassete pode ser removida e inserida em um plasmídeo ou vetor viral como uma única unidade.
[0143]Como usado no presente documento, o termo “polinucleotídeo(s) de interesse” se refere a um ou mais polinucleotídeos, por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo (isto é, um polipeptídeo de interesse), inserido em um vetor de expressão que é desejado ser expresso. Nas modalidades preferenciais, os vetores e/ou plasmídeos da presente invenção compreendem um ou mais polinucleotídeos de interesse que codificam um ou mais RNAs terapêuticos, por exemplo, shRNAs, miRNAs ou shmiRs e/ou polipeptídeos terapêuticos, por exemplo, uma globina. Em modalidades particulares, o polinucleotídeo de interesse é um transgene que codifica um shmiR BCL11A e um polipeptídeo que fornece uma função terapêutica para o tratamento de uma hemoglobinopatia, por exemplo, a-globina, β-globina
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30/89 ou 3-globinaA-T87Q. Exemplos ilustrativos de sequências de polinucleotídeos de globina adequados para uso em modalidades exemplificadores incluem, mas não estão limitados a, polinucleotídeos que codificam a-globina, β-globina, β-globina AT87Q, globinas anti-falciformes, γ-globina e δ globina.
[0144]O termo “globina”, conforme usado no presente documento, se refere a proteínas ou subunidades de proteínas que são capazes de se ligar covalentemente ou não covalentemente a uma porção heme e, portanto, podem transportar ou armazenar oxigênio. Subunidades de hemoglobinas de vertebrados e invertebrados, mioglobinas de vertebrados e invertebrados ou seus mutantes são incluídas pelo termo globina. O termo exclui hemocianinas. Exemplos de globinas incluem aglobina ou variante da mesma, β-globina ou variante da mesma, uma γ-globina ou uma variante da mesma e δ-globina ou uma variante da mesma.
[0145]Polinucleotídeos, independentemente do comprimento da própria sequência de codificação, podem ser combinados com outras sequências de DNA, como promotores e/ou intensificadores, regiões não traduzidas (UTRs), sequências de Kozak, sinais de poliadenilação, sítios adicionais de enzimas de restrição, múltiplos sítios de clonagem, internos sítios de entrada ribossômica (IRES), sítios de reconhecimento de recombinase (por exemplo, sítios LoxP, FRT e Att), códons de terminação, sinais de terminação transcricional e polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de auto-clivagem, tags de epítopo, como revelado em outras partes neste documento ou como conhecido na técnica, de modo que seu comprimento total possa variar consideravelmente. Portanto, é contemplado que um fragmento polinucleotídico de quase qualquer comprimento possa ser empregado, com o comprimento total sendo preferencialmente limitado pela facilidade de preparação e uso no protocolo de DNA recombinante pretendido.
[0146]O termo “sequência de controle de expressão” se refere a uma sequência polinucleotídica que compreende um ou mais promotores, intensificadores
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31/89 ou outros elementos de controle transcricionais ou combinações dos mesmos que são capazes de direcionar, aumentar, regular ou controlar a transcrição ou expressão de um polinucleotídeo operacionalmente ligado. Em modalidades particulares, os vetores da invenção compreendem uma ou mais sequências de controle de expressão que são específicas para células eritroides específicas, tipos de células eritroides ou linhagens de células eritroides. Em modalidades preferenciais, os vetores compreendem uma ou mais sequências de controle de expressão específicas para células eritroides, por exemplo, uma sequência de controle de expressão específica para eritroides.
[0147]Uma sequência de controle de expressão “endógena” é aquela que está naturalmente ligada a um determinado gene no genoma. Uma sequência de controle de expressão “exógena” é aquela que é colocada em justaposição a um gene por meio de manipulação genética (isto é, técnicas biológicas moleculares), de modo que a transcrição desse gene seja direcionada pelo intensificador/promotor vinculado. Uma sequência de controle de expressão “heteróloga” é uma sequência exógena que é de uma espécie diferente da célula que está sendo manipulada geneticamente. Uma sequência de controle de expressão “sintética” pode compreender elementos de mais uma sequência endógena e/ou exógena e/ou sequências determinadas in vitro ou in siiico que fornecem ótima atividade promotora e/ou potenciadora para a terapia genética específica. Em modalidades particulares, um vetor compreende sequências de controle de expressão exógenas, endógenas ou heterólogas, como promotores e/ou potenciadores.
[0148]O termo “promotor”, conforme usado no presente documento, se refere a uma sequência de controle de expressão que compreende um sítio de reconhecimento de um polinucleotídeo (DNA ou RNA) ao qual uma RNA polimerase se liga. O termo “intensificador” se refere a uma sequência de controle de expressão que compreende um segmento de DNA que contém sequências capazes de fornecer
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32/89 transcrição aprimorada e, em alguns casos, pode funcionar independentemente de sua orientação em relação a outra sequência de controle. Um intensificador pode funcionar de forma cooperativa ou aditiva com promotores e/ou outros elementos potencializadores. O termo “promotor/intensificador” se refere a um segmento de DNA que contém sequências capazes de fornecer funções de promotor e intensificador.
[0149]O termo “operacionalmente ligado” se refere a uma justaposição em que os componentes descritos estão em um relacionamento que lhes permite funcionar da maneira pretendida. Em uma modalidade, o termo se refere a uma ligação funcional entre uma sequência de controle de expressão de ácido nucleico (como um promotor e/ou intensificador ou outra sequência de controle de expressão) e uma segunda sequência de polinucleotídeo, por exemplo, um polinucleotídeo de interesse, em que a sequência de controle de expressão direciona a transcrição do ácido nucleico correspondente à segunda sequência.
[0150]Os termos “polipeptídeo” e “proteína” são usados no presente documento de forma intercambiável para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos e a variantes e análogos sintéticos dos mesmos. Dessa forma, estes termos se aplicam a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são aminoácidos sintéticos que não ocorrem naturalmente, como um análogo químico de um aminoácido correspondente, bem como a polímeros de aminoácidos naturais. Exemplos ilustrativos de polipeptídeos incluem, mas não estão limitados a polipeptídeos de globina, adequados para uso nas composições e métodos de modalidades particulares. Também, consulte, por exemplo, as Patentes n° US 6.051.402; 7.901.671; e 9.068.199, cuja revelação completa e reivindicações estão especificamente incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0151]Modalidades particulares contempladas no presente documento, tam
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33/89 bém incluem “variantes” do polipeptídeo. O polipeptídeo de recitação “variante” se refere a polipeptídeos que são diferenciados de um polipeptídeo de referência pela adição, exclusão, truncamentos, modificações e/ou substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido e que retêm uma atividade biológica. Em certas modalidades, uma variante de polipeptídeo é diferenciada de um polipeptídeo de referência por uma ou mais substituições, que podem ser conservadoras ou não conservadoras, como conhecido na técnica. Em certas modalidades, um polipeptídeo variante inclui uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade ou semelhança de sequência com uma sequência correspondente de um polipeptídeo de referência. Em certas modalidades, adições ou deleções de aminoácidos ocorrem na extremidade C-terminal e/ou na extremidade N-terminal do polipeptídeo de referência.
[0152]Uma “célula hospedeira” inclui células transfectadas, infectadas ou transduzidas in vivo, ex vivo ou in vitro com um vetor recombinante ou um polinucleotídeo contemplado no presente documento. As células hospedeiras podem incluir células de empacotamento, células produtoras e células infectadas com vetores virais. Em modalidades particulares, as células hospedeiras infectadas com o vetor viral da invenção são administradas a um indivíduo necessitado de terapia. Em certas modalidades, o termo “célula-alvo” é usado de forma intercambiável com a célula hospedeira e se refere a células transfectadas, infectadas ou transduzidas do tipo de célula desejado. Em modalidades preferenciais, a célula-alvo é uma célula-tronco ou célula progenitora. Em certas modalidades preferenciais, a célula-alvo é uma célula somática, por exemplo, célula-tronco adulta, célula progenitora ou célula diferenciada. Em modalidades particularmente preferenciais, a célula-alvo é uma célula hematopoiética, por exemplo, uma célula-tronco hematopoiética ou célula progenitora. Células alvo terapêuticas adicionais são discutidas, infra.
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34/89 [0153]O termo “célula primária”, como usado no presente documento, é conhecido na técnica como se refere a uma célula que foi isolada de um tecido e foi estabelecida para crescimento in vitro ou ex vivo. As células correspondentes sofreram muito poucas, se houver, duplicação da população e, portanto, são mais representativas do principal componente funcional do tecido do qual são derivadas em comparação com linhas celulares contínuas, representando assim um modelo mais representativo para o estado in vivo. Os métodos para obter amostras de vários tecidos e métodos para estabelecer linhas celulares primárias são bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Jones e Wise, Methods Mol Biol. 1997). As células primárias para utilização no método da invenção são derivadas de, por exemplo, sangue. Em uma modalidade, a célula primária é uma célula-tronco hematopoiética ou célula progenitora.
[0154]O termo “célula-tronco” se refere a uma célula que é uma célula indiferenciada capaz de (1) auto-renovação a longo prazo ou a capacidade de gerar pelo menos uma cópia idêntica da célula original, (2) diferenciação no nível de célula única em múltiplos e, em alguns casos, apenas um tipo celular especializado e (3) regeneração funcional in vivo dos tecidos. As células-tronco são subclassificadas de acordo com seu potencial de desenvolvimento como totipotentes, pluripotentes, multipotentes e oligo/unipotentes. “Auto-renovação” se refere a uma célula com capacidade única de produzir células-filha inalteradas e gerar tipos de células especializados (potência). A auto-renovação pode ser alcançada de duas maneiras. A divisão celular assimétrica produz uma célula filha que é idêntica à célula parental e uma célula filha que é diferente da célula parental e é um progenitor ou célula diferenciada. A divisão celular simétrica produz duas células filhas idênticas. “Proliferação” ou “expansão” de células se refere a células que se dividem simetricamente.
[0155]Como usado no presente documento, o termo “progenitor” ou “células progenitoras” se refere a células que têm a capacidade de se auto-renovar e se dife
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35/89 renciar em células mais maduras. Muitas células progenitoras se diferenciam em uma única linhagem, mas podem ter uma capacidade proliferativa bastante extensa.
[0156]O termo “célula-tronco hematopoiética” ou “HSC” se refere a célulastronco multipotentes que dão origem a todos os tipos de células sanguíneas de um organismo, incluindo mieloide (por exemplo, monócitos e macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrócitos, megacariócitos/plaquetas), células dendríticas) e linhagens linfoides (por exemplo, células T, células B, células NK) e outras conhecidas na técnica (verFei, R., etal., patente US No. 5. 635. 387; McGlave, etal, Patente ri US 5.460.964;. Simmons, P., et al, Patente ri US 5.677.136;. Tsukamoto, et al, Patente ri US 5.750.397;. Schwartz, etal, Patente ri US 5.759.793;. DiGuisto, etal., Patente ri US 5.681.599; Tsukamoto et al., Patente ri US 5.716.827). Quando transplantadas em animais ou humanos irradiados letalmente, as células-tronco hematopoiéticas e progenitoras podem repovoar o pool de células eritroide, neutrófilomacrófago, megacariócito e hematopoiético linfoide.
[0157]Por “aprimorar” ou “promover” ou “aumentar” ou “expandir” se refere geralmente à capacidade das composições e/ou métodos contemplados no presente documento de provocar, causar ou produzir níveis aumentados de HbF, aumentar a expressão de γ-globina e/ou maior eficiência de transdução em comparação com as composições de veículo ou controle. Uma quantidade “aumentada” ou “aprimorada” é tipicamente uma quantidade “estatisticamente significativa” e pode incluir um aumento de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,15, 20, 30 ou mais vezes (por exemplo, 500, 1000 vezes) (incluindo todos os números inteiros e casas decimais entre e acima de 1, por exemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) um valor de referência.
[0158]Por “diminui” ou “reduzir” ou “que diminui” ou “que reduz” ou “reduzindo” se refere geralmente a composições ou métodos que provocam, causam ou reduzem níveis anormais de globina, diminuem os níveis de expressão do gene da βglobina e/ou diminuir os níveis de expressão do gene BCL11 A. Uma quantidade “de
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36/89 crescente d” ou “reduzida” é tipicamente uma quantia “estatisticamente significativa” e pode incluir uma diminuição de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 ou mais vezes (por exemplo, 500, 1000 vezes) (incluindo todos os números inteiros e casas decimais entre e acima de 1, por exemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) um valor de referência.
[0159]Por “manutenção” ou “preservação” ou “manutenção” ou “nenhuma alteração” ou “nenhuma alteração substancial” ou “nenhuma redução substancial” se refere geralmente a uma resposta fisiológica comparável a uma resposta causada por qualquer veículo, uma molécula/composição de controle ou a resposta em uma célula específica. Uma resposta comparável é aquela que não é significativamente diferente ou mensurável diferente da resposta de referência.
[0160]Na descrição a seguir, certos detalhes específicos são estabelecidos para fornecer um entendimento completo de várias modalidades ilustrativas da invenção contempladas no presente documento. No entanto, um versado na técnica entenderá que modalidades ilustrativas particulares podem ser praticadas sem esses detalhes.
C. VETORES LENTIVIRAIS SHMIR BCL11A [0161]Os vetores lentivirais contemplados no presente documento fornecem uma solução muito necessária para o problema de transduzir e expressar com eficiência RNAs terapêuticos em células eritroides, a fim de tratar, prevenir ou melhorar pelo menos um sintoma de um distúrbio hemoglobinopático. As arquiteturas aprimoradas de vetores lentivirais dos vetores lentivirais contempladas no presente documento resultam em aumento do título do vetor, maior transdutibilidade, maior número de cópias do vetor e maior eficiência da transdução em comparação com as arquiteturas existentes do vetor lentiviral.
[0162]Em modalidades particulares, o vetor lentiviral compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente liga
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37/89 das a um polinucleotídeo que codifica um shCLi de BCL11A. O shmiR compreende um andaime de miRNA, que retém as regiões flanqueadoras e o loop de miRNA, e otimiza os fios de passageiros e guias a partir de um construto de shRNA que visa o BCL11 A. Sem desejar ater-se a nenhuma teoria em particular, a adição de GCGC à extremidade 3’ da fita guia é contemplada para aumentar a estabilidade termodinâmica da extremidade 3’ no RNA duplex, o que deve promover o carregamento RISC preferencial da fita guia pretendida.
[0163]Em modalidades preferenciais, o vetor lentiviral é um vetor lentiviral da cepa NL4-3 do HIV-1, em que todas as sequências nativas do vetor lentiviral exceto o RRE são derivadas da cepa NL4-3 do HIV-1. Em modalidades particulares, os vetores lentivirais contemplados no presente documento compreendem uma ou mais diferenças em comparação com as arquiteturas de vetores lentivirais existentes que codificam shmiRs BCL11 A. As uma ou mais diferenças permitem que os vetores lentivirais contemplados no presente documento superem os vetores lentivirais existentes e produzam um produto de terapia gênica aprimorado. Exemplos ilustrativos de uma ou mais diferenças incluem, mas não estão limitados a: o vetor lentiviral LTR, cPPT/FLAP e sequências S/A env são isolados da cepa NL4-3 do HIV-1; a sequência RRE é isolada da cepa HXB3 do HIV-1; a arquitetura dos elementos vetoriais lentivirais é o sítio 5’ LTR-psi (Ψ) de sinal de empacotamento-aceitador de splice cPPT/FLAP-RRE-env (S/A); o vetor lentiviral compreende uma 5’ LTR, em que o promotor endógeno foi substituído por um promotor de CMV; o vetor lentiviral compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína gag truncada de cerca de 459 nucleotídeos e que possui pelo menos dois códons ATG mutados; o vetor lentiviral compreende um sítio aceitador de splice de env (S/A) de cerca de 176 nucleotídeos; o vetor lentiviral compreende uma sequência de cPPT/FLAP de cerca de 381 nucleotídeos; o vetor lentiviral compreende um sítio hipersensível à DNAse I da βglobina LCR HS2 de cerca de 638 nucleotídeos; o vetor lentiviral compreende um
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38/89 sítio hipersensível à DNAse I da β-globina LCR HS3 de cerca de 847 nucleotídeos; e o vetor lentiviral compreende uma sequência de poliadenilação sintética na extremidade 3’ do cassete de expressão shmiR.
[0164]Os vetores lentivirais contemplados em modalidades particulares compreendem um promotor específico para eritroide selecionado do grupo que consiste em: um promotor de β-globina humana; uma LCR de p-globina humana; e um intensificador de α-globina HS40 humana e um promotor de anquirina-1, operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um shmiR projetado para hibridar e facilitar a divagem de um mRNA de BCL11 A, isto é, um shmiR de BCL11 A.
[0165]A arquitetura do vetor lentiviral dos vetores lentivirais contemplada no presente documento compreende de 5’a 3’, um sinal de empacotamento de Psi (Ψ); um elemento do trato polipurina central lentiviral (cPPT)/FLAP, opcionalmente em que o elemento cPPT/FLAP compreende uma sequência polinucleotídica de cerca de 381 nucleotídeos de comprimento e compreende ainda um elemento cPPT e uma sequência CTS; um elemento de exportação de RNA, opcionalmente em que o elemento de exportação de RNA é um elemento de resposta REV ou RRE; e uma sequência aceitadora de splice de HIV-1 env.
[0166]A segurança do vetor lentiviral é de suma importância para qualquer potencial terapia gênica lentiviral. Os vetores lentivirais contemplados no presente documento compreendem uma ou mais modificações, incluindo, mas não se limitando a, modificações a uma ou mais LTRs, para tornar o lentivírus defeituoso na replicação. Em modalidades particulares, o lentivírus compreende uma repetição terminal longa 5’ modificada (LTR), em que a modificação compreende a substituição do promotor endógeno da 5’ LTR por um promotor heterólogo de CMV. Em modalidades particulares, o lentivírus compreende uma 3’ LTR modificada, em que a modificação compreende a exclusão dos promotores e melhoradores virais na região U3 da 3’ LTR, opcionalmente em que a exclusão tem cerca de 400 nucleotídeos de
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39/89 comprimento.
[0167]Em modalidades particulares, um vetor lentiviral contemplado no presente documento compreende uma cepa NL4-3 5’ LTR do HIV-1, em que a região U3 foi substituída por um promotor de CMV; um sinal de empacotamento de Psi (Ψ); um elemento do trato polipurino central da cepa NL4-3 do HIV-1 (cPPT)/FLAP que compreende um elemento cPPT e uma sequência CTS; um elemento de exportação de RNA HXB3 RRE da cepa HIV-1, uma sequência aceitadora de splice da cepa NL4-3 HIV-1; um promotor específico para eritroide operativamente ligado a um shmiR que codifica uma sequência de RNA que hibridiza em um mRNA de BCL11A humano; e uma cepa de HIV-1 NL4-3 3’ SIN LTR.
[0168]Em modalidades particulares, um vetor lentiviral contemplado no presente documento compreende uma cepa NL4-3 5’ LTR do HIV-1, em que a região U3 foi substituída por um promotor de CMV; um sinal de empacotamento de Psi (Ψ); um elemento do trato polipurino central da cepa NL4-3 do HIV-1 (cPPT)/FLAP que compreende um elemento cPPT e uma sequência CTS; um elemento de exportação de RNA HXB3 RRE da cepa HIV-1, uma sequência aceitadora de splice da cepa NL4-3 HIV-1; um LCR de β-globina humana e um promotor de β-globina humana operacionalmente ligado a um shmiR que codifica uma sequência de RNA que hibridiza em um mRNA de BCL11A humano; e uma cepa de HIV-1 NL4-3 3’ SIN LTR.
[0169]Em modalidades particulares, um vetor lentiviral contemplado no presente documento compreende uma cepa NL4-3 5’ LTR do HIV-1, em que a região U3 foi substituída por um promotor de CMV; um sinal de empacotamento de Psi (Ψ); um elemento do trato polipurino central da cepa NL4-3 do HIV-1 (cPPT)/FLAP que compreende um elemento cPPT e uma sequência CTS; um elemento de exportação de RNA HXB3 RRE da cepa HIV-1, uma sequência aceitadora de splice da cepa NL4-3 HIV-1; sítios hipersensíveis ao DNAsel HS3 e HS2 do LCR da β-globina humana e do promotor da β-globina humana operativamente ligados a um shmiR que
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40/89 codifica uma sequência de RNA que hibridiza em um mRNA de BCL11A humano; e uma cepa de HIV-1 NL4-3 3’ SIN LTR.
[0170]Em modalidades particulares, um vetor lentiviral contemplado no presente documento compreende uma cepa NL4-3 5’ LTR do HIV-1, em que a região U3 foi substituída por um promotor de CMV; um sinal de empacotamento de Psi (Ψ); um polinucleotídeo que codifica uma proteína gag truncada e compreende um ou mais um ou mais códons ATG mutados; um elemento do trato polipurino central da cepa NL4-3 do HIV-1 (cPPT)/FLAP que compreende um elemento cPPT e uma sequência CTS; um elemento de exportação de RNA HXB3 RRE da cepa HIV-1, uma sequência aceitadora de splice da cepa NL4-3 HIV-1; um sítio hipersensível ao DNAsel HS3 e HS2 do LCR de β-globina humana e do promotor de β-globina humana operacionalmente ligado a um shmiR que codifica uma sequência de RNA que hibridiza em um mRNA de BCL11A humano e um sinal sintético de poli (A); e uma cepa de HIV-1 NL4-3 3’ SIN LTR.
[0171]Em modalidades particulares, um vetor lentiviral contemplado no presente documento compreende uma cepa NL4-3 5’ LTR do HIV-1, em que a região U3 foi substituída por um promotor de CMV; um sinal de empacotamento de Psi (Ψ); um polinucleotídeo que codifica uma proteína gag truncada e compreende um ou mais um ou mais códons ATG mutados; um elemento do trato polipurino central (cPPT)/FLAP da cepa NL4-3 do HIV-1 com cerca de 381 nucleotideos de comprimento e que compreende um elemento cPPT e uma sequência CTS; um elemento de exportação de RNA HXB3 RRE da cepa HIV-1, uma sequência aceitadora de splice da cepa NL4-3 HIV-1; um sítio hipersensível ao DNAsel HS3 do LCR da βglobina humana de cerca de 847 nucleotideos de comprimento, um sítio hipersensível ao DNAsel HS3 do LCR da β-globina humana de cerca de 638 nucleotideos de comprimento e ao promotor da β-globina humana operacionalmente ligado a um cassete de expressão shmiR que compreende uma sequência apresentada na SEQ
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ID NO: 1 e um sinal sintético de poli (A); e uma cepa de HIV-1 NL4-3 3’ SIN LTR.
[0172]Em modalidades particulares, um vetor lentiviral contemplado no presente documento compreende uma cepa NL4-3 5’ LTR do HIV-1, em que a região U3 foi substituída por um promotor de CMV; um sinal de empacotamento de Psi (Ψ); um polinucleotídeo de cerca de 459 nucleotídeos de comprimento codificando uma proteína gag truncada e que compreende um ou mais um ou mais códons ATG mutados; um elemento do trato polipurino central (cPPT)/FLAP da cepa NL4-3 do HIV-1 com cerca de 381 nucleotídeos de comprimento e que compreende um elemento cPPT e uma sequência CTS; um elemento de exportação de RNA HXB3 RRE da cepa HIV-1, uma sequência aceitadora de splice da cepa NL4-3 HIV-1; um sítio hipersensível ao DNAsel HS3 do LCR da β-globina humana de cerca de 847 nucleotídeos de comprimento, um sítio hipersensível ao DNAsel HS3 do LCR da β-globina humana de cerca de 638 nucleotídeos de comprimento e ao promotor da β-globina humana operacionalmente ligado a um cassete de expressão shmiR que compreende uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 1 e um sinal sintético de poli (A); e uma cepa de HIV-1 NL4-3 3’ SIN LTR.
[0173]Em modalidades particulares, um vetor lentiviral contemplado no presente documento compreende uma cepa NL4-3 5’ LTR do HIV-1, em que a região U3 foi substituída por um promotor de CMV; um sinal de empacotamento de Psi (Ψ); um polinucleotídeo de cerca de 459 nucleotídeos de comprimento codificando uma proteína gag truncada e que compreende um ou mais um ou mais códons ATG mutados; um elemento do trato polipurino central (cPPT)/FLAP da cepa NL4-3 do HIV-1 com cerca de 381 nucleotídeos de comprimento e que compreende um elemento cPPT e uma sequência CTS; um elemento de exportação de RNA HXB3 RRE da cepa HIV-1, uma sequência aceitadora de splice da cepa NL4-3 HIV-1; um sítio hipersensível ao DNAsel HS3 do LCR da β-globina humana de cerca de 847 nucleotídeos de comprimento, um sítio hipersensível ao DNAsel HS3 do LCR da β-globina
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42/89 humana de cerca de 638 nucleotídeos de comprimento e ao promotor da β-globina humana operacionalmente ligado a um cassete de expressão shmiR que compreende uma cadeia de guia que hibridiza em a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 e um sinal sintético de poli (A); e uma cepa de HIV-1 NL4-3 3’ SIN LTR.
[0174]Em modalidades preferenciais, a orientação do cassete de expressão shmiR (uma ou mais sequências de controle de expressão operacionalmente ligadas a um sinal shmiR e poli (A)) é oposta à orientação do RNA lentiviral genômico mediado pelo 5’ LTR.
[0175]A produção de partículas virais em larga escala é frequentemente necessária para obter um título viral razoável. As partículas virais são produzidas transfectando um vetor de transferência para uma linha celular de empacotamento que compreende genes estruturais e/ou acessórios virais, por exemplo, genes gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx ou nef ou outros genes virais genes.
[0176]Como usado no presente documento, o termo “vetor de empacotamento” se refere a um vetor de expressão ou vetor viral que não possui um sinal de empacotamento e compreende um polinucleotídeo que codifica um, dois, três, quatro ou mais genes estruturais e/ou acessórios virais. Tipicamente, os vetores de empacotamento são incluídos em uma célula de empacotamento e são introduzidos na célula por transfecção, transdução ou infecção. Os métodos para transfecção, transdução ou infecção são bem conhecidos pelos versados na matéria. Um vetor de transferência lentiviral contemplado em modalidades particulares pode ser introduzido em uma linha celular de empacotamento, via transfecção, transdução ou infecção, para gerar uma célula ou linha celular produtora [0177]As proteínas do envelope viral (env) determinam o intervalo de células hospedeiras que podem finalmente ser infectadas e transformadas por retrovirus recombinantes gerados a partir das linhas celulares. Em uma modalidade preferencial, o lentivírus contemplado no presente documento é pseudotipado com a glico
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43/89 proteína VSV-G. Os termos “pseudótipo” ou “pseudotipagem”, conforme usado no presente documentos, se referem a um vírus cujas proteínas do envelope viral foram substituídas por proteínas de outro vírus com características preferíveis.
[0178]Como usado no presente documento, o termo “linhas celulares de empacotamento” é usado em referência a linhas celulares que não contêm um sinal de empacotamento, mas expressam de maneira estável ou transitória proteínas estruturais virais e enzimas de replicação (por exemplo, gag, pol e env) que são necessárias para o empacotamento correto de partículas virais. Em modalidades particulares, a linha celular adequada pode ser empregada para preparar as células de empacotamento da invenção. Geralmente, as células são células de mamíferos. Em uma modalidade particular, as células usadas para produzir a linha celular de empacotamento são células humanas. As linhas celulares adequadas que podem ser usadas incluem, por exemplo, células CHO, células BHK, células MDCK, células C3H 10T1/2, células FLY, células Psi-2, células BOSC 23, células PA317, células WEHI, células COS, BSC 1 células, células BSC 40, células BMT 10, células VERO, células W138, células MRC5, células A549, células HT1080, 293 células, células 293T, células B-50, células 3T3, células NIH3T3, células HepG2, células Saos-2, Células Huh7, células HeLa, células W163, células 211 e células 211 A. Em modalidades preferenciais, as células de empacotamento são 293 células, células 293T, células 293F ou células A549.
[0179]Como usado no presente documento, o termo “linha celular produtora” se refere a uma linha celular capaz de produzir partículas retrovirais recombinantes, que compreende uma linha celular de empacotamento e um construto de vetor de transferência que compreende um sinal de empacotamento. A produção de partículas virais infecciosas e soluções de estoque virais pode ser realizada usando técnicas convencionais. Os métodos de preparação de soluções de estoque virais são conhecidos na técnica e são ilustrados por, por exemplo, Y. Soneoka et al. (1995)
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Nucl. Acids Res. 23: 628-633 e NR Landau et al. (1992) J. Virol. 66: 5110-5113. Partículas de vírus infecciosas podem ser coletadas das células de empacotamento usando técnicas convencionais. Por exemplo, as partículas infecciosas podem ser coletadas por lise celular ou coleta do sobrenadante da cultura de células, como é conhecido na técnica. Opcionalmente, as partículas de vírus coletadas podem ser purificadas, se desejado. Técnicas de purificação adequadas são bem conhecidas dos versados na técnica, por exemplo, Kutner et al., BMC Biotechnol. 2009; 9: 10. doi: 10. 1186/1472-6750-9-10; Kutner et al. Nat. Protoc. 2009; 4 (4): 495-505. doi: 10. 1038/nprot. 2009. 22.
D. Composições e Formulações [0180]As formulações e composições contempladas no presente documento podem compreender uma combinação de qualquer número de células transduzidas ou não transduzidas ou uma combinação das mesmas, vetores virais, polipeptídeos, polinucleotídeos e um ou mais agentes que aumentam a eficiência da transdução e/ou VCN, por exemplo, poloxâmeros, e agentes que aumentam a sinalização de prostaglandina, conforme descrito no presente documento, formulados em soluções farmaceuticamente aceitáveis ou fisiologicamente aceitáveis (por exemplo, meio de cultura) para administração a uma célula, tecido, órgão ou animal, sozinho ou em combinação com um ou mais outras modalidades de terapia.
[0181]Formulações e composições ex vivo e in vitro particulares contempladas no presente documento podem compreender uma população de células CD34+ humanas, transduzidas com um vetor lentiviral que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um shmiR BCL11 A, formulado em farmaceuticamente aceitável ou soluções fisiologicamente aceitáveis (por exemplo, meio de cultura) para administração a uma célula, tecido, órgão ou animal, isoladamente ou em combinação com uma ou mais outras modalidades de terapia.
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45/89 [0182]Formulações e composições in vivo particulares contempladas no presente documento podem compreender uma combinação de vetores virais e um ou mais agentes que aumentam a eficiência de transdução e/ou VCN, por exemplo, poloxâmeros e agentes que aumentam a sinalização de prostaglandina, conforme descrito no presente documento, formulado em farmaceuticamente aceitável ou soluções fisiologicamente aceitáveis (por exemplo, meio de cultura) para administração a uma célula, tecido, órgão ou animal, isoladamente ou em combinação com uma ou mais modalidades de terapia.
[0183]Em certas modalidades, as composições contempladas no presente documento compreendem uma população de células que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de células-tronco hematopoiéticas ou células progenitoras, por exemplo, células CD34+, transduzidas com um vetor lentiviral que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo codificando um shmiR BCL11A, formulado em conjunto com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis (aditivos) e/ou diluentes (por exemplo, meio de cultura de células farmaceuticamente aceitável).
[0184]Em modalidades particulares, as composições compreendem uma população de células que compreende células-tronco ou progenitoras, um vetor lentiviral que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um shmir BCL11A e um ou mais agentes que aumentam a eficiência da transdução e/ou VCN, por exemplo, poloxâmeros e agentes que aumentam a sinalização de prostaglandina, como no presente documento descrito, formulados em conjunto com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis (aditivos) e/ou diluentes (por exemplo, meio de cultura de células farmaceuticamente aceitável). Em uma modalidade relacionada, a população de células compreende células-tronco hematopoiéticas e célu
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46/89 las progenitoras. Em uma modalidade, a população de células compreende células CD34+. Em uma modalidade, a população de células compreende células CD133+. Em uma modalidade, a população de células são células selecionadas para CD34+.
[0185]Em modalidades preferenciais, a população de células compreende células CD34+ que têm um dos seguintes alelos de β-globina: βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, β°/β+, βΕ/β+, β°/β+, β+/β+, β°/β°, βΕ/βδ, β°/βδ, β°/βδ, β+/β8 ou β8/β8.
[0186]Em modalidades preferenciais, a população de células compreende células CD34+ que têm um dos seguintes alelos de β-globina: βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, βΕ/β+, β°/βΕ, β°/β+, β°/β+ ou β+/β+.
[0187]Em modalidades preferenciais, a população de células compreende células CD34+ que têm um dos seguintes alelos de β-globina: βΕ/β8, β°/βδ, β°/βδ, β+/β8 ou β8/β8.
[0188]As composições farmacêuticas contempladas em modalidades particulares no presente documento compreendem células transduzidas produzidas de acordo com métodos no presente documento descritos e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0189]Em outras modalidades, as composições farmacêuticas compreendem um vetor lentiviral que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um shCLi BCL11A e um ou mais agentes que aumentam a eficiência da transdução e/ou VCN, incluindo, mas não se limitando a, poloxâmeros e agentes que aumentam a sinalização da prostaglandina.
[0190]A expressão “farmaceuticamente aceitável” se refere a entidades e composições moleculares que não produzem uma reação indesejável alérgica ou semelhante quando administradas a um ser humano. Em uma modalidade específica, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia dos EUA ou em
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47/89 outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e, mais particularmente, em seres humanos.
[0191]O termo “carreador” se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual as células terapêuticas são administradas. Exemplos ilustrativos de veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como meios de cultura de células, água e óleos, incluindo aqueles de petróleo, animal, vegetal ou origem sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser empregadas como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados em modalidades particulares incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de silica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o ingrediente ativo, seu uso nas composições terapêuticas é contemplado. Os ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
[0192]Em uma modalidade, uma composição que compreende um veículo é adequada para administração parentérica, por exemplo, administração intravascular (intravenosa ou intra-arterial), intraperitoneal ou intramuscular. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas estéreis, meios de cultura de células ou dispersões. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com as células transduzidas, é contemplado o seu uso nas composições farmacêuticas.
[0193]Em modalidades particulares, as composições contempladas no presente documento compreendem células-tronco hematopoiéticas geneticamente modificadas e/ou células progenitoras e um carreador farmaceuticamente aceitável, por
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48/89 exemplo, meio de cultura de células farmaceuticamente aceitável. Uma composição que compreende uma composição baseada em células contemplada no presente documento pode ser administrada separadamente por métodos de administração entérica ou parentérica ou em combinação com outros compostos adequados para efetuar os objetivos de tratamento desejados [0194]O carreador farmaceuticamente aceitável deve ser de pureza suficientemente alta e de toxicidade suficientemente baixa para torná-lo adequado para administração ao indivíduo humano que está sendo tratado. Além disso, deve manter ou aumentar a estabilidade da composição. O carreador farmaceuticamente aceitável pode ser líquido ou sólido e é selecionado, com o modo de administração planejado em mente, para fornecer o volume desejado, consistência, etc., quando combinado com outros componentes da composição. Por exemplo, o carreador farmaceuticamente aceitável pode ser, sem limitação, um agente de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropilmetilcelulose, etc.), um agente de enchimento (por exemplo, lactose e outros açúcares, celulose microcristalina, pectina, gelatina, cálcio sulfato, etilcelulose, poliacrilatos, hidrogenofosfato de cálcio, etc.), um lubrificante (por exemplo, estearato de magnésio, talco, silica, dióxido de silício coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, óleos vegetais hidrogenados, amido de milho, polietileno glicóis, benzoato de sódio, acetato de sódio, etc.), um desintegrante (por exemplo, amido, glicolato de amido e sódio, etc.) ou um agente umectante (por exemplo, lauril sulfato de sódio, etc.). Outros carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados para as composições contempladas no presente documento incluem, mas não estão limitados a, água, soluções salinas, álcoois, polietileno glicóis, gelatinas, amiloses, estearatos de magnésio, talcos, ácidos silícicos, parafinas viscosas, hidroximetilceluloses, polivinilpirrolidonas e similares.
[0195]Tais soluções carreadoras também podem conter tampões, diluentes
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49/89 e outros aditivos adequados. O termo “tampão”, conforme usado no presente documento, se refere a uma solução ou líquido cuja composição química neutraliza ácidos ou bases sem uma alteração significativa no pH. Exemplos de tampões contemplados no presente documento incluem, entre outros, solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS), solução de Ringer, dextrose a 5% em água (D5W), solução salina normal/fisiológica (NaCI a 0,9%).
[0196]Os carreadores e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis podem estar presentes em quantidades suficientes para manter um pH da composição terapêutica de cerca de 7. Alternativamente, a composição terapêutica tem um pH na faixa de cerca de 6,8 a cerca de 7,4, por exemplo, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 e 7,4. Ainda em outra modalidade, a composição terapêutica tem um pH de cerca de 7,4.
[0197]As composições contempladas no presente documento podem compreender um meio farmaceuticamente aceitável não tóxico. As composições podem ser uma suspensão. O termo “suspensão”, conforme usado neste documento, se refere a condições não aderentes nas quais as células não estão ligadas a um suporte sólido. Por exemplo, as células mantidas como uma suspensão podem ser agitadas ou agitadas e não são aderidas a um suporte, como um prato de cultura.
[0198]Em modalidades particulares, as composições contempladas no presente documento são formuladas em uma suspensão, em que as células-tronco hematopoiéticas e/ou células progenitoras são dispersas dentro de um meio ou solução líquida aceitável, por exemplo, solução salina ou meio sem soro, em uma bolsa intravenosa (IV) ou no gostar. Os diluentes aceitáveis incluem, entre outros, água, PlasmaLyte, solução de Ringer, solução isotônica de cloreto de sódio (solução salina), meio de cultura de células sem soro e meio adequado para armazenamento criogênico, por exemplo, meio Cryostor®.
[0199]Em certas modalidades, um carreador farmaceuticamente aceitável é substancialmente livre de proteínas naturais de origem humana ou animal e ade
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50/89 quado para armazenar uma composição que compreende uma população de células, por exemplo, células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras. A composição terapêutica destina-se a ser administrada a um paciente humano e, portanto, é substancialmente livre de componentes de cultura de células, como albumina de soro bovino, soro de cavalo e soro fetal de bovino.
[0200]Em algumas modalidades, as composições são formuladas em um meio de cultura de células farmaceuticamente aceitável. Tais composições são adequadas para administração a indivíduos humanos. Em modalidades particulares, o meio de cultura de células farmaceuticamente aceitável é um meio isento de soro.
[0201 ]O meio isento de soro tem várias vantagens sobre o meio que contém soro, incluindo uma composição simplificada e melhor definida, um grau reduzido de contaminantes, eliminação de uma fonte potencial de agentes infecciosos e menor custo. Em várias modalidades, o meio isento de soro é isento de animais e pode opcionalmente ser isento de proteínas. Opcionalmente, o meio pode conter proteínas recombinantes biofarmaceuticamente aceitáveis. Meio “isento de animais” se refere ao meio em que os componentes são derivados de fontes não animais. As proteínas recombinantes substituem as proteínas animais nativas em meio isento de animais e os nutrientes são obtidos de fontes sintéticas, vegetais ou microbianas. O meio “sem proteína”, em contraste, é definido como substancialmente livre de proteína.
[0202]Exemplos ilustrativos de meios sem soro usados em composições específicas incluem, mas não estão limitados a, QBSF-60 (Quality Biological, Inc.), StemPro-34 (Life Technologies) e X-VIVO 10.
[0203]Em uma modalidade preferencial, as composições que compreende células estaminais hematopoiéticas e/ou células progenitoras são formuladas em PlasmaLyte.
[0204]Em várias modalidades, composições que compreende células-tronco hematopoiéticas e/ou células progenitoras são formuladas em um meio de criopre
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51/89 servação. Por exemplo, meios de criopreservação com agentes de criopreservação podem ser usados para manter um alto resultado de viabilidade celular após o descongelamento. Exemplos ilustrativos de meios de criopreservação usados em composições específicas incluem, entre outros, CryoStor CS10, CryoStor CS5 e CryoStor CS2.
[0205]Em modalidades particulares, a composição é substancialmente livre de micoplasma, endotoxina e contaminação microbiana. Por “substancialmente livre” em relação à endotoxina, significa que há menos endotoxina por dose de células do que é permitido pelo FDA para um biológico, que é uma endotoxina total de 5 UE/kg de peso corporal por dia, o que, em média, 70 kg de pessoa é 350 UE por dose total de células. Em modalidades particulares, as composições que compreende célulastronco hematopoiéticas ou progenitoras transduzidas com um vetor retroviral contemplado no presente documento contêm cerca de 0,5 UE/ml a cerca de 5,0 UE/ml, ou cerca de 0,5 UE/ml, 1,0 UE/ml, 1,5 UE/ml, 2,0 UE/ml, 2,5 UE/ml, 3,0 UE/ml, 3,5 UE/ml, 4,0 UE/ml, 4,5 UE/ml ou 5,0 UE/ml.
[0206]Em certas modalidades, são contempladas composições e formulações adequadas para a entrega de sistemas de vetores virais (isto é, transdução mediada por vírus) incluindo, mas não se limitando a, vetores retrovirais (por exemplo, lentivirais).
[0207]Formulações exemplificadores para entrega ex vivo também podem incluir o uso de vários agentes de transfecção conhecidos na técnica, como fosfato de cálcio, eletroporação, choque térmico e várias formulações de lipossomas (isto é, transfecção mediada por lipídios). Os lipossomas, como descritos em mais detalhes abaixo, são bicamadas lipídicas que prendem uma fração do fluido aquoso. O DNA associa-se espontaneamente à superfície externa dos lipossomos catiônicos (em virtude de sua carga) e esses lipossomos interagem com a membrana celular.
[0208]Em modalidades particulares, a formulação de excipientes e soluções
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52/89 carreadoras farmaceuticamente aceitáveis é bem conhecida dos versados na técnica, assim como o desenvolvimento de regimes de dosagem e tratamento adequados para o uso das composições particulares descritas no presente documento em uma variedade de regimes de tratamento, incluindo por exemplo, administração e formulação entérica e parentérica, por exemplo, intravascular, intravenosa, intrarterial, intra-óssea e intramedular. Deve ser entendido pelo versado na técnica que modalidades específicas contempladas neste documento podem compreender outras formulações, como aquelas que são bem conhecidas na técnica farmacêutica, e são descritas, por exemplo, em Flemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20â edição. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2005, que é incorporado a título de referência no presente documento, na sua totalidade.
E. Composições de cultura de células [0209]Como discutido no presente documento, em todas as modalidades, composições e métodos contemplados no presente documento são úteis para terapias gênicas baseadas em células ex vivo e in vivo. Em modalidades particulares, as composições podem compreender células em cultura, isto é, uma composição de cultura de células. Uma composição de cultura de células pode compreender uma população de células que compreende células-tronco hematopoiéticas ou progenitoras, um meio de cultura de células adequado, um ou mais poloxâmeros, um ou mais agentes que aumentam a sinalização de prostaglandinas.
[0210]Em modalidades particulares, as células cultivadas são células-tronco hematopoiéticas ou progenitoras ou células CD34+ transduzidas com um vetor lentiviral que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um shmiR BCL11A, em que as células têm os seguintes alelos β-globina : βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, β°/β+, βΕ/β+, β°/β+, β+/β+, β°/β°’ β e/s β, β°/ρ S’ β°/β8’ β+/β8 ou β8/β8.
[0211]Em modalidades particulares, as células cultivadas são células-tronco
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53/89 hematopoiéticas ou progenitoras ou células CD34+ transduzidas com um vetor lentiviral que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um shmiR BCL11A, em que as células têm os seguintes alelos β-globina : βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, βΕ/β+, β°/βΕ, β°/β+, β°/β+ ou β+/β+.
[0212]Em modalidades particulares, as células cultivadas são células-tronco hematopoiéticas ou progenitoras ou células CD34+ transduzidas com um vetor lentiviral que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um shmiR BCL11 A, em que as células têm os seguintes alelos β-globina : β e/s β, β°/ρ s’ β°/β8’ β+/β8 ou β8/β8.
[0213]Em uma modalidade, uma composição de cultura de células compreende uma população de células que compreende células-tronco hematopoiéticas ou progenitoras, um meio de cultura de células adequado para administração humana, células transduzidas com um vetor lentiviral que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um shmiR BCL11A, um poloxâmero e um agente que aumenta a sinalização da prostaglandina.
[0214]Em algumas modalidades, o meio de cultura de células é um meio de cultura de células farmaceuticamente aceitável.
[0215]As composições de cultura de células contempladas no presente documento, que compreendem células-tronco hematopoiéticas ou progenitoras transduzidas, podem ser administradas sistemicamente ou por injeção direcionada a um indivíduo em necessidade, a fim de efetuar a terapia gênica desejada.
F. Métodos de Transdução [0216]As composições e métodos contemplados no presente documento em modalidades particulares aumentam o VCN e transduzem significativamente mais
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54/89 células com significativamente menos vírus, minimizando assim o risco de alteração genômica e/ou ativação de inserção de proto-oncogenes no genoma da célula terapêutica, enquanto simultaneamente aumenta a eficácia terapêutica do medicamento produzido. Dessa forma, as composições e métodos contemplados no presente documento não apenas levam à produção de uma terapia genética mais segura, mas a um medicamento mais robusto e terapeuticamente eficaz.
[0217]A entrega de um gene(s) ou outras sequências polinucleotídicas com o uso de um vetor lentiviral por meio de infecção viral em vez de transfecção é referida como transdução. Em uma modalidade, os vetores lentivirais são transduzidos para uma célula através da integração de infecção e provírus. Em certas modalidades, uma célula, por exemplo, uma célula-alvo, é transduzida se compreender um gene ou outra sequência polinucleotídica entregue à célula por infecção com o uso de um vetor lentiviral. Em modalidades particulares, uma célula transduzida compreende um ou mais genes ou outras sequências polinucleotídicas entregues por um vetor lentiviral em seu genoma celular.
[0218]Em modalidades particulares, células hospedeiras ou células-alvo transduzidas com um vetor viral são administradas a um indivíduo para tratar e/ou prevenir uma hemoglobinopatia ou pelo menos um sintoma de uma hemoglobinopatia.
[0219]A produção de partículas virais infecciosas e soluções de estoque virais pode ser realizada usando técnicas convencionais. Os métodos de preparação de soluções de estoque virais são conhecidos na técnica e são ilustrados por, por exemplo, Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23: 628-633 e NR Landau et al. (1992) J. Virol. 66: 5110-5113.
[0220]Em modalidades particulares, partículas virais baseadas em HIV tipo 1 (HIV-1) podem ser geradas co-expressando os elementos de empacotamento de virion e o vetor de transferência em uma célula produtora. Estas células podem ser
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55/89 transfectadas transitoriamente com um número de plasmídeos. Tipicamente, são utilizados de três a cinco plasmídeos, mas o número pode ser maior dependendo do grau em que os componentes lentivirais são divididos em unidades separadas. Por exemplo, um plasmídeo pode codificar o núcleo e os componentes enzimáticos do virião, derivados do HIV-1. Este plasmídeo é denominado plasmídeo de empacotamento. Outro plasmídeo codifica tipicamente a(s) proteína(s) do envelope, mais comumente a proteína G do vírus da estomatite vesicular (VSV G) devido à sua alta estabilidade e amplo tropismo. Este plasmídeo pode ser denominado plasmídeo de expressão em envelope. Ainda outro plasmídeo codifica o genoma a ser transferido para a célula-alvo, ou seja, o próprio vetor e é chamado vetor de transferência. Os plasmídeos de empacotamento podem ser introduzidos nas linhas celulares humanas por técnicas conhecidas, incluindo transfecção com fosfato de cálcio, lipofecção ou eletroporação. Vírus recombinantes com títulos de vários milhões de unidades de transdução por mililitro (TU/ml) podem ser gerados por essa técnica e suas variantes. Após a ultracentrifugação, podem ser obtidos estoques concentrados de cerca de 108 TU/ml, 109 TU/ml, 1010 TU/ml, 1011 TU/ml, 1012 TU/ml ou cerca de 1013 TU/ml.
[0221]Partículas de vírus infecciosas podem ser coletadas das células de empacotamento usando técnicas convencionais. Por exemplo, as partículas infecciosas podem ser coletadas por lise celular, ou coleta do sobrenadante da cultura de células, como é conhecido na técnica. Opcionalmente, as partículas de vírus coletadas podem ser purificadas, se desejado. Técnicas de purificação adequadas são bem conhecidas dos versados na técnica, por exemplo, Kutner et al., BMC Biotechnol. 2009; 9:10. doi: 10.1186/1472-6750-9-10; Kutner et al. Nat. Protoc. 2009; 4 (4): 495-505. doi: 10. 1038/nprot. 2009. 22.
[0222]Os vírus podem ser utilizados para infectar células in vivo, ex vivo ou in vitro com o uso de técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, quando células, por exemplo, células sanguíneas periféricas mobilizadas, células da medula
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56/89 óssea, células CD34+ ou células-tronco ou progenitoras hematopoiéticas são transduzidas ex vivo, as partículas de vetor podem ser incubadas com as células usando uma dose geralmente na ordem entre 1 a 50 multiplicidades de infecção (MOI) que também corresponde a 1 x 105 a 50 x 105 unidades transdutoras do vetor viral por 105 células. Isso, é claro, inclui uma quantidade de vetor correspondente a 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 e 50 MOI e todos os valores inteiros no meio.
[0223]Os vírus também podem ser entregues a um indivíduo in vivo, por injeção direta na célula, tecido ou órgão que necessita de terapia. A injeção direta requer da ordem de 1 a 100 multiplicidades de infecção (MOI), que também corresponde a 1 x 105 a 100 x 105 unidades de transdução do vetor viral por 105 células. Isso, é claro, inclui uma quantidade de vetor correspondente a 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 50, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 e 100 MOI e todos os valores inteiros no meio.
[0224]Os vírus também podem ser entregues de acordo com o título viral (TU/ml), que pode ser medido, por exemplo, com o uso de um ensaio de título p24 disponível no mercado, que é um ELISA contra a proteína de revestimento viral p24. A fórmula a seguir pode ser usada para calcular a pg/ml de p24: existem aproximadamente 2000 moléculas de p24 por partícula física (PP) de lentivírus: (2 x 103) x (24 x 103 Da de p24 por PP), 48 x 106/Avogadro = (48 x 106)/(6 x 1023) = 8 x 10’17 g de p24 por PP, aproximadamente 1 PP por 1 x 10’16 g de p24, 1 x 104 PP por pg de p24. Um vetor lentiviral pseudotipado VSV-G razoavelmente bem embalado terá um índice de infecciosidade na faixa de 1 TU por 1000 partículas físicas (PP) a 1 TU por 100 PP (ou menos). Dessa forma, o intervalo é de aproximadamente 10 a 100 TU/pg de p24. É através dessa conversão que TU/ml é obtido.
[0225]Com base na experiência anterior, a quantidade de lentivírus injetado diretamente é determinada pela TU total e pode variar com base no volume que po
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57/89 de ser injetado de maneira viável no sítio e no tipo de tecido a ser injetado. Por exemplo, um sítio de injeção de medula óssea pode permitir apenas a injeção de um volume muito pequeno de vírus; portanto, uma preparação de título elevado seria preferível, uma UT de cerca de 1 x 106 a 1 x 107, cerca de 1 x 106 para 1 x 108, 1 x 106 a 1 x 109, cerca de 1 x 107 a 1 x 1O10, 1 x 108 a 1 x 1011, cerca de 1 x 108 a 1 x 1012 ou aproximadamente 1 x 1O10 a 1 x 1012 ou mais por injeção pode ser usado. No entanto, uma entrega sistêmica pode acomodar uma UT muito maior, uma carga de 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1O10, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013, 1 x 1014, ou 1 x 1015, pode ser entregue.
[0226]As composições e métodos contemplados no presente documento fornecem alta eficiência de transdução e VCN de células hematopoiéticas in vitro, ex vivo e in vivo, usando títulos virais mais baixos do que os revelados acima para alcançar eficiências de transdução comparáveis na ausência das composições e métodos no presente documento fornecidos.
[0227]Certas modalidades contempladas neste documento surgem da descoberta inesperada de que arquiteturas particulares de vetores lentivirais em comparação com arquiteturas lentivirais existentes na técnica resultam em maior eficiência de transdução e/ou VCNs em células hematopoiéticas, in vitro, ex vivo ou in vivo, quando as células são transduzido na presença dos vetores lentivirais contemplados em modalidades particulares deste documento e um poloxâmero e um ou mais agentes que estimulam a via de sinalização do receptor de prostaglandina EP (consulte, por exemplo, os documentos WO 2007/112084 e WO2010/108028).
[0228]Em modalidades particulares, a eficiência da transdução é aumentada em uma população de células que compreende células-tronco hematopoiéticas ou células progenitoras cultivando as células na presença de um vetor lentiviral contemplado neste documento que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que
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58/89 codifica um shmiR BCL11A na presença de um poloxâmero e um ou mais agentes que estimulam a via de sinalização do receptor de prostaglandina EP. Como usado no presente documento, o termo “poloxâmero” se refere a um copolímero tribloco não iônico composto por uma cadeia hidrofóbica central de polioxipropileno flanqueada por duas cadeias hidrofílicas de polioxietileno. Os poloxâmeros também são conhecidos pelo nome comercial de “Pluronics” ou “Synperonics” (BASF). O copolímero em bloco pode ser representado pela seguinte fórmula: HO(C2H40)x(C3H60)y(C2H40)zH.
[0229]Os comprimentos dos blocos de polímero podem ser personalizados; como resultado, existem muitos poloxâmeros diferentes. Poloxâmeros adequados para uso em modalidades particulares têm um peso molecular médio de pelo menos cerca de 10 kDa, pelo menos cerca de 11,4 kDa, pelo menos cerca de 12,6 kDa, pelo menos cerca de 13 kDa, pelo menos cerca de 14,6 kDa ou pelo menos cerca de 15 kDa. Em modalidades particulares, y pode estar na faixa de cerca de 39 a cerca de 70.
[0230]Como a síntese de copolímeros em bloco não pode ser precisa, os valores acima mencionados podem não ser exatamente alcançáveis após a síntese e o valor médio será diferente até certo ponto. Dessa forma, o termo “poloxâmero”, conforme usado no presente documento, pode ser usado de forma intercambiável com o termo “poloxâmeros” (representando uma entidade de vários poloxâmeros, também denominada mistura de poloxâmeros), se não explicitamente indicado de outra forma. O termo “média” em relação ao número de unidades de monômero ou peso molecular de (a) poloxâmero(s), conforme usado no presente documento, é uma consequência da incapacidade técnica de produzir poloxâmeros, todos com a mesma composição e, portanto, o mesmo peso molecular. Os poloxâmeros produzidos de acordo com os métodos mais avançados estarão presentes como uma mistura de poloxâmeros, cada um mostrando uma variabilidade em relação ao seu peso mole
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59/89 cular, mas a mistura como um todo calculando a média do peso molecular especificado no presente documento. BASF e Sigma Aldrich são fontes adequadas de poloxâmeros para uso em modalidades particulares contempladas no presente documento.
[0231 ]Em uma modalidade, um poloxâmero adequado para uso em modalidades particulares contempladas no presente documento é selecionado do grupo que consiste em: poloxâmero 288, poloxâmero 335, poloxâmero 338 e poloxâmero 407.
[0232]Em uma modalidade, o poloxâmero é poloxâmero 288.
[0233]Em uma modalidade, o poloxâmero é poloxâmero 335.
[0234]Em uma modalidade, o poloxâmero é poloxâmero 338.
[0235]Em uma modalidade, o poloxâmero é poloxâmero 407.
[0236]Em uma modalidade, o poloxâmero 288 (F98;
HO(C2H40)x(C3H60)y(C2H40)zH; x+y = 236,36, z=44,83; peso molecular médio de 13 kDa) é usado para aumentar a eficiência da transdução e/ou VCN em uma população de células hematopoiéticas que compreende células-tronco hematopoiéticas ou células progenitoras. O F98 pode ser usado sozinho ou em combinação com um agente que estimula a via de sinalização do receptor de prostaglandina EP ou estaurosporina para aumentar a eficiência da transdução e/ou VCN.
[0237]Em uma modalidade, o poloxâmero 335 (P105;
HO(C2H40)x(C3H60)y(C2H40)zH; x+y = 73,86, z=56,03; peso molecular médio de 6,5 kDa) é usado para aumentar a eficiência da transdução e/ou VCN em uma população de células hematopoiéticas que compreende células-tronco hematopoiéticas ou células progenitoras. Ο P105 pode ser usado sozinho ou em combinação com um agente que estimula a via de sinalização do receptor da prostaglandina EP ou estaurosporina para aumentar a eficiência da transdução e/ou VCN.
[0238]Em uma modalidade, o poloxâmero 338 (F108;
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HO(C2H40)x(C3H60)y(C2H40)zH; x+y = 265,45, z=50,34; peso molecular médio de
14.6 kDa) é usado para aumentar a eficiência da transdução e/ou VCN em uma população de células hematopoiéticas que compreende células-tronco hematopoiéticas ou células progenitoras. O F108 pode ser usado sozinho ou em combinação com um agente que estimula a via de sinalização do receptor da prostaglandina EP ou estaurosporina para aumentar a eficiência da transdução e/ou VCN.
[0239]Em uma modalidade, o poloxâmero 407 (F127;
HO(C2H40)x(C3H60)y(C2H40)zH; x+y = 200,45, z=65,17; peso molecular médio de
12.6 kDa) é usado para aumentar a eficiência da transdução e/ou VCN em uma população de células hematopoiéticas que compreende células-tronco hematopoiéticas ou células progenitoras. O F127 pode ser usado sozinho ou em combinação com um agente que estimula a via de sinalização do receptor da prostaglandina EP ou estaurosporina para aumentar a eficiência da transdução e/ou VCN.
[0240]As concentrações finais ilustrativas de poloxâmero usadas para células hematopoiéticas transduzidas incluem, entre outras, 10 pg/ml a cerca de 5000 pg/ml, cerca de 10 pg/ml a cerca de 2500 pg/ml, cerca de 10 pg/ml a cerca de 1000 pg/ml, cerca de 50 pg/ml a cerca de 1000 pg/ml, cerca de 100 pg/ml a cerca de 1000 pg/ml, cerca de 200 pg/ml a cerca de 1000 pg/ml, cerca de 200 pg/ml a cerca de 500 pg/ml, ou cerca de 10 pg/ml, cerca de 20 pg/ml, cerca de 30 pg/ml, cerca de 40 pg/ml, cerca de 50 pg/ml, cerca de 60 pg/ml, cerca de 60 pg/ml, cerca de 70 pg/ml, cerca de 80 pg/ml, cerca de 90 pg/ml, cerca de 100 pg/ml, cerca de 200 pg/ml, cerca de 300 pg/ml, cerca de 400 pg/ml, cerca de 500 pg/ml, cerca de 500 pg/ml, cerca de 600 pg/ml, cerca de 700 pg/ml, cerca de 700 pg/ml, cerca de 800 pg/ml, cerca de 900 pg/ml, cerca de 1000 pg/ml, cerca de 1250 pg/ml, cerca de 1500 pg/ml, cerca de 1750 pg/ml, cerca de 1750 pg/ml, cerca de 2000 pg/ml, cerca de 2500 pg/ml ou cerca de 5000 pg/ml, ou cerca de 5000 pg/ml ou mais e qualquer concentração intermediária dos mesmos.
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61/89 [0241]Surpreendentemente, os presentes inventores descobriram que a eficiência de transdução e/ou VCN de populações de células que compreende célulastronco hematopoiéticas e células progenitoras com um vetor lentiviral contemplado no presente documento que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um shmiR BCL11A pode ser aumentada pela transdução das células na presença de um poloxâmero e um ou mais agentes que estimulam a via de sinalização do receptor da prostaglandina EP.
[0242]Como usado no presente documento, os termos “estimular a sinalização do receptor da prostaglandina EP”, “ativar a sinalização do receptor da prostaglandina EP” ou “aumentar a sinalização do receptor da prostaglandina EP” geralmente se refere à capacidade de um agente para aumentar a atividade de sinalização celular a jusante de um receptor de prostaglandina EP na célula em contato com um ou mais agentes em comparação com a atividade de sinalização celular a jusante do receptor de prostaglandina EP na ausência de um ou mais agentes. Os agentes que estimulam a sinalização do receptor de prostaglandina EP incluem, mas não estão limitados a moléculas pequenas, ou aos compostos revelados nos documentos WO 2007/112084 e WO2010/108028, cada um dos quais está incorporado no presente documento a título de referência na sua totalidade. Os ensaios que podem ser utilizados para medir a ativação ou estimulação da via de sinalização do receptor da prostaglandina EP são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, no documento WO2010/108028, que está incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0243]Exemplos ilustrativos de agentes que estimulam a via de sinalização do receptor da prostaglandina EP incluem, mas não estão limitados a, moléculas pequenas, por exemplo, moléculas orgânicas pequenas, prostaglandinas, agonistas da via Wnt, agonistas da via CAMP/PI3K/AKT, agonistas da via do segundo mensa
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62/89 geiro Ca 2+, agonistas da sinalização de óxido nítrico (NO)/angiotensina e outros compostos conhecidos por estimular a via de sinalização da prostaglandina selecionada do grupo que consiste em: mebeverina, flurandrenolida, atenolol, pindolol, gaboxadol, ácido cinurênico, hidralazina, tiabendazol, pericolilida, vesâmico, Imipramina, Clorpropamida, 1,5-Pentametilenotetrazol, 4-Aminopiridina, Diazóxido, Benfotiamina, ácido 12-metoxidodecenoico, N-Formil-Met-Leu-Phe, Galiamina, IAA 94, Clorotrianiseno e derivados desses compostos.
[0244]Em modalidades particulares, o agente que estimula a via da prostaglandina é uma molécula ou polipeptídeo químico natural ou sintético que se liga e/ou interage com um receptor EP, normalmente para ativar ou aumentar uma ou mais das vias de sinalização a jusante associadas a um receptor de prostaglandina EP.
[0245]Em uma modalidade, o agente que estimula a via da prostaglandina é selecionado do grupo que consiste em: PGA2; PGB2; PGD2; PGE1 (alprostadil); PGE2; PGF2; PGI2 (epoprostenol); PGH2; PGJ2; e derivados e análogos dos mesmos.
[0246]Agentes ilustrativos adicionais que estimulam a via de prostaglandina incluem, mas não estão limitados a 15d-PGJ2; deitai 2-PGJ2; Ácido 2hidroxiheptadecatrienoico (HHT); Tromboxano (TXA2 e TXB2); Análogos da PGI2, por exemplo, lloprost e Treprostinil; Análogos de PGF2, por exemplo, Travoprost, Carboprost trometamina, Tafluprost, Latanoprost, Bimatoprost, Unoprostone isopropil, Cloprostenol, Oestrophan e Superphan; Análogos de PGE1, por exemplo, 11-desoxi PGE1, Misoprostol e Butaprost; e álcool Corey-A [[3aa, 4α, 5β, 6aa]-(-)-[Hexa-hidro-
4-(hidroximetil)-2-oxo-2H-ciclopenta/b/furan-5-il] [1,1 '-bifenil]-4-carboxilato]; álcool Corey-B [2H-Ciclopenta [b] furan-2-on, 5-(benzoiloxi) hexa-hidro-4-(hidroximetil) [3aR-(3aa,4a,5p,6aa)]]; e Corey diol ((3aR,4S,5R,6aS)-hexahidro-5-hidroxi-4(hidroximetil)-2H-ciclopenta [b] furan-2-ona).
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63/89 [0247]Em uma modalidade, o agente é um ligando do receptor de prostaglandina EP, incluindo, mas não limitado a, prostaglandina E2 (PGE2), bem como “análogos” ou “derivados” dos mesmos.
[0248]Exemplos ilustrativos de “análogos” ou “derivados” de PGE2 incluem, mas não estão limitados a, 16,16-dimetil PGE2, 16-16 dimetil PGE2 éster de p-(pacetamidobenzamido) fenil, 11-desoxi-16,16-dimetil PGE2, 9-desoxi-9-metileno-16,
16-dimetil PGE2, 9-desoxi-9-metileno PGE2, 9-ceto Fluprostenol, 5-trans PGE2, 17fenil-ômega-trinor PGE2, PGE2 serinol amida, éster metílico de PGE2, 16-fenil tetranor PGE2, 15 (S)-15-metil PGE2, 15 (R)-15-metil PGE2, 8-iso-15-ceto PGE2, 8-iso PGE2 éster isopropílico, 20-hidroxi PGE2, nocloprost, sulprostona, butaprost, 15-ceto PGE2 e 19 (R) hidroxi PGE2.
[0249]Em uma modalidade específica, um método para melhorar a eficiência da transdução compreende cultivar uma população de células com um vetor lentiviral contemplado neste documento que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um shCLi de BCL11A e um poloxâmero e um ou mais agentes que são ligantes de um receptor de prostaglandina EP selecionado do grupo que consiste em: PGE2, 16,16-dimetil PGE2, 16-16 dimetil PGE2 éster de p- (pacetamidobenzamido) fenil, 11-desoxi-16,16-dimetil PGE2, 9-desoxi-9-metileno-16, 16-dimetil PGE2, 9-desoxi-9-metileno PGE2, 9-ceto Fluprostenol, 5-trans PGE2, 17fenil-ômega-trinor PGE2, PGE2 serinol amida, PGE2 éster metílico, 16-fenil tetranor PGE2, 15(S)-15-metil PGE2, 15(R)-15-metil PGE2, 8-iso-15-ceto PGE2, 8 -iso PGE2 éster de isopropil, 20-hidroxi PGE2, nocloprost, sulprostona, butaprost, 15-ceto-PGE2, e 19(R) hidroxi PGE2.
[0250]Em modalidades particulares, 0 agente que estimula uma via do receptor de prostaglandina EP é PGE2 ou 16,16-dimetil PGE2.
[0251 ]Em uma modalidade, 0 agente que estimula a via do receptor da pros
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64/89 taglandina EP é PGE2.
[0252]Em várias modalidades, uma população de células é transduzida na presença de um vetor lentiviral contemplado neste documento que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um BCL11A shmiR, um poloxâmero selecionado do grupo que consiste em: poloxâmero 288, poloxâmero 335, poloxâmero 338 e poloxâmero 407, e um ou mais agentes que são ligantes de um receptor de prostaglandina EP selecionado do grupo que consiste em: PGE2, 16,16-dimetil PGE2, 16-16 dimetil PGE2 p- (éster de p-acetamidobenzamido) fenil, 11-desoxi16,16-dimetil PGE2, 9-desoxi-9-metileno-16, 16-dimetil PGE2, 9-desoxi-9-metileno PGE2, 9-ceto Fluprostenol, PGE2 5-trans, 17-fenil-ômega-trinor PGE2, PGE2 serinol amida, éster metílico de PGE2, 16-fenil tetranor PGE2, 15(S)-15-metil PGE2, 15(R)15 -metil PGE2, 8-iso-15-ceto PGE2, 8-iso PGE2 éster isopropílico, 20-hidroxi PGE2, nocloprost, sulprostona, butaprost, 15-ceto PGE2 e 19 (R) hidróxi PGE2.
[0253]As concentrações ilustrativas de agonistas da via de sinalização do receptor EP da prostaglandina final usadas para células hematopoiéticas transduzidas incluem, mas não estão limitadas a, aproximadamente 10 μΜ a cerca de 200 μΜ, cerca de 10 μΜ a cerca de 100 μΜ, cerca de 50 μΜ a cerca de 100 μΜ ou cerca de 10 μΜ, cerca de 20 μΜ, cerca de 30 μΜ, cerca de 40 μΜ, cerca de 50 μΜ, cerca de 60 μΜ, cerca de 70 μΜ, cerca de 80 μΜ, cerca de 90 μΜ ou cerca de 100 μΜ ou mais, e qualquer concentração intermediária dos mesmos.
[0254]Em várias modalidades, uma população de células é transduzida na presença de um vetor lentiviral contemplado neste documento que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um BCL11A shmiR, um poloxâmero selecionado do grupo que consiste em: poloxâmero 288, poloxâmero 335, poloxâmero 338, e poloxâmero 407, e de PGE2.
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65/89 [0255]Em várias modalidades, uma população de células é transduzida na presença de um vetor lentiviral contemplado neste documento que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um BCL11A shmiR, um poloxâmero selecionado do grupo que consiste em: poloxâmero 288, poloxâmero 335, poloxâmero 338 e poloxâmero 407 e 16,16-dimetil PGE2 [0256]Em modalidades particulares, as células hematopoiéticas podem ser cultivadas na presença de um lentivírus podem ser expostas a (contatadas com) um poloxâmero e um ou mais agentes que estimulam a via de sinalização do receptor de prostaglandina EP, por um período de duração de cerca de 10 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, aproximadamente 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas, cerca de 24 horas, cerca de 48 horas ou cer ca de 72 horas ou qualquer período intermediário.
[0257]Em várias modalidades, as arquiteturas, composições e métodos de vetores lentivirais contemplados no presente documento aumentam a eficiência da transdução para pelo menos cerca de 30% cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ( , pelo menos cerca de 40%, pelo menos pelo menos cerca de 65%, pelo menos pelo menos cerca de 80%, pelo menos pelo menos cerca de 91%, pelo menos pelo menos cerca de 94 %, pelo menos pelo menos cerca de 97%, pelo menos du pelo menos cerca de 100%, incluindo quaisquer porcentagens intervenientes.
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66/89 [0258]Em várias modalidades, as arquiteturas de vetores lentivirais, as composições e métodos contemplados no presente documento aumentam o VCN médio para pelo menos cerca de 0,5 a pelo menos cerca de 5,0, pelo menos cerca de 0,5 a pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 0,5 a pelo menos cerca de 1,0, em pelo menos cerca de 1,0 a pelo menos cerca de 5,0, pelo menos cerca de 1,0 a pelo menos cerca de 3,0 ou pelo menos cerca de 0,5, pelo menos cerca de 1,0, pelo menos cerca de 1,5, pelo menos cerca de 1,5, pelo menos cerca de 2,0, pelo menos cerca de 2,5, pelo menos cerca de 3,0, pelo menos cerca de 3,5, pelo menos cerca de 4,0, pelo menos cerca de 4,5 ou pelo menos cerca de 5,0.
[0259]Em várias modalidades, células hematopoiéticas transduzidas com as arquiteturas de vetores lentivirais, as composições e métodos contemplados no pre sente documento têm uma pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 94%, eficiência de transdução de pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99 %, ou pelo menos cerca de 100% e um VCN médio de pelo menos cerca de 0,5, pelo me nos cerca de 1,0, pelo menos cerca de 1,5, pelo menos cerca de 2,0 ou pelo menos cerca de 2,5.
[0260]Certas modalidades contemplam isolamento e transdução de uma população de células. Como usado no presente documento, o termo “população de células” se refere a uma pluralidade de células que podem ser constituídas por qualquer número e/ou combinação de tipos de células homogêneas ou heterogêneas, conforme descrito em outras partes deste documento. Por exemplo, para a transdução de células-tronco hematopoiéticas ou progenitoras, uma população de células pode ser isolada ou obtida a partir de sangue do cordão umbilical, sangue placentário, medula óssea ou sangue periférico. Uma população de células pode compreen
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67/89 der cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou cerca de 100% da célulaalvo tipo a ser transduzido. Em certas modalidades, células-tronco hematopoiéticas ou progenitoras podem ser isoladas ou purificadas a partir de uma população de células heterogêneas usando métodos conhecidos na técnica.
[0261 ]Os tipos de células-alvo preferidos transduzidos com as composições e métodos contemplados no presente documento incluem células hematopoiéticas, por exemplo, células hematopoiéticas humanas.
[0262]Fontes ilustrativas para obter células hematopoiéticas transduzidas com os métodos e composições contemplados no presente documento incluem, mas não estão limitadas a: sangue do cordão umbilical, medula óssea ou sangue periférico mobilizado.
[0263]Exemplos ilustrativos de células hematopoiéticas incluem células CD34+. O termo “célula CD34+”, conforme usado no presente documento, se refere a uma célula que expressa a proteína CD34 em sua superfície celular. “CD34”, como usado no presente documento, se refere a uma glicoproteína da superfície celular (por exemplo, proteína de sialomucina) que muitas vezes atua como um fator de adesão célula-célula. CD34+ é um marcador de superfície celular de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras.
[0264]Exemplos ilustrativos adicionais de células-tronco hematopoiéticas ou progenitoras incluem células hematopoiéticas CD34+CD38LoCD90+CD45RA·, células hematopoiéticas CD34+, CD59+, Thy1/CD90+, CD38Lo/’, C-kit/CD117+ e Lin() e células hematopoiéticas CD133+.
[0265]Em modalidades particulares, as células CD34+ que são transduzidas com um vetor lentiviral que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um shCLi de BCL11A e as composições contempladas no presente documento
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68/89 têm os seguintes alelos de β-globina: βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, β°/β+, βΕ/β+, β°/β+, β+/β+, β°/β°, βΕ/β8’ β°/ρ S’ β°/β8’ β+/β8 ou β8/β8.
[0266]Em modalidades particulares, as células CD34+ que são transduzidas com um vetor lentiviral que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um shCLi de BCL11A e as composições contempladas no presente documento têm os seguintes alelos de β-globina: βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, βΕ/β+, β°/βΕ, β°/β+, β°/β+ ou β+/β+.
[0267]Em modalidades particulares, as células CD34+ que são transduzidas com um vetor lentiviral que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um shCLi de BCL11A e as composições contempladas no presente documento têm os seguintes alelos de β-globina: βΕ/β8, β°/ρ s’ β°/β8’ β+/β8 ou β8/β8.
G. MÉTODOS DE TERAPIA GÊNICA [0268]Medicamentos que compreende uma proporção maior de células hematopoiéticas que compreende um vetor lentiviral que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um shCLi de BCL11A, em que o número de cópias vetoriais de cada célula também é mais alto fornece um terapias gênicas mais terapeuticamente eficazes. Como usado no presente documento, o termo “medicamento” se refere a células geneticamente modificadas produzidas usando as composições e métodos contemplados no presente documento. Em modalidades particulares, o medicamento compreende células-tronco hematopoiéticas ou progenitoras geneticamente modificadas, por exemplo, células CD34+. Sem desejar ater-se a nenhuma teoria em particular, aumentar a quantidade de uma terapêutica em um medicamento pode permitir o tratamento de indivíduos sem expressão mínima ou mínima do gene correspondente in vivo, expandindo significativamente a oportunidade
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69/89 de levar terapia genética a indivíduos para os quais a terapia gênica não era anteriormente uma opção viável de tratamento.
[0269]As células transduzidas e os vetores lentivirais correspondentes contemplados no presente documento fornecem métodos aprimorados de terapia gênica. Tal como usado no presente documento, o termo “terapia de genes” se refere à introdução de um gene em um genoma da célula. Em várias modalidades, um vetor lentiviral que compreende uma ou mais sequências de controle de expressão de células eritroides operativamente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um BCL11A shmiR que fornece benefícios curativos, preventivos ou melhoramentos a um indivíduo diagnosticado com ou com suspeita de ter uma condição de hemoglobinopatia ou hemoglobinopatia.
[0270]Conforme usado no presente documento, os termos “hemoglobinopatia” ou “condição hemoglobinopática” se referem a um grupo diversificado de distúrbios hereditários do sangue que envolvem a presença de moléculas anormais de hemoglobina resultantes de alterações na estrutura e/ou síntese da hemoglobina. Normalmente, a hemoglobina consiste em quatro subunidades de proteínas: duas subunidades de β-globina e duas subunidades de α-globina. Cada uma dessas subunidades proteicas é conectada (ligada) a uma molécula contendo ferro chamada heme; cada heme contém uma molécula de ferro em seu centro que pode se ligar a uma molécula de oxigênio. A hemoglobina nos glóbulos vermelhos liga-se às moléculas de oxigênio nos pulmões. Essas células, então, viajam pela corrente sanguínea e entregam oxigênio aos tecidos por todo o corpo.
[0271]Hemoglobina A (HbA) é a designação para a hemoglobina normal que existe após o nascimento. A hemoglobina A é um tetrâmero com duas cadeias alfa e duas cadeias beta (αζβζ). A hemoglobina A2 é um componente menor da hemoglobina encontrada nos eritrócitos após o nascimento e consiste em duas cadeias alfa e duas cadeias delta (0262). A hemoglobina A2 geralmente compreende menos de 3%
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70/89 da hemoglobina total de hemácias. A hemoglobina F é a hemoglobina predominante durante o desenvolvimento fetal. A molécula é um tetrâmero de duas cadeias alfa e duas cadeias gama (0272).
[0272]As hemoglobinopatias mais comuns incluem doença falciforme, βtalassemia e a-talassemia.
[0273]Em modalidades particulares, as composições e métodos contemplados no presente documento fornecem terapia gênica para indivíduos com uma doença falciforme. O termo “anemia das células falciformes” ou “doença das células falciformes” é no presente documento definido para incluir qualquer condição anêmica sintomática resultante da falcização de glóbulos vermelhos. A anemia falciforme β8/β3, uma forma comum de doença falciforme (SCD), é causada pela hemoglobina S (HbS). A HbS é gerada pela substituição do ácido glutâmico (E) pela valina (V) na posição 6 na β-globina, anotada como Glu6Val ou E6V. Substituir 0 ácido glutâmico por valina faz com que as subunidades anormais da HbS se juntem e formem moléculas longas e rígidas que dobram os glóbulos vermelhos em forma de foice (crescente). As células em forma de foice morrem prematuramente, 0 que pode levar à falta de glóbulos vermelhos (anemia). Além disso, as células em forma de foice são rígidas e podem bloquear pequenos vasos sanguíneos, causando dor intensa e danos aos órgãos. Sem desejar se vincular a qualquer teoria em particular, os vetores lentivirais contemplados no presente documento reduzem ou eliminam a expressão de BCL11A nas células eritroides e resultam na reativação ou desrepressão da expressão do gene da γ-globina e na diminuição da expressão do gene da βδ^ΙοΡίη3, aumentando assim a expressão de HbF para tratar e/ou melhorar efetivamente um ou mais sintomas associados a indivíduos com hemoglobinopatia.
[0274]Mutações adicionais na /3-globina O gene também pode causar outras anormalidades na β-globina, levando a outros tipos de doença falciforme. Essas formas anormais de β-globina são frequentemente designadas por letras do alfabeto
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71/89 ou, às vezes, por um nome. Nesses outros tipos de doença falciforme, uma subunidade β-globina é substituída por HbS e a outra subunidade β-globina é substituída por uma variante anormal diferente, como a hemoglobina C (HbC; alelo β-globina anotada como β°) ou hemoglobina E (HbE; alelo β-globina anotada como βΕ).
[0275]Na doença da hemoglobina SC (HbSC), as subunidades da β-globina são substituídas por HbS e HbC. A HbC resulta de uma mutação no gene da βglobina e é a hemoglobina predominante encontrada em pessoas com doença da HbC (α2β°2). A HbC ocorre quando o aminoácido lisina substitui o aminoácido glutâmico na posição 6 na β-globina, observado como Glu6Lys ou E6K. A doença da HbC é relativamente benigna, produzindo anemia hemolítica leve e esplenomegalia. A gravidade da doença HbSC é variável, mas pode ser tão grave quanto a anemia falciforme.
[0276]A HbE é causada quando o aminoácido ácido glutâmico é substituído pelo aminoácido lisina na posição 26 na β-globina, observado como Glu26Lys ou E26K. Pessoas com doença HbE têm anemia hemolítica leve e esplenomegalia leve. A HbE é extremamente comum no Sudeste Asiático e em algumas áreas é igual à hemoglobina A em frequência. Em alguns casos, a mutação HbE está presente com HbS. Nesses casos, uma pessoa pode ter sinais e sintomas mais graves associados à anemia falciforme, como episódios de dor, anemia e função anormal do baço.
[0277]Outras condições, conhecidas como β-talassias falciformes da hemoglobina (HbSBetaThal), são causadas quando mutações que produzem hemoglobina S e β-talassemia ocorrem juntas. Mutações que combinam doença falciforme com beta-zero (β°; mutações genéticas que impedem a produção de β-globina) levam a doença grave, enquanto doença falciforme combinada com beta-plus (β+; mutações genéticas que diminuem a produção de β-globina) a talassemia é mais leve.
[0278]Como usado no presente documento, “talassemia” se refere a um distúrbio hereditário caracterizado por produção defeituosa de hemoglobina. Exemplos
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72/89 de talassemias incluem a- e β-talassemia.
[0279]Em modalidades particulares, as composições e métodos contemplados no presente documento fornecem terapia gênica para indivíduos com uma betatalassemia. As β-talassemias são causadas por uma mutação na cadeia da βglobina e podem ocorrer de forma maior ou menor. Verificou-se que quase 400 mutações no gene da β-globina causam β-talassemia. A maioria das mutações envolve uma alteração em um único bloco de construção de DNA (nucleotídeo) dentro ou próximo ao gene da β-globina. Outras mutações inserem ou excluem um pequeno número de nucleotídeos no gene da β-globina. Como observado acima, as mutações no gene da β-globina que diminuem a produção de β-globina resultam em um tipo de condição chamada talassemia beta-plus (β+). Mutações que impedem as células de produzirem beta-globina resultam em talassemia beta-zero (β°). Na forma principal de β-talassemia, as crianças são normais ao nascimento, mas desenvolvem anemia durante o primeiro ano de vida. A forma menor de β-talassemia produz pequenos glóbulos vermelhos. A talassemia menor ocorre se você receber o gene defeituoso de apenas um dos pais. Pessoas com essa forma de distúrbio são portadoras da doença e geralmente não apresentam sintomas. Sem desejar ater-se a nenhuma teoria em particular, os vetores lentivirais contemplados no presente documento reduzem ou eliminam a expressão de BCL11A nas células eritroides e resultam na reativação ou desrepressão da expressão do gene da γ-globina e na diminuição da expressão do gene da β-talassêmica e, assim, aumentam Expressão de HbF para tratar e/ou melhorar efetivamente um ou mais sintomas associados a indivíduos que têm uma β-talassemia.
[0280]A HbE^-talassemia resulta da combinação de HbE e β-talassemia (βΕ/β°, βΕ/β+) e produz uma condição mais grave do que a observada nas características HbE ou β-talassemia. O distúrbio se manifesta como uma talassemia moderadamente grave que se enquadra na categoria de talassemia intermediária. A HbE/β
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73/89 talassemia é mais comum em pessoas de origem do sudeste asiático.
[0281 ]Em modalidades particulares, as composições e métodos contemplados no presente documento fornecem terapia genética para indivíduos com uma atalassemia. A talassemia é um distúrbio sanguíneo bastante comum em todo o mundo. Milhares de crianças com síndrome de Hb Bart e doença de HbH nascem a cada ano, principalmente no sudeste da Ásia. A tha-talassemia também ocorre frequentemente em pessoas de países do Mediterrâneo, norte da África, Oriente Médio, índia e Ásia Central, a-talassemia normalmente resulta de supressões envolvendo os genes hba1 e HBA2. Ambos os genes fornecem instruções para produzir uma proteína chamada α-globina, que é um componente (subunidade) da hemoglobina. As pessoas têm duas cópias do gene HBA1 e duas cópias do gene HBA2 em cada célula. Os diferentes tipos de α-talassemia resultar da perda de alguns ou de todos os alelos hba1 e HbA2.
[0282]A síndrome de Hb Bart, a forma mais grave de α-talassemia, resulta da perda de todos os quatro alelos da α-globina. A doença da HbH é causada pela perda de três dos quatro alelos da α-globina. Nessas duas condições, a falta de aglobina impede que as células produzam hemoglobina normal. Em vez disso, as células produzem formas anormais de hemoglobina chamada hemoglobina Bart (Hb Bart) ou hemoglobina H (HbH). Essas moléculas anormais de hemoglobina não podem efetivamente transportar oxigênio para os tecidos do corpo. A substituição de Hb Bart ou HbH por hemoglobina normal causa anemia e outros problemas sérios de saúde associados à a-talassemia.
[0283]Duas variantes adicionais da α-talassemia estão relacionadas a uma quantidade reduzida de α-globina. Como as células ainda produzem alguma hemoglobina normal, essas variantes tendem a causar poucos ou nenhum problema de saúde. Uma perda de dois dos quatro alelos de α-globina resulta na característica de α-talassemia. Pessoas com característica de α-talassemia podem ter glóbulos ver
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74/89 melhos pálidos incomumente pequenos e anemia leve. Uma perda de um alelo de aglobina é encontrada em portadores silenciosos de a-talassemia. Esses indivíduos normalmente não apresentam sinais ou sintomas relacionados à talassemia.
[0284]Em uma modalidade preferencial, os métodos de terapia gênica contemplados no presente documento são usados para tratar, prevenir ou melhorar uma hemoglobinopatia é selecionada do grupo que consiste em: doença da hemoglobina C, doença da hemoglobina E, anemia falciforme, doença falciforme (SCD), talassemia, β-talassemia, talassemia maior, talassemia intermediária, α-talassemia, síndrome da hemoglobina Bart e doença da hemoglobina H. Sem desejar ater-se a nenhuma teoria em particular, os vetores lentivirais contemplados no presente documento reduzem ou eliminam a expressão de BCL11A nas células eritroides e resultam na reativação ou desrepressão da expressão do gene da γ-globina e na diminuição da expressão do gene da β-globina defeituosa, aumentando assim a HbF expressão para tratar e/ou melhorar efetivamente um ou mais sintomas associados a indivíduos com hemoglobinopatia.
[0285]Em uma modalidade preferencial, os métodos de terapia gênica contemplados no presente documento são usados para tratar, prevenir ou melhorar uma hemoglobinopatia em um indivíduo com um genótipo de β-globina selecionado do grupo que consiste em: βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, β°/β+, βΕ/β+, β°/β+, β+/β+, β°/β°, βΕ/β8, β°/β8’ β°/β8’ β+/β8 ou β8/β8.
[0286]Em várias modalidades, os vetores retrovirais são administrados por injeção direta a uma célula, tecido ou órgão de um indivíduo com necessidade de terapia gênica, in vivo. Em várias outras modalidades, as células são transduzidas in vitro ou ex vivo com vetores da invenção e opcionalmente expandidas ex vivo. As células transduzidas são então administradas a um indivíduo necessitado de terapia gênica.
[0287]As células adequadas para transdução e administração nos métodos
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75/89 de terapia gênica contempladas no presente documento incluem, mas não estão limitadas a células-tronco, células progenitoras e células diferenciadas, conforme descrito em outras partes deste documento. Em certas modalidades, as células transduzidas são células-tronco hematopoiéticas ou células progenitoras, como no presente documento descrito em outra parte.
[0288]As células preferenciais para uso nas composições de terapia gênica e nos métodos contemplados no presente documento incluem células autólogas/autogênicas (“auto”).
[0289]Em modalidades particulares, as células usadas como fonte de terapia gênica têm os seguintes alelos de β-globina: βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, β°/β+, βΕ/β+, β°/β+, β+/β+, β°/β°, βΕ/β8, β°/β8, β°/β8, β+/β8 ou β8/β8.
[0290]Em modalidades particulares, as células usadas como fonte de terapia gênica têm os seguintes alelos de β-globina: βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, β θ/β+’ βθ/β e, βθ/β+, ρ 0/β+, ou β+/β+ [0291 ]Em modalidades particulares, as células usadas como fonte de terapia gênica têm os seguintes alelos de β-globina: βΕ/β8, β°/β8, β°/β8, β+/β8 ou β8/β8.
[0292]Um “indivíduo”, como usado no presente documento, inclui qualquer animal que exibe um sintoma de uma doença, distúrbio ou condição monogênica que pode ser tratada com os vetores de terapia genética, terapêutica baseada em células e métodos revelados em outras partes deste documento. Em modalidades preferenciais, um indivíduo inclui qualquer animal que exibe sintomas de uma doença, distúrbio ou condição do sistema hematopoiético, por exemplo, uma hemoglobinopatia, que pode ser tratada com os vetores de terapia gênica, terapêutica baseada em células e métodos revelados em outras partes deste documento. Assuntos adequados (por exemplo, pacientes) incluem animais de laboratório (como camundongo, rato, coelho ou cobaia), animais de fazenda e animais domésticos ou animais de estimação (como gato ou cachorro). Primatas não humanos e, de preferência, paci
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76/89 entes humanos, estão incluídos. Os assuntos típicos incluem animais que exibem quantidades aberrantes (quantidades inferiores ou superiores a um indivíduo “normal” ou “saudável”) de uma ou mais atividades fisiológicas que podem ser moduladas por terapia genética.
[0293]Como usado no presente documento, “tratar” ou “tratamento” inclui qualquer efeito benéfico ou desejável sobre os sintomas ou patologia de uma doença ou condição patológica e pode incluir até reduções mínimas em um ou mais marcadores mensuráveis da doença ou condição sendo tratada. O tratamento pode envolver opcionalmente a redução ou melhora dos sintomas da doença ou condição, ou o atraso da progressão da doença ou condição. “Tratamento” não indica necessariamente erradicação ou cura completa da doença ou condição ou sintomas associados.
[0294]Conforme usado no presente documento, “impedir” e palavras similares como “impedir”, “prevenir” etc., indicam uma abordagem para prevenir, inibir ou reduzir a probabilidade de ocorrência ou recorrência de uma doença ou condição. Também se refere ao atraso no aparecimento ou recorrência de uma doença ou condição ou ao atraso na ocorrência ou recorrência dos sintomas de uma doença ou condição. Conforme usado neste documento, “prevenção” e palavras similares também incluem a redução da intensidade, efeito, sintomas e/ou ônus de uma doença ou condição antes do início ou recorrência da doença ou condição.
[0295]Como usado no presente documento, o termo “quantidade” se refere a “uma quantidade eficaz” ou “uma quantidade eficaz” de um vírus ou célula terapêutica transduzida para alcançar um resultado profilático ou terapêutico benéfico ou desejado, incluindo resultados clínicos.
[0296]Uma “quantidade profilaticamente eficaz” se refere a uma quantidade de vírus ou célula terapêutica transduzida eficaz para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profiláti
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77/89 ca é usada em indivíduos antes ou em uma fase anterior da doença, a quantidade profilaticamente eficaz é menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[0297]Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de um vírus ou célula terapêutica transduzida pode variar de acordo com fatores como estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade das células-tronco e progenitoras de provocar uma resposta desejada no Individual. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do vírus ou células terapêuticas transduzidas são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” inclui uma quantidade que é eficaz para “tratar” um indivíduo (por exemplo, um paciente).
[0298]Sem desejar vincular-se a nenhuma teoria em particular, uma vantagem importante fornecida pelos vetores, composições e métodos da presente invenção é a alta eficácia da terapia gênica que pode ser alcançada pela administração de populações de células que compreendem altas porcentagens de células transduzidas em comparação com métodos existentes.
[0299]As células transduzidas podem ser administradas como parte de um transplante de medula óssea ou de sangue do cordão um indivíduo que tenha ou não sido submetido a terapia ablativa da medula óssea. Em uma modalidade, as células transduzidas da invenção são administradas em um transplante de medula óssea a um indivíduo que foi submetido a terapia de medula óssea quimioablativa ou radioablativa.
[0300]Em uma modalidade, uma dose de células transduzidas é entregue a um indivíduo por via intravenosa. Em modalidades preferenciais, as células estaminais hematopoiéticas transduzidas são administradas por via intravenosa a um indivíduo.
[0301 ]Em uma modalidade ilustrativa, a quantidade eficaz de células transduzidas fornecidas a um indivíduo é de pelo menos 2 χ 106 células/kg, pelo menos 3
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78/89 x 106 células/kg, pelo menos 4 x 106 células/kg, pelo menos 5 x 106 células/kg, pelo menos 6 x 106 células/kg, pelo menos 7 x 106 células/kg, pelo menos 8 x 106 células/kg, pelo menos 9 x 106 células/kg, ou pelo menos 10 x 106 células/kg, ou mais células/kg, incluindo todas as doses intermediárias de células.
[0302]Em outra modalidade ilustrativa, a quantidade eficaz de células transduzidas fornecidas a um indivíduo é de cerca de 2 x 106 células/kg, cerca de 3 x10 células/kg, cerca de 4 x 106 células/kg, cerca de 5 x 106 células/kg, cerca de 6 x10 células/kg, cerca de 7 x 106 células/kg, cerca de 8 x 106 células/kg, cerca de 9 x10 células/kg ou cerca de 10 x 106 células/kg, ou mais células/kg, incluindo todas as doses intermediárias de células.
[0303]Em outra modalidade ilustrativa, a quantidade eficaz de células transduzidas fornecidas a um indivíduo é de cerca de 2 x 106 células/kg a cerca de 10 x 106 células/kg, cerca de 3 x 106 células/kg a cerca de 10 x 106 células/kg, cerca de 4 x 106 células/kg a cerca de 10 x 106 células/kg, cerca de 5 x 106 células/kg a cerca de 10 x 106 células/kg, 2 x 106 células/kg a cerca de 6 x 106 células/kg, 2 x 106 células/kg a cerca de 7 x 106 células/kg, 2 x 106 células/kg a cerca de 8 x 106 células/kg, 3 x 106 células/kg a cerca de 6 x 106 células/kg, 3 x 106 células/kg a cerca de 7 x 106 células/kg, 3 x 106 células/kg a cerca de 8 x 106 células/kg, 4 x 106 células/kg a cerca 6 x 106 células/kg, 4 x 106 células/kg a cerca de 7 x 106 células/kg, 4 x 106 células/kg a cerca de 8 x 106 células/kg, 5 x 106 células/kg a cerca de 6 x 106 células/kg, 5 x 106 células/kg a cerca de 7 x 106 células/kg, 5 x 106 células/kg a cerca de 8 x 106 células/kg ou 6 x 106 células/kg a cerca de 8 x 106 células/kg, incluindo todas as doses intermediárias de células.
[0304]Alguma variação na dosagem necessariamente ocorrerá, dependendo da condição do indivíduo a ser tratado. A pessoa responsável pela administração determinará, em qualquer caso, a dose apropriada para o indivíduo.
[0305]Todas as publicações, pedidos de patente e patentes emitidas citadas
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79/89 nesta especificação são no presente documento incorporadas a título de referência como se cada publicação individual, pedido de patente ou patente emitida fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada a título de referência.
[0306]Embora a invenção anterior tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será facilmente aparente para um versado na técnica, à luz dos ensinamentos desta invenção, que certas mudanças e modificações podem ser feito sem se afastar do espírito ou do escopo das reivindicações anexas. Os exemplos a seguir são fornecidos apenas como ilustração e não como limitação. Os versados na técnica reconhecerão prontamente uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser alterados ou modificados para produzir resultados essencialmente similares.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1
VETOR LENTIVIRAL BB694 [0307]Um cassete shmiR BCL11A (SEQ ID NO: 1) foi clonado de um vetor lentiviral pD12G5 para outro esqueleto do vetor lentiviral para melhorar a expressão do shmir. O novo vetor é referido como BB694. Figura 1.
[0308]0 vetor lentiviral BB694 difere do vetor lentiviral pD12G5 em pelo menos os seguintes aspectos: a espinha dorsal do vetor lentiviral BB694 foi derivada da linhagem HIV-1 NL43, enquanto que a espinha dorsal do vetor lentiviral pD12G5 é baseada na cepa HIV-1 HXB2; a arquitetura dos elementos do vetor lentiviral no BB694 é o sítio do aceitador de sinal de empacotamento de cPPT/FLAP-RRE-env (S/A) de 5’ LTR-psi (Ψ), enquanto a arquitetura dos elementos do vetor lentiviral no BB694 é 5’ LTR-psi (Ψ) sinal de empacotamento S/A-cPPT/FLAP-RRE-env; o vetor lentiviral BB694 compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína gag truncada de cerca de 459 nucleotídeos e que possui pelo menos dois códons ATG mutados, enquanto o vetor lentiviral pD12G5 compreende um polinucleotídeo que codi
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80/89 fica uma proteína gag truncada de cerca de 339 nucleotídeos e que não possui códons ATG mutados ; o vetor lentiviral BB694 compreende um sítio aceitador de união env (S/A) de cerca de 176 nucleotídeos, enquanto o vetor lentiviral D12G5 compreende um env S/A de cerca de 334 nucleotídeos; o vetor lentiviral BB694 compreende uma sequência cPPT/FLAP de cerca de 381 nucleotídeos, enquanto o vetor lentiviral D12G5 compreende uma sequência cPPT/FLAP de cerca de 118 nucleotídeos; o vetor lentiviral BB694 compreende um sítio hipersensível à DNAse I HS2 de cerca de 638 nucleotídeos, enquanto o vetor lentiviral D12G5 compreende um sítio hipersensível à DNAse I HS2 de cerca de 1435 nucleotídeos; o vetor lentiviral BB694 compreende um sítio hipersensível à DNAse I HS3 de cerca de 847 nucleotídeos, enquanto o vetor lentiviral D12G5 compreende um sítio hipersensível à DNAse I HS3 de cerca de 1202 nucleotídeos; e o vetor lentiviral BB694 compreende uma sequência de poliadenilação sintética, enquanto o vetor lentiviral D12G5 compreende uma sequência de poliadenilação do gene do hormônio do crescimento bovino.
[0309]0s aspectos do vetor BB694 e suas posições são apresentados na Tabela 1 e na SEQ ID NO: 4.
Tabela 1: 0b694
Nucleotídeos Identidade
1-185 Estrutura principal do plasmídeo pUC19
185-202 Ligante
203-800 CMV
801-1136 R, U5, PBS e sequências de empacotamento
1137-1139 Códon de partida Gag (ATG) alterado para parar o codon (TAG)
1140-1240 Sequência gag de HIV-1
1241-1243 Sequência de gag do HIV-1 alterada para um segundo códon de parada
1244-1595 Sequência gag de HIV-1
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81/89
1596-1992 Pol HIV-1; cPPT/CTS
1993-2517 HIV-1, região env HXB3 isolada (RRE)
2518-2693 Sequências S/A HIV-1 env env
2694-2699 Ligante
2700-2747 Sinal PolyA sintético
2748-2775 Ligante
2776-2859 miR223
2860-2916 Gancho de cabelo D12
2917-2968 miR223
2969-3004 Ligante
3005-3321 b-globina exonl contendo 5' UTR e promotor
3322-3960 HS2
3961-3973 Ligante
3974-4820 HS3
4821-4859 Ligante
4860-4965 HIV-1 ppt e parte de U3
4966-5082 HIV-1 parte de U3 (exclusão de 399bp) e R
5083-5106 Poli (A) sintética
5107-5124 Ligante
5125-7294 Estrutura principal pUC19, contém Amp R
7295-7297 Ligante
7298-7499 SV40 ori
7500-7547 Ligante
7548-7598 Estrutura principal pUC19
EXEMPLO 2
O VETOR LENTIVIRAL BB694 INDUZ HEMOGLOBINA FETAL EM
CÉLULAS ERITROIDES NORMAIS E EM CÉLULAS ERITROIDES CONTENDO
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82/89
UMA MUTAÇÃO NA DOENÇA FALCIFORME
Antecedentes [0310]As características dos vetores lentivirais pD12G5 e BB694 foram comparadas. Ambos os vetores compreendem um shmiR direcionado contra o mRNA de BCL11A. O BCL11A é um fator de transcrição que regula a expressão do gene da γglobina e, portanto, contribui para a regulação dos níveis de hemoglobina fetal (HbF) (Bauer et al., Science 2013). A expressão diminuída de BCL11A está correlacionada com HbF elevado. No entanto, a expressão reduzida de BCL11A também causa apoptose em células B e CLPs precoces e abole completamente o potencial de desenvolvimento linfoide de HSCs para células B, T e NK (Yu et al., JEM 2012). Além disso, a deficiência de BCL11A leva a defeitos nas células-tronco hematopoiéticas com um fenótipo semelhante ao envelhecimento (Luc et al., Cell Rep 2016). O uso de uma expressão específica de promotor/potenciador eritroide do shmir BCL11A permite que o BCL11A funcione adequadamente durante o desenvolvimento.
[0311]O vetor lentiviral foi preparado para D12G5 e BB 694. Quatro litros de D12G5 foram colhidas com um tulo de 2,03 x 10 6 TU/ml (qPCR tulo em células HOS) e concentrada para um volume final de 23 ml com um título de 1,25 x 10 8 TU/ml. Dois litros de BB694 foram colhidas com um tulo de 13,7 x 10 6 TU/ml (qPCR tulo em células HOS) e concentrada para um volume final de 30 ml com um título de 5,65 x 10 8 TU/ml. No geral, o rendimento de BB694 foi muito maior (59%) do que o de D12G5 (35%).
Transducão de células CD34+ [0312]Humanos (h), as células CD34+ foram isoladas a partir de dadores normais ou de indivíduos têm a doença das células falciformes e prestimulated a 1 x 10 6 células/ml durante 48 horas em CelIGro® soro-livre (Media CelIGenix) suplementado com hSCF, hTPO, e hFIt- 3L em uma incubadora de cultura de tecidos humidificada padrão (5% CO 2). Em seguida, as células foram contadas, distribuídos
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83/89 em 21 poços (3 réplicas por condição) e transduzidas a 4 x 10 6 células/ml durante h de acordo com o desenho experimental resumidos na Tabela 2.
Tabela 2: Resumo do Projeto Experimental
Condições de Transdução Poços n2
Células hCD34+ normais, transdução de MOCK 1,2, 3
Células hCD34+ normais transduzidas com BB694 (MOI 25) + sulfato de protamina 4, 5, 6
Células hCD34+ normais transduzidas com BB694 (MOI 25) + F108 + PGE2 7, 8, 9
Células hCD34+ normais transduzidas com BB694 (MOI 50) + sulfato de protamina 10, 11, 12
Células hCD34+ normais transduzidas com BB694 (MOI 50) + F108 + PGE2 13, 14, 15
Células hCD34+ normais transduzidas com D12G5 (MOI 25) + sulfato de protamina 16, 17, 18
+ Células normais transduzidas com hCD34 D12G5 (MOI 25) + F108 + PGE2 19, 20, 21
Células SCD hCD34+, transdução de MOCK 22, 23, 24
Células SCD hCD34+ transduzidas com BB694 (MOI 25) + sulfato de protamina 25, 26, 27
Células SCD hCD34+ transduzidas com BB694 (MOI 25) + F108 + PGE2 28, 29, 30
Células SCD hCD34+ transduzidas com BB694 (MOI 50) + sulfato de protamina 31,32, 33
Células SCD hCD34+ transduzidas com BB694 (MOI 50) + F108 + PGE2 34, 35, 36
Células SCD hCD34+ transduzidas com D12G5 (MOI 25) + sulfato de 37, 38, 39
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84/89
protamina
Células SCD hCD34+ transduzidas com D12G5 (MOI 25) + F108 + PGE2 40, 41,42
- O sulfato de protamina foi utilizado a 8 pg/ml, F108 a 200 pg/ml, PGE2a 10 μΜ [0313]Após a transdução, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Foram utilizadas 500 células por condição para cultura clonogênica (MethoCult, H4434, StemCell Technologies) e as células restantes foram divididas igualmente entre cultura líquida em SCGM para avaliação de VCN no dia 6 (D6) e diferenciação eritroide na cultura líquida para análise de hemoglobina.
Cultura líquida em SCGM para avaliação D6 VCN [0314]As células hCD34+ transduzidas foram cultivadas em SCGM para avaliação de VCN em meio sem soro CelIGro® (CelIGenix) suplementado com hSCF, hTPO, hFlt-3L e IL-3 por 6 dias em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada (5% de CO 2) As células foram colhidas, extração de DNA enômico de g e 0 número médio de cópias de vetores por genoma diplóide foi determinado por qPCR. Os VCN D6 para as condições de transdução na Tabela 2 são mostrados na Figura 2.
Ensaio Clonoqênico [0315]500 células de cada condição de transdução foram lavadas e transferidas para alíquotas de 3 ml de metilcelulose suplementada com citocina (por exemplo, Methocult M4434 Classic). 1,1 ml foi então transferido para placas de cultura de tecidos paralelas de 35 mm com 0 uso de uma agulha romba de calibre 16. Os pratos foram mantidos em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada por 14 a 16 dias a 37QC e CO2 a 5% e as colônias foram classificadas quanto ao tamanho, morfologia e composição celular. As condições de transdução não levaram a diferenças inesperadas na frequência clonogênica ou aumentaram a toxicidade. Figuras 3A-3B.
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85/89 [0316]As colônias individuais foram reunidas e submetidas à análise de VCN. Figura 4.
Diferenciação Eritroide em Cultura Líquida [0317]Cerca de metade das células transduzidas foram cultivadas em meio de diferenciação eritroide em uma incubadora de cultura de tecidos humidificada padrão durante 14-16 dias a 37QC e CO2 a 5%. O meio de diferenciação tireoidiana (meio HF) compreende IMDM suplementado com Pen/Strep, hSCF, hlL-3, eritropoietina (R&D n° 287-TC) e FBS a 20% inativado pelo calor (lote 1658396). Após 14 dias, as células foram centrifugadas (~ 300 g 10 min), lavadas em PBS e lisadas em água de qualidade para HPLC. Após a centrifugação em alta velocidade (20 OOOg 30min 4QC), 0 conteúdo de hemoglobina no sobrenadante foi analisado por cromatografia líquida de alta eficiência por troca iônica (HPLC).
Análise de hemoglobina por HPLC [0318]As hemoglobinas foram analisadas com um cromatógrafo Prominence (Shimadzu): unidade de desgaseificação DGU-20A 3R, duas unidades de entrega de fase móvel LC-20AD (bombas), em série com um controlador de sistema CBM-20A, um amostrador automático SIL-20AC HT, um amostrador automático CTO- Forno de coluna 20AC e um detetor UV-vis de comprimento de onda duplo SPO-20A. As injeções automatizadas de amostras foram realizadas com 0 amostrador automático SIL-20AC HT.
[0319]Um a trinta microlitros do sobrenadante foi injetado em uma partícula de 100 x 2,1 mm, 5 mm de diâmetro, com poros de 1000 angstrons, coluna PolyCAT A (PolyLC, Columbia, MD). As hemoglobinas foram eluídas com um gradiente de dois tampões Tris (tampão A: Tris 40 mM, KCN 3 mM e ajustados a pH 6,5 com ácido acético; tampão B: Tris 40 mM, KCN 3 mM, NaCI 200 mM, ajustado a pH 6,5 com ácido acético) de força iônica diferente a uma taxa de fluxo de 0,3 ml/minuto. Os gradientes utilizados foram de 0 a 2 minutos, B a 2%; 2 a 6 minutos, B a 20%; 8 a 12
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86/89 minutos, B a 60%; 12-12: 30 minutos B a 100%; e 13 minutos, B a 2%. O forno da coluna foi regulado para 30 ° C. O comprimento de onda de detecção foi de 418 nm. A aquisição de dados e a análise da data foram realizadas com o software LC Solution da Shimadzu. As hemoglobinas foram identificadas graças ao seu tempo de retenção e a um padrão de referência executado no mesmo lote. A proporção das diferentes hemoglobinas foi avaliada com a área do pico de cada pico a 418 nm.
[0320]A Figura 5 mostra os níveis relativos de hemoglobina fetal, hemoglobina normal e hemoglobina falciforme produzidos por células eritroides derivadas das células doadoras CD34+ saudáveis (painel esquerdo) e SCD (painel direito) transduzidas nas condições da Tabela 2.
Colônias positivas em vetor e produção de HbF [0321 ]As colônias eritroides foram arrancadas individualmente sob um microscópio. As colônias foram lavadas em PBS (~ 300g 10min) e ressuspensas em 100 ml de água de qualidade para HPLC. Foram utilizados 20 pL para avaliação da VCN por qPCR e 80 pL para análise da hemoglobina por HPLC de troca iônica.
[0322]A porcentagem de colônias positivas em vetor é mostrada na Figura 6. A transdução na presença de bb694, F108 e PGE2 resultou em mais de 80% de células transduzidas em células doadoras humanas normais e células SCD.
[0323]Como esperado, 0 fundo de HbF é alto (até 50%) nas colônias. No entanto, nenhuma das colônias MOCK possui HbF> 50% e mais de 93% das colônias produzidas por transdução com bb694, F108 e PGE2 possuem HbF> 50%. Figura 7. A porcentagem de HbF aumenta quando a VCN aumenta e os platôs ficam entre 80% e 100% quando 0 número médio de cópias de vetores por genoma diplóide é maior que 5.
Conclusão [0324]O vetor lentiviral bb694 foi superior ao vetor D12G5 em todas as condições testadas. O vetor lentiviral bb694 foi produzido com alto título (>1,108 TU/ml),
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87/89 foi capaz de transduzir cerca de 40% dos progenitores eritroides no MOI 25 e mais de 80% dos progenitores eritroides no MOI 25 na presença de F108 e PGE2. Nas últimas condições, a porcentagem de HbF foi superior a 70%.
EXEMPLO 3
POTENCIAL DE ENXERTO DE CÉLULAS HCD34+ TRANSDUZIDAS COM
BB694 VETOR LENTIVIRAL ADMINISTRADO A CAMUNDONGOS NSG [0325]O potencial de enxerto de células hCD34+ transduzidas com 0 vetor lentiviral bb694 foi avaliado em um modelo de camundongo NSG.
[0326]células hCD34+ foram prestimulated a 1 x 106 células/ml durante 48 horas em meio isento de soro suplementado com hSCF, hTPO, e hFlt-3L em uma incubadora de cultura de tecidos humidificada padrão (CO2 a 5%). Após préestimulação, as células foram transduzidas com 2-4 x 106 células/ml durante 24 h em SCGM hSCF 100 ng/ml, hTPO 100 ng/ml, hFlt-3L 100 ng/ml com bb694 (6E+8 TU/ml) em um MOI de 30 e na presença de F108 e PGE2.
[0327]Camundongos fêmeas NOD-Cg-Prkdcscidll2rgtm 1 Wjl/Sz (NSG) foram condicionados com 40 mg/kg de busulfan e transplantados por administração intravenosa única com célula CD34+ humana transduzida com vetor lentiviral bb694 ou células transduzidas simuladas.
[0328]Para cada condição, 500 células lavadas foram transferidas para alíquotas de 3 ml de metilcelulose suplementada com citocina (por exemplo, Methocult M4434 Classic). 1,1 ml foi, em seguida, transferidos para uma placa de cultura de tecidos de 35 mm de uma cultura durante 14-16 dias a 37QC e CO2 a 5%. As colônias foram classificadas quanto ao tamanho, morfologia e composição celular. Colônias individuais foram colhidas para análise subsequente do número de cópias vetoriais ou 0 conteúdo de uma placa inteira de 35 mm foi reunido e depois submetido à análise do número de cópias vetoriais. O número de colônias para 500 células banhadas em metilcelulose é mostrado na Figura 8. Não foi observada diferença esta
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88/89 tisticamente significante entre os dois grupos.
[0329]As colônias eritroides foram arrancadas individualmente sob um microscópio. Cada colônia foi então analisada por colônia individual qPCR para colônias positivas para VCN e LVV percentual. Figura 9.
[0330]Cerca de metade das células transduzidas foi cultivada em meios de diferenciação eritroide em uma incubadora de cultura de tecidos humidificada padrão durante 14-16 dias a 37QC e 5% de CO2. A mídia de diferenciação eritroide. Após 14 dias, as células foram centrifugadas (~ 300 g 10 min), lavadas em PBS e lisadas em água de qualidade para HPLC. Após centrifugação em alta velocidade (20. OOOg 30min 4QC), 0 sobrenadante foi utilizado para analisar as cadeias de globinas por HPLC de fase reversa. Figura 10.
[0331 ]As células da medula óssea de camundongos NSG transplantados foram analisadas por citometria de fluxo usando os seguintes anticorpos: CD3 (n2 560835), CD19 (n2 560353), CD33 (n2 555450), CD45 (n2 561864) e citômetro de fluxo BD. A porcentagem de células hCD45+ foi avaliada para avaliar 0 enxerto de células hCD34+ transduzidas. Não foi observada diferença estatisticamente significante entre as células transduzidas por simulação e bb694. Figura 11. A porcentagem de células CD19+CD45+ e a porcentagem de células CD33+CD45+ foram avaliadas para analisar 0 equilíbrio entre as células B e as células mieloides. Não foi observada diferença estatisticamente significante entre os dois grupos. Figura 12.
[0332]Quatro meses após 0 transplante, as células da medula óssea foram colhidas, 0 DNA genômico foi extraído e 0 número médio de cópias de vetores por genoma diplóide foi avaliado por PCR quantitativo (qPCR). Figura 13.
[0333]As células CD34+ humanas foram eficientemente transduzidas com bb694 (3,1 cpd em colônias reunidas) e uma indução de 3,5 vezes a hemoglobina F foi observada após a diferenciação eritroide na cultura líquida (proporção de cadeias gama de 13,5% com Mock e 47% com bb694). A frequência de colônias avaliadas
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89/89 nas células pós-transdução foi semelhante nos dois grupos. O nível de enxerto de células CD45 + humanas estava na faixa esperada e não foi estatisticamente diferente entre os dois grupos. Nenhum desvio de linhagem foi observado. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos para a porcentagem de células CD19+CD45+ ou a porcentagem de células CD33+CD45+.
[0335] Em geral, nas reivindicações a seguir, os termos usados não devem ser interpretados para limitar as reivindicações às modalidades específicas reveladas no relatório descritivo e nas reivindicações, mas devem ser interpretados para incluir todas as modalidades possíveis, juntamente com o escopo completo de equivalentes aos quais tais reivindicações têm direito. Por conseguinte, as reivindicações não são limitadas pela revelação.

Claims (65)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Vetor lentiviral CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma repetição terminal longa (LTR) da linhagem HIV-1 da NL4-3 5’, um promotor específico para a tireoide operativamente ligado a um polinucleotídeo que codifica um shmiR que compreende uma sequência anti-senso que hibridiza com um mRNA de BCL11A humano e uma HIV-1 cepa NL4-3 3' LTR.
  2. 2. Vetor lentiviral, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda de 5’ a 3’, um sinal de empacotamento de Psi (Ψ); um elemento do trato polipurino central NL4-3 da cepa HIV-1 (cPPT)/FLAP; um elemento de exportação de RNA; e uma sequência aceitadora de splice de HIV-1 env.
  3. 3. Vetor lentiviral, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma LTR 5’ modificada e uma LTR SIN HIV-1 3’.
  4. 4. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma 5’ LTR modificada, em que o promotor da 5’ LTR modificada é substituído por um promotor de CMV; e um HIV-1 3' SIN LTR.
  5. 5. Vetor lentiviral CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    (a) uma LTR de HIV-1 5’;
    (b) um sinal de empacotamento Psi (Ψ);
    (c) um elemento cPPT/FLAP lentiviral;
    (d) um elemento de exportação de RNA;
    (e) uma sequência aceitadora de junções de HIV-1 env;
    (f) um promotor específico para eritroide operativamente ligado a um shmiR que codifica uma sequência anti-senso que hibridiza com um mRNA de BCL11A humano; e
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    2/10 (g) uma LTR de HIV-1 3’.
  6. 6. Vetor lentiviral, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma 5’ LTR modificada, em que o promotor da 5’ LTR modificada é substituído por um promotor de CMV; e um HIV-1 3' SIN LTR.
  7. 7. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um elemento de exportação de RNA RRE da cepa HXB3 do HIV-1.
  8. 8. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor específico da eritroide compreende um promotor de β-globina.
  9. 9. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor específico do eritroide compreende um promotor da β-globina humana.
  10. 10. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma LCR de β-globina.
  11. 11. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma LCR de β-globina humana.
  12. 12. Vetor lentiviral de autoinativação (SIN) CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    (a) uma cepa NL4-3 5’ LTR de HIV-1 modificada, em que o promotor da LTR 5’ modificado é substituído por um promotor de CMV;
    (b) um sinal de empacotamento Psi (Ψ);
    (c) um elemento cPPT/FLAP da cepa HIV-1 NL4-3;
    (d) um elemento de exportação de RNA RRE da cepa HXB3 de HIV-1;
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    3/10 (e) uma sequência aceitadora de splice da cepa NL4-3 de HIV-1;
    (f) um promotor de β-globina operacionalmente ligado a um shmiR que codifica uma sequência anti-senso que hibridiza com um mRNA de BCL11A humano;
    (g) uma LCR de p-globina; e (g) uma cepa de HIV-1 NL4-3 3' SIN LTR.
  13. 13. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma LCR de β-globina humana que compreende sítios de hipersensibilidade à DNAse I HS3 e HS2.
  14. 14. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma LCR de β-globina humana que compreende sítios de hipersensibilidade à DNAse I de HS3 e HS2, mas sem um sítio de hipersensibilidade à DNAse I de HS4.
  15. 15. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um polinucleotídeo de cerca de 459 nucleotídeos que codifica uma proteína gag.
  16. 16. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um polinucleotídeo que codifica a proteína gag compreende uma ou mais sequências ATG mutadas.
  17. 17. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma sequência aceitadora de splice de HIV-1 env de cerca de 176 nucleotídeos.
  18. 18. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um elemento cPPT/FLAP de cerca de 381 nucleotídeos.
  19. 19. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18,
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    CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um sítio hipersensível à HSse DNAse I de cerca de 638 nucleotídeos.
  20. 20. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um sítio hipersensível à HS3 DNAse I de cerca de 847 nucleotídeos.
  21. 21. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma sequência poli (A) sintética disposta entre uma sequência aceitadora de splice de HIV-1 env e o shmiR.
  22. 22. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o shmiR codifica a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1.
  23. 23. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o shmiR compreende a sequência de fita guia estabelecida na SEQ ID NO: 2.
  24. 24. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o shmiR compreende uma sequência de fita guia que hibridiza com a sequência alvo estabelecida na SEQ ID NO: 3.
  25. 25. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, CARACTERIZADO pelo fato de que um cassete de expressão que compreende o promotor específico da eritroide e o polinucleotídeo que codifica o shmiR estão na orientação reversa em comparação com a transcrição do RNA genômico lentiviral.
  26. 26. Vetor de transferência lentiviral CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a sequência polinucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 4.
  27. 27. Célula CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26.
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  28. 28. Célula CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam HIV-1 gag e pol, VSV-G e um vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26.
  29. 29. Partícula de vetor lentiviral CARACTERIZADO pelo fato de que é produzida a partir da célula, de acordo com a reivindicação 28.
  30. 30. Célula CARACTERIZADO pelo fato de que é transduzida com um vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26.
  31. 31. Célula, de acordo com a reivindicação 30, em que a célula é CARACTERIZADO pelo fato de que é transduzida na presença de uma quantidade eficaz de um poloxâmero selecionado do grupo que consiste em poloxâmero 288, poloxâmero 335, poloxâmero 338, e poloxâmero 407 e agonista do receptor de PGE2.
  32. 32. Célula CARACTERIZADO pelo fato de que é transduzida com a partícula de vetor lentiviral, de acordo com a reivindicação 29.
  33. 33. Célula, de acordo com a reivindicação 32, em que a célula é CARACTERIZADO pelo fato de que é transduzida na presença de uma quantidade eficaz de um poloxâmero selecionado do grupo que consiste em poloxâmero 288, poloxâmero 335, poloxâmero 338, e poloxâmero 407 e um agonista do receptor de PGE2.
  34. 34. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, em que a célula é CARACTERIZADO pelo fato de que é uma célula-tronco hematopoiética ou célula progenitora hematopoiética.
  35. 35. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 34, em que a célula é CARACTERIZADO pelo fato de que é uma célula-tronco hematopoiética ou célula progenitora.
  36. 36. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, em que a
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    6/10 célula é CARACTERIZADO pelo fato de que é CD34+.
  37. 37. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 36, em que a célula é CARACTERIZADO pelo fato de que é CD133+.
  38. 38. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 37, em que a célula é CARACTERIZADO pelo fato de que é CD34+CD38LoCD90+CD45RA
  39. 39. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 38, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula compreende um dos mais alelos de βglobina mutados associados a uma hemoglobinopatia.
  40. 40. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 39, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula compreende um dos mais alelos de βglobina mutados selecionados do grupo que consiste em: βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, β°/β+, βΕ/β+, β°/β+, β+/β+, β°/β°, βΕ/βδ, β°/β8 β°/β8, β+/β8 e βδ/βδ.
  41. 41. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 39, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula compreende um dos mais alelos de βglobina mutados selecionados do grupo que consiste em: βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, βΕ/β+, β°/βΕ, β°/β+, β°/β+ e β+/β+.
  42. 42. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 39, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula compreende um dos mais alelos de βglobina mutados selecionados do grupo que consiste em: βΕ/β8, β°/β8, β°/β8, β+/β8 e β8/βδ.
  43. 43. População de células CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma pluralidade de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 42.
  44. 44. Composição CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma população de células que compreende uma pluralidade de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 42.
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  45. 45. Composição farmacêutica CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um transportador farmaceuticamente aceitável e uma população de células que compreende uma pluralidade de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 42.
  46. 46. Método para transduzir uma população de células hematopoiéticas CARACTERIZADO pelo fato de que compreende cultivar as células em um meio de cultura, na presença de um vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26; um poloxâmero; e um agonista de receptor de PGE2.
  47. 47. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que 0 poloxâmero é selecionado do grupo que consiste em: poloxâmero 288, poloxâmero 335, poloxâmero 338 e poloxâmero 407.
  48. 48. Método, de acordo com a reivindicação 46 ou 47, CARACTERIZADO pelo fato de que 0 agonista do receptor de PGE2 é selecionado do grupo que consiste em: 15d-PGJ2; deitai2-PGJ2; Ácido 2-hidróxi-heptadecatrienoico (HHT); Tromboxano A2; Tromboxano B2; lloprost; Treprostinil; Travoprost; Carboprost trometamina; Tafluprost; Latanoprost; Bimatoprost; Unoprostona isopropil; Cloprostenol; Estrofano; Superfano; Misoprostol; Butaprost; Ácido linoleico; 13(s)-HODE; LY171883; Ácido de hidromel; Ácido eicosatrienoico; Ácido epoxieicosatrienoico; ONO-259; Cay1039; um agonista do receptor de PGE2; 16,16-dimetil PGE2; 19(R)-hidróxi PGE2; 16,16-dimetil PGE2 p-(pacetamidobenzamido) éster de fenila; 11-desoxi-16,16-dimetil PGE2; 9-desoxi-9metileno-16,16-dimetil PGE2; -9-desoxi-9 metileno PGE2; Sulprostona; PGE2 serinol amida; PGE2 éster de metila; 16-tetranor fenil PGE2; 15(S)-15-metil-PGE2; e 15(R)-15metil PGE2.
  49. 49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 48, CARACTERIZADO pelo fato de que 0 agonista do receptor PGE2 é PGE2 ou 16,16
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    8/10 dimetil PGE2.
  50. 50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 49, CARACTERIZADO pelo fato de que 0 vetor lentiviral está presente em um MOI de cerca de 10 a cerca de 30 ou em um MOI de cerca de 10 a cerca de 25.
  51. 51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 50, CARACTERIZADO pelo fato de que 0 vetor lentiviral está presente em um MOI de cerca de 10 a cerca de 20.
  52. 52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 49, CARACTERIZADO pelo fato de que 0 vetor lentiviral está presente em um MOI de cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 17, cerca de 19, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24, cerca de 25, cerca de 26, cerca de 27, cerca de 28, cerca de 29 ou cerca de 30.
  53. 53. Método para tratar uma hemoglobinopatia em um indivíduo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma população de células, de acordo com a reivindicação 43, uma composição, de acordo com a reivindicação 44 ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 45.
  54. 54. Método para melhorar pelo menos um sintoma de uma hemoglobinopatia em um indivíduo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma população de células, de acordo com a reivindicação 43, uma composição, de acordo com a reivindicação 44 ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 45.
  55. 55. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de que os alelos de β-globina do indivíduo são βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, β°/β+, βΕ/β+, β°/β+,
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    9/10 β+/β+, β°/β°, βθ/βδ, β°/ρ s, β°/β8, β+/β8 ou βδ/βδ.
  56. 56. Método para tratar uma talassemia em um indivíduo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma população de células, de acordo com a reivindicação 43, uma composição, de acordo com a reivindicação 44 ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 45.
  57. 57. Método, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que a talassemia é uma a-talassemia.
  58. 58. Método, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que a talassemia é uma β-talassemia.
  59. 59. Método, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que os alelos de β-globina do indivíduo são βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, βΕ/β+, β°/βΕ, β°/β+, β°/β+ ou β+/β+.
  60. 60. Método para tratar a doença das células falciformes em um indivíduo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma população de células, de acordo com a reivindicação 43, uma composição, de acordo com a reivindicação 44 ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 45.
  61. 61. Método, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADO pelo fato de que os alelos de p-globina do indivíduo são βΕ/8 β, β°/ρ s, β°/βδ, β+/β8 ou βδ/βδ.
  62. 62. Método para tratar uma β-talassemia em um indivíduo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma população de células, de acordo com a reivindicação 43, uma composição, de acordo com a reivindicação 44 ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 45.
    Petição 870190097022, de 27/09/2019, pág. 18/21
    10/10
  63. 63. Método, de acordo com a reivindicação 62, CARACTERIZADO pelo fato de que os alelos de β-globina do indivíduo são βΕ/β°, β°/β°, β°/β°, β°/β°, βΕ/βΕ, βΕ/β+, β°/βΕ, β°/β+, β°/β+ ou β+/β+.
  64. 64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 63, CARACTERIZADO pelo fato de que a população de células-tronco hematopoiéticas é administrada por via intravenosa, via intramedular ou via intra-óssea.
  65. 65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 64, CARACTERIZADO pelo fato de que a população de células-tronco hematopoiéticas é administrada por via intravenosa.
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