JP2021522825A - CRISPR/Cas9システムおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本出願は、2018年5月11日に出願された米国仮出願第62/670,135号の優先権を主張し、当該仮出願は本参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
1.細胞中の標的ポリヌクレオチドの改変のためのsgRNAであって、
(a)前記標的ポリヌクレオチドの領域に対応するガイド配列を含むガイドセグメントと、
(b)前記ガイド配列の3’に位置する第1のヘアピン形成セグメントであって、前記第1のヘアピン形成セグメントが、ステム部分およびループ部分を含むヘアピンを形成することができ、前記ステム部分が、RNAポリメラーゼIII終結シグナルに対応する配列を含まない、前記第1のヘアピン形成セグメントと
を含む、sgRNA。
2.前記ステム部分が4つより多くの連続するウラシルヌクレオチドを含まない、項目1に記載のsgRNA。
3.前記ステム部分が3つより多くの連続するウラシルヌクレオチドを含まない、項目1に記載のsgRNA。
4.前記ステム部分が第1のステム部分および第2のステム部分を含み、前記第1のステム部分が、RNAポリメラーゼIII終結シグナルに対応する配列を含まない、項目1に記載のsgRNA。
5.前記第1のステム部分が4つより多くの連続するウラシルヌクレオチドを含まない、項目4に記載のsgRNA。
6.前記第1のステム部分が3つより多くの連続するウラシルヌクレオチドを含まない、項目5に記載のsgRNA。
7.前記第1のステム部分および前記第2のステム部分が第1のバルジ部分により分離されている、項目4〜6のいずれか1項に記載のsgRNA。
8.前記ループ部分が3〜6のヌクレオチドの配列を含むまたはからなる、項目1〜8のいずれか1項に記載のsgRNA。
9.前記ループ部分が3〜5のヌクレオチドの配列を含むまたはからなる、項目8に記載のsgRNA。
10.前記ループ部分が4のヌクレオチドの配列を含むまたはからなる、項目9に記載のsgRNA。
11.前記ループ部分がヌクレオチド配列N1N2N3N4を含みまたはからなり、N1、N2、およびN3がそれぞれ独立してA、C、GまたはUであり、かつ、N4がCまたはGである、項目10に記載のsgRNA。
12.前記ループ部分がヌクレオチド配列N1N2N3N4を含みまたはからなり、N1、N3、およびN4がそれぞれ独立してA、C、GまたはUであり、かつ、N2がU、GまたはAである、項目10または11に記載のsgRNA。
13.N1がGである、項目11または12に記載のsgRNA。
14.N2がUである、項目11〜13のいずれか1項に記載のsgRNA。
15.N3がAである、項目11〜14のいずれか1項に記載のsgRNA。
16.N4がCである、項目11〜15のいずれか1項に記載のsgRNA。
17.前記ループ部分がヌクレオチド配列GUACを含むまたはからなる、項目10〜16のいずれか1項に記載のsgRNA。
18.前記第2のステム部分が4のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、項目4〜17のいずれか1項に記載のsgRNA。
19.前記第1のステム部分に対して遠位の、前記第2のステム部分の前記ハイブリッドの第4の対がG−C対である、項目18に記載のsgRNA。
20.前記第2のステム部分の前記ハイブリッドが、配列5’−CAGA−3’にハイブリダイズした配列5’−UCUG−3’を含むまたはからなる、項目18または19に記載のsgRNA。
21.前記第1のステム部分が少なくとも5のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、項目4〜20のいずれか1項に記載のsgRNA。
22.前記第1のステム部分が12以下のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、項目4〜21のいずれか1項に記載のsgRNA。
23.前記第1のステム部分が6〜10のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、項目21または22に記載のsgRNA。
24.前記第1のステム部分が7〜9のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、項目23に記載のsgRNA。
25.前記第1のステム部分が8のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、項目24に記載のsgRNA。
26.前記第1のステム部分がミスマッチを含まない、項目4〜25のいずれか1項に記載のsgRNA。
27.前記第1のステム部分の前記ハイブリッドが、配列5’−UACAAAGA−3’にハイブリダイズした配列5’−UCUUUGUA−3’を含むまたはからなる、項目4〜26のいずれか1項に記載のsgRNA。
28.前記第1のステム部分が単一のミスマッチを含む、項目4〜24のいずれか1項に記載のsgRNA。
29.前記第1のステム部分の前記ハイブリッドが、配列5’−UACAAAGAU−3’にハイブリダイズした配列5’−GUCUUUGUA−3’を含むまたはからなる、項目28に記載のsgRNA。
30.前記第1のヘアピン形成セグメントの3’に位置する1つまたはより多くの追加のヘアピン形成セグメントをさらに含む、項目1〜29のいずれか1項に記載のsgRNA。
31.前記第1のヘアピン形成セグメントと前記追加のヘアピン形成セグメントとの間、および/または前記追加のヘアピン形成セグメントの間に位置する1つまたはより多くのリンカーセグメントをさらに含む、項目30に記載のsgRNA。
33.項目32に記載の核酸を含む、ベクター。
34.CRISPRヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目33に記載のベクター。
35.前記CRISPRヌクレアーゼがCas9酵素である、項目34に記載のベクター。
36.前記CRISPRヌクレアーゼが非病原性細菌に由来する、項目34または35に記載のベクター。
37.前記CRISPRヌクレアーゼがストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)Cas9ヌクレアーゼである、項目34〜36のいずれか1項に記載のベクター。
38.前記CRISPRヌクレアーゼがII型Cas9ヌクレアーゼである、項目34〜37のいずれか1項に記載のベクター。
39.前記CRISPRヌクレアーゼがストレプトコッカス・サーモフィルスII−A型CRISPR1−Cas9(St1Cas9)である、項目34〜38のいずれか1項に記載のベクター。
40.前記CRISPRヌクレアーゼが1つまたはより多くの核局在シグナル(NLS)をさらに含み、かつ、前記ベクターが、前記1つまたはより多くのNLSをコードする1つまたはより多くのヌクレオチド配列をさらに含む、項目34〜39のいずれか1項に記載のベクター。
41.前記CRISPRヌクレアーゼがそのアミノ末端における第1のNLSおよびそのカルボキシ末端における第2のNLSを含み、かつ、前記ベクターが、前記CRISPRヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に隣接するNLSをコードするヌクレオチド配列を含む、項目40に記載のベクター。
42.前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、項目33に記載のベクター。
43.前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列および/または前記CRISPRヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結した1つもしくはより多くのプロモーターをさらに含む、項目34〜41のいずれか1項に記載のベクター。
44.前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列および/または前記CRISPRヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列の両方が単一のプロモーターに作動可能に連結している、項目43に記載のベクター。
45.前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列が第1のプロモーターに作動可能に連結しており、かつ、前記CRISPRヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が第2のプロモーターに作動可能に連結しており、前記第1のプロモーターおよび前記第2のプロモーターが同じまたは異なっていてもよい、項目43に記載のベクター。
46.(i)前記第1のプロモーターおよび前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに(ii)前記第2のプロモーターおよび前記CRISPRヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ベクター内で同じ方向にある、項目45に記載のベクター。
47.(i)前記第1のプロモーターおよび前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに(ii)前記第2のプロモーターおよび前記CRISPRヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ベクター内で反対の方向にある、項目45に記載のベクター。
48.前記ベクターがウイルスベクターである、項目33〜47のいずれか1項に記載のベクター。
49.前記ベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、項目48に記載のベクター。
50.項目32に記載の核酸または項目33〜49のいずれか1項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
52.薬学的に許容される担体をさらに含む、項目51に記載の組成物。
53.項目1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、項目32に記載の核酸、項目33〜49のいずれか1項に記載のベクター、項目50に記載の宿主細胞、および/または請求項51もしくは52に記載の組成物を含む、システム。
54.項目33に記載のベクターおよびCRISPRヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなるベクターを含む、システム。
55.前記CRISPRヌクレアーゼが、項目35〜41のいずれか1項において定義されるものである、項目54に記載のシステム。
56.項目33に記載のベクターが、前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含み、かつ、さらなるベクターが、前記CRISPRヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、項目54または55に記載のシステム。
57.細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法であって、前記細胞を、項目1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、項目32に記載の核酸、項目33〜49のいずれか1項に記載のベクター、項目51もしくは52に記載の組成物および/または項目53〜56のいずれか1項に記載のシステムと接触させることを含む、方法。
58.in vitroの方法である、項目57に記載の方法。
59.in vivoの方法であり、かつ、前記細胞が対象中にある、項目57に記載の方法。
60.細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための、項目1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、項目32に記載の核酸、項目33〜49のいずれか1項に記載のベクター、項目51もしくは52に記載の組成物および/または項目53〜56のいずれか1項に記載のシステムの使用。
61.細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための医薬の調製のための、項目1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、項目32に記載の核酸、項目33〜49のいずれか1項に記載のベクター、項目51もしくは52に記載の組成物および/または項目53〜56のいずれか1項に記載のシステムの使用。
62.細胞中の標的ポリヌクレオチドの改変において使用するための、項目1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、項目32に記載の核酸、項目33〜49のいずれか1項に記載のベクター、項目51もしくは52に記載の組成物および/または項目53〜56のいずれか1項に記載のシステム。
63.それを必要とする対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療する方法であって、前記対象に有効量の項目1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、項目32に記載の核酸、項目33〜49のいずれか1項に記載のベクター、項目51もしくは52に記載の組成物および/または項目53〜56のいずれか1項に記載のシステムを投与することを含む、方法。
64.前記病態が代謝性の病態である、項目63に記載の方法。
65.前記病態が肝臓の病態である、項目63または64に記載の方法。
66.対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療するための、項目1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、項目32に記載の核酸、項目33〜49のいずれか1項に記載のベクター、項目51もしくは52に記載の組成物および/または項目53〜56のいずれか1項に記載のシステムの使用。
67.対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療するための医薬の調製のための、項目1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、項目32に記載の核酸、項目33〜49のいずれか1項に記載のベクター、項目51もしくは52に記載の組成物および/または項目53〜56のいずれか1項に記載のシステムの使用。
68.前記病態が代謝性の病態である、項目66または67に記載の使用。
69.前記病態が肝臓の病態である、項目66〜68のいずれか1項に記載の使用。
70.対象における標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態の予防または治療において使用するための、項目1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、項目32に記載の核酸、項目33〜49のいずれか1項に記載のベクター、項目51もしくは52に記載の組成物および/または項目53〜56のいずれか1項に記載のシステム。
71.前記病態が代謝性の病態である、項目70に記載の使用のためのsgRNA、核酸、ベクター、組成物および/またはシステム。
72.前記病態が肝臓の病態である、項目70または71に記載の使用のためのsgRNA、核酸、ベクター、組成物および/またはシステム。
73.医薬として使用するための、項目1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、項目32に記載の核酸、項目33〜49のいずれか1項に記載のベクター、項目50に記載の宿主細胞、項目51もしくは52に記載の組成物および/または項目53〜56のいずれか1項に記載のシステム。
75.前記第1および第2のドメインが非病原性細菌に由来する、項目74に記載の単離されたポリペプチド。
76.前記第1および第2のドメインが異なる細菌種に由来する、項目74または75に記載の単離されたポリペプチド。
77.前記第1および第2のドメインが同じ細菌種の異なる株に由来する、項目74または75に記載の単離されたポリペプチド。
78.前記第1および第2のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスの異なる株に由来する、項目77に記載の単離されたポリペプチド。
79.前記CRISPRヌクレアーゼがII型Cas9ヌクレアーゼである、項目74〜78のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
80.前記CRISPRヌクレアーゼがストレプトコッカス・サーモフィルスII−A型CRISPR1−Cas9(St1Cas9)である、項目74〜79のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
81.1つまたはより多くの核局在シグナル(NLS)をさらに含む、項目74〜80のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
82.前記第1のドメインのN末側にある第1のNLSおよび前記第2のドメインのC末側にある第2のNLSを含む、項目81に記載の単離されたポリペプチド。
83.シチジンデアミナーゼドメインまたはアデノシンデアミナーゼドメインをさらに含む、項目74〜82のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
84.シチジンデアミナーゼドメインを含む、項目83に記載の単離されたポリペプチド。
85.前記シチジンデアミナーゼがAPOBECシチジンデアミナーゼである、項目84に記載の単離されたポリペプチド。
86.前記シチジンデアミナーゼドメインが、配列番号50のアミノ酸配列、またはその機能的断片、またはその機能的バリアントを含む、項目84に記載の単離されたポリペプチド。
87.ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤(UGI)ドメインをさらに含む、項目84または85に記載の単離されたポリペプチド。
88.前記UGIドメインが、配列番号51のアミノ酸配列、またはその機能的断片、またはその機能的バリアントを含む、項目87に記載の単離されたポリペプチド。
89.前記第1のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9、LMG18311、CNRZ1066またはTH1477に由来する、項目74〜88のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
90.前記第2のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9、LMG18311、CNRZ1066またはTH1477に由来する、項目74〜89のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
91.前記第1のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9に由来し、かつ、前記第2のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMG18311、CNRZ1066またはTH1477に由来する、項目74〜90のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
92.前記第1のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスLMG18311に由来し、かつ、前記第2のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9、CNRZ1066またはTH1477に由来する、項目74〜90のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
93.前記第1のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスCNRZ1066に由来し、かつ、前記第2のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMG18311、LMD−9またはTH1477に由来する、項目74〜90のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
94.前記第1のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスTH1477に由来し、かつ、前記第2のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMG18311、CNRZ1066またはLMD−9に由来する、項目74〜90のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
95.前記第1のドメインが、配列番号264、265、266、もしくは267のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、項目74〜88のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
96.前記第2のドメインが、配列番号260、261、262、もしくは263のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、項目74〜88のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
97.前記第1のドメインが、配列番号264のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含み、かつ、前記第2のドメインが、配列番号261、262、もしくは263のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、項目74〜88、95および96のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
98.前記第1のドメインが、配列番号265のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含み、かつ、前記第2のドメインが、配列番号260、262、もしくは263のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、項目74〜88、95および96のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
99.前記第1のドメインが、配列番号266のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含み、かつ、前記第2のドメインが、配列番号260、261、もしくは263のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、項目74〜88、95および96のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
100.前記第1のドメインが、配列番号267のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含み、かつ、前記第2のドメインが、配列番号260、261、もしくは262のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、項目74〜88、95および96のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
101.前記第1のドメインが、リンカー領域を介して前記第2のドメインに接続されている、項目74〜100のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
102.前記ポリペプチドが、前記第1のドメインが由来するCRISPRヌクレアーゼが結合するPAMとは異なるPAMに結合することができる、項目74〜101のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
103.前記ポリペプチドが、配列NNAGAA、NNGGAA、NNACAA、NNGCAA、NNGAAAまたはNNAAAAを含むPAMに結合する、項目74〜102のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
105.項目104に記載の核酸を含む、ベクター。
106.sgRNAをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目105に記載のベクター。
107.前記sgRNAが、項目1〜31のいずれか1項に記載のsgRNAである、項目106に記載のベクター。
108.前記ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列および/または前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結した1つまたはより多くのプロモーターをさらに含む、項目105〜107のいずれか1項に記載のベクター。
109.前記ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列および前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列の両方が単一のプロモーターに作動可能に連結している、項目108に記載のベクター。
110.前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列が第1のプロモーターに作動可能に連結しており、かつ、前記ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が第2のプロモーターに作動可能に連結しており、前記第1のプロモーターおよび前記第2のプロモーターが同じまたは異なっていてもよい、項目108に記載のベクター。
111.(i)前記第1のプロモーターおよび前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに(ii)前記第2のプロモーターおよび前記CRISPRヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ベクター内で同じ方向にある、項目110に記載のベクター。
112.(i)前記第1のプロモーターおよび前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに(ii)前記第2のプロモーターおよび前記CRISPRヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ベクター内で反対の方向にある、項目110に記載のベクター。
113.前記ベクターがウイルスベクターである、項目105〜112のいずれか1項に記載のベクター。
114.前記ベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、項目113に記載のベクター。
115.項目104に記載の核酸または項目105〜113のいずれか1項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
116.項目74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、項目104に記載の核酸、項目105〜112のいずれか1項に記載のベクター、または項目115に記載の宿主細胞を含む、組成物。
117.薬学的または生物学的に許容される担体をさらに含む、項目116に記載の組成物。
119.項目105に記載のベクターおよびsgRNAをコードするヌクレオチド配列を含むさらなるベクターを含む、システム。
120.細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法であって、前記細胞を、項目74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、項目104に記載の核酸、項目105〜112のいずれか1項に記載のベクター、項目115に記載の宿主細胞、および/または項目116もしくは117に記載の組成物、および/または項目118もしくは119に記載のシステムと接触させることを含む、方法。
121.in vitroの方法である、項目120に記載の方法。
122.in vivoの方法であり、かつ、前記細胞が対象中にある、項目120に記載の方法。
123.細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための、項目74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、項目104に記載の核酸、項目105〜112のいずれか1項に記載のベクター、項目115に記載の宿主細胞、および/または項目116もしくは117に記載の組成物、および/または項目118もしくは119に記載のシステムの使用。
124.細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための医薬の調製のための、項目74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、項目104に記載の核酸、項目105〜112のいずれか1項に記載のベクター、項目115に記載の宿主細胞、および/または項目116もしくは117に記載の組成物、および/または項目118もしくは119に記載のシステムの使用。
125.細胞中の標的ポリヌクレオチドの改変において使用するための、項目74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、項目104に記載の核酸、項目105〜112のいずれか1項に記載のベクター、項目115に記載の宿主細胞、および/または項目116もしくは117に記載の組成物、および/または項目118もしくは119に記載のシステム。
126.それを必要とする対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療する方法であって、前記対象に有効量の項目74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、項目104に記載の核酸、項目105〜112のいずれか1項に記載のベクター、項目115に記載の宿主細胞、および/または項目116もしくは117に記載の組成物、および/または項目118もしくは119に記載のシステムを投与することを含む、方法。
127.前記病態が代謝性の病態である、項目126に記載の方法。
128.前記病態が肝臓の病態である、項目126または127に記載の方法。
129.対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療するための、項目74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、項目104に記載の核酸、項目105〜112のいずれか1項に記載のベクター、項目115に記載の宿主細胞、および/または項目116もしくは117に記載の組成物、および/または項目118もしくは119に記載のシステムの使用。
130.対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療するための医薬の調製のための、項目74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、項目104に記載の核酸、項目105〜112のいずれか1項に記載のベクター、項目115に記載の宿主細胞、および/または項目116もしくは117に記載の組成物、および/または項目118もしくは119に記載のシステムの使用。
131.前記病態が代謝性の病態である、項目129または130に記載の使用。
132.前記病態が肝臓の病態である、項目129〜131のいずれか1項に記載の使用。
133.対象における標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態の予防または治療において使用するための、項目74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、項目104に記載の核酸、項目105〜112のいずれか1項に記載のベクター、項目115に記載の宿主細胞、および/または項目116もしくは117に記載の組成物、および/または項目118もしくは119に記載のシステム。
134.前記病態が代謝性の病態である、項目133に記載の使用のためのsgRNA、核酸、ベクター、組成物および/またはシステム。
135.前記病態が肝臓の病態である、項目133または134に記載の使用のためのsgRNA、核酸、ベクター、組成物および/またはシステム。
136.医薬として使用するための、項目74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、項目104に記載の核酸、項目105〜112のいずれか1項に記載のベクター、項目115に記載の宿主細胞、および/または項目116もしくは117に記載の組成物、および/または項目118もしくは119に記載のシステム。
CRISPR−Cas9システムを使用する遺伝子改変のための試薬および方法が本明細書に記載される。例えば、in vitroおよびin vivoの両方におけるCRISPRベースの遺伝子改変が本明細書に示される。
(a)標的ポリヌクレオチドの領域に対応するガイド配列を含むガイドセグメントと、
(b)ガイド配列の3’に位置する第1のヘアピン形成セグメントであって、第1のヘアピン形成セグメントが、ステム部分およびループ部分を含むヘアピンを形成することができ、ステム部分が、RNAポリメラーゼIII終結シグナルに対応する配列を含まない、第1のヘアピン形成セグメントと
を含む、sgRNAが本明細書に記載される。RNAポリメラーゼIIIは、典型的には5〜6のヌクレオチドの長さの、ポリ(T)ストレッチを末端に持つ。標的上のポリ(T)ストレッチはsgRNA中のポリ(U)に対応する。そのため一実施形態では、ステム部分は4つより多くの連続するウラシルヌクレオチド(U)を含まず、さらなる実施形態では、ステム部分は3つより多くの連続するUを含まない。
・ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9からのgRNA結合およびヌクレアーゼドメインならびにストレプトコッカス・サーモフィルスLMG18311、CNRZ1066またはTH1477に由来するPAM相互作用ドメイン
・ストレプトコッカス・サーモフィルスLMG18311からのgRNA結合およびヌクレアーゼドメインならびにストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9、CNRZ1066またはTH1477に由来するPAM相互作用ドメイン
・ストレプトコッカス・サーモフィルスCNRZ1066からのgRNA結合およびヌクレアーゼドメインならびにストレプトコッカス・サーモフィルスLMG18311、LMD−9またはTH1477に由来するPAM相互作用ドメイン
・ストレプトコッカス・サーモフィルスTH1477からのgRNA結合およびヌクレアーゼドメインならびにストレプトコッカス・サーモフィルスLMG18311、CNRZ1066またはLMD−9に由来するPAM相互作用ドメイン
を含んでもよい。
本出願における用語の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義を提供する。
「相同性」および「相同」は、2つのペプチドまたは2つの核酸分子の間の配列類似性を指す。相同性は、アライメントされる配列中の各位置を比較することにより決定され得る。核酸間またはアミノ酸配列間の相同性の程度は、配列により共有される位置における同一のまたはマッチするヌクレオチドまたはアミノ酸の数の関数である。当該用語が本明細書において使用される場合、2つの配列が実質的に同一であり、かつ、配列の機能的活性が保存されている場合に、核酸配列は別の配列と「実質的に相同」である(本明細書において使用される場合、「相同」という用語は、進化的関連性を暗示せず、むしろ実質的な配列同一性を指し、そのため「同一性」/「同一」という用語と交換可能である)。2つの核酸配列は、最適にアライメント(ギャップが許容される)された場合に、少なくとも約50%の配列類似性もしくは同一性を共有する場合に、または、配列が、定義される機能的なモチーフを共有する場合に、実質的に同一であると考えられる。代替的な実施形態では、最適にアライメントされた実質的に同一の配列における配列類似性は、少なくとも60%、70%、75%、80%、85%、90%または95%であってもよい。簡潔性のために、単位(例えば、66、67・・・81、82、・・・91、92%・・・)は体系的に記載されていないが、それにもかかわらず、本開示の範囲内であると考えられる。
CRISPR技術は、例えば、核酸配列の改変のための、ゲノム編集用のシステムであり、特定の遺伝子の発現を改変する例のためにも使用されることがある。
特定の部位においてDNAを切断するために、CRISPRヌクレアーゼは、sgRNAおよび標的化された遺伝子上のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の存在を必要とする。PAMは、標的化されたポリヌクレオチド遺伝子配列中のsgRNA標的配列に直ちに後続する(すなわち、隣接する)。PAMは、(使用されるCRISPRヌクレアーゼに依存して)sgRNA標的配列の3’末端または5’末端に位置するが、sgRNAガイド配列に含まれない。例えば、Cas9 CRISPRヌクレアーゼのためのPAMは、標的遺伝子上のsgRNA標的配列の3’末端に位置し、Cpf1ヌクレアーゼのためのPAMは、標的遺伝子上のsgRNA標的配列の5’末端に位置する。異なるCRISPRヌクレアーゼはまた、異なるPAMを必要とする。したがって、特定のポリヌクレオチドのsgRNA標的配列の選択は、概しては、使用されるCRISPRヌクレアーゼに基づく。ストレプトコッカス・ピオゲネスCas9 CRISPRシステムのためのPAMは5’−NRG−3’(RはAまたはGのいずれかである)であり、ヒト細胞においてこのシステムの特異性を特徴付ける。S.アウレウス(S. aureus)Cas9のPAMはNNGRRである。S.ピオゲネス(S. pyogenes)II型システムは天然に「NGG」配列(「N」は任意のヌクレオチドであり得る)の使用を好むが、操作されたシステムにおいて「NAG」などの他のPAM配列も許容する。同様に、ナイセリア・メニンギチジスに由来するCas9(NmCas9)は、通常、NNNNGATTの天然のPAMを有するが、高度に縮重したNNNNGNNN PAMを含む様々なPAMにわたり活性を有する。AsCpf1またはLbCpf1 CRISPRヌクレアーゼのためのPAMはTTTNである。一実施形態では、本開示にしたがって使用されるCas9タンパク質のためのPAMはNGGトリヌクレオチド配列(Cas9)である。別の実施形態では、本開示にしたがって使用されるCpf1 CRISPRヌクレアーゼのためのPAMはTTTNヌクレオチド配列である。好ましい実施形態では、St1Cas9が使用されてもよく、これはPAM配列NNAGAAおよびNNGGAAに対応する。実施形態では、異なるSt1Cas9 PAM配列が使用されてもよく、例えば、株CNRZ1066およびLMG13811からのSt1Cas9のための推測されるコンセンサスPAM配列はそれぞれNNACAA(W)およびNNGCAA(A)である(文献24、26)。以下の表1は、各々のPAM配列と共にCRISPR/ヌクレアーゼシステムの非限定的な例のリストを提供する。
ヒト細胞において高い効率で伸長した配列を認識して内因性遺伝子を編集できる組換えdCas9−FoKI二量体ヌクレアーゼ(RFN)が設計された。これらのヌクレアーゼは、酵素活性がないCas9(dCas9)タンパク質に融合した二量体化依存性の野生型FokIヌクレアーゼドメインを含む。融合タンパク質の二量体は、2つの半部位(それぞれは、dCas9(すなわち、ヌクレアーゼ活性を欠いたCas9ヌクレアーゼ)単量体ドメインに結合している)とそれらの間のスペーサー配列とから構成されて標的部位に結合した場合に配列特異的なDNA切断を媒介する。dCas9−FoKI二量体ヌクレアーゼは、効率的なゲノム編集活性のために二量体化を必要とするため、DNAに切断を導入するために2つのsgRNAを使用する。
CRISPRヌクレアーゼタンパク質は、通常は細菌中で発現されるタンパク質である(またはそれに由来する)ので、CRISPRヌクレアーゼ組換えタンパク質を設計および調製する場合に真核細胞(例えば、哺乳動物細胞)中での最適な発現のために核酸配列を改変することが有利であり得る。同様に、標的ポリヌクレオチド中に特定の改変を導入するために使用される本開示のドナーまたはパッチ核酸は、(例えば、標的化された改変のより容易な検出を可能とするために新たな制限部位を導入するために)コドン縮重を使用してもよい。
以下の非限定的な例示により本開示をさらに詳細に説明する。
細胞培養およびトランスフェクション
K562をATCC(CCL−243)から得、10%のFBS、ペニシリン−ストレプトマイシンおよびGlutaMAX(商標)を添加したRPMI培地中で5%のCO2下37℃で維持した。Neuro−2aをATCCから得、10%のFBS、ペニシリン−ストレプトマイシンおよびGlutaMAX(商標)を添加したDMEM培地中で5%のCO2下37℃で維持した。全ての細胞株をマイコプラズマ夾雑物の非存在について試験する。製造者の推奨にしたがってAmaxa 4D−Nucleofector(Lonza)を使用して細胞(2×105/トランスフェクション)にトランスフェクトを行った。AAVS1セーフハーバー遺伝子座からSaCas9およびSt1Cas9を発現するK562細胞株を記載されたように生成した(文献35、36)。簡潔に述べれば、トランスフェクションの3日後に開始する0.5μg/mlのピューロマイシンを添加したメチルセルロースベースの半固体RPMI培地中での10日間の同時の選択およびクローニングを行った。クローンを選び取り、96ウェル中で3日間拡大増殖し、さらなる3日間のために12ウェルプレートに移した後に細胞をウエスタンブロットのために回収した。
この研究において生成したCRISPR1−StCas9 LMD−9システムを用いるin vitroおよびin vivoゲノム編集用のベクターはAddgeneから入手可能である(図11)。CRISPOR(文献39)ウェブツールを使用して、マウスおよびヒト標的に対するガイド(スペーサー)配列を設計した(表3〜6)。必要な場合、ヒトU6プロモーターの転写開始要件に起因して「G」をコードするようにスペーサー用のDNA配列を位置1において改変した。代替的に、天然に存在する「G」を捕捉するようにスペーサーの長さを増加させた。NおよびC末端においてSV40 NLS配列に融合したS.サーモフィルスCRISPR1(St1Cas9 LMD−9)用の哺乳動物発現ベクター(MSP1594_2x_NLS;Addgeneプラスミド#110625)をMSP1594(文献34)(Addgeneプラスミド#65775)から構築した。S.サーモフィルスCRISPR1(St1Cas9 LMD−9)(v1)(St1Cas9_LMD−9_sgRNA_pUC19;Addgeneプラスミド#110627)およびSaCas9(文献7)用のU6駆動性sgRNA発現プラスミドをgBlocks(商標)遺伝子断片(Integrated DNA Technologies)として合成し、pUC19にクローニングした。BPK2301(文献34)(v0)(Addgeneプラスミド#65778)を使用してSt1Cas9 sgRNA構造を比較した。CAGプロモーター駆動性St1Cas9 LMD−9およびそのU6駆動性sgRNAを含有する単一ベクター哺乳動物発現系(U6_sgRNA_CAG_hSt1Cas9_LMD9;Addgeneプラスミド#110626)を上記のプラスミドから構築した。肝臓特異的プロモーターを含有する単一ベクターrAAV−St1Cas9 LMD−9システム(表8)を上記の成分から、BsmBI制限部位を除去するために骨格内に欠失を含有するpX602(文献7)の誘導体(Addgeneプラスミド#61593)にアセンブルさせた。以前に記載(文献53、54)されたAAV発現カセットからのエレメントを組み合わせることによりLP1bプロモーターを操作した。このベクター(v3)のほとんどの活性版は構造pAAV_LP1B_St1Cas9_LMD−9_SpA_U6_sgRNA(Addgeneプラスミド#110624)を有する。hPGK1プロモーターの制御下でC末端タグ化SaCas9およびSt1Cas9を構成的に発現するクローン性K562細胞株を確立するために、pX602からのCas9 ORFおよびMSP1594_2x_NLSをAAVS1_Puro_PGK1_3xFLAG_Twin_Strep(文献36)(Addgeneプラスミド#68375)にサブクローニングした。
製造者の推奨にしたがって250mlのQuickExtract(商標) DNA extraction solution(Epicentre)を用いて2.5E5の細胞からゲノムDNAを抽出した。表9に記載のプライマーを使用してPCRにより様々な遺伝子座を増幅した。記載(文献35、37)されたようにSurveyor(商標) mutation detection kit(Transgenomics)を用いてアッセイを行った。TBE緩衝液中10%のPAGEゲル上で試料を分離した。ChemiDoc(商標) MP(Bio−Rad)システムを使用してゲルをイメージングし、Image Lab(商標)ソフトウェア(Bio−Rad)を使用して定量化を行った。p<0.001の分解用の有意カットオフ値を使用してTIDE分析を行った(文献38)。
本質的に記載(文献81)されたようなトリプルプラスミドトランスフェクションにより組換えアデノ随伴ウイルスベクターの製造を行った。簡潔に述べれば、ポリエチレンイミン(PEI、Polysciences)を使用してHEK293T17細胞にヘルパープラスミドpxx−680、rep/capハイブリッドプラスミドpAAV2/8およびrAAVベクタープラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、培地をFBSを含まない増殖培地で置き換え、24時間後に細胞を回収した。凍結/解凍サイクルにより細胞抽出物からAAV粒子を抽出し、不連続のイオジキサノール勾配で精製した。ウイルスをPBS中の320mMのNaCl+10%のソルビトール+0.002%のプルロニック酸に再懸濁し、アリコート化し、−80℃で貯蔵した。記載(文献82)されたようにSYBR(商標) greenおよびITRプライマーを使用してqPCR(Roche)によりAAVを滴定した。トリス−グリシン−SDS緩衝液中10%のSDS−PAGE stain free gel(Biorad)上で類似した体積のAAVを分離することにより物理的力価および純度を確認した。AAVプラスミドのBssHII消化後にITR完全性を評価した。CERVO brain research center(Universite Laval)のvector core facilityによりrAAV8を製造した。
C57BL/6遺伝的背景のFah−/−マウス(文献83)を集団飼育し、食物および水への自由なアクセスと共に標準的な食餌(Harlan #2018SX)を与えた。Fah−/−マウスの飲用水に7.5mg(2−(2−ニトロ−4−トリフルオロメチルベンゾイル)−1,3−シクロヘキサンジオン)(NTBC)/Lを添加し、pHを7.0に調整した。マウスを12:12hの暗−明サイクルに曝露し、23±1℃の周囲温度下に保った。動物の世話および取扱いは、Canadian Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsにしたがって行った。The Universite Laval Animal Care and Use Committeeにより手順は承認された。
NTBC除去の15日後に代謝ケージ(Tecniplast)中で3〜4匹のマウスの群から尿を終夜収集した。尿を2000rpmで5分間遠心分離し、アリコート化し、−80oCで凍結させた。以前に記載(文献85)されたようにガスクロマトグラフィー−質量分析(GC−MS)を使用して高感度法により尿試料中のスクシニルアセトンを定量化した。Centre Hospitalier universitaire de Sherbrookeのbiochemical genetics laboratoryにより分析を行った。
S.サーモフィルスは2つまでのII−A型システム(CRISPR1およびCRISPR3)をコードする。S.サーモフィルスに感染したファージから単離されたSt1Cas9と多様なAcrファミリーとの相互作用を特徴付けている間に(文献32)、ヒト細胞において達成された実質的なレベルの編集に我々は驚いた。この観察は、このオルソログは軽度に活性であることを指し示した初期の報告(文献7、33)と対照的である。
CRISPOR(文献39)を使用して、破壊された場合に肝臓機能に影響する3つの遺伝子であるPck1、Pcsk9、およびHpdに対するsgRNAを設計した。可能な場合、必須のタンパク質ドメインを標的化しかつ潜在的なオフターゲットをほとんど有しないことが予測されるガイドを選択した。St1Cas9およびそのsgRNAの両方を発現する単一のベクター構築物の一過性トランスフェクションは、15の標的部位のうちの14において強い切断活性(18%〜>50%のインデル)を明らかにし、sgRNA設計則(文献33)に依拠しないにもかかわらずシステムのロバスト性を強調した(図2a〜c)。注記として、このスクリーニングは、ヒトHPD中に見出される突然変異の近傍において標的化する高度に活性のsgRNAを同定した(文献40、41)。チロシン異化経路における第2の酵素である4−ヒドロキシフェニル−ピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPD)の欠損はチロシン血症III型を引き起こす(Orphanet ORPHA:69723)(図3a)。この希少な疾患(頻度<1/1,000,000)を引き起こす3つのミスセンス突然変異のみが公知であり、高い有効性でそれらの2つを標的化することができた(OMIM 276710)(図3cおよび図6)。第3の突然変異の標的化は、ガイドの低い特異性スコアに起因して試みなかった。以上を合わせると、これらのデータは、St1Cas9は、そのsgRNAおよびその発現を駆動するために必要とされる調節エレメントと一緒に単一のrAAV粒子にパッケージングできた場合にin vivoゲノム編集を可能とする可能性を示唆する。
ホロSt1Cas9(St1Cas9+sgRNA)を肝臓に送達するために、元々のSaCas9ベクター構造(文献7)をミラーリングすることによりHpdエクソン13を標的化する肝臓トロピックrAAV血清型8(文献11、16〜18)ベクター(別名AAV8−St1Cas9 Hpd G5)を生成した(図3c)。in vivoでのSt1Cas9の切断活性を試験するために、生後2日目のマウスの後眼窩洞に増加性の量のベクターを注射し、注射後28日目に全肝臓DNAを単離した(図3b)。滴定は、編集の程度は実質的なものであり、AAV8−St1Cas9の用量に依存することを示した(図3d)。
St1Cas9の使用についての1つの制約は、標的化を制限し得るより長いPAMの形態N1N2A3G4A5A6W7(WはAまたはT)の必要性である。このコンセンサスは最初に、バクテリオファージゲノム内のCRISPR−Cas9標的部位に隣接する配列を調べることにより得られた。しかしながら、コンセンサスに密接に関連する配列(NNAGAAWおよびNNGGAAW)は、試験管中でまたは大腸菌に移植された場合に機能的であり得る。これらの差異は、異種システムにより付与される異なるストリンジェンシーから生じると考えられる。それにもかかわらず、コンセンサスからのこれらの逸脱は、PAM認識においてある程度の柔軟性があることを示唆する。そのため、適切な文脈、我々の場合にはヒトおよびマウス細胞において各Cas9のために機能的なPAMを定義することが極めて重要である。
新規のPAM要件を有する追加のSt1Cas9タンパク質を同定する試みにおいて、「Search for PAMs by ALignment Of Targets」(SPAMALOT)と呼ばれる最近報告されたバイオインフォマティクスパイプラインを使用した(文献86)。この方法は、NNGAAA PAMを潜在的に標的化する株TH1477により表される追加のSt1Cas9を同定した(図20a)。CNRZ1066およびLMG1831について我々が行ったようにLMD−9のN末端およびTH1477のC末端ドメインを有するキメラ融合タンパク質を生成した。このアプローチは、NNGAAA PAMを標的化できるTH1477株に由来する活性のSt1Cas9をもたらした(図20b)。
DNA塩基エディターは、触媒障害性Casヌクレアーゼと一本鎖DNA(ssDNA)上で作動する塩基修飾酵素との融合物を含む(文献80)。シトシン塩基エディター(CBE)は、APOBEC1シチジンデアミナーゼを使用してC・G塩基対をT・Aに変換する。ストレプトコッカス・ピオゲネスD10A突然変異体(ニッカーゼ)および2コピーのウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤(UGI)へのAPOBEC1の融合物は、BE4max酵素の作製を結果としてもたらした。SaBE4を作製するためにスタフィロコッカス・アウレウスCas9もまた塩基エディターに変換された。SpCas9 D10AをSt1Cas9 D9A(LMD−9)と交換して元々のBE4max構築物に入れることによりSt1BE4maxを作製した。これは、St1Cas9の特有のPAMに起因して新規の標的化特異性を有する強力なCBEを作製した(図21)。我々のデータは、St1BE4maxはSaBE4と類似した活性ウィンドウを有することを指し示す。塩基エディターの活性ウィンドウ(別名、編集ウィンドウ)は狭いので、PAM配列の広い範囲に標的化可能な塩基エディターを作製するという確固とした利点がある。TCR>TCY>VCNのヒエラルキー(文献80)にしたがって特定のモチーフ中のシチジンを優先的に脱アミノ化するAPOBEC3A(eA3A)などのよりいっそう狭い編集ウィンドウを有するデアミナーゼドメインの最近の操作を考慮するとこれは特に重要である。
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配列番号2: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
配列番号3: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
配列番号4: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
配列番号5: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
配列番号6: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
配列番号7: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
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配列番号9: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
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配列番号14: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
配列番号15: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
配列番号16: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
配列番号17: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
配列番号18: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
配列番号19: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
配列番号20: 合成、組換えまたはハイブリッド配列;6位〜24位のnはそれぞれ独立にA、C、G、T、U、不明またはその他である
配列番号21: 合成、組換えまたはハイブリッド配列;5位〜23位のnはそれぞれ独立にA、C、G、T、U、不明またはその他である
配列番号22: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
配列番号23: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
配列番号24: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
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配列番号260: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
配列番号261: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
配列番号262: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
配列番号263: 合成、組換えまたはハイブリッド配列
Claims (136)
- 細胞中の標的ポリヌクレオチドの改変のためのsgRNAであって、
(a)前記標的ポリヌクレオチドの領域に対応するガイド配列を含むガイドセグメントと、
(b)前記ガイド配列の3’に位置する第1のヘアピン形成セグメントであって、前記第1のヘアピン形成セグメントが、ステム部分およびループ部分を含むヘアピンを形成することができ、前記ステム部分が、RNAポリメラーゼIII終結シグナルに対応する配列を含まない、前記第1のヘアピン形成セグメントと、
を含む、sgRNA。 - 前記ステム部分が4つより多くの連続するウラシルヌクレオチドを含まない、請求項1に記載のsgRNA。
- 前記ステム部分が3つより多くの連続するウラシルヌクレオチドを含まない、請求項1に記載のsgRNA。
- 前記ステム部分が第1のステム部分および第2のステム部分を含み、前記第1のステム部分が、RNAポリメラーゼIII終結シグナルに対応する配列を含まない、請求項1に記載のsgRNA。
- 前記第1のステム部分が4つより多くの連続するウラシルヌクレオチドを含まない、請求項4に記載のsgRNA。
- 前記第1のステム部分が3つより多くの連続するウラシルヌクレオチドを含まない、請求項5に記載のsgRNA。
- 前記第1のステム部分および前記第2のステム部分が第1のバルジ部分により分離されている、請求項4〜6のいずれか1項に記載のsgRNA。
- 前記ループ部分が3〜6のヌクレオチドの配列を含むまたはからなる、請求項1〜8のいずれか1項に記載のsgRNA。
- 前記ループ部分が3〜5のヌクレオチドの配列を含むまたはからなる、請求項8に記載のsgRNA。
- 前記ループ部分が4のヌクレオチドの配列を含むまたはからなる、請求項9に記載のsgRNA。
- 前記ループ部分がヌクレオチド配列N1N2N3N4を含みまたはからなり、N1、N2、およびN3がそれぞれ独立してA、C、GまたはUであり、かつ、N4がCまたはGである、請求項10に記載のsgRNA。
- 前記ループ部分がヌクレオチド配列N1N2N3N4を含みまたはからなり、N1、N3、およびN4がそれぞれ独立してA、C、GまたはUであり、かつ、N2がU、GまたはAである、請求項10または11に記載のsgRNA。
- N1がGである、請求項11または12に記載のsgRNA。
- N2がUである、請求項11〜13のいずれか1項に記載のsgRNA。
- N3がAである、請求項11〜14のいずれか1項に記載のsgRNA。
- N4がCである、請求項11〜15のいずれか1項に記載のsgRNA。
- 前記ループ部分がヌクレオチド配列GUACを含むまたはからなる、請求項10〜16のいずれか1項に記載のsgRNA。
- 前記第2のステム部分が4のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、請求項4〜17のいずれか1項に記載のsgRNA。
- 前記第1のステム部分に対して遠位の、前記第2のステム部分の前記ハイブリッドの第4の対がG−C対である、請求項18に記載のsgRNA。
- 前記第2のステム部分の前記ハイブリッドが、配列5’−CAGA−3’にハイブリダイズした配列5’−UCUG−3’を含むまたはからなる、請求項18または19に記載のsgRNA。
- 前記第1のステム部分が少なくとも5のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、請求項4〜20のいずれか1項に記載のsgRNA。
- 前記第1のステム部分が12以下のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、請求項4〜21のいずれか1項に記載のsgRNA。
- 前記第1のステム部分が6〜10のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、請求項21または22に記載のsgRNA。
- 前記第1のステム部分が7〜9のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、請求項23に記載のsgRNA。
- 前記第1のステム部分が8のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、請求項24に記載のsgRNA。
- 前記第1のステム部分がミスマッチを含まない、請求項4〜25のいずれか1項に記載のsgRNA。
- 前記第1のステム部分の前記ハイブリッドが、配列5’−UACAAAGA−3’にハイブリダイズした配列5’−UCUUUGUA−3’を含むまたはからなる、請求項4〜26のいずれか1項に記載のsgRNA。
- 前記第1のステム部分が単一のミスマッチを含む、請求項4〜24のいずれか1項に記載のsgRNA。
- 前記第1のステム部分の前記ハイブリッドが、配列5’−UACAAAGAU−3’にハイブリダイズした配列5’−GUCUUUGUA−3’を含むまたはからなる、請求項28に記載のsgRNA。
- 前記第1のヘアピン形成セグメントの3’に位置する1つまたはより多くの追加のヘアピン形成セグメントをさらに含む、請求項1〜29のいずれか1項に記載のsgRNA。
- 前記第1のヘアピン形成セグメントと前記追加のヘアピン形成セグメントとの間、および/または前記追加のヘアピン形成セグメントの間に位置する1つまたはより多くのリンカーセグメントをさらに含む、請求項30に記載のsgRNA。
- 請求項1〜31のいずれか1項に記載のsgRNAをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
- 請求項32に記載の核酸を含む、ベクター。
- CRISPRヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項33に記載のベクター。
- 前記CRISPRヌクレアーゼがCas9酵素である、請求項34に記載のベクター。
- 前記CRISPRヌクレアーゼが非病原性細菌に由来する、請求項34または35に記載のベクター。
- 前記CRISPRヌクレアーゼがストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)Cas9ヌクレアーゼである、請求項34〜36のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記CRISPRヌクレアーゼがII型Cas9ヌクレアーゼである、請求項34〜37のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記CRISPRヌクレアーゼがストレプトコッカス・サーモフィルスII−A型CRISPR1−Cas9(St1Cas9)である、請求項34〜38のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記CRISPRヌクレアーゼが1つまたはより多くの核局在シグナル(NLS)をさらに含み、かつ、前記ベクターが、前記1つまたはより多くのNLSをコードする1つまたはより多くのヌクレオチド配列をさらに含む、請求項34〜39のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記CRISPRヌクレアーゼがそのアミノ末端における第1のNLSおよびそのカルボキシ末端における第2のNLSを含み、かつ、前記ベクターが、前記CRISPRヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に隣接するNLSをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項40に記載のベクター。
- 前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項33に記載のベクター。
- 前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列および/または前記CRISPRヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結した1つもしくはより多くのプロモーターをさらに含む、請求項34〜41のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列およびまたは前記CRISPRヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列の両方が単一のプロモーターに作動可能に連結している、請求項43に記載のベクター。
- 前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列が第1のプロモーターに作動可能に連結しており、かつ、前記CRISPRヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が第2のプロモーターに作動可能に連結しており、前記第1のプロモーターおよび前記第2のプロモーターが同じまたは異なっていてもよい、請求項43に記載のベクター。
- (i)前記第1のプロモーターおよび前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに(ii)前記第2のプロモーターおよび前記CRISPRヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ベクター内で同じ方向にある、請求項45に記載のベクター。
- (i)前記第1のプロモーターおよび前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに(ii)前記第2のプロモーターおよび前記CRISPRヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ベクター内で反対の方向にある、請求項45に記載のベクター。
- 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項33〜47のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記ベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項48に記載のベクター。
- 請求項32に記載の核酸または請求項33〜49のいずれか1項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、請求項32に記載の核酸、請求項33〜49のいずれか1項に記載のベクター、または請求項50に記載の宿主細胞を含む、組成物。
- 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項51に記載の組成物。
- 請求項1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、請求項32に記載の核酸、請求項33〜49のいずれか1項に記載のベクター、請求項50に記載の宿主細胞、および/または請求項51もしくは52に記載の組成物を含む、システム。
- 請求項33に記載のベクターおよびCRISPRヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなるベクターを含む、システム。
- 前記CRISPRヌクレアーゼが、請求項35〜41のいずれか1項において定義されるものである、請求項54に記載のシステム。
- 請求項33に記載のベクターが、前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含み、かつ、さらなるベクターが、前記CRISPRヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項54または55に記載のシステム。
- 細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法であって、前記細胞を、請求項1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、請求項32に記載の核酸、請求項33〜49のいずれか1項に記載のベクター、請求項51もしくは52に記載の組成物および/または請求項53〜56のいずれか1項に記載のシステムと接触させることを含む、方法。
- in vitroの方法である、請求項57に記載の方法。
- in vivoの方法であり、かつ、前記細胞が対象中にある、請求項57に記載の方法。
- 細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための、請求項1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、請求項32に記載の核酸、請求項33〜49のいずれか1項に記載のベクター、請求項51もしくは52に記載の組成物および/または請求項53〜56のいずれか1項に記載のシステムの使用。
- 細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための医薬の調製のための、請求項1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、請求項32に記載の核酸、請求項33〜49のいずれか1項に記載のベクター、請求項51もしくは52に記載の組成物および/または請求項53〜56のいずれか1項に記載のシステムの使用。
- 細胞中の標的ポリヌクレオチドの改変において使用するための、請求項1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、請求項32に記載の核酸、請求項33〜49のいずれか1項に記載のベクター、請求項51もしくは52に記載の組成物および/または請求項53〜56のいずれか1項に記載のシステム。
- それを必要とする対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療する方法であって、前記対象に有効量の請求項1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、請求項32に記載の核酸、請求項33〜49のいずれか1項に記載のベクター、請求項51もしくは52に記載の組成物および/または請求項53〜56のいずれか1項記載のシステムを投与することを含む、方法。
- 前記病態が代謝性の病態である、請求項63に記載の方法。
- 前記病態が肝臓の病態である、請求項63または64に記載の方法。
- 対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療するための、請求項1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、請求項32に記載の核酸、請求項33〜49のいずれか1項に記載のベクター、請求項51もしくは52に記載の組成物および/または請求項53〜56のいずれか1項に記載のシステムの使用。
- 対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療するための医薬の調製のための、請求項1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、請求項32に記載の核酸、請求項33〜49のいずれか1項に記載のベクター、請求項51もしくは52に記載の組成物および/または請求項53〜56のいずれか1項に記載のシステムの使用。
- 前記病態が代謝性の病態である、請求項66または67に記載の使用。
- 前記病態が肝臓の病態である、請求項66〜68のいずれか1項に記載の使用。
- 対象における標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態の予防または治療において使用するための、請求項1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、請求項32に記載の核酸、請求項33〜49のいずれか1項に記載のベクター、請求項51もしくは52に記載の組成物および/または請求項53〜56のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記病態が代謝性の病態である、請求項70に記載の使用のためのsgRNA、核酸、ベクター、組成物および/またはシステム。
- 前記病態が肝臓の病態である、請求項70または71に記載の使用のためのsgRNA、核酸、ベクター、組成物および/またはシステム。
- 医薬として使用するための、請求項1〜31のいずれか1項に記載のsgRNA、請求項32に記載の核酸、請求項33〜49のいずれか1項に記載のベクター、請求項50に記載の宿主細胞、請求項51もしくは52に記載の組成物および/または請求項53〜56のいずれか1項に記載のシステム。
- 第1のドメインおよび前記第1のドメインのC末側にある第2のドメインを含む単離されたCRISPRヌクレアーゼポリペプチドであって、前記第1のドメインがガイドRNA結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含み、かつ、前記第2のドメインがWEDドメインおよびPAM相互作用ドメインを含み、前記第1および第2のドメインが異なる細菌株に由来する、単離されたポリペプチド。
- 前記第1および第2のドメインが非病原性細菌に由来する、請求項74に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第1および第2のドメインが異なる細菌種に由来する、請求項74または75に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第1および第2のドメインが同じ細菌種の異なる株に由来する、請求項74または75に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第1および第2のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスの異なる株に由来する、請求項77に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記CRISPRヌクレアーゼがII型Cas9ヌクレアーゼである、請求項74〜78のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記CRISPRヌクレアーゼがストレプトコッカス・サーモフィルスII−A型CRISPR1−Cas9(St1Cas9)である、請求項74〜79のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 1つまたはより多くの核局在シグナル(NLS)をさらに含む、請求項74〜80のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第1のドメインのN末側にある第1のNLSおよび前記第2のドメインのC末側にある第2のNLSを含む、請求項81に記載の単離されたポリペプチド。
- シチジンデアミナーゼドメインまたはアデノシンデアミナーゼドメインをさらに含む、請求項74〜82のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- シチジンデアミナーゼドメインを含む、請求項83に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記シチジンデアミナーゼがAPOBECシチジンデアミナーゼである、請求項84に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記シチジンデアミナーゼドメインが、配列番号50のアミノ酸配列、またはその機能的断片、またはその機能的バリアントを含む、請求項84に記載の単離されたポリペプチド。
- ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤(UGI)ドメインをさらに含む、請求項84または85に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記UGIドメインが、配列番号51のアミノ酸配列、またはその機能的断片、またはその機能的バリアントを含む、請求項87に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第1のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9、LMG8311、CNRZ1066またはTH1477に由来する、請求項74〜88のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第2のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9、LMG8311、CNRZ1066またはTH1477に由来する、請求項74〜89のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第1のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9に由来し、かつ、前記第2のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMG8311、CNRZ1066またはTH1477に由来する、請求項74〜90のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第1のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスLMG8311に由来し、かつ、前記第2のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9、CNRZ1066またはTH1477に由来する、請求項74〜90のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第1のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスCNRZ1066に由来し、かつ、前記第2のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMG8311、LMD−9またはTH1477に由来する、請求項74〜90のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第1のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスTH1477に由来し、かつ、前記第2のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMG8311、CNRZ1066またはLMD−9に由来する、請求項74〜90のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第1のドメインが、配列番号264、265、266、もしくは267のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、請求項74〜88のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第2のドメインが、配列番号260、261、262、もしくは263のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、請求項74〜88のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第1のドメインが、配列番号264のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含み、かつ、前記第2のドメインが、配列番号261、262、もしくは263のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、請求項74〜88、95および96のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第1のドメインが、配列番号265のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含み、かつ、前記第2のドメインが、配列番号260、262、もしくは263のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、請求項74〜88、95および96のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第1のドメインが、配列番号266のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含み、かつ、前記第2のドメインが、配列番号260、261、もしくは263のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、請求項74〜88、95および96のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第1のドメインが、配列番号267のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含み、かつ、前記第2のドメインが、配列番号260、261、もしくは262のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、請求項74〜88、95および96のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記第1のドメインが、リンカー領域を介して前記第2のドメインに接続されている、請求項74〜100のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、前記第1のドメインが由来するCRISPRヌクレアーゼが結合するPAMとは異なるPAMに結合することができる、請求項74〜101のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列NNAGAA、NNGGAA、NNACAA、NNGCAA、NNGAAAまたはNNAAAAを含むPAMに結合する、請求項74〜102のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
- 請求項74〜103のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
- 請求項104に記載の核酸を含む、ベクター。
- sgRNAをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項105に記載のベクター。
- 前記sgRNAが、請求項1〜31のいずれか1項に記載のsgRNAである、請求項106に記載のベクター。
- 前記ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列および/または前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結した1つまたはより多くのプロモーターをさらに含む、請求項105〜107のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列および前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列の両方が単一のプロモーターに作動可能に連結している、請求項108に記載のベクター。
- 前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列が第1のプロモーターに作動可能に連結しており、かつ、前記ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が第2のプロモーターに作動可能に連結しており、前記第1のプロモーターおよび前記第2のプロモーターが同じまたは異なっていてもよい、請求項108に記載のベクター。
- (i)前記第1のプロモーターおよび前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに(ii)前記第2のプロモーターおよび前記CRISPRヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ベクター内で同じ方向にある、請求項110に記載のベクター。
- (i)前記第1のプロモーターおよび前記sgRNAをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに(ii)前記第2のプロモーターおよび前記CRISPRヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ベクター内で反対の方向にある、請求項110に記載のベクター。
- 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項105〜112のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記ベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項113に記載のベクター。
- 請求項104に記載の核酸または請求項105〜113のいずれか1項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項104に記載の核酸、請求項105〜112のいずれか1項に記載のベクター、または請求項115に記載の宿主細胞を含む、組成物。
- 薬学的または生物学的に許容される担体をさらに含む、請求項116に記載の組成物。
- 請求項74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項104に記載の核酸、請求項105〜112のいずれか1項に記載のベクター、請求項115に記載の宿主細胞、および/または請求項116もしくは117に記載の組成物を含む、システム。
- 請求項105に記載のベクターおよびsgRNAをコードするヌクレオチド配列を含むさらなるベクターを含む、システム。
- 細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法であって、前記細胞を、請求項74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項104に記載の核酸、請求項105〜112のいずれか1項に記載のベクター、請求項115に記載の宿主細胞、および/または請求項116もしくは117に記載の組成物、および/または請求項118もしくは119に記載のシステムと接触させることを含む、方法。
- in vitroの方法である、請求項120に記載の方法。
- in vivoの方法であり、かつ、前記細胞が対象中にある、請求項120に記載の方法。
- 細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための、請求項74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項104に記載の核酸、請求項105〜112のいずれか1項に記載のベクター、請求項115に記載の宿主細胞、および/または請求項116もしくは117に記載の組成物、および/または請求項118もしくは119に記載のシステムの使用。
- 細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための医薬の調製のための、請求項74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項104に記載の核酸、請求項105〜112のいずれか1項に記載のベクター、請求項115に記載の宿主細胞、および/または請求項116もしくは117に記載の組成物、および/または請求項118もしくは119に記載のシステムの使用。
- 細胞中の標的ポリヌクレオチドの改変において使用するための、請求項74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項104に記載の核酸、請求項105〜112のいずれか1項に記載のベクター、請求項115に記載の宿主細胞、および/または請求項116もしくは117に記載の組成物、および/または請求項118もしくは119に記載のシステム。
- それを必要とする対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療する方法であって、前記対象に有効量の請求項74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項104に記載の核酸、請求項105〜112のいずれか1項に記載のベクター、請求項115に記載の宿主細胞、および/または請求項116もしくは117に記載の組成物、および/または請求項118もしくは119に記載のシステムを投与することを含む、方法。
- 前記病態が代謝性の病態である、請求項126に記載の方法。
- 前記病態が肝臓の病態である、請求項126または127に記載の方法。
- 対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療するための、請求項74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項104に記載の核酸、請求項105〜112のいずれか1項に記載のベクター、請求項115に記載の宿主細胞、および/または請求項116もしくは117に記載の組成物、および/または請求項118もしくは119に記載のシステムの使用。
- 対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療するための医薬の調製のための、請求項74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項104に記載の核酸、請求項105〜112のいずれか1項に記載のベクター、請求項115に記載の宿主細胞、および/または請求項116もしくは117に記載の組成物、および/または請求項118もしくは119に記載のシステムの使用。
- 前記病態が代謝性の病態である、請求項129または130に記載の使用。
- 前記病態が肝臓の病態である、請求項129〜131のいずれか1項に記載の使用。
- 対象における標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態の予防または治療において使用するための、請求項74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項104に記載の核酸、請求項105〜112のいずれか1項に記載のベクター、請求項115に記載の宿主細胞、および/または請求項116もしくは117に記載の組成物、および/または請求項118もしくは119に記載のシステム。
- 前記病態が代謝性の病態である、請求項133に記載の使用のためのsgRNA、核酸、ベクター、組成物および/またはシステム。
- 前記病態が肝臓の病態である、請求項133または134に記載の使用のためのsgRNA、核酸、ベクター、組成物および/またはシステム。
- 医薬として使用するための、請求項74〜103のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項104に記載の核酸、請求項105〜112のいずれか1項に記載のベクター、請求項115に記載の宿主細胞、および/または請求項116もしくは117に記載の組成物、および/または請求項118もしくは119に記載のシステム。
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