JP7149599B2 - 操作された転写活性化因子様エフェクター（ｔａｌｅ）ドメインおよびその使用 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、35 U.S.C. § 365(c)の下で、２０１４年６月３０日に出願されたU.S.S.N. 14/320,519の優先権を主張し、また、35 U.S.C. § 119(e)の下で、２０１３年８月２２日に出願された米国仮特許出願U.S.S.N. 61/868,846の優先権を主張する；これらの出願の各々は、本明細書に参照により組み込まれる。

政府支援
本発明は、米国政府の支援を受け、Defense Advanced Research Projects Agencyによって授与されたグラントHR0011-11-2-0003およびN66001-12-C-4207；National Institute of General Medical Sciencesによって授与されたグラントT32GM007753；およびNational Institutes of Healthによって授与されたグラントDP1 GM105378のもとでなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

発明の背景
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ切断ドメインとＤＮＡ結合転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）反復アレイとの融合体である。ＴＡＬＥＮは、所望の標的ＤＮＡ配列に特異的に結合して切断するように操作することができ、これはin vitroおよびin vivoでの核酸分子、遺伝子およびゲノムの操作のために有用である。操作されたＴＡＬＥＮは、限定することなく基礎研究および治療的用途を含む多くの用途の場面において有用である。例えば操作されたＴＡＬＥＮは、遺伝子ノックアウトまたはノックインの作製の場面において、ゲノムの操作のために使用することができ、これはそれぞれ、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介した、標的遺伝子のノックアウトのための標的ゲノム部位でのＤＮＡ切断の誘導によるか、または、相同性配向型修復（ＨＤＲ）を介した、外来ＤＮＡ鋳型を使用する標的ゲノム配列の置換による。ＴＡＬＥＮはしたがって、遺伝子操作された細胞、組織、および生物の生成に有用である。

ＴＡＬＥＮは、天然および合成の配列を含む、任意の所望の標的ＤＮＡ配列を切断するように設計することができる。しかし、密接に関連するオフターゲット配列から標的配列を区別するＴＡＬＥＮの能力は、深くは研究されていない。この能力およびこれに影響を与えるパラメータを理解することは、所望の特異性レベルを有するＴＡＬＥＮの設計に、およびまた、切断すべきユニークな標的配列を選択するため、例えば望ましくないオフターゲット切断の可能性を最小限にするために重要である。

ＴＡＬＥＮは、in vitroおよびin vivoでの遺伝子およびゲノムの操作のための用途の広いツールであり、その理由は、ＴＡＬＥＮが、核酸分子内の実質的に全ての標的配列に結合して切断するように設計することができるからである。例えば、ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ切断の誘導を介した、細胞のゲノム内のＤＮＡ配列の標的化された除去のために使用することができ、該ＤＮＡ切断は、次に、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して、細胞のＤＮＡ修復機構により修復される。ＴＡＬＥＮはまた、ゲノム配列に挿入される配列を含む核酸の存在下で、相同性配向型修復（ＨＤＲ）を介した、標的化された配列置換のためにも使用することができる。ＴＡＬＥＮは生細胞のゲノムを操作するために使用可能であるため、得られた遺伝的に修飾された細胞は、形質転換された細胞または組織培養物および生物を生成するために、使用することができる。

複雑な試料の場面で、例えばゲノムの場面において、ＴＡＬＥＮがＤＮＡ配列の標的切断のために使用されるシナリオでは、ＴＡＬＥＮが特定の標的配列のみに結合して切断し、オフターゲット切断活性はないか、または最小であることが、多くの場合に望ましい（例えば、ＰＣＴ出願公開WO2013/066438 A2を参照、この全内容は本明細書に参照により組み込まれる）。いくつかの態様において、理想的なＴＡＬＥＮは、その意図する標的配列にのみ特異的に結合し、全くオフターゲット活性を有さず、したがって単一の配列の標的切断、例えば、全ゲノムの場面においては目的の遺伝子の単一のアレルのみの標的切断を、可能とする。

本開示のいくつかの側面は、ＴＡＬＥＮの、オフターゲット配列を切断するという傾向およびオフターゲットＴＡＬＥＮ活性の性質に影響するパラメータについては、あまり理解されていないとの認識に基づく。ここで紹介する研究は、ＴＡＬＥＮのオフターゲット活性をもたらす構造パラメータの、より良い理解を提供する。オフターゲット活性を有さないか、最小限にしか有さない、操作されたＴＡＬＥＮを生成するための方法およびシステムが、本明細書に提供され、また、増加したオンターゲット切断効率および最小限のオフターゲット活性を有する、操作されたＴＡＬＥＮも提供される。ＴＡＬＥＮによる、非特異的またはオフターゲットＤＮＡ結合を低減するための、本明細書に提供される戦略、方法、および試薬は、他のＤＮＡ結合タンパク質にも適用可能であることが、当業者によって理解されるであろう。特に、ＤＮＡへの非特異的結合を低減するために、ＤＮＡ結合タンパク質のアミノ酸配列を修飾するための戦略であって、カチオン性アミノ酸残基を、カチオン性ではないか、非荷電であるか、または生理的ｐＨでアニオン性ではないアミノ酸残基で置換することによる、前記戦略を使用して、例えば、他のＴＡＬＥエフェクタータンパク質、操作されたジンクフィンガータンパク質（ジンクフィンガーヌクレアーゼを含む）、およびＣａｓ９タンパク質などの特異性を減少させることができる。

本開示のいくつかの側面は、操作され、単離された転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ドメインを提供する。いくつかの態様において、単離されたＴＡＬＥドメインはＮ末端ＴＡＬＥドメインであり、単離されたＮ末端ドメインの正味電荷は、生理的ｐＨでの標準Ｎ末端ドメイン（配列番号１）の正味電荷より少ない。いくつかの態様において、単離されたＴＡＬＥドメインはＣ末端ＴＡＬＥドメインであり、Ｃ末端ドメインの正味電荷は、生理的ｐＨでの標準Ｃ末端ドメイン（配列番号２２）の正味電荷より少ない。いくつかの態様において、単離されたＴＡＬＥドメインはＮ末端ＴＡＬＥドメインであり、標的核酸分子に対するＮ末端ドメインの結合エネルギーは、標準Ｎ末端ドメイン（配列番号１）の結合エネルギーより少ない。いくつかの態様において、単離されたＴＡＬＥドメインはＣ末端ＴＡＬＥドメインであり、標的核酸分子に対するＣ末端ドメインの結合エネルギーは、標準Ｃ末端ドメイン（配列番号２２）の結合エネルギーより少ない。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインの正味電荷は、＋６以下、＋５以下、＋４以下、＋３以下、＋２以下、＋１以下、＋０以下、－１以下、－２以下、－３以下、－４以下、または－５以下である。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインはアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は、標準Ｃ末端ドメイン配列とは次の点で、すなわち標準Ｃ末端ドメイン配列の少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基が、生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基で置き換えられている点で異なっている。いくつかの態様において、Ｎ末端ドメインはアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は、標準Ｎ末端ドメイン配列とは次の点で、すなわち標準Ｎ末端ドメイン配列の少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基が、生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基で置き換えられている点で異なっている。いくつかの態様において、単離されたＴＡＬＥドメインの、少なくとも１個の、少なくとも２個の、少なくとも３個の、少なくとも４個の、少なくとも５個の、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、少なくとも９個の、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、または少なくとも１５個のカチオン性アミノ酸残基は、生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基で置き換えられている。いくつかの態様において、少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）である。いくつかの態様において、生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基は、グルタミン（Ｑ）またはグリシン（Ｇ）である。いくつかの態様において、少なくとも１つのリジンまたはアルギニン残基は、グルタミン残基で置き換えられている。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、１または２以上の次のアミノ酸置換：Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ、を含む。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、Ｑ３バリアント配列（Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｋ８０１Ｑ）を含む。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、Ｑ７バリアント配列（Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ）を含む。いくつかの態様において、Ｎ末端ドメインは、標準Ｎ末端ドメインのトランケート型である。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、標準Ｃ末端ドメインのトランケート型である。いくつかの態様において、トランケートされたドメインは、標準ドメインの残基の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、または２５％未満を含む。いくつかの態様において、トランケートされたＣ末端ドメインは、６０個未満、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２９個未満、２８個未満、２７個未満、２６個未満、２５個未満、２４個未満、２３個未満、２２個未満、２１個未満、または２０個未満のアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、トランケートされたＣ末端ドメインは、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０個の残基を含む。いくつかの態様において、単離されたＴＡＬＥドメインは、次の構造：［Ｎ末端ドメイン］－［ＴＡＬＥ反復アレイ］－［Ｃ末端ドメイン］－［エフェクタードメイン］；または［エフェクタードメイン］－［Ｎ末端ドメイン］－［ＴＡＬＥ反復アレイ］－［Ｃ末端ドメイン］、を含むＴＡＬＥ分子中に含まれる。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、ヌクレアーゼドメイン、転写活性化因子もしくはリプレッサードメイン、リコンビナーゼドメイン、またはエピゲノム修飾酵素ドメインを含む。いくつかの態様において、ＴＡＬＥ分子は、疾患または障害に関連することが知られている遺伝子内の標的配列に結合する。

本開示のいくつかの側面は、標準ＴＡＬＥＮと比較して、修飾された正味電荷および／またはそれらの標的核酸配列に結合する修飾された結合エネルギーを有する、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を提供する。典型的には、本発明のＴＡＬＥＮは、（ａ）ヌクレアーゼ切断ドメイン；（ｂ）ヌクレアーゼ切断ドメインにコンジュゲートしたＣ末端ドメイン；（ｃ）Ｃ末端ドメインにコンジュゲートしたＴＡＬＥ反復アレイ；および（ｄ）ＴＡＬＥ反復アレイにコンジュゲートしたＮ末端ドメイン、を含む。いくつかの態様において、（ｉ）生理的ｐＨでのＮ末端ドメインの正味電荷は、生理的ｐＨでの標準Ｎ末端ドメイン（配列番号１）の正味電荷より少なく；および／または（ｉｉ）生理的ｐＨでのＣ末端ドメインの正味電荷は、生理的ｐＨでの標準Ｃ末端ドメイン（配列番号２２）の正味電荷より少ない。いくつかの態様において、（ｉ）標的核酸分子に対するＮ末端ドメインの結合エネルギーは、標準Ｎ末端ドメイン（配列番号１）の結合エネルギーより少なく；および／または（ｉｉ）標的核酸分子に対するＣ末端ドメインの結合エネルギーは、標準Ｃ末端ドメイン（配列番号２２）の結合エネルギーより少ない。いくつかの態様において、（ｉ）標的核酸分子に対するＮ末端ドメインの結合エネルギーは、標準Ｎ末端ドメイン（配列番号１）の結合エネルギーより少ない；および／または（ｉｉ）標的核酸分子に対するＣ末端ドメインの結合エネルギーは、標準Ｃ末端ドメイン（配列番号２２）の結合エネルギーより少ない。いくつかの態様において、生理的ｐＨでのＣ末端ドメインの正味電荷は、＋６以下、＋５以下、＋４以下、＋３以下、＋２以下、＋１以下、＋０以下、－１以下、－２以下、－３以下、－４以下、または－５以下である。いくつかの態様において、Ｎ末端ドメインはアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は、標準Ｎ末端ドメイン配列の少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基が、カチオン性電荷を有さないか、電荷を全く有さないか、またはアニオン性電荷を有するアミノ酸残基で置き換えられている点で、標準Ｎ末端ドメイン配列とは異なっている。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインはアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は、標準Ｃ末端ドメイン配列の少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基が、カチオン性電荷を有さないか、電荷を全く有さないか、またはアニオン性電荷を有するアミノ酸残基で置き換えられている点で、標準Ｃ末端ドメイン配列とは異なっている。いくつかの態様において、Ｎ末端ドメインおよび／またはＣ末端ドメインにおいて、少なくとも１個の、少なくとも２個の、少なくとも３個の、少なくとも４個の、少なくとも５個の、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、少なくとも９個の、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、または少なくとも１５個のカチオン性アミノ酸は、カチオン性電荷を有さないか、電荷を全く有さないか、またはアニオン性電荷を有するアミノ酸残基で置き換えられている。いくつかの態様において、少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）である。いくつかの態様において、カチオン性アミノ酸を置き換えるアミノ酸残基は、グルタミン（Ｑ）またはグリシン（Ｇ）である。本開示の側面に従って置換され得るＣ末端ドメインの正に荷電した残基としては、限定はされないが、アルギニン（Ｒ）残基およびリジン（Ｋ）残基、例えば、Ｃ末端ドメインのＲ７４７、Ｒ７７０、Ｋ７７７、Ｋ７７８、Ｋ７８８、Ｒ７８９、Ｒ７９２、Ｒ７９３、Ｒ７９７、およびＲ８０１である（例えば配列番号２２を参照、番号付けは完全長ＴＡＬＥＮタンパク質のそれぞれの残基の位置を示し、配列番号２２に提供されるＣ末端ドメインの同等の位置は、Ｒ８、Ｒ３０、Ｋ３７、Ｋ３８、Ｋ４８、Ｒ４９、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５７、Ｒ６１である）。本開示の側面に従って置換され得るＮ末端ドメインの正に荷電した残基としては、限定はされないが、アルギニン（Ｒ）残基およびリジン（Ｋ）残基、例えば、Ｋ５７、Ｋ７８、Ｒ８４、Ｒ９７、Ｋ１１０、Ｋ１１３、およびＲ１１４（例えば、配列番号１を参照）が挙げられる。いくつかの態様において、少なくとも１つのリジンまたはアルギニン残基は、グルタミン残基で置き換えられている。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、１または２以上の次のアミノ酸置換：Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ、を含む。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、Ｑ３バリアント配列（Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｋ８０１Ｑ）を含む。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、Ｑ７バリアント配列（Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ）を含む。いくつかの態様において、Ｎ末端ドメインは、標準Ｎ末端ドメインのトランケート型である。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、標準Ｃ末端ドメインのトランケート型である。いくつかの態様において、トランケートされたドメインは、標準ドメインの残基の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、または２５％未満を含む。いくつかの態様において、トランケートされたＣ末端ドメインは、６０個未満、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２９個未満、２８個未満、２７個未満、２６個未満、２５個未満、２４個未満、２３個未満、２２個未満、２１個未満、または２０個未満のアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、トランケートされたＣ末端ドメインは、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０個の残基を含む。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ切断ドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである。いくつかの態様において、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、配列番号２６～３０で提供される配列を含む。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは単量体である。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮ単量体は、別のＴＡＬＥＮ単量体と二量体化してＴＡＬＥＮ二量体を形成する。いくつかの態様において、二量体は、ヘテロ二量体である。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、疾患または障害に関連することが知られている遺伝子内の標的配列に結合する。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、二量体化の際に標的配列を切断する。いくつかの態様において、処置または予防される疾患は、ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳ、または増殖性疾患である。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの処置または予防において、ＣＣＲ５（Ｃ－Ｃケモカイン受容体５型）標的配列に結合する。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症変異）標的配列に結合する。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、ＶＥＧＦＡ（血管内皮増殖因子Ａ）標的配列に結合する。

本開示のいくつかの側面は、本明細書に記載のＴＡＬＥＮを、例えばＴＡＬＥＮ単量体を含む、組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、本発明のＴＡＬＥＮ単量体および、ヘテロ二量体を形成する別のＴＡＬＥＮ単量体を含み、ここで二量体は、ヌクレアーゼ活性を示す。いくつかの態様において、組成物は医薬組成物である。

本開示のいくつかの側面は、本明細書に提供されるＴＡＬＥＮを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、in vitroで細胞または組織と接触させるのに好適になるように処方される。いくつかの態様において、医薬組成物は、例えば、in vitroまたはex vivoでの細胞または組織内の標的配列を切断するための、ＴＡＬＥＮの有効量を含む。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、目的の遺伝子内の標的配列、例えば疾患または障害と関連することが知られている遺伝子内の標的配列に結合し、および組成物は、疾患または障害に関連する徴候および／または症状を軽減するための、ＴＡＬＥＮの有効量を含む。本開示のいくつかの側面は、本明細書に提供されるＴＡＬＥＮおよび薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの態様において、医薬組成物は、対象への投与のために処方される。いくつかの態様において、医薬組成物は、対象における細胞の標的配列を切断するためのＴＡＬＥＮの有効量を含む。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、疾患または障害と関連することが知られている遺伝子内の標的配列に結合し、組成物は、疾患または障害に関連する徴候および／または症状を緩和するための、ＴＡＬＥＮの有効量を含む。

本開示のいくつかの側面は、本明細書に提供されるＴＡＬＥＮを用いて、核酸分子内の標的配列を切断する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、標的配列を含む核酸分子を、標的配列に結合する本発明のＴＡＬＥＮと、ＴＡＬＥＮが標的配列に結合して切断するのに好適な条件下で、接触させることを含む。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、単量体として提供される。いくつかの態様において、本発明のＴＡＬＥＮ単量体は、本発明のＴＡＬＥＮ単量体と二量体化してヌクレアーゼ活性を有するヘテロ二量体を形成することができる異なるＴＡＬＥＮ単量体を含む、組成物中で提供される。いくつかの態様において、本発明のＴＡＬＥＮは、医薬組成物中で提供される。いくつかの態様において、標的配列は、細胞のゲノム内にある。いくつかの態様において、標的配列は、対象の中にある。いくつかの態様において、方法は、ＴＡＬＥＮを含む例えば医薬組成物などの組成物を、対象に対して、ＴＡＬＥＮが標的部位に結合して切断するのに充分な量で、投与することを含む。

本開示のいくつかの側面は、操作されたＴＡＬＥＮを製造する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、標準Ｎ末端ＴＡＬＥＮドメインおよび／または標準Ｃ末端ＴＡＬＥＮドメインの少なくとも１個のアミノ酸を、置き換えられるアミノ酸と比較して生理的ｐＨで電荷を有さないかまたは負電荷を有するアミノ酸で置き換えること；および／または、Ｎ末端ＴＡＬＥＮドメインおよび／またはＣ末端ＴＡＬＥＮドメインをトランケートして、正に荷電した断片を除去すること；したがって、生理的ｐＨで減少した正味電荷のＮ末端ドメインおよび／またはＣ末端ドメインを有する、操作されたＴＡＬＥＮを生成すること、を含む。いくつかの態様において、置換されている少なくとも１つのアミノ酸は、カチオン性アミノ酸または生理的ｐＨで正電荷を有するアミノ酸を含む。本開示の側面に従って置換され得るＣ末端ドメインの正に荷電した残基としては、限定はされないが、アルギニン（Ｒ）残基およびリジン（Ｋ）残基、例えば、Ｃ末端ドメインのＲ７４７、Ｒ７７０、Ｋ７７７、Ｋ７７８、Ｋ７８８、Ｒ７８９、Ｒ７９２、Ｒ７９３、Ｒ７９７、およびＲ８０１が挙げられる。本開示の側面に従って置換され得るＮ末端ドメインの正に荷電した残基としては、限定はされないが、アルギニン（Ｒ）残基およびリジン（Ｋ）残基、例えば、Ｋ５７、Ｋ７８、Ｒ８４、Ｒ９７、Ｋ１１０、Ｋ１１３、およびＲ１１４が挙げられる。いくつかの態様において、少なくとも１つのアミノ酸を置き換えるアミノ酸は、カチオン性アミノ酸または中性のアミノ酸である。いくつかの態様において、トランケートされたＮ末端ＴＡＬＥＮドメインおよび／またはトランケートされたＣ末端ＴＡＬＥＮドメインは、それぞれの標準ドメインの残基の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、または２５％未満を含む。いくつかの態様において、トランケートされたＣ末端ドメインは、６０個未満、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２９個未満、２８個未満、２７個未満、２６個未満、２５個未満、２４個未満、２３個未満、２２個未満、２１個未満、または２０個未満のアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、トランケートされたＣ末端ドメインは、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０個のアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、方法は、標準Ｎ末端ＴＡＬＥＮドメインおよび／または標準Ｃ末端ＴＡＬＥＮドメインの少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、または少なくとも１５個のアミノ酸を、生理的ｐＨで電荷を有さないかまたは負電荷を有するアミノ酸で置き換えることを含む。いくつかの態様において、置き換えられるアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）である。いくつかの態様において、生理的ｐＨで電荷を有さないかまたは負電荷を有するアミノ酸は、グルタミン（Ｑ）またはグリシン（Ｇ）である。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのリジンまたはアルギニン残基を、グルタミン残基で置き換えることを含む。

本開示のいくつかの側面は、本明細書に提供される操作されたＴＡＬＥＮ、またはかかるＴＡＬＥＮを含む組成物（例えば、医薬組成物）を含む、キットを提供する。いくつかの態様において、キットは、ＴＡＬＥＮを賦形剤と接触させて、核酸をＴＡＬＥＮと接触させるのに好適な組成物を生成するための、賦形剤および指示書を含む。いくつかの態様において、賦形剤は薬学的に許容可能な賦形剤である。

上記の概要は、本明細書に開示された技術のいくつかの態様、利点、特徴、および使用について、非限定的に説明することを意図する。本明細書に開示された技術の他の態様、利点、特徴、および使用は、詳細な説明、図面、例、および特許請求の範囲から明らかであろう。

ＴＡＬＥＮ構築物（architecture）および選択スキーム。（Ａ）ＴＡＬＥＮの構築物。ＴＡＬＥＮ単量体は、Ｎ末端ドメインに続いてＴＡＬＥ反復のアレイ、Ｃ末端ドメイン、およびＦｏｋＩヌクレアーゼ切断ドメインを含む。各ＴＡＬＥ反復の１２番目と１３番目のアミノ酸（ＲＶＤ、赤）は、特定のＤＮＡ塩基対を認識する。２つの異なるＴＡＬＥＮは、それらに対応する半部位に結合し、ＦｏｋＩの二量体化およびＤＮＡ切断を可能にする。本研究で用いたＣ末端ドメインバリアントが示されている。（Ｂ）部分的にランダム化された左半部位（Ｌ）、スペーサー（Ｓ）、右半部位（Ｒ）および定常領域（太い黒線）を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドの一本鎖ライブラリーを環状化し、ローリングサークル増幅によりコンカテマー化した。得られたＤＮＡライブラリーを、目的のin vitro翻訳したＴＡＬＥＮと共にインキュベートした。切断されたライブラリーメンバーを平滑化し、アダプター＃１にライゲートした。ライゲーション産物は、アダプター＃１からなる１つのプライマーと、アダプター＃２－定常配列からなる、定常領域にアニーリングする別のプライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅した。長さが

の標的配列カセットのアンプリコンをゲル精製によって単離し、ハイスループットＤＮＡシーケンシングおよびコンピューター分析に供した。

in vitro選択の結果。選択を耐えた配列（灰色）および選択前配列（黒）の割合を、両方の半部位における変異数の関数として、ＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮ（Ａ）およびＡＴＭ ＴＡＬＥＮ（Ｂ）について示す。（Ｃ）標的半部位における全ての位置、および単一の隣接位置における、Ｌ１８＋Ｒ１８ ＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮについての特異性スコア。色は、最大特異性スコアの１．０～白（特異性なし、スコア０）～最大の負のスコアの－１．０の範囲である。枠内の塩基は、意図された標的塩基を表す。（Ｄ）Ｌ１８＋Ｒ１８ ＡＴＭ ＴＡＬＥＮについて、（Ｃ）と同様。（Ｅ）１６の変異体ＤＮＡ配列（変異は赤色）について、Ｌ１３＋Ｒ１３ ＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮの選択からの、オンターゲットＤＮＡ（ＯｎＢ）と比較した濃縮値（enrichment value）。（Ｆ）オンターゲット切断（＝１）に対して正規化された、（Ｅ）にリストされた配列についての、in vitroの個別のＴＡＬＥＮ切断効率（切断されたＤＮＡの、全ＤＮＡに対する比率）と、オンターゲット濃縮値（＝１）に対して正規化された、選択におけるそれらの濃縮値の間の対応。（Ｇ）（Ｆ）で使用されたオンターゲットおよびオフターゲット配列の、ＰＡＧＥによって分析された個別アッセイ。

オンターゲットおよび予測されたオフターゲットゲノム部位での、ＴＡＬＥＮにより誘導された細胞修飾。（Ａ）ＴＡＬＥＮなし、またはヘテロ二量体ＥＬ／ＫＫ、ヘテロ二量体ＥＬＤ／ＫＫＲ、もしくはホモ二量体（Ｈｏｍｏ）ＦｏｋＩバリアントを含有するＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮのいずれかで処置した細胞について、細胞修飾率を示したものであり、該細胞修飾率は、オンターゲット部位（Ｏｎ）および予測オフターゲット部位（Ｏｆｆ）について、配列の総数に相対的な、ＴＡＬＥＮ切断に整合して観察された挿入または欠失（インデル）の数のパーセンテージとして示される。（Ｂ）ＡＴＭ ＴＡＬＥＮについて、（Ａ）と同様。（Ｃ）ＥＬＤ／ＫＫＲ ＦｏｋＩドメインを含むＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮで処置した細胞について、オンターゲット部位およびオフターゲット部位での修飾された配列の例。示された各例について、未修飾のゲノム部位が最初の配列であり、続いて欠失を含有するトップ３の配列が示される。括弧内の数字はシーケンシングの数を表し、半部位は下線太字で示す。

ヒトゲノムにおける、ＴＡＬＥＮ特異性およびオフターゲット部位の存在量の両方を考慮した、ＴＡＬＥＮ長の関数としての予測されたオフターゲットゲノム切断。（Ａ）オンターゲット（ゼロ変異）および１～６個の変異を含むオフターゲット配列の濃縮値を、様々なＴＡＬＥ反復アレイ長さのＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮについて示す。ＴＡＬＥＮは、長さが３２ｂｐ（Ｌ１６＋Ｒ１６）、２９ｂｐ（Ｌ１６＋Ｒ１３またはＬ１３＋Ｒ１６）、２６ｂｐ（Ｌ１６＋Ｒ１０またはＬ１３＋Ｒ１３またはＬ１０＋Ｒ１６）、２３ｂｐ（Ｌ１３＋Ｒ１０またはＬ１０＋Ｒ１３）または２０ｂｐ（Ｌ１０＋Ｒ１０）のＤＮＡ部位を標的とした。（Ｂ）９個のＣＣＲ５Ｂオンターゲット配列（Ｌ１０、Ｌ１３、またはＬ１６を、Ｒ１０、Ｒ１３、またはＲ１６と組み合わせたもの）の各々に関連するヒトゲノム中の部位の数、これにより、２つの半部位の間に１２～２５ｂｐのスペーサー長が可能となる。（Ｃ）全９個のＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮについて、全体的なゲノムのオフターゲット切断頻度を、一定数の変異を含むヒトゲノム中の部位の数に、（Ａ）に示された同数の変異を含むオフターゲット配列の濃縮値を掛け合わせることにより予測した。おそらくは選択感度の限界により、濃縮値は高い変異数において横ばいとなるため、高い変異濃縮値は、濃縮値を変異数の関数として近似することにより、外挿する必要があった（表９）。全体的な予測のゲノム切断を、ヒトゲノムで１回より多く発生することが観測された部位の変異数についてのみ、算出した。

標準または操作されたＣ末端ドメインを含むＴＡＬＥＮの、in vitro特異性および個別切断効率。（ＡおよびＢ）標準、Ｑ３、Ｑ７、または２８－ａａＣ末端ドメインを含む（Ａ）ＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮまたは（Ｂ）ＡＴＭ ＴＡＬＥＮの選択についての、オンターゲット濃縮値。（Ｃ）ＣＣＲ５Ａオンターゲット配列（ＯｎＣ）と小文字で示す変異を有する二重変異配列。（Ｄ）ＡＴＭオンターゲット配列（ＯｎＣ）と小文字で示す変異を有する単一変異配列。（Ｅ）標準または操作されたＱ７ Ｃ末端ドメインのいずれかを含むＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮを用いた、（Ｃ）にリストされたＤＮＡ配列の、個別のin vitro切断効率。（Ｆ）ＡＴＭ ＴＡＬＥＮについて、（Ｅ）と同様。

ヒト細胞における操作されたＴＡＬＥＮの特異性。標準および操作されたＴＡＬＥＮの細胞修飾効率を、全配列からのＴＡＬＥＮ誘導性修飾に整合するインデルのパーセンテージとして表し、これを、オンターゲットＣＣＲ５Ａ配列および、最も高度に切断された試験されたオフターゲット基質である、ＣＣＲ５Ａオフターゲット部位＃５について示す。オンターゲットのオフターゲット修飾に対する比率として定義される細胞特異性を、各バーの対の下に示す。

ヒトＣＣＲ５およびＡＴＭ遺伝子における標的ＤＮＡ配列。本研究で使用するＴＡＬＥＮのための標的ＤＮＡ配列を、黒で示す。各半部位標的の５’Ｔを認識するＮ末端ＴＡＬＥＮ末端に注目し（５’）、ＴＡＬＥＮは、標的とされた塩基対の数に応じて命名される。示されたＣＣＲ５ Ｌ１８とＲ１８を標的とするＴＡＬＥＮを、ＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮと呼び、一方、示されたＬ１０、Ｌ１３、Ｌ１６、Ｒ１０、Ｒ１３またはＲ１６半部位を標的とするＴＡＬＥＮを、ＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮと呼ぶ。

ヒートマップにおける、すべてのＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮの選択からの特異性プロファイル。ＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮの選択内のすべての標的化塩基対に対する特異性スコアが示される。標的半部位における全ての位置、および単一の隣接位置における、Ｌ１８＋Ｒ１８ ＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮについての特異性スコア。色は、最大特異性スコアの１．０～白（スコア０、特異性なし）～最大の負のスコアの－１．０の範囲である。枠内の塩基は、意図された標的塩基を表す。右側のタイトルは、選択に使用されるＴＡＬＥＮが、標準ＴＡＬＥＮ構築物（これは標準Ｃ末端ドメイン、野生型Ｎ末端ドメイン、およびＥＬ／ＫＫ ＦｏｋＩバリアントを含む）と異なるかどうかを示す。選択は、表２にリストされた条件に対応する。（Ａ）標準、Ｑ３、Ｑ７、２８－ａａ、３２ｎＭ標準、８ｎＭ標準、４ｎＭ標準、３２ｎＭ Ｑ７、および８ｎＭ Ｑ７のＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮ選択の、特異性プロファイル。（Ｂ）４ｎＭ Ｑ７、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、標準ＥＬＤ／ＫＫＲ、Ｑ３ ＥＬＤ／ＫＫＲ、Ｑ７ ＥＬＤ／ＫＫＲおよびＮ２ ＥＬＤ／ＫＫＲのＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮ選択の、特異性プロファイル。指定されていない場合、ＴＡＬＥＮ濃度は１６ｎＭである。

すべてのＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮ選択からの、棒グラフで表した特異性プロファイル。ＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮの選択内のすべての標的化された塩基対に対する特異性スコアが示される。正の特異性スコアは、特異性スコア１．０の完全な特異性までは、その位置での他の可能性に対する当該塩基対の濃縮を表す。負の特異性スコアは、－１．０の完全な非特異性スコアまでは、その塩基対に対する濃縮を表す。指定された位置は、Ｘ軸上に積み重ね棒グラフとしてプロットし（同一位置の複数の指定された塩基対は、短い棒を前側にして互いの上にプロットし、端から端には並べない）、一方、指定されない塩基対は、細いグループ化された棒としてプロットした。右側のタイトルは、選択に使用されるＴＡＬＥＮが、標準ＴＡＬＥＮ構築物（これは標準Ｃ末端ドメイン、野生型Ｎ末端ドメイン、およびＥＬ／ＫＫ ＦｏｋＩバリアントを含む）と異なるかどうかを示す。選択は、表２にリストされた条件に対応する。（Ａ）標準、Ｑ３、Ｑ７、２８－ａａ、３２ｎＭ標準、および８ｎＭ標準のＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮ選択の、特異性プロファイル。（Ｂ）４ｎＭ標準、３２ｎＭ Ｑ７、８ｎＭ Ｑ７、４ｎＭ Ｑ７、Ｎ１、およびＮ２のＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮ選択の、特異性プロファイル。（Ｃ）Ｎ３、標準ＥＬＤ／ＫＫＲ、Ｑ３ ＥＬＤ／ＫＫＲ、Ｑ７ ＥＬＤ／ＫＫＲおよびＮ２ ＥＬＤ／ＫＫＲのＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮ選択の、特異性プロファイル。指定されていない場合、ＴＡＬＥＮ濃度は１６ｎＭである。

ヒートマップにおける、すべてのＡＴＭ ＴＡＬＥＮの選択からの特異性プロファイル。ＡＴＭ ＴＡＬＥＮの選択内のすべての標的化塩基対に対する特異性スコアが示される。標的半部位における全ての位置、および単一の隣接位置における、Ｌ１８＋Ｒ１８ ＡＴＭ ＴＡＬＥＮについての特異性スコア。色は、最大特異性スコアの１．０～白（スコア０、特異性なし）～最大の負のスコアの－１．０の範囲である。枠内の塩基は、意図された標的塩基を表す。右側のタイトルは、選択に使用されるＴＡＬＥＮが、標準ＴＡＬＥＮ構築物（これは標準Ｃ末端ドメイン、野生型Ｎ末端ドメイン、およびＥＬ／ＫＫ ＦｏｋＩバリアントを含む）と異なるかどうかを示す。選択は、表２にリストされた条件に対応する。（Ａ）（１２ｎＭ）標準、Ｑ３、（１２ｎＭ）Ｑ７、２４ｎＭ標準、６ｎＭ標準、３ｎＭ標準、２４ｎＭ Ｑ７、および６ｎＭ Ｑ７のＡＴＭ ＴＡＬＥＮ選択の、特異性プロファイル。（Ｂ）Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、標準ＥＬＤ／ＫＫＲ、Ｑ３ ＥＬＤ／ＫＫＲ、Ｑ７ ＥＬＤ／ＫＫＲおよびＮ２ ＥＬＤ／ＫＫＲのＡＴＭ ＴＡＬＥＮ選択の、特異性プロファイル。指定されていない場合、ＴＡＬＥＮ濃度は１２ｎＭである。

すべてのＡＴＭ ＴＡＬＥＮ選択からの、棒グラフで表した特異性プロファイル。ＡＴＭ ＴＡＬＥＮの選択内のすべての標的化された塩基対に対する特異性スコアが示される。正の特異性スコアは、特異性スコア１．０の完全な特異性までは、その位置での他の可能性に対する当該塩基対の濃縮を表す。負の特異性スコアは、－１．０の完全な非特異性スコアまでは、その塩基対に対する濃縮を表す。指定された位置は、Ｘ軸上に積み重ね棒グラフとしてプロットし（同一位置の複数の指定された塩基対は、短い棒を前側にして互いの上にプロットし、端から端には並べない）、一方、指定されない塩基対は、細いグループ化された棒としてプロットした。右側のタイトルは、選択に使用されるＴＡＬＥＮが、標準ＴＡＬＥＮ構築物（これは標準Ｃ末端ドメイン、野生型Ｎ末端ドメイン、およびＥＬ／ＫＫ ＦｏｋＩバリアントを含む）と異なるかどうかを示す。選択は、表２にリストされた条件に対応する。（Ａ）標準、Ｑ３、Ｑ７、２８－ａａ、３２ｎＭ標準、および８ｎＭ標準のＡＴＭ ＴＡＬＥＮ選択の、特異性プロファイル。（Ｂ）３ｎＭ標準、２４ｎＭ Ｑ７、６ｎＭ Ｑ７、Ｎ１、Ｎ２およびＮ３のＡＴＭ ＴＡＬＥＮ選択の、特異性プロファイル。（Ｃ）標準ＥＬＤ／ＫＫＲ、Ｑ３ ＥＬＤ／ＫＫＲ、Ｑ７ ＥＬＤ／ＫＫＲおよびＮ２ ＥＬＤ／ＫＫＲのＡＴＭ ＴＡＬＥＮ選択の、特異性プロファイル。指定されていない場合、ＴＡＬＥＮ濃度は１２ｎＭである。

ヒートマップにおける、すべてのＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮの選択からの特異性プロファイル。ＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮの選択内のすべての標的化塩基対に対する特異性スコアが示される。標的半部位における全ての位置、および単一の隣接位置における、左（Ｌ１０、Ｌ１３、Ｌ１６）および右（Ｒ１０、Ｒ１３、Ｒ１６）半部位のすべての可能な組み合わせを標的とするＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮについての特異性スコア。色は、最大特異性スコアの１．０～白（スコア０、特異性なし）～最大の負のスコアの－１．０の範囲である。枠内の塩基は、意図された標的塩基を表す。右側のタイトルは、選択に使用されるＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮについての標的化された左（Ｌ）および右（Ｒ）標的半部位を示す。選択は、表２にリストされた条件に対応する。

すべてのＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮ選択からの、棒グラフで表した特異性プロファイル。ＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮの選択内のすべての標的化された塩基対に対する特異性スコアが示される。正の特異性スコアは、特異性スコア１．０の完全な特異性までは、その位置での他の可能性に対する当該塩基対の濃縮を表す。負の特異性スコアは、－１．０の完全な非特異性スコアまでは、その塩基対に対する濃縮を表す。指定された位置は、Ｘ軸上に積み重ね棒グラフとしてプロットし（同一位置の複数の指定された塩基対は、短い棒を前側にして互いの上にプロットし、端から端には並べない）、一方、指定されない塩基対は、細いグループ化された棒としてプロットした。右側のタイトルは、選択に使用されるＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮについての標的化された左（Ｌ）および右（Ｒ）標的半部位を示す。選択は、表２にリストされた条件に対応する。

二重変異体配列の予測された濃縮値に対する観測された濃縮値。（Ａ）Ｌ１３＋Ｒ１３ ＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮの選択について、個別の配列の観測された二重変異体濃縮値（選択後配列の存在量÷選択前配列の存在量）を、オンターゲット濃縮値（定義により＝１．０）について正規化し、オンターゲット濃縮値について正規化された成分の単一変異体の濃縮値を乗じることにより算出した予測二重変異体濃縮値に対して、プロットした。したがって予測二重変異体濃縮値は、各単一変異から二重変異体濃縮値に対して、独立した寄与を果たす。（Ｂ）観測された二重変異体配列濃縮を、予測二重変異体配列濃縮で割り算し、２つの変異の間の距離（塩基対の単位）の関数としてプロットしたもの。同一の半部位に２つの変異を有する配列のみを検討した。

操作されたＴＡＬＥＮドメインおよびＴＡＬＥＮ濃度の、特異性に対する効果。（Ａ）ＣＣＲ５Ａ部位の各位置での標的塩基対の特異性スコアを、標準、Ｑ３、Ｑ７、または２８－ａａＣ末端ドメインを含有するＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮについて算出した。Ｑ３、Ｑ７、または２８－ａａＣ末端ドメインＴＡＬＥＮの特異性スコアから、標準Ｃ末端ドメインを有するＴＡＬＥＮの特異性スコアを引き算したものを示す。（Ｂ）操作されたＮ末端ドメインＮ１、Ｎ２、またはＮ３を含有するＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮについて、（Ａ）と同様。（Ｃ）（Ａ）と同様だが、１６ｎＭ、８ｎＭまたは４ｎＭにてアッセイされた標準ＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮの特異性スコアから、３２ｎＭにてアッセイされた標準ＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮの特異性スコアを引き算したものの差を比較。（Ｄ～Ｆ）ＡＴＭ ＴＡＬＥＮについて、（Ａ～Ｃ）と同様。選択は、表２に記載された条件に対応する。

ＴＡＬＥＮのスペーサー長の選好。（Ａ）ＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮであって、次の様々な組み合わせを含有するもの：標準、Ｑ３、Ｑ７、または２８－ａａＣ末端ドメイン；Ｎ１、Ｎ２、またはＮ３のＮ末端変異；および、４、８、１６または３２ｎＭでのＥＬ／ＫＫまたはＥＬＤ／ＫＫＲのＦｏｋＩバリアント、による各選択に対して、ＤＮＡスペーサー長の濃縮値を、選択後配列中のＤＮＡスペーサー長の存在量を選択前ライブラリー配列のＤＮＡスペーサー長の存在量で割り算することにより、算出した。（Ｂ）ＡＴＭ ＴＡＬＥＮについて、（Ａ）と同様。

ＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断部位の選好。（Ａ）ＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮであって、次の様々な組み合わせを含有するもの：標準の、Ｑ３、Ｑ７、または２８－ａａＣ末端ドメイン；Ｎ１、Ｎ２、またはＮ３のＮ末端変異；および、４、８、１６または３２ｎＭでのＥＬ／ＫＫまたはＥＬＤ／ＫＫＲのＦｏｋＩバリアント、の各選択に対して、各可能なＤＮＡスペーサー長についての右半部位に先行するスペーサーＤＮＡ塩基対の数のヒストグラムを、選択全体の総配列カウントに対して正規化して示す。（Ｂ）ＡＴＭ ＴＡＬＥＮについて、（Ａ）と同様。

異なるアミノ酸置換を有するＮ末端ドメインを含むＴＡＬＥＮの、ＤＮＡ切断部位の選好。

例示のＴＡＬＥＮプラスミドコンストラクト。

定義
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかに他を示さない限り、単数形と複数形の言及を含む。したがって例えば、「薬剤」への言及は、１つの薬剤および複数の薬剤を含む。

本明細書で使用する用語「標準配列」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはアミノ酸の配列であって、その種類の知られている分子の中で各位置における塩基またはアミノ酸の最も一般的な選択を反映している前記配列を指す。例えば、タンパク質ドメインの標準アミノ酸配列は、その種類の知られている全てのドメイン、またはその種類の知られている主要なドメインの各位置に存在するアミノ酸の、最も一般的な選択を反映し得る。いくつかの態様において、標準配列はコンセンサス配列である。

核酸配列の文脈において本明細書中で使用される用語「コンセンサス配列」および「コンセンサス部位」は、複数の類似の配列の各位置で見出される最も頻繁なヌクレオチド残基を表す、算出された配列を指す。典型的には、コンセンサス配列は、類似の配列が互いに比較され、類似の配列モチーフが算出される、配列アラインメントによって決定される。ヌクレアーゼ標的部位配列の文脈において、ヌクレアーゼ標的部位のコンセンサス配列は、いくつかの態様において、所与のヌクレアーゼによって最も頻繁に結合された、最も高い親和性で結合された、および／または最高の効率で切断された、配列であってよい。

用語「コンジュゲートする」、「コンジュゲートされた」および「コンジュゲーション」とは、２つの実体の関連を指し、２つの実体とは例えば、２つのタンパク質などの２つの分子、２つのドメイン（例えば、結合ドメインと切断ドメイン）、またはタンパク質と薬剤（例えば、タンパク質結合ドメインと小分子）である。関連とは、例えば、直接的もしくは間接的な（例えば、リンカーを介した）共有結合を介するものか、または非共有結合性相互作用を介するものであり得る。いくつかの態様において、関連は共有結合性である。いくつかの態様において、２つの分子は、両方の分子を連結するリンカーを介してコンジュゲートされている。例えば、２つのタンパク質がお互いにコンジュゲートされて（例えば操作されたヌクレアーゼの結合ドメインと切断ドメインなど）タンパク質融合体を形成するいくつかの態様においては、２つのタンパク質は、ポリペプチドリンカーを介して、例えば、１つのタンパク質のＣ末端を別のタンパク質のＮ末端に連結するアミノ酸配列を介して、コンジュゲートされてもよい。

本明細書で使用する用語「有効量」は、所望の生物学的応答を誘発するのに充分な、生物学的に活性な薬剤の量を意味する。例えば、いくつかの態様において、ＴＡＬＥヌクレアーゼの有効量は、例えば、無細胞アッセイにおいて、または標的細胞、組織、もしくは生物体において、ヌクレアーゼにより特異的に結合され切断される標的部位の切断を誘導するのに充分な、ヌクレアーゼの量を指してもよい。当業者によって理解されるように、薬剤、例えば、ヌクレアーゼ、ハイブリッドタンパク質、またはポリヌクレオチドの有効量は、種々の要因に応じて、例えば、所望の生物学的応答、特定のアレル、ゲノム、標的部位、細胞、または標的とされる組織、および使用される薬剤に応じて、変化し得る。

本明細書で使用する用語「操作された」とは、ヒトによって設計され、生産され、製造され、合成され、および／または製作される、分子、複合体、物質、または実体を指す。したがって、操作された生成物は、自然界に存在しない生成物である。いくつかの態様において、操作された分子または複合体、例えば、操作されたＴＡＬＥＮ単量体、二量体、または多量体は、特定の要件を満たすために、または特定の所望の特徴を有するように設計されたＴＡＬＥＮであり、例えば、最小限のオフターゲット結合で目的の標的配列に結合するため、特定の最小または最大の切断活性を有するため、および／または特定の安定性を有するために、設計されたＴＡＬＥＮである。

本明細書中で使用される用語「単離された」とは、分子、複合体、物質、または実体であって、（１）（天然であれ、実験設定においてであれ）最初に生成された時にそれが関連していた成分の少なくともいくつかから分離されたもの、および／または（２）ヒトによって生産、製造、合成、および／または製作されたもの、を指す。単離された物質および／または実体は、最初に関連していた他の成分の、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から、分離することができる。いくつかの態様において、単離された薬剤は、約８０％より高く、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％より高く、純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、それが他の成分を実質的に含まない場合に「純粋」である。

核酸またはタンパク質の文脈において本明細書で使用する用語「ライブラリー」はそれぞれ、２または３以上の異なる核酸またはタンパク質の集団を指す。例えば、ヌクレアーゼ標的部位のライブラリーは、異なるヌクレアーゼ標的部位を含む少なくとも２つの核酸分子を含む。いくつかの態様において、ライブラリーは、少なくとも１０^１、少なくとも１０^２、少なくとも１０^３、少なくとも１０^４、少なくとも１０^５、少なくとも１０^６、少なくとも１０^７、少なくとも１０^８、少なくとも１０^９、少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１、少なくとも１０^１２、少なくとも１０^１３、少なくとも１０^１４、または少なくとも１０^１５の、異なる核酸またはタンパク質を含む。いくつかの態様において、ライブラリーのメンバーはランダム化配列、例えば、完全にまたは部分的にランダム化された配列を含んでよい。いくつかの態様において、ライブラリーは、互いに関連しない核酸分子を、例えば完全なランダム化配列を含む核酸を含む。他の態様において、ライブラリーの少なくともいくつかのメンバーは関連することができ、例えば、コンセンサス標的部位配列などの特定の配列のバリアントまたは誘導体であり得る。

本明細書中で使用される用語「リンカー」は、２つの分子または部分、例えばヌクレアーゼの結合ドメインおよび切断ドメインを連結する、化学基または分子を指す。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、または他の部分の、間に位置するか、またはそれらに隣接して、それぞれを共有結合を介して連結し、したがって両者を結び付ける。いくつかの態様において、リンカーはアミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの態様において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。

用語「ヌクレアーゼ」は、本明細書において、例えばタンパク質または小分子などの薬剤であって、核酸分子中のヌクレオチド残基を連結するホスホジエステル結合を切断することができるものを指す。いくつかの態様において、ヌクレアーゼはタンパク質であり、例えば、核酸分子に結合でき、核酸分子内のヌクレオチド残基を連結するリン酸ジエステル結合を切断することができる、酵素である。ヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断するエンドヌクレアーゼ、またはポリヌクレオチド鎖の末端でホスホジエステル結合を切断するエキソヌクレアーゼであってよい。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、特定のヌクレオチド配列内の特定のホスホジエステル結合を結合および／または切断する、部位特異的ヌクレアーゼであり、これは本明細書において、「認識配列」、「ヌクレアーゼ標的部位」または「標的部位」とも呼ばれる。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは一本鎖標的部位を認識し、一方他の態様において、ヌクレアーゼは、例えば二本鎖ＤＮＡ標的部位などの二本鎖標的部位を認識する。多くの天然に存在するヌクレアーゼの標的部位、例えば、多くの天然に存在するＤＮＡ制限ヌクレアーゼは、当業者に知られている。多くの場合、EcoRI、HindIII、またはBamHIなどのＤＮＡヌクレアーゼは、パリンドロームの長さ４～１０塩基対の二本鎖ＤＮＡの標的部位を認識し、２つのＤＮＡ鎖の各々を標的部位内の特定の位置で切断する。いくつかのエンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸の標的部位を対称的に切断し、すなわち、両方の鎖を同じ位置で切断して、末端が塩基対ヌクレオチドを含むようにし、これは本明細書で平滑末端とも称される。他のエンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸の標的部位を非対称的に切断し、すなわち、両方の鎖を異なる位置で切断して、末端が不対ヌクレオチドを含むようにする。二本鎖ＤＮＡ分子の末端の不対ヌクレオチドはまた、「オーバーハング」とも呼ばれ、例えば、不対ヌクレオチド（単数または複数）がそれぞれのＤＮＡ鎖の５’または５’末端を形成するかどうかに依存して、「５’－オーバーハング」または「３’－オーバーハング」と呼ばれる。不対ヌクレオチドで終了する二本鎖ＤＮＡ分子は、粘着（スティッキィ）末端とも呼ばれ、何故なればそれらが、相補的な不対ヌクレオチド（単数または複数）を含む他の二本鎖ＤＮＡ分子末端に粘着するからである。ヌクレアーゼタンパク質は、典型的には、タンパク質と核酸基質との相互作用を媒介する「結合ドメイン」、および核酸骨格内のホスホジエステル結合の切断を触媒する「切断ドメイン」を含む。いくつかの態様において、ヌクレアーゼタンパク質は、単量体の形態で、核酸分子に結合し切断することができ、他の態様において、ヌクレアーゼタンパク質は、標的核酸分子を切断するために、二量体化または多量体化しなければならない。天然に存在するヌクレアーゼの結合ドメインおよび切断ドメイン、ならびに特定の標的部位に結合するヌクレアーゼを生成するために組み合わせることができる、モジュラー結合ドメインおよび切断ドメインは、当業者に知られている。例えば、転写活性化因子様要素を、所望の標的部位に特異的に結合する結合ドメインとして使用し、切断ドメイン、例えばＦｏｋＩの切断ドメインに融合またはコンジュゲートして、所望の標的部位を切断する操作されたヌクレアーゼを生成することができる。

本明細書中で使用される用語「核酸」および「核酸分子」は、核酸塩基および酸性部分を含む化合物、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーを指す。典型的には、ポリマー核酸、例えば３または４以上のヌクレオチドを含む核酸分子は、隣接するヌクレオチドがホスホジエステル結合を介して互いに連結されている直鎖状分子である。いくつかの態様において、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの態様において、「核酸」は、３または４以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、少なくとも３つのヌクレオチドのストリング）を指すために互換的に使用することができる。いくつかの態様において、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡを包含する。核酸は、天然に存在するものであってよく、例えばゲノムの文脈において、転写産物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体、または他の天然に存在する核酸分子である。一方、核酸分子は非天然分子であってもよく、例えば組換えＤＮＡまたはＲＮＡ、人工染色体、操作されたゲノム、またはそれらの断片、または合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、または非天然のヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」および／または類似の用語は、核酸アナログ、すなわちホスホジエステル骨格以外を有する類似体を含む。核酸は、天然源から精製される、組換え発現系を用いて生産されて任意に精製される、化学的に合成される、などが可能である。適切な場合、例えば化学的に合成された分子の場合、核酸は、化学的に修飾された塩基または糖、および骨格修飾を有する類似体などの、ヌクレオシド類似体を含むことができる。特に断らない限り、核酸配列は、５’から３’方向に表される。いくつかの態様において、核酸は、以下であるか、またはこれを含む：天然のヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニルウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジン）；化学的修飾塩基；生物学的修飾塩基（例えば、メチル化塩基）；挿入（intercalated）塩基；修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）。

本明細書で使用する用語「医薬組成物」は、疾患または障害の処置の文脈において、対象に投与することができる組成物を指す。いくつかの態様において、医薬組成物は、活性成分、例えば、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸、および薬学的に許容し得る賦形剤を含む。
用語「予防」または「予防する」とは、疾患、障害、または症状を発症するリスクのある対象（例えば、対照対象または対象の対照群と比較してリスクが上昇したか、年齢を適合および／または性別を適合させた対象の平均的なリスクと比較して、リスクが高い）に対する予防的処置であって、対象が疾患、障害、または症状を発症する確率の低下（予防なしの確率と比較して）をもたらすものを指すか、および／または、既に確立された障害のさらなる進行の抑制を指す。

本明細書で使用する用語「増殖性疾患」は、細胞または組織の恒常性が妨げられて、細胞または細胞集団が異常に高い増殖速度を示す、任意の疾患を指す。増殖性疾患は、前新生物過形成状態および新生物疾患などの、過剰増殖性疾患を含む。新生物疾患は、細胞の異常増殖を特徴とし、良性および悪性両方の新生物を含む。悪性新生物はまた、がんとも呼ぶ。

用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書中で交換可能に使用され、ペプチド（アミド）結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸長である。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々のタンパク質またはタンパク質の集合を指してもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中の１または２以上のアミノ酸は、例えば炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、およびコンジュゲーション用、官能化用、もしくは他の修飾用のリンカーなどの、化学的実体を添加することによって、修飾されてもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドはまた、単一の分子であってもよく、または多分子複合体であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するタンパク質またはペプチドのほんの断片であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然の、組換えの、もしくは合成のもの、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。タンパク質は、例えば、核酸結合ドメインおよび核酸切断ドメインなどの、異なるドメインを含んでもよい。いくつかの態様において、タンパク質は、タンパク質性部分、例えば核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列、および有機化合物、例えば核酸切断剤として作用し得る化合物、を含む。

核酸配列の文脈において本明細書で使用する用語「ランダム化」は、遊離ヌクレオチドの混合物を組み込むために、例えば、４つすべてのヌクレオチドＡ、Ｔ、ＧおよびＣの混合物を組み込むために合成された配列内の、配列または残基を指す。ランダム化残基は、典型的には、ヌクレオチド配列内の文字Ｎによって表される。いくつかの態様において、ランダム化配列または残基は完全にランダム化され、この場合、ランダム化残基を、それぞれの配列残基の合成ステップの間に同量の組み込まれるべきヌクレオチドを添加することによって（例えば、２５％のＴ、２５％のＡ、２５％のＧ、および２５％のＣ）、合成する。いくつかの態様において、ランダム化配列または残基は部分的にランダム化され、この場合、ランダム化残基を、それぞれの配列残基の合成ステップの間に異なる量の組み込まれるべきヌクレオチドを添加することによって（例えば、７９％のＴ、７％のＡ、７％のＧ、および７％のＣ）、合成する。部分的なランダム化は、与えられた配列を鋳型とするが、所望の頻度で変異が組み込まれる配列の生成を可能にする。例えば、周知のヌクレアーゼ標的部位を合成の鋳型として使用する場合、各ステップにおいてそれぞれの残基で表されるヌクレオチドを７９％で合成に添加し、残りの３つのヌクレオチドをそれぞれ７％ずつ添加する部分的ランダム化は、合成され部分的にランダム化された標的部位の混合物をもたらし、これは依然として元の標的部位のコンセンサス配列を表すが、元の標的部位とは、各残基において、合成された各残基の統計的頻度が２１％で異なっている（二項分布）。いくつかの態様において、部分的ランダム化配列は、平均して５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、または３０％以上の二項分布により、コンセンサス配列とは異なる。いくつかの態様において、部分的ランダム化配列は、平均して１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、または５０％未満の二項分布により、コンセンサス配列とは異なる。

本明細書において用語「対象」とは、例えば個々の哺乳類などの、個々の生物を指す。いくつかの態様において、対象は、いずれかの性別で発達の任意の段階におけるヒトである。いくつかの態様において、対象は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は、非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、対象は、齧歯類である。いくつかの態様において、対象は、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、またはイヌである。いくつかの態様において、対象は、脊椎動物、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、ハエ、または線虫である。

ヌクレアーゼの文脈において本明細書中で使用される用語「標的核酸」および「標的ゲノム」は、それぞれ、与えられたヌクレアーゼの少なくとも1つの標的部位を含む核酸分子またはゲノムを指す。

本明細書中で交換可能に使用される「標的部位」および「ヌクレアーゼ標的部位」は、ヌクレアーゼによって結合され切断される、核酸分子内の配列を指す。標的部位は、一本鎖または二本鎖であってもよい。二量体化するヌクレアーゼ、例えばＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインを含むヌクレアーゼの文脈において、標的部位は、典型的には、左半部位（ヌクレアーゼの１つの単量体によって結合される）、右半部位（ヌクレアーゼの第２の単量体によって結合される）、および切断が行われる半分部位の間のスペーサー配列を含む。この構造（［左半部位］－［スペーサー配列］－［右半部位］）は本明細書において、ＬＳＲ構造と呼ぶ。いくつかの態様において、左半部位および／または右半部位は、１０～１８のヌクレオチド長である。いくつかの態様において、一方または両方の半部位は、より短いかまたはより長い。いくつかの態様において、左右の半部位は、異なる核酸配列を含む。

本明細書で使用する用語「転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）」とは、高度に可変な２アミノ酸モチーフ（反復可変二残基、ＲＶＦ）を含む高度に保存された３３～３４のアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合ドメインを含む、タンパク質を指す。ＲＶＤモチーフは、核酸配列に対する結合特異性を決定し、当業者に周知の方法に従って、所望のＤＮＡ配列に特異的に結合するよう、操作することができる。（例えば、以下を参照：Miller, Jeffrey; et.al. (February 2011). “A TALE nuclease architecture for efficient genome editing”. Nature Biotechnology 29 (2): 143-8；Zhang, Feng; et.al. (February 2011). ”Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription”. Nature Biotechnology 29 (2): 149-53；Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed. “Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity”. PLoS ONE 6 (5): e19509；Boch, Jens (February 2011). “TALEs of genome targeting”. Nature Biotechnology 29 (2): 135-6；Boch, Jens; et.al. (December 2009). “Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors”. Science 326 (5959): 1509-12；およびMoscou, Matthew J.; Adam J. Bogdanove (December 2009). “A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors”. Science 326 (5959): 1501；これらの各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。アミノ酸配列とＤＮＡ認識との間の単純な関係は、適切なＲＶＤを含有する反復セグメントの組み合わせを選択することにより、特定のＤＮＡ結合ドメインの操作を可能にした。

本明細書で使用する用語「転写活性化因子様要素ヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）は、例えばＦｏｋＩドメインなどのＤＮＡ切断ドメインに対する、転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む、人工的ヌクレアーゼを指す。操作されたＴＡＬＥコンストラクトを生成するための、多くのモジュールアセンブリスキームが報告されている（Zhang, Feng; et.al. (February 2011). ”Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription”. Nature Biotechnology 29 (2): 149-53；Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed. “Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity”. PLoS ONE 6 (5): e19509；Cermak, T.; Doyle, E. L.; Christian, M.; Wang, L.; Zhang, Y.; Schmidt, C.; Baller, J. A.; Somia, N. V. et al. (2011). “Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting”. Nucleic Acids Research；Morbitzer, R.; Elsaesser, J.; Hausner, J.; Lahaye, T. (2011). “Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning”. Nucleic Acids Research；Li, T.; Huang, S.; Zhao, X.; Wright, D. A.; Carpenter, S.; Spalding, M. H.; Weeks, D. P.; Yang, B. (2011). “Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes”. Nucleic Acids Research.；Weber, E.; Gruetzner, R.; Werner, S.; Engler, C.; Marillonnet, S. (2011). Bendahmane, Mohammed. ed. “Assembly of Designer TAL Effectors by Golden Gate Cloning”. PLoS ONE 6 (5): e19722；これらの各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。

用語「処置」、「処置する」および「処置すること」とは、本明細書に記載のように、疾患または障害、またはその１または２以上の症状の、発症を逆転、緩和または遅延させる、またはその進行を阻害するための、臨床的介入を指す。本明細書において、用語「処置」、「処置する」および「処置すること」とは、本明細書に記載のように、疾患または障害、またはその１または２以上の症状の、発症を逆転、緩和または遅延させる、またはその進行を阻害するための、臨床的介入を指す。いくつかの態様において、処置は、１または２以上の症状が発症した後、および／または疾患が診断された後に行ってもよい。他の態様において、処置は、症状の不在下で、例えば、症状の発症を予防または遅延させるため、または疾患の発症または進行を阻害するために行ってもよい。例えば、処置は、感受性の高い個人に対して、症状の発症前に行ってもよい（例えば、症状の履歴に照らして、および／または遺伝的または他の感受性因子に照らして）。処置はまた、症状が解消した後に、例えばその再発を予防または遅延させるために、継続してもよい。

本発明の特定の態様の詳細な説明
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインと、ＤＮＡ結合転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）反復アレイとの融合体である。ＴＡＬＥＮは、オフターゲット切断活性を低減し、したがって標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するように操作することができ、例えばゲノム内、in vitroまたはin vivoで標的ＤＮＡ配列を切断するために使用することができる。かかる操作されたＴＡＬＥＮは、in vivoまたはin vitroでゲノムを操作するために使用することができ、例えば標的ゲノム部位でのＤＮＡ切断の誘導を介した遺伝子ノックアウトまたはノックインのために、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介した標的遺伝子ノックアウトのため、または外来ＤＮＡ鋳型を使用した相同性配向型修復（ＨＤＲ）を介した標的ゲノム配列置換のために、使用できる。

ＴＡＬＥＮは、天然および合成配列を含む任意の所望の標的ＤＮＡ配列を切断するように、設計することができる。しかし、密接に関連するオフターゲット配列から標的配列を区別するＴＡＬＥＮの能力は、深く研究されていなかった。この能力およびそれに影響を与えるパラメータを理解することは、その治療的使用のために所望の特異性レベルを有するＴＡＬＥＮの設計に、およびまた、オフターゲット切断の可能性を最小化する目的で切断すべきユニークな標的配列を選択するために、重要である。

本開示のいくつかの側面は、１０^１２の潜在的なオフターゲット部位でのin vitro選択およびハイスループットシーケンシングによる、４１のＴＡＬＥＮのプロファイリングから得られた切断特異性データに基づく。選択結果のコンピューター分析は、ヒトゲノムにおけるオフターゲット基質を予測し、そのうち１３は、ヒト細胞においてＴＡＬＥＮにより修飾された。本開示のいくつかの側面は、次の驚くべき知見に基づく：（ｉ）ＴＡＬＥＮ反復は、比較的独立してＤＮＡに結合する；（ｉｉ）より長いＴＡＬＥＮは、ミスマッチにより寛容であるが、ゲノムの場面でより特異的である；および（ｉｉｉ）過剰なＤＮＡ結合エネルギーは、ＴＡＬＥＮ特異性の低減につながり得る。これらの知見に基づき、最適化されたＴＡＬＥＮを、非特異的ＤＮＡ結合を減少させるために設計された変異を用いて操作した。これらの操作されたＴＡＬＥＮのいくつかは、ヒト細胞において一般的に使用されるＴＡＬＥＮと比較して、例えば３４～＞１１６倍高い改善された特異性を示す。

ゲノム中に部位特異的な変化を操作する能力は、重要な治療的意味を持つ強力な研究能力を表す。ＴＡＬＥＮは、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ切断ドメインとＤＮＡ結合ＴＡＬＥ反復アレイの融合体である（図１Ａ）。これらのアレイは、各々が位置１２と１３のアミノ酸である反復可変二残基（ＲＶＤ）を使用して単一のＤＮＡヌクレオチドを認識する、複数の３４アミノ酸ＴＡＬＥ反復配列からなる^１，２。４つのＤＮＡ塩基対の各々を認識可能なＲＶＤの例が知られており、事実上任意のＤＮＡ配列に結合することができるＴＡＬＥ反復のアレイの構築を可能とする。ＴＡＬＥＮは、真正のヘテロ二量体ＦｏｋＩバリアントの使用を介して、ヘテロ二量体としてのみ活性であるように操作可能である^３、４。この構成において、２つの異なるＴＡＬＥＮ単量体はそれぞれが、１つの標的半部位に結合して２つの半部位の間のＤＮＡスペーサー配列内で切断するように、設計される。

例えば哺乳動物細胞などの細胞において、ＴＡＬＥＮによって誘導される二重鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介した標的遺伝子ノックアウト^５、または、外来ＤＮＡ鋳型を使用し相同性配向型修復（ＨＤＲ）を介した標的ゲノム配列置換^６，７をもたらすことができる。ＴＡＬＥＮは、種々の生物^８－１１および細胞株^{７，１２，１３}においてゲノムを操作するために、首尾良く使用されている。

オフターゲット部位でのＴＡＬＥＮ媒介性のＤＮＡ切断は、ゲノム座位での意図しない変異をもたらし得る。ＳＥＬＥＸ実験は、単量体ＴＡＬＥタンパク質のＤＮＡ結合特異性を特徴付けたが^５，７、活性な二量体ヌクレアーゼのＤＮＡ切断特異性は、それらの成分の単量体ＤＮＡ結合ドメインの特異性とは異なる可能性がある^１４。ＴＡＬＥＮで処置した４つの酵母株^１５および、ＴＡＬＥＮで処置した細胞由来の２つのヒト細胞株^１６の全ゲノムシーケンシングは、ＴＡＬＥ誘発性のゲノムオフターゲット変異の証拠がないことを明らかにし、これは、アフリカツメガエル（Xenopus）^１７およびヒト細胞株^１８におけるオフターゲットゲノム修飾が観察されないとの他の報告と整合する。対照的に、ＴＡＬＥＮは、ゼブラフィッシュ^{１３，１９}、ラット^９、ヒト初代線維芽細胞^２０および胚性幹細胞^７でのin vivoのオンターゲット配列と比較して、２～１１個の変異を含むオフターゲット部位を切断することが観察された。関連する変異標的部位の大規模なセットでのＴＡＬＥＮ切断の測定値から生成される、ＴＡＬＥＮの特異性の系統的および包括的プロファイルは、これまで記載されていない。かかる広い特異性プロファイルは、研究ツールおよび治療剤としてのＴＡＬＥＮの可能性を理解し、改善するための、基本である。

本明細書に記載される研究の一部は、ＤＮＡ切断特異性のために以前に記載されたin vitro選択^１４の修正版を使用した、４１のＴＡＬＥＮ対の能力であって、それらの標的配列の各々の１０^１２のオフターゲットバリアントを切断する前記能力をプロファイルするために行った実験に関する。これらの実験からのこれらの結果は、ＴＡＬＥＮ切断特異性の総合的なプロファイルを提供する。in vitroでの選択結果を使用して、ヒトゲノムにおけるオフターゲット基質をコンピューターにより予測し、これらのうち１３個が、ヒト細胞においてＴＡＬＥＮによって切断されることが確認された。

驚くべきことに、塩基対当たりより少なく特異的であるにも関わらず、より長い標的部位を切断するように設計されたＴＡＬＥＮは、ヒトゲノムにおける潜在的なオフターゲット部位の数を考慮した場合、より短い部位を標的とするものよりも一般に全体として高い特異性を示すことが判明した。選択結果はまた、過剰な非特異的ＴＡＬＥＮ結合エネルギーが、オンターゲットの切断に比べてより大きいオフターゲット切断を生じるというモデルを示唆する。このモデルに基づき、我々は、現在使用されているＴＡＬＥＮコンストラクトよりも、in vitroで実質的に改善されたＤＮＡ切断特異性を有し、ヒト細胞において３０～＞１５０倍高い特異性を有するＴＡＬＥＮを操作した。

本開示のいくつかの側面は、本明細書の別の箇所でより詳細に説明するように、３つの異なる配列の１つを標的とするように設計された４１のヘテロ二量体ＴＡＬＥＮの特異性のプロファイリングから得られたデータに基づく。プロファイリングは、in vitro選択法^１４の改善版（ＰＣＴ出願公開WO2013/066438 A2にも記載されており、この全内容は参照により本明細書に組み込まれる）を、選択のスループットと感度を高める修飾を加えて実施した（図１Ｂ）。

簡単に述べると、ＴＡＬＥＮは、＞１０^１２のＤＮＡ配列のライブラリーに対してプロファイリングされ、切断産物を捕捉し分析して、各ＴＡＬＥＮの特異性およびオフターゲット活性を決定した。選択データは、in vitroでのオフターゲットＴＡＬＥＮ切断の効率を正確に予測し、またＴＡＬＥＮが、標的配列全体を通して全体的に高度に特異的であることを示したが、従来のＴＡＬＥＮではオフターゲット切断のいくつかのレベルが生じ、これは、ＴＡＬＥＮ使用のいくつかのシナリオにおいては望ましくない場合がある。本明細書に記載した実験の結果、驚くべきことに、ＴＡＬＥ反復がそれらのそれぞれのＤＮＡ塩基対に、隣接するミスマッチに対するわずかに増加した許容範囲を超えて、独立して結合することが見出され、これは、塩基対当たりのＴＡＬＥＮ特異性が、標的部位の長さとは無関係であるという認識を知らしめた。本明細書の別の箇所でより詳細に説明するように、短いＴＡＬＥＮは長いＴＡＬＥＮよりも、標的塩基対当たり大きい特異性を有するが、しかし、長いＴＡＬＥＮは短いＴＡＬＥＮよりも、２０～３２ｂｐの部位を標的とする試験されたＴＡＬＥＮ長については、全ゲノムの場面における潜在的な切断部位のセットに対してより特異的であることが、実験的に検証された。

本開示のいくつかの側面は、長いＴＡＬＥＮ中の過剰な結合エネルギーが、対応するオンターゲット切断効率の効率増加なしでオフターゲット配列の切断を可能にすることにより、特異性を減少させるという、驚くべき発見に基づく。本開示のいくつかの側面は、ＴＡＬＥＮが、オンターゲット切断効率を損なうことなく、オフターゲット結合エネルギー低減することによって、それらの標的配列をより特異的に切断するように操作することができるという、驚くべき発見に基づく。ＴＡＬＥＮ特異性が、効率的なオンターゲット切断を可能とするために必要とされるものを越えて、非特異的ＤＮＡ結合エネルギーを低減することにより、改善可能であるとの認識は、改善された標的部位特異性を有する操作されたＴＡＬＥＮを生成するための基礎となる。

典型的には、ＴＡＬＥＮ単量体、例えば本明細書で提供されるＴＡＬＥＮ単量体は、次の構造を含むか、または次の構造のものである：
［Ｎ末端ドメイン］－［ＴＡＬＥ反復アレイ］－［Ｃ末端ドメイン］－［ヌクレアーゼドメイン］
式中、各「－」は個別に、共有結合または非共有結合的なコンジュゲーションを示し、および式中、コンジュゲーションは、例えば直接結合を介して直接的であっても、または例えばリンカードメインを介して間接的であってもよい。図１も参照されたい。

本開示のいくつかの側面は、以前に使用されたＴＡＬＥＮに比べて、強化された特異性を有するＴＡＬＥＮを提供する。一般に、ＴＡＬＥＮの配列特異性は、特定のヌクレオチド配列に結合するＴＡＬＥ反復アレイによって付与される。ＴＡＬＥ反復アレイは複数の３４アミノ酸ＴＡＬＥ反復配列からなり、その各々は、位置１２と１３のアミノ酸である反復可変二残基（ＲＶＤ）を使用して、１つのＤＮＡヌクレオチドを認識する。本開示のいくつかの側面は、ＴＡＬＥ反復アレイの特異的結合が、二量体化および核酸切断のために充分であること、および、非特異的核酸結合活性が、ＴＡＬＥＮのＮ末端および／またはＣ末端ドメインに起因することを、提供する。

この認識に基づき、改善されたＴＡＬＥＮが本明細書に提供されるように操作される。Ｎ末端ドメインを介した非特異的結合が、生理的ｐＨで正に荷電した（カチオン性）アミノ酸残基によって付与される過剰な結合エネルギーを介して、発生し得ることが発見されたので、本明細書で提供される改善されたＴＡＬＥＮの一部は、標準ＴＡＬＥＮと比較して、減少した正味電荷および／またはそれらの標的核酸配列に結合するための減少した結合エネルギーを有する。この電荷の減少は、修飾Ｎ末端およびＣ末端ドメインを介した、オフターゲット結合の減少につながる。したがって標的認識および結合の一部は、ＴＡＬＥ反復アレイの特異的認識および結合活性により狭く限定される。得られたＴＡＬＥＮは、したがって、非修飾ドメインを使用するＴＡＬＥＮと比較して、結合の特異性の増加および、次に、改善されたＴＡＬＥＮによる標的部位の切断の特異性の増加を示す。

いくつかの態様において、Ｎ末端ドメインの正味電荷が標準Ｎ末端ドメイン（配列番号１）の正味電荷より少ないＴＡＬＥＮ；および／またはＣ末端ドメインの正味電荷が、標準Ｃ末端ドメイン（配列番号２２）の正味電荷より少ないＴＡＬＥＮが、提供される。いくつかの態様において、Ｎ末端ドメインの標的核酸分子への結合エネルギーが、標準Ｎ末端ドメイン（配列番号１）の結合エネルギーより少ないＴＡＬＥＮ、および／またはＣ末端ドメインの標的核酸分子への結合エネルギーが、標準Ｃ末端ドメイン（配列番号２２）の結合エネルギーより少ないＴＡＬＥＮが、提供される。いくつかの態様において、修飾ＴＡＬＥＮのＮ末端ドメインであって、ＴＡＬＥＮ標的核酸分子へのその結合エネルギーが、標準Ｎ末端ドメイン（配列番号１）の結合エネルギーより少ないものが、提供される。いくつかの態様において、修飾ＴＡＬＥＮのＣ末端ドメインであって、ＴＡＬＥＮ標的核酸分子へのその結合エネルギーが、標準Ｃ末端ドメイン（配列番号２２）の結合エネルギーより少ないものが、提供される。いくつかの態様において、提供されるＴＡＬＥＮにおけるＮ末端および／またはＣ末端ドメインの結合エネルギーは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、低減されている。

いくつかの態様において、標準Ｎ末端ドメインおよび／または標準Ｃ末端ドメインは、生理的ｐＨで正に荷電したアミノ酸残基を、荷電していないかまたは負に荷電したアミノ酸残基で置き換えるように、修飾される。いくつかの態様において、修飾は、正に荷電した残基の、負に荷電した残基による置き換えを含む。いくつかの態様において、修飾は、正に荷電した残基の、中性（非荷電）残基による置き換えを含む。いくつかの態様において、修飾は、正に荷電した残基の、電荷を有さないかまたは負電荷を有する残基による置換を含む。いくつかの態様において、修飾Ｎ末端ドメインおよび／または修飾Ｃ末端ドメインの正味電荷は、＋１０以下、＋９以下、＋８以下、＋７以下、＋６以下、＋５以下、＋４以下、＋３以下、＋２以下、＋１以下、０以下、－１以下、－２以下、－３以下、－４以下、－５以下、または－１０以下である。いくつかの態様において、修飾Ｎ末端ドメインおよび／または修飾Ｃ末端ドメインの正味電荷は、＋５～－５の間、＋２～－７の間、０～－５の間、０～－１０の間、－１～－１０の間、または－２～－１５の間である。いくつかの態様において、修飾Ｎ末端ドメインおよび／または修飾Ｃ末端ドメインの正味電荷は、負である。いくつかの態様において、修飾Ｎ末端ドメインおよび修飾Ｃ末端ドメインの正味電荷は、共に負である。いくつかの態様において、修飾Ｎ末端ドメインおよび修飾Ｃ末端ドメインの正味電荷は、中性またはわずかに正である（例えば、＋２未満または＋１未満）。いくつかの態様において、修飾Ｎ末端ドメインおよび修飾Ｃ末端ドメインの正味電荷は、共に、中性またはわずかに正である（例えば、＋２未満または＋１未満）。

いくつかの態様において、修飾Ｎ末端ドメインおよび／または修飾Ｃ末端ドメインは、標準ドメイン配列の少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基が、生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基で置き換えられている点で、それぞれの標準ドメイン配列とは異なっているアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、修飾Ｎ末端ドメインおよび／または修飾Ｃ末端ドメインにおいて、少なくとも１個の、少なくとも２個の、少なくとも３個の、少なくとも４個の、少なくとも５個の、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、少なくとも９個の、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、または少なくとも１５個のカチオン性アミノ酸は、生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基で置き換えられている。いくつかの態様において、修飾Ｎ末端ドメインおよび／または修飾Ｃ末端ドメインにおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個のカチオン性アミノ酸は、生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基で置き換えられている。

いくつかの態様において、カチオン性アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）である。いくつかの態様において、カチオン性アミノ酸残基は、ＲまたはＨである。いくつかの態様において、生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基は、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）である。いくつかの態様において、生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基は、Ｑである。いくつかの態様において、修飾Ｎ末端ドメインおよび／または修飾Ｃ末端ドメインにおいて、少なくとも１つのリジンまたはアルギニン残基は、グルタミン残基で置き換えられている。

いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、次のアミノ酸置換の１または２以上を含む：Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、次のアミノ酸置換の２または３以上を含む：Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、次のアミノ酸置換の３または４以上を含む：Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、次のアミノ酸置換の４または５以上を含む：Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、次のアミノ酸置換の５または６以上を含む：Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、次のアミノ酸置換の６または７以上を含む：Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、次のアミノ酸置換の全７つを含む：Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、Ｑ３バリアント配列（Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ８０１Ｑ、配列番号２３参照）を含む。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、Ｑ７バリアント配列（Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ、配列番号２４参照）を含む。

いくつかの態様において、Ｎ末端ドメインは、標準Ｎ末端ドメインのトランケート型である。いくつかの態様において、Ｃ末端ドメインは、標準Ｃ末端ドメインのトランケート型である。いくつかの態様において、トランケートされたＮ末端ドメインおよび／またはトランケートされたＣ末端ドメインは、標準ドメインの残基の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、または２５％未満を含む。いくつかの態様において、トランケートされたＣ末端ドメインは、６０個未満、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２９個未満、２８個未満、２７個未満、２６個未満、２５個未満、２４個未満、２３個未満、２２個未満、２１個未満、または２０個のアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、トランケートされたＣ末端ドメインは、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０個の残基を含む。いくつかの態様において、修飾Ｎ末端ドメインおよび／または修飾Ｃ末端ドメインはトランケートされており、１または２以上のアミノ酸置換を含む。当業者には、いくつかの態様においては、トランケートを収容するために、例えばトランケートされたＣ末端ドメインなどのトランケートされたドメインを使用してＴＡＬＥＮにおけるＤＮＡスペーサー長を調整することが望ましいことが明らかであろう。

いくつかの態様において、核酸切断ドメインと呼ばれることもあるヌクレアーゼドメインは、非特異的な切断ドメイン、例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである。いくつかの態様において、ヌクレアーゼドメインは単量体であり、核酸を切断するために、二量体化または多量体化しなければならない。ＴＡＬＥＮ単量体の、ホモまたはヘテロ二量体化または多量体化は、典型的には、単量体の、二量体化を可能にするのに充分近接している結合配列への、例えば、同一の核酸分子（例えば同一の二本鎖核酸分子）上で互いに近接している配列への結合を介して、生じる。

最も一般的に使用されるドメイン、例えば、最も広く使用されるＮ末端およびＣ末端ドメインは、本明細書において標準ドメインと呼ぶ。標準Ｎ末端ドメインの例示的な配列（配列番号１）および標準Ｃ末端ドメインの例示的な配列（配列番号２２）が、本明細書中に提供される。ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの典型的な配列も、本明細書中に提供される。さらに、ＣＣＲ５結合ＴＡＬＥ反復アレイを形成する、ＴＡＬＥ反復の例示的な配列が提供される。以下に提供される配列は例示的であり、本開示に包含されるいくつかの態様を説明する目的のために提供されることが、理解されるであろう。これらは限定的であることを意味せず、本開示の側面に従って有用である追加の配列は、この開示に基づいて当業者には明らかであろう。

標準Ｎ末端ドメイン：

修飾Ｎ末端ドメイン：Ｎ１

修飾Ｎ末端ドメイン：Ｎ２

修飾Ｎ末端ドメイン：Ｎ３

ＴＡＬＥ反復アレイ：Ｌ１８ ＣＣＲ５Ａ

標準Ｃ末端ドメイン：

修飾Ｃ末端ドメイン：Ｑ３

修飾Ｃ末端ドメイン：Ｑ７

修飾Ｃ末端ドメイン：２８－ａａ

ＦｏｋＩ：ホモ二量体

ＦｏｋＩ：ＥＬ

ＦｏｋＩ：ＫＫ

ＦｏｋＩ：ＥＬＤ

ＦｏｋＩ：ＫＫＲ

いくつかの態様において、標準Ｎ末端ドメイン、ＴＡＬＥ反復アレイ、修飾Ｃ末端ドメイン、およびヌクレアーゼドメインを含むＴＡＬＥＮが、本明細書に提供される。いくつかの態様において、修飾Ｎ末端ドメイン、ＴＡＬＥ反復アレイ、標準Ｃ末端ドメイン、およびヌクレアーゼドメインを含むＴＡＬＥＮが、本明細書に提供される。いくつかの態様において、修飾Ｎ末端ドメイン、ＴＡＬＥ反復アレイ、修飾Ｃ末端ドメイン、およびヌクレアーゼドメインを含むＴＡＬＥＮが、本明細書に提供される。いくつかの態様において、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである。いくつかの態様において、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、ホモ二量体ＦｏｋＩドメイン、またはＦｏｋＩ－ＥＬ、ＦｏｋＩ－ＫＫ、ＦｏｋＩ－ＥＬＤ、もしくはＦｏｋＩ－ＫＫＲドメインである。

本明細書に提供される標準および修飾ドメインの特定の配列の全ての可能な組み合わせは、本開示によって包含され、以下を含む。

表１：本開示に包含される例示のＴＡＬＥＮ。使用されるそれぞれのＴＡＬＥ反復アレイは、具体的な標的配列に依存する。当業者は、かかる配列特異的なＴＡＬＥ反復アレイを、本開示および当該技術分野の知識に基づいて設計することができるであろう。異なるＮ末端、Ｃ末端、およびヌクレアーゼドメインに対する配列は、上に提供されている（配列番号１～４および２２～３０参照）。

当業者は、本明細書で提供される例示的な配列は、単に説明目的のためであり、本開示の範囲の限定を意図しないことを理解するであろう。本開示はまた、本発明のＴＡＬＥＮドメイン、例えば本明細書に記載の修飾されたＮ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、およびヌクレアーゼドメインの、他のＴＡＬＥＮ配列の場面における、例えば他の修飾または非修飾ＴＡＬＥＮ構造における使用も包含する。本開示の側面に従って有用な、記載の原理およびパラメータを満足する追加の配列は、当業者には明らかであろう。

いくつかの態様において、提供されるＴＡＬＥＮは、単量体である。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮ単量体は、別のＴＡＬＥＮ単量体と二量体化してＴＡＬＥＮ二量体を形成することができる。いくつかの態様において形成された二量体は、ホモ二量体である。いくつかの態様において、二量体はヘテロ二量体である。

いくつかの態様において、本明細書で提供されるＴＡＬＥＮは、その標的部位を高い特異性で切断する。例えば、いくつかの態様において、ゲノム内の所望の標的部位を切断し、かつ一方で、ヌクレアーゼがその意図される標的部位を切断するのに有効な濃度において、１未満、２未満、３未満、４未満、５未満、６未満、７未満、８未満、９未満、または１０未満のオフターゲット部位に結合および／または切断するように操作された、改善されたＴＡＬＥＮが提供される。いくつかの態様において、ゲノム内の任意の他の部位とは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個のヌクレオチド残基で異なるように選択された所望のユニークな標的部位を切断するように操作されたＴＡＬＥＮが、提供される。

本開示のいくつかの側面は、本明細書に提供されるＴＡＬＥＮをコードする核酸を提供する。例えば、表１に記載のＴＡＬＥＮをコードする核酸が、本明細書で提供される。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮをコードする核酸は、異種プロモーターの制御下にある。いくつかの態様において、コードする核酸は、発現コンストラクト、例えば、プラスミド、ウイルスベクターまたは直鎖発現コンストラクトに含まれている。いくつかの態様において、核酸または発現コンストラクトは、細胞、組織、または生物中に存在する。

本明細書に提供されるＴＡＬＥＮをコードする例示的な核酸のマップを、図１９に示す。かかる核酸の例示の配列を下に提供する。当業者は、本明細書に提供されるマップおよび配列は例示であり、本開示の範囲を限定するものではないことを理解するであろう。

本明細書の別の箇所で説明したように、本開示により提供される改善されたＴＡＬＥＮを含むＴＡＬＥＮは、実質的に任意の核酸配列に結合する（および切断する）ように、使用される配列特異的ＴＡＬＥ反復アレイに基づいて、操作することができる。いくつかの態様において、本明細書に提供される改善されたＴＡＬＥＮは、疾患または障害と関連することが知られている遺伝子内の標的配列に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるＴＡＬＥＮは、治療目的のために使用することができる。たとえば、いくつかの態様において、本明細書に提供されるＴＡＬＥＮは、以下の１または２以上を含むがこれらに限定されない様々な疾患、障害、および／または状態のいずれかの処置のために使用され得る：自己免疫疾患（例えば、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ）；炎症性疾患（例えば、関節炎、骨盤内炎症性疾患）；感染症（例えば、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ）、細菌感染、真菌感染、敗血症）；神経学的障害（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病；自閉症；デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；心臓血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、血栓症、凝固障害、黄斑変性症などの血管新生障害）；増殖性疾患（例えばがん、良性腫瘍）；呼吸器疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患）；消化器疾患（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍）；筋骨格障害（例えば、線維筋痛、関節炎）；内分泌、代謝、および栄養障害（例えば、糖尿病、骨粗しょう症）；泌尿器疾患（例えば、腎疾患）；精神障害（例えば、うつ病、統合失調症）；皮膚疾患（例えば創傷、湿疹）；血液およびリンパ管障害（例えば、貧血、血友病）など。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、二量体化の際に標的配列を切断する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるＴＡＬＥＮは、疾患または障害に関連するアレル内の標的部位を切断する。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは標的部位を切断し、これが、疾患または障害の処置または予防をもたらす。いくつかの態様において、疾患は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳである。いくつかの態様において、疾患は増殖性疾患である。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、ＣＣＲ５標的配列（例えば、ＨＩＶに関連するＣＣＲ５配列）に結合する。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、ＡＴＭ標的配列（例えば、毛細血管拡張性運動失調症に関連するＡＴＭ標的配列）に結合する。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、ＶＥＧＦＡ標的配列（例えば、増殖性疾患に関連するＶＥＧＦＡ配列）に結合する。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、ＣＦＴＲ標的配列（例えば、嚢胞性線維症に関連するＣＦＴＲ配列）に結合する。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、ジストロフィン標的配列（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関連するジストロフィン遺伝子配列）に結合する。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、ヘモクロマトーシス、血友病、シャルコー・マリー・トゥース病、神経線維腫症、フェニルケトン尿症、多発性嚢胞腎疾患、鎌状赤血球病、またはテイ・サックス病に関連する標的配列に結合する。好適な標的遺伝子、例えば、リストされている疾患の原因となる遺伝子は、当業者に知られている。疾患または障害に関連する追加の遺伝子および遺伝子配列は、当業者には明らかであろう。

本開示のいくつかの側面では、以前に使用されたＴＡＬＥエフェクタードメインと比較して、非特異的核酸結合活性が減少したＮ末端およびＣ末端ＴＡＬＥエフェクタードメインなどの、単離されたＴＡＬＥエフェクタードメインを提供する。本明細書で提供される単離されたＴＡＬＥエフェクタードメインは、好適なＴＡＬＥエフェクター分子の場面において、例えばＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ転写活性化因子、ＴＡＬＥ転写リプレッサー、ＴＡＬＥリコンビナーゼ、およびＴＡＬＥエピゲノム修飾酵素などで、使用することができる。その場面において単離されたＴＡＬＥドメインが使用できる追加の好適なＴＡＬＥエフェクターは、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。一般に、本明細書で提供される単離されたＮ末端およびＣ末端ドメインは、生理的ｐＨで正に荷電した（カチオン性）アミノ酸残基によって付与される過剰な結合エネルギーを最適化する、例えば最小化するように、操作される。本明細書で提供される改善されたＮ末端またはＣ末端ＴＡＬＥドメインのいくつかは、それぞれの標準ＴＡＬＥドメインと比較して、標的核酸配列に結合するための減少した正味電荷および／または減少した結合エネルギーを有している。ＴＡＬＥエフェクター分子の一部として使用する場合、例えば、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ転写活性化因子、ＴＡＬＥ転写リプレッサー、ＴＡＬＥリコンビナーゼ、またはＴＡＬＥエピゲノム修飾酵素の一部として使用する場合は、荷電におけるこの減少は、修飾Ｎ末端およびＣ末端ドメイン（単数または複数）を介した、オフターゲット結合の減少につながる。したがって、標的認識および結合の部分は、本明細書の他の箇所でより詳細に説明されるように、より狭く、ＴＡＬＥ反復アレイの特異的認識および結合活性に限定される。得られたＴＡＬＥエフェクター分子は、したがって、非修飾ドメインを使用するＴＡＬＥエフェクター分子と比較して、結合の特異性の増加、ひいてはＴＡＬＥエフェクターのそれぞれの効果の特異性の増加を示す（例えば、ＴＡＬＥヌクレアーゼによる標的部位の切断、ＴＡＬＥ転写活性化因子による標的遺伝子の活性化、ＴＡＬＥ転写リプレッサーによる標的遺伝子の発現の抑制、ＴＡＬＥリコンビナーゼによる標的配列の組換え、またはＴＡＬＥエピゲノム修飾酵素による標的配列のエピジェネティックな修飾）。

いくつかの態様において、正味電荷が標準Ｎ末端ドメイン（配列番号１）の正味電荷より小さい、単離されたＮ末端ＴＡＬＥドメインが提供される。いくつかの態様において、正味電荷が標準Ｃ末端ドメイン（配列番号２２）の正味電荷より小さい、単離されたＣ末端ＴＡＬＥドメインが提供される。いくつかの態様において、標的核酸分子への結合エネルギーが、標準Ｎ末端ドメイン（配列番号１）の結合エネルギーより小さい、単離されたＮ末端ＴＡＬＥドメインが提供される。いくつかの態様において、標的核酸分子への結合エネルギーが、標準Ｃ末端ドメイン（配列番号２２）の結合エネルギーより小さい、単離されたＣ末端ＴＡＬＥドメインが提供される。いくつかの態様において、本明細書で提供される単離されたＮ末端および／または単離されたＣ末端ＴＡＬＥドメインの結合エネルギーは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、低減されている。

いくつかの態様において、標準Ｎ末端ドメインおよび／または標準Ｃ末端ドメインは、生理的ｐＨで正に荷電したアミノ酸残基を、荷電していないかまたは負に荷電したアミノ酸残基で置き換えるよう修飾されて、本明細書で提供される単離されたＮ末端および／またはＣ末端ドメインが達成される。いくつかの態様において、修飾は、正に荷電した残基の、負に荷電した残基による置換を含む。いくつかの態様において、修飾は、正に荷電した残基の、中性（非荷電）残基による置換を含む。いくつかの態様において、修飾は、正に荷電した残基の、電荷を有さないかまたは負電荷を有する残基による置換を含む。いくつかの態様において、本明細書で提供される単離Ｎ末端ドメインおよび／または単離Ｃ末端ドメインの正味電荷は、生理的ｐＨにおいて＋１０以下、＋９以下、＋８以下、＋７以下、＋６以下、＋５以下、＋４以下、＋３以下、＋２以下、＋１以下、０以下、－１以下、－２以下、－３以下、－４以下、－５以下、または－１０以下である。いくつかの態様において、単離Ｎ末端ＴＡＬＥドメインおよび／または単離Ｃ末端ＴＡＬＥドメインの正味電荷は、生理的ｐＨにおいて＋５～－５の間、＋２～－７の間、０～－５の間、０～－１０の間、－１～－１０の間、または－２～－１５の間である。いくつかの態様において、単離Ｎ末端ドメインおよび／または単離Ｃ末端ドメインの正味電荷は、負である。いくつかの態様において、単離Ｎ末端ＴＡＬＥドメインおよび／または単離Ｃ末端ＴＡＬＥドメインが提供され、単離Ｎ末端ＴＡＬＥドメインおよび単離Ｃ末端ＴＡＬＥドメインの正味電荷は、共に負である。いくつかの態様において、単離Ｎ末端ＴＡＬＥドメインおよび単離Ｃ末端ＴＡＬＥドメインの正味電荷は、中性またはわずかに正である（例えば、生理的ｐＨで＋２未満または＋１未満）。いくつかの態様において、単離Ｎ末端ＴＡＬＥドメインおよび／または単離Ｃ末端ＴＡＬＥドメインが提供され、単離Ｎ末端ＴＡＬＥドメインおよび単離Ｃ末端ＴＡＬＥドメインの正味電荷は、共に、中性またはわずかに正である（例えば、生理的ｐＨで＋２未満または＋１未満）。

いくつかの態様において、本明細書に提供される単離Ｎ末端ドメインおよび／または単離Ｃ末端ドメインは、標準ドメイン配列の少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基が、生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基で置き換えられている点で、それぞれの標準ドメイン配列とは異なっているアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、提供される単離Ｎ末端ドメインおよび／または単離Ｃ末端ドメインの少なくとも１個の、少なくとも２個の、少なくとも３個の、少なくとも４個の、少なくとも５個の、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、少なくとも９個の、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、または少なくとも１５個のカチオン性アミノ酸は、生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基で置き換えられている。いくつかの態様において、単離Ｎ末端ドメインおよび／または単離Ｃ末端ドメインの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個のカチオン性アミノ酸は、生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基で置き換えられている。

いくつかの態様において、カチオン性アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）である。いくつかの態様において、カチオン性アミノ酸残基は、ＲまたはＨである。いくつかの態様において、生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基は、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）である。いくつかの態様において、生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基は、Ｑである。いくつかの態様において、単離Ｎ末端ドメインおよび／または修飾Ｃ末端ドメインの少なくとも１つのリジンまたはアルギニン残基は、グルタミン残基で置き換えられている。

いくつかの態様において、次のアミノ酸置換の１または２以上を含む単離Ｃ末端ＴＡＬＥドメインが、本明細書で提供される：Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ。いくつかの態様において、単離Ｃ末端ドメインは、次のアミノ酸置換の２または３以上を含む：Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ。いくつかの態様において、単離Ｃ末端ドメインは、次のアミノ酸置換の３または４以上を含む：Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ。いくつかの態様において、単離Ｃ末端ドメインは、次のアミノ酸置換の４または５以上を含む：Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ。いくつかの態様において、単離Ｃ末端ドメインは、次のアミノ酸置換の５または６以上を含む：Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ。いくつかの態様において、単離Ｃ末端ドメインは、次のアミノ酸置換の６または７以上を含む：Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ。いくつかの態様において、単離Ｃ末端ドメインは、次のアミノ酸置換の全７つを含む：Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ。いくつかの態様において、単離Ｃ末端ドメインは、Ｑ３バリアント配列（Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ８０１Ｑ、配列番号２３参照）を含む。いくつかの態様において、単離Ｃ末端ドメインは、Ｑ７バリアント配列（Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ、配列番号２４参照）を含む。

いくつかの態様において、標準Ｎ末端ドメインのトランケート型である、単離Ｎ末端ＴＡＬＥドメインが提供される。いくつかの態様において、標準Ｃ末端ドメインのトランケート型である、単離Ｃ末端ＴＡＬＥドメインが提供される。いくつかの態様において、トランケートされたＮ末端ドメインおよび／またはトランケートされたＣ末端ドメインは、標準ドメインの残基の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、または２５％未満を含む。いくつかの態様において、トランケートされたＣ末端ドメインは、６０個未満、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２９個未満、２８個未満、２７個未満、２６個未満、２５個未満、２４個未満、２３個未満、２２個未満、２１個未満、または２０個のアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、トランケートされたＣ末端ドメインは、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０個の残基を含む。いくつかの態様において、トランケートされ、１または２以上のアミノ酸置換を含む、単離Ｎ末端ＴＡＬＥドメインおよび／または単離Ｃ末端ＴＡＬＥドドメインが提供される。いくつかの態様において、単離Ｎ末端ＴＡＬＥドメインは、配列番号２～５のいずれかに提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離Ｃ末端ＴＡＬＥドメインは、配列番号２３～２５のいずれかに提供されるアミノ酸配列を含む。

本明細書で提供される単離されたＣおよびＮ末端ＴＡＬＥエドメインは、任意のＴＡＬＥエフェクター分子の場面において、例えばＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ転写活性化因子、ＴＡＬＥ転写リプレッサー、ＴＡＬＥリコンビナーゼ、ＴＡＬＥエピゲノム修飾酵素、および任意のその他の好適なＴＡＬＥエフェクター分子の一部として使用できることが、当業者には明らかであろう。いくつかの態様において、本明細書で提供されるＴＡＬＥドメインは、次の構造を含むかまたは本質的にこれからなるＴＡＬＥ分子の場面において、使用される。
［Ｎ末端ドメイン］－［ＴＡＬＥ反復アレイ］－［Ｃ末端ドメイン］－［エフェクタードメイン］
または
［エフェクタードメイン］－［Ｎ末端ドメイン］－［ＴＡＬＥ反復アレイ］－［Ｃ末端ドメイン］
この式中、エフェクタードメインは、いくつかの態様において、ヌクレアーゼドメイン、転写活性化因子もしくはリプレッサードメイン、リコンビナーゼドメイン、またはエピゲノム修飾酵素ドメインであってよい。

当業者には明らかなように、いくつかの態様においては、トランケートを収容するために、例えば本明細書で提供されるようなトランケートされたＣ末端ドメインなどのトランケートされたドメインを使用する場合に、スペーサーを含むＴＡＬＥエフェクタードメインにおけるかかるＤＮＡスペーサー長を調整することが好ましい。

本開示のいくつかの側面は、例えば、ＴＡＬＥＮ単量体などのＴＡＬＥＮを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、ＴＡＬＥＮ単量体と、該ＴＡＬＥＮとヘテロ二量体を形成することができる別のＴＡＬＥＮ単量体とを含む。

いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、例えばヒト対象などの対象への投与用に処方された組成物中に提供される。例えば、いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮおよび薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物が提供される。いくつかの態様において、医薬組成物は、対象への投与のために処方される。いくつかの態様において、医薬組成物は、対象における細胞内の標的配列を切断するためのＴＡＬＥＮの有効量を含む。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、疾患または障害に関連することが知られている遺伝子内の標的配列に結合し、ここで組成物は、疾患または障害に関連する症状を軽減するためのＴＡＬＥＮの有効量を含む。

例えば、いくつかの態様は、本明細書で提供されるＴＡＬＥＮ、またはかかるヌクレアーゼをコードする核酸、および薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。医薬組成物は、任意に１または２以上の追加の治療的に活性な物質を含んでもよい。

本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で既知のまたは今後開発される任意の方法によって、製造することができる。一般にかかる製造方法は、活性成分を、賦形剤および／または１もしくは２以上の他の補助成分と会合させるステップ、次いで必要に応じて、および／または望ましい場合には、生成物を所望の単一または複数用量単位に成形および／または包装すること、を含む。

医薬製剤は、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含んでもよく、これは本明細書中で使用する場合、所望の特定の剤形に適するように、任意の全ての溶媒、分散媒質、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤等を含む。RemingtonのThe Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro（Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006；参照により本明細書に組み込まれる）には、医薬組成物の処方に使用される種々の賦形剤および、その製造のための知られている技術が開示されている。任意の従来の賦形剤媒体が、例えば任意の望ましくない生物学的効果を生成するか、あるいは医薬組成物の任意の他の成分（単数または複数）と有害な様式で相互作用することによって物質またはその誘導体と不適合である限りを除き、その使用は、本発明の範囲内にあることが意図されている。

いくつかの態様において、本明細書で提供される組成物は、例えばヒト対象などの対象に対して、対象内の標的ゲノム修飾を行うために投与される。いくつかの態様において、細胞を対象から得て、ex vivoでヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸と接触させ、所望のゲノム修飾が細胞内で行われるかまたは検出された後に、その対象に再投与される。本明細書で提供される医薬組成物の記述は、主にヒトへの投与に好適な医薬組成物に向けられているが、当業者は、かかる組成物が一般にあらゆる種類の動物への投与に好適であることを、理解するであろう。ヒトへの投与に好適な医薬組成物の、組成物を様々な動物への投与に好適なものとするための修飾は充分に理解されており、通常の知識を有する獣医学の薬理学者は、日常的な実験以上を用いることなく、かかる修飾を設計および／または実施することができる。医薬組成物の投与が意図される対象としては、限定はされないが、ヒトおよび／または他の霊長類；限定することなくウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウスおよび／またはラットを含む哺乳動物；および／またはニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウなどの商業的に関連する鳥類を含む、鳥などが挙げられる。

本開示の範囲は、本明細書に提供されるＴＡＬＥＮを使用する方法を包含する。当業者には、本明細書に提供されるＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥＮの適用に好適な任意の方法において使用されることが明らかであり、これは当該技術分野で知られている方法および用途を含むが、これに限定はされない。かかる方法は、例えばゲノム操作の場面におけるＴＡＬＥＮ媒介性のＤＮＡの切断を含み、例えば、外来ＤＮＡ鋳型を使用する非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介した標的遺伝子ノックアウト、または相同性配向型修復（ＨＤＲ）を介した標的ゲノム配列置換である。本明細書で提供されるＴＡＬＥＮの改善された特徴、例えば、本明細書に提供されるＴＡＬＥＮのいくつかの改善された特異性は、典型的には、かかる方法および用途を高い効率で実施することを可能とする。ＴＡＬＥＮの使用に好適であり、本明細書で提供されるＴＡＬＥＮを用いて実施されるすべての方法および用途が意図され、本開示の範囲内である。例えば、本開示は、本明細書に提供されるＴＡＬＥＮの、以下の文献に記載されているようなＴＡＬＥＮの使用に好適な任意の方法における使用を提供する：Boch, Jens (February 2011). “TALEs of genome targeting”. Nature Biotechnology 29 (2): 135-6. doi:10.1038/nbt.1767. PMID 21301438；Boch, Jens; et.al. (December 2009). “Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors”. Science 326 (5959): 1509-12. Bibcode:2009Sci...326.1509B. doi:10.1126/science.1178811. PMID 19933107；Moscou, Matthew J.; Adam J. Bogdanove (December 2009). “A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors”. Science 326 (5959): 1501. Bibcode:2009Sci...326.1501M. doi:10.1126/science.1178817. PMID 19933106；Christian, Michelle; et.al. (October 2010). “Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nucleases”. Genetics 186 (2): 757-61. doi:10.1534/genetics.110.120717. PMC 2942870. PMID 20660643；Li, Ting; et.al. (August 2010). “TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain”. Nucleic Acids Research 39: 1-14. doi:10.1093/nar/gkq704. PMC 3017587. PMID 20699274；Mahfouz, Magdy M.; et.al. (February 2010). “De novo-engineered transcription activator-like effector (TALE) hybrid nuclease with novel DNA binding specificity creates double-strand breaks”. PNAS 108 (6): 2623-8. Bibcode:2011PNAS..108.2623M. doi:10.1073/pnas.1019533108. PMC 3038751. PMID 21262818；Cermak, T.; Doyle, E. L.; Christian, M.; Wang, L.; Zhang, Y.; Schmidt, C.; Baller, J. A.; Somia, N. V. et al. (2011). “Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting”. Nucleic Acids Research. doi:10.1093/nar/gkr218；Miller, Jeffrey; et.al. (February 2011). “A TALE nuclease architecture for efficient genome editing”. Nature Biotechnology 29 (2): 143-8. doi:10.1038/nbt.1755. PMID 21179091；Hockemeyer, D.; Wang, H.; Kiani, S.; Lai, C. S.; Gao, Q.; Cassady, J. P.; Cost, G. J.; Zhang, L. et al. (2011). “Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases”. Nature Biotechnology 29 (8). doi:10.1038/nbt.1927；Wood, A. J.; Lo, T. -W.; Zeitler, B.; Pickle, C. S.; Ralston, E. J.; Lee, A. H.; Amora, R.; Miller, J. C. et al. (2011). “Targeted Genome Editing Across Species Using ZFNs and TALENs”. Science 333 (6040): 307. doi:10.1126/science.1207773. PMC 3489282. PMID 21700836；Tesson, L.; Usal, C.; Menoret, S. V.; Leung, E.; Niles, B. J.; Remy, S. V.; Santiago, Y.; Vincent, A. I. et al. 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(2010). “Directed Evolution of an Enhanced and Highly Efficient FokI Cleavage Domain for Zinc Finger Nucleases”. Journal of Molecular Biology 400 (1): 96. doi:10.1016/j.jmb.2010.04.060. PMC 2885538. PMID 20447404；Mussolino, C.; Morbitzer, R.; Lutge, F.; Dannemann, N.; Lahaye, T.; Cathomen, T. (2011). “A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity”. Nucleic Acids Research. doi:10.1093/nar/gkr597；Zhang, Feng; et.al. (February 2011). “Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription”. Nature Biotechnology 29 (2): 149-53. doi:10.1038/nbt.1775. PMC 3084533. PMID 21248753；Morbitzer, R.; Elsaesser, J.; Hausner, J.; Lahaye, T. (2011). “Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning”. Nucleic Acids Research. doi:10.1093/nar/gkr151；Li, T.; Huang, S.; Zhao, X.; Wright, D. A.; Carpenter, S.; Spalding, M. H.; Weeks, D. P.; Yang, B. (2011). “Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes”. Nucleic Acids Research. doi:10.1093/nar/gkr188；Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011). “Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity”. In Shiu, Shin-Han. PLoS ONE 6 (5): e19509. doi:10.1371/journal.pone.0019509；Weber, E.; Gruetzner, R.; Werner, S.; Engler, C.; Marillonnet, S. (2011). “Assembly of Designer TAL Effectors by Golden Gate Cloning”. In Bendahmane, Mohammed. PLoS ONE 6 (5): e19722. doi:10.1371/journal.pone.0019722；Sander et al. “Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs”. Nature Biotechnology Vol 29:697-98 (5 August 2011) Sander, J. D.; Cade, L.; Khayter, C.; Reyon, D.; Peterson, R. T.; Joung, J. K.; Yeh, J. R. J. (2011). “Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs”. Nature Biotechnology 29 (8): 697. doi:10.1038/nbt.1934；これらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの態様において、本明細書に記載のＴＡＬＥＮ、ＴＡＬＥＮドメイン、ＴＡＬＥＮをコードするもしくはＴＡＬＥＮドメインをコードする核酸、組成物および試薬は、単離されている。いくつかの態様において、本明細書に記載のＴＡＬＥＮ、ＴＡＬＥＮドメイン、ＴＡＬＥＮをコードするもしくはＴＡＬＥＮドメインをコードする核酸、組成物および試薬は、精製されており、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％純粋である。

本開示のいくつかの側面は、本明細書に記載の本発明のＴＡＬＥＮを用いて、核酸分子中の標的配列を切断する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、標的配列を含む核酸分子を、ＴＡＬＥＮが標的配列に結合して切断するために好適な条件下で、標的配列に結合するＴＡＬＥＮと接触させることを含む。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、単量体として提供される。いくつかの態様において、本発明のＴＡＬＥＮ単量体は、本発明の第１のＴＡＬＥＮ単量体と二量体化してヌクレアーゼ活性を有するヘテロ二量体を形成することができる別のＴＡＬＥＮ単量体を含む、組成物中に提供される。いくつかの態様において、本発明のＴＡＬＥＮは、医薬組成物中に提供される。いくつかの態様において、標的配列は、細胞内にある。いくつかの態様において、標的配列は、細胞のゲノム内にある。いくつかの態様において、標的配列は、対象中にある。いくつかの態様において、この方法は、ＴＡＬＥＮを含有する例えば医薬組成物などの組成物を、対象に対して、ＴＡＬＥＮが標的部位に結合してトランケートするのに充分な量で投与することを含む。

本開示のいくつかの側面は、操作されたＴＡＬＥＮを製造する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、標準Ｎ末端ＴＡＬＥＮドメインおよび／または標準Ｃ末端ＴＡＬＥＮドメインの少なくとも１個のアミノ酸を、生理的ｐＨで電荷を有さないかまたは負電荷を有するアミノ酸で置き換えること；および／または、Ｎ末端ＴＡＬＥＮドメインおよび／またはＣ末端ＴＡＬＥＮドメインをトランケートして、正に荷電した断片を除去すること；したがって、減少した正味電荷のＮ末端ドメインおよび／またはＣ末端ドメインを有する、操作されたＴＡＬＥＮを生成すること、を含む。いくつかの態様において、置換される少なくとも１つのアミノ酸は、カチオン性アミノ酸または生理的ｐＨで正電荷を有するアミノ酸を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのアミノ酸を置き換えるアミノ酸は、カチオン性アミノ酸または中性のアミノ酸である。いくつかの態様において、トランケートされたＮ末端ＴＡＬＥＮドメインおよび／またはトランケートされたＣ末端ＴＡＬＥＮドメインは、それぞれの標準ドメインの残基の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、または２５％未満を含む。いくつかの態様において、トランケートされたＣ末端ドメインは、６０個未満、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２９個未満、２８個未満、２７個未満、２６個未満、２５個未満、２４個未満、２３個未満、２２個未満、２１個未満、または２０個未満のアミノ酸残基を含む。

いくつかの態様において、トランケートされたＣ末端ドメインは、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０個のアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、方法は、標準Ｎ末端ＴＡＬＥＮドメインおよび／または標準Ｃ末端ＴＡＬＥＮドメインの少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、または少なくとも１５個のアミノ酸を、生理的ｐＨで電荷を有さないかまたは負電荷を有するアミノ酸で置き換えることを含む。いくつかの態様において、置き換えられるアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）である。いくつかの態様において、生理的ｐＨで電荷を有さないかまたは負電荷を有するアミノ酸は、グルタミン（Ｑ）またはグリシン（Ｇ）である。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのリジンまたはアルギニン残基を、グルタミン残基で置き換えることを含む。

いくつかの態様において、本明細書で提供される改善されたＴＡＬＥＮは、組換え技術によって設計され、および／または生成される。いくつかの態様において、設計すること、および／または生成することは、所望の標的配列またはそれらの半部位に特異的に結合する、ＴＡＬＥ反復アレイを設計することを含む。

本開示のいくつかの側面は、本明細書に提供される操作されたＴＡＬＥＮまたはかかるＴＡＬＥＮを含む組成物（例えば、医薬組成物）を含む、キットを提供する。いくつかの態様において、キットは、ＴＡＬＥＮを賦形剤と接触させて、核酸をＴＡＬＥＮと接触させるのに好適な組成物を生成するための、賦形剤および指示書を含む。いくつかの態様において、賦形剤は、薬学的に許容し得る賦形剤である。

典型的には、キットは、キットの構成要素を格納する容器、および、キットの構成要素を如何にして貯蔵し使用すべきかを述べた書面による指示書を含む。

本発明のこれらおよび他の態様の機能および利点は、以下の例からより完全に理解されるであろう。以下の例は、本発明の利点を説明し、および特定の態様を記述することを意図しているが、本発明の完全な範囲を例示することは意図していない。したがって、例は本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるであろう。

例１
材料および方法
オリゴヌクレオチド、ＰＣＲおよびＤＮＡ精製
すべてのオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies（IDT）から購入した。オリゴヌクレオチド配列は、表１０に記載されている。ＰＣＲは、５０μＬの１×ＨＦ緩衝液中の０．４μＬの２Ｕ／μＬ Phusion Hot Start IIＤＮＡポリメラーゼ（Thermo-Fisher）、０．２ｍＭのｄＮＴＰミックス（０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ）（NEB）、０．５μＭ～１μＭの各プライマーを用い、次のプログラムで実施した：特に断りのない限り、９８℃、１分；［９８℃、１５秒；６２℃、１５秒；７２℃、１分］を３５サイクル。ＤＮＡ反応物の多くは、以下ではＱカラム精製と呼ばれるQIAquick PCR Purification Kit（Qiagen）、または以下ではＭカラム精製と呼ばれるMinElute PCR Purification Kit（Qiagen）を用いて精製した。

ＴＡＬＥＮの構築
標準ＴＡＬＥＮプラスミドは、FLASH法^１２により、各ＴＡＬＥＮが１０～１８塩基対を標的として構築した。Ｎ末端変異は、ＰＣＲによりQ5 Hot Start Master Mix（NEB）［９８℃、２２秒；６２℃、１５秒；７２℃、７分］を用いて、リン酸化TAL-N1fwd（Ｎ１に対し）、リン酸化TAL-N2fwd（Ｎ２に対し）、またはリン酸化TAL-N3fwd（Ｎ３に対し）、およびリン酸化TALNrevをプライマーとして使用して行った。１μＬのDpnI（NEB）を添加し、反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＭカラム精製した。溶出した～２５ｎｇのＤＮＡを、１０μＬの２×Quick Ligase Buffer、１μＬのQuick Ligase（NEB）中、２０μＬの総容量で、室温（～２１℃）で１５分、分子内で平滑末端ライゲーションした。このライゲーション反応物１μＬを、トップ１０のケミカルコンピテント細胞（Invitrogen）に形質転換した。Ｃ末端ドメインの変異は、ＰＣＲによりTAL-CifwdとTAL-Cirevプライマーを用いてクローニングした後、Ｑカラム精製した。この溶出ＤＮＡ～１ｎｇを鋳型として、TALCifwdおよびTAL-Q3（Ｑ３に対し）またはTAL-Q7（Ｑ７に対し）の何れかをプライマーとするＰＣＲに使用し、次いでＱカラム精製した。このＤＮＡ断片～１μｇを、１×NEBuffer 4中のHpaIおよびBamHIで消化し、HpaIおよびBamHIで前もって消化された約２μｇの所望のＴＡＬＥＮプラスミド中にクローンニングした。

in vitroでのＴＡＬＥＮの発現
全てが３×ＦＬＡＧタグを含むＴＡＬＥＮタンパク質を、in vitro転写／翻訳により発現させた。ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドまたはプラスミドなし（「空の溶解物」対照）８００ｎｇを、TNT（登録商標）Quick Coupled Transcription/Translation System、T7バリアント（Promega）を最終容量２０μＬで３０℃にて１．５時間用いて、in vitro転写／翻訳反応物中に添加した。ウェスタンブロットを使用し、抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（Sigma-Aldrich）を用いてタンパク質を可視化した。ＴＡＬＥＮ濃度は、１ｎｇ～１６ｎｇのＮ末端ＦＬＡＧタグ付き細菌アルカリホスファターゼ（Sigma-Aldrich）の標準曲線と比較することにより、算出した。

ＤＮＡ切断のためのin vitro選択
選択前ライブラリーを、部分的にランダム化された標的半部位配列（ＣＣＲ５Ａ、ＡＴＭ、またはＣＣＲ５Ｂ）および完全にランダム化された１０～２４ｂｐスペーサー配列を含有する、１０ｐｍｏｌのオリゴライブラリーを用いて製造した（表１０）。オリゴヌクレオチドライブラリーを、２．５ｍＭのＭｎＣｌ_２を補足した１×CircLigase II反応緩衝液（３３ｍＭのトリス酢酸、６６ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭのジチオスレイトール、ｐＨ７．５）の全２０μＬ中の、１００単位のCircLigase II ssDNA Ligase（Epicentre）で６０℃にて１６時間インキュベートすることにより、個別に環状化し、ついで８０℃で１０分インキュベートした。２．５μＬの各環状化反応物を、Illustra TempliPhi 100 Amplification Kit（GE Healthcare）を使用するローリングサークル増幅のための基質として、３０℃で１６時間、５０μＬの反応物中で用いた。得られたコンカテマーライブラリーを、Quant-iT（商標）PicoGreen（登録商標）dsDNA Kit（Invitrogen）で定量し、異なるスペーサー長のライブラリーを、等モル比で混合した。

ＣＣＲ５Ｂ配列ライブラリーでの選択については、５００ｎｇの選択前ライブラリーを、１×NEBuffer 3中、in vitro転写／翻訳ＴＡＬＥＮ＋空の溶解物（合計３０μＬ）で３７℃にて２時間消化した。すべてのＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮについて、in vitro転写／翻訳ＴＡＬＥＮ濃度をウェスタンブロットにより定量し（ブロット中、ＴＡＬＥＮを４℃で１６時間保存）、次いでＴＡＬＥＮを、単量体当たり４０ｎＭの最終濃度で添加した。ＣＣＲ５ＡおよびＡＴＭ配列ライブラリーでの選択については、合わせた選択前ライブラリーを、３００，０００ＭＷＣＯスピンカラム（Sartorius）を用い、１×NEBuffer 3での３回の５００μＬ洗浄により、さらに精製した。１２５ｎｇの選択前ライブラリーを、１×NEBuffer 3中、合計２４μＬの新鮮なin vitro転写／翻訳ＴＡＬＥＮ＋空の溶解物で３７℃で３０分消化した。すべてのＣＣＲ５ＡおよびＡＴＭ ＴＡＬＥＮについて、６μＬのin vitro転写／翻訳左ＴＡＬＥＮおよび６μＬの右ＴＡＬＥＮを使用し、これらはそれぞれ、ＣＣＲ５ＡおよびＡＴＭ ＴＡＬＥＮについて、切断反応物の最終濃度１６ｎＭ±２ｎＭまたは１２ｎＭ±１．５ｎＭに対応する。これらのＴＡＬＥＮ濃度は、消化と並行して行ったウェスタンブロットにより定量した。

すべての選択について、ＴＡＬＥＮ消化ライブラリーを、１μＬの１００μｇ／μＬのRNase A（Qiagen）で２分間インキュベートした後、Ｑカラム精製した。５０μＬの精製ＤＮＡを、３μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス（１０ｍＭのｄＡＴＰ、１０ｍＭのｄＣＴＰ、１０ｍＭのｄＧＴＰ、１０ｍＭのｄＴＴＰ）（NEB）、６μＬの１０×NEBuffer 2、および１μＬの５Ｕ／μＬ Klenow Fragment DNA Polymerase（NEB）で、室温で３０分インキュベートした後、Ｑカラム精製した。５０μＬの溶出ＤＮＡを、各試料に対応するバーコードを含む加熱および冷却＃１アダプターでライゲートした（異なるＴＡＬＥＮ濃度またはコンストラクトによる選択）（表１０Ａ）。ライゲーションは、１×T4 ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭのTris-HCl、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．５）中で１μＬの４００Ｕ／μＬ T4 ＤＮＡリガーゼ（NEB）により６０μＬの総容量で、室温にて１６時間実施し、次いでＱカラム精製した。

６μＬの溶出ＤＮＡのＰＣＲによる増幅を、１５０μＬの総反応容量（３×５０μＬの反応物に分割）で、表１０Ａの＃２Ａのアダプタープライマーを用いて１４～２２サイクル実施した。ＰＣＲ産物を、Ｑカラムで精製した。各ＤＮＡ試料は、Quant-iT（商標）PicoGreen（登録商標）dsDNA Kit（Invitrogen）で定量化した後、等モル混合物にプールした。５００ｎｇのプールされたＤＮＡについて、５％ＴＢＥの１８ウェルCriterion ＰＡＧＥゲル（BioRad）を２００Ｖで３０分実行し、～２３０塩基対の長さのＤＮＡ（１．５標的部位反復＋アダプター配列に対応する）を単離し、Ｑカラム精製した。溶出ＤＮＡ～２ｎｇをＰＣＲで５～８サイクル、＃２Ｂアダプタープライマー（表１０Ａ）で増幅し、Ｍカラム精製した。

１０μＬの溶出ＤＮＡを、１２μＬのAMPure XPビーズ（Agencourt）を用いて精製し、Illumina/Universal Library Quantification Kit（Kapa Biosystems）を用いて定量した。ＤＮＡは、Illuminaの指示に従ってハイスループットＤＮＡシーケンシングのために製造し、MiSeq DNA Sequencer（Illumina）を用い、１２ｐＭの最終溶液および１５６ｂｐのペアエンドリードを使用してシーケンシングした。シーケンシングのための選択前ライブラリーを製造するために、選択前ライブラリーを、１μＬ～４μＬの適切な制限酵素で（ＣＣＲ５Ａ＝Ｔｓｐ４５Ｉ、ＡＴＭ＝Ａｃｃ６５Ｉ、ＣＣＲ５Ｂ＝ＡｖａＩ（NEB））３７℃で１時間消化した後、上記と同様２ｐｍｏｌの加熱および冷却＃１ライブラリーアダプター（表１０Ａ）でライゲートした。選択前ライブラリーＤＮＡを上記と同様に、＃２Ａライブラリーアダプタープライマーおよび＃２Ｂライブラリーアダプタープライマーを、それぞれ＃２Ａアダプタープライマーおよび＃２Ｂアダプタープライマー（表１０Ａ）の代わりに使用して製造した。得られた選択前ライブラリーＤＮＡを、ＴＡＬＥＮ消化試料と共にシーケンシングした。

個別のin vitroＴＡＬＥＮ切断アッセイ
ＴＡＬＥＮ消化のための個別のＤＮＡ基質の構築を、表９Ｂに特定されたオリゴヌクレオチドのペアを制限クローニング１４でpUC19（NEB）中に組み合わせることにより、実施した。対応するクローニングされたプラスミドの増幅を、ＰＣＲにより（５９℃で１５秒アニーリング）２４サイクル、pUC19OfwdおよびpUC19Orevプライマー（表１０Ｂ）を用いて実施し、Ｑカラム精製した。５０ｎｇの増幅したＤＮＡを、１×NEBuffer 3中、それぞれ３μＬのin vitro転写／翻訳ＴＡＬＥＮ左および右単量体（～１６ｎＭから～１２ｎＭの最終ＴＡＬＥＮ濃度に相当）および６μＬの空の溶解物で、総反応容量１２０μＬで消化した。消化反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで１μＬの１００μｇ／μＬ RNase A（Qiagen）で２分間インキュベートし、Ｍカラム精製した。全体で１０μＬの溶出ＤＮＡに、グリセロールを１５％まで添加したものを、５％ＴＢＥ １８ウェルCriterion ＰＡＧＥゲル上で（Bio-Rad）、２００Ｖで４５分間分析し、次に１×SYBR Gold（Invitrogen）で１０分間染色した。バンドを、AlphaImager HP（Alpha Innotech）で可視化し、定量した。

細胞のＴＡＬＥＮ切断アッセイ
ＴＡＬＥＮを、哺乳動物発現ベクター１２にクローニングし、得られたＴＡＬＥＮベクターを前に記載のようにしてU2OS-EGFP細胞にトランスフェクトした^１２。ゲノムＤＮＡを、前に記載のようにして２日後に単離した^１２。各アッセイについて、５０ｎｇの単離したゲノムＤＮＡの増幅を、ＰＣＲにより［９８℃で１５秒；６７．５℃で１５秒；７２℃で２２秒］、表１０Ｃに指定のように４％ＤＭＳＯありまたはなしのプライマー対を用いて３５サイクル実施した。各ゲノム部位のＰＣＲ反応物の相対的ＤＮＡ含量は、Quant-iT（商標）PicoGreen（登録商標）dsDNA Kit（Invitrogen）で定量し、次いで等モル混合物中にプールし、ＴＡＬＥＮなしの試料と全てのＴＡＬＥＮ処置試料とを分離した。１５０～３５０ｂｐに相当するＤＮＡを、上述のようにＰＡＧＥによって精製した。

４４μＬの溶出ＤＮＡを、５μＬの１×T4 ＤＮＡリガーゼ緩衝液および１μＬの１０Ｕ／μＬポリヌクレオチドキナーゼ（NEB）で、３７℃で３０分インキュベートし、Ｃカラム精製した。４３μＬの溶出ＤＮＡを、１μＬの１０ｍＭのｄＡＴＰ（NEB）、５μＬの１０×NEBuffer 2、および１μＬの５Ｕ／μＬのＤＮＡクレノウ断片（３’→５’エキソ－）（NEB）で、３７℃で３０分インキュベートし、Ｍカラム精製した。１０μＬの溶出ＤＮＡを、上記と同様に１０ｐｍｏｌの加熱および冷却Ｇ（ゲノム）アダプター（表１０Ａ）でライゲートした。８μＬの溶出ＤＮＡを、ＰＣＲにより、各試料に対応するバーコードを含むＧ－Ｂプライマーで６～８サイクル増幅した。各試料のＤＮＡを、Quant-iT（商標）PicoGreen（登録商標）dsDNA Kit（Invitrogen）で定量し、次いで等モル混合物中にプールした。合わせたＤＮＡを、上記のようにMiSeqを用いてハイスループットシーケンシングに供した。

データ分析
Illuminaシーケンシングリードをフィルタリングし、アルゴリズムのセクションで概説されるようにUnix Bashで記述されたスクリプトで解析した。ソースコードは、リクエストにより入手可能である。特異性スコアは、前に記載のようにして算出した^１４。表３の様々なＴＡＬＥＮ選択中の変異数の分布に関する統計解析は、前に記載のようにして実施した^１４。表７の修飾部位の統計解析は、前に記載のようにして実施した^１４。

アルゴリズム
すべてのスクリプトはbashまたはMATLABで記述された。

選択前配列および選択された配列のコンピューターによるフィルタリング
選択前配列について
１）最初の４塩基（ランダムな塩基）のリードの直後の、１６ｂｐの定常配列（ＣＣＲ５Ａ＝CGTCACGCTCACCACT、ＣＣＲ５Ｂ＝CCTCGGGACTCCACGCT、ＡＴＭ＝GGTACCCCACTCCGCGT）を探索し、１つの変異を可能にする１６ｂｐ定常配列を有する配列のみを承認する。
２）定常配列から、少なくとも最小可能限度の完全部位長から最大の完全部位長までの距離で離れている位置における、９ｂｐの最終配列を探索して、完全部位の存在を確認し、この９ｂｐの最終配列を有する配列のみを承認する。（最終配列：ＣＣＲ５Ａ＝CGTCACGCT、ＣＣＲ５Ｂ＝CCTCGGGAC、ＡＴＭ＝GGTACGTGC）。
３）完全部位内の各半部位の最良の例を探索し、左の後に右という、正しい左および右半部位の順序のすべての配列を承認する。
４）２つの半部位と、左半部位の左の単一隣接ヌクレオチドおよび右半部位の右の単一隣接ヌクレオチドの間の、ＤＮＡスペーサー配列（半部位と定常配列の間の配列）を決定する。
５）シーケンシングリード品質スコアによりフィルタリングして、半部位の位置の４分の３に渡って品質スコアＡ以上の配列のみを承認する。

選択された配列について
１）異なる選択条件に対応する正しい５ｂｐのバーコードから開始される全ての配列の、全配列のリードおよび位置の品質スコアを、別々のファイルに出力する。
２）初期配列から少なくとも最小可能限度の完全部位長離れ、かつ初期配列から最大の完全部位長離れている位置で反復される、５ｂｐのバーコードの直後の初期１６ｂｐ配列を探索して、反復配列を有する完全部位の存在を確認し、１つの変異を可能にする１６ｂｐの反復を有する配列のみを承認する。
３）完全部位内の１６ｂｐの定常配列を探索し、１つの変異を可能にする定常配列を有する配列のみを承認する。配列の解析を、定常配列＋５’配列から開始して２番目の反復配列まで、次にバーコードの後の初期配列から定常配列まで実施して、１つの完全部位の均等物を挟む複数定常配列を得る。
CONSTANT－LFLANK－LHS－SPACER－RHS－RFLANK－CONSTANT
LFLANK＝左隣接配列（単一のランダム塩基として設計）
LHS＝左半分部位配列
RHS＝右半分部位配列
RFLANK＝右隣接配列（単一のランダム塩基として設計）
CONSTANT＝定常配列（ＣＣＲ５Ａ＝CGTCACGCTCACCACT、ＣＣＲ５Ｂ＝CCTCGGGACTCCACGCT、ＡＴＭ＝GGTACCCCACTCCGCGT）
４）完全部位内の各半部位の最良の例を探索し、左の後に右という、正しい左および右半部位の順序のすべての配列を承認する。
５）半部位の位置で、対応するスペーサー（２つの半部位間の配列）、左隣接および右隣接配列（半部位と定常配列の間の配列）を決定する。
６）５ｂｐのバーコード配列の後のリードの開始から、定常配列の始まりまでの配列を得ることにより、配列末端を決定する。
SEQUENCESTART－RHS－RFLANK－CONSTANT
７）シーケンシングリード品質スコアによりフィルタリングして、半部位の位置の４分の３に渡って品質スコアＡ以上の配列のみを承認する。
８）選択された配列を、スペーサー側からの各半部位中に０～５個の塩基対の末端を有する配列の数の平均として計算された配列末端の背景の量よりも２．５倍豊富なスペーサー中に配列末端を有する配列のみを承認することによって（配列末端の背景数は、比較のための配列末端の背景として利用した配列末端に最も近い半部位を有する両方の半部位について計算した）、配列末端によってフィルタリングした。

ＣＣＲ５Ｂ標的部位に関連するゲノムオフターゲット部位のコンピューター探索
１）Patmatchプログラム^３９を使用して、パターン配列について次のようにヒトゲノム（GRCh37／hg19ビルド）を探索した：ＣＣＲ５Ｂ左半部位配列（Ｌ１６、Ｌ１３またはＬ１０）NNNNNNNNN ... ＣＣＲ５Ｂ右部位配列（Ｒ１６、Ｒ１３またはＲ１０）［Ｍ，０，０］、ここでＮの数は１２～２５で変化し、およびＭ（可能な変異を示す）は０～１４で変化する。
２）プログラムがＸ個以下の変異を有するすべての配列を出力するため、出力されるオフターゲット部位の数は脱累積されて、標的部位から離れた変異の特定数である、ヒトゲノム中のオフターゲット部位の数がもたらされるからである。

ゲノム部位の配列におけるインデルの同定
１）各配列について、プライマー配列を使用してゲノム部位を同定した。
２）標的部位の左の８ｂｐに対応する参照ゲノム配列、および完全標的部位の右の８ｂｐ（またはシーケンシングリードの最末端のゲノム部位については６ｂｐ）の参照ゲノム配列を含む配列は、標的部位配列と考えられた。
３）参照ゲノム部位と同じ大きさに対応する任意の標的部位配列は、非修飾と考えられ、参照サイズではない任意の配列は、ClustalW^４０で参照ゲノム部位と整列させた。
４）２つ半部位配列の間のＤＮＡスペーサー配列における２つより多くの挿入または２つより多くの欠失を有する整列された配列は、インデルと考えられた。

結果
ＣＣＲ５およびＡＴＭを標的とするＴＡＬＥＮの特異性プロファイリング
我々は、種々の長さの左および右半部位を標的とするＴＡＬＥＮ、および異なるドメインバリアントを有するＴＡＬＥＮを含む、合計４１のヘテロ二量体ＴＡＬＥＮ対（以下ＴＡＬＥＮと呼ぶ）の特異性をプロファイリングした。４１のＴＡＬＥＮのそれぞれは、２つの異なるヒト遺伝子ＣＣＲ５およびＡＴＭにおける、３つの異なる配列（ＣＣＲ５Ａ、ＣＣＲ５Ｂ、またはＡＴＭと呼ぶ）の１つを標的とするように設計した（図７）。我々は、前述のin vitro選択法^１４の改良版に、選択のスループットおよび感度を高める変更を加えて使用した（図１Ｂ）。

簡単に述べると、＞１０^１２のＤＮＡ配列の選択前ライブラリーにおいて、それぞれを、３ｎＭ～４０ｎＭのin vitroで翻訳されたＴＡＬＥＮで消化した。これらの濃度は、ヒト細胞核当たり～２０から～２００の二量体ＴＡＬＥＮ分子に相当し^２１、これは比較的低レベルの細胞タンパク質発現である^{２２，２３}。切断されたライブラリーメンバーは、アダプターライゲーションによって捕捉してゲル精製により単離した、遊離の５’一リン酸を含んでいた（図１Ｂ）。対照試料において、選択前ライブラリーのすべてのメンバーは、定常配列において制限エンドヌクレアーゼにより切断されており、これらがアダプターライゲーションによって捕捉されゲル精製によって単離されることが可能であった。この選択プロセスを耐えたＴＡＬＥＮ処置試料または対照試料のハイスループットシーケンシングとコンピューター解析により、ＴＡＬＥＮで切断されたすべての配列の存在量だけでなく、選択前の対応する配列の存在量が明らかにされた。選択を耐えた各ライブラリーメンバーの濃縮値の算出は、その選択後配列存在量を、その選択前存在量で割り算することにより行った。選択前ＤＮＡライブラリーは、その各々が、理論的には、オンターゲット配列に対して６個以下の変異を有する全ての可能なＤＮＡ配列の少なくとも１０のコピーを含有するだけ、充分に大きかった。

試験した全４１のＴＡＬＥＮについて、選択を耐えたＤＮＡは、選択前ライブラリーに存在したよりも有意に少ない平均変異を標的半部位に含んでいた（表３および４）。例えば、１８ｂｐの左および右半部位を標的とするＴＡＬＥＮで処置後の選択を耐えたＤＮＡ配列における変異の平均数は、ＣＣＲ５Ａ配列について４．０６、ＡＴＭ配列について３．１８であり、比較して、対応する選択前ライブラリーではそれぞれ７．５４と６．８２の変異であった（図２Ａおよび２Ｂ）。すべての選択について、オンターゲット配列は８～６４０倍に濃縮された（表５）。我々の選択結果をin vitroで検証するために、１３ｂｐの左および右半部位（Ｌ１３＋Ｒ１３）を標的とするＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮの、１６の多様なオフターゲット基質のそれぞれを切断する能力をアッセイした（図２Ｅおよび２Ｆ）。得られた個別のin vitro切断効率は、観測された濃縮値と良好に相関した（図２Ｇ）。

全４つの可能な塩基対に対する、ＴＡＬＥＮ標的部位における各位置での特異性を決定するために、特異性スコアを選択前と選択後の塩基対頻度の差として算出し、これを、完全な特異性（１．０と定義）から完全な反特異性（anti-specificity）（－１．０と定義）までの選択前頻度の最大可能な変化について、正規化した。試験したすべてのＴＡＬＥＮについて、両方の半部位内の全ての位置で標的とされた塩基対が好ましく、ただし唯一の例外は、右半部位でのいくつかのＡＴＭ ＴＡＬＥＮについてのスペーサーに最も近い塩基対であった（図２Ｃ、２Ｄおよび図８～１３）。Ｎ末端ドメインによって認識される５’Ｔヌクレオチドが高度に特異的であり、５’ＤＮＡ末端（Ｎ末端ＴＡＬＥＮ末端）は、一般に、３’ＤＮＡ末端よりも高い特異性を示す；両方の観測は、以前の報告と整合する^{２４，２５}。まとめると、これらの結果は、選択データが正確にin vitroでのオフターゲットＴＡＬＥＮ切断の効率を予測し、ＴＡＬＥＮが、標的配列全体にわたって高度に特異的であることを示す。

細胞におけるＴＡＬＥＮのオフターゲット切断
選択によって報告されたオフターゲット切断活性が、細胞でのオフターゲット切断に関連しているかどうかを試験するために、我々はin vitroでの選択結果を用いて、機械学習アルゴリズムを、ヒトゲノムで潜在的なＴＡＬＥＮオフターゲット部位を生成するように訓練した^２６。このコンピューターのステップが必要であるのは、選択前ライブラリーは６個以下の変異を有する全ての配列をカバーするが、一方ＣＣＲ５配列およびＡＴＭ配列については、ヒトゲノムのほぼすべての潜在的なオフターゲット部位が、標的配列に対して６より多くの位置で異なるからである。このアルゴリズムは、切断が観察されなかった標的ライブラリーからの配列に対する、ＴＡＬＥＮにより切断された配列で生じる、標的の各位置の各ヌクレオチドの事後確率を算出する^２７。次にこれらの事後確率を用いて、アルゴリズムの訓練に使用したＴＡＬＥＮが、１０～３０ｂｐの単量体スペーシングのヒトゲノムにおける、全ての潜在的標的配列を切断する尤度（likelihood）をスコア付けした。機械学習アルゴリズムを使用して、我々は、７～１４の位置においてオンターゲット配列と異なる、３６のＣＣＲ５Ａおよび３６のＡＴＭ ＴＡＬＥＮオフターゲット部位を同定した（表６）。

ＣＣＲ５ＡおよびＡＴＭ ＴＡＬＥＮについての７２のベストスコアのゲノムオフターゲット部位を、ＣＣＲ５ＡまたはＡＴＭいずれかのＴＡＬＥＮを発現するヒトU2OS-EGFP細胞１２から精製したゲノムＤＮＡから増幅した^３。潜在的なゲノムオフターゲット部位のＤＮＡスペーサー内に３または４以上の塩基対の挿入または欠失を含む配列であって、未処置の対照試料と比べてＴＡＬＥＮ処置試料中に有意に高い数値で存在するものは、ＴＡＬＥＮ誘導性の修飾と考えられた。我々が首尾良く増幅した３５のＣＣＲ５Ａオフターゲット部位から、ＴＡＬＥＮ誘導性の修飾を有する６つのオフターゲット部位を同定した；同様に、我々が首尾良く増幅した３１のＡＴＭオフターゲット部位から、ＴＡＬＥＮ誘導性の修飾を有する７つのオフターゲット部位を観測した（図３および表７）。修飾されたオンターゲットおよびオフターゲット部位の検査により、３から数十に及ぶ塩基対の範囲の欠失の保有率が得られ（図３）、これは、ＴＡＬＥＮ誘導性のゲノム修飾の、以前に説明された特徴と整合していた^２８。

これらの結果をまとめると、機械学習アルゴリズムによって処理されたin vitro選択データが、ヒト細胞においてＴＡＬＥＮ誘導性修飾を受ける真正のオフターゲット基質を予測できることを示す。ＴＡＬＥ反復は、相対的独立性で塩基対に生産的に結合する。選択データにおいて定量的に特徴付けられた多数のオフターゲット基質は、標的配列内の１つの位置での変異が、他の位置に生産的に結合するＴＡＬＥＮ反復の能力に影響を与えるかどうか評価することを可能にした。我々は、Ｌ１３＋Ｒ１３ ＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮに対するあらゆる可能な二重変異体配列の予測濃縮値を、対応する２つの単一変異濃縮からの独立した寄与を仮定して生成した。一般的には、予測濃縮値は、各二重変異配列について実際に観測された濃縮値に非常に類似しており（図１４Ａ）、成分単一変異は、二重変異配列の全体のトランケート性に独立して寄与することを示唆する。観測と予測の二重変異濃縮値の間の差は、２つの変異の間の距離とは比較的無関係であったが、ただし、２つの隣接するミスマッチは、予想されるよりもわずかに良好に耐容されていた（図１４Ｂ）。

２つ以上の変異の潜在的な相互依存関係を決定するために、我々は、Ｌ１３＋Ｒ１３ ＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮについての選択後の標的における、選択濃縮値と変異数の関係を評価した（図４Ａ、黒線）。０～５の変異について、濃縮値は、変異の平均数（ｍ）の単純な指数関数に密接に従った（表８）。この関係は、連続した各変異が一定量（ΔＧ）ずつ結合エネルギーを低減し、ＴＡＬＥＮ結合（Ｋｅｑ（ｍ））が、Ｋｅｑ（ｍ）～ｅΔＧ^＊ｍという指数関数的減少をもたらすというモデルと整合する。したがって、観測された指数関数的な関係は、典型的なミスマッチからの結合エネルギーの平均の減少が、ＴＡＬＥＮ：ＤＮＡ相互作用中に既に存在するミスマッチの数とは無関係であることを示唆する。まとめると、これらの結果は、ＴＡＬＥ反復がそれぞれのＤＮＡ塩基対に、隣接のミスマッチに対するわずかに増加した耐性を超えて、独立して結合することを示す。

長いＴＡＬＥＮは認識塩基対当たりの特異性が低い
ＴＡＬＥ反復の独立した結合は、塩基対当たりのＴＡＬＥＮ特異性が、標的部位の長さとは無関係であることを単純化して予測する。ＴＡＬＥアレイの長さとオフターゲット切断の間の関係を実験的に特徴づけるために、我々は、１０、１３、または１６ｂｐ（５’Ｔを含む）を標的とするＴＡＬＥＮを、左（Ｌ１０、Ｌ１３、Ｌ１６）および右（Ｒ１０、Ｒ１３、Ｒ１６）の両方の半部位について構築した。左および右のＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮの９つすべての可能な組み合わせを表すＴＡＬＥＮを、in vitro選択に供した。結果は、より短いＴＡＬＥＮが、より長いＴＡＬＥＮよりも、標的化塩基対当たりより大きな特異性を有することが明らかになった（表３）。例えば、Ｌ１０＋Ｒ１０ ＴＡＬＥＮにより切断された配列は、認識塩基対当たり平均して０．０３２の変異を含んでいるのに対し、Ｌ１６＋Ｒ１６ ＴＡＬＥＮにより切断されたものは、認識塩基対当たり平均して０．０６７の変異を含んでいた。１６＋１６塩基対を標的とする最長のＣＣＲ５Ｂ ＴＡＬＥＮ、または１８＋１８ｂｐを標的とするＣＣＲ５ＡおよびＡＴＭ ＴＡＬＥＮによる選択の場合、平均の選択濃縮値は、変異数の関数としての単純な指数関数的減少には従わない（図４Ａおよび表８）。

我々は次のように仮定した：長いＴＡＬＥＮにおけるより多数のＴＡＬＥ反復からの過剰な結合エネルギーは、より多くの変異を有する配列の切断を可能にすることにより、より少ない変異を有する配列において対応する切断の増加なしで、特異性を低下させるが、これは、後者の配列が既にほぼ完全に切断されているからである。実際、これらのより長いＴＡＬＥＮについての個々のＤＮＡ配列のin vitro切断効率は、標的部位における少数の変異の存在とは無関係であり（図５Ｃ－５Ｆ）、わずかな変異を含有する配列のほぼ完全な結合および切断を示唆する。同様に、より高いＴＡＬＥＮ濃度はまた、わずかな変異を有する配列の濃縮値の減少をもたらし、一方で多くの変異を有する配列の濃縮値を増加させる（表５）。これらの結果は共に、長いＴＡＬＥアレイまたは高いＴＡＬＥＮ濃度のいずれかから生じた、過剰なＴＡＬＥＮ結合が、各認識塩基対で観測されたＴＡＬＥＮ ＤＮＡ切断特異性を低下させるというモデルを支持する。

長いＴＡＬＥＮはゲノムの場面において少ないオフターゲット切断を誘導する
長いＴＡＬＥＮは短いＴＡＬＥＮより、ミスマッチ配列（図４Ａ）に対してより耐容であるが、ヒトゲノムには、短い標的部位よりも長い標的部位について、はるかに少ない数の密接に関連するオフターゲット部位が存在する（図４Ｂ）。オフターゲット部位の存在量と切断効率は両方とも、ゲノムの場面におけるオフターゲット切断イベントの数に寄与するため、我々は、全体的なゲノムの切断特異性をＴＡＬＥＮ長の関数として、与えられた長さの変異配列の外挿平均濃縮度値に、ヒトゲノムにおける対応する変異配列の数を乗じて算出した。より長い標的部位の長さに起因する潜在的なオフターゲット部位の存在量の減少は、より長いＴＡＬＥＮについて観測された認識塩基対当たりの特異性の減少を上回るに充分な大きさである（図４Ｃ）。その結果、長いＴＡＬＥＮは、短いＴＡＬＥＮよりも、２０～３２ｂｐの部位を標的とした試験されたＴＡＬＥＮ長さに関して、ヒトゲノムにおける潜在的な切断部位のセットに対しより特異的であることが、予測されている。

改善された特異性を有するＴＡＬＥＮの操作
上記の知見は、ＴＡＬＥＮ特異性を、効率的なオンターゲット切断を可能にするために必要とされるものを超えた非特異的ＤＮＡ結合エネルギーを低減することによって、改善可能であることを示唆する。最も広く使用されている、ＴＡＬＥ反復アレイとＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの間の６３－ａａ Ｃ末端ドメインは、１０個のカチオン性残基を含む。我々は、標準ＴＡＬＥ Ｃ末端ドメインのカチオン性電荷を減少させることは、非特異的ＤＮＡ結合を減少させ^２９、ＴＡＬＥＮ特異性を改善するであろうと推測した。

我々は、２つのＣ末端ドメインバリアントを構築し、ここで、標準６３－ａａ Ｃ末端ドメインの３個（「Ｑ３」、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ８０１Ｑ）または７個（「Ｑ７」、Ｋ７７７Ｑ、Ｋ７７８Ｑ、Ｋ７８８Ｑ、Ｒ７８９Ｑ、Ｒ７９２Ｑ、Ｒ７９３Ｑ、Ｒ８０１Ｑ）のカチオン性ＡｒｇまたはＬｙｓは、Ｇｌｎに変異されている。我々は、標準、操作Ｑ３、および操作Ｑ７のＣ末端ドメイン、ならびに、Ｑ７ Ｃ末端ドメインと同一の理論正味電荷（－１）を有する、以前に報告された２８－ａａトランケートされたＣ末端ドメイン^５、を含有するＣＣＲ５ＡおよびＡＴＭ ＴＡＬＥＮ上でin vitroでの選択を行った。

ＣＣＲ５ＡとＡＴＭの選択のためのオンターゲット配列濃縮値は、Ｃ末端ドメインの正味電荷が減少するにつれて、実質的に増加した（図５Ａおよび５Ｂ）。例えば、ＡＴＭの選択は、Ｑ７、Ｑ３、および標準６３－ａａのＣ末端バリアントそれぞれについて、５１０、５０、および２０のオンターゲット濃縮値をもたらした。これらの結果は、Ｃ末端ドメイン中のカチオン性残基が部分的に中性残基によって置換または完全に除去されたＴＡＬＥＮバリアントが、標準６３－ａａ Ｃ末端ドメインを含むＴＡＬＥＮよりも、in vitroで実質的により特異的であることを示唆する。同様に、ＴＡＬＥＮ Ｎ末端における１つ、２つ、または３つのカチオン性の残基をＧｌｎに変異させることもまた、切断特異性を増加させた（表５、および図８－１１）。

Ｑ７の、in vitroの標準６３－ａａ Ｃ末端ドメインを超える、高いＤＮＡ切断特異性を確認するために、１６のオフターゲットＤＮＡ基質の代表的なコレクションを、in vitroで標準または操作いずれかのＱ７ Ｃ末端ドメインを含むＴＡＬＥＮで消化した。標準６３－ａａ Ｃ末端ドメインＴＡＬＥＮを有するＡＴＭおよびＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮは、０、１、または２つの変異を有する標的部位に、同等のin vitro切断活性を実証する（図５Ｃ－５Ｆ）。これとは対照的に、試験された１６のオフターゲット基質のうち１１については、操作されたＱ７ ＴＡＬＥＮ変異体は、標準６３－ａａ Ｃ末端ドメインＴＡＬＥＮよりも、１または２つの変異を有するオフターゲットＤＮＡ基質に対して実質的に高い（～４倍以上）識別を示し、ただし、Ｑ７ ＴＡＬＥＮはそれぞれのオンターゲット配列を、標準６３－ａａ Ｃ末端ドメインＴＡＬＥＮと同等かそれ以上の効率で切断した（図５Ｃ－５Ｆ）。全体的に、個別の切断アッセイは選択結果と一致しており、操作されたＱ７ Ｃ末端ドメインを有するＴＡＬＥＮが標準６３－ａａ Ｃ末端ドメインのＴＡＬＥＮよりも、in vitroで実質的により特異的であることを示す。

ヒト細胞における操作されたＴＡＬＥＮの改善された特異性
in vitroで観測された、操作されたＴＡＬＥＮの特異性の増加が、ヒト細胞にも適用されるかどうかを決定するために、オンターゲット部位およびトップ３６の予測オフターゲット部位のＴＡＬＥＮ誘導性の修飾率を、標準６３－ａａ、Ｑ３、またはＱ７のＣ末端ドメインおよびＥＬ／ＫＫまたはＥＬＤ／ＫＫＲのＦｏｋＩドメインの全６つの可能な組み合わせを含むＣＣＲ５ＡおよびＡＴＭ ＴＡＬＥＮ（合計１２のＴＡＬＥＮ）について測定した。

両方のＦｏｋＩバリアントについて、Ｑ３ Ｃ末端ドメインのＴＡＬＥＮは、８％～２４％の修飾の範囲の顕著なオンターゲット活性を実証し、これは、標準６３－ａａ Ｃ末端ドメインのＴＡＬＥＮの活性に匹敵する。標準６３－ａａまたはＱ３ Ｃ末端ドメインおよびＥＬＤ／ＫＫＲ ＦｏｋＩドメインを有するＴＡＬＥＮは両方とも、細胞内のＣＣＲ５ＡおよびＡＴＭオンターゲット部位を修飾するのに、Ｑ７ Ｃ末端ドメインの対応するＴＡＬＥＮよりも、～５倍、より活性である（図６および表７）。

in vitroで観測された改善された特異性と一致して、操作されたＱ７ ＴＡＬＥＮは、Ｑ３バリアントよりも特異的であり、これは次に標準６３－ａａ Ｃ末端ドメインＴＡＬＥＮよりも特異的である。標準６３－ａａ Ｃ末端ドメインと比較して、Ｑ３ Ｃ末端ドメインのＴＡＬＥＮは、ＥＬＤ／ＫＫＲのＦｏｋＩドメインを有するＣＣＲ５ＡおよびＡＴＭ部位についてそれぞれ、１３倍および９倍以上も、細胞特異性の平均増加（オンターゲット部位のオフターゲット部位に対する細胞修飾率の比として定義される）を示す（表７）。これらの平均の改善は、多くのオフターゲット配列に対しては操作されたＴＡＬＥＮによる観測された切断イベントがないかまたはほとんどないために、下限値としてのみ表すことができる。最も多く切断されたオフターゲット部位について（ＣＣＲ５Ａオフターゲット部位＃５）、Ｑ３ Ｃ末端ドメインは、標準６３－ａａ Ｃ末端ドメインより３４倍さらに特異的であり（図６）、Ｑ７ Ｃ末端ドメインは＞１１６倍さらに特異的である。

これらの結果は共に、ＣＣＲ５およびＡＴＭ配列を標的とするために、標準６３－ａａ Ｃ末端ドメインを操作されたＱ３ Ｃ末端ドメインで置き換えることが、細胞内でのオンターゲット部位に対して匹敵する活性、最も容易に切断されるオフターゲット部位に対して細胞における特異性の３４倍の改善、およびその他のオフターゲット部位に対する特異性の一貫した増加をもたらすことを明らかにする。低い活性が必要な場合は、操作されたＱ７ Ｃ末端ドメインは、特異性の付加的な増加を提供する。

改善されたＴＡＬＥＮ ＤＮＡ切断特異性のためのＮ末端ドメインの操作
本明細書に記載のＴＡＬＥＮ結合および特異性のモデルは、過剰なＴＡＬＥＮ結合エネルギーを低減することが、ＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断特異性を増加させることを予測する。この予測をさらに試験し、ＴＡＬＥＮ特異性を潜在的にさらに強化するために、我々は、ＣＣＲ５ＡおよびＡＴＭを標的とするＴＡＬＥＮのＮ末端ドメインにおいて、１個（「Ｎ１」、Ｋ１５０Ｑ）、２個（「Ｎ２」、Ｋ１５０ＱおよびＫ１５３Ｑ）、または３個（「Ｎ３」、Ｋ１５０Ｑ、Ｋ１５３Ｑ、およびＲ１５４Ｑ）のＬｙｓまたはＡｒｇ残基を、Ｇｌｎに変異させた。これらのＮ末端残基は、以前の研究において、ＤＮＡに非特異的に結合することが示されており、これらの特定の残基における、カチオン性電荷を中和するための変異は、非特異的ＤＮＡ結合エネルギーを減少させる^３３。我々は、これらのＮ末端変異からの非特異的結合エネルギーの減少は、過剰なＴＡＬＥＮ結合エネルギーを減少させ、特異性の増加をもたらすとの仮説をたてた。これら３つのＴＡＬＥＮバリアント上でのin vitro選択は、より少ないカチオン性のＮ末端ＴＡＬＥＮが実際に、オンターゲット切断のより大きな濃縮値を示すことを明らかにした（表５）。

Ｎ末端およびＣ末端ドメインならびにＴＡＬＥＮ濃度の特異性に対する効果
試験したすべてのＴＡＬＥＮコンストラクトは、両方の半部位にわたって意図した塩基対を特異的に認識するが（図８～１３）、ただし、ＡＴＭ ＴＡＬＥＮのいくつかは、スペーサーに隣接する塩基対とは特異的に相互作用しない（ほとんどのＣ末端ＴＡＬＥ反復により標的化）（図１０および１１）。標準ＴＡＬＥＮと、操作されたＣ末端またはＮ末端ドメインを含有するものの、広い特異性プロファイルを比較するために、標準、Ｑ３、またはＱ７のＣ末端ドメインおよびＮ１、Ｎ２、またはＮ３のＮ末端ドメインを有するＣＣＲ５ＡおよびＡＴＭ ＴＡＬＥＮを使用した選択からの各標的塩基対の特異性スコアから、標準ＴＡＬＥＮ（標準６３－ａａ Ｃ末端ドメイン、野生型Ｎ末端ドメイン）上の選択からの対応する特異性スコアを差し引いた。

結果を図１５に示す。特異性を増加させるＣ末端ドメインにおける変異は、各半部位の中央およびＣ末端において最も強く特異性を増加させた。同様に、Ｎ末端における特異性増大変異は、ＴＡＬＥＮのＮ末端（５’ＤＮＡ末端）付近の位置で最も強く特異性を増加させる傾向にあったが、ただし、右半部位を標的とするＡＴＭ ＴＡＬＥＮのＮ末端における変異は、特異性を顕著に変化させなかった。これらの結果は、いずれかの末端での弱い結合が、この末端近くのＴＡＬＥ反復における特異性の増加を要求するとの、局所的結合補償モデルと整合する。ＴＡＬＥＮ濃度の特異性に対する効果を特徴付けるために、３ｎＭ～１６ｎＭの範囲の３つの異なる濃度で行ったＡＴＭおよびＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮの選択からの特異性スコアから、アッセイした最高ＴＡＬＥＮ濃度、すなわちＡＴＭについて２４ｎＭ、またはＣＣＲ５Ａについて３２ｎＭで行った対応する選択からの特異性スコアを差し引いた。結果（図１５）は、特異性スコアが、ＴＡＬＥＮの濃度が減少するにつれて、半部位にわたってかなり均一に増加することを示す。

ＤＮＡスペーサー長と切断部位の選好
様々なＴＡＬＥＮ構築物（Ｃ末端変異、Ｎ末端変異、およびＦｏｋＩバリアント）のスペーサー長および様々なＴＡＬＥＮ濃度の選好を評価するために、１０～２４塩基対のスペーサー長を有するライブラリーメンバーの濃縮値の算出を、標準、Ｑ３、Ｑ７、または２８－ａａ Ｃ末端ドメイン；Ｎ１、Ｎ２、またはＮ３ Ｎ末端変異；およびＥＬ／ＫＫまたはＥＬＤ／ＫＫＲ ＦｏｋＩバリアントの様々な組み合わせを有するＣＣＲ５ＡおよびＡＴＭ ＴＡＬＥＮによる選択のそれぞれについて、４ｎＭ～３２ｎＭのＣＣＲ５ＡおよびＡＴＭ ＴＡＬＥＮにて実施した（図１６）。試験した全濃度において、Ｎ末端バリアント、Ｃ末端バリアント、およびのＦｏｋＩバリアントは、３つの顕著な例外を除いて、１４～２４塩基対の範囲の広いＤＮＡスペーサー長の選好を示した。第１に、以前の報告と整合して^{３４－３６}、ＣＣＲ５Ａ ２８－ａａ Ｃ末端ドメインは、標準Ｃ末端ドメインのより広範なＤＮＡスペーサー長の選好よりはるかに狭い、ＤＮＡスペーサー長の選好を示した。第２に、Ｑ７ Ｃ末端ドメインを含有するＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮは、標準Ｃ末端ドメインバリアントと比較して、１２塩基のスペーサーに対する耐性の増加を示した（図１６）。このわずかに広がったスペーサー長の選好は、おそらくはＴＡＬＥＮ：ＤＮＡ境界にそったより少数の非特異的タンパク質：ＤＮＡ相互作用から生じる、Ｑ７ Ｃ末端ドメインのより大きな立体配座的柔軟性を反映している可能性がある。第３に、Ｑ７ Ｃ末端ドメインのＡＴＭ ＴＡＬＥＮおよびＮ３変異体のＮ末端ドメインのＡＴＭ ＴＡＬＥＮは、狭いスペーサーの選好を示した。

これらの、低いＤＮＡ結合親和性を有するより特異的なＴＡＬＥＮ（表５）は、非最適なＤＮＡスペーサー長の切断速度と競争力のある、より速いオフ速度（off-rate）を有することができ、観測されたスペーサー長の選好を変化させる。以前の報告は、ＴＡＬＥＮ Ｃ末端ドメインの長さをＤＮＡスペーサー長の選好の主要な決定因子として焦点を当てているが、これらの結果は、Ｃ末端ドメインの正味の電荷ならびに全体的なＤＮＡ結合親和性もまた、ＴＡＬＥＮのスペーサー長の選好に影響を与える可能性があることを示唆する。

我々はまた、スペーサー内のＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断の位置を特徴付けた。我々は、各配列の右半部位に先だって観測されるスペーサーＤＮＡ塩基の数を報告するヒストグラムを、標準、Ｑ３、Ｑ７、または２８－ａａ Ｃ末端ドメイン；Ｎ１、Ｎ２、またはＮ３ Ｎ末端変異；およびＥＬ／ＫＫまたはＥＬＤ／ＫＫＲ ＦｏｋＩバリアントの様々な組み合わせを有するＣＣＲ５ＡおよびＡＴＭ ＴＡＬＥＮによる選択からの配列の各々において作製した（図１７）。ヒストグラムのピークは、スペーサー内のＤＮＡ切断の最も可能性の高い場所を表すと解釈された。切断位置は、ＴＡＬＥＮ Ｃ末端ドメインとＤＮＡスペーサー長によって課される立体配座的制約から予想されるように、ＴＡＬＥＮ結合半部位の間のＤＮＡスペーサー長に依存する。

考察
１０^１２の密接に関連するオフターゲット配列でチャレンジした４１のＴＡＬＥＮのin vitro選択およびその後の分析は、次の４つの重要な知見を通して、ＴＡＬＥＮ特異性についての我々の理解を報告する：（ｉ）ＴＡＬＥＮは、その意図する標的塩基対に対して、全ての位置において高度に特異的であり、各ＴＡＬＥ反復アレイのＮ末端ＴＡＬＥＮ末端近くで（結合したＤＮＡの５’末端に相当）特異性が増加する；（ｉｉ）長いＴＡＬＥＮは、ゲノムの場面においてより特異的であり、一方短いＴＡＬＥＮは、ヌクレオチド当たりのより高い特異性を有する；（ｉｉｉ）ＴＡＬＥ反復はそれぞれ、対応する塩基対に比較的独立的に結合する；および（ｉｖ）過剰なＤＮＡ結合親和性は、オフターゲット部位に対してＴＡＬＥＮ活性を増加させ、したがって特異性の減少をもたらす。

Ｃ末端ドメインまたはＮ末端におけるより多くのＴＡＬＥ反復またはより多くのカチオン性残基を有するＴＡＬＥＮについての特異性の、観測された減少は、過剰なＴＡＬＥＮ結合親和性が混乱の増加につながるというモデルと整合する。過剰な結合エネルギーはまた、長いＣ末端ドメインのＴＡＬＥＮの５’末端Ｔで以前に報告された混乱を説明し^３０、また高いＴＡＬＥＮタンパク質濃度がin vivoでより多くのオフターゲット部位の切断をもたらすとの報告とも整合する^９。細胞内でのＴＡＬＥＮタンパク質発現の低減は、理論的には、オフターゲット切断を減らすことができるが、いくつかのＴＡＬＥＮコンストラクトのそれらの標的ＤＮＡ配列に対するＫｄ値は既に、ヒト細胞の核内での理論的な最小のタンパク質濃度である～０．２ｎＭと、同等かまたはそれ以下である可能性がある。

かかるＴＡＬＥＮの特異性を、それらの発現レベルを低下させることによって改善することの困難さは、所望のレベルのオンターゲット切断を達成するのに充分なＴＡＬＥＮ濃度を維持する必要性と相まって、本研究で記載されているような、より高い固有の特異性を有するＴＡＬＥＮを操作することの価値を強調する。我々の知見は、低下した非特異的ＤＮＡ結合を有する変異体Ｃ末端ドメインを使用して、ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合親和性を微調整し、オンターゲット配列が効率的にしかし最小限の過剰な結合エネルギーで切断され、オンターゲット部位とオフターゲット部位の間のより良好な識別をもたらし得ることを示唆する。４６の総塩基対までを標的とするＴＡＬＥＮは、細胞において活性であることが示されているため^１５、ここで提示された結果は、特異性が、変異Ｎ末端およびＣ末端ドメインの組み合わせを有する操作されたＴＡＬＥＮによって、さらに改善することができるという考えと整合し、ここで該ＴＡＬＥＮは、低減した非特異的ＤＮＡ結合および、追加のオンターゲットＤＮＡ結合に寄与するより多数のＴＡＬＥ反復、および、Ｇを認識するより特異的な（しかし低親和性の）ＮＫ ＲＶＤを、付与するものである^{２５，３１}。

本研究では、ＳＥＬＥＸまたはインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）などの方法^３２を使用した他の研究よりもより多くの、真正なＴＡＬＥＮゲノムのオフターゲット部位を同定した。我々のモデルおよび得られた改善ＴＡＬＥＮは、ゲノム中に存在する目的の標的配列に密接に関連する少ない数の配列により本質的に制限されている、細胞オフターゲット切断方法からは、または、ＤＮＡ切断活性を測定せず、したがって活性な二量体ＴＡＬＥＮを特徴づけない、単量体ＴＡＬＥ反復アレイによるＳＥＬＥＸ実験^５からは、得ることが困難であろう。対照的に、本研究の各ＴＡＬＥＮは、哺乳動物ゲノムにおける異なる配列の数よりも数桁大きいライブラリーサイズの、そのオンターゲット配列の１０^１２個の密接なバリアントのいずれかを切断する能力について評価した。オフターゲット配列空間のこの密な有効範囲により、ＤＮＡ切断の特異性と、標的塩基対の位置、ＴＡＬＥ反復長、ＴＡＬＥＮ濃度、ミスマッチの位置、および操作されたＴＡＬＥＮドメイン組成物との間の詳細な関係の解明が可能となった。

例２
標準Ｎ末端ドメイン配列の少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基が、生理学ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基で置き換えられている、多数のＴＡＬＥＮを生成した。ＴＡＬＥＮは、それらのＮ末端ドメインにおいて、グリシン（Ｇ）および／またはグルタミン（Ｑ）の置換を含んでいた（図１８参照）。操作されたＴＡＬＥＮの切断の選好の評価は、グリシン（Ｇ）に対する変異が、グルタミン（Ｑ）に対するものと同等であることを実証した。ＴＡＬＥＮのＮ末端ドメイン（Ｋ１５０Ｑ、Ｋ１５３Ｑ、およびＲ１５４Ｑ）における正に荷電したアミノ酸の変異は、ＱまたはＧのいずれかへの変異に対する結合親和性およびオフターゲット切断に、類似の減少をもたらした。例えば、Ｍ３およびＭ４のＮ末端を含むＴＡＬＥＮ、これはそれぞれ、ＱまたはＧのいずれかに変異した同一アミノ酸（Ｒ１５４）を含むが、これらはほぼ同量の切断を示した。同様に、ＱまたはＧ置換が位置Ｋ１５０およびＲ１５４で導入されている点でのみ異なる、Ｍ６およびＭ８のＮ末端を含むＴＡＬＥＮ、および、ＱまたはＧ置換が位置Ｋ１５０、Ｋ１５３、およびＲ１５４で導入されている点でのみ異なる、Ｍ９およびＭ１０のＮ末端を含むＴＡＬＥＮは、類似の切断活性を示した。

例３
本明細書において提供される操作されたＴＡＬＥＮの、クローニングおよび発現のためのプラスミドを生成した。プラスミドのマップを、図１９に示す。プラスミドは、例えば本明細書で提供される操作されたドメインなどのＮ末端およびＣ末端ドメイン、およびＴＡＬＥ反復の、モジュラークローニングを可能にし、所望の操作されたＴＡＬＥＮをコードする組換え核酸を生成する。プラスミドはまたアミノ酸タグをコードし、該タグは例えば、Ｎ末端ＦＬＡＧタグおよびＣ末端Ｖ５タグであり、これらは必要に応じてコードされたＴＡＬＥＮの精製または検出のために利用することができる。これらのタグの使用は任意であり、当業者は、タグ付けされたＴＡＬＥＮタンパク質をコードするために、ＴＡＬＥＮをコードする配列は、タグをコードする配列とインフレームでクローニングされなければならないことを理解するであろう。

図１９に示すようなクローニングベクターの例示的な配列を、以下に提供する。当業者は、以下の配列は例示的な態様の説明であり、本開示を限定するものではないことを理解するであろう。

参考文献

本明細書において、例えば背景、要約、詳細な説明、例、および／または参考文献のセクションで言及された全ての刊行物、特許、特許出願、刊行物、およびデータベースエントリー（例えば、配列データベースエントリー）は、その全体が、個々の刊行物、特許、特許出願、刊行物、およびデータベースエントリーが具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれたかのようにして、本明細書に参照により組み込まれる。矛盾する場合、本明細書中の任意の定義を含む本出願が支配する。

均等物および範囲
当業者は、日常的な実験を超えるものを使用することなく、本明細書に記載の本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。本発明の範囲は上記の説明に限定されることを意図せず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されている通りである。

特許請求の範囲において、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、逆が示されるかまたは文脈から明らかでない限り、１または１より多くを意味することができる。群の１または２以上のメンバーの間に「または」を含む特許請求の範囲または記載は、逆が示されるかまたは文脈から明らかでない限り、群のメンバーの１つ、１つより多く、または全てが、所与の製品またはプロセスに存在するか、用いられるか、またはその他で関連している場合に、満たされていると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在するか、用いられるか、またはその他で関連している態様も包含する。本発明はまた、群のメンバーの１つより多く、または全てが、所与の製品またはプロセスに存在するか、用いられるか、またはその他で関連している態様も包含する。

さらに、本発明は、すべての変更、組み合わせ、および、１または２以上の特許請求の範囲からのまたは説明の関連する部分からの１または２以上の限定、要素、節、記述用語などが、別の特許請求の範囲に導入されるところの置換を、包含することが理解されるべきである。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項は、同じ基本請求項に従属する任意の他の請求項に見出される１または２以上の限定を含むように、修飾することができる。さらに、請求項が組成物を述べる場合、本明細書に開示される目的のいずれかのために組成物を使用する方法、および、本明細書に開示されるかまたは当該技術分野において知られている他の方法のいずれかによって組成物を作製する方法も、別の記載がない限り、または矛盾もしくは不一致生じるであろうことが当業者に明らかでない限り、含まれることが理解されるべきである。

要素がリストとして、例えばマーカッシュグループ形式で表される場合、要素の各サブグループも開示されており、任意の要素（単数または複数）がグループから削除され得ることを理解すべきである。また、用語「含む」は、オープンであることが意図され、追加の要素または工程の包含を許容することに留意されたい。一般に、本発明、または本発明の側面が、特定の要素、特徴、工程等を含むと言及される場合、本発明の特定の態様または本発明の側面は、かかる要素、特徴、工程等からなるか、または本質的にこれらからなることが、理解されるべきである。単純化のために、かかる態様は、本明細書においてこのような言葉で具体的に記載されていない。したがって、１または２以上の要素、特徴、工程等を含む本発明の各態様について、本発明はまた、これらの要素、特徴、工程等からなるか、本質的にこれらからなる態様も提供する。

範囲が与えられている場合、終点も含まれる。さらに、他に指示がない限り、または文脈および／または当業者の理解から別が明らかでない限り、範囲として表される値は、本発明の異なる態様において記載された範囲内の任意の特定の値を、文脈が明確に別を指示しない限り、範囲の下限の単位の１０分の１までの値でとることができることが理解されるべきである。また、他に指示がない限り、または文脈および／または当業者の理解から別が明らかでない限り、範囲で表された値は、所与の範囲内の任意の下位範囲をとることができ、ここで下位範囲の終点は、範囲の下限の単位の１０分の１までと同程度の精度で表される。

さらに、本発明の任意の特定の態様は、任意の１または２以上の特許請求の範囲から明示的に除外できることが理解されるべきである。範囲が与えられる場合、範囲内の任意の値を、任意の１または２以上の特許請求の範囲から明示的に除外してよい。本発明の組成物および／または方法の任意の態様、要素、特徴、用途、または側面は、任意の１または２以上の特許請求の範囲から除外することができる。簡潔にするため、１または２以上の要素、特徴、目的、または側面が除外される態様のすべてが、本明細書に明示的に記載されているわけではない。

表２．選択に使用したＴＡＬＥＮコンストラクトおよび濃度。ＣＣＲ５Ａ標的配列（Ａ）、ＡＴＭ標的配列（Ｂ）およびＣＣＲ５Ｂ標的配列（Ｃ）を標的とするＴＡＬＥＮを使用した各選択について、選択名、標的ＤＮＡ部位、ＴＡＬＥＮ Ｎ末端ドメイン、ＴＡＬＥＮ Ｃ末端ドメイン、ＴＡＬＥＮ ＦｏｋＩドメイン、およびＴＡＬＥＮ濃度（conc.）が示されている。

表３．ＴＡＬＥＮ消化により選択された配列の統計値。統計値は、ＣＣＲ５Ａ標的配列（Ａ）、ＡＴＭ標的配列（Ｂ）およびＣＣＲ５Ｂ標的配列（Ｃ）に対するそれぞれのＴＡＬＥＮ選択について示される。Seq.数：ハイスループットシーケンシングされコンピューターによりフィルタリングされた選択配列の総カウント数。平均mut.：選択された配列内の平均変異数。Stdev. mut.：選択された配列における変異の標準偏差。Mut./bp：標的部位長（ｂｐ）について正規化された平均変異数。Ｐ値vs.ライブラリー：ＴＡＬＥＮ選択配列分布の、対応する選択前ライブラリー配列分布（表５）に対するＰ値は、以前の報告のようにして決定した^５。Ｐ値vs.他のＴＡＬＥＮ：すべてのＴＡＬＥＮ消化間のすべてのペアワイズ比較を算出し、０．０１～０．５の間のＰ値を示す。３ｎＭのＱ７ ＡＴＭおよび２８－ａａ ＡＴＭ選択について、これらの選択が実施されたにも関わらず、解釈に充分な配列が得られなかったことに注意されたい。

表４．選択前ライブラリーからの配列の統計値。各選択前ライブラリーは、ＣＣＲ５Ａ標的配列、ＡＴＭ標的配列およびＣＣＲ５Ｂ標的配列の変異配列の分布を含む。Seq.数：ハイスループットシーケンシングされコンピューターによりフィルタリングされた選択配列の総カウント数。平均mut.：配列の平均変異数。Stdev. mut.：配列の標準偏差。Mut./bp：標的部位長（ｂｐ）について正規化した平均変異数。

表５．変異数の関数としての配列の濃縮値。ＣＣＲ５Ａ標的配列（Ａ）、ＡＴＭ標的配列（Ｂ）およびＣＣＲ５Ｂ標的配列（Ｃ）に対するそれぞれのＴＡＬＥＮ選択について、濃縮値は、ＴＡＬＥＮ消化からの選択後配列の部分的存在量（fractional abundance）を、選択前配列の部分的存在量で割り算し、半部位における総変異数（Mut.）の関数として算出した。

表６．ヒトゲノム中の予測オフターゲット部位。（Ａ）in vitroのＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮ選択の出力に対して訓練された機械学習「classifier」アルゴリズムを使用し、１０～３０塩基対のスペーサー長を可能にする、標的部位の６変異配列をスコア付けした。ＣＣＲ５Ａ ＴＡＬＥＮについてのベストスコアを有する得られた３６の予測オフターゲット部位を、classifierスコア、変異数、左および右半部位配列（オンターゲットからの変異を小文字で示す）、塩基対における半部位の間のスペーサー長、および、それが遺伝子内にある場合は予測されたオフターゲット部位が生じる遺伝子（イントロンを含む）と共に示す。（Ｂ）ＡＴＭ ＴＡＬＥＮについて、（Ａ）と同様。配列は配列番号４３～ＸＸに関連する。

表７．オンターゲットおよび予測オフターゲットゲノム部位においてＴＡＬＥＮにより誘導される細胞修飾。（Ａ）ＴＡＬＥＮなしで、または標準、Ｑ３もしくはＱ７ Ｃ末端ドメイン、ならびにＥＬ／ＫＫヘテロ二量体、ＥＬＤ／ＫＫＲヘテロ二量体、もしくはホモ二量体（Ｈｏｍｏ）ＦｏｋＩドメインのいずれかを含有するＴＡＬＥＮで処置したヒト細胞から単離されたゲノムＤＮＡから増幅された、ＣＣＲ５Ａオンターゲットおよび各予測されたゲノムオフターゲット部位のシーケンシングの結果。インデル：ＴＡＬＥＮ誘導性の切断と整合する、挿入または欠失を含む観測された配列の数。総数：配列カウントの総数。修飾：インデルの数を、配列の総数で割ったパーセンテージ。潜在的な修飾の上限値は、観測されたインデルなしの部位について１未満のインデルを仮定し、配列カウントの総数で割り算して修飾率の上限に到達するか、または検出の理論的限界値（１／１６，４００）のうち、より保守的な（大きい）値を取る。Ｐ値：各ＴＡＬＥＮ処置試料と未処置の対照試料との間で前に報告されたように５計算する。０．０５未満のＰ値が示される。特異性：各部位について、オンターゲットゲノム修飾頻度のオフターゲットゲノム修飾頻度に対する比率。（Ｂ）ＡＴＭ標的部位について、（Ａ）と同様。

表８．変異数の関数としての濃縮値の指数フィッティング。変異の関数としての選択後配列の濃縮値を、オンターゲット濃縮（定義により＝１．０）に対して正規化した。０～４個の変異を有する配列の正規化濃縮値を、指数関数ａ＊ｅｂにフィットさせ、ここでＲ２は、非線形最小二乗法を用いて報告された。

表９．変異数の関数としての濃縮値の指数フィッティングおよび外挿。変異数の関数としての、全９個のＣＣＲ５Ｂ選択からの全ての配列の濃縮値を、示した範囲内の最小変異数（定義により＝１．０）を有する配列の濃縮値に対して正規化した。指定された変異の範囲からの配列の正規化された濃縮値は、指数関数ａ＊ｅ^ｂにフィットさせ、ここでＲ^２は、非線形最小二乗法を用いて報告された。これらの指数関数的減少ｂを用いて、すべての平均濃縮値を５つの変異を超えて外挿した。

表１０．本研究で用いたオリゴヌクレオチド。（Ａ）全てのオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologiesから購入した。‘/5Phos/’は、５’リン酸化オリゴヌクレオチドを示す。％記号は、先行するヌクレオチドが、先行するヌクレオチドに対応する７９ｍｏｌ％のホスホロアミダイトおよびそれぞれ７ｍｏｌ％の他の３つの標準ホスホロアミダイトからなるホスホロアミダイトの混合物として組み込まれたことを示す。（^＊）は、オリゴヌクレオチドプライマーが、選択配列（ＣＣＲ５Ａ、ＡＴＭまたはＣＣＲ５Ｂのいずれか）に特異的であったことを示す。（^＊＊）は、オリゴヌクレオチドアダプターまたはプライマーが、異なる試料（選択条件または細胞のＴＡＬＥＮ処置）を区別するためのユニークな配列識別子を有していたことを示す。（Ｂ）ＴＡＬＥＮ消化アッセイに用いる個別のＤＮＡ基質を構築するために使用されるオリゴヌクレオチドの組み合わせ。（Ｃ）オンターゲットおよびオフターゲットゲノム部位のＰＣＲ増幅のためのプライマー対。＋ＤＭＳＯ：ＤＭＳＯをＰＣＲに使用した；ＮＤ：正しいＤＮＡ産物が、ＰＣＲ反応から検出されなかった。配列は、配列番号ＸＸ～ＸＸに関連する。

Claims (32)

1. 核酸分子中の標的配列を切断するin vitroでの方法であって、標的配列を含む核酸分子を、ＴＡＬＥＮが標的配列に結合して標的配列を切断するのに好適な条件下で、標的配列に結合するＴＡＬＥＮと接触させることを含み、任意に、標的配列が細胞中に存在し、
   ここで、ＴＡＬＥＮは、
   Ｃ末端ＴＡＬＥドメイン；Ｃ末端ＴＡＬＥドメインにコンジュゲートしているＴＡＬＥ反復アレイ；およびＴＡＬＥ反復アレイにコンジュゲートしているＮ末端ＴＡＬＥドメインを含み；
   （ｉ）Ｃ末端ＴＡＬＥドメインは、下記アミノ酸置換：Ｋ４８Ｑ、Ｒ５２Ｑ、およびＲ６１Ｑを含む点で、配列番号２２の標準Ｃ末端ドメインとは異なるアミノ酸配列を含み、ここで、標的核酸分子に対するＣ末端ドメインの結合エネルギーが、標準Ｃ末端ドメイン（配列番号２２）の結合エネルギーより少ない、ならびに／あるいは
   （ｉｉ）Ｎ末端ＴＡＬＥドメインは、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含み、ここで、標的核酸分子に対するＮ末端ドメインの結合エネルギーが、標準Ｎ末端ドメイン（配列番号１）の結合エネルギーより少ない、
   前記方法。
2. Ｃ末端ドメインの正味電荷が、＋６以下、＋５以下、＋４以下、＋３以下、＋２以下、＋１以下、０以下、－１以下、－２以下、－３以下、－４以下、または－５以下である、請求項１に記載の方法。
3. Ｎ末端ドメインが、標準Ｎ末端ドメイン配列の少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基が生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基で置き換えられている点で標準Ｎ末端ドメイン配列と異なっているアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
4. Ｃ末端ドメインが、標準Ｃ末端ドメイン配列の少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基が生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基で置き換えられている点で標準Ｃ末端ドメイン配列と異なっているアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. Ｃ末端ドメインにおいて、少なくとも１個の、少なくとも２個の、少なくとも３個の、少なくとも４個の、少なくとも５個の、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、少なくとも９個の、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、または少なくとも１５個のカチオン性アミノ酸が、生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基で置き換えられている、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. Ｃ末端ドメインが、配列番号２２において、１または２以上の次のアミノ酸置換：Ｋ３７Ｑ、Ｋ３８Ｑ、Ｒ４９Ｑ、およびＲ５３Ｑをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. Ｃ末端ドメインが、配列番号２２において、次の各アミノ酸置換：Ｋ３７Ｑ、Ｋ３８Ｑ、Ｋ４８Ｑ、Ｒ４９Ｑ、Ｒ５２Ｑ、Ｒ５３ＱおよびＲ６１Ｑを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. ＴＡＬＥＮが、ヌクレアーゼ切断ドメインを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. ヌクレアーゼ切断ドメインが、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインであり、任意に、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインが配列番号２６～３０で提供される配列を含む、請求項８に記載の方法。
10. ＴＡＬＥＮが単量体であり、任意に、ＴＡＬＥＮ単量体が、別のＴＡＬＥＮ単量体と二量体化してＴＡＬＥＮ二量体を形成することができ、任意に、ＴＡＬＥＮ二量体がヘテロ二量体であり、および任意に、ＴＡＬＥＮは、二量体化の際に標的配列を切断する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. ＴＡＬＥＮが、疾患または障害に関連することが知られている遺伝子内の標的配列に結合し、任意に、疾患がＨＩＶ／ＡＩＤＳまたは増殖性疾患である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. ＴＡＬＥＮが、ＣＣＲ５標的配列、ＡＴＭ標的配列、またはＶＥＧＦＡ標的配列に結合する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. Ｎ末端ドメインが、配列番号１の位置Ｋ５７、Ｋ７８、Ｒ８４、Ｒ９７、Ｋ１１０、Ｋ１１３およびＲ１１４に対応する位置における１または２以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. Ｃ末端ドメインが、配列番号２２の位置Ｒ８、Ｒ３０、およびＲ５７に対応する位置における１または２以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 下記に定義された通りのＣ末端ＴＡＬＥドメインおよび／またはＮ末端ＴＡＬＥドメインを含む操作されたＴＡＬＥＮを製造する方法であって、方法が、Ｎ末端ＴＡＬＥドメインおよび／またはＣ末端ＴＡＬＥドメインの少なくとも１つのアミノ酸を、生理的ｐＨで電荷を有さないかまたは負電荷を有するアミノ酸で置き換えること；したがって、減少した正味電荷のＮ末端ドメインおよび／またはＣ末端ドメインを有する、操作されたＴＡＬＥＮを生成すること、を含み、
    置き換えられるアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）であり、任意に、生理的ｐＨで電荷を有さないかまたは負電荷を有するアミノ酸が、グルタミン（Ｑ）またはグリシン（Ｇ）であり、
    ここで、ＴＡＬＥＮは、
    Ｃ末端ＴＡＬＥドメイン；Ｃ末端ＴＡＬＥドメインにコンジュゲートしているＴＡＬＥ反復アレイ；およびＴＡＬＥ反復アレイにコンジュゲートしているＮ末端ＴＡＬＥドメインを含み；
    （ｉ）Ｃ末端ＴＡＬＥドメインは、下記アミノ酸置換：Ｋ４８Ｑ、Ｒ５２Ｑ、およびＲ６１Ｑを含む点で、配列番号２２の標準Ｃ末端ドメインとは異なるアミノ酸配列を含み、ここで、標的核酸分子に対するＣ末端ドメインの結合エネルギーが、標準Ｃ末端ドメイン（配列番号２２）の結合エネルギーより少ない、ならびに／あるいは
    （ｉｉ）Ｎ末端ＴＡＬＥドメインは、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含み、ここで、標的核酸分子に対するＮ末端ドメインの結合エネルギーが、標準Ｎ末端ドメイン（配列番号１）の結合エネルギーより少ない、
    前記方法。
16. Ｎ末端ＴＡＬＥドメインおよび／またはＣ末端ＴＡＬＥドメインにおいて置き換えられる少なくとも１つのアミノ酸が、カチオン性アミノ酸を含み、
    任意に、少なくとも１つのアミノ酸を置き換えるアミノ酸が、アニオン性アミノ酸または中性のアミノ酸であり、および／または
    任意に、標準Ｃ末端ＴＡＬＥドメインの少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、または少なくとも１５個のアミノ酸を、生理的ｐＨで電荷を有さないかまたは負電荷を有するアミノ酸で置き換えることを含む、
    請求項１５に記載の方法。
17. Ｃ末端ドメインの正味電荷が、＋６以下、＋５以下、＋４以下、＋３以下、＋２以下、＋１以下、０以下、－１以下、－２以下、－３以下、－４以下、または－５以下である、請求項１５または１６に記載の方法。
18. Ｎ末端ドメインが、標準Ｎ末端ドメイン配列の少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基が生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基で置き換えられている点で標準Ｎ末端ドメイン配列と異なっているアミノ酸配列を含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. Ｃ末端ドメインが、標準Ｃ末端ドメイン配列の少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基が生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基で置き換えられている点で標準Ｃ末端ドメイン配列と異なっているアミノ酸配列を含む、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. Ｃ末端ドメインにおいて、少なくとも１個の、少なくとも２個の、少なくとも３個の、少なくとも４個の、少なくとも５個の、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、少なくとも９個の、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、または少なくとも１５個のカチオン性アミノ酸が、生理的ｐＨで電荷を示さないかまたは負電荷を示すアミノ酸残基で置き換えられている、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. Ｃ末端ドメインが、配列番号２２において、１または２以上の次のアミノ酸置換：Ｋ３７Ｑ、Ｋ３８Ｑ、Ｒ４９Ｑ、およびＲ５３Ｑをさらに含む、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. Ｃ末端ドメインが、配列番号２２において、次の各アミノ酸置換：Ｋ３７Ｑ、Ｋ３８Ｑ、Ｋ４８Ｑ、Ｒ４９Ｑ、Ｒ５２Ｑ、Ｒ５３ＱおよびＲ６１Ｑを含む、請求項１５～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. ＴＡＬＥＮが、ヌクレアーゼ切断ドメインを含む、請求項１５～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. ヌクレアーゼ切断ドメインが、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインであり、任意に、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインが配列番号２６～３０で提供される配列を含む、請求項２３に記載の方法。
25. ＴＡＬＥＮが単量体であり、任意に、ＴＡＬＥＮ単量体が、別のＴＡＬＥＮ単量体と二量体化してＴＡＬＥＮ二量体を形成することができ、任意に、ＴＡＬＥＮ二量体がヘテロ二量体であり、および任意に、ＴＡＬＥＮは、二量体化の際に標的配列を切断する、請求項１５～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. ＴＡＬＥＮが、疾患または障害に関連することが知られている遺伝子内の標的配列に結合し、任意に、疾患がＨＩＶ／ＡＩＤＳまたは増殖性疾患である、請求項１５～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. ＴＡＬＥＮが、ＣＣＲ５標的配列、ＡＴＭ標的配列、またはＶＥＧＦＡ標的配列に結合する、請求項１５～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. Ｎ末端ドメインが、配列番号１の位置Ｋ５７、Ｋ７８、Ｒ８４、Ｒ９７、Ｋ１１０、Ｋ１１３およびＲ１１４に対応する位置における１または２以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１５～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. Ｃ末端ドメインが、配列番号２２の位置Ｒ８、Ｒ３０、およびＲ５７に対応する位置における１または２以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１５～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. ヌクレアーゼ切断ドメイン；Ｃ末端ＴＡＬＥドメイン；Ｃ末端ＴＡＬＥドメインにコンジュゲートしているＴＡＬＥ反復アレイ；およびＴＡＬＥ反復アレイにコンジュゲートしているＮ末端ＴＡＬＥドメイン
    を含む、ＴＡＬＥＮであって、
    （ｉ）Ｎ末端ＴＡＬＥドメインは、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｋ１１０が、生理的ｐＨで、電荷を示さないか、または負電荷を示すアミノ酸残基で、置き換えられているアミノ酸配列を含み、ならびに任意に、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｋ５７、Ｋ７８、Ｒ８４、Ｒ９７、Ｋ１１３およびＲ１１４のうちの少なくとも１つが、生理的ｐＨで、電荷を示さないか、または負電荷を示すアミノ酸残基で、さらに置き換えられているアミノ酸配列を含む、ならびに／あるいは、
    （ｉｉ）Ｃ末端ＴＡＬＥドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列において、Ｋ４８、Ｒ５２、およびＲ６１が、生理的ｐＨで、電荷を示さないか、または負電荷を示すアミノ酸残基で、置き換えられているアミノ酸配列を含み、ならびに任意に、配列番号２２のアミノ酸配列において、Ｒ８、Ｒ３０、Ｋ３７、Ｋ３８、Ｒ４９、Ｒ５３およびＲ５７のうちの少なくとも１つが、生理的ｐＨで、電荷を示さないか、または負電荷を示すアミノ酸残基で、さらに置き換えられているアミノ酸配列を含む、
    ならびに、
    前記ＴＡＬＥＮは、標準Ｎ末端ドメイン（配列番号１）を含むＮ末端ＴＡＬＥドメインおよび標準Ｃ末端ドメイン（配列番号２２）を含むＣ末端ＴＡＬＥドメインを含むＴＡＬＥＮと比較して、増加したオンターゲット切断効率を有する、
    前記ＴＡＬＥＮ。
31. 請求項３０に記載のＴＡＬＥＮと、該ＴＡＬＥＮと共にヘテロ二量体を形成することができる異なるＴＡＬＥＮとを含む組成物であって、ここで該二量体がヌクレアーゼ活性を示す、前記組成物。
32. 請求項３０に記載のＴＡＬＥＮまたは請求項３１に記載の組成物、および薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物であって、任意に、ＴＡＬＥＮが疾患または障害と関連することが知られている遺伝子内の標的配列に結合し、および前記組成物が疾患または障害に関連する症状を軽減するあるいは疾患または障害を処置するための有効量のＴＡＬＥＮを含む、前記医薬組成物。

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