JP2023551873A - Cagリピート病を処置するためのrna標的化組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
毒性標的CAGリピートRNAを破壊または遮断するための、ならびにハンチントン病(HD)および脊髄小脳失調症1型(SCA1)などのCAGリピート障害を処置するための、RNA標的化遺伝子治療用組成物およびRNA標的化遺伝子治療方法が、開示される。本開示は、CAGリピート障害のための組成物および方法を提供する。本明細書に開示される組成物および方法は、分解または遮断のどちらかによってCAGexp(CAGリピート伸長)RNAの用量依存的低減をもたらす。
Description
開示の分野
本開示は、分子生物学、遺伝子治療、ならびにRNA分子の発現および活性を改変するための組成物および方法を対象とする。
本開示は、分子生物学、遺伝子治療、ならびにRNA分子の発現および活性を改変するための組成物および方法を対象とする。
関連出願
本出願は、2020年12月1日に出願した米国特許出願第63/119,977号および2020年12月23日に出願した米国特許出願第63/130,060号に基づく利益および優先権を主張するものである。各々の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年12月1日に出願した米国特許出願第63/119,977号および2020年12月23日に出願した米国特許出願第63/130,060号に基づく利益および優先権を主張するものである。各々の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照による組込み
2021年12月1日に作成された140KBサイズの「LOCN_008_001WO_SeqList_ST25」という名称のテキストファイルの内容は、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
2021年12月1日に作成された140KBサイズの「LOCN_008_001WO_SeqList_ST25」という名称のテキストファイルの内容は、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
有効な遺伝子治療、特に、疾患を引き起こす原因となる病原性RNAを標的とする遺伝子療法を提供することについて長年にわたるが満たされていない必要性が当技術分野において存在する。
有効な遺伝子治療、特に、疾患を引き起こす原因となる病原性RNAを標的とする遺伝子療法を提供することについて長年にわたるが満たされていない必要性が当技術分野において存在する。
20を超える不安定なマイクロサテライトリピート伸長(MRE)が、ヒトにおける神経疾患の原因として同定されている(Rohilla and Gagnon, Acta Neuropahtologica Communications, (2017) 5:63)。マイクロサテライトリピート伸長におけるこれらの反復MREトラクトから発現される病原性RNAは、様々な衰弱性の、多くの場合、破滅的な疾患および障害を引き起こす。これらのリピートRNA、遺伝子内のそれらの位置、正常なおよび疾患を引き起こすリピート長の範囲、ならびに臨床転帰は、異なる。不安定なリピートは、遺伝子のコード領域に位置することもあり、または非コード領域に位置することもある。利用可能な処置がこれらのMRE病の症状に対処するが、それらの基礎にある病因を標的としない。
タンパク質生理機能を変えることにより疾患を引き起こす最も一般的なトリヌクレオチドリピートがCAG MREである。CAG MREの翻訳は、ポリQトラクトを生じさせる結果となる。多くの異なる障害が、遺伝子のコード領域にCAGリピートを共有する。結果として生じるタンパク質の伸長サイズ、構造、細胞局在および機能は異なるが、全てのCAG MRE誘導疾患が神経変性および/または神経筋疾患または障害である。
HDは、ハンチンチン(HTT)遺伝子におけるCAGリピート伸長によって引き起こされる致死的な障害である。この疾患は、線条体ニューロンの変性につながり、その結果、制御されない動き、情緒的問題および認知症に至る。現在、40,000名を超える患者、および200,000名のリスクのある患者が、米国には存在する。
伸長CAGリピートはまた、脊髄小脳失調症(SCA)の群の原因となり、これまでに記載されたSCAは、9つあり、SCAのサブセットは、CAG MREの存在によって引き起こされる。SCA1は、ATXN1遺伝子におけるCAGトリヌクレオチドリピートの存在によって引き起こされる。SCA 1型(SCA1)は、運動に関する進行性の問題を特徴とする稀なオートドミナント障害である。SCA1症状は、協調および平衡(運動失調)、言語および嚥下障害、筋硬直(痙攣)、ならびに眼球運動を制御する眼筋の衰弱(眼振)、ならびに処理、学習および記憶に関連する認知機能障害を含む。世界中で100,000名に1~2名がSCA1に罹患する。
これらのCAG MRE病および障害のための疾患修飾療法の非存在を克服するために有効、持続的かつスケーラブルな処置を提供するための治療法を正確に説明する必要があり、開発する必要がある。RNA標的化遺伝子治療用の系は、疾患および障害の原因となる病変に関与するCAG MREなどの病原性トリヌクレオチドリピートの標的化に理想的である。
したがって、本開示は、ハンチントン病(HD)および脊髄小脳失調症(SCA)などのトリヌクレオチドCAGリピート障害として公知のマイクロサテライトリピート伸長(MRE)病の際に反復トラクトから発現される毒性RNAを特異的に標的とし、破壊するための、遺伝子治療用組成物および遺伝子治療方法を提供する。毒性CAGリピートを消失させることができる、RNAを標的とする遺伝子治療用組成物および系、ならびにCAG MREの原因となる疾患および障害を処置するためにそれらを使用する方法が、本明細書において提供される。
したがって、本開示は、ハンチントン病(HD)および脊髄小脳失調症(SCA)などのトリヌクレオチドCAGリピート障害として公知のマイクロサテライトリピート伸長(MRE)病の際に反復トラクトから発現される毒性RNAを特異的に標的とし、破壊するための、遺伝子治療用組成物および遺伝子治療方法を提供する。毒性CAGリピートを消失させることができる、RNAを標的とする遺伝子治療用組成物および系、ならびにCAG MREの原因となる疾患および障害を処置するためにそれらを使用する方法が、本明細書において提供される。
Rohilla and Gagnon, Acta Neuropahtologica Communications, (2017) 5:63
要旨
本開示は、CAGリピート障害のための組成物および方法を提供する。本明細書に開示される組成物および方法は、分解または遮断のどちらかによってCAGexp(CAGリピート伸長)RNAの用量依存的低減をもたらす。
本開示は、CAGリピート障害のための組成物および方法を提供する。本明細書に開示される組成物および方法は、分解または遮断のどちらかによってCAGexp(CAGリピート伸長)RNAの用量依存的低減をもたらす。
本開示は、CAG MREの原因となる疾患および障害を処置するための組成物および方法を提供する。
哺乳動物におけるハンチントン病(HD)を処置する方法であって、哺乳動物の組織における毒性標的CAGマイクロサテライトリピート伸長(MRE)分子に組成物を投与するステップを含み、組成物が、a)毒性標的CAG RNAリピート配列に結合することができる、PUF RNA結合性配列またはCas13d RNA結合性タンパク質と、b)毒性標的CAG RNAリピート配列を切断することができるエンドヌクレアーゼとを含むガイドされないRNA結合性融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、それによって毒性標的RNAの発現レベルが低下される方法が、本明細書に開示される。
哺乳動物における脊髄小脳失調症1型(SCA1)を処置する方法であって、哺乳動物の組織における毒性標的CAGマイクロサテライトリピート伸長(MRE)分子に組成物を投与するステップを含み、組成物が、a)毒性標的CAG RNAリピート配列に結合することができる、PUF RNA結合性配列またはCas13d RNA結合性タンパク質と、b)毒性標的CAG RNAリピート配列を切断することができるエンドヌクレアーゼとを含むガイドされないRNA結合性融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、それによって毒性標的RNAの発現レベルが低下される方法が、本明細書に開示される。
本開示は、毒性標的CAGリピートRNA配列に結合することができるガイドされないRNA結合性ポリペプチドまたはガイドされるRNA結合性ポリペプチドを含むRNA結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組成物を提供する。
一部の実施形態では、RNA結合性ポリペプチドは、融合タンパク質である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、毒性CAGリピートRNA配列を切断することができるエンドヌクレアーゼと融合したRNA結合性ポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ガイドされないRNA結合性ポリペプチドは、PUFまたはPUMBYタンパク質である。一部の実施形態では、ガイドされるRNA結合性ポリペプチドは。一部の実施形態では、cas13dタンパク質は、触媒的に失活している。
一部の実施形態では、cas13dタンパク質は、配列番号587または590~594のいずれか1つで示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ZC3H12Aジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインである。
一部の実施形態では、PUF RNA結合性タンパク質は、配列番号444~451、461、480~488、549~557、または656のいずれか1つで示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、PUF RNA結合性タンパク質は、配列番号549または480で示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、毒性標的CAG RNAリピート配列は、配列番号453~456または472~479で示される核酸配列のいずれか1つを含む。一部の実施形態では、毒性標的CAG RNAリピート配列は、配列番号453または472のいずれか1つで示される核酸配列を含む。
一部の実施形態では、CAG標的化PUFタンパク質は、配列番号577、581、614、619、621、または622で示される核酸配列によってコードされる。
一部の実施形態では、PUFまたはPUMBYタンパク質は、ヒトPUFまたはPUMBYタンパク質である。一部の実施形態では、PUFまたはPUMBYタンパク質は、リンカー配列によってZC3H12Aエンドヌクレアーゼに連結されている。
一部の実施形態では、リンカーは、配列番号411で示されるアミノ酸配列を含む。
融合タンパク質は、核局在化配列(NLS)、および核外輸送配列(NES)からなる群から選択される1つまたは複数のシグナル配列を含む。
一部の実施形態では、ZC3H12Aジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号358または配列番号359で示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号460のいずれか1つで示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号574~582を含む核酸配列によってコードされる。
一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸分子は、プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、tCAGプロモーター、EFS/UBBプロモーター、またはシナプシンプロモーターである。
本開示のいずれかの実施形態の組成物を含む、ベクター。
一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、およびデンドリマーからなる群から選択される。一部の実施形態では、AAVベクターである。
一部の実施形態では、AAVベクターは、第1のAAV ITR配列と、第1のプロモーター配列と、少なくとも1つのCAGリピートRNA結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、第2のAAV ITR配列とを含む。
一部の実施形態では、CAGリピートRNA結合性ポリペプチドは、PUFまたはPUMBYタンパク質を含む。本開示のいずれかの実施形態のAAVベクターでは、PUFまたはPUMBY配列をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号577、581、614、619、621、または622で示される核酸配列を含む。
一部の実施形態では、CAGリピートRNA結合性ポリペプチドは、Cas13dタンパク質を含む。一部の実施形態では、Cas13d配列をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号587または590~594で示される核酸配列を含む。
一部の実施形態では、第1のプロモーター配列は、配列番号389、627、または613で示される核酸配列を含む。
一部の実施形態では、第1のAAV ITR配列は、配列番号597または598で示される核酸配列を含む。一部の実施形態では、第2のAAV ITR配列は、配列番号597または598で示される核酸配列を含む。
一部の実施形態では、第2のプロモーター配列をさらに含む。
一部の実施形態では、第2のプロモーターは、ガイドRNA(gRNA)の発現を制御し、gRNAは、(i)DR配列および(ii)スペーサー配列を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、配列番号519で示される核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ポリA配列をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのリンカー配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号588、589、624、または625のいずれかで示される核酸でコードされる。
本開示は、a)本開示のいずれかの実施形態のAAVウイルスベクターと、b)少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤および/または添加剤とを含む、医薬組成物を提供する。
本開示は、a)本開示のいずれかの実施形態のAAVベクターと、b)AAVカプシドタンパク質とを含む、AAVウイルスベクターを提供する。
一部の実施形態では、AAVカプシドタンパク質は、AAV1カプシドタンパク質、AAV2カプシドタンパク質、AAV4カプシドタンパク質、AAV5カプシドタンパク質、AAV6カプシドタンパク質、AAV7カプシドタンパク質、AAV8カプシドタンパク質、AAV9カプシドタンパク質、AAV10カプシドタンパク質、AAV11カプシドタンパク質、AAV12カプシドタンパク質、AAV13カプシドタンパク質、AAVPHP.Bカプシドタンパク質、AAVrh74カプシドタンパク質またはAAVrh.10カプシドタンパク質である。一部の実施形態では、AAVカプシドタンパク質は、AAV9またはAAVrh10カプシドタンパク質である。
本開示は、本開示のいずれかの実施形態のベクターを含む、細胞を提供する。
本開示は、哺乳動物におけるCAGリピート病を処置する方法であって、本開示のいずれかの実施形態の組成物またはAAVベクターを、哺乳動物の組織における毒性標的CAGマイクロサテライトリピート伸長(MRE)RNA配列に投与するステップを含み、それによって毒性標的RNAの発現レベルが低下される、方法を提供する。
一部の実施形態では、組成物またはAAVベクターは、対象に、静脈内、くも膜下腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、気管内、耳内、眼内もしくは目周囲、経口、直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、大槽内、神経内、胸膜内、局部、リンパ内、大槽内投与されるか、または神経内にある。
一部の実施形態では、組成物またはAAVベクターは、対象に静脈内投与される。一部の実施形態では、CAGリピート障害は、ハンチントン病(HD)または脊髄小脳失調症1型(SCA1)である。
一部の実施形態では、毒性標的RNAの発現レベルの低下によって、哺乳動物におけるHDまたはSCA1の症状が好転する。
一部の実施形態では、毒性標的RNAの発現レベルは、未処置毒性標的CAG RNAの発現レベルの低下と比較して低下される。
一部の実施形態では、毒性CAGリピートは、CAG36であるかまたはそれより多い。一部の実施形態では、毒性CAGリピートは、CAG80リピートである。一部の実施形態では、低下のレベルは、1倍~20倍の間である。
ガイドされないRNA結合性融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組成物であって、前記融合タンパク質が、a)毒性標的CAGリピートRNA配列に結合することができるPUFまたはPUMBYタンパク質、およびb)毒性標的RNA配列を切断することができるエンドヌクレアーゼを含み、エンドヌクレアーゼが、ZC3H12Aジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインである、組成物が、本明細書に開示される。
一部の実施形態では、PUF RNA結合性タンパク質は、配列番号444~451、461、480~488、または549~557のいずれか1つを含む。
一部の実施形態では、PUF RNA結合性タンパク質は、配列番号549または480を含む。
一部の実施形態では、毒性標的CAG RNAリピート配列は、配列番号453~456または472~479のいずれか1つを含む。
一部の実施形態では、毒性標的CAG RNAリピート配列は、配列番号453または472を含む。
一部の実施形態では、CAG標的化PUFタンパク質は、配列番号577または581のいずれか1つを含む核酸配列によってコードされる。
一部の実施形態では、PUFまたはPUMBYタンパク質は、ヒトPUFまたはPUMBYタンパク質である。
一部の実施形態では、PUFまたはPUMBYタンパク質は、VDTANGS(配列番号411)リンカーによってZC3H12Aに連結されている。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、核局在化配列(NLS)および核外輸送配列(NES)からなる群から選択される1つまたは複数のシグナル配列を含む。
一部の実施形態では、ZC3H12Aジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号358または配列番号359を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号574~582のいずれか1つを含む核酸配列によってコードされる。
一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸分子は、プロモーターを含む。
一部の実施形態では、プロモーターは、tCAGプロモーターである。
前述の組成物のいずれかを含むベクターが、本明細書に開示される。
一部の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、およびデンドリマーからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ベクターは、AAVベクターである。
一部の実施形態では、AAVベクターは、AAV9、AAVrh10、またはAAVrh.74である。
任意の前述の実施形態のベクターを含む細胞が、本明細書に開示される。
哺乳動物におけるCAGリピート病を処置する方法であって、哺乳動物の組織における毒性標的CAGマイクロサテライトリピート伸長(MRE)RNA配列に組成物を投与するステップを含み、組成物が、a)毒性標的CAG RNAリピート配列に結合することができるPUF RNA結合性タンパク質と、b)毒性標的CAG RNAリピート配列を切断することができるエンドヌクレアーゼとを含むガイドされないRNA結合性融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、それによって毒性標的RNAの発現レベルが低下される方法が、本明細書に開示される。
一部の実施形態では、PUF RNA結合性タンパク質は、配列番号444~451、461、480~488、または549~557のいずれか1つを含む。
一部の実施形態では、PUF RNA結合性タンパク質は、配列番号549または480を含む。
一部の実施形態では、毒性標的CAG RNAリピート配列は、配列番号453~456または472~479のいずれか1つを含む。
一部の実施形態では、毒性標的CAG RNAリピート配列は、配列番号453または472を含む。
一部の実施形態では、組成物は、線条体内投与によって哺乳動物の組織に投与される。
一部の実施形態では、毒性標的RNAの発現レベルの低下によって、哺乳動物におけるCAGリピート障害の症状が好転する。
一部の実施形態では、毒性標的RNAの発現レベルは、未処置毒性標的CAG RNAの発現レベルの低下と比較して低下される。
一部の実施形態では、低下のレベルは、1倍~20倍の間である。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ZC3H12Aジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのドメインである。
一部の実施形態では、ZC3H12Aジンクフィンガーヌクレアーゼのドメインは、配列番号358または配列番号359を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸配列は、プロモーターを含む。
一部の実施形態では、プロモーターは、tCAGプロモーターである。
一部の実施形態では、プロモーターは、ニューロン特異的プロモーターである。
一部の実施形態では、ニューロン特異的プロモーターは、シナプシンプロモーターである。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号574~582のいずれか1つを含む核酸配列によってコードされる。
天然に存在しないまたは操作された、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート(CRISPR)関連(Cas)系をコードする核酸配列を含む組成物であって、前記核酸配列が、(a)少なくとも1つの、RNAによりガイドされるRNse Casタンパク質と、b)少なくとも1つのCasタンパク質の1つと複合体を形成することができる少なくとも1つの同族CRISPR-Cas系ガイドRNA(gRNA)とを含み、gRNAが、(i)DR配列および(ii)スペーサー配列を含み、スペーサー配列が、標的CAG MRE分子とハイブリダイズし、スペーサー配列が、tgctgctgctgctgctgctgctgctg(ガイド1、配列番号457)、gctgctgctgctgctgctgctgctgc(ガイド2、配列番号458)、およびctgctgctgctgctgctgctgctgct(ガイド3、配列番号458)からなる群から選択されるスペーサー配列またはその一部を含み、CRISPR-Cas系が、標的CAG MREに結合することおよびそれを切断することができ、CRISPR-Cas系が、触媒として不活性である、およびCRISPR-Casが、標的CAG MREに結合することができるがそれを切断することができない、組成物。
一部の実施形態では、Casタンパク質は、Cas13a、Cas13b、Cas13c、またはCas13dである。一部の実施形態では、Casタンパク質は、Cas13dである。
一部の実施形態では、RNAによりガイドされるRNase Casタンパク質またはガイドされないRNA結合性ポリペプチドは、第2のRNA結合性ポリペプチドと融合している第1のRNA結合性ポリペプチドである。一実施形態では、第2のRNA結合性ポリペプチドは、RNAと会合する様式でRNAに結合することができる。一部の実施形態では、第2のRNA結合性ポリペプチドは、RNAを切断する様式でRNAと会合することができる。一実施形態では、第2のRNA結合性ポリペプチドは、ZC3H12Aジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインである。
一部の実施形態では、CasまたはdCas系をコードする核酸は、プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、EFSプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ニューロン特異的プロモーターである。一部の実施形態では、ニューロン特異的プロモーターは、シナプシンプロモーターである。
一部の実施形態では、CAGリピート障害は、HDまたはSCA1である。
一部の実施形態では、毒性CAGリピートは、CAG36であるかまたはそれより多い。一部の実施形態では、毒性CAGリピートは、CAG80リピートである。
方法の別の実施形態では、組成物は、小脳内または線条体内投与によって哺乳動物の組織に投与される。
別の実施形態では、毒性標的RNAの発現レベルの低下によって、哺乳動物における疾患の症状が好転する。
別の実施形態では、毒性標的RNAの発現レベルは、未処置毒性標的CAG RNAの発現レベルの低下と比較して低下される。
別の実施形態では、低下のレベルは、1倍~20倍の間であり、または毒性CAGリピートの消失は、約20%~100%の間である。
別の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ZC3H12Aジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインである。
別の実施形態では、核酸配列は、プロモーターを含む。
別の実施形態では、プロモーターは、tCAGプロモーターである。
別の実施形態では、融合タンパク質は、NLSおよびNESからなる群から選択される1つまたは複数のシグナル配列を含む。
一実施形態では、NLSまたはNESは、ヒトNLSまたはヒトNESである。別の実施形態では、ヒトNLSは、ヒトpRB-NLS:KRSAEGSNPPKPLKKLR(配列番号442)またはヒトRB-NLS(延長バージョン):DRVLKRSAEGSNPPKPLKKLR(配列番号543)である。
別の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸分子は、プロモーターを含む。
別の実施形態では、プロモーターは、tCAGプロモーターである。
哺乳動物におけるCAGリピート障害HDまたはSCA1を処置する方法であって、哺乳動物の組織における毒性標的CAGマイクロサテライトリピート伸長(MRE)分子に組成物を投与するステップを含み、組成物が、天然に存在しないまたは操作された、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート(CRISPR)関連(Cas)系をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、(a)少なくとも1つの、RNAによりガイドされるRNase Casタンパク質と、(b)少なくとも1つのCasタンパク質の1つと複合体を形成することができる少なくとも1つの同族CRISPR-Cas系ガイドRNA(gRNA)とを含み、gRNAが、(i)DR配列および(ii)スペーサー配列を含み、スペーサー配列が、標的CAG MRE分子とハイブリダイズし、それによって、組成物により形成された複合体が、標的CAG MRE分子を直接標的とし、それを破壊し、その結果、哺乳動物における疾患が処置される方法が、本明細書に開示される。
前述の方法の別の実施形態では、スペーサー配列は、tgctgctgctgctgctgctgctgctg(ガイド1、配列番号457)、gctgctgctgctgctgctgctgctgc(ガイド2、配列番号458)、およびctgctgctgctgctgctgctgctgct(ガイド3、配列番号459)からなる群から選択されるスペーサー配列を含む。
別の実施形態では、組成物は、線条体内または小脳内投与によって哺乳動物の組織に投与される。
別の実施形態では、RNAによりガイドされるRNase Casタンパク質は、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、およびそのRNA結合性部分からなる群から選択される。
別の実施形態では、RNAによりガイドされるRNase Casタンパク質は、Cas13dまたはそのRNA結合性部分である。
別の実施形態では、触媒的に不活性化されている、RNAによりガイドされるRNase Casタンパク質(dCas)。
別の実施形態では、dCasタンパク質は、エンドヌクレアーゼに連結されている。
別の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ZC3H12Aジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインである。
別の実施形態では、核酸分子は、RNAによりガイドされるCasタンパク質の発現を駆動することができるプロモーターを含む。
別の実施形態では、プロモーターは、EFSプロモーターである。
天然に存在しないまたは操作された、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート(CRISPR)関連(Cas)系をコードする核酸配列を含む組成物であって、前記核酸配列が、(a)少なくとも1つの、RNAによりガイドされるRNase Casタンパク質と、b)少なくとも1つのCasタンパク質の1つと複合体を形成することができる少なくとも1つの同族CRISPR-Cas系ガイドRNA(gRNA)とを含み、gRNAが、(i)DR配列および(ii)スペーサー配列を含み、スペーサー配列が、標的CAG MRE分子とハイブリダイズし、スペーサー配列が、tgctgctgctgctgctgctgctgctg(ガイド1、配列番号457)、gctgctgctgctgctgctgctgctgc(ガイド2、配列番号458)、およびctgctgctgctgctgctgctgctgct(ガイド3、配列番号458)からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、組成物が、本明細書に開示される。
前述の組成物のいずれかを含むベクターが、本明細書に開示される。
別の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、およびデンドリマーからなる群から選択される。
別の実施形態では、ベクターは、AAVベクターである。
別の実施形態では、AAVベクターは、AA9、AAVrh10、またはAAVrh.74である。
ベクターを含む細胞が、本明細書に開示される。
本特許または出願のファイルは、カラーで製作された少なくとも1つの図面を含有する。カラーの図面(複数可)を伴う本特許または特許出願公開のコピーは、要請し、必要な料金を支払えば、特許庁により提供される。
詳細な説明
本開示は、CAGトリヌクレオチドリピートによって引き起こされるまたはCAG MREの原因となる疾患および/または障害、例えばHDおよびSCA1、を処置するための、RNA標的化遺伝子治療用組成物およびRNA標的化遺伝子治療方法を提供する。
本開示は、CAGトリヌクレオチドリピートによって引き起こされるまたはCAG MREの原因となる疾患および/または障害、例えばHDおよびSCA1、を処置するための、RNA標的化遺伝子治療用組成物およびRNA標的化遺伝子治療方法を提供する。
HDおよびSCA1は、それぞれ、HTTおよびATXN1遺伝子における伸長されたCAGリピートによって引き起こされる致死的な進行性の常染色体優性疾患である。これらのリピートは、ポリグルタミントラクトをコードし、そのサイズが疾患の発症および進行と相関する。
ヒトハンチンチン(HTT)遺伝子は、67のエクソンを有する。エクソン1におけるCAGリピート伸長は、ポリQタンパク質凝集およびHDにつながる。HD疾患発症は、CAGリピートの数と逆相関する。全ての一塩基多型(SNP)が、エクソン1の下流の伸長されたCAG対立遺伝子と関連付けられる。伸長と関連付けられるSNPを利用する対立遺伝子特異的様式でのHTTの標的化は、HTTエクソン1アイソフォームを含有する高病原性の短いCAGを標的とすることになる。CAGリピート以外のエクソン1の標的化は、対立遺伝子特異的ノックダウンにつながることにならない。HDを処置するためのここに開示される遺伝子治療用組成物および遺伝子治療方法は、対立遺伝子優先的様式でCAGリピートを標的とし、正常なHTTタンパク質の発現を可能にする(図5)。
HDでは、CAGセグメントは、HTT遺伝子内での10~35回の正常なCAGリピートと見なされるものと比較して、変異体HTT遺伝子内では36~120回反復される。CAGセグメントのサイズの増加は、異常に長いバージョンのハンチンチンタンパク質の産生につながり、このタンパク質が切断されてより小さい毒性断片となり、これらの断片が互いに結合し、ニューロンに蓄積し、その結果、これらの細胞の正常な機能が妨げられる。脳内のある特定の領域におけるニューロンのこの機能障害および最終的な死が、HDの徴候および症状の根底にある。
SCA1では、CAGセグメントは、ATXN1遺伝子内での4~39回の正常なCAGリピートと見なされるものと比較して、変異体ATXN1遺伝子内では40回~80を超える回数、反復される。CAGセグメントのこの増加は、不良な3次元形状にフォールディングする、異常に長いバージョンのアタキシン-1タンパク質の産生につながる。タンパク質フォールディングのこの異常は、細胞核内でこのタンパク質を他のタンパク質とクラスター化させて集塊(凝集塊)を形成し、細胞損傷および最終的には細胞死に至る。CAGリピートの標的化および消失(または遮断)は、HDおよびSCA1の治療戦略である。
本明細書に開示される遺伝子治療用組成物は、CAGリピート病および/または障害を処置する方法で毒性CAGリピートの切断の改善をもたらす(図8A)。本開示の他の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子治療用組成物は、mRNA転写物を含有する毒性CAGリピートの発現を阻止する(図8B)。これらの遺伝子治療用組成物は、毒性CAGリピートRNAを特異的に標的とすることができ、HDおよびSCA1などの疾患に関連する疾患表現型の長期修復をもたらすことができる。これらの遺伝子治療用組成物はまた、毒性CAGリピートRNAの効率的切断または遮断をもたらす。CAG MREを標的とするこのような遺伝子治療用組成物は、組成物の成分がユニタリー(単一)ベクターに頼れるほど小さいサイズであるため、治療用の系の製造規模の調整に重要である。本明細書に開示される遺伝子治療用組成物は、非処置と比較して毒性CAGリピートのより有効なノックダウンまたは遮断を達成することができる。
CAGリピート病、例えばHDおよびSCA1、を処置するための、毒性CAGリピートRNAに結合することができるガイドされるまたはガイドされないRNA結合性の系をコードする核酸分子を含む組成物、およびそれを含むベクターが、本明細書に開示される。そのような組成物は、毒性CAGリピートをノックダウン/分解または遮断のどちらかの標的とすることができ、そのどちらかのために毒性CAGリピートに結合することができる。一部の態様では、CAGリピートRNAの遮断に好適な組成物は、CAGリピート含有RNAに結合し、CAGリピートRNAの翻訳を防止する。一部の態様では、この翻訳防止は、CAGリピート含有RNA配列からのタンパク質発現の低下を誘導する結果となる。これらの系は、RNAによりガイドされるRNase Cas、例えばCas13d、またはガイドされないPUF、PUMBYもしくはPPRタンパク質配置(configuration)を含む。
HDまたはSCA1を処置するための前述のまたは以降のRNA標的化組成物のいずれにおいても、特定のRNA標的化組成物の文脈で記載されるいずれかの特定の構築物エレメント(例えば、リンカー、プロモーター、シグナル配列など)を、同じエレメントタイプ(例えば、リンカー、プロモーター、シグナル配列など)の別のものの代わりに用いることができる。一部の実施形態では、いずれかの特定の構築物エレメント(例えば、タグ配列)を、削除または除去することができる。言い換えると、本明細書に記載されるいずれの特定の遺伝子治療用組成物におけるエレメントの例示的な組合せも、限定することを意図したものではない。
RNAを遮断の標的とする例示的な組成物
RNAを遮断の標的とする例示的な組成物
HTTまたはATXN1 mRNAにおける伸長されたCAG(CAGexp)リピートは、HTTまたはアタキシン-1のタンパク質凝集をもたらし、それに起因してそれらの機能が喪失される。PUF(CAG)またはdCas13d(CAG)は、CAGexp RNAに直接結合し、CAGexp RNAを遮断することになり、その結果、翻訳遮断/阻害部が隔離されることによって、最終的に、mHTTTまたはmATXN1などの変異型タンパク質のレベルが低下することになる。
CAGを遮断の標的とする例示的なPUFタンパク質組成物は、以下のものを含む:
mycタグを有する、CAGフレーム2を(遮断の)標的とするPUF
mycタグを有さない、CAGフレーム2を(遮断の)標的とするPUF
RNAによりガイドされるCAGリピートRNA結合性の系
mycタグを有する、CAGフレーム2を(遮断の)標的とするPUF
一部の実施形態では、RNAによりガイドされるRNA結合性の系は、RNase Casに基づくRNAによりガイドされるRNA結合性ポリペプチドである。一部の実施形態では、核酸配列は、RNase Casタンパク質(または不活性化RNase Casタンパク質)である、RNAによりガイドされるRNA結合性ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、核酸配列は、毒性標的CAGリピートRNAに結合するスペーサー配列と、RNase Casタンパク質に結合するダイレクトリピート(DR)配列とを含む、gRNA配列をさらに含む。
一実施形態では、Cas13d(CAG)系は、触媒として活性であり、この場合、Cas13d核タンパク質複合体は、毒性RNA CAGリピートを切断し、破壊する。別の実施形態では、Cas13d(CAG)系は、触媒として不活性であり、この場合、Cas13d核タンパク質複合体は、RNA CAGリピートに結合し、それを遮断する(切断しない)。さらに別の実施形態では、Cas13d(CAG)は、毒性RNA CAGリピートを切断することができるエンドヌクレアーゼと融合した、触媒として不活性なCas13d(CAG)を含む。そのような実施形態では、エンドヌクレアーゼは、活性RNaseである。RNase活性を有する例示的なエンドヌクレアーゼは、本明細書中で見つけることができ、これらは、例えば、ZC3H12Aジンクフィンガー(本明細書ではE17とも呼ばれる)またはPINエンドヌクレアーゼからのドメインを含む。
一実施形態では、RNase Casタンパク質は、Cas13タンパク質である。別の実施形態では、Cas13タンパク質は、Cas13dタンパク質である。別の実施形態では、Cas13dタンパク質は、不活性化RNase Cas13dタンパク質(dCas13d)である。別の実施形態では、dCas13dタンパク質は、1)dCas13dと、2)ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質またはその断片をコードするポリペプチドとを含む、融合タンパク質である。別の実施形態では、dCas13dタンパク質は、1)dCas13dと、2)ZC3H12A、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ、(本明細書ではE17とも呼ばれる)のヌクレアーゼドメインとを含む、融合タンパク質である。一部の実施形態では、Cas構成は、シグナル配列、例えば、NLSおよび/またはNESを含む。一部の実施形態では、dCas13dは、リンカー配列を介してE17に連結されている。一実施形態では、リンカー配列は、VDTANGS(配列番号411)である。一部の実施形態では、Cas13dまたはdCas13d融合タンパク質をコードする核酸配列は、少なくとも1つのプロモーター配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、プロモーター配列は、エンハンサーおよび/またはイントロンを含む。一部の実施形態では、プロモーター配列は、EFSプロモーター配列、tCAGプロモーター配列、EFS/UBBプロモーター配列、EFSプロモーター配列、またはシナプシン配列である(図3B、図3C、図20A、および図20B)。
一部の実施形態では、核酸配列は、Cas13dタンパク質またはCas13d融合タンパク質の発現を制御する第1のプロモーター配列、および少なくとも1つのガイドRNA配列の発現を制御する第2のプロモーター配列を含む。一部の実施形態では、Cas13dまたはdCas13d系は、伸長されたCAGリピートを標的とし、このCAGリピートは、CAG36であるかまたはそれより多い。一部の実施形態では、CAGリピートは、CAG80である。一部の態様では、CAG36またはCAG80は、HTTまたはATXN1遺伝子における36 CAGリピートまたは80 CAGリピートを指す。少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、90、95、100、105、110、115、120 CAGリピート、またはその間の任意の他のCAGリピート数を含む、任意の他の数のCAGリピートが可能である。
一部の実施形態では、本開示のCAGリピート標的化dCas13dタンパク質は、N末端からC末端へ、dCas13d(dSeq212)、リンカー、SV-40 NLS、リンカー、およびHAタグを含む。一部の実施形態では、本開示のdCas13dタンパク質は、N末端からC末端へ、dCas13d(dSeq212)、リンカー、SV-40 NLS、およびリンカーを含む。一部の態様では、本開示のCAGリピート標的化dCas13dタンパク質は、表Aで示される。一部の態様では、CAGリピート標的化dCas13dタンパク質は、CAGリピートRNA配列伸長を阻止する方法に使用される。
一部の実施形態では、本開示のCAGリピート標的化Cas13dまたはdCas13dタンパク質は、N末端からC末端へ、dCas13d(dSeq212)、リンカー、SV-40 NLS、リンカー、およびHAタグを含む。一部の実施形態では、本開示のdCas13dタンパク質は、N末端からC末端へ、dCas13d(dSeq212)、リンカー、およびSV-40 NLSを含む。一部の態様では、本開示のCAGリピート標的化dCas13dタンパク質は、表Bで示される。一部の態様では、CAGリピート標的化dCas13dタンパク質は、CAGリピートRNA配列伸長を阻止する方法に使用される。
一部の実施形態では、本開示のCAGリピート標的化dCas13dタンパク質は、N末端からC末端へ、dCas13d(dSeq212)、リンカー、SV-40 NLS、リンカー、およびHAタグを含む。一部の実施形態では、本開示のdCas13dタンパク質は、N末端からC末端へ、dCas13d(dSeq212)、リンカー、SV-40 NLS、およびリンカーを含む。一部の態様では、本開示のCAGリピート標的化dCas13dタンパク質は、表Cで示される。一部の態様では、CAGリピート標的化dCas13dタンパク質は、CAGリピートRNA配列伸長を阻止する方法に使用される。
表C: CAGリピート標的化dCas13dタンパク質
CAGリピート標的化dCas13dタンパク質
CAGリピート標的化dCas13dタンパク質
CAGリピート標的化dCas13dタンパク質
CAGリピート標的化dCas13dタンパク質
一部の実施形態では、本開示のCAGリピート標的化dCas13d融合タンパク質は、N末端からC末端へ、SV-40 NLS配列、dCas13d(dSeq212)配列、リンカー配列、SV-40 NLS、ZC3H12Aエンドヌクレアーゼ(E17)、リンカー配列、およびmycタグを含む。一部の実施形態では、本開示のCAGリピート標的化dCas13d融合タンパク質は、N末端からC末端へ、SV-40 NLS配列、dCas13d(dSeq212)配列、リンカー配列、SV-40 NLS、およびZC3H12Aエンドヌクレアーゼ(E17)を含む。一部の態様では、本開示のCAGリピート標的化dCas13dタンパク質は、表Dで示される。一部の態様では、CAGリピート標的化dCas13dタンパク質は、CAGリピートRNA配列に結合するおよびそれを切断する方法に使用される。
一部の実施形態では、本開示のCAGリピート標的化dCas13d融合タンパク質は、N末端からC末端へ、SV-40 NLS配列、リンカー配列、dCas13d(dSeq212)配列、リンカー配列、ZC3H12Aエンドヌクレアーゼ(E17)、リンカー配列、およびmycタグを含む。一部の実施形態では、本開示のCAGリピート標的化dCas13d融合タンパク質は、N末端からC末端へ、SV-40 NLS配列、リンカー配列、dCas13d(dSeq212)配列、リンカー配列、およびZC3H12Aエンドヌクレアーゼ(E17)を含む。一部の態様では、本開示のCAGリピート標的化dCas13dタンパク質は、表Eで示される。一部の態様では、CAGリピート標的化dCas13dタンパク質は、CAGリピートRNA配列に結合するおよびそれを切断する方法に使用される。
一部の実施形態では、本開示のCAGリピート標的化dCas13d融合タンパク質は、N末端からC末端へ、ZC3H12Aエンドヌクレアーゼ(E17)、リンカー配列、dCas13d(dSeq212)配列、リンカー配列、SV-40 NLS、リンカー配列、およびHAタグを含む。一部の実施形態では、本開示のCAGリピート標的化dCas13d融合タンパク質は、N末端からC末端へ、ZC3H12Aエンドヌクレアーゼ(E17)、リンカー配列、dCas13d(dSeq212)配列、リンカー配列、およびSV-40 NLSを含む。一部の態様では、本開示のCAGリピート標的化dCas13dタンパク質は、表Fで示される。一部の態様では、CAGリピート標的化dCas13dタンパク質は、CAGリピートRNA配列に結合するおよびそれを切断する方法に使用される。
ガイドされないCAGリピートRNA結合性の系
一部の実施形態では、CAG毒性リピートの標的化用のRNA結合性の系は、RNAによりガイドされるRNA結合性ポリペプチドを含まない。一部の実施形態では、RNA結合性の系は、RNAによりガイドされないRNA結合性ポリペプチドで構成される。一部の実施形態では、RNA結合性の系は、RNAによりガイドされないRNA結合性ポリペプチド、例えばPUFタンパク質もしくはPUMBYタンパク質、またはそのRNA結合性部分で構成されている。一実施形態では、本明細書に開示されるガイドされないRNA結合性融合タンパク質は、a)CAGCAGCA(配列番号453)またはGCAGCAGC(配列番号476)を含む毒性標的CAGリピートRNA配列に結合することができるPUFまたはPUMBY RNA結合性配列と、b)毒性標的CAGリピート配列を切断することができるエンドヌクレアーゼとを含む。標的CAGリピートフレーム1(図1のCAG-f1)は、CAGCAGCA(配列番号453)であり、標的CAGリピートフレーム2(図1のCAG-f2)は、GCAGCAGC(配列番号476)である。別の実施形態では、標的CAGリピートフレームは、AGCAGCAG(配列番号472)であるCAGリピートフレーム3である。
別の実施形態では、毒性標的RNA配列は、CAGCAGCAGCAGCA(配列番号454)、CAGCAGCAGCAGCAG(配列番号455)、CAGCAGCAGCAGCAGC(配列番号456)、GCAGCAGCAGCAGC(配列番号477)、GCAGCAGCAGCAGCA(配列番号478)、GCAGCAGCAGCAGCAG(配列番号479)、AGCAGCAGCAGCAG(配列番号473)、AGCAGCAGCAGCAGC(配列番号474)、およびAGCAGCAGCAGCAGCA(配列番号475)からなる群から選択される標的RNA配列を含む。
一実施形態では、PUFまたはPUMBY RNA結合性融合タンパク質は、a)PUFまたはPUMBY CAG標的化タンパク質と、b)ZC3H12A、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ、(本明細書ではE17とも呼ばれる)のヌクレアーゼドメインとを含む。一部の実施形態では、CAG標的化PUFまたはPUMBY融合タンパク質は、N末端からC末端への方向性で、以下のとおりに構成される:
PUF(CAG)-E17(ここで、PUF(CAG)は、CAG標的化PUFである);
E17-PUF(CAG);
PUMBY(CAG)-E17(ここで、PUMBY(CAG)は、CAG標的化PUMBYである);または
E17-PUMBY(CAG)。
一部の実施形態では、PUFまたはPUMBY融合構成は、PUF(CAG)またはPUMBY(CAG)とE17ヌクレアーゼドメインの間にリンカーを含む。一実施形態では、リンカー配列は、VDTANGS(配列番号411)である。
一部の実施形態では、リンカーを含む、CAG標的化PUFまたはPUMBY融合タンパク質は、N末端からC末端へ、以下のとおりに構成される:
PUF(CAG)-リンカー-E17
E17-リンカー-PUF(CAG)
PUMBY(CAG)-リンカー-E17;または
E17-リンカー-PUMBY(CAG)。
一実施形態では、CAG標的化PUFまたはPUMBY融合タンパク質構成は、N末端からC末端へ、PUF(CAG)-VDTANGS-E17またはPUMBY(CAG)-VDTANGS-E17という配向である。別の実施形態では、CAG標的化PUFまたはPUMBY融合タンパク質構成は、N末端からC末端へ、E17-VDTANGS-PUF(CAG)またはE17-VDTANGS-PUMBY(CAG)という配向である。
一部の実施形態では、PUFまたはPUMBY構成は、1つまたは複数のシグナル配列および/またはタグ、例えば、FLAG、NLS、NESまたはこれらの組合せを含む。一実施形態では、FLAGタグ配列は、DYKDDDDK(配列番号436)である。一実施形態では、NLSは、ヒトNLSである。別の実施形態では、ヒトNLSは、ヒトpRB-NLS:KRSAEGSNPPKPLKKLR(配列番号442)またはヒトRB-NLS(延長バージョン):DRVLKRSAEGSNPPKPLKKLR(配列番号543)である。
一実施形態では、構成は、2つの異なるタグおよび/またはシグナル配列を含む。別の実施形態では、構成は、2つまたはそれより多くのシグナル配列を含む。一部の実施形態では、シグナルは、N末端に位置する。一部の実施形態では、シグナルは、C末端に位置する。一部の実施形態では、あるシグナルは、N末端に位置し、あるシグナルは、C末端に位置する。一実施形態では、1つまたは複数のシグナルおよび/またはタグを含む、CAG標的化PUFまたはPUMBY融合タンパク質は、N末端からC末端へ、以下のとおりに構成される:
FLAG-NLS-PUF(CAG)-リンカー-E17;
FLAG-NLS-PUMBY(CAG)-リンカー-E17;
NLS-PUF(CAG)-リンカー-E17;または
NLS-PUMBY(CAG)-リンカー-E17。
一実施形態では、1つまたは複数のタグを含む、CAG標的化PUFまたはPUMBY融合タンパク質は、N末端からC末端へ、以下のとおりに構成される:
FLAG-NLS-PUF(CAG)-VDTANGS-E17;
FLAG-NLS-PUMBY(CAG)-VDTANGS-E17;
NLS-PUF(CAG)-VDTANGS-E17;または
NLS-PUMBY(CAG)-VDTANGS-E17
NLS-PUF(CAG)-VDTANGS-E17-NES。
一実施形態では、PUF(CAG)またはPUMBY(CAG)融合構築物は、伸長されたCAGリピートを標的とし、これらのCAGリピートは、CAG36であるかまたはそれより多い。別の実施形態では、CAGリピートは、CAG80である。一部の態様では、CAG36またはCAG80は、HTTまたはSCA1遺伝子における36 CAGリピートまたは80 CAGリピートを指す。少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、90、95、100、105、110、115、120 CAGリピート、またはその間の任意の他のCAGリピート数を含む、任意の他の数のCAGリピートが可能である。
一実施形態では、PUF(CAG)またはPUMBY(CAG)タンパク質または融合構築物をコードする核酸配列は、細胞における発現のためにプロモーター配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、プロモーター配列は、短縮化CAG(tCAG)プロモーターである(図3A)。一部の実施形態では、プロモーター配列は、エンハンサー配列および/またはイントロン配列を含む。一実施形態では、プロモーターは、EFS/UBBプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーター配列は、ニューロン特異的プロモーターである。
一実施形態では、Cas13d(CAG)またはdCas13d(CAG)(エンドヌクレアーゼを有するまたは有さないdCas13d(CAG))をコードする核酸は、細胞における発現のためにプロモーター配列に作動可能に連結されている(図3A~3Cおよび図18A~18B)。一実施形態では、プロモーター配列は、EFSプロモーターである(図3Cまたは図18A~18B)。一実施形態では、プロモーターは、EFS/UBBプロモーターである(図18A~18B)。一実施形態では、プロモーターは、シナプシンプロモーターである(図18A~18B)。一部の実施形態では、プロモーター配列は、エンハンサー配列および/またはイントロン配列を含む。一部の実施形態では、プロモーター配列は、ニューロン特異的プロモーターである。
別の実施形態では、PUF(CAG)またはPUMBY(CAG)またはCas13d(CAG)またはdCas13d(CAG)構成は、AAVベクター内にパッケージングされる。一実施形態では、AAVベクターは、AAV9ベクターである。別の実施形態では、AAVベクターは、AAVrh74ベクターである。
別の実施形態では、PUF(CAG)またはPUMBY(CAG)構成は、AAVベクター内にパッケージングされる。一実施形態では、AAVベクターは、AAV9またはAAVrh10ベクターである。
RNAによりガイドされるRNA結合性タンパク質のためのガイドRNA
RNAによりガイドされるRNA結合性タンパク質のためのガイドRNA
ガイドRNA(gRNA)という用語と単一ガイドRNA(sgRNA)という用語は、本開示全体を通して互換的に使用される。
本開示のガイドRNA(gRNA)は、スペーサー配列および「ダイレクトリピート」(DR)配列で構成され得る。一部の実施形態では、ガイドRNAは、連続したスペーサー配列およびDR配列を含む、単一ガイドRNA(sgRNA)である。一部の実施形態では、スペーサー配列とDR配列は連続していない。一部の実施形態では、gRNAは、DR配列を含む。DR配列は、スペーサー配列が散在する、CRISPR遺伝子座(細菌ゲノムまたはプラスミドに天然に存在する)内の反復配列を指す。関連するCRISPR遺伝子座の配列が分かっている場合には、対応する(または同族の)Casタンパク質のDR配列を推測することができることは周知である。一部の実施形態では、ガイドRNAは、ダイレクトリピート(DR)配列およびスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、本開示のガイドRNAまたは単一ガイドRNAをコードする配列は、リンカー配列によって分離されているスペーサー配列とDR配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、リンカー配列は、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個またはその間の任意の数のヌクレオチド(nt)を含み得るまたはそれからなり得る。一部の実施形態では、リンカー配列は、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個またはその間の任意の数のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、DR配列は、Cas13d DR配列である。
一実施形態では、Cas13d媒介様式で1つまたは複数の標的RNA分子とハイブリダイズするgRNAは、1つまたは複数のダイレクトリピート(DR)配列、1つまたは複数のスペーサー配列、例えば、DR-スペーサー-DR-スペーサーのアレイを含む1つまたは複数の配列などを含む。一実施形態では、各gRNAが異なり得る、例えば、異なるRNA、または単一のRNAからの複数の標的領域、またはこれらの組合せを標的とし得る、複数のgRNAが、単一のアレイから生成される。一部の実施形態では、単離されたgRNAは、1つまたは複数のダイレクトリピート配列、例えば、プロセシングされていない(例えば、約36nt)またはプロセシングされたDR(例えば、約30nt)を含む。一部の実施形態では、gRNAは、標的RNAに対して特異的な1つまたは複数のスペーサー配列をさらに含み得る(例えば、標的RNAと相補的である)。ある特定のそのような実施形態では、複数のpolIIIプロモーターを使用して、複数のgRNA、スペーサーおよび/またはDRを駆動することができる。一実施形態では、ガイドアレイは、DR(約36nt)-スペーサー(約30nt)-DR(約36nt)-スペーサー(約30nt)を含む。
本開示のガイドRNA(gRNA)は、天然に存在しないヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、本開示のガイドRNA、またはガイドRNAをコードする配列は、改変または合成されたRNAヌクレオチドを含むまたはそれからなる。例示的な改変されたRNAヌクレオチドとしては、これだけに限定されないが、プソイドウリジン(Ψ)、ジヒドロウリジン(D)、イノシン(I)、および7-メチルグアノシン(m7G)、ヒポキサンチン、キサンチン、キサントシン、7-メチルグアニン、5、6-ジヒドロウラシル、5-メチルシトシン、5-メチルシチジン、5-ヒドロキシメチルシトシン(hydropxymethylcytosine)、イソグアニン、およびイソシトシンが挙げられる。
本開示のガイドRNA(gRNA)は、標的配列内の改変されたRNAに結合し得る。本開示のガイドRNA(gRNA)は、標的配列内の改変されたまたは変異型(例えば、病原性)RNAに結合し得る。例示的なエピジェネティック的にまたは転写後に改変されたRNAとしては、これだけに限定されないが、2’-O-メチル化(2’-OMe)(2’-O-メチル化がリボース部分の遊離の2’-OHの酸素に存在する)、N6-メチルアデノシン(m6A)、および5-メチルシトシン(m5C)が挙げられる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のガイドRNAは、非コードC/Dボックス核小体低分子RNA(snoRNA)配列をコードする少なくとも1つの配列を含む。一部の実施形態では、snoRNA配列は、標的RNAと相補的である少なくとも1つの配列を含み、ここで、RNA分子の標的配列は、少なくとも1つの2’-OMeを含む。一部の実施形態では、snoRNA配列は、標的RNAと相補的である少なくとも1つの配列を含み、ここで、標的RNAと相補的である少なくとも1つの配列は、ボックスCモチーフ(RUGAUGA)およびボックスDモチーフ(CUGA)を含む。
本開示のスペーサー配列は、RNA分子の標的配列に結合する。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、病原性標的RNAに結合する。
本開示の組成物の一部の実施形態では、gRNAを含む配列は、標的RNA配列に特異的に結合するスペーサー配列をさらに含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的RNA配列に対して少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、87%、90%、95%、97%、99%、またはその間の任意のパーセンテージ相補性を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的RNA配列に対して100%の相補性を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、20個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、21個のヌクレオチド、22個のヌクレオチド、23個のヌクレオチド、24個のヌクレオチド、25個のヌクレオチド、26個のヌクレオチド、27個のヌクレオチド、28個のヌクレオチド、または29個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、26個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、プロセシングされておらず、30個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、プロセシングされていないスペーサー配列は、30~36個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。
本開示のDR配列は、本開示のCasポリペプチドに結合する。gRNAのスペーサー配列が標的RNA配列に結合すると、gRNAのDR配列に結合しているCasタンパク質は、標的RNA配列に配置される。その同族Casタンパク質またはその核酸に対して十分な相補性を有するDR配列は、Casタンパク質の標的核酸配列に選択的に結合し、その配列に対して少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96、97%、98%、99%、またはその間の任意のパーセンテージ同一性を有する。一部の実施形態では、十分な相補性を有する配列は、100%の同一性を有する。一部の実施形態では、本開示のDR配列は、二次構造または三次構造を含む。例示的な二次構造としては、これだけに限定されないが、へリックス、ステムループ、バルジ、テトラループおよびシュードノットが挙げられる。例示的な三次構造としては、これだけに限定されないが、A形態のへリックス、B形態のへリックス、およびZ形態のへリックスが挙げられる。例示的な三次構造としては、これだけに限定されないが、ねじれたまたはらせん状になったステムループが挙げられる。例示的な三次構造としては、これだけに限定されないが、ねじれたまたはらせん状になったシュードノットが挙げられる。一部の実施形態では、本開示のDR配列は、少なくとも1つの二次構造または少なくとも1つの三次構造を含む。一部の実施形態では、本開示のDR配列は、1つもしくは複数の二次構造または1つもしくは複数の三次構造を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドRNAまたはその一部は、本開示のRNA分子内のテトラループモチーフに選択的に結合する。一部の実施形態では、RNA分子の標的配列は、テトラループモチーフを含む。一部の実施形態では、テトラループモチーフは、GAAA、GUGA、GCAAまたはGAGAである配列の1つまたは複数を含むまたはそれからなる「GRNA」モチーフである。
本開示の組成物の一部の実施形態では、RNA分子の標的配列に結合するガイドRNAまたはその一部は、RNA分子の標的配列とハイブリダイズする。一部の実施形態では、第1のRNA結合性タンパク質または第2のRNA結合性タンパク質に結合するガイドRNAまたはその一部は、第1のRNA結合性タンパク質または第2のRNA結合性タンパク質に共有結合により結合する。一部の実施形態では、第1のRNA結合性タンパク質または第2のRNA結合性タンパク質に結合するガイドRNAまたはその一部は、第1のRNA結合性タンパク質または第2のRNA結合性タンパク質に非共有結合により結合する。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドRNAまたはその一部は、終点を含めて、10個から100個の間のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、終点を含めて、10個から30個の間のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個または30個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、20個のヌクレオチドを含むまたはそれらからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、21個のヌクレオチドを含むまたはそれらからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、26個のヌクレオチドを含むまたはそれらからなる。
ガイド分子は、一般に、種々のプロセシング状態で存在する。一例では、プロセシングされていないガイドRNAは、36ntのDRであり、これに30~32ntのスペーサーが続く。ガイドRNAは、Cas13d自体または他のRNaseによって、より短い「成熟」形態へとプロセシング(短縮化/改変)される。一部の実施形態では、プロセシングされていないガイド配列は、長さ約または少なくとも約30、35、40、45、50、55、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、またはそれを超えるヌクレオチド(nt)である。一部の実施形態では、プロセシングされたガイド配列は、約44~60nt(例えば、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、または70nt)である。一部の実施形態では、プロセシングされていないスペーサーは、約28~32nt長(例えば、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、または35nt)であるが、成熟(プロセシングされた)スペーサーは、約10~30nt、10~25nt、14~25nt、20~22nt、または14~30nt(例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、または35nt)であり得る。一部の実施形態では、プロセシングされていないDRは、約36nt(例えば、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、または41nt)であるが、プロセシングされたDRは、約30nt(例えば、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、または35nt)である。一部の実施形態では、DR配列は、例えば5’末端で、1~10ヌクレオチド(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、~10ヌクレオチド)短縮化されて、成熟した予めプロセシングされたガイドRNAとして発現される。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドRNAまたはその一部は、核局在化配列(NLS)を含まない。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドRNAまたはその一部は、プロトスペーサーフランキング配列(PFS)と相補的な配列を含む。一部の実施形態では、ガイドRNAまたはその一部がPFSと相補的な配列を含むものを含め、第1のRNA結合性タンパク質は、Cas13タンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含み得る。一部の実施形態では、ガイドRNAまたはその一部がPFSと相補的な配列を含むものを含め、第1のRNA結合性タンパク質は、Cas13タンパク質またはそのRNA結合性部分をコードする配列を含み得る。一部の実施形態では、ガイドRNAまたはその一部は、PFSと相補的な配列を含まない。
本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のガイドRNA配列を含むベクターは、ガイドRNAの発現を駆動するためのプロモーター配列を含む。一部の実施形態では、本開示のガイドRNA配列を含むベクターは、ガイドRNAの発現を駆動するためのプロモーター配列を含む。一部の実施形態では、ガイドRNAの発現を駆動するためのプロモーターは、構成的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーター配列は、誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーター配列(the promoter is a sequence)は、組織特異的かつ/または細胞型特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ハイブリッドまたは組換えプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ガイドRNAを哺乳動物細胞において発現させることができるプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ガイドRNAをヒト細胞において発現させることができるプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ガイドRNAを発現させ、ガイドRNAを細胞の核に制限することができるプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトRNAポリメラーゼプロモーターまたはヒトRNAポリメラーゼプロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列である。一部の実施形態では、プロモーターは、U6プロモーターまたはU6プロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列である。一部の実施形態では、U6プロモーターは、ヒトU6プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトtRNAプロモーターまたはヒトtRNAプロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列である。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトバリンtRNAプロモーターまたはヒトバリンtRNAプロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列である。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドRNAの発現を駆動するためのプロモーターは、調節エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、ガイドRNAの発現を駆動するためのプロモーター配列を含むベクターは、調節エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、調節エレメントは、ガイドRNAの発現を増強するものである。例示的な調節エレメントとしては、これだけに限定されないが、エンハンサーエレメント、イントロン、エクソン、またはこれらの組合せが挙げられる。本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のベクターは、ガイドRNAをコードする配列、ガイドRNAの発現を駆動するためのプロモーター配列および調節エレメントをコードする配列のうちの1つまたは複数を含む。本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターは、本開示の融合タンパク質をコードする配列をさらに含む。
RNAによりガイドされるRNA結合性タンパク質
RNAによりガイドされるRNA結合性タンパク質
本開示の組成物の一部の実施形態では、gRNAは、標的RNA分子、およびRNAによりガイドされるRNA結合性タンパク質に対応する。一部の実施形態では、gRNAは、RNAによりガイドされるRNA結合性融合タンパク質に対応し、この融合タンパク質は、第1および第2のRNA結合性タンパク質を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質中の第1のRNA結合性タンパク質は、不活性化RNA結合性タンパク質、例えば、不活性化Casまたは触媒的に失活しているCasタンパク質である。一部の実施形態では、RNA結合性融合タンパク質をコードする配列に沿って、第1のRNA結合性タンパク質をコードする配列は、第2のRNA結合性タンパク質をコードする配列に対して5’側に位置する。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする配列に沿って、第1のRNA結合性タンパク質をコードする配列は、第2のRNA結合性タンパク質をコードする配列に対して3’側に位置する。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第1のRNA結合性タンパク質をコードする配列は、RNA分子に結合することができるタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第1のRNA結合性タンパク質をコードする配列は、RNA分子に選択的に結合することができ、DNA分子には結合しない、哺乳動物DNA分子には結合しない、またはいかなるDNA分子にも結合しないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第1のRNA結合性タンパク質をコードする配列は、RNA分子に結合し、RNA分子の破壊(break)を誘導することができるタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第1のRNA結合性タンパク質をコードする配列は、RNA分子に結合し、RNA分子の破壊を誘導することができ、DNA分子には結合しない、哺乳動物DNA分子には結合しない、またはいかなるDNA分子にも結合しないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第1のRNA結合性タンパク質をコードする配列は、RNA分子に結合し、RNA分子の破壊を誘導することができ、DNA分子には結合せず、その破壊も誘導しない、哺乳動物DNA分子には結合せず、その破壊も誘導しない、または、いかなるDNA分子にも結合せず、その破壊も誘導しないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第1のRNAによりガイドされるRNA結合性タンパク質をコードする配列は、DNAヌクレアーゼ活性を有さないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるRNAによりガイドされるRNA結合性タンパク質をコードする配列は、CRISPR Casタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、CRISPR Casタンパク質は、II型CRISPR Casタンパク質ではない。一部の実施形態では、CRISPR Casタンパク質は、Cas9タンパク質ではない。
本開示の組成物の一部の実施形態では、RNAによりガイドされるRNA結合性タンパク質をコードする配列は、VI型CRISPR Casタンパク質またはその一部を含む。一部の実施形態では、VI型CRISPR Casタンパク質は、Cas13タンパク質またはその一部を含む。本開示の例示的なCas13タンパク質は、これだけに限定されないが、細菌または古細菌を含めた、任意の種から単離し得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なCas13タンパク質は、これだけに限定されないが、Leptotrichia wadei、Listeria seeligeri serovar 1/2b(strain ATCC 35967/DSM 20751/CIP 100100/SLCC 3954)、Lachnospiraceae bacterium、Clostridium aminophilum DSM 10710、Carnobacterium gallinarum DSM 4847、Paludibacter propionicigenes WB4、Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317、Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317、bacterium FSL M6-0635(Listeria newyorkensis)、Leptotrichia wadei F0279、Rhodobacter capsulatus SB 1003、Rhodobacter capsulatus R121、Rhodobacter capsulatus DE442およびCorynebacterium ulceransを含めた、任意の種から単離し得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なCas13タンパク質は、DNAヌクレアーゼが不活化されたものであり得る。本開示の例示的なCas13タンパク質としては、これだけに限定されないが、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13dおよびそれらのオルソログが挙げられる。本開示の例示的なCas13bタンパク質としては、これだけに限定されないが、本明細書ではそれぞれCsx27およびCsx28と称される亜型1および2が挙げられる。
本開示の例示的な野生型Cas13aタンパク質は、配列番号408のアミノ酸配列を含み得るまたはそれからなり得る。
本開示の例示的な野生型Bergeyella zoohelcum ATCC 43767 Cas13b(BzCas13b)タンパク質は、配列番号409のアミノ酸配列を含み得るまたはそれからなり得る。
本開示の組成物の一部の実施形態では、RNA結合性タンパク質をコードする配列は、Cas13dタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。Cas13dは、VI-D型CRISPR-Cas系のエフェクターである。一部の実施形態では、Cas13dタンパク質は、RNAを切る(cut)またはそれに結合することができる、RNAによりガイドされるRNAエンドヌクレアーゼ酵素である。一部の実施形態では、Cas13dタンパク質は、1つまたは複数の高等真核生物および原核生物ヌクレオチド結合性(HEPN)ドメインを含み得る。一部の実施形態では、Cas13dタンパク質は、野生型HEPNドメインまたは変異型HEPNドメインのいずれかを含み得る。一部の実施形態では、Cas13dタンパク質は、RNAを切ることはできないが、ガイドRNAをプロセシングすることができる変異型HEPNドメインを含む。一部の実施形態では、Cas13dタンパク質は、プロトスペーサーフランキング配列を必要としない。Cas13dタンパク質のさらなる例および配列について、限定することなく、その全体が参照により本明細書に組み込まれるWO公開第WO2019/040664号およびUS2019/0062724も参照されたい。
一部の実施形態では、本開示のCas13d配列は、限定することなく、WO2019/040664の配列番号1~296を含み、本明細書においてもそのように番号が付けられ、これをもって含まれる。
配列番号1は、HEPN部位を含有する、Eubacterium siraeumからの例示的なCas13d配列である。
配列番号2は、変異型HEPN部位を含有する、Eubacterium siraeumからの例示的なCas13d配列である。
配列番号3は、HEPN部位を含有する、未培養Ruminococcus sp.からの例示的なCas13d配列である。
配列番号4は、変異型HEPN部位を含有する、未培養Ruminococcus sp.からの例示的なCas13d配列である。
配列番号5は、Gut_metagenome_contig2791000549からの例示的なCas13d配列である。
配列番号6は、Gut_metagenome_contig855000317からの例示的なCas13d配列である。
配列番号7は、Gut_metagenome_contig3389000027からの例示的なCas13d配列である。
配列番号8は、Gut_metagenome_contig8061000170からの例示的なCas13d配列である。
配列番号9は、Gut_metagenome_contigl509000299からの例示的なCas13d配列である。
配列番号10は、Gut_metagenome_contig9549000591からの例示的なCas13d配列である。
配列番号11は、Gut_metagenome_contig71000500からの例示的なCas13d配列である。
配列番号12は、ヒト胃メタゲノムからの例示的なCas13d配列である。
配列番号13は、Gut_metagenome_contig3915000357からの例示的なCas13d配列である。
配列番号14は、Gut_metagenome_contig4719000173からの例示的なCas13d配列である。
配列番号15は、Gut_metagenome_contig6929000468からの例示的なCas13d配列である。
配列番号16は、Gut_metagenome_contig7367000486からの例示的なCas13d配列である。
配列番号17は、Gut_metagenome_contig7930000403からの例示的なCas13d配列である。
配列番号18は、Gut_metagenome_contig993000527からの例示的なCas13d配列である。
配列番号19は、Gut_metagenome_contig6552000639からの例示的なCas13d配列である。
配列番号20は、Gut_metagenome_contigll932000246からの例示的なCas13d配列である。
配列番号21は、Gut_metagenome_contigl2963000286からの例示的なCas13d配列である。
配列番号22は、Gut_metagenome_contig2952000470からの例示的なCas13d配列である。
配列番号23は、Gut_metagenome_contig451000394からの例示的なCas13d配列である。
配列番号24は、Eubacterium_siraeum_DSM_l5702からの例示的なCas13d配列である。
配列番号25は、gut_metagenome_P19E0k2120140920,_c369000003からの例示的なCas13d配列である。
配列番号26は、Gut_metagenome_contig7593000362からの例示的なCas13d配列である。
配列番号27は、Gut_metagenome_contigl2619000055からの例示的なCas13d配列である。
配列番号28は、Gut_metagenome_contigl405000151からの例示的なCas13d配列である。
配列番号29は、Chicken_gut_metagenome_c298474からの例示的なCas13d配列である。
配列番号30は、Gut_metagenome_contigl516000227からの例示的なCas13d配列である。
配列番号31は、Gut_metagenome_contigl838000319からの例示的なCas13d配列である。
配列番号32は、Gut_metagenome_contig13123000268からの例示的なCas13d配列である。
配列番号33は、Gut_metagenome_contig5294000434からの例示的なCas13d配列である。
配列番号34は、Gut_metagenome_contig6415000192からの例示的なCas13d配列である。
配列番号35は、Gut_metagenome_contig6144000300からの例示的なCas13d配列である。
配列番号36は、Gut_metagenome_contig9118000041からの例示的なCas13d配列である。
配列番号37は、Activated_sludge_metagenome_transcript_124486からの例示的なCas13d配列である。
配列番号38は、Gut_metagenome_contig1322000437からの例示的なCas13d配列である。
配列番号39は、Gut_metagenome_contig4582000531からの例示的なCas13d配列である。
配列番号40は、Gut_metagenome_contig9190000283からの例示的なCas13d配列である。
配列番号41は、Gut_metagenome_contigl709000510からの例示的なCas13d配列である。
配列番号42は、HEPNドメインを有するM24_(LSQX01212483_Anaerobic_digester_metagenome)からの例示的なCas13d配列である。
配列番号43は、Gut_metagenome_contig3833000494からの例示的なCas13d配列である。
配列番号44は、Activated_sludge_metagenome_transcript_117355からの例示的なCas13d配列である。
配列番号45は、Gut_metagenome_contigll061000330からの例示的なCas13d配列である。
配列番号46は、ヒツジ胃メタゲノムからのGut_metagenome_contig338000322からの例示的なCas13d配列である。
配列番号47は、ヒト胃メタゲノムからの例示的なCas13d配列である。
配列番号48は、Gut_metagenome_contig9530000097からの例示的なCas13d配列である。
配列番号49は、Gut_metagenome_contigl750000258からの例示的なCas13d配列である。
配列番号50は、Gut_metagenome_contig5377000274からの例示的なCas13d配列である。
配列番号51は、gut_metagenome_P19E0k2120140920_c248000089からの例示的なCas13d配列である。
配列番号52は、Gut_metagenome_contigll400000031からの例示的なCas13d配列である。
配列番号53は、Gut_metagenome_contig7940000191からの例示的なCas13d配列である。
配列番号54は、Gut_metagenome_contig6049000251からの例示的なCas13d配列である。
配列番号55は、Gut_metagenome_contigl137000500からの例示的なCas13d配列である。
配列番号56は、Gut_metagenome_contig9368000105からの例示的なCas13d配列である。
配列番号57は、Gut_metagenome_contig546000275からの例示的なCas13d配列である。
配列番号58は、Gut_metagenome_contig7216000573からの例示的なCas13d配列である。
配列番号59は、Gut_metagenome_contig4806000409からの例示的なCas13d配列である。
配列番号60は、Gut_metagenome_contigl0762000480からの例示的なCas13d配列である。
配列番号61は、Gut_metagenome_contig4114000374からの例示的なCas13d配列である。
配列番号62は、Ruminococcus_flavefaciens_FD1からの例示的なCas13d配列である。
配列番号63は、Gut_metagenome_contig7093000170からの例示的なCas13d配列である。
配列番号64は、Gut_metagenome_contigl1113000384からの例示的なCas13d配列である。
配列番号65は、Gut_metagenome_contig6403000259からの例示的なCas13d配列である。
配列番号66は、Gut_metagenome_contig6193000124からの例示的なCas13d配列である。
配列番号67は、Gut_metagenome_contig721000619からの例示的なCas13d配列である。
配列番号68は、Gut_metagenome_contigl666000270からの例示的なCas13d配列である。
配列番号69は、Gut_metagenome_contig2002000411からの例示的なCas13d配列である。
配列番号70は、Ruminococcus_albusからの例示的なCas13d配列である。
配列番号71は、Gut_metagenome_contig13552000311からの例示的なCas13d配列である。
配列番号72は、Gut_metagenome_contigl0037000527からの例示的なCas13d配列である。
配列番号73は、Gut_metagenome_contig238000329からの例示的なCas13d配列である。
配列番号74は、Gut_metagenome_contig2643000492からの例示的なCas13d配列である。
配列番号75は、Gut_metagenome_contig874000057からの例示的なCas13d配列である。
配列番号76は、Gut_metagenome_contig4781000489からの例示的なCas13d配列である。
配列番号77は、Gut_metagenome_contigl2144000352からの例示的なCas13d配列である。
配列番号78は、Gut_metagenome_contig5590000448からの例示的なCas13d配列である。
配列番号79は、Gut_metagenome_contig9269000031からの例示的なCas13d配列である。
配列番号80は、Gut_metagenome_contig8537000520からの例示的なCas13d配列である。
配列番号81は、Gut_metagenome_contigl845000130からの例示的なCas13d配列である。
配列番号82は、gut_metagenome_P13E0k2l20140920_c3000072からの例示的なCas13d配列である。
配列番号83は、gut_metagenome_P1 E0k2l20140920 _c I000078からの例示的なCas13d配列である。
配列番号84は、Gut_metagenome_contigl2990000099からの例示的なCas13d配列である。
配列番号85は、Gut_metagenome_contig525000349からの例示的なCas13d配列である。
配列番号86は、Gut_metagenome_contig7229000302からの例示的なCas13d配列である。
配列番号87は、Gut_metagenome_contig3227000343からの例示的なCas13d配列である。
配列番号88は、Gut_metagenome_contig7030000469からの例示的なCas13d配列である。
配列番号89は、Gut_metagenome_contig5149000068からの例示的なCas13d配列である。
配列番号90は、Gut_metagenome_contig400200045からの例示的なCas13d配列である。
配列番号91は、Gut_metagenome_contigl0420000446からの例示的なCas13d配列である。
配列番号92は、new_flavefaciens_strain_XPD3002 (CasRx)からの例示的なCas13d配列である。
配列番号93は、M26_Gut_metagenome_contig698000307からの例示的なCas13d配列である。
配列番号94は、M36_Uncultured_ Eubacterium_sp_TS28_c40956からの例示的なCas13d配列である。
配列番号95は、M12_gut_metagenome_P25C0k2l20140920 _c134000066からの例示的なCas13d配列である。
配列番号96は、ヒト胃メタゲノムからの例示的なCas13d配列である。
配列番号97は、MlO_gut_metagenome _P25C90k2120 l 40920_c28000041からの例示的なCas13d配列である。
配列番号98は、30 Ml I_gut_metagenome_P25C7k2120140920_c4078000105からの例示的なCas13d配列である。
配列番号99は、gut_metagenome_P25C0k2120l40920_c32000045からの例示的なCas13d配列である。
配列番号100は、M13_gut_metagenome _P23C7k2l20140920 _c3000067からの例示的なCas13d配列である。
配列番号101は、M5_gut_metagenome_Pl8E90k2120140920からの例示的なCas13d配列である。
配列番号102は、M2l_gut_metagenome_Pl8E0k2120140920からの例示的なCas13d配列である。
配列番号103は、M7_gut_metagenome _P38C7k2120 l 40920_c484 l 000003からの例示的なCas13d配列である。
配列番号104は、Ruminococcus_bicirculansからの例示的なCas13d配列である。
配列番号105は、例示的なCas13d配列である。
配列番号106は、例示的なCas13dコンセンサス配列である。
配列番号107は、M18_gut_metagenome _P22EOk2l20140920_c3395000078からの例示的なCas13d配列である。
配列番号108は、M17_gut_metagenome_P22E90k2120140920_c114からの例示的なCas13d配列である。
配列番号109は、Ruminococcus_sp_CAG57からの例示的なCas13d配列である。
配列番号110は、gut_metagenome_Pl 1E90k2120 l 40920_c43000123からの例示的なCas13d配列である。
配列番号111は、M6_gut_metagenome_P13E90k2120 l 40920_c7000009からの例示的なCas13d配列である。
配列番号112は、Ml9_gut_metagenome_Pl 7E90k2120140920からの例示的なCas13d配列である。
配列番号113は、gut_metagenome_Pl7E0k2120l40920,_c87000043からの例示的なCas13d配列である。
配列番号114は、例示的なヒトコドン最適化Eubacterium siraeum Cas13d核酸配列である。
配列番号115は、変異体HEPNドメインを有する例示的なヒトコドン最適化Eubacterium siraeum Cas13d核酸配列である。
配列番号116は、N末端NLSを有する例示的なヒトコドン最適化Eubacterium siraeum Cas13d核酸配列である。
配列番号117は、NおよびC末端NLSタグを有する例示的なヒトコドン最適化Eubacterium siraeum Cas13d核酸配列である。
配列番号118は、例示的なヒトコドン最適化非培養Ruminococcus sp. Cas13d 30核酸配列である。
配列番号119は、変異体HEPNドメインを有する例示的なヒトコドン最適化非培養Ruminococcus sp. Cas13d核酸配列である。
配列番号120は、N末端NLSを有する例示的なヒトコドン最適化非培養Ruminococcus sp. Cas13d核酸配列である。
配列番号121は、NおよびC末端NLSタグを有する例示的なヒトコドン最適化非培養Ruminococcus sp. Cas13d核酸配列である。
配列番号122は、例示的なヒトコドン最適化非培養Ruminococcus flavefaciens FDl Cas13d核酸配列である。
配列番号123は、変異型HEPNドメインを有する例示的なヒトコドン最適化非培養Ruminococcus flavefaciens FDl Casl3d核酸配列である。
配列番号124は、Ruminococcus bicirculansからの例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号125は、Eubacterium siraeumからの例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号126は、Ruminococcus flavefaciens FD1からの例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号127は、Ruminococcus albusからの例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号128は、Ruminococcus flavefaciens XPDからの例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号129は、E. siraeum Cas13dについての例示的なコンセンサスDR核酸配列である。
配列番号130は、Rum. Sp. Cas13dについての例示的なコンセンサスDR核酸配列である。
配列番号131は、Rum. Flavefaciens strain XPD3002 Cas13d(CasRx)についての例示的なコンセンサスDR核酸配列である。
配列番号132~137は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である。
配列番号138は、7つの全長Cas13dオルソログの例示的な50%コンセンサス配列である。
配列番号139は、腸内メタゲノムPlEOからの例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号140は、Anaerobic digesterからの例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号141は、Ruminococcus sp.CAG:57からの例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号142は、例示的なヒトコドン最適化未培養腸内メタゲノムPlEO Cas13d核酸配列である。
配列番号143は、例示的なヒトコドン最適化Anaerobic Digester Cas13d核酸配列である。
配列番号144は、例示的なヒトコドン最適化Ruminococcus flavefaciens XPD Cas13d核酸配列である。
配列番号145は、例示的なヒトコドン最適化Ruminococcus albus Cas13d核酸配列である。
配列番号146は、Ruminococcus sp.CAG:57 CRISPRアレイの例示的プロセシングである。
配列番号147は、コンティグemb|OBVH01003037.1、ヒト腸内メタゲノム配列(WGSコンティグemb|OBXZ01000094.1|およびemb|OBJFO1000033.1にも見いだされる)からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号148は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号147と組みになる)。
配列番号149は、コンティグtpg|DBYI01000091.1|(ウシ腸内メタゲノムからアセンブルした未培養Ruminococcus flavefaciens UBA1190)からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号150~152は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号149と組みになる)。
配列番号153は、コンティグtpg|DJXD01000002.1|(ヒツジ腸内メタゲノムからの未培養Ruminococcusアセンブリ、UBA7013)からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号154は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号153と組みになる)。
配列番号155は、コンティグOGZC01000639.1(ヒト腸内メタゲノムアセンブリ)からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号156~177は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号155と組みになる)。
配列番号158は、コンティグemb|OHBM01000764.1(ヒト腸内メタゲノムアセンブリ)からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号159は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号158と組みになる)。
配列番号160は、コンティグemb|0HCP01000044.1(ヒト腸内メタゲノムアセンブリ)からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号161は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号160と組みになる)。
配列番号162は、コンティグembl0GDF01008514.1|(ヒト腸内メタゲノムアセンブリ)からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号163は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号162と組みになる)。
配列番号164は、コンティグemb|0GPN01002610.1(ヒト腸内メタゲノムアセンブリ)からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号165は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号164と組みになる)。
配列番号166は、コンティグNFIR01000008.1(ニワトリ腸内メタゲノムからの、Eubacterium sp.An3)からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号167は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号166と組みになる)。
配列番号168は、コンティグNFLV01000009.1(ニワトリ腸内メタゲノムからの、Eubacterium sp.An11)からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号169は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号168と組みになる)。
配列番号171~174は、例示的なCas13dモチーフ配列である。
配列番号175は、コンティグOJMM01002900ヒト腸内メタゲノム配列からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号176は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号175と組みになる)。
配列番号177は、コンティグODAI011611274.1腸内メタゲノム配列からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号178は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号177と組みになる)。
配列番号179は、コンティグOIZX01000427.1からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号180は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号179と組みになる)。
配列番号181は、コンティグemb|OCVV012889144.1|からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号182は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号181と組みになる)。
配列番号183は、コンティグOCTW011587266.1からの例示的なCas13dタンパク質配列である
配列番号184は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号183と組みになる)。
配列番号185は、コンティグemb|OGNFO 1009141.1からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号186は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号185と組みになる)。
配列番号187は、コンティグemb|OIEN01002l96.1からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号188は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号187と組みになる)。
配列番号189は、コンティグe-k87_11092736からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号190~193は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号189と組みになる)。
配列番号194は、Gut_metagenome_contig6893000291からの例示的なCas13d配列である。
配列番号195~197は、例示的なCas13dモチーフ配列である。
配列番号198は、Ga0224415_10007274からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号199は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号198と組みになる)。
配列番号200は、EMG_l0003641からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号202は、Ga0129306_1000735からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号201は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号200と組みになる)。
配列番号202は、Ga0129306_1000735からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号203は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号203と組みになる
配列番号204は、GaO129317_1008067からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号205は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号204と組みになる)。
配列番号206は、Ga0224415_10048792からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号207は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号206と組みになる)。
配列番号208は、160582958_gene49834からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号209は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号208と組みになる)。
配列番号210は、250twins_35838_GL0110300からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号211は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号210と組みになる)。
配列番号212は、250twins_36050_GLOI58985からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号213は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号212と組みになる)。
配列番号214は、31009_GL0034153からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号215は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号214と組みになる)。
配列番号216は、530373_GL0023589からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号217は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号216と組みになる)。
配列番号218は、BMZ-l 1B_GL0037771からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号219は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号218と組みになる)。
配列番号220は、BMZ-l 1B_GL0037915からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号221は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号220と組みになる)。
配列番号222は、BMZ-l 1B_GL006961 7からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号223は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号222と組みになる)。
配列番号224は、DLF014_GL0011914からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号225は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号224と組みになる)。
配列番号226は、EYZ-362B_GL0088915からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号227~228は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号226と組みになる)。
配列番号229は、Ga0099364 10024192からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号230は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号229と組みになる)。
配列番号231は、Ga0187910_10006931からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号232は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号231と組みになる)。
配列番号233は、Ga0187910_10015336からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号234は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号233と組みになる)。
配列番号235は、Ga0187910_10040531からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号236は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号23と組みになる)。
配列番号237は、Ga0187911_10069260からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号238は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号237と組みになる)。
配列番号239は、MH0288_GL0082219からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号240は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号239と組みになる)。
配列番号241は、O2.UC29-0_GL0096317からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号242は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号241と組みになる)。
配列番号243は、PIG-014_GL0226364からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号244は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号243と組みになる)。
配列番号245は、PIG-018_GL0023397からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号246は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号245と組みになる)。
配列番号247は、PIG-025_GL0099734からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号248は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号247と組みになる)。
配列番号249は、PIG-028_GL0185479からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号250は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号249と組みになる)。
配列番号251は、-Ga0224422_10645759からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号252は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号251と組みになる)。
配列番号253は、ODAIキメラからの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号254は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号253と組みになる)。
配列番号255は、HEPNモチーフである。
配列番号256および257は、それぞれ、例示的なCas13d核局在化シグナルアミノ酸および核酸配列である。
配列番号258および260は、それぞれ、例示的なSV40ラージT抗原核局在化シグナルアミノ酸および核酸配列である。
配列番号259は、dCas9標的配列である。
配列番号261は、ccdBを標的とする人工Eubacterium siraeum nCaslアレイである。
配列番号262は、完全36ntダイレクトリピートである。
配列番号263~266は、スペーサー配列である。
配列番号267は、ccdBを標的とする人工未培養Ruminoccus sp.nCaslアレイである。
配列番号268は、完全36ntダイレクトリピートである。
配列番号269~272は、スペーサー配列である。
配列番号273は、ccdB標的RNA配列である。
配列番号274~277は、スペーサー配列である。
配列番号278は、変異型Cas13d配列、NLS-Ga_053l(trunc)-NLS-HAである。この変異体は、非保存N末端の欠失を有する。
配列番号279は、変異型Cas13d配列、NES-Ga_053l(trunc)-NES-HAである。この変異体は、非保存N末端の欠失を有する。
配列番号280は、全長Cas13d配列、NLS-RfxCas13d-NLS-HAである。
配列番号281は、変異型Cas13d配列、NLS-RfxCas13d(del5)-NLS-HAである。この変異体は、アミノ酸558~587の欠失を有する。
配列番号282は、変異型Cas13d配列、NLS-RfxCas13d(del5.12)-NLS-HAである。この変異体は、アミノ酸558~587および953~966の欠失を有する。
配列番号283は、変異型Cas13d配列、NLS-RfxCas13d(del5.13)-NLS-HAである。この変異体は、アミノ酸376~392および558~587の欠失を有する。
配列番号284は、変異型Cas13d配列、NLS-RfxCas13d(del5.12+5.13)-NLS-HAである。この変異体は、アミノ酸376~392、558~587、および953~966の欠失を有する。
配列番号285は、変異型Cas13d配列、NLS-RfxCas13d(dell3)-NLS-HAである。この変異体は、アミノ酸376~392の欠失を有する。
配列番号286は、ADAR2の発現を編集するために使用されるエフェクター配列である。アミノ酸1~969は、dRfxCas13であり、aa 970~991は、NLS配列であり、アミノ酸992~1378は、ADAR2DDである。
配列番号287は、例示的なHIV NESタンパク質配列である。
配列番号288~291は、例示的なCas13dモチーフ配列である。
配列番号292は、Cas13dオルソログ配列MH_4866である。
配列番号293は、037_-_emblOIZA01000315.llからの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号294は、PIG-022 GL002635lからの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号295は、PIG-046_GL0077813からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号296は、pig_chimeraからの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号297は、Ruminococcus flavefaciens XPD3002(CasRx)からの例示的なヌクレアーゼ不活性または失活Cas13d(dCas13d)タンパク質配列である。
配列番号298は、例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号299は、(コンティグtpg|DJXD01000002.1|;ヒツジ腸内メタゲノムからの未培養Ruminococcusアセンブリ、UBA7013)からの例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号300は、Cas13d(コンティグtpg|DJXD01000002.1|;ヒツジ腸内メタゲノムからの未培養Ruminococcusアセンブリ、UBA7013)からの例示的なCas13dダイレクトリピートヌクレオチド配列である(配列番号299と組みになる)。
配列番号301は、例示的なCas13dタンパク質コンティグemb|OBLI01020244である。
Yan et al. (2018) Mol Cell. 70(2):327-339(doi: 10.1016/j.molcel.2018.02.2018)およびKonermann et al. (2018) Cell 173(3):665-676(doi: 10.1016/j.cell/2018.02.033)には、Cas13dタンパク質が記載されており、これらの両方は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。WO公開番号WO2018/183403(Cas13dであるCasM)およびWO2019/006471(Cas13d)も参照されたく、これらは、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列番号587は、不活性化Cas13dまたはdCas13dと呼ばれる、触媒活性のない例示的なcas13dである。
配列番号590は、不活性化Cas13dまたはdCas13dと呼ばれる、触媒活性のない例示的なcas13dである。
配列番号591は、不活性化Cas13dまたはdCas13dと呼ばれる、触媒活性のない例示的なcas13dである。
配列番号592は、不活性化Cas13dまたはdCas13dと呼ばれる、触媒活性のない例示的なcas13dである。
配列番号593は、不活性化Cas13dまたはdCas13dと呼ばれる、触媒活性のない例示的なcas13dである。
配列番号594は、不活性化Cas13dまたはdCas13dと呼ばれる、触媒活性のない例示的なcas13dである。
配列番号303は、Eubacterium siraeumからの例示的なCasMタンパク質である。
配列番号304は、Ruminococcus sp.、2789STDY5834971分離株からの、例示的なCasMタンパク質である。
配列番号305は、Ruminococcus bicirculansからの例示的なCasMタンパク質である。
配列番号306は、Ruminococcus sp.、2789STDY5608892分離株からの、例示的なCasMタンパク質である。
配列番号307は、Ruminococcus sp.、CAG:57からの、例示的なCasMタンパク質である。
配列番号308は、Ruminococcus flavefaciens FD-1からの例示的なCasMタンパク質である。
配列番号309は、Ruminococcus albus KH2T6株からの、例示的なCasMタンパク質である。
配列番号310は、Ruminococcus flavefaciens XPD3002株からの例示的なCasMタンパク質である。
配列番号311は、Ruminococcus sp.、2789STDY5834894分離株からの、例示的なCasMタンパク質である。
配列番号312は、例示的なRtcBホモログである。
配列番号313は、Eubacterium siraeumからの例示的なWYL+C末端NLSである。
配列番号314は、Ruminococcus sp. 2789STDY5834971分離株からの例示的なWYL+C末端NLSである。
配列番号315は、Ruminococcus bicirculansからの例示的なWYL+C末端NLSである。
配列番号316は、Ruminococcus sp. 2789STDY5608892分離株からの例示的なWYL+C末端NLSである。
配列番号317は、Ruminococcus sp.CAG:57からの例示的なWYL+C末端NLSである。
配列番号318は、Ruminococcus flavefaciens FD-1からの例示的なWYL+C末端NLSである。
配列番号319は、Ruminococcus albus KH2T6株からの例示的なWYL+C末端NLSである。
配列番号320は、Ruminococcus flavefaciens XPD3002株からの例示的なWYL+C末端NLSである。
配列番号321は、Eubacterium siraeumからの例示的なRtcB+C末端NLSである。
配列番号322は、Ruminococcus flavefaciens XPD3002 Cas13d (CasRx)の例示的なダイレクトリピート配列である。
本開示の例示的な野生型Cas13dタンパク質は、アミノ酸配列の配列番号92または配列番号298(CasRxとしても公知のCas13dタンパク質)を含み得るまたはそれからなり得る。
Ruminococcus flavefaciens XPD3002 Cas13d(CasRx)の例示的なダイレクトリピート配列は、核酸配列:AACCCCTACCAACTGGTCGGGGTTTGAAAC(配列番号302)を含む。
gRNA標的配列
gRNA標的配列
本開示の組成物は、病原性リピート配列を含むRNA分子の標的配列に結合し、それを破壊する。一実施形態では、標的RNAは、RNAによりガイドされるRNA結合性タンパク質に対応するガイドRNAのスペーサー配列に対応する配列モチーフを含む。一部の実施形態では、1つまたは複数の標的配列を標的とするために1つまたは複数のスペーサー配列が使用される。一部の実施形態では、複数の標的RNAを標的とするために複数のスペーサーが使用される。そのような標的RNAは、同じRNA分子内の異なる標的部位であることもあり、または異なるRNA分子内の異なる標的部位であることもある。スペーサー配列は、非コードRNAを標的することもできる。一部の実施形態では、複数のプロモーター、例えば、Pol IIIプロモーターを使用して、複数の標的RNAを標的とするためにgRNA内の複数のスペーサーを駆動することができる。一実施形態では、標的RNAまたは標的配列モチーフの分解は、病原性CAGリピートRNAの発現を低下させ、それによって、CAGリピート病、例えばHDもしくはSCA1、が処置される、および/またはCAGリピート病、例えばHDもしくはSCA1、に関連する1つもしくは複数の症状が好転する。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、標的RNAの配列モチーフは、疾患または障害のシグネチャーである。
本開示の標的配列モチーフは、ゲノム配列内に見いだされる外来または外因性配列の配列から単離し得るまたはそれに由来し得、したがって、本開示のmRNA分子または本開示のRNA配列内に見いだされる外来または外因性配列の配列に翻訳される。
本開示の標的配列モチーフは、疾患または障害を引き起こす、内因性配列内の変異を含み得るまたはそれからなり得る。変異は、配列の置換、逆位、欠失、挿入、転位、またはこれらの任意の組合せを含み得る、それからなり得る、それの近くに位置し得る、またはそれと関連し得る。
本開示の標的配列モチーフは、リピート配列を含み得るまたはそれからなり得る。一部の実施形態では、リピート配列は、マイクロサテライト不安定性(MSI)に関連し得る。1つまたは複数の遺伝子座におけるMSIは、本開示の細胞のDNAミスマッチ修復機構が損なわれたことに起因する。DNAの超可変配列は、超可変配列を含むまたはそれからなる標的配列を含む本開示のmRNAに転写され得る。
本開示の標的配列モチーフは、バイオマーカーを含み得るまたはそれからなり得る。バイオマーカーは、疾患または障害が発生するリスクを示すものであり得る。バイオマーカーは、健康な遺伝子(疾患または障害が発生することの確定可能なリスクが低いまたはリスクがない)を示すものであり得る。バイオマーカーは、編集された遺伝子を示すものであり得る。例示的なバイオマーカーとしては、これだけに限定されないが、一塩基多型(SNP)、配列バリエーションまたは変異、エピジェネティックマーク、スプライスアクセプター部位、外因性配列、異種配列、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。
本開示の配列モチーフは、二次構造、三次構造または四次構造を含み得るまたはそれからなり得る。二次構造、三次構造または四次構造は、内因性または天然に存在するものであり得る。二次構造、三次構造または四次構造は、誘導されたまたは天然に存在しないものであり得る。二次構造、三次構造または四次構造は、内因性配列、外因性配列、または異種配列にコードされるものであり得る。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、RNA分子の標的配列は、終点を含めて、2個から100個の間のヌクレオチドまたは核酸塩基を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNA分子の標的配列は、終点を含めて、2個から50個の間のヌクレオチドまたは核酸塩基を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNA分子の標的配列は、終点を含めて、2個から20個の間のヌクレオチドまたは核酸塩基を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNA分子の標的配列は、終点を含めて、20個から30個の間のヌクレオチドまたは核酸塩基を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNA分子の標的配列は、終点を含めて、約26個のヌクレオチドまたは核酸塩基を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、RNA分子の標的配列は連続している。一部の実施形態では、RNA分子の標的配列は連続していない。例えば、RNA分子の標的配列は、標的配列のヌクレオチド間に1つまたは複数の断続的なヌクレオチドが位置することに起因して連続していない1つまたは複数のヌクレオチドまたは核酸塩基を含み得るまたはそれからなり得る。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、RNA分子の標的配列は、天然に存在するものである。一部の実施形態では、RNA分子の標的配列は、天然に存在しないものである。例示的な天然に存在しない標的配列は、配列バリエーションもしくは変異、キメラ配列、外因性配列、異種配列、キメラ配列、組換え配列、改変もしくは合成されたヌクレオチドを含む配列またはこれらの任意の組合せを含み得るまたはそれからなり得る。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、RNA分子の標的配列は、本開示のガイドRNAに結合する。本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、RNA分子の1つまたは複数の標的配列は、本開示の1つまたは複数のガイドRNAスペーサー配列に結合する。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、RNA分子の標的配列は、本開示の第1のRNA結合性タンパク質に結合する。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、RNA分子の標的配列は、本開示の第2のRNA結合性タンパク質に結合する。
本開示の組成物は、標的毒性CAG RNAリピート配列に特異的に結合するスペーサー配列を含むgRNAを含む。一部の実施形態では、標的CAG RNAリピート配列に結合するスペーサーは、約20個から30個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、gRNAは、1つまたは複数のスペーサー配列を含む。
RNA分子の標的CAG配列に特異的に結合する、本開示の例示的なgRNAスペーサー配列は、配列番号457~459である。
エンドヌクレアーゼ
エンドヌクレアーゼ
一部の実施形態では、本開示の組成物は、ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる、第2のRNA結合性タンパク質を含む。一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、エフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、RNAと会合する様式でRNAに結合する。一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、RNAを切断する(cleave)様式でRNAと会合する。一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、PUF、PUMBYまたはPPRに基づくタンパク質である、第1のRNA結合性タンパク質と融合している。一実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、触媒的に不活性化されているCasに基づく(dCasに基づく)タンパク質である、第1のRNA結合性タンパク質と融合している。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、RNAseを含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、RNAse1を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNAse1タンパク質は、配列番号325を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、RNase4を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNase4タンパク質は、配列番号配列番号326を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、RNase6を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNase6タンパク質は、配列番号配列番号327を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、RNase7を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNase7タンパク質は、配列番号配列番号328を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、RNase8を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNase8タンパク質は、配列番号配列番号329を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、RNase2を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNase2タンパク質は、配列番号配列番号330を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、RNase6PLを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNase6PLタンパク質は、配列番号配列番号331を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、RNaseLを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNaseLタンパク質は、配列番号配列番号332を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、RNaseT2を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNaseT2タンパク質は、配列番号配列番号333を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、RNase11を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNase11タンパク質は、配列番号配列番号334を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、RNaseT2様を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNaseT2様タンパク質は、配列番号配列番号335を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、変異型RNaseである。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、変異型RNase1(RNase1(K41R))ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNase1(K41R)ポリペプチドは、配列番号336を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、変異型RNase1(RNase1(K41R、D121E))ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNase1(RNase1(K41R、D121E))ポリペプチドは、配列番号337を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、変異型RNase1(RNase1(K41R、D121E、H119N))ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNase1(RNase1(K41R、D121E、H119N))ポリペプチドは、配列番号338を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、変異型RNase1を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、変異型RNase1(RNase1(H119N))ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNase1(RNase1(H119N))ポリペプチドは、配列番号339を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、変異型RNase1(RNase1(R39D、N67D、N88A、G89D、R91D、H119N))ポリペプチドを含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、RNase1(RNase1(R39D、N67D、N88A、G89D、R91D、H119N))ポリペプチドは、配列番号340を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、変異型RNase1(RNase1(R39D、N67D、N88A、G89D、R91D、H119N))ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNase1(RNase1(R39D、N67D、N88A、G89D、R91D、H119N、K41R、D121E))ポリペプチドは、配列番号341を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、変異型RNase1(RNase1(R39D、N67D、N88A、G89D、R91D、H119N))ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNase1(RNase1(R39D、N67D、N88A、G89D、R91D))ポリペプチドは、配列番号342を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、配列番号343を含むまたはそれからなる変異型RNase1(RNase1(R39D、N67D、N88A、G89D、R91D、H119N、K41R、D121E))ポリペプチドである。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、変異型RNase1(RNase1(R39D、N67D、N88A、G89D、R91D、H119N))ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNase1(RNase1(R39D、N67D、N88A、G89D、R91D))ポリペプチドは、配列番号342を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、配列番号343を含むまたはそれからなる変異型RNase1(RNase1(R39D、N67D、N88A、G89D、R91D、H119N、K41R、D121E))ポリペプチドである。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、NOB1ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、NOB1ポリペプチドは、配列番号344を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼV(ENDOV)を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ENDOVタンパク質は、配列番号345を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼG(ENDOG)を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ENDOGタンパク質は、配列番号346を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼD1(ENDOD1)を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ENDOD1タンパク質は、配列番号配列番号347を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、ヒトフラップエンドヌクレアーゼ-1(hFEN1)を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、hFEN1ポリペプチドは、配列番号348を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、DNA修復エンドヌクレアーゼXPF(ERCC4)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ERCC4ポリペプチドは、配列番号349を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼIII様タンパク質1(NTHL)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、NTHLポリペプチドは、配列番号340を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、ヒトSchlafen14(hSLFN14)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、hSLFN14ポリペプチドは、配列番号351を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、ヒトベータ-ラクタマーゼ様タンパク質2(hLACTB2)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、hLACTB2ポリペプチドは、配列番号352を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、脱プリン/脱ピリミジン(AP)エンドデオキシリボヌクレアーゼ(APEX)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、脱プリン/脱ピリミジン(AP)エンドデオキシリボヌクレアーゼ(APEX2)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、APEX2ポリペプチドは、配列番号353を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、APEX2ポリペプチドは、配列番号354を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、脱プリンまたは脱ピリミジン部位リアーゼ(APEX1)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、APEX1ポリペプチドは、配列番号355を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、アンジオゲニン(ANG)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ANGポリペプチドは、配列番号356を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、熱応答タンパク質12(HRSP12)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、HRSP12ポリペプチドは、配列番号357を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、ジンクフィンガーCCCH型、12A含有(ZC3H12A)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ZC3H12Aポリペプチドは、ポリペプチドのエンドヌクレアーゼドメインであり、これは、配列番号358を含むまたはそれからなり、本明細書でE17とも称される。一部の実施形態では、ZC3H12Aポリペプチドは、配列番号359を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、反応性中間体イミンデアミナーゼA(RIDA)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RIDAポリペプチドは、配列番号360を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、ホスホリパーゼDファミリーメンバー6(PDL6)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、PDL6ポリペプチドは、配列番号361を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、ミトコンドリアリボヌクレアーゼP触媒サブユニット(KIAA0391)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、KIAA0391ポリペプチドは、配列番号362を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、アルゴノート2(AGO2)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、AGO2ポリペプチドは、配列番号363を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、AGO2ポリペプチドは、配列番号363を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、ミトコンドリアヌクレアーゼEXOG(EXOG)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、EXOGポリペプチドは、配列番号364を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、ジンクフィンガーCCCH型、12D含有(ZC3H12D)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ZC3H12Dポリペプチドは、配列番号365を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、小胞体-核シグナル伝達2(ERN2)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ERN2ポリペプチドは、配列番号366を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、ペロタmRNA生存およびリボソーム救援因子(PELO)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、PELOポリペプチドは、配列番号367を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、YBEYメタロペプチダーゼ(YBEY)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、YBEYポリペプチドは、配列番号368を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、切断およびポリアデニル化特異的因子4様(CPSF4L)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、CPSF4Lポリペプチドは、配列番号369を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、hCG_2002731ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、hCG_2002731ポリペプチドは、配列番号370を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、hCG_2002731ポリペプチドは、配列番号371を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、除去修復相互相補化グループ1(ERCC1)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ERCC1ポリペプチドは、配列番号372を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、ras関連C3ボツリヌス毒素基質1アイソフォーム(RAC1)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RAC1ポリペプチドは、配列番号373を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、リボヌクレアーゼAA1(RAA1)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RAA1ポリペプチドは、配列番号374を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、Ras関連タンパク質(RAB1)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RAB1ポリペプチドは、配列番号375を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、DNA複製ヘリカーゼ/ヌクレアーゼ2(DNA2)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、DNA2ポリペプチドは、配列番号376を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、FLJ35220ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、FLJ35220ポリペプチドは、配列番号377を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、FLJ13173ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、FLJ13173ポリペプチドは、配列番号378を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、Teneurin膜貫通タンパク質(TENM)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、Teneurin膜貫通タンパク質1(TENM1)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、TENM1ポリペプチドは、配列番号379を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、Teneurin膜貫通タンパク質2(TENM2)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、TENM2ポリペプチドは、配列番号380を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、リボヌクレアーゼカパ(RNaseK)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNaseKポリペプチドは、配列番号381を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、Teneurin膜貫通タンパク質2(TENM2)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、TENM2ポリペプチドは、配列番号380を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、リボヌクレアーゼカパ(RNaseK)ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、RNaseKポリペプチドは、配列番号381を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、転写活性位因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)ポリペプチドまたはそのヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、TALENポリペプチドは、配列番号382を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、TALENポリペプチドは、配列番号383を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼポリペプチドまたはそのヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、ZNF638ポリペプチドまたはそのヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ZNF638ポリペプチドは、配列番号384を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第2のRNA結合性タンパク質は、一般にテロメラーゼ結合性タンパク質EST1Aアイソフォーム3、NCBI参照配列:NP_001243756.1としても公知のヒトSMG6タンパク質に由来するPINドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、例えば、これだけに限定することなく、hSMG6由来のPINは、本明細書では、Cas融合タンパク質の形態で、内部対照として使用される。一部の実施形態では、PINポリペプチドは、配列番号626を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、組成物は、(a)RNA分子の内部に特異的に結合するgRNAを含む配列および(b)ヌクレアーゼをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、CRISPR/Casタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、TALENまたはそのヌクレアーゼドメインから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。
AAVベクター
AAVベクター
「AAVベクター」は、本明細書で使用される場合、1つまたは複数の核酸分子および1つまたは複数のAAV末端逆位反復配列(ITR)を含む、それらから本質的になるまたはそれからなるベクターを指す。一部の態様では、核酸分子は、本開示のCAGリピート標的化タンパク質および/または組成物をコードする。そのようなAAVベクターは、例えば宿主細胞へのトランスフェクションにより、repおよびcap遺伝子産物の機能を提供する宿主細胞に存在する場合、複製され、感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る。一部の態様では、AAVベクターは、プロモーターを含有し、少なくとも1つのタンパク質もしくはRNAをコードし得る少なくとも1つの核酸を含有し、ならびに/または感染性AAV粒子にパッケージングされるエンハンサーおよび/もしくはターミネーターをフランキングITR内に含有する。カプシド封入核酸部分は、AAVベクターゲノムと呼ばれ得る。AAVベクターを含有するプラスミドは、製造のためのエレメント、例えば、抗生物質耐性遺伝子、複製起点配列なども含有し得るが、これらは、カプシドに封入されず、したがって、AAV粒子の一部を形成しない。
一部の態様では、AAVベクターは、本開示のCAGリピート標的化組成物をコードする少なくとも1つの核酸分子を含み得る。一部の態様では、AAVベクターは、少なくとも1つの調節配列を含み得る。一部の態様では、AAVベクターは、少なくとも1つのAAV末端逆位(ITR)配列を含み得る。一部の態様では、AAVベクターは、第1のITR配列および第2のITR配列を含み得る。一部の態様では、AAVベクターは、少なくとも1つのプロモーター配列を含み得る。一部の態様では、AAVベクターは、少なくとも1つのエンハンサー配列を含み得る。一部の態様では、AAVベクターは、少なくとも1つのポリA配列を含み得る。一部の態様では、AAVベクターは、少なくとも1つのリンカー配列を含み得る。一部の態様では、本開示のAAVベクターは、少なくとも1つの核局在化シグナルを含み得る。一部の態様では、本開示のAAVベクターは、CAGリピート標的化PUFまたはPUMBYタンパク質、ペプチド、またはその断片を含み得る。一部の態様では、本開示のAAVベクターは、Casタンパク質、ペプチド、またはその断片を含み得る。一部の態様では、本開示のAAVベクターは、エンドヌクレアーゼタンパク質、ペプチド、またはその断片を含み得る。一部の態様では、本開示のAAVベクターは、ガイドRNA、一部の場合にはCAGリピート標的化ガイドRNAを含み得る。一部の態様では、本開示のAAVベクターは、これだけに限定されないが、CAGリピート標的化タンパク質(例えば、Cas、PUF、またはPUMBY)およびエンドヌクレアーゼを含む、本開示の1つまたは複数のエレメントを含む、融合タンパク質を含み得る。必要に応じて、AAVベクターの融合タンパク質は、本開示の1つまたは複数のエレメント間にリンカーアミノ酸配列をさらに含み得る。
一部の態様では、AAVベクターは、第1のAAV ITR配列、プロモーター配列、CAGリピート標的化組成物核酸分子、調節配列、および第2のAAV ITR配列を含み得る。一部の態様では、AAVベクターは、5’から3’方向に、第1のAAV ITR配列、プロモーター配列、導入遺伝子核酸分子、および第2のAAV ITR配列を含み得る。
CAG標的化Cas13dベクター
CAG標的化Cas13dベクター
本開示の組成物の一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、AAVベクターとしてパッケージングされる。一部の実施形態では、AAVベクターとしてパッケージングされるCAG標的化Cas13d組成物は、配列番号518、528、534、536、および539で示される。
一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物を含むAAVベクターは、5’から3’へ:ヒトU6プロモーター、cas13d gRNA(この場合のgRNAは、ダイレクトリピート配列およびCAG標的化スペーサー配列を含む)、EFSプロモーター、コザック配列、SV40 NLS配列、リンカー配列、Cas13dをコードする配列、リンカー配列、SV40 NLS配列、リンカー配列、HAタグ配列、およびBGH配列を含む。
一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物をコードする核酸は、配列番号518で示される。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表3に描示されるように配列される。
一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、NからC末端へ:ヒトU6プロモーター、cas13d gRNA(この場合のgRNAは、ダイレクトリピート配列およびCAG標的化スペーサー配列を含む)、EFSプロモーター、コザック配列、Cas13dをコードする配列、リンカー配列、SV40 NLS配列、およびSV40ポリa配列を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物をコードする核酸は、配列番号528で示される。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表4に描示されるように配列される。
一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物を含むAAVベクターは、5’から3’へ:ヒトU6プロモーター、cas13d gRNA(この場合のgRNAは、ダイレクトリピート配列およびCAG標的化スペーサー配列を含む)、EFSプロモーター、コザック配列、Cas13dをコードする配列、リンカー配列、SV40 NLS配列、およびSV40ポリa配列を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物をコードする核酸は、配列番号534で示される。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表5に描示されるように配列される。
一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物を含むAAVベクターは、5’から3’へ:ヒトU6プロモーター、cas13d gRNA(この場合のgRNAは、ダイレクトリピート配列およびCAG標的化スペーサー配列を含む)、EFSプロモーター、コザック配列、Cas13dをコードする配列、リンカー配列、SV40 NLS配列、およびSV40ポリa配列を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物をコードする核酸は、配列番号536で示される。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表6に描示されるように配列される。
一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物を含むAAVベクターは、5’から3’へ:ヒトU6プロモーター、cas13d gRNA(この場合のgRNAは、ダイレクトリピート配列およびCAG標的化スペーサー配列を含む)、EFSプロモーター、コザック配列、Cas13dをコードする配列、リンカー配列、SV40 NLS配列、およびSV40ポリa配列を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物をコードする核酸は、配列番号539で示される。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表7に描示されるように配列される。
一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物をコードする核酸を含むAAVベクターは、5’から3’へ:5’ITR(第1のITR)をコードする配列、ヒトU6プロモーターをコードする配列、dCas13d seq212ダイレクトリピート、CAGガイド3スペーサー配列をコードする配列、EFSプロモーターをコードする配列、コザック配列をコードする配列、dCas13d seq212タンパク質をコードする配列、リンカー配列をコードする配列、SV-40 NLSをコードする配列、リンカー配列をコードする配列、HAタグをコードする配列、WPREをコードする配列、SV-40ポリAをコードする配列、および3’ITR(第2のITR)を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表Gに描示されるように配列される。一部の実施形態では、ベクターA01479は、遮断に好適である。一部の態様では、A01479は、配列番号588を含む核酸配列によりコードされる。
一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物をコードする核酸を含むAAVベクターは、5’から3’へ:5’ITR(第1のITR)をコードする配列、ヒトU6プロモーターをコードする配列、dCas13d seq212ダイレクトリピート、CAGガイド3スペーサー配列をコードする配列、EFSプロモーターをコードする配列、コザック配列をコードする配列、dCas13d seq212タンパク質をコードする配列、リンカー配列をコードする配列、SV-40 NLSをコードする配列、リンカー配列をコードする配列、HAタグをコードする配列、WPREをコードする配列、SV-40ポリAをコードする配列、および3’ITR(第2のITR)を含む。一部の実施形態では、ベクターをコードする核酸は、配列番号589で示される。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表Hに描示されるように配列される。一部の実施形態では、ベクターA01922は、遮断に好適である。一部の態様では、ベクターA01922は、配列番号589を含む核酸配列によりコードされる。
一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物をコードする核酸を含むAAVベクターは、5’から3’へ:5’ITR(第1のITR)をコードする配列、ヒトU6プロモーターをコードする配列、dCas13d seq212ダイレクトリピート、CAGガイド3スペーサー配列をコードする配列、EFSプロモーターをコードする配列、コザック配列をコードする配列、dCas13d seq212タンパク質をコードする配列、リンカー配列をコードする配列、SV-40 NLSをコードする配列、リンカー配列をコードする配列、HAタグをコードする配列、WPREをコードする配列、SV-40ポリAをコードする配列、および3’ITR(第2のITR)を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表Iに描示されるように配列される。
表I: CAGリピートを標的とするdCas13d融合体をコードするベクター
表I: CAGリピートを標的とするdCas13d融合体をコードするベクター
一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物をコードする核酸を含むAAVベクターは、5’から3’へ:5’ITR(第1のITR)をコードする配列、ヒトU6プロモーターをコードする配列、dCas13d seq212ダイレクトリピート、CAGガイド3スペーサー配列をコードする配列、EFSプロモーターをコードする配列、コザック配列をコードする配列、dCas13d seq212タンパク質をコードする配列、リンカー配列をコードする配列、SV-40 NLSをコードする配列、リンカー配列をコードする配列、HAタグをコードする配列、WPREをコードする配列、SV-40ポリAをコードする配列、および3’ITR(第2のITR)を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表Jに描示されるように配列される。
表J: CAGリピートを標的とするdCas13d融合体をコードするベクター
表J: CAGリピートを標的とするdCas13d融合体をコードするベクター
一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物をコードする核酸を含むAAVベクターは、5’から3’へ:5’ITR(第1のITR)をコードする配列、ヒトU6プロモーターをコードする配列、dCas13d seq212ダイレクトリピート、CAGガイド3スペーサー配列をコードする配列、EFSプロモーターをコードする配列、コザック配列をコードする配列、dCas13d seq212タンパク質をコードする配列、リンカー配列をコードする配列、SV-40 NLSをコードする配列、リンカー配列をコードする配列、HAタグをコードする配列、WPREをコードする配列、SV-40ポリAをコードする配列、および3’ITR(第2のITR)を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表Kに描示されるように配列される。
一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物をコードする核酸を含むAAVベクターは、5’から3’へ:5’ITR(第1のITR)をコードする配列、ヒトU6プロモーターをコードする配列、dCas13d seq212ダイレクトリピート、CAGガイド3スペーサー配列をコードする配列、EFSプロモーターをコードする配列、コザック配列をコードする配列、dCas13d seq212タンパク質をコードする配列、リンカー配列をコードする配列、SV-40 NLSをコードする配列、リンカー配列をコードする配列、HAタグをコードする配列、WPREをコードする配列、SV-40ポリAをコードする配列、および3’ITR(第2のITR)を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表Lに描示されるように配列される。
一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物をコードする核酸を含むAAVベクターは、5’から3’へ:5’ITR(第1のITR)をコードする配列、ヒトU6プロモーターをコードする配列、dCas13d seq212ダイレクトリピート、CAGガイド3スペーサー配列をコードする配列、EFSプロモーターをコードする配列、コザック配列をコードする配列、SV-40 NLSをコードする配列、リンカーをコードする配列、dCas13d seq212タンパク質をコードする配列、リンカー配列をコードする配列、E17エンドヌクレアーゼをコードする配列、リンカー配列をコードする配列、mycタグをコードする配列、WPREをコードする配列、SV-40ポリAをコードする配列、および3’ITR(第2のITR)を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表Mに描示されるように配列される。一部の実施形態では、表Mに示されるベクターは、A01545と称される。
一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物をコードする核酸を含むAAVベクターは、5’から3’へ:5’ITR(第1のITR)をコードする配列、ヒトU6プロモーターをコードする配列、dCas13d seq212ダイレクトリピート、CAGガイド3スペーサー配列をコードする配列、EFSプロモーターをコードする配列、コザック配列をコードする配列、SV-40 NLSをコードする配列、リンカーをコードする配列、dCas13d seq212タンパク質をコードする配列、リンカー配列をコードする配列、E17エンドヌクレアーゼをコードする配列、リンカー配列をコードする配列、mycタグをコードする配列、WPREをコードする配列、SV-40ポリAをコードする配列、および3’ITR(第2のITR)を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表Nに描示されるように配列される。一部の実施形態では、表Nに示されるベクターは、A01553と称される。
一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物をコードする核酸を含むAAVベクターは、5’から3’へ:5’ITR(第1のITR)をコードする配列、ヒトU6プロモーターをコードする配列、dCas13d seq212ダイレクトリピート、CAGガイド3スペーサー配列をコードする配列、EFSプロモーターをコードする配列、コザック配列をコードする配列、E17エンドヌクレアーゼをコードする配列、リンカーをコードする配列、dCas13d seq212タンパク質をコードする配列、リンカー配列をコードする配列、SV-40 NLSをコードする配列、リンカーをコードする配列、HAタグをコードする配列、WPREをコードする配列、SV-40ポリAをコードする配列、および3’ITR(第2のITR)を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表Oに描示されるように配列される。
本開示の組成物の一部の実施形態では、CAG標的化PUF組成物は、AAVベクターとしてパッケージングされる。一部の実施形態では、AAVベクターとしてパッケージングされるCAG標的化PUF組成物は、配列番号518、528、534、536、および539で示される。
一部の実施形態では、CAGリピート標的化PUFをコードする核酸を含むAAVベクターは、5’から3’へ:5’ITR(第1のITR)、EFS/UBBプロモーターをコードする配列、コザック配列をコードする配列、8PUFタンパク質をコードする配列、リンカーをコードする配列、ヌクレアーゼ(E17)をコードする配列、WPREエレメントをコードする配列、SV40ポリA配列をコードする配列、および3’ITR(第2のITR)を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表Pに描示されるように配列される。一部の実施形態では、表Pに示されるベクターは、A01383と呼ばれる。
表P: CAGリピート標的化PUF-E17融合体をコードするベクターA01383
表P: CAGリピート標的化PUF-E17融合体をコードするベクターA01383
一部の実施形態では、CAGリピート標的化PUFをコードする核酸を含むAAVベクターは、5’から3’へ:5’ITR(第1のITR)をコードする配列、EFS/UBBプロモーターをコードする配列、コザック配列をコードする配列、8PUFタンパク質をコードする配列、リンカーをコードする配列、mycタグをコードする配列、WPREエレメントをコードする配列、SV40ポリA配列をコードする配列、および3’ITR(第2のITR)を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表Qに描示されるように配列される。一部の実施形態では、表Qに示されるベクターは、A01684と呼ばれる。一部の実施形態では、ベクターA01684は遮断に好適である。
表Q: CAGリピートを遮断の標的とするPUFをコードするベクターA01684
表Q: CAGリピートを遮断の標的とするPUFをコードするベクターA01684
一部の実施形態では、CAGリピート標的化PUFをコードする核酸を含むAAVベクターは、5’から3’へ:5’ITR(第1のITR)をコードする配列、EFS/UBBプロモーターをコードする配列、コザック配列をコードする配列、8PUFタンパク質をコードする配列、WPREエレメントをコードする配列、SV40ポリA配列をコードする配列、および3’ITR(第2のITR)を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表Rに描示されるように配列される。一部の実施形態では、表Rに示されるベクターは、A01683と呼ばれる。
表R: CAGリピートを遮断の標的とするPUFをコードするベクターA01683
表R: CAGリピートを遮断の標的とするPUFをコードするベクターA01683
一部の実施形態では、CAGリピート標的化PUFをコードする核酸を含むAAVベクターは、5’から3’へ:5’ITR(第1のITR)をコードする配列、EFS/UBBプロモーターをコードする配列、コザック配列をコードする配列、8PUFタンパク質をコードする配列、リンカー配列、PINエンドヌクレアーゼ、リンカー配列、mycタグ、WPREエレメントをコードする配列、SV40ポリA配列をコードする配列、および3’ITR(第2のITR)を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表S1およびS2に描示されるように配列される。ベクターA02249をコードする核酸配列は、配列番号624を含む。ベクターA02250をコードする核酸配列は、配列番号625を含む。
一部の実施形態では、CAGリピート標的化PUFをコードする核酸を含むAAVベクターは、5’から3’へ:5’ITR(第1のITR)をコードする配列、EFS/UBBプロモーターをコードする配列、コザック配列をコードする配列、8PUFタンパク質をコードする配列、リンカー配列、PINエンドヌクレアーゼ、WPREエレメントをコードする配列、ポリA配列をコードする配列、および3’ITR(第2のITR)を含む。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13d組成物は、表S3およびS4に描示されるように配列される。
表S3: PINエンドヌクレアーゼと融合したCAGリピート標的化PUFをコードするベクターA02249
表S4: PINエンドヌクレアーゼと融合したCAGリピート標的化PUF
表S3: PINエンドヌクレアーゼと融合したCAGリピート標的化PUFをコードするベクターA02249
一部の実施形態では、本開示のCAG標的化Cas13dタンパク質をコードする核酸配列は、コドン最適化された核酸配列である。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化された配列は、ヒト対象において、野生型のまたはコドン最適化されていない核酸配列と比べて、翻訳の少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも500%、または少なくとも1000%増加を示す。
一部の態様では、配列番号518、528、534、536および539で提示されるものなどの、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、安定性の増大を示す。一部の態様では、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、耐加水分解性の増大によって安定性の増大を示す。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化された配列は、野生型のまたはコドン最適化されていない核酸配列と比べて、安定性の少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも500%、または少なくとも1000%増大を示す。一部の実施形態では、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化された配列は、ヒト対象において、野生型のまたはコドン最適化されていない核酸配列と比べて、耐加水分解性の少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも500%、または少なくとも1000%増大を示す。
一部の態様では、配列番号518、528、534、536および539で提示されるものなどの、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、ドナースプライス部位を含み得ない。一部の態様では、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、約1つ、または約2つ、または約3つ、または約4つ、または約5つ、または約6つ、または約7つ、または約8つ、または約9つ、または約10以下のドナースプライス部位を含み得る。一部の態様では、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化されていない核酸配列と比較して、少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つ、または少なくとも4つ、または少なくとも5つ、または少なくとも6つ、または少なくとも7つ、または少なくとも8つ、または少なくとも9つ、または少なくとも10少ない、ドナースプライス部位を含む。
理論により拘束されることを望まないが、コドン最適化された核酸配列におけるドナースプライス部位の除去は、隠れたスプライシングが防止されるので、in vivoでCAG標的化Cas13dタンパク質の発現を予想外におよび予測不能に増加させることができる。さらに、隠れたスプライシングは、対象によって異なることがあり、これは、ドナースプライス部位を含むCAG標的化Cas13dタンパク質の発現レベルが、予測不能に対象によって異なることがあることを意味する。ヒトの治療に関して、このような予測不能性は受入れ難い。それに応じて、ドナースプライス部位を欠いている配列番号518、528、534、536および539で提示されるコドン最適化された核酸配列は、予想外におよび驚くべきことに、ヒト対象におけるCAG標的化Cas13dタンパク質の発現増加を可能にし、CAG標的化Cas13dタンパク質の発現をヒト対象の違いを超えて規則化する。
一部の態様では、配列番号518、528、534、536および539で提示されるものなどの、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化されていない核酸配列のGC含量とは異なるGC含量を有し得る。一部の態様では、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列のGC含量は、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化されていない核酸配列と比較して、核酸配列全体にわたってより均一に分布している。
理論により拘束されることを望まないが、核酸配列全体にわたってより均一にGC含量を分布させることによって、コドン最適化された核酸配列は、転写物長にわたってより均一な融解温度(「Tm」)を示す。融解温度の均一性は、ポリメラーゼおよび/またはリボソームがあまり失速せずに核酸配列の転写および/または翻訳が起こるので、ヒト対象におけるコドン最適化された核酸の発現増加を予想外にもたらす。
一部の態様では、配列番号518、528、534、536および539で提示されるものなどの、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化されていない核酸配列と比較して、より少ない抑制的マイクロRNA標的結合性部位を有し得る。一部の態様では、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、コドン最適化されていない核酸配列、CAG標的化Cas13dタンパク質と比較して、少なくとも1つ、もしくは少なくとも2つ、もしくは少なくとも3つ、もしくは少なくとも4つ、もしくは少なくとも5つ、もしくは少なくとも6つ、もしくは少なくとも7つ、もしくは少なくとも8つ、もしくは少なくとも9つ、もしくは少なくとも10の、または少なくとも10少ない、抑制的マイクロRNA標的結合性部位を有し得る。
理論により拘束されることを望まないが、より少ない抑制的マイクロRNA標的結合性部位を有することによって、CAG標的化Cas13dタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、ヒト対象において発現の増加を予想外に示す。
融合タンパク質
融合タンパク質
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、組成物は、(a)第1のRNA結合性ポリペプチドをコードする配列またはその一部と、必要に応じて(b)第2のRNA結合性ポリペプチドをコードする配列とを含む標的RNA結合性融合タンパク質をコードする配列を含み、ここで、第1のRNA結合性ポリペプチドは、標的RNAに結合し、第2のRNA結合性ポリペプチドは、RNAヌクレアーゼ活性を含む。
一部の実施形態では、標的RNA結合性融合タンパク質は、RNAによりガイドされる標的RNA結合性融合タンパク質である。RNAによりガイドされる標的RNA結合性融合タンパク質は、RNA結合性ポリペプチドを標的RNAへガイドするgRNAに対応する少なくとも1つのRNA結合性ポリペプチドを含む。RNAによりガイドされる標的RNA結合性融合タンパク質としては、これだけに限定することなく、CRISPR/Casに基づくRNA結合性ポリペプチドまたはその一部であるRNA結合性ポリペプチドが挙げられる。
シグナル配列
一部の実施形態では、本開示の標的RNA結合性融合タンパク質は、シグナル配列を含む。一部の実施形態では、標的RNA結合性融合タンパク質は、1つまたは複数のシグナル配列を含む。一部の実施形態では、シグナル配列は、核局在化配列(NLS)、核外輸送シグナル(NES)またはこれらの組合せである。一部の実施形態では、タグ配列は、核局在化配列(NLS)を含む。一部の実施形態では、NLS配列は、表8に収載される配列を含む。一部の実施形態では、NLSシグナル配列は、ヒトNLSである。一部の実施形態では、ヒトNLSシグナル配列は、ヒトpRB-NLSまたはヒトpRB-NLS(延長バージョン)である。
一部の実施形態では、シグナル配列は、1つまたは複数のNES配列を含む。一部の実施形態では、1つまたは複数のNES配列は、表9に収載される配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の標的RNA結合性融合タンパク質は、タグ配列を含む。一部の実施形態では、タグ配列は、FLAGタグである。
一部の実施形態では、FLAGタグ配列は、DYKDDDDK(配列番号436)である。
リンカー配列
一部の実施形態では、標的RNA結合性融合タンパク質は、リンカー配列を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個またはその間の任意の数のアミノ酸を含み得るまたはそれからなり得る。一部の実施形態では、リンカー配列は、表10に収載されるリンカー配列を含む。
プロモーター配列
態様では、本開示のCAG標的化組成物は、プロモーター配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるいずれかのプロモーターを、本明細書に開示されるRNA標的化構築物に関して述べられる他のプロモーターのいずれかの代わりに用いることができる。一部の態様では、CAG標的化組成物は、短縮化CAG(tCAG)プロモーター(配列番号385)を含む。一部の態様では、CAG標的化組成物は、短いEF1-アルファ(EFS)プロモーター(配列番号520)を含む。一部の態様では、CAG標的化組成物は、配列番号613で示されるEFS-UBBプロモーターを含む。一部の態様では、CAG標的化組成物は、配列番号627で示されるヒトシナプシンプロモーターを含む。一部の実施形態では、本開示のプロモーター配列は、ヒトEF1-アルファコアプロモーター(配列番号642)を含む。一部の実施形態では、本開示のプロモーター配列は、改変されたUBBイントロン(配列番号643)を含む。一部の実施形態では、本開示のプロモーター配列は、改変されたCMVエンハンサー配列(配列番号644)を含む。一部の実施形態では、本開示のプロモーター配列は、eCMV-EFS-UBBプロモーター配列(配列番号645)を含む。
一部の実施形態では、プロモーターによる発現制御は、構成的または遍在性である。非限定的な例示的なプロモーターとしては、Pol IIIプロモーター、例えばU6およびH1プロモーターなど、ならびに/またはPol IIプロモーター、例えばSV40、CMV(必要に応じて、CMVエンハンサーを含む)、RSV(ラウス肉腫ウイルス)LTRプロモーター(必要に応じて、RSVエンハンサーを含む)、CBA(ハイブリッドCMVエンハンサー/ニワトリβ-アクチン)、CAG(ニワトリβ-アクチンと融合したハイブリッドCMVエンハンサー)、短縮化CAG、Cbh(ハイブリッドCBA)、EF-1a(ヒト伸長因子アルファ-1)またはEFS(短い、イントロン不含の、EF-1アルファ)、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)、CEF(ニワトリ胚線維芽細胞)、UBC(ユビキチンC)、GUSB(リソソーム酵素ベータ-グルクロニダーゼ)、UCOE(遍在性クロマチンオープニングエレメント)、hAAT(アルファ-1アンチトリプシン)、TBG(チロキシン結合性グロブリン)、デスミン(全長または短縮化)、MCK(筋クレアチンキナーゼ)、C5-12(合成筋プロモーター)、CK8e(クリアチン(creatin)キナーゼ8)、NSE(ニューロン特異的エノラーゼ)、シナプシン、シナプシン-1(SYN-1)、オプシン、PDGF(血小板由来増殖因子)、PDGF-A、MecP2(メチルCpG結合性タンパク質2)、CaMKII(カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII)、mGluR2(代謝型グルタミン酸受容体2)、NFL(ニューロフィラメント軽鎖)、NFH(ニューロフィラメント重鎖)、nβ2、PPE(ラットプレプロエンケファリン)、ENK(プレプロエンケファリン)、プレプロエンケファリン-ニューロフィラメントキメラプロモーター、EAAT2(グルタミン酸輸送体)、GFAP(グリア細胞線維性酸性タンパク質)、MBP(ミエリン塩基性タンパク質)、ヒトロドプシンキナーゼプロモーター(hGRK1)、β-アクチンプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、MHCK7(筋クレアチンキナーゼおよびアルファミオシン重鎖遺伝子のエンハンサー/プロモーター領域のハイブリッドプロモーター)、ならびにこれらの組合せが挙げられる。「エンハンサー」は、活性化タンパク質が結合して転写の尤度または頻度を増加させることができる、DNAの領域である。非限定的な例示的なエンハンサーおよび転写後調節エレメントとしては、CMVエンハンサー、MCKエンハンサー、HTLV-1のLTR内のR-U5’セグメント、SV40エンハンサー、ウサギβ-グロビンのエクソン2と3の間のイントロン配列、およびWPREが挙げられる。一部の実施形態では、イントロン、例えば、UBBイントロンは、プロモーター活性を増強するために使用される。一部の実施形態では、UBBイントロンは、EFSプロモーターとともに使用される。一部の実施形態では、エンハンサー配列を5’または3’UTR内に付加させることができる。一部の実施形態では、5’エンハンサーは、配列番号657:
で示される、Hsp70であり得る。
ガイドされないRNA結合性融合タンパク質
一部の実施形態では、標的RNA結合性融合タンパク質は、RNAによりガイドされる標的RNA結合性融合タンパク質ではなく、したがって、対応するgRNA配列を有さない標的RNAに結合することができる少なくとも1つのRNA結合性ポリペプチドを含む。そのようなガイドされないRNA結合性ポリペプチドとしては、限定することなく、PUF(PumilioおよびFBFホモロジーファミリー)タンパク質である少なくとも1つのRNA結合性タンパク質またはそのRNA結合性部分が挙げられる。この型のRNA結合性ポリペプチドを、CRISPR/CasなどのgRNAによりガイドされるRNA結合性タンパク質の代わりに使用することができる。mRNAの安定性および翻訳の媒介に関与するPUFタンパク質(Drosophila PumilioおよびC.elegans fem-3結合因子に由来する)の独特のRNA認識方式は当技術分野で周知である。同じく当技術分野で公知のヒトPumilio1のPUFドメインは同族RNA配列に密接に結合し、また、その特異性は改変することができる。ヒトPumilio1のPUFドメインは、8つの連続したRNA塩基を認識する8つのPUFモジュールを含有し、各モジュールが一塩基を認識する。各モジュール内の2つのアミノ酸側鎖は、対応する塩基のワトソン・クリック端を認識し、そのモジュールの特異性が決定されるので、PUFモジュールは、最大の8~16ntのRNAに特異的に結合するように設計することができる。Wang et al., Nat Methods. 2009; 6 (11): 825-830。その全体が参照により本明細書に組み込まれるWO2012/068627も参照されたい。
PUF-RNA相互作用のモジュール的性質は、PUFドメインの結合特異性を合理的に操作するために使用されている(Cheong, C. G. & Hall, T. M. (2006) PNAS 103: 13635-13639;Wang, X. et al (2002) Cell 110: 501-512)。しかし、アデニン、グアニンまたはウラシルを認識するモジュールを有するPUFタンパク質の設計の成功しか、上掲のWO2012/06827の教示より前に報告されていない。野生型PumHDは、シトシン(C)に結合しないが、分子操作によって、Pumユニットの一部が良好な収率および特異性でCに結合するように変異され得ることが示されている。例えば、Dong, S. et al. Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains, The Journal of biological chemistry 286, 26732-26742 (2011)を参照されたい。したがって、PumHDは、RNAの任意の8塩基配列へのプログラム可能な結合を示す、WT Pumilioタンパク質の改変バージョンである。PumHDの8ユニットの各々は、4つ全てのRNA塩基に結合することができ、標的配列に隣接しているRNA塩基は、結合に影響を与えない。PUF設計の当技術分野において認知されているRNA結合規則については以下の参考文献も参照されたい:Filipovska A, Razif MF, Nygard KK, & Rackham O. A universal code for RNA recognition by PUF proteins. Nature chemical biology, 7(7), 425-427 (2011);Filipovska A, & Rackham O. Modular recognition of nucleic acids by PUF, TALE and PPR proteins. Molecular BioSystems, 8(3), 699-708 (2012);Abil Z, Denard CA, & Zhao H. Modular assembly of designer PUF proteins for specific post-transcriptional regulation of endogenous RNA. Journal of biological engineering, 8(1), 7 (2014);Zhao Y, Mao M, Zhang W, Wang J, Li H, Yang Y, Wang Z, & Wu J. Expanding RNA binding specificity and affinity of engineered PUF domains. Nucleic Acids Research, 46(9), 4771-4782 (2018);Shinoda K, Tsuji S, Futaki S, & Imanishi M. Nested PUF Proteins: Extending Target RNA Elements for Gene Regulation. ChemBioChem, 19(2), 171-176 (2018);Koh YY, Wang Y, Qiu C, Opperman L, Gross L, Tanaka Hall TM, & Wickens M. Stacking Interactions in PUF-RNA Complexes. RNA, 17(4), 718-727 (2011)。
しかるが故に、ヒトPUM1(1186個のアミノ酸)が、このタンパク質のC末端にRNA結合性ドメイン(RBD)(Pumilio相同ドメインPUM-HDアミノ酸828~アミノ酸1175としても公知)を含有すること、およびPUFがヒトPUM1のRBDに基づくことは、当技術分野において周知である。RNA結合のための36個のアミノ酸の8つの構造リピートモジュール(43個のアミノ酸を有するモジュール7を除く)、ならびにタンパク質の構造および安定性に重要なフランキングNまたはC末端領域がある。各リピートモジュール内の、アミノ酸12、13および16は、RNA結合にとって重要であり、12および16がRNA塩基認識に関与する。アミノ酸13は、RNA塩基とスタックし、特異性および親和性を調整するために改変され得る。あるいは、PUF設計は、ヒトPUM1のネイティブな残基としてアミノ酸13を維持し得る。本明細書に開示されるPUF(CAG)またはPUMBY(CAG)組成物の一部の実施形態では、アミノ酸13は(スタッキングのために)、Hで操作されることになり、他の実施形態では、Yで操作されることになる。一部の実施形態では、スタッキング残基は、結合および特異性を改善するために改変され得る。認識は、N末端からC末端へPUFが3’から5’へRNAを認識するのとは逆の配向で行われる。したがって、当技術分野において公知の8モジュール(8PUF)のPUF操作は、ヒトタンパク質を模倣する。例示的な8-mer RNA認識(8PUF)は、次のように設計されることになる:R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R8’。一実施形態では、8PUFは、RBDとして使用される。別の実施形態では、8PUF設計のバリエーションが、14-mer RNA認識(14PUF)RBD、15-mer RNA認識(15PUF)RBD、または16-mer RNA認識(16PUF)RBDを作出するために使用される。別の実施形態では、PUFは、4-mer、5-mer、6-mer、7-mer、8-mer、9-mer、10-mer、11-mer、12-mer、13-mer、14-mer、15-mer、16-mer、24-mer、30-mer、36-mer、またはその間の任意の数のモジュールを含むように操作され得る。Shinoda et al., 2018;Criscuolo et al., 2020。野生型ヒトPUM1のリピート1~8が、これをもって配列番号462~469でそれぞれ提供される。ヒトPUM1からのPUFドメインをコードする核酸配列は、配列番号470であり、ヒトPUM1アミノ酸828~1176からのPUFドメインのアミノ酸配列は、配列番号471である。その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許9,580,714も参照されたい。
本開示のガイドされないRNA結合性融合タンパク質の一部の実施形態では、融合タンパク質は、PUMBY(Pumilioに基づくアセンブリ)タンパク質である少なくとも1つのRNA結合性タンパク質またはそのRNA結合性部分を含む。RNAを標的とするためネイティブな形態および改変された形態で広く使用されているRNA結合性タンパク質PumHDは、それぞれが1つのRNA塩基を標的とする4つの標準的なタンパク質モジュールのセットをもたらすように設計したタンパク質構造に操作されている。これらのモジュール(すなわち、Pumilioに基づくアセンブリに関してはPumby)を、所望の標的RNAに結合するように様々な組成および長さの鎖に連結される。本質的に、PUMBYは、PumHDの単一のタンパク質ユニットが連結されて任意のサイズおよび結合性配列特異性のアレイになる、より単純なモジュール形態のPumHDである。そのようなPumby-RNA相互作用の特異性は高く、Pumby鎖の、標的配列から3つまたはそれよりも多くのミスマッチを有するRNA配列への結合は検出不可能である。Katarzyna et al., PNAS, 2016; 113 (19): E2579-E2588。その全体が参照により本明細書に組み込まれるUS2016/0238593も参照されたい。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第1のRNA結合性タンパク質は、PumilioおよびFBF(PUF)タンパク質を含む。一部の実施形態では、第1のRNA結合性タンパク質は、Pumilioに基づくアセンブリ(PUMBY)タンパク質を含む。一部の実施形態では、PUFまたはPUMBY RNA結合性タンパク質は、E17などのヌクレアーゼドメインと融合している。
本開示の組成物の一部の実施形態では、RNA結合性タンパク質またはそのRNA結合性部分の少なくとも1つは、PPRタンパク質である。PPRタンパク質(植物に由来するペンタトリコペプチドリピート(PPR)モチーフを有するタンパク質)は、核にコードされ、RNAレベルで、細胞小器官(葉緑体およびミトコンドリア)、切り取り(cutting)、翻訳、スプライシング、RNAの編集、RNA安定性に特異的に作用する遺伝子を排他的に制御する。PPRタンパク質は、一般には、35アミノ酸のモチーフであり、PPRモチーフが約10個の連続したアミノ酸である構造を有する。PPRモチーフの組合せをRNAへの配列選択的結合に使用することができる。PPRタンパク質は、多くの場合、約10リピートドメインのPPRモチーフで構成される。PPRドメインまたはRNA結合性ドメインは、触媒として不活性になるように構成することができる。その全体が参照により本明細書に組み込まれるWO2013/058404。
一部の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質は、少なくとも2つのRNA結合性ポリペプチド間のリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、VDTANGS(配列番号411)である。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、トリペプチドGGSの1つまたは複数のリピートを含む。他の実施形態では、リンカーは、非ペプチドリンカーである。一部の実施形態では、非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、co-ポリ(エチレン/プロピレン)グリコール、ポリオキシエチレン(POE)、ポリウレタン、ポリホスファゼン、多糖、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ヘパリン、またはアルキルリンカーを含む。
一部の実施形態では、少なくとも1つのRNA結合性タンパク質は、RNA結合活性のために多量体形成を必要としない。一部の実施形態では、少なくとも1つのRNA結合性タンパク質は、多量体複合体の単量体ではない。一部の実施形態では、多量体タンパク質複合体は、RNA結合性タンパク質を含まない。一部の実施形態では、少なくとも1つのRNA結合性タンパク質は、RNA分子内の標的配列に選択的に結合する。一部の実施形態では、少なくとも1つのRNA結合性タンパク質は、RNA分子内の第2の配列に対する親和性を含まない。一部の実施形態では、少なくとも1つのRNA結合性タンパク質は、RNA分子内の第2の配列に対して高い親和性を含まずそれに選択的に結合しない。一部の実施形態では、少なくとも1つのRNA結合性タンパク質は、終点を含めて、2アミノ酸から1300アミノ酸の間を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質の少なくとも1つのRNA結合性タンパク質は、核局在化シグナル(NLS)をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、核局在化シグナル(NLS)は、RNA結合性タンパク質のN末端に位置する。一部の実施形態では、少なくとも1つのRNA結合性タンパク質は、NLSをC末端に含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのRNA結合性タンパク質は、第1のNLSをコードする第1の配列および第2のNLSをコードする第2の配列をさらに含む。一部の実施形態では、第1のNLSまたは第2のNLSは、RNA結合性タンパク質のN末端に位置する。一部の実施形態では、少なくとも1つのRNA結合性タンパク質は、第1のNLSまたは第2のNLSをC末端に含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのRNA結合性タンパク質は、NES(核外輸送シグナル)または他のペプチドタグまたは分泌シグナルをさらに含む。一部の実施形態では、タグは、FLAGタグである。
一部の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質は、第1のRNA結合性タンパク質として少なくとも1つのRNA結合性タンパク質を含み、それと共に、ヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる第2のRNA結合性タンパク質を含む。
一部の実施形態では、第2のRNA結合性ポリペプチドは、第1のRNA結合性ポリペプチドのC末端において第1のRNA結合性ポリペプチドに対して作動可能に構成されている。一部の実施形態では、第2のRNA結合性ポリペプチドは、第1のRNA結合性ポリペプチドのN末端において第1のRNA結合性ポリペプチドに対して作動可能に構成されている。一実施形態では、例示的な融合タンパク質は、ZC3H12Aとして公知のジンクフィンガーエンドヌクレアーゼであるまたはその短縮化が配列番号358で示される第2のRNA結合性タンパク質(E17とも呼ばれる)と融合している、PUFまたはPUMBYに基づく第1のRNA結合性タンパク質である。
AGCAGCAG(配列番号472)を標的とする例示的な8-mer RNA認識(8PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号444は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号444は、表11で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
GCAGCAGC(配列番号476)を標的とする例示的な8-mer RNA認識(8PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号656は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。
一部の態様では、本開示のPUFタンパク質は、改善されたスタッキングのために改変され得る。改善されたスタッキングのために可能な変異が表Tに収載される。一部の実施形態では、PUFモジュールR1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、1’および8’を、本開示のPUFタンパク質のために任意の数でおよび任意の順序で組み合わせることができる。
AGCAGCAGCAGCAG(配列番号473)を標的とする例示的な14-mer RNA認識(14PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号445は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号445は、表12で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
AGCAGCAGCAGCAG(配列番号473)を標的とする例示的な14-mer RNA認識(14PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号446は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号446は、表13で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
AGCAGCAGCAGCAGC(配列番号474)を標的とする例示的な15-mer RNA認識(15PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号447は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号447は、表14で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
AGCAGCAGCAGCAGC(配列番号474)を標的とする例示的な15-mer RNA認識(15PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号448は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号448は、表15で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
AGCAGCAGCAGCAGC(配列番号474)を標的とする例示的な15-mer RNA認識(15PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号461は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号461は、表16で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
AGCAGCAGCAGCAGCA(配列番号475)を標的とする例示的な16-mer RNA認識(16PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号449は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号449は、表17で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
AGCAGCAGCAGCAGCA(配列番号475)を標的とする例示的な16-mer RNA認識(16PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号450は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号450は、表18で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
AGCAGCAGCAGCAGCA(配列番号475)を標的とする例示的な16-mer RNA認識(16PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号451は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号451は、表19で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
CAGCAGCA(配列番号453)を標的とする例示的な8-mer RNA認識(8PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号480は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号480は、表20で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
CAGCAGCAGCAGCA(配列番号454)を標的とする例示的な14-mer RNA認識(14PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号481は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号481は、表21で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
CAGCAGCAGCAGCA(配列番号454)を標的とする例示的な14-mer RNA認識(14PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号482は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号482は、表22で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
CAGCAGCAGCAGCAG(配列番号455)を標的とする例示的な15-mer RNA認識(15PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号483は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号483は、表23で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
CAGCAGCAGCAGCAG(配列番号455)を標的とする例示的な15-mer RNA認識(15PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号484は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号484は、表24で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
CAGCAGCAGCAGCAG(配列番号455)を標的とする例示的な15-mer RNA認識(15PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号485は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号485は、表25で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
CAGCAGCAGCAGCAGC(配列番号456)を標的とする例示的な16-mer RNA認識(16PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号486は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号486は、表26で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
CAGCAGCAGCAGCAGC(配列番号456)を標的とする例示的な16-mer RNA認識(16PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号487は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号487は、表27で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
CAGCAGCAGCAGCAGC(配列番号456)を標的とする例示的な16-mer RNA認識(16PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号488は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号488は、表28で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
GCAGCAGC(配列番号476)を標的とする例示的な8-mer RNA認識(8PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号549は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号549は、表29で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
GCAGCAGCAGCAGC(配列番号477)を標的とする例示的な14-mer RNA認識(14PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号550は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号550は、表30で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
GCAGCAGCAGCAGC(配列番号477)を標的とする例示的な14-mer RNA認識(14PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号551は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号551は、表31で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
GCAGCAGCAGCAGCA(配列番号478)を標的とする例示的な15-mer RNA認識(15PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号552は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号552は、表32で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
GCAGCAGCAGCAGCA(配列番号478)を標的とする例示的な15-mer RNA認識(15PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号553は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R7--R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号553は、表33で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
GCAGCAGCAGCAGCA(配列番号478)を標的とする例示的な15-mer RNA認識(15PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号554は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号554は、表34で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
GCAGCAGCAGCAGCAG(配列番号479)を標的とする例示的な16-mer RNA認識(16PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号555は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号555は、表35で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
GCAGCAGCAGCAGCAG(配列番号479)を標的とする例示的な16-mer RNA認識(16PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号556は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号556は、表36で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
GCAGCAGCAGCAGCAG(配列番号479)を標的とする例示的な16-mer RNA認識(16PUF)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号557は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号557は、表37で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
一部の実施形態では、本開示のPUFタンパク質をコードする核酸配列は、コドン最適化された核酸配列である。一部の実施形態では、PUFタンパク質をコードするコドン最適化された配列は、ヒト対象において、野生型のまたはコドン最適化されていない核酸配列と比べて、発現の少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも500%、または少なくとも1000%増加を示す。一部の実施形態では、本開示の8PUFタンパク質は、配列番号576または581を含む核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、CAG標的化融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、5’から3’へ、flagタグ、H2B核局在化配列、8PUF、およびE17ヌクレアーゼを含み、配列番号578で示される。一部の実施形態では、CAG標的化融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、5’から3’へ、H2B核局在化配列、8PUF、E17ヌクレアーゼ、およびPKI NESを含み、配列番号575で示される。一部の実施形態では、CAG標的化融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号577では、5’から3’へ、H2B核局在化配列、8PUF、およびE17ヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、CAG標的化融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、5’から3’へ、H2B核局在化配列、8PUF、およびE17ヌクレアーゼを含み、配列番号579で示される。一部の実施形態では、CAG標的化融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、5’から3’へ、H2B核局在化配列、8PUF、E17ヌクレアーゼ、およびPKI核外輸送配列を含み、配列番号574で示される。一部の実施形態では、CAG標的化融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、5’から3’へ、RB NLS、8PUF、およびE17ヌクレアーゼを含み、配列番号580または582で示される。
一部の実施形態では、本開示のPUFタンパク質をコードする核酸配列は、コドン最適化された核酸配列である。一部の実施形態では、PUFタンパク質をコードするコドン最適化された配列は、ヒト対象において、野生型のまたはコドン最適化されていない核酸配列と比べて、翻訳の少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも500%、または少なくとも1000%増加を示す。
一部の態様では、配列番号574~582で提示されるものなどの、PUFタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、安定性の増大を示す。一部の態様では、PUFタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、耐加水分解性の増大によって安定性の増大を示す。一部の実施形態では、PUFタンパク質をコードするコドン最適化された配列は、野生型のまたはコドン最適化されていない核酸配列と比べて、安定性の少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも500%、または少なくとも1000%増大を示す。一部の実施形態では、PUFタンパク質をコードするコドン最適化された配列は、ヒト対象において、野生型のまたはコドン最適化されていない核酸配列と比べて、耐加水分解性の少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも500%、または少なくとも1000%増大を示す。
一部の態様では、配列番号574~582で提示されるものなどの、PUFタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、ドナースプライス部位を含み得ない。一部の態様では、PUFタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、約1つ、または約2つ、または約3つ、または約4つ、または約5つ、または約6つ、または約7つ、または約8つ、または約9つ、または約10以下のドナースプライス部位を含み得る。一部の態様では、PUFタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、PUFタンパク質をコードするコドン最適化されていない核酸配列と比較して、少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つ、または少なくとも4つ、または少なくとも5つ、または少なくとも6つ、または少なくとも7つ、または少なくとも8つ、または少なくとも9つ、または少なくとも10少ない、ドナースプライス部位を含む。
理論により拘束されることを望まないが、コドン最適化された核酸配列におけるドナースプライス部位の除去は、隠れたスプライシングが防止されるので、in vivoでPUFタンパク質の発現を予想外におよび予測不能に増加させることができる。さらに、隠れたスプライシングは、対象によって異なることがあり、これは、ドナースプライス部位を含むPUFタンパク質の発現レベルが、予測不能に対象によって異なることがあることを意味する。ヒトの治療に関して、このような予測不能性は受入れ難い。それに応じて、ドナースプライス部位を欠いている配列番号574~582で提示されるコドン最適化された核酸配列は、予想外におよび驚くべきことに、ヒト対象におけるPUFタンパク質の発現増加を可能にし、PUFタンパク質の発現をヒト対象の違いを超えて規則化する。
一部の態様では、配列番号574~582で提示されるものなどの、PUFタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、PUFタンパク質をコードするコドン最適化されていない核酸配列のGC含量とは異なるGC含量を有し得る。一部の態様では、PUFタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列のGC含量は、PUFタンパク質をコードするコドン最適化されていない核酸配列と比較して、核酸配列全体にわたってより均一に分布している。
理論により拘束されることを望まないが、核酸配列全体にわたってより均一にGC含量を分布させることによって、コドン最適化された核酸配列は、転写物長にわたってより均一な融解温度(「Tm」)を示す。融解温度の均一性は、ポリメラーゼおよび/またはリボソームがあまり失速せずに核酸配列の転写および/または翻訳が起こるので、ヒト対象におけるコドン最適化された核酸の発現増加を予想外にもたらす。
一部の態様では、配列番号574~582で提示されるものなどの、PUFタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、PUFタンパク質をコードするコドン最適化されていない核酸配列と比較して、より少ない抑制的マイクロRNA標的結合性部位を有し得る。一部の態様では、PUFタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、コドン最適化されていない核酸配列、PUFタンパク質と比較して、少なくとも1つ、もしくは少なくとも2つ、もしくは少なくとも3つ、もしくは少なくとも4つ、もしくは少なくとも5つ、もしくは少なくとも6つ、もしくは少なくとも7つ、もしくは少なくとも8つ、もしくは少なくとも9つ、もしくは少なくとも10の、または少なくとも10少ない、抑制的マイクロRNA標的結合性部位を有し得る。
理論により拘束されることを望まないが、より少ない抑制的マイクロRNA標的結合性部位を有することによって、PUFタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、ヒト対象において発現の増加を予想外に示す。
CAGCAGCAGCAGCA(配列番号454)を標的とする例示的な14-mer RNA認識(14PUMBY)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号548は、R1’-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号548は、表38で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
GCAGCAGCAGCAGC(配列番号477)を標的とする例示的な14-mer RNA認識(14PUMBY)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号558は、R1’-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号558は、表39で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
AGCAGCAGCAGCAG(配列番号473)を標的とする例示的な14-mer RNA認識(14PUMBY)は、アミノ酸配列:
を含む。一部の態様では、配列番号547は、R1’-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R6-R8’に従ってN末端からC末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号547は、表40で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
一部の態様では、本開示の融合タンパク質は、配列番号444~451、461、480-488または549~557によるPUFを含む。一部の態様では、本開示の融合タンパク質は、表41~49のいずれか1つに示されるようにN末端からC末端に配置される。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドRNAを含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドRNAを少なくとも1つ含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドRNAを1つまたは複数含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドRNAを2つまたはそれよりも多く含む。一実施形態では、ベクターは、3つのガイドRNAを含む。一実施形態では、ベクターは、4つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドされるまたはガイドされないRNA結合性タンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のRNA結合性融合タンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、第1のRNA結合性タンパク質および第2のRNA結合性タンパク質を含む。一部の実施形態では、RNA結合性タンパク質とgRNAとを含む、RNAによりガイドされるRNA結合性の系は、単一のベクター内に存在する。特定の実施形態では、単一のベクターは、Cas13d RNAによりガイドされるRNA結合性の系、または触媒的に不活性化されているCas13d(dCas13d) RNAによりガイドされるRNA結合性の系である、RNAによりガイドされるRNA結合性の系を含む。一実施形態では、単一のベクターは、CasRxまたはdCasRx RNAによりガイドされるRNA結合性の系である、Cas13d RNAによりガイドされるRNA結合性の系を含む。別の実施形態では、単一のベクターは、E17(配列番号358)などのZC3H12Aからのヌクレアーゼドメインと融合した、PUFまたはPUMBYに基づくタンパク質を含む、ガイドされないRNA結合性の系を含む。別の実施形態では、単一のベクターは、E17(配列番号359)などのZC3H12Aからのヌクレアーゼドメインと融合した、dCas13d RNA結合性の系を含む。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、第1のベクターが本開示のガイドRNAを含み、第2のベクターが本開示のRNA結合性タンパク質またはRNA結合性融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、第1のベクターは、本開示のガイドRNAを少なくとも1つ含む。一部の実施形態では、第1のベクターは、本開示のガイドRNAを1つまたは複数含む。一部の実施形態では、第1のベクターは、本開示のガイドRNAを2つまたはそれよりも多く含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、第1のRNA結合性タンパク質と第2のRNA結合性タンパク質とを含む。一部の実施形態では、第1のベクターと第2のベクターは同一のベクターまたはベクター血清型である。一部の実施形態では、第1のベクターと第2のベクターは同一ではないベクターまたはベクター血清型である。本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、毒性CAG RNAリピートを標的とすることができるRNA結合性の系は、単一のベクター内に存在する。
1つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、プラスミドは、追加のDNAセグメントが、例えば標準的な分子クローニング技法により、挿入され得る、環状二本鎖DNAループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルス由来のDNAまたはRNA配列が、ウイルス(例えば、レトロウイルス、複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損型アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)へのパッケージングのためのベクター内に存在する、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含む。一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルス(例えば、組込み欠損型レンチウイルスベクター)またはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。ベクター、例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターなどは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができ、エピソーム哺乳動物ベクター、および他のベクター、例えば非エピソーム哺乳動物ベクターなどは、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。
一部の実施形態では、ベクター、例えば、発現ベクターなどは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。一般的な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、本明細書において提供される核酸、例えば、DNA配列から発現され得るガイドRNA、およびCas 13dタンパク質をコードする核酸などを、宿主細胞におけるタンパク質の発現に好適な形態で含む。組換え発現ベクターは、発現に使用されることになる宿主細胞に基づいて選択され得る1つまたは複数の調節エレメントであって、発現されることになる核酸配列に作動可能に連結されている調節エレメントを含む。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結されている」は、目的のヌクレオチド配列が、例えば、in vitro転写/翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入されたときに宿主細胞において、などにおいて、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で、調節エレメントに連結されていることを意味するように意図されている。ベクターのある特定の実施形態は、形質転換されることになる宿主細胞の選択、および所望される発現レベルなどの、因子に依存する。ベクターを宿主細胞に導入して、それによって、例えば、CRISPR転写物、タンパク質、酵素、その変異体形態、その融合タンパク質などのような、本明細書に記載の核酸によりコードされる融合タンパク質またはペプチドを含む、転写物、タンパク質、またはペプチドを産生することができる。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、複製能力がない。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、単離されたものまたは組み換えられたものである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、自己相補的である。
用語「アデノ随伴ウイルス」または「AAV」は、本明細書で使用される場合、この名前に関連するウイルスの綱のメンバーであって、Parvoviridae科、Dependoparvovirus属に属するメンバーを指す。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能がヘルパーウイルスの同時感染により提供される細胞において成長する一本鎖DNAウイルスである。AAVの一般的な情報および総説は、例えば、Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169- 228、およびBerns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)において見つけることができる。これらの総説に記載されている同じ原理が、これらの総説の発表日後に特徴付けられた追加のAAV血清型に適用可能であることは、十分に予想される。なぜなら、多様な血清型が、構造的にも機能的にも、さらには遺伝子レベルで、非常に密接に関連していることは周知であるからである。(例えば、Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.;およびRose, Comprehensive Virology 3: 1-61 (1974)を参照されたい)。例えば、全てのAAV血清型は、相同rep遺伝子により媒介される非常に類似した複製特性を示すようであり、全てが、3つの関連カプシドタンパク質、例えば、AAV2に発現されるものを有する。この類似度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の過度の交差ハイブリダイゼーションを明示するヘテロ二本鎖解析;および「末端逆位反復配列」(ITR)に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在によってさらに示唆される。類似した感染力パターンも、各血清型における複製機能が、類似した調節制御下にあることを示唆する。このウイルスの複数の血清型は、遺伝子送達に好適であることが公知であり、あらゆる公知血清型が、種々の組織型からの細胞に感染し得る。
AAVは、そのAAVを、例えば遺伝子治療において、外来DNAを細胞に送達するベクターとして魅力的なものにする、独特の特徴を有する。培養下の細胞のAAV感染は、非細胞変性性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、無症状および無症候性である。さらに、AAVは、多くの哺乳動物細胞に感染し、それによって、in vivoで多くの異なる組織を標的とする可能性が認められる。さらに、AAVは、分裂および非分裂細胞に緩徐に形質導入し、本質的にこれらの細胞の寿命にわたって転写活性核エピソーム(染色体外エレメント)として存続することができる。AAVプロウイルスゲノムは、プラスミド内にクローン化DNAとして挿入され、そのため組換えゲノムの構築が実現可能になる。さらに、AAVの複製およびゲノムカプシド封入を指示するシグナルがAAVゲノムのITR内に含有されているため、AAVベクターを生成するために内部のおおよそ4.3kbのゲノム(複製および構造カプシドタンパク質、rep-cap、をコードする)の一部または全てを外来DNAに置き換えることができる。repおよびcapタンパク質をin transで提供することができる。AAVのもう1つの有意な特徴は、極めて安定している丈夫なウイルスであることである。AAVは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件(56℃~65℃、数時間)にたやすく耐え、そのためAAVの低温保存があまり重要でなくなる。AAVを凍結乾燥させることさえできる。最終的に、AAV感染細胞は、重複感染に対して耐性がない。
本発明の組換えAAV(rAAV)ゲノムは、CAGリピート標的化組成物(例えば、PUF、PUMBY、またはRNAによりガイドされるタンパク質)をコードする核酸分子、およびその核酸分子に隣接している1つまたは複数のAAV ITRを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。偽型rAAVの産生は、例えば、WO2001083692において開示されている。他のタイプのrAAVバリアント、例えば、カプシド変異を有するrAAVも、企図される。例えば、Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)を参照されたい。様々なAAV血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当技術分野において公知である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10(AAVrh10)、AAV11またはAAV12のAAVから単離されるまたはそれに由来する、末端逆位反復配列またはカプシド配列を含む。一部の実施形態では、AAV血清型は、AAVrh.74である。一実施形態では、AAVベクターは、改変されたカプシドを含む。一実施形態では、AAVベクターは、AAV2-Tyr変異体ベクターである。一実施形態では、AAVベクターは、非チロシンアミノ酸が、野生型AAV2の位置Tyr252、Tyr272、Tyr275、Tyr281、Tyr508、Tyr612、Tyr704、Tyr720、Tyr730またはTyr673の表面露出チロシン残基に対応する位置にある、カプシドを含む。その全体が本明細書に組み込まれるWO2008/124724も参照されたい。一部の実施形態では、AAVベクターは、操作されたカプシドを含む。操作されたカプシドを含むAAVベクターとしては、限定することなく、AAV2.7m8、AAV9.7m8、AAV2 2tYF、およびAAV8 Y733F)が挙げられる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、複製能力がない。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、単離されたものまたは組み換えられたもの(rAAV)である。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、自己相補的(scAAV)である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のベクターは、非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、ナノ粒子、ミセル、リポソームまたはリポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックスまたはデンドリマーを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ベクターは、発現ベクターまたは組換え発現系である。本明細書で使用される場合、「組換え発現系」という用語は、組換えによって形成されたある特定の遺伝子材料を発現させるための遺伝子構築物を指す。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本明細書に提示される発現ベクター、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは、これだけに限定することなく、発現制御エレメントを含む。「発現制御エレメント」は、本明細書で使用される場合、遺伝子などのコード配列の発現を調節する任意の配列を指す。例示的な発現制御エレメントとしては、これだけに限定されないが、プロモーター、エンハンサー、マイクロRNA、転写後調節エレメント、ポリアデニル化シグナル配列、およびイントロンが挙げられる。発現制御エレメントは、例えば、構成的、誘導性、抑制性、または組織特異的であり得る。「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域である制御配列である。プロモーターは、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節性タンパク質および分子が結合することができる遺伝子エレメントを含有し得る。一部の実施形態では、プロモーターによる発現制御は、組織特異的である。一部の実施形態では、プロモーターによる発現制御は、構成的または遍在性である。非限定的な例示的なプロモーターとしては、Pol IIIプロモーター、例えばU6およびH1プロモーターなど、ならびに/またはPol IIプロモーター、例えばSV40、CMV(必要に応じて、CMVエンハンサーを含む)、RSV(ラウス肉腫ウイルス)LTRプロモーター(必要に応じて、RSVエンハンサーを含む)、CBA(ハイブリッドCMVエンハンサー/ニワトリβ-アクチン)、CAG(ニワトリβ-アクチンと融合したハイブリッドCMVエンハンサー)、短縮化CAG、Cbh(ハイブリッドCBA)、EF-1a(ヒト伸長因子アルファ-1)またはEFS(短い、イントロン不含の、EF-1アルファ)、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)、CEF(ニワトリ胚線維芽細胞)、UBC(ユビキチンC)、GUSB(リソソーム酵素ベータ-グルクロニダーゼ)、UCOE(遍在性クロマチンオープニングエレメント)、hAAT(アルファ-1アンチトリプシン)、TBG(チロキシン結合性グロブリン)、デスミン(全長(配列番号654)または短縮化(配列番号655))、MCK(筋クレアチンキナーゼ)、C5-12(合成筋プロモーター)、CK8e(クリアチンキナーゼ8)、NSE(ニューロン特異的エノラーゼ)、シナプシン、シナプシン-1(SYN-1)、オプシン、PDGF(血小板由来増殖因子)、PDGF-A、MecP2(メチルCpG結合性タンパク質2)、CaMKII(カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII)、mGluR2(代謝型グルタミン酸受容体2)、NFL(ニューロフィラメント軽鎖)、NFH(ニューロフィラメント重鎖)、nβ2、PPE(ラットプレプロエンケファリン)、ENK(プレプロエンケファリン)、プレプロエンケファリン-ニューロフィラメントキメラプロモーター、EAAT2(グルタミン酸輸送体)、GFAP(グリア細胞線維性酸性タンパク質)、MBP(ミエリン塩基性タンパク質)、ヒトロドプシンキナーゼプロモーター(hGRK1)、β-アクチンプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、MHCK7(筋クレアチンキナーゼおよびアルファミオシン重鎖遺伝子のエンハンサー/プロモーター領域のハイブリッドプロモーター)、ならびにこれらの組合せが挙げられる。「エンハンサー」は、活性化タンパク質が結合して転写の尤度または頻度を増加させることができる、DNAの領域である。非限定的な例示的なエンハンサーおよび転写後調節エレメントとしては、CMVエンハンサー、MCKエンハンサー、HTLV-1のLTR内のR-U5’セグメント、SV40エンハンサー、ウサギβ-グロビンのエクソン2と3の間のイントロン配列、ならびにウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)転写後調節エレメント(WPRE)が挙げられる。一部の実施形態では、イントロン、例えば、UBBイントロンは、プロモーター活性を増強するために使用される。一部の実施形態では、UBBイントロンは、EFSプロモーターとともに使用される。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本明細書に提示される発現ベクター、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは、これだけに限定することなく、「マルチシストロン性」または「ポリシストロン性」または「バイシストロン性」または「トリシストロン性」構築物の配置(configuration)のためのIRESまたは2Aペプチド部位を含む、すなわち、二重もしくは三重もしくは多重のコード領域またはエクソンなどのベクターエレメントを有し、したがって、単一の構築物から、mRNAから2つまたはそれよりも多くのタンパク質を発現させる能力を有する。マルチシストロン性ベクターは、同じmRNAから2つまたはそれよりも多くの別々のタンパク質を同時に発現させる。マルチシストロン性配置を構築するために最も広く使用されている2つの戦略は、IRESまたは2A自己切断部位を使用することである。「IRES」は、ポリシストロニックベクター構築物に使用される、ウイルス、原核生物、または真核生物を起源とする配列内リボソーム進入部位またはその一部を指す。一部の実施形態では、IRESは、キャップ依存的に翻訳開始を可能にするRNAエレメントである。「自己切断ペプチド」または「自己切断ペプチドをコードする配列」または「2A自己切断部位」という用語は、リボソームスキッピングを促進するため、したがって、単一のプロモーターから2つのポリペプチドを生成するための部位を組み入れるためにベクター構築物内に使用される連結配列を指す。そのような自己切断ペプチドとしては、これだけに限定することなく、T2Aペプチド、およびP2Aペプチドまたは自己切断ペプチドをコードする配列が挙げられる。
一実施形態では、例示的なベクター構成は、図4A~4Cに示される。例示的なベクター構成は、CAG標的化PUF-エンドヌクレアーゼ融合体をコードする核酸の発現を駆動する、プロモーターまたは調節配列(プロモーター/エンハンサーの組合せ)を含む。別の実施形態では、ベクター構成は、RNAによりガイドされるCas RNase RNA結合性タンパク質の発現を駆動するプロモーター、または同族gRNAの発現を駆動する第2のプロモーターと作動可能に連結しているdCasタンパク質融合体を含む。別の実施形態では、ベクター構成は、リンカーおよび1つまたは複数のタグを含む。
一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、またはレンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルス/レトロウイルスキメラベクター、単純ヘルペスウイルスIもしくはIIベクター、パルボウイルスベクター、細網内皮症ウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、乳頭腫ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または2つまたはそれよりも多くのウイルスベクターの好都合な側面が組み入れられた任意のハイブリッドもしくはキメラベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結した1つまたは複数の発現制御エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、ベクターは、1つまたは複数の選択マーカーをさらに含む。一部の実施形態では、AAVベクターは低毒性を有する。一部の実施形態では、AAVベクターは宿主ゲノム内に組み入れられず、それにより、挿入変異誘発が引き起こされる確率が低くなる。一部の実施形態では、AAVベクターは、4.5kbから4.75kbまでの範囲の総ポリヌクレオチドをコードし得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物、系、方法、およびキットのいずれかに使用することができる例示的なAAVベクターとしては、AAV1ベクター、改変AAV1ベクター、AAV2ベクター、改変AAV2ベクター、AAV2-Tyr変異体ベクター、AAV3ベクター、改変AAV3ベクター、AAV4ベクター、改変AAV4ベクター、AAV5ベクター、改変AAV5ベクター、AAV6ベクター、改変AAV6ベクター、AAV7ベクター、改変AAV7ベクター、AAV8ベクター、AAV9ベクター、AAV.rh10ベクター、改変AAV.rh10ベクター、AAVrh.74、AAV.rh32/33ベクター、改変AAV.rh32/33ベクター、AAV.rh43ベクター、改変AAV.rh43ベクター、AAV.rh64R1ベクター、AAV-Tyr変異体ベクター、および改変AAV.rh64R1ベクターおよび任意の組合せまたはその等価物を挙げることができる。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼコンピテントレンチウイルスベクター(ICLV)である。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子プラスミドベクターならびに関連するプラスミド(例えば、パッケージングプラスミド、rev発現プラスミド、エンベローププラスミド)と併せた導入遺伝子プラスミドベクターならびにウイルスまたはウイルス様侵入機構によって外因性核酸を細胞に導入することができるレンチウイルスに基づく粒子を指し得る。レンチウイルスベクターは、当技術分野で周知である(例えば、Trono D. (2002) Lentiviral vectors, New York: Spring-Verlag Berlin HeidelbergおよびDurand et al. (2011) Viruses 3 (2): 132-159 doi: 10.3390/v3020132を参照されたい)。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物、系、方法、およびキットのいずれかに使用することができる例示的なレンチウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)1ベクター、改変ヒト免疫不全ウイルス(HIV)1ベクター、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)2ベクター、改変ヒト免疫不全ウイルス(HIV)2ベクター、スーティーマンガベイサル免疫不全ウイルス(SIVSM)ベクター、改変スーティーマンガベイサル免疫不全ウイルス(SIVSM)ベクター、アフリカミドリザルサル免疫不全ウイルス(SIVAGM)ベクター、改変アフリカミドリザルサル免疫不全ウイルス(SIVAGM)ベクター、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)ベクター、改変ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)ベクター、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)ベクター、改変ネコ免疫不全ウイルス(FIV)ベクター、ビスナ/マエディウイルス(VNV/VMV)ベクター、改変ビスナ/マエディウイルス(VNV/VMV)ベクター、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)ベクター、改変ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)ベクター、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、または改変ウシ免疫不全ウイルス(BIV)を挙げることができる。
核酸
核酸
本明細書に記載の遺伝子移入および発現技法における使用のための、本明細書に開示されるRNA結合性CAGリピート標的化系をコードする核酸配列が本明細書に提示される。必ずしも明記されていないが、本明細書に提示される配列を使用して、同じ生物学的性質を有するタンパク質を生じさせる発現産物ならびに実質的に同一の配列をもたらすことができることが理解されるべきである。これらの「生物学的に等価の」または「生物活性ある」または「等価の」ポリペプチドは、本明細書に記載の等価のポリヌクレオチドによってコードされる。これらは、デフォルトの条件下で実行される配列同一性方法を使用して比較した場合に、参照ポリペプチドに対して少なくとも60%、あるいは少なくとも65%、あるいは少なくとも70%、あるいは少なくとも75%、あるいは少なくとも80%、あるいは少なくとも85%、あるいは少なくとも90%、あるいは少なくとも95%あるいは少なくとも98%同一の一次アミノ酸配列を有することができる。特定の実施形態の例として特定のポリペプチド配列が提示されている。同様の電荷を有する代替のアミノ酸を用いたアミノ酸への配列の改変。さらに、等価のポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドもしくはその相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである、またはポリペプチドに関しては、参照コードポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。あるいは、等価のポリペプチドまたはタンパク質は、等価のポリヌクレオチドから発現されるものである。
本明細書に開示される核酸配列(例えば、ポリヌクレオチド配列)は、当技術分野で周知の技法であるコドン最適化がなされたものであり得る。本明細書に開示される一部の実施形態では、例えば配列番号92(CasRxとして公知のCas13d)をコードする核酸配列または配列番号298(CasRxとして公知のCas13d)をコードする核酸配列などの例示的なCas配列は、ヒト細胞における発現に関してコドン最適化されている。コドン最適化は、異なる細胞では特定のコドンの使用が異なるという事実を指す。このコドンの偏りは、細胞型における特定のtRNAの相対的な存在量の偏りに対応する。配列内のコドンを対応するtRNAの相対的な存在量と釣り合うように変更することにより、発現を増加させることが可能である。対応するtRNAが特定の細胞型において稀であることが分かっているコドンを故意に選択することによって発現を低減させることも可能である。哺乳動物細胞に関して、ならびに種々の他の生物体に関してコドン使用表が当技術分野で公知である。遺伝暗号に基づいて、例えばCasタンパク質をコードする核酸配列を生成することができる。一部の実施形態では、そのような配列を、例えば、Casタンパク質を発現する宿主細胞または開示されている方法が実施される細胞(例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞など)を使用するなど、宿主または標的細胞における発現に関して最適化する。特定の種についてのコドンの選好およびコドン使用表を使用して、その特定の種のコドン使用選好性(codon usage preference)を活用する、Casタンパク質をコードする単離された核酸分子(例えば、その対応する野生型タンパク質に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%配列同一性を有するタンパク質をコードするものなど)を操作することができる。例えば、本明細書に開示されるCasタンパク質を、目的の特定の生物体によって優先的に使用されるコドンを有するように設計することができる。一実施例では、Cas核酸配列は、例えば、その対応する野生型または起源核酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%配列同一性を有するものなど、ヒト細胞における発現に関して最適化されたものである。一部の実施形態では、少なくとも1つのCasタンパク質(ベクターの一部であり得る)をコードする単離された核酸分子は、真核細胞における発現に関してコドン最適化された少なくとも1つのCasタンパク質コード配列、またはヒト細胞における発現に関してコドン最適化された少なくとも1つのCasタンパク質コード配列を含む。一実施形態では、そのようなコドン最適化されたCasコード配列は、その対応する野生型または起源配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%配列同一性を有する。別の実施形態では、真核細胞のコドン最適化された核酸配列は、その対応する野生型または起源タンパク質に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%配列同一性を有するCasタンパク質をコードする。別の実施形態では、配列は異なるが同じCasタンパク質配列をコードする核酸などの、機能的に等価の核酸を含有する種々のクローンを常套的に生成することができる。コード配列内のサイレント変異は、1つよりも多くのコドンが同じアミノ酸残基をコードし得る遺伝暗号の縮退(すなわち、重複性)に起因する。したがって、例えば、ロイシンはCTT、CTC、CTA、CTG、TTA、またはTTGによってコードされ得る;セリンはTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、またはAGCによってコードされ得る;アスパラギンはAATまたはAACによってコードされ得る;アスパラギン酸はGATまたはGACによってコードされ得る;システインはTGTまたはTGCによってコードされ得る;アラニンはGCT、GCC、GCA、またはGCGによってコードされ得る;グルタミンはCAAまたはCAGによってコードされ得る;チロシンはTATまたはTACによってコードされ得る;およびイソロイシンはATT、ATC、またはATAによってコードされ得る。標準の遺伝暗号を示す表は、種々の供給源に見いだすことができる(例えば、Stryer, 1988, Biochemistry,3.sup.rd Edition, W.H. 5 Freeman and Co., NYを参照されたい)。
「ハイブリダイゼーション」は、1つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグスティーン結合、または任意の他の配列特異的様式で存在する。複合体は、二重鎖構造を形成する2つの鎖、多重鎖複合体を形成する3つまたはそれよりも多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、PC反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断などのより広範囲にわたるプロセスのステップを構成し得る。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、インキュベーション温度、約25℃~約37℃;ハイブリダイゼーション緩衝液濃度、約6×SSC~約10×SSC;ホルムアミド濃度、約0%~約25%;および洗浄溶液、約4×SSC~約8×SSCが挙げられる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては、インキュベーション温度、約40℃~約50℃;緩衝液濃度、約9×SSC~約2×SSC;ホルムアミド濃度、約30%~約50%;および洗浄溶液、約5×SSC~約2×SSCが挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、インキュベーション温度、約55℃~約68℃;緩衝液濃度、約1×SSC~約0.1×SSC;ホルムアミド濃度、約55%~約75%;および洗浄溶液、約1×SSC、0.1×SSC、または脱イオン水が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は5分間から24時間までであり、1回、2回、またはそれよりも多くの洗浄ステップを伴い、洗浄インキュベーション時間は、約1分間、2分間、または15分間である。SSCは、0.15MのNaClおよび15mMのクエン酸緩衝液である。他の緩衝液系を使用したSSCの等価物を使用することができることが理解される。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、2つのペプチド間または2つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のためにアラインメントすることができる各配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列内の位置を同じ塩基またはアミノ酸が占めている場合、その分子は、その位置において相同である。配列間の相同性程度は、それらの配列が共有するマッチするまたは相同な位置の数に応じる。「関連しない」または「非相同的」配列は、本発明の配列の1つと40%未満の同一性あるいは25%未満の同一性を共有する。
細胞
細胞
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の細胞は、原核細胞である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の細胞は、真核細胞である。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ウシ類、ネズミ類、ネコ類、ウマ類、ブタ類、イヌ類、サル類、またはヒトの細胞である。一部の実施形態では、細胞は、非ヒト霊長類細胞などの非ヒト哺乳動物細胞である。
一部の実施形態では、本開示の細胞は、体細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、生殖細胞系列細胞である。一部の実施形態では、本開示の生殖細胞系列細胞は、ヒト細胞ではない。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の細胞は、幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、胚性幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の胚性幹細胞は、ヒト細胞ではない。一部の実施形態では、本開示の細胞は、複能性幹細胞または多能性幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、成体幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、造血幹細胞(HSC)である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、神経細胞である。一実施形態では、本明細書に開示される組成物で処置される患者の細胞(単数または複数)としては、限定することなく、中枢神経系(ニューロン)、末梢神経系(ニューロン)、末梢運動ニューロン、および/または感覚ニューロンが挙げられる。一実施形態では、神経細胞は、グリア細胞である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、上皮細胞である。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、線維芽細胞、扁平上皮細胞、立方上皮細胞、円柱上皮細胞、重層上皮細胞、多列円柱上皮細胞または移行上皮細胞を形成する。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、これだけに限定されないが、松果体、胸腺、下垂体、甲状腺、副腎、アポクリン腺、ホロクリン腺、部分分泌腺、漿液腺、粘液腺および脂腺を含めた腺を形成する。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、これだけに限定されないが、肺、脾臓、胃、膵臓、膀胱、腸、腎臓、胆嚢、肝臓、喉頭または咽頭を含めた器官の外表面と接触している。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、血管または静脈の外表面と接触している。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、初代細胞である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、培養細胞である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、in vivo、in vitro、ex vivoまたはin situにある。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、自家細胞または同種異系細胞である。
使用方法
使用方法
本開示は、本開示のRNA分子またはRNA分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、本開示の組成物とRNA分子をガイドRNAまたはRNA結合性タンパク質またはRNA結合性融合タンパク質(またはその一部)の1つまたは複数がRNA分子に結合するのに適した条件下で接触させることを含む方法を提供する。
本開示は、RNA分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、本開示の組成物とRNA分子を、RNA分子へのガイドRNAまたはRNA結合性タンパク質または融合タンパク質(またはその一部)の1つまたは複数の結合に好適な条件下で接触させるステップを含む方法を提供する。
本開示は、本開示のRNA分子の発現またはそのRNA分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、本開示の組成物とRNA分子を含む細胞とを、RNA分子へのガイドRNAまたはRNA結合性タンパク質または融合タンパク質(またはその一部)の1つまたは複数の結合に好適な条件下で接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、in vivo、in vitro、ex vivoまたはin situにある。一部の実施形態では、本開示の組成物は、本開示のガイドRNAと本開示のRNA結合性タンパク質または融合タンパク質とを含むベクターを含む。一部の実施形態では、ベクターは、AAVである。
本開示は、RNA分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、本開示の組成物とRNA分子を含む細胞とを、RNA分子へのガイドRNAまたはRNA結合性タンパク質または融合タンパク質(またはその一部)の1つまたは複数の結合に好適な条件下で接触させるステップを含む方法を提供する。
本開示は、本開示のRNA分子の発現またはそのRNA分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、本開示の組成物とRNA分子を、RNA結合性タンパク質または融合タンパク質がRNA分子の破壊(break)を誘導するRNAヌクレアーゼ活性に好適な条件下で、接触させるステップを含む方法を提供する。
本開示は、RNA分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、本開示の組成物とRNA分子を、RNA結合性タンパク質または融合タンパク質がRNA分子の破壊を誘導するRNAヌクレアーゼ活性に好適な条件下で、接触させるステップを含む方法を提供する。
本開示は、本開示のRNA分子の発現またはそのRNA分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、本開示の組成物とRNA分子を含む細胞とを、RNA結合性タンパク質または融合タンパク質がRNA分子の破壊を誘導するRNAヌクレアーゼ活性に好適な条件下で、接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、in vivo、in vitro、ex vivoまたはin situにある。一部の実施形態では、組成物は、本開示のガイドRNAと本開示のRNA結合性融合タンパク質とを含む組成物を含むベクターを含む。一部の実施形態では、ベクターは、AAVである。
本開示は、RNA分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、組成物とRNA分子を含む細胞とを、RNA結合性タンパク質または融合タンパク質がRNA分子の破壊を誘導するRNAヌクレアーゼ活性に好適な条件下で、接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、in vivo、in vitro、ex vivoまたはin situにある。一部の実施形態では、組成物は、本開示のガイドRNAまたは単一ガイドRNAおよび本開示のRNA結合性タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組成物を含むベクターを含む。一部の実施形態では、ベクターは、AAVである。
本開示は、疾患または障害を処置する方法であって、対象に本開示の組成物を治療有効量で投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本開示は、CAGリピート病を処置する方法を提供する。別の実施形態では、CAGリピート障害は、HDまたはSCA1である。別の実施形態では、CAGリピート障害は、HD、SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA12、SCA17、球脊髄性筋萎縮症、および歯状核赤核(Denatorubral)-淡蒼球ルイ体萎縮症からなる群から選択される。
本開示は、HDおよびSCA1などのCAGリピート病の処置を、そのような処置を必要とする患者において行う方法であって、本開示の組成物の治療有効量を患者に投与するステップを含み、組成物が、本開示のガイドRNAを含むベクターと、本開示のRNA結合性タンパク質またはRNA結合性タンパク質融合タンパク質をコードする核酸配列とを含み、組成物が、毒性CAGリピートRNAの発現のレベルを(非標的化(NT)対照で処置された毒性CAGリピートRNAの発現のレベルと比較して、または無処置と比較して)改変する、低下させる、破壊する、下げるまたはより小さくする、方法を提供する。一実施形態では、標的毒性CAGリピートRNAのまたは標的RNAによりコードされる毒性リピートの低減のレベルが、RNase Casに基づかない系(例えば、RCas9)で処置されたときの標的RNAのまたは標的RNAによりコードされる毒性リピートの低減のレベルと比較される。別の実施形態では、低減のレベルは、1倍である、またはそれより大きい。別の実施形態では、低減のレベルは、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍または10倍である。別の実施形態では、低減のレベルは、10倍である、またはそれより大きい。別の実施形態では、低減のレベルは、10倍~20倍の間である。別の実施形態では、低減のレベルは、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、または20倍である。別の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子治療用組成物は、患者に投与されたとき、毒性CAGリピートRNAの20%~100%分解をもたらす。一実施形態では、毒性CAGリピートRNAの%消失は、20~99%、25%~99%、50%~99%、80%~99%、90%~99%、95%~99%のいずれかである。一実施形態では、%消失は、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%である。別の実施形態では、%消失は、毒性CAGリピートRNAの完全消失または100%消失である。
一部の実施形態では、本開示のCAG-リピートRNA標的化組成物は、CAG-リピート含有RNA(例えば、mRNA)から翻訳されるタンパク質の発現を変更する。一部の態様では、タンパク質発現は、低減または消失される。一部の態様では、タンパク質を構成するCAG_リピートは、変異型HTT(mHTT)である。一部の態様では、タンパク質を構成するCAG_リピートは、変異型アタキシン-1(mATXN1)である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、処置されることになる患者の疾患または障害としては、限定することなく、CAGマイクロサテライトリピート伸長の発現に関連する疾患または障害が挙げられる。一部の実施形態では、疾患または障害は、HTT遺伝子のCAGマイクロサテライトリピート伸長に関連する(HD)、またはATXN1遺伝子のCAGマイクロサテライトリピート伸長に関連する(SCA1)。本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害は、HDまたはSCA1である。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、CAGリピート障害の診断を受けている。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、CAGリピート障害、例えば、HDまたはSCA1の診断を受けている。一部の実施形態では、本開示の対象は、CAGリピート障害についての少なくとも1つの徴候または症状を示している。一部の実施形態では、本開示の対象は、HDについての少なくとも1つの徴候または症状を示している。一部の実施形態では、本開示の対象は、SCA1についての少なくとも1つの徴候または症状を示している。少なくとも1つのHD徴候またはHD症状としては、限定することなく、うつ状態、協調運動不全(歩行、発話、嚥下に関して)、舞踏病、認知機能障害(学習、決断力の欠如、推論、思考能力の低下)、および/または癲癇が挙げられる。少なくとも1つのSCA1徴候またはSCA1症状としては、限定することなく、協調および平衡問題(運動失調)、言語および嚥下障害、筋硬直(痙攣)、眼球運動を制御する筋肉の衰弱(眼振)、認知機能障害(処理、学習、記憶に関連して)、感覚性ニューロパチー、ジストニア、萎縮、線維束性攣縮、振戦、および/または舞踏病が挙げられる。一実施形態では、CAGリピート病、例えばHDまたはSCA1、についての少なくとも1つの徴候または症状は、本明細書に開示される組成物での処置により好転する。一部の実施形態では、対象は、CAGリピート病、例えばHDまたはSCA1が発生するリスクが予測されるバイオマーカーを有する。一部の実施形態では、バイオマーカーは、遺伝子変異である。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、女性である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、男性である。一部の実施形態では、本開示の対象は、2つの染色体XXまたはXYを有する。一部の実施形態では、本開示の対象は、2つの染色体XXまたはXYおよび第3の染色体、XまたはYのいずれかを有する。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、新生児、乳児、小児、成人、年配成人、または高齢成人である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、少なくとも1日齢、2日齢、3日齢、4日齢、5日齢、6日齢、7日齢、8日齢、9日齢、10日齢、11日齢、12日齢、13日齢、14日齢、15日齢、16日齢、17日齢、18日齢、19日齢、20日齢、21日齢、22日齢、23日齢、24日齢、25日齢、26日齢、27日齢、28日齢、29日齢、30日齢または31日齢である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、少なくとも1カ月齢、2カ月齢、3カ月齢、4カ月齢、5カ月齢、6カ月齢、7カ月齢、8カ月齢、9カ月齢、10カ月齢、11カ月齢または12カ月齢である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、少なくとも1歳、2歳、3歳、4歳、5歳、6歳、7歳、8歳、9歳、10歳、15歳、20歳、25歳、30歳、35歳、40歳、45歳、50歳、55歳、60歳、65歳、70歳、75歳、80歳、85歳、90歳、95歳、100歳またはその間の任意の年齢または部分年齢である。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、哺乳動物である。一部の実施形態では、本開示の対象は、非ヒト哺乳動物である。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、ヒトである。
本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、単回用量の本開示の組成物を含む。一部の実施形態では、治療有効量は、少なくとも1用量の本開示の組成物を含む。一部の実施形態では、治療有効量は、1用量または複数用量の本開示の組成物を含む。
本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の徴候または症状を排除するものである。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の徴候または症状の重症度を低下させるものである。
本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害を排除するものである。
本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の発症を防止するものである。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の発症を遅延させるものである。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の徴候または症状の重症度を低下させるものである。一部の実施形態では、治療有効量は、対象の予後を改善するものである。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に脳内投与を介して投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に線条体内経路によって投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に定位固定注射または注入によって投与される。一部の実施形態では、組成物は、脳に投与される。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に局所的に投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物を医薬組成物として製剤化する。簡単に述べると、本明細書に開示される使用のための医薬組成物は、必要に応じて免疫直交性でもある、タンパク質(複数可)または必要に応じてAAV内に含められたタンパク質(複数可)をコードするポリヌクレオチドを、1つまたは複数の薬学的にまたは生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など;炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール;タンパク質;ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン;抗酸化剤;キレート剤、例えば、EDTAまたはグルタチオン;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);および保存剤を含み得る。本開示の組成物を、例えば、経口、経腸、局部、経皮、鼻腔内および/または吸入投与経路などの、投与経路用に、ならびに例えば、静脈内、筋肉内、軟膜下、くも膜下、実質内、くも膜下、線条体内、皮下、皮内、腹腔内、腫瘍内、静脈内、眼内および/または非経口投与などの、注射または注入による投与経路用に、製剤化することができる。ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、脳内または線条体内投与用に製剤化される。
(実施例1)
Cas13dおよびPUF系は毒性CAGリピートを破壊する
方法
トランスフェクション、RNA抽出、FISH、qRT-PCR解析
CMVプロモーターによって駆動される80のCAGリピートを外因性に発現させること、および社内設計qRT-PCRアッセイおよびまたはFISH(DAPI染色および蛍光CAGプローブ)を使用してCAGリピート含有RNAのノックダウンを評定することにより、in vitroでCAGリピートの切断効率を検出した。抗ポリQ抗体を使用する免疫蛍光検査は、毒性ポリQタンパク質凝集物の消失を示した。CasおよびCAGスペーサー系、またはCAGリピートを標的とするエンドヌクレアーゼE17タンパク質に連結されているPUFタンパク質を使用して、CAGリピート含有RNAの切断を評価した。全ての実験について、Lipofectamine 3000(Thermo)を使用して(製造業者のプロトコールに従って)CosM6細胞にトランスフェクトするために50ngのpCMV-CAG80レポータープラスミドとともに1ugのエフェクターまたはエフェクターおよびガイドを使用した。細胞を解析のためにqRT-PCRまたはFISHに付した。(PUF-CAG-E17のmycタグ付きバージョンを使用し、タンパク質発現を、抗myc抗体を使用してIF(免疫蛍光検査)によって検出した。)トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクションから48時間後に回収し、qRT-PCRのために、Qiagen RNeasyキットを使用してRNAを抽出し、CAGリピートについてのqRT-PCRを、Quantabio 1-step qRT-PCRキット、Biorad qPCRマシン、および次のプライマーセットを使用して行った:CAGフォワード:CAAAGACCACGACGGAGATT(配列番号584)、リバース:TCAGCTTCTGCTCCAGATCC(配列番号585)。CAG発現をGAPDH参照遺伝子に対して正規化し、標的化なしの対照条件に対して計算した。
Cas13dおよびPUF系は毒性CAGリピートを破壊する
方法
トランスフェクション、RNA抽出、FISH、qRT-PCR解析
CMVプロモーターによって駆動される80のCAGリピートを外因性に発現させること、および社内設計qRT-PCRアッセイおよびまたはFISH(DAPI染色および蛍光CAGプローブ)を使用してCAGリピート含有RNAのノックダウンを評定することにより、in vitroでCAGリピートの切断効率を検出した。抗ポリQ抗体を使用する免疫蛍光検査は、毒性ポリQタンパク質凝集物の消失を示した。CasおよびCAGスペーサー系、またはCAGリピートを標的とするエンドヌクレアーゼE17タンパク質に連結されているPUFタンパク質を使用して、CAGリピート含有RNAの切断を評価した。全ての実験について、Lipofectamine 3000(Thermo)を使用して(製造業者のプロトコールに従って)CosM6細胞にトランスフェクトするために50ngのpCMV-CAG80レポータープラスミドとともに1ugのエフェクターまたはエフェクターおよびガイドを使用した。細胞を解析のためにqRT-PCRまたはFISHに付した。(PUF-CAG-E17のmycタグ付きバージョンを使用し、タンパク質発現を、抗myc抗体を使用してIF(免疫蛍光検査)によって検出した。)トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクションから48時間後に回収し、qRT-PCRのために、Qiagen RNeasyキットを使用してRNAを抽出し、CAGリピートについてのqRT-PCRを、Quantabio 1-step qRT-PCRキット、Biorad qPCRマシン、および次のプライマーセットを使用して行った:CAGフォワード:CAAAGACCACGACGGAGATT(配列番号584)、リバース:TCAGCTTCTGCTCCAGATCC(配列番号585)。CAG発現をGAPDH参照遺伝子に対して正規化し、標的化なしの対照条件に対して計算した。
一部の態様では、短縮化CAG(tCAG)プロモーター(配列番号389)を使用した。一部の態様では、短いEF1-アルファ(EFS)プロモーター(配列番号520)を使用した。
PUF標的化CAGのために、以下の8PUF(CAG)をコードする構築物を使用した:
(実施例2)
CAGリピート病であるハンチントン病のPUF-E17による処置のためのRNAレベルでの伸長されたCAGリピートの標的化
CAGリピート病であるハンチントン病のPUF-E17による処置のためのRNAレベルでの伸長されたCAGリピートの標的化
エンドヌクレアーゼE17(ヒトZC3H112A遺伝子に由来する)に連結されたCAG標的化PUFをコードする導入遺伝子を、ウイルスアプローチによる線条体内経路または非ウイルスアプローチによる線条体内経路のどちらかによって送達する。ハンチントン病の下記の当技術分野において認知されている動物モデル、R6/2マウスモデル、におけるAAVに基づく送達のためのPUF標的化CAG構築物は、以下のものである:
HDに関連する伸長されたCAGリピートを標的とするために、CAG標的化PUF-E17をコードするDNAを有するAAVベクターを、両側定位固定注射によって送達する。PUF-E17発現がプロモーターにより駆動される(図3A)。一部の態様では、短縮化CAG(tCAG)プロモーター(配列番号389)を使用した。
(実施例3)
HDマウスモデルにおけるCAGベクターの評定
(実施例3)
HDマウスモデルにおけるCAGベクターの評定
CAG標的化PUF AAVrh10-1684およびAAVrh10-1589(図6Bにおける特徴を含む)を、R6/2マウスモデルにおいて試験した。マウスの体重を、注射後、数週間に評価した。
図6Aは、偽対照と比べて、中用量のAAVrh10-1684ベクターまたはAAVrh10-1589ベクターのどちらかで処置したマウスにおける体重の変化パーセントを描示するグラフである。
図6Bは、AAVrh10-1684ベクターおよびAAVrh10-1589ベクターのベクター組成を描示する表である。AAVrh10-1684は、エンドヌクレアーゼ融合体を欠いている、CAG標的化されたPUFタンパク質の発現を制御する、EFS/UBBプロモーターを含む。AAVrh10-1589は、CAG標的化RNA結合性タンパク質を欠いている、E17エンドヌクレアーゼの発現を制御する、EFS/UBBプロモーターを含む。
(実施例4)
非ヒト霊長類におけるCAGリピート標的化RNA送達の最適化
(実施例4)
非ヒト霊長類におけるCAGリピート標的化RNA送達の最適化
異なる種における忍容性を評定するために、AAVrh10-1383(LBIO-210)を評価した。非ヒト霊長類において、LBIO-210の送達を、体積および流速の低下、カニューレのタイプの変更、同定された理想的なカニューレ留置に従って最適化した。
(実施例5)
CAG標的化RCas9系は、変異体HTT RNAレベルを変化させずに変異体HTTタンパク質を低減させる
CAG標的化RCas9系は、変異体HTT RNAレベルを変化させずに変異体HTTタンパク質を低減させる
CAGリピート標的化RCas9系をマウスにおいて評価して、CAGリピートRNAを標的とすることによるHTTタンパク質発現の影響を評定した。
図9Aは、図9Bおよび9Cにおいて使用されているrCas9構築物を描示する表である。研究HD08群1を、2等分した(2つのヘミスフェアに分けた):ヘミ1は、AAV9-rCas9-PINおよび非標的化(NT)ガイドRNA(AAV9-1475)を用いたが、他方のヘミ(ヘミ2)は、AAV9-rCas9-PINとCAGリピート標的化ガイドRNA(AAV9-1347)を用いた。研究HD08bを、群2(AAV9-RCas9-PIN+CAGガイド(AAV9-1347)および群3 AAV9-RCas9-PIN+NTガイド(AAV9-1475)に分けた。
図9Bは、RCas9+NTまたはRCas9+CAG(研究HD08)での処置後のマウスにおける相対変異体HTT(mHTT)RNAレベルおよびタンパク質(可溶性mHTT)レベルを描示する一連のグラフである。*Atp5bおよびEif4a2に対して正規化したmHTT RNAレベル。
図9Cは、RCas9+NTまたはRCas9+CAGでの処置後のマウスにおける相対変異体HTT(mHTT)RNAレベル、ならびに相対Darpp32レベルおよび相対Pde10aレベル*を描示する一連のグラフである。(研究HD08b)。*Atp5bおよびEif4a2に対して正規化した。
処置後に体重減少は観察されなかった。さらに、変異体HTT RNAレベルの無変化は、PINが弱いエンドヌクレアーゼであることを示唆する(図9B)。しかし、可溶性変異体HTTタンパク質の大きな低減[動物4匹のうちの3匹が、意義のある低減(44~74%減少)を示した]。
(実施例6)
有効性および安全性モデルとしてのzQ175 P1皮質ニューロン培養物の確立
(実施例6)
有効性および安全性モデルとしてのzQ175 P1皮質ニューロン培養物の確立
P1皮質ニューロンは、マウスHTTエクソン1が、約190のCAGリピートトラクトを有するヒトHTTエクソン1配列に置き換えられた、zQ175ノックイン(zQ175 KI)対立遺伝子マウスから得た。これらのB6J.zQ175 KIマウス(Jax Lab、ストック番号027410)は、ハンチントン病の病因の研究に、および可能性のある治療介入の評定に、有用である。zQ175マウスからのP1ニューロンの単離および培養は、関連神経疾患モデルにおける遺伝子治療用構築物のハイスループット評定を助長する。
全般的方法
パパイン解離法を使用してzQ175マウスからP1ニューロンを単離し、培養物を(3日目にAraCを添加して)10日間、成熟させる。10日目にウイルス構築物(すなわち、本開示のCAG標的化タンパク質)によって培養物に形質導入する。形質導入後7日間、培養物を維持し、適切な時点で、有効性および安全性の評定のために上清および細胞溶解物の試料採取を行う。
方法
結果
確立したzQ175 P1皮質ニューロン培養物は、蛍光顕微鏡法および免疫組織化学染色により測定したところニューロンとアストロサイトの両方を含有する(図10A)。
次に、培養細胞を、AAVrh10ベクターを伝達する能力について評定した。緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするAAVrh10ベクターは容易に伝達され、GFPが容易に発現される(図10B)。
変異体HTT(mHTT)レベルを、本開示のCAG標的化AAV構築物での細胞培養物の処置後に評定し、mHTTレベルを未処置対照(UTC)と比較した(図10C)。1E4、1E5および1E6のMOIで送達された、ニューロン特異的プロモーターシナプシンを含むベクターA01380(シナプシン-PUF(CAG)-E17)。mHTTレベルの用量依存的低下が、A01380ベクターの投薬量の増加に伴って観察された(図10C)。
(実施例7)
HD患者由来の細胞は、CAGリピート長の範囲にわたっての対立遺伝子選好性および有効性の評価を可能にする
HD患者由来の細胞は、CAGリピート長の範囲にわたっての対立遺伝子選好性および有効性の評価を可能にする
患者由来の細胞は、様々なCAGリピート長の範囲にわたっての対立遺伝子選好性および有効性の評価を可能にする。図11Aは、ハンチントン病患者由来の線維芽細胞の一連の画像である。図11Bは、野生型HTTと変異型HTTの両方を描示するゲルの画像である。これらの線維芽細胞は、本開示のCAG標的化組成物の試験に有用な系である。
(実施例8)
zQ175 P1ニューロンにおけるCas13d CAG標的化構築物の評定
(実施例8)
zQ175 P1ニューロンにおけるCas13d CAG標的化構築物の評定
P1皮質ニューロンは、マウスHTTエクソン1が、約190のCAGリピートトラクトを有するヒトHTTエクソン1配列に置き換えられた、zQ175ノックイン(zQ175 KI)対立遺伝子マウスから得た。これらのB6J.zQ175 KIマウス(Jax Lab、ストック番号027410)は、ハンチントン病の病因の研究に、および可能性のある治療介入の評定に、有用である。zQ175マウスからのP1ニューロンの単離および培養は、関連神経疾患モデルにおける遺伝子治療用構築物のハイスループット評定を助長する。
全般的方法
全般的方法
パパイン解離法を使用してzQ175マウスからP1ニューロンを単離し、培養物を(3日目にAraCを添加して)10日間、成熟させる。培養物に10日目にウイルス構築物(すなわち、本開示のCAG標的化タンパク質)によって形質導入する。形質導入後7日間、培養物を維持し、適切な時点で、有効性および安全性の評定のために上清および細胞溶解物の試料採取を行う。
方法
生存中:
方法
生存中:
1日目:前のスライドで説明したように、細胞を単離し、24ウェルプレートで平板培養し、維持する。
3日目:1uMの最終濃度でのAra-C投与を開始する。
10日目:1E5および1E6 MOIでAAV形質導入を行う。形質導入物を投与する前に(可能であれば、試料が許せば)ベースライン培地および細胞溶解物の試料採取を行う。
13日目:形質導入時点後3日間(可能であれば、試料が許せば)培地および細胞溶解物を回収する。
17日目:形質導入時点後7日間、培地および細胞溶解物を回収する。
エンドポイントアッセイ:
エンドポイントアッセイ:
RNAを調製し、qRT-PCRを実行して、構築物および標的転写物の発現レベルを定量する。
Meso Scale Discovery(MSD)によるmHTTおよびWT HTタンパク質レベルの評定用のタンパク質を調製する。
LDH-Glo細胞傷害性アッセイ。
解析:
解析:
標的転写物発現を参照遺伝子パネル(GAPDH、EIF4A2、およびATP5B)に対して正規化する。
HKG正規化データを、効率のプライマー間変動を説明するために検量線に対して正規化する。
細胞傷害性データからバックグラウンドを減算し、未処置対照からの倍率変化としてプロットする。
材料
材料
AAV:表Uに詳細を収載する。
RNAプレップ:Rneasy 96(Qiagen、74182)
qRT-PCR:TaqPath 1-Step Multiplex Master Mix(ThermoFisher、A28522)
プライマー:HTT-FAM、mGAPDH-HEX、mEIF4A2-Cy5、およびmATP5B-HEX
細胞の健康:細胞傷害性(LDH-Glo、J2380、Promega)
変異体HTT(mHTT)発現を、未処置のWTおよびHETの仔から得たP1ニューロン培養物においてqRT-PCRによる測定によって評定した(図12)。mHTTのHET特異的発現は、生のCtを使用して実証されたが、46の野生型試料のうちの40においてmHTTは検出されなかった。
本開示のCAGリピート標的化構築物を、P1ニューロン培養物におけるmHTT発現を変えるそれらの能力について評定した。CAG標的化PUFタンパク質およびCAG標的化dCas13d(Seq212)タンパク質を含む本開示のベクターによって、7日間、P1ニューロン培養物に形質導入した。使用したベクターは、表U中のものを含む。用量は、1E5および1E6 MOIを含んだ。mHTTおよびWT HT発現レベルをqRT-PCRによって測定した。
ノックダウン増加がより高いデルタCtによって示される、デルタCt増加によって評定したところ、mHTT特異的ノックダウン(KD)がCAG標的化構築物A01383、A01479、およびA01553で観察された(図13A)。野生型HTTレベルは、大きな影響を受けなかった(図13B)。
ヘテロ接合体zQ175マウスの仔から得たP1ニューロンに、CAG標的化PUFおよびCas1d Seq212構築物によって1E5および1E6 MOIで7日間、形質導入した。mHTTタンパク質レベルをMeso Scale Discoveryイムノアッセイ(MSD)によって測定した(図14Aおよび図14B)。パパイン解離法を使用してzQ175ヘテロ接合体の仔からP1ニューロンを調製した。10日の成熟後、ニューロンに、CAG標的化PUFおよびCas13d Seq212構築物によって1E5および1E6 MOIで7日間、形質導入した。細胞を溶解し、Meso Scale Discoveryイムノアッセイ(MSD)を使用してmHTTタンパク質レベルを測定した。mHTTタンパク質ノックダウンが、CAG標的化構築物A01383、A01479、およびA01922で観察された。
CAGリピート標的化cas13d構築物の発現を評定して、CAG標的化構築物A01383、A01479、およびA01922で観察されたmHTTタンパク質KDでのcas13d発現とガイドRNA発現の両方を測定した。
dCas13d(Seq212)およびガイドRNA発現レベルをqRT-PCRによって測定した。
dCas13d発現構築物A01479およびA01553は、同様のdCas13d発現レベルを示した(より高度な発現=より小さいデルタCt)(図15A)。
同等の用量応答性ガイドRNAレベルが、dCas13d発現構築物A01479およびA0155で観察された(図15B)。「ガイドのみ」(Seq212なし)構築物A01477で低いガイドRNAレベルが観察された。
CAG標的化PUF A01383によって1E5 MOIで7日間、形質導入したP1ニューロンにおいて、ニューロン健康シグネチャーを評価した。ニューロンおよびミクログリア活性化マーカー、AIF1、PDE10A、PPPIR1B、およびRBFOX3発現レベルを、qRT-PCRによって測定した。ニューロンおよびミクログリア活性化マーカー発現レベルを、qRT-PCRによって測定した(図16Aおよび図16B)。CAGリピート標的化PUF構築物A01383特異的ニューロン健康シグネチャーを観察した(dCas13d構築物と比較した)。より低度の発現=デルタCt増加。刺激を受けた発現=デルタCt低下。さらに、細胞傷害性をベクター構築物ごとに評定した。CAG標的化構築物によって1E5 MOIで7日間、P1ニューロンに形質導入した(図17)。LDH-Glo(Promega)を使用して、細胞傷害性を評定した。A01383強化細胞傷害性が観察された(dCas13d Seq212構築物と比較して)。in vivo安全性を予示することができるニューロン健康遺伝子シグネチャーを開発した。
参照による組込み
参照による組込み
あらゆる相互参照されるまたは関連する特許または出願を含めた、本明細書において引用されているあらゆる文書は、明白に排除されるまたは他のやり方で限定される場合を除き、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。いずれの文書の引用も、それが本明細書に開示されるもしくは具体化されるあらゆる発明に対して先行技術であること、または、単独で、もしくは任意の他の参考文献(複数可)との任意の組合せで、あらゆるそのような発明を教示、示唆もしくは開示するものであることを認めるものではない。さらに、本文書における用語のいずれかの意味または定義が参照により組み込まれる文書における同じ用語のいずれかの意味または定義と矛盾する範囲では、本文書におけるその用語に割り当てられた意味または定義が支配するものとする。
他の実施形態
他の実施形態
本開示の特定の実施形態を例示し、記載したが、種々の他の変化および改変を本開示の主旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。添付の特許請求の範囲は、本開示の範囲内に入るそのような変化および改変の全てを包含する。
Claims (54)
- 毒性標的CAGリピートRNA配列に結合することができるガイドされないRNA結合性ポリペプチドまたはガイドされるRNA結合性ポリペプチドを含むRNA結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組成物。
- 前記RNA結合性ポリペプチドが、融合タンパク質である、請求項1に記載の組成物。
- 前記融合タンパク質が、前記毒性CAGリピートRNA配列を切断することができるエンドヌクレアーゼと融合した前記RNA結合性ポリペプチドを含む、請求項2に記載の組成物。
- 前記ガイドされないRNA結合性ポリペプチドが、PUFまたはPUMBYタンパク質である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ガイドされるRNA結合性ポリペプチドが、Cas13dタンパク質である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記cas13dタンパク質が、触媒的に失活している、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記cas13dタンパク質が、配列番号587または590~594のいずれか1つで示されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記エンドヌクレアーゼが、ZC3H12Aジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインである、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- PUF RNA結合性タンパク質が、配列番号444~451、461、480~488、549~557、または656のいずれか1つで示されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記PUF RNA結合性タンパク質が、配列番号549または480で示されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記毒性標的CAG RNAリピート配列が、配列番号453~456または472~479で示される核酸配列のいずれか1つを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記毒性標的CAG RNAリピート配列が、配列番号453または472のいずれか1つで示される核酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- CAG標的化PUFタンパク質が、配列番号577、581、614、619、621、または622で示される核酸配列によってコードされる、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記PUFまたはPUMBYタンパク質が、ヒトPUFまたはPUMBYタンパク質である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記PUFまたはPUMBYタンパク質が、リンカー配列によって前記ZC3H12Aエンドヌクレアーゼに連結されている、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記リンカーが、配列番号411で示されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記融合タンパク質が、核局在化配列(NLS)、および核外輸送配列(NES)からなる群から選択される1つまたは複数のシグナル配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ZC3H12Aジンクフィンガーヌクレアーゼが、配列番号358または配列番号359で示されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記融合タンパク質が、配列番号460のいずれか1つで示されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記融合タンパク質が、配列番号574~582を含む核酸配列によってコードされる、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記融合タンパク質をコードする核酸分子が、プロモーターを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
- プロモーターが、tCAGプロモーター、EFS/UBBプロモーター、またはシナプシンプロモーターである、請求項14に記載の組成物。
- 前記請求項のいずれか一項に記載の組成物を含む、ベクター。
- アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、およびデンドリマーからなる群から選択される、請求項23に記載のベクター。
- AAVベクターである、請求項23に記載のベクター。
- 第1のAAV ITR配列と、
第1のプロモーター配列と、
少なくとも1つのCAGリピートRNA結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、
第2のAAV ITR配列と
を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVベクター。 - 前記CAGリピートRNA結合性ポリペプチドが、PUFまたはPUMBYタンパク質を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVベクター。
- PUFまたはPUMBY配列をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号577、581、614、619、621、または622で示される核酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVベクター。
- 前記CAGリピートRNA結合性ポリペプチドが、Cas13dタンパク質を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVベクター。
- Cas13d配列をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号587または590~594で示される核酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVベクター。
- 前記第1のプロモーター配列が、配列番号389、627、または613で示される核酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVベクター。
- 前記第1のAAV ITR配列が、配列番号597または598で示される核酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVベクター。
- 前記第2のAAV ITR配列が、配列番号597または598で示される核酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVベクター。
- 第2のプロモーター配列をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVベクター。
- 前記第2のプロモーターが、ガイドRNA(gRNA)の発現を制御し、前記gRNAが、(i)DR配列および(ii)スペーサー配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVベクター。
- 前記第2のプロモーターが、配列番号519で示される核酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVベクター。
- ポリA配列をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVベクター。
- 少なくとも1つのリンカー配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVベクター。
- 少なくとも1つの核局在化配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVベクター。
- 前記ベクターが、配列番号588、589、624、または625のいずれかで示される核酸でコードされる、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVベクター。
- a)請求項25から40のいずれか一項に記載のAAVウイルスベクターと、
b)少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤および/または添加剤と
を含む、医薬組成物。 - a)前記請求項のいずれか一項に記載のAAVベクターと、
b)AAVカプシドタンパク質と
を含む、AAVウイルスベクター。 - 前記AAVカプシドタンパク質が、AAV1カプシドタンパク質、AAV2カプシドタンパク質、AAV4カプシドタンパク質、AAV5カプシドタンパク質、AAV6カプシドタンパク質、AAV7カプシドタンパク質、AAV8カプシドタンパク質、AAV9カプシドタンパク質、AAV10カプシドタンパク質、AAV11カプシドタンパク質、AAV12カプシドタンパク質、AAV13カプシドタンパク質、AAVPHP.Bカプシドタンパク質、AAVrh74カプシドタンパク質またはAAVrh.10カプシドタンパク質である、請求項42に記載のAAVウイルスベクター。
- 前記AAVカプシドタンパク質が、AAV9またはAAVrh10カプシドタンパク質である、請求項43に記載のAAVウイルスベクター。
- 前記請求項のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
- 哺乳動物におけるCAGリピート病を処置する方法であって、請求項1から45のいずれか一項に記載の組成物またはAAVベクターを、前記哺乳動物の組織における毒性標的CAGマイクロサテライトリピート伸長(MRE)RNA配列に投与するステップを含み、それによって毒性標的RNAの発現レベルが低下される、方法。
- 前記組成物またはAAVベクターが、対象に、静脈内、くも膜下腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、気管内、耳内、眼内もしくは目周囲、経口、直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、大槽内、神経内、胸膜内、局部、リンパ内、大槽内投与されるか、または神経内にある、請求項46に記載の方法。
- 前記組成物またはAAVベクターが、対象に静脈内投与される、請求項46に記載の方法。
- CAGリピート障害が、ハンチントン病(HD)または脊髄小脳失調症1型(SCA1)である、請求項46に記載の方法。
- 前記毒性標的RNAの発現レベルの低下によって、前記哺乳動物におけるHDまたはSCA1の症状が好転する、請求項46に記載の方法。
- 前記毒性標的RNAの前記発現レベルが、未処置毒性標的CAG RNAの発現レベルの低下と比較して低下される、請求項46に記載の方法。
- 前記毒性CAGリピートが、CAG36であるかまたはそれより多い、請求項46に記載の方法。
- 前記毒性CAGリピートが、CAG80リピートである、請求項46に記載の方法。
- 低下のレベルが、1倍~20倍の間である、請求項46に記載の方法。
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