JP6416939B2 - 核酸の初期収集物から標的分子を減損させる方法、並びにそれを実施するための組成物及びキット - Google Patents
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Description
米国特許法(35 U.S.C.)第119条(e)に準拠し、本出願は、2014年2月13日に出願された米国仮特許第61/939,658号の出願日及び2014年8月22日に出願された米国仮特許出願第62/040,804号の出願日に対する優先権を主張するものであり;その開示を参照により本明細書中に援用する。
生物学的医学研究における適用‐例えば、アレイハイブリダイゼーション、qPCR又は大規模な並列配列決定による遺伝子発現解析、では、他の配列との複雑な混合物の状態で存在する核酸の特定のサブセットの分析を伴うことが多い。着目の核酸配列が既知である場合には、特異的プライマー配列を用いたPCRが混合物から所望の配列を増幅するのに使用できる。しかしながら、場合によっては、恐らく配列情報が完全に分かっていない複数の異なった配列を分析することが望まれることもある。例えば、真核細胞系のメッセンジャーRNAは、ポリAテールに対するプライミングにより最初のcDNA鎖合成を開始するためのオリゴdTプライマーを使用することで一括して増幅及び分析され、その結果、好ましくない核酸‐例えばリボソームRNA、ミトコンドリアRNA及びゲノムDNAによる夾雑を低減又は回避し得る。しかしながら、このアプローチのための要件はRNAが完全であって、且つ、分解されていないこと、例えば、ポリAテールがRNAメッセージの本体から失われておらず、切断もされていないことである。残念ながら、多くのその他の有効且つ興味深い生物学的材料‐例えばホルマリン固定及びパラフィン包埋組織サンプル(FFPEサンプル)として維持された生検材料などは、こういったサンプルとって実用的ではないオリゴdTプライミングをもたらすような分解に晒されることが多い。さらに、多くの興味深いRNA配列‐例えば、非コーディングRNAや非真核生物のRNAにはポリAテールがない。こうした場合には、サンプル中のすべてのヌクレオチド種を全体的に増幅するのにランダムプライミングが使用できる。しかしながら、ランダムプライミングはまた、潜在的な好ましくない配列‐例えばゲノムDNA又はリボソームRNAなどの増幅ももたらす。
核酸の初期収集物から標的核酸を減損させる(depleting)方法を提供する。該方法の態様には、初期収集物から標的核酸を減損させるのに十分な様式下で標的核酸に特異的な核酸誘導型ヌクレアーゼと初期収集物とを接触させることが含まれる。所定の適用によって、標的核酸の減損は、例えば減損させることが初期収集物中の標的核酸を切断すること、又は初期収集物から標的核酸を選択的に分離することを含み得る場合、核酸の初期収集物を変化させ得る。該方法の実施形態を実施するための組成物及びキットもまた提供する。
本発明の態様は、核酸の初期収集物から標的核酸を選択的に減損させる方法を含んでいる。標的核酸を「減損させる」こととは、核酸の初期収集物中の標的核酸の量を低減することを意味する。例えば、(単数若しくは複数の)ヌクレアーゼ要素がヌクレアーゼ活性を有する1若しくは複数の核酸誘導型ヌクレアーゼによる標的核酸内の1若しくは複数の位置での標的核酸の切断によって、標的核酸が減損され得る。そして、初期収集物中に存在する非減損核酸が、核酸増幅、核酸配列決定、遺伝子発現分析(例えば、アレイハイブリダイゼーション、定量的RT‐PCR、大規模並列配列決定などによる)、又は着目のその他の下流適用などの着目の下流適用に使用され得る。
或いは、標的核酸は、標的核酸の除去(及び適宜、回収)によって核酸の初期収集物から減損され得る。以下でより詳細に説明されるとおり、特定の態様において、初期収集物からの標的核酸の除去は、切断欠損性ヌクレアーゼを含めた核酸誘導型ヌクレアーゼを使用して作用され、そしてそのヌクレアーゼは、核酸の初期収集物からのヌクレアーゼ(従って、該ヌクレアーゼに結合する標的核酸)の除去を容易にする異種要素(例えば、タグ)を含んでいてもよい。初期収集物から標的核酸を取り出すか又は回収することによって、標的配列が濃縮された次の核酸収集物を得ることができる。そして、この濃縮サンプル(例えば、エキソーム濃縮サンプル、着目の遺伝子パネルを濃縮したサンプルなど)は、例えば核酸増幅、核酸配列決定、遺伝子発現分析(例えば、アレイハイブリダイゼーション、定量的RT‐PCR、大規模並列配列決定などによる)又は着目のその他の下流適用などの着目の下流適用に使用されてもよい。
標的核酸は異なっていてもよい。「核酸」とは、あらゆる長さ、例えば10塩基以上、20塩基以上、50塩基以上、100塩基以上、500塩基以上、1000塩基以上、2000塩基以上、3000塩基以上、4000塩基以上、5000塩基以上、10,000塩基以上、50,000塩基以上のヌクレオチド、例えばリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドで構成された高分子を意味している。場合によっては、核酸の長さは、100,000塩基以下、例えば75,000塩基以下、50,000塩基以下、例えば25,000塩基以下、例えば10,000塩基以下、5,000塩基以下、2,000塩基以下、1,000塩基以下又は500塩基以下などを含めた長さである。
crRNA‐tracrRNA複合体の要件は、crRNAとtracrRNAのアニーリングによって通常形成されたヘアピンを含む「単独ガイドRNA」(sgRNA)を形成するためにcrRNAとtracrRNAとの遺伝子操作された融合の使用によって回避できる。例えば、Jinek et al. (2012) Science 337:816-821;Mali et al. (2013) Science 339:823-826;及びJiang et al. (2013) Nature Biotechnology 31:233-239を参照のこと。
特定の実施形態によると、核酸誘導型ヌクレアーゼのヌクレアーゼ要素は、Casタンパク質などのCRISPR関連タンパク質である。Casタンパク質の制限されることのない例としては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csn1及びCsx12としても知られている)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、その相同体、又はその改変バージョンが挙げられる。特定の態様において、核酸誘導型ヌクレアーゼのヌクレアーゼ要素はCas9である。Cas9は、これだけに限定されるものではないが、NGGのPAM配列を有するストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)(「spCas9」、Uniprot Q99ZW2)、NNNNGATTのPAM配列を有するネイセリア・メニンギチジス(Neisseria meningitidis)(「nmCas9」、Uniprot C6S593)、NNAGAAのPAM配列を有するストレプトコッカス・サーモフィルス(streptococcus thermophilus)(「stCas9」、Uniprot Q5M542)、及びNAAAACのPAM配列を有するトレポネーマ・デンティコルス(Treponema denticols)(「tdCas9」、Uniprot M2B9U0)を含めた着目の任意の生物体由来であってよい。sgRNAガイド要素が汎用の標的核酸の相補的領域と整列されている、Cas9ヌクレアーゼ及びsgRNAガイド要素を含んでいる核酸誘導型ヌクレアーゼの例が図1で図式的に例示されている。
哺乳動物は8つのアルゴノートタンパク質を有し、そしてそれは、2つのサブファミリー:Piwiクレード及びAgoクレードに分類される。野生型Agoタンパク質(Ago1‐4、又はEIF2C1‐4)では、Ago2だけがエンドヌクレアーゼ活性を持っている。完全長ヒトAgo2(Uniprot Q9UKV8)の結晶構造が解明された。例えば、Elkayam et al. (2012) Cell 150(1):100-110を参照のこと。細菌の対応物と同様に、ヒトAgo2は、N末端(N)、PAZ、MID、及びPIWIドメインを含む二小葉性構造物である。PAZドメインは、低分子RNAの3’末端を固定し、Ago2の触媒能のために不必要である。しかしながら、PAZ領域欠失は、非接触Agosが低分子RNA二本鎖をほどき、機能性RISCを形成する能力を妨害する。
核酸ガイド要素は任意の好適な長さの1若しくは複数の核酸重合体であってもよい。特定の態様において、核酸ガイド要素は、長さが10〜200ヌクレオチド、例えば長さが10〜100、10〜90、10〜80、10〜70、10〜60、10〜50、10〜40、10〜30、10〜25、10〜20、又は10〜15ヌクレオチドを含めた長さが10〜150ヌクレオチドなどの核酸高分子(例えば、一本鎖又は二本鎖RNA又はDNA)である。
核酸ガイド要素の少なくとも一部は、着目の標的核酸の少なくとも一部に相補的(例えば100%相補的又は100%未満相補的)である。核酸ガイド要素のすべての配列又は一部の配列は、標的核酸にヌクレアーゼ要素を特異的に誘導するために着目の標的核酸に対して十分に相補的であるように、対象方法の実施者によって選択され得る。着目の標的核酸の核酸配列は、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)、欧米分子生物学研究所の欧州バイオインフォマティクス研究所(EMBL‐EBI)の核酸配列データベースなどのリソースから容易に入手可能である。一例として、着目の標的核酸がヒト18S rRNA(1.9kb)及び/又はヒト28S rRNAの一方又は両方であるとき、18S rRNAのヌクレオチド配列は、それぞれNCBI参照配列NR_003286.2及びNR_003287.2のものが容易に入手可能である。
先にまとめたように、本開示の方法は、核酸の初期収集物を着目の標的核酸に特異的な核酸誘導型ヌクレアーゼと、該初期収集物から標的核酸を減損させるのに十分な様式下で接触させることを含む。特定の態様において、核酸の初期収集物の核酸誘導型ヌクレアーゼとの接触は、反応混合物中で核酸の初期収集物、核酸ガイド要素、及びヌクレアーゼ要素を組み合わせることを含む。核酸ガイド要素とヌクレアーゼ要素は、反応混合物に加えられる前に(例えば、複合体として)安定して結合し得るか、又はこれらの要素は、その後の互いの結合そして、標的核酸の標的化/減損のために別々に加えられ得る。特定の態様において、接触ステップの少なくとも一部は、ヌクレアーゼ要素が活性であって標的核酸を切断できる条件下で起こる。
ヌクレアーゼ要素が標的核酸を切断する実施形態によると、接触条件は、利用した特定のヌクレアーゼが活性、例えばヌクレアーゼ活性を持っている温度を含み得る。斯かる温度は異なっていてもよいが、特定の態様において、0℃〜10℃(例えば、4℃)、10℃〜20℃(例えば、16℃)、20℃〜30℃(例えば、25℃)、30℃〜40℃(例えば、37℃)、40℃〜50℃、50℃〜60℃、60℃〜70℃、又は70℃〜80℃の温度を含み得る。
反応混合物は、例えばヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性を呈する好適なpHにて接触が起こるのを保証するための1若しくは複数のバッファー(例えば、トリスバッファー、PBSバッファー、又は同様のもの)を含み得る。例えば、接触条件は、pH4.5〜8.5、例えば4.5〜5.5、5.5〜6.5、6.5〜7.5又は7.5〜8.5などの反応混合物のpHを含み得る。
接触ステップは、核酸の初期収集物、核酸ガイド要素、及びヌクレアーゼ要素の終濃度が標的核酸を減損させるのに好適であるように実施され得る。例えば、核酸の初期収集物の終濃度は0.1pg/μl〜10μg/μlであり得、核酸ガイド要素の終濃度は25pM〜50μMであり得、及びヌクレアーゼ要素の終濃度は25pM〜50μMであり得る。
特定の態様において、着目の核酸の初期収集物は、これだけに限定されるものではないが、単独の細胞、複数の細胞(例えば、培養細胞)、組織、臓器又は生物体、例えば細菌、酵母、又は生物体の収集物(例えばメタゲノムサンプル、例えば複数の生物体を含む海水、多くの異なった細菌種を含む糞便サンプル、頬側スワブなど)、或いは同様のものから単離された核酸サンプルを含めた、着目の核酸起源から単離された核酸(例えば、望ましくない及び所望の核酸)の収集物である。「サンプル」という用語は、本明細書中に使用される場合、当業者が(例えば、本明細書中の他の箇所に記載した切断又は除去により)初期収集物から減損させることを所望する核酸及び/又はタンパク質を含んでいる、典型的には、必須ではないが、液体の形態の、材料又は材料の混合物に関する。特定の態様において、核酸のサンプルは哺乳動物(例えば、ヒト、齧歯動物(例えば、マウス)又は着目のその他の哺乳動物)の細胞、組織、臓器、及び/又は同様のものから単離される。他の態様において、核酸のサンプルは、哺乳動物以外の起源、例えば細菌、酵母、昆虫(例えば、ショウジョウバエ)、両生類(例えばカエル(例えばツメガエル(Xenopus)))、ウイルス、植物又はその他の非哺乳動物の核酸サンプル起源などからも単離される。特定の実施形態によると、着目の核酸の初期収集物はゲノムDNAではない。
特定の実施形態によると、着目の核酸の初期収集物は着目の核酸の前駆収集物から生じる。例えば、着目の核酸の初期収集物は、着目の核酸(例えば、RNA)の前駆収集物から転写されたDNA(例えば、cDNA)の収集物であってもよい。特定の態様において、着目の核酸の初期収集物は、着目のRNAの前駆収集物から転写されたcDNAの収集物であり、ここで、該着目のRNAの前駆収集物は、mRNA、miRNA、rRNA、及び/又は同様のものを含んでおり、そして、該減損されるべき標的核酸は、核酸の前駆収集物中に存在するrRNAから転写されたcDNAである。
配列決定されるべき核酸の両末端にてアダプター配列を利用する配列決定プラットフォーム(例えば、Illumina(登録商標)‐イオンTorrent(登録商標)ベースのプラットフォーム)では、標的核酸(例えばrRNAから転写されたcDNA)における核酸誘導型ヌクレアーゼによる1つの切断事象が、シーケンサーに断片化標的核酸を見えなくしている。
或いは、又は加えて、複数の2以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼが、2以上の型のヌクレアーゼ要素を含んでいてもよい。例えば、該方法は、ヌクレアーゼの起源に関して互いに異なるヌクレアーゼ(例えば、異なる原核生物及び/又は真核生物種からのヌクレアーゼ)、ヌクレアーゼ活性に関して互いに異なるヌクレアーゼ(例えば、プール/ライブラリはヌクレアーゼ活性を有する1若しくは複数のヌクレアーゼ、切断欠損性である1若しくは複数のヌクレアーゼ、1若しくは複数のニッカーゼ、又はあらゆるそれらの組み合わせを含み得る)、PAM配列(例えば、プール/ライブラリは異なるPAM配列を有するガイド核酸を利用するヌクレアーゼを含み得る)の任意の所望の組み合わせ、並びに初期収集物から1以上の標的核酸を減損させるのに好適なヌクレアーゼ要素の任意のその他の組み合わせから成るプール/ライブラリを利用してもよい。
このように、本開示の態様は、核酸の初期収集物から核酸(例えば、rRNA及び/又はmtRNA由来の核酸)の小集団を選択的に減損させる方法を含む。斯かる実施形態において、該方法は、核酸の初期収集物を該初期収集物から小集団を減損させるのに十分な様式下で核酸誘導型ヌクレアーゼのライブラリと接触させることを含んでよく、ここで、該ライブラリは、核酸の小集団の2以上の構成要素及び/又は単一の構成要素の複数の領域に特異的な2以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含んでいる。これらの実施形態において、ライブラリのサイズは異なっていてもよい。例えば、ライブラリは、2以上、3以上、4以上、5以上、10以上、25以上、100以上、500以上、1000以上、10000以上、50000以上、100000以上、500000以上、又は100万以上の異なる核酸誘導性ヌクレアーゼなどを含み得る。特定の態様において、ライブラリは、2以上、しかし100万以下、500000以下、100000以下、50000以下、10000以下、1000以下、500以下、100以下、25以下、10以下、5、4、又は3の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む。
組成物もまた本開示によって提供される。特定の態様において、該組成物は、複数の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含んでいる。複数の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼは、2以上、3以上、4以上、5以上、10以上、25以上、100以上、500以上、1000以上、10,000以上、50,000以上、100,000以上、500,000以上、又は100万以上の異なる核酸誘導性ヌクレアーゼなどを含み得る。特定の態様において、複数の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼは、2以上、しかし100万以下、500,000以下、100,000以下、50,000以下、10,000以下、1000以下、500以下、100以下、25以下、10以下、5、4、又は3の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む。
本開示の方法を実施するとき、(単数若しくは複数の)核酸誘導型ヌクレアーゼは、特定の標的核酸の切断頻度及び得られる断片のサイズが対象方法の実施者によって選択されるように設計され得る。例えば、先に記載したように、標的核酸内の異なる配列を標的とする2以上の核酸誘導型ヌクレアーゼは、斯かる標的核酸が3以上の断片に切断されることが望ましいときに、多重様式下で使用され得る。標的核酸の標的配列は、所望のサイズの断片、例えば、スピンカラム、アルコール沈殿、及び/又は同様のものを使用してサンプルから取り除かれるほど十分に小さい断片、を生じるように選択され得る。
対象方法は、さまざまな異なる適用、例えば、着目のサンプルから無関係の及び/又は望ましくない分子を減損させるのが望ましい場合;その後の回収のためにサンプルから着目の核酸を取り出すことによって着目の核酸を減損させることが望ましい場合(その結果、着目の核酸が濃縮されたサンプルを製造する);及び/又は同様のもの、における用途が見出された。無関係の及び/又は望ましくない分子を減損させるか、又は濃縮サンプルを製造するために望ましい分子を取り出すことによって、サンプルの複雑さが低減され、そしてサンプルは着目の分子が濃縮される。着目の分子が核酸であるときに、低減された複雑さと着目の核酸の濃縮は、核酸増幅、核酸配列決定、遺伝子発現分析(例えば、アレイハイブリダイゼーション、定量的RT‐PCR、大規模並列配列決定などによる)、着目の治療用核酸がその中に含まれている医薬組成物の調製、及び低減されたサンプルの複雑さと着目の核酸の濃縮が有益であるその他の適用などの下流適用を容易にし得る、及び/又はその結果を改善し得る。
対象方法を実施するのに有用なキットもまた本開示によって提供される。該キットは、対象方法及び組成物に関連する先に記載した任意の要素の1以上を含み得る。例えば、該キットは、核酸ガイド要素がインビトロ転写によってそれから製造され得るPCR増幅産物を作り出すためのプライマー及び鋳型を含み得る。斯かる試薬は、図2に示し、本明細書中で先に記載した核酸ガイド要素(例えば、sgRNA)を製造するための方法を実施する際に有用である任意の試薬を含み得る。特定の態様によると、該キットは、キットの使用者によって提供されたフォワードプライマーに関連して使用するためのリバースプライマーを含んでいて、ここで、該フォワードプライマーの少なくとも一部が使用者による減損のために選択された標的核酸に相補的な核酸配列を含んでいる。
対象のキットの要素は別々の容器に存在してもよく、又は複数の要素が1つの容器に存在してもよい。例えば、キットが、インビトロ転写によってそこからRNAガイド要素が製造される鋳型DNAを作り出すためのプライマーを含んでいるとき、プライマーは、別々の容器内に又はキットの第二の要素(例えば、バッファー又は同様のもの)を含んでいる容器内に提供されてもよい。
この実施例では、核酸誘導型ヌクレアーゼを製造し、概念実証として、rRNA配列に対応する標的配列を有するPCR産物を減損するのに使用した。図2に概説し、先に記載した方法を使用して、2つの異なるsgDNA鋳型(CMBO640及びCMBO641)をAdvantage(登録商標)HDポリメラーゼ(Clontech Laboratories, Mountain View, CA)を使用したPCRによって作り出した。PCR産物は、図4に示したゲル画像において主な(下側の)バンドとして見られる。100〜120ngの鋳型を、対応するsgRNAの製造のためにTakara T7 RNAポリメラーゼマニュアルに従ってインビトロ転写反応に使用した。
インビトロ転写したCMBO640(72ng/μl)及びCMBO641(90ng/μl)sgRNAを、次に、Cas9(500ng)と組み合わせたときの、rRNA配列に対応する配列を有するPCR産物(260ng)を切断するそれらの能力について試験した。結果を図5に提供する。示したとおり、Cas9、COMBO640及び/又はCOMBO641 sgRNA、及びPCR産物を組み合わせることで、PCR産物の切断がもたらされた。
この実施例では、異なる標的配列特異性を有する2つの別々のsgRNAが、完全長18S rRNAに対応する配列を有する標的DNAを減損するために併用した(すなわち、多重様式下で)使用できることを示す。図6に提供したゲル画像で示したとおり、Cas9と第一のsgRNAを含んでいる核酸誘導型ヌクレアーゼ(「sgRNA1」、左から4番目のレーン)及びCas9と第二のsgRNAを含んでいる核酸誘導型ヌクレアーゼ(「sgRNA2」、左から5番目のレーン)は、完全長18S rRNAに対応する配列を有する標的DNAを別の箇所で別々に切断することができる。2つの核酸誘導型ヌクレアーゼがともに標的DNAに組み合わせられるとき(左から6番目のレーン)、標的DNAはそれぞれの切断部位の両方で切断され、多重標的減損が起こったことを示唆する。
この実施例では、核酸誘導型ヌクレアーゼが次世代配列決定ライブラリから好ましくない配列を減損する能力を試験した。ヒト脳全RNAから転写したcDNAの次世代配列決定ライブラリをsgRNA/Cas9核酸誘導型ヌクレアーゼによって処理して、該ライブラリの配列決定前に、18S rRNAに対応するcDNAの1022〜1041位における切断によって18S rRNAに対応するcDNAを減損した。得られた配列をrRNAに対してマッピングし、そして、1022〜1041と重なる読み取り数をrRNAに対するマッピングの読み取り総数で割った。その比をプロットし、対照に対して正規化した。
図7のパネルAに示したように、標的配列の減損は、Cas9と特異的なガイドRNAの両方で処理したライブラリでのみ起こった。
この実験では、配列決定ライブラリを、SMARTer Stranded RNA‐Seq Kit(Clontech)を使用して100ngのHuman Brain Total RNA(Clontech)から作り出した。70ngのライブラリを、20μlの1X NEB3.1バッファー中で0、2、又は5μgの遺伝子組み換えにより精製したCas9及び0又は191ngの先の実験で記載の35 sgRNAプールと共に37℃にて1時間インキュベートした。次に、Cas9を70℃にて10分間、熱不活性化した。次に、ライブラリを貯留し、MiSeq装置により配列決定した。得られた配列を、STARアライナーを使用して同時にヒトゲノム、hg19、及びrRNA転写産物に対してマッピングした。図8は、Cas9及びsgRNAプールの両方での処理のみによって生じる、18S rRNA転写産物の配列網羅率の低下を例示する。18S rRNAに対してマッピングされた配列決定読み取り数を、図9で配列決定し、プロットした読み取り総数に対して正規化し、そして、18S 転写産物に対して配列マッピングにおける〜75%の低下を実証した。
実施例1〜4に記載したsgRNAは、以下の標的特異的配列を有する図1に示したsgRNA足場を含んでいた:
実施例1及び2で使用したsgRNA1:UUAUCAGAUCAAAACCAACC(配列番号01)
実施例1、2及び3で使用したsgRNA2:UAAUCAAGAACGAAAGUCGG(配列番号02)
実施例3及び4で使用した35 sgRNAのプール:(配列番号03〜37)
この実施例では、標的核酸を減損させるアルゴノート(Ago)タンパク質の能力を評価した。Hisタグ付与したTth Agoを発現させ、そして、精製した(図10、パネルA)。5’FAM標識したssDNAの代表的な標的の減損は、500nMの一本鎖DNA、Tth Ago、及び100nMの標的一本鎖DNAに相補的な5’リン酸化ターゲッティングオリゴヌクレオチドと組み合わせ、75℃にて1時間インキュベートすることによって実施した。図10、パネルBに示したとおり、一本鎖標的はAgoの不存在下で切断されなかったが(一番右側のレーン)、様々なAgo濃度でのAgoとターゲッティングオリゴヌクレオチドの存在下で切断された。図11は、同様であるが、20nMのssDNA標的と50nMのガイドDNAを用いた実験が一般的なライブラリ濃度の減損を代表することを実証する。
実施例5で実証されたように、アルゴノートは溶液中で標的ssDNA分子を減損させることができる。所望であれば、標的は二本鎖であり、該二本鎖材料は、例えば熱若しくは高いpHを用いるなどした変性によって、又はエキソヌクレアーゼ処理によって非標的鎖を分解することによって一本鎖に変換され得る。例えば、混合物は、その一方だけが5’リン酸化されている、一般的な対のPCRプライマーによって増幅され得る。次に、増幅産物をλエキソヌクレアーゼで処理して、ssDNA生成物を得ることができる。次に、このssDNA生成物を、Ago及びターゲッティングオリゴヌクレオチドによる切断の基質として使用することができる。
この実施例では、Cas9の6xHNタグ付与D10A/H840A突然変異体(本明細書中ではdCas9とも呼ばれる)を発現させ、そして、E.コリ(E. coli)において精製した(図12、パネルA)。RNA‐Seqライブラリを、100ngのHuman Brain PolyA-plus RNA(Clontech)及びSMARTer Stranded RNA‐Seqキット(Clontech)から作り出した。10ngのライブラリを、10μlの1X NEB3.1中で〜1.25μgのdCas9及びヒト5S、5.8S、18S、28S、mt12S、及びmt16S配列に対して〜50bpごとに設計した76ngの190sgRNAのプールを組み合わせた。混合物を37℃にて1時間インキュベートした。次に、10μgのサケ精子DNA(Life Technologies)を加え、そして、反応を37℃にて30分間さらに続けた。10のμlのNEB3中で平衡化した5μlのTALON磁性ビーズ(Clontech)を管に加え、回転させながら25℃にて30分間インキュベートした。該ビーズを200μlのNEBで二度洗浄した。50μlのSeqAmp PCR Mastermix(1X SeqAmp Buffer、1μlのSeqAmp DNAポリメラーゼ、250nMのIllumina P5、及びP7PCRプライマー)を洗浄したビーズに加え、15サイクルのPCR(94℃1分間、15×(98℃‐15s、55℃‐15s、68℃‐30s))で増幅した。増幅産物を、製造業者の取扱説明書に従って50μlのAMPureビーズ(Beckman)を用いて精製し、20μlの10mM Tris HCl pH8.5、0.1% Tween‐20中で溶出した。次に、ライブラリをMiSeq装置で配列決定した。得られた配列を、STARアライナーを使用して同時にヒトゲノム、hg19、及びrRNA転写産物に対してマッピングした。rRNAに対してマッピングした読み取りをPicard RNA‐Seq Metricsによって同定し、そしてrRNAに対してマッピングした配列の相対量を図12、パネルBにプロットし、未処理のライブラリに対して〜340%の濃縮を示した。この実施例は、核酸誘導型ヌクレアーゼが核酸の初期収集物からの標的核酸の除去によって標的核酸を減損させるために、その後の標的核酸の回収及びそれを濃縮したサンプル製造のために使用されうることを実証する。
添付の特許請求の範囲の条項に関わらず、本開示は以下の付記の条項によっても定義される:
核酸の初期収集物から標的核酸を選択的に減損させる方法であって:
該初期収集物から標的核酸を減損させるのに十分な様式下で、核酸の収集物を標的核酸に特異的な核酸誘導型ヌクレアーゼと接触させること、
を含む方法。
付記2.
前記標的核酸が、デオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)である、付記1に記載の方法。
付記3.
前記標的核酸が二本鎖核酸である、付記1又は2に記載の方法。
付記4.
前記標的核酸が一本鎖核酸である、付記1又は2に記載の方法。
付記5.
前記核酸誘導型ヌクレアーゼが、RNAガイド要素及びヌクレアーゼ要素を含む、付記1〜4のいずれか1項に記載の方法。
前記ヌクレアーゼ要素がCasヌクレアーゼ要素を含む、付記5に記載の方法。
付記7.
前記Casヌクレアーゼ要素が切断活性を呈し、且つ、前記方法が標的核酸の切断をもたらして、標的核酸の初期収集物を減損させる、付記6に記載の方法。
付記8.
前記Casヌクレアーゼ要素が切断欠損性突然変異体であり、且つ、前記方法が標的核酸/核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体を含む生成物組成物の製造をもたらす、付記6に記載の方法。
付記9.
前記方法が生成物組成物の他の構成要素から複合体を分離することをさらに含む、付記8に記載の方法。
付記10.
前記Casヌクレアーゼ要素がタグをさらに含む、付記9に記載の方法。
前記方法が、標的核酸を複合体から回収することをさらに含む、付記10に記載の方法。
付記12.
前記核酸誘導型ヌクレアーゼが、DNAガイド要素及びヌクレアーゼ要素を含む、付記1〜4のいずれか1項に記載の方法。
付記13.
前記ヌクレアーゼ要素がTth Agoヌクレアーゼ要素を含む、付記12に記載の方法。
付記14.
前記方法が、核酸の初期収集物を複数の2以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼと接触させることを含む、付記1〜13のいずれか1項に記載の方法。
付記15.
核酸の初期収集物から核酸の小集団を選択的に減損させる方法であって:
初期収集物から小集団を減損させるのに十分な様式下で、核酸の初期収集物を核酸誘導型ヌクレアーゼのライブラリと接触させること、
を含み、ここで、該ライブラリは核酸の小集団の1若しくは複数の構成要素に特異的な2以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含んでいる、方法。
前記小集団がデオキシリボ核酸を含む、付記15に記載の方法。
付記17.
前記小集団が二本鎖核酸を含む、付記15又は16に記載の方法。
付記18.
前記小集団が一本鎖核酸を含む、付記15又は16に記載の方法。
付記19.
前記ライブラリが5以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記15又は16に記載の方法。
付記20.
前記5以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼが、異なる配列の核酸ガイド要素を有する、付記19に記載の方法。
前記核酸誘導型ヌクレアーゼがそれぞれRNAガイド要素及びヌクレアーゼ要素を含む、付記16〜20のいずれか1項に記載の方法。
付記22.
前記ヌクレアーゼ要素がCasヌクレアーゼ要素を含む、付記21に記載の方法。
付記23.
前記Casヌクレアーゼ要素が切断活性を呈し、且つ、前記方法が小集団の切断をもたらして、小集団の初期収集物を減損させる、付記22に記載の方法。
付記24.
前記Casヌクレアーゼ要素が切断欠損性突然変異体であり、且つ、前記方法が小集団核酸/核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体を含む生成物組成物の製造をもたらす、付記22に記載の方法。
付記25.
前記方法が、生成物組成物の他の構成要素から複合体を分離することをさらに含む、付記24に記載の方法。
前記Casヌクレアーゼ要素がタグをさらに含む、付記25に記載の方法。
付記27.
前記方法が、小集団核酸を複合体から回収することをさらに含む、付記26に記載の方法。
付記28.
前記核酸誘導型ヌクレアーゼがそれぞれDNAガイド要素及びTth Agoヌクレアーゼ要素を含む、付記16〜20のいずれか1項に記載の方法。
付記29.
前記核酸の初期収集物が次世代配列決定(NGS)核酸収集物を含む、付記15〜27のいずれか1項に記載の方法。
付記30.
前記小集団が配列決定することを望まない配列を含む、付記29に記載の方法。
前記方法が、小集団を減損したNGS核酸収集物の配列決定をさらに含む、付記30に記載の方法。
付記32.
複数の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む組成物。
付記33.
前記組成物が5以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記32に記載の組成物。
付記34.
前記組成物が25以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記33に記載の組成物。
付記35.
前記組成物が100以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記34に記載の組成物。
前記組成物が500以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記35に記載の組成物。
付記37.
前記組成物が1000以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記36に記載の組成物。
付記38.
前記核酸誘導型ヌクレアーゼが、異なる配列の核酸ガイド要素を有する、付記32〜37のいずれか1項に記載の組成物。
付記39.
前記核酸誘導型ヌクレアーゼがそれぞれRNAガイド要素及びヌクレアーゼ要素を含む、付記32〜38のいずれか1項に記載の組成物。
付記40.
前記ヌクレアーゼ要素がCasヌクレアーゼ要素を含む、付記39に記載の組成物。
前記Casヌクレアーゼ要素が切断活性を呈する、付記40に記載の組成物。
付記42.
前記Casヌクレアーゼ要素が切断欠損性突然変異体である、付記40に記載の組成物。
付記43.
前記Casヌクレアーゼ要素がタグをさらに含む、付記42に記載の組成物。
付記44.
前記核酸誘導型ヌクレアーゼがそれぞれDNAガイド要素及びヌクレアーゼ要素を含む、付記32〜38のいずれか1項に記載の組成物。
付記45.
前記ヌクレアーゼ要素がTth Agoヌクレアーゼ要素を含む、付記44に記載の組成物。
核酸誘導型ヌクレアーゼのライブラリを作製する方法であって:
核酸誘導型ヌクレアーゼのライブラリを製造するのに十分な様式下で、複数の異なるガイド核酸をヌクレアーゼと組み合わせること、
を含む方法。
付記47.
前記ヌクレアーゼがCasヌクレアーゼである、付記46に記載の方法。
付記48.
前記Casヌクレアーゼが切断活性を含む、付記47に記載の方法。
付記49.
前記Casヌクレアーゼが切断欠損性突然変異体である、付記47に記載の方法。
付記50.
前記ライブラリが5以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記46〜49のいずれか1項に記載の方法。
前記ライブラリが25以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記50に記載の方法。
付記52.
前記ライブラリが100以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記51に記載の方法。
付記53.
前記ライブラリが500以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記52に記載の方法。
付記54.
前記ライブラリが1000以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、付記53に記載の方法。
付記55.
前記核酸ガイドが、crRNA及びtracrRNAを含む、付記46〜54のいずれか1項に記載の方法。
前記核酸ガイドがsgRNAを含む、付記46〜55のいずれか1項に記載の方法。
付記57.
前記方法が核酸ガイドの製造をさらに含む、付記1〜56のいずれか1項に記載の方法。
付記58.
前記核酸ガイドが、該核酸ガイドをコードするベクターから核酸ガイドを発現することによって製造される、付記57に記載の方法。
付記59.
前記核酸ガイドが、インビトロ転写プロトコールを使用して製造される、付記57に記載の方法。
付記60.
以下の:
sgRNA足場鋳型ドメインを含むベクター;
PCR反応においてベクターと共に使用するために構成されたリバースプライマー;及び
RNAポリメラーゼ、
を含むキット。
前記リバースプライマーが、ポリAドメイン及びsgRNA足場ドメインを含む、付記60に記載のキット。
付記62.
前記RNAポリメラーゼがT7ポリメラーゼである、付記60〜61のいずれか1項に記載のキット。
付記63.
前記キットがDNAポリメラーゼをさらに含む、付記60〜62のいずれか1項に記載のキット。
付記64.
前記キットがPCRバッファーをさらに含む、付記60〜63のいずれか1項に記載のキット。
付記65.
前記キットがヌクレアーゼをさらに含む、付記60〜64のいずれか1項に記載のキット。
前記ヌクレアーゼがCasヌクレアーゼである、付記65に記載のキット。
付記67.
前記Casヌクレアーゼが切断活性を含む、付記66に記載のキット。
付記68.
前記Casヌクレアーゼが切断欠損性突然変異体である、付記66に記載のキット。
Claims (9)
- RNA配列ライブラリーサンプルから標的cDNAsを選択的に減損させる方法であって:
その両者がRNAから転写される標的cDNAs及び非標的cDNAsを含むRNA配列ライブラリーサンプルを取得し、ここで標的cDNAsは、リボソームRNAから転写されるcDNAsを含み;
該サンプルから標的cDNAsを減損させるのに十分な様式下で、サンプルを標的cDNAsに特異的な核酸誘導型ヌクレアーゼと接触させ、ここで、当該核酸誘導型ヌクレアーゼがRNAガイド要素及びCasヌクレアーゼ要素を含み、そして
サンプルから標的cDNAを除去し、そしてそれにより前記標的cDNAsを減損させたRNA配列ライブラリーを生成すること、
を含む方法。 - 前記標的cDNAsが二本鎖核酸である、請求項1に記載の方法。
- 前記標的cDNAsが一本鎖核酸である、請求項1に記載の方法。
- 前記Casヌクレアーゼ要素が、切断活性を示し、そして前記方法が標的cDNAの切断をもたらして、サンプルからの標的cDNAを減損させる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Casヌクレアーゼ要素が、エピトープタグ、FLAGタグ、HAタグ、Hisタグ、Mycタグ、S−タグ、SBPタグ、Sofタグ、GSTタグ、GFPタグ、ビオチン、ストレプトアビジン、及び6−Hisタグからなる群から選ばれるタグをさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 前記方法が、前記サンプルからから前記標的核酸を回収することをさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記サンプルを複数の2以上の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼと接触させることを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプルをシーケンシングする工程をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RNAガイド要素が、ヒト5S、5.8S、18S、及び/又は28SRNAsに標的化されたsgRNAsを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
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