JP2023134462A - 標的化核酸編集のための系、方法、及び組成物 - Google Patents

標的化核酸編集のための系、方法、及び組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP2023134462A
JP2023134462A JP2023100415A JP2023100415A JP2023134462A JP 2023134462 A JP2023134462 A JP 2023134462A JP 2023100415 A JP2023100415 A JP 2023100415A JP 2023100415 A JP2023100415 A JP 2023100415A JP 2023134462 A JP2023134462 A JP 2023134462A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acids
protein
cas13
target
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023100415A
Other languages
English (en)
Inventor
フェン チャン
Feng Zhang
ジョナサン グーテンバーグ
Gootenberg Jonathan
ディヴィッド ベンジャミン ターイッツ コックス
Benjamin Turitz Cox David
オマール アブデイェー
Abudayyeh Omar
ソーミャ カナン
Kannan Soumya
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harvard College
Massachusetts Institute of Technology
Broad Institute Inc
Original Assignee
Harvard College
Massachusetts Institute of Technology
Broad Institute Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harvard College, Massachusetts Institute of Technology, Broad Institute Inc filed Critical Harvard College
Publication of JP2023134462A publication Critical patent/JP2023134462A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/295—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Chlamydiales (O)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
    • C12Y305/04004—Adenosine deaminase (3.5.4.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
    • C12Y305/04005—Cytidine deaminase (3.5.4.5)

Abstract

【課題】核酸の標的化及び編集のための、特に、目的の標的遺伝子座でのアデニンのプログラム可能な脱アミノ化のための系、方法、及び組成物を提供する。【解決手段】触媒的に不活性なＣａｓ１３エフェクタータンパク質（ｄＣａｓ１３）、または前記触媒的に不活性なＣａｓ１３エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、エンジニアリングされた天然に存在しない系を提供する。【選択図】図１

Description

本願は、２０１７年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／５６１，６６９号の利益を主張する。上記特定された出願の全ての内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
本発明は、国立衛生研究所から付与された助成金第ＭＨ１１００４９号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
電子配列表の内容（「ＢＲＯＤ－２３０５ＷＰ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」；サイズが、１，４０９，９４３バイトであり、２０１８年９月１４日に作成された）は、本明細書によって全体として参照により援用される。
本発明は、概して、核酸の標的化及び編集のための、特に、目的の標的遺伝子座でのアデニンのプログラム可能な脱アミノ化のための系、方法、及び組成物に関する。
ゲノムシーケンシング技術及び分析方法の最近の進歩により、様々な生物学的機能及び疾患に関連する遺伝因子をカタログ化し、マッピングする能力は急速に向上している。個々の遺伝エレメントを選択的に摂動させることによる原因遺伝的変異の体系的なリバースエンジニアリングを可能にするとともに合成生物学、バイオテクノロジー的、及び医学的応用を進歩させるには、正確なゲノムターゲティング技術が必要である。標的化したゲノム摂動を生じさせるためにデザイナージンクフィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、またはホーミングメガヌクレアーゼなどのゲノム編集技術が利用可能であるものの、新規戦略及び分子機構を利用した、かつ安価で、セットアップし易く、スケーリングが可能で、及び真核生物ゲノム内の複数の位置を標的化するのに適した新規のゲノムエンジニアリング技術が依然として必要とされている。それは、ゲノムエンジニアリング及びバイオテクノロジーにおける新規適用の主要なリソースとなるであろう。
シトシンのプログラム可能な脱アミノ化が報告されており、Ａ→Ｇ及びＴ→Ｃ点突然変異の補正に使用することができる。例えば、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）５３３：４２０－４２４は、Ｃａｓ９－ガイドＲＮＡ複合体の標的ＤＮＡ鎖への結合によって変位した非標的ＤＮＡ鎖における、ＡＰＯＢＥＣ１シチジンデアミナーゼによるシトシンの標的脱アミノ化を報告しており、これにより、シトシンのウラシルへの変換がもたらされる。Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１７）３５：３７１－３７６；Ｓｈｉｍａｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１７）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３８３３；Ｚｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１７）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３８１１；Ｙａｎｇ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ（２０１６）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１３３３０も参照されたい。
一態様では、本開示は、触媒的に不活性なＣａｓ１３エフェクタータンパク質（ｄＣａｓ１３）、または前記触媒的に不活性なＣａｓ１３エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、エンジニアリングされた天然に存在しない系を含む。
いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ１３タンパク質は、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方で短縮される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ１３は、Ｃ末端上の少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０、少なくとも２００、少なくとも２２０、少なくとも２４０、少なくとも２６０、または少なくとも３００アミノ酸により短縮される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ１３は、Ｎ末端上の少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０、少なくとも２００、少なくとも２２０、少なくとも２４０、少なくとも２６０、または少なくとも３００アミノ酸により短縮される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質の短縮型は、Ｃ末端Δ９８４－１０９０、Ｃ末端Δ１０２６－１０９０、Ｃ末端Δ１０５３－１０９０、Ｃ末端Δ９３４－１０９０、Ｃ末端Δ８８４－１０９０、Ｃ末端Δ８３４－１０９０、Ｃ末端Δ７８４－１０９０、またはＣ末端Δ７３４－１０９０で短縮されており、短縮のアミノ酸位置は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質の短縮型は、Ｃ末端Δ７９５－１０９５で短縮されており、短縮のアミノ酸位置は、Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質の短縮型は、Ｃ末端Δ８７５－１１７５、Ｃ末端Δ８９５－１１７５、Ｃ末端Δ９１５－１１７５、Ｃ末端Δ９３５－１１７５、Ｃ末端Δ９５５－１１７５、Ｃ末端Δ９７５－１１７５、Ｃ末端Δ９９５－１１７５、Ｃ末端Δ１０１５－１１７５、Ｃ末端Δ１０３５－１１７５、Ｃ末端Δ１０５５－１１７５、Ｃ末端Δ１０７５－１１７５、Ｃ末端Δ１０９５－１１７５、Ｃ末端Δ１１１５－１１７５、Ｃ末端Δ１１３５－１１７５、Ｃ末端Δ１１５５－１１７５で短縮されており、アミノ酸位置は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質の短縮型は、Ｎ末端Δ１－１２５、Ｎ末端Δ１－８８、またはＮ末端Δ１－７２で短縮されており、短縮のアミノ酸位置は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ１３は、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質のＨＥＰＮドメインで、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質の短縮型を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ａである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｃまたはＣａｓ１３ｄである。
いくつかの実施形態では、系は、機能性成分をさらに含み、ヌクレオチド配列は、機能性成分をさらにコードする。いくつかの実施形態では、機能性成分は、塩基編集成分である。いくつかの実施形態では、塩基編集成分は、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはその触媒ドメインを含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはその触媒ドメインは、ｄＣａｓ１３に融合する。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはその触媒ドメインは、リンカーによって、ｄＣａｓ１３に融合する。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはその触媒ドメインは、ｄＣａｓ１３の内部ループに挿入される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはその触媒ドメインは、アダプタータンパク質に連結される。いくつかの実施形態では、アダプタータンパク質は、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１から選択される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはその触媒ドメインは、ヒト、頭足類、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａタンパク質である。
いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ１３は、スプリットＣａｓ１３エフェクタータンパク質である。いくつかの実施形態では、スプリットＣａｓ１３エフェクタータンパク質は、第１のスプリットＣａｓ１３エフェクタータンパク質であり、第２のスプリットＣａｓ１３エフェクタータンパク質に融合して、触媒的に活性なＣａｓ１３エフェクタータンパク質を形成することができる。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＣａｓ１３エフェクタータンパク質の融合は、誘導性である。
いくつかの実施形態では、機能性成分は、転写因子またはその活性ドメインである。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ１３は、転写因子またはその活性ドメインと融合する。いくつかの実施形態では、系は、ガイド配列をさらに含む。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるｄＣａｓ１３をコードする１つ以上のベクターを含むベクター系を含む。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される系を含む、インビトロまたはエキソビボの宿主細胞もしくはその子孫または細胞株もしくはその子孫を含む。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される系を細胞に送達することを含む、標的配列のプログラム可能なかつ標的化した塩基編集の方法を含む。いくつかの実施形態では、方法は、目的の標的配列を決定すること、及び標的配列に存在するアデニンまたはシチジンを最も効率的に脱アミノ化するアデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはその触媒ドメインを選択することをさらに含む。いくつかの実施形態では、脱アミノ化は、病原性Ｔ（Ｕ）→Ｃ、Ａ→Ｇ、Ｇ→Ａ、またはＣ→Ｔ点突然変異を含む転写物が引き起こす疾患を治す。
別の態様では、本開示は、標的遺伝子座での核酸の改変方法であって、（１）請求項１に記載の系（ｄＣａｓ１３は、第１のスプリットＣａｓ１３エフェクタータンパク質である）、及び（２）第２のスプリットＣａｓ１３エフェクタータンパク質（前記第１及び前記第２のスプリットＣａｓ１３エフェクタータンパク質は、触媒的に活性なＣａｓ１３エフェクタータンパク質を形成することができる）、を送達することを含む、方法を含む。
別の態様では、本開示は、細胞中の標的遺伝子の調節方法であって、本明細書に開示される系を送達することを含み、ｄＣａｓ１３は、転写因子またはその活性ドメインに融合する、方法を含む。
例示の実施形態のこれら及び他の態様、目的、特徴、及び利点は、示されている例示の実施形態の以下の詳細な説明を考察した後、当業者に明白なものとなるであろう。
本発明の原理が利用される例示の実施形態を示す以下の詳細な説明、及びその添付の図面を参照することにより、本発明の特徴及び利点の理解が得られるであろう。
Ｃａｓ１３ｂタンパク質と本明細書で例示される、目的の標的ＲＮＡ配列でアデニンの標的脱アミノ化の本発明の例示の実施形態を示す。 例えば、Ｃａｓ１３ｂを用いた場合に、ヒト疾患を転写レベルで治療するための治療戦略としてＲＮＡ編集の開発を示す。ルシフェラーゼ転写物におけるエンジニアリングされた成熟前終止終止コドンを標的化するＣａｓ１３－ＡＤＡＲ２融合によるＲＮＡ塩基編集の概略図。 ルシフェラーゼ発現を回復するためのガイド位置及び長さ最適化。 アデニンデアミナーゼタンパク質の例示の配列（配列番号６５０～６５６）。 アデニンデアミナーゼタンパク質の例示の配列（配列番号６５０～６５６）。 例示の実施形態で使用したガイド（配列番号６５７～６５９及び７６２）。 編集効率は、ＤＲからさらに遠くに離れ、かつ、長いＲＮＡ二本鎖を有する編集塩基に相関し、これは、ガイド長さの伸長によって達成される。 編集効率が高いほど、編集部位は、ＤＲ／タンパク質結合領域からより遠くに離れる。 編集部位のＤＲからの距離。 ＮまたはＣ末端上のＣａｓ１３ｂ１２（ダブルＲ ＨＥＰＮ突然変異体）へのＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２の融合。ガイドは、ルシフェラーゼ中の終止コドンに完全に一致する。シグナルは、編集塩基とガイドの５’末端の間の距離に相関しているように見え、より短い距離で、より良い編集がもたらされる。 Ｃａｓ１３ａ／Ｃａｓ１３ｂ干渉のＣｌｕｃ／Ｇｌｕｃタイリング。 ＮＧＳ（ルシフェラーゼレポーター）によるＡＤＡＲ編集定量化。 ＮＧＳ（ＫＲＡＳ及びＰＰＩＢ）によるＡＤＡＲ編集定量化。 ＲＮＡ配列からのＣａｓ１３ａ／ｂ＋ｓｈＲＮＡ特異性。 オフターゲット（Ａ：ＡまたはＡ：Ｇ）を減らすミスマッチ特異性（配列番号６６１～６６８）。 オンターゲット活性のミスマッチ。 ＡＤＡＲモチーフ選好性。 大きなバブルが、ＲＮＡ編集効率を増強する。 転写物における多数のＡの編集（配列番号６６９～６７２）。 ＲＮＡ編集のガイド長さ滴定。 哺乳類コドン最適化されたＣａｓ１３ｂオルソログは、高効率のＲＮＡノックダウンを媒介する。代表的なＣａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、及びＣａｓ１３ｃ遺伝子座及び会合ｃｒＲＮＡの概略図。 哺乳類コドン最適化されたＣａｓ１３ｂオルソログは、高効率のＲＮＡノックダウンを媒介する。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞中のＣａｓ１３ａ開裂活性を測定するルシフェラーゼアッセイの概略図。 哺乳類コドン最適化されたＣａｓ１３ｂオルソログは、高効率のＲＮＡノックダウンを媒介する。１９のＣａｓ１３ａ、１５のＣａｓ１３ｂ、及び５つのＣａｓ１３ｃオルソログでＣｌｕｃを標的化する２つの異なるガイドを用いたＲＮＡノックダウン効率。ルシフェラーゼ発現は、ノンターゲティングガイド制御条件における発現に正規化される。 哺乳類コドン最適化されたＣａｓ１３ｂオルソログは、高効率のＲＮＡノックダウンを媒介する。パートＣにおいて行う上位７つのオルソログは、Ｃｌｕｃを標的化する２つの異なるガイドＲＮＡで、３つの異なるＮＬＳ及びＮＥＳタグによる活性を評価する。 哺乳類コドン最適化されたＣａｓ１３ｂオルソログは、高効率のＲＮＡノックダウンを媒介する。Ｃａｓ１３ｂ１２及びＣａｓ１３ａ２（ＬｗＣａｓ１３ａ）を、Ｇｌｕｃ及びＣｌｕｃに対するノックダウン活性について比較する。ガイドは、転写物に沿ってタイリングされ、Ｃａｓ１３ｂ１２とＣａｓ１３ａ２の間のガイドは、位置が一致する。 哺乳類コドン最適化されたＣａｓ１３ｂオルソログは、高効率のＲＮＡノックダウンを媒介する。内因性ＫＲＡＳ転写物に対するＣａｓ１３ａ２、Ｃａｓ１３ｂ６、Ｃａｓ１３ｂ１１、及びＣａｓ１３ｂ１２のガイドノックダウンを、対応するｓｈＲＮＡと比較する。 Ｃａｓ１３酵素は、哺乳類細胞における特異的ＲＮＡノックダウンを媒介する。Ｃａｓ１３ａ／ｂミスマッチ特異性試験の半縮重標的配列の概略図（配列番号６７３～２９４）。 Ｃａｓ１３酵素は、哺乳類細胞における特異的ＲＮＡノックダウンを媒介する。Ｃａｓ１３ａ／ｂのシングルミスマッチノックダウンデータのヒートマップ。ノックダウンは、酵素ごとのノンターゲティング（ＮＴ）ガイドに正規化される。 Ｃａｓ１３酵素は、哺乳類細胞における特異的ＲＮＡノックダウンを媒介する。Ｃａｓ１３ａのダブルミスマッチノックダウンデータ。各ミスマッチの位置は、Ｘ及びＹ軸上に示す。ノックダウンデータは、所与の位置セットにおける全てのダブルミスマッチの合計である。データは、酵素ごとのＮＴガイドに正規化される。 Ｃａｓ１３酵素は、哺乳類細胞における特異的ＲＮＡノックダウンを媒介する。Ｃａｓ１３ｂのダブルミスマッチノックダウンデータ。説明については、Ｃを参照されたい。 Ｃａｓ１３酵素は、哺乳類細胞における特異的ＲＮＡノックダウンを媒介する。位置が一致したガイドのＣａｓ１３ａ／ｂ及びｓｈＲＮＡのトランスクリプトームワイド特異性を比較するＲＮＡ配列データ。Ｙ軸は、ターゲティング条件のリードカウントを表し、Ｘ軸は、ノンターゲティング条件のカウントを表す。 Ｃａｓ１３酵素は、哺乳類細胞における特異的ＲＮＡノックダウンを媒介する。Ｃａｓ１３ａ／ｂ及びｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列データから計算されるＲＮＡ発現。 Ｃａｓ１３酵素は、哺乳類細胞における特異的ＲＮＡノックダウンを媒介する。ＲＮＡ配列データからのＣａｓ１３ａ／ｂ及びｓｈＲＮＡの有意なオフターゲット。有意なオフターゲットは、ＦＤＲ＜０．０５を用いて計算した。 触媒的に不活性なＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物は、哺乳類細胞における標的化ＲＮＡ編集を可能にする。Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼ転写物上の終止コドンを除去するための、Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物タンパク質によるＲＮＡ編集の概略図。 触媒的に不活性なＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物は、哺乳類細胞における標的化ＲＮＡ編集を可能にする。多数のガイド位置について、野生型ＡＤＡＲ２と融合したＣａｓ１３ｂと、ハイパーアクティブＡＤＡＲ２ Ｅ４８８Ｑ突然変異体と融合したＣａｓ１３ｂとの間のＲＮＡ編集比較。ルシフェラーゼ発現は、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ対照値に正規化される。 触媒的に不活性なＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物は、哺乳類細胞における標的化ＲＮＡ編集を可能にする。編集部位を取り囲む様々な位置を標的化するように設計された３０、５０、７０、及び８４ｎｔガイド間のＲＮＡ編集比較。 触媒的に不活性なＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物は、哺乳類細胞における標的化ＲＮＡ編集を可能にする。Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼ転写物上の終止コドン（配列番号６９５）に対するシーケンシング定量化に使用したガイドの位置及び長さを示す概略図。 触媒的に不活性なＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物は、哺乳類細胞における標的化ＲＮＡ編集を可能にする。シーケンシングによって定量化されるような、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼ転写物上の対応するアデニン塩基でのガイド設計ごとのオン及びオフターゲット編集効率。 触媒的に不活性なＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物は、哺乳類細胞における標的化ＲＮＡ編集を可能にする。標的化アデニンに対向する塩基を変化させたガイドのルシフェラーゼ読み出し。 Ａは、Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物による内因性ＲＮＡ編集。内因性ＫＲＡＳ及びＰＰＩＢ遺伝子座の内因性Ｃａｓ１３ｂ１２－ＡＤＡＲ編集の次世代シーケンシング。転写物ごとの２つの異なる領域を標的化し、標的化アデニンの近くの全てのアデニンでＡ→Ｇ編集を定量化した。 最適なガイド位置を決定する戦略。 Ｃａｓ１３ｂ－ｈｕＡＤＡＲ２は、突然変異型ルシフェラーゼ転写物の修復を促進する。 Ｃａｓ１３ｂ－ｈｕＡＤＡＲ１は、突然変異型ルシフェラーゼ転写物の修復を促進する。 ヒトＡＤＡＲ１とヒトＡＤＡＲ２の比較。 Ｅ４８８Ｑ対野生型ｄＡＤＡＲ２編集の比較。Ｅ４８８Ｑは、ｄＡＤＡＲ２のハイパーアクティブ突然変異体である。 Ｃａｓ１３ｂ－ｈｕＡＤＡＲ２－Ｅ４８８Ｑによって標的化された転写物は、期待されるＡ－Ｇ編集を含む。（図２７Ａ）ヒートマップ。（図２７Ｂ）鋳型の位置。ヒートマップのように、Ｇに対する編集率と共にＡ部位のみを示す。 ガイドの内因性タイリング。（図２８Ａ）ＫＲＡＳ：ヒートマップ。（上）鋳型の位置（下）。ヒートマップのように、Ｇに対する編集率と共にＡ部位のみを示す。（図２８Ｂ）ＰＰＩＢ：ヒートマップ。（上）鋳型の位置（下）。ヒートマップのように、Ｇに対する編集率と共にＡ部位のみを示す。 ノンターゲティング編集。 リンカー最適化。 Ｃａｓ１３ｂ ＡＤＡＲを使用して、発現したｃＤＮＡ中の患者由来の病原性Ａ＞Ｇ突然変異を補正することができる。 Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲは、５’Ｇモチーフ上に僅かな制限を有する。 編集効率の効果に対する退化ＰＦＳ位置のスクリーニング。全てのＰＦＳ（４－Ｎ）同一性は、ノンターゲティング（配列番号６９６～６９９）よりも高い編集を有する。 編集効率の効果に対する退化ＰＦＳ位置のスクリーニング。全てのＰＦＳ（４－Ｎ）同一性は、ノンターゲティング（配列番号６９６～６９９）よりも高い編集を有する。 標的転写物におけるオフターゲット編集の減少。 標的転写物におけるオフターゲット編集の減少。 Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲトランスクリプトーム特異性。オンターゲット編集は７１％である。（図３６Ａ）ターゲティングガイド；４８２の有意な部位。（図３６Ｂ）ノンターゲティングガイド；９４９の有意な部位。染色体０はＧｌｕｃであり、染色体１はＣｌｕｃであり；ヒト染色体はその後に順番通りであることに留意されたい。 Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲトランスクリプトーム特異性。ターゲティングガイド。 Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲトランスクリプトーム特異性。ノンターゲティングガイド。 Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲトランスクリプトーム特異性。ターゲティングガイド。 Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲトランスクリプトーム特異性。ノンターゲティングガイド。 Ｃａｓ１３ｂは、競合するＡＤＡＲ編集戦略と比較して、最も高い効率を有する。 競合するＲＮＡ編集系。ボックスＢ；オンターゲット編集は６３％である；ターゲティングガイド－２０２０の有意な部位。 競合するＲＮＡ編集系。ボックスＢ；オンターゲット編集は６３％である；ノンターゲティングガイド－１８０５の有意な部位。 競合するＲＮＡ編集系。Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ；オンターゲット編集は３６％である；ターゲティングガイド－１７６の有意な部位 競合するＲＮＡ編集系。Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ；オンターゲット編集は３６％である；ノンターゲティングガイド－１８６の有意な部位。 ＡＤＡＲの用量滴定。ｃｒＲＮＡ量は一定である。 特異性に対する用量応答効果。１５０ｎｇのＣａｓ１３－ＡＤＡＲ；オンターゲット編集は８３％である；ターゲティングガイド－１２３１の有意な部位。 特異性に対する用量応答効果。１５０ｎｇのＣａｓ１３－ＡＤＡＲ；オンターゲット編集は８３％である；ノンターゲティングガイド－５２０の有意な部位。 特異性に対する用量応答効果。１０ｎｇのＣａｓ１３－ＡＤＡＲ；オンターゲット編集は８０％である；ターゲティングガイド－３４７の有意な部位。 特異性に対する用量応答効果。１０ｎｇのＣａｓ１３－ＡＤＡＲ；オンターゲット編集は８０％である；ノンターゲティングガイド－２２３の有意な部位。 ＡＤＡＲ１は、ＡＤＡＲ２よりも特異的であるようである。オンターゲット編集は２９％である。（図４２Ａ）ターゲティングガイド；１１の有意な部位。（図４２Ｂ）ノンターゲティングガイド；６つの有意な部位。染色体０はＧｌｕｃであり、染色体１はＣｌｕｃであり；ヒト染色体はその後に順番通りであることに留意されたい。 ＡＤＡＲ特異的突然変異体は、特異性が増強されている。ターゲティングガイド。 ＡＤＡＲ特異的突然変異体は、特異性が増強されている。ノンターゲティングガイド。 ＡＤＡＲ特異的突然変異体は、特異性が増強されている。ターゲティング対ノンターゲティングの比。 ＡＤＡＲ特異的突然変異体は、特異性が増強されている。ターゲティング及びノンターゲティングガイド。 各残基のＲＮＡ標的との接触点に沿ってプロットしたＡＤＡＲ突然変異体ルシフェラーゼ結果。 ＡＤＡＲ特異的突然変異体は、特異性が増強されている。紫色の点は、全トランスクリプトームオフターゲットＮＧＳ分析で選択される突然変異体である。赤色の点は、出発点（すなわち、Ｅ４８８Ｑ突然変異体）である。全ての追加の突然変異体が、Ｅ４８８Ｑ突然変異も有することに留意されたい。 ＡＤＡＲ突然変異体は、ＮＧＳに従ってより特異的である。（図４６Ａ）オンターゲット。（図４６Ｂ）オフターゲット。 ＡＤＡＲ特異的突然変異体上のルシフェラーゼデータは、ＮＧＳと一致する。（図４７Ａ）ＮＧＳについて選択されたターゲティングガイド。（図４７Ｂ）ＮＧＳについて選択されたノンターゲティングガイド。ルシフェラーゼデータは、図４６のＮＧＳデータと一致する。ノンターゲティングガイドとの活性が少ないオルソログは、トランスクリプトームにわたってオフターゲットが少なく、それらのオンターゲット編集効率は、ターゲティングガイドルシフェラーゼ条件によって予測することができる。 Ｃａｓ１３ｂ １２のＣ末端短縮は、ＡＤＡＲ編集において依然として活性が高い。 ＲＮＡノックダウンのための高活性Ｃａｓ１３ｂオルソログの特徴付け。図４９Ａ）ステレオタイプＣａｓ１３遺伝子座及び対応するｃｒＲＮＡ構造の概略図。図４９Ｂ）２つの異なるガイドを用いたルシフェラーゼノックダウンのための１９のＣａｓ１３ａ、１５のＣａｓ１３ｂ、及び７つのＣａｓ１３ｃオルソログの評価。両方のガイドを用いた効率的なノックダウンによるオルソログは、それらの宿主生物名で標識される。図４９Ｃ）ＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びＬｗａＣａｓ１３ａノックダウン活性は、Ｇｌｕｃに対するガイドをタイリングし、ルシフェラーゼ発現を測定することによって比較される。図４９Ｄ）ＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びＬｗａＣａｓ１３ａノックダウン活性は、Ｃｌｕｃに対するガイドをタイリングし、ルシフェラーゼ発現を測定することによって比較される。図４９Ｅ）ＬｗａＣａｓ１３ａ（赤色）及びｓｈＲＮＡ（黒色）のＧｌｕｃ標的化条件（ｙ軸）と比較した、ノンターゲティング対照（ｘ軸）のＲＮＡ配列ライブラリーで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値の発現レベル。３つの生物学的反復の平均を示す。Ｇｌｕｃ転写物データポイントを標識する。図４９Ｆ）ＰｓｐＣａｓ１３ｂ（青色）及びｓｈＲＮＡ（黒色）のＧｌｕｃ標的化条件（ｙ軸）と比較した、ノンターゲティング対照（ｘ軸）のＲＮＡ配列ライブラリーで検出された全ての遺伝子のｌｏｇ２（転写物百万分率（ＴＰＭ））値の発現レベル。３つの生物学的反復の平均を示す。Ｇｌｕｃ転写物データポイントを標識する。図４９Ｇ）図４９Ｅ及び図４９Ｆにおけるトランスクリプトームワイド分析から、ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ、及びｓｈＲＮＡのＧｌｕｃノックダウンからの有意なオフターゲットの数。 ＲＮＡ編集のためのｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物のエンジニアリング。図５０Ａ）ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物タンパク質によるＲＮＡ編集の概略図。図５０Ｂ）ＣｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼＷ８５Ｘ標的及びターゲティングガイド設計（配列番号７００及び７０１）の概略図。図５０Ｃ）３０、５０、７０、または８４ｎｔの長さのタイリングガイドを有する、Ｃａｓ１３ｂ－ｄＡＤＡＲ１（左）及びＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２－ｃｄ（右）のルシフェラーゼ活性回復の定量化。図５０Ｄ）ＣｙｐｒｉｄｉｎｉａルシフェラーゼＷ８５Ｘの標的化のための標的部位の概略図。図５０Ｅ）ＣｙｐｒｉｄｉｎｉａルシフェラーゼＷ８５Ｘ（配列番号７０２）を標的化する５０ｎｔガイドのＡ→Ｉ編集のシーケンシング定量化。 図５１Ａ）ＲＥＰＡＩＲｖ１によるＲＮＡ編集のための配列柔軟性の測定。ＲＥＰＡＩＲｖ１（配列番号７０３）によるＲＮＡ編集のプロトスペーサー隣接部位（ＰＦＳ）選好性を決定するためのスクリーニングの概略図。図５１Ｂ）２つの異なる編集部位での全ての４－Ｎ ＰＦＳ組み合わせのＲＮＡ編集効率の分布。図５１Ｃ）全ての可能な３塩基モチーフ（配列番号７０４）にわたるＣｌｕｃ Ｗ８５でのＲＥＰＡＩＲｖ１のパーセント編集の定量化。図５１Ｄ）全ての可能な３塩基モチーフにわたるＣｌｕｃ Ｗ８５でのＲＮＡ編集の５’及び３’塩基選好性のヒートマップ。 ＲＥＰＡＩＲｖ１による疾患関連突然変異の補正。図５２Ａ）ＡＶＰＲ２ ８７８Ｇ＞Ａ（配列番号７０５～７０８）の標的化のための標的及びガイド設計の概略図。図５２Ｂ）ＡＶＰＲ２中の８７８Ｇ＞Ａ突然変異は、３つの異なるガイド設計によるＲＥＰＡＩＲｖ１を用いて、パーセンテージを変えて補正する。図５２Ｃ）ＦＡＮＣＣ １５１７Ｇ＞Ａ（配列番号７０９～７１２）の標的化のための標的及びガイド設計の概略図。図５２Ｄ）ＦＡＮＣＣ中の１５１７Ｇ＞Ａ突然変異は、３つの異なるガイド設計によるＲＥＰＡＩＲｖ１を用いて、パーセンテージを変えて補正する。図５２Ｅ）ＲＥＰＡＩＲｖ１を用いた、３４個の異なる疾患関連Ｇ＞Ａ突然変異のパーセント編集の定量化。図５２Ｆ）ＣｌｉｎＶａｒデータベースによって注釈されるように補正することができる全ての可能なＧ＞Ａ突然変異の分析。ＣｌｉｎＶａｒにおける全てのＧ＞Ａ突然変異の分布編集モチーフを、Ｇｌｕｃ転写物で定量化したように、モチーフ当たりのＲＥＰＡＩＲｖ１による編集効率に対して示す。 ＲＥＰＡＩＲｖ１の特異性の特徴付け。図５３Ａ）ＫＲＡＳ標的部位及びガイド設計（配列番号７１３～７２０）の概略図。図５３Ｂ）タイルされたＫＲＡＳターゲティングガイドのパーセント編集の定量化。編集パーセンテージを、オンターゲット部位及び隣接するアデノシン部位で示す。ガイドごとに、二本鎖ＲＮＡの領域を赤色の長方形で示す。図５３Ｃ）Ｃｌｕｃターゲティングガイドを有するＲＥＰＡＩＲｖ１による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲット部位Ｃｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。図５３Ｄ）ノンターゲティングガイドを有するＲＥＰＡＩＲｖ１による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。 ＲＥＰＡＩＲｖ１の特異性を改善するためのＡＤＡＲ２の合理的な突然変異誘発。図５４Ａ）様々なｄＣａｓ１３－ＡＤＡＲ２突然変異体によるルシフェラーゼシグナル回復の定量化、ならびに主要なＡＤＡＲ２デアミナーゼ残基とｄｓＲＮＡ標的の間の接触の概略に沿ってプロットしたそれらの特異性スコア。特異性スコアは、ターゲティングガイドとノンターゲティングガイド条件の間のルシフェラーゼシグナルの比として定義される。図５４Ｂ）様々なｄＣａｓ１３－ＡＤＡＲ２突然変異体によるルシフェラーゼシグナル回復の定量化対それらの特異性スコア。図５４Ｃ）オンターゲット編集画分の測定、ならびにｍＲＮＡのトランスクリプトームワイドシーケンシングによるｄＣａｓ１３－ＡＤＡＲ２突然変異体ごとの有意なオフターゲット数。図５４Ｄ）ガイドが、Ｃｌｕｃ中の成熟前終止部位を標的化している、ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲットＣｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。図５４Ｅ）ＲＮＡシーケンシングは、ＲＥＰＡＩＲｖ１とＲＥＰＡＩＲｖ２の間のオフターゲット編集の差を強調表示するオンターゲットＣｌｕｃ編集部位（２５４ Ａ＞Ｇ）を取り囲んで読み取る。全てのＡ＞Ｇ編集を赤色で強調表示する一方、シーケンシングエラーを青色で強調表示する（配列番号７２１）。図５４Ｆ）ガイドが、内因性ＫＲＡＳ及びＰＰＩＢ転写物のアウトオブフレームＵＡＧ部位を標的化している、ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２によるＲＮＡ編集。オンターゲット編集画分は、条件行ごとに右側の横棒グラフとして示す。ガイドＲＮＡによって形成された二本鎖領域を赤色の外枠で示す。 インビボ効率及びＰＦＳ決定のためのＣａｓ１３ｂオルソログの細菌性スクリーニング。図５５Ａ）Ｃａｓ１３ｂオルソログのＰＦＳを決定するための細菌分析の概略図。β－ラクタマーゼターゲティングスペーサーを有するＣａｓ１３ｂオルソログをβ－ラクタマーゼ発現プラスミドと同時形質転換し、二重選択を施す（配列番号７２２）。図５５Ｂ）コロニー形成単位（ｃｆｕ）によって測定される、β－ラクタマーゼを標的化するＣａｓ１３ｂオルソログの干渉活性の定量化。図５５Ｃ）細菌分析からの枯渇配列によって決定されるＣａｓ１３ｂオルソログのＰＦＳロゴ。 Ｃａｓ１３ｂノックダウンの最適化、及びミスマッチ特異性のさらなる特徴付け。図５６Ａ）２つの異なるガイドによるＧｌｕｃノックダウンは、様々な核局在化及び核外搬出タグに融合したトップ２ Ｃａｓ１３ａ及びトップ４ Ｃａｓ１３ｂオルソログを用いて測定される。図５６Ｂ）ＫＲＡＳのノックダウンは、４つの異なるガイドを有するＬｗａＣａｓ１３ａ、ＲａｎＣａｓ１３ｂ、ＰｇｕＣａｓ１３ｂ、及びＰｓｐＣａｓ１３ｂについて測定し、位置が一致した４つのｓｈＲＮＡ対照と比較する。図５６Ｃ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂノックダウンの特異性を評価するために使用したシングル及びダブルミスマッチプラスミドライブラリーの概略図。可能な全てのシングル及びダブルミスマッチは、標的配列、ならびに標的部位の５’及び３’末端に直接隣接する３位置に存在する（配列番号７２３～７３５）。図５６Ｄ）示したシングルミスマッチを有する転写物の枯渇レベルを、ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂ条件の両方のヒートマップとしてプロットする。図５６Ｅ）示したダブルミスマッチを有する転写物の枯渇レベルを、ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂ条件の両方のヒートマップとしてプロットする（配列番号７３６）。 ｄＣａｓ１３－ＡＤＡＲ２ ＲＮＡ編集の設計パラメーターの特徴付け。図５７Ａ）野生型Ｃａｓ１３ｂ及び触媒的に不活性なＨ１３３Ａ／Ｈ１０５８Ａ Ｃａｓ１３ｂ（ｄＣａｓ１３ｂ）のＧｌｕｃターゲティングのノックダウン効率。図５７Ｂ）野生型ＡＤＡＲ２触媒ドメインまたはハイパーアクティブＥ４８８Ｑ突然変異体ＡＤＡＲ２触媒ドメインのいずれかに融合したｄＣａｓ１３ｂによるルシフェラーゼ活性回復の定量化を、Ｃｌｕｃターゲティングガイドのタイリングにより試験した。図５７Ｃ）ＣｙｐｒｉｄｉｎｉａルシフェラーゼＷ８５Ｘを標的化する３０ｎｔガイドのＡ→Ｉ編集のガイド設計及びシーケンシング定量化（配列番号７３７～７４５）。図５７Ｄ）ＰＰＩＢを標的化する５０ｎｔガイドのＡ→Ｉ編集のガイド設計及びシーケンシング定量化（配列番号７４６～７５３）。図５７Ｅ）ＲＥＰＡＩＲｖ１によるルシフェラーゼ活性回復に対するリンカー選択の影響。図５７Ｆ）ＲＥＰＡＩＲｖ１によるルシフェラーゼ活性回復に対する、標的化アデノシンの反対側の塩基同一性の影響（配列番号７５４～７５５）。 Ｇ＞Ａ突然変異のＣｌｉｎＶａｒモチーフ分布。全てのＧ＞Ａ突然変異のＣｌｉｎＶａｒデータベースで観察された各々の可能なトリプレットモチーフの数。 ｄＣａｓ１３ｂの短縮は、機能性ＲＮＡ編集を依然として有する。ｄＣａｓ１３ｂの様々なＮ末端及びＣ末端短縮により、ルシフェラーゼシグナルの回復によって測定されるように、ＲＮＡ編集が可能になる。 ｄＣａｓ１３－ＡＤＡＲ２エディターと他のプログラム可能なＡＤＡＲ系の比較。図６０Ａ）２つのプログラム可能なＡＤＡＲスキーム：ボックスＢベースターゲティング及び完全長ＡＤＡＲ２標的化の概略図。ボックスＢスキーム（上）では、ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメイン（ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ））は、ボックスＢ－λと呼ばれる小ＲＮＡ配列に特異的に結合する、ラムダＮ（λＮ）と呼ばれる小細菌性ウイルスタンパク質に融合する。次いで、２つのボックスＢ－λヘアピンを含むガイドＲＮＡは、ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ），－λＮをガイドして、部位特異的編集を行うことができる。完全長ＡＤＡＲ２スキーム（下）では、ＡＤＡＲ２のｄｓＲＮＡ結合ドメインが、ガイドＲＮＡにおけるヘアピンと結合し、プログラム可能なＡＤＡＲ２編集が可能になる（配列番号７５６～７６０）。図６０Ｂ）Ｃｌｕｃを標的化するガイド及びノンターゲティングガイドを有するボックスＢ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲットＣｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。図６０Ｃ）Ｃｌｕｃを標的化するガイド及びノンターゲティングガイドを有するＡＤＡＲ２による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲットＣｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。図６０Ｄ）Ｃｌｕｃを標的化するガイド及びノンターゲティングガイドを有するＲＥＰＡＩＲｖ１による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲットＣｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。図６０Ｅ）Ｃｌｕｃに対するガイドの標的化のための、ボックスＢ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）、ＡＤＡＲ２、及びＲＥＰＡＩＲｖ１のオンターゲット編集率パーセンテージの定量化。図６０Ｆ）プログラム可能なＡＤＡＲ系について異なるターゲティング条件とノンターゲティング条件との間のオフターゲット部位の重複。 Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２突然変異体の効率及び特異性。図６１Ａ）Ｃｌｕｃを標的化するガイド及びノンターゲティングガイドのｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体によるルシフェラーゼ活性回復の定量化。図６１Ｂ）トランスクリプトームワイドシーケンシングによって定量化されるように、ターゲティング及びノンターゲティングガイドの比とＲＮＡ編集オフターゲットの数との関係。図６１Ｃ）トランスクリプトームワイドオフターゲットＲＮＡ編集部位の数の定量化対ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体のオンターゲットＣｌｕｃ編集効率。 ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体によるＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド特異性。図６２Ａ）Ｃｌｕｃを標的化するガイドを有するｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。オンターゲットＣｌｕｃ部位（２５４ Ａ＞Ｇ）をオレンジ色で強調表示する。図６２Ｂ）ノンターゲティングガイドを有するｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体による有意なＲＮＡ編集のトランスクリプトームワイド部位。 ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）編集のオフターゲットにおけるモチーフバイアスの特徴付け。図６３Ａ）ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異体ごとに、トランスクリプトームにおける全てのＡ＞Ｇオフターゲット編集にわたって存在するモチーフを示す。図６３Ｂ）モチーフ同一性当たりのオフターゲットＡ＞Ｇ編集の分布を、ターゲティング及びノンターゲティングガイドを有するＲＥＰＡＩＲｖ１について示す。図６３Ｃ）モチーフ同一性当たりのオフターゲットＡ＞Ｇ編集の分布を、ターゲティング及びノンターゲティングガイドを有するＲＥＰＡＩＲｖ２について示す。 ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２オフターゲットのさらなる特徴付け。図６４Ａ）ＲＥＰＡＩＲｖ１の転写物ごとのオフターゲットの数のヒストグラム。図６４Ｂ）ＲＥＰＡＩＲｖ２の転写物ごとのオフターゲットの数のヒストグラム。図６４Ｃ）ＲＥＰＡＩＲｖ１オフターゲットのバリアント効果予測。図６４Ｄ）ＲＥＰＡＩＲｖ１オフターゲットの潜在的な発がん性効果の分布。図６４Ｅ）ＲＥＰＡＩＲｖ２オフターゲットバリアント効果予測。図６４Ｆ）ＲＥＰＡＩＲｖ２オフターゲットの潜在的な発がん性効果の分布。 ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２のＲＮＡ編集効率及び特異性。図６５Ａ）ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２の標的化アデノシン及び隣接部位での、ＫＲＡＳターゲティングガイド１によるＫＲＡＳのパーセント編集の定量化。図６５Ｂ）ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２の標的化アデノシン及び隣接部位での、ＫＲＡＳターゲティングガイド３によるＫＲＡＳのパーセント編集の定量化。図６５Ｃ）ＲＥＰＡＩＲｖ１及びＲＥＰＡＩＲｖ２の標的化アデノシン及び隣接部位での、ＰＰＩＢターゲティングガイド２によるＰＰＩＢのパーセント編集の定量化。 Ａ＞Ｇ ＲＮＡエディターによる全ての潜在的なコドン変化の実証。図６６Ａ）Ａ＞Ｉ編集で有効化される全ての潜在的なコドン転移の表。図６６Ｂ）Ａ＞Ｉ編集で有効化される全ての潜在的なコドン転移を示すコドン表。 Ｃａｓ１３ｂ６上のＲＮＡ編集活性の試験結果を示す。 Ｃａｓ１３ｂ１１上のＲＮＡ編集活性の試験結果を示す。 Ｃａｓ１３ｂ１２上のＲＮＡ編集活性の試験結果を示す。 構築物のｄＣａｓ１３ｂ６（Δ７９５－１０９５）－ＲＥＰＡＩＲ及び編集率の概略図を示す。 ｄＣａｓ１３ｂ６（Δ７９５－１０９５）－ＲＥＰＡＩＲを送達することによってすでに天然ＡＤＡＲ２基質であるカリウムイオンチャネルＫｃｎａ１における部位での改変編集を示す。 ｄＣａｓ１３ｂ６（Δ７９５－１０９５）－ＧＳ－ＨＩＶＮＥＳ－ＧＳ－ｈｕＡＤＡＲ２ｄｄの概略図を示す。 ｐｇＣａｓ１３ｂ Ｃ末端短縮のＲＥＰＡＩＲアッセイ。 本明細書の系及び方法で使用することができるＡＤＡＲオルソログのアラインメントツリーを示す。
本明細書の図は例示目的に過ぎず、必ずしも一定の尺度で描かれているとは限らない。
一般的な定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。分子生物学における一般用語及び技術の定義は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５）（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｏｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｏｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３（Ｅ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｄ．）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．）；Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＸ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔ，２００８（ＩＳＢＮ ０７６３７５２２２３）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ ９７８０４７１１８５７１０）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４），Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）；及びＭａｒｔｅｎ Ｈ．Ｈｏｆｋｅｒ ａｎｄ Ｊａｎ ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１１）で見出され得る。
２０１６年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／３５１，６６２号及び同第６２／３５１，８０３号、２０１６年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／３７６，３７７号、２０１６年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／４１０，３６６号、２０１６年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／４３２，２４０号、２０１７年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／４７１，７９２号、ならびに２０１７年４月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／４８４，７８６号が参照される。２０１７年６月１９日に出願された国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８１５４号が参照される。２０１７年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／４７１，７１０号（発明の名称「Ｎｏｖｅｌ Ｃａｓ１３Ｂ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅｓ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、代理人整理番号：ＢＩ－１０１５７ ＶＰ ４７６２７．０４．２１４９）が参照される。さらに、２０１６年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／４３２，５５３号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６，６４５号、及び２０１７年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／４７１，９３０号（発明の名称「ＣＲＩＳＰＲ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂａｓｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」、代理人整理番号ＢＩ－１０１２１ ＢＲＯＤ ０８４２Ｐ）及び２０１７年４月１２日に出願された譲渡予定の米国仮特許出願（発明の名称「ＣＲＩＳＰＲ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂａｓｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」、代理人整理番号ＢＩ－１０１２１ ＢＲＯＤ ０８４３Ｐ）が参照される。
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上特に明確に指示されない限り、単数及び複数の両方の指示対象が含まれる。
用語「任意の」及び「任意選択で」は、その後に記載される事象または状況が起こってもよいし起こらなくてもよいこと、及びこの記載はその事象または状況が起こる場合と起こらない場合とを包含することを意味する。
端点による数値範囲の記載は、それぞれの範囲内に含まれるあらゆる数及び分数、ならびに記載される端点を含む。
用語「約」または「おおよそ」は、本明細書で使用する場合、パラメーター、量、時間的期間などの計測可能な値に言及するとき、指示される値の、ならびにそれから±１０％以下、±５％以下、±１％以下、及び±０．１％以下の変動を、かかる変動が開示される発明の実施に適切である限り包含することを意味する。修飾語「約」または「おおよそ」が参照する値は、それ自体もまた具体的に、かつ好ましくは開示されていることが理解されるべきである。
本明細書で使用する場合、「生物試料」は、全細胞及び／または生細胞及び／または細胞残屑を含み得る。生物試料は、「体液」を含み得る（または、それに由来し得る）。本発明は、体液が、羊水、房水、硝子体液、胆汁、血清、母乳、脳脊髄液、耳垢（耳糞）、乳糜、糜粥、内リンパ、外リンパ、滲出物、糞便、女性射出液、胃酸、胃液、リンパ、粘液（鼻漏及び痰を含む）、膜液、腹膜液、胸膜液、膿、粘膜分泌物、唾液、皮脂（皮膚油脂）、精液、唾液、関節液、汗、涙、膣分泌物、吐瀉物、及びそれらの１つ以上の混合物から選択される実施形態を包含する。生物試料は、細胞培養、体液、体液由来の細胞培養を含む。体液は、例えば、穿刺、または他の収集もしくはサンプリング手順によって、哺乳類生物から得られ得る。
用語「対象」、「個体」、及び「患者」は、本明細書において脊椎動物、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、ヒトを指すために同義的に使用される。哺乳類としては、限定はされないが、ネズミ、サル、ヒト、家畜、競技動物、及び愛玩動物が挙げられる。インビボで得られ、またはインビトロで培養される生物学的実体の組織、細胞及びそれらの子孫も包含される。
本明細書全体を通じて「一実施形態」、「ある実施形態」、「例示の実施形態」への言及は、その実施形態に関連して説明される詳細な特徴、構造または特性が本発明のうちの少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書全体を通じて様々な箇所に語句「一実施形態では」または「ある実施形態では」または「例示の実施形態」が出現するが、それは必ずしも全てが同じ実施形態に言及しているとは限らず、しかしそうであることもあり得る。さらに、当業者には本開示から明らかであろう通り、１つ以上の実施形態ではそのような詳細な特徴、構造または特性を任意の好適な方法で組み合わせることができる。さらに、本明細書に記載される一部の実施形態は他の実施形態に含まれる数ある特徴の中の特定の一部を含むが、異なる実施形態の特徴の組み合わせが本発明の範囲内にあることが意図される。例えば、添付の特許請求の範囲においては、特許請求される任意の実施形態を任意の組み合わせで用いることができる。
現在、Ｃ２ｃ２は、Ｃａｓ１３ａとして知られる。本明細書における用語「Ｃ２ｃ２」は、「Ｃａｓ１３ａ」と同義的に使用されることは理解されるであろう。本明細書で使用する場合、Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂまたはＣａｓ１３ｃまたはＣａｓ１３ｄまたはＣａｓ１３ファミリーの他のメンバーを指し得る。いくつかの例では、Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ１３ａであり得る。いくつかの例では、Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ１３ｂであり得る。いくつかの例では、Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ１３ｃであり得る。いくつかの例では、Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ１３ｄであり得る。
本明細書において引用される全ての刊行物、公開された特許文書、及び特許出願は、各個別の刊行物、公開された特許文書、または特許出願が、参照によって具体的かつ個別に組み込まれることが示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
様々な実施形態を、下記に後述する。但し、具体的な実施形態が、網羅的な説明、または本明細書で述べられる、より広い態様の限定を意図したものではないことに留意されたい。特定の実施形態に関連して記載される１つの態様は、必ずしもその実施形態に限定されるものではなく、かつ任意の他の実施形態（複数可）と共に実施されることができる。
概要
本明細書に開示される実施形態は、様々な適用のために、触媒的に不活性なＣａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３）を用いる系、構築物、及び方法を提供する。一般に、本明細書に開示される系は、触媒的に不活性なＣａｓエフェクタータンパク質（例えば、ｄＣａｓ１３）を含み得る。触媒的に不活性なＣａｓ１３（ｄＣａｓ１３）は、例えば、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方でＣａｓ１３エフェクタータンパク質の短縮を含み得る。いくつかの実施形態では、系は、ｄＣａｓ１３を含む。ｄＣａｓ１３は、任意のＣａｓ１３サブタイプタンパク質の触媒的に不活性な形態であり得る。例えば、ｄＣａｓ１３は、ｄＣａｓ１３ａ、ｄＣａｓ１３ｂ、ｄＣａｓ１３ｃ、またはｄＣａｓ１３ｄであり得る。いくつかの例では、ｄＣａｓ１３は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５－１２５、Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ由来の改変Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質であり得る。
系は、所望の適用のための１つ以上の機能性成分をさらに含み得る。いくつかの例では、系は、塩基編集成分、例えば、アデノシンデアミナーゼもしくはシチジンデアミナーゼ、またはその触媒ドメインを含み得る。いくつかの例では、系は、転写因子またはその活性ドメインを含み得る。これらの場合、触媒的に不活性なＣａｓエフェクタータンパク質を使用して、転写因子を標的配列に送達することができる。いくつかの例では、触媒的に不活性なＣａｓエフェクタータンパク質は、スプリットＣａｓエフェクタータンパク質であり得る。スプリットＣａｓは、様々な適用のために、別のスプリットＣａｓと共に使用することができる。例えば、２つのスプリットＣａｓエフェクタータンパク質を融合して、触媒的に活性なＣａｓエフェクタータンパク質を形成することができる。融合は、例えば、誘導剤を用いて制御可能であり得る。
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質
本出願は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を用いた方法について記載する。これは、Ｃａｓ１３と本明細書で例示され、それにより多くのオルソログまたはホモログが同定されている。さらなるオルソログまたはホモログを同定することができ、本明細書に記載される機能性のいずれかを他のオルソログ、例えば、多数のオルソログからの断片を含むキメラ酵素にエンジニアリングすることができることが当業者には明らかであろう。
新規のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座を同定する計算法は、ＥＰ３００９５１１またはＵＳ２０１６２０８２４３に記載されており、以下のステップ：Ｃａｓ１タンパク質をコードする全てのコンティグを検出すること；ｃａｓ１遺伝子の２０ｋＢ以内の全ての予測されたタンパク質コード遺伝子を同定すること；同定された遺伝子をＣａｓタンパク質特異的プロファイルと比較して、ＣＲＩＳＰＲアレイを予測すること；５００アミノ酸（＞５００ａａ）よりも大きいタンパク質を含む未分類の候補ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座を選択すること；ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ及びＨＨＰｒｅｄなどの方法を用いて、選択された候補を分析して、公知のタンパク質ドメインをスクリーニングすることで、新規のクラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座を同定することを含み得る（Ｓｃｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．６０（３）：３８５－９７も参照されたい）。上述のステップに加えて、候補の追加の分析は、追加のホモログのメタゲノミクスデータベースを検索することで実施してもよい。それに加えてまたは代えて、検索を非自律的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に拡張するため、シードとして使用したＣＲＩＳＰＲアレイで同じ手順を行うことができる。
一態様では、Ｃａｓ１タンパク質をコードする全てのコンティグを検出するステップは、“ＧｅｎｅＭａｒｋＳ：ａ ｓｅｌｆ－ｔｒａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｓｔａｒｔｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｊｏｈｎ Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ａｌｅｘａｎｄｒｅ Ｌｏｍｓａｄｚｅ ａｎｄ Ｍａｒｋ Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１）２９，ｐｐ ２６０７－２６１８（本明細書において参照により援用される）にさらに記載される通りの遺伝子予測プログラムであるＧｅｎｅｍａｒｋＳによって実施される。
一態様では、全ての予測タンパク質コード遺伝子を同定するステップは、同定された遺伝子をＣａｓタンパク質特異的プロファイルと比較し、古いドメイン及び完全長タンパク質の十分にアノテートされた多重配列アラインメントモデルのコレクションからなるタンパク質注釈付けリソースであるＮＣＢＩ保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）に従いそれらをアノテートすることによって行われる。これらは、ＲＰＳ－ＢＬＡＳＴによってタンパク質配列における保存されたドメインを迅速に同定するための位置特異的スコア行列（ＰＳＳＭ）として利用可能である。ＣＤＤの内容には、三次元構造情報を用いてドメイン境界を明示的に定義し、かつ配列／構造／機能の関係について洞察を提供するＮＣＢＩのキュレーションによるドメイン、ならびにいくつもの外部ソースのデータベース（Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、ＣＯＧ、ＰＲＫ、ＴＩＧＲＦＡＭ）からインポートされたドメインモデルが含まれる。さらなる態様では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、“ＰＩＬＥＲ－ＣＲ：ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ｒｅｐｅａｔｓ”，Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｊａｎ ２０；８：１８（２００７）（本明細書において参照により援用される）に記載される通りの、ＣＲＩＳＰＲリピートを見つけ出すための公開されているドメインソフトウェアであるＰＩＬＥＲ－ＣＲプログラムを用いて予測した。
さらなる態様では、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ（位置特異的反復的基本局所アラインメント検索ツール）を用いてケース・バイ・ケース分析が実施される。ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴは、タンパク質間ＢＬＡＳＴを用いて所与のスコア閾値を上回って検出された配列の多重配列アラインメントから位置特異的スコアリング行列（ＰＳＳＭ）またはプロファイルを導出する。このＰＳＳＭは、新規マッチに関するデータベースのさらなる検索に用いられ、続いて、これらの新規に検出された配列で反復するためアップデートされる。従って、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴは、タンパク質間の遠縁の関係性を検出する手段を提供する。
別の態様では、ＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ－ＢＬＡＳＴと同じように使用し易いと同時に離れたホモログを見つけ出すのにはるかに感受性が高い配列データベース検索及び構造予測方法であるＨＨｐｒｅｄを用いてケース・バイ・ケース分析が実施される。実際に、ＨＨｐｒｅｄの感受性は、現在利用可能な最も強力な構造予測サーバーに匹敵する。ＨＨｐｒｅｄは、プロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）のペアワイズ比較をベースとする最初のサーバーである。最も従来的な配列検索方法はＵｎｉＰｒｏｔまたはＮＲなどの配列データベースを検索するが、ＨＨｐｒｅｄは、ＰｆａｍまたはＳＭＡＲＴなどのアラインメントデータベースを検索する。これによりヒットのリストが雑然とした単一配列の山でなく、何個かの配列ファミリーへと大幅に単純化される。主要な公的に利用可能なプロファイル及びアラインメントデータベースは全てＨＨｐｒｅｄで利用可能である。ＨＨｐｒｅｄは入力として単一のクエリ配列または多重アラインメントを受け入れる。ＨＨｐｒｅｄは僅か数分以内にＰＳＩ－ＢＬＡＳＴと同様の読み易いフォーマットで検索結果を返す。検索オプションには、局所または大域アラインメント及び二次構造類似性のスコアリングが含まれる。ＨＨｐｒｅｄは、ペアワイズのクエリ－鋳型配列アラインメント、合成クエリ－鋳型多重アラインメント（例えば、推移的検索のため）、ならびにＨＨｐｒｅｄアラインメントからＭＯＤＥＬＬＥＲソフトウェアによって計算される三次元構造モデルを生成することができる。
Ｃａｓ１３のオルソログ
用語「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とも称される）及び「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とも称される）は、当該技術分野において周知である。さらなる指針として、本明細書で使用される通りのタンパク質の「ホモログ」は、それがそのホモログであるところのタンパク質と同じまたは同様の機能を果たす同じ種のタンパク質である。しかし、ホモログタンパク質は、構造上関係がなくてもよく、または構造上部分的にのみ関係している。本明細書で使用される通りのタンパク質の「オルソログ」は、それがそのオルソログであるところのタンパク質と同じまたは同様の機能を果たす異なる種のタンパク質である。オルソログタンパク質は、構造上関係があってもよいがなくてもよく、または構造上部分的にのみ関係している。ホモログ及びオルソログは、相同性モデリング（例えば、Ｇｒｅｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．２２８（１９８５）１０５５、及びＢｌｕｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｖｏｌ １７２（１９８８），５１３を参照されたい）または「構造的ＢＬＡＳＴ（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＢＬＡＳＴ）」（Ｄｅｙ Ｆ，Ｃｌｉｆｆ Ｚｈａｎｇ Ｑ，Ｐｅｔｒｅｙ Ｄ，Ｈｏｎｉｇ Ｂ．Ｔｏｗａｒｄ ａ“ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＢＬＡＳＴ”：ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｔｏ ｉｎｆｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２０１３ Ａｐｒ；２２（４）：３５９－６６．ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏ．２２２５）によって同定し得る。また、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座の分野における適用に関して、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）も参照されたい。ホモログタンパク質は、構造上関係があってもよいがなくてもよく、または構造上部分的にのみ関係している。
Ｃａｓ１３遺伝子は、いくつかの多様な細菌ゲノムに見られ、典型的には、ｃａｓ１、ｃａｓ２、及びｃａｓ４遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲカセット（例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｃｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｆｘ１のＦＮＦＸ１＿１４３１－ＦＮＦＸ１＿１４２８）で同じ遺伝子座にある。従って、この推定新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のレイアウトは、ＩＩ－Ｂ型と類似しているものと思われる。さらに、Ｃａｓ９と同様に、Ｃａｓ１３タンパク質は、トランスポゾンＯＲＦ－Ｂと相同の容易に同定可能なＣ末端領域を含有し、活性ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼ、アルギニンリッチ領域、及びＺｎフィンガー（Ｃａｓ９にはない）を含む。しかしながら、Ｃａｓ９と異なり、Ｃａｓ１３はまた、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓコンテクストのないいくつかのゲノムにも存在し、ＯＲＦ－Ｂとのその比較的高い類似性から、これがトランスポゾン成分である可能性が示唆される。これが真正のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であったならば、Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ９の機能性の類似体であり、新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタイプ、すなわちＶ型であろうことが示唆された（Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍａｋａｒｏｖａ ＫＳ，Ｋｏｏｎｉｎ ＥＶ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１５；１３１１：４７－７５を参照）。しかしながら、本明細書に記載される通り、Ｃａｓ１３は、同一のドメイン構造を有しない、従ってサブタイプＶ－Ｂと称されるＣ２ｃ１ｐとそれを区別するため、サブタイプＶ－Ａと称される。
本発明は、サブタイプＶ－Ａと称されるＣａｓ１３コード遺伝子座に由来するＣａｓ１３エフェクタータンパク質の使用を包含する。本明細書で、かかるエフェクタータンパク質は、「Ｃａｓ１３ｐ」、例えば、Ｃａｓ１３タンパク質とも称される（及びかかるエフェクタータンパク質またはＣａｓ１３タンパク質またはＣａｓ１３遺伝子座に由来するタンパク質は、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」とも呼ばれる）。
ある特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｖｉｂｒｉｏ、Ｐｅｒｉｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、ＴｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａまたはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓを含む属の生物由来のＣａｓ１３エフェクタータンパク質である。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ、Ｂｕｔｙｖｉｂｒｉｏ、Ｐｅｒｉｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、ＴｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａまたはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓから選択される属の生物から選択される。
さらにある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ；Ｎ．ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ；Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ；Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ；Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ、Ｌ．ｉｎａｄａｉ、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｐ．ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐ．ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐ．ｄｉｓｉｅｎｓ及びＰ．ｍａｃａｃａｅから選択される生物由来である。
エフェクタータンパク質は、第１のエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３）オルソログ由来の第１の断片と第２のエフェクター（例えば、Ｃａｓ１３）タンパク質オルソログ由来の第２の断片とを含むキメラエフェクタータンパク質を含むことができ、ここで、第１及び第２のエフェクタータンパク質オルソログは異なる。第１及び第２のエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３）オルソログのうちの少なくとも一方は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｖｉｂｒｉｏ、Ｐｅｒｉｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、ＴｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａまたはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓを含む生物由来のエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３）を含むことができ；例えば、第１の断片と第２の断片とを含むキメラエフェクタータンパク質であって、ここで、第１及び第２の断片の各々は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｖｉｂｒｉｏ、Ｐｅｒｉｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、ＴｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａまたはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓを含む生物のＣａｓ１３から選択され、ここで、第１及び第２の断片は、同じ細菌由来でなく；例えば、第１の断片と第２の断片とを含むキメラエフェクタータンパク質であって、ここで、第１及び第２の断片の各々は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ；Ｎ．ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ；Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ；Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ；Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅのＣａｓ１３から選択され、ここで、第１及び第２の断片は、同じ細菌由来でない。
より好ましい実施形態では、Ｃａｓ１３ｐは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ＡＡＸ０８＿００２０５、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ＡＡＸ１１＿００２０５、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＮＣ３００５、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．ＸＳ５、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅから選択される細菌種に由来する。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３ｐは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０から選択される細菌種に由来する。ある特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、限定はされないが、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｎｏｖｉｃｉｄａを含め、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １の亜種に由来する。特定の好ましい実施形態では、Ｃａｓ１３ｐは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ＡＡＸ０８＿００２０５、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ＡＡＸ１１＿００２０５、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＮＣ３００５、またはＴｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．ＸＳ５から選択される細菌種に由来する。
特定の実施形態では、本明細書において言及される通りのＣａｓ１３のホモログまたはオルソログは、本明細書に開示される例示のＣａｓ１３タンパク質と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％などの配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態では、本明細書において言及される通りのＣａｓ１３のホモログまたはオルソログは、野生型Ｃａｓ１３と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％などの配列同一性を有する。Ｃａｓ１３が１つ以上の突然変異を有する場合（突然変異型）、本明細書において言及される通りの前記Ｃａｓ１３のホモログまたはオルソログは、突然変異型Ｃａｓ１３と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％などの配列同一性を有する。
ある実施形態では、Ｃａｓ１３タンパク質は、限定はされないが、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉを含む属の生物のオルソログであり得る；特定の実施形態では、Ｖ型Ｃａｓタンパク質は、限定はされないが、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６；Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣａｓ１３）またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７を含む種の生物のオルソログであり得る。特定の実施形態では、本明細書において言及される通りのＣａｓ１３のホモログまたはオルソログは、本明細書に開示されるＣａｓ１３配列の１つ以上と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％などの配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態では、本明細書において言及される通りのＣａｓ１３のホモログまたはオルソログは、野生型ＦｎＣａｓ１３、ＡｓＣａｓ１３またはＬｂＣａｓ１３と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％などの配列同一性を有する。
特定の実施形態では、本発明のＣａｓ１３タンパク質は、ＦｎＣａｓ１３、ＡｓＣａｓ１３またはＬｂＣａｓ１３と少なくとも６０％、より詳細には少なくとも７０、例えば、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％などの配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態では、本明細書において言及される通りのＣａｓ１３タンパク質は、野生型ＡｓＣａｓ１３またはＬｂＣａｓ１３と少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、より詳細には少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％などの配列同一性を有する。特定の実施形態では、本発明のＣａｓ１３タンパク質は、ＦｎＣａｓ１３と６０％未満の配列同一性を有する。当業者は、これに短縮型のＣａｓ１３タンパク質が含まれ、従って、短縮型の長さにわたって配列同一性が決定されることを理解するであろう。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３酵素は、ＦｎＣａｓ１３ではない。
改変Ｃａｓ１３酵素
特定の実施形態では、本明細書に定義する通りのエンジニアリングされたＣａｓ１３タンパク質、例えば、Ｃａｓ１３を利用することが意図され、このタンパク質は、ＲＮＡを含む核酸分子と複合体化してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ複合体内にある場合、核酸分子が１つ以上の標的ポリヌクレオチド遺伝子座を標的化し、このタンパク質は、非改変Ｃａｓ１３タンパク質と比較して少なくとも１つの改変を含み、及びここで、この改変タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体は、非改変Ｃａｓ１３タンパク質を含む複合体と比較した際に活性の変化を有する。本明細書においてＣＲＩＳＰＲ「タンパク質」と言う場合、Ｃａｓ１３タンパク質は、好ましくは改変ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（酵素活性が増加または低下している（または全くない）、例えば、限定なしにＣａｓ１３である。用語「ＣＲＩＳＰＲタンパク質」は、野生型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と比較して酵素活性が増加または低下している（または全くない）など、ＣＲＩＳＰＲタンパク質が変化しているかどうかに関わらず、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」と同義的に使用され得ることが理解されるべきである。
Ｃａｓ１３ヌクレアーゼの一次構造のコンピューター分析から、３つの個別的な領域が明らかになる。第一に、Ｃ末端ＲｕｖＣ様ドメインであり、これは、唯一機能的に特徴付けられたドメインである。第二に、Ｎ末端α－ヘリックス領域であり、及び第三に、ＲｕｖＣ様ドメインとα－ヘリックス領域との間に位置する混合α及びβ領域である。
Ｃａｓ１３一次構造内に、非構造化領域のいくつかの小さいストレッチが予想される。溶媒に露出していて、かつ異なるＣａｓ１３オルソログ内で保存されていない非構造化領域は、スプリット及び小さいタンパク質配列の挿入に好ましいサイドである。加えて、これらのサイドを使用して、Ｃａｓ１３オルソログ間のキメラタンパク質を作成することができる。
上記の情報に基づき、酵素の不活性化につながるまたは二本鎖ヌクレアーゼをニッカーゼ活性に改変する突然変異体を作成することができる。代替的実施形態では、この情報を用いてオフターゲット効果が低下した酵素（本明細書の他の部分に記載される）が開発される。
ある特定の上述のＣａｓ１３酵素では、酵素は、限定されないが、ＡｓＣａｓ１３（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｒ９０９、Ｒ９１２、Ｒ９３０、Ｒ９４７、Ｋ９４９、Ｒ９５１、Ｒ９５５、Ｋ９６５、Ｋ９６８、Ｋ１０００、Ｋ１００２、Ｒ１００３、Ｋ１００９、Ｋ１０１７、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ｋ１０３５、Ｋ１０５４、Ｋ１０７２、Ｋ１０８６、Ｒ１０９４、Ｋ１０９５、Ｋ１１０９、Ｋ１１１８、Ｋ１１４２、Ｋ１１５０、Ｋ１１５８、Ｋ１１５９、Ｒ１２２０、Ｒ１２２６、Ｒ１２４２、及び／またはＲ１２５２を含めた、（ＲｕｖＣドメイン内の）１つ以上の残基の突然変異によって改変される。ある特定の実施形態では、前記１つ以上の突然変異を含むＣａｓ１３酵素は、標的に対する改変された、より好ましくは増加した特異性を有する。
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の特定のものでは、酵素は、限定されないが、ＡｓＣａｓ１３（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｋ３２４、Ｋ３３５、Ｋ３３７、Ｒ３３１、Ｋ３６９、Ｋ３７０、Ｒ３８６、Ｒ３９２、Ｒ３９３、Ｋ４００、Ｋ４０４、Ｋ４０６、Ｋ４０８、Ｋ４１４、Ｋ４２９、Ｋ４３６、Ｋ４３８、Ｋ４５９、Ｋ４６０、Ｋ４６４、Ｒ６７０、Ｋ６７５、Ｒ６８１、Ｋ６８６、Ｋ６８９、Ｒ６９９、Ｋ７０５、Ｒ７２５、Ｋ７２９、Ｋ７３９、Ｋ７４８、及び／またはＫ７５２を含めた（ＲＡＤ５０ドメイン内の）１つ以上の残基の突然変異によって改変される。ある特定の実施形態では、前記１つ以上の突然変異を含むＣａｓ１３酵素は、標的に対する改変された、より好ましくは増加した特異性を有する。
上述のＣａｓ１３酵素の特定のものでは、酵素は、限定されないが、ＡｓＣａｓ１３（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｒ９１２、Ｔ９２３、Ｒ９４７、Ｋ９４９、Ｒ９５１、Ｒ９５５、Ｋ９６５、Ｋ９６８、Ｋ１０００、Ｒ１００３、Ｋ１００９、Ｋ１０１７、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ｋ１０７２、Ｋ１０８６、Ｆ１１０３、Ｒ１２２６、及び／またはＲ１２５２を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。ある特定の実施形態では、前記１つ以上の突然変異を含むＣａｓ１３酵素は、標的に対する改変された、より好ましくは増加した特異性を有する。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３酵素は、限定されないが、ＬｂＣａｓ１３（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｒ８３３、Ｒ８３６、Ｋ８４７、Ｋ８７９、Ｋ８８１、Ｒ８８３、Ｒ８８７、Ｋ８９７、Ｋ９００、Ｋ９３２、Ｒ９３５、Ｋ９４０、Ｋ９４８、Ｋ９５３、Ｋ９６０、Ｋ９８４、Ｋ１００３、Ｋ１０１７、Ｒ１０３３、Ｒ１１３８、Ｒ１１６５、及び／またはＲ１２５２を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。ある特定の実施形態では、前記１つ以上の突然変異を含むＣａｓ１３酵素は、標的に対する改変された、より好ましくは増加した特異性を有する。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３酵素は、限定されないが、ＡｓＣａｓ１３（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｋ１５、Ｒ１８、Ｋ２６、Ｑ３４、Ｒ４３、Ｋ４８、Ｋ５１、Ｒ５６、Ｒ８４、Ｋ８５、Ｋ８７、Ｎ９３、Ｒ１０３、Ｎ１０４、Ｔ１１８、Ｋ１２３、Ｋ１３４、Ｒ１７６、Ｋ１７７、Ｒ１９２、Ｋ２００、Ｋ２２６、Ｋ２７３、Ｋ２７５、Ｔ２９１、Ｒ３０１、Ｋ３０７、Ｋ３６９、Ｓ４０４、Ｖ４０９、Ｋ４１４、Ｋ４３６、Ｋ４３８、Ｋ４６８、Ｄ４８２、Ｋ５１６、Ｒ５１８、Ｋ５２４、Ｋ５３０、Ｋ５３２、Ｋ５４８、Ｋ５５９、Ｋ５７０、Ｒ５７４、Ｋ５９２、Ｄ５９６、Ｋ６０３、Ｋ６０７、Ｋ６１３、Ｃ６４７、Ｒ６８１、Ｋ６８６、Ｈ７２０、Ｋ７３９、Ｋ７４８、Ｋ７５７、Ｔ７６６、Ｋ７８０、Ｒ７９０、Ｐ７９１、Ｋ７９６、Ｋ８０９、Ｋ８１５、Ｔ８１６、Ｋ８６０、Ｒ８６２、Ｒ８６３、Ｋ８６８、Ｋ８９７、Ｒ９０９、Ｒ９１２、Ｔ９２３、Ｒ９４７、Ｋ９４９、Ｒ９５１、Ｒ９５５、Ｋ９６５、Ｋ９６８、Ｋ１０００、Ｒ１００３、Ｋ１００９、Ｋ１０１７、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ａ１０５３、Ｋ１０７２、Ｋ１０８６、Ｆ１１０３、Ｓ１２０９、Ｒ１２２６、Ｒ１２５２、Ｋ１２７３、Ｋ１２８２、及び／またはＫ１２８８を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。ある特定の実施形態では、前記１つ以上の突然変異を含むＣａｓ１３酵素は、標的に対する改変された、より好ましくは増加した特異性を有する。
ある特定の実施形態では、酵素は、限定されないが、ＦｎＣａｓ１３（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｋ１５、Ｒ１８、Ｋ２６、Ｒ３４、Ｒ４３、Ｋ４８、Ｋ５１、Ｋ５６、Ｋ８７、Ｋ８８、Ｄ９０、Ｋ９６、Ｋ１０６、Ｋ１０７、Ｋ１２０、Ｑ１２５、Ｋ１４３、Ｒ１８６、Ｋ１８７、Ｒ２０２、Ｋ２１０、Ｋ２３５、Ｋ２９６、Ｋ２９８、Ｋ３１４、Ｋ３２０、Ｋ３２６、Ｋ３９７、Ｋ４４４、Ｋ４４９、Ｅ４５４、Ａ４８３、Ｅ４９１、Ｋ５２７、Ｋ５４１、Ｋ５８１、Ｒ５８３、Ｋ５８９、Ｋ５９５、Ｋ５９７、Ｋ６１３、Ｋ６２４、Ｋ６３５、Ｋ６３９、Ｋ６５６、Ｋ６６０、Ｋ６６７、Ｋ６７１、Ｋ６７７、Ｋ７１９、Ｋ７２５、Ｋ７３０、Ｋ７６３、Ｋ７８２、Ｋ７９１、Ｒ８００、Ｋ８０９、Ｋ８２３、Ｒ８３３、Ｋ８３４、Ｋ８３９、Ｋ８５２、Ｋ８５８、Ｋ８５９、Ｋ８６９、Ｋ８７１、Ｒ８７２、Ｋ８７７、Ｋ９０５、Ｒ９１８、Ｒ９２１、Ｋ９３２、Ｉ９６０、Ｋ９６２、Ｒ９６４、Ｒ９６８、Ｋ９７８、Ｋ９８１、Ｋ１０１３、Ｒ１０１６、Ｋ１０２１、Ｋ１０２９、Ｋ１０３４、Ｋ１０４１、Ｋ１０６５、Ｋ１０８４、及び／またはＫ１０９８を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。ある特定の実施形態では、前記１つ以上の突然変異を含むＣａｓ１３酵素は、標的に対する改変された、より好ましくは増加した特異性を有する。
ある特定の実施形態では、酵素は、限定されないが、ＬｂＣａｓ１３（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｋ１５、Ｒ１８、Ｋ２６、Ｋ３４、Ｒ４３、Ｋ４８、Ｋ５１、Ｒ５６、Ｋ８３、Ｋ８４、Ｒ８６、Ｋ９２、Ｒ１０２、Ｋ１０３、Ｋ１１６、Ｋ１２１、Ｒ１５８、Ｅ１５９、Ｒ１７４、Ｒ１８２、Ｋ２０６、Ｋ２５１、Ｋ２５３、Ｋ２６９、Ｋ２７１、Ｋ２７８、Ｐ３４２、Ｋ３８０、Ｒ３８５、Ｋ３９０、Ｋ４１５、Ｋ４２１、Ｋ４５７、Ｋ４７１、Ａ５０６、Ｒ５０８、Ｋ５１４、Ｋ５２０、Ｋ５２２、Ｋ５３８、Ｙ５４８、Ｋ５６０、Ｋ５６４、Ｋ５８０、Ｋ５８４、Ｋ５９１、Ｋ５９５、Ｋ６０１、Ｋ６３４、Ｋ６４０、Ｒ６４５、Ｋ６７９、Ｋ６８９、Ｋ７０７、Ｔ７１６、Ｋ７２５、Ｒ７３７、Ｒ７４７、Ｒ７４８、Ｋ７５３、Ｋ７６８、Ｋ７７４、Ｋ７７５、Ｋ７８５、Ｋ７８７、Ｒ７８８、Ｑ７９３、Ｋ８２１、Ｒ８３３、Ｒ８３６、Ｋ８４７、Ｋ８７９、Ｋ８８１、Ｒ８８３、Ｒ８８７、Ｋ８９７、Ｋ９００、Ｋ９３２、Ｒ９３５、Ｋ９４０、Ｋ９４８、Ｋ９５３、Ｋ９６０、Ｋ９８４、Ｋ１００３、Ｋ１０１７、Ｒ１０３３、Ｋ１１２１、Ｒ１１３８、Ｒ１１６５、Ｋ１１９０、Ｋ１１９９、及び／またはＫ１２０８を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。ある特定の実施形態では、前記１つ以上の突然変異を含むＣａｓ１３酵素は、標的に対する改変された、より好ましくは増加した特異性を有する。
ある特定の実施形態では、酵素は、限定されないが、ＭｂＣａｓ１３（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｋ１４、Ｒ１７、Ｒ２５、Ｋ３３、Ｍ４２、Ｑ４７、Ｋ５０、Ｄ５５、Ｋ８５、Ｎ８６、Ｋ８８、Ｋ９４、Ｒ１０４、Ｋ１０５、Ｋ１１８、Ｋ１２３、Ｋ１３１、Ｒ１７４、Ｋ１７５、Ｒ１９０、Ｒ１９８、Ｉ２２１、Ｋ２６７、Ｑ２６９、Ｋ２８５、Ｋ２９１、Ｋ２９７、Ｋ３５７、Ｋ４０３、Ｋ４０９、Ｋ４１４、Ｋ４４８、Ｋ４６０、Ｋ５０１、Ｋ５１５、Ｋ５５０、Ｒ５５２、Ｋ５５８、Ｋ５６４、Ｋ５６６、Ｋ５８２、Ｋ５９３、Ｋ６０４、Ｋ６０８、Ｋ６２３、Ｋ６２７、Ｋ６３３、Ｋ６３７、Ｅ６４３、Ｋ７８０、Ｙ７８７、Ｋ７９２、Ｋ８３０、Ｑ８４６、Ｋ８５８、Ｋ８６７、Ｋ８７６、Ｋ８９０、Ｒ９００、Ｋ９０１、Ｍ９０６、Ｋ９２１、Ｋ９２７、Ｋ９２８、Ｋ９３７、Ｋ９３９、Ｒ９４０、Ｋ９４５、Ｑ９７５、Ｒ９８７、Ｒ９９０、Ｋ１００１、Ｒ１０３４、Ｉ１０３６、Ｒ１０３８、Ｒ１０４２、Ｋ１０５２、Ｋ１０５５、Ｋ１０８７、Ｒ１０９０、Ｋ１０９５、Ｎ１１０３、Ｋ１１０８、Ｋ１１１５、Ｋ１１３９、Ｋ１１５８、Ｒ１１７２、Ｋ１１８８、Ｋ１２７６、Ｒ１２９３、Ａ１３１９、Ｋ１３４０、Ｋ１３４９、及び／またはＫ１３５６を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。ある特定の実施形態では、前記１つ以上の突然変異を含むＣａｓ１３酵素は、標的に対する改変された、より好ましくは増加した特異性を有する。
一実施形態では、Ｃａｓ１３タンパク質は、ＡｓＣａｓ１３のアミノ酸位置付番を基準として、Ｓ１２２８（例えば、Ｓ１２２８Ａ）の突然変異によって改変される。Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６５：９４９－９６２（２０１６）（本明細書においてその全体が参照により援用される）を参照されたい。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３タンパク質は、非天然ＰＡＭを認識する、例えば、配列ＹＣＮ、ＹＣＶ、ＡＹＶ、ＴＹＶ、ＲＹＮ、ＲＣＮ、ＴＧＹＶ、ＮＴＴＮ、ＴＴＮ、ＴＲＴＮ、ＴＹＴＶ、ＴＹＣＴ、ＴＹＣＮ、ＴＲＴＮ、ＮＴＴＮ、ＴＡＣＴ、ＴＹＣＣ、ＴＲＴＣ、ＴＡＴＶ、ＮＴＴＶ、ＴＴＶ、ＴＳＴＧ、ＴＶＴＳ、ＴＹＹＳ、ＴＣＹＳ、ＴＢＹＳ、ＴＣＹＳ、ＴＮＹＳ、ＴＹＹＳ、ＴＮＴＮ、ＴＳＴＧ、ＴＴＣＣ、ＴＣＣＣ、ＴＡＴＣ、ＴＧＴＧ、ＴＣＴＧ、ＴＹＣＶ、またはＴＣＴＣを有するかまたはそれらを含むＰＡＭを認識するように改変されている。ある特定の実施形態では、前記突然変異型Ｃａｓ１３は、ＡｓＣａｓ１３の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、３４、３６、３９、４０、４３、４６、４７、５０、５４、５７、５８、１１１、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６７６、６７９、６８０、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、７０７、７１１、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７３９、７６５、７６８、７６９、７７３、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、もしくは１０４８位、またはＣａｓ１３オルソログにおけるそれらに対応する位置で１つ以上の突然変異型アミノ酸残基；好ましくは、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５７０、５７１、５７２、５７３、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６３０、６３１、６３２、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９位、または６９０で１つ以上の突然変異型アミノ酸残基を含む；
ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３タンパク質は、活性の増加、すなわち、より広いＰＡＭ特異性を有するように改変される。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３タンパク質は、ＡｓＣａｓ１３の５３９、５４２、５４７、５４８、５５０、５５１、５５２、１６７、６０４、及び／または６０７位、あるいはＡｓＣａｓ１３オルソログ、ホモログ、または変異体の対応する位置、好ましくは、５４２または５４２及び６０７位の突然変異型アミノ酸残基（前記突然変異は、好ましくは、５４２Ｒ及び６０７Ｒ、例えば、Ｓ５４２Ｒ及びＫ６０７Ｒ）；あるいは好ましくは、５４２及び５４８位（及び任意選択で、５５２位）の突然変異型アミノ酸残基（前記突然変異は、好ましくは、５４２Ｒ及び５４８Ｖ（及び任意選択で、５５２Ｒ）、例えば、Ｓ５４２Ｒ及びＫ５４８Ｖ（及び任意選択で、Ｎ５５２Ｒ））；あるいはＬｂＣａｓ１３の５３２、５３８、５４２、及び／または５９５位、あるいはＡｓＣａｓ１３オルソログ、ホモログ、または変異体の対応する位置、好ましくは、５３２または５３２及び５９５位の突然変異型アミノ酸残基（前記突然変異は、好ましくは、５３２Ｒ及び５９５Ｒ、例えば、Ｇ５３２Ｒ及びＫ５９５Ｒ）；あるいは好ましくは、５３２及び５３８位（及び任意選択で、５４２位）の突然変異型アミノ酸残基（前記突然変異は、好ましくは、５３２Ｒ及び５３８Ｖ（及び任意選択で、５４２Ｒ）、例えば、Ｇ５３２Ｒ及びＫ５３８Ｖ（及び任意選択で、Ｙ５４２Ｒ）であり、最も好ましくは、前記突然変異は、ＡｓＣａｓ１３のＳ５４２Ｒ及びＫ６０７Ｒ、Ｓ５４２Ｒ及びＫ５４８Ｖ、またはＳ５４２Ｒ、Ｋ５４８Ｖ及びＮ５５２Ｒである）を含むが、これらに限定されない１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
非活性化／不活性化Ｃａｓ１３タンパク質
Ｃａｓ１３タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する場合、Ｃａｓ１３タンパク質は、低下したヌクレアーゼ活性、例えば、野生型酵素と比較した時少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または１００％のヌクレアーゼ不活性化を有するように改変することができ；あるいは別の言い方をすれば、Ｃａｓ１３酵素は有利には、非突然変異型もしくは野生型Ｃａｓ１３酵素もしくはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性の約０％、または非突然変異型もしくは野生型Ｃａｓ１３酵素、例えば、非突然変異型もしくは野生型Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２（ＦｎＣａｓ１３）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣａｓ１３）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣａｓ１３）もしくはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣａｓ１３）Ｃａｓ１３酵素もしくはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性の約３％もしくは約５％もしくは約１０％以下を有する。これは、Ｃａｓ１３及びそのオルソログのヌクレアーゼドメインに突然変異を導入することによって可能である。
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも１つのＣａｓ１３タンパク質を使用し、これは、Ｃａｓ１３ニッカーゼである。より詳細には、標的鎖を開裂しないが、標的鎖に相補的である鎖のみ、すなわち、ガイド配列に相補的でない鎖としても本明細書で呼ばれるノンターゲットＤＮＡ鎖のみを開裂することができるＣａｓ１３ニッカーゼを使用する。より詳細には、Ｃａｓ１３ニッカーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣａｓ１３のＮｕｃドメインにおける１２２６Ａ位、またはＣａｓ１３オルソログにおける対応する位置で、アルギニンの突然変異を含むＣａｓ１３タンパク質である。さらにある特定の実施形態では、酵素は、アルギニン→アラニン置換またはＲ１２２６Ａ突然変異を含む。当業者であれば、酵素がＡｓＣａｓ１３ではない場合、突然変異は、対応する位置における残基でなされ得ることが理解されるであろう。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３は、ＦｎＣａｓ１３であり、突然変異は、位置Ｒ１２１８のアルギニンである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３は、ＬｂＣａｓ１３であり、突然変異は、位置Ｒ１１３８のアルギニンである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３は、ＭｂＣａｓ１３であり、突然変異は、位置Ｒ１２９３のアルギニンである。
ある特定の実施形態では、エンジニアリングされ、ヌクレアーゼ活性を低下または消失させる１つ以上の突然変異を含むことができるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が、追加または代替として使用される。ＦｎＣａｓ１３ｐ ＲｕｖＣドメインにおけるアミノ酸位置としては、限定はされないが、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｎ１２５７Ａ、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ及びＮ１２５７Ａが挙げられる。本出願人らはまた、ＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫヌクレアーゼスーパーファミリー及びＨｉｎｃＩＩエンドヌクレアーゼ様に最も類似した推定上の第２のヌクレアーゼドメインも同定している。ヌクレアーゼ活性を実質的に減らすためこの推定ヌクレアーゼドメインに生成される点突然変異としては、限定はされないが、Ｎ５８０Ａ、Ｎ５８４Ａ、Ｔ５８７Ａ、Ｗ６０９Ａ、Ｄ６１０Ａ、Ｋ６１３Ａ、Ｅ６１４Ａ、Ｄ６１６Ａ、Ｋ６２４Ａ、Ｄ６２５Ａ、Ｋ６２７Ａ及びＹ６２９Ａが挙げられる。好ましい実施形態では、ＦｎＣａｓ１３ｐ ＲｕｖＣドメインの突然変異は、Ｄ９１７ＡまたはＥ１００６Ａであり、ここで、Ｄ９１７ＡまたはＥ１００６Ａ突然変異は、ＦｎＣａｓ１３エフェクタータンパク質のＤＮＡ開裂活性を完全に不活性化する。別の実施形態では、ＦｎＣａｓ１３ｐ ＲｕｖＣドメインの突然変異は、Ｄ１２５５Ａであり、ここで、突然変異型ＦｎＣａｓ１３エフェクタータンパク質は、核酸分解活性の有意な低下を有する。
より詳細には、不活性化Ｃａｓ１３酵素は、ＡｓＣａｓ１３のアミノ酸位置Ａｓ９０８、Ａｓ９９３、Ａｓ１２６３またはＣａｓ１３オルソログにおける対応する位置で突然変異した酵素を含む。加えて、不活性化Ｃａｓ１３酵素は、ＬｂＣａｓ１３のアミノ酸位置Ｌｂ８３２、９２５、９４７もしくは１１８０またはＣａｓ１３オルソログにおける対応する位置で突然変異した酵素を含む。より詳細には、不活性化Ｃａｓ１３酵素は、ＡｓＣａｓ１３の突然変異ＡｓＤ９０８Ａ、ＡｓＥ９９３Ａ、ＡｓＤ１２６３Ａの１つ以上またはＣａｓ１３オルソログにおける対応する突然変異を含む酵素を含む。加えて、不活性化Ｃａｓ１３酵素は、ＬｂＣａｓ１３の突然変異ＬｂＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７ＡもしくはＤ１１８０Ａの１つ以上またはＣａｓ１３オルソログにおける対応する突然変異を含む酵素を含む。
突然変異はまた、隣接残基、例えば、ヌクレアーゼ活性に関与する上記に指示したものの近傍にあるアミノ酸にも作成することができる。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣドメインのみが不活性化され、及び他の実施形態では、別の推定ヌクレアーゼドメインが不活性化され、ここで、エフェクタータンパク質複合体は、ニッカーゼとして機能して、一方のＤＮＡ鎖のみを開裂する。好ましい実施形態では、他方の推定ヌクレアーゼドメインは、ＨｉｎｃＩＩ様エンドヌクレアーゼドメインである。
不活性化Ｃａｓ１３またはＣａｓ１３ニッカーゼは、例えば、アデノシンデアミナーゼまたはその触媒ドメインを含む１つ以上の機能性ドメインと（例えば、融合タンパク質を介して）会合していてもよい。ある場合には、追加で少なくとも１つの異種ＮＬＳが提供されることが有利である。場合によっては、ＮＬＳをＮ末端に位置することが有利である。一般に、不活性化Ｃａｓ１３またはＣａｓ１３ニッカーゼ上に１つ以上の機能性ドメインを位置決めすることは、機能性ドメインの正しい空間的定位が、起因する機能効果により標的に影響を及ぼすことが可能になることである。例えば、機能性ドメインがそのアデノシンデアミナーゼ触媒ドメインである場合、アデノシンデアミナーゼ触媒ドメインは、空間的定位に置かれることで、標的アデニンと接触し、脱アミノ化することができる。これは、Ｃａｓ１３のＮ／Ｃ末端以外の位置を含み得る。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、Ｃａｓ１３の内部ループに挿入される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される通りの本発明に係るエフェクタータンパク質（ＣＲＩＳＰＲ酵素；Ｃａｓ１３；エフェクタータンパク質）は、触媒的に不活性なまたは失活したＣａｓ１３エフェクタータンパク質（ｄＣａｓ１３）である。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ１３エフェクターは、ヌクレアーゼドメインにおける突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ１３エフェクタータンパク質は、短縮されている。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ１３は、以下の位置：Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端タンパク質、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質のＮ末端、またはＣａｓ１３エフェクタータンパク質の１つ以上のドメイン（例えば、ＨＥＰＮドメイン）の１つ以上で、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質の短縮型を含む。例えば、ｄＣａｓ１３は、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質のＣ末端で、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質の短縮型を含み得る。例えば、ｄＣａｓ１３は、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質のＮ末端で、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質の短縮型を含み得る。例えば、ｄＣａｓ１３は、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質のＨＥＰＮドメインで、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質の短縮型を含み得る。いくつかの実施形態では、かかる短縮は、Ｃａｓ１３エフェクターと１つ以上の機能性成分との融合タンパク質のサイズを低下させ得る。場合によっては、短縮型Ｃａｓ１３は、そのＲＮＡ結合機能をまだ維持し得る。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端は、短縮することができる。例えば、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、または少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸、または最大１２０アミノ酸、または最大１４０アミノ酸、または最大１６０アミノ酸、または最大１８０アミノ酸、または最大２００アミノ酸、または最大２５０アミノ酸、または最大３００アミノ酸、または最大３５０アミノ酸、または最大４００アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。Ｃａｓ１３短縮の例としては、Ｃ末端Δ９８４－１０９０、Ｃ末端Δ１０２６－１０９０、及びＣ末端Δ１０５３－１０９０、Ｃ末端Δ９３４－１０９０、Ｃ末端Δ８８４－１０９０、Ｃ末端Δ８３４－１０９０、Ｃ末端Δ７８４－１０９０、及びＣ末端Δ７３４－１０９０が挙げられ、ここで、アミノ酸位置は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する。Ｃａｓ１３短縮の例としては、Ｃ末端Δ７９５－１０９５も挙げられ、アミノ酸位置は、Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する。Ｃａｓ１３短縮の例としては、Ｃ末端Δ８７５－１１７５、Ｃ末端Δ８９５－１１７５、Ｃ末端Δ９１５－１１７５、Ｃ末端Δ９３５－１１７５、Ｃ末端Δ９５５－１１７５、Ｃ末端Δ９７５－１１７５、Ｃ末端Δ９９５－１１７５、Ｃ末端Δ１０１５－１１７５、Ｃ末端Δ１０３５－１１７５、Ｃ末端Δ１０５５－１１７５、Ｃ末端Δ１０７５－１１７５、Ｃ末端Δ１０９５－１１７５、Ｃ末端Δ１１１５－１１７５、Ｃ末端Δ１１３５－１１７５、Ｃ末端Δ１１５５－１１７５がさらに挙げられ、ここで、アミノ酸位置は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する。当業者であれば、他のＣａｓ１３ｂオルソログ、または他のＣａｓ１３タイプもしくはサブタイプ、例えば、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｃ、もしくはＣａｓ１３ｄに対して同様の短縮を設計できることが理解されるであろう。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質のＮ末端は、短縮され得る。例えば、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、または少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸、または最大１２０アミノ酸、または最大１４０アミノ酸、または最大１６０アミノ酸、または最大１８０アミノ酸、または最大２００アミノ酸、または最大２５０アミノ酸、または最大３００アミノ酸、または最大３５０アミノ酸、または最大４００アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。Ｃａｓ１３短縮の例としては、Ｎ末端Δ１－１２５、Ｎ末端Δ１－８８、またはＮ末端Δ１－７２が挙げられ、ここで、短縮のアミノ酸位置は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方は、短縮され得る。例えば、少なくとも２０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも４０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも６０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも８０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも１００アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも１２０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも１４０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも１６０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも１８０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも２００アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも２２０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも２４０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも２６０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも２８０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも３００アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも２０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも４０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも６０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。
例えば、少なくとも８０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも１００アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも１２０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも１４０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも１６０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも１８０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも２００アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも２２０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも２４０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも２６０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも２８０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも３００アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。例えば、少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＮ末端で短縮され得、及び少なくとも２０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２６０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸は、Ｃａｓ１３エフェクターのＣ末端で短縮され得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びガイド
本発明の方法及び系では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び対応するガイド分子の使用がなされる。より詳細には、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質である。ある特定の実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、特異的配列を標的化するのにカスタマイズしたタンパク質を作成する必要はなく、むしろ単一のＣａｓタンパク質をガイド分子によって特異的核酸標的を認識するようにプログラムすることができ、換言すれば、前記ガイド分子を用いて、Ｃａｓ酵素タンパク質を目的の特異的核酸標的遺伝子座に動員することができる。
ガイド分子
クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のガイド分子またはガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では、「ダイレクトリピート」を包含する）、及びガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では、「スペーサー」とも称される）を含む。実際、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質とは対照的に、Ｃａｓ１３タンパク質は、ｔｒａｃｒ配列の存在に依存しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される通りのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系または複合体は、（例えば、Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１３である場合）ｔｒａｃｒ配列を含まない、及び／またはｔｒａｃｒ配列の存在に依存しない。ある特定の実施形態では、ガイド分子は、ガイド配列またはスペーサー配列に融合または連結されたダイレクトリピート配列を含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。
一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈では、「標的配列」とは、ガイド配列がそれに対して相補性を有するように設計される配列を指し、ここでは、標的ＤＮＡ配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。
用語「ガイド分子」及び「ガイドＲＮＡ」は、本明細書で同義的に使用され、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と複合体を形成することができ、かつ、標的核酸配列とハイブリダイズして標的核酸配列への複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的核酸配列との相補性を有するガイド配列を含む、ＲＮＡベース分子を指す。ガイド分子またはガイドＲＮＡは、（例えば、２つのリボヌクレオチドの化学連結によって、または１つ以上のリボヌクレオチドの１つ以上のデオキシリボヌクレオチドへの置換によって）本明細書に記載される通りの１つ以上の化学的に改変を有するＲＮＡベース分子を特異的に包含する。
本明細書で使用する場合、用語「ガイド配列」は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の文脈では、標的核酸配列とハイブリダイズして標的核酸配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含む。本発明の文脈では、標的核酸配列または標的配列は、「標的アデノシン」とも本明細書で呼ばれる、脱アミノ化される標的アデノシンを含む配列である。いくつかの実施形態では、意図したｄＡ－Ｃミスマッチを除いて、相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントした場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか、またはこれらのおよその数より多い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス－ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン－ブンシュアルゴリズム、バローズ－ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ・ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。ガイド配列（核酸ターゲティングガイドＲＮＡ内にある）が標的核酸配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、核酸ターゲティング複合体を形成するのに十分な核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の成分が、試験しようとするガイド配列を含め、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞へと、核酸ターゲティング複合体の成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして提供されてもよく、続いて、本明細書に記載される通りのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的核酸配列内における優先的な標的化（例えば、開裂）を評価し得る。同様に、標的核酸配列の開裂は、標的核酸配列、試験しようとするガイド配列を含めた核酸ターゲティング複合体の成分、及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、それらの供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間で標的配列における、またはその近くの結合または開裂率を比較することにより、試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者には想起されるであろう。ガイド配列、ひいては核酸ターゲティングガイドＲＮＡは、任意の標的核酸配列を標的化するように選択し得る。
いくつかの実施形態では、ガイド配列と標的配列の間に形成されたＲＮＡ二本鎖が、標的配列上の脱アミノ化のために、標的Ａに対向するガイド配列中の非対合Ｃを含むように、ガイド分子は、標的配列と少なくとも１つのミスマッチを有するように設計されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、このＡ－Ｃミスマッチとは別に、相補性の度合いは、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントした場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか、またはこれらのおよその数より多い。
ある特定の実施形態では、ガイド分子のガイド配列またはスペーサー長は、１５～５０ｎｔである。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、少なくとも１５ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、スペーサー長は、１５～１７ｎｔ、例えば、１５、１６、もしくは１７ｎｔ、１７～２０ｎｔ、例えば、１７、１８、１９、もしくは２０ｎｔ、２０～２４ｎｔ、例えば、２０、２１、２２、２３、もしくは２４ｎｔ、２３～２５ｎｔ、例えば、２３、２４、もしくは２５ｎｔ、２４～２７ｎｔ、例えば、２４、２５、２６、もしくは２７ｎｔ、２７～３０ｎｔ、例えば、２７、２８、２９、もしくは３０ｎｔ、３０～３５ｎｔ、例えば、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５ｎｔ、または３５ｎｔもしくはそれ以上である。ある特定の例示の実施形態では、ガイド配列は、１５、１６、１７，１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００ｎｔである。
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、１０～５０ｎｔの長さであるが、より詳細には、約２０～３０ｎｔ、有利には、約２０ｎｔ、２３～２５ｎｔまたは２４ｎｔのＲＮＡ配列である。ガイド配列は、それを脱アミノ化されるアデノシンを含む標的配列にハイブリダイズすることを確実にするように選択される。これを以下により詳細に説明する。選択は、脱アミノ化の有効性及び特異性を増加させるさらなるステップを包含し得る。
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約２０ｎｔ～約３０ｎｔの長さであり、標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズして、標的アデノシン部位にｄＡ－Ｃミスマッチを有する以外はほぼ完全にマッチした二本鎖を形成する。特に、いくつかの実施形態では、ｄＡ－Ｃミスマッチは、標的配列の中心（従って、ガイド配列が標的配列にハイブリダイズする際の二本鎖の中心）近くに位置することで、アデノシンデアミナーゼを狭い編集ウィンドウ（例えば、約４ｂｐ幅）に制限する。いくつかの実施形態では、標的配列は、脱アミノ化される２つ以上の標的アデノシンを含み得る。さらなる実施形態では、標的配列はさらに、標的アデノシン部位に対して１つ以上のｄＡ－Ｃミスマッチ３’を含み得る。いくつかの実施形態では、標的配列中の意図しないアデニン部位でのオフターゲット編集を回避するため、ガイド配列は、前記意図しないアデニンに対応する位置に非対合グアニンを含み、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２などのある特定のアデノシンデアミナーゼに対して触媒的に好ましくないｄＡ－Ｇミスマッチを導入するように設計することができる。Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ７：８４６－８５８（２００１）（その全体を参照により本明細書に組み込む）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、カノニカル長さ（例えば、ＡｓＣａｓ１３に対して約２４ｎｔ）を有するＣａｓ１３ガイド配列を使用して、標的ＤＮＡを有するＲＮＡ二本鎖を形成する。いくつかの実施形態では、カノニカル長さ（例えば、ＡｓＣａｓ１３に対して２４ｎｔ超）よりも長いＣａｓ１３ガイド分子を使用して、例えば、Ｃａｓ１３－ガイドＲＮＡ－標的ＤＮＡ複合体の外に、標的ＤＮＡを有するＲＮＡ二本鎖を形成する。これは、ヌクレオチドの所与のストレッチ内での２つ以上のアデニンの脱アミノ化を対象とする場合に目的であり得る。代替的実施形態では、カノニカルガイド配列の長さの制限を維持することは興味深い。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、Ｃａｓ１３ガイドのカノニカル長さの外にｄＡ－Ｃミスマッチを導入するように設計され、これにより、Ｃａｓ１３による立体障害が減少し、アデノシンデアミナーゼとｄＡ－Ｃミスマッチの間の接触頻度を増すことができる。
いくつかの実施形態では、ガイド分子（ダイレクトリピート及び／またはスペーサー）の配列は、ガイド分子内の二次構造度が低下するように選択される。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティングガイドＲＮＡのヌクレオチドのうち最適に折り畳まれた時に自己相補性塩基対合に関与するのは約７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％以下であるか、またはそれより少ない。最適な折り畳みは、任意の好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定し得る。一部のプログラムは、最小ギブズ自由エネルギーの計算に基づく。かかる１つのアルゴリズムの例は、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３－１４８）により記載される通りのｍＦｏｌｄである。別の例示的な折り畳みアルゴリズムは、ウィーン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにおいて開発された、セントロイド構造予測アルゴリズムを用いるオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３－２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１－６２を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ガイド分子のＲＮＡ開裂、例えば、Ｃａｓ１３による開裂への感受性を減らすことを意図する。従って、ある特定の実施形態では、ガイド分子を調整して、Ｃａｓ１３または他のＲＮＡ開裂酵素による開裂を回避する。
ある特定の実施形態では、ガイド分子は、天然に存在しない核酸及び／または天然に存在しないヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体、及び／または化学的改変を含む。好ましくは、これらの天然に存在しない核酸及び天然に存在しないヌクレオチドは、ガイド配列の外側に位置する。天然に存在しない核酸には、例えば、天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドとの混合物が含まれ得る。天然に存在しないヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体は、リボース、リン酸、及び／または塩基部分が改変されていてもよい。本発明のある実施形態では、ガイド核酸は、リボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。１つのかかる実施形態では、ガイドは、１つ以上のリボヌクレオチド及び１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のある実施形態では、ガイドは、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチド、リボース環の２’及び４’炭素間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、または架橋核酸（ＢＮＡ）など、１つ以上の天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む。改変ヌクレオチドの他の例には、２’－Ｏ－メチル類似体、２’－デオキシ類似体、または２’－フルオロ類似体が含まれる。改変塩基のさらなる例としては、限定はされないが、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、プソイドウリジン、イノシン、７－メチルグアノシンが挙げられる。ガイドＲＮＡの化学的改変の例としては、限定なしに、１つ以上の末端ヌクレオチドにおける２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ－拘束エチル（ｃＥｔ）、または２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の取込みが挙げられる。かかる化学的に改変されたガイドは、非改変ガイドと比較したとき高い安定性及び高い活性を含むことができ、しかしながらオンターゲット対オフターゲット特異性は予測不可能である（Ｈｅｎｄｅｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５－９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２９ Ｊｕｎｅ ２０１５ Ｒａｇｄａｒｍ ｅｔ ａｌ．，０２１５，ＰＮＡＳ，Ｅ７１１０－Ｅ７１１１；Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，４８：９０１－９０４；Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１２，３：１５４；Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１５，１１２：１１８７０－１１８７５；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍｍ．，２０１４，５：１４５４－１４７１；Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３（９）：９８５－９８９；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１，００６６ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５５１－０１７－００６６を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの５’及び／または３’末端は、蛍光色素、ポリエチレングリコール、コレステロール、タンパク質、または検出タグを含む様々な機能性部分によって改変される（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３３：７４－８３を参照されたい）。ある特定の実施形態では、ガイドは、標的ＤＮＡ及び１つ以上のデオキシリボヌクレオチドに結合する領域におけるリボヌクレオチド、及び／またはＣａｓ１３に結合する領域におけるヌクレオチド類似体を含む。本発明のある実施形態では、デオキシリボヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体は、限定されないが、ステムループ領域及びシード領域などのエンジニアリングされたガイド構造に組み込まれる。Ｃａｓ１３ガイドに関して、ある特定の実施形態では、改変は、ステムループ領域の５’－ハンドルではない。ガイドのステムループ領域の５’－ハンドルにおける化学的改変は、その機能を無効にし得る（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１：００６６を参照されたい）。ある特定の実施形態では、ガイドの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドは、化学的に改変される。いくつかの実施形態では、ガイドの３’または５’末端のいずれかの３～５ヌクレオチドは、化学的に改変される。いくつかの実施形態では、僅かな改変のみが、２’－Ｆ改変などのシード領域に導入される。いくつかの実施形態では、２’－Ｆ改変は、ガイドの３’末端で導入される。ある特定の実施形態では、ガイドの５’及び／または３’末端の３～５ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ－拘束エチル（ｃＥｔ）、または２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）により化学的に改変される。かかる改変は、ゲノム編集効率を強化することができる（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３（９）：９８５－９８９を参照されたい）。ある特定の実施形態では、ガイドのホスホジエステル結合の全ては、ホスホロチオエート（ＰＳ）と置換され、遺伝子破壊レベルを強化する。ある特定の実施形態では、ガイドの５’及び／または３’末端の６つ以上のヌクレオチドは、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－ＦまたはＳ－拘束エチル（ｃＥｔ）により化学的に改変される。かかる化学的に改変されたガイドは、遺伝子破壊レベルの強化を媒介することができる（Ｒａｇｄａｒｍ ｅｔ ａｌ．，０２１５，ＰＮＡＳ，Ｅ７１１０－Ｅ７１１１を参照されたい）。本発明のある実施形態では、ガイドは、その３’及び／または５’末端で化学部分を含むように改変される。かかる部分はに、限定されないが、アミン、アジド、アルキン、チオ、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、またはローダミンが含まれる。ある特定の実施形態では、化学部分は、アルキル鎖などのリンカーによってガイドにコンジュゲートされる。ある特定の実施形態では、改変ガイドの化学部分を使用して、ガイドを、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはナノ粒子などの別の分子に付着させることができる。かかる化学的に改変されたガイドを使用して、ＣＲＩＳＰＲ系によって遺伝的に編集された細胞を同定または濃縮することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ｅＬｉｆｅ，２０１７，６：ｅ２５３１２，ＤＯＩ：１０．７５５４を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ガイドは、５’－ハンドルを有する改変Ｃａｓ１３ｃｒＲＮＡ、ならびにシード領域及び３’末端をさらに含むガイドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、改変ガイドは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃａｓ１３（ＡｓＣａｓ１３）；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２ Ｃａｓ１３（ＦｎＣａｓ１３）；Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ Ｃａｓ１３（Ｌｂ３Ｃａｓ１３）；Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ Ｃａｓ１３（ＢｐＣａｓ１３）；Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７ Ｃａｓ１３（ＰｂＣａｓ１３）；Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０ Ｃａｓ１３（ＰｅＣａｓ１３）；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ Ｃａｓ１３（ＬｉＣａｓ１３）；Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣ＿Ｋ０８Ｄ１７ Ｃａｓ１３（ＳｓＣａｓ１３）；Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０ Ｃａｓ１３（Ｌｂ２Ｃａｓ１３）；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ Ｃａｓ１３（ＰｃＣａｓ１３）；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ Ｃａｓ１３（ＰｍＣａｓ１３）；Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ Ｃａｓ１３（ＣＭｔＣａｓ１３）；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ Ｃａｓ１３（ＥｅＣａｓ１３）；Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７ Ｃａｓ１３（ＭｂＣａｓ１３）；Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ Ｃａｓ１３（ＰｄＣａｓ１３）；またはＬ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃａｓ１３（ＬｂＣａｓ１３）のいずれか１つのＣａｓ１３で使用することができる。
いくつかの実施形態では、ガイドの改変は、化学的改変、挿入、欠失またはスプリットである。いくつかの実施形態では、化学的改変は、限定はされないが、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）類似体、２’－デオキシ類似体、２－チオウリジン類似体、Ｎ６－メチルアデノシン類似体、２’－フルオロ類似体、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍｅ１Ψ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、７－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ－拘束エチル（ｃＥｔ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、または２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の組み込みを含む。いくつかの実施形態では、ガイドは、１つ以上のホスホロチオエート改変を含む。ある特定の実施形態では、ガイドの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５ヌクレオチドは、化学的に改変される。ある特定の実施形態では、シード領域の１つ以上のヌクレオチドは、化学的に改変される。ある特定の実施形態では、３’末端の１つ以上のヌクレオチドは、化学的に改変される。ある特定の実施形態では、５’－ハンドルにおけるヌクレオチドはどれも化学的に改変されない。いくつかの実施形態では、シード領域における化学的改変は、２’－フルオロ類似体の組み込みなどの若干の改変である。特定の実施形態では、シード領域の１つのヌクレオチドは、２’－フルオロ類似体に置換される。いくつかの実施形態では、３’末端の５～１０ヌクレオチドは、化学的に改変される。Ｃａｓ１３ ＣｒＲＮＡの３’末端のかかる化学的改変は、Ｃａｓ１３活性を改善し得る（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１：００６６を参照されたい）。特定の実施形態では、３’末端の、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドは、２’－フルオロ類似体に置換される。特定の実施形態では、３’末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）類似体に置換される。
いくつかの実施形態では、ガイドの５’－ハンドルのループは改変される。いくつかの実施形態では、ガイドの５’－ハンドルのループは、欠失、挿入、スプリット、または化学的改変を有するように改変される。ある特定の実施形態では、改変ループは、３、４、または５ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ループは、ＵＣＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＡＵＵ、またはＵＧＵＵの配列を含む。
いくつかの実施形態では、ガイド分子は、別々の非共有結合した配列と共にステムループを形成し、これは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ある特定の実施形態では、ガイドを形成する配列は、標準ホスホロアミダイト合成プロトコルを用いて最初に合成される（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．，ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌ ２８８，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（２０１２））。いくつかの実施形態では、これらの配列は、当該技術分野において公知の標準プロトコルを用いて、ライゲーションに適当な官能基を含むように官能基化することができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３））。官能基の例としては、限定はされないが、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸活性エステル、アルデヒド、カルボニル、クロロカルボニル、イミダゾリルカルボニル、ヒドロジド、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオール、マレイミド、ハロアルキル、スルホニル、アリル、プロパルギル、ジエン、アルキン、及びアジドが挙げられる。この配列が官能基化されると、共有化学結合または連結は、この配列とダイレクトリピート配列の間に形成することができる。化学結合の例としては、限定はされないが、カルバミン酸、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリジン、ヒドロゾン、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオエート、ホルホロジチオエート、スルホンアミド、スルホン酸、スルホン、スルホキシド、尿素、チオ尿素、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、感光性結合、Ｃ－Ｃ結合形成基、例えば、Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環状付加対または閉環メタセシス対、及びＭｉｃｈａｅｌ反応対に基づくものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、これらのステムループ形成配列は、化学的に合成することができる。いくつかの実施形態では、化学合成は、２’－アセトキシエチルオルトエステル（２’－ＡＣＥ）（Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１１８２０－１１８２１；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）３１７：３－１８）または２’－チオノカルバメート（２’－ＴＣ）ケミストリー（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０１１）１３３：１１５４０－１１５４６；Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３：９８５－９８９）と共に自動化固相オリゴヌクレオチド合成機械を使用する。
ある特定の実施形態では、（Ｃａｓ１３を標的遺伝子座にガイドすることが可能な）ガイド分子は、（１）標的遺伝子座にハイブリダイズすることが可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅまたはダイレクトリピート配列を含み、それによって、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列から上流（すなわち、５’）に位置する。特定の実施形態では、Ｃａｓ１３ガイド配列のシード配列（すなわち、標的遺伝子座の配列の認識及び／またはそれとのハイブリダイゼーションに必須の重要な配列）は、おおよそ、ガイド配列の最初の約１０ヌクレオチド以内にある。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３は、ＦｎＣａｓ１３であり、シード配列は、ガイド配列の５’末端上の最初のおおよそ５ｎｔ以内にある。
ある特定の実施形態では、ガイド分子は、ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列を含み、ダイレクトリピート配列は、１つ以上のステムループまたは最適化された二次構造を含む。特定の実施形態において、ダイレクトリピートは、１６ｎｔの最小長さ及び単一のステムループを有する。さらなる実施形態では、ダイレクトリピートは、長さが１６ｎｔより長く、好ましくは１７ｎｔより長く、かつ、２つ以上のステムループまたは最適化された二次構造を有する。ある特定の実施形態では、ガイド分子は、天然ダイレクトリピート配列の全てまたは一部に連結されたガイド配列を含むかまたはからなる。典型的なＶ型Ｃａｓ１３ガイド分子は、（３’からの５’の方向で）：ガイド配列、第１の相補的ストレッチ（「リピート」）、ループ（典型的には、４または５ヌクレオチド長である）、第２の相補的ストレッチ（リピートに相補的な「抗リピート」）、及びポリＡ（ＲＮＡ中ではポリＵが多い）テール（ターミネーター）を含む。ある特定の実施形態では、ダイレクトリピート配列は、その天然アーキテクチャーを保持し、単一のステムループを形成する。特定の実施形態では、ガイドアーキテクチャーのある特定の態様は、例えば、特徴の付加、削除または置換によって改変することができる一方、ガイドアーキテクチャーのある特定の他の態様は維持される。エンジニアリングされたガイド分子の改変（挿入、欠失、及び置換を含むがこれらに限定されない）の好ましい位置には、Ｃａｓ１３タンパク質及び／または標的と複合体化した場合に露出されるガイド分子、例えば、ダイレクトリピート配列のステムループのガイド末端及び領域が含まれる。
ある特定の実施形態では、ステムは、相補的Ｘ及びＹ配列を含む少なくとも約４ｂｐを含むが、それ以上、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１または１２、またはそれ以下、例えば、３、２の塩基対のステムも企図される。従って、例えば、Ｘ２－１０及びＹ２－１０（式中、Ｘ及びＹは、ヌクレオチドの任意の補集合を表す）が企図され得る。一態様では、Ｘ及びＹヌクレオチドから構成されるステムは、ループと一緒にして、二次構造全体において完全なヘアピンを形成し；これは有利である場合があり、塩基対の量は、完全なヘアピンを形成する任意の量であり得る。一態様では、任意の相補的Ｘ：Ｙ塩基対合配列（例えば、長さに関して）は、ガイド分子全体の二次構造が保存される限り許容される。一態様では、Ｘ：Ｙ塩基対から構成されるステムを連結するループは、ガイド分子の二次構造全体を邪魔しない同じ長さ（例えば、４または５ヌクレオチド）またはそれ以上の任意の配列であり得る。一態様では、ステムループは、例えば、ＭＳ２アプタマーをさらに含み得る。一態様では、ステムは、相補的Ｘ及びＹ配列を含む約５～７ｂｐを含むが、それ以上またはそれ以下の塩基対のステムも企図される。一態様では、かかる対合が、そうでなければ概して、その位置でステムループのアーキテクチャーを保存する場合には、非ワトソン・クリック塩基対合が企図される。
ある特定の実施形態では、ガイド分子の天然ヘアピンまたはステムループ構造は、伸長したステムループによって伸長または置換される。ステムの伸長が、ガイド分子のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質とのアセンブリを増強できることが実証されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．（２０１３）；１５５（７）：１４７９－１４９１）。ある特定の実施形態では、ステムループのステムは、少なくとも１、２、３、４、５またはそれよりも多い相補塩基対によって伸長される（すなわち、ガイド分子中の２、４、６、８、１０またはそれよりも多いヌクレオチドの付加に対応する）。特定の実施形態では、これらは、ステムループのループに隣接する、ステムの末端に位置する。
ある特定の実施形態では、ＲＮＡまたは発現低下に対するガイド分子の感受性は、その機能に影響を及ぼさないガイド分子の配列の僅かな改変によって減らすことができる。例えば、ある特定の実施形態では、転写の成熟前終止、例えば、Ｕ６ Ｐｏｌ－ＩＩＩの未成熟転写は、ガイド分子配列中の推定Ｐｏｌ－ＩＩＩターミネーター（４つ連続したＵ）を改変することによって除去することができる。かかる配列改変が、ガイド分子のステムループにおいて必要とされる場合、塩基対フリップによって確保するのが好ましい。
好ましい実施形態では、ダイレクトリピートは、１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含むように改変され得る。特定の実施形態では、１つ以上のアプタマーは、例えば、最適化された二次構造の一部として含まれ得る。かかるアプタマーは、本明細書でさらに詳細されるように、バクテリオファージ被膜タンパク質に結合することができ得る。
いくつかの実施形態では、ガイド分子は、編集すべき少なくとも１つの標的アデノシン残基を含む標的ＤＮＡ鎖と二本鎖を形成する。ガイドＲＮＡ分子を標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイゼーションする際に、アデノシンデアミナーゼは、二本鎖に結合し、ＤＮＡ－ＲＮＡ二本鎖内に含まれる１つ以上の標的アデノシン残基の脱アミノ化を触媒する。
ガイド配列、従って、核酸ターゲティングガイドＲＮＡは、任意の標的核酸配列を標的にするように選択され得る。標的配列は、ＤＮＡであり得る。標的配列は、ゲノムＤＮＡであり得る。標的配列は、ミトコンドリアＤＮＡであり得る。
ある特定の実施形態では、標的配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）またはＰＦＳ（プロトスペーサーに隣接する配列または部位）と会合すべきである；すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の性質に応じて、標的配列は、ＤＮＡ二本鎖中のその相補配列（ノンターゲット配列とも本明細書で呼ばれる）がＰＡＭの上流または下流であるように選択すべきである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質がＣａｓ１３タンパク質である本発明の実施形態では、標的配列の相補配列は、ＰＡＭの下流または３’である。ＰＡＭの正確な配列及び長さ要件は、用いられるＣａｓ１３タンパク質に応じて異なるが、ＰＡＭは、典型的にはプロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２～５塩基対の配列である。異なるＣａｓ１３オルソログの天然ＰＡＭ配列の例は、以下の本明細書に記載され、当業者は、所与のＣａｓ１３タンパク質と共に使用されるさらなるＰＡＭ配列を同定することができるであろう。
さらに、ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインをエンジニアリングすることにより、ＰＡＭ特異性をプログラムし、標的部位認識の忠実度を向上させ、かつ、例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ＢＰ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｊｕｌ ２３；５２３（７５６１）：４８１－５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４５９２においてＣａｓ９について記載される通り、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の多用途性を増加させることが可能となり得る。本明細書でさらに詳述する場合、当業者であれば、Ｃａｓ１３タンパク質を類似的に改変し得ることが理解されるであろう。
特定の実施形態では、ガイド配列は、脱アミノ化されるアデニン上のデアミナーゼの最適な効率を確実にするために選択される。Ｃａｓ１３ニッカーゼの開裂部位に対する標的鎖中のアデニンの位置を考慮してもよい。特定の実施形態では、ニッカーゼが、ノンターゲット鎖上の、脱アミノ化されるアデニンの近くに作用することを保証することが有益である。例えば、特定の実施形態では、Ｃａｓ１３ニッカーゼは、ＰＡＭの１７ヌクレオチド下流（例えば、ＡｓＣａｓ１３、ＬｂＣａｓ１３）またはＰＡＭの１８ヌクレオチド下流（例えば、ＦｎＣａｓ１３）のノンターゲティング鎖を開裂し、脱アミノ化されるアデニンに対応するシトシンが、対応するノンターゲット鎖の配列におけるニッカーゼ開裂部位の１０ｂｐ上流内または下流内のガイド配列に位置するガイドを設計することは有益であり得る。
特定の実施形態では、ガイドは、エスコート付きガイドである。「エスコート付き」とは、Ｃａｓ１３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系または複合体またはガイドが細胞内で選択された時間または場所に送達され、従って、Ｃａｓ１３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系または複合体またはガイドの活性が空間的または時間的に制御されることを意味する。例えば、Ｃａｓ１３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系または複合体またはガイドの活性及び送達先が、細胞表面タンパク質または他の局在細胞成分などのアプタマーリガンドに対して結合親和性を有するエスコートＲＮＡアプタマー配列によって制御され得る。あるいは、エスコートアプタマーは、例えば、特定の時点で細胞に加えられる外部エネルギー源など、一過性エフェクターなどの細胞上または細胞内のアプタマーエフェクターに応答するものであってもよい。
エスコート付きＣａｓ１３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系または複合体は、ガイド分子の構造、アーキテクチャー、安定性、遺伝子発現、またはこれらの任意の組み合わせを改善するように設計された機能的構造を有するガイド分子を有する。かかる構造は、アプタマーを含み得る。
アプタマーは、例えば、試験管内進化法と呼ばれる技法を用いて（ＳＥＬＥＸ；Ｔｕｅｒｋ Ｃ，Ｇｏｌｄ Ｌ：“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＲＮＡ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０，２４９：５０５－５１０）、他のリガンドに緊密に結合するように設計しまたは選択することのできる生体分子である。核酸アプタマーは、例えば、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールから選択することができ、広範囲の生物医学的に関連性のある標的に対して高い結合親和性及び特異性を備え、アプタマーの広範囲の治療的有用性が示唆される（Ｋｅｅｆｅ，Ａｎｔｈｏｎｙ Ｄ．，Ｓｕｐｒｉｙａ Ｐａｉ，ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ．“Ａｐｔａｍｅｒｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ９．７（２０１０）：５３７－５５０）。これらの特徴はまた、薬物送達媒体としてのアプタマーの広範囲の用途も示唆している（Ｌｅｖｙ－Ｎｉｓｓｅｎｂａｕｍ，Ｅｔｇａｒ，ｅｔ ａｌ．“Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｐｔａｍｅｒｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．”Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６．８（２００８）：４４２－４４９；及び、Ｈｉｃｋｅ ＢＪ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＡＷ．“Ｅｓｃｏｒｔ ａｐｔａｍｅｒｓ：ａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｅｒｖｉｃｅ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０００，１０６：９２３－９２８）。フルオロフォアに結合して緑色蛍光タンパク質の活性を模倣するＲＮＡアプタマーなど（Ｐａｉｇｅ，Ｊｅｒｅｍｙ Ｓ．，Ｋａｒｅｎ Ｙ．Ｗｕ，ａｎｄ Ｓａｍｉｅ Ｒ．Ｊａｆｆｒｅｙ．“ＲＮＡ ｍｉｍｉｃｓ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３．６０４２（２０１１）：６４２－６４６）、特性を変化させることによりキュー（ｑｕｅ）に応答する、分子スイッチとして機能するアプタマーもまた構築し得る。また、例えば細胞表面タンパク質を標的化する標的化したｓｉＲＮＡ治療送達系の成分としてアプタマーを用い得ることも示唆されている（Ｚｈｏｕ，Ｊｉｅｈｕａ，ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｊ．Ｒｏｓｓｉ．“Ａｐｔａｍｅｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．”Ｓｉｌｅｎｃｅ １．１（２０１０）：４）。
従って、ある特定の実施形態では、ガイド分子は、例えば、細胞膜を越える送達、細胞内区画への送達、または核内への送達を含め、ガイド分子送達を改善するように設計された１つ以上のアプタマー（複数可）によって改変される。かかる構造は、１つ以上のアプタマー（複数可）に加えて、またはかかる１つ以上のアプタマー（複数可）なしに、ガイド分子を選択のエフェクターに送達可能なもの、誘導可能なものまたは応答性のものにするための部分（複数可）を含み得る。従って、本発明は、限定なしに、ｐＨ、低酸素症、Ｏ２濃度、温度、タンパク質濃度、酵素濃度、脂質構造、露光、機械的破壊（例えば、超音波）、磁界、電界、または電磁放射線を含む正常または病的生理的条件に応答するガイド分子を包含する。
誘導性系の光反応性は、クリプトクロム－２及びＣＩＢ１の活性化及び結合によって達成され得る。青色光刺激がクリプトクロム－２の活性化コンホメーション変化を引き起こし、それによりその結合パートナーＣＩＢ１が動員される。この結合は速く、可逆的であり、パルス刺激後１５秒未満で飽和に達し、刺激終了後１５分未満でベースラインに戻る。これらの急速な結合反応速度は、誘導剤の取込み及びクリアランスよりむしろ、転写／翻訳及び転写物／タンパク質分解の速度によってのみ時間的に拘束された系をもたらす。クリプトクロム－２活性化はまた極めて感受性が高く、低光強度刺激の使用が可能であり、光毒性のリスクが軽減される。さらに、インタクトな哺乳類脳などの文脈では、可変光強度を用いて刺激領域のサイズを制御することができ、ベクター送達単独で提供し得るよりも高い精度が実現する。
本発明は、電磁放射線、音響エネルギーまたは熱エネルギーなどのエネルギー源がガイドを誘導することを企図する。有利には、電磁放射線は、可視光の一成分である。好ましい実施形態では、光は、約４５０～約４９５ｎｍの波長の青色光である。特に好ましい実施形態では、波長は、約４８８ｎｍである。別の好ましい実施形態では、光刺激はパルスによる。光パワーは、約０～９ｍＷ／ｃｍ２の範囲であってもよい。好ましい実施形態では、１５秒毎に０．２５秒という低度の刺激パラダイムが最大の活性化をもたらすはずである。
化学物質またはエネルギー感受性ガイドは、化学物質源の結合によるかまたはエネルギーによる誘導時にコンホメーション変化を起こし、それがガイドとして働くこと、及びＣａｓ１３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系または複合体を機能させることが可能になり得る。本発明は、ガイドを機能させ及びＣａｓ１３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系または複合体を機能させるため化学物質源またはエネルギーを適用すること；ならびに任意選択でさらにゲノム遺伝子座の発現が変化していると決定することを含み得る。
この化学物質誘導性系にはいくつかの異なる設計がある：１．アブシジン酸（ＡＢＡ）によって誘導可能なＡＢＩ－ＰＹＬベースの系（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｓｔｋｅ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ａｂｓｔｒａｃｔ／ｓｉｇｔｒａｎｓ；４／１６４／ｒｓ２を参照されたい）、２．ラパマイシン（またはラパマイシンをベースとする関連する化学物質）によって誘導可能なＦＫＢＰ－ＦＲＢベースの系（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｍｅｔｈ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ２／ｎ６／ｆｕｌｌ／ｎｍｅｔｈ７６３．ｈｔｍｌを参照されたい）、３．ジベレリン（ＧＡ）によって誘導可能なＧＩＤ１－ＧＡＩベースの系（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｃｈｅｍｂｉｏ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ８／ｎ５／ｆｕｌｌ／ｎｃｈｅｍｂｉｏ．９２２．ｈｔｍｌを参照されたい）。
化学物質誘導性系は、４－ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）によって誘導可能なエストロゲン受容体（ＥＲ）ベースの系であってもよい（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０４／３／１０２７．ａｂｓｔｒａｃｔを参照されたい）。ＥＲＴ２と呼ばれるエストロゲン受容体の突然変異型リガンド結合ドメインが、４－ヒドロキシタモキシフェンの結合時に細胞の核内に移行する。本発明のさらなる実施形態では、任意の核内受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体、エストロゲン受容体、エストロゲン関連受容体、グルココルチコイド受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体の任意の天然に存在するまたはエンジニアリングされた誘導体を、ＥＲベースの誘導性系と類似した誘導性系で使用し得る。
別の誘導性系は、エネルギー、熱または電波によって誘導可能な一過性受容体電位（ＴＲＰ）イオンチャネルベースの系を用いる設計に基づく（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３３６／６０８１／６０４を参照されたい）。これらのＴＲＰファミリータンパク質は、光及び熱を含めた種々の刺激に応答する。このタンパク質が光または熱によって活性化されると、イオンチャネルが開口し、カルシウムなどのイオンが細胞膜内へと侵入することが可能になる。この流入イオンが、ガイド及びＣａｓ１３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体または系の他の成分を含むポリペプチドに連結した細胞内イオン相互作用パートナーに結合し、この結合がポリペプチドの細胞内局在の変化を誘導して、細胞の核内へのポリペプチド全体の侵入につながることになる。核内に入ると、ガイドタンパク質及びＣａｓ１３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の他の成分が活性になり、細胞における標的遺伝子発現が調節される。
光活性化が有利な実施形態であり得るが、時にこれは、特に光が皮膚または他の臓器を透過しないこともあるインビボ適用について不利となり得る。この場合、他のエネルギー活性化方法、特に、同様の効果を有する電界エネルギー及び／または超音波が企図される。
電界エネルギーは、好ましくは、実質的に当該技術分野で記載される通り、インビボ条件下で約１ボルト／ｃｍ～約１０ｋボルト／ｃｍの１つ以上の電気的パルスを用いて投与される。パルスの代わりにまたはそれに加えて、電界は連続的に送達されてもよい。電気的パルスは、１μｓ～５００ミリ秒間、好ましくは１μｓ～１００ミリ秒間印加され得る。電界は、連続的にまたはパルス式に約５分間印加され得る。
本明細書で使用する場合、「電界エネルギー」は、細胞が曝露される電気的エネルギーである。好ましくは、電界は、インビボ条件下で約１ボルト／ｃｍ～約１０ｋボルト／ｃｍまたはそれ以上の強度を有する（ＷＯ９７／４９４５０を参照されたい）。
本明細書で使用する場合、用語「電界」には、可変静電容量及び電圧の、指数関数波及び／または方形波及び／または被変調波及び／または被変調方形波の波形を含む１つ以上のパルスが含まれる。電界及び電気に関する言及は、細胞の環境における電位差の存在への言及を含むものと解釈されなければならない。かかる環境は、当該技術分野において公知の通り、静電気、交流電流（ＡＣ）、直流電流（ＤＣ）などによってセットアップし得る。電界は一様、非一様またはその他であってもよく、時間依存的に強度及び／または方向が変わってもよい。
電界の単回または複数回の印加、ならびに超音波の単回または複数回の印加もまた、任意の順序で、及び任意の組み合わせで可能である。超音波及び／または電界は、単回もしくは複数回の連続印加として送達されても、またはパルスとして（パルス状送達）送達されてもよい。
外来性材料を生細胞に導入するためのインビトロ手順及びインビボ手順の両方で、電気穿孔が用いられている。インビトロ適用では、生細胞試料が初めに目的の薬剤と混合され、平行板などの電極間に置かれる。次に、電極が細胞／インプラント混合物に電界を印加する。インビトロ電気穿孔を実施するシステムの例としては、いずれもＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，ＩｎｃのＢＴＸ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ製であるＥｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ＥＣＭ６００製品、及びＥｌｅｃｔｒｏ Ｓｑｕａｒｅ Ｐｏｒａｔｏｒ Ｔ８２０が挙げられる（米国特許第５，８６９，３２６号明細書を参照されたい）。
公知の電気穿孔技術（インビトロ及びインビボの両方）は、処理領域の周囲に位置決めした電極に短い高電圧パルスを印加することによって機能する。電極間に発生する電界によって細胞膜が一時的に多孔質となり、そのとき目的の薬剤の分子が細胞に侵入する。公知の電気穿孔適用では、この電界は、約１００μｓの持続時間で１０００Ｖ／ｃｍ程度の単一方形波パルスを含む。かかるパルスは、例えば、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｑｕａｒｅ Ｐｏｒａｔｏｒ Ｔ８２０の公知の適用において発生させることができる。
好ましくは、電界は、インビトロ条件下で約１Ｖ／ｃｍ～約１０ｋＶ／ｃｍの強度を有する。従って、電界は、１Ｖ／ｃｍ、２Ｖ／ｃｍ、３Ｖ／ｃｍ、４Ｖ／ｃｍ、５Ｖ／ｃｍ、６Ｖ／ｃｍ、７Ｖ／ｃｍ、８Ｖ／ｃｍ、９Ｖ／ｃｍ、１０Ｖ／ｃｍ、２０Ｖ／ｃｍ、５０Ｖ／ｃｍ、１００Ｖ／ｃｍ、２００Ｖ／ｃｍ、３００Ｖ／ｃｍ、４００Ｖ／ｃｍ、５００Ｖ／ｃｍ、６００Ｖ／ｃｍ、７００Ｖ／ｃｍ、８００Ｖ／ｃｍ、９００Ｖ／ｃｍ、１ｋＶ／ｃｍ、２ｋＶ／ｃｍ、５ｋＶ／ｃｍ、１０ｋＶ／ｃｍ、２０ｋＶ／ｃｍ、５０ｋＶ／ｃｍまたはそれ以上の強度を有し得る。より好ましくはインビトロ条件下で約０．５ｋＶ／ｃｍ～約４．０ｋＶ／ｃｍ。好ましくは、電界は、インビボ条件下で約１Ｖ／ｃｍ～約１０ｋＶ／ｃｍの強度を有する。しかしながら、標的部位に送達されるパルス数を増加させる場合、電界強度は低くてもよい。従って、より低い電界強度でのパルス状電界送達が想定される。
好ましくは、電界の印加は、同じ強度及び静電容量の二重パルスなどの多重パルスか、あるいは様々な強度及び／または静電容量の逐次パルスの形態である。本明細書で使用する場合、用語「パルス」には、可変静電容量及び電圧の、指数関数波及び／または方形波及び／または被変調波／被変調方形波の波形を含む１つ以上の電気的パルスが含まれる。
好ましくは、電気的パルスは、指数関数波形、方形波形、被変調波形及び被変調方形波形から選択される波形として送達される。
好ましい実施形態では、低電圧の直流電流が用いられる。従って、本出願人らは、細胞、組織または組織塊に１Ｖ／ｃｍ～２０Ｖ／ｃｍの電界強度で１００ミリ秒以上、好ましくは１５分以上の時間にわたって印加される電界の使用を開示する。
超音波は、有利には約０．０５Ｗ／ｃｍ２～約１００Ｗ／ｃｍ２のパワーレベルで投与される。診断用もしくは治療用超音波、またはこれらの組み合わせが用いられてもよい。
本明細書で使用する場合、用語「超音波」は、その周波数がヒトの聴覚範囲を超えるほど高い機械的振動からなる形態のエネルギーを指す。超音波スペクトルの下限周波数は、概して約２０ｋＨｚと考えられ得る。超音波の多くの診断適用では、１～１５ＭＨｚ範囲の周波数が利用される（出典Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｐ．Ｎ．Ｔ．Ｗｅｌｌｓ，ｅｄ．，２ｎｄ．Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌ．Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ［Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｌｏｎｄｏｎ ＆ ＮＹ，１９７７］）。
超音波は、診断及び治療の両方の適用に用いられている。診断ツールとして用いられる場合（「診断用超音波」）、超音波は、典型的には最大約１００ｍＷ／ｃｍ２（ＦＤＡ推奨）のエネルギー密度範囲で用いられるが、最大７５０ｍＷ／ｃｍ２のエネルギー密度が用いられている。理学療法では、超音波は、典型的には最大約３～４Ｗ／ｃｍ２（ＷＨＯ推奨）の範囲のエネルギー源として用いられる。他の治療適用では、より高い強度の超音波が利用されることもあり、例えば、ＨＩＦＵでは短時間の１００Ｗ／ｃｍ～１ｋＷ／ｃｍ２（またはさらに高い）である。用語「超音波」は、本明細書で使用する場合、診断用、治療用及び集束超音波を包含することが意図される。
集束超音波（ＦＵＳ）は、侵襲的なプローブのない熱エネルギーの送達を可能にする（Ｍｏｒｏｃｚ ｅｔ ａｌ １９９８ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１，ｐｐ．１３６－１４２を参照。別の形態の集束超音波は高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）であり、これは、Ｍｏｕｓｓａｔｏｖ ｅｔ ａｌ ｉｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ（１９９８）Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．８，ｐｐ．８９３－９００及びＴｒａｎＨｕｕＨｕｅ ｅｔ ａｌ ｉｎ Ａｃｕｓｔｉｃａ（１９９７）Ｖｏｌ．８３，Ｎｏ．６，ｐｐ．１１０３－１１０６によってレビューされている。
好ましくは、診断用超音波と治療用超音波との組み合わせが利用される。しかしながら、この組み合わせは限定的であることを意図するものでなく、当業者であれば、任意の様々な組み合わせの超音波を用い得ることを理解するであろう。加えて、エネルギー密度、超音波周波数、及び曝露時間も様々であり得る。
好ましくは、超音波エネルギー源への曝露は、約０．０５～約１００Ｗｃｍ－２のパワー密度である。さらにより好ましくは、超音波エネルギー源への曝露は、約１～約１５Ｗｃｍ－２のパワー密度である。
好ましくは、超音波エネルギー源への曝露は、約０．０１５～約１０．０ＭＨｚの周波数である。より好ましくは、超音波エネルギー源への曝露は、約０．０２～約５．０ＭＨｚまたは約６．０ＭＨｚの周波数である。最も好ましくは、超音波は、３ＭＨｚの周波数で印加される。
好ましくは、曝露は、約１０ミリ秒～約６０分の時間である。好ましくは、曝露は、約１秒～約５分の時間である。より好ましくは、超音波は、約２分間印加される。しかしながら、破壊する詳細な標的細胞に応じて、曝露は、より長い持続時間、例えば、１５分間であってもよい。
有利には、標的組織は、約０．０１５～約１０ＭＨｚの範囲の周波数で約０．０５Ｗｃｍ－２～約１０Ｗｃｍ－２の音響パワー密度の超音波エネルギー源に曝露される（ＷＯ９８／５２６０９を参照されたい）。しかしながら、別の方法、例えば、１００Ｗｃｍ－２を超える音響パワー密度で、しかし、より短時間の、例えば、１０００Ｗｃｍ－２でミリ秒範囲以下の時間にわたる超音波エネルギー源への曝露もまた可能である。
好ましくは、超音波の印加は、多重パルスの形態である；従って、連続波及びパルス波（パルス状超音波送達）の両方を任意の組み合わせで利用し得る。例えば、連続波超音波が印加され、続いてパルス波超音波が印加されてもよく、または逆も同様である。これが任意の回数、任意の順序及び組み合わせで繰り返されてもよい。パルス波超音波が連続波超音波のバックグラウンドに対して印加されてもよく、あらゆるパルスがあらゆるまとまりで用いられ得る。
好ましくは、超音波は、パルス波超音波を含み得る。極めて好ましい実施形態では、超音波は、０．７Ｗｃｍ－２または１．２５Ｗｃｍ－２のパワー密度で連続波として印加される。パルス波超音波が用いられる場合、より高いパワー密度が用いられ得る。
超音波の使用は、光と同様、標的上に正確に集束させ得るため有利である。さらに、超音波は、光と異なり組織のより深部に集束させ得るため有利である。従って、超音波は、全組織透過療法（限定はされないが、肝葉など）または全臓器療法（限定はされないが、全肝臓または全筋肉、例えば、心臓など）により良く適している。別の重要な利点は、超音波が多種多様な診断及び治療適用に使用される非侵襲性の刺激であるという点である。例として、超音波は、医用イメージング技法において周知であり、加えて、整形外科療法においても周知である。さらに、対象脊椎動物への超音波の印加に好適な機器が広く利用可能であり、それらの使用は、当該技術分野において周知である。
ある特定の実施形態では、ガイド分子は、二次構造によって改変されて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の特異性を増加させ、二次構造は、エクソヌクレアーゼ活性に対して防御して、保護ガイド分子とも本明細書で呼ばれるガイド配列に５’付加することができる。
一態様では、本発明は、「プロテクターＲＮＡ」をガイド分子の配列にハイブリダイズすることを提供し、「プロテクターＲＮＡ」は、ガイド分子の３’末端に相補的であることで、部分的に二本鎖のガイドＲＮＡを生成するＲＮＡ鎖である。本発明のある実施形態では、ミスマッチ塩基（すなわち、ガイド配列の一部を形成しないガイド分子の塩基）を完全に相補的なプロテクター配列で保護することは、標的ＤＮＡが３’末端でミスマッチ塩基対に結合する可能性を減らす。本発明の特定の実施形態では、ガイドがガイド分子内のプロテクター配列を含むように、伸長した長さを含む追加の配列は、ガイド分子内に存在してもよい。この「プロテクター配列」により、ガイド分子が、「露出配列」（標的配列にハイブリダイズするガイド配列の一部を含む）に加えて、「保護配列」を含むことを確実にする。特定の実施形態では、ガイド分子は、プロテクターガイドの存在によって改変され、ヘアピンなどの二次構造を含む。３または４から３０またはそれよりも多い、例えば、約１０またはそれよりも多い、保護配列、ガイド配列、または両方に相補性を有する隣接塩基対が存在するのが有利である。保護部分が、その標的と相互作用するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の熱力学を邪魔しないことが有利である。部分的に二本鎖のガイド分子を含むかかる伸長を提供することで、ガイド分子は、保護されていると見なされ、特異的活性を維持しながら、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の特異的結合の改善をもたらす。
ある特定の実施形態では、短縮型ガイド（ｔｒｕ－ｇｕｉｄｅ）、すなわち、カノニカルガイド配列長さに対して長さが短縮されているガイド配列を含むガイド分子を使用する。Ｎｏｗａｋ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１６）４４（２０）：９５５５－９５６４）に記載されるように、かかるガイドは、標的ＤＮＡを開裂することなく、触媒的に活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素がその標的に結合することを可能にし得る。特定の実施形態では、短縮型ガイドを使用することで、標的に結合することができるが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素のニッカーゼ活性のみを保持する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素
その非改変形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、触媒的に活性なタンパク質である。これは、（標的配列にハイブリダイズしたガイドＲＮＡを含む）核酸ターゲティング複合体を形成する際に、標的配列中またはその近く（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０以内、またはそれよりも多い塩基対）の一方または両方のＤＮＡ鎖が改変（例えば、開裂）されることを意味する。本明細書で使用する場合、用語「目的の標的遺伝子座に会合する配列（複数可）」は、標的配列の近くの配列（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０以内、またはそれよりも多い塩基対、標的配列は、目的の標的遺伝子座内に含まれる）を指す。非改変触媒的に活性なＣａｓ１３タンパク質遺伝子は、スタガード切断を生成することで、切断部位は、典型的には標的配列内である。より詳細には、スタガード切断は、典型的には、ＰＡＭから１３～２３ヌクレオチド遠位である。特定の実施形態では、ノンターゲット鎖上の切断は、ＰＡＭの１７ヌクレオチド下流（すなわち、ＰＡＭのヌクレオチド１７と１８下流の間）である一方、標的鎖（すなわち、ガイド配列にハイブリダイズする鎖）上の切断は、ＰＡＭに相補的である配列からさらに４ヌクレオチドで生じる（これは、３’鎖上のＰＡＭの補体の２１ヌクレオチド上流、またはＰＡＭの補体のヌクレオチド２１及び２２上流の間である）。
本発明に係る方法では、突然変異型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が、標的配列を含む標的遺伝子座の一方または両方のＤＮＡ鎖を開裂する能力を欠くように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、対応する野生型酵素に対して突然変異しているのが好ましい。特定の実施形態では、Ｃａｓ１３タンパク質の１つ以上の触媒ドメインは、標的配列の一方のＤＮＡ鎖のみを開裂する突然変異型Ｃａｓタンパク質を生成するように突然変異している。
特定の実施形態では、突然変異型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が、実質的に全てのＤＮＡ開裂活性を欠くように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、対応する野生型酵素に対して突然変異していてもよい。いくつかの実施形態では、突然変異酵素の開裂活性が、酵素の非突然変異型の核酸開裂活性の約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、またはそれ以下に過ぎない場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、全てのＤＮＡ及び／またはＲＮＡ開裂活性を実質的に欠いていると見なされ；例としては、突然変異型の核酸開裂活性が、非突然変異型と比較してゼロかまたは無視できる場合であり得る。
本明細書に記載される方法のある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、一方のＤＮＡ鎖のみ、すなわち、ニッカーゼを開裂する突然変異型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質である。より詳細には、本発明の文脈では、ニッカーゼは、ノンターゲット配列内、すなわち、標的配列の反対側のＤＮＡ鎖上であり、かつ、ＰＡＭ配列の３’である配列内の開裂を確実にする。さらなるガイダンスによって、及び限定はされないが、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣａｓ１３のＮｕｃドメインにおけるアルギニン→アラニン置換（Ｒ１２２６Ａ）は、両方の鎖を開裂するヌクレアーゼ由来のＣａｓ１３をニッカーゼに変換する（単一鎖を開裂する）。当業者であれば、酵素がＡｓＣａｓ１３ではない場合、突然変異は、対応する位置における残基で作製され得ることが理解されるであろう。特定の実施形態では、Ｃａｓ１３は、ＦｎＣａｓ１３であり、突然変異は、位置Ｒ１２１８のアルギニンである。特定の実施形態では、Ｃａｓ１３は、ＬｂＣａｓ１３であり、突然変異は、位置Ｒ１１３８のアルギニンである。特定の実施形態では、Ｃａｓ１３は、ＭｂＣａｓ１３であり、突然変異は、位置Ｒ１２９３のアルギニンである。
本明細書に記載される方法のある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、触媒活性が低下しているかまたはそれが無い。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質がＣａｓ１３タンパク質である場合、突然変異は、ＡｓＣａｓ１３における位置を参照しながら、Ｄ９０８ＡまたはＥ９９３Ａなどの触媒ＲｕｖＣ様ドメインにおける１つ以上の突然変異を含み得るが、これらに限定はされない。
いくつかの実施形態では、突然変異酵素のＤＮＡ開裂活性が酵素の非突然変異型のＤＮＡ開裂活性の約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、またはそれ以下に過ぎない場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠いていると見なされ；例としては、突然変異型のＤＮＡ開裂活性が、非突然変異型と比較してゼロかまたは無視できる場合であり得る。これらの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、総括的なＤＮＡ結合タンパク質として使用される。突然変異は、人工的に導入された突然変異、または機能獲得もしくは喪失突然変異であってもよい。
上述の突然変異に加えて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、さらに改変されてもよい。本明細書で使用する場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質に関する用語「改変された」は、概して、誘導される野生型Ｃａｓタンパク質と比較して、１つ以上の改変または突然変異（点突然変異、短縮、挿入、欠失、キメラ、融合タンパク質などを含む）を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を指す。誘導とは、誘導された酵素が、野生型酵素と高度の配列相同性を有するという意味で主に基づいているが、当該技術分野において公知または本明細書に記載される通りの何らかの方法で突然変異（改変）されていることを意味する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の追加の改変は、機能性の変化を引き起こしてもよいし、引き起こさなくてもよい。例によって、及び特にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を参照しながら、機能性の変化をもたらさない改変としては、例えば、特定の宿主に発現するためのコドン最適化、または（例えば、視覚化のために）特定のマーカーによるヌクレアーゼの提供が挙げられる。機能性の変化をもたらし得る改変には、点突然変異、挿入、欠失、短縮（例えば、スプリットヌクレアーゼ）などを含む突然変異も含まれ得る。融合タンパク質には、限定はされないが、例えば、異種ドメインまたは機能性ドメイン（例えば、局在化シグナル、触媒ドメインなど）との融合が含まれ得る。ある特定の実施形態では、様々な異なる改変を組み合わせてもよい（例えば、突然変異型ヌクレアーゼは、触媒的に不活性であり、かつ、機能性ドメインにさらに融合されて、例えば、ＤＮＡメチル化、または、限定はされないが、（例えば、異なるヌクレアーゼ（ドメイン）による）破壊、突然変異、欠失、挿入、置換、ライゲーション、分解、破壊または組み換えを含む、別の核酸改変を誘導することができる）。本明細書で使用する場合、「機能性の変化」には、限定はされないが、特異性の変化（例えば、標的認識の変化、特異性の増加（例えば、「強化」Ｃａｓタンパク質）または減少、またはＰＡＭ認識の変化）、活性の変化（例えば、触媒的に不活性なヌクレアーゼまたはニッカーゼを含む、触媒活性の増加または減少）、及び／または安定性の変化（例えば、不安定化ドメインとの融合）が含まれる。好適な異種ドメインとしては、限定はされないが、ヌクレアーゼ、リガーゼ、修復タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、（ウイルス性）インテグラーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、アルゴノート、シチジンデアミナーゼ、レトロン、グループＩＩイントロン、ホスファターゼ、ホスホリラーゼ、スルフリラーゼ、キナーゼ、ポリメラーゼ、エクソヌクレアーゼなどが挙げられる。これら全ての改変の例は、当該技術分野において公知である。本明細書において言及される通りの「改変」ヌクレアーゼ、及び特に、「改変」Ｃａｓまたは「改変」ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系または複合体は、ポリ核酸と相互作用するかまたはそれに結合する能力（例えば、ガイド分子との複合体化）をまだ有するのが好ましいことが理解されるであろう。かかる改変Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載される通りのデアミナーゼタンパク質またはその活性ドメインと組み合わせることができる。
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、活性及び／または特異性の強化をもたらす１つ以上の改変、例えば、ターゲティングまたはノンターゲティング鎖を安定化させる突然変異残基（例えば、ｅＣａｓ９；“Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５１（６２６８）：８４－８８（その全体を参照により本明細書に組み込む）を含み得る。ある特定の実施形態では、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲタンパク質の活性の変化または改変は、ターゲティング効率の増加またはオフターゲット結合の減少を含む。ある特定の実施形態では、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲタンパク質の活性の変化は、開裂活性の改変を含む。ある特定の実施形態では、活性の変化は、標的ポリヌクレオチド遺伝子座に関する開裂活性の増加を含む。ある特定の実施形態では、活性の変化は、標的ポリヌクレオチド遺伝子座に関する開裂活性の低下を含む。ある特定の実施形態では、活性の変化は、オフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座に関する開裂活性の低下を含む。ある特定の実施形態では、改変ヌクレアーゼの活性の変化または改変は、ヘリカーゼ動態の変化を含む。ある特定の実施形態では、改変ヌクレアーゼは、（Ｃａｓタンパク質の場合には）ＲＮＡを含む核酸分子、または標的ポリヌクレオチド遺伝子座の鎖、またはオフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座の鎖とタンパク質との会合を変化させる改変を含む。本発明の態様では、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を変化させる改変を含む。ある特定の実施形態では、活性の変化は、オフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座に関する開裂活性の増加を含む。従って、ある特定の実施形態では、オフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座と比較して、標的ポリヌクレオチド遺伝子座に対する特異性の増加がある。他の実施形態では、オフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座と比較して、標的ポリヌクレオチド遺伝子座に対する特異性の減少がある。ある特定の実施形態では、突然変異は、例えば、標的とガイドＲＮＡの間のミスマッチに対する耐性の低下をもたらすＣａｓタンパク質の場合には、オフターゲット効果（例えば、開裂または結合特性、活性、または動態）の減少をもたらす。他の突然変異は、オフターゲット効果（例えば、開裂または結合特性、活性、または動態）の増加をもたらし得る。他の突然変異は、オンターゲット効果（例えば、開裂または結合特性、活性、または動態）の増加または減少をもたらし得る。ある特定の実施形態では、突然変異は、機能性ヌクレアーゼ複合体（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体）のヘリカーゼ活性、会合または形成の変化（例えば、増加または減少）をもたらす。ある特定の実施形態では、上述したように、突然変異は、ＰＡＭ認識の変化をもたらす、すなわち、非改変Ｃａｓタンパク質と比較して、異なるＰＡＭを（追加または代わりに）認識し得る。特に好ましい突然変異としては、特異性を増強するために、保存された正電荷残基などの正電荷残基及び／または（進化的に）保存された残基が挙げられる。ある特定の実施形態では、かかる残基は、アラニンなどの非電荷残基に突然変異し得る。
塩基編集
いくつかの実施形態では、系は、塩基編集に使用してもよい。例えば、本明細書に開示される系は、ターゲティング成分及び塩基編集成分を含む。ターゲティング成分は、塩基編集成分を、１つ以上のヌクレオチドが編集される標的ヌクレオチド配列に特異的に標的するように機能する。いくつかの例では、標的成分は、触媒的に不活性なＣａｓ１３エフェクタータンパク質（例えば、ｄＣａｓ１３）であり得る。次いで、塩基編集成分は、化学反応を触媒して、標的配列中の第１のヌクレオチドを第２のヌクレオチドに変換し得る。例えば、塩基エディターは、細胞の転写もしくは翻訳機構によってアデニンがグアニンとして読まれるようにアデニンの変換を触媒し得、またはその逆も同様である。同様に、塩基編集成分は、シチジンからウラシルへの変換を触媒し得、またはその逆も同様である。ある特定の例示の実施形態では、塩基エディターは、アデニンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼなどの公知の塩基エディターで開始することで導出され、指向性進化法などの方法を用いて改変し、新たな機能性を導出し得る。指向性進化法技術は、当該技術分野において公知であり、ＷＯ２０１５／１８４０１６“Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｅｒｍｕａｔａｔｉｏｎｓ”に記載されるものを含み得る。
ある特定の例示の実施形態では、結合成分は、ＤＮＡ結合タンパク質もしくはその機能性ドメイン、またはＲＮＡ結合ドメインもしくはその機能性ドメインであり得る。結合成分は、標的遺伝子座でまたはそれに隣接して、配列、モチーフ、または構造的特徴に結合し得る。構造的特徴は、核酸のヘアピン、テトラループ、または他の二次構造的特徴を含み得る。本明細書で使用する場合、「隣接する」は、アデノシンデアミナーゼがその塩基編集機能を完了し得る標的遺伝子座のある距離及び／または指向性の範囲内を意味する。ある特定の例示の実施形態では、その結合成分は、ガイド分子の配列、モチーフ、または構造配列に結合し得る。ガイド分子は、目的の標的遺伝子座にハイブリダイズすることで、アデノシンデアミナーゼを標的遺伝子座に仕向ける配列を含む。
アデノシンデアミナーゼ
ある特定の例示の実施形態では、塩基編集成分は、アデノシンデアミナーゼである。アデノシンデアミナーゼは、ターゲティング成分によって、標的遺伝子座に動員される。ある特定の例示の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＲＮＡ結合タンパク質もしくはその機能性断片、またはＤＮＡ結合タンパク質もしくはその機能性断片に連結される。
用語「アデノシンデアミナーゼ」または「アデノシンデアミナーゼタンパク質」は、本明細書で使用する場合、以下に示すように、アデニン（または、分子のアデニン部分）をヒポキサンチン（または、分子のヒポキサンチン部分）に変換する加水分解脱アミノ化反応を触媒することができる、タンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質もしくはポリペプチド１つ以上の機能性ドメイン（複数可）を指す。いくつかの実施形態では、アデニン含有分子は、アデノシン（Ａ）であり、ヒポキサンチン含有分子は、イノシン（Ｉ）である。アデニン含有分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。
Figure 2023134462000002
本開示によれば、本開示と関連して使用することができるアデノシンデアミナーゼとしては、限定はされないが、ＲＮＡ（ＡＤＡＲ）に作用するアデノシンデアミナーゼとして知られる酵素ファミリーのメンバー、ｔＲＮＡ（ＡＤＡＴ）に作用するアデノシンデアミナーゼとして知られる酵素ファミリーのメンバー、及び他のアデノシンデアミナーゼドメイン含有（ＡＤＡＤ）ファミリーメンバーが挙げられる。本開示によれば、アデノシンデアミナーゼは、ＲＮＡ／ＤＮＡ及びＲＮＡ二本鎖中のアデニンを標的化することができる。実際、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１７，４５（６）：３３６９－３３７７）は、ＡＤＡＲが、ＲＮＡ／ＤＮＡ及びＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖上でアデノシンからイノシンへの編集反応を実施できることを示している。ある特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、本明細書において以下に詳細するように、ＲＮＡ／ＤＮＡｎ ＲＮＡ二本鎖中のＤＮＡを編集する能力を増加させるように改変されている。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、哺乳類、鳥類、カエル、イカ、魚類、ハエ及び線虫を含むがこれらに限定されない１つ以上の後生動物種に由来する。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ヒト、イカまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａアデノシンデアミナーゼである。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ヒトＡＤＡＲ、例えば、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、ｈＡＤＡＲ３である。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＡＤＡＲタンパク質、例えば、ＡＤＲ－１及びＡＤＲ－２である。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＡＤＡＲタンパク質、例えば、ｄＡｄａｒである。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｓｑｕｉｄ Ｌｏｌｉｇｏ ｐｅａｌｅｉｉ ＡＤＡＲタンパク質、例えば、ｓｑＡＤＡＲ２ａ及びｓｑＡＤＡＲ２ｂである。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ヒトＡＤＡＴタンパク質である。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＡＤＡＴタンパク質である。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ヒトＡＤＡＤタンパク質、例えば、ＴＥＮＲ（ｈＡＤＡＤ１）及びＴＥＮＲＬ（ｈＡＤＡＤ２）である。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、二本鎖核酸基質中の１つ以上の標的アデノシン残基（複数可）を認識し、それをイノシン残基（複数可）に変換する。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸基質は、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド二本鎖である。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、二本鎖基質上の結合ウィンドウを認識する。いくつかの実施形態では、結合ウィンドウは、少なくとも１つの標的アデノシン残基（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、結合ウィンドウは、約３ｂｐ～約１００ｂｐの範囲である。いくつかの実施形態では、結合ウィンドウは、約５ｂｐ～約５０ｂｐの範囲である。いくつかの実施形態では、結合ウィンドウは、約１０ｂｐ～約３０ｂｐの範囲である。いくつかの実施形態では、結合ウィンドウは、約１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、５ｂｐ、７ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ、または１００ｂｐである。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、１つ以上のデアミナーゼドメインを含む。理論によって束縛されることを意図しないが、デアミナーゼドメインは、二本鎖核酸基質中に含まれる１つ以上の標的アデノシン（Ａ）残基（複数可）を認識し、それをイノシン（Ｉ）残基（複数可）に変換することが企図される。いくつかの実施形態では、デアミナーゼドメインは、活性中心を含む。いくつかの実施形態では、活性中心は、亜鉛イオンを含む。いくつかの実施形態では、Ａ→Ｉ編集プロセス中に、標的アデノシン残基の塩基対合が破壊され、標的アデノシン残基は、二重らせんから「飛び出し（ｆｌｉｐｐｅｄ）」、アデノシンデアミナーゼがアクセス可能になる。いくつかの実施形態では、活性中心またはその近くのアミノ酸残基は、標的アデノシン残基に対する１つ以上のヌクレオチド（複数可）５’と相互作用する。いくつかの実施形態では、活性中心またはその近くのアミノ酸残基は、標的アデノシン残基に対する１つ以上のヌクレオチド（複数可）３’と相互作用する。いくつかの実施形態では、活性中心またはその近くのアミノ酸残基はさらに、逆鎖上の標的アデノシン残基に相補的であるヌクレオチドと相互作用する。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、ヌクレオチドの２’ヒドロキシル基と水素結合を形成する。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ヒトＡＤＡＲ２完全タンパク質（ｈＡＤＡＲ２）またはそのデアミナーゼドメイン（ｈＡＤＡＲ２－Ｄ）を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２またはｈＡＤＡＲ２－Ｄと相同であるＡＤＡＲファミリーメンバーである。
特に、いくつかの実施形態では、相同ＡＤＡＲタンパク質は、ヒトＡＤＡＲ１（ｈＡＤＡＲ１）またはそのデアミナーゼドメイン（ｈＡＤＡＲ１－Ｄ）である。いくつかの実施形態では、ｈＡＤＡＲ１－Ｄのグリシン１００７は、グリシン４８７ ｈＡＤＡＲ２－Ｄに対応し、ｈＡＤＡＲ１－Ｄのグルタミン酸１００８は、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのグルタミン酸４８８に対応する。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄの野生型アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄの編集効率及び／または基質編集選好性が特定のニーズに従って変化するように、ｈＡＤＡＲ２－Ｄ配列に１つ以上の突然変異を含む。
ｈＡＤＡＲ１及びｈＡＤＡＲ２タンパク質のある特定の突然変異は、Ｋｕｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２０１２）１０９（４８）：Ｅ３２９５－３０４；Ｗａｎｔ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２０１５）１０（１１）：２５１２－９；及びＺｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１７）４５（６）：３３６９－３３７（その全体を参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のグリシン３３６、または相同ＡＤＡＲタンパク質の対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、３３６位のグリシン残基は、アスパラギン酸残基（Ｇ３３６Ｄ）に置換される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のグリシン４８７、または相同ＡＤＡＲタンパク質の対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、４８７位のグリシン残基は、比較的小さい側鎖を有する無極性アミノ酸残基に置換される。例えば、いくつかの実施形態では、４８７位のグリシン残基は、アラニン残基（Ｇ４８７Ａ）に置換される。いくつかの実施形態では、４８７位のグリシン残基は、バリン残基（Ｇ４８７Ｖ）に置換される。いくつかの実施形態では、４８７位のグリシン残基は、比較的大きな側鎖を有するアミノ酸残基に置換される。いくつかの実施形態では、４８７位のグリシン残基は、アルギニン残基（Ｇ４８７Ｒ）に置換される。いくつかの実施形態では、４８７位のグリシン残基は、リシン残基（Ｇ４８７Ｋ）に置換される。いくつかの実施形態では、４８７位のグリシン残基は、トリプトファン残基（Ｇ４８７Ｗ）に置換される。いくつかの実施形態では、４８７位のグリシン残基は、チロシン残基（Ｇ４８７Ｙ）に置換される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のグルタミン酸４８８、または相同ＡＤＡＲタンパク質の対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、グルタミン残基（Ｅ４８８Ｑ）に置換される。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、ヒスチジン残基（Ｅ４８８Ｈ）に置換される。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、アルギニン残基（Ｅ４８８Ｒ）に置換される。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、リシン残基（Ｅ４８８Ｋ）に置換される。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、アスパラギン残基（Ｅ４８８Ｎ）に置換される。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、アラニン残基（Ｅ４８８Ａ）に置換される。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、メチオニン残基（Ｅ４８８Ｍ）に置換される。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、セリン残基（Ｅ４８８Ｓ）に置換される。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、フェニルアラニン残基（Ｅ４８８Ｆ）に置換される。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、リシン残基（Ｅ４８８Ｌ）に置換される。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、トリプトファン残基（Ｅ４８８Ｗ）に置換される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のトレオニン４９０、または相同ＡＤＡＲタンパク質の対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、４９０位のトレオニン残基は、システイン残基（Ｔ４９０Ｃ）に置換される。いくつかの実施形態では、４９０位のトレオニン残基は、セリン残基（Ｔ４９０Ｓ）に置換される。いくつかの実施形態では、４９０位のトレオニン残基は、アラニン残基（Ｔ４９０Ａ）に置換される。いくつかの実施形態では、４９０位のトレオニン残基は、フェニルアラニン残基（Ｔ４９０Ｆ）に置換される。いくつかの実施形態では、４９０位のトレオニン残基は、チロシン残基（Ｔ４９０Ｙ）に置換される。いくつかの実施形態では、４９０位のトレオニン残基は、セリン残基（Ｔ４９０Ｒ）に置換される。いくつかの実施形態では、４９０位のトレオニン残基は、アラニン残基（Ｔ４９０Ｋ）に置換される。いくつかの実施形態では、４９０位のトレオニン残基は、フェニルアラニン残基（Ｔ４９０Ｐ）に置換される。いくつかの実施形態では、４９０位のトレオニン残基は、チロシン残基（Ｔ４９０Ｅ）に置換される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のバリン４９３、または相同ＡＤＡＲタンパク質の対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、４９３位のバリン残基は、アラニン残基（Ｖ４９３Ａ）に置換される。いくつかの実施形態では、４９３位のバリン残基は、セリン残基（Ｖ４９３Ｓ）に置換される。いくつかの実施形態では、４９３位のバリン残基は、トレオニン残基（Ｖ４９３Ｔ）に置換される。いくつかの実施形態では、４９３位のバリン残基は、アルギニン残基（Ｖ４９３Ｒ）に置換される。いくつかの実施形態では、４９３位のバリン残基は、アスパラギン酸残基（Ｖ４９３Ｄ）に置換される。いくつかの実施形態では、４９３位のバリン残基は、プロリン残基（Ｖ４９３Ｐ）に置換される。いくつかの実施形態では、４９３位のバリン残基は、グリシン残基（Ｖ４９３Ｇ）に置換される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のアラニン５８９、または相同ＡＤＡＲタンパク質の対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、５８９位のアラニン残基は、バリン残基（Ａ５８９Ｖ）に置換される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のアスパラギン５９７、または相同ＡＤＡＲタンパク質の対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、５９７位のアスパラギン残基は、リシン残基（Ｎ５９７Ｋ）に置換される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列でアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の５９７位で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、５９７位のアスパラギン残基は、アルギニン残基（Ｎ５９７Ｒ）に置換される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列でアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の５９７位で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、５９７位のアスパラギン残基は、アラニン残基（Ｎ５９７Ａ）に置換される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列でアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の５９７位で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、５９７位のアスパラギン残基は、グルタミン酸残基（Ｎ５９７Ｅ）に置換される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列でアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の５９７位で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、５９７位のアスパラギン残基は、ヒスチジン残基（Ｎ５９７Ｈ）に置換される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列でアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の５９７位で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、５９７位のアスパラギン残基は、グリシン残基（Ｎ５９７Ｇ）に置換される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列でアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の５９７位で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、５９７位のアスパラギン残基は、チロシン残基（Ｎ５９７Ｙ）に置換される。いくつかの実施形態では、５９７位のアスパラギン残基は、フェニルアラニン残基（Ｎ５９７Ｆ）に置換される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のセリン５９９、または相同ＡＤＡＲタンパク質の対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、５９９位のセリン残基は、トレオニン残基（Ｓ５９９Ｔ）に置換される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のアスパラギン６１３、または相同ＡＤＡＲタンパク質の対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、６１３位のアスパラギン残基は、リシン残基（Ｎ６１３Ｋ）に置換される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列でアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の６１３位で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、６１３位のアスパラギン残基は、アルギニン残基（Ｎ６１３Ｒ）に置換される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列でアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の６１３位で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、６１３位のアスパラギン残基は、アラニン残基（Ｎ６１３Ａ）に置換される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、野生型配列でアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の６１３位で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、６１３位のアスパラギン残基は、グルタミン酸残基（Ｎ６１３Ｅ）に置換される。
いくつかの実施形態では、編集効率を改善するため、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置に基づく突然変異：Ｇ３３６Ｄ、Ｇ４８７Ａ、Ｇ４８７Ｖ、Ｅ４８８Ｑ、Ｅ４８８Ｈ、Ｅ４８８Ｒ、Ｅ４８８Ｎ、Ｅ４８８Ａ、Ｅ４８８Ｓ、Ｅ４８８Ｍ、Ｔ４９０Ｃ、Ｔ４９０Ｓ、Ｖ４９３Ｔ、Ｖ４９３Ｓ、Ｖ４９３Ａ、Ｖ４９３Ｒ、Ｖ４９３Ｄ、Ｖ４９３Ｐ、Ｖ４９３Ｇ、Ｎ５９７Ｋ、Ｎ５９７Ｒ、Ｎ５９７Ａ、Ｎ５９７Ｅ、Ｎ５９７Ｈ、Ｎ５９７Ｇ、Ｎ５９７Ｙ、Ａ５８９Ｖ、Ｓ５９９Ｔ、Ｎ６１３Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６１３Ａ、Ｎ６１３Ｅ、及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質の突然変異のうちの１つ以上を含み得る。
いくつかの実施形態では、編集効率を減らすため、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置に基づく突然変異：Ｅ４８８Ｆ、Ｅ４８８Ｌ、Ｅ４８８Ｗ、Ｔ４９０Ａ、Ｔ４９０Ｆ、Ｔ４９０Ｙ、Ｔ４９０Ｒ、Ｔ４９０Ｋ、Ｔ４９０Ｐ、Ｔ４９０Ｅ、Ｎ５９７Ｆ、及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質の突然変異のうちの１つ以上を含み得る。ある特定の実施形態では、有効性を低下させたアデノシンデアミナーゼ酵素を使用して、オフターゲット効果を減らすことは有益であり得る。
いくつかの実施形態では、オフターゲット効果を減らすため、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置に基づく突然変異Ｒ３４８、Ｖ３５１、Ｔ３７５、Ｋ３７６、Ｅ３９６、Ｃ４５１、Ｒ４５５、Ｎ４７３、Ｒ４７４、Ｋ４７５、Ｒ４７７、Ｒ４８１、Ｓ４８６、Ｅ４８８、Ｔ４９０、Ｓ４９５、Ｒ５１０、及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質の突然変異のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８、及びＲ３４８、Ｖ３５１、Ｔ３７５、Ｋ３７６、Ｅ３９６、Ｃ４５１、Ｒ４５５、Ｎ４７３、Ｒ４７４、Ｋ４７５、Ｒ４７７、Ｒ４８１、Ｓ４８６、Ｔ４９０、Ｓ４９５、Ｒ５１０から選択される１つ以上の追加の位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５、及び任意選択で、１つ以上の追加の位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ４７３、及び任意選択で、１つ以上の追加の位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１、及び任意選択で、１つ以上の追加の位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８及びＴ３７５、ならびに任意選択で、１つ以上の追加の位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８及びＮ４７３、ならびに任意選択で、１つ以上の追加の位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８及びＶ３５１、ならびに任意選択で、１つ以上の追加の位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８、ならびにＴ３７５、Ｎ４７３、及びＶ３５１のうちの１つ以上で突然変異を含む。
いくつかの実施形態では、オフターゲット効果を減らすため、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置に基づくＲ３４８Ｅ、Ｖ３５１Ｌ、Ｔ３７５Ｇ、Ｔ３７５Ｓ、Ｒ４５５Ｇ、Ｒ４５５Ｓ、Ｒ４５５Ｅ、Ｎ４７３Ｄ、Ｒ４７４Ｅ、Ｋ４７５Ｑ、Ｒ４７７Ｅ、Ｒ４８１Ｅ、Ｓ４８６Ｔ、Ｅ４８８Ｑ、Ｔ４９０Ａ、Ｔ４９０Ｓ、Ｓ４９５Ｔ、及びＲ５１０Ｅから選択される突然変異、ならびに上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質の突然変異のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｅ４８８Ｑ、ならびにＲ３４８Ｅ、Ｖ３５１Ｌ、Ｔ３７５Ｇ、Ｔ３７５Ｓ、Ｒ４５５Ｇ、Ｒ４５５Ｓ、Ｒ４５５Ｅ、Ｎ４７３Ｄ、Ｒ４７４Ｅ、Ｋ４７５Ｑ、Ｒ４７７Ｅ、Ｒ４８１Ｅ、Ｓ４８６Ｔ、Ｔ４９０Ａ、Ｔ４９０Ｓ、Ｓ４９５Ｔ、及びＲ５１０Ｅから選択される１つ以上の追加の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｔ３７５ＧまたはＴ３７５Ｓ、及び任意選択で、１つ以上の追加の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｎ４７３Ｄ、及び任意選択で、１つ以上の追加の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｖ３５１Ｌ、及び任意選択で、１つ以上の追加の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｅ４８８Ｑ、及びＴ３７５ＧまたはＴ３７５Ｇ、及び任意選択で、１つ以上の追加の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｅ４８８Ｑ及びＮ４７３Ｄ、ならびに任意選択で、１つ以上の追加の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｅ４８８Ｑ及びＶ３５１Ｌ、ならびに任意選択で、１つ以上の追加の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｅ４８８Ｑ、ならびにＴ３７５Ｇ／Ｓ、Ｎ４７３Ｄ及びＶ３５１Ｌのうちの１つ以上を含む。
ある特定の実施形態では、オフターゲット改変の編集及び低下の改善は、ｇＲＮＡの化学的改変によって達成される。Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ，５３：６２６７－６２７１，ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１４０２６３４（その全体を参照により本明細書に組み込む）に例示するように化学的に改変されているｇＲＮＡは、オフターゲット活性を低下させて、オンターゲット効率を改善する。２’－Ｏ－メチル及びホスホチオエート改変ガイドＲＮＡは、一般的に、細胞中の編集効率を改善する。
ＡＤＡＲは、編集されたＡの両側の隣接ヌクレオチドに対する選好性を示すことが知られている（ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｓｍｂ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ２３／ｎ５／ｆｕｌｌ／ｎｓｍｂ．３２０３．ｈｔｍｌ，Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２３（５）：４２６－４３３（その全体を参照により本明細書に組み込む））。従って、ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡ、標的、及び／またはＡＤＡＲは、モチーフ選好性を最適化するように選択される。
意図的なミスマッチは、好ましくないモチーフの編集を可能にすることがインビトロで実証されている（ｈｔｔｐｓ：／／ａｃａｄｅｍｉｃ．ｏｕｐ．ｃｏｍ／ｎａｒ／ａｒｔｉｃｌｅ－ｌｏｏｋｕｐ／ｄｏｉ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ２７２；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ、４２（１０）：ｅ８７）；Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ。（２０１７），Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４１４７８（その全体を参照により本明細書に組み込む））。従って、ある特定の実施形態では、好ましくない５’または３’隣接塩基上のＲＮＡ編集効率を増強するため、隣接塩基中に意図的なミスマッチを導入する。
結果は、ＡＤＡＲデアミナーゼドメインのターゲティングウィンドウにおけるＡ－Ｃは、他の塩基にわたって優先的に編集されることを示唆している。加えて、標的化塩基の少数の塩基内のＡ－Ｕ塩基対は、Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物による低レベルの編集を示し、酵素が多数のＡを編集する柔軟性があることを示唆する。例えば、図１８を参照されたい。これら２つの観察は、Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物の活性ウィンドウにおける多数のＡが、Ｃで編集すべき全てのＡをミスマッチすることによって、編集に特異的にすることができたことを示唆する。従って、ある特定の実施形態では、活性ウィンドウにおける多数のＡ：Ｃミスマッチは、多数のＡ：Ｉ編集を生成するように設計される。ある特定の実施形態では、活性ウィンドウにおける潜在的なオフターゲット編集を抑制するため、ノンターゲットＡをＡまたはＧと対合させる。
用語「編集特異性」及び「編集選好性」は、二本鎖基質における特定のアデノシン部位でＡ→Ｉ編集の程度を指すように本明細書で同義的に使用される。いくつかの実施形態では、基質編集選好性は、標的アデノシン残基の５’最近傍及び／または３’最近傍によって決定される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｕ＞Ａ＞Ｃ＞Ｇとランク付けされる基質の５’最近傍に対する選好性を有する（「＞」は、より大きな選好性を示す）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ＞Ｃ～Ａ＞Ｕとランク付けされる基質の３’最近傍に対する選好性を有する（「＞」は、より大きな選好性を示し；「～」は、同様の選好性を示す）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ＞Ｃ＞Ｕ～Ａとランク付けされる基質の３’最近傍に対する選好性を有する（「＞」は、より大きな選好性を示し；「～」は、同様の選好性を示す）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ＞Ｃ＞Ａ＞Ｕとランク付けされる基質の３’最近傍に対する選好性を有する（「＞」は、より大きな選好性を示す）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｃ～Ｇ～Ａ＞Ｕとランク付けされる基質の３’最近傍に対する選好性を有する（「＞」は、より大きな選好性を示し；「～」は、同様の選好性を示す）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴＡＧ＞ＡＡＧ＞ＣＡＣ＞ＡＡＴ＞ＧＡＡ＞ＧＡＣとランク付けされる標的アデノシン残基を含むトリプレット配列に対する選好性を有し（「＞」は、より大きな選好性を示す）、中心Ａは、標的アデノシン残基である。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼの基質編集選好性は、アデノシンデアミナーゼタンパク質における核酸結合ドメインの存在または不在の影響を受ける。いくつかの実施形態では、基質編集選好性を改変するため、デアミナーゼドメインは、二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）または二本鎖ＲＮＡ結合モチーフ（ｄｓＲＢＭ）と連結される。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＢＤまたはｄｓＲＢＭは、ｈＡＤＡＲ１またはｈＡＤＡＲ２などのＡＤＡＲタンパク質に由来し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｄｓＲＢＤ及びデアミナーゼドメインを含む完全長ＡＤＡＲタンパク質を使用する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｄｓＲＢＭまたはｄｓＲＢＤは、デアミナーゼドメインのＮ末端である。他の実施形態では、１つ以上のｄｓＲＢＭまたはｄｓＲＢＤは、デアミナーゼドメインのＣ末端である。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼの基質編集選好性は、酵素の活性中心近くまたは中心におけるアミノ酸残基の影響を受ける。いくつかの実施形態では、基質編集選好性を改変するため、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置に基づく突然変異：Ｇ３３６Ｄ、Ｇ４８７Ｒ、Ｇ４８７Ｋ、Ｇ４８７Ｗ、Ｇ４８７Ｙ、Ｅ４８８Ｑ、Ｅ４８８Ｎ、Ｔ４９０Ａ、Ｖ４９３Ａ、Ｖ４９３Ｔ、Ｖ４９３Ｓ、Ｎ５９７Ｋ、Ｎ５９７Ｒ、Ａ５８９Ｖ、Ｓ５９９Ｔ、Ｎ６１３Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質の突然変異のうちの１つ以上を含み得る。
特に、いくつかの実施形態では、編集特異性を減らすため、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置に基づく突然変異Ｅ４８８Ｑ、Ｖ４９３Ａ、Ｎ５９７Ｋ、Ｎ６１３Ｋ、及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質の突然変異のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、編集特異性を増加させるため、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｔ４９０Ａを含み得る。
いくつかの実施形態では、トリプレット配列ＧＡＣを含む基質（中心Ａが標的アデノシン残基である）などの即時５’Ｇを有する標的アデノシン（Ａ）の編集選好性を増加させるため、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置に基づく突然変異Ｇ３３６Ｄ、Ｅ４８８Ｑ、Ｅ４８８Ｎ、Ｖ４９３Ｔ、Ｖ４９３Ｓ、Ｖ４９３Ａ、Ａ５８９Ｖ、Ｎ５９７Ｋ、Ｎ５９７Ｒ、Ｓ５９９Ｔ、Ｎ６１３Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質の突然変異のうちの１つ以上を含み得る。
特に、いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、突然変異Ｅ４８８Ｑ、または相同ＡＤＡＲタンパク質の対応する突然変異を含み、以下のトリプレット配列：ＧＡＣ、ＧＡＡ、ＧＡＵ、ＧＡＧ、ＣＡＵ、ＡＡＵ、ＵＡＣを含む基質（中心Ａが標的アデノシン残基である）を編集する。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄの野生型アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄの編集効率及び／または基質編集選好性が特定のニーズに従って変化するように、ｈＡＤＡＲ１－Ｄ配列に１つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄアミノ酸配列のグリシン１００７、または相同ＡＤＡＲタンパク質の対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、１００７位のグリシン残基は、比較的小さい側鎖を有する無極性アミノ酸残基に置換される。例えば、いくつかの実施形態では、１００７位のグリシン残基は、アラニン残基（Ｇ１００７Ａ）に置換される。いくつかの実施形態では、１００７位のグリシン残基は、バリン残基（Ｇ１００７Ｖ）に置換される。いくつかの実施形態では、１００７位のグリシン残基は、比較的大きな側鎖を有するアミノ酸残基に置換される。いくつかの実施形態では、１００７位のグリシン残基は、アルギニン残基（Ｇ１００７Ｒ）に置換される。いくつかの実施形態では、１００７位のグリシン残基は、リシン残基（Ｇ１００７Ｋ）に置換される。いくつかの実施形態では、１００７位のグリシン残基は、トリプトファン残基（Ｇ１００７Ｗ）に置換される。いくつかの実施形態では、１００７位のグリシン残基は、チロシン残基（Ｇ１００７Ｙ）に置換される。加えて、他の実施形態では、１００７位のグリシン残基は、ロイシン残基（Ｇ１００７Ｌ）に置換される。他の実施形態では、１００７位のグリシン残基は、トレオニン残基（Ｇ１００７Ｔ）に置換される。他の実施形態では、１００７位のグリシン残基は、セリン残基（Ｇ１００７Ｓ）に置換される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄアミノ酸配列のグルタミン酸１００８、または相同ＡＤＡＲタンパク質の対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、比較的大きな側鎖を有する極性アミノ酸残基に置換される。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、グルタミン残基（Ｅ１００８Ｑ）に置換される。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、ヒスチジン残基（Ｅ１００８Ｈ）に置換される。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、アルギニン残基（Ｅ１００８Ｒ）に置換される。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、リシン残基（Ｅ１００８Ｋ）に置換される。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、無極性または小極性アミノ酸残基に置換される。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、フェニルアラニン残基（Ｅ１００８Ｆ）に置換される。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、トリプトファン残基（Ｅ１００８Ｗ）に置換される。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、グリシン残基（Ｅ１００８Ｇ）に置換される。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、イソロイシン残基（Ｅ１００８Ｉ）に置換される。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、バリン残基（Ｅ１００８Ｖ）に置換される。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、プロリン残基（Ｅ１００８Ｐ）に置換される。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、セリン残基（Ｅ１００８Ｓ）に置換される。他の実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、アスパラギン残基（Ｅ１００８Ｎ）に置換される。他の実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、アラニン残基（Ｅ１００８Ａ）に置換される。他の実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、メチオニン残基（Ｅ１００８Ｍ）に置換される。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、ロイシン残基（Ｅ１００８Ｌ）に置換される。
いくつかの実施形態では、編集効率を改善するため、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄのアミノ酸配列位置に基づく突然変異：Ｅ１００７Ｓ、Ｅ１００７Ａ、Ｅ１００７Ｖ、Ｅ１００８Ｑ、Ｅ１００８Ｒ、Ｅ１００８Ｈ、Ｅ１００８Ｍ、Ｅ１００８Ｎ、Ｅ１００８Ｋ、及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質の突然変異のうちの１つ以上を含み得る。
いくつかの実施形態では、編集効率を減らすため、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄのアミノ酸配列位置に基づく突然変異：Ｅ１００７Ｒ、Ｅ１００７Ｋ、Ｅ１００７Ｙ、Ｅ１００７Ｌ、Ｅ１００７Ｔ、Ｅ１００８Ｇ、Ｅ１００８Ｉ、Ｅ１００８Ｐ、Ｅ１００８Ｖ、Ｅ１００８Ｆ、Ｅ１００８Ｗ、Ｅ１００８Ｓ、Ｅ１００８Ｎ、Ｅ１００８Ｋ、及び上記に対応する相同ＡＤＡＲタンパク質の突然変異のうちの１つ以上を含み得る。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼの基質編集選好性、効率及び／または選択性は、酵素の活性中心近くまたは活性中心のアミノ酸残基の影響を受ける。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄ配列中のグルタミン酸１００８位、または相同ＡＤＡＲタンパク質の対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は、Ｅ１００８Ｒ、または相同ＡＤＡＲタンパク質の対応する突然変異である。いくつかの実施形態では、Ｅ１００８Ｒ突然変異体は、逆鎖上にミスマッチＧ残基を有する標的アデノシン残基の編集効率が増加している。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、二本鎖核酸基質を認識して、それに結合するための１つ以上の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合モチーフ（ｄｓＲＢＭ）またはドメイン（ｄｓＲＢＤ）をさらに含むかまたはそれに連結している。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼと二本鎖基質の間の相互作用は、１つ以上の追加のタンパク質因子（複数可）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳタンパク質因子によって媒介される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼと二本鎖基質の間の相互作用は、１つ以上の核酸成分（複数可）、例えば、ガイドＲＮＡによってさらに媒介される。
ある特定の例示の実施形態では、指向性進化法を使用して、アデニンからヒポキサンチンへの脱アミノ化に加えて、追加の反応を触媒することができる改変ＡＤＡＲタンパク質を設計することができる。例えば、
本発明によれば、アデノシンデアミナーゼの基質は、ガイド分子がそのＤＮＡ標的に結合する際に形成されるＲＮＡ／ＤＮＡｎ ＲＮＡ二本鎖であり、これは次いで、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素とＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成する。ＲＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡｎ ＲＮＡ二本鎖は、「ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド」、「ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド」または「二本鎖基質」とも本明細書で呼ばれる。ガイド分子及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素の特定の特徴を以下に詳述する。
用語「編集選択性」は、本明細書で使用する場合、アデノシンデアミナーゼによって編集される二本鎖基質上の全ての部位の画分を指す。理論に束縛されるものではないが、アデノシンデアミナーゼの編集選択性は、ミスマッチ塩基、バルジ、及び／または内部ループの存在などの二本鎖基質の長さ及び二次構造の影響を受けることが企図される。
いくつかの実施形態では、基質が５０ｂｐよりも長い完全に塩基対合二本鎖である場合、アデノシンデアミナーゼは、二本鎖内で多数のアデノシン残基を脱アミノ化することができ得る（例えば、全てのアデノシン残基の５０％）。いくつかの実施形態では、基質が５０ｂｐよりも短い場合、アデノシンデアミナーゼの編集選択性は、標的アデノシン部位でのミスマッチの存在の影響を受ける。特に、いくつかの実施形態では、逆鎖上にミスマッチシチジン（Ｃ）残基を有するアデノシン（Ａ）残基は、高効率で脱アミノ化される。いくつかの実施形態では、逆鎖上にミスマッチグアノシン（Ｇ）残基を有するアデノシン（Ａ）残基は、編集せずにスキップされる。
ＡＤＡＲ１／ＡＤＡＲ２によるＲＮＡ編集
（転写された／コード領域／スプライシング配列において）Ｇ→Ａ変化を有する遺伝性疾患は、本明細書に開示される系及び方法によって治療することができる。
ＡＤＡＲは、アデノシン（Ａ）をイノシン（Ｉ）に変異させ、イノシン（Ｉ）は、グアノシン（Ｇ）として細胞翻訳機構によって処理される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ１３－ＡＤＡＲ融合物によるＲＮＡ編集を使用して、病原性Ｇ→Ａ変化を含む転写物における遺伝子突然変異の効果を反転させ得る。ＡＤＡＲ ＲＮＡ編集は、二本鎖ＲＮＡで生じ得、編集塩基は、ＵまたはＣの反対である。Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ（例えば、ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ）ＲＮＡ編集は、二本鎖ＲＮＡ構造を作成して、ＡＤＡＲを死型Ｃａｓ１３ｂに遺伝的に融合させるために、ガイド－ＲＮＡを用いて達成することができる。
ＣｌｉｎＶａｒにおける全ての成熟前終止の病原性突然変異のうち、９１３５個のうちの９８５個（１０．７％）は、Ｇ→Ａ突然変異であり、Ｃａｓ１３－ＡＤＡＲ融合物エディターによる補正のための潜在的な候補である。ＣｌｉｎＶａｒにおける全ての病原性突然変異のうち、９７９４１個のうちの１５５３１個（１５．８％）は、Ｇ→Ａ突然変異である。
本明細書の系及び方法によって治療することができる、Ｇ＞Ａ突然変異を有する疾患の例としては、マイヤー－ゴーリン症候群、セッケル症候群４、ジュベール症候群５、レーバー先天性黒内障１０、シャルコー・マリー・トゥース病２型、白質脳症、アッシャー症候群２Ｃ型、脊髄小脳失調症２８、糖原病ＩＩＩ型、原発性高シュウ酸尿症Ｉ型、ＱＴ拡張症候群２、シェーグレン・ラーソン症候群、遺伝性フルクトース尿症、神経芽細胞腫、筋萎縮性側索硬化症９型、カルマン症候群１、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ型、家族性腺腫性ポリポーシス１、家族性３型高リポタンパク血症、アルツハイマー病１型、異染性白質ジストロフィーが挙げられる。
以下の疾患はまた、本明細書の系及び方法によって治療することができる。
成熟前終止疾患
成熟前終止疾患は、終止を導入する一塩基多型、タンパク質の翻訳フレームを変えて、新しい終止コドンを生成するインデル、または早期終止を有するエクソンを優先的に導入する選択的スプライシングのいずれかを介した早期終止コドンにおける突然変異によって特徴付けられる。Ａ→Ｉ編集を介したこれらの方法で生成された終止コドンを除去することによって、ＡＤＡＲによる本明細書の系及び方法によるＲＮＡ編集は、成熟前終止を伴う疾患を修復し得る。ＳＮＰがＧ→Ａではないが、ナンセンス突然変異を生成する場合には、いくつかの臨床的利益は、ナンセンス突然変異をミスセンス突然変異に変えることで得ることができる。
生殖細胞系列編集をしない不妊突然変異の変化
ＤＮＡ編集を上回るＲＮＡ編集の１つの利点は、不妊に影響を及ぼすＳＮＰの場合には、ゲノム編集による補正が、潜在的な倫理的または安全性の意味合いにおいて、生殖細胞系列編集を必然的にもたらすことである。本明細書の系及び方法によるＲＮＡ編集は、ゲノムに永続的に影響を与えることなくこれらの突然変異を補正することで、これらの問題を避けることができる。
スプライシング変化
プレｍＲＮＡは、スプライソソームによるプロセシングを受けるために、特異的スプライスドナー及びアクセプター配列を必要とする。スプライスアクセプター部位は、スプライスドナー配列による攻撃の受容、及びイントロン除去に必要なインバリアントＡＧ配列を含む。Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物をプレｍＲＮＡに標的化し、ＡＧスプライスアクセプター部位をＩＧに編集することによって、スプライスアクセプター部位を不活性化させて、下流エクソンのスキッピングを生じさせることができる。スプライシング変化に対するこのアプローチは、化学的に改変されたアンチセンスオリゴによるエクソンスキッピングの現在の方法を上回る利点を有する。Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲが遺伝的にコードされることで、長期のエクソンスキッピングが可能になる。加えて、Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲは、突然変異を生成して、スキッピングを促進することができ、アンチセンスオリゴで行われるように、二本鎖ＲＮＡによるスプライスドナー／アクセプター部位のマスキングよりもロバストである可能性が高い。
ネオアンチゲン
がんにおけるネオアンチゲンは、ミスマッチ修復不全のために生じる突然変異により腫瘍細胞で発現される新規の抗原である。ネオアンチゲンに対してＴ細胞をエンジニアリングすることは、抗原が腫瘍細胞でのみ発現されることから、Ｔ細胞にオフターゲット活性、ひいては毒性がないため有利である。本明細書の系及び方法によるＲＮＡ編集により、Ｃａｓ１３－ＡＤＡＲ融合物は、がん細胞を標的化して、転写物に突然変異を導入することができる。それにより、アミノ酸変化と、キメラ抗原受容体Ｔ細胞を用いて標的化することができる新しい抗原とを導入することができる。このアプローチは、一過性であり、かつ、オフターゲット送達による恒久的な編集非腫瘍細胞のリスクが最小限になるために、ＤＮＡ塩基エディターよりも良好である。
（腫瘍抑制因子の）マイクロＲＮＡ標的の変化
ＡＤＡＲは、ｍＲＮＡを自然に編集して、マイクロＲＮＡ標的を生成または除去することで、発現を調節する。プログラム可能なＲＮＡ編集を使用して、ターゲティング領域の変化を介して、マイクロＲＮＡ標的を上方調節または下方調節することができる。加えて、マイクロＲＮＡそれ自体は、ＡＤＡＲの天然基質であり、マイクロＲＮＡのプログラム可能なＲＮＡ編集は、それらの対応する標的上の機能を低下または強化することができる。
領域に沿って多数の編集を作成（ガイドにおける多数のミスマッチ）
Ｃａｓ１３－ＡＤＡＲ融合物は、所望のアデノシン標的からガイド領域におけるミスマッチを導入し、Ａ→Ｉ編集に好適なバブルを生成することによって、特異的アデノシンを編集するように正確に標的化することができる。ガイド／標的二本鎖における異なるアデノシン部位にわたって多数のこれらのミスマッチを導入することで、多数の突然変異を一度に導入することができる。
ＰＴＣのためのＴＡＡ（ダブルＡ→Ｇ）の反転
成熟前終止コドン変化を伴う多くの疾患は、ＴＡＡ終止コドンに関与し、１つのＡ→Ｉ編集のみを必要とするＴＡＧまたはＴＧＡ終止コドンよりむしろ、補正のためにＡ→Ｉ変化を必要とする。２つのアプローチを使用して、ＴＡＡ終止コドンを反転し得る。（１）本明細書に記載される通り、２つのミスマッチは、ＴＡＡコドンにおける２つのアデノシンに対するガイドに導入し得る。（２）２つのガイドアレイを使用して、アデノシンの各々をイノシンに順次変換し得る。アレイの第１のガイドは、第１のアデノシンに対する突然変異を含み得、次いで、第２のガイドは、この変化に相補性を有し、かつ、終止コドンにおける第２のアデノシンに対するミスマッチを有し得る。
がん（ＧＯＦ、ＬＯＦ突然変異反転）
がんにおける多くの発がん性変化は、機能表現型の機能獲得または機能喪失を突然変異型タンパク質に導入するＧ→Ａ突然変異を伴う。本明細書のＲＮＡ編集系及び方法は、これらの変化を補正し、発がん性を減らすためにうまく位置付けることができる。
新しい塩基選好性の設計
現在のＡＤＡＲ１／２タンパク質は、触媒活性に対する周囲塩基の選好性を有することが分かっており（，ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／１０．１０２１／ａｃｓｃｈｅｍｂｉｏ．５ｂ００７１１）、これは、ある特定の適用に対する制約を提起することがある。変化またはリラックスした塩基選好性を有するＡＤＡＲ変異体の合理的な突然変異誘発または指向性進化法は、プログラム可能なＲＮＡ編集の多用途性を増加させることができる。
使用可能なＡＤＡＲオルソログ
様々なＡＤＡＲオルソログを本明細書の方法及び系で使用することができる。使用することができるＡＤＡＲオルソログの例としては、以下のものが挙げられる：
Figure 2023134462000003
上記のオルソログは、ハイパーアクティブＥ→Ｑ突然変異と共に列記されることに留意されたい。頭足類オルソログを使用することができる。頭足類は、非常に高速度のＲＮＡ編集が知られているため、これらのオルソログは、ヒト変異体よりも高い活性または変化された塩基選好性を有し得る。
これらのオルソログのアラインメントツリーを図７４に示す。
ヒト細胞中の活性が増加したＡＤＡＲ突然変異体。インビトロまたは酵母中の活性が変化したＡＤＡＲ突然変異体が以前に報告されている。本開示はさらに、ヒト細胞の文脈において活性が増した突然変異体のスクリーニングまたは合理的設計を提供し、これにより、ＡＤＡＲベースのプログラム可能なＲＮＡ編集系または構築物の効率または特異性を改善し得る。
イノシン生成の生物学的適用。ＡＤＡＲによるＲＮＡ編集は、イノシンを生成し、これは、転写物において複数回生じる場合には、内因性生物学的経路と相互作用して、細胞及び組織中の炎症を増加させることができる。多数のイノシン塩基の生成は、特に、炎症がクリアランスをもたらし得る細胞中で炎症を増加させることができる。追加のイノシン生成を使用して、転写物を不安定化させることもできる。
上流開始コドンを除去して、下流ＯＲＦのタンパク質発現（ＡＴＧ突然変異）を促進する。アンチセンスオリゴを使用して、上流開始コドン部位を遮断して、下流開始コドンでのタンパク質発現を促進し得る。これにより、治療目的のための内因性タンパク質レベルのブーストが可能になり得る。Ｃａｓ１３－ＡＤＡＲ融合物は、ＡＴＧ部位をＩＴＧ（ＧＴＧ）部位に変換することによって、同様の効果を達成し、それにより内因性転写物における上流コドンを除去し、タンパク質翻訳をブーストすることができる。これは、遺伝子発現のブーストが可能になる適用であり得る。一例としては、鎌状赤血球症及びサラセミアにおける胎児型ヘモグロビンレベルのブーストが挙げられる。
Ｃ→Ｕまたは任意の転移に対するＡＤＡＲの突然変異誘発。ＡＤＡＲ（例えば、オルソログセクションに記載のもの）は、合理的突然変異誘発または指向性進化法を通じて、Ｃ→Ｕエディターまたは任意の塩基転移のエディターに作成することができる。
ＡＰＯＢＥＣ ＲＮＡ編集
Ｃ→Ｕ変換。系は、Ｃａｓ１３ｂ－ＡＰＯＢＥＣ融合物（例えば、ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＰＯＢＥＣ融合物）を含み得る。これらの融合物によりＲＮＡのＣ→Ｕ編集が可能になる。ＡＰＯＢＥＣ基質は、ｓｓＲＮＡであり、これらの系は、ガイド／標的二本鎖のまわりのＲＮＡの領域を標的にし得る。
終止コドン導入を介したＣ→Ｕによるノックダウン。細胞周期中に生じる病原性Ｕ→Ｃ突然変異を補正することに加えて、Ｃａｓ１３－ＡＰＯＢＥＣ融合物は、ＣＡＡ、ＣＧＡ、またはＣＡＧをＴＡＡ、ＴＧＡ、またはＴＡＧにそれぞれ変換することによって、終止コドンを導入することができ得る。
ＡＰＯＢＥＣオルソログ。ＡＰＯＢＥＣオルソログは、系を用いてスクリーニングし得る。Ｃａｓ１３（例えば、ｄＣａｓ１３）と融合した追加のＡＰＯＢＥＣオルソログのスクリーニングは、Ｃ→Ｕ編集の効率を増加させ得るか、または追加の種類の塩基変換を可能にし得る。
ｄｓＲＮＡ／塩基フリップ／活性増加のためのＡＰＯＢＥＣの突然変異。エディトソームによるＲＮＡ挿入／欠失。系はさらに、ＲＮＡエディトソーム（例えば、ｄＣａｓ１３などのＣａｓ１３に融合したＲＮＡエディトソーム）を含み得る。かかる系は、標的化欠失または配列の転写物への標的化挿入をガイドし得る。
参照文献
Ｈｕｍａｎ ＳＮＰｓ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００６；２（５）：２７４－２８６．
Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｂｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＮＰｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．ＰＮＡＳ Ａｕｇｕｓｔ １８，２０１５ １１２（３３）１０４３１－１０４３６
ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｓｅｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ａｌｉｇｎｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｈｙｐｏｘｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ４４，Ｉｓｓｕｅ １３，２７ Ｊｕｌｙ ２０１６，Ｐａｇｅｓ ６２９８－６３０８
ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｒｙｌ Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ｃｒｅａｔｉｎｇ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｊａｎｕａｒｙ ８，２０１６，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９１，８９４－９０３．
Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｅｄｉｔｉｎｇ－ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＡＤＡＲｓ．ＰＮＡＳ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２７，２０１２ １０９（４８）Ｅ３２９５－Ｅ３３０４．
Ａ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ １．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１５、１０（１１），ｐｐ ２５１２－２５１９．
Ｉｎｏｓｉｎｅ－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＲＮＡ Ｉｓ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｄｕｃｅｓ ＲＳＶ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（１０）：ｅ２６４６３．
Ｉｎｏｓｉｎｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｓｅｎｓｉｎｇ ｂｙ Ｔｏｌｌ－Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ７ （ＴＬＲ７） ａｎｄ ＴＬＲ８．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１４ Ｊａｎ；８８（２）：７９９－８１０．
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｈｙｐｅｒ－ｅｄｉｔｅｄ ｄｓＲＮＡｓ．Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（２００１）２０，４２４３－４２５２．
Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｉｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ３４，ｐａｇｅｓ ８７５－８８０（２０１６）．
Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｕ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／ｄｅｌｅｔｉｏｎ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇｉｎ ｋｉｎｅｔｏｐｌａｓｔｉｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７ Ｏｃｔ １；２５（１９）：３７５１－３７５９．
Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ Ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．７９：３２１－３４９（Ｖｏｌｕｍｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｄａｔｅ ７／７／２０１０）．
Ｔｒａｄｅ－ｏｆｆ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｐｈａｌｏｐｏｄｓ．Ｃｅｌｌ．Ｖｏｌｕｍｅ １６９，Ｉｓｓｕｅ ２，６ Ａｐｒｉｌ ２０１７，Ｐａｇｅｓ １９１－２０２．ｅ１１．
Ａｎ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ－ｔｏ－ｉｎｏｓｉｎｅ ｔＲＮＡ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈａｔ ｃａｎ ｐｅｒｆｏｒｍ Ｃ－ｔｏ－Ｕ ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ．ＰＮＡＳ Ｍａｙ ８，２００７ １０４（１９）７８２１－７８２６．
シチジンデアミナーゼ
用語「シチジンデアミナーゼ」または「シチジンデアミナーゼタンパク質」は、本明細書で使用する場合、以下に示すように、シトシン（または分子のシトシン部分）をウラシル（または分子のウラシル部分）に変換する加水分解脱アミノ化反応を触媒することが可能なタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質もしくはポリペプチドの１つ以上の機能性ドメイン（複数可）を指す。いくつかの実施形態では、シトシン含有分子は、シチジン（Ｃ）であり、ウラシル含有分子は、ウリジン（Ｕ）である。シトシン含有分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。
Figure 2023134462000004
本開示によれば、本開示と関連して使用することができるシチジンデアミナーゼは、限定はされないが、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ－編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼ、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）、またはシチジンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）として知られる酵素ファミリーのメンバーが含まれる。ある特定の実施形態では、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼ、及びＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼ、またはＡＰＯＢＥＣ４デアミナーゼである。
本発明の方法及び系では、シチジンデアミナーゼは、ＤＮＡ単鎖中のシトシンを標的化することができる。ある特定の例示の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、結合成分、例えば、結合Ｃａｓ１３の外に存在する単一鎖を編集し得る。他の例示の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、局在バブル、例えば、ガイド配列ではなく標的編集部位のミスマッチによって形成された局在バブルで編集し得る。ある特定の例示の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１７）３５（４）：３７１－３７７（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３８０３に開示されるものなど、活性に焦点を当てるのに役立つ突然変異を含み得る。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、哺乳類、鳥類、カエル、イカ、魚類、ハエ及び線虫を含むがこれらに限定されない１つ以上の後生動物種に由来する。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスシチジンデアミナーゼである。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ヒトＡＰＯＢＥＣ、例えば、ｈＡＰＯＢＥＣ１またはｈＡＰＯＢＥＣ３である。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ヒトＡＩＤである。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼタンパク質は、ＲＮＡ二本鎖の一本鎖バブル中の１つ以上の標的シトシン残基（複数可）を認識し、それをウラシル残基（複数可）に変換する。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼタンパク質は、ＲＮＡ二本鎖の一本鎖バブル上の結合ウィンドウを認識する。いくつかの実施形態では、結合ウィンドウは、少なくとも１つの標的シトシン残基（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、結合ウィンドウは、約３ｂｐ～約１００ｂｐの範囲である。いくつかの実施形態では、結合ウィンドウは、約５ｂｐ～約５０ｂｐの範囲である。いくつかの実施形態では、結合ウィンドウは、約１０ｂｐ～約３０ｂｐの範囲である。いくつかの実施形態では、結合ウィンドウは、約１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、５ｂｐ、７ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ、または１００ｂｐである。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼタンパク質は、１つ以上のデアミナーゼドメインを含む。理論によって束縛されることを意図しないが、デアミナーゼドメインは、ＲＮＡ二本鎖の一本鎖バブル中に含まれる１つ以上の標的シトシン（Ｃ）残基（複数可）を認識し、それをウラシル（Ｕ）残基（複数可）に変換するように機能することが企図される。いくつかの実施形態では、デアミナーゼドメインは、活性中心を含む。いくつかの実施形態では、活性中心は、亜鉛イオンを含む。いくつかの実施形態では、活性中心またはその近くのアミノ酸残基は、１つ以上のヌクレオチド（複数可）５’から標的シトシン残基と相互作用する。いくつかの実施形態では、活性中心またはその近くのアミノ酸残基は、１つ以上のヌクレオチド（複数可）３’から標的シトシン残基と相互作用する。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ヒトＡＰＯＢＥＣ１完全タンパク質（ｈＡＰＯＢＥＣ１）、またはそのデアミナーゼドメイン（ｈＡＰＯＢＥＣ１－Ｄ）、またはそのＣ末端短縮型（ｈＡＰＯＢＥＣ－Ｔ）を含む。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ１、ｈＡＰＯＢＥＣ－Ｄ、またはｈＡＰＯＢＥＣ－Ｔと相同であるＡＰＯＢＥＣファミリーメンバーである。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ヒトＡＩＤ１完全タンパク質（ｈＡＩＤ）、またはそのデアミナーゼドメイン（ｈＡＩＤ－Ｄ）、またはそのＣ末端短縮型（ｈＡＩＤ－Ｔ）を含む。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ｈＡＩＤ、ｈＡＩＤ－Ｄ、またはｈＡＩＤ－Ｔと相同であるＡＩＤファミリーメンバーである。いくつかの実施形態では、ｈＡＩＤ－Ｔは、約２０アミノ酸Ｃ末端短縮されているｈＡＩＤである。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、シトシンデアミナーゼの野生型アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、シトシンデアミナーゼの編集効率及び／または基質編集選好性が特定のニーズに従って変化するように、シトシンデアミナーゼ配列に１つ以上の突然変異を含む。
ＡＰＯＢＥＣ１及びＡＰＯＢＥＣ３タンパク質のある特定の突然変異は、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１７）３５（４）：３７１－３７７（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３８０３）；及びＨａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２００２）１０：１２４７－１２５３（各々は、その全体を参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ラットＡＰＯＢＥＣ１におけるＷ９０、Ｒ１１８、Ｈ１２１、Ｈ１２２、Ｒ１２６、もしくはＲ１３２に対応するアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含むＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、またはヒトＡＰＯＢＥＣ３ＧにおけるＷ２８５、Ｒ３１３、Ｄ３１６、Ｄ３１７Ｘ、Ｒ３２０、もしくはＲ３２６に対応するアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含むＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼである。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ラットＡＰＯＢＥＣ１アミノ酸配列のトリプトファン９０、または相同ＡＰＯＢＥＣタンパク質における対応する位置、例えば、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのトリプトファン２８５で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、９０位のトリプトファン残基は、チロシンまたはフェニルアラニン残基（Ｗ９０ＹまたはＷ９０Ｆ）に置換される。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ラットＡＰＯＢＥＣ１アミノ酸配列のアルギニン１１８、または相同ＡＰＯＢＥＣタンパク質における対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、１１８位のアルギニン残基は、アラニン残基（Ｒ１１８Ａ）に置換される。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ラットＡＰＯＢＥＣ１アミノ酸配列のヒスチジン１２１、または相同ＡＰＯＢＥＣタンパク質における対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、１２１位のヒスチジン残基は、アルギニン残基（Ｈ１２１Ｒ）に置換される。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ラットＡＰＯＢＥＣ１アミノ酸配列のヒスチジン１２２、または相同ＡＰＯＢＥＣタンパク質における対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、１２２位のヒスチジン残基は、アルギニン残基（Ｈ１２２Ｒ）に置換される。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ラットＡＰＯＢＥＣ１アミノ酸配列のアルギニン１２６、または相同ＡＰＯＢＥＣタンパク質における対応する位置、例えば、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのアルギニン３２０で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、１２６位のアルギニン残基は、アラニン残基（Ｒ１２６Ａ）またはグルタミン酸（Ｒ１２６Ｅ）に置換される。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１アミノ酸配列のアルギニン１３２、または相同ＡＰＯＢＥＣタンパク質における対応する位置で突然変異を含む。いくつかの実施形態では、１３２位のアルギニン残基は、グルタミン酸残基（Ｒ１３２Ｅ）に置換される。
いくつかの実施形態では、編集ウィンドウの幅を狭めるため、シチジンデアミナーゼは、ラットＡＰＯＢＥＣ１のアミノ酸配列位置に基づく突然変異：Ｗ９０Ｙ、Ｗ９０Ｆ、Ｒ１２６Ｅ及びＲ１３２Ｅ、ならびに上記に対応する相同ＡＰＯＢＥＣタンパク質における突然変異のうちの１つ以上を含み得る。
いくつかの実施形態では、編集効率を減らすため、シチジンデアミナーゼは、ラットＡＰＯＢＥＣ１のアミノ酸配列位置に基づく突然変異：Ｗ９０Ａ、Ｒ１１８Ａ、Ｒ１３２Ｅ、及び上記に対応する相同ＡＰＯＢＥＣタンパク質における突然変異のうちの１つ以上を含み得る。ある特定の実施形態では、有効性を低下させたシチジンデアミナーゼ酵素を使用して、オフターゲット効果を減らすことは有益であり得る。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、野生型ラットＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１、またはその触媒ドメインである。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１の編集効率及び／または基質編集選好性が特定のニーズに従って変化するように、ｒＡＰＯＢＥＣ１配列に１つ以上の突然変異を含む。
ｒＡＰＯＢＥＣ１：ＭＳＳＥＴＧＰＶＡＶＤＰＴＬＲＲＲＩＥＰＨＥＦＥＶＦＦＤＰＲＥＬＲＫＥＴＣＬＬＹＥＩＮＷＧＧＲＨＳＩＷＲＨＴＳＱＮＴＮＫＨＶＥＶＮＦＩＥＫＦＴＴＥＲＹＦＣＰＮＴＲＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＧＥＣＳＲＡＩＴＥＦＬＳＲＹＰＨＶＴＬＦＩＹＩＡＲＬＹＨＨＡＤＰＲＮＲＱＧＬＲＤＬＩＳＳＧＶＴＩＱＩＭＴＥＱＥＳＧＹＣＷＲＮＦＶＮＹＳＰＳＮＥＡＨＷＰＲＹＰＨＬＷＶＲＬＹＶＬＥＬＹＣＩＩＬＧＬＰＰＣＬＮＩＬＲＲＫＱＰＱＬＴＦＦＴＩＡＬＱＳＣＨＹＱＲＬＰＰＨＩＬＷＡＴＧＬＫ
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、野生型ヒトＡＰＯＢＥＣ１（ｈＡＰＯＢＥＣ１）またはその触媒ドメインである。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ１の編集効率及び／または基質編集選好性が特定のニーズに従って変化するように、ｈＡＰＯＢＥＣ１配列に１つ以上の突然変異を含む。
ＡＰＯＢＥＣ１：ＭＴＳＥＫＧＰＳＴＧＤＰＴＬＲＲＲＩＥＰＷＥＦＤＶＦＹＤＰＲＥＬＲＫＥＡＣＬＬＹＥＩＫＷＧＭＳＲＫＩＷＲＳＳＧＫＮＴＴＮＨＶＥＶＮＦＩＫＫＦＴＳＥＲＤＦＨＰＳＭＳＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＷＥＣＳＱＡＩＲＥＦＬＳＲＨＰＧＶＴＬＶＩＹＶＡＲＬＦＷＨＭＤＱＱＮＲＱＧＬＲＤＬＶＮＳＧＶＴＩＱＩＭＲＡＳＥＹＹＨＣＷＲＮＦＶＮＹＰＰＧＤＥＡＨＷＰＱＹＰＰＬＷＭＭＬＹＡＬＥＬＨＣＩＩＬＳＬＰＰＣＬＫＩＳＲＲＷＱＮＨＬＴＦＦＲＬＨＬＱＮＣＨＹＱＴＩＰＰＨＩＬＬＡＴＧＬＩＨＰＳＶＡＷＲ
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、野生型ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）またはその触媒ドメインである。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇの編集効率及び／または基質編集選好性が特定のニーズに従って変化するように、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ配列に１つ以上の突然変異を含む。
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ：ＭＥＬＫＹＨＰＥＭＲＦＦＨＷＦＳＫＷＲＫＬＨＲＤＱＥＹＥＶＴＷＹＩＳＷＳＰＣＴＫＣＴＲＤＭＡＴＦＬＡＥＤＰＫＶＴＬＴＩＦＶＡＲＬＹＹＦＷＤＰＤＹＱＥＡＬＲＳＬＣＱＫＲＤＧＰＲＡＴＭＫＩＭＮＹＤＥＦＱＨＣＷＳＫＦＶＹＳＱＲＥＬＦＥＰＷＮＮＬＰＫＹＹＩＬＬＨＩＭＬＧＥＩＬＲＨＳＭＤＰＰＴＦＴＦＮＦＮＮＥＰＷＶＲＧＲＨＥＴＹＬＣＹＥＶＥＲＭＨＮＤＴＷＶＬＬＮＱＲＲＧＦＬＣＮＱＡＰＨＫＨＧＦＬＥＧＲＨＡＥＬＣＦＬＤＶＩＰＦＷＫＬＤＬＤＱＤＹＲＶＴＣＦＴＳＷＳＰＣＦＳＣＡＱＥＭＡＫＦＩＳＫＮＫＨＶＳＬＣＩＦＴＡＲＩＹＤＤＱＧＲＣＱＥＧＬＲＴＬＡＥＡＧＡＫＩＳＩＭＴＹＳＥＦＫＨＣＷＤＴＦＶＤＨＱＧＣＰＦＱＰＷＤＧＬＤＥＨＳＱＤＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱＮＱＥＮ
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、野生型Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ ｍａｒｉｎｕｓ ＣＤＡ１（ｐｍＣＤＡｌ）またはその触媒ドメインである。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ｐｍＣＤＡ１の編集効率及び／または基質編集選好性が特定のニーズに従って変化するように、ｐｍＣＤＡ１配列に１つ以上の突然変異を含む。
ｐｍＣＤＡｌ：ＭＴＤＡＥＹＶＲＩＨＥＫＬＤＩＹＴＦＫＫＱＦＦＮＮＫＫＳＶＳＨＲＣＹＶＬＦＥＬＫＲＲＧＥＲＲＡＣＦＷＧＹＡＶＮＫＰＱＳＧＴＥＲＧＩＨＡＥＩＦＳＩＲＫＶＥＥＹＬＲＤＮＰＧＱＦＴＩＮＷＹＳＳＷＳＰＣＡＤＣＡＥＫＩＬＥＷＹＮＱＥＬＲＧＮＧＨＴＬＫＩＷＡＣＫＬＹＹＥＫＮＡＲＮＱＩＧＬＷＮＬＲＤＮＧＶＧＬＮＶＭＶＳＥＨＹＱＣＣＲＫＩＦＩＱＳＳＨＮＱＬＮＥＮＲＷＬＥＫＴＬＫＲＡＥＫＲＲＳＥＬＳＩＭＩＱＶＫＩＬＨＴＴＫＳＰＡＶ
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、野生型ヒトＡＩＤ（ｈＡＩＤ）またはその触媒ドメインである。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ｐｍＣＤＡ１の編集効率及び／または基質編集選好性が特定のニーズに従って変化するように、ｐｍＣＤＡ１配列に１つ以上の突然変異を含む。
ｈＡＩＤ：ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴＳＦＳＬＤＦＧＹＬＲＮＫＮＧＣＨＶＥＬＬＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧＮＰＹＬＳＬＲＩＦＴＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴＦＫＤＹＦＹＣＷＮＴＦＶＥＮＨＥＲＴＦＫＡＷＥＧＬＨＥＮＳＶＲＬＳＲＱＬＲＲＩＬＬＰＬＹＥＶＤＤＬＲＤＡＦＲＴＬＧＬＬＤ
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ｈＡＩＤ（ｈＡＩＤ－ＤＣ）の短縮型またはその触媒ドメインである。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ｈＡＩＤ－ＤＣの編集効率及び／または基質編集選好性が特定のニーズに従って変化するように、ｈＡＩＤ－ＤＣ配列に１つ以上の突然変異を含む。
ｈＡＩＤ－ＤＣ：ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴＳＦＳＬＤＦＧＹＬＲＮＫＮＧＣＨＶＥＬＬＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧＮＰＮＬＳＬＲＩＦＴＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴＦＫＤＹＦＹＣＷＮＴＦＶＥＮＨＥＲＴＦＫＡＷＥＧＬＨＥＮＳＶＲＬＳＲＱＬＲＲＩＬＬ
シチジンデアミナーゼの追加の実施形態は、「ヌクレオ塩基エディター及びその使用（Ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ）」（その全体を参照により本明細書に組み込む）と題されたＷＯ２０１７／０７０６３２に開示されている。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、脱アミノ化編集の影響を受けやすいヌクレオチドを閉じ込める効率的な脱アミノ化ウィンドウを有する。従って、いくつかの実施形態では、「編集ウィンドウ幅」は、シチジンデアミナーゼの編集効率がその標的部位の半最大値を超える所与の標的部位のヌクレオチド位置の数を指す。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、約１～約６ヌクレオチドの範囲で編集ウィンドウ幅を有する。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼの編集ウィンドウ幅は、１、２、３、４、５、または６ヌクレオチドである。
理論によって束縛されることを意図しないが、いくつかの実施形態では、リンカー配列の長さが、編集ウィンドウ幅に影響を及ぼすことが企図される。いくつかの実施形態では、リンカー長が延びるにつれて（例えば、約３～約２１アミノ酸）、編集ウィンドウ幅が増加する（例えば、約３～約６ヌクレオチド）。非限定例では、１６残基リンカーは、約５ヌクレオチドの効率的な脱アミノ化ウィンドウを提供する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの長さは、編集ウィンドウ幅に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの短縮は、シチジンデアミナーゼの効率的な脱アミノ化ウィンドウの狭幅化につながる。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼの突然変異は、編集ウィンドウ幅に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、デアミナーゼが、ＤＮＡ結合事象ごとの多数のシチジンの脱アミノ化を受けないように、ＣＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系のシチジンデアミナーゼ成分は、シチジンデアミナーゼの触媒効率を減らす１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ１の残基９０（Ｗ９０）のトリプトファンまたは相同配列における対応するトリプトファン残基は突然変異される。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ１３は、Ｗ９０ＹまたはＷ９０Ｆ突然変異を含むＡＰＯＢＥＣ１突然変異体に融合または連結される。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの残基２８５（Ｗ２８５）のトリプトファンまたは相同配列における対応するトリプトファン残基は突然変異される。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ１３は、Ｗ２８５ＹまたはＷ２８５Ｆ突然変異を含むＡＰＯＢＥＣ３Ｇ突然変異体に融合または連結される。
いくつかの実施形態では、ＣＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系のシチジンデアミナーゼ成分は、デアミナーゼ活性部位に対するシチジンの非最適提示の耐性を減らす１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、デアミナーゼ活性部位の基質結合活性を変化させる１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、デアミナーゼ活性部位によって認識されて、かつ結合されるＤＮＡの立体配座を変化させる１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、デアミナーゼ活性部位に対する基質アクセシビリティを変化させる１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ１の残基１２６（Ｒ１２６）のアルギニン、または相同配列における対応するアルギニン残基は突然変異される。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ１３は、Ｒ１２６ＡまたはＲ１２６Ｅ突然変異を含むＡＰＯＢＥＣ１に融合または連結される。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの残基３２０（Ｒ３２０）のトリプトファン、または相同配列における対応するアルギニン残基は突然変異される。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ１３は、Ｒ３２０ＡまたはＲ３２０Ｅ突然変異を含むＡＰＯＢＥＣ３Ｇ突然変異体に融合または連結される。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ１の残基１３２（Ｒ１３２）のアルギニン、または相同配列における対応するアルギニン残基は突然変異される。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ１３は、Ｒ１３２Ｅ突然変異を含むＡＰＯＢＥＣ１突然変異体に融合または連結される。
いくつかの実施形態では、ＣＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系のＡＰＯＢＥＣ１ドメインは、Ｗ９０Ｙ、Ｗ９０Ｆ、Ｒ１２６Ａ、Ｒ１２６Ｅ、及びＲ１３２Ｅから選択される１つ、２つ、または３つの突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ１ドメインは、Ｗ９０Ｙ及びＲ１２６Ｅの二重突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ１ドメインは、Ｗ９０Ｙ及びＲ１３２Ｅの二重突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ１ドメインは、Ｒ１２６Ｅ及びＲ１３２Ｅの二重突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ１ドメインは、Ｗ９０Ｙ、Ｒ１２６Ｅ及びＲ１３２Ｅの三重突然変異を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される通りのシチジンデアミナーゼにおける１つ以上の突然変異は、編集ウィンドウ幅を約２ヌクレオチドに減らす。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される通りのシチジンデアミナーゼにおける１つ以上の突然変異は、編集ウィンドウ幅を約１ヌクレオチドに減らす。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される通りのシチジンデアミナーゼにおける１つ以上の突然変異は、編集ウィンドウ幅を減らす一方、酵素の編集効率に最小限または控えめにのみ影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される通りのシチジンデアミナーゼにおける１つ以上の突然変異は、酵素の編集効率を減らすことなく、編集ウィンドウ幅を減らす。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される通りのシチジンデアミナーゼにおける１つ以上の突然変異は、隣接するシチジンヌクレオチドの識別を可能にし、これは、そうでなければ、シチジンデアミナーゼによる同様の効率で編集されるであろう。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼタンパク質はさらに、１つ以上の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合モチーフ（ｄｓＲＢＭ）またはドメイン（ｄｓＲＢＤ）を含むかまたはそれに連結されて、二本鎖核酸基質を認識して、それに結合する。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼと基質の間の相互作用は、１つ以上の追加のタンパク質因子（複数可）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳタンパク質因子によって媒介される。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼと基質の間の相互作用は、１つ以上の核酸成分（複数可）、例えば、ガイドＲＮＡによってさらに媒介される。
本発明によれば、シチジンデアミナーゼの基質は、目的のシトシンを含むＲＮＡ二本鎖のＤＮＡ単鎖バブルであり、これは、ガイド分子がそのＤＮＡ標的に結合する際にシチジンデアミナーゼにアクセス可能に作成されており、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素とＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成する。それによって、シトシンデアミナーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の１つ以上の成分、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素及び／またはガイド分子に融合するかまたはそれに結合することができる。ガイド分子及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素の特定の特徴を以下に詳述する。
ＲＮＡ結合タンパク質
ある特定の例示の実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質またはその機能性ドメインは、ＲＮＡ認識モチーフを含む。いくつかの例では、ＲＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質などのＣａｓエフェクタータンパク質であり得る。場合によっては、ＲＮＡ結合タンパク質は、ｄＣａｓ１３などの触媒的に不活性なＣａｓエフェクタータンパク質であり得る。
ある特定の例示の実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガーモチーフを含む。ＲＮＡ結合タンパク質またはその機能性ドメインは、Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２、Ｇａｇ ｋｎｕｃｋｌｅ、Ｔｒｅｂｌｅ－ｃｌｅｔ、亜鉛リボン、Ｚｎ２／Ｃｙｓ６クラスモチーフを含み得る。
ある特定の例示の実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、Ｐｕｍｉｌｉｏ相同性ドメインを含み得る。
一態様では、本発明は、ＲＮＡ、より詳細には、目的のＲＮＡ配列におけるアデニンの標的脱アミノ化の方法を提供する。本発明の方法によれば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤ）タンパク質は、標的配列に特異的に結合することができるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体によって、目的のＲＮＡ配列における関連アデニンに特異的に動員される。これを達成するために、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素に共有結合される、または分離タンパク質として提供されることができるが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体に対するその動員を確実にするようになっている。
本発明の方法のある特定の実施形態では、標的遺伝子座に対するアデノシンデアミナーゼの動員は、アデノシンデアミナーゼまたはその触媒ドメインを、Ｃａｓ１３タンパク質であるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質に融合することによって確実となる。２つの分離タンパク質から融合タンパク質を生成する方法は、当該技術分野において公知であり、典型的には、スペーサーまたはリンカーの使用を伴う。Ｃａｓ１３タンパク質は、そのＮまたはＣ末端のいずれかのアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインに融合することができる。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、不活性または失活Ｃａｓ１３タンパク質であり、デアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインのＮ末端に連結されている。
用語「リンカー」は、融合タンパク質に参照して使用される場合、タンパク質に結合して、融合タンパク質を形成する分子を指す。一般に、かかる分子は、タンパク質に連結するかまたはタンパク質間の最低限の距離もしくは他の空間的関係を保存する以外の特異的な生物活性を有さない。しかしながら、ある特定の実施形態では、リンカーは、リンカー及び／または融合タンパク質のいくつかの特性、例えば、リンカーの折り畳み、正味電荷、または疎水性に影響するように選択してもよい。リンカー（例えば、非ヌクレオチドループ）は、任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、約０～１６ヌクレオチドと同等の長さを有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、約０～８ヌクレオチドと同等の長さを有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、約０～４ヌクレオチドと同等の長さを有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、約２ヌクレオチドと同等の長さを有する。リンカー設計の例は、ＷＯ２０１１／００８７３０にも記載されている。
本発明の方法での使用に好適なリンカーは当業者に周知であり、限定されないが、直鎖もしくは分枝鎖炭素リンカー、複素環炭素リンカー、またはペプチドリンカーが含まれる。しかしながら、本明細書で使用する場合、リンカーは、共有結合（炭素－炭素結合または炭素－ヘテロ原子結合）でもあり得る。ある特定の実施形態では、リンカーを使用して、各タンパク質がその必要な機能性特性を保つことを確実にするのに十分な距離によって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びアデノシンデアミナーゼを分離する。好ましいペプチドリンカー配列は、柔軟で拡張した立体配座を適合し、秩序二次構造を発生する傾向を呈しない。ある特定の実施形態では、リンカーは、化学部分であり得、これは、単量体、二量体、多量体または重合体であり得る。リンカーは、アミノ酸を含むのが好ましい。柔軟なリンカーにおける典型的なアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒを含む。従って、ある特定の実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒアミノ酸の１つ以上の組み合わせを含む。Ｔｈｒ及びＡｌａなどの他の中性に近いアミノ酸はまた、リンカー配列に使用してもよい。例示のリンカーは、Ｍａｒａｔｅａ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｇｅｎｅ ４０：３９－４６；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８－６２；米国特許第４，９３５，２３３号；及び米国特許第４，７５１，１８０号に開示されている。例えば、ＧｌｙＳｅｒリンカーＧＧＳ、ＧＧＧＳまたはＧＳＧを使用することができる。ＧＧＳ、ＧＳＧ、ＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳリンカーは、３（例えば、（ＧＧＳ）３（配列番号１２、（ＧＧＧＧＳ）３）（配列番号１）または５、６、７、９またはさらに１２またはそれよりも多い繰り返しで使用して、適当な長さを提供することができる。ある特定の実施形態では、（ＧＧＧＧＳ）３）（配列番号１）などのリンカーを本明細書で使用するのが好ましい。（ＧＧＧＧＳ）６）（配列番号４）（ＧＧＧＧＳ）９）（配列番号７）または（ＧＧＧＧＳ）１２）（配列番号１３）は、代替として使用するのが好ましい場合がある。他の好ましい代替は、（ＧＧＧＧＳ）１）（配列番号１４）、（ＧＧＧＧＳ）２）（配列番号１５）、（ＧＧＧＧＳ）４）（配列番号２）、（ＧＧＧＧＳ）５）（配列番号３）、（ＧＧＧＧＳ）７）（配列番号５）、（ＧＧＧＧＳ）８）（配列番号６）、（ＧＧＧＧＳ）１０）（配列番号８）、または（ＧＧＧＧＳ）１１）（配列番号９）である。さらに別に実施形態では、ＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号１１）は、リンカーとして使用される。さらに追加の実施形態では、リンカーは、ＸＴＥＮリンカーである。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質であり、ＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号１１）リンカーによって、デアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインに連結される。さらに特定の実施形態では、Ｃａｓ１３タンパク質は、ＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号１１）リンカーによって、デアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインのＮ末端にＣ末端連結される。加えて、Ｎ及びＣ末端ＮＬＳは、リンカー（例えば、ＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳＳＰＫＫＲＫＶＥＡＳ（配列番号１６））として機能することもできる。
本発明の方法の特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、細胞に送達されるかまたは分離タンパク質として細胞内で発現されるが、Ｃａｓ１３タンパク質またはガイド分子のいずれかに連結することができるように改変される。ある特定の実施形態では、これは、多様なバクテリオファージ被膜タンパク質内に存在するオルソゴナルＲＮＡ結合タンパク質またはアダプタータンパク質／アプタマー組み合わせの使用によって確実となる。かかる被膜タンパク質の例としては、限定はされないが、ＭＳ２、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１が挙げられる。アプタマーは、特異的標的に結合するようにインビトロ選択またはＳＥＬＥＸ（指数的濃縮によるリガンドの系統進化法）の反復ラウンドを介してエンジニアリングされている、天然に存在するまたは合成オリゴヌクレオチドであり得る。
本発明の方法及び系の特定の実施形態では、ガイド分子は、アダプタータンパク質を動員することができる１つ以上の固有のＲＮＡループ（複数可）または固有の配列（複数可）で提供される。ガイド分子は、固有のＲＮＡループ（複数可）または固有の配列（複数可）に結合することができるアダプタータンパク質を動員し得る固有のＲＮＡループ（複数可）または固有の配列（複数可）の挿入によって、Ｃａｓ１３タンパク質と衝突せずに拡張することができる。改変ガイド、及びエフェクタードメインをＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体に動員するためのそれらの使用の例は、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２０１５，５１７（７５３６）：５８３－５８８）に提供される。ある特定の実施形態では、アプタマーは、哺乳類細胞中の二量化ＭＳ２バクテリオファージ被膜タンパク質に選択的に結合し、ステムループ及び／またはテトラループなどのガイド分子に導入される最小ヘアピンアプタマーである。これらの実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、ＭＳ２に融合される。その後、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び対応するガイドＲＮＡと一緒に共送達される。
用語「ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系」は、本明細書で使用する場合、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、より詳細には、触媒的に不活性なＣａｓ１３タンパク質；（ｂ）ガイド配列を含むガイド分子；及び（ｃ）アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを含む核酸ターゲティング及び編集系を指し、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質もしくはガイド分子に共有もしくは非共有結合され、または送達後にそれらに連結するようになっており；ガイド配列は、標的配列に実質的に相補的であるが、脱アミノ化のために標的化されているＡに対応する非対合Ｃを含み、ガイド配列及び標的配列によって形成されたＲＮＡ二本鎖におけるＡ－Ｃミスマッチをもたらす。真核細胞に適応する場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び／またはアデノシンデアミナーゼは、ＮＬＳタグ付加されるのが好ましい。
いくつかの実施形態では、成分（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、リボ核タンパク質複合体として細胞に送達される。リボ核タンパク質複合体は、１つ以上の脂質ナノ粒子を介して送達することができる。
いくつかの実施形態では、成分（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、１つ以上のＲＮＡ分子、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、アデノシンデアミナーゼタンパク質、及び任意選択で、アダプタータンパク質をコードする１つ以上のガイドＲＮＡ及び１つ以上のｍＲＮＡ分子として細胞に送達される。ＲＮＡ分子は、１つ以上の脂質ナノ粒子を介して送達することができる。
いくつかの実施形態では、成分（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、１つ以上のＤＮＡ分子として細胞に送達される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＤＮＡ分子は、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）などの１つ以上のベクター内に含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のＤＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ガイド分子、及びアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを発現するように作動可能に構成されている１つ以上の調節エレメントを含み、任意選択で、１つ以上の調節エレメントは、誘導性プロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、失活Ｃａｓ１３である。いくつかの実施形態では、失活Ｃａｓ１３は、ＨＥＰＮドメインに１つ以上の突然変異を含む失活Ｃａｓ１３ａタンパク質である。いくつかの実施形態では、失活Ｃａｓ１３ａは、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉにおいてＲ４７４Ａ及びＲ１０４６Ａに対応する突然変異（ＬｗａＣａｓ１３ａ）を含む。いくつかの実施形態では、失活Ｃａｓ１３は、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ ＡＴＣＣ ４３７６７から生じるＣａｓ１３ｂタンパク質のＲ１１６Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｒ１１７７Ａ、Ｈ１１８２Ａ、またはＣａｓ１３ｂオルソログのそれに対応するアミノ酸位置のうちの１つ以上を含む失活Ｃａｓ１３ｂタンパク質である。
いくつかの実施形態では、ガイド分子は、ＲＮＡ配列内で、脱アミノ化されるアデニンを含む標的配列でハイブリダイズして、前記アデニンに対向する非対合シトシンを含むＲＮＡ二本鎖を形成することが可能である。ＲＮＡ二本鎖が形成されると、ガイド分子は、Ｃａｓ１３タンパク質と複合体を形成し、複合体が、目的の標的ＲＮＡ配列でＲＮＡポリヌクレオチドに結合するように仕向ける。ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のガイドの態様の詳細を本明細書の以下に提供する。
いくつかの実施形態では、例えば、ＬａｗＣａｓ１３のカノニカル長さを有するＣａｓ１３ガイドＲＮＡを使用して、標的ＤＮＡを有するＲＮＡ二本鎖を形成する。いくつかの実施形態では、例えば、ＬａｗＣａｓ１３ａのカノニカル長さよりも長いＣａｓ１３ガイド分子を使用して、例えば、Ｃａｓ１３－ガイドＲＮＡ－標的ＤＮＡ複合体の外に、標的ＤＮＡを有するＲＮＡ二本鎖を形成する。
少なくとも第１の設計では、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質に融合または連結されたアデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、触媒的に不活性である）、及び（ｂ）ガイド配列と標的配列の間に形成されたＲＮＡ二本鎖中にＡ－Ｃミスマッチを導入するように設計されたガイド配列を含むガイド分子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び／またはアデノシンデアミナーゼは、ＮもしくはＣ末端のいずれかまたは両方にＮＬＳタグ付加される。
少なくとも第２の設計では、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系は、（ａ）触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、（ｂ）ガイド配列と標的配列の間に形成されたＲＮＡ二本鎖中にＡ－Ｃミスマッチを導入するように設計されたガイド配列、及びアダプタータンパク質（例えば、ＭＳ２被膜タンパク質またはＰＰ７被膜タンパク質）に結合することができるアプタマー配列（例えば、ＭＳ２ ＲＮＡモチーフまたはＰＰ７ ＲＮＡモチーフ）を含むガイド分子、ならびに（ｃ）アダプタータンパク質に融合または連結されたアデノシンデアミナーゼ（アプタマーとアダプタータンパク質の結合は、Ａ－ＣミスマッチのＡでの標的脱アミノ化のために、ガイド配列と標的配列の間に形成されたＲＮＡ二本鎖にアデノシンデアミナーゼを動員する）を含む。いくつかの実施形態では、アダプタータンパク質及び／またはアデノシンデアミナーゼは、ＮもしくはＣ末端のいずれかまたは両方にＮＬＳタグ付加される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質もまた、ＮＬＳタグ付加することができる。
いくつかの実施形態では、カノニカル長さ（例えば、約１５～３０ｎｔ）を有するＣａｓ１３ガイドＲＮＡを使用して、標的ＲＮＡを有するＲＮＡ二本鎖を形成する。いくつかの実施形態では、カノニカル長さ（例えば、＞３０ｎｔ）よりも長いＣａｓ１３ガイド分子を使用して、例えば、Ｃａｓ１３－ガイドＲＮＡ－標的ＲＮＡ複合体の外に、標的ＲＮＡを有するＲＮＡ二本鎖を形成する。
少なくとも第１の設計では、ＣＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質に融合または連結されたシチジンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓ１３である）、及び（ｂ）任意選択で、（Ａ）目的のシトシンの上流もしくは下流になるかまたは（Ｂ）ガイド配列と標的配列の間に形成されたＲＮＡ二本鎖中にＣ－Ａ／Ｕミスマッチを導入するのいずれかに設計されるガイド配列を含むガイド分子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び／またはシチジンデアミナーゼは、ＮもしくはＣ末端のいずれかまたは両方にＮＥＳタグ付加される。
少なくとも第２の設計では、ＣＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系は、（ａ）触媒的に不活性なＣａｓ１３であるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、（ｂ）任意選択で、（Ａ）目的のシトシンの上流もしくは下流になるかまたは（Ｂ）ガイド配列と標的配列の間に形成されたＲＮＡ二本鎖中にＣ－Ａ／Ｕミスマッチを導入するのいずれかに設計されるガイド配列、及びアダプタータンパク質（例えば、ＭＳ２被膜タンパク質またはＰＰ７被膜タンパク質）に結合することができるアプタマー配列（例えば、ＭＳ２ ＲＮＡモチーフまたはＰＰ７ ＲＮＡモチーフ）を含むガイド分子、ならびに（ｃ）アダプタータンパク質に融合または連結されたシチジンデアミナーゼ（アプタマーとアダプタータンパク質の結合は、標的配列の外のＣまたは任意選択のＣ－Ａ／ＵミスマッチのＣのいずれかでの標的脱アミノ化のために、ガイド配列と標的配列の間に形成されたＲＮＡ二本鎖にシチジンデアミナーゼを動員する）を含む。いくつかの実施形態では、アダプタータンパク質及び／またはシチジンデアミナーゼは、ＮもしくはＣ末端のいずれかまたは両方にＮＥＳタグ付加される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質もまた、ＮＥＳタグ付加される。
異なるアプタマー及び対応するアダプタータンパク質の使用により、オルソゴナル遺伝子編集を実装することも可能にする。アデノシンデアミナーゼをシチジンデアミナーゼと併用して、オルソゴナル遺伝子を編集／脱アミノ化する一例では、ｓｇＲＮＡを標的化する異なる遺伝子座は、ＭＳ２－アデノシンデアミナーゼ及びＰＰ７－シチジンデアミナーゼ（またはＰＰ７－アデノシンデアミナーゼ及びＭＳ２－シチジンデアミナーゼ）をそれぞれ動員するために、固有のＲＮＡループで改変され、目的の標的遺伝子座でのＡまたはＣのそれぞれのオルソゴナル脱アミノ化をもたらす。ＰＰ７は、ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのＲＮＡ結合被膜タンパク質である。ＭＳ２と同様、ＰＰ７は、特異的ＲＮＡ配列及び二次構造に結合する。ＰＰ７ ＲＮＡ認識モチーフは、ＭＳ２のものとは異なる。その結果、ＰＰ７及びＭＳ２は、多重化して、異なるゲノム遺伝子座での異なる影響を同時に媒介することができる。例えば、ｓｇＲＮＡを標的化する遺伝子座Ａは、ＭＳ２ループで改変され、ＭＳ２アデノシンデアミナーゼを動員することができる一方、別のｓｇＲＮＡを標的化する遺伝子座Ｂは、ＰＰ７ループで改変され、ＰＰ７シチジンデアミナーゼを動員することができる。同じ細胞では、従って、オルソゴナルの遺伝子座特異的改変が実現される。この原理を拡張して、他のオルソゴナルＲＮＡ結合タンパク質を組み込むことができる。
少なくとも第３の設計では、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の内部ループまたは非構造化領域に挿入されるアデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、触媒的に不活性であるかまたはニッカーゼである）、及び（ｂ）ガイド配列と標的配列の間に形成されたＲＮＡ二本鎖中にＡ－Ｃミスマッチを導入するように設計されたガイド配列を含むガイド分子を含む。
アデノシンデアミナーゼの挿入に好適なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質スプリット部位は、結晶構造の助けを借りて同定することができる。比較的高度の相同性がオルソログと意図したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の間に存在する場合には、オルソログの結晶構造を使用することができる。
スプリット位置は、領域またはループ内に位置し得る。好ましくは、スプリット位置は、アミノ酸配列の中断が構造的特徴（例えば、α－ヘリックスまたはβシート）の部分的または完全な破壊をもたらさないところに存在する。非構造化領域（それらの領域が結晶中に「凍結」されるほど十分には構造化されていないため結晶構造に現れない領域）が、好ましい選択肢であることが多い。非構造化領域内またはループの外の位置は、上述した数に正確である必要はないが、スプリット位置が非構造化領域内またはループの外にまだ収まる限り、ループのサイズに応じて、上で与えられた位置の両側で、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはさらに１０アミノ酸異なり得る。
本明細書に記載される系を使用して、ＲＮＡポリヌクレオチド配列内の特異的アデニンを標的にして、脱アミノ化することができる。例えば、ガイド分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と複合体を形成することができ、複合体が、目的のＲＮＡポリヌクレオチドで標的ＲＮＡ配列に結合するように仕向ける。ガイド配列は非対合Ｃを有するように設計されるため、ガイド配列と標的配列の間に形成されたＲＮＡ二本鎖は、Ａ－Ｃミスマッチを含み、これは、アデノシンデアミナーゼが、非対合Ｃに対向するＡに接触して、脱アミノ化し、それをイノシン（Ｉ）に変換するように仕向ける。Ｃとのイノシン（Ｉ）塩基対は、細胞プロセスにおいてＧのように機能するため、本明細書に記載されるＡの標的脱アミノ化は、望ましくないＧ－Ａ及びＣ－Ｔ突然変異の補正、ならびに所望のＡ－Ｇ及びＴ－Ｃ突然変異を得るために有用である。
いくつかの実施形態では、系を使用して、ＲＮＡポリヌクレオチド分子における標的脱アミノ化をインビトロで行う。いくつかの実施形態では、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、細胞内のＤＮＡ分子における標的脱アミノ化を行う。細胞は、動物細胞、哺乳類細胞、ヒト、または植物細胞などの真核細胞であり得る。
本発明はまた、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系を用いて、標的脱アミノ化によって疾患を治療または予防する方法であって、Ａの脱アミノ化が、病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ点突然変異を含む転写物が引き起こす疾患を治す、方法に関する。本発明により治療または予防することができる疾患の例としては、がん、マイヤー－ゴーリン症候群、セッケル症候群４、ジュベール症候群５、レーバー先天性黒内障１０；シャルコー・マリー・トゥース病２型；シャルコー・マリー・トゥース病２型；アッシャー症候群２Ｃ型；脊髄小脳失調症２８；脊髄小脳失調症２８；脊髄小脳失調症２８；ＱＴ拡張症候群２；シェーグレン・ラーソン症候群；遺伝性フルクトース尿症；遺伝性フルクトース尿症；神経芽細胞腫；神経芽細胞腫；カルマン症候群１；カルマン症候群１；カルマン症候群１；異染性白質ジストロフィーが挙げられる。
本発明はまた、遺伝子の望まれない活性をノックアウトまたはノックダウンする方法であって、遺伝子の転写物でのＡの脱アミノ化が、機能の喪失をもたらす、方法に関する。例えば、一実施形態では、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系による標的脱アミノ化は、ナンセンス突然変異を引き起こし、内因性遺伝子において成熟前終止コドンをもたらすことがあり得る。これは、内因性遺伝子の発現を変化させ得、編集細胞において所望の形質をもたらすことができる。別の実施形態では、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系による標的脱アミノ化は、非保存的なミスセンス突然変異を引き起こし、内因性遺伝子における異なるアミノ酸残基のコードをもたらすことができる。これは、発現された内因性遺伝子の発現を変化させ得、編集細胞において所望の形質もまたもたらすことができる。
本発明はまた、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系を用いて標的脱アミノ化によって得られた改変細胞、またはその子孫に関し、改変細胞は、標的脱アミノ化前の対応する細胞と比較して、目的の標的ＲＮＡ配列において、Ａの代わりにＩまたはＧを含む。改変細胞は、動物細胞、植物細胞、哺乳類細胞、またはヒト細胞などの真核細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、改変細胞は、ＣＡＲ－Ｔ療法に好適なＴ細胞などの治療用Ｔ細胞である。改変は、免疫チェックポイント受容体（例えば、ＰＤＡ、ＣＴＬＡ４）の発現低下、ＨＬＡタンパク質（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ）の発現低下、及び内因性ＴＣＲの発現低下を含むがこれらに限定されない、治療用Ｔ細胞の１つ以上の所望の形質をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、改変細胞は、抗体産生Ｂ細胞である。改変は、Ｂ細胞中で１つ以上の所望の形質をもたらすことができ、限定はされないが、抗体産生の強化が挙げられる。
本発明はまた、改変非ヒト動物または改変植物に関する。改変非ヒト動物は、家畜であり得る。改変植物は、農作物であり得る。
本発明はさらに、本明細書に記載される改変細胞をそれを必要とする患者に投与することを含み、改変細胞の存在により患者の疾患を治療する、細胞治療の方法に関する。一実施形態では、細胞治療の改変細胞は、腫瘍細胞を認識及び／または攻撃することができるＣＡＲ－Ｔ細胞である。別の実施形態では、細胞治療の改変細胞は、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、またはｉＰＳＣ細胞などの幹細胞である。
本発明は、追加的に、ガイド配列を含むガイド分子、またはガイド分子をコードするヌクレオチド配列；ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列；アデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、またはそれらをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む、目的の標的遺伝子座におけるアデニンを改変するのに好適なエンジニアリングされた天然に存在しない系であって、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質もしくはガイド分子に共有もしくは非共有結合され、または送達後にそれらに連結するようになっており；ガイド配列は、目的のＲＮＡポリヌクレオチド内にアデニンを含む標的配列でハイブリダイズすることができるが、アデニンに対応する位置でシトシンを含む、エンジニアリングされた天然に存在しない系に関する。
本発明は、追加的に、ガイド配列を含むガイド分子をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に連結している第１の調節エレメント；ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している第２の調節エレメント；及び任意選択で、第１もしくは第２の調節エレメントの制御下であるかまたは第３の調節エレメントに作動可能に連結しているアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上のベクターを含む、目的の標的遺伝子座におけるアデニンを改変するのに好適なエンジニアリングされた天然に存在しない系であって、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列が、第３の調節エレメントに作動可能に連結している場合には、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、発現後にガイド分子またはＣｒｉｓｐｒ－Ｃａｓタンパク質に連結するようになっており；ガイド配列は、標的遺伝子座内にアデニンを含む標的配列でハイブリダイズすることができるが、アデニンに対応する位置でシトシンを含み；成分（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、系の同じまたは異なるベクター上に位置する、エンジニアリングされた天然に存在しない系に関する。
本発明は、追加的に、本明細書に記載されるエンジニアリングされた天然に存在しない系またはベクター系を含む、インビトロ、エキソビボまたはインビボ宿主細胞または細胞株またはその子孫に関する。宿主細胞は、動物細胞、植物細胞、哺乳類細胞、またはヒト細胞などの真核細胞であり得る。
塩基除去修復阻害剤
いくつかの実施形態では、系は、塩基除去修復（ＢＥＲ）阻害剤をさらに含む。任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、Ｉ：Ｔ対合の存在に対する細胞ＤＮＡ修復応答は、細胞中の核酸塩基編集効率の低下の原因となり得る。アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＤＮＡ－３－メチルアデニングリコシラーゼ、３－アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、またはＮ－メチルプリンＤＮＡグリコシラーゼとしても知られる）は、細胞中のＤＮＡからヒポキサンチンの除去を触媒し、これにより塩基除去修復を開始することができ、結果としてＩ：Ｔ対がＡ：Ｔ対に反転する。
いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、ポリペプチド阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、ヒポキサンチンに結合するタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、ＤＮＡ中のヒポキサンチンに結合するタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、触媒的に不活性なアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼタンパク質またはその結合ドメインである。いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、ＤＮＡからヒポキサンチンを除去しない触媒的に不活性なアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼタンパク質またはその結合ドメインである。アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害する（例えば、立体的に遮断する）ことができる他のタンパク質は、本開示の範囲内である。加えて、塩基除去修復を遮断または阻害する任意のタンパク質もまた、本開示の範囲内である。
任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、塩基除去修復は、編集鎖に結合する、編集塩基を遮断する、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼを阻害する、塩基除去修復を阻害する、編集塩基を保護する、及び／または非編集鎖の固定を促進する分子によって阻害することができる。本明細書に記載されるＢＥＲ阻害剤の使用は、Ａ→Ｉ変化を触媒することができるアデノシンデアミナーゼの編集効率を増加させることができると考えられる。
従って、上記のＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系の第１の設計では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアデノシンデアミナーゼは、ＢＥＲ阻害剤（例えば、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤）に融合または連結することができる。いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、以下の構造の１つから構成され得る（ｎＣａｓ１３＝Ｃａｓ１３ニッカーゼ；ｄＣａｓ１３＝失活Ｃａｓ１３）：［ＡＤ］－［任意のリンカー］－［ｎＣａｓ１３／ｄＣａｓ１３］－［任意のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］；［ＡＤ］－［任意のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］－［任意のリンカー］－［ｎＣａｓ１３／ｄＣａｓ１３］；［ＢＥＲ阻害剤］－［任意のリンカー］－［ＡＤ］－［任意のリンカー］－［ｎＣａｓ１３／ｄＣａｓ１３］；［ＢＥＲ阻害剤］－［任意のリンカー］－［ｎＣａｓ１３／ｄＣａｓ１３］－［任意のリンカー］－［ＡＤ］；［ｎＣａｓ１３／ｄＣａｓ１３］－［任意のリンカー］－［ＡＤ］－［任意のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］；［ｎＣａｓ１３／ｄＣａｓ１３］－［任意のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］－［任意のリンカー］－［ＡＤ］。
同様に、上記のＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系の第２の設計では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、アデノシンデアミナーゼ、またはアダプタータンパク質は、ＢＥＲ阻害剤（例えば、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤）に融合または連結することができる。いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、以下の構造の１つから構成され得る（ｎＣａｓ１３＝Ｃａｓ１３ニッカーゼ；ｄＣａｓ１３＝失活Ｃａｓ１３）：［ｎＣａｓ１３／ｄＣａｓ１３］－［任意のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］；［ＢＥＲ阻害剤］－［任意のリンカー］－［ｎＣａｓ１３／ｄＣａｓ１３］；［ＡＤ］－［任意のリンカー］－［アダプター］－［任意のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］；［ＡＤ］－［任意のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］－［任意のリンカー］－［アダプター］；［ＢＥＲ阻害剤］－［任意のリンカー］－［ＡＤ］－［任意のリンカー］－［アダプター］；［ＢＥＲ阻害剤］－［任意のリンカー］－［アダプター］－［任意のリンカー］－［ＡＤ］；［アダプター］－［任意のリンカー］－［ＡＤ］－［任意のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］；［アダプター］－［任意のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］－［任意のリンカー］－［ＡＤ］。
上記のＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ系の第３の設計では、ＢＥＲ阻害剤は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の内部ループまたは非構造化領域に挿入することができる。
核のターゲティング
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、目的の標的遺伝子座（標的遺伝子座は、細胞内である）におけるアデニンを改変することに関する。本発明の方法で使用したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び／またはアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインの、核への標的化を改善するために、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有するこれらの成分の１つまたは両方を提供することが有利であり得る。
好ましい実施形態では、本発明の文脈で使用されるＮＬＳは、タンパク質に対して異種である。ＮＬＳの非限定例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１７）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ（配列番号１８）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１９）を有する核質二分）由来のＮＬＳ；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２０）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号２１）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号２２）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチンα由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号２３）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号２４）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号２５）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号２６）；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号２７）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号２８）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号２９）；肝炎ウイルスδ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３０）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号３１）；ヒトポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号３２）；及びステロイドホルモン受容体（ヒト）糖質コルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号３３）に由来するＮＬＳ配列が挙げられる。一般に、１つ以上のＮＬＳは、真核細胞の核中の検出可能な量のＤＮＡターゲティングＣａｓタンパク質の蓄積をドライブするために十分な強度である。一般に、核局在化活性の強度は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質中のＮＬＳの数、使用した特定のＮＬＳ（複数可）、またはこれらの因子の組み合わせから導出し得る。核中の蓄積の検出は、任意の好適な技術によって実施されてもよい。例えば、検出可能なマーカーは、核酸ターゲティングタンパク質に融合してもよい。その結果、細胞内の位置を、例えば、核の位置を検出する手段（例えば、ＤＡＰＩなどの核に特異的な染色）と組み合わせて視覚化することができる。細胞核はまた、細胞から単離してもよく、次いで、その含有量は、免疫組織化学、ウエスタンブロット、または酵素活性アッセイなどの、タンパク質を検出する任意の好適なプロセスによって分析してもよい。核中の蓄積はまた、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びデアミナーゼタンパク質に露出していない対照、または１つ以上のＮＬＳが欠失しているＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ及び／またはデアミナーゼタンパク質に露出した対照と比較して、例えば、標的配列での核酸ターゲティング複合体形成の効果に対するアッセイ（例えば、デアミナーゼ活性に対するアッセイ）、またはＤＮＡターゲティング複合体形成及び／またはＤＮＡ標的化によって影響される遺伝子発現活性の変化に対するアッセイ）によって間接的に決定することができる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ及び／またはアデノシンデアミナーゼタンパク質は、１つ以上の異種ＮＬＳ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い異種ＮＬＳで提供されてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質は、アミノ末端またはその付近に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれよりも多いＮＬＳ、またはこれらのおよその数より多いＮＬＳを含むか、カルボキシ末端にまたはその付近に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれより多いＮＬＳ、またはこれらのおよその数より多いＮＬＳを含むか、あるいはこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端に０または少なくとも１つ以上のＮＬＳ、及びカルボキシ末端に０または少なくとも１つ以上のＮＬＳ）を含む。２つ以上のＮＬＳが存在する場合、各々を互いに独立して選択することができ、従って、単一のＮＬＳが、２つ以上のコピーに存在することもあり、及び／または１つ以上のコピーに存在する１つ以上の他のＮＬＳとの組み合わせで存在することもある。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、ＮＬＳの最近接アミノ酸が、ポリペプチド鎖に沿ってＮまたはＣ末端から約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０またはそれより多いアミノ酸以内にある場合、ＮまたはＣ末端付近にあるとみなされる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の好ましい実施形態では、ＮＬＳは、タンパク質のＣ末端に付着している。
本明細書に記載される方法のある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びデアミナーゼタンパク質は、細胞に送達されるかまたは分離タンパク質として細胞内で発現される。これらの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ及びデアミナーゼタンパク質の各々は、本明細書に記載される通りの１つ以上のＮＬＳで提供することができる。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ及びデアミナーゼタンパク質は、細胞に送達されるかまたは融合タンパク質として細胞内で発現される。これらの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ及びデアミナーゼタンパク質の一方または両方は、１つ以上のＮＬＳで提供される。アデノシンデアミナーゼが、上述したように、アダプタータンパク質（例えば、ＭＳ２）に融合される場合、１つ以上のＮＬＳは、アプタマー結合と相互作用しない限り、アダプタータンパク質上で提供することができる。ある特定の実施形態では、１つ以上のＮＬＳ配列は、アデノシンデアミナーゼとＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の間のリンカー配列として機能することもある。
ある特定の実施形態では、本発明のガイドは、アダプタータンパク質の特異的結合部位（例えば、アプタマー）を含み、これは、アデノシンデアミナーゼまたはその触媒ドメインに連結または融合され得る。かかるガイドが、ＣＲＩＳＰＲ複合体（すなわち、ガイド及び標的に結合するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質）を形成する場合、アダプタータンパク質は結合し、アダプタータンパク質と会合するアデノシンデアミナーゼまたはその触媒ドメインは、空間的定位に位置し、それに起因する機能が効果的になるために有利である。
当業者であれば、アダプター＋アデノシンデアミナーゼの結合を可能にするが、（例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の三次元構造内の立体障害により）アダプター＋アデノシンデアミナーゼを適切に位置決めしないガイドに対する改変は、意図しない改変であることが理解されるであろう。１つ以上の改変ガイドは、本明細書に記載される通りのテトラループ、ステムループ１、ステムループ２、またはステムループ３、好ましくは、テトラループまたはステムループ２のいずれか、及び最も好ましくは、テトラループ及びステムループ２の両方で改変されてもよい。
オルソゴナルの触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の使用
ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３ニッカーゼを、オルソゴナルの触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と併用して、前記Ｃａｓ１３ニッカーゼの効率を増加させる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８：１４９５８；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４９５８に記載される通り）。より詳細には、オルソゴナルの触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、系で使用されるＣａｓ１３ニッカーゼとは異なるＰＡＭ認識部位によって特徴付けられ、対応するガイド配列は、系のＣａｓ１３ニッカーゼに近位の標的配列に結合するように選択される。オルソゴナルの触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、本発明の文脈において使用される場合、系の一部を形成しないが、前記Ｃａｓ１３ニッカーゼの効率を増加させるようにのみ機能し、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質について当該技術分野で記載されるように、標準ガイド分子と併用される。ある特定の実施形態では、前記オルソゴナルの触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、失活ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質である、すなわち、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性を廃止する１つ以上の突然変異を含む。ある特定の実施形態では、触媒的に不活性なオルソゴナルＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３ニッカーゼの標的配列に近位である標的配列にハイブリダイズすることができる２つ以上のガイド分子で提供される。ある特定の実施形態では、少なくとも２つのガイド分子を使用して、前記触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を標的化する。そのうちの少なくとも１つのガイド分子は、系のＣａｓ１３ニッカーゼの標的配列の標的配列５’にハイブリダイズすることができ、少なくとも１つのガイド分子は、系のＣａｓ１３ニッカーゼの標的配列の標的配列３’にハイブリダイズすることができる。それによって、前記１つ以上の標的配列は、Ｃａｓ１３ニッカーゼの標的配列と同じまたは反対のＤＮＡ鎖上であってもよい。ある特定の実施形態では、オルソゴナルの触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の１つ以上のガイド分子のガイド配列は、標的配列が、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲの標的化、すなわち、Ｃａｓ１３ニッカーゼの標的化のためのガイド分子のものに近位であるように選択される。ある特定の実施形態では、オルソゴナルの触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素の１つ以上の標的配列は、Ｃａｓ１３ニッカーゼの標的配列から、５を超えるが４５０未満の塩基対それぞれ分離される。オルソゴナルの触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質で使用されるガイドの標的配列と、系の標的配列の間の最適距離は、当業者によって決定することができる。ある特定の実施形態では、オルソゴナルＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、クラスＩＩ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質である。ある特定の実施形態では、オルソゴナルＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、クラスＩＩのＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質である。ある特定の実施形態では、触媒的に不活性なオルソゴナルＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質。ある特定の実施形態では、触媒的に不活性なオルソゴナルＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、本明細書において他所に記載するように、そのＰＡＭ特異性を変化させるように改変されている。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３タンパク質ニッカーゼは、それ自体はヒト細胞中では限定された活性を有するが、不活性オルソゴナルＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と１つ以上の対応する近位ガイドとの組み合わせにより、必要なニッカーゼ活性を確実にするニッカーゼである。
Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質複合体は、機能性エフェクターを送達することができる
ＤＮＡレベルで突然変異させることにより発現を消失させるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３媒介性ノックアウトとは異なり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ノックダウンは、人工転写因子を用いて遺伝子発現を一時的に減らすことが可能である、例えば、突然変異を介して、Ｃａｓ１３タンパク質の開裂ドメイン（複数可）の残基は、触媒的に不活性なＣａｓ１３タンパク質の生成をもたらす。触媒的に不活性なＣａｓ１３は、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡと複合体を形成し、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡのターゲティングドメインによって特定されるＤＮＡ配列に局在化するが、しかしながら、これは、標的を開裂しない。不活性Ｃａｓ１３タンパク質をエフェクタードメイン、例えば、転写抑制ドメインと融合させると、ガイドＲＮＡによって特定される任意の部位へとそのエフェクターを動員することが可能になる。
いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ１３を使用して、転写因子またはその活性ドメインを送達してもよい。ｄＣａｓ１３は、転写因子またはその活性ドメインと融合してもよい。得られた複合体は、核酸のガイダンス、例えば、ガイド配列の下で送達し得る。
スプリットタンパク質
これに関連して、及びより一般的に本明細書に記載される通りの様々な適用について、スプリットバージョンのＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用を想定し得ることが注記される。実際、これは特異性の増加を可能にし得るのみならず、送達にも有利であり得る。Ｃａｓ１３（例えば、Ｃａｓ１３ｂ）は、Ｃａｓ１３酵素の２つのパートが実質的に機能性Ｃａｓ１３を含むという意味でスプリットであり得る。理想的には、スプリットは、常に触媒ドメイン（複数可）が影響を受けないようなものでなければならない。このＣａｓ１３ｃは、ヌクレアーゼとして機能してもよく、またはそれは、典型的にはその触媒ドメインの突然変異（複数可）に起因して、本質的に触媒活性をほぼもしくは全く持たないＲＮＡ結合タンパク質である失活Ｃａｓ１３ｃであってもよい。
スプリットＣａｓ１３の各半分は、二量化パートナーに融合されてもよい。例として、及び限定ではなく、ラパマイシン感受性二量化ドメインを用いると、Ｃａｓ１３活性を時間的に制御するための化学的に誘導可能なスプリットＣａｓ１３の作成が可能となる。従って、Ｃａｓ１３は、２つの断片に分割することにより化学的に誘導可能にすることができ、このラパマイシン感受性二量化ドメインを使用して、Ｃａｓ１３を制御された形で再アセンブルし得る。スプリットＣａｓ１３ｃの２つのパートは、スプリットＣａｓ１３ｃのＮ’末端パート及びＣ’末端パートと考えることができる。この融合は、典型的には、Ｃａｓ１３のスプリット点である。換言すれば、スプリットＣａｓ１３ｃのＮ’末端パートのＣ’末端が二量体半分のうちの一方に融合し、一方でＣ’末端パートのＮ’末端が他方の二量体半分に融合する。
Ｃａｓ１３は、開裂点が新しく作り出されるという意味で分割される必要はない。スプリット点は、典型的には、インシリコで設計され、構築物にクローニングされる。一緒になって、スプリットＣａｓ１３ｃの２つのパート、Ｎ’末端パート及びＣ’末端パートは、好ましくは野生型アミノ酸（またはそれをコードするヌクレオチド）の少なくとも７０％以上、好ましくは野生型アミノ酸（またはそれをコードするヌクレオチド）の少なくとも８０％以上、好ましくは少なくとも９０％以上、好ましくは少なくとも９５％以上、及び最も好ましくは少なくとも９９％以上を含む完全なＣａｓ１３を形成する。何らかのトリミングがある可能性があってもよく、突然変異体が想定される。非機能性ドメインは、完全に除去されてもよい。重要な点は、２つのパートが一体にされ得ること、及び所望のＣａｓ１３ｃ機能が修復しまたは元に戻ることである。二量体は、ホモ二量体またはヘテロ二量体であってよい。
場合によっては、第１及び第２のスプリットＣａｓ１３エフェクタータンパク質は、互いに融合して、触媒的に活性なＣａｓ１３エフェクタータンパク質を形成することができ得る。融合は、誘導性であり得る。
最適化された機能性ＲＮＡターゲティング系
ある態様では、本発明は、機能性成分をＲＮＡ環境に特異的に送達する系を提供する。これは、異なる成分をＲＮＡに特異的に標的化することができる、本発明のＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ系を用いて確実に行うことができる。より詳細には、かかる成分には、アクチベーターまたはリプレッサー、例えば、ＲＮＡ翻訳、分解などのアクチベーターまたはリプレッサーが挙げられる。
一態様によれば、本発明は、細胞中の目的の標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列を含むガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡを含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、アダプタータンパク質に結合する１つ以上の固有のＲＮＡ配列（複数可）の挿入によって改変される、組成物を提供する。ある特定の実施形態では、ＲＮＡ配列は、２つ以上のアダプタータンパク質（例えば、アプタマー）に結合することができ、各アダプタータンパク質は、１つ以上の機能性ドメインと会合する。２つ以上の機能性ドメインが存在する場合、機能性ドメインは、同じか、または異なり得る、例えば、２つの同じまたは２つの異なるアクチベーターまたはリプレッサーである。ある態様では、本発明は、本明細書に記載される組成物であって、１つ以上の機能性ドメインが、ＲＮＡターゲティング酵素に付着し、その結果、標的ＲＮＡに結合する際に、機能性ドメインは、機能性ドメインがその起因する機能で機能することができる空間的定位である、組成物を提供する。ある態様では、本発明は、本明細書に記載される組成物であって、組成物が、少なくとも３つの機能性ドメインを有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３複合体を含み、そのうちの少なくとも１つが、ＲＮＡターゲティング酵素に会合し、そのうちの少なくとも２つが、ｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡと会合する、組成物を提供する。
ＣＲＩＳＰＲの開発及び使用
本発明は、以下の論文に示される通りの、ならびに特に、細胞及び生物におけるＣＲＩＳＰＲタンパク質複合体の送達及びＲＮＡガイド下エンドヌクレアーゼの使用に関する通りのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの開発及び使用の態様に基づきさらに例示し、及び拡張することができる：
・Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９－２３（２０１３）；
・ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊｉａｎｇ Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ Ｄ．，Ｃｏｘ Ｄ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ＬＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｍａｒ；３１（３）：２３３－９（２０１３）；
・Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｅ Ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｗａｎｇ Ｈ．，Ｙａｎｇ Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ ＣＳ．，Ｄａｗｌａｔｙ ＭＭ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．Ｃｅｌｌ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０－８（２０１３）；
・Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｃｏｎｇ Ｌ，Ｐｌａｔｔ ＲＪ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ．Ａｕｇ ２２；５００（７４６３）：４７２－６．ｄｏｉ：１０．１０３８／Ｎａｔｕｒｅ１２４６６．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｕｇ ２３（２０１３）；
・Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｌｉｎ，ＣＹ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ＪＳ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，ＡＥ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｃｅｌｌ Ａｕｇ ２８．ｐｉｉ：Ｓ００９２－８６７４（１３）０１０１５－５（２０１３－Ａ）；
・ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）；
・Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１－３０８（２０１３－Ｂ）；
・Ｇｅｎｏｍｅ－Ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｃ １２．（２０１３）．；
・Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｓ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｓｈｅｈａｔａ，ＳＩ．，Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｎｕｒｅｋｉ，Ｏ．Ｃｅｌｌ Ｆｅｂ ２７，１５６（５）：９３５－４９（２０１４）；
・Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｗｕ Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ．，Ｋｒｉｚ ＡＪ．，Ｃｈｉｕ ＡＣ．，Ｈｓｕ ＰＤ．，Ｄａｄｏｎ ＤＢ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ．，Ｃｈｅｎ Ｓ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｓｈａｒｐ ＰＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｒ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８８９（２０１４）；
・ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｉｎ Ｍｉｃｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｐｌａｔｔ ＲＪ，Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｙｉｍ ＭＪ，Ｓｗｉｅｃｈ Ｌ，Ｋｅｍｐｔｏｎ ＨＲ，Ｄａｈｌｍａｎ ＪＥ，Ｐａｒｎａｓ Ｏ，Ｅｉｓｅｎｈａｕｒｅ ＴＭ，Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ Ｍ，Ｇｒａｈａｍ ＤＢ，Ｊｈｕｎｊｈｕｎｗａｌａ Ｓ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｘａｖｉｅｒ ＲＪ，Ｌａｎｇｅｒ Ｒ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＤＧ，Ｈａｃｏｈｅｎ Ｎ，Ｒｅｇｅｖ Ａ，Ｆｅｎｇ Ｇ，Ｓｈａｒｐ ＰＡ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｃｅｌｌ １５９（２）：４４０－４５５ ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４（２０１４）；
・Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｃｅｌｌ．Ｊｕｎ ５；１５７（６）：１２６２－７８（２０１４）
・Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｎｇ Ｔ，Ｗｅｉ ＪＪ，Ｓａｂａｔｉｎｉ ＤＭ，Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｊａｎｕａｒｙ ３；３４３（６１６６）：８０－８４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４６９８１（２０１４）；
・Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｇＲＮＡｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｄｏｅｎｃｈ ＪＧ，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ Ｅ，Ｇｒａｈａｍ ＤＢ，Ｔｏｔｈｏｖａ Ｚ，Ｈｅｇｄｅ Ｍ，Ｓｍｉｔｈ Ｉ，Ｓｕｌｌｅｎｄｅｒ Ｍ，Ｅｂｅｒｔ ＢＬ，Ｘａｖｉｅｒ ＲＪ，Ｒｏｏｔ ＤＥ．，（オンライン発行 ３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｄｅｃ；３２（１２）：１２６２－７（２０１４）；
・Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９，Ｓｗｉｅｃｈ Ｌ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ａ，Ｈａｂｉｂ Ｎ，Ｌｉ Ｙ，Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ Ｊ，Ｓｕｒ Ｍ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，（オンライン発行 １９ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊａｎ；３３（１）：１０２－６（２０１５）；
・Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ，Ｊｏｕｎｇ Ｊ，Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ＯＯ，Ｂａｒｃｅｎａ Ｃ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｈａｂｉｂ Ｎ，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ＪＳ，Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ Ｈ，Ｎｕｒｅｋｉ Ｏ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ｊａｎ ２９；５１７（７５３６）：５８３－８（２０１５）
・Ａ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ，Ｖｏｌｚ ＳＥ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，（オンライン発行 ０２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｆｅｂ；３３（２）：１３９－４２（２０１５）；
・Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｓａｎｊａｎａ ＮＥ，Ｚｈｅｎｇ Ｋ，Ｓｈａｌｅｍ Ｏ，Ｌｅｅ Ｋ，Ｓｈｉ Ｘ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｓｏｎｇ Ｊ，Ｐａｎ ＪＱ，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ Ｒ，Ｌｅｅ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｓｈａｒｐ ＰＡ．Ｃｅｌｌ １６０，１２４６－１２６０，Ｍａｒｃｈ １２，２０１５（マウスにおける多重スクリーニング）、及び
・Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９，Ｒａｎ ＦＡ，Ｃｏｎｇ Ｌ，Ｙａｎ ＷＸ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ＪＳ，Ｋｒｉｚ ＡＪ，Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ，Ｓｈａｌｅｍ Ｏ，Ｗｕ Ｘ，Ｍａｋａｒｏｖａ ＫＳ，Ｋｏｏｎｉｎ ＥＶ，Ｓｈａｒｐ ＰＡ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，（オンライン発行 ０１ Ａｐｒｉｌ ２０１５），Ｎａｔｕｒｅ．Ａｐｒ ９；５２０（７５４６）：１８６－９１（２０１５）
・Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９，”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，２９９－３１１（Ｍａｙ ２０１５）
・Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ，”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５，１１４７－１１５７（Ａｕｇｕｓｔ ２０１５）
・Ｐａｒｎａｓ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｄｉｓｓｅｃｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ，”Ｃｅｌｌ １６２，６７５－６８６（Ｊｕｌｙ ３０，２０１５）
・Ｒａｍａｎａｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：１０８３３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１０８３３（Ｊｕｎｅ ２，２０１５）
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９，Ｃｅｌｌ １６２，１１１３－１１２６（Ａｕｇ．２７，２０１５）
・ＢＣＬ１１Ａ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｃａｎｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２７（７５７７）：１９２－７（Ｎｏｖ．１２，２０１５）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１５５２１．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｓｅｐ １６
・Ｃａｓ１３ Ｉｓ ａ Ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６３，７５９－７１（Ｓｅｐ ２５，２０１５）
・Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０（３），３８５－３９７ ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１５．１０．００８ Ｅｐｕｂ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２２，２０１５
・Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６ Ｊａｎ １ ３５１（６２６８）：８４－８８ ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５２２７．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｄｅｃ １．
・Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ１３ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，”ｂｉｏＲｘｉｖ ０９１６１１；ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０９１６１１（Ｄｅｃ．４，２０１６）。
この各々が参照により本明細書に援用され、本発明の実施において考慮されてもよく、及び以下に簡単に考察する：
・Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９及びまたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の両方に基づき、真核細胞で使用されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をエンジニアリングし、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが低分子ＲＮＡの指図を受けてヒト及びマウス細胞で正確なＤＮＡ開裂を誘導し得ることを実証した。この著者らの研究はさらに、ニッキング酵素に変換されるＣａｓ９を使用して、最小限の変異原活性を有する真核細胞での相同性組換え修復を促進し得ることを示した。加えて、この著者らの研究は、複数のガイド配列を単一のＣＲＩＳＰＲ配列にコードすることによって哺乳類ゲノム内の内因性ゲノム遺伝子座部位でいくつかを同時に編集することが可能となり得ることを実証し、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ技術の容易なプログラム可能性及び広範な適用性を実証した。このようにＲＮＡを使用して細胞における配列特異的ＤＮＡ開裂をプログラムすることが可能となり、ゲノムエンジニアリングツールの新しいクラスが定義された。これらの研究はさらに、他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が哺乳類細胞に移植可能である可能性があり、哺乳類ゲノム開裂も媒介し得ることを示した。重要なことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のいくつかの側面をさらに改良してその効率及び多用途性を高め得ることが想定され得る。
・Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．は、デュアルＲＮＡと複合体を形成したクラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのゲノムに正確な突然変異を導入した。この手法は、標的ゲノム部位におけるデュアルＲＮＡ：Ｃａｓ９誘導開裂によって非突然変異細胞を死滅させることに頼ったもので、選択可能マーカーまたは対抗選択系の必要性が回避される。この研究は、単一及び複数のヌクレオチド変化が生じるように短鎖ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の配列を変えることによってデュアルＲＮＡ：Ｃａｓ９特異性を再プログラム化すると、鋳型の編集が行われることを報告した。この研究は、２つのｃｒＲＮＡを同時に使用すると突然変異誘発の多重化が可能であることを示した。さらに、この手法を組換えと併用した時、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでは、記載される手法を用いて回収された細胞のほぼ１００％が所望の突然変異を含み、Ｅ．ｃｏｌｉでは回収された細胞の６５％が突然変異を含んだ。
・Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いることにより、胚性幹細胞における逐次的組換え及び／または及び／または時間のかかる単一突然変異を有するマウスの交雑による複数の段階で従来作成された複数の遺伝子に突然変異を保有するマウスを一段階で作成した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は機能的に重複する遺伝子及び上位遺伝子相互作用のインビボ研究を大幅に加速させ得る。
・Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素及びまた転写活性化因子様エフェクターに基づくＤＮＡ結合ドメインの光学的及び化学的調節を可能にする多用途のかつロバストな技術が当該技術分野で必要とされていることに対処した。
・Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３－Ａ）は、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異体を対のガイドＲＮＡと組み合わせて標的二本鎖開裂を導入するという手法を記載した。これは、微生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のＣａｓ９ヌクレアーゼがガイド配列によって特異的なゲノム遺伝子座に標的化されるが、ガイド配列は、ＤＮＡ標的とのいくらかのミスマッチに耐えることができるため、従って、望ましくないオフターゲット突然変異誘発を促進し得るという問題に対処する。ゲノム中の個々のニックは高いフィデリティーで修復されるため、二本鎖開裂には適切にオフセットしたガイドＲＮＡによる同時のニッキングが必要であり、標的開裂のために特異的に認識される塩基の数が大きくなる。この著者らは、対のニッキングを使用して細胞系におけるオフターゲット活性を５０～１，５００分の１に減らし、オンターゲット開裂効率を犠牲にすることなしにマウス接合体における遺伝子ノックアウトを促進し得ることを実証した。この多用途戦略により、高い特異性が要求される多種多様なゲノム編集適用が可能となる。
・Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、標的部位の選択を知らせ、かつオフターゲット効果を回避するためのヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９標的化の特異性を特徴付けた。この研究は、７００個を超えるガイドＲＮＡ変異体ならびに２９３Ｔ及び２９３ＦＴ細胞の１００個を超える予測ゲノムオフターゲット遺伝子座におけるＳｐＣａｓ９誘導インデル突然変異レベルを評価した。この著者ら、ＳｐＣａｓ９が、ミスマッチの数、位置及び分布に感受性を示して配列依存的に種々の位置におけるガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間のミスマッチに耐えること。この著者らはさらに、ＳｐＣａｓ９媒介性開裂がＤＮＡメチル化の影響を受けないこと、ＳｐＣａｓ９及びガイドＲＮＡの投薬量を滴定してオフターゲット改変を最小限に抑え得ることを示した。加えて、哺乳類ゲノムエンジニアリング適用を促進するため、この著者らは、標的配列の選択及び検証ならびにオフターゲット分析をガイドするウェブベースのソフトウェアツールの提供を報告した。
・Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３－Ｂ）は、哺乳類細胞における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性組換え修復（ＨＤＲ）を用いたＣａｓ９媒介性ゲノム編集用ならびに下流機能研究のための改変細胞系作成用の一組のツールを記載した。オフターゲット開裂を最小限に抑えるため、この著者らはさらに、対のガイドＲＮＡを含むＣａｓ９ニッカーゼ突然変異体を使用した二重ニッキング戦略を記載した。この著者らによって提供されるプロトコルから、標的部位の選択、開裂効率の評価及びオフターゲット活性の分析に関する指針が実験的に導かれた。この研究は、標的設計から始めて、僅か１～２週間以内に遺伝子改変を達成し得るとともに、２～３週間以内に改変クローン細胞系を誘導し得ることを示した。
・Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．は、ゲノムワイドな規模で遺伝子機能を調べる新しい方法を記載した。この著者らの研究は、６４，７５１個のユニークなガイド配列で１８，０８０個の遺伝子を標的化するゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリーの送達が、ヒト細胞におけるネガティブ選択及びポジティブ選択の両方のスクリーニングを可能にしたことを示した。第一に、この著者らは、ＧｅＣＫＯライブラリーを使用した、がん及び多能性幹細胞における細胞生存にとって不可欠な遺伝子の同定を示した。次に、この著者らは黒色腫モデルにおいて、その欠損が突然変異体プロテインキナーゼＢＲＡＦを阻害する治療薬ベムラフェニブに対する耐性に関わる遺伝子をスクリーニングした。この著者らの研究は、最も上位にランク付けされた候補に、以前検証された遺伝子ＮＦ１及びＭＥＤ１２ならびに新規ヒットＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ、及びＴＡＤＡ１が含まれたことを示した。この著者らは、同じ遺伝子を標的化する独立したガイドＲＮＡ間における高度な一致及び高率のヒット確認を観察し、従ってＣａｓ９によるゲノム規模スクリーニングの有望さを実証した。
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．は、２．５Åの分解能でｓｇＲＮＡ及びその標的ＤＮＡと複合体形成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の結晶構造を報告した。この構造から、標的認識ローブとヌクレアーゼローブとで構成された、それらの界面にある正電荷の溝にｓｇＲＮＡ：ＤＮＡｎ ＲＮＡ二本鎖を受け入れる２ローブ構成が明らかになった。認識ローブはｓｇＲＮＡ及びＤＮＡの結合に決定的に重要であるのに対し、ヌクレアーゼローブはＨＮＨ及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含み、これらのドメインは標的ＤＮＡのそれぞれ相補鎖及び非相補鎖の開裂に適切な位置にある。ヌクレアーゼローブはまた、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）との相互作用に関与するカルボキシル末端ドメインも含む。この高分解能構造分析及び付随する機能分析により、Ｃａｓ９によるＲＮＡガイド下ＤＮＡ標的化の分子機構が明らかになることで、ひいては新規の多用途ゲノム編集技術の合理的な設計への道が開かれつつある。
・Ｗｕ ｅｔ ａｌ．は、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）においてシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を負荷したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）のゲノムワイドな結合部位をマッピングした。この著者らは、試験した４つのｓｇＲＮＡの各々が、多くの場合にｓｇＲＮＡにおける５ヌクレオチドシード領域及びＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）によって特徴付けられる数十個ないし数千個のゲノム部位にｄＣａｓ９を標的化することを示した。クロマチンが接触不可能であることにより、一致するシード配列を含む他の部位に対するｄＣａｓ９結合が減少し；従って、オフターゲット部位の７０％が遺伝子と会合する。この著者らは、触媒活性Ｃａｓ９をトランスフェクトしたｍＥＳＣにおける２９５個のｄＣａｓ９結合部位の標的シーケンシングから、バックグラウンドレベルを上回って突然変異した部位は１つのみ同定されたことを示した。この著者らは、Ｃａｓ９結合及び開裂の２状態モデルを提案しており、このモデルではシードの一致が結合を引き起こすが、開裂には標的ＤＮＡとの広範な対合が必要である。
・Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．はＣｒｅ依存性Ｃａｓ９ノックインマウスを樹立した。この著者らは、ニューロン、免疫細胞、及び内皮細胞においてガイドＲＮＡのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性、レンチウイルス媒介性、または粒子媒介性送達を用いたインビボならびにエキソビボゲノム編集を実証した。
・Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、細胞の遺伝子スクリーニングを含めたヨーグルトからゲノム編集に至るまでのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の歴史を広く考察するレビュー論文である。
・Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、ゲノム規模のレンチウイルスシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ライブラリーを使用するポジティブ選択及びネガティブ選択の両方に好適なプールされた機能喪失型遺伝子スクリーニング手法に関する。
・Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．は、６個の内因性マウス遺伝子及び３個の内因性ヒト遺伝子のパネルの可能な全ての標的部位にわたってタイリングするｓｇＲＮＡのプールを作成し、その標的遺伝子のヌル対立遺伝子を産生するそれらの能力を抗体対比染色及びフローサイトメトリーによって定量的に評価した。この著者らは、ＰＡＭの最適化により活性が向上することを示し、また、ｓｇＲＮＡを設計するためのオンラインツールも提供した。
・Ｓｗｉｅｃｈ ｅｔ ａｌ．は、ＡＡＶ媒介性ＳｐＣａｓ９ゲノム編集により脳における遺伝子機能の逆遺伝学研究が可能となり得ることを実証している。
・Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、複数のエフェクタードメイン、例えば、転写アクチベーター、機能及びエピゲノム調節因子をステムまたはテトラループなどのガイド上の適切な位置にリンカーを伴い及び伴わず付加する能力を考察している。
・Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．は、Ｃａｓ９酵素が２つに分割されることができ、ひいては活性化のためのＣａｓ９のアセンブリを制御し得ることを実証している。
・Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．は、マウスにおけるゲノムワイドなインビボＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９スクリーニングによって肺転移の調節遺伝子が明らかになることを実証することによる多重スクリーニングに関する。
・Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）はＳａＣａｓ９及びそのゲノム編集能力に関し、生化学アッセイからは推定できないことを実証している。
・Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）の融合物を用いて発現を合成的に抑制（ＣＲＩＳＰＲｉ）または活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）する方法について記載し、アレイ化及びプール化されたスクリーニングを含めたゲノム規模のスクリーニング、ゲノム遺伝子座を不活性化させるノックアウト手法ならびに転写活性を調節する戦略にＣａｓ９を用いる進歩を示している。
・Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、ＣＲＩＳＰＲベースのスクリーニングにおけるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の効率に寄与するＤＮＡ配列特徴を評価した。この著者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトの効率及び開裂部位におけるヌクレオチド選好性を調査した。この著者らはまた、ＣＲＩＳＰＲｉ／ａの配列選好性がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトのものと実質的に異なることも見出した。
・Ｐａｒｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、ゲノムワイドなプールＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ライブラリーを樹状細胞（ＤＣ）に導入することにより、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）による腫瘍壊死因子（Ｔｎｆ）の誘導を制御する遺伝子を同定した。Ｔｌｒ４シグナル伝達の既知の調節因子及びこれまで知られていない候補が同定され、ＬＰＳに対するカノニカルな応答への個別的な効果を有する３つの機能モジュールに分類された。
・Ｒａｍａｎａｎ ｅｔ ａｌ（２０１５）は、感染細胞におけるウイルスエピソームＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の開裂を実証した。ＨＢＶゲノムは、感染ヘパトサイトの核に、共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）と呼ばれる３．２ｋｂの二本鎖エピソームＤＮＡ種として存在し、ｃｃｃＤＮＡは、現在の治療法によってはその複製が阻害されないＨＢＶライフサイクルの主要な成分である。この著者らは、ＨＢＶの高度に保存された領域を特異的に標的化するｓｇＲＮＡがウイルス複製をロバストに抑制し、ｃｃｃＤＮＡを枯渇させることを示した。
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、５’－ＴＴＧＡＡＴ－３’ＰＡＭ及び５’－ＴＴＧＧＧＴ－３’ＰＡＭを含有する、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）及びその二本鎖ＤＮＡ標的との複合体中のＳａＣａｓ９の結晶構造を報告した。ＳａＣａｓ９とＳｐＣａｓ９の構造比較により、構造的保存及び多様性の両方が明らかとなり、それらの特徴的なＰＡＭ特異性及びオルソロガスｓｇＲＮＡ認識が説明された。
・Ｃａｎｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、非コードゲノムエレメントのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベースの機能研究を実証した。この著者ら、我々は、プールＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ガイドＲＮＡライブラリーを開発してヒト及びマウスＢＣＬ１１Ａエンハンサーのインサイチュ飽和突然変異誘発を実施し、それによりエンハンサーの重要な特徴が明らかになった。
・Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、Ｃａｓ９と異なる特徴を有するＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のクラス２ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであるＣａｓ１３の特徴付けを報告した。Ｃａｓ１３は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用し、及びスタガードＤＮＡ二本鎖開裂によってＤＮＡを開裂する。
・Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、３つの特徴的なクラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を報告した。２つの系ＣＲＩＳＰＲ酵素（Ｃ２ｃ１及びＣ２ｃ３）は、遠隔でＣａｓ１３に関係するＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有する。Ｃａｓ１３と異なり、Ｃ２ｃ１はＤＮＡ開裂に関してｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方に依存する。第３の酵素（Ｃ２ｃ２）は２つの予想されたＨＥＰＮ ＲＮａｓｅドメインを含有し、ｔｒａｃｒＲＮＡ非依存性である。
・Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１６）は、構造ガイド下タンパク質エンジニアリングを用いたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）の特異性の改良を報告した。この著者らは、オフターゲット効果が低下しながらもロバストなオンターゲット開裂を維持する「特異性増強」ＳｐＣａｓ９（ｅＳｐＣａｓ９）変異体を開発した。
本明細書で提供される方法及びツールは、ｔｒａｃｒＲＮＡを使用しないＣａｓ１３、ＩＩ型ヌクレアーゼについて例示する。Ｃａｓ１３のオルソログは、本明細書に記載される通りの異なる細菌種で同定されている。さらに、同様の性質を有するＩＩ型ヌクレアーゼは、当該技術分野において記載される方法を用いて同定することができる（Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１５，６０：３８５－３９７；Ａｂｕｄａｙｅｈ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，５；３５３（６２９９））。ある特定の実施形態では、新規のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を同定するかかる方法は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ遺伝子座の存在を同定するシードをコードするデータベースから配列を選択するステップ、選択された配列にオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むシードの１０ｋｂ内に位置する遺伝子座を同定するステップ、同定した遺伝子座からＯＲＦ（そのうちのただ１つのＯＲＦが、７００超のアミノ酸を有し、かつ、公知のＣＲＩＳＰＲエフェクターに対して９０％以下の相同性を有する新規のＣＲＩＳＰＲエフェクターをコードする）を含む遺伝子座を選択することを含み得る。ある特定の実施形態では、シードは、Ｃａｓ１などのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に共通しているタンパク質である。さらなる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイをシードとして使用して、新規のエフェクタータンパク質を同定する。
以来、本発明の有効性が実証されてきた。Ｃａｓ１３とｃｒＲＮＡとを含む予めアセンブルした組換えＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３複合体は、例えば、電気穿孔によってトランスフェクトしてもよく、それにより高い突然変異率が得られ、かつ検出可能なオフターゲット突然変異がなくなる。Ｈｕｒ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓ１３ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｊｕｎ ６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３５９６。ゲノムワイドな分析は、Ｃａｓ１３が極めて特異的であることを示している。１つの尺度では、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＣａｓ１３について決定されたインビトロ開裂部位は、ＳｐＣａｓ９と比べて著しく少なかった。Ｋｉｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｃａｓ１３ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｊｕｎ ６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３６０９。Ｃａｓ１３を用いた効率的な多重化系が、発明のｔＲＮＡを含有するアレイからプロセシングされたｇＲＮＡを用いてＤｒｏｓｏｐｈｉｌａで実証されている。Ｐｏｒｔ，Ｆ．ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｔｏｏｌｂｏｘ ｉｎ ａｎ ａｎｉｍａｌ ｗｉｔｈ ｔＲＮＡ－ｆｌａｎｋｅｄ Ｃａｓ９ ａｎｄ Ｃａｓ１３ ｇＲＮＡｓ．ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０４６４１７。
また、“Ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＦｏｋＩ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ”，Ｓｈｅｎｇｄａｒ Ｑ．Ｔｓａｉ，Ｎｉｃｏｌａｓ Ｗｙｖｅｋｅｎｓ，Ｃｙｄ Ｋｈａｙｔｅｒ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ａ．Ｆｏｄｅｎ，Ｖｉｓｈａｌ Ｔｈａｐａｒ，Ｄｅｅｐａｋ Ｒｅｙｏｎ，Ｍａｔｈｅｗ Ｊ．Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ａｒｙｅｅ，Ｊ．Ｋｅｉｔｈ Ｊｏｕｎｇ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（６）：５６９－７７（２０１４）を参照されたく、これは、伸長配列を認識し、かつヒト細胞において内因性遺伝子を高効率で編集することのできる二量体ＲＮＡガイド下ＦｏｋＩヌクレアーゼに関する。
方法、材料、送達媒体、ベクター、粒子、ならびに量及び製剤に関してなど、それらの作製及び使用、ならびにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ発現真核細胞、マウスなどのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ発現真核生物を含め、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、その成分、及びかかる成分の送達に関する概略的な情報に関しては、米国特許第８，９９９，６４１号、同第８，９９３，２３３号、同第８，６９７，３５９号、同第８，７７１，９４５号、同第８，７９５，９６５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，８７１，４４５号、同第８，８８９，３５６号、同第８，８８９，４１８号、同第８，８９５，３０８号、同第８，９０６，６１６号、同第８，９３２，８１４号、及び同第８，９４５，８３９号；米国特許出願公開第ＵＳ２０１４－０３１０８３０号（米国特許出願第１４／１０５，０３１号）、ＵＳ２０１４－０２８７９３８ Ａ１（米国特許出願第１４／２１３，９９１号）、ＵＳ２０１４－０２７３２３４ Ａ１（米国特許出願第１４／２９３，６７４号）、ＵＳ２０１４－０２７３２３２ Ａ１（米国特許出願第１４／２９０，５７５号）、ＵＳ２０１４－０２７３２３１号（米国特許出願第１４／２５９，４２０号）、ＵＳ２０１４－０２５６０４６ Ａ１（米国特許出願第１４／２２６，２７４号）、ＵＳ２０１４－０２４８７０２ Ａ１（米国特許出願第１４／２５８，４５８号）、ＵＳ２０１４－０２４２７００ Ａ１（米国特許出願第１４／２２２，９３０号）、ＵＳ２０１４－０２４２６９９ Ａ１（米国特許出願第１４／１８３，５１２号）、ＵＳ２０１４－０２４２６６４ Ａ１（米国特許出願第１４／１０４，９９０号）、ＵＳ２０１４－０２３４９７２ Ａ１（米国特許出願第１４／１８３，４７１号）、ＵＳ２０１４－０２２７７８７ Ａ１（米国特許出願第１４／２５６，９１２号）、ＵＳ２０１４－０１８９８９６ Ａ１（米国特許出願第１４／１０５，０３５号）、ＵＳ２０１４－０１８６９５８号（米国特許出願第１４／１０５，０１７号）、ＵＳ２０１４－０１８６９１９ Ａ１（米国特許出願第１４／１０４，９７７号）、ＵＳ２０１４－０１８６８４３ Ａ１（米国特許出願第１４／１０４，９００号）、ＵＳ２０１４－０１７９７７０ Ａ１（米国特許出願第１４／１０４，８３７号）及びＵＳ２０１４－０１７９００６ Ａ１（米国特許出願第１４／１８３，４８６号）、ＵＳ２０１４－０１７０７５３（米国特許出願第１４／１８３，４２９号）；ＵＳ２０１５－０１８４１３９（米国特許出願第１４／３２４，９６０号）；１４／０５４，４１４、欧州特許出願ＥＰ２ ７７１ ４６８号（ＥＰ１３８１８５７０．７）、ＥＰ２ ７６４ １０３（ＥＰ１３８２４２３２．６）、及びＥＰ２ ７８４ １６２（ＥＰ１４１７０３８３．５）；ならびにＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１４／０９３６６１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３）、ＷＯ２０１４／０９３６９４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７９０）、ＷＯ２０１４／０９３５９５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６１１）、ＷＯ２０１４／０９３７１８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８２５）、ＷＯ２０１４／０９３７０９（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１２）、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）、ＷＯ２０１４／０９３６３５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６９１）、ＷＯ２０１４／０９３６５５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７３６）、ＷＯ２０１４／０９３７１２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１９）、ＷＯ２０１４／０９３７０１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８００）、ＷＯ２０１４／０１８４２３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８）、ＷＯ２０１４／２０４７２３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１７９０）、ＷＯ２０１４／２０４７２４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８００）、ＷＯ２０１４／２０４７２５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０３）、ＷＯ２０１４／２０４７２６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０４）、ＷＯ２０１４／２０４７２７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０６）、ＷＯ２０１４／２０４７２８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０８）、ＷＯ２０１４／２０４７２９（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０９）、ＷＯ２０１５／０８９３５１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９８９７）、ＷＯ２０１５／０８９３５４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９０２）、ＷＯ２０１５／０８９３６４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９２５）、ＷＯ２０１５／０８９４２７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７００６８）、ＷＯ２０１５／０８９４６２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１２７）、ＷＯ２０１５／０８９４１９（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７００５７）、ＷＯ２０１５／０８９４６５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１３５）、ＷＯ２０１５／０８９４８６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１７５）、ＷＯ２０１５／０５８０５２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６１０７７）、ＷＯ２０１５／０７００８３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６４６６３）、ＷＯ２０１５／０８９３５４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９０２）、ＷＯ２０１５／０８９３５１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９８９７）、ＷＯ２０１５／０８９３６４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９２５）、ＷＯ２０１５／０８９４２７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７００６８）、ＷＯ２０１５／０８９４７３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１５２）、ＷＯ２０１５／０８９４８６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１７５）、ＷＯ２０１６／０４９２５８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５１８３０）、ＷＯ２０１６／０９４８６７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５３８５）、ＷＯ２０１６／０９４８７２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５３９３）、ＷＯ２０１６／０９４８７４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５３９６）、ＷＯ２０１６／１０６２４４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６７１７７）を参照されたい。
また、米国特許出願第６２／１８０，７０９号、１５年６月１７日、ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ ＧＵＩＤＥ ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ）；１４年１２月１２日に出願された米国特許出願第６２／０９１，４５５号、ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ ＧＵＩＤＥ ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ）；米国特許出願第６２／０９６，７０８号、１４年１２月２４日、ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ ＧＵＩＤＥ ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ）；米国特許出願第６２／０９１，４６２号、１４年１２月１２日、同第６２／０９６，３２４号、１４年１２月２３日、同第６２／１８０，６８１号、２０１５年６月１７日、及び同第６２／２３７，４９６号、２０１５年１０月５日、ＤＥＡＤ ＧＵＩＤＥＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＦＡＣＴＯＲＳ；米国特許出願第６２／０９１，４５６号、１４年１２月１２日及び同第６２／１８０，６９２号、２０１５年６月１７日、ＥＳＣＯＲＴＥＤ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬＩＺＥＤ ＧＵＩＤＥＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ；米国特許出願第６２／０９１，４６１号、１４年１２月１２日、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＧＥＮＯＭＥ ＥＤＩＴＩＮＧ ＡＳ ＴＯ ＨＥＭＡＴＯＰＯＥＴＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ （ＨＳＣｓ）；米国特許出願第６２／０９４，９０３号、１４年１２月１９日、ＵＮＢＩＡＳＥＤ ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＯＵＢＬＥ－ＳＴＲＡＮＤ ＢＲＥＡＫＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＩＣ ＲＥＡＲＲＡＮＧＥＭＥＮＴ ＢＹ ＧＥＮＯＭＥ－ＷＩＳＥ ＩＮＳＥＲＴ ＣＡＰＴＵＲＥ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ；米国特許出願第６２／０９６，７６１号、１４年１２月２４日、ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＡＮＤ ＧＵＩＤＥ ＳＣＡＦＦＯＬＤＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ；米国特許出願第６２／０９８，０５９号、１４年１２月３０日、同第６２／１８１，６４１号、２０１５年６月１８日、及び同第６２／１８１，６６７号、２０１５年６月１８日、ＲＮＡ－ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ；米国特許出願第６２／０９６，６５６号、１４年１２月２４日及び同第６２／１８１，１５１号、２０１５年６月１７日、ＣＲＩＳＰＲ ＨＡＶＩＮＧ ＯＲ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＷＩＴＨ ＤＥＳＴＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ ＤＯＭＡＩＮＳ；米国特許出願第６２／０９６，６９７号、１４年１２月２４日、ＣＲＩＳＰＲ ＨＡＶＩＮＧ ＯＲ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＷＩＴＨ ＡＡＶ；米国特許出願第６２／０９８，１５８号、１４年１２月３０日、ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸ ＩＮＳＥＲＴＩＯＮＡＬ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ；米国特許出願第６２／１５１，０５２号、１５年４月２２日、ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＦＯＲ ＥＸＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ ＥＸＯＳＯＭＡＬ ＲＥＰＯＲＴＩＮＧ；米国特許出願第６２／０５４，４９０号、１４年９月２４日、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＰＡＲＴＩＣＬＥ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ；米国特許出願第６１／９３９，１５４号、１４年２月１２日、ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ；米国特許出願第６２／０５５，４８４号、１４年９月２５日、ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ；米国特許出願第６２／０８７，５３７号、１４年１２月４日、ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ；米国特許出願第６２／０５４，６５１号、１４年９月２４日、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ ＯＦ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＡＮＣＥＲ ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＶＩＶＯ；米国特許出願第６２／０６７，８８６号、１４年１０月２３日、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ ＯＦ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＡＮＣＥＲ ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＶＩＶＯ；米国特許出願第６２／０５４，６７５号、１４年９月２４日及び同第６２／１８１，００２号、２０１５年６月１７日、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＩＮ ＮＥＵＲＯＮＡＬ ＣＥＬＬＳ／ＴＩＳＳＵＥＳ；米国特許出願第６２／０５４，５２８号、１４年９月２４日、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＥ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＯＲ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ；米国特許出願第６２／０５５，４５４号、１４年９月２５日、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＣＥＬＬ ＰＥＮＥＴＲＡＴＩＯＮ ＰＥＰＴＩＤＥＳ（ＣＰＰ）；米国特許出願第６２／０５５，４６０号、１４年９月２５日、ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ－ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ ＡＮＤ／ＯＲ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＬＩＮＫＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ－ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ；米国特許出願第６２／０８７，４７５号、１４年１２月４日及び同第６２／１８１，６９０号、２０１５年６月１８日、ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ；米国特許出願第６２／０５５，４８７号、１４年９月２５日、ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ；米国特許出願第６２／０８７，５４６号、１４年１２月４日及び同第６２／１８１，６８７号、２０１５年６月１８日、ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ ＡＮＤ／ＯＲ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＬＩＮＫＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ－ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ；及び米国特許出願第６２／０９８，２８５号、１４年１２月３０日、ＣＲＩＳＰＲ ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＩＮ ＶＩＶＯ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＯＦ ＴＵＭＯＲ ＧＲＯＷＴＨ ＡＮＤ ＭＥＴＡＳＴＡＳＩＳも挙げられる。
米国特許出願第６２／１８１，６５９号、２０１５年６月１８日及び同第６２／２０７，３１８号、２０１５年８月１９日、ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ，ＥＮＺＹＭＥ ＡＮＤ ＧＵＩＤＥ ＳＣＡＦＦＯＬＤＳ ＯＦ ＣＡＳ９ ＯＲＴＨＯＬＯＧＳ ＡＮＤ ＶＡＲＩＡＮＴＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮが挙げられる。米国特許出願第６２／１８１，６６３号、２０１５年６月１８日及び同第６２／２４５，２６４号、２０１５年１０月２２日、ＮＯＶＥＬ ＣＲＩＳＰＲ ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ、米国特許出願第６２／１８１，６７５号、２０１５年６月１８日、同第６２／２８５，３４９号、２０１５年１０月２２日、同第６２／２９６，５２２号、２０１６年２月１７日、及び同第６２／３２０，２３１号、２０１６年４月８日、ＮＯＶＥＬ ＣＲＩＳＰＲ ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ、米国特許出願第６２／２３２，０６７号、２０１５年９月２４日、米国特許出願第１４／９７５，０８５号、２０１５年１０月１８日、欧州出願ＥＰ１６１５０４２８．７号、米国特許出願第６２／２０５，７３３号、２０１５年８月１６日、米国特許出願第６２／２０１，５４２号、２０１５年８月５日、米国特許出願第６２／１９３，５０７号、２０１５年７月１６日、及び米国特許出願第６２／１８１，７３９号、２０１５年６月１８日、各々標題ＮＯＶＥＬ ＣＲＩＳＰＲ ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳが挙げられ、及び米国特許出願第６２／２４５，２７０号、２０１５年１０月２２日、ＮＯＶＥＬ ＣＲＩＳＰＲ ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳが挙げられる。また、米国特許出願第６１／９３９，２５６号、２０１４年２月１２日、及びＷＯ２０１５／０８９４７３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１５２）、２０１４年１０月１２日、各々標題ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＧＵＩＤＥ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＷＩＴＨ ＮＥＷ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴＵＲＥＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮも挙げられる。また、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４５５０４、２０１５年８月１５日、米国特許出願第６２／１８０，６９９号、２０１５年６月１７日、及び米国特許出願第６２／０３８，３５８号、２０１４年８月１７日、各々標題「ＣＡＳ９ニッカーゼを用いたゲノム編集（ＧＥＮＯＭＥ ＥＤＩＴＩＮＧ ＵＳＩＮＧ ＣＡＳ９ ＮＩＣＫＡＳＥＳ）」も挙げられる。
これらの特許、特許公報、及び出願の各々、ならびにそれらの中にまたはそれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）及び出願引用文献において引用または参照される全ての文献は、それらの中で言及されるまたはそれらの中にある任意の文献において言及され及び参照によって本明細書に援用される任意の製品に関する任意の指示書、説明書、製品仕様書、及び製品シートと共に、本明細書によって参照により本明細書に援用され、かつ本発明の実施に用いることができる。全ての文献（例えば、これらの特許、特許公報及び出願ならびに出願引用文献）は、各個別の文献が参照によって援用されることが具体的かつ個別的に示されたものとみなすのと同程度に参照により本明細書に援用される。
細胞状態を調節するＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の使用
ある特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡと複合体化するＣａｓ１３は、標的ＲＮＡに結合する際に活性化され、その後、任意の近くのｓｓＲＮＡ標的を開裂する（すなわち、「副次的」または「バイスタンダー」効果）。同族標的によって一度プライミングされたＣａｓ１３は、他の（非相補的）ＲＮＡ分子を開裂することができる。かかる無差別ＲＮＡ開裂は、細胞毒性を引き起こす可能性があり、またはあるいは、細胞生理学または細胞状態に影響を及ぼす。
従って、ある特定の実施形態では、本明細書に記載される通りの天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、ベクター系、または送達系は、細胞休眠状態の誘導に使用されるかまたは使用されるものである。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される通りの天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、ベクター系、または送達系は、細胞周期停止の誘導に使用されるかまたは使用されるものである。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される通りの天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、ベクター系、または送達系は、細胞成長及び／または細胞増殖の減少に使用されるかまたは使用されるものである。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される通りの天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、ベクター系、または送達系は、細胞アネルギーの誘導に使用されるかまたは使用されるものである。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される通りの天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、ベクター系、または送達系は、細胞アポトーシスの誘導に使用されるかまたは使用されるものである。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される通りの天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、ベクター系、または送達系は、細胞壊死の誘導に使用されるかまたは使用されるものである。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される通りの天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、ベクター系、または送達系は、細胞死の誘導に使用されるかまたは使用されるものである。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される通りの天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、ベクター系、または送達系は、プログラム細胞死の誘導に使用されるかまたは使用されるものである。
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される通りの天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、ベクター系、または送達系を導入または誘導することを含む、細胞休眠状態の誘導方法に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される通りの天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、ベクター系、または送達系を導入または誘導することを含む、細胞周期停止の誘導方法に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される通りの天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、ベクター系、または送達系を導入または誘導することを含む、細胞成長及び／または細胞増殖の減少方法に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される通りの天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、ベクター系、または送達系を導入または誘導することを含む、細胞アネルギーの誘導方法に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される通りの天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、ベクター系、または送達系を導入または誘導することを含む、細胞アポトーシスの誘導方法に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される通りの天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、ベクター系、または送達系を導入または誘導することを含む、細胞壊死の誘導方法に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される通りの天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、ベクター系、または送達系を導入または誘導することを含む、細胞死の誘導方法に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される通りの天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、ベクター系、または送達系を導入または誘導することを含む、プログラム細胞死の誘導方法に関する。
ＰＡＭの決定
ＰＡＭの決定を以下のように確実にすることができる。この実験は、ＳｔＣａｓ９の異種発現に関するＥ．ｃｏｌｉにおける同様の研究（Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９，９２７５－９２８２（２０１１））と極めて類似している。本出願人らは、ＰＡＭ及び抵抗性遺伝子の両方を含有するプラスミドを異種Ｅ．ｃｏｌｉに導入し、次に対応する抗生物質上にプレーティングする。プラスミドのＤＮＡ開裂がある場合、本出願人らは生存コロニーを観察しない。
さらなる詳細において、ＤＮＡ標的に関してアッセイは以下の通りである。このアッセイでは、２つのＥ．ｃｏｌｉ株を使用する。一方は、細菌株由来の内因性エフェクタータンパク質遺伝子座をコードするプラスミドを有する。他方の株は、空のプラスミドを有する（例えば、ｐＡＣＹＣ１８４、対照株）。可能な全ての７または８ｂｐ ＰＡＭ配列を抗生物質耐性プラスミド（アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＵＣ１９）に提供する。ＰＡＭは、プロトスペーサー１（内因性エフェクタータンパク質遺伝子座における第１のスペーサーに対するＤＮＡ標的）の配列の隣りに位置する。２つのＰＡＭライブラリーをクローニングした。一方は、プロトスペーサーの５’側に８ランダムｂｐ（例えば、合計６５５３６個の異なるＰＡＭ配列＝複雑性）を有する。他方のライブラリーは、プロトスペーサーの３’側に７ランダムｂｐを有する（例えば、複雑性の合計は、１６３８４個の異なるＰＡＭである）。両方のライブラリーをクローニングすると、可能性のあるＰＡＭ当たり平均５００個のプラスミドを有することになった。試験株及び対照株に別個の形質転換で５’ＰＡＭ及び３’ＰＡＭライブラリーを形質転換し、形質転換細胞を別々にアンピシリンプレートにプレーティングした。プラスミドによる認識及び続く開裂／干渉によって細胞はアンピシリンに対して脆弱になり、成長が妨げられる。形質転換の約１２時間後、試験株及び対照株によって形成された全てのコロニーを回収し、プラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドＤＮＡを鋳型として使用してＰＣＲ増幅し、続いてディープシーケンシングを行った。非形質転換ライブラリー中の全てのＰＡＭの表現が、形質転換細胞におけるＰＡＭの予想される表現を示した。対照株に見られる全てのＰＡＭの表現が、実際の表現を示した。試験株における全てのＰＡＭの表現が、どのＰＡＭが酵素によって認識されないかを示したとともに、対照株との比較により、枯渇したＰＡＭの配列を抽出することが可能である。
以下のＰＡＭは、ある特定の野生型Ｃａｓ１３オルソログに対して同定されており：Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃａｓ１３（ＡｓＣａｓ１３）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃａｓ１３（ＬｂＣａｓ１３）及びＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ（ＰａＣａｓ１３）は、ＴＴＴＶ ＰＡＭにより先行される標的部位を開裂することができ、ここで、Ｖは、Ａ／ＣまたはＧであり、ＦｎＣａｓ１３ｐは、ＴＴＮにより先行される部位を開裂することができ、ここで、Ｎは、Ａ／Ｃ／ＧまたはＴである。Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ＡＡＸ０８＿００２０５、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ＡＡＸ１１＿００２０５、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＮＣ３００５、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．ＸＳ５、またはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０ ＰＡＭは、５’ＴＴＮであり、ここで、Ｎは、Ａ／Ｃ／ＧまたはＴである。天然ＰＡＭ配列は、ＴＴＴＶまたはＢＴＴＶであり、ここで、Ｂは、Ｔ／ＣまたはＧであり、Ｖは、Ａ／ＣまたはＧであり、エフェクタータンパク質は、モＭｏｒａｘｅｌｌａ ｌａｃｕｎａｔａ Ｃａｓ１３である。
コドン最適化された核酸配列
エフェクタータンパク質が、核酸として投与される場合、適用は、コドン最適化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｖ型タンパク質、より詳細には、Ｃａｓ１３コード核酸配列（及び任意選択で、タンパク質配列）の使用を想定する。コドン最適化された配列の例は、この場合、真核生物、例えば、ヒトでの発現に最適化されるか（すなわち、ヒトでの発現に最適化されている）、または別の本明細書で考察される通りの真核生物、動物もしくは哺乳類に最適化された配列である；例えば、コドン最適化配列の例として、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照されたい（当該技術分野及び本開示における知識から、特にエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３）に関して、コード核酸分子（複数可）のコドン最適化は、当業者の範囲内にある）。これが好ましいが、他の例が可能であることが理解され、ヒト以外の宿主種に対するコドン最適化、または特定の器官に対するコドン最適化が公知である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ／ＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質をコードする酵素コード配列が、特定の細胞、例えば、真核細胞での発現にコドン最適化される。真核細胞は、特定の生物、例えば、植物または限定はされないがヒトを含めた哺乳類、あるいは本明細書で考察される通りの非ヒト真核生物または動物または哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、または非ヒト哺乳類もしくは霊長類のものであるか、またはそれに由来し得る。いくつかの実施形態では、ヒトまたは動物に対するいかなる実質的な医学的利益もなくそれらに苦痛を生じさせる可能性のあるヒトの生殖細胞系列遺伝子アイデンティティの改変方法及び／または動物の遺伝子アイデンティティの改変方法、さらにかかる方法から得られる動物は除外され得る。一般に、コドン最適化とは、天然配列のうちの少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個以上、またはこれらのおよその数より多いコドン）を、天然のアミノ酸配列を維持しつつ、当該の宿主細胞の遺伝子においてより高頻度でまたは最も高頻度で使用されるコドンに置き換えることにより、目的の宿主細胞における発現を増強するための核酸配列の改変方法を指す。様々な種が、特定のアミノ酸のあるコドンについて特定のバイアスを呈する。コドンバイアス（生物間でのコドン使用の違い）は、多くの場合にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、次にはそれが、数ある中でも特に、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択のｔＲＮＡが優勢であることは、概して、ペプチド合成で最も高頻度に使用されるコドンを反映するものである。従って、コドン最適化に基づき所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせて遺伝子を調整することができる。コドン使用表が、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な「コドン使用データベース（Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）」で容易に利用可能であり、これらの表をいくつもの方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の配列を特定の宿主細胞における発現にコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムもまた利用可能であり、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）などもまた利用可能である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ／ＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質をコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０以上、または全てのコドン）が、特定のアミノ酸について最も高頻度に使用されるコドンに対応する。酵母におけるコドン使用に関しては、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／ｃｏｄｏｎ＿ｕｓａｇｅ．ｓｈｔｍｌで利用可能なオンライン酵母ゲノムデータベース、またはＣｏｄｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ，Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８２ Ｍａｒ ２５；２５７（６）：３０２６－３１が参照される。藻類を含めた植物におけるコドン使用に関しては、Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ，ｇｒｅｅｎ ａｌｇａｅ，ａｎｄ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｗｒｉ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９０ Ｊａｎ；９２（１）：１－１１；ならびにＣｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｓ，Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８９ Ｊａｎ ２５；１７（２）：４７７－９８；またはＳｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｄｏｎ ｂｉａｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ａｎｄ ｃｙａｎｅｌｌｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｎｔ ａｎｄ ａｌｇａｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ，Ｍｏｒｔｏｎ ＢＲ，Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ．１９９８ Ａｐｒ；４６（４）：４４９－５９が参照される。
ある特定の例示の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、表１から選択される。
Figure 2023134462000005
ある特定の例示の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、表２から選択されるＣａｓ１３ａタンパク質である。
Figure 2023134462000006
Figure 2023134462000007
ある特定の例示の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、表３から選択されるＣａｓ１３ｂタンパク質である。
Figure 2023134462000008
Figure 2023134462000009
Figure 2023134462000010
Figure 2023134462000011
ある特定の例示の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、表４からのＣａｓ１３ｃタンパク質である。
Figure 2023134462000012
他のＤＮＡ結合タンパク質
ある特定の例示の実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）であり得る。本発明の文脈における使用に適当なＴＡＬＥの例としては、限定はされないが、米国特許出願第２０１２／０２７０２７３号及びＷＯ／２０１３／０８２５１９に記載されるものが挙げられる。
送達
いくつかの実施形態では、ＡＤ官能基化系の成分は、ＤＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＲＮＡの組み合わせまたはタンパク質ＲＮＡなど、様々な形態で送達し得る。例えば、Ｃａｓ１３タンパク質は、ＤＮＡコードポリヌクレオチドもしくはＲＮＡコードポリヌクレオチドとして、またはタンパク質として送達してもよい。ガイドは、ＤＮＡコードポリヌクレオチドまたはＲＮＡとして送達してもよい。混合型の送達を含め、可能なあらゆる組み合わせが想定される。
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載される通りの１つ以上のベクター、１つ以上のその転写物、及び／またはそれから転写された１つ以上のタンパク質などの１つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。
ベクター
一般に、用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。これは、別のＤＮＡセグメントが挿入されて挿入セグメントの複製をもたらし得るレプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミドである。概して、ベクターは、適切な制御エレメントと会合している場合に複製することができる。ベクターとしては、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、または部分的二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端のない（例えば、環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方を含む核酸分子；及び当該技術分野において公知の他の種類のポリヌクレオチドが挙げられる。ある種のベクターは、「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加のＤＮＡセグメントを挿入することのできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、ベクターには、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）へのパッケージングのためのウイルス由来ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって担持されるポリヌクレオチドも含む。ある特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。真核細胞における発現用の、及びそこでの発現をもたらすベクターは、本明細書では、「真核細胞発現ベクター」と称することができる。組換えＤＮＡ技術において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含むことができ、これはつまり、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメント（これは、発現に用いられる宿主細胞に基づき選択されてもよい）を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内において、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における、またはベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における）発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が調節エレメント（複数可）に連結されていることを意味するように意図される。有利なベクターとしては、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスが挙げられ、かかるベクターのタイプもまた、特定のタイプの細胞を標的化するように選択することができる。
組換え及びクローニング方法に関しては、２００４年９月２日にＵＳ２００４－０１７１１５６ Ａ１として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号（この内容は、本明細書において全体として参照により援用される）が挙げられる。
用語「調節エレメント」には、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列などの転写終止シグナル）が含まれることが意図される。かかる調節エレメントについては、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載される。調節エレメントには、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主として、所望の目的組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、または特定の細胞型（例えば、リンパ球）において発現を導き得る。調節エレメントはまた、細胞周期依存的または発生段階依存的様式など、時間依存的様式で発現を導いてもよく、この発現もまた組織または細胞型特異的であることもまたはそうでないこともある。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、またはそれより多いｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、またはそれより多いｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、またはそれより多いｐｏｌ Ｉプロモーター）、またはこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、Ｕ６及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーと共に）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーと共に）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、用語「調節エレメント」には、ＷＰＲＥなどのエンハンサーエレメント；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ－ＩのＬＴＲにおけるＲ－Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６－４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ－グロビンのエクソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７－３１，１９８１）も包含される。当業者によれば、発現ベクターの設計が、形質転換する宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの要因に依存し得ることが理解されるであろう。ベクターは、宿主細胞に導入することができ、それにより、本明細書に記載される通りの核酸によってコードされる転写物、タンパク質、またはペプチドが、融合タンパク質またはペプチド（例えば、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異型、それらの融合タンパク質など）を含め、産生され得る。調節配列に関しては、米国特許出願第１０／４９１，０２６号（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。プロモーターに関しては、ＷＯ２０１１／０２８９２９及び米国特許出願第１２／５１１，９４０号（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。
有利なベクターとしては、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスが挙げられ、かかるベクターのタイプもまた、特定のタイプの細胞を標的化するように選択することができる。
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ及びアデノシンデアミナーゼに融合した（任意選択で改変または突然変異）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質用のバイシストロニックベクターを使用する。ガイドＲＮＡ及びアデノシンデアミナーゼに融合した（任意選択で改変または突然変異）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質用のバイシストロニック発現ベクターが好ましい。概して、及び特に、この実施形態ではアデノシンデアミナーゼに融合した（任意選択で改変または突然変異）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、好ましくはＣＢｈプロモーターによってドライブされる。ＲＮＡは、好ましくはＵ６プロモーターなどのＰｏｌ ＩＩＩプロモーターによってドライブされ得る。理想的にはこの２つが組み合わされる。
ベクターは、原核細胞または真核細胞でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、または酵素）の発現用に設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、または哺乳類細胞で発現させることができる。好適な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に詳しく考察されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写及び翻訳されてもよい。
ベクターは、原核生物または原核細胞に導入して増殖させてもよい。いくつかの実施形態では、真核細胞に導入するベクターのコピーを増幅させるため、または真核細胞に導入するベクターの産生における中間ベクターとして（例えば、ウイルスベクターパッケージング系の一部としてプラスミドを増幅する）、原核生物が使用される。いくつかの実施形態では、原核生物を用いてベクターのコピーを増幅し、１つ以上の核酸を発現させて、それにより例えば、宿主細胞または宿主生物に送達するための１つ以上のタンパク質の供給源を提供する。原核生物でのタンパク質の発現は、多くの場合に、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を導く構成的プロモーターまたは誘導プロモーターを含むベクターを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで行われる。融合ベクターが、そこでコードされるタンパク質、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端にいくつものアミノ酸を付加する。かかる融合ベクターは、（ｉ）組換えタンパク質の発現の増加；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度の増加；及び（ｉｉｉ）親和性精製でリガンドとして作用することによる組換えタンパク質の精製の促進など、１つ以上の目的を果たし得る。多くの場合に、融合発現ベクターでは、融合タンパク質の精製後に組換えタンパク質を融合部分と分離することができるように、融合部分と組換えタンパク質との接合部にタンパク質分解開裂部位が導入される。かかる酵素及びその同族認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼが含まれる。融合発現ベクターの例としては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１－４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらはそれぞれ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる。好適な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０－８９）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現用のベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９－２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３－９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３－１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞でのタンパク質発現をドライブする。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６－２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１－３９）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞での１つ以上の配列の発現をドライブする能力を有する。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７－１９５）が挙げられる。哺乳類細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、典型的には１つ以上の調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、ならびに本明細書に開示される及び当該技術分野において公知の他のウイルスに由来する。原核細胞及び真核細胞の両方に好適な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９のＣｈａｐｔｅｒｓ １６及び１７を参照されたい。
いくつかの実施形態では、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸の発現を導くことが可能である（例えば、組織特異的調節エレメントが核酸の発現に使用される）。組織特異的調節エレメントは、当該技術分野において公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５）、詳細にはＴ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３）及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９－７４０；Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１－７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３－５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６）、及び乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号、及び欧州特許出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４－３７９）及びαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７－５４６）もまた包含される。これらの原核生物及び真核生物ベクターに関しては、米国特許第６，７５０，０５９号（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。本発明の他の実施形態は、ウイルスベクターの使用に関してもよく、それについては、米国特許出願第１３／０９２，０８５号（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。組織特異的調節エレメントは、当該技術分野において公知であり、この点で、米国特許第７，７７６，３２１号（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現をドライブするため、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに調節エレメントが作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントの発現をドライブする１つ以上のベクターが宿主細胞に導入され、核酸ターゲティング系のエレメントが発現すると、１つ以上の標的部位において核酸ターゲティング複合体の形成が導かれる。例えば、核酸ターゲティングエフェクター酵素及び核酸ターゲティングガイドＲＮＡが、各々別個のベクター上で別個の調節エレメントに作動可能に連結されてもよい。核酸ターゲティング系のＲＮＡ（複数可）は、トランスジェニック核酸ターゲティングエフェクタータンパク質動物または哺乳類、例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を構成的にもしくは誘導性にもしくは条件的に発現する動物もしくは哺乳類；または本来核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を発現しているかもしくは核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含有する細胞を有する動物もしくは哺乳類へと、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質をインビボでコードし及び発現する１つ以上のベクターをそれに事前投与するなどして送達することができる。あるいは、同じまたは異なる調節エレメントから発現するエレメントのうちの２つ以上が単一のベクターに組み合わされてもよく、１つ以上の追加のベクターが、第１のベクターに含まれない核酸ターゲティング系の任意の成分を提供する。単一のベクターに組み合わされる核酸ターゲティング系エレメントは、あるエレメントが第２のエレメントに対して５’側（その「上流」）に位置し、またはそれに対して３’側（その「下流」）に位置するなど、任意の好適な向きで配置されてもよい。あるエレメントのコード配列は、第２のエレメントのコード配列と同じ鎖上または逆鎖上に位置してもよく、同じまたは逆の方向に向いていてもよい。いくつかの実施形態では、単一のプロモーターが、１つ以上のイントロン配列内に組み込まれた（例えば、各々が異なるイントロンにあるか、２つ以上が少なくとも１つのイントロンにあるか、または全てが単一のイントロンにある）、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質及び核酸ターゲティングガイドＲＮＡをコードする転写物の発現をドライブする。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と核酸ターゲティングガイドＲＮＡとは、同じプロモーターに作動可能に連結されていて、そこから発現してもよい。核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントを発現させるための送達媒体、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤及びその成分については、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）など、前述の文献で使用されている通りである。いくつかの実施形態では、ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列などの１つ以上の挿入部位（「クローニング部位」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入部位（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、またはこれらのおよその数より多い挿入部位）は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流及び／または下流に位置する。複数の異なるガイド配列を使用すると、単一の発現構築物を用いて細胞内の複数の異なる対応する標的配列へと核酸ターゲティング活性を標的化させることができる。例えば、単一のベクターが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個以上、またはこれらのおよその数より多いガイド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、またはこれらのおよその数より多いかかるガイド配列含有ベクターが提供され、及び任意選択で細胞に送達されてもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含む。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質または１つ以上の核酸ターゲティングガイドＲＮＡは、別個に送達してもよく；及び有利には、これらのうちの少なくとも１つが、粒子複合体によって送達される。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質に発現する時間を与えるため、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡを核酸ターゲティングガイドＲＮＡより先に送達してもよい。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡは、核酸ターゲティングガイドＲＮＡの投与の１～１２時間前（好ましくは、約２～６時間前）に投与されてもよい。あるいは、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及び核酸ターゲティングガイドＲＮＡは、一緒に投与されてもよい。有利には、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの初回投与から１～１２時間後（好ましくは約２～６時間後）にガイドＲＮＡの第２のブースター用量が投与されてもよい。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及び／またはガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率的なゲノム改変レベルを達成するのに有用であり得る。
哺乳類細胞または標的組織における核酸の導入には、従来のウイルスベース及び非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いることができる。かかる方法を用いて、核酸ターゲティング系の成分をコードする核酸を培養下の細胞に、または宿主生物中の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されるベクターの転写物）、ネイキッド核酸、及び送達媒体と複合体を形成した核酸、例えば、リポソームが含まれる。ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれ、これは、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込みゲノムのいずれかを有する。遺伝子療法手順のレビューに関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１－２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２－１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７－１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５－４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９－１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５－３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１－４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３－２６（１９９４）を参照されたい。
核酸の非ウイルス送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤で促進するＤＮＡ取込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号；及び同第４，８９７，３５５号に記載され）、ならびにリポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性及び中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４；ＷＯ９１／１６０２４のものが含まれる。送達は、細胞に対してであってもよく（例えば、インビトロまたはエキソビボ投与）、または標的組織に対してであってもよい（例えば、インビボ投与）。
プラスミド送達は、ガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質発現プラスミドへのクローニングすること、及び細胞培養中でＤＮＡをトランスフェクトすることを伴う。プラスミド骨格は市販されており、特定機器は必要としない。プラスミド骨格は、異なるサイズのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓコード配列（より大きなサイズのタンパク質をコードするものを含む）ならびに選択マーカーを運ぶことができるモジュラーである利点を有する。プラスミドの両方の利点は、一過性であるが、持続的な発現を確実にすることである。しかしながら、プラスミドの送達は、簡単ではないため、インビボ効率が低いことが多い。持続発現は、オフターゲット編集を増やし得るという点で不利でもあり得る。加えて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の過剰な蓄積は、細胞に毒性であり得る。最後に、プラスミドは、より詳細には、二本鎖開裂（オン及びオフターゲット）が生成されることを考慮して、宿主ゲノム中のｄｓＤＮＡのランダムインテグレーションのリスクを常に抱える。
脂質：核酸複合体の調製は、免疫脂質複合体などの標的リポソームを含め、当業者に周知されている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４－４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１－２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２－３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７－６５４（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７－４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、及び同第４，９４６，７８７号を参照されたい）。これを以下でより詳細に記載する。
ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系を使用した核酸の送達では、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化して、ウイルスペイロードを核に輸送する高度に進化したプロセスが利用される。ウイルスベクターは、患者に直接投与してもよく（インビボ）、またはインビトロでの細胞の処理に使用してもよく、任意選択でその改変細胞が患者に投与され得る（エキソビボ）。従来のウイルスベースの系は、遺伝子導入用にレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴及び単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法では宿主ゲノムにおける組み込みが可能であり、多くの場合に、挿入されたトランス遺伝子の長期発現がもたらされる。加えて、多くの異なる細胞型及び標的組織で高い形質導入効率が観察されている。
レトロウイルスの向性は、外来性エンベロープタンパク質の取込みによって変えることができ、標的細胞の潜在的標的集団が拡大し得る。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入し、または感染させ、かつ典型的には高いウイルス価を生じさせることが可能なレトロウイルスベクターである。従って、レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存し得る。レトロウイルスベクターは、６～１０ｋｂまでの外来配列のパッケージング能力を有するシス作用性長末端反復配列で構成される。ベクターの複製及びパッケージングには、最小のシス作用性ＬＴＲが十分であり、次にはこれを用いて治療遺伝子を標的細胞に組み込むと、永続的なトランス遺伝子発現がもたらされる。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びそれらの組み合わせをベースとするものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。
一過的発現が好ましい適用には、アデノウイルスベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型で極めて高い形質導入効率を示すことができ、細胞分裂が不要である。このようなベクターで、高い力価及び発現レベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、例えば、核酸及びペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボ及びエキソビボ遺伝子療法手順のため、標的核酸による細胞の形質導入に使用することができる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたい。組換えＡＡＶベクターの構築は、多数の刊行物、例として、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）に記載されている。
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系をコードする外来性核酸分子、例えば、プロモーターと、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（推定ヌクレアーゼまたはヘリカーゼタンパク質）、例えば、Ｃａｓ１３をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含むもしくはそれから本質的になる第１のカセット、及びプロモーターと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含むもしくはそれから本質的になる１つ以上の、有利にはベクターのパッケージングサイズ限界に至るまでの、例えば、合計で（第１のカセットを含めて）５つのカセット（例えば、各カセットは概略的に、プロモーター－ｇＲＮＡ１－ターミネーター、プロモーター－ｇＲＮＡ２－ターミネーター．．．プロモーター－ｇＲＮＡ（Ｎ）－ターミネーター（式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界の上限である挿入可能な数である）と表される）を含むもしくはそれからなる複数のカセットを含むもしくはそれから本質的になるＡＡＶ、または２つ以上の個々のｒＡＡＶであって、各々がＣＲＩＳＰＲ系の１つもしくは２つ以上のカセットを含み、例えば、第１のｒＡＡＶが、プロモーターと、Ｃａｓ、例えば、Ｃａｓ（Ｃａｓ１３）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含むもしくはそれから本質的になる第１のカセットを含み、及び第２のｒＡＡＶが、プロモーターと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含むもしくはそれから本質的になる１つ以上のカセット（例えば、各カセットは概略的に、プロモーター－ｇＲＮＡ１－ターミネーター、プロモーター－ｇＲＮＡ２－ターミネーター．．．プロモーター－ｇＲＮＡ（Ｎ）－ターミネーター（式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界の上限である挿入可能な数である）と表される）を含むｒＡＡＶを提供する。あるいは、Ｃａｓ１３は、それ自体のｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡを有し得るため、単一ｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡアレイ多重遺伝子編集に使用することができる。従って、ｇＲＮＡを送達するための多数のカセットを含む代わりに、ｒＡＡＶは、プロモーターと、複数のｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡと、ターミネーターとを含むまたはそれから本質的になる単一のカセットを含み（例えば、概略的に、プロモーター－ｇＲＮＡ１－ｇＲＮＡ２ …ｇＲＮＡ（Ｎ）－ターミネーター（式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界の上限である挿入可能な数である）と表される）を含み得る。Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３５，３１－３４（２０１７）（その全体を参照により本明細書に組み込む）を参照されたい。ｒＡＡＶはＤＮＡウイルスであるため、ＡＡＶまたはｒＡＡＶに関する本明細書の考察における核酸分子は、有利にはＤＮＡである。プロモーターは、いくつかの実施形態では、有利にはヒトシナプシンＩプロモーター（ｈＳｙｎ）である。核酸を細胞に送達するさらなる方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられるＵＳ２００３００８７８１７を参照されたい。
別の実施形態では、コーカル（Ｃｏｃａｌ）ベシクロウイルスエンベロープ偽型レトロウイルスベクター粒子が企図される（例えば、フレッド・ハッチンソンがん研究センター（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）に譲渡された米国特許出願公開第２０１２０１６４１１８号を参照されたい）。コーカルウイルスは、Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓであり、哺乳類における水疱性口内炎の原因病原体である。コーカルウイルスは、当初はトリニダードでダニから分離されたもので（Ｊｏｎｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２５：２３６－２４２（１９６４））、トリニダード、ブラジル、及びアルゼンチンで昆虫、ウシ、及びウマから感染が同定されている。哺乳類に感染するベシクロウイルスの多くは、自然感染した節足動物から分離されており、それがベクター媒介性であることが示唆される。ベシクロウイルスに対する抗体は、農村地域に住む人々によく見られ、そこではこのウイルスが地方病性であり、実験室内感染性である；ヒトにおける感染は、通常はインフルエンザ様症状をもたらす。コーカルウイルスエンベロープ糖タンパク質は、アミノ酸レベルでＶＳＶ－Ｇインディアナと７１．５％の同一性を共有し、ベシクロウイルスのエンベロープ遺伝子の系統発生学的比較では、ベシクロウイルスの中でコーカルウイルスが、ＶＳＶ－Ｇインディアナ株と血清学的には異なるものの最も近縁であることが示される。Ｊｏｎｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２５：２３６－２４２（１９６４）及びＴｒａｖａｓｓｏｓ ｄａ Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄ．＆ Ｈｙｇｉｅｎｅ ３３：９９９－１００６（１９８４）。コーカルベシクロウイルスエンベロープ偽型レトロウイルスベクター粒子には、例えば、レトロウイルスのＧａｇ、Ｐｏｌ、及び／または１つ以上のアクセサリータンパク質（複数可）ならびにコーカルベシクロウイルスエンベロープタンパク質を含み得るレンチウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、及びイプシロンレトロウイルスベクター粒子が含まれ得る。これらの実施形態の特定の態様の範囲内において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びアクセサリータンパク質は、レンチウイルス及び／またはガンマレトロウイルスのものである。
いくつかの実施形態では、宿主細胞が、本明細書に記載の１つ以上のベクターによって一過性にまたは非一過性にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、細胞は、それが、任意選択で再導入される対象において、天然に存在する通りにトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされる細胞は、対象から採取される。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞株など、対象から採取された細胞に由来する。組織培養向けの広範な細胞株が、当該技術分野において公知である。細胞株の例としては、限定はされないが、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ－３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ－Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ－３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ－２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ－７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ－ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ－Ｋ２、ＷＥＨＩ－２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、ジャーカット、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ－１、ＢＣ－３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ－５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－６、ＣＯＳ－Ｍ６Ａ、ＢＳ－Ｃ－１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３スイス、３Ｔ３－Ｌ１、１３２－ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３－Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ－５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ－１細胞、ＢＥＡＳ－２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ－２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ－２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ－７、ＣＨＯ－ＩＲ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｋ２、ＣＨＯ－Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ－／－、ＣＯＲ－Ｌ２３、ＣＯＲ－Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ－Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ－Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ－７、ＣＯＶ－４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ－２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ－６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ－２９、ジャーカット、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ－Ｍｅｌ１－４８、ＭＣ－３８、ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－１０Ａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ－ＭＡＣ６、ＭＴＤ－１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＮＡＬＭ－１、ＮＷ－１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ－１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ－５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｓｆ－９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ－４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、ベロ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ－４９、Ｘ６３、ＹＡＣ－１、ＹＡＲ、及びそれらのトランスジェニック変種が挙げられる。細胞株は、当業者に公知の種々の供給元から入手可能である（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）を参照されたい）。
ある特定の実施形態では、系の成分の１つ以上の一過性発現及び／または存在は、例えば、オフターゲット効果の低減などの対象であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のベクターによってトランスフェクトされた細胞を使用して、１つ以上のベクター由来配列を含む新規の細胞株が樹立される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される系の成分によって一過性にトランスフェクトされ（例えば、１つ以上のベクターの一過性のトランスフェクション、またはＲＮＡによるトランスフェクションによる）、かつＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を通して改変された細胞を使用して、改変を含むものの他のあらゆる外因性配列を欠く細胞を含む新規の細胞株が樹立される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のベクターによって一過性にもしくは非一過性にトランスフェクトされた細胞、またはかかる細胞に由来する細胞株が、１つ以上の試験化合物の評価において使用される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／またはタンパク質を宿主細胞に直接導入することが想定される。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、ｍＲＮＡをコードするものとして、インビトロ転写されたガイドＲＮＡと一緒に送達することができる。かかる方法は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の効果を確実にするまでの時間を減らし、ＣＲＩＳＰＲ系成分の長期発現をさらに防止することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、リポソーム製剤またはリポフェクチン製剤などで送達され、当業者に周知の方法によって調製され得る。かかる方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号及び同第５，５８０，８５９号（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。特に哺乳類細胞へのｓｉＲＮＡの送達の増強及び改良を目的とした送達系が開発されており（例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．２００３，５３９：１１１－１１４；Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０：１００６－１０１０；Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ．２００３，９：２１０－２１６；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３，３２７：７６１－７６６；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２，３２：１０７－１０８及びＳｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２００３，３１，１１：２７１７－２７２４を参照されたい）、本発明に適用し得る。ｓｉＲＮＡは近年、霊長類において遺伝子発現を抑制するための使用が成功している（例えば、Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ ２４（４）：６６０を参照されたく、これもまた本発明に適用することができる）。
実際、ＲＮＡ送達は、インビボ送達の有用な方法である。リポソームまたはナノ粒子を用いてＣａｓ１３、アデノシンデアミナーゼ、及びガイドＲＮＡを細胞内に送達することが可能である。従って、Ｃａｓ１３などのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の送達、アデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアダプタータンパク質に融合され得る）の送達、及び／または本発明のＲＮＡの送達は、ＲＮＡ形態で、微小胞、リポソームまたは１つ以上の粒子を介することができる。例えば、Ｃａｓ１３ ｍＲＮＡ、アデノシンデアミナーゼｍＲＮＡ、及びガイドＲＮＡをインビボ送達用にリポソーム粒子にパッケージングすることができる。リポソームトランスフェクション試薬、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのリポフェクタミン及び市販の他の試薬は、ＲＮＡ分子を肝臓に効果的に送達することができる。
同様に好ましいＲＮＡの送達手段としてはまた、ＲＮＡの粒子による送達（Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｏｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｅｉ，Ｙ．，Ｂｏｇａｔｙｒｅｖ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９：３１１２－３１１８，２０１０）またはエキソソームによる送達（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｔｅｚ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６７：９－２１，２０１０，ＰＭＩＤ：２００５９６４１）も挙げられる。実際、エキソソームは、ＣＲＩＳＰＲ系とある程度の類似性を有する系であるｓｉＲＮＡの送達に特に有用であることが示されている。例えば、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（“Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ”Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２ Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２－２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ １５）は、エキソソームがいかに種々の生物学的障壁を越えた薬物送達に有望なツールであるか、ならびにｓｉＲＮＡのインビトロ及びインビボ送達に利用できるかを記載している。彼らの手法は、発現ベクターのトランスフェクションにより、ペプチドリガンドに融合したエキソソームタンパク質を含む標的エキソソームを作成するものである。次に、トランスフェクト細胞上清からエキソソームが精製され、特徴付けられた後、ＲＮＡがエキソソームにロードされる。本発明に係る送達または投与は、エキソソームを用いて、詳細には、限定はされないが脳に対して行うことができる。ビタミンＥ（α－トコフェロール）をＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓにコンジュゲートさせて、例えば、Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：７１１－７１９（Ｊｕｎｅ ２０１１））によって行われた脳への低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達と同じように、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と共に脳に送達することができる。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはフリーＴｏｃｓｉＢＡＣＥもしくはＴｏｃ－ｓｉＢＡＣＥ／ＨＤＬが充填されかつＢｒａｉｎ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ ３（Ａｌｚｅｔ）に接続された浸透圧ミニポンプ（モデル１００７Ｄ；Ａｌｚｅｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）でマウスが注入された。背側第三脳室内への注入のため、正中線上でブレグマから約０．５ｍｍ後方に脳注入カニューレが留置された。Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．は、ＨＤＬを含む僅か３ｎｍｏｌのＴｏｃ－ｓｉＲＮＡが、同じＩＣＶ注入法による同程度の標的の減少を誘導可能であったことを見出した。脳を標的としてＨＤＬと共投与される、α－トコフェロールにコンジュゲートされた同様の投薬量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを本発明においてヒトで企図することができ、例えば、脳を標的とする約３ｎｍｏｌ～約３μｍｏｌのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを企図し得る。Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：４６５－４７５（Ａｐｒｉｌ ２０１１））は、ラットの脊髄におけるインビボでの遺伝子サイレンシングのためのＰＫＣγを標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡのレンチウイルス媒介送達方法を記載している。Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．は、１×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有する約１０μｌの組換えレンチウイルスをくも膜下カテーテルによって投与した。脳を標的とするレンチウイルスベクターにおいて発現する同様の投薬量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを本発明においてヒトに企図することができ、例えば、１×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有するレンチウイルスにおける脳を標的とする約１０～５０ｍｌのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを企図し得る。
ベクターの投薬量
いくつかの実施形態では、ベクター、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターは、例えば、筋肉注射によって目的の組織に送達されるが、一方で送達は、静脈内、経皮、鼻腔内、口腔、粘膜、または他の送達方法によることもある。かかる送達は、単回投与によっても、または複数回投与によってもよい。当業者は、本明細書で送達される実際の投薬量が、ベクターの選択、標的細胞、生物、または組織、治療する対象の全身状態、求められる形質転換／改変の程度、投与経路、投与様式、求められる形質転換／改変の種類など、種々の要因に応じて大きく異なり得ることを理解する。
かかる用量は、例えば、担体（水、生理食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油など）、希釈剤、薬学的に許容可能な担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、薬学的に許容可能な賦形剤、及び／または当該技術分野で公知の他の化合物をさらに含み得る。投薬量は、１つ以上の薬学的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩をさらに含み得る。加えて、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ゲルまたはゲル化物質、香料、着色剤、ミクロスフェア、ポリマー、懸濁剤などの補助物質もまたこの中に存在し得る。加えて、１つ以上の他の従来の医薬成分、例えば、防腐剤、湿潤剤、懸濁剤、界面活性剤、酸化防止剤、固化防止剤、充填剤、キレート化剤、コーティング剤、化学安定剤などもまた、特に、投薬形態が再構成可能な形態である場合に存在し得る。好適な例示的成分として、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容可能な賦形剤の徹底的な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）（参照により本明細書に援用される）において利用可能である。
本明細書のある実施形態では、送達は、アデノウイルスを介し、これは、少なくとも１×１０５粒子（粒子単位、ｐｕとも称される）のアデノウイルスベクターを含有する単回ブースター用量であり得る。本明細書のある実施形態では、用量は、好ましくは、少なくとも約１×１０６粒子（例えば、約１×１０６～１×１０１２粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０７粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０８粒子（例えば、約１×１０８～１×１０１１粒子または約１×１０８～１×１０１２粒子）、及び最も好ましくは少なくとも約１×１００粒子（例えば、約１×１０９～１×１０１０粒子または約１×１０９～１×１０１２粒子）、またはさらには少なくとも約１×１０１０粒子（例えば、約１×１０１０～１×１０１２粒子）のアデノウイルスベクターである。あるいは、用量は、約１×１０１４粒子以下、好ましくは約１×１０１３粒子以下、さらにより好ましくは約１×１０１２粒子以下、さらにより好ましくは約１×１０１１粒子以下、及び最も好ましくは約１×１０１０粒子以下（例えば、約１×１０９粒子（ａｒｔｉｃｌｅｓ）以下）を含む。従って、用量は、例えば、約１×１０６粒子単位（ｐｕ）、約２×１０６ｐｕ、約４×１０６ｐｕ、約１×１０７ｐｕ、約２×１０７ｐｕ、約４×１０７ｐｕ、約１×１０８ｐｕ、約２×１０８ｐｕ、約４×１０８ｐｕ、約１×１０９ｐｕ、約２×１０９ｐｕ、約４×１０９ｐｕ、約１×１０１０ｐｕ、約２×１０１０ｐｕ、約４×１０１０ｐｕ、約１×１０１１ｐｕ、約２×１０１１ｐｕ、約４×１０１１ｐｕ、約１×１０１２ｐｕ、約２×１０１２ｐｕ、または約４×１０１２ｐｕのアデノウイルスベクターを含む単回用量のアデノウイルスベクターを含有し得る。例えば、２０１３年６月４日に付与されたＮａｂｅｌ，ｅｔ．ａｌ．に対する米国特許第８，４５４，９７２ Ｂ２号（参照によって本明細書に援用される）のアデノウイルスベクター、及びその第２９欄第３６～５８行にある投薬量を参照されたい。本明細書のある実施形態では、アデノウイルスは、複数回用量で送達される。
本明細書のある実施形態では、送達は、ＡＡＶを介する。ヒトに対するＡＡＶのインビボ送達についての治療上有効な投薬量は、約１×１０１０～約１×１０１０の機能性ＡＡＶ／ｍｌ溶液を含有する約２０～約５０ｍｌの生理食塩水の範囲であると考えられる。投薬量は、治療利益と任意の副作用との均衡がとれるように調整され得る。本明細書のある実施形態では、ＡＡＶ用量は、概して、約１×１０５～１×１０５０ゲノムＡＡＶ、約１×１０８～１×１０２０ゲノムＡＡＶ、約１×１０１０～約１×１０１６ゲノム、または約１×１０１１～約１×１０１６ゲノムＡＡＶの濃度範囲である。ヒト投薬量は、約１×１０１３ゲノムＡＡＶであってもよい。かかる濃度は、約０．００１ｍｌ～約１００ｍｌ、約０．０５～約５０ｍｌ、または約１０～約２５ｍｌの担体溶液で送達し得る。他の効果的な投薬量が、当業者により、用量反応曲線を作成するルーチンの試験を用いて容易に確立され得る。例えば、２０１３年３月２６日に付与されたＨａｊｊａｒ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第８，４０４，６５８ Ｂ２号、第２７欄、第４５～６０行を参照されたい。
本明細書のある実施形態では、送達は、プラスミドを介する。かかるプラスミド組成物では、投薬量は、反応を誘発するのに十分な量のプラスミドでなければならない。例えば、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの好適な分量は、個体７０ｋｇ当たり約０．１～約２ｍｇ、または約１μｇ～約１０μｇであり得る。本発明のプラスミドは、概して、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）前記プロモーターに作動可能に連結された、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードする配列；（ｉｉｉ）選択可能マーカー；（ｉｖ）複製起点；及び（ｖ）（ｉｉ）の下流で（ｉｉ）に作動可能に連結された転写ターミネーターを含み得る。プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＲＮＡ成分もコードし得るが、これらのうちの１つ以上は、代わりに異なるベクター上にコードされてもよい。
本明細書の用量は、平均７０ｋｇの個体に基づく。投与頻度は、医学もしくは獣医学の実務者（例えば、医師、獣医師）、または当該技術分野の科学者の裁量の範囲内にある。また、実験に使用されるマウスは、典型的には約２０ｇであり、マウス実験から７０ｋｇの個体にスケールアップし得ることも注記される。
本明細書に提供される組成物に用いられる投薬量は、反復投与または繰り返し投与向けの投薬量を含む。特定の実施形態では、投与は数週間、数ヵ月、または数年間の期間の範囲内で反復される。最適な投薬量レジームを得るため、好適なアッセイを実施することができる。反復投与は、より低い投薬量の使用が可能であり、これはオフターゲット改変に正の影響を及ぼし得る。
ＲＮＡ送達
ある特定の実施形態では、ＲＮＡベース送達を使用する。これらの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のｍＲＮＡ、アデノシンデアミナーゼのｍＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアダプターに融合され得る）は、インビトロで転写されたガイドＲＮＡと一緒に送達される。Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．は、ＲＮＡベース送達を用いた効率的なゲノム編集を記載している（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｍａｙ；６（５）：３６３－３７２）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３及び／またはアデノシンデアミナーゼをコードするｍＲＮＡ（複数可）は、化学的に改変することができ、プラスミドコード化Ｃａｓ１３及び／またはアデノシンデアミナーゼと比較して、活性の改善をもたらし得る。例えば、ｍＲＮＡ（複数可）中のウリジンは、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍｅ１Ψ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）で部分的または完全に置換することができる。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １，００６６ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５５１－０１７－００６６（２０１７）（その全体を参照により本明細書に組み込む）を参照されたい。
ＲＮＰ送達
ある特定の実施形態では、前複合体化ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、及びアデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアダプターに融合され得る）は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）として送達される。ＲＮＰは、このプロセスが転写の必要性を回避するため、ＲＮＡ法よりもさらに急速な編集効果をもたらすという利点を有する。重要な利点は、両方のＲＮＰ送達が一過性であり、オフターゲット効果及び毒性の問題を減らすことである。異なる細胞型における効率的なゲノム編集は、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１４，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２４（６）：１０１２－９）、Ｐａｉｘ ｅｔ ａｌ．（２０１５，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０４（１）：４７－５４）、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１６，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４）、及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３，Ｃｅｌｌ．９；１５３（４）：９１０－８）によって観察されている。
ある特定の実施形態では、リボ核タンパク質は、ＷＯ２０１６１６１５１６に記載されるようなポリペプチドベースのシャトル剤によって送達される。ＷＯ２０１６１６１５１６は、細胞透過性ドメイン（ＣＰＤ）と作動可能に連結されたエンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）、またはヒスチジンリッチドメイン及びＣＰＤと作動可能に連結されたＥＬＤを含む合成ペプチドを用いた、ポリペプチドカーゴの効率的な形質導入を記載している。同様に、これらのポリペプチドを使用して、真核細胞中にＣＲＩＳＰＲ－エフェクターベースＲＮＰを送達することができる。
粒子
いくつかの態様または実施形態では、送達粒子製剤を含む組成物を使用し得る。いくつかの態様または実施形態では、製剤は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を含み、この複合体は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質、及びＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合に仕向けるガイドを含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、脂質ベース粒子、任意選択で、脂質ナノ粒子、またはカチオン性脂質、及び任意選択で、生分解性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーは、エチレングリコールまたはポリエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、リポタンパク質、好ましくは、コレステロールをさらに含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、直径が５００ｎｍ未満、任意選択で直径が２５０ｎｍ未満、任意選択で直径が１００ｎｍ未満、任意選択で直径が約３５ｎｍ～約６０ｎｍである。
粒子送達複合体の例は、「Ｎｏｖｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｌａｒｇｅ Ｐａｙｌｏａｄｓ」と題された、２０１７年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／４８５，６２５号にさらに開示されている。
いくつかのタイプの粒子送達系及び／または製剤が、多様な生物医学的適用において有用であることが知られている。一般に、粒子は、その輸送及び特性の点で一単位として挙動する小さい物体として定義される。粒子は、さらに直径に基づき分類される。粗粒子は、２，５００～１０，０００ナノメートルの範囲を包含する。微粒子は、１００～２，５００ナノメートルのサイズを有する。超微粒子、またはナノ粒子は、概して１～１００ナノメートルのサイズである。１００ｎｍ限度の基準は、粒子をバルク材料と区別する新規特性が典型的には１００ｎｍ未満の臨界長さスケールで生じるという事実である。
本明細書で使用する場合、粒子送達系／製剤は、本発明における粒子を含む任意の生物学的送達系／製剤として定義される。本発明における粒子は、１００ミクロン（μｍ）未満の最大径（例えば、直径）を有する任意の実体である。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は１０μｍ未満の最大径を有する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は２０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大径を有する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大径を有する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、または１００ｎｍ未満の最大径を有する。典型的には、本発明の粒子は、５００ｎｍ以下の最大径（例えば、直径）を有する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、２５０ｎｍ以下の最大径（例えば、直径）を有する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、２００ｎｍ以下の最大径（例えば、直径）を有する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、１５０ｎｍ以下の最大径（例えば、直径）を有する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、１００ｎｍ以下の最大径（例えば、直径）を有する。より小さい粒子、例えば、５０ｎｍ以下の最大径を有する粒子が、本発明の一部の実施形態で使用される。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、２５ｎｍ～２００ｎｍの範囲の最大径を有する。
本発明に関しては、ＣＲＩＳＰＲ複合体の１つ以上の成分、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質もしくはｍＲＮＡ、またはアデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアダプターに融合され得る）もしくはｍＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをナノ粒子または脂質エンベロープを用いて送達することが好ましい。他の送達系またはベクターを本発明のナノ粒子の態様と併せて用いてもよい。
一般に、「ナノ粒子」は、直径が１０００ｎｍ未満の任意の粒子を指す。特定の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、最大径（例えば、直径）が５００ｎｍ以下である。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、最大径が２５ｎｍ～２００ｎｍの範囲である。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、最大径が１００ｎｍ以下である。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、最大径が３５ｎｍ～６０ｎｍの範囲である。適切な場合、本明細書における粒子またはナノ粒子への言及は、同義的であり得ることが理解されるであろう。
粒子のサイズは、ローディング前または後に測定されるかどうかに応じて異なることが理解されるであろう。従って、特定の実施形態では、用語「ナノ粒子」は、ローディング前の粒子にのみ適用され得る。
本発明に包含されるナノ粒子は、例えば、固体ナノ粒子（例えば、銀、金、鉄、チタンなどの金属）、非金属、脂質ベースの固体、ポリマー）、ナノ粒子の懸濁液、またはこれらの組み合わせとして、種々の形態で提供され得る。金属、誘電体、及び半導体ナノ粒子、ならびにハイブリッド構造（例えば、コアシェルナノ粒子）を調製してもよい。半導体材料でできているナノ粒子はまた、電子エネルギーレベルの量子化が起こるのに十分に小さい（典型的には、１０ｎｍ未満）ならば、標識量子ドットであってもよい。かかるナノスケール粒子は、生物医学的適用において薬物担体または造影剤として用いられ、本発明における同様の目的に応用し得る。
半固体及び軟質ナノ粒子が製造されており、本発明の範囲内にある。半固体の性質のプロトタイプナノ粒子がリポソームである。各種のリポソームナノ粒子が現在、抗がん薬及びワクチンの送達系として臨床で用いられている。一方の親水性の半分と他方の疎水性の半分とを有するナノ粒子は、ヤヌス粒子と呼ばれ、特に、エマルションを安定化させるのに有効である。ヤヌス粒子は、水／油界面で自己集合して、固体界面活性剤として働くことができる。
粒子の特徴付け（例えば、形態、寸法等を特徴付けることを含む）は種々の異なる技術を用いて行われる。一般的な技術は、電子顕微鏡法（ＴＥＭ、ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、紫外・可視分光法、二重偏光干渉法及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）である。特徴付け（寸法計測）は、天然粒子（すなわち、負荷前）に関して行われても、またはカーゴの負荷後に行われてもよく（本明細書においてカーゴとは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の１つ以上の成分、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質もしくはｍＲＮＡ、アデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアダプターに融合され得る）もしくはｍＲＮＡ、またはガイドＲＮＡ、あるいはこれらの任意の組み合わせを指し、さらなる担体及び／または賦形剤を含み得る）、それにより本発明の任意のインビトロ、エキソビボ及び／またはインビボ適用のための送達に最適なサイズの粒子が提供される。特定の好ましい実施形態では、粒子寸法（例えば、直径）の特徴付けは、動的レーザー散乱法（ＤＬＳ）を用いた計測に基づく。粒子、その作製及び使用方法ならびにその計測に関して、米国特許第８，７０９，８４３号；米国特許第６，００７，８４５号；米国特許第５，８５５，９１３号；米国特許第５，９８５，３０９号；米国特許第５，５４３，１５８号；及びＪａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １１ Ｍａｙ ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４による発表が挙げられる。
本発明の範囲内の粒子送達系は、限定はされないが、固体、半固体、エマルション、またはコロイド粒子を含め、任意の形態で提供され得る。従って、限定はされないが、例えば、脂質ベースの系、リポソーム、ミセル、微小胞、エキソソーム、または遺伝子銃を含め、本明細書に記載される送達系の任意のものが、本発明の範囲内の粒子送達系として提供され得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質ｍＲＮＡ、アデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアダプターに融合され得る）またはｍＲＮＡ、及びガイドＲＮＡは、粒子または脂質エンベロープを使用して同時に送達し得る；例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びＲＮＡ（例えば、複合体としての）は、７Ｃ１など、Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ２０１５０８９４１９ Ａ２及びその引用文献にある通りの粒子によって送達することができ（例えば、Ｊａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １１ Ｍａｙ ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４を参照されたい）、例えば、送達粒子は脂質またはリピドイド及び親水性ポリマー、例えば、カチオン性脂質及び親水性ポリマーを含み、例えば、カチオン性脂質には、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）もしくは１，２－ジテトラデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）が含まれ、及び／または親水性ポリマーには、エチレングリコールもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれ；及び／または粒子は、コレステロール（例えば、製剤１＝ＤＯＴＡＰ １００、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ０、コレステロール ０；製剤番号２＝ＤＯＴＡＰ ９０、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ １０、コレステロール ０；製剤番号３＝ＤＯＴＡＰ ９０、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ５、コレステロール ５からの粒子）をさらに含み、粒子は効率的な多段階プロセスを用いて形成され、ここでは初めに、エフェクタータンパク質及びＲＮＡを、例えば、１：１モル比で、例えば、室温で、例えば、３０分間、例えば、無菌ヌクレアーゼフリー１×ＰＢＳ中において共に混合し；それとは別に、製剤に適用し得る場合ＤＯＴＡＰ、ＤＭＰＣ、ＰＥＧ、及びコレステロールをアルコール、例えば、１００％エタノール中に溶解し；これらの２つの溶液を共に混合して、複合体を含有する粒子を形成する）。
核酸ターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３などのＶ型タンパク質など）ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、粒子または脂質エンベロープを使用して同時に送達し得る。好適な粒子の例としては、限定はされないが、米国特許第９，３０１，９２３号に記載されるものが挙げられる。
例えば、Ｓｕ Ｘ，Ｆｒｉｃｋｅ Ｊ，Ｋａｖａｎａｇｈ ＤＧ，Ｉｒｖｉｎｅ ＤＪ（“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｐｉｄ－ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｐＨ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１１ Ｊｕｎ ６；８（３）：７７４－８７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ１００３９０ｗ．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ １）は、ポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアがリン脂質二重層シェルによって被包された生分解性コア－シェル構造化ナノ粒子について記載している。これらはインビボｍＲＮＡ送達のために開発された。ｐＨ応答性ＰＢＡＥ成分はエンドソーム破壊を促進するように選ばれ、一方、脂質表面層はポリカチオンコアの毒性を最小限に抑えるように選択された。従って、これは本発明のＲＮＡの送達に好ましい。
一実施形態では、自己集合生体付着性ポリマーをベースとする粒子／ナノ粒子が企図され、これは、ペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達及びペプチドの経鼻送達、脳への全てに適用し得る。疎水性薬物の経口吸収及び眼内送達など、他の実施形態もまた企図される。分子エンベロープ技術は、保護されかつ疾患部位に送達されるエンジニアリングされたポリマーエンベロープを含む（例えば、Ｍａｚｚａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＡＣＳＮａｎｏ，２０１３．７（２）：１０１６－１０２６；Ｓｉｅｗ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（１）：１４－２８；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ，２０１２．１６１（２）：５２３－３６；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１６６５－８０；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１７６４－７４；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，２０１２．５（５－６）：４５８－６８；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔ，２０１２．４３（５）：６８１－６８８；Ａｈｍａｄ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ２０１０．７：Ｓ４２３－３３；Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ，２００６．３（５）：６２９－４０；Ｑｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６．７（１２）：３４５２－９及びＵｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ，２００１．２２４：１８５－１９９を参照されたい）。標的組織に応じて単回または複数回用量での約５ｍｇ／ｋｇの用量が企図される。
一実施形態では、ＭＩＴのＤａｎ Ａｎｄｅｒｓｏｎ研究室によって開発された、腫瘍成長を止めるためＲＮＡをがん細胞に送達することのできる粒子／ナノ粒子を、本発明のＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に使用し及び／または適合させることができる。特に、Ａｎｄｅｒｓｏｎ研究室は、新規生体材料及びナノ製剤の合成、精製、特徴付け、及び製剤化のための完全に自動化されたコンビナトリアル系を開発した。例えば、Ａｌａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ａｕｇ ６；１１０（３２）：１２８８１－６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ．２０１３ Ｓｅｐ ６；２５（３３）：４６４１－５；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１３ Ｍａｒ １３；１３（３）：１０５９－６４；Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ｏｃｔ ２３；６（１０）：８４８４－７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ａｕｇ ２８；６（８）：６９２２－９及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ ３；７（６）：３８９－９３を参照されたい。
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号はリピドイド化合物に関し、同様にポリヌクレオチドの投与に特に有用であり、これは、本発明のＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の送達に適用し得る。一態様では、アミノアルコールリピドイド化合物が、細胞または対象に送達される薬剤と組み合わされて、マイクロパーティクル、ナノ粒子、リポソーム、またはミセルを形成する。粒子、リポソーム、またはミセルによって送達される薬剤は、気体、液体、または固体の形態であってもよく、薬剤は、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、または小分子であってもよい。アミノアルコールリピドイド化合物は、他のアミノアルコールリピドイド化合物、ポリマー（合成または天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、タンパク質、脂質等と組み合わされて粒子を形成し得る。次にはこれらの粒子が、任意選択で医薬賦形剤と組み合わされて医薬組成物を形成し得る。
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号はまた、アミノアルコールリピドイド化合物を調製する方法も提供する。アミンの１つ以上の等価物をエポキシド末端化合物の１つ以上の等価物と好適な条件下で反応させると、本発明のアミノアルコールリピドイド化合物が形成される。ある特定の実施形態では、アミンの全てのアミノ基がエポキシド末端化合物と完全に反応して、第三級アミンを形成する。他の実施形態では、アミンの全てのアミノ基がエポキシド末端化合物と完全には反応せずに第三級アミンを形成し、それによりアミノアルコールリピドイド化合物に第一級または第二級アミンが生じる。これらの第一級または第二級アミンはそのままにされるか、または異なるエポキシド末端化合物などの別の求電子剤と反応させてもよい。当業者によって理解されるであろう通り、アミンが過剰未満のエポキシド末端化合物と反応すると、様々な数の末端部を有する複数の異なるアミノアルコールリピドイド化合物が生じることになる。ある種のアミン類は２つのエポキシド由来化合物末端部で完全に官能基化されてもよく、一方、他の分子はエポキシド末端化合物末端部で完全には官能基化されない。例えば、ジアミンまたはポリアミンは、分子の様々なアミノ部分の１、２、３、または４つのエポキシド由来化合物末端部を含んで第一級、第二級、及び第三級アミンを生じ得る。ある特定の実施形態では、全てのアミノ基が完全には官能基化されない。ある特定の実施形態では、同じタイプのエポキシド末端化合物のうちの２つが使用される。他の実施形態では、２つ以上の異なるエポキシド末端化合物が使用される。アミノアルコールリピドイド化合物の合成は溶媒有りまたは無しで実施され、合成は３０～１００℃、好ましくは約５０～９０℃の範囲の高温で実施され得る。調製されたアミノアルコールリピドイド化合物は任意選択で精製されてもよい。例えば、アミノアルコールリピドイド化合物の混合物を精製して、特定の数のエポキシド由来化合物末端部を有するアミノアルコールリピドイド化合物を得てもよい。または混合物を精製して、特定の立体または位置異性体を得てもよい。アミノアルコールリピドイド化合物はまた、ハロゲン化アルキル（例えば、ヨウ化メチル）もしくは他のアルキル化剤を用いてアルキル化されてもよく、及び／またはそれらはアシル化されてもよい。
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号はまた、本発明の方法によって調製されたアミノアルコールリピドイド化合物のライブラリーも提供する。これらのアミノアルコールリピドイド化合物は、液体ハンドラー、ロボット、マイクロタイタープレート、コンピュータ等が関わるハイスループット技術を用いて調製され及び／またはスクリーニングされ得る。ある特定の実施形態では、アミノアルコールリピドイド化合物は、ポリヌクレオチドまたは他の薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子）を細胞にトランスフェクトする能力に関してスクリーニングされる。
米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号は、コンビナトリアル重合を用いて調製されたポリ（β－アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）類の一クラスに関する。本発明のＰＢＡＡは、コーティング（医療器具またはインプラントのフィルムまたは多層フィルムコーティングなど）、添加剤、材料、賦形剤、生物付着防止剤、マイクロパターニング剤、及び細胞封入剤として、バイオテクノロジー及び生物医学的適用において用いられ得る。表面コーティングとして使用される場合、これらのＰＢＡＡは、インビトロ及びインビボの両方で、その化学構造に応じて様々なレベルの炎症を誘発した。この材料クラスの化学的多様性は大きいため、インビトロでマクロファージ活性化を阻害するポリマーコーティングを同定することが可能であった。さらに、これらのコーティングは、カルボキシル化ポリスチレンマイクロパーティクルの皮下移植後の炎症細胞の動員を低減し、及び線維症を低減する。これらのポリマーを使用して、細胞封入用の高分子電解質複合体カプセルを形成し得る。本発明もまた、抗菌性コーティング、ＤＮＡまたはｓｉＲＮＡ送達、及び幹細胞組織工学など、他の多くの生物学的適用を有し得る。米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号の教示は、本発明のＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に適用し得る。
Ｃａｓ１３、アデノシンデアミナーゼ（Ｃａｓ１３またはアダプタータンパク質に融合され得る）、及びガイドＲＮＡを含む予めアセンブルした組換えＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は、例えば、電気穿孔によってトランスフェクトしてもよく、それにより高い突然変異率が得られ、かつ検出可能なオフターゲット突然変異がなくなる。Ｈｕｒ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓ１３ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｊｕｎ ６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３５９６。
脳への局所送達に関して、これは様々な方法で達成することができる。例えば、物質を線条体内に、例えば、注入によって送達することができる。注入は、開頭により定位的に行うことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される通り、ならびに特に、別段明らかでない限りあらゆる粒子への送達適用に関してＷＯ２０１４１１８２７２（参照により本明細書に援用される）及びＮａｉｒ，ＪＫ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３６（４９），１６９５８－１６９６１）及び本明細書の教示を参照して、糖ベースの粒子、例えば、ＧａｌＮＡｃを使用してもよい。これは、糖ベースの粒子と見なすことができ、他の粒子送達系及び／または製剤に関するさらなる詳細は、本明細書に提供される。従って、ＧａｌＮＡｃは、本明細書に記載される他の粒子の意味における粒子と見なすことができ、一般的な使用及び他の考察、例えば、前記粒子の送達が、ＧａｌＮＡｃ粒子にも同様に適用される。例えば、溶相コンジュゲーション戦略を用いて、ＰＦＰ（ペンタフルオロフェニル）エステルとして活性化したトリアンテナリーＧａｌＮＡｃクラスター（分子量約２０００）を５’－ヘキシルアミノ修飾オリゴヌクレオチド（５’－ＨＡ ＡＳＯ、分子量約８０００Ｄａ；Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２０１５，２６（８），ｐｐ １４５１－１４５５）に付加し得る。同様に、インビボ核酸送達にポリ（アクリレート）ポリマーが記載されている（ＷＯ２０１３１５８１４１（参照により本明細書に援用される）を参照されたい）。さらなる代替的実施形態では、ＣＲＩＳＰＲナノ粒子（またはタンパク質複合体）を天然に存在する血清タンパク質と予め混合することが、送達の向上に用いられ得る（Ａｋｉｎｃ Ａ ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１８ ｎｏ．７，１３５７－１３６４）。
ナノクリュー
さらに、系は、例えば、Ｓｕｎ Ｗ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｃｏｏｎ－ｌｉｋｅ ｓｅｌｆ－ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ＤＮＡ ｎａｎｏｃｌｅｗ ｆｏｒ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１４ Ｏｃｔ ２２；１３６（４２）：１４７２２－５．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ５０８８０２４．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｏｃｔ １３．；またはＳｕｎ Ｗ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ＤＮＡ Ｎａｎｏｃｌｅｗｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２０１５ Ｏｃｔ ５；５４（４１）：１２０２９－３３．ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１５０６０３０．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ａｕｇ ２７に記載される通りのナノクリューを用いて送達し得る。
ＬＮＰ
いくつかの実施形態では、ＬＮＰなどの脂質粒子中のＣａｓ１３タンパク質またはｍＲＮＡ形態の封入によって送達される。いくつかの実施形態では、従って、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が企図される。抗トランスサイレチン低分子干渉ＲＮＡが脂質ナノ粒子に封入され、ヒトに送達されており（例えば、Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３；３６９：８１９－２９を参照されたい）、かかる系を本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に適合させて応用し得る。静脈内投与される約０．０１～約１ｍｇ／ｋｇ体重の用量が企図される。注入関連反応のリスクを減らす薬物投与が企図され、デキサメタゾン、アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミンまたはセチリジン、及びラニチジンなどが企図される。４週間毎の５用量にわたる約０．３ｍｇ／キログラムの複数回用量もまた企図される。
ＬＮＰは、ｓｉＲＮＡの肝臓への送達に極めて有効であることが示されており（例えば、Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ ３６３－４７０を参照されたい）、従ってＣＲＩＳＰＲ ＣａｓをコードするＲＮＡの肝臓への送達に企図される。２週間毎に６ｍｇ／ｋｇのＬＮＰの約４用量の投薬量が企図され得る。Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．は、０．７ｍｇ／ｋｇで投与するＬＮＰの最初の２サイクル後に腫瘍退縮が観察され、及び６サイクルの終わりまでに患者がリンパ節転移の完全退縮及び肝腫瘍の実質的な縮小を伴う部分奏効を達成したことを実証した。この患者においては４０用量後に完全奏効が得られ、２６ヵ月間にわたって投与を受けた後も患者は寛解を保ったまま治療を完了した。ＶＥＧＦ経路阻害剤による先行治療後に進行していた、腎臓、肺、及びリンパ節を含めた肝外疾患部位を有する２人のＲＣＣ患者は、おおよそ８～１２ヵ月間全ての部位で疾患の安定が得られ、ＰＮＥＴ及び肝転移患者は、１８ヵ月間（３６用量）にわたって拡張試験を継続し、疾患は安定していた。
しかしながら、ＬＮＰの電荷が考慮されなければならない。カチオン性脂質を負電荷脂質と組み合わせると、細胞内送達を促進する非二重層構造が誘導されるためである。荷電ＬＮＰは、静脈内注射後に循環から急速に除去されるため、ｐＫａ値が７未満のイオン化可能なカチオン性脂質が開発された（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照されたい）。ＲＮＡなどの負電荷ポリマーは、低ｐＨ値（例えば、ｐＨ４）でＬＮＰに負荷することができ、ここで、イオン化可能な脂質は、正電荷を呈する。しかしながら、生理的ｐＨ値では、ＬＮＰは、より長い循環時間と適合する低い表面電荷を呈する。４種のイオン化可能なカチオン性脂質、すなわち、１，２－ジリネオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－ケト－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）、及び１，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）が着目されている。これらの脂質を含有するＬＮＰ ｓｉＲＮＡ系は、インビボで肝細胞において著しく異なる遺伝子サイレンシング特性を呈し、効力は、第ＶＩＩ因子遺伝子サイレンシングモデルを用いて系列ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ＞ＤＬｉｎＫＤＭＡ＞ＤＬｉｎＤＭＡ＞＞ＤＬｉｎＤＡＰに従い様々であることが示されている（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照されたい）。ＬＮＰまたはＬＮＰ中のもしくはそれに会合するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡの１μｇ／ｍｌの投薬量が、特に、ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡを含有する製剤について企図され得る。
ＬＮＰ及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ封入の調製は、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃ．２０１１）を使用し及び／または適合させ得る。カチオン性脂質１，２－ジリネオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシケト－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）、（３－ｏ－［２”－（メトキシポリエチレングリコール２０００）サクシノイル］－１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリコール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）、及びＲ－３－［（ω－メトキシ－ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオクスルプロピル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｌｐｒｏｐｙｌ）－３－アミン（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ）が、Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）によって供給され、または合成されてもよい。コレステロールは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る。特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡは、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ－ＤＭＡ、及びＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡを含有するＬＮＰに封入してもよい（４０：１０：４０：１０モル比のカチオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ）。必要な場合、０．２％ＳＰ－ＤｉＯＣ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）を取り入れて細胞取込み、細胞内送達、及び体内分布を評価する。封入は、カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（４０：１０：４０：１０モル比）で構成される脂質混合物をエタノール中に１０ｍｍｏｌ／ｌの最終脂質濃度となるように溶解することにより実施し得る。このエタノール脂質溶液を５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、ｐＨ４．０に滴下して加えると、多層小胞が形成され、３０％エタノールｖｏｌ／ｖｏｌの最終濃度が生じ得る。エクストルーダ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用して２つの積み重ねた８０ｎｍ Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅポリカーボネートフィルターで多層小胞を押し出した後、大きい単層小胞が形成され得る。封入は、３０％エタノールｖｏｌ／ｖｏｌを含有する５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、ｐＨ４．０中に２ｍｇ／ｍｌのＲＮＡを、押し出されて予め形成された大きい単層小胞に滴下して加え、０．０６／１ｗｔ／ｗｔの最終ＲＮＡ／脂質重量比となるように常に混合しながら３１℃で３０分間インキュベートすることにより達成し得る。Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ２再生セルロース透析膜を使用したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４での１６時間の透析によってエタノールの除去及び製剤化緩衝液の中和を実施した。ナノ粒径分布は、ＮＩＣＯＭＰ ３７０粒径測定機、小胞／強度モード、及びガウスフィッティング（Ｎｉｃｏｍｐ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用した動的光散乱によって決定し得る。３つ全てのＬＮＰ系の粒径が、直径約７０ｎｍであり得る。ＲＮＡ封入効率は、透析前及び透析後に収集した試料からＶｉｖａＰｕｒｅＤ ＭｉｎｉＨカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して遊離ＲＮＡを除去することにより決定し得る。溶出したナノ粒子から封入されたＲＮＡを抽出し、２６０ｎｍで定量化し得る。Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）からのコレステロールＥ酵素アッセイを用いて小胞中のコレステロール含有量を計測することにより、ＲＮＡ対脂質比を決定した。本明細書におけるＬＮＰ及びＰＥＧ脂質の考察と併せて、ＰＥＧ化リポソームまたはＬＮＰも同様にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系またはその成分の送達に好適である。
エタノール中にＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを５０：１０：３８．５モル比で含有する脂質プレミックス溶液（２０．４ｍｇ／ｍｌ総脂質濃度）を調製し得る。酢酸ナトリウムを０．７５：１（酢酸ナトリウム：ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）のモル比でこの脂質プレミックスに加え得る。続いて、混合物を１．８５容積のクエン酸塩緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ３．０）と激しく撹拌しながら合わせることにより脂質を水和させると、３５％エタノールを含有する水性緩衝液中でリポソームの自然形成が起こり得る。このリポソーム溶液を３７℃でインキュベートして、粒径を時間依存的に増加させ得る。インキュベーション中様々な時点でアリコートを取り出して、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によってリポソームサイズの変化を調べ得る。所望の粒径に達したところで、総脂質の３．５％の最終ＰＥＧモル濃度が得られるようにリポソーム混合物にＰＥＧ脂質水溶液（ストック＝３５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール中１０ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ－ＤＭＧ）を加え得る。ＰＥＧ－脂質を加えると、リポソームはそのサイズで、さらなる成長が事実上クエンチされるはずである。次に、空のリポソームに約１：１０（ｗｔ：ｗｔ）のＲＮＡ対総脂質でＲＮＡを加え、続いて、３７℃で３０分間インキュベートすると、負荷されたＬＮＰが形成され得る。続いて、この混合物をＰＢＳで一晩透析し、０．４５μｍシリンジフィルターでろ過し得る。
球状核酸（ＳＮＡ（商標））構築物及び他のナノ粒子（特に、金ナノ粒子）もまた、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を意図した標的に送達する手段として企図される。多量のデータが、核酸機能化金ナノ粒子をベースとするＡｕｒａＳｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの球状核酸（ＳＮＡ（商標））構築物が有用であることを示している。
本明細書の教示と併せて用い得る文献としては、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１ １３３：９２５４－９２５７、Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１ ７：３１５８－３１６２、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１１ ５：６９６２－６９７０、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１３７６－１３９１、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１２ １２：３８６７－７１、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２ １０９：１１９７５－８０、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２ ７：６３５－６３８ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１６４８８－１６９１、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１３ ４９５：Ｓ１４－Ｓ１６、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３ １１０（１９）：７６２５－７６３０、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，１０：１８６－１９２が挙げられる。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠位端に結合したＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドリガンドによってポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をＰＥＧ化して、ＲＮＡを含む自己集合性ナノ粒子を構築し得る。この系は、例えば、インテグリンを発現する腫瘍新生血管系を標的化し、かつ血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦ Ｒ２）の発現を阻害して、それにより腫瘍血管新生を達成するｓｉＲＮＡを送達する手段として用いられている（例えば、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１９を参照されたい）。ナノプレックスは、等容積のカチオン性ポリマーと核酸との水溶液を混合して２～６の範囲にわたって正味モル過剰のイオン化可能な窒素（ポリマー）対リン酸（核酸）を得ることにより調製し得る。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用によって平均粒径分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従って、ここではナノプレックスと称される。Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．の自己集合性ナノ粒子での送達には、約１００～２００ｍｇの投薬量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが想定される。
Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２５，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．３９）のナノプレックスもまた、本発明に適用され得る。Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．のナノプレックスは、等容積のカチオン性ポリマーと核酸との水溶液を混合して２～６の範囲にわたって正味モル過剰のイオン化可能な窒素（ポリマー）対リン酸（核酸）を得ることにより調製される。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用によって平均粒径分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従って、ここではナノプレックスと称される。Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．のＤＯＴＡ－ｓｉＲＮＡは、以下の通り合成された：１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸モノ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＯＴＡ－ＮＨＳエステル）をＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）から注文した。カーボネート緩衝液（ｐＨ９）中１００倍モル過剰のＤＯＴＡ－ＮＨＳ－エステルを有するアミン改変ＲＮＡセンス鎖を微量遠心管に加えた。室温で４時間撹拌することにより内容物を反応させた。ＤＯＴＡ－ＲＮＡセンスコンジュゲートをエタノール沈殿させて、水中に再懸濁し、及び非改変アンチセンス鎖とアニーリングさせることにより、ＤＯＴＡ－ｓｉＲＮＡを得た。液体は全てＣｈｅｌｅｘ－１００（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で前処理して微量金属の汚染が除去された。シクロデキストリン含有ポリカチオンを使用することにより、Ｔｆ標的及び非標的ｓｉＲＮＡナノ粒子を形成し得る。典型的には、３（±）の電荷比及び０．５ｇ／リットルのｓｉＲＮＡ濃度で水中にナノ粒子が形成された。標的ナノ粒子の表面上にある１パーセントのアダマンタン－ＰＥＧ分子をＴｆ（アダマンタン－ＰＥＧ－Ｔｆ）で改変した。注射用に５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコース担体溶液中にナノ粒子を懸濁した。
Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ４６４，１５ Ａｐｒｉｌ ２０１０）は、標的ナノ粒子送達系を使用するＲＮＡ臨床試験を行う（臨床試験登録番号ＮＣＴ００６８９０６５）。標準ケア療法に抵抗性の固形がん患者に対し２１日間サイクルの１、３、８及び１０日目に用量の標的ナノ粒子を３０分間静脈内注入によって投与する。ナノ粒子は、（１）線状シクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、（２）がん細胞の表面上のＴＦ受容体（ＴＦＲ）と会合するようにナノ粒子の外側に提示されたヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）標的リガンド、（３）親水性ポリマー（生体液中でのナノ粒子の安定性を促進するために用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、及び（４）ＲＲＭ２の発現を減らすように設計されたｓｉＲＮＡ（臨床で使用された配列は、以前はｓｉＲ２Ｂ＋５と称された）を含有する合成送達系からなる。ＴＦＲは、悪性細胞で上方制御されることが長く知られており、ＲＲＭ２は、確立された抗がん標的である。これらのナノ粒子（臨床版は、ＣＡＬＡＡ－０１と称される）は、非ヒト霊長類における複数回投与試験で良好に忍容されることが示されている。１人の慢性骨髄性白血病患者にｓｉＲＮＡがリポソーム送達によって投与されているが、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．の臨床試験は、ｓｉＲＮＡを標的送達系で全身送達して固形がん患者を治療する初期ヒト試験である。標的送達系がヒト腫瘍への機能性ｓｉＲＮＡの有効な送達を提供し得るかどうかを確かめるため、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．は、３つの異なる投与コホートからの３人の患者の生検を調べた；患者Ａ、Ｂ及びＣ（全員が転移性黒色腫を有し、それぞれ１８、２４及び３０ｍｇ・ｍ－２ ｓｉＲＮＡのＣＡＬＡＡ－０１の投与を受けた）。同程度の用量が本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系にも企図され得る。本発明の送達は、線状シクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、がん細胞の表面上のＴＦ受容体（ＴＦＲ）と会合するようにナノ粒子の外側に提示されたヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）標的リガンド、及び／または親水性ポリマー（例えば、生体液中でのナノ粒子の安定性を促進するために用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含有するナノ粒子で達成され得る。
米国特許第８，７０９，８４３号（参照により本明細書に援用される）は、治療剤含有粒子を組織、細胞、及び細胞内区画に標的化して送達するための薬物送達系を提供する。本発明は、界面活性剤、親水性ポリマーまたは脂質にコンジュゲートしたポリマーを含む標的粒子を提供する。米国特許第６，００７，８４５号（参照により本明細書に援用される）は、多官能基化合物を１つ以上の疎水性ポリマー及び１つ以上の親水性ポリマーと共有結合的に連結することにより形成されたマルチブロック共重合体のコアを有し、かつ生物学的に活性な材料を含有する粒子を提供する。米国特許第５，８５５，９１３号（参照により本明細書に援用される）は、肺系統への薬物送達のためその表面上に界面活性剤を取り込んだ、タップ密度が０．４ｇ／ｃｍ３未満で平均直径が５μｍ～３０μｍの空気力学的に軽い粒子を有する粒子状組成物を提供する。米国特許第５，９８５，３０９号（参照により本明細書に援用される）は、界面活性剤及び／または正電荷もしくは負電荷治療薬もしくは診断薬と肺系統への送達用の逆の電荷の荷電分子との親水性もしくは疎水性複合体を取り込んだ粒子を提供する。米国特許第５，５４３，１５８号（参照により本明細書に援用される）は、生物学的に活性な材料を含有する生分解性固体コア及び表面上のポリ（アルキレングリコール）部分を有する生分解性注射用粒子を提供する。ＷＯ２０１２１３５０２５（ＵＳ２０１２０２５１５６０としても公開されている）（参照により本明細書に援用される）は、コンジュゲート型ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマー及びコンジュゲート型アザ大環状分子（まとめて「コンジュゲート型リポマー（ｌｉｐｏｍｅｒ）」または「リポマー」と称される）について記載している。ある特定の実施形態では、かかるコンジュゲート型リポマーを、インビトロ、エキソビボ及びインビボゲノム摂動を達成してタンパク質発現の改変を含めた遺伝子発現の改変を行うためＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のコンテクストで使用し得ることを想定し得る。
一実施形態では、ナノ粒子はエポキシド改変脂質ポリマー、有利には７Ｃ１であってもよい（例えば、Ｊａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １１ Ｍａｙ ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４を参照されたい）。Ｃ７１は、Ｃ１５エポキシド末端脂質をＰＥＩ６００と１４：１のモル比で混合することにより合成され、Ｃ１４ＰＥＧ２０００と配合されて、ＰＢＳ溶液中で少なくとも４０日間安定なナノ粒子が作製された（直径３５～６０ｎｍ）。
エポキシド改変脂質ポリマーを利用して本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を肺細胞、心血管細胞または腎細胞に送達し得るが、しかしながら、当業者はこの系を応用して他の標的器官に送達し得る。約０．０５～約０．６ｍｇ／ｋｇの範囲の投薬量が想定される。数日間または数週間にわたる、総投薬量を約２ｍｇ／ｋｇとする投薬もまた想定される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子を送達するＬＮＰは、当該技術分野において公知の方法、例えば、ＷＯ２００５／１０５１５２（ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００４９２０）、ＷＯ２００６／０６９７８２（ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１４０７４）、ＷＯ２００７／１２１９４７（ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００３４９６）、及びＷＯ２０１５／０８２０８０（ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／００３２７４）、（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものによって調製される。特に哺乳類細胞へのｓｉＲＮＡの送達の増強及び改良を目的としたＬＮＰは、例えば、Ａｌｅｋｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６８（２３）：９７８８－９８（Ｄｅｃ．１，２００８）、Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，５０（１）：７６－８（Ｊａｎ．２０１２）、Ｓｃｈｕｌｔｈｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，３２（３６）：４１４１－４８（Ｄｅｃ．２０，２０１４）、及びＦｅｈｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２２（４）：８１１－２０（Ａｐｒ．２２，２０１４）（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、本発明の技術に適用し得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＷＯ２００５／１０５１５２（ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００４９２０）、ＷＯ２００６／０６９７８２（ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１４０７４）、ＷＯ２００７／１２１９４７（ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００３４９６）、及びＷＯ２０１５／０８２０８０（ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／００３２７４）に開示される任意のＬＮＰを含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式Ｉを有する少なくとも１つの脂質を含み、
（式Ｉ）、式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立して、アルキルを含む群から選択され、ｎは、１～４の任意の整数であり、及びＲ３は、式ＩＩ：
Figure 2023134462000013
 によるリシル、オルニチル、２，４－ジアミノブチリル、ヒスチジル及びアシル部分を含む群から選択されるアシルであり、式中、ｍは、１～３の任意の整数であり、Ｙ－は、薬学的に許容可能なアニオンである。いくつかの実施形態では、式Ｉによる脂質は、少なくとも２つの不斉炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、式Ｉの鏡像異性体としては、限定はされないが、Ｒ－Ｒ；Ｓ－Ｓ；Ｒ－Ｓ及びＳ－Ｒ鏡像異性体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、ラウリルであり、Ｒ２は、ミリスチルである。別の実施形態では、Ｒ１は、パルミチル及びＲ２は、オレイルである。いくつかの実施形態では、ｍは、１または２である。いくつかの実施形態では、Ｙ－は、ハロゲン化物、酢酸塩またはトリフルオロ酢酸塩から選択される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、
－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－パルミチル－Ｎ－オレイル－アミドトリヒドロクロリド（式ＩＩＩ）：
Figure 2023134462000014
 －アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－ラウリル－Ｎ－ミリスチル－アミドトリヒドロクロリド（式ＩＶ）：
Figure 2023134462000015
 及び －アルギニル－リシン－Ｎ－ラウリル－Ｎ－ミリスチル－アミドトリヒドロクロリド（式Ｖ）：
Figure 2023134462000016
 から選択される１つ以上の脂質を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰはまた、エレメントを含む。例として、但し限定ではなく、いくつかの実施形態では、エレメントは、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、またはその組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、エレメントは、抗体、例えば、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、エレメントは、例えば、リボザイム、アプタマー、シュピーゲルマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、またはその組み合わせから選択される核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は、ガイドＲＮＡ及び／またはｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰのエレメントは、ＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのエレメントは、ＩＩ型またはＶ型ＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのエレメントは、アデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアダプタータンパク質に融合され得る）をコードするｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰのエレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを血管内皮に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを肺内皮に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを肝臓に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを肺に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを心臓に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを脾臓に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを腎臓に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを膵臓に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを脳に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡをマクロファージに送達するように構成される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰはまた、少なくとも１つの補助脂質を含む。いくつかの実施形態では、補助脂質は、ホスホ脂質及びステロイドから選択される。いくつかの実施形態では、ホスホ脂質は、リン酸のジ及び／またはモノエステルである。いくつかの実施形態では、ホスホ脂質は、ホスホグリセリド及び／またはスフィンゴ脂質である。いくつかの実施形態では、ステロイドは、天然に存在する化合物、及び／または部分水素添加シクロペンタ［ａ］フェナントレンに基づく合成化合物である。いくつかの実施形態では、ステロイドは、２１～３０個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、ステロイドは、コレステロールである。いくつかの実施形態では、補助脂質は、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）、セラミド、及び１，２－ジオレイルｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの補助脂質は、ＰＥＧ部分、ＨＥＧ部分、ポリヒドロキシエチルデンプン（ポリＨＥＳ）部分及びポリプロピレン部分を含む群から選択される部分を含む。いくつかの実施形態では、部分は、約５００～１０，０００Ｄａまたは約２，０００～５，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアルキル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、及びセラミド－ＰＥＧから選択される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、約５００～１０，０００Ｄａまたは約２，０００～５，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、２，０００Ｄａの分子量を有する。
いくつかの実施形態では、補助脂質は、組成物の総脂質含有量の約２０モル％～８０モル％である。いくつかの実施形態では、補助脂質成分は、ＬＮＰの総脂質含有量の約３５モル％～６５モル％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＬＮＰの総脂質含有量の５０モル％で脂質、及びＬＮＰの総脂質含有量の５０モル％で補助脂質を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＰｈｙＰＥと組み合わせて、－３－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－パルミチル－Ｎ－オレイル－アミドトリヒドロクロリド、－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－ラウリル－Ｎ－ミリスチル－アミドトリヒドロクロリドまたは－アルギニル－リシン－Ｎ－ラウリル－Ｎ－ミリスチル－アミドトリヒドロクロリドのいずれかを含み、ＤＰｈｙＰＥの含有量は、ＬＮＰの総脂質含有量の約８０モル％、６５モル％、５０モル％及び３５モル％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－パルミチル－Ｎ－オレイル－アミドトリヒドロクロリド（脂質）及び１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（補助脂質）を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－パルミチル－Ｎ－オレイル－アミドトリヒドロクロリド（脂質）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（第１の補助脂質）、及び１，２－ジステロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ＰＥＧ２０００（第２の補助脂質）を含む。
いくつかの実施形態では、第２の補助脂質は、総脂質含有量の約０．０５モル％～４．９モル％または約１モル％～３モル％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、総脂質含有量の約４５モル％～５０モル％で脂質、総脂質含有量の約４５モル％～５０モル％の第１の補助脂質を含み、但し、総脂質含有量の約０．１モル％～５モル％、約１モル％～４モル％、または約２モル％のペグ化した第２の補助脂質が存在し、脂質、第１の補助脂質、及び第２の補助脂質の含有量の合計は、総脂質含有量の１００モル％であり、第１の補助脂質及び第２の補助脂質の合計は、総脂質含有量の５０モル％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、（ａ）－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－パルミチル－Ｎ－オレイル－アミドトリヒドロクロリドの５０モル％、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンの４８モル％；及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ＰＥＧ２０００の２モル％；または（ｂ）－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－パルミチル－Ｎ－オレイル－アミドトリヒドロクロリドの５０モル％、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンの４９モル％；及びＮ（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ３－ホスホエタノールアミン、またはそのナトリウム塩の１モル％を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、核酸を含み、核酸骨格リン酸のカチオン性脂質窒素原子に対する電荷比は、約１：１．５～７または約１：４である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰはまた、インビボ条件下で脂質組成物から除去可能な遮蔽化合物を含む。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、生物学的に不活性な化合物である。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、その表面上または、例えば、分子上にいずれの電荷も運ばない。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルグルコース（ＨＥＧ）系ポリマー、ポリヒドロキシエチルデンプン（ポリＨＥＳ）及びポリプロピレンである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ、ＨＥＧ、ポリＨＥＳ、及びポリプロピレンは、約５００～１０，０００Ｄａまたは約２０００～５０００Ｄａの重量である。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、ＰＥＧ２０００またはＰＥＧ５０００である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、少なくとも１つの脂質、第１の補助脂質、及びインビボ条件下で脂質組成物から除去可能な遮蔽化合物を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはまた、第２の補助脂質を含む。いくつかの実施形態では、第１の補助脂質は、セラミドである。いくつかの実施形態では、第２の補助脂質は、セラミドである。いくつかの実施形態では、セラミドは、６～１０個の炭素原子のうちの少なくとも１つの短炭素鎖置換基を含む。いくつかの実施形態では、セラミドは、８個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、セラミドに結合する。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、セラミドに結合する。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、セラミドに共有結合する。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、ＬＮＰ中の核酸に結合する。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、核酸に共有結合する。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、リンカーによって核酸に結合する。いくつかの実施形態では、リンカーは、生理学的条件下で開裂される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ペプチド、Ｓ－Ｓ－リンカー及びｐＨ感受性リンカーから選択される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、核酸のセンス鎖の３’末端に結合する。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分を含む。いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分は、アニオン性リンカーまたはアニオン性部分である。いくつかの実施形態では、アニオン性リンカーまたはアニオン性部分は、酸性環境において低アニオン性または中性である。いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分は、オリゴ（グルタミン酸）、オリゴフェノラート（複数可）及びジエチレントリアミン五酢酸から選択される。
前段落のＬＮＰ実施形態のいずれかでは、ＬＮＰは、約５０～６００ミリオスモル／ｋｇ、約２５０～３５０ミリオスモル／ｋｇ、もしくは約２８０～３２０ミリオスモル／ｋｇのオスモル濃度を有し得、及び／または、脂質及び／または１つもしくは２つの補助脂質によって形成されたＬＮＰ、ならびに遮蔽化合物は、約２０～２００ｎｍ、約３０～１００ｎｍ、または約４０～８０ｎｍの粒径を有する。
いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、インビボでより長い循環時間をもたらし、ＬＮＰを含有する核酸のより良い生体内分布が可能になる。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、ＬＮＰと、他の体液または細胞膜、例えば、ＬＮＰが投与される血管系の内皮性内膜の細胞膜の血清化合物または化合物との即時の相互作用を防止する。それに加えてまたは代えて、いくつかの実施形態では、遮蔽化合物はまた、免疫系のエレメントとＬＮＰとの即時の相互作用を防止する。それに加えてまたは代えて、いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、抗オプソニン化化合物として作用する。いずれか特定の機序または理論により拘束されることを望むものではないが、いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、その環境との相互作用に利用可能なＬＮＰの表面積を減少させるカバーまたは被膜を形成する。それに加えてまたは代えて、いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、ＬＮＰの全電荷を遮蔽する。
別の実施形態では、ＬＮＰは、式ＶＩ：
Figure 2023134462000017
 を有する少なくとも１つのカチオン性脂質を含み、
式中、ｎは、１、２、３、または４であり、ｍは、１、２、または３であり、Ｙ－は、アニオンであり、Ｒ１及びＲ２の各々は、個別かつ独立して、直鎖Ｃ１２－Ｃ１８アルキル及び直鎖Ｃ１２－Ｃ１８アルケニル、ステロール化合物からなる群から選択され、ステロール化合物は、コレステロール及びスチグマステロール、及びペグ化脂質からなる群から選択され、ペグ化脂質は、ＰＥＧ部分を含み、ペグ化脂質は、
式ＶＩＩのペグ化ホスホエタノールアミン：
Figure 2023134462000018
 （式中、Ｒ３及びＲ４は、個別かつ独立して、直鎖Ｃ１３－Ｃ１７アルキルであり、ｐは、１５～１３０の任意の整数である）；
式ＶＩＩＩのペグ化セラミド：
Figure 2023134462000019
 （式中、Ｒ５は、直鎖Ｃ７－Ｃ１５アルキルであり、及びｑは、１５～１３０の任意の整数である）；及び
式ＩＸのペグ化ジアシルグリセロール：
Figure 2023134462000020
 （式中、Ｒ６及びＲ７の各々は、個別かつ独立して、直鎖Ｃ１１－Ｃ１７アルキルであり、ｒは、１５～１３０の任意の整数である）、からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は互いに異なる。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、パルミチルであり、Ｒ２は、オレイルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、ラウリルであり、Ｒ２は、ミリスチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２の各々は、個別かつ独立して、Ｃ１２アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１６アルケニル及びＣ１８アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１６アルケニル及びＣ１８アルケニルの各々は、１つまたは２つの二重結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ１８アルケニルは、Ｃ９とＣ１０の間に１つの二重結合を有するＣ１８アルケニルである。いくつかの実施形態では、Ｃ１８アルケニルは、シス－９－オクタデシルである。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｘ：
Figure 2023134462000021
 の化合物である。いくつかの実施形態では、Ｙ－は、ハロゲン化物、酢酸塩及びトリフルオロ酢酸塩から選択される。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式ＩＩＩ：
Figure 2023134462000022
 の－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－パルミチル－Ｎ－オレイル－アミドトリヒドロクロリドである。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式ＩＶ：
Figure 2023134462000023
 の－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－ラウリル－Ｎ－ミリスチル－アミドトリヒドロクロリドである。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｖ：
Figure 2023134462000024
 の－アルギニル－リシン－Ｎ－ラウリル－Ｎ－ミリスチル－アミドトリヒドロクロリドである。
いくつかの実施形態では、ステロール化合物は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、ステロール化合物は、スチグマステリンである。
いくつかの実施形態では、ペグ化脂質のＰＥＧ部分は、約８００～５，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質のＰＥＧ部分の分子量は、約８００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質のＰＥＧ部分の分子量は、約２，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質のＰＥＧ部分の分子量は、約５，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質は、式ＶＩＩのペグ化ホスホエタノールアミンであり、式中、Ｒ３及びＲ４の各々は、個別かつ独立して、直鎖Ｃ１３－Ｃ１７アルキルであり、ｐは、１８、１９または２０、または４４、４５または４６、または１１３、１１４または１１５の任意の整数である。いくつかの実施形態では、Ｒ３及びＲ４は同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ３及びＲ４は異なる。いくつかの実施形態では、Ｒ３及びＲ４の各々は、個別かつ独立して、Ｃ１３アルキル、Ｃ１５アルキル及びＣ１７アルキルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、式ＶＩＩのペグ化ホスホエタノールアミンは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）である：
Figure 2023134462000025
 いくつかの実施形態では、式ＶＩＩのペグ化ホスホエタノールアミンは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５０００］（アンモニウム塩）である：
Figure 2023134462000026
 いくつかの実施形態では、ペグ化脂質は、式ＶＩＩＩのペグ化セラミドであり、式中、Ｒ５は、直鎖Ｃ７－Ｃ１５アルキルであり、ｑは、１８、１９または２０、または４４、４５または４６、または１１３、１１４または１１５の任意の整数である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、直鎖Ｃ７アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、直鎖Ｃ１５アルキルである。いくつかの実施形態では、式ＶＩＩＩのペグ化セラミドは、Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝である：
Figure 2023134462000027
 いくつかの実施形態では、式ＶＩＩＩのペグ化セラミドは、Ｎ－パルミトイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝である：
Figure 2023134462000028
 いくつかの実施形態では、ペグ化脂質は、式ＩＸのペグ化ジアシルグリセロールであり、式中、Ｒ６及びＲ７の各々は、個別かつ独立して、直鎖Ｃ１１－Ｃ１７アルキルであり、ｒは、１８、１９または２０、または４４、４５または４６、または１１３、１１４または１１５の任意の整数である。いくつかの実施形態では、Ｒ６及びＲ７は同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ６及びＲ７は異なる。いくつかの実施形態では、Ｒ６及びＲ７の各々は、個別かつ独立して、直鎖Ｃ１７アルキル、直鎖Ｃ１５アルキル及び直鎖Ｃ１３アルキルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、式ＩＸのペグ化ジアシルグリセロールは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］である：
Figure 2023134462000029
 いくつかの実施形態では、式ＩＸのペグ化ジアシルグリセロールは、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］である：
Figure 2023134462000030
 いくつかの実施形態では、式ＩＸのペグ化ジアシルグリセロールは、
Figure 2023134462000031
 である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式ＩＩＩ、ＩＶ、及びＶから選択される少なくとも１つのカチオン性脂質、コレステロール及びスチグマステリンから選択される少なくとも１つのステロール化合物を含み、ペグ化脂質は、式ＸＩ及びＸＩＩから選択される少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式ＩＩＩ、ＩＶ、及びＶから選択される少なくとも１つのカチオン性脂質、コレステロール及びスチグマステリンから選択される少なくとも１つのステロール化合物を含み、ペグ化脂質は、式ＸＩＩＩ及びＸＩＶから選択される少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式ＩＩＩ、ＩＶ、及びＶから選択される少なくとも１つのカチオン性脂質、コレステロール及びスチグマステリンから選択される少なくとも１つのステロール化合物を含み、ペグ化脂質は、式ＸＶ及びＸＶＩから選択される少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式ＩＩＩのカチオン性脂質、ステロール化合物としてコレステロールを含み、ペグ化脂質は、式ＸＩである。
前段落のＬＮＰ実施形態のいずれかでは、カチオン性脂質組成物の含有量は、約６５モル％～７５モル％であり、ステロール化合物の含有量は、約２４モル％～３４モル％であり、ペグ化脂質の含有量は、約０．５モル％～１．５モル％であり、脂質組成物のカチオン性脂質、ステロール化合物及びペグ化脂質の含有量の合計は、１００モル％である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、約７０モル％であり、ステロール化合物の含有量は、約２９モル％であり、ペグ化脂質の含有量は、約１モル％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、７０モル％の式ＩＩＩ、２９モル％のコレステロール、及び１モル％の式ＸＩである。
エキソソーム
エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送する内因性のナノ小胞であり、これは、ＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達することができる。免疫原性を減らすため、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：３４１）は、エキソソーム産生に自己由来の樹状細胞を使用した。ニューロン特異的ＲＶＧペプチドに融合したエキソソーム膜タンパク質Ｌａｍｐ２ｂを発現するように樹状細胞をエンジニアリングすることにより、脳への標的化が達成された。精製エキソソームに電気穿孔によって外因性ＲＮＡが負荷された。静脈内注射されるＲＶＧ標的化エキソソームが、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを脳内のニューロン、ミクログリア、オリゴデンドロサイトに特異的に送達し、特異的遺伝子ノックダウンが得られた。ＲＶＧエキソソームに予め曝露してもノックダウンは減弱しなかったとともに、他の組織における非特異的取込みは観察されなかった。アルツハイマー病の治療標的であるＢＡＣＥ１の強力なｍＲＮＡ（６０％）及びタンパク質（６２％）ノックダウンによって、エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達の治療可能性が実証された。
免疫学的に不活性なエキソソームのプールを得るため、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、同種主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプの近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスから骨髄を採取した。未熟樹状細胞は、ＭＨＣ－ＩＩ及びＣＤ８６など、Ｔ細胞アクチベーターを欠くエキソソームを多量に産生するため、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、顆粒球／マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を有する樹状細胞を７日間選択した。翌日、十分に確立された超遠心法プロトコルを用いて培養上清からエキソソームを精製した。産生されたエキソソームは、物理的に均一であり、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）及び電子顕微鏡法によって決定した時分布サイズのピークが直径８０ｎｍであった。Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、１０６細胞当たり（タンパク質濃度に基づき計測して）６～１２μｇのエキソソームを得た。
次に、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、ナノスケール適用に適合させた電気穿孔プロトコルを用いて改変エキソソームに外因性カーゴを負荷する可能性を調べた。ナノメートルスケールでの膜粒子に対する電気穿孔は十分に特徴付けられていないため、非特異的Ｃｙ５標識ＲＮＡを使用して電気穿孔プロトコルを経験的に最適化した。超遠心法及びエキソソームの溶解後に、封入されるＲＮＡの量をアッセイした。４００Ｖ及び１２５μＦでの電気穿孔が最大のＲＮＡ保持をもたらし、以降の全ての実験でこれを使用した。
Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、１５０μｇのＲＶＧエキソソームに封入された１５０μｇの各ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与し、４つの対照とノックダウン効率を比較した：未治療マウス、ＲＶＧエキソソームのみを注入したマウス、インビボカチオン性リポソーム試薬と複合体化したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを注入したマウス、及びＲＶＧ－９Ｒ（ｓｉＲＮＡに静電的に結合する９つのＤ－アルギニンとコンジュゲートしたＲＶＧペプチド）と複合体化したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを注入したマウス。投与３日後に皮質組織試料を分析し、ｓｉＲＮＡ－ＲＶＧ－９Ｒ治療マウス及びｓｉＲＮＡＲＶＧエキソソーム治療マウスの両方で有意なタンパク質ノックダウン（４５％、Ｐ＜０．０５、対６２％、Ｐ＜０．０１）が観察され、ＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡレベルの有意な低下がもたらされた（それぞれ６６％±１５％、Ｐ＜０．００１及び６１％±１３％、Ｐ＜０．０１）。さらに、この出願人らは、ＲＶＧ－エキソソーム治療動物においてアルツハイマー病におけるアミロイド斑の主要な成分である総β－アミロイド１－４２レベルの有意な低下（５５％、Ｐ＜０．０５）を実証した。観察された低下は、正常マウスでＢＡＣＥ１阻害剤の脳室内注射後に実証されたβ－アミロイド１－４０の低下よりも大きかった。Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、ＢＡＣＥ１開裂生成物でｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）を実施し、これは、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ媒介性ノックダウンのエビデンスを提供した。
最後に、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、ＩＬ－６、ＩＰ－１０、ＴＮＦα及びＩＦＮ－α血清濃度を評価することにより、ＲＮＡ－ＲＶＧエキソソームがインビボで免疫応答を誘導したかどうかを調べた。エキソソーム治療後、ｓｉＲＮＡ－ＲＶＧ－９Ｒと対照的にｓｉＲＮＡ－トランスフェクション試薬治療と同様に全てのサイトカインにおける有意でない変化を記録し、これはＩＬ－６分泌を強力に刺激したことから、エキソソーム治療の免疫学的に不活性なプロファイルが確認された。エキソソームがｓｉＲＮＡの２０％しか封入しないことを所与とすれば、対応するレベルの免疫刺激なしに５分の１のｓｉＲＮＡで同等のｍＲＮＡノックダウン及びより大きいタンパク質ノックダウンが達成されたため、ＲＶＧ－エキソソームによる送達は、ＲＶＧ－９Ｒ送達よりも効率的であるように見える。この実験は、ＲＶＧ－エキソソーム技術の治療可能性を実証したものであり、これは、潜在的に神経変性疾患に関連する遺伝子の長期サイレンシングに適している。Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．のエキソソーム送達系は、治療標的、特に神経変性疾患への本発明のＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の送達に適用し得る。約１００～１０００ｍｇのＲＶＧエキソソームに封入された約１００～１０００ｍｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投薬量が本発明に企図され得る。
Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７，２１１２－２１２６（２０１２））は、培養細胞に由来するエキソソームをどのようにインビトロ及びインビボでのＲＮＡの送達に利用することができるかを開示している。このプロトコルは、初めに、ペプチドリガンドと融合したエキソソームタンパク質を含む、発現ベクターのトランスフェクションによる標的エキソソームの作成を記載している。次に、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、トランスフェクト細胞上清からエキソソームをどのように精製し及び特徴付けるかを説明する。次に、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、ＲＮＡをエキソソームに負荷するために重要なステップを詳説する。最後に、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、どのようにエキソソームを使用してインビトロで及びマウス脳においてインビボでＲＮＡを効率的に送達するかを概説する。エキソソーム媒介性ＲＮＡ送達の見込まれた結果の例が機能アッセイによって評価され、イメージングもまた提供される。プロトコル全体は約３週間かかる。本発明に係る送達または投与は、自己由来樹状細胞から産生されたエキソソームを使用して実施されてもよい。本明細書における教示から、これを本発明の実施において用いることができる。
別の実施形態では、Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７ ｅ１３０）の血漿エキソソームが企図される。エキソソームは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞、上皮細胞及び腫瘍細胞を含めた多くの細胞型によって産生されるナノサイズの小胞（３０～９０ｎｍサイズ）である。これらの小胞は後期エンドソームの内向きの出芽によって形成され、次に細胞膜との融合時に細胞外環境へと放出される。エキソソームは天然で細胞間にＲＮＡを有するため、この特性は遺伝子療法に有用であり得るとともに、この開示から、本発明の実施に用いることができる。
血漿からのエキソソームは、バフィーコートを９００ｇで２０分間遠心して血漿を単離し、続いて細胞上清を回収し、３００ｇで１０分間遠心して細胞を除去し、１６ ５００ｇで３０分間遠心し、続いて０．２２ｍｍフィルターでろ過することにより調製することができる。１２０ ０００ｇで７０分間の超遠心によってエキソソームをペレット化する。エキソソームへのｓｉＲＮＡの化学的トランスフェクションをＲＮＡｉヒト／マウススターターキット（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造者の指示に従い実施する。ｓｉＲＮＡを１００ｍｌ ＰＢＳに２ｍｍｏｌ／ｍｌの最終濃度で加える。ＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬を加えた後、混合物を室温で１０分間インキュベートする。過剰なミセルを除去するため、アルデヒド／硫酸塩ラテックスビーズを使用してエキソソームを再単離する。エキソソームへのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの化学的トランスフェクションをｓｉＲＮＡと同様に行い得る。エキソソームを健常ドナーの末梢血から単離した単球及びリンパ球と共培養し得る。従って、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを含有するエキソソームをヒトの単球及びリンパ球に導入し、かつヒトに自己再導入し得ることが企図され得る。従って、本発明に係る送達または投与を血漿エキソソームを用いて実施し得る。
リポソーム
本発明に係る送達または投与は、リポソームで実施することができる。リポソームは、内部の水性区画を取り囲む単層または多重膜脂質二重層及び比較的不透過性の外側の親油性リン脂質二重層から構成される球形の小胞構造である。リポソームは、生体適合性であり、非毒性であり、親水性及び親油性の両方の薬物分子を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、かつ生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を越えてそのロードを輸送するため、薬物送達担体として大いに注目を集めてきた（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。
リポソームは、いくつかの異なるタイプの脂質から作製することができる；しかしながら、薬物担体としてのリポソームの作成には、リン脂質が最も一般的に用いられている。脂質薄膜が水溶液と混合された時にリポソーム形成は自然に起こるが、また、ホモジナイザー、ソニケーター、または押出し装置を使用して振盪の形態の力を加えることによっても促進し得る（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。
その構造及び特性を改変するため、リポソームにいくつかの他の添加剤を加えてもよい。例えば、リポソーム構造の安定化を助けるため、及びリポソームの内部カーゴの漏出を防ぐため、リポソーム混合物にコレステロールまたはスフィンゴミエリンのいずれかを加えてもよい。さらに、リポソームは、水素化卵ホスファチジルコリンまたは卵ホスファチジルコリン、コレステロール、及びジセチルリン酸から調製され、その平均小胞サイズは約５０及び１００ｎｍに調整された（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。
リポソーム製剤は主に、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン及びモノシアロガングリオシドなどの天然リン脂質及び脂質で構成され得る。この製剤はリン脂質のみでできているため、リポソーム製剤は多くの難題に直面しており、その１つが血漿中での不安定性である。これらの難題を解消しようとするいくつかの試みが、特に脂質膜の操作においてなされている。これらの試みの１つは、コレステロールの操作に着目するものであった。従来の製剤にコレステロールを加えると、封入された生物学的活性化合物が血漿または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）中に急速に放出されることが抑えられ、安定性が増す（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。
特に有利な実施形態では、トロイの木馬リポソーム（分子トロイの木馬としても知られる）が望ましく、ｈｔｔｐ：／／ｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０１０／４／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７．ｌｏｎｇにおいてプロトコルを参照し得る。これらの粒子は、トランス遺伝子を血管内注射後に脳全体に送達することが可能である。制約により拘束されるものではないが、特異抗体が表面にコンジュゲートした中性脂質粒子はエンドサイトーシスによって血液脳関門を通過することが可能であると考えられる。本出願人は、トロイの木馬リポソームを利用してヌクレアーゼのＣＲＩＳＰＲファミリーを血管内注射によって脳に送達し、これにより、胚を操作する必要なしに全脳トランスジェニック動物が実現し得る。リポソームでのインビボ投与には、約１～５ｇのＤＮＡまたはＲＮＡが企図され得る。
別の実施形態では、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系またはその成分は、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）などのリポソームで投与され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ ２００５を参照されたい）。ＳＮＡＬＰで標的化される特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの毎日の約１、３または５ｍｇ／ｋｇ／日の静脈内注射が企図される。毎日の治療は約３日間にわたり、次に毎週、約５週間にわたり得る。別の実施形態では、特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが封入されたＳＮＡＬＰの約１または２．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注射による投与もまた企図される（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照されたい）。ＳＮＡＬＰ製剤は、脂質３－Ｎ－［（ｗメトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオキシ－プロピルアミン（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びコレステロールを２：４０：１０：４８モルパーセント比で含有し得る（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照されたい）。
別の実施形態では、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、高度に血管新生したＨｅｐＧ２由来肝腫瘍への分子の送達に有効であるが、血管新生が不十分なＨＣＴ－１１６由来肝腫瘍においては有効でないことが分かっている（例えば、Ｌｉ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１９，７７５－７８０を参照されたい）。ＳＮＡＬＰリポソームは、Ｄ－Ｌｉｎ－ＤＭＡ及びＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡをジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及びｓｉＲＮＡと共に２５：１脂質／ｓｉＲＮＡ比及び４８／４０／１０／２モル比のコレステロール／Ｄ－Ｌｉｎ－ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡを用いて製剤化することにより調製し得る。得られたＳＮＡＬＰリポソームは約８０～１００ｎｍサイズである。
さらに別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）、３－Ｎ－［（ｗ－メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミレスチルオキシプロピルアミン（ｄｉｍｙｒｅｓｔｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）、及びカチオン性１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎジメチルアミノアミノプロパンを含み得る（例えば、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０１０；３７５：１８９６－９０５を参照されたい）。例えば、ボーラス静脈内注入として投与される１用量当たり合計約２ｍｇ／ｋｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投薬量が企図され得る。
さらに別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ－ｃＤＭＡ、及び１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ；Ｎ－ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る（例えば、Ｊｕｄｇｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９：６６１－６７３（２００９）を参照されたい）。インビボ研究に用いられる製剤は、約９：１の最終脂質／ＲＮＡ質量比を含み得る。
ＲＮＡｉナノメディシンの安全性プロファイルが、Ａｌｎｙｌａｍ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢａｒｒｏｓ ａｎｄ Ｇｏｌｌｏｂによってレビューされている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６４（２０１２）１７３０－１７３７を参照されたい）。安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、４つの異なる脂質－低ｐＨでカチオン性のイオン化可能な脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）、中性ヘルパー脂質、コレステロール、及び拡散性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質で構成される。この粒子は、直径約８０ｎｍであり、生理的ｐＨで電荷的に中性である。製剤化時、イオン化可能な脂質が粒子形成の間に脂質をアニオン性ＲＮＡと凝縮させる働きをする。漸進的に酸性になるエンドソーム条件下で正電荷のとき、イオン化可能な脂質はまた、ＳＮＡＬＰとエンドソーム膜との融合も媒介し、細胞質中へのＲＮＡの放出を可能にする。ＰＥＧ－脂質は粒子を安定化させ、製剤化時の凝集を低減し、続いて薬物動態特性を改善する中性の親水性外部を提供する。
現在までに、ＲＮＡを有するＳＮＡＬＰ製剤を使用して２つの臨床プログラムが開始されている。Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、最近、高ＬＤＬコレステロールの成人ボランティアにおけるＳＮＡＬＰ－ＡｐｏＢの第Ｉ相単回投与試験を完了した。ＡｐｏＢは主に肝臓及び空腸に発現し、ＶＬＤＬ及びＬＤＬのアセンブリ及び分泌に必須である。１７人の対象に単一用量のＳＮＡＬＰ－ＡｐｏＢが投与された（７用量レベルにわたる用量漸増）。肝毒性（前臨床試験に基づき潜在的用量制限毒性として予想された）のエビデンスはなかった。（２人中）１人の対象が最も高い用量で免疫系刺激と一致してインフルエンザ様症状を起こし、試験終了が決定された。
Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓも同様にＡＬＮ－ＴＴＲ０１を進めており、これは上記に記載されるＳＮＡＬＰ技術を用い、ＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）の治療のため突然変異体及び野生型の両方のＴＴＲの肝細胞産生を標的化する。３つのＡＴＴＲ症候群が記載されている：家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）－両方ともにＴＴＲの常染色体優性突然変異によって引き起こされる；及び野生型ＴＴＲによって引き起こされる老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）。ＡＬＮ－ＴＴＲ０１のプラセボ対照単回用量漸増第Ｉ相試験が最近、ＡＴＴＲ患者で完了した。ＡＬＮ－ＴＴＲ０１が１５分間の静脈内注入として３１人の患者に（２３人は試験薬物及び８人はプラセボ）０．０１～１．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲内で（ｓｉＲＮＡに基づく）投与された。治療は良好に忍容され、肝機能検査値の重大な増加はなかった。≧０．４ｍｇ／ｋｇで２３人中３人の患者に注入関連反応が認められた；全員が注入速度の減速に応答し、全員が試験を続行した。２人の患者に１ｍｇ／ｋｇの最も高い用量で血清サイトカインＩＬ－６、ＩＰ－１０及びＩＬ－１ｒａの最小限かつ一過性の上昇が認められた（前臨床及びＮＨＰ試験から予想された通り）。ＡＬＮ－ＴＴＲ０１の期待された薬力学的効果である血清ＴＴＲの低下が１ｍｇ／ｋｇで観察された。
さらに別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、例えば、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ－脂質をエタノール中に、例えば、それぞれ４０：１０：４０：１０のモル比で可溶化させることにより作製し得る（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２８ Ｎｕｍｂｅｒ ２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０，ｐｐ．１７２－１７７を参照されたい）。水性緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４）にそれぞれ３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び６．１ｍｇ／ｍｌの最終エタノール及び脂質濃度となるように混合しながら脂質混合物を加え、２２℃で２分間平衡化させた後、押し出した。水和した脂質を、２つの積み重ねた８０ｎｍ細孔径フィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）で２２℃においてＬｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、動的光散乱分析によって決定した時７０～９０ｎｍの小胞直径が観察されるまで押し出した。これには、概して１～３回のパスが必要であった。ｓｉＲＮＡ（３０％エタノールを含有する５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４水溶液中に可溶化した）を、予め平衡化した（３５℃）小胞に約５ｍｌ／分の速度で混合しながら加えた。０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の最終目標ｓｉＲＮＡ／脂質比に達した後、混合物を３５℃でさらに３０分間インキュベートして小胞再構築及びｓｉＲＮＡの封入を可能にした。次に、エタノールを除去し、外部緩衝液を透析またはタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションのいずれかによってＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）と交換した。制御された段階的希釈方法プロセスを用いてｓｉＲＮＡをＳＮＡＬＰに封入した。ＫＣ２－ＳＮＡＬＰの脂質エレメントは、５７．１：７．１：３４．３：１．４のモル比で用いられたＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（カチオン性脂質）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ）及びＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡであった。負荷粒子が形成されたところで、ＳＮＡＬＰをＰＢＳで透析し、使用前に０．２μｍフィルターで滅菌ろ過した。平均粒径は、７５～８５ｎｍであり、ｓｉＲＮＡの９０～９５％が脂質粒子内に封入された。インビボ試験に使用した製剤中の最終的なｓｉＲＮＡ／脂質比は、約０．１５（ｗｔ／ｗｔ）であった。使用直前に、第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含有するＬＮＰ－ｓｉＲＮＡ系を滅菌ＰＢＳ中に適切な濃度に希釈し、製剤を１０ｍｌ／ｋｇの合計容積で外側尾静脈から静脈内投与した。この方法及びこれらの送達系は、本発明のＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に当てはめることができる。
他の脂質
アミノ脂質２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）などの他のカチオン性脂質を利用して、例えば、ＳｉＲＮＡと同様に、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓまたはその成分またはそれをコードする１つ以上の核酸分子を封入してもよく（例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，８５２９－８５３３を参照されたい）、従って、本発明の実施に用い得る。以下の脂質組成を有する予め形成された小胞が企図され得る：アミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及び（Ｒ）－２，３－ビス（オクタデシルオキシ）プロピル－１－（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ－脂質）（それぞれモル比４０／１０／４０／１０、及び約０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ／総脂質比）。７０～９０ｎｍの範囲の狭い粒径分布及び０．１１±０．０４の低い多分散性指数（ｎ＝５６）が確実となるように、粒子を最大３回まで８０ｎｍ膜で押し出し、その後ガイドＲＮＡに加えた。極めて強力なアミノ脂質１６を含有する粒子を使用してもよく、ここで４つの脂質成分１６、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ－脂質のモル比（５０／１０／３８．５／１．５）はインビボ活性を増強させるためさらに最適化され得る。
Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ Ｄ Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍｉｃｅ：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ：２９，Ｐａｇｅｓ：１５４－１５７（２０１１））は、脂質エンベロープを用いたＲＮＡの送達について記載している。脂質エンベロープの使用は、本発明においても好ましい。
別の実施形態では、脂質を本発明のＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系またはその成分（複数可）またはそれをコードする１つ以上の核酸分子（複数可）と共に製剤化して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成してもよい。脂質としては、限定はされないが、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ４、Ｃ１２－２００及びコリピド（ｃｏｌｉｐｉｄ）ジステロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｃｈｏｌｉｎｅ）、コレステロールが挙げられ、ＰＥＧ－ＤＭＧを小胞自然形成手順を用いて、ｓｉＲＮＡの代わりにＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓと共に製剤化してもよい（例えば、Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１２）１，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３を参照されたい）。成分のモル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡまたはＣ１２－２００／ジステロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｃｈｏｌｉｎｅ）／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ）であってもよい。最終的な脂質：ｓｉＲＮＡ重量比は、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ及びＣ１２－２００脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の場合、それぞれ約１２：１及び９：１であり得る。製剤は、＞９０％の捕捉効率で約８０ｎｍの平均粒子直径を有し得る。３ｍｇ／ｋｇ用量が企図され得る。
Ｔｅｋｍｉｒａは、米国及び米国外に、ＬＮＰ及びＬＮＰ製剤の様々な態様に関するおおよそ９５のパテントファミリーのポートフォリオを有し（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号；同第７，７９９，５６５号；同第８，０５８，０６９号；同第８，２８３，３３３号；同第７，９０１，７０８号；同第７，７４５，６５１号；同第７，８０３，３９７号；同第８，１０１，７４１号；同第８，１８８，２６３号；同第７，９１５，３９９号；同第８，２３６，９４３号及び同第７，８３８，６５８号ならびに欧州特許第１７６６０３５号；同第１５１９７１４号；同第１７８１５９３号及び同第１６６４３１６号を参照されたい）、これらは全て、本発明に使用及び／または応用することができる。
ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系またはその成分またはそれをコードする１つ以上の核酸分子は、タンパク質、タンパク質前駆体、または部分的もしくは完全にプロセシングされた形態のタンパク質もしくはタンパク質前駆体をコードし得る改変核酸分子を含む組成物の製剤の態様に関する米国特許出願公開第２０１３０２５２２８１号及び同第２０１３０２４５１０７号及び同第２０１３０２４４２７９号（Ｍｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに譲渡された）にさらに記載されるものなど、ＰＬＧＡミクロスフェアに封入して送達し得る。製剤は、モル比５０：１０：３８．５：１．５～３．０（カチオン性脂質：膜融合性脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）を有し得る。ＰＥＧ脂質は、限定はされないが、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧから選択され得る。膜融合性脂質はＤＳＰＣであり得る。また、Ｓｃｈｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、米国特許出願公開第２０１２０２５１６１８号も参照されたい。
Ｎａｎｏｍｅｒｉｃｓの技術は、低分子量疎水性薬物、ペプチド、及び核酸ベースの治療薬（プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含めた広範囲の治療薬に関するバイオアベイラビリティの難題に対処している。この技術が明らかな利点を実証している特定の投与経路には、経口経路、血液脳関門を越える輸送、固形腫瘍への送達、ならびに眼への送達が含まれる。例えば、Ｍａｚｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１３ Ｆｅｂ ２６；７（２）：１０１６－２６；Ｕｃｈｅｇｂｕ ａｎｄ Ｓｉｅｗ，２０１３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０２（２）：３０５－１０及びＬａｌａｔｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１２ Ｊｕｌ ２０；１６１（２）：５２３－３６を参照されたい。
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号は、ポリヌクレオチド分子、ペプチド及びポリペプチド及び／または医薬品などの生理活性分子を哺乳類の体に送達するためのカチオン性デンドリマーについて記載している。デンドリマーは、生理活性分子の送達を、例えば、肝臓、脾臓、肺、腎臓または心臓に（またはさらには脳までも）標的化するのに好適である。デンドリマーは、単純な分岐単量体単位から段階的に調製される合成三次元巨大分子であり、その性質及び機能は容易に制御し、変化させることができる。デンドリマーは、エレメントを多機能コアに（ダイバージェント合成手法）、または多機能コアに向かって（コンバージェント合成手法）反復的に加えることによって合成され、エレメントの三次元シェルを加える毎に、より高世代のデンドリマーの形成につながる。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、ジアミノブタンコアから開始され、それに第一級アミンへのアクリロニトリルの二重マイケル付加によって２倍の数のアミノ基が加えられ、続いてニトリルが水素化される。この結果、アミノ基の倍増がもたらされる。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、１００％プロトン化可能な窒素及び最大６４個の末端アミノ基（第５世代、ＤＡＢ ６４）を含有する。プロトン化可能な基は、通常、中性ｐＨでプロトンを受け取ることが可能なアミン基である。デンドリマーの遺伝子デリバリー剤としての使用は、大部分が、コンジュゲート単位としてそれぞれアミン／アミドまたはＮ－－Ｐ（Ｏ２）Ｓの混合物を有するポリアミドアミン及び亜リン酸含有化合物の使用に着目したものであり、それより低い世代のポリプロピレンイミンデンドリマーの遺伝子送達への使用に関しては報告がない。ポリプロピレンイミンデンドリマーもまた、周囲アミノ酸性基によって化学的に改変された時薬物送達及びゲスト分子のそれらの封入のためのｐＨ感受性制御放出系として研究されている。ＤＮＡを有するポリプロピレンイミンデンドリマーの細胞傷害性及び相互作用ならびにＤＡＢ ６４のトランスフェクション有効性もまた研究されている。
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号は、先行の報告に反して、ポリプロピレンイミンデンドリマーなどのカチオン性デンドリマーが、特異的標的化及び低毒性など、遺伝物質などの生理活性分子の標的化した送達において用いるのに好適な特性を示すという観察に基づく。加えて、カチオン性デンドリマーの誘導体もまた、生理活性分子の標的化された送達に好適な特性を示す。また、「カチオン性ポリアミンポリマー及びデンドリマーポリマーを含めた様々なポリマーは抗増殖活性を有することが示され、従って、新生物及び腫瘍、炎症性障害（自己免疫障害を含む）、乾癬及びアテローム性動脈硬化症など、望ましくない細胞増殖によって特徴付けられる障害の治療に有用であり得る。ポリマーは、単独で活性薬剤として用いられてもよく、または遺伝子療法用の薬物分子もしくは核酸など、他の治療剤の送達媒体として用いられてもよい。そのような場合、ポリマーそれ自体の固有の抗腫瘍活性が、送達される薬剤の活性を補完し得る」ことを開示するＢｉｏａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，米国特許出願公開第２００８０２６７９０３号も参照されたい。これらの特許公報の開示は、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（複数可）またはその成分（複数可）またはそれをコードする核酸分子（複数可）の送達に関する本明細書における教示と併せて用いられ得る。
超荷電タンパク質
超荷電タンパク質は、異常に高い理論上の正味正電荷または負電荷を有するエンジニアリングされたまたは天然に存在するタンパク質の一クラスであり、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（複数可）またはその成分（複数可）またはそれをコードする核酸分子（複数可）の送達に用いられ得る。超負電荷及び超正電荷の両方のタンパク質とも、熱的または化学的に誘導される凝集に耐える著しい能力を呈する。超正電荷タンパク質はまた、哺乳類細胞に侵入することも可能である。プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のタンパク質など、これらのタンパク質とカーゴを関連付けることが、インビトロ及びインビボの両方でこれらの巨大分子を哺乳類細胞に機能的に送達することを可能にし得る。２００７年に超荷電タンパク質の作成及び特徴付けが報告されている（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２９，１０１１０－１０１１２）。
哺乳類細胞へのＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡの非ウイルス性送達は、研究及び治療適用の両方に価値がある（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６，５６１－５６９）。精製＋３６ ＧＦＰタンパク質（または他の超正電荷タンパク質）を適切な無血清培地中でＲＮＡと混合して複合体化させた後、細胞に加える。この段階で血清を含めると、超荷電タンパク質－ＲＮＡ複合体の形成が阻害され、治療の有効性が低下する。以下のプロトコルが種々の細胞株に有効であることが分かっている（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１－６１１６）（しかしながら、具体的な細胞株に対して手順を最適化するには、タンパク質及びＲＮＡの用量を変化させるパイロット実験を行わなければならない）。（１）処理前日、４８ウェルプレートにウェル当たり１×１０５細胞をプレーティングする。（２）処理当日、最終濃度２００ｎＭとなるように精製＋３６ ＧＦＰタンパク質を無血清培地中に希釈する。５０ｎＭの最終濃度となるようにＲＮＡを加える。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。（３）インキュベーション中、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。（４）＋３６ ＧＦＰ及びＲＮＡのインキュベーション後、細胞にタンパク質－ＲＮＡ複合体を加える。（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。（６）インキュベーション後、培地を吸引し、２０Ｕ／ｍＬヘパリンＰＢＳで３回洗浄する。細胞を血清含有培地と共に、活性に関するアッセイに応じてさらに４８時間またはそれ以上インキュベートする。（７）免疫ブロット、ｑＰＣＲ、表現型アッセイ、または他の適切な方法によって細胞を分析する。
＋３６ ＧＦＰが様々な細胞で有効なプラスミド送達試薬であることをさらに見出した。プラスミドＤＮＡはｓｉＲＮＡよりも大きいカーゴであるため、プラスミドを有効に複合体化するためには、比例してさらなる＋３６ ＧＦＰタンパク質が必要になる。有効なプラスミド送達のため、本出願人らは、インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質に由来する公知のエンドソーム破壊ペプチドであるＣ末端ＨＡ２ペプチドタグを担持する＋３６ ＧＦＰの変異体を開発している。以下のプロトコルが種々の細胞において有効となっているが、上記の通り、プラスミドＤＮＡ及び超荷電タンパク質の用量を特定の細胞株及び送達の適用に最適化することが助言される。（１）処理前日、４８ウェルプレートにウェル当たり１×１０５をプレーティングする。（２）処理当日、無血清培地中の精製ｐ３６ ＧＦＰタンパク質を最終濃度２ｍＭとなるように希釈する。１ｍｇのプラスミドＤＮＡを加える。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。（３）インキュベーション中、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。（４）ｐ３６ ＧＦＰ及びプラスミドＤＮＡのインキュベーション後、タンパク質－ＤＮＡ複合体を細胞に穏やかに加える。（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。（６）インキュベーション後、培地を吸引し、ＰＢＳで洗浄する。血清含有培地中で細胞をインキュベートし、さらに２４～４８時間インキュベートする。（７）適宜、プラスミド送達を分析する（例えば、プラスミドによってドライブされる遺伝子発現による）。
また、例えば、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１－６１１６（２００９）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，７４７－７５２（２０１０）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８，８３３－８３８（２０１１）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５０３，２９３－３１９（２０１２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９（７），８３１－８４３（２０１２）も参照されたい。超荷電タンパク質の方法は、本発明のＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の送達に使用及び／または応用することができる。本明細書における文献のこれらの系を本明細書における教示と併せてＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（複数可）またはその成分（複数可）またはそれをコードする核酸分子（複数可）の送達に用いることができる。
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）
さらに別の実施形態では、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の送達に細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）が企図される。ＣＰＰは、（ナノサイズ粒子から化学的小分子及び大型ＤＮＡ断片に至るまでの）様々な分子カーゴの細胞取込みを促進する短鎖ペプチドである。用語「カーゴ」は、本明細書で使用する場合、限定はされないが、治療剤、診断プローブ、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、タンパク質、ナノ粒子を含めた粒子、リポソーム、発色団、小分子及び放射性物質からなる群を含む。本発明の態様では、カーゴにはまた、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の任意の成分またはＡＤ官能基化機能性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系全体も含まれ得る。本発明の態様は、所望のカーゴを対象に送達する方法をさらに提供し、この方法は、（ａ）本発明の細胞透過性ペプチドと所望のカーゴとを含む複合体を調製するステップ、及び（ｂ）複合体を対象に経口的に、関節内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、動脈内に（ｉｎｔｒａｒｔｅｒｉａｌｌｙ）、鼻腔内に、実質内に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、経皮的に、直腸内に、または局所的に投与するステップを含む。カーゴは、共有結合を介した化学的連結によるか、または非共有結合性の相互作用によるかのいずれかでペプチドと会合している。
ＣＰＰの機能は、カーゴを細胞内に送達することであり、これは一般的にはエンドサイトーシスを通じて起こるプロセスであって、カーゴは哺乳類生細胞のエンドソームに送達される。細胞透過性ペプチドのサイズ、アミノ酸配列、及び電荷は様々であるが、全てのＣＰＰが、細胞膜を移行しかつ細胞質または細胞小器官への様々な分子カーゴの送達を促進する能力である１つの個別的な特徴を有する。ＣＰＰの移行は、３つの主な侵入機構に分類し得る：膜における直接の透過、エンドサイトーシスを介する侵入、及び一過性構造の形成を通じた移行。ＣＰＰは、がん及びウイルス阻害剤、ならびに細胞標識用の造影剤を含め、種々の疾患の治療におけるドラッグデリバリー剤として医薬において数多くの適用が見出されている。後者の例としては、ＧＦＰ、ＭＲＩ造影剤、または量子ドットの担体としての働きが挙げられる。ＣＰＰには、研究及び医薬に用いられるインビトロ及びインビボ送達ベクターとして大きな可能性がある。ＣＰＰのアミノ酸組成は、典型的には、リシンもしくはアルギニンなど正電荷アミノ酸の高い相対存在量を含むか、または極性／荷電アミノ酸と非極性疎水性アミノ酸との交互のパターンを含む配列を有するかのいずれかである。これらの２つの構造タイプは、それぞれポリカチオン性または両親媒性と称される。第３のＣＰＰクラスは、非極性残基のみを含む疎水性ペプチドであり、これは正味電荷が低いかまたは細胞取込みに重要な疎水性アミノ酸基を有する。発見当初のＣＰＰの１つはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）由来のトランス活性化転写アクチベーター（Ｔａｔ）であり、これは多数の培養下細胞型によって周囲の培地から効率的に取り込まれることが見出された。それ以降、既知のＣＰＰの数は大幅に増え続け、より有効なタンパク質形質導入特性を有する小分子合成類似体が作成されている。ＣＰＰとしては、限定はされないが、ペネトラチン、Ｔａｔ（４８－６０）、トランスポータン、及び（Ｒ－ＡｈＸ－Ｒ４）（Ａｈｘ＝アミノヘキサノイル）が挙げられる。
米国特許第８，３７２，９５１号は、高い細胞透過性効率及び低毒性を呈する好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）から送達されるＣＰＰを提供する。ＣＰＰをそのカーゴで脊椎動物対象に送達する態様もまた提供されている。ＣＰＰ及びそれらの送達のさらなる態様は、米国特許第８，５７５，３０５号；同第８，６１４，１９４号及び同第８，０４４，０１９号に記載されている。ＣＰＰは、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系またはその成分の送達に使用することができる。ＣＰＰを用いてＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系またはその成分を送達できることはまた、論稿“Ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｂｙ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ”，Ｓｕｒｅｓｈ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，Ａｂｕ－Ｂｏｎｓｒａｈ Ｋｗａｋｕ Ｄａｄ，Ｊａｇａｄｉｓｈ Ｂｅｌｏｏｒ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４ Ａｐｒ ２．（全体として参照により援用される）にも提供されており、ここでは、ＣＰＰコンジュゲート組換えＣａｓ９タンパク質及びＣＰＰ複合体化ガイドＲＮＡによる処理が、ヒト細胞株における内因性遺伝子破壊につながることが実証されている。この論文では、Ｃａｓ９タンパク質は、チオエーテル結合によってＣＰＰにコンジュゲートされた一方、ガイドＲＮＡはＣＰＰと複合体化され、縮合した正電荷粒子を形成した。胚性幹細胞、皮膚線維芽細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、及び胚性癌腫細胞を含めたヒト細胞を改変Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡで同時に及び逐次的に処理すると、プラスミドトランスフェクションと比べてオフターゲット突然変異が低下した効率的な遺伝子破壊につながったことが示された。
エアロゾル送達
肺疾患の治療を受ける対象は、例えば、自発呼吸下で気管支内送達される薬学的有効量のエアロゾル化ＡＡＶベクター系の経肺投与を受けてもよい。このように、エアロゾル化送達は、一般にＡＡＶ送達に好ましい。送達には、アデノウイルスまたはＡＡＶ粒子が用いられ得る。各々が１つ以上の調節配列に作動可能に連結している好適な遺伝子構築物を送達ベクターにクローニングし得る。
パッケージング及びプロモーター
核酸分子発現をコードするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びアデノシンデアミナーゼのドライブに用いられるプロモーターには、ＡＡＶ ＩＴＲが含まれ得、これは、プロモーターとして役立ち得る。これは、追加のプロモーターエレメント（ベクター内で場所をとり得る）の必要性がなくなる点で有利である。空いた追加の空間を使用して、追加のエレメント（ｇＲＮＡなど）の発現をドライブすることができる。また、ＩＴＲ活性は比較的弱いため、Ｃａｓ１３の過剰発現による潜在的な毒性を軽減するために使用することができる。
偏在発現には、使用し得るプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖または軽鎖等が挙げられる。脳または他のＣＮＳでの発現には、全てのニューロン用のシナプシンＩ、興奮性ニューロン用のＣａＭＫＩＩα、ＧＡＢＡ作動性ニューロン用のＧＡＤ６７またはＧＡＤ６５またはＶＧＡＴを使用することができる。肝臓での発現には、アルブミンプロモーターを使用することができる。肺での発現には、ＳＰ－Ｂを使用することができる。内皮細胞には、ＩＣＡＭを使用することができる。造血細胞には、ＩＦＮβまたはＣＤ４５を使用することができる。骨芽細胞には、ＯＧ－２を使用することができる。
ガイドＲＮＡのドライブに用いられるプロモーターには、Ｕ６またはＨ１などのＰｏｌ ＩＩＩプロモーター、ならびにガイドＲＮＡを発現させるためのＰｏｌ ＩＩプロモーター及びイントロンカセットの使用が含まれ得る。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、アデノシンデアミナーゼ、及び１つ以上のガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルスまたは他のプラスミドもしくはウイルスベクタータイプを使用して、詳細には、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号（アデノウイルス用の製剤、用量）、同第８，４０４，６５８号（ＡＡＶ用の製剤、用量）及び同第５，８４６，９４６号（ＤＮＡプラスミド用の製剤、用量）ならびにレンチウイルス、ＡＡＶ及びアデノウイルスが関わる臨床試験及びそのような臨床試験に関する刊行物からの製剤及び用量を用いて送達することができる。例えば、ＡＡＶについて、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号及びＡＡＶが関わる臨床試験にある通りであってもよい。アデノウイルスについては、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号及びアデノウイルスが関わる臨床試験にある通りであってもよい。プラスミド送達については、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号及びプラスミドが関わる臨床試験にある通りであってもよい。用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば、男性成人ヒト）に基づくか、またはそれに対して外挿してもよく、異なる体重及び種の患者、対象、哺乳類用に調整することができる。投与頻度は、患者または対象の年齢、性別、全般的な健康、他の条件ならびに対処される特定の状態または症状を含めた通常の要因に応じて、医学または獣医学実務者（例えば、医師、獣医師）の範囲内である。ウイルスベクターは、目的の組織に注射することができる。細胞型特異的ゲノム改変について、Ｃａｓ１３の発現は細胞型特異的プロモーターによってドライブすることができる。例えば、肝臓特異的発現にはアルブミンプロモーターが用いられてもよく、及びニューロン特異的発現には（例えば、ＣＮＳ障害を標的化するため）シナプシンＩプロモーターが用いられてもよい。
インビボ送達に関しては、他のウイルスベクターと比べていくつかの理由でＡＡＶが有利である：低毒性（これは、免疫応答を活性化させ得る細胞粒子の超遠心が不要な精製方法に起因し得る）；及び宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入突然変異誘発を引き起こす確率の低さ。
ＡＡＶは、４．５または４．７５Ｋｂのパッケージング限界を有する。これは、Ｃａｓ１３ならびにプロモーター及び転写ターミネーターが全て同じウイルスベクターに収まる必要があることを意味する。４．５または４．７５Ｋｂよりも大きい構築物はウイルス産生の大幅な低下につながり得る。ＳｐＣａｓ９はかなり大きく、遺伝子それ自体が４．１Ｋｂを超えるため、ＡＡＶにパッケージングすることが困難である。従って、本発明の実施形態は、より短いＣａｓ１３のホモログを利用することを含む。
ＡＡＶに関して、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはこれらの任意の組み合わせであり得る。標的化しようとする細胞に関連するＡＡＶのＡＡＶを選択することができる；例えば、脳または神経細胞の標的化には、ＡＡＶ血清型１、２、５またはハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはこれらの任意の組み合わせを選択することができ；及び心臓組織の標的化には、ＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓への送達に有用である。本明細書におけるプロモーター及びベクターが個々に好ましい。これらの細胞に関する特定のＡＡＶ血清型の一覧は、以下の通りである（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７－５９１１（２００８）を参照されたい）。
Figure 2023134462000032
レンチウイルス
レンチウイルスは、有糸分裂細胞及び分裂終了細胞の両方でその遺伝子の感染能及び発現能を有する複合的レトロウイルスである。最も一般的に知られているレンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、これは、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を用いて広範囲の細胞型を標的化する。
レンチウイルスは、以下の通り調製し得る。ｐＣａｓＥＳ１０（これはレンチウイルストランスファープラスミド骨格を含有する）のクローニング後、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴをＴ－７５フラスコに５０％コンフルエンスとなるように播種し、その翌日、１０％ウシ胎仔血清含有及び抗生物質不含のＤＭＥＭ中でトランスフェクトした。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行った。細胞に１０μｇのレンチウイルストランスファープラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）及び以下のパッケージングプラスミド：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ－ｇシュードタイプ）、及び７．５ｕｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）をトランスフェクトした。トランスフェクションは、カチオン性脂質デリバリー剤（５０ｕＬ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及び１００ｕｌ Ｐｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬ ＯｐｔｉＭＥＭ中で行った。６時間後、培地を１０％ウシ胎仔血清を含む抗生物質不含ＤＭＥＭに交換した。これらの方法では、細胞培養中に血清を使用するが、無血清方法が好ましい。
レンチウイルスは、以下の通り精製し得る。４８時間後にウイルス上清を回収した。初めに上清から残屑を除去し、０．４５ｕｍ低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルターでろ過した。次にそれを超遠心機において２４，０００ｒｐｍで２時間スピンした。ウイルスペレットを５０ｕｌのＤＭＥＭ中に４℃で一晩再懸濁した。次にそれをアリコートに分け、直ちに－８０℃で凍結した。
別の実施形態では、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースとする最小限の非霊長類レンチウイルスベクターもまた、特に眼遺伝子療法に企図される（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６；８：２７５－２８５を参照されたい）。別の実施形態では、滲出型（ｗｅｂ ｆｏｒｍ）の加齢黄斑変性症の治療のため網膜下注射によって送達される血管新生抑制タンパク質エンドスタチン及びアンジオスタチンを発現するウマ伝染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子療法ベクターであるＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）もまた企図され（例えば、Ｂｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２３：９８０－９９１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１２）を参照されたい）、このベクターは、本発明のＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系向けに改変し得る。
別の実施形態では、ＨＩＶ ｔａｔ／ｒｅｖによって共有される共通のエクソンを標的化するｓｉＲＮＡと、核小体局在ＴＡＲデコイと、抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッド型リボザイムとを含む自己不活性化レンチウイルスベクター（例えば、ＤｉＧｉｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２：３６ｒａ４３を参照されたい）を本発明のＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に使用し及び／または適合させてもよい。患者の体重１キログラム当たり最低２．５×１０６個のＣＤ３４＋細胞を収集し、２μｍｏｌ／Ｌ－グルタミン、幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びトロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含有するＸ－ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ）中２×１０６細胞／ｍｌの密度でで１６～２０時間予備刺激し得る。フィブロネクチン（２５ｍｇ／ｃｍ２）（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ，Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）で被膜した７５ｃｍ２組織培養フラスコにおいて、予備刺激した細胞をレンチウイルスによって感染多重度５で１６～２４時間にわたって形質導入し得る。
レンチウイルスベクターについては、パーキンソン病の治療にある通り開示されており、例えば、米国特許出願公開第２０１２０２９５９６０号ならびに米国特許第７３０３９１０号及び同第７３５１５８５号を参照されたい。レンチウイルスベクターはまた、眼疾患の治療についても開示されており、例えば、米国特許出願公開第２００６０２８１１８０号、同第２００９０００７２８４号、同第２０１１０１１７１８９号；同第２００９００１７５４３号；同第２００７００５４９６１号、同第２０１００３１７１０９号を参照されたい。レンチウイルスベクターはまた、脳への送達についても開示されており、例えば、米国特許出願公開第２０１１０２９３５７１号；同第２０１１０２９３５７１号、同第２００４００１３６４８号、同第２００７００２５９７０号、同第２００９０１１１１０６号及び米国特許第７２５９０１５号を参照されたい。
非動物生物への適用
系（複数可）（例えば、単一のまたは多重化した）は、作物ゲノミクスにおける近年の進歩と併せて用いることができる。本明細書に記載される系を使用して、効率的でかつ対費用効果の高い植物遺伝子またはゲノムの探索または編集または操作を－例えば、植物遺伝子またはゲノムの迅速な調査及び／または選択及び／または探索及び／または比較及び／または操作及び／または形質転換のため、実施することができ；例えば、形質（複数可）もしくは特徴（複数可）を作出し、同定し、開発し、最適化し、もしくは植物（複数可）に付与し、または植物ゲノムを形質転換することができる。従って、植物の生産の向上、新規組み合わせの形質もしくは特徴を有する新規植物、または形質が増強された新規植物があり得る。系は、植物に関して、部位特異的組み込み（ＳＤＩ）または遺伝子編集（ＧＥ）または任意の準逆育種（ＮＲＢ）もしくは逆育種（ＲＢ）技術において使用することができる。本明細書に記載されるＣａｓ１３エフェクタータンパク質系を利用する態様は、植物におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）系の使用と同様であってもよく、アリゾナ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ）ウェブサイト「ＣＲＩＳＰＲ－ＰＬＡＮＴ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｒｉｚｏｎａ．ｅｄｕ／ｃｒｉｓｐｒ／）（後援Ｐｅｎｎ Ｓｔａｔｅ及びＡＧＩ）が挙げられる。本発明の実施形態は、植物におけるゲノム編集で、またはＲＮＡｉもしくは同様のゲノム編集技術が既に用いられているところで用いることができる；例えば、Ｎｅｋｒａｓｏｖ，“Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｍａｄｅ ｅａｓｙ：ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ，”Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３，９：３９（ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４６－４８１１－９－３９）；Ｂｒｏｏｋｓ，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ，”Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４ ｐｐ １１４．２４７５７７；Ｓｈａｎ，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，６８６－６８８（２０１３）；Ｆｅｎｇ，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ，”Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）２３：１２２９－１２３２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２０１３．１１４；オンライン発行 ２０ Ａｕｇｕｓｔ ２０１３；Ｘｉｅ，“ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ，”Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１３ Ｎｏｖ；６（６）：１９７５－８３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｐ／ｓｓｔ１１９．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｕｇ １７；Ｘｕ，“Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｒｉｃｅ，”Ｒｉｃｅ ２０１４，７：５（２０１４）、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ＳＮＰｓ ｆｏｒ ｂｉａｌｌｅｌｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ ｗｏｏｄｙ ｐｅｒｅｎｎｉａｌ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｒｅｖｅａｌｓ ４－ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ ｌｉｇａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ，”Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ（２０１５）（Ｆｏｒｕｍ）１－４（ｗｗｗ．ｎｅｗｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ．ｃｏｍにおいてオンラインでのみ入手可能）；Ｃａｌｉａｎｄｏ ｅｔ ａｌ，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ ＤＮＡ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｖｉｃｅ ｓｔａｂｌｙ ｃａｒｒｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｇｅｎｏｍｅ，”ＮＡＴＵＲＥ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ ６：６９８９，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９８９，ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９８９；米国特許第６，６０３，０６１号－Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ；米国特許第７，８６８，１４９号－Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ及び米国特許出願公開第２００９／０１００５３６号－Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ Ｔｒａｉｔｓ（これらの各々の内容及び開示は全て、本明細書において全体として参照により援用される）を参照されたい。本発明の実施では、Ｍｏｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ“Ｃｒｏｐ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ｄｅｃ ２９；１３（２）：８５－９６の内容及び開示；その各々が、本明細書における実施形態が植物に関してどのように用いられ得るかに関してを含め、参照により本明細書に援用される。従って、本明細書において動物細胞への言及はまた、特に明らかでない限り、適宜補正して植物細胞にも適用し得る；ならびに、オフターゲット効果が低下した本明細書における酵素及びかかる酵素を利用する系は、本明細書に記載するものを含め、植物適用に用いることができる。
植物及び酵母への適用
一般に、用語「植物」は、細胞分裂によって特徴的に成長し、葉緑体を含有し、及びセルロースで構成される細胞壁を有する植物界（Ｐｌａｎｔａｅ）の任意の様々な光合成生物、真核生物、単細胞生物または多細胞生物に関する。用語の植物には、単子葉及び双子葉植物が包含される。具体的には、植物には、限定なしに、アカシア、アルファルファ、アマランス、リンゴ、アンズ、チョウセンアザミ、トネリコの木、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ類、テンサイ、カバノキ、ブナノキ、クロイチゴ、ブルーベリー、ブロッコリー、メキャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタループ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、ヒマラヤスギ、穀物、セロリ、クリ、サクランボ、ハクサイ、柑橘類、クレメンタイン、クローバ、コーヒー、トウモロコシ、ワタ、ササゲ、キュウリ、イトスギ、ナス、ニレ、エンダイブ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、モミ、ゼラニウム、ブドウ、グレープフルーツ、ラッカセイ類、ホオズキ、ガムヘムロック、ヒッコリー、ケール、キーウィフルーツ、コールラビ、カラマツ、レタス、ニラ、レモン、ライム、ニセアカシア、マツ、メイデンヘア、トウモロコシ、マンゴー、カエデ、メロン、キビ、キノコ、カラシ、堅果類、オーク、オートムギ、油ヤシ、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞植物または装飾花または観賞樹、パパイヤ、ヤシ、パセリ、パースニップ、エンドウマメ、モモ、ピーナッツ、セイヨウナシ、ピート、コショウ、カキ、キマメ、マツ、パイナップル、オオバコ、セイヨウスモモ、ザクロ、ジャガイモ、カボチャ、赤チコリ、ダイコン、ナタネ、キイチゴ、コメ、ライムギ、モロコシ、ベニバナ、サルヤナギ、ダイズ、ホウレンソウ、エゾマツ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、スイートコーン、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、樹木、ライ小麦、芝草、カブ、つる植物、クルミ、オランダガラシ、スイカ、コムギ、ヤムイモ、イチイ、及びズッキーニなどの被子植物及び裸子植物が含まれることが意図される。用語の植物にはまた、それらに根、葉及び高等植物を特徴付ける他の器官がないことによって主に統一された、大部分が光独立栄養生物である藻類も包含される。
本明細書に記載される通りの系を使用したゲノム編集方法を用いることにより、本質的にいかなる植物にも所望の形質を付与することができる。本明細書に記載される所望の生理学的及び農学的特性について、本開示の核酸構築物及び上述の様々な形質転換方法を用いて多種多様な植物及び植物細胞系をエンジニアリングし得る。好ましい実施形態では、エンジニアリングの標的となる植物及び植物細胞としては、限定はされないが、穀類作物（例えば、コムギ、トウモロコシ、コメ、キビ、オオムギ）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）；顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹及びマツの木（例えば、モミ、エゾマツ）；ファイトレメディエーションで用いられる植物（例えば、重金属蓄積植物）；油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）及び実験目的で用いられる植物（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）を含めた作物など、単子葉及び双子葉植物が挙げられる。従って、本方法及び系は、広範囲の植物にわたり、例えば、Ｍａｇｎｉｏｌａｌｅｓ、Ｉｌｌｉｃｉａｌｅｓ、Ｌａｕｒａｌｅｓ、Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ、Ａｒｉｓｔｏｃｈｉａｌｅｓ、Ｎｙｍｐｈａｅａｌｅｓ、Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ、Ｐａｐｅｖｅｒａｌｅｓ、Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ、Ｔｒｏｃｈｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ、Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｌｅｓ、Ｅｕｃｏｍｉａｌｅｓ、Ｌｅｉｔｎｅｒｉａｌｅｓ、Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｃａｓｕａｒｉｎａｌｅｓ、Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ、Ｂａｔａｌｅｓ、Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ、Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｌｅｓ、Ｄｉｌｌｅｎｉａｌｅｓ、Ｔｈｅａｌｅｓ、Ｍａｌｖａｌｅｓ、Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ、Ｌｅｃｙｔｈｉｄａｌｅｓ、Ｖｉｏｌａｌｅｓ、Ｓａｌｉｃａｌｅｓ、Ｃａｐｐａｒａｌｅｓ、Ｅｒｉｃａｌｅｓ、Ｄｉａｐｅｎｓａｌｅｓ、Ｅｂｅｎａｌｅｓ、Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ、Ｒｏｓａｌｅｓ、Ｆａｂａｌｅｓ、Ｐｏｄｏｓｔｅｍａｌｅｓ、Ｈａｌｏｒａｇａｌｅｓ、Ｍｙｒｔａｌｅｓ、Ｃｏｒｎａｌｅｓ、Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ、Ｓａｎ ｔａｌｅｓ、Ｒａｆｆｌｅｓｉａｌｅｓ、Ｃｅｌａｓｔｒａｌｅｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ、Ｒｈａｍｎａｌｅｓ、Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ、Ｊｕｇｌａｎｄａｌｅｓ、Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ、Ｐｏｌｙｇａｌａｌｅｓ、Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ、Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ、Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ、Ｌａｍｉａｌｅｓ、Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｌｅｓ、Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｌｅｓ、Ｃａｍｐａｎｕｌａｌｅｓ、Ｒｕｂｉａｌｅｓ、Ｄｉｐｓａｃａｌｅｓ、及びＡｓｔｅｒａｌｅｓに属する双子葉植物などで用いることができる；本方法及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ、Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｌｅｓ、Ｎａｊａｄａｌｅｓ、Ｔｒｉｕｒｉｄａｌｅｓ、Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ、Ｅｒｉｏｃａｕｌａｌｅｓ、Ｒｅｓｔｉｏｎａｌｅｓ、Ｐｏａｌｅｓ、Ｊｕｎｃａｌｅｓ、Ｃｙｐｅｒａｌｅｓ、Ｔｙｐｈａｌｅｓ、Ｂｒｏｍｅｌｉａｌｅｓ、Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ、Ａｒｅｃａｌｅｓ、Ｃｙｃｌａｎｔｈａｌｅｓ、Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ、Ａｒａｌｅｓ、Ｌｉｌｌｉａｌｅｓ、及びＯｒｃｈｉｄ ａｌｅｓに属するものなどの単子葉植物、またはＧｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅに属する植物、例えば、Ｐｉｎａｌｅｓ、Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ、Ｃｙｃａｄａｌｅｓ、Ａｒａｕｃａｒｉａｌｅｓ、Ｃｕｐｒｅｓｓａｌｅｓ及びＧｎｅｔａｌｅｓに属するもので用いることができる。
本明細書に記載される系及び使用方法は、以下の双子葉類、単子葉類または裸子植物の属の非限定的なリストに含まれる広範囲にわたる植物種に用いることができる：Ａｔｒｏｐａ、Ａｌｓｅｏｄａｐｈｎｅ、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｂｅｉｌｓｃｈｍｉｅｄｉａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ、Ｃｏｃｃｕｌｕｓ、Ｃｒｏｔｏｎ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ、Ｃｏｃｏｓ、Ｃｏｆｆｅａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｄｕｇｕｅｔｉａ、Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｚｉａ、Ｆｉｃｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｇｌａｕｃｉｕｍ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｈｅｖｅａ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｌａｎｄｏｌｐｈｉａ、Ｌｉｎｕｍ、Ｌｉｔｓｅａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｌｕｐｉｎｕｓ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｍａｌｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｌｅａ、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ、Ｐａｐａｖｅｒ、Ｐｅｒｓｅａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｔａｃｉａ、Ｐｉｓｕｍ、Ｐｙｒｕｓ、Ｐｒｕｎｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓｉｎｏｍｅｎｉｕｍ、Ｓｔｅｐｈａｎｉａ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｃｉａ、Ｖｉｎｃａ、Ｖｉｌｉｓ、及びＶｉｇｎａ；ならびにＡｌｌｉｕｍ、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ、Ａｒａｇｒｏｓｔｉｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｖｅｎａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｆｅｓｔｕｌｏｌｉｕｍ、Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｌｅｍｎａ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｍｕｓａ、Ｏｒｙｚａ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐａｎｎｅｓｅｔｕｍ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｚｅａ、Ａｂｉｅｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａ、Ｅｐｈｅｄｒａ、Ｐｉｃｅａ、Ｐｉｎｕｓ、及びＰｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ。
系及び使用方法はまた、例えば、Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ（紅藻類）、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ（緑藻類）、Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ（褐藻類）、Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ（珪藻類）、Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ及び渦鞭毛藻類を含むいくつかの真核生物の門、ならびに原核生物の門、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（藍藻類）から選択される藻類（ａｌｇｅａ）を含め、広範囲にわたる「藻類」または「藻類細胞」にも用いることができる。用語「藻類」には、例えば、Ａｍｐｈｏｒａ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎｉｋｓｔｒｏｄｅｓｍｉｓ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｅｍｉｌｉａｎａ、Ｅｕｇｌｅｎａ、Ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｍｏｎｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｎａｎｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｎａｖｉｃｕｌａ、Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｏｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｒｔｏｒｉａ、Ｐａｖｌｏｖａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｐｌａｙｔｍｏｎａｓ、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｐｏｒｈｙｒａ、Ｐｓｅｕｄｏａｎａｂａｅｎａ、Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ、Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍから選択される藻類が含まれる。
植物の一部、すなわち「植物組織」を本発明の方法に従い処理して改良された植物を作り出し得る。植物組織は植物細胞も包含する。用語「植物細胞」は、本明細書で使用する場合、インタクトな全植物であるか、あるいはインビトロ組織培養下に培地もしくは寒天上で、成長培地もしくは緩衝液中の懸濁液中で、または高度に組織化された単位、例えば、植物組織、植物器官、もしくは全植物などの一部として成長した単離された形態であるかのいずれかの、生きている植物の個々の単位を指す。
「プロトプラスト」は、その細胞壁を再形成し、増殖し及び再生して適切な成長条件下で全植物に成長することのできる生きている植物のインタクトな生化学的にコンピテントな単位が生じるようにその保護細胞壁が例えば、機械的または酵素的手段を用いて完全にまたは部分的に除去された植物細胞を指す。
用語「形質転換」は、広義には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａまたは種々の化学的もしくは物理的方法の１つを用いたＤＮＡの導入によって植物宿主が遺伝子改変される方法を指す。本明細書で使用する場合、用語「植物宿主」は、植物の任意の細胞、組織、器官、または子孫を含め、植物を指す。多くの好適な植物組織または植物細胞を形質転換することができ、限定はされないが、プロトプラスト、体細胞胚、花粉、葉、実生、茎、カルス、走根、微小管、及び苗条が挙げられる。植物組織はまた、有性生殖的に生成されたか、それとも無性生殖的に生成されたかに関わらず、かかる植物、種子、子孫、ムカゴの任意のクローン、及び挿し木または種子など、これらのいずれかの子孫も指す。
用語「形質転換された」は、本明細書で使用する場合、構築物などの外来性ＤＮＡ分子が導入されている細胞、組織、器官、または生物を指す。導入されたＤＮＡ分子は、導入されたＤＮＡ分子が後続の子孫に伝わるようにレシピエント細胞、組織、器官、または生物のゲノムＤＮＡに組み込まれてもよい。これらの実施形態では、「形質転換」または「トランスジェニック」細胞または植物にはまた、その細胞または植物の子孫、及び交雑でかかる形質転換植物を親として用いる育種計画から作り出された、かつ導入されたＤＮＡ分子の存在によって生じる表現型の変化を呈する子孫も含まれ得る。好ましくは、トランスジェニック植物は稔性であり、導入されたＤＮＡを有性生殖を通じて子孫に伝えることが可能である。
トランスジェニック植物の子孫など、用語「子孫」は、植物またはトランスジェニック植物から生まれるか、それから作り出されたか、またはそれに由来するものである。導入ＤＮＡ分子はまた、レシピエント細胞に一過性に導入されてもよく、そのため導入ＤＮＡ分子は後続の子孫によって受け継がれないことになり、従って「トランスジェニック」とは見なされない。従って、本明細書で使用する場合、「非トランスジェニック」植物または植物細胞は、そのゲノムに安定に組み込まれた外来ＤＮＡを含有しない植物である。
用語「植物プロモーター」は、本明細書で使用する場合、その起源が植物細胞であるか否かに関わらず、植物細胞において転写を開始させる能力を有するプロモーターである。例示的な適した植物プロモーターとしては、限定はされないが、植物、植物ウイルス、及び植物細胞で発現する遺伝子を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＲｈｉｚｏｂｉｕｍなどの細菌から得られるものが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「真菌細胞」は、真菌類の界内にある任意の種類の真核細胞を指す。真菌類の界内にある門としては、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ、及びＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇｏｍｙｃｏｔａが挙げられる。真菌細胞には、酵母、カビ、及び糸状菌類が含まれ得る。いくつかの実施形態では、真菌細胞は、酵母細胞である。
本明細書で使用する場合、用語「酵母細胞」は、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ及びＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａの範囲内にある任意の真菌細胞を指す。酵母細胞には、出芽酵母細胞、分裂酵母細胞、及びカビ細胞が含まれ得る。これらの生物に限定されないが、研究室及び工業環境で使用される多くの種類の酵母が、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａの一部である。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｒｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、またはＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ細胞である。他の酵母細胞としては、限定なしに、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ）（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、及びＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、別名Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ及びＣａｎｄｉｄａ ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）を挙げることができる。いくつかの実施形態では、真菌細胞は糸状菌細胞である。本明細書で使用する場合、用語「糸状菌細胞」は、フィラメント状に、すなわち菌糸または菌糸体として成長する任意の種類の真菌細胞を指す。糸状菌細胞の例としては、限定なしに、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、及びＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、真菌細胞は、工業用菌株である。本明細書で使用する場合、「工業用菌株」は、工業的プロセス、例えば、商業的または工業的規模での製品の生産において使用されるかまたはそれから単離される真菌細胞の任意の株を指す。工業用菌株は、典型的に工業的プロセスで使用される真菌種を指してもよく、またはそれは、非工業目的（例えば、実験研究）にもまた用いられ得る真菌種の分離株を指してもよい。工業的プロセスの例としては、発酵（例えば、食品または飲料製品の生産における）、蒸留、バイオ燃料生産、化合物の生産、及びポリペプチドの生産を挙げることができる。工業用菌株の例としては、限定なしに、ＪＡＹ２７０及びＡＴＣＣ４１２４を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、真菌細胞は倍数体細胞である。本明細書で使用する場合、「倍数体」細胞は、ゲノムが２つ以上のコピーで存在する任意の細胞を指し得る。倍数体細胞は、天然で倍数体状態で見られる種類の細胞を指してもよく、またはそれは、倍数体状態で存在するように（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはＤＮＡ複製の特定の調節、変化、不活性化、活性化、または改変によって）誘導された細胞を指してもよい。倍数体細胞は、ゲノム全体が倍数体である細胞を指してもよく、またはそれは、特定の目的のゲノム遺伝子座において倍数体である細胞を指してもよい。理論に拘束されることを望むものではないが、一倍体細胞と比べて倍数体細胞のゲノムエンジニアリングにおいてはより多くの場合にガイドＲＮＡの存在量が律速成分となり得るため、本明細書に記載される系を用いた方法は、ある特定の真菌細胞タイプを使用することの利点を生かし得ると考えられる。
いくつかの実施形態では、真菌細胞は、二倍体細胞である。本明細書で使用する場合、「二倍体」細胞は、ゲノムが２つのコピーで存在する任意の細胞を指し得る。二倍体細胞は、天然で二倍体状態で見られる種類の細胞を指してもよく、またはそれは、二倍体状態で存在するように（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはＤＮＡ複製の特定の調節、変化、不活性化、活性化、または改変によって）誘導された細胞を指してもよい。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ２２８Ｃは、一倍体または二倍体状態で維持され得る。二倍体細胞は、ゲノム全体が二倍体である細胞を指してもよく、またはそれは、特定の目的のゲノム遺伝子座において二倍体である細胞を指してもよい。いくつかの実施形態では、真菌細胞は、一倍体細胞である。本明細書で使用する場合、「一倍体」細胞は、ゲノムが１つのコピーで存在する任意の細胞を指し得る。一倍体細胞は、天然で一倍体状態で見られる種類の細胞を指してもよく、またはそれは、一倍体状態で存在するように（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはＤＮＡ複製の特定の調節、変化、不活性化、活性化、または改変によって）誘導された細胞を指してもよい。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ２２８Ｃは、一倍体または二倍体状態で維持され得る。一倍体細胞は、ゲノム全体が一倍体である細胞を指してもよく、またはそれは、特定の目的のゲノム遺伝子座において一倍体である細胞を指してもよい。
本明細書で使用する場合、「酵母発現ベクター」は、ＲＮＡ及び／またはポリペプチドをコードする１つ以上の配列を含有する核酸であって、かつその核酸（複数可）の発現を制御する任意の所望のエレメント、ならびに酵母細胞内部における発現ベクターの複製及び維持を可能にする任意のエレメントをさらに含有し得る核酸を指す。多くの好適な酵母発現ベクター及びそれらの特徴が当該技術分野において公知である；例えば、様々なベクター及び技術が、Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｘｉａｏ，Ｗ．，ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７）及びＢｕｃｋｈｏｌｚ，Ｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｌｅｅｓｏｎ，Ｍ．Ａ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９（１１）：１０６７－７２に例示されている。酵母ベクターは、限定なしに、セントロメア（ＣＥＮ）配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、目的の配列または遺伝子に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーターなどのターミネーター、複製起点、及びマーカー遺伝子（例えば、栄養要求体、抗生物質、または他の選択可能マーカー）を含有し得る。酵母において用いられる発現ベクターの例としては、プラスミド、酵母人工染色体、２μプラスミド、酵母組み込みプラスミド、酵母複製プラスミド、シャトルベクター、及びエピソームプラスミドを挙げることができる。
植物及び植物細胞のゲノムにおける系成分の安定組み込み
ある特定の実施形態では、植物細胞のゲノムに安定に組み込むため系の成分をコードするポリヌクレオチドを導入することが想定される。これらの実施形態では、形質転換ベクターまたは発現系の設計は、いつ、どこで、及びどのような条件下でガイドＲＮＡ及び／またはアデノシンデアミナーゼ及びＣａｓ１３の融合タンパク質を発現させるかに応じて調整し得る。
ある特定の実施形態では、系の成分を植物細胞のゲノムＤＮＡに安定に導入することが想定される。それに加えてまたは代えて、限定はされないが、プラスチド、ミトコンドリアまたは葉緑体などの植物細胞小器官のＤＮＡに安定に組み込むため系の成分を導入することが想定される。
植物細胞のゲノムに安定に組み込むための発現系は、以下のエレメントの１つ以上を含有し得る：植物細胞においてＲＮＡ及び／またはアデノシンデアミナーゼ及びＣａｓ１３の融合タンパク質を発現させるために使用し得るプロモーターエレメント；発現を増強する５’非翻訳領域；単子葉植物細胞など、ある特定の細胞における発現をさらに増強するイントロンエレメント；ガイドＲＮＡ及び／またはアデノシンデアミナーゼ及びＣａｓ１３の融合タンパク質をコードする配列及び他の所望のエレメントを挿入するのに好都合な制限部位を提供する多クローニング部位；及び発現した転写物の効率的な終止をもたらす３’非翻訳領域。
発現系のエレメントは、プラスミドもしくは形質転換ベクターなどの環状か、または線状二本鎖ＤＮＡなどの非環状かのいずれかである１つ以上の発現構築物上にあってもよい。
ある特定の実施形態では、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ発現系は、少なくとも：植物の標的配列とハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、ガイドＲＮＡが、ガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む、ヌクレオチド配列、ならびにアデノシンデアミナーゼ及びＣａｓ１３の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、成分（ａ）または（ｂ）は、同じまたは異なる構築物上に位置し、及びそれによって異なるヌクレオチド配列が、植物細胞において作動可能な同じまたは異なる調節エレメントの制御下にあることができる。
系の成分、及び適用可能な場合には鋳型配列を含有するＤＮＡ構築物（複数可）は、種々の従来技術によって植物、植物部位、または植物細胞のゲノムに導入し得る。このプロセスには、概して、好適な宿主細胞または宿主組織を選択するステップ、宿主細胞または宿主組織に構築物（複数可）を導入するステップ、及びそれから植物細胞または植物を再生するステップが含まれる。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、限定はされないが、電気穿孔、マイクロインジェクション、植物細胞プロトプラストのエアロゾルビーム注入などの技術を用いて植物細胞に導入してもよく、またはＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ粒子衝撃などの微粒子銃法を用いて植物組織に直接導入することもできる（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｆｅｂ；９（１）：１１－９も参照されたい）。粒子衝撃の基本は、１つ以上の目的の遺伝子で被膜された粒子を細胞に向けて加速させることにより粒子を原形質に侵入させて、典型的にはゲノムへの安定組み込みを得るというものである（例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｈ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）、Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）を参照されたい）。
ある特定の実施形態では、系の成分を含有するＤＮＡ構築物は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換によって植物に導入し得る。ＤＮＡ構築物を好適なＴ－ＤＮＡ隣接領域と組み合わせて、従来のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主ベクターに導入し得る。外来ＤＮＡは、植物を感染させることによるか、または植物プロトプラストを、１つ以上のＴｉ（腫瘍誘発）プラスミドを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌と共にインキュベートすることにより、植物のゲノムに取り入れることができる（例えば、Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）及び米国特許第５，５６３，０５５号を参照されたい）。
植物プロモーター
植物細胞における適切な発現を確実にするために、本明細書に記載される系の成分は、典型的には植物プロモーター、すなわち、植物細胞において作動可能なプロモーターの制御下に置かれる。異なる種類のプロモーターの使用が想定される。
構成的植物プロモーターは、それが制御するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を植物の全てまたはほぼ全ての発生段階において全てまたはほぼ全ての植物組織中で発現（「構成的発現」と称される）させることが可能なプロモーターである。構成的プロモーターの非限定的な１つの例は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターである。「調節型プロモーター」は、構成的でないものの時間的及び／または空間的に調節された形で遺伝子発現を導くプロモーターを指し、組織特異的、組織優先的及び誘導性プロモーターが含まれる。異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を導き得る。ある特定の実施形態では、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ成分の１つ以上が、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなどの構成的プロモーターの制御下で発現し、組織優先的プロモーターを利用することにより、特定の植物組織内のある種の細胞型、例えば、葉もしくは根の維管束細胞または種子の特異細胞における発現の増強を標的化することができる。系において用いられる詳細なプロモーターの例については、Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：７９２－８０３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ １２：２５５－６５；Ｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０：２０７－１８、Ｋｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９：７５９－７２、及びＣａｐａｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：６８１－９１が参照される。
誘導性プロモーターは、限られた条件下で、系の成分の１つ以上を発現し、デアミナーゼの非特異的活性を回避する目的であり得る。ある特定の実施形態では、系の１つ以上のエレメントは、誘導性プロモーターの制御下で発現される。誘導性で、かつ遺伝子編集または遺伝子発現を時空間的に制御することが可能なプロモーターの例は、ある形態のエネルギーを使用し得る。エネルギーの形態としては、限定はされないが、音響エネルギー、電磁放射線、化学エネルギー及び／または熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例としては、テトラサイクリン誘導性プロモーター（ＴｅｔオンまたはＴｅｔオフ）、小分子２ハイブリッド転写活性化系（ＦＫＢＰ、ＡＢＡなど）、または光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、またはクリプトクロム）、例えば、転写活性の配列特異的変化を導く光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）が挙げられる。光誘導性系の成分には、アデノシンデアミナーゼ及びＣａｓ１３の融合タンパク質、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来）が含まれ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法のさらなる例が、ＵＳ６１／７３６４６５及びＵＳ６１／７２１，２８３（本明細書によって全体として参照により援用される）に提供される。
ある特定の実施形態では、一過性または誘導性発現は、例えば、化学物質調節型プロモーターを使用して実現することができ、すなわち、それによって外因性化学物質を加えると遺伝子発現が誘導される。遺伝子発現の調節はまた、化学物質抑制性プロモーターによっても達成することができ、ここでは、化学物質を加えると遺伝子発現が抑制される。化学物質誘導性プロモーターとしては、限定はされないが、ベンゼンスルホンアミド系除草剤解毒剤によって活性化するトウモロコシｌｎ２－２プロモーター（Ｄｅ Ｖｅｙｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：５６８－７７）、発芽前除草剤として使用される疎水性求電子化合物によって活性化するトウモロコシＧＳＴプロモーター（ＧＳＴ－ＩＩ－２７、ＷＯ９３／０１２９４）、及びサリチル酸によって活性化するタバコＰＲ－１ａプロモーター（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６８：８０３－７）が挙げられる。テトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制性プロモーターなど、抗生物質によって調節されるプロモーターもまた（Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２７：２２９－３７；米国特許第５，８１４，６１８号及び同第５，７８９，１５６号）、本明細書において使用することができる。
特定の植物細胞小器官への転位及び／またはそこでの発現
発現系は、特定の植物細胞小器官に転位し及び／またはそこで発現するためのエレメントを含み得る。
葉緑体ターゲティング
ある特定の実施形態では、系を用いて葉緑体遺伝子を特異的に改変し、または葉緑体における発現を確実にすることが想定される。この目的で、葉緑体形質転換方法またはＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ成分の葉緑体への区画化が用いられる。例えば、プラスチドゲノムに遺伝子改変を導入すると、花粉を通じた遺伝子流動などのバイオセーフティ問題を軽減することができる。
葉緑体形質転換方法は、当該技術分野において公知であり、粒子衝撃、ＰＥＧ処理、及びマイクロインジェクションが挙げられる。加えて、ＷＯ２０１００６１１８６に記載される通り、核ゲノムからプラスチドへの形質転換カセットの転位が関わる方法を用いることができる。
あるいは、ＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲ成分の１つ以上を植物葉緑体に標的化することが想定される。これは、アデノシンデアミナーゼ及びＣａｓ１３の融合タンパク質をコードする配列の５’領域に作動可能に連結された、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）またはプラスチド輸送ペプチドをコードする配列を発現構築物に取り込むことにより実現する。ＣＴＰは、葉緑体への転位中にプロセシング段階で除去される。発現タンパク質の葉緑体標的化は、当業者に周知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｔｏ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ，２０１０，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６１：１５７－１８０を参照されたい）。かかる実施形態では、ガイドＲＮＡを植物葉緑体に標的化することもまた望ましい。葉緑体局在化配列を用いてガイドＲＮＡを葉緑体に転位させるために用いることのできる方法及び構築物については、例えば、ＵＳ２００４０１４２４７６（参照により本明細書に援用される）に記載されている。かかる各種の構築物を本発明の発現系に取り込むことにより、系成分を効率的に転位させることができる。
藻類細胞における系をコードするポリヌクレオチドの導入
トランスジェニック藻類（または他の植物、例えば、セイヨウアブラナ）が、植物油もしくはバイオ燃料、例えば、アルコール（特にメタノール及びエタノール）または他の生成物の生産において特に有用であり得る。これらは、油またはバイオ燃料産業で使用される油またはアルコールを高度に発現または過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
ＵＳ８９４５８３９は、Ｃａｓ９を用いた微細藻類（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ細胞）種）のエンジニアリング方法について記載している。類似のツールを使用して、本明細書に記載される系の方法をＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ種及び他の藻類に適用することができる。ある特定の実施形態では、Ｈｓｐ７０Ａ－Ｒｂｃ Ｓ２またはβ２－チューブリンなどの構成的プロモーターの制御下でアデノシンデアミナーゼ及びＣａｓ１３の融合タンパク質を発現するベクターを使用して発現する藻類に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１３）、アデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアプタマー結合アダプタータンパク質に融合され得る）、及びガイドＲＮＡが導入される。ガイドＲＮＡは、任意選択で、Ｔ７プロモーターを含有するベクターを使用して送達される。あるいは、藻類細胞にＣａｓ１３ ｍＲＮＡ及びインビトロ転写ガイドＲＮＡが送達されてもよい。当業者には、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓエンジニアリングキットからの標準的な推奨プロトコルなど、電気穿孔プロトコルが利用可能である。
酵母細胞における系成分の導入
ある特定の実施形態では、本発明は、酵母細胞のゲノム編集のための系の使用に関する。系成分をコードするポリヌクレオチドの導入に用いることのできる酵母細胞の形質転換方法は当該技術分野において周知であり、Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｅｎｇ Ｂｕｇｓ．２０１０ Ｎｏｖ－Ｄｅｃ；１（６）：３９５－４０３）によってレビューされている。非限定的な例としては、酢酸リチウム処理による酵母細胞の形質転換（これはキャリアＤＮＡ及びＰＥＧ処理をさらに含み得る）、衝撃または電気穿孔によるものが挙げられる。
植物及び植物細胞における系成分の一過性発現
ある特定の実施形態では、植物細胞においてガイドＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子を一過性に発現させることが想定される。これらの実施形態では、系により、細胞内にガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１３）、及びアデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアプタマー結合アダプタータンパク質に融合され得る）の両方が存在するときに限った標的遺伝子の改変が確実となり、従って、ゲノム改変をさらに制御することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の発現は一過性であるため、かかる植物細胞から再生した植物は、典型的には外来ＤＮＡを含有しない。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、植物細胞によって安定に発現し、及びガイド配列は一過性に発現する。
ある特定の実施形態では、系成分は、植物ウイルスベクターを使用して植物細胞に導入することができる（Ｓｃｈｏｌｔｈｏｆ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．１９９６；３４：２９９－３２３）。さらにある特定の実施形態では、前記ウイルスベクターは、ＤＮＡウイルス由来のベクターである。例えば、ジェミニウイルス（例えば、キャベツ巻葉ウイルス、マメ萎黄ウイルス、コムギ萎縮ウイルス、トマト巻葉ウイルス、トウモロコシ条斑ウイルス、タバコ巻葉ウイルス、またはトマトゴールデンモザイクウイルス）またはナノウイルス（例えば、ソラマメ黄化えそウイルス）。他の特定の実施形態では、前記ウイルスベクターは、ＲＮＡウイルス由来のベクターである。例えば、トブラウイルス（例えば、タバコ茎えそウイルス、タバコモザイクウイルス）、ポルテクスウイルス（例えば、ジャガイモＸウイルス）、またはホルデイウイルス（例えば、ムギ斑葉モザイクウイルス）。植物ウイルスの複製ゲノムは、非組み込みベクターである。
ある特定の実施形態では、系の一過性発現に使用されるベクターは、例えば、ｐＥＡＱベクターであり、これは、プロトプラストにおけるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介一過性発現に合わせて調整されているものである（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２００９ Ｓｅｐ；７（７）：６８２－９３）。ＣＲＩＳＰＲ酵素を発現する安定トランスジェニック植物においてガイドＲＮＡを発現する改変キャベツ巻葉ウイルス（ＣａＬＣｕＶ）ベクターを使用して、ゲノム位置の正確な標的化が実証された（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１４９２６（２０１５），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１４９２６）。
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子をコードする二本鎖ＤＮＡ断片を植物細胞に一過性に導入することができる。かかる実施形態では、導入される二本鎖ＤＮＡ断片は、細胞を改変するのに十分な、しかし企図された時間が経った後または１回以上の細胞分裂後には残らない量で提供される。植物においてＤＮＡ移入を導く方法は、当業者に公知である（例えば、Ｄａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８９ Ｓｅｐ；１３（３）：２７３－８５を参照されたい）。
他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１３）及び／またはアデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアプタマー結合アダプタータンパク質に融合され得る）をコードするＲＮＡポリヌクレオチドが、細胞を（少なくとも１つのガイドＲＮＡの存在下で）改変するのに十分な、しかし企図された時間が経った後または１回以上の細胞分裂後には残らない量で植物細胞に導入され、次にはこれが、タンパク質を生成する宿主細胞によって翻訳及びプロセシングされる。一過性発現のため植物プロトプラストにｍＲＮＡを導入する方法は、当業者に公知である（例えば、Ｇａｌｌｉｅ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９９３），１３；１１９－１２２を参照されたい）。
上記に記載される異なる方法の組み合わせもまた想定される。
植物細胞への系成分の送達
ある特定の実施形態では、系の１つ以上の成分を植物細胞に直接送達することが有益である。これは特に、非トランスジェニック植物の作成に有益である（下記参照）。ある特定の実施形態では、系成分の１つ以上が植物または植物細胞の外部で調製され、細胞に送達される。例えば、ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質がインビトロで調製された後、植物細胞に導入される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、当業者に公知の、組換え産生を含めた様々な方法によって調製することができる。発現後、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が単離され、必要に応じて再び折り畳まれ、精製され、任意選択でＨｉｓタグなどの任意の精製タグを除去するため処理される。粗製の、部分的に精製された、またはより完全に精製されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が得られたところで、タンパク質が植物細胞に導入され得る。
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が目的の遺伝子を標的化するガイドＲＮＡと混合され、予めアセンブルされたリボ核タンパク質が形成される。
個々の成分または予めアセンブルされたリボ核タンパク質は、電気穿孔を用いるか、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ関連遺伝子生成物で被膜した粒子の衝撃によるか、化学的トランスフェクションによるか、または細胞膜を越えて輸送する他の何らかの手段によって植物細胞に導入することができる。例えば、予めアセンブルされたＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質による植物プロトプラストのトランスフェクションは、植物ゲノムの標的改変を確実にすることが実証されている（Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５；ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３３８９による記載の通り）。
ある特定の実施形態では、系成分は、ナノ粒子を用いて植物細胞に導入される。成分は、タンパク質もしくは核酸としてであれ、またはそれらの組み合わせであれ、ナノ粒子上にアップロードするかまたはそれにパッケージングして植物に適用することができる（例えば、ＷＯ２００８０４２１５６及びＵＳ２０１３０１８５８２３の記載など）。特に、本発明の実施形態は、ＷＯ２０１５０８９４１９に記載される通り、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１３）をコードするＤＮＡ分子（複数可）、アデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアプタマー結合アダプタータンパク質に融合され得る）をコードするＤＮＡ分子（複数可）、ならびにガイドＲＮＡ及び／または単離ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子がアップロードされたまたはそれでパッケージングされたナノ粒子を含む。
系の１つ以上の成分を植物細胞に導入するさらなる手段は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を用いることによるものである。従って、詳細には、本発明の実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質に連結された細胞透過性ペプチドを含む組成物を含む。本発明のある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び／またはガイドＲＮＡは、それらを植物プロトプラストの内部に有効に輸送する１つ以上のＣＰＰにカップリングされる（ヒト細胞におけるＣａｓ９については、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４ Ｊｕｎ；２４（６）：１０２０－７）も参照されたい。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子及び／またはガイドＲＮＡは、植物プロトプラスト送達のための１つ以上のＣＰＰにカップリングされた１つ以上の環状または非環状ＤＮＡ分子（複数可）によってコードされる。次に、植物プロトプラストは、植物細胞、及びさらには植物に再生される。ＣＰＰは、概して、生体分子を受容体非依存的に細胞膜を越えて輸送する能力を有するタンパク質またはキメラ配列のいずれかに由来する３５アミノ酸未満の短鎖ペプチドとして記載される。ＣＰＰは、カチオン性ペプチド、疎水性配列を有するペプチド、両親媒性ペプチド、プロリンリッチな抗微生物性の配列を有するペプチド、及びキメラまたは二部ペプチドであってもよい（Ｐｏｏｇａ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｌ ２００５）。ＣＰＰは、生体膜を透過することが可能であり、そのため様々な生体分子の細胞膜を越えて細胞質に入る移動を引き起こし、それらの細胞内輸送を改善することが可能であり、ひいては生体分子と標的の相互作用を促進する。ＣＰＰの例としては、中でも特に、ＨＩＶ １型によるウイルス複製に必要な核内転写活性化タンパク質であるＴａｔ、ペネトラチン、カポジ線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナルペプチド配列、インテグリンβ３シグナルペプチド配列；ポリアルギニンペプチドＡｒｇｓ配列、グアニンリッチ分子輸送体、スイートアローペプチドなどが挙げられる。
系を用いた遺伝子改変非トランスジェニック植物の作成
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＣＲＩＳＰＲ成分をコードするものを含めた任意の外因性遺伝子を植物のゲノムに永久的に導入することなく、そのようにして植物のゲノムに外来ＤＮＡが存在することを回避しつつ内因性遺伝子を改変し、またはそれらの発現を改変するために用いられる。非トランスジェニック植物に求められる規制上の要件は厳しさが緩和されるため、これは有益であり得る。
ある特定の実施形態では、これは、系成分の一過性発現によって確実となる。ある特定の実施形態では、成分の１つ以上は、本明細書に記載される方法による目的の遺伝子の改変を一貫して常に確実に行うのに十分なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、アデノシンデアミナーゼ、及びガイドＲＮＡを産生する１つ以上のウイルスベクター上で発現する。
ある特定の実施形態では、系構築物の一過性発現は、植物プロトプラストで確実に起こり、従ってゲノムに組み込まれない。系が本明細書に記載される通りの標的遺伝子の改変を確実に行うことを可能にするには、限られた発現ウィンドウで十分であり得る。
ある特定の実施形態では、系の種々の成分は、本明細書において上記に記載される通りのナノ粒子またはＣＰＰ分子などの粒子状送達分子の助けを借りて、別々に、または混合して、植物細胞、プロトプラストまたは植物組織に導入される。
系成分が発現すると、アデノシンデアミナーゼのデアミナーゼ活性によりゲノムの標的改変が誘導され得る。本明細書において上記に記載される種々の戦略により、系成分を植物ゲノムに導入する必要なしに、ＣＲＩＳＰＲ媒介性標的ゲノム編集が可能となる。植物細胞に一過性に導入される成分は、典型的には交雑時に除去される。
植物培養物及び再生
ある特定の実施形態では、改変ゲノムを有し、かつ本明細書に記載される方法のいずれかによって作製または入手される植物細胞は、培養することにより、形質転換されまたは改変された遺伝子型を備えた、ひいては所望の表現型を備えた全植物を再生することができる。従来の再生技術は、当業者に周知である。かかる再生技術の詳細な例は、組織培養成長培地中でのある種の植物ホルモンの操作に頼るものであり、典型的には所望のヌクレオチド配列と共に導入された殺生物剤及び／または除草剤マーカーに頼るものである。さらにある特定の実施形態では、植物再生は、培養したプロトプラスト、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚またはそれらの一部から得られる（例えば、Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８３），Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓを参照されたい）。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される通りの形質転換植物または改良植物は、自家受粉により本発明のホモ接合改良植物（ＤＮＡ改変に関してホモ接合性）の種子を提供するか、または非トランスジェニック植物もしくは別の改良植物との交雑によりヘテロ接合植物の種子を提供することができる。植物細胞に組換えＤＮＡが導入された場合、かかる交雑により得られる植物は、組換えＤＮＡ分子に関してヘテロ接合の植物である。改良植物からの交雑によって得られた、遺伝子改変（組換えＤＮＡであり得る）を含むかかるホモ接合植物及びヘテロ接合植物は、両方ともに、本明細書では「子孫」と称される。子孫植物は、元のトランスジェニック植物に由来する、かつ本明細書に提供される方法によって導入されたゲノム改変または組換えＤＮＡ分子を含有する植物である。あるいは、遺伝子改変植物は、外来ＤＮＡがゲノムに取り込まれない系を用いる上述の方法のうちの１つによって得ることができる。さらなる育種によって得られたかかる植物の子孫もまた、その遺伝子改変を含有し得る。育種は、種々の作物に一般に用いられている任意の育種方法によって実施される（例えば、Ａｌｌａｒｄ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｕ．ｏｆ ＣＡ，Ｄａｖｉｓ，ＣＡ，５０－９８（１９６０）。
農業形質が増強された植物の生成
本明細書に提供される系を用いて、標的Ａ－Ｇ及びＴ－Ｃ突然変異を導入することができる。単一細胞において複数の改変を実現するために行われるマルチターゲティングＲＮＡの共発現により、多重化ゲノム改変を確実に行うことができる。この技術は、栄養価、病害抵抗性ならびに生物的及び非生物的ストレスに対する抵抗性の増加、ならびに商業的に有用な植物製品または異種化合物の生産増加を含め、改良された特徴を備える植物の高精度エンジニアリングに用いることができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される系を用いて、標的Ａ－Ｇ及びＴ－Ｃ突然変異を導入する。かかる突然変異は、ナンセンス突然変異（例えば、成熟前終止コドン）またはミスセンス突然変異（例えば、異なるアミノ酸残基をコードする）であり得る。これは、ある特定の内因性遺伝子のＡ－Ｇ及びＴ－Ｃ突然変異が所望の形質を付与し得るか、またはそれに寄与し得る場合に有益である。
本明細書に記載される方法は、概して、野生型植物と比較して１つ以上の望ましい形質を有するという点で「改良植物」の生成をもたらす。ある特定の実施形態では、得られる植物、植物細胞または植物部位は、トランスジェニック植物であり、植物の細胞の全てまたは一部のゲノムに取り込まれた外因性ＤＮＡ配列を含む。ある特定の実施形態では、植物のいずれの植物細胞のゲノムにも外因性ＤＮＡ配列が取り込まれないという点で、非トランスジェニック遺伝子改変植物、植物部位または細胞が得られる。かかる実施形態では、改良植物は、非トランスジェニックである。内因性遺伝子の改変のみが確実に起こり、外因性遺伝子は植物ゲノムに導入または維持されない場合、得られる遺伝子改変作物は外因性遺伝子を含まず、従って、基本的に非トランスジェニックと見なし得る。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡウイルス（例えば、ジェミニウイルス）またはＲＮＡウイルス（例えば、トブラウイルス）によって細胞に送達される。ある特定の実施形態では、導入するステップは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、アデノシンデアミナーゼ、及びガイドＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含有するＴ－ＤＮＡを植物細胞に送達することを含み、ここで、送達は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる。系の成分をコードするポリヌクレオチド配列は、構成的プロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）、または細胞特異的もしくは誘導性プロモーターなど、プロモーターに作動可能に連結されてもよい。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、マイクロプロジェクタイル衝撃によって導入される。ある特定の実施形態では、方法は、導入するステップの後に植物細胞をスクリーニングして目的の遺伝子の発現が改変されたかどうかを決定するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、植物細胞から植物を再生するステップを含む。さらなる実施形態では、方法は、植物を交雑育種して遺伝的に望ましい植物系統を得るステップを含む。
上記に記載される方法の特定の実施形態では、罹病性遺伝子または植物防御遺伝子の負の調節因子をコードする遺伝子（例えば、Ｍｌｏ遺伝子）の標的突然変異によって病害抵抗性作物が得られる。ある特定の実施形態では、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）及びプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）をコードするものなど、植物遺伝子における特異的ヌクレオチドの標的複製によって除草剤耐性作物が生成される。ある特定の実施形態では、非生物的ストレス耐性の負の調節因子をコードする遺伝子の標的突然変異による耐乾性及び耐塩性作物、Ｗａｘｙ遺伝子の標的突然変異による低アミロース穀物、アリューロン層における主要リパーゼ遺伝子の標的突然変異による低酸敗性のコメまたは他の穀物など。ある特定の実施形態では。目的の形質をコードする内因性遺伝子のより包括的なリストを以下に挙げる。
倍数体植物を改変するための系の使用
多くの植物は倍数体であり、つまり、それらはそのゲノムの二重のコピー（時にコムギの場合のように６個にも上る）を有するということである。系を利用する本発明に係る方法は「多重化」されるため、遺伝子の全てのコピーに影響を及ぼすことができ、または何十個もの遺伝子を一度に標的化することができる。例えば、ある特定の実施形態では、本発明の方法を用いて、病害に対する防御の抑制に関与する種々の遺伝子で機能喪失突然変異が同時に起こることが確実にされる。ある特定の実施形態では、本発明の方法を用いて、コムギ植物細胞におけるＴａＭＬＯ－Ａｌ、ＴａＭＬＯ－Ｂｌ及びＴａＭＬＯ－Ｄｌ核酸配列の発現が同時に抑制され、それからコムギ植物が再生されて、コムギ植物がうどんこ病に抵抗性となるよう確実にされる（ＷＯ２０１５１０９７５２も参照されたい）。
農業形質を付与する例示の遺伝子
ある特定の実施形態では、本発明は、以下に挙げるものなどの、内因性遺伝子及びそれらの調節エレメントの標的Ａ－Ｇ及びＴ－Ｃ突然変異が関わる方法を包含する。
１．害虫または病害に対する抵抗性を付与する遺伝子：
植物病害抵抗性遺伝子。植物をクローン抵抗性遺伝子で形質転換することにより、特定の病原菌株に対して抵抗性の植物をエンジニアリングすることができる。例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７８９（１９９４）（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍに対する抵抗性のためのトマトＣｆ－９遺伝子のクローニング）；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４３２（１９９３）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔｏｍａｔｏに対する抵抗性のためのトマトＰｔｏ遺伝子はプロテインキナーゼをコードする）；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７８：１０８９（１９９４）（ＡｒａｂｉｄｏｐｓはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅに対する抵抗性のためのＲＳＰ２遺伝子であり得る）を参照されたい。病原体感染中に上方制御または下方制御される植物遺伝子をエンジニアリングして、病原体抵抗性を有することができる。例えば、Ｔｈｏｍａｚｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ０６４８２４；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０６４８２４ Ｅｐｕｂ．Ｊｕｌｙ ２３，２０１６を参照されたい（病原体感染中に通常は上方制御されるＳ１ＤＭＲ６－１が欠失したトマト植物）。
ダイズシスト線虫などの害虫に対する抵抗性を付与する遺伝子。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３０５１７；ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１９１８１を参照されたい。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓタンパク質、例えば、Ｇｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４８：１０９（１９８６）を参照されたい。
レクチン、例えば、Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：２５（１９９４を参照されたい。
アビジンなどのビタミン結合タンパク質、ＰＣＴ出願ＵＳ９３／０６４８７号を参照されたい、害虫に対する幼虫撲滅剤としてのアビジン及びアビジンホモログの使用を教示している。
プロテアーゼまたはプロテイナーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤などの酵素阻害剤。例えば、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６７９３（１９８７）、Ｈｕｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：９８５（１９９３））、Ｓｕｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：１２４３（１９９３）及び米国特許第５，４９４，８１３号を参照されたい。
エクジステロイドもしくは幼若ホルモン、それらの変異体、それらをベースとする模倣体、またはそれらの拮抗薬もしくは作動薬など、昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン。例えば、Ｈａｍｍｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：４５８（１９９０）を参照されたい。
発現時に、罹病源の害虫の生理機能を破壊する昆虫特異的ペプチドまたは神経ペプチド。例えば、Ｒｅｇａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９（１９９４）及びＰｒａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６３：１２４３（１９８９）。また米国特許第５，２６６，３１７号も参照されたい。
ヘビ、スズメバチ、または任意の他の生物によって天然で産生される昆虫特有の毒液。例えば、Ｐａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １１６：１６５（１９９２）を参照されたい。
モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の過剰な蓄積に関与する酵素。
翻訳後修飾を含め、生物学的に活性な分子の改変に関わる酵素；例えば、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ及びグルカナーゼ（天然かまたは合成かに関わらない）。ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０２１９７、Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２３：６９１（１９９３）及びＫａｗａｌｌｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：６７３（１９９３）を参照されたい。
シグナル伝達を刺激する分子。例えば、Ｂｏｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：７５７（１９９４）、及びＧｒｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１４６７（１９９４）を参照されたい。
ウイルス侵入性タンパク質またはそれに由来する複合体毒素。Ｂｅａｃｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２８：４５１（１９９０）を参照されたい。
病原体または寄生虫によって天然で産生される発生抑止性タンパク質。Ｌａｍｂ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４３６（１９９２）及びＴｏｕｂａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：３６７（１９９２）を参照されたい。
植物によって天然で産生される発生抑止性タンパク質。例えば、Ｌｏｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：３０５（１９９２）。
植物では、病原体は、多くの場合に宿主特異的である。例えば、あるＦｕｓａｒｉｕｍ種は、トマト萎凋病を引き起こし得るが、攻撃するのはトマトのみであり、他のＦｕｓａｒｉｕｍ種は、コムギのみを攻撃する。植物は、既存の誘導防御を有して多くの病原体に抵抗する。特に病原体が植物よりも高い頻度で複製することに伴い、植物世代間での突然変異及び組換えイベントが、感受性を生じさせる遺伝的変異性をもたらす。植物には、非宿主抵抗性が存在することもあり、例えば、その宿主と病原体とが適合しないか、または典型的には多くの遺伝子によって制御される、あらゆる病原体系統に対する部分抵抗性、及び／または、また、他の系統に対しては存在しない、一部の病原体系統に対する完全抵抗性も存在し得る。かかる抵抗性は、典型的には、数個の遺伝子によって制御される。系の方法及び成分を用いることにより、ここで特異的突然変異をそれを見越して誘導する新規ツールが存在する。従って、抵抗性遺伝子の供給源のゲノムを分析し、かつ所望の特性または形質を有する植物において、系の方法及び成分を用いることにより、抵抗性遺伝子の産生を誘発することができる。本系は、これまでの突然変異誘発物質より高い精度でそれを行うことができ、ひいては植物育種プログラムを加速させ、及び改善することができる。
２．ＷＯ２０１３０４６２４７に挙げられるものなど、植物病害に関与する遺伝子：
イネの病害：Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｍｉｙａｂｅａｎｕｓ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ；コムギの病害：Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆ．ａｖｅｎａｃｅｕｍ、Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｐ．ｒｅｃｏｎｄｉｔａ、Ｍｉｃｒｏｎｅｃｔｒｉｅｌｌａ ｎｉｖａｌｅ、Ｔｙｐｈｕｌａ ｓｐ．、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃａｒｉｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ ｎｏｄｏｒｕｍ、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｒｉｔｉｃｉ－ｒｅｐｅｎｔｉｓ；オオムギの病害：Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆ．ａｖｅｎａｃｅｕｍ、Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｐ．ｈｏｒｄｅｉ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ、Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｅｃａｌｉｓ、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｅｒｅｓ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｇｒａｍｉｎｅａ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ；トウモロコシの病害：Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ、Ｇｌｏｅｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｏｒｇｈｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｐｏｌｙｓｏｒａ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｚｅａｅ－ｍａｙｄｉｓ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ；
柑橘類の病害：Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｃｉｔｒｉ、Ｅｌｓｉｎｏｅ ｆａｗｃｅｔｔｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｉｇｉｔａｔｕｍ、Ｐ．ｉｔａｌｉｃｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｔｒｏｐｈｔｈｏｒａ；リンゴの病害：Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｍａｌｉ、Ｖａｌｓａ ｃｅｒａｔｏｓｐｅｒｍａ、Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ ａｐｐｌｅ ｐａｔｈｏｔｙｐｅ、Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ａｃｕｔａｔｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍ；
セイヨウナシの病害：Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｎａｓｈｉｃｏｌａ、Ｖ．ｐｉｒｉｎａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐｅａｒ ｐａｔｈｏｔｙｐｅ、Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｈａｒａｅａｎｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍ；
モモの病害：Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｓｐ．；
ブドウの病害：Ｅｌｓｉｎｏｅ ａｍｐｅｌｉｎａ、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ、Ｕｎｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒ、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ａｍｐｅｌｏｐｓｉｄｉｓ、Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ ｂｉｄｗｅｌｌｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ；
カキの病害：Ｇｌｏｅｓｐｏｒｉｕｍ ｋａｋｉ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋａｋｉ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌａ ｎａｗａｅ；
ウリ類の病害：Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｌｉｇｉｎｅａ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｍｅｌｏｎｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐ．、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐ．；
トマトの病害：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．Ｔｏｍａｔｏ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ；Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ナスの病害：Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｖｅｘａｎｓ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ；アブラナ科野菜の病害：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ；
ネギの病害：Ｐｕｃｃｉｎｉａ ａｌｌｉｉ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ；
ダイズの病害：Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋｉｋｕｃｈｉｉ、Ｅｌｓｉｎｏｅ ｇｌｙｃｉｎｅｓ、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ ｖａｒ．ｓｏｊａｅ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｏｊｉｎａ、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ｃａｓｉｉｃｏｌａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ；
インゲンマメの病害：Ｃｏｌｌｅｔｒｉｃｈｕｍ ｌｉｎｄｅｍｔｈｉａｎｕｍ；
ピーナッツの病害：Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｐｅｒｓｏｎａｔａ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ａｒａｃｈｉｄｉｃｏｌａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ；
エンドウマメの病害エンドウマメ：Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｐｉｓｉ；
ジャガイモの病害：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｅｒｙｔｈｒｏｓｅｐｔｉｃａ、Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ，ｆ．ｓｐ．Ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ；
イチゴの病害：Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｈｕｍｕｌｉ、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ；
チャノキの病害：Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ、Ｅｌｓｉｎｏｅ ｌｅｕｃｏｓｐｉｌａ、Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｈｅａｅ－ｓｉｎｅｎｓｉｓ；
タバコの病害：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｏｎｇｉｐｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔａｂａｃｕｍ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｔａｂａｃｉｎａ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ；
ナタネの病害：Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ；
綿の病害：Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ；
テンサイの病害：Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｂｅｔｉｃｏｌａ、Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ、Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ、Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ ｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ；
バラの病害：Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ ｒｏｓａｅ、Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｐａｎｎｏｓａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｓｐａｒｓａ；
ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ及びａｓｔｅｒａｃｅａｅ植物の病害：Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ－ｉｎｄｉｃｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｈｏｒｉａｎａ；
様々な植物の病害：Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｅｂａｒｉａｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ；
ダイコンの病害：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ；
シバの病害：Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｅｏｃａｒｐａ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ；
バナナの病害：Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｍｕｓｉｃｏｌａ；
ヒマワリの病害：Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｈａｌｓｔｅｄｉｉ；
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．、Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．、Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ．、Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｒｈｏｍａ ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｐｐ．、Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｓｐｐ．などによって引き起こされる様々な植物の種子の病害または生育初期段階における病害；
Ｐｏｌｙｍｉｘａ ｓｐｐ．、Ｏｌｐｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．などによって媒介される様々な植物のウイルス性病害。
３．除草剤抵抗性を付与する遺伝子の例：
成長点または分裂組織を阻害する除草剤に対する抵抗性、例えば、それぞれ、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．７：１２４１（１９８８）、及びＭｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０：４４９（１９９０）によるイミダゾリノンまたはスルホニル尿素など。
グリホセート耐性（例えば、それぞれ、突然変異５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）遺伝子、ａｒｏＡ遺伝子及びグリホセートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子によって付与される抵抗性）、またはグルホシネートによるなどの他のホスホノ化合物に対する抵抗性（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓを含めたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種由来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子）、及びＡＣＣアーゼ阻害剤コード遺伝子によるピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸（ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）及びシクロヘキソンに対する抵抗性。例えば、米国特許第４，９４０，８３５号及び米国特許第６，２４８，８７６号、米国特許第４，７６９，０６１号、ＥＰ０３３３０３３及び米国特許第４，９７５，３７４号を参照されたい。また、ＥＰ０２４２２４６、ＤｅＧｒｅｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６１（１９８９）、Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８３：４３５（１９９２）、Ｃａｓｔｌｅ ｅｔ．ａｌ．に対するＷＯ２００５０１２５１５、及びＷＯ２００５１０７４３７も参照されたい。
Ｐｒｚｉｂｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：１６９（１９９１）、米国特許第４，８１０，６４８号、及びＨａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８５：１７３（１９９２）におけるトリアジン（ｐｓｂＡ及びｇｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）、及びグルタチオンＳ－トランスフェラーゼなど、光合成を阻害する除草剤抵抗性。
除草剤を解毒する酵素または阻害に対して抵抗性の突然変異グルタミンシンターゼ酵素をコードする遺伝子、例えば、米国特許出願第１１／７６０，６０２号。または解毒酵素は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種由来のｂａｒまたはｐａｔタンパク質など）をコードする酵素である。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼについては、例えば、米国特許第５，５６１，２３６号；同第５，６４８，４７７号；同第５，６４６，０２４号；同第５，２７３，８９４号；同第５，６３７，４８９号；同第５，２７６，２６８号；同第５，７３９，０８２号；同第５，９０８，８１０号及び同第７，１１２，６６５号に記載されている。
ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、すなわち、天然に存在するＨＰＰＤ抵抗性酵素、またはＷＯ９６／３８５６７、ＷＯ９９／２４５８５、及びＷＯ９９／２４５８６、ＷＯ２００９／１４４０７９、ＷＯ２００２／０４６３８７、もしくは米国特許第６，７６８，０４４号に記載される通りの突然変異もしくはキメラＨＰＰＤ酵素をコードする遺伝子。
４．非生物的ストレス耐性に関わる遺伝子の例：
ＷＯ００／０４１７３、またはＷＯ／２００６／０４５６３３に記載される通りの、植物細胞または植物におけるポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）遺伝子の発現及び／または活性を減らすことが可能なトランス遺伝子。
例えば、ＷＯ２００４／０９０１４０に記載される通りの、植物または植物細胞のＰＡＲＧコード遺伝子の発現及び／または活性を減らすことが可能なトランス遺伝子。
例えば、ＥＰ０４０７７６２４．７、ＷＯ２００６／１３３８２７、ＰＣＴ／ＥＰ０７／００２，４３３、ＥＰ１９９９２６３、またはＷＯ２００７／１０７３２６に記載される通りの、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドシンテターゼまたはニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼを含めた、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドサルベージ合成経路の植物機能性酵素をコードするトランス遺伝子。
炭水化物生合成に関わる酵素としては、例えば、ＥＰ０５７１４２７、ＷＯ９５／０４８２６、ＥＰ０７１９３３８、ＷＯ９６／１５２４８、ＷＯ９６／１９５８１、ＷＯ９６／２７６７４、ＷＯ９７／１１１８８、ＷＯ９７／２６３６２、ＷＯ９７／３２９８５、ＷＯ９７／４２３２８、ＷＯ９７／４４４７２、ＷＯ９７／４５５４５、ＷＯ９８／２７２１２、ＷＯ９８／４０５０３、ＷＯ９９／５８６８８、ＷＯ９９／５８６９０、ＷＯ９９／５８６５４、ＷＯ００／０８１８４、ＷＯ００／０８１８５、ＷＯ００／０８１７５、ＷＯ００／２８０５２、ＷＯ００／７７２２９、ＷＯ０１／１２７８２、ＷＯ０１／１２８２６、ＷＯ０２／１０１０５９、ＷＯ０３／０７１８６０、ＷＯ２００４／０５６９９９、ＷＯ２００５／０３０９４２、ＷＯ２００５／０３０９４１、ＷＯ２００５／０９５６３２、ＷＯ２００５／０９５６１７、ＷＯ２００５／０９５６１９、ＷＯ２００５／０９５６１８、ＷＯ２００５／１２３９２７、ＷＯ２００６／０１８３１９、ＷＯ２００６／１０３１０７、ＷＯ２００６／１０８７０２、ＷＯ２００７／００９８２３、ＷＯ００／２２１４０、ＷＯ２００６／０６３８６２、ＷＯ２００６／０７２６０３、ＷＯ０２／０３４９２３、ＥＰ０６０９０１３４．５、ＥＰ０６０９０２２８．５、ＥＰ０６０９０２２７．７、ＥＰ０７０９０００７．１、ＥＰ０７０９０００９．７、ＷＯ０１／１４５６９、ＷＯ０２／７９４１０、ＷＯ０３／３３５４０、ＷＯ２００４／０７８９８３、ＷＯ０１／１９９７５、ＷＯ９５／２６４０７、ＷＯ９６／３４９６８、ＷＯ９８／２０１４５、ＷＯ９９／１２９５０、ＷＯ９９／６６０５０、ＷＯ９９／５３０７２、米国特許第６，７３４，３４１号、ＷＯ００／１１１９２、ＷＯ９８／２２６０４、ＷＯ９８／３２３２６、ＷＯ０１／９８５０９、ＷＯ０１／９８５０９、ＷＯ２００５／００２３５９、米国特許第５，８２４，７９０号、米国特許第６，０１３，８６１号、ＷＯ９４／０４６９３、ＷＯ９４／０９１４４、ＷＯ９４／１１５２０、ＷＯ９５／３５０２６もしくはＷＯ９７／２０９３６に記載されるもの、またはＥＰ０６６３９５６、ＷＯ９６／０１９０４、ＷＯ９６／２１０２３、ＷＯ９８／３９４６０、及びＷＯ９９／２４５９３に開示される通りの、ポリフルクトース、特にイヌリン及びレバン型のポリフルクトースの産生、ＷＯ９５／３１５５３、ＵＳ２００２０３１８２６、米国特許第６，２８４，４７９号、米国特許第５，７１２，１０７号、ＷＯ９７／４７８０６、ＷＯ９７／４７８０７、ＷＯ９７／４７８０８及びＷＯ００／１４２４９に開示される通りのα－１，４－グルカン類の産生、ＷＯ００／７３４２２に開示される通りのα－１，６分枝α－１，４－グルカンの産生、例えば、ＷＯ００／４７７２７、ＷＯ００／７３４２２、ＥＰ０６０７７３０１．７、米国特許第５，９０８，９７５号及びＥＰ０７２８２１３に開示される通りのアルテルナンの産生、例えば、ＷＯ２００６／０３２５３８、ＷＯ２００７／０３９３１４、ＷＯ２００７／０３９３１５、ＷＯ２００７／０３９３１６、ＪＰ２００６３０４７７９、及びＷＯ２００５／０１２５２９に開示される通りのヒアルロナンの産生に関わる酵素が挙げられる。
耐乾性を改善する遺伝子。例えば、ＷＯ２０１３１２２４７２は、機能性ユビキチンタンパク質リガーゼタンパク質（ＵＰＬ）タンパク質、より具体的にはＵＰＬ３が存在しないかまたはそのレベルが低下すると、前記植物の水要求の減少または耐乾性の向上につながることを開示している。耐乾性が増加したトランスジェニック植物の他の例が、例えば、ＵＳ２００９／０１４４８５０、ＵＳ２００７／０２６６４５３、及びＷＯ２００２／０８３９１１に開示されている。ＵＳ２００９／０１４４８５０は、ＤＲ０２核酸の発現の変化に起因して耐乾性表現型を呈する植物について記載している。ＵＳ２００７／０２６６４５３は、ＤＲ０３核酸の発現の変化に起因して耐乾性表現型を呈する植物について記載し、及びＷＯ２００２／０８３９１１は、孔辺細胞で発現するＡＢＣトランスポーターの活性の低下に起因して干ばつストレスに対する抵抗性が増加した植物について記載している。別の例はＫａｓｕｇａ及び共著者ら（１９９９）による研究であり、彼らは、トランスジェニック植物におけるＤＲＥＢ１ ＡをコードするｃＤＮＡの過剰発現が、正常な生育条件下で多くのストレス耐性遺伝子の発現を活性化し、耐乾性、食塩負荷耐性、及び耐凍性の改善をもたらしたことを記載している。しかしながら、ＤＲＥＢ１Ａの発現はまた、正常な生育条件下で重大な成長遅延ももたらした（Ｋａｓｕｇａ（１９９９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７（３）２８７－２９１）。
さらなる特定の実施形態では、特定の植物形質に影響を及ぼすことにより、作物植物を改良することができる。例えば、農薬抵抗性植物の開発、植物における病害抵抗性の改善、植物の昆虫及び線虫抵抗性の改善、寄生雑草に対する植物の抵抗性の改善、植物の耐乾性の改善、植物の栄養価の改善、植物のストレス耐性の改善、自家受粉の回避、植物飼料分解性バイオマス、穀粒収量などによる。いくつかの具体的な非限定例は、本明細書で以下に提供する。
単一遺伝子の標的突然変異に加えて、系は、植物における複数の遺伝子の標的突然変異、染色体断片の欠失、トランス遺伝子の部位特異的組み込み、インビボでの部位特異的突然変異誘発、及び正確な遺伝子置換または対立遺伝子スワッピングが可能となるように設計することができる。従って、本明細書に記載される方法は、遺伝子の発見及び検証、突然変異及びシスジェニック育種、及びハイブリッド育種において幅広い適用性を有する。これらの適用は、除草剤抵抗性、病害抵抗性、非生物的ストレス耐性、高収率、及び高品質など、様々な改良された農業形質を有する新世代の遺伝子改変作物の生産を促進する。
雄性不稔植物を作出するための系の使用
ハイブリッド植物は、典型的には純系植物と比較して有利な農業形質を有する。しかしながら、自家受粉植物については、ハイブリッドの生成には難題が伴い得る。種々の植物タイプにおいて、植物の稔性、より詳細には雄性稔性に重要な遺伝子が同定されている。例えば、トウモロコシでは、稔性において重大な少なくとも２つの遺伝子が同定されている（Ａｍｉｔａｂｈ Ｍｏｈａｎｔｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｎｅｗ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｏｃｔ ９－１０，２０１４，Ｊａｉｐｕｒ，Ｉｎｄｉａ；Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１５ Ｏｃｔ；１６９（２）：９３１－４５；Ｄｊｕｋａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．２０１３ Ｄｅｃ；７６（５）：８８８－９９）。本明細書に提供される方法及び系は、容易に交雑させてハイブリッドを生成し得る雄性不稔植物を生成するため雄性稔性に必要な遺伝子を標的化するのに用いることができる。特定の実施形態では、本明細書に提供される系がシトクロムＰ４５０様遺伝子（ＭＳ２６）またはメガヌクレアーゼ遺伝子（ＭＳ４５）の標的突然変異誘発に用いられ、それによりトウモロコシ植物に雄性不稔が付与される。このように遺伝的に変化したトウモロコシ植物は、ハイブリッド育種計画に使用することができる。
植物における稔性期の増加
特定の実施形態では、本明細書に提供される方法及び系を用いてコメ植物などの植物の稔性期が拡張される。例えば、Ｅｈｄ３などのコメ稔性期遺伝子を標的化することによりその遺伝子に突然変異を生成することができ、拡張された再生植物稔性期に関して小植物を選択することができる（ＣＮ １０４００４７８２に記載される通り）
目的の作物に遺伝的変異を生成するための系の使用
作物植物における野生生殖質の利用可能性及び遺伝的変異は作物改良計画の鍵であるが、作物植物からの利用可能な生殖質の多様性は限られている。本発明は、目的の生殖質に遺伝的変異の多様性を生じさせる方法を想定する。系のこの適用では、植物ゲノム内の種々の位置を標的化するガイドＲＮＡのライブラリーが提供され、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びアデノシンデアミナーゼと共に植物細胞に導入される。このようにして、ゲノム規模の点突然変異及び遺伝子ノックアウトのコレクションを生成することができる。特定の実施形態では、本方法は、そのように得られた細胞から植物部位または植物を生成するステップ、及び目的の形質に関して細胞をスクリーニングするステップを含む。標的遺伝子は、コード領域及び非コード領域の両方を含み得る。特定の実施形態では、形質は、ストレス耐性であり、本方法は、ストレス耐性作物品種の生成方法である。
果実の熟成に影響を及ぼすためのＡＤ官能基化ＣＲＩＳＰＲの使用
熟成は、果実及び野菜の成熟過程における通常の段階である。熟成が始まると、それにより僅か数日で果実または野菜は食べるのに適さないものとなる。この過程は、農業従事者及び消費者の双方に著しい損失をもたらす。特定の実施形態では、本発明の方法を用いてエチレン産生を減らす。これは、以下の１つ以上を確実にすることにより確実にされる：ａ．ＡＣＣシンターゼ遺伝子発現の抑制。ＡＣＣ（１－アミノシクロプロパン－１－カルボン酸）シンターゼは、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）からＡＣＣへの変換；エチレン生合成における２番目から最後への段階に関与する酵素である。植物のゲノムにシンターゼ遺伝子のアンチセンス（「鏡像」）または短縮型コピーが挿入されると、酵素発現が妨げられる；ｂ．ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の挿入。この酵素をコードする遺伝子は、一般的な非病原性土壌細菌であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓから得られる。これはＡＣＣを別の化合物に変換し、それによりエチレン産生に利用可能なＡＣＣ量を減らす；ｃ．ＳＡＭヒドロラーゼ遺伝子の挿入。この手法はＡＣＣデアミナーゼと同様であり、ここではその代謝産物前駆体の量を減らすとエチレン産生が妨げられる；この場合ＳＡＭはホモセリンに変換される。この酵素をコードする遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔ３バクテリオファージから得られる、及びｄ．ＡＣＣオキシダーゼ遺伝子発現の抑制。ＡＣＣオキシダーゼは、エチレン生合成経路の最後の段階であるＡＣＣからエチレンへの酸化を触媒する酵素である。本明細書に記載される方法を用いてＡＣＣオキシダーゼ遺伝子を下方制御すると、エチレン産生が抑制されることになり、それにより果実の熟成が遅延する。特定の実施形態では、上記に記載される改変に加えてまたは代えて、本明細書に記載される方法はエチレン受容体の改変に用いられ、それにより果実が得るエチレンシグナルを妨害する。特定の実施形態では、エチレン結合タンパク質をコードするＥＴＲ１遺伝子の発現が改変され、より詳細には抑制される。特定の実施形態では、上記に記載される改変に加えてまたは代えて、本明細書に記載される方法は、植物細胞壁の完全性を維持する物質ペクチンの分解に関与する酵素であるポリガラクツロナーゼ（ＰＧ）をコードする遺伝子の発現の改変に用いられる。ペクチン分解は熟成過程の始めに起こり、果実の軟化をもたらす。従って、特定の実施形態では、本明細書に記載される方法を用いてＰＧ遺伝子に突然変異を導入するか、またはＰＧ遺伝子の活性化を抑制することによりＰＧ酵素の産生量を低下させて、それによりペクチン分解を遅延させる。
従って、特定の実施形態では、本方法は、上記に記載したものなど、植物細胞のゲノムの１つ以上の改変を確実にするためのＣａｓ１３ ＣＲＩＳＰＲ系の使用、及びそれから植物を再生することを含む。特定の実施形態では、植物はトマト植物である。
植物の貯蔵寿命の増加
特定の実施形態では、本発明の方法を用いて、植物または植物部位の貯蔵寿命に影響を及ぼす化合物の産生に関わる遺伝子が改変される。より詳細には、改変は、ジャガイモ塊茎における還元糖の蓄積を防止する遺伝子における改変である。高温処理を行うと、これらの還元糖が遊離アミノ酸と反応し、褐色の苦味がある生産品となり、かつ潜在的発がん物質であるアクリルアミドレベルが上昇する。特定の実施形態では、本明細書に提供される方法を用いて液胞型インベルターゼ遺伝子（ＶＩｎｖ）（スクロースをグルコースとフルクトースとに分解するタンパク質をコードする）の発現を低下させ、または阻害する（Ｃｌａｓｅｎ ｅｔ ａｌ．ＤＯＩ：１０．１１１１／ｐｂｉ．１２３７０）。
付加価値形質を確保するための系の使用
特定の実施形態では、系を用いて、栄養的に改良された農業作物が作製される。特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、「機能性食品」、すなわちそれが含有する従来の栄養素を超えた健康上の利益を提供し得る改変された食品または食品成分、及び／または「ニュートラシューティカルズ」、すなわち食品または食品の一部と見なすことができ、かつ疾患の予防及び治療を含めた健康上の利益を提供する物質を生成するように適合される。特定の実施形態では、ニュートラシューティカルズは、がん、糖尿病、心血管疾患、及び高血圧症のうちの１つ以上の予防及び／または治療に有用である。
栄養的に改良された作物の例としては、以下が挙げられる（Ｎｅｗｅｌｌ－ＭｃＧｌｏｕｇｈｌｉｎ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌｙ ２００８，Ｖｏｌ．１４７，ｐｐ．９３９－９５３）：
バヒアグラス（Ｌｕｃｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．２００５，Ｆｌｏｒｉｄａ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｏｓｔｅｒ）、キャノーラ（Ｒｏｅｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１３ ７５－８１）、トウモロコシ（Ｃｒｏｍｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ，１９６７，１９６９ Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ ２６ １３２５－１３３１、Ｏ’Ｑｕｉｎ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ ７８ ２１４４－２１４９、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ １１ １１－２０、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｐｌａｎｔ Ｊ ３８ ９１０－９２２）、ジャガイモ（Ｙｕ Ｊ ａｎｄ Ａｏ，１９９７ Ａｃｔａ Ｂｏｔ Ｓｉｎ ３９ ３２９－３３４；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ ｅｔ ａｌ．２０００，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７ ３７２４－３７２９；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２００１）Ｃｈｉｎ Ｓｃｉ Ｂｕｌｌ ４６ ４８２－４８４、コメ（Ｋａｔｓｕｂｅ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２０ １０６３－１０７４）、ダイズ（Ｄｉｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｒａｐｐ ２００２，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｐｌａｎｔ ３７ ７４２－７４７）、サツマイモ（Ｅｇｎｉｎ ａｎｄ Ｐｒａｋａｓｈ １９９７，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３３ ５２Ａ）に関して記載されているものなど、改変されたタンパク質品質、含有量及び／またはアミノ酸組成。
キャノーラ（Ｆａｌｃｏ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３ ５７７－５８２）、ルピナス（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｊ Ｓｃｉ Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ ８１ １４７－１５４）、トウモロコシ（Ｌａｉ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，２００２，Ａｇｂｉｏｓ ２００８ ＧＭ ｃｒｏｐ ｄａｔａｂａｓｅ（Ｍａｒｃｈ １１，２００８））、ジャガイモ（Ｚｅｈ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２７ ７９２－８０２）、モロコシ（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，ｐｐ ４１３－４１６）、ダイズ（Ｆａｌｃｏ ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３ ５７７－５８２；Ｇａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ ２１ １６７－２０４）に関して記載されているものなど、必須アミノ含有量。
キャノーラ（Ｄｅｈｅｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｊ ９ １６７－１７２［ＰｕｂＭｅｄ］；Ｄｅｌ Ｖｅｃｃｈｉｏ（１９９６）ＩＮＦＯＲＭ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗｓ ｏｎ Ｆａｔｓ，Ｏｉｌｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ７ ２３０－２４３；Ｒｏｅｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１３ ７５－８１［ＰＭＣ ｆｒｅｅ ａｒｔｉｃｌｅ］［ＰｕｂＭｅｄ］；Ｆｒｏｍａｎ ａｎｄ Ｕｒｓｉｎ（２００２，２００３）Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ｐａｐｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２２３ Ｕ３５；Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ７７ １１４０－１１４５［ＰｕｂＭｅｄ］；Ａｇｂｉｏｓ（２００８，上記）；ワタ（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｊ Ａｍ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ７８ ９４１－９４７；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｎｕｔｒ ２１ ２０５Ｓ－２１１Ｓ［ＰｕｂＭｅｄ］；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ（２００７）Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈｎｅｗｓ．ｃｏｍ．ａｕ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｉｄ；８６６６９４８１７；ｆｐ；４；ｆｐｉｄ；２（Ｊｕｎｅ １７，２００８））、リンシード（Ａｂｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １６：２７３４－２７４８）、トウモロコシ（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｌａｎｔ Ｊ ３８ ９１０－９２２）、油ヤシ（Ｊａｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｊ Ａｍ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ７４ １４５１－１４５５；Ｐａｒｖｅｅｚ，２００３，ＡｇＢｉｏｔｅｃｈＮｅｔ １１３ １－８）、コメ（Ａｎａｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２１ ９８８－９９２）、ダイズ（Ｒｅｄｄｙ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，１９９６，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４ ６３９－６４２；Ｋｉｎｎｅｙ ａｎｄ Ｋｗｏｌｔｏｎ，１９９８，Ｂｌａｃｋｉｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ １９３－２１３）、ヒマワリ（Ａｒｃａｄｉａ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００８）に関するなどの、油及び脂肪酸。
チコリ（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ ２ ２８６－２８７、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４００ ３５５－３５８、Ｓｅｖｅｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６ ８４３－８４６）、トウモロコシ（Ｃａｉｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１０ ３５５－３６３）、ジャガイモ（Ｈｅｌｌｗｅｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｐｌａｎｔ Ｊ １２ １０５７－１０６５）、サトウダイコン（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．１９９７，上記）に関して記載されるフルクタン、ジャガイモに関して記載されるなどのイヌリン（Ｈｅｌｌｅｗｅｇｅ ｅｔ ａｌ．２０００，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７ ８６９９－８７０４）、コメに関して記載されるなどのデンプン（Ｓｃｈｗａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８ ５５１－５５４、Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ Ｂｒｅｅｄ １５ １２５－１４３）など、炭水化物。
キャノーラ（Ｓｈｉｎｔａｎｉ ａｎｄ ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２ ２０９８－２１００）、トウモロコシ（Ｒｏｃｈｅｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｎｕｔｒ ２１ １９１Ｓ－１９８Ｓ，Ｃａｈｏｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１ １０８２－１０８７、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００ ３５２５－３５３０）、カラシ種子（Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｊ ２０ ４０１－４１２、ジャガイモ（Ｄｕｃｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ ５６ ８１－８９）、コメ（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７ ３０３－３０５、イチゴ（Ａｇｉｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１ １７７－１８１）、トマト（Ｒｏｓａｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ ２４ ４１３－４１９、Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｓｃｉ Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ ８１ ８２２－８２７、Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０ ６１３－６１８、Ｄｉａｚ ｄｅ ｌａ Ｇａｒｚａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１ １３７２０－１３７２５、Ｅｎｆｉｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ３ １７－２７、ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ（２００７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４ ３６７５－３６７６に関して記載されるなどのビタミン類及びカロテノイド類。
リンゴ（スチルベン類、Ｓｚａｎｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２２：１４１－１４９）、アルファルファ（レスベラトロール、Ｈｉｐｓｋｉｎｄ ａｎｄ Ｐａｉｖａ（２０００）Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ １３ ５５１－５６２）、キーウィ（レスベラトロール、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １９ ９０４－９１０）、トウモロコシ及びダイズ（フラボノイド類、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２４ ７８１－７９４）、ジャガイモ（アントシアニン及びアルカロイドグリコシド、Ｌｕｋａｓｚｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ５２ １５２６－１５３３）、コメ（フラボノイド類及びレスベラトロール、Ｓｔａｒｋ－Ｌｏｒｅｎｚｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １６ ６６８－６７３、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ４ ３０３－３１５）、トマト（＋レスベラトロール、クロロゲン酸、フラボノイド類、スチルベン；Ｒｏｓａｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）上記、Ｍｕｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ １９ ４７０－４７４、Ｎｉｇｇｅｗｅｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２ ７４６－７５４、Ｇｉｏｖｉｎａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ３ ５７－６９）、コムギ（コーヒー酸及びフェルラ酸、レスベラトロール；Ｕｎｉｔｅｄ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２００２））に関して記載されるなどの機能性二次代謝産物；及び
アルファルファ（フィターゼ、Ａｕｓｔｉｎ－Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆａｒｍｉｎｇ．ｃｏｍ／ｎｏｎｍｅｄｉｃａｌ．ｈｔｍｌ）、レタス（ｌｅｔｔｕｓｅ）（鉄、Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ １００ ６５８－６６４）、コメ（鉄、Ｌｕｃｃａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｎｕｔｒ ２１ １８４Ｓ－１９０Ｓ）、トウモロコシ、ダイズ及びコムギ（ｗｈｅａｔｅ）（フィターゼ、Ｄｒａｋａｋａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５９ ８６９－８８０、Ｄｅｎｂｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｏｕｌｔ Ｓｃｉ ７７ ８７８－８８１、Ｂｒｉｎｃｈ－Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ Ｂｒｅｅｄ ６ １９５－２０６）に関して記載されるなどのミネラル利用可能性。
特定の実施形態では、付加価値形質は、植物中に存在する化合物の想定される健康上の利益に関する。例えば、特定の実施形態では、付加価値作物は、本発明の方法を適用して以下の１つ以上の化合物の改変を確実に起こし、またはその合成を誘導し／増加させることによって得られる：
・ニンジンに存在するα－カロチン（細胞に損傷を引き起こし得るフリーラジカルを中和する）または様々な果実及び野菜に存在するβ－カロチン（フリーラジカルを中和する）など、カロテノイド類
・緑色野菜に存在するルテイン（健康な視力の維持に寄与する）、
・トマト及びトマト製品に存在するリコペン（前立腺癌のリスクを低減すると考えられている）
・柑橘類及びトウモロコシに存在するゼアキサンチン（健康な視力の維持に寄与する）、
・小麦ふすまに存在する不溶性繊維などの食物繊維（乳癌及び／または結腸癌のリスクを低減し得る）及びオートムギに存在するβ－グルカン、サイリウム及び全粒穀物に存在する可溶性繊維（心血管疾患（ＣＶＤ）のリスクを低減し得る）
・ω－３脂肪酸などの脂肪酸（ＣＶＤのリスクを低減し、かつ精神機能及び視覚機能を改善し得る）、共役リノール酸（体組成を改善し得る、ある種のがんのリスクを減少させ得る）、及びＧＬＡ（がん及びＣＶＤの炎症リスクを低減し得る、体組成を改善し得る）
・コムギに存在するヒドロキシ桂皮酸などのフラボノイド類（抗酸化剤様活性を有する、変性疾患のリスクを低減し得る）、果実及び野菜に存在するフラボノール類、カテキン類及びタンニン類（フリーラジカルを中和し、かつがんのリスクを低減し得る）
・アブラナ科の野菜（ブロッコリー、ケール）、セイヨウワサビに存在する、スルホラファンなど、グルコシノレート類、インドール類、イソチオシアネート類（フリーラジカルを中和し、がんのリスクを低減し得る）
・ブドウに存在するスチルベン類などのフェノール類（変性疾患、心疾患、及びがんのリスクを低減し得る、長寿効果を有し得る）ならびに野菜及び柑橘類に存在するコーヒー酸及びフェルラ酸（抗酸化剤様活性を有する、変性疾患、心疾患、及び眼疾患のリスクを低減し得る）、及びカカオに存在するエピカテキン（抗酸化剤様活性を有する、変性疾患及び心疾患のリスクを低減し得る）
・トウモロコシ、ダイズ、コムギ及び木由来のオイル（ｗｏｏｄｅｎ ｏｉｌ）に存在する植物スタノール／ステロール（血中コレステロール値を下げることにより冠動脈心疾患のリスクを低減し得る）
・キクイモ、エシャロット、オニオンパウダーに存在するフルクタン類、イヌリン類、フラクトオリゴ糖類（胃腸の健康を改善し得る）
・ダイズに存在するサポニン類（ＬＤＬコレステロールを下げ得る）
・ダイズに存在するダイズタンパク質（心疾患のリスクを低減し得る）
・ダイズに存在するイソフラボン類などのフィトエストロゲン類（のぼせなどの閉経症状を低減し得る、骨粗鬆症及びＣＶＤを低減し得る）ならびに亜麻、ライムギ及び野菜に存在するリグナン類（心疾患及びいくつかのがんから保護し得る、ＬＤＬコレステロール、総コレステロールを下げ得る）。
・タマネギ、ニンニク、オリーブ、ニラ及びワケギ（ｓｃａｌｌｏｎ）に存在する硫化ジアリルなどの硫化物及びチオール類、ならびにアブラナ科の野菜に存在するアリルメチルトリスルフィド、ジチオールチオン類（ＬＤＬコレステロールを下げ得る、健康な免疫系を維持する助けとなる）
・クランベリー、ココアに存在するプロアントシアニジン類などのタンニン類（尿路の健康を改善し得る、ＣＶＤ及び高血圧のリスクを低減し得る）。
加えて、本発明の方法はまた、タンパク質／デンプン機能、貯蔵寿命、味／美しさ、繊維品質、ならびにアレルゲン、抗栄養素、及び毒素低減形質を改変することも想定する。
従って、本発明は、栄養上の付加価値のある植物を作製する方法を包含し、前記方法は、栄養的付加価値の成分の産生に関与する酵素をコードする遺伝子を本明細書に記載される通りの系を用いて植物細胞に導入するステップ、及び前記植物細胞から植物を再生するステップを含み、前記植物は、栄養的付加価値の前記成分の発現の増加を特徴とする。特定の実施形態では、系を用いて、例えば、化合物の代謝を制御する１つ以上の転写因子を改変することにより、これらの化合物の内因性合成が間接的に改変される。系を用いて目的の遺伝子を植物細胞に導入する方法及び／または内因性遺伝子を改変する方法は、本明細書において上記に記載される。
付加価値形質を付与するため改変された植物における改変のいくつかの具体的な例は、例えば、ステアリル－ＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子で植物を形質転換して植物のステアリン酸含有量を増加させることによる、脂肪酸代謝が改変された植物である。Ｋｎｕｌｔｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：２６２４（１９９２）を参照されたい。別の例は、例えば、低レベルのフィチン酸によって特徴付けられるトウモロコシ突然変異体に関与し得る単一対立遺伝子に関連するＤＮＡをクローニングして、次に再導入することによる、フィチン酸塩含有量を減少させることを伴うものである。Ｒａｂｏｙ ｅｔ ａｌ，Ｍａｙｄｉｃａ ３５：３８３（１９９０）を参照されたい。
同様に、強力なプロモーターの制御下でトウモロコシアリューロン層中のフラボノイド類の産生を調節するトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）Ｔｆｓ Ｃ１及びＲを発現させると、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）において恐らくは経路全体の活性化によってアントシアニン類の高蓄積率が得られた（Ｂｒｕｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １２：６５－８０）。ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ（Ｗｅｌｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ５７：７１１－７３８）は、Ｔｆ ＲＡＰ２．２及びその相互作用パートナーＳＩＮＡＴ２がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉におけるカロチン生成を増加させることを見出した。Ｔｆ Ｄｏｆ１の発現は、トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて炭素骨格生成酵素をコードする遺伝子の上方制御、アミノ含有量の顕著な増加、及びＧｌｃレベルの低下を誘導し（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，２００４ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ４５：３８６－３９１）、及びＤＯＦ Ｔｆ ＡｔＤｏｆ１．１（ＯＢＰ２）は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるグルコシノレート生合成経路の全ての段階を上方制御した（Ｓｋｉｒｙｃｚ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｐｌａｎｔ Ｊ ４７：１０－２４）。
植物におけるアレルゲンの低減
特定の実施形態では、本明細書に提供される方法を用いて、植物が消費者にとってより安全なものとなるよう、アレルゲンレベルが低下した植物が作成される。特定の実施形態では、本方法は、植物アレルゲンの生成に関与する１つ以上の遺伝子の発現を改変することを含む。例えば、特定の実施形態では、本方法は、ライグラス植物細胞などの植物細胞のＬｏｌ ｐ５遺伝子の発現を下方制御すること、及び前記植物の花粉のアレルゲン性を減らすためそれらの植物細胞から植物を再生することを含む（Ｂｈａｌｌａ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．９６：１１６７６－１１６８０）。
ピーナッツアレルギー及び一般にマメ科植物に対するアレルギーは、実際に存在する重大な健康問題である。本発明の系を用いると、かかるマメ科植物のアレルゲンタンパク質をコードする遺伝子を同定し、次にそれを突然変異させることができる。かかる遺伝子及びタンパク質に関して限定なしに、Ｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．が、ピーナッツ、ダイズ、レンズマメ、エンドウマメ、ルピナス、サヤマメ、及びヤエナリのアレルゲンタンパク質を同定している。Ｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１；１１（３）：２２２）を参照されたい。
目的の内因性遺伝子のスクリーニング方法
本明細書に提供される方法は、さらに、栄養的付加価値のある成分の産生に関与する価値コード酵素の遺伝子、または一般に種、門、及び植物界にわたって目的の農業形質に影響を及ぼす遺伝子の同定を可能にする。例えば、植物における代謝経路の酵素をコードする遺伝子を本明細書に記載される通りの系を用いて選択的に標的化することにより、植物のある種の栄養的側面に関与する遺伝子を同定することができる。同様に、望ましい農業形質に影響を及ぼし得る遺伝子を選択的に標的化することにより、関連性のある遺伝子を同定することができる。従って、本発明は、特定の栄養価及び／または農業形質を有する化合物の生成に関与する酵素をコードする遺伝子のスクリーニング方法を包含する。
植物及び酵母における系のさらなる適用
バイオ燃料生成における系の使用
用語「バイオ燃料」は、本明細書で使用する場合、植物及び植物由来の資源から作られる代替燃料である。再生可能バイオ燃料は、エネルギーが炭素固定の過程を通じて得られてきた有機物から抽出することができ、またはバイオマスの使用もしくは変換によって作られる。このバイオマスはバイオ燃料に直接使用してもよく、または熱変換、化学変換、及び生化学変換によって好都合なエネルギー含有物質に変換されてもよい。このバイオマス変換により、固体、液体、または気体の形態の燃料が得られ得る。バイオ燃料には、バイオエタノールとバイオディーゼルとの２種類がある。バイオエタノールは、主として、大部分がトウモロコシ及びサトウキビに由来するセルロース（デンプン）の糖発酵プロセスによって生産される。他方でバイオディーゼルは、主として、ナタネ、ヤシ、及びダイズなどの油料作物から生産される。バイオ燃料は、主として輸送機関に用いられる。
バイオ燃料生成のための植物特性の増強
特定の実施形態では、発酵に際して糖類がより効率的に放出されるよう主要な加水分解剤によるアクセスを容易にするため、本明細書に記載される通りの系を使用する本方法を用いて細胞壁の特性を変化させる。特定の実施形態では、セルロース及び／またはリグニンの生合成が改変される。セルロースは、細胞壁の主要な成分である。セルロース及びリグニンの生合成は共調節される。植物中のリグニンの割合を減らすことにより、セルロースの割合を増加させることができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて植物におけるリグニン生合成が下方制御され、それにより発酵性糖質を増加させる。より詳細には、ＷＯ２００８０６４２８９ Ａ２に開示される通り、本明細書に記載される方法を用いて、４－クマル酸３－ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、桂皮酸－４－ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（ＨＣＴ）、コーヒー酸Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、カフェオイルＣｏＡ３－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）、フェルラ酸５－ヒドロキシラーゼ（Ｆ５Ｈ）、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、シンナモイルＣｏＡ－レダクターゼ（ＣＣＲ）、４－クマル酸－ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）、モノリグノール－リグニン特異的グリコシルトランスフェラーゼ、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）からなる群から選択される少なくとも第１のリグニン生合成遺伝子が下方制御される。
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて、発酵中に発生する酢酸レベルがより低い植物マスが作製される（ＷＯ２０１００９６４８８もまた参照されたい）。より詳細には、本明細書に開示される方法を用いてＣａｓｌＬのホモログに突然変異が生成され、多糖アセチル化が低減される。
バイオ燃料生成のための酵母の改変
特定の実施形態では、本明細書に提供される系は、組換え微生物によるバイオエタノールの生産に用いられる。例えば、系を用いて酵母などの微生物をエンジニアリングすることにより、発酵性糖類からバイオ燃料または生体高分子を作成することができ、任意選択で発酵性糖類の供給源としての農業廃棄物から得られた植物由来のリグノセルロースを分解することが可能である。いくつかの実施形態では、系を用いて、バイオ燃料生成経路と競合する内因性代謝経路が改変される。
従って、より特定の実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて以下の通り微生物が改変される：前記宿主細胞における代謝経路の酵素をコードする少なくとも１つの核酸が改変され（ここで、前記経路は、ピルビン酸からアセトアルデヒドまたはアセトアルデヒドからエタノール以外の代謝産物を産生し、前記改変は前記代謝産物の産生の低下をもたらす）、または前記酵素の阻害因子をコードする少なくとも１つの核酸が導入される。
植物油またはバイオ燃料を生成するための藻類及び植物の改変
トランスジェニックの藻類またはセイヨウアブラナなどの他の植物は、例えば、アルコール類（特に、メタノール及びエタノール）など、植物油またはバイオ燃料の生成に特に有用であり得る。これらは、油またはバイオ燃料産業で使用される高レベルの油またはアルコールを発現または過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
本発明の特定の実施形態によれば、系を用いて、バイオ燃料生成に有用な脂質リッチ珪藻類が生成される。
特定の実施形態では、藻類細胞によって産生される脂質の量及び／または脂質の質の改変に関与する遺伝子を特異的に改変することが想定される。脂肪酸合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子は、例えば、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸シンターゼ、３－ケトアシルアシルキャリアータンパク質シンターゼＩＩＩ、グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、エノイルアシルキャリアータンパク質レダクターゼ（エノイル－ＡＣＰ－レダクターゼ）、グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼまたはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼなどの脂肪酸チオエステラーゼ、またはリンゴ酸酵素活性を有するタンパク質をコードすることができる。さらなる実施形態では、脂質蓄積が増加した珪藻類を作成することが想定される。これは、脂質異化を減少させる遺伝子を標的化することによって実現し得る。トリアシルグリセロール及び遊離脂肪酸の両方の活性化に関わる遺伝子、ならびにアシル－ＣｏＡシンテターゼ、３－ケトアシル－ＣｏＡチオラーゼ、アシル－ＣｏＡオキシダーゼ活性及びホスホグルコムターゼなどの脂肪酸のβ酸化に直接関わる遺伝子が、本発明の方法で用いるのに特に有益である。本明細書に記載される系及び方法を用いると、その脂質含有量が増加するように珪藻類のかかる遺伝子を特異的に活性化させることができる。
微細藻類などの生物は、合成生物学に広く用いられている。Ｓｔｏｖｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍ．，２０１５；２：１３は、工業生産用のロバストな株を効率的に作製するための工業用酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅのゲノム編集について記載している。Ｓｔｏｖｉｃｅｋは、酵母にコドン最適化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を使用して内因性遺伝子の両方の対立遺伝子を同時に破壊し、異種遺伝子をノックインした。ゲノムまたはエピソーム２μ系ベクター位置からＣａｓ９及びｇＲＮＡを発現させた。この著者らはまた、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ発現レベルを最適化することにより遺伝子破壊効率を改善できたことも示した。Ｈｌａｖｏｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２０１５）は、挿入突然変異誘発及びスクリーニングのため核及び葉緑体遺伝子を標的化するＣＲＩＳＰＲなどの技術を用いた微細藻類の種または株の開発を考察している。
ＵＳ８９４５８３９は、Ｃａｓ９を用いた微細藻類（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ細胞）種）のエンジニアリング方法について記載している。同様のツールを用いて、本明細書に記載される系の方法をＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ種及び他の藻類に適用することができる。特定の実施形態では、Ｈｓｐ７０Ａ－Ｒｂｃ Ｓ２またはβ２－チューブリンなどの構成的プロモーターの制御下で、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、及び任意選択で、アデノシンデアミナーゼを発現するベクターを用いて発現させて、藻類にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１３）、アデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアプタマー結合アダプタータンパク質に融合され得る）、及びガイドＲＮＡが導入される。ガイドＲＮＡは、Ｔ７プロモーターを含有するベクターを用いて送達されることになる。あるいは、ｍＲＮＡ及びインビトロ転写されたガイドＲＮＡが藻類細胞に送達されてもよい。電気穿孔プロトコルは、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓエンジニアリングキットの標準的な推奨プロトコルに従う。
脂肪酸産生能を有する微生物の作成における系の使用
特定の実施形態では、本発明の方法は、脂肪酸メチルエステル類（「ＦＡＭＥ」）及び脂肪酸エチルエステル類（「ＦＡＥＥ」）など、脂肪酸エステル類の産生能を有する遺伝子操作された微生物の作成に用いられる。
典型的には、宿主細胞は、チオエステラーゼをコードする遺伝子、アシル－ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子、及びエステルシンターゼをコードする遺伝子の発現または過剰発現により、アルコールなど、培地中に存在する炭素源から脂肪酸エステル類を産生するようにエンジニアリングすることができる。従って、本明細書に提供される方法を用いて、チオエステラーゼ遺伝子、アシル－ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子、及びエステルシンターゼをコードする遺伝子を過剰発現するかまたは導入するように微生物が改変される。特定の実施形態では、チオエステラーゼ遺伝子は、ｔｅｓＡ、’ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｆａｔＢ、ｆａｔＢ２、ｆａｔＢ３、ｆａｔＡｌ、またはｆａｔＡから選択される。特定の実施形態では、アシル－ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子は、ｆａｄＤＪａｄＫ、ＢＨ３１０３、ｐｆｌ－４３５４、ＥＡＶ１５０２３、ｆａｄＤｌ、ｆａｄＤ２、ＲＰＣ＿４０７４、ｆａｄＤＤ３５、ｆａｄＤＤ２２、ｆａａ３９、または同じ特性を有する酵素をコードする同定された遺伝子から選択される。特定の実施形態では、エステルシンターゼをコードする遺伝子は、Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＤＰ、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｆｕｎｄｉｂａｃｔｅｒ ｊａｄｅｎｓｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、もしくはＡｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、またはその変異体由来のシンターゼ／アシル－ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。それに加えてまたは代えて、本明細書に提供される方法を用いると、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、外膜タンパク質受容体をコードする遺伝子、及び脂肪酸生合成の転写調節因子をコードする遺伝子のうちの少なくとも１つの前記微生物における発現が減少する。特定の実施形態では、これらの遺伝子のうちの１つ以上が、突然変異の導入によるなどして不活性化される。特定の実施形態では、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ｆａｄＥである。特定の実施形態では、脂肪酸生合成の転写調節因子をコードする遺伝子は、ＤＮＡ転写リプレッサー、例えば、ｆａｂＲをコードする。
それに加えてまたは代えて、前記微生物は、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のうちの少なくとも一方、または両方の発現が低下するように改変される。特定の実施形態では、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子は、ｐｆｌＢである。特定の実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ＩｄｈＡである。特定の実施形態では、これらの遺伝子のうちの１つ以上が、そこに突然変異を導入することによるなどして不活性化される。
特定の実施形態では、微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｙｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈａｍｏｎａｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓから選択される。
有機酸産生能を有する微生物の作成における系の使用
本明細書に提供される方法は、有機酸産生能、より詳細にはペントースまたはヘキソース糖類からの有機酸産生能を有する微生物のエンジニアリングにさらに用いられる。特定の実施形態では、本方法は、外因性ＬＤＨ遺伝子を微生物に導入するステップを含む。特定の実施形態では、それに加えてまたは代えて、目的の有機酸以外の代謝産物を産生する内因性代謝経路であって、及び／または有機酸を消費する内因性代謝経路に関わるタンパク質をコードする内因性遺伝子を不活性化することにより、前記微生物における有機酸産生を増加させる。特定の実施形態では、この改変により、目的の有機酸以外の代謝産物の産生が低下することが確実となる。特定の実施形態によれば、本方法は、有機酸が消費される内因性経路のうちの少なくとも１つのエンジニアリングされた遺伝子欠失及び／または不活性化、あるいは目的の有機酸以外の代謝産物を作り出す内因性経路に関わる生成物をコードする遺伝子の導入に用いられる。特定の実施形態では、少なくとも１つのエンジニアリングされた遺伝子欠失または不活性化は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、Ｄ－乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄ－ｌｄｈ）、Ｌ－乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌ－ｌｄｈ）、乳酸２－モノオキシゲナーゼからなる群から選択される酵素をコードする１つ以上の遺伝子にある。さらなる実施形態では、少なくとも１つのエンジニアリングされた遺伝子欠失及び／または不活性化は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする内因性遺伝子（ｐｄｃ）にある。
さらなる実施形態では、微生物は、乳酸を産生するようにエンジニアリングされ、少なくとも１つのエンジニアリングされた遺伝子欠失及び／または不活性化は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする内因性遺伝子にある。それに加えてまたは代えて、微生物は、シトクロムＢ２依存性Ｌ－乳酸デヒドロゲナーゼなどのシトクロム依存性乳酸デヒドロゲナーゼをコードする内因性遺伝子のうちの少なくとも１つのエンジニアリングされた遺伝子欠失または不活性化を含む。
酵母株を利用した改良キシロースまたはセロビオースの生成における系の使用
特定の実施形態では、系は、酵母株を利用した改良キシロースまたはセロビオースの選択に適用し得る。エラープローンＰＣＲを用いて、キシロース利用またはセロビオース利用経路に関わる１つ（または複数）の遺伝子を増幅することができる。キシロース利用経路及びセロビオース利用経路に関わる遺伝子の例としては、限定なしに、Ｈａ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８（２）：５０４－９及びＧａｌａｚｋａ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０（６０００）：８４－６に記載されるものを挙げることができる。各々がかかる選択の遺伝子にランダム突然変異を含む得られた二本鎖ＤＮＡ分子ライブラリーは、系の成分と共に酵母株（例えば、Ｓ２８８Ｃ）に共形質転換してもよく、ＷＯ２０１５１３８８５５に記載される通り、キシロースまたはセロビオース利用能が増強された株を選択することができる。
イソプレノイド生合成に用いられる改良酵母株の作成における系の使用
Ｔａｄａｓ Ｊａｋｏｃｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．は、パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて１回の形質転換ステップで最大５つの異なるゲノム遺伝子座をゲノムエンジニアリングすることへの多重Ｃａｓ１３ ＣＲＩＳＰＲ系の適用に成功したことについて記載しており（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌｕｍｅ ２８，Ｍａｒｃｈ ２０１５，Ｐａｇｅｓ ２１３－２２２）、工業的に重要なイソプレノイド生合成経路にとって鍵となる中間体であるメバロン酸高産生株が得られている。特定の実施形態では、イソプレノイド合成に用いられるさらなる高産生酵母株を同定するため、本明細書に記載される通りの多重ゲノムエンジニアリング方法において、系が適用されてもよい。
改良された植物及び酵母細胞
本発明はまた、本明細書に提供される方法によって得ることのできる及びそれによって得られた植物及び酵母細胞も提供する。本明細書に記載される方法によって得られた改良植物は、例えば、植物害虫、除草剤、乾燥、低温または高温、過剰な水などに対する耐性を確実にする遺伝子の発現により、食品または飼料製造において有用となり得る。
本明細書に記載される方法によって得られた改良植物、特に作物及び藻類は、例えば、通常野生型に見られるであろうよりも高いタンパク質、炭水化物、栄養素またはビタミンレベルの発現により、食品または飼料製造において有用となり得る。この点で、改良植物、特に豆類及び塊茎が好ましい。
改良藻類またはセイヨウアブラナなどの他の植物は、例えば、アルコール類（特に、メタノール及びエタノール）など、植物油またはバイオ燃料の生成において特に有用であり得る。これらは、油またはバイオ燃料産業で使用される高レベルの油またはアルコールを発現または過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
本発明はまた、植物の改良された一部分も提供する。植物部位としては、限定はされないが、葉、茎、根、塊茎、種子、胚乳、胚珠、及び花粉が挙げられる。本明細書において想定される通りの植物部位は、生育可能、生育不能、再生可能、及び／または再生不能であってもよい。
また、本明細書では、本発明の方法によって作成された植物細胞及び植物を提供することも包含される。従来の育種方法によって作製された、遺伝子改変を含む植物の配偶子、種子、胚（接合胚であれまたは体細胞胚であれ）、子孫またはハイブリッドもまた、本発明の範囲内に含まれる。かかる植物は、標的配列に挿入されるかまたはそれの代わりに挿入された異種または外来性ＤＮＡ配列を含有し得る。あるいは、かかる植物は、１つ以上のヌクレオチドに、ある変化（突然変異、欠失、挿入、置換）のみを含有し得る。そのため、かかる植物は、その前駆植物と特定の改変の存在だけが異なるに過ぎないことになる。
従って、本発明は、本方法によって作製される植物、動物もしくは細胞、またはそれらの子孫を提供する。子孫は、作製された植物もしくは動物のクローンであってもよく、またはさらに望ましい形質をその子孫に遺伝子移入させるため同じ種の他の個体と交雑させることによる有性生殖から生じてもよい。細胞は、多細胞生物、特に、動物または植物の場合にインビボまたはエキソビボであってよい。
本明細書に記載される通りの系を使用したゲノム編集方法を用いることにより、本質的にいかなる植物、藻類、菌類、酵母などにも所望の形質を付与することができる。本明細書に記載される所望の生理学的及び農学的特性について、本開示の核酸構築物及び上述の様々な形質転換方法を用いて多種多様な植物、藻類、菌類、酵母など及び植物藻類、菌類、酵母細胞または組織系をエンジニアリングし得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＣＲＩＳＰＲ成分をコードするものを含めた任意の外因性遺伝子を植物、藻類、菌類、酵母などのゲノムに永久的に導入することなく、そのようにして植物のゲノムに外来ＤＮＡが存在することを回避しつつ内因性遺伝子を改変し、またはそれらの発現を改変するために用いられる。非トランスジェニック植物に求められる規制上の要件は厳しさが緩和されるため、これは有益であり得る。
本明細書に記載される方法は、概して、野生型植物と比較して１つ以上の望ましい形質を有するという点で「改良植物、藻類、菌類、酵母など」の生成をもたらす。特定の実施形態では、植物のいずれの細胞のゲノムにも外因性ＤＮＡ配列が取り込まれないという点で、非トランスジェニック遺伝子改変植物、藻類、菌類、酵母など、部位または細胞が得られる。かかる実施形態では、改良植物、藻類、菌類、酵母などは、非トランスジェニックである。内因性遺伝子の改変のみが確実に起こり、外因性遺伝子は植物、藻類、菌類、酵母などのゲノムに導入または維持されない場合、得られる遺伝子改変作物は、外因性遺伝子を含まず、従って、基本的に非トランスジェニックと見なし得る。植物、藻類、菌類、酵母などのゲノム編集への系の種々の適用は、限定されないが、内因性遺伝子の編集による目的の農業形質の付与が含まれる。農業形質を付与する例示遺伝子としては、限定されないが、害虫または病害に対する抵抗性を付与する遺伝子；ＷＯ２０１３０４６２４７に挙げられるものなど、植物病害に関与する遺伝子；除草剤、殺菌剤などに耐性を付与する遺伝子；（非生物的）ストレス耐性に関わる遺伝子が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の使用の他の態様は、限定されないが、（雄性）不稔植物を作出するため；植物／藻類などにおける稔性期の増加；目的の作物に遺伝的変異を生成するため；果実の熟成に影響を及ぼすため；植物／藻類などの貯蔵寿命の増加；植物／藻類などにおけるアレルゲンの低減；付加価値形質を確保するため（例えば、栄養改善）；目的の内因性遺伝子のスクリーニング方法；バイオ燃料、脂肪酸、有機酸などの産生が含まれる。
系は、非ヒト生物において使用することができる
ある態様では、本発明は、記載される実施形態のいずれかに係る真核生物宿主細胞を含む非ヒト真核生物；好ましくは多細胞真核生物を提供する。他の態様では、本発明は、記載される実施形態のいずれかに係る真核生物宿主細胞を含む真核生物；好ましくは多細胞真核生物を提供する。これらの態様の一部の実施形態における生物は、動物；例えば、哺乳類であってもよい。また、生物は、昆虫などの節足動物であってもよい。本発明はまた、例えば、家畜及び生産動物など、他の農業適用にも拡張し得る。例えば、ブタは、それを特に再生医学における生物医学モデルとして魅力的なものにする多くの特徴を備えている。特に、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）のブタが、再生医学、異種移植（本明細書のいずれかにもまた記載される）、及び腫瘍発生の有用なモデルを提供し得るとともに、ヒトＳＣＩＤ患者に対する治療薬の開発の助けとなり得る。Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１４ Ｍａｙ ２０；１１１（２０）：７２６０－５）は、レポーター－ガイド下転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系を利用して、両方の対立遺伝子に影響を及ぼすものを含め、高効率で体細胞に組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ）２の標的改変を作成した。系を同様の系に適用し得る。
Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１４ Ｍａｙ ２０；１１１（２０）：７２６０－５）の方法は、以下の通り類似的に本発明に適用し得る。胎児線維芽細胞におけるＲＡＧ２の標的改変と、それに続くＳＣＮＴ及び胚移植によって突然変異ブタを作製する。ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ及びレポーターをコードする構築物を胎児由来の線維芽細胞に電気穿孔処理する。４８時間後、緑色蛍光タンパク質を発現するトランスフェクト細胞を９６ウェルプレートの個々のウェル中に１ウェル当たり推定希釈の単一細胞で保存する。ＲＡＧ２の標的改変は、任意のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ開裂部位に隣接するゲノムＤＮＡ断片を増幅し、続いてＰＣＲ生成物をシーケンシングすることによりスクリーニングする。スクリーニングし、オフサイト突然変異がないことを確認した後、ＲＡＧ２の標的改変を有している細胞をＳＣＮＴに使用する。極体を卵母細胞の隣接細胞質の一部分（恐らく、第二分裂中期の中期板を含有する）と共に除去し、及びドナー細胞を卵黄周囲に置く。次に再構成された胚を電気穿孔処理してドナー細胞を卵母細胞と融合させ、次に化学的に活性化させる。活性化した胚を０．５μＭスクリプタイド（Ｓ７８１７；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）含有ブタ接合子培地３（ＰＺＭ３）中で１４～１６時間インキュベートする。次に胚を洗浄してスクリプタイドを除去し、胚が代理母ブタの卵管に移されるまでＰＺＭ３中で培養する。
本発明はまた、雌ウシなどの他の動物のＳＮＰの改変にも適用可能である。Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｏｃｔ ８；１１０（４１）：１６５２６－１６５３１）は、プラスミド、ｒＡＡＶ、及びオリゴヌクレオチド鋳型を使用した転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）刺激性及びクラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９刺激性相同依存性修復（ＨＤＲ）を含むように家畜遺伝子編集ツールボックスを展開した。遺伝子特異的ｇＲＮＡ配列が彼らの方法によってＣｈｕｒｃｈ ｌａｂ ｇＲＮＡベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：４１８２４）にクローニングされた（Ｍａｌｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８２３－８２６）。ｈＣａｓ９プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：４１８１５）またはＲＣＩＳｃｒｉｐｔ－ｈＣａｓ９から合成されたｍＲＮＡのいずれかの同時トランスフェクションによってＣａｓ９ヌクレアーゼが提供された。このＲＣＩＳｃｒｉｐｔ－ｈＣａｓ９は、ｈＣａｓ９プラスミド（ｈＣａｓ９ ｃＤＮＡを包含する）からＲＣＩＳｃｒｉｐｔプラスミドにＸｂａＩ－ＡｇｅＩ断片をサブクローニングすることにより構築された。
Ｈｅｏ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２０１５ Ｆｅｂ １；２４（３）：３９３－４０２．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｓｃｄ．２０１４．０２７８．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｎｏｖ ３）は、ウシ多能性細胞及びクラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いたウシゲノムにおける極めて効率的な遺伝子標的化を報告した。第一に、Ｈｅｏ ｅｔ ａｌ．は、ウシ体細胞線維芽細胞から山中因子の異所性発現ならびにＧＳＫ３β及びＭＥＫ阻害因子（２ｉ）処理によって人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作成した。Ｈｅｏ ｅｔ ａｌ．は、これらのウシｉＰＳＣが遺伝子発現及び奇形腫発生可能性の点でナイーブ多能性幹細胞に極めて類似していることを観察した。さらに、ウシＮＡＮＯＧ遺伝子座に特異的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ウシｉＰＳＣ及び胚においてウシゲノムの極めて効率的な編集を示した。
Ｉｇｅｎｉｔｙ（登録商標）は、屠体組成、屠体品質、母系及び繁殖形質ならびに平均１日増体量など、経済的重要性のある経済的形質の形質を実施し及び伝達するための、雌ウシなどの動物のプロファイル分析を提供している。網羅的Ｉｇｅｎｉｔｙ（登録商標）プロファイルの分析は、ＤＮＡマーカー（ほとんどの場合一塩基変異多型またはＳＮＰ）の発見から始まる。Ｉｇｅｎｉｔｙ（登録商標）プロファイルの背後にあるマーカーは全て、大学、研究組織、及びＵＳＤＡなどの政府機関を含めた研究機関の独立した科学者らによって発見された。次にバリデートされた集団においてＩｇｅｎｉｔｙ（登録商標）でマーカーが分析される。Ｉｇｅｎｉｔｙ（登録商標）は、様々な作製環境及び生物学的タイプを代表する複数のリソース集団を使用し、一般に入手可能でない表現型を収集するため牛肉産業のシードストック、雌ウシ－仔ウシ、フィードロット及び／またはパッキングセグメントからの工業的パートナーと協働することも多い。ウシゲノムデータベースは広く利用可能であり、例えば、ＮＡＧＲＰウシゲノムコーディネーションプログラム（Ｃａｔｔｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｎｉｍａｌｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃａｔｔｌｅ／ｍａｐｓ／ｄｂ．ｈｔｍｌ）を参照されたい。従って、本発明は、ウシＳＮＰの標的化に適用し得る。当業者は、例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．またはＨｅｏ ｅｔ ａｌ．による通り、上記のプロトコルをＳＮＰの標的化に利用して、及びそれらをウシＳＮＰに適用し得る。
Ｑｉｎｇｊｉａｎ Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅ Ａｃｃｅｓｓ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｃｔｏｂｅｒ １２，２０１５）は、イヌミオスタチン（ＭＳＴＮ）遺伝子（骨格筋量の負の調節因子）の第１のエクソンを標的化することによりイヌにおける筋量の増加を実証した。第一に、ＭＳＴＮを標的化するｓｇＲＮＡをＣａｓ９ベクターと共にイヌ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）に同時トランスフェクトすることを用いてｓｇＲＮＡの効率が検証された。その後、正常な形態の胚にＣａｓ９ ｍＲＮＡとＭＳＴＮ ｓｇＲＮＡとの混合物をマイクロインジェクションし、及び接合子を同じ雌イヌの卵管に自家移植することにより、ＭＳＴＮ ＫＯイヌが作成された。ノックアウト仔イヌはその野生型同腹姉妹と比較して大腿上に明らかな筋肉表現型を示した。これはまた、本明細書に提供される系を用いて実施することもできる。
家畜－ブタ
家畜におけるウイルス標的には、いくつかの実施形態では、例えば、ブタマクロファージ上のブタＣＤ１６３が含まれ得る。ＣＤ１６３は、ＰＲＲＳｖ（アルテリウイルスであるブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス）による感染に関連する（ウイルスの細胞への侵入を介すると考えられている）。ＰＲＲＳｖが特にブタ肺胞マクロファージ（肺に見られる）に感染すると、飼育ブタの生殖障害、体重減少及び高死亡率を含めた被害をもたらす、以前は不治であったブタ症候群（「ミステリーブタ病」または「青耳病」）が引き起こされる。マクロファージ活性が失われることによる免疫不全に起因して、流行性肺炎、髄膜炎及び耳浮腫などの日和見感染症が見られることが多い。また、抗生物質の使用増加及び金銭的損失に起因して、経済的及び環境的影響も大きい（毎年推定６億６千万ドル）。
Ｇｅｎｕｓ Ｐｌｃと共同でミズーリ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）のＫｒｉｓｔｉｎ Ｍ Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ及びＤｒ Ｒａｎｄａｌｌ Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３４３４ オンライン発行 ０７ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１５）によって報告される通り、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いてＣＤ１６３が標的化されており、編集されたブタの子孫はＰＲＲＳｖへの曝露時に抵抗性であった。１匹のファウンダー雄及び１匹のファウンダー雌（両方ともにＣＤ１６３のエクソン７に突然変異を有した）を繁殖させて子孫が作製された。ファウンダー雄は一方の対立遺伝子上のエクソン７に１１ｂｐの欠失を有したが、これはフレームシフト突然変異及びドメイン５のアミノ酸４５におけるミスセンス翻訳及びアミノ酸６４の続く成熟前終止コドンをもたらす。他方の対立遺伝子はエクソン７に２ｂｐの付加及び先行するイントロンに３７７ｂｐの欠失を有したが、これらはドメイン５の初めの４９アミノ酸の発現と、続くアミノ酸８５の成熟前終止コードをもたらすと予想された。雌ブタは一方の対立遺伝子に７ｂｐの付加を有し、これにより翻訳時にドメイン５の初めの４８アミノ酸が発現し、それにアミノ酸７０の成熟前終止コドンが続くと予想された。雌ブタの他方の対立遺伝子は増幅不能であった。選択された子孫はヌル動物（ＣＤ１６３－／－）、すなわちＣＤ１６３ノックアウトであると予想された。
従って、いくつかの実施形態では、ブタ肺胞マクロファージがＣＲＩＳＰＲタンパク質によって標的化され得る。いくつかの実施形態では、ブタＣＤ１６３がＣＲＩＳＰＲタンパク質によって標的化され得る。いくつかの実施形態では、ブタＣＤ１６３は、ＤＳＢの誘導によるか、または上記に記載されるものの１つ以上を含め、例えば、エクソン７の欠失もしくは改変を標的化するなど、挿入もしくは欠失によるか、または遺伝子の他の領域における、例えば、エクソン５の欠失もしくは改変によりノックアウトされ得る。
編集されたブタ及びその子孫、例えば、ＣＤ１６３ノックアウトブタもまた想定される。これは、家畜、育種またはモデル化目的（すなわち、ブタモデル）であり得る。遺伝子ノックアウトを含む精液もまた提供される。
ＣＤ１６３は、スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーのメンバーである。インビトロ研究に基づけば、このタンパク質のＳＲＣＲドメイン５は、ウイルスゲノムのアンパッケージング及び放出に関与するドメインである。そのため、ＳＲＣＲスーパーファミリーの他のメンバーもまた、他のウイルスに対する抵抗性を評価するため標的化され得る。ＰＲＲＳＶはまた、哺乳類アルテリウイルス群（これには、マウス乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、サル出血熱ウイルス及びウマ動脈炎ウイルスもまた含まれる）のメンバーである。アルテリウイルスは、マクロファージ向性ならびに重症疾患及び持続感染の両方を引き起こす能力を含め、重要な病因特性を共有する。従って、アルテリウイルス、及び詳細にはマウス乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、サル出血熱ウイルス及びウマ動脈炎ウイルスが、例えば、ブタＣＤ１６３または他の種、ならびにマウス、サル及びウマモデルにおけるそのホモログを介して標的化されてもよく、ノックアウトもまた提供される。
実際、この手法は、インフルエンザＣ型ならびにＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ１、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、及びＨ２Ｎ３として知られるインフルエンザＡ型のサブタイプを含むブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）株など、ヒトに伝染し得る他の家畜疾患ならびに上述の肺炎、髄膜炎及び浮腫を引き起こすウイルスまたは細菌にまで拡張し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される系を使用して、ブタゲノムを遺伝的に改変して、１つ以上のブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子座を不活性化させて、ブタからヒトへの異種移植の臨床適用をし易くすることができる。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０（６２６４）：１１０１－１１０４（２０１５）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される系を使用して、任意の活性なブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子座を含まない遺伝子改変ブタを産生することができる。
系による治療的ターゲティング
明らかな通り、本系を用いていかなる目的のポリヌクレオチド配列も標的化し得ることが想定される。本発明は、標的細胞をインビボ、エキソビボまたはインビトロで改変するために用いられる、天然に存在しないもしくはエンジニアリングされた組成物、または前記組成物の成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、または前記組成物の成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターもしくは送達系を提供し、改変後はＣＲＩＳＰＲにより改変された細胞の子孫または細胞株が変化した表現型を保持するように細胞を変化させる形で行われ得る。改変された細胞及び子孫は、ＣＲＩＳＰＲ系が所望の細胞型にエキソビボまたはインビボ適用された植物または動物などの多細胞生物の一部であり得る。本ＣＲＩＳＰＲ発明は、療法的治療方法であり得る。療法的治療方法には、遺伝子またはゲノム編集、または遺伝子療法が含まれ得る。
養子細胞治療
本発明はまた、養子療法向けに細胞を改変するための、本明細書に記載される系の使用も企図する。本発明の態様は、従って、特定の抗原、例えば、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞などの免疫系細胞の養子移入を含む（Ｍａｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３２：１８９－２２５；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ，２０１５，Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｓ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．３４８ ｎｏ．６２３０ ｐｐ．６２－６８；Ｒｅｓｔｉｆｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ：ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（４）：２６９－２８１；及びＪｅｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｉｄｄｅｌｌ，２０１４，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２５７（１）：１２７－１４４を参照されたい）。様々な戦略を例えば、用いて、例えば、選択されたペプチド特異性を有する新規ＴＣＲ α及びβ鎖の導入によってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の特異性を変化させることにより、Ｔ細胞を遺伝的に改変し得る（米国特許第８，６９７，８５４号；ＰＣＴ特許公開：ＷＯ２００３０２０７６３、ＷＯ２００４０３３６８５、ＷＯ２００４０４４００４、ＷＯ２００５１１４２１５、ＷＯ２００６０００８３０、ＷＯ２００８０３８００２、ＷＯ２００８０３９８１８、ＷＯ２００４０７４３２２、ＷＯ２００５１１３５９５、ＷＯ２００６１２５９６２、ＷＯ２０１３１６６３２１、ＷＯ２０１３０３９８８９、ＷＯ２０１４０１８８６３、ＷＯ２０１４０８３１７３；米国特許第８，０８８，３７９号を参照されたい）。
ＴＣＲ改変に代えて、またはそれに加えて、悪性細胞などの選択の標的に特異的なＴ細胞などの免疫応答性細胞の作成にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を使用してもよく、多種多様な受容体キメラ構築物が記載されている（米国特許第５，８４３，７２８号；同第５，８５１，８２８号；同第５，９１２，１７０号；同第６，００４，８１１号；同第６，２８４，２４０号；同第６，３９２，０１３号；同第６，４１０，０１４号；同第６，７５３，１６２号；同第８，２１１，４２２号；及びＰＣＴ公開ＷＯ９２１５３２２を参照されたい）。代替的なＣＡＲ構築物は、継続的世代に属するものとして特徴付けることができる。初代のＣＡＲは、典型的には、ある抗原に特異的な抗体の一本鎖可変断片からなり、例えば、ＣＤ３ζまたはＦｃＲγのいずれかの膜貫通及び細胞内シグナル伝達ドメインに可動性リンカー、例えば、ＣＤ８αヒンジドメイン及びＣＤ８α膜貫通ドメインによって連結された、特異抗体のＶＨに連結されたＶＬを含む（ｓｃＦｖ－ＣＤ３ζまたはｓｃＦｖ－ＦｃＲγ；米国特許第７，７４１，４６５号；米国特許第５，９１２，１７２号；米国特許第５，９０６，９３６号を参照されたい）。２代目のＣＡＲは、エンドドメイン内にＣＤ２８、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、または４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）などの１つ以上の副刺激分子の細胞内ドメインを取り込む（例えば、ｓｃＦｖ－ＣＤ２８／ＯＸ４０／４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ；米国特許第８，９１１，９９３号；同第８，９１６，３８１号；同第８，９７５，０７１号；同第９，１０１，５８４号；同第９，１０２，７６０号；同第９，１０２，７６１号を参照されたい）。３代目のＣＡＲは、ＣＤ３ζ－鎖、ＣＤ９７、ＧＤＩ ｌａ－ＣＤ１８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１５４、ＣＤＳ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、またはＣＤ２８シグナル伝達ドメインなど、共刺激エンドドメインの組み合わせを含む（例えば、ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζまたはｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ；米国特許第８，９０６，６８２号；米国特許第８，３９９，６４５号；米国特許第５，６８６，２８１号；ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４１３４１６５；ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２０７９０００を参照されたい）。あるいは、例えば、共刺激が付随する、プロフェッショナル抗原提示細胞上の抗原によるその天然αβＴＣＲの会合後に活性化され拡大されるように選択された抗原特異的Ｔ細胞においてＣＡＲを発現させることにより共刺激が画策されてもよい。加えて、免疫応答性細胞上にさらなるエンジニアリングされた受容体が提供されてもよく、例えば、それによりＴ細胞攻撃の標的化が向上し、及び／または副作用が最小限に抑えられる。
プロトプラスト融合、リポフェクション、トランスフェクションまたは電気穿孔など、代替的な技術を用いて標的免疫応答性細胞を形質転換してもよい。レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、プラスミドまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンなどのトランスポゾンなど、多種多様なベクターを使用することができ（米国特許第６，４８９，４５８号；同第７，１４８，２０３号；同第７，１６０，６８２号；同第７，９８５，７３９号；同第８，２２７，４３２号を参照されたい）、それを用いて、例えば、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８またはＣＤ１３７のいずれかを通じてシグナル伝達する２代目の抗原特異的ＣＡＲを使用してＣＡＲを導入し得る。ウイルスベクターとしては、例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶまたはＢＰＶベースのベクターを挙げることができる。
形質転換のために標的化される細胞としては、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）またはそこからリンパ系細胞が分化し得る多能性幹細胞を挙げることができる。所望のＣＡＲを発現するＴ細胞は、例えば、γ線を照射した活性化及び増殖細胞（ＡａＰＣ）（がん抗原及び共刺激分子を共発現する）との共培養によって選択されてもよい。エンジニアリングされたＣＡＲ Ｔ細胞は、例えば、ＩＬ－２及びＩＬ－２１などの可溶性因子の存在下でＡａＰＣ上で共培養することによって拡大してもよい。この拡大は、例えば、記憶ＣＡＲ＋Ｔ細胞を提供するように実施されてもよい（これは例えば、非酵素的デジタルアレイ及び／またはマルチパネルフローサイトメトリーによってアッセイされてもよい）。このようにして、抗原担持腫瘍に特異的な細胞傷害活性を有するＣＡＲ Ｔ細胞が（任意選択でインターフェロン－γなどの所望のケモカインの産生と併せて）提供され得る。この種のＣＡＲ Ｔ細胞は、例えば、腫瘍異種移植片の治療のため、例えば、動物モデルに用いられ得る。
前述のような手法は、例えば、選択の抗原に結合する抗原認識受容体を含む免疫応答性細胞の有効量を投与することによる、新生物などの疾患を治療する及び／またはそれを有する対象の生存を増加させる方法を提供するために適合させることができ、ここでは結合により免疫応答性細胞が活性化し、それにより疾患（新生物、病原体感染、自己免疫障害、または同種移植反応など）を治療または予防する。ＣＡＲ Ｔ細胞治療薬の用量決定には、例えば、シクロホスファミドによる、リンパ球枯渇の過程を伴うまたは伴わない、例えば、１０６～１０９細胞／ｋｇの投与が関わり得る。
一実施形態では、本治療は、免疫抑制治療を受けている患者に投与することができる。細胞または細胞集団は、かかる免疫抑制剤に対する受容体をコードする遺伝子の不活性化に起因して、少なくとも１つの免疫抑制剤に対して抵抗性になり得る。理論によって拘束されないが、免疫抑制治療は患者体内での本発明に係る免疫応答性細胞またはＴ細胞の選択及び拡大の助けとなるはずである。
本発明に係る細胞または細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸液、植え込みまたは移植によることを含め、任意の好都合な方法で行われ得る。本細胞または細胞集団は患者に皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋内、静脈内もしくはリンパ内注射、または腹腔内投与されてもよい。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。
細胞または細胞集団の投与は、体重１ｋｇ当たり１０４～１０９細胞、好ましくは１０５～１０６細胞／ｋｇ体重（これらの範囲内にある全ての整数値の細胞数を含む）の投与からなり得る。ＣＡＲ Ｔ細胞治療における用量決定には、例えば、例えば、シクロホスファミドによるリンパ球枯渇の過程を伴うまたは伴わない、１０６～１０９細胞／ｋｇの投与が関わり得る。本細胞または細胞集団は１つ以上の用量で投与することができる。別の実施形態では、細胞の有効量は単一用量として投与される。別の実施形態では、細胞の有効量は、ある期間にわたる２つ以上の用量として投与される。投与のタイミングは管理する医師の判断の範囲内であり、患者の臨床状態に依存する。本細胞または細胞集団は、血液バンクまたはドナーなど、任意の供給源から入手し得る。個々の必要性は様々であるが、特定の疾患または病態に対する所与の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当該分野の技術の範囲内である。有効量とは、治療的または予防的有益性をもたらす量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康及び体重、ある場合には併用治療の種類、治療頻度及び所望の効果の性質に依存し得る。
別の実施形態では、細胞またはそれらの細胞を含む組成物の有効量は非経口投与される。投与は静脈内投与であってもよい。投与は腫瘍内への注射によって直接行われてもよい。
可能性のある有害反応を防ぐため、エンジニアリングされた免疫応答性細胞が、細胞を特定のシグナルへの曝露に対して脆弱にするトランス遺伝子の形態のトランスジェニック安全スイッチを備えてもよい。例えば、幹細胞移植後のドナーリンパ球注入として用いられる同種Ｔリンパ球に例えば、導入することにより、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をこのように使用し得る（Ｇｒｅｃｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＴＫ－ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ．Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５；６：９５）。かかる細胞では、ガンシクロビルまたはアシクロビルなどのヌクレオシドプロドラッグを投与すると細胞死が起こる。代替的な安全スイッチ構築物には、例えば、２つの非機能性のｉｃａｓｐ９分子を一緒にして活性酵素を形成する小分子二量化剤の投与によって惹起される誘導性カスパーゼ９が含まれる。細胞増殖の制御を実現する多種多様な代替的な手法が記載されている（米国特許出願公開第２０１３００７１４１４号；ＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１１１４６８６２；ＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１４０１１９８７；ＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１３０４０３７１；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．ＢＬＯＯＤ，２０１４，１２３／２５：３８９５－３９０５；Ｄｉ Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１；３６５：１６７３－１６８３；Ｓａｄｅｌａｉｎ Ｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１；３６５：１７３５－１７３；Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２８（６）：１１０７－１５（２０１０）を参照されたい）。
養子療法のさらなる改良では、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系によるゲノム編集を用いて免疫応答性細胞を代替的な実現方法、例えば、編集されたＣＡＲ Ｔ細胞を提供することに合わせて調整し得る（Ｐｏｉｒｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ“ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ”ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７５（１８）：３８５３を参照されたい）。例えば、免疫応答性細胞を編集して、ＨＬＡ ＩＩ型及び／またはＩ型分子クラスの一部または全ての発現を欠失させ、あるいはＰＤ１遺伝子など、所望の免疫応答を阻害し得る選択の遺伝子をノックアウトしてもよい。
細胞は、本明細書に記載される通りの系を用いて編集し得る。系は、本明細書に記載される任意の方法によって免疫細胞に送達し得る。好ましい実施形態では、細胞はエキソビボで編集され、それを必要としている対象に移される。免疫応答性細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞または養子細胞移入に用いられる任意の細胞を編集し得る。編集は、潜在的なアロ反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を消失させ、化学療法剤の標的を破壊し、免疫チェックポイントを遮断し、Ｔ細胞を活性化させ、及び／または機能的に枯渇したもしくは機能不全のＣＤ８＋Ｔ細胞の分化及び／または増殖を増加させるために実施されてもよい（ＰＣＴ特許公開：ＷＯ２０１３１７６９１５、ＷＯ２０１４０５９１７３、ＷＯ２０１４１７２６０６、ＷＯ２０１４１８４７４４、及びＷＯ２０１４１９１１２８を参照されたい）。編集によって遺伝子の不活性化がもたらされ得る。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、抗原の提示に応答したＴ細胞の活性化に関与する細胞表面受容体である。ＴＣＲは、概して２つの鎖、α及びβで構成され、これらは、アセンブルしてヘテロ二量体を形成し、及びＣＤ３形質導入サブユニットと会合して細胞表面上に存在するＴ細胞受容体複合体を形成する。ＴＣＲの各α及びβ鎖は、免疫グロブリン様Ｎ末端可変（Ｖ）及び定常（Ｃ）領域、疎水性膜貫通ドメイン、ならびに短い細胞質領域からなる。免疫グロブリン分子に関しては、α及びβ鎖の可変領域はＶ（Ｄ）Ｊ組換えによって生じ、Ｔ細胞集団内に抗原特異性の大きい多様性を生み出す。しかしながら、インタクトな抗原を認識する免疫グロブリンと対照的に、Ｔ細胞はＭＨＣ分子と会合したプロセシング済みのペプチド断片によって活性化され、Ｔ細胞による抗原認識に、ＭＨＣ制約として知られる余分な側面を導入する。Ｔ細胞受容体を介してドナーとレシピエントとの間のＭＨＣの差異が認識されることにより、Ｔ細胞増殖及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の潜在的な発症につながる。ＴＣＲαまたはＴＣＲβを不活性化すると、Ｔ細胞の表面からＴＣＲが除去されることになり、それにより同種抗原の認識、ひいてはＧＶＨＤが防止される。しかしながら、ＴＣＲの破壊は概してＣＤ３シグナル伝達成分の除去をもたらし、さらなるＴ細胞拡大の手段を変化させる。
同種異系細胞は宿主免疫系によって速やかに拒絶される。非照射血液製剤に存在する同種異系白血球は５～６日以下にわたり持続することが実証されている（Ｂｏｎｉ，Ｍｕｒａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｂｌｏｏｄ １；１１２（１２）：４７４６－５４）。従って、同種異系細胞の拒絶を防ぐには、通常は宿主の免疫系がある程度抑制されなければならない。しかしながら、養子細胞移入の場合、免疫抑制薬の使用もまた導入された治療用Ｔ細胞に有害作用を有する。従って、これらの条件下で養子免疫療法手法を有効に使用するためには、導入された細胞が免疫抑制治療に抵抗性であることが必要となり得る。従って、特定の実施形態では、本発明は、好ましくは免疫抑制剤の標的を編集する少なくとも１つの遺伝子を不活性化することにより、Ｔ細胞が免疫抑制剤に抵抗性となるようにＴ細胞を改変するステップをさらに含む。免疫抑制剤は、いくつかの作用機構のうちの１つによって免疫機能を抑える薬剤である。免疫抑制剤は、限定はされないが、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシン標的、インターロイキン２受容体α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤、コルチコステロイドまたは免疫抑制代謝拮抗薬であり得る。本発明は、Ｔ細胞内の免疫抑制剤の標的を不活性化させることにより、免疫療法用のＴ細胞に免疫抑制抵抗性を付与することを可能にする。非限定的な例として、免疫抑制剤の標的は、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバー及びシクロフィリンファミリー遺伝子メンバーなど、免疫抑制剤の受容体であり得る。
免疫チェックポイントは、免疫反応を減速させまたは停止させ、制御されない免疫細胞活性からの過度の組織損傷を防ぐ阻害経路である。特定の実施形態では、標的となる免疫チェックポイントはプログラム死－１（ＰＤ－１またはＣＤ２７９）遺伝子（ＰＤＣＤ１）である。他の実施形態では、標的となる免疫チェックポイントは細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ－４）である。さらなる実施形態では、標的となる免疫チェックポイントは、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤＬ１またはＫＩＲなど、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ４ Ｉｇスーパーファミリーの別のメンバーである。さらなる別の実施形態では、標的となる免疫チェックポイントはＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７またはＴＩＭ－３など、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである。
さらなる免疫チェックポイントとしては、Ｓｒｃ相同性２ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ１（ＳＨＰ－１）が挙げられる（Ｗａｔｓｏｎ ＨＡ，ｅｔ ａｌ．，ＳＨＰ－１：ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ？ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．２０１６ Ａｐｒ １５；４４（２）：３５６－６２）。ＳＨＰ－１は、広く発現する阻害性タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）である。Ｔ細胞では、それは抗原依存性活性化及び増殖の負の調節因子である。それは細胞質タンパク質であり、従って、抗体媒介療法には適しないが、活性化及び増殖におけるその役割により、ＳＨＰ－１は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞など、養子移入戦略における遺伝子操作の魅力的な標的となる。免疫チェックポイントはまた、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ／Ｖｓｔｍ３／ＷＵＣＡＭ／ＶＳＩＧ９）ならびにＶＩＳＴＡを含むＴ細胞免疫受容体も含み得る（Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｂｅｙｏｎｄ ＣＴＬＡ－４ ａｎｄ ＰＤ－１，ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｚ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：４１８）。
ＷＯ２０１４１７２６０６は、枯渇ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び／または活性を増加させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇を減少させる（例えば、機能的に枯渇したまたは非応答性のＣＤ８＋免疫細胞を減少させる）ためのＭＴ１及び／またはＭＴ１阻害剤の使用に関する。特定の実施形態では、養子移入されたＴ細胞における遺伝子編集によってメタロチオネインが標的化される。
特定の実施形態では、遺伝子編集の標的は、免疫チェックポイントタンパク質の発現に関与する少なくとも１つの標的遺伝子座であり得る。かかる標的としては、限定はされないが、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＰＤＬ１、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＶＩＳＴＡ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＭＴ１、ＭＴ２、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＳＨＰ－１またはＴＩＭ－３を挙げることができる。好ましい実施形態では、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４遺伝子の発現に関与する遺伝子座が標的化される。他の好ましい実施形態では、限定はされないがＰＤ－１及びＴＩＧＩＴなど、遺伝子の組み合わせが標的化される。
他の実施形態では、少なくとも２つの遺伝子が編集される。遺伝子のペアとしては、限定はされないが、ＰＤ１及びＴＣＲα、ＰＤ１及びＴＣＲβ、ＣＴＬＡ－４及びＴＣＲα、ＣＴＬＡ－４及びＴＣＲβ、ＬＡＧ３及びＴＣＲα、ＬＡＧ３及びＴＣＲβ、Ｔｉｍ３及びＴＣＲα、Ｔｉｍ３及びＴＣＲβ、ＢＴＬＡ及びＴＣＲα、ＢＴＬＡ及びＴＣＲβ、ＢＹ５５及びＴＣＲα、ＢＹ５５及びＴＣＲβ、ＴＩＧＩＴ及びＴＣＲα、ＴＩＧＩＴ及びＴＣＲβ、Ｂ７Ｈ５及びＴＣＲα、Ｂ７Ｈ５及びＴＣＲβ、ＬＡＩＲ１及びＴＣＲα、ＬＡＩＲ１及びＴＣＲβ、ＳＩＧＬＥＣ１０及びＴＣＲα、ＳＩＧＬＥＣ１０及びＴＣＲβ、２Ｂ４及びＴＣＲα、２Ｂ４及びＴＣＲβを挙げることができる。
Ｔ細胞の遺伝子改変の前か、それともその後かに関わらず、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号；及び同第７，５７２，６３１号に記載される通りの方法を概して用いて活性化し、及び拡大することができる。Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボで拡大することができる。
本発明の実施では、当該分野の技術の範囲内にある免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス及び組換えＤＮＡの従来技術を利用する。ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ）；ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８７）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（１９９５）（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．）；ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（１９８８）（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．）；ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）（Ｅ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｄ．）；及びＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（１９８７）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．）を参照されたい。
疾患関連の突然変異及び病原性ＳＮＰの補正
一態様では、本明細書に記載される本発明は、Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ点突然変異または病原性一塩基多型（ＳＮＰ）によって引き起こされるまたは引き起こされる可能性が高い病的状態を治療及び／または予防することを目的として、標的遺伝子座でアデノシン残基を改変する方法を提供する。
脳及び中枢神経系に影響を及ぼす疾患
脳及び中枢神経系に影響を及ぼす様々な疾患に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告され、表Ａに開示されており、アルツハイマー病、パーキンソン病、自閉症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、統合失調症、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ・グティエール症候群、ファブリー病、レッシュ・ナイハン症候群、及びメンケス症候群が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明の態様は、以下に記載するこれらの疾患のいずれかに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する方法に関する。
アルツハイマー病
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、アルツハイマー病に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、及びＡＰＰから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿００００２１．３（ＰＳＥＮ１）：ｃ．７９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２６６Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００４８４．３（ＡＰＰ）：ｃ．２０１７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ６７３Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００４８４．３（ＡＰＰ）：ｃ．２１４９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ７１７Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０００４８４．３（ＡＰＰ）：ｃ．２１３７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ７１３Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００４８４．３（ＡＰＰ）：ｃ．２１４３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ７１５Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００４８４．３（ＡＰＰ）：ｃ．２１４１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ７１４Ｉｌｅ）
ＮＭ＿００００２１．３（ＰＳＥＮ１）：ｃ．４３８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｍｅｔ１４６Ｉｌｅ）
ＮＭ＿００００２１．３（ＰＳＥＮ１）：ｃ．１２２９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ４１０Ｔｙｒ）
ＮＭ＿００００２１．３（ＰＳＥＮ１）：ｃ．４８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｈｉｓ１６３Ｔｙｒ）
ＮＭ＿００００２１．３（ＰＳＥＮ１）：ｃ．７９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ２６７Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００００２１．３（ＰＳＥＮ１）：ｃ．２３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ７９Ｖａｌ）
ＮＭ＿００００２１．３（ＰＳＥＮ１）：ｃ．５０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ１７０Ｐｈｅ）
ＮＭ＿０００４４７．２（ＰＳＥＮ２）：ｃ．１２８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ４３０Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００４４７．２（ＰＳＥＮ２）：ｃ．７１７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｍｅｔ２３９Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０００４４７．２（ＰＳＥＮ２）：ｃ．２５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ８５Ｖａｌ）
ＮＭ＿００００２１．３（ＰＳＥＮ１）：ｃ．８０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２６９Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００４８４．３（ＡＰＰ）：ｃ．２０１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ６７３Ｖａｌ）。
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、及びＡＰＰから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、アルツハイマー病を治療または予防する方法に関する。
パーキンソン病
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、パーキンソン病に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＳＮＣＡ、ＰＬＡ２Ｇ６、ＦＢＸＯ７、ＶＰＳ３５、ＥＩＦ４Ｇ１、ＤＮＡＪＣ６、ＰＲＫＮ、ＳＹＮＪ１、ＣＨＣＨＤ２、ＰＩＮＫ１、ＰＡＲＫ７、ＬＲＲＫ２、ＡＴＰ１３Ａ２、及びＧＢＡから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００３４５．３（ＳＮＣＡ）：ｃ．１５７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ５３Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００３４５．３（ＳＮＣＡ）：ｃ．１５２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ５１Ａｓｐ）
ＮＭ＿００３５６０．３（ＰＬＡ２Ｇ６）：ｃ．２２２２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ７４１Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００３５６０．３（ＰＬＡ２Ｇ６）：ｃ．２２３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７４７Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００３５６０．３（ＰＬＡ２Ｇ６）：ｃ．１９０４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ６３５Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００３５６０．３（ＰＬＡ２Ｇ６）：ｃ．１３５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４５２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１２１７９．３（ＦＢＸＯ７）：ｃ．１４９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１２１７９．３（ＦＢＸＯ７）：ｃ．６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ２２Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０１８２０６．５（ＶＰＳ３５）：ｃ．１８５８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ６２０Ａｓｎ）
ＮＭ＿１９８２４１．２（ＥＩＦ４Ｇ１）：ｃ．３６１４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１２０５Ｈｉｓ）
ＮＭ＿１９８２４１．２（ＥＩＦ４Ｇ１）：ｃ．１５０５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ５０２Ｖａｌ）
ＮＭ＿００１２５６８６５．１（ＤＮＡＪＣ６）：ｃ．２２００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１２５６８６５．１（ＤＮＡＪＣ６）：ｃ．２３２６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７７６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４５６２．２（ＰＲＫＮ）：ｃ．９３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４５６２．２（ＰＲＫＮ）：ｃ．１３５８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４５６２．２（ＰＲＫＮ）：ｃ．６３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ２１２Ｔｙｒ）
ＮＭ＿２０３４４６．２（ＳＹＮＪ１）：ｃ．７７３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２５８Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００１３２０３２７．１（ＣＨＣＨＤ２）：ｃ．１８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ６１Ｉｌｅ）
ＮＭ＿００１３２０３２７．１（ＣＨＣＨＤ２）：ｃ．４３４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１４５Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００１３２０３２７．１（ＣＨＣＨＤ２）：ｃ．３００＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０３２４０９．２（ＰＩＮＫ１）：ｃ．９２６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ３０９Ａｓｐ）
ＮＭ＿０３２４０９．２（ＰＩＮＫ１）：ｃ．１３１１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３２４０９．２（ＰＩＮＫ１）：ｃ．７３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２４６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３２４０９．２（ＰＩＮＫ１）：ｃ．８３６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２７９Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０３２４０９．２（ＰＩＮＫ１）：ｃ．９３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ３１３Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０３２４０９．２（ＰＩＮＫ１）：ｃ．１３６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２６２．４（ＰＡＲＫ７）：ｃ．７８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｍｅｔ２６Ｉｌｅ）
ＮＭ＿１９８５７８．３（ＬＲＲＫ２）：ｃ．４３２１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４４１Ｃｙｓ）
ＮＭ＿１９８５７８．３（ＬＲＲＫ２）：ｃ．４３２２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１４４１Ｈｉｓ）
ＮＭ＿１９８５７８．３（ＬＲＲＫ２）：ｃ．１２５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ４１９Ｖａｌ）
ＮＭ＿１９８５７８．３（ＬＲＲＫ２）：ｃ．６０５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２０１９Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０２２０８９．３（ＡＴＰ１３Ａ２）：ｃ．１３０６＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０２２０８９．３（ＡＴＰ１３Ａ２）：ｃ．２６２９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ８７７Ａｒｇ）
ＮＭ＿０２２０８９．３（ＡＴＰ１３Ａ２）：ｃ．４９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６４Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００１００５７４１．２（ＧＢＡ）：ｃ．１４４４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ４８２Ａｓｎ）
ｍ．１５９５０Ｇ＞Ａ．
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＳＮＣＡ、ＰＬＡ２Ｇ６、ＦＢＸＯ７、ＶＰＳ３５、ＥＩＦ４Ｇ１、ＤＮＡＪＣ６、ＰＲＫＮ、ＳＹＮＪ１、ＣＨＣＨＤ２、ＰＩＮＫ１、ＰＡＲＫ７、ＬＲＲＫ２、ＡＴＰ１３Ａ２、及びＧＢＡから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、パーキンソン病を治療または予防する方法に関する。
自閉症
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、自閉症に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＭＥＣＰ２、ＮＬＧＮ３、ＳＬＣ９Ａ９、ＥＨＭＴ１、ＣＨＤ８、ＮＬＧＮ４Ｘ、ＧＳＰＴ２、及びＰＴＥＮから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿００１１１０７９２．１（ＭＥＣＰ２）：ｃ．９１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３０６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４９９２．３（ＭＥＣＰ２）：ｃ．４７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１５８Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０１８９７７．３（ＮＬＧＮ３）：ｃ．１３５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４５１Ｃｙｓ）
ＮＭ＿１７３６５３．３（ＳＬＣ９Ａ９）：ｃ．１２６７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４２３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２４７５７．４（ＥＨＭＴ１）：ｃ．３４１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１１３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２０９２０．３（ＣＨＤ８）：ｃ．２８７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９５９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２０９２０．３（ＣＨＤ８）：ｃ．３１７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１８１３３２．２（ＮＬＧＮ４Ｘ）：ｃ．３０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１８０９４．４（ＧＳＰＴ２）：ｃ．１０２１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ３４１Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０００３１４．６（ＰＴＥＮ）：ｃ．３９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１３１Ｉｌｅ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＭＥＣＰ２、ＮＬＧＮ３、ＳＬＣ９Ａ９、ＥＨＭＴ１、ＣＨＤ８、ＮＬＧＮ４Ｘ、ＧＳＰＴ２、及びＰＴＥＮから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、自閉症を治療または予防する方法に関する。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、ＡＬＳに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＳＯＤ１、ＶＣＰ、ＵＢＱＬＮ２、ＥＲＢＢ４、ＨＮＲＮＰＡ１、ＴＵＢＡ４Ａ、ＳＯＤ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＩＧ４、ＯＰＴＮ、ＳＥＴＸ、ＳＰＧ１１、ＦＵＳ、ＶＡＰＢ、ＡＮＧ、ＣＨＣＨＤ１０、ＳＱＳＴＭ１、及びＴＢＫ１から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．２８９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ９７Ａｓｎ）
ＮＭ＿００７１２６．３（ＶＣＰ）：ｃ．１７７４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ５９２Ａｓｎ）
ＮＭ＿００７１２６．３（ＶＣＰ）：ｃ．４６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１５５Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００７１２６．３（ＶＣＰ）：ｃ．５７２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１９１Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０１３４４４．３（ＵＢＱＬＮ２）：ｃ．１４８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ４９７Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０１３４４４．３（ＵＢＱＬＮ２）：ｃ．１５２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ５０９Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０１３４４４．３（ＵＢＱＬＮ２）：ｃ．１５７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ５２５Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０１３４４４．３（ＵＢＱＬＮ２）：ｃ．１４９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ４９７Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００５２３５．２（ＥＲＢＢ４）：ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ９２７Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００５２３５．２（ＥＲＢＢ４）：ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１２７５Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０３１１５７．３（ＨＮＲＮＰＡ１）：ｃ．９４０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ３１４Ａｓｎ）
ＮＭ＿００６０００．２（ＴＵＢＡ４Ａ）：ｃ．６４３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２１５Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００６０００．２（ＴＵＢＡ４Ａ）：ｃ．９５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３２０Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００６０００．２（ＴＵＢＡ４Ａ）：ｃ．９５９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３２０Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００６０００．２（ＴＵＢＡ４Ａ）：ｃ．１２２０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００６０００．２（ＴＵＢＡ４Ａ）：ｃ．１１４７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ３８３Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．１１２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ３８Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．１２４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ４２Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．１２５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ４２Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．１４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ５Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ５Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．４３６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ１４６Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ２２Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．４０４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｓｅｒ１３５Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．４９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１７Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．２１７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ７３Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００７３７５．３（ＴＡＲＤＢＰ）：ｃ．８９２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２９８Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００７３７５．３（ＴＡＲＤＢＰ）：ｃ．９４３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ３１５Ｔｈｒ）
ＮＭ＿００７３７５．３（ＴＡＲＤＢＰ）：ｃ．８８３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２９５Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００７３７５．３（ＴＡＲＤＢＰ）：ｃ．＊６９７Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７３７５．３（ＴＡＲＤＢＰ）：ｃ．１１４４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ３８２Ｔｈｒ）
ＮＭ＿００７３７５．３（ＴＡＲＤＢＰ）：ｃ．８５９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２８７Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０１４８４５．５（ＦＩＧ４）：ｃ．５４７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１８３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１００８２１１．１（ＯＰＴＮ）：ｃ．１１９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１５０４６．５（ＳＥＴＸ）：ｃ．６４０７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２１３６Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０１５０４６．５（ＳＥＴＸ）：ｃ．８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ３Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０２５１３７．３（ＳＰＧ１１）：ｃ．１１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２５１３７．３（ＳＰＧ１１）：ｃ．２６７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２５１３７．３（ＳＰＧ１１）：ｃ．５９７４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１９９２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４９６０．３（ＦＵＳ）：ｃ．１５５３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ５１８Ｌｙｓ）
ＮＭ＿００４９６０．３（ＦＵＳ）：ｃ．１５６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５２１Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００４９６０．３（ＦＵＳ）：ｃ．１５６２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ５２１Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００４９６０．３（ＦＵＳ）：ｃ．１５２０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ５０７Ａｓｐ）
ＮＭ＿００４９６０．３（ＦＵＳ）：ｃ．１４８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４９６０．３（ＦＵＳ）：ｃ．６１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２０６Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００４９６０．３（ＦＵＳ）：ｃ．６４６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２１６Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００４７３８．４（ＶＡＰＢ）：ｃ．１６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ５６Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００４７３８．４（ＶＡＰＢ）：ｃ．１３７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ４６Ｉｌｅ）
ＮＭ＿００１１４５．４（ＡＮＧ）：ｃ．１６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ５５Ｌｙｓ）
ＮＭ＿００１１４５．４（ＡＮＧ）：ｃ．１５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｓｅｒ５２Ａｓｎ）
ＮＭ＿００１１４５．４（ＡＮＧ）：ｃ．４０７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ１３６Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００１１４５．４（ＡＮＧ）：ｃ．４０９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ１３７Ｉｌｅ）
ＮＭ＿００１３０１３３９．１（ＣＨＣＨＤ１０）：ｃ．２３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ８０Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００１３０１３３９．１（ＣＨＣＨＤ１０）：ｃ．１７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ５９Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００１１４２２９８．１（ＳＱＳＴＭ１）：ｃ．－４７－１９２４Ｃ＞Ｔ
ＮＭ＿００３９００．４（ＳＱＳＴＭ１）：ｃ．１１６０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ３８７Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００３９００．４（ＳＱＳＴＭ１）：ｃ．１１７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ３９２Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０１３２５４．３（ＴＢＫ１）：ｃ．１３４０＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１３２５４．３（ＴＢＫ１）：ｃ．２０８６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ６９６Ｌｙｓ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＳＯＤ１、ＶＣＰ、ＵＢＱＬＮ２、ＥＲＢＢ４、ＨＮＲＮＰＡ１、ＴＵＢＡ４Ａ、ＳＯＤ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＩＧ４、ＯＰＴＮ、ＳＥＴＸ、ＳＰＧ１１、ＦＵＳ、ＶＡＰＢ、ＡＮＧ、ＣＨＣＨＤ１０、ＳＱＳＴＭ１、及びＴＢＫ１から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、ＡＬＳを治療または予防する方法に関する。
統合失調症
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、統合失調症に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＰＲＯＤＨ、ＳＥＴＤ１Ａ、及びＳＨＡＮＫ３から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０１６３３５．４（ＰＲＯＤＨ）：ｃ．１２９２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ４３１Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０１６３３５．４（ＰＲＯＤＨ）：ｃ．１３９７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ４６６Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０１４７１２．２（ＳＥＴＤ１Ａ）：ｃ．２２０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３３５１７．１（ＳＨＡＮＫ３）：ｃ．３３４９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１１７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３３５１７．１（ＳＨＡＮＫ３）：ｃ．１６０６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５３６Ｔｒｐ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＰＲＯＤＨ、ＳＥＴＤ１Ａ、及びＳＨＡＮＫ３から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、統合失調症を治療または予防する方法に関する。
副腎白質ジストロフィー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、副腎白質ジストロフィーに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＡＢＣＤ１遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．４２１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ１４１Ｔｈｒ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．７９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２６６Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１２５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４１８Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１５５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５１８Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１８５０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ６１７Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１３９６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４６６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１５５３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ５１８Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１６７９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ５６０Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１７７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５９１Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１８０２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ６０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．３４６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１１６Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．４０６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１６６１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ５５４Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１８２５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ６０９Ｌｙｓ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１２８８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４３０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１７８１－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．５２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１８６６－１０Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、少なくともＡＢＣＤ１遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、副腎白質ジストロフィーを治療または予防する方法に関する。
アイカルディ・グティエール症候群
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、アイカルディ・グティエール症候群に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＴＲＥＸ１、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、ＡＤＡＲ、及びＩＦＩＨ１から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０１６３８１．５（ＴＲＥＸ１）：ｃ．７９４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３３６２９．４（ＴＲＥＸ１）：ｃ．５２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ１８Ａｓｎ）
ＮＭ＿０３３６２９．４（ＴＲＥＸ１）：ｃ．４９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３２１９３．３（ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ）：ｃ．２０５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６９Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００１１１１．４（ＡＤＡＲ）：ｃ．３０１９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１００７Ａｒｇ）
ＮＭ＿０２２１６８．３（ＩＦＩＨ１）：ｃ．２３３６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ７７９Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０２２１６８．３（ＩＦＩＨ１）：ｃ．２３３５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７７９Ｃｙｓ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＴＲＥＸ１、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、ＡＤＡＲ、及びＩＦＩＨ１から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、アイカルディ・グティエール症候群を治療または予防する方法に関する。
ファブリー病
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、ファブリー病に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＧＬＡ遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．１０２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．１０６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３５６Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．１０２５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３４２Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．２８１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ９４Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．６７７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．７３４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．７４８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２５０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．６５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２２０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．７３０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ２４４Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．３６９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．３３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１１２Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．４８５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．６６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．９１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．１０７２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ３５８Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．１０８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３６３Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．１０８８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３６３Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．６０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ２０２Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．８３０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．９７９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３２７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．４２２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１４１Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．２８５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．７３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．６３９＋９１９Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．６８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２２７Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．６７９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２２７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．２４２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ８１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．９０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．９７４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ３２５Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．８４７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．４６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．１１１８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ３７３Ａｓｐ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、少なくともＧＬＡ遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、ファブリー病を治療または予防する方法に関する。
レッシュ・ナイハン症候群
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、レッシュ・ナイハン症候群に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＨＰＲＴ１遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００１９４．２（ＨＰＲＴ１）：ｃ．１５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１９４．２（ＨＰＲＴ１）：ｃ．３８４＋１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、少なくともＨＰＲＴ１遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、レッシュ・ナイハン症候群を治療または予防する方法に関する。
メンケス症候群
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、メンケス症候群に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＡＴＰ７Ａ遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．６０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．２９３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．３０５６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１０１９Ａｓｐ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．５９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２００Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．１２２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４０９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．１５４４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．１６３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．１９３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．１９４６＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．１９５０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ６５０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．２１７９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ７２７Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．２１８７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．２３８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．２４９９－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．２５５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ８５２Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．２９５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．３１１２－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．３４６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．３５０２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１６８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．３７６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１２５５Ｇｌｕ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．３９４３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１３１５Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．４１２３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．４２２６＋５Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、少なくともＡＴＰ７Ａ遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、メンケス症候群を治療または予防する方法に関する。
眼疾患
様々な眼疾患に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告され、表Ａに開示されており、シュタルガルト病、バルデー・ビードル症候群、桿体錐体ジストロフィー、先天性停止性夜盲、アッシャー症候群、レーバー先天黒内障、網膜色素変性症、及び色覚異常が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明の態様は、以下に記載するこれらの疾患のいずれかに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する方法に関する。
シュタルガルト病
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、シュタルガルト病に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＡＢＣＡ４遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４４２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６６４７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ２２１６Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．５３１２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．５１８９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１７３０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４３５２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４２５３＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．３８７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．３８１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ１２７１＝）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．１２９３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．２０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ６９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．３３２２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１０８Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．１８０４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６０２Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．１９３７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．２５６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ８５５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４２３４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４４５７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ１４８６Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４５９４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ１５３２Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４９１９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１６４０Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．５１９６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６３１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２１０６Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．３０５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１０１９Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１８Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．１２２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．１９０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．１９４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ６５Ｇｌｕ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．３０８５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４１９５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ１３９９Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４６１０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１５３７Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６１１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０３８Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６１１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６３４２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ２１１４＝）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６６５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２２２０Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＡＢＣＡ４遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、シュタルガルト病を治療または予防する方法に関する。
バルデー・ビードル症候群
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、バルデー・ビードル症候群に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＢＢＳ１、ＢＢＳ２、ＢＢＳ７、ＢＢＳ９、ＢＢＳ１０、ＢＢＳ１２、ＬＺＴＦＬ１、及びＴＲＩＭ３２から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０２４６４９．４（ＢＢＳ１）：ｃ．４１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１３９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２４６４９．４（ＢＢＳ１）：ｃ．８７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９８４２８．２（ＢＢＳ９）：ｃ．２６３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００１１７８００７．１（ＢＢＳ１２）：ｃ．１７０４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５６８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１２７６３７８．１（ＬＺＴＦＬ１）：ｃ．２７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３１８８５．３（ＢＢＳ２）：ｃ．１８６４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６２２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９８４２８．２（ＢＢＳ９）：ｃ．１７５９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５８７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９８４２８．２（ＢＢＳ９）：ｃ．１７８９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０２４６４９．４（ＢＢＳ１）：ｃ．４３２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１７６８２４．２（ＢＢＳ７）：ｃ．６３２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ２１１Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０１２２１０．３（ＴＲＩＭ３２）：ｃ．３８８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ１３０Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０３１８８５．３（ＢＢＳ２）：ｃ．８２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２７５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２４６８５．３（ＢＢＳ１０）：ｃ．１４５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９Ｔｒｐ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＢＢＳ１、ＢＢＳ２、ＢＢＳ７、ＢＢＳ９、ＢＢＳ１０、ＢＢＳ１２、ＬＺＴＦＬ１、及びＴＲＩＭ３２から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、バルデー・ビードル症候群を治療または予防する方法に関する。
桿体錐体ジストロフィー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、桿体錐体ジストロフィーに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＲＰＧＲＩＰ１、ＤＲＡＭ２、ＡＢＣＡ４、ＡＤＡＭ９、及びＣＡＣＮＡ１Ｆから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０２０３６６．３（ＲＰＧＲＩＰ１）：ｃ．１５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１７８４５４．５（ＤＲＡＭ２）：ｃ．４９４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１６５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１７８４５４．５（ＤＲＡＭ２）：ｃ．１３１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｓｅｒ４４Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．１６１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ５４Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．５７１４＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．８８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６０７９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｌｅｕ２０２７Ｐｈｅ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．３１１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ１０３８Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６３４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２１２Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００３８１６．２（ＡＤＡＭ９）：ｃ．４９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００５１８３．３（ＣＡＣＮＡ１Ｆ）：ｃ．２４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８２Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＲＰＧＲＩＰ１、ＤＲＡＭ２、ＡＢＣＡ４、ＡＤＡＭ９、及びＣＡＣＮＡ１Ｆから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、桿体錐体ジストロフィーを治療または予防する方法に関する。
先天性停止性夜盲
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、先天性停止性夜盲に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＧＲＭ６、ＴＲＰＭ１、ＧＰＲ１７９、及びＣＡＣＮＡ１Ｆから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００８４３．３（ＧＲＭ６）：ｃ．１４６２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４８８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００２４２０．５（ＴＲＰＭ１）：ｃ．２９９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０００Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１００４３３４．３（ＧＰＲ１７９）：ｃ．６７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００５１８３．３（ＣＡＣＮＡ１Ｆ）：ｃ．２５７６＋１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＧＲＭ６、ＴＲＰＭ１、ＧＰＲ１７９、及びＣＡＣＮＡ１Ｆから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、先天性停止性夜盲を治療または予防する方法に関する。
アッシャー症候群
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、アッシャー症候群に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＨ１Ｃ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＵＳＨ２Ａ、ＡＤＧＲＶ１、ＷＨＲＮ、及びＣＬＲＮ１から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．６４０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２１４Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．１２００＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．１４１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．１５５６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ５１９Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．１９００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．１９６３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６５５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．２０９４＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．４２９３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１４３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．５１０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１７０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．５６１７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１８７３Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．５６６０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ１８８７Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．６０７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．４７０＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．５９６８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．３７１９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１２４０Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．４９４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．５３９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．５６４８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１８８３Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．４４８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．７００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．６３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２１２Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．１９９６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６６６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００５７０９．３（ＵＳＨ１Ｃ）：ｃ．２１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ７２＝）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．７３６２＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．３４８１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．３６２８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２１０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．５２７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．５７１２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．５７１２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｈｒ１９０４＝）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．５９２３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．６０４９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．７７７６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２５９２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．９５５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３１８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．３７０６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１２３６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．４３０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．６０５０－９Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０３３０５６．３（ＰＣＤＨ１５）：ｃ．３３１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１０６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３３０５６．３（ＰＣＤＨ１５）：ｃ．７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３３０５６．３（ＰＣＤＨ１５）：ｃ．１９２７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６４３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１４２７７２．１（ＰＣＤＨ１５）：ｃ．４００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３３０５６．３（ＰＣＤＨ１５）：ｃ．３３５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１２０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１１０４８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１１４３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１１９５４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９８５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１２８６８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４２９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１４１８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４７２７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１４９１１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９７１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．５７８８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１９３０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．５８５８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．６２２４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２０７５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．８２０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２７４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．８９８１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２９９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．９３０４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３１０２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１３０１０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ４３３７Ｍｅｔ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１４２４８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４７５０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．６３９８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２１３３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．６３２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．６６０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２２０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１３３１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ４４３９Ｉｌｅ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．４４０５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４６９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．９５７０＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．８７４０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９１４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．８６８１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１０００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３３４Ｔｒｐ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１４１７５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４７２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．９３９０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１３０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．９０８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３０３Ｈｉｓ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．５７７６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１１１５６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３７１９Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０３２１１９．３（ＡＤＧＲＶ１）：ｃ．２３９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８００Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３２１１９．３（ＡＤＧＲＶ１）：ｃ．７４０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２４６９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３２１１９．３（ＡＤＧＲＶ１）：ｃ．１２６３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４２１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３２１１９．３（ＡＤＧＲＶ１）：ｃ．７１２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２３７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３２１１９．３（ＡＤＧＲＶ１）：ｃ．１４８８５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４９６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１５４０４．３（ＷＨＲＮ）：ｃ．１２６７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４２３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１７４８７８．２（ＣＬＲＮ１）：ｃ．６１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０７Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＨ１Ｃ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＵＳＨ２Ａ、ＡＤＧＲＶ１、ＷＨＲＮ、及びＣＬＲＮ１から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、強化されたアッシャー症候群を治療または予防する方法に関する。
レーバー先天黒内障
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、レーバー先天黒内障に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＴＵＬＰ１、ＲＰＥ６５、ＳＰＡＴＡ７、ＡＩＰＬ１、ＣＲＢ１、ＮＭＮＡＴ１、及びＰＥＸ１から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿００３３２２．５（ＴＵＬＰ１）：ｃ．１４９５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００３２９．２（ＲＰＥ６５）：ｃ．１１＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１８４１８．４（ＳＰＡＴＡ７）：ｃ．３２２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１４３３６．４（ＡＩＰＬ１）：ｃ．７８４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２６２Ｓｅｒ）
ＮＭ＿２０１２５３．２（ＣＲＢ１）：ｃ．１５７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０１２５３．２（ＣＲＢ１）：ｃ．３３０７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１１０３Ａｒｇ）
ＮＭ＿２０１２５３．２（ＣＲＢ１）：ｃ．２８４３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ９４８Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０２２７８７．３（ＮＭＮＡＴ１）：ｃ．７６９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ２５７Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００４６６．２（ＰＥＸ１）：ｃ．２５２８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ８４３Ａｓｐ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＴＵＬＰ１、ＲＰＥ６５、ＳＰＡＴＡ７、ＡＩＰＬ１、ＣＲＢ１、ＮＭＮＡＴ１、及びＰＥＸ１から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、レーバー先天黒内障を治療または予防する方法に関する。
網膜色素変性症
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、網膜色素変性症に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＣＲＢ１、ＩＦＴ１４０、ＲＰ１、ＩＭＰＤＨ１、ＰＲＰＦ３１、ＲＰＧＲ、ＡＢＣＡ４、ＲＰＥ６５、ＥＹＳ、ＮＲＬ、ＦＡＭ１６１Ａ、ＮＲ２Ｅ３、ＵＳＨ２Ａ、ＲＨＯ、ＰＤＥ６Ｂ、ＫＬＨＬ７、ＰＤＥ６Ａ、ＣＮＧＢ１、ＢＥＳＴ１、Ｃ２ｏｒｆ７１、ＰＲＰＨ２、ＣＡ４、ＣＥＲＫＬ、ＲＰＥ６５、ＰＤＥ６Ｂ、及びＡＤＧＲＶ１から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿００１２５７９６５．１（ＣＲＢ１）：ｃ．２７１１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ９０４Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０１４７１４．３（ＩＦＴ１４０）：ｃ．３８２７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１２７６Ｇｌｕ）
ＮＭ＿００６２６９．１（ＲＰ１）：ｃ．２０２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００８８３．３（ＩＭＰＤＨ１）：ｃ．９３１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ３１１Ａｓｎ）
ＮＭ＿０１５６２９．３（ＰＲＰＦ３１）：ｃ．１２７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１５６２９．３（ＰＲＰＦ３１）：ｃ．１０７３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００３２８．２（ＲＰＧＲ）：ｃ．１３８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４５７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１５２６Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６２２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０７７Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００３２９．２（ＲＰＥ６５）：ｃ．２７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９１Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００１１４２８００．１（ＥＹＳ）：ｃ．２１９４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７３２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１４２８００．１（ＥＹＳ）：ｃ．４９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００６１７７．３（ＮＲＬ）：ｃ．１５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ５１Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００１２０１５４３．１（ＦＡＭ１６１Ａ）：ｃ．１５６７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５２３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１４２４９．３（ＮＲ２Ｅ３）：ｃ．１６６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ５６Ａｒｇ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．２２０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１４８０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１００７３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ３３５８Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００５３９．３（ＲＨＯ）：ｃ．５４１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ１８１Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００２８３．３（ＰＤＥ６Ｂ）：ｃ．８９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１０３１７１０．２（ＫＬＨＬ７）：ｃ．４５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ１５３Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００４４０．２（ＰＤＥ６Ａ）：ｃ．１９２６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００１２９７．４（ＣＮＧＢ１）：ｃ．２１２８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７１０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１２９７．４（ＣＮＧＢ１）：ｃ．９５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４１８３．３（ＢＥＳＴ１）：ｃ．６８２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ２２８Ａｓｎ）
ＮＭ＿００１０２９８８３．２（Ｃ２ｏｒｆ７１）：ｃ．１８２８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６１０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３２２．４（ＰＲＰＨ２）：ｃ．６４７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ２１６Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００７１７．４（ＣＡ４）：ｃ．４０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４Ｔｒｐ）
ＮＭ＿２０１５４８．４（ＣＥＲＫＬ）：ｃ．７６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３２９．２（ＲＰＥ６５）：ｃ．１１８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ４０Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００３２２．４（ＰＲＰＨ２）：ｃ．４９９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１６７Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００５３９．３（ＲＨＯ）：ｃ．４０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１３５Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００２８３．３（ＰＤＥ６Ｂ）：ｃ．２１９３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０３２１１９．３（ＡＤＧＲＶ１）：ｃ．６９０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３０１Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＣＲＢ１、ＩＦＴ１４０、ＲＰ１、ＩＭＰＤＨ１、ＰＲＰＦ３１、ＲＰＧＲ、ＡＢＣＡ４、ＲＰＥ６５、ＥＹＳ、ＮＲＬ、ＦＡＭ１６１Ａ、ＮＲ２Ｅ３、ＵＳＨ２Ａ、ＲＨＯ、ＰＤＥ６Ｂ、ＫＬＨＬ７、ＰＤＥ６Ａ、ＣＮＧＢ１、ＢＥＳＴ１、Ｃ２ｏｒｆ７１、ＰＲＰＨ２、ＣＡ４、ＣＥＲＫＬ、ＲＰＥ６５、ＰＤＥ６Ｂ、及びＡＤＧＲＶ１から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、網膜色素変性症を治療または予防する方法に関する。
色覚異常
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、色覚異常に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、及びＡＴＦ６から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿００１２９８．２（ＣＮＧＡ３）：ｃ．８４７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２８３Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００１２９８．２（ＣＮＧＡ３）：ｃ．１０１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００１２９８．２（ＣＮＧＡ３）：ｃ．１５８５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ５２９Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０１９０９８．４（ＣＮＧＢ３）：ｃ．１５７８＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１９０９８．４（ＣＮＧＢ３）：ｃ．６０７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１９０９８．４（ＣＮＧＢ３）：ｃ．１１１９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３７３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７３４８．３（ＡＴＦ６）：ｃ．９７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３２４Ｃｙｓ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、及びＡＴＦ６から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、色覚異常を治療または予防する方法に関する。
聴覚に影響を及ぼす疾患
聴覚に影響を及ぼす様々な疾患に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告され、表Ａに開示されており、難聴及び非症候性難聴が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明の態様は、以下に記載するこれらの疾患のいずれかに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する方法に関する。
難聴
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、難聴に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＦＧＦ３、ＭＹＯ７Ａ、ＳＴＲＣ、ＡＣＴＧ１、ＳＬＣ１７Ａ８、ＴＭＣ１、ＧＪＢ２、ＭＹＨ１４、ＣＯＣＨ、ＣＤＨ２３、ＵＳＨ１Ｃ、ＧＪＢ２、ＭＹＯ７Ａ、ＰＣＤＨ１５、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＷＨＲＮ、ＤＦＮＢ５９、ＴＭＣ１、ＬＯＸＨＤ１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＯＴＯＧＬ、ＯＴＯＦ、ＪＡＧ１、及びＭＡＲＶＥＬＤ２から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿００５２４７．２（ＦＧＦ３）：ｃ．２８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９５Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．６５２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ２１８Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．６８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ２３０Ｖａｌ）
ＮＭ＿１５３７００．２（ＳＴＲＣ）：ｃ．４０５７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１６１４．３（ＡＣＴＧ１）：ｃ．７２１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ２４１Ｌｙｓ）
ＮＭ＿１３９３１９．２（ＳＬＣ１７Ａ８）：ｃ．６３２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ２１１Ｖａｌ）
ＮＭ＿１３８６９１．２（ＴＭＣ１）：ｃ．１７１４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ５７２Ａｓｎ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．５９８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２００Ａｒｇ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．７１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．４１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｓｅｒ１３９Ａｓｎ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．２２４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ７５Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．９５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３２Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．２５０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ８４Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．４２８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１４３Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．５５１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１８４Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．２２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７５Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０２４７２９．３（ＭＹＨ１４）：ｃ．３５９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ１２０Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００４０８６．２（ＣＯＣＨ）：ｃ．１５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ５１Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．４０２１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ１３４１Ａｓｎ）
ＮＭ＿１５３７００．２（ＳＴＲＣ）：ｃ．４７０１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１５３６７６．３（ＵＳＨ１Ｃ）：ｃ．４９６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．１３１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．２８３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ９５Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．２９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｈｉｓ１００Ｔｙｒ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．４２７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４３Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．１０９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ３７Ｉｌｅ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．－２３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．１４８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ５０Ａｓｎ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．１３４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ４５Ｇｌｕ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．３７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．２３０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．２３１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．５８９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１９６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．２００５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６６９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３３０５６．３（ＰＣＤＨ１５）：ｃ．７３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１６２３９．３（ＭＹＯ１５Ａ）：ｃ．３８６６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１６２３９．３（ＭＹＯ１５Ａ）：ｃ．６１７８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１６２３９．３（ＭＹＯ１５Ａ）：ｃ．８７１４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１７４３３．４（ＭＹＯ３Ａ）：ｃ．２５０６－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１５４０４．３（ＷＨＲＮ）：ｃ．１４１７－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００１０４２７０２．３（ＤＦＮＢ５９）：ｃ．４９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９１．２（ＴＭＣ１）：ｃ．１００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９１．２（ＴＭＣ１）：ｃ．１１６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１４４６１２．６（ＬＯＸＨＤ１）：ｃ．２００８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１４４６１２．６（ＬＯＸＨＤ１）：ｃ．４７１４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５７２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１４４６１２．６（ＬＯＸＨＤ１）：ｃ．４４８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２４０２２．２（ＴＭＰＲＳＳ３）：ｃ．３２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０９Ｔｒｐ）
ＮＭ＿１７３５９１．３（ＯＴＯＧＬ）：ｃ．３０７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９４２４８．２（ＯＴＯＦ）：ｃ．４４８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９４２４８．２（ＯＴＯＦ）：ｃ．２１２２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７０８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９４２４８．２（ＯＴＯＦ）：ｃ．２４８５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１０３８６０３．２（ＭＡＲＶＥＬＤ２）：ｃ．１４９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５００Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＦＧＦ３、ＭＹＯ７Ａ、ＳＴＲＣ、ＡＣＴＧ１、ＳＬＣ１７Ａ８、ＴＭＣ１、ＧＪＢ２、ＭＹＨ１４、ＣＯＣＨ、ＣＤＨ２３、ＵＳＨ１Ｃ、ＧＪＢ２、ＭＹＯ７Ａ、ＰＣＤＨ１５、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＷＨＲＮ、ＤＦＮＢ５９、ＴＭＣ１、ＬＯＸＨＤ１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＯＴＯＧＬ、ＯＴＯＦ、ＪＡＧ１、及びＭＡＲＶＥＬＤ２から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、難聴を治療または予防する方法に関する。
非症候性難聴
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、非症候性難聴に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＧＪＢ２、ＰＯＵ３Ｆ４、ＭＹＯ１５Ａ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＬＯＸＨＤ１、ＯＴＯＦ、ＭＹＯ６、ＯＴＯＡ、ＳＴＲＣ、ＴＲＩＯＢＰ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＴＭＣ１、ＴＥＣＴＡ、ＯＴＯＧＬ、及びＧＩＰＣ３から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．１６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３０７．４（ＰＯＵ３Ｆ４）：ｃ．４９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１６２３９．３（ＭＹＯ１５Ａ）：ｃ．８７６７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９２３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２４０２２．２（ＴＭＰＲＳＳ３）：ｃ．３２３－６Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０２４０２２．２（ＴＭＰＲＳＳ３）：ｃ．９１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ３０６Ｔｈｒ）
ＮＭ＿１４４６１２．６（ＬＯＸＨＤ１）：ｃ．２４９７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８３３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９４２４８．２（ＯＴＯＦ）：ｃ．２１５３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９４２４８．２（ＯＴＯＦ）：ｃ．２８１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９４２４８．２（ＯＴＯＦ）：ｃ．４７９９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４９９９．３（ＭＹＯ６）：ｃ．８２６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２７６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１４４６７２．３（ＯＴＯＡ）：ｃ．１８８０＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１５３７００．２（ＳＴＲＣ）：ｃ．５１８８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１７３０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１５３７００．２（ＳＴＲＣ）：ｃ．３６７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１２２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１５３７００．２（ＳＴＲＣ）：ｃ．４４０２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４６８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２４０２２．２（ＴＭＰＲＳＳ３）：ｃ．１１９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１０３９１４１．２（ＴＲＩＯＢＰ）：ｃ．６５９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２２００Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１６２３９．３（ＭＹＯ１５Ａ）：ｃ．７８９３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１６２３９．３（ＭＹＯ１５Ａ）：ｃ．５５３１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１６２３９．３（ＭＹＯ１５Ａ）：ｃ．６０４６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１４４６１２．６（ＬＯＸＨＤ１）：ｃ．３１６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１０３８６０３．２（ＭＡＲＶＥＬＤ２）：ｃ．１３３１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１３８６９１．２（ＴＭＣ１）：ｃ．１６７６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５５９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９１．２（ＴＭＣ１）：ｃ．１６７７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５５９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００５４２２．２（ＴＥＣＴＡ）：ｃ．５９７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１９９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１７３５９１．３（ＯＴＯＧＬ）：ｃ．４９８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１５３７００．２（ＳＴＲＣ）：ｃ．３４９３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１６５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１５３７００．２（ＳＴＲＣ）：ｃ．３２１７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０７３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１６２３９．３（ＭＹＯ１５Ａ）：ｃ．５８９６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１９６６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３３２６１．２（ＧＩＰＣ３）：ｃ．４１１＋１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＧＪＢ２、ＰＯＵ３Ｆ４、ＭＹＯ１５Ａ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＬＯＸＨＤ１、ＯＴＯＦ、ＭＹＯ６、ＯＴＯＡ、ＳＴＲＣ、ＴＲＩＯＢＰ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＴＭＣ１、ＴＥＣＴＡ、ＯＴＯＧＬ、及びＧＩＰＣ３から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、非症候性難聴を治療または予防する方法に関する。
血液障害
様々な血液障害に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告され、表Ａに開示されており、ベータサラセミア、血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、及びウィスコット・アルドリッチ症候群が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明の態様は、以下に記載するこれらの疾患のいずれかに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する方法に関する。
ベータサラセミア
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、ベータサラセミアに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＨＢＢ遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．－１３７Ｃ＞Ｔ
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．－５０－８８Ｃ＞Ｔ
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．－１４０Ｃ＞Ｔ
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．３１６－１９７Ｃ＞Ｔ
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．９３－２１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．１１４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．１１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．９２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．３１５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．９２＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．－５０－１０１Ｃ＞Ｔ
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＨＢＢ遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、ベータサラセミアを治療または予防する方法に関する。
血友病Ａ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、血友病Ａに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＦ８遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００１３２．３（Ｆ８）：ｃ．３１６９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ１０５７Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００１３２．３（Ｆ８）：ｃ．９０２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３０１Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００１３２．３（Ｆ８）：ｃ．１８３４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６１２Ｃｙｓ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、Ｆ８遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、血友病Ａを治療または予防する方法に関する。
第Ｖ因子ライデン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、第Ｖ因子ライデン突然変異を補正する。この疾患が引き起こす単一点突然変異（Ｇ１７４６→Ａ）は、白人集団における遺伝性多因子性血栓症の最も豊富な遺伝子リスク因子を表す。点突然変異により、単一アミノ酸置換（Ｒ５３４［ＲＩＧＨＴＷＡＲＤＳ ＡＲＲＯＷ］Ｑ）は、血液凝固因子Ｆ５のタンパク質Ｃ依存性タンパク質分解性開裂部位（Ｒ５３３Ｒ５３４）で現れる。ヘテロ接合性欠失は、血栓症リスク（約８倍）のほんの僅かな増加を伴う一方、ホモ接合性欠失は、はるかにより強力な効果を有する（＞８０倍の増加リスク）。１９の特異的ＲＮＡ編集は、ＲＮＡレベルでのその修復によって、この遺伝的欠陥を補償する可能性を有する。
血友病Ｂ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、血友病Ｂに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＦ９遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００１３３．３（Ｆ９）：ｃ．８３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ２７９Ｔｈｒ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、Ｆ９遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、血友病Ｂを治療または予防する方法に関する。
血友病Ｃ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、血友病Ｃに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＦ１１遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００１２８．３（Ｆ１１）：ｃ．４００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１２８．３（Ｆ１１）：ｃ．１４３２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ４７８Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００１２８．３（Ｆ１１）：ｃ．１２８８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ４３０Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００１２８．３（Ｆ１１）：ｃ．３２６－１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、Ｆ１１遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、血友病Ｃを治療または予防する方法に関する。
ウィスコット・アルドリッチ症候群
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＷＡＳ遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００３７７．２（ＷＡＳ）：ｃ．３７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３７７．２（ＷＡＳ）：ｃ．２５７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ８６Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００３７７．２（ＷＡＳ）：ｃ．７７７＋１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＷＡＳ遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、ウィスコット・アルドリッチ症候群を治療または予防する方法に関する。
肝臓病
様々な肝臓病に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告され、表Ａに開示されており、トランスサイレチンアミロイドーシス、α１－アンチトリプシン欠乏症、ウィルソン病、及びフェニルケトン尿症が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明の態様は、以下に記載するこれらの疾患のいずれかに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する方法に関する。
トランスサイレチンアミロイドーシス
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、トランスサイレチンアミロイドーシスに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＴＴＲ遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００３７１．３（ＴＴＲ）：ｃ．４２４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ１４２Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０００３７１．３（ＴＴＲ）：ｃ．１４８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ５０Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００３７１．３（ＴＴＲ）：ｃ．１１８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ４０Ｉｌｅ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＴＴＲ遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、トランスサイレチンアミロイドーシスを治療または予防する方法に関する。
α１－アンチトリプシン欠乏症
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、α１－アンチトリプシン欠乏症に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００２９５．４（ＳＥＲＰＩＮＡ１）：ｃ．５３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１２７７０１．１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）：ｃ．１１７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ３９３Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００１１２７７０１．１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）：ｃ．２３０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ７７Ｐｈｅ）
ＮＭ＿００１１２７７０１．１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）：ｃ．１０９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ３６６Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００２９５．４（ＳＥＲＰＩＮＡ１）：ｃ．１１７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ３９３Ｓｅｒ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、α１－アンチトリプシン欠乏症を治療または予防する方法に関する。
ウィルソン病
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、ウィルソン病に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＡＴＰ７Ｂ遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２２９３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ７６５Ａｓｎ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．３９５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１３１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２８６５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．３７９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１２６６Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２６２１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ８７４Ｖａｌ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２０７１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ６９１Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２１２８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ７１０Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２３３６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７７９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．４０２１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１３４１Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．３１８２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１０６１Ｇｌｕ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．４１１４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３７２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．１７０８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．８６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２９３０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ９７７Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．３６５９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１２２０Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２６０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ８６９Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２９７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ９９２Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２５１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ８４０Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２９０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ９６９Ｇｌｎ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、ウィルソン病を治療または予防する方法に関する。
フェニルケトン尿症
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、フェニルケトン尿症に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＰＡＨ遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１３１５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１２２２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４０８Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．８３８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ２８０Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．３３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７８２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２６１Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２５２Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．４７３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１５８Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７２７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２４３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．８４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ２８１Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７２８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２４３Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１０６６－１１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７８１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１２２３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ４０８Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１１６２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ３８８Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１０６６－３Ｃ＞Ｔ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１２０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ４０３Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．８９０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２９７Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．９２６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ３０９Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．４４１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．５２６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１７６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．６８８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ２３０Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７２１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２４１Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７４５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｌｅｕ２４９Ｐｈｅ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．４４２－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．８４２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ２５９Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１２００－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．９１２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１０６５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．４７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５８Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２５２Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．８０９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２７０Ｌｙｓ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＰＡＨ遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、フェニルケトン尿症を治療または予防する方法に関する。
腎臓病
様々な腎臓病に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告され、表Ａに開示されており、常染色体劣性多発性嚢胞腎及び腎カルニチン輸送障害が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明の態様は、以下に記載するこれらの疾患のいずれかに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する方法に関する。
常染色体劣性多発性嚢胞腎
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、常染色体劣性多発性嚢胞腎に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＰＫＨＤ１遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．１０４４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３４８２Ｃｙｓ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．９３１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３１０７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．１４８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．７０７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．１４８６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．８３０３－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．２８５４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ９５２Ａｒｇ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．７１９４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２３９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．１０２１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３４０７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．１０７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ３６Ｍｅｔ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．８８２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．９８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３２８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．４８７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６２４Ｔｒｐ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．１６０２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．１６９４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．２３４１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７８１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．２４０７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．２４５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．５２３６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．６４９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．２７２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９０９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．３７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．２８１０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ９３７Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＰＫＨＤ１遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、常染色体劣性多発性嚢胞腎を治療または予防する方法に関する。
腎カルニチン輸送障害
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、腎カルニチン輸送障害に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＳＬＣ２２Ａ５遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．７６０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．３９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１３２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．８４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．５０５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６９Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．１３１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ４４０Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．１１９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３９９Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．６９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ２３２Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．８４５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２８２Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．１１９３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ３９８Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．１４６３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ４８８Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．３３８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ１１３Ｔｙｒ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．１３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ４６Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．５０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１６９Ｇｌｎ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＳＬＣ２２Ａ５遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、腎カルニチン輸送障害を治療または予防する方法に関する。
筋肉疾患
様々な筋肉疾患に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告され、表Ａに開示されており、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー、及び顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーが挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明の態様は、以下に記載するこれらの疾患のいずれかに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する方法に関する。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＤＭＤ遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２７９７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９３３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４８７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５５５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８５１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３１８８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１０６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８３５７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２７８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．７８１７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６０６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．７７５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２５８５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５９１７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９７３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５６４１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８８１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５１３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４２４０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４１４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３４２７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１４３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２４０７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８０３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２３６８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１６８３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１６６３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５５５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１３８８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１３３１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１３２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．９４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５５０６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８３６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１５０４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５０２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５０３２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６７８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４５７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１５９４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５３２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１１５０－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．６２２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２０７５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３７４７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１２４９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２８６１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ９５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．９５６３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４４８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４３１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８２０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２７３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４０７１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２６６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２２０２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２０７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１６５３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５５１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１０６１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８９１４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９７２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．６１１８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４７２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５７７Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＤＭＤ遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療または予防する方法に関する。
ベッカー型筋ジストロフィー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、ベッカー型筋ジストロフィーに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＤＭＤ遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３４１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１１３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３５８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１０１０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３３７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．６３７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．９５６８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３１９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８７１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９０５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１６１５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５３９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３１５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０５１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３４３２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５２８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１７６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５５３０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１８４４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８６０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２８７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８６５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８９４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５８９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１９６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１００３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３３４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１００８６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４０１９．２（ＤＭＤ）：ｃ．１０２０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｈｒ３４０＝）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１２６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１４６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１９９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２０３２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６７８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２３３２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７７８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２４１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８０７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２６５０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８８４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２８０４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３２７６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３２９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０９９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３３６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３５８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４１１７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３７３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．６４９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．６９０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２３０２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．７１８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３９７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．７３０９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．７６５７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２５５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．７６８２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２５６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．７６８３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２５６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．７８９４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２６３２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．９３６１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．９５６４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２９５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３１＋３６９４７Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１０２７９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３４２７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１０１７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３３９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．９３３７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３１１３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８０３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２６８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１８１２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１０９３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３６５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１７０４＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１９１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５８６８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１９５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５０８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６９７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２５１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１０４７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３４９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．９３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４１７４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３９２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３９４０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１３１４Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＤＭＤ遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、ベッカー型筋ジストロフィーを治療または予防する方法に関する。
肢帯型筋ジストロフィー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、肢帯型筋ジストロフィーに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＳＧＣＢ、ＭＹＯＴ、ＬＭＮＡ、ＣＡＰＮ３、ＤＹＳＦ、ＳＧＣＡ、ＴＴＮ、ＡＮＯ５、ＴＲＡＰＰＣ１１、ＬＭＮＡ、ＰＯＭＴ１、及びＦＫＲＰから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００２３２．４（ＳＧＣＢ）：ｃ．３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００６７９０．２（ＭＹＯＴ）：ｃ．１６４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ５５Ｐｈｅ）
ＮＭ＿００６７９０．２（ＭＹＯＴ）：ｃ．１７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ５７Ｉｌｅ）
ＮＭ＿１７０７０７．３（ＬＭＮＡ）：ｃ．１４８８＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１７０７０７．３（ＬＭＮＡ）：ｃ．１６０９－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１７１５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ５７２Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．２２４３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ７４８Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１４５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１３１９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ４４０Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１３４３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ４４８Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１４６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４８９Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１７１４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５７２Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．２３０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ７６９Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１３３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ４５Ｔｈｒ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．４９９－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．４３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１０６３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３５５Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１２５０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ４１７Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．２４５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ８２Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．２２４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７４８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１３１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４４０Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１３３３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ４４５Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１９５７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１８０１－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．２２６３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．９５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ３１９Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１４６８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９０Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．８０２－９Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１３４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４４８Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１３０３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ４３５Ｌｙｓ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１９９３－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．３１１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１０３８Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．５１７４＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．１５９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．２９２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９７７Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．４２８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４２８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．１５７７－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５５２９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１８４３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．１５７６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．４４６２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４８８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５４２９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１８１０Ｌｙｓ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５０７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６９３Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００１１３０９７８．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．１８１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６０５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．３２３０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１０７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．２６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．４４３４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１４７８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．３４７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１６０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．１３７２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ４５８Ａｒｇ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．４０９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．２４０９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．１７０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．１９５６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ６５２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．５００４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．３３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１３０９７８．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．５７７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１９２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．６１２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０４２Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．２６４３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．４２５３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１４１８Ａｓｐ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．６１０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．１８３４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５６６８－７Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００１１３０９７８．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．３１３７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１０４６Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．１０５３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．１３９８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．１４８１－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．２３１１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７７１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．２８６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．４７５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５５０９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ１８３７Ａｓｎ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５６４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５９４６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．９３７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５２６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．３８３２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２７８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５５２５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．３１１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００２３．３（ＳＧＣＡ）：ｃ．２９３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ９８Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００００２３．３（ＳＧＣＡ）：ｃ．８５０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２８４Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００００２３．３（ＳＧＣＡ）：ｃ．４０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００２３．３（ＳＧＣＡ）：ｃ．４０９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ１３７Ｌｙｓ）
ＮＭ＿００００２３．３（ＳＧＣＡ）：ｃ．７４７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００２３．３（ＳＧＣＡ）：ｃ．２２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７７Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００００２３．３（ＳＧＣＡ）：ｃ．１０１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３４Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００００２３．３（ＳＧＣＡ）：ｃ．７３９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ２４７Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００１２５６８５０．１（ＴＴＮ）：ｃ．８７３９４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９１３２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．７６２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．１２１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４０５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．１６３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．１４０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４６９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．１２１０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４０４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．２２７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７５８Ｃｙｓ）
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．４１－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．１７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５８Ｔｒｐ）
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．１８９８＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０２１９４２．５（ＴＲＡＰＰＣ１１）：ｃ．１２８７＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１７０７０７．３（ＬＭＮＡ）：ｃ．１６０８＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７１７１．３（ＰＯＭＴ１）：ｃ．１８６４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６２２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２４３０１．４（ＦＫＲＰ）：ｃ．３１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０５Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＳＧＣＢ、ＭＹＯＴ、ＬＭＮＡ、ＣＡＰＮ３、ＤＹＳＦ、ＳＧＣＡ、ＴＴＮ、ＡＮＯ５、ＴＲＡＰＰＣ１１、ＬＭＮＡ、ＰＯＭＴ１、及びＦＫＲＰから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、肢帯型筋ジストロフィーを治療または予防する方法に関する。
エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィーに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＥＭＤまたはＳＹＮＥ１遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００１１７．２（ＥＭＤ）：ｃ．３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｍｅｔ１Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０３３０７１．３（ＳＹＮＥ１）：ｃ．１１９０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３９７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３３０７１．３（ＳＹＮＥ１）：ｃ．２１７２１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７２４１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１１７．２（ＥＭＤ）：ｃ．１３０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４４Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＥＭＤまたはＳＹＮＥ１遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィーを治療または予防する方法に関する。
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＳＭＣＨＤ１遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０１５２９５．２（ＳＭＣＨＤ１）：ｃ．３８０１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１５２９５．２（ＳＭＣＨＤ１）：ｃ．１８４３－１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＳＭＣＨＤ１遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを治療または予防する方法に関する。
先天性代謝異常（ＩＥＭ）
様々なＩＥＭに関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告され、表Ａに開示されており、原発性高シュウ酸尿症１型、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、オルニチンカルバモイル基転移酵素欠損症、及びメープルシロップ尿症が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明の態様は、以下に記載するこれらの疾患のいずれかに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する方法に関する。
原発性高シュウ酸尿症１型
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、原発性高シュウ酸尿症１型に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＡＧＸＴ遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．２４５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ８２Ｇｌｕ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．６９８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２３３Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．４６６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１５６Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．１０６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３６Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．３４６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１１６Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．５６８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１９０Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．６５３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ２１８Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．７３７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２４６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．１０４９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ３５０Ａｓｐ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．４７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ１５８Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．９０７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．９９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３３２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．５０８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１７０Ａｒｇ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＡＧＸＴ遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、原発性高シュウ酸尿症１型を治療または予防する方法に関する。
アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＡＳＬ遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿００１０２４９４３．１（ＡＳＬ）：ｃ．１１５３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３８５Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．５３２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ１７８Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．５４５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１８２Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．１７５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ５９Ｌｙｓ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．７１８＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．８８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９７Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．１３６０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．１０６０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１２Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．４４６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．５４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．１１３５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３７９Ｃｙｓ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＡＳＬ遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症を治療または予防する方法に関する。
オルニチンカルバモイル基転移酵素欠損症
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、オルニチンカルバモイル基転移酵素欠損症に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＯＴＣ遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００５３１．５（ＯＴＣ）：ｃ．１１９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ４０Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００５３１．５（ＯＴＣ）：ｃ．４２２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１４１Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００５３１．５（ＯＴＣ）：ｃ．８２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２７７Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００５３１．５（ＯＴＣ）：ｃ．６７４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ２２５Ｌｅｕ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＯＴＣ遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、オルニチンカルバモイル基転移酵素欠損症を治療または予防する方法に関する。
メープルシロップ尿症
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、メープルシロップ尿症に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＫＤＨＢ、ＤＢＴ、及びＤＬＤから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．４７６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１５９Ｇｌｎ）
ＮＭ＿１８３０５０．３（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｍｅｔ１Ｉｌｅ）
ＮＭ＿１８３０５０．３（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．５５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ１８５Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００１９１８．３（ＤＢＴ）：ｃ．１０３３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ３４５Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．９４０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３１４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．７９３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２６５Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．８６８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２９０Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００１０８．４（ＤＬＤ）：ｃ．１１２３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ３７５Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．１２３４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ４１２Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．２８８＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．９７９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ３２７Ｌｙｓ）
ＮＭ＿００１９１８．３（ＤＢＴ）：ｃ．９０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３０１Ｃｙｓ）
ＮＭ＿１８３０５０．３（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．５０９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１７０Ｈｉｓ）
ＮＭ＿１８３０５０．３（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．７９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１８３０５０．３（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．８５３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２８５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１８３０５０．３（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．９７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１８３０５０．３（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．８３２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２７８Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．１０３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３４６Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．２８８＋９Ｃ＞Ｔ
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．６３２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ２１１Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．６５９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ２２０Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．９６４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３２２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１９１８．３（ＤＢＴ）：ｃ．１２９１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１９１８．３（ＤＢＴ）：ｃ．２５１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ８４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１９１８．３（ＤＢＴ）：ｃ．８７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５６．４（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．１０１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ３３９Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００５６．４（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．３４４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５６．４（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．６３３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５６．４（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．９５２－１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＫＤＨＢ、ＤＢＴ、及びＤＬＤから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、メープルシロップ尿症を治療または予防する方法に関する。
がん関連疾患
様々ながん及びがん関連疾患に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告され、表Ａに開示されており、乳房卵巣癌及びリンチ症候群が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明の態様は、以下に記載するこれらの疾患のいずれかに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する方法に関する。
乳房卵巣癌
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、乳房卵巣癌に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５０９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６９９Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７５５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２５２０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２５７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３６０７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１２０３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５５０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１８３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２０５９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６８７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４６７５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５２５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１７５１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５４４４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１８１５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９３１８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１０６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９３８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３１２８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２７４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６９５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２３１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１６８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２５９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．７８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５５４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８４８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５１６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４５７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４２７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４２２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４０９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４０６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３６７９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２２７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１９１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．９６３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．７１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９１９６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０６６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９１５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３０５２Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３９９１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４０９７－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１０５９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１１１５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３７２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１１３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１６１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１６２１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５４１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１６３０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５４４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１９６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２２７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７５９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２４１０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８０４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２８６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２９２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９７５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３２６８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３４３０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１４４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３５４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４０７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３５９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４２０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４３９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４５５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５０５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１６８５Ｉｌｅ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５１４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５２３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５２６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５３３５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７７９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５３４５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１７８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５５１１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１８３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５５３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８４６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．９４９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３１７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．９２８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３１０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５１１７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１７０６Ｇｌｕ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５１３６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１７１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４３２７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４４３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１４７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１５７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１６０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２６８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２７６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３８９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２９９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４３３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４３７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５１５３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１７１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５４４５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１８１５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５５１０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１８３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５３４６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１７８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１１１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３７２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１９９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４１８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４８１０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６０４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．８５０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１０５８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１３１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ４４Ｔｙｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１６００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３２８６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０９６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３４０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４２５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４２０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４６０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５１５４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１７１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５４３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２４１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３３３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３９６７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３２３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４１５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５０５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５１９４－１２Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５２１２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１７３８Ａｒｇ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５３３２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１４８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２５６３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８５５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１０６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３７１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３８１７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２７３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３９３７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３１３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４３５７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５０７４＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５２７７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２３３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３５９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２００Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３８４１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２８１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４２２２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４０８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４５２４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１５０８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５３５３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７８５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．９６２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２２０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２７１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９０５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２８００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４６１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３３５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４８３４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４５２３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１５０８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５１３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１７１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１１５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３８５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４９８７－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９５７３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１９４５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６４９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２１７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２５４８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８５０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２９０５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９６９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４６８９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１５６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４９７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１１８４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２１３７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７１３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３２１７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０７３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３５２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１７５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４７８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５８００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６４７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１６０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７０３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７４９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２４９９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７５０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２５０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７８８７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８９１０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２９７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９１３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９７３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３２４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５８２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７９６３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２６５５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８６９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８９９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８８６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１１１７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３７３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１８２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６０９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２４５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２８８１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３２６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３２８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３４４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１４８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３８７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４５２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５０９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４７５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５３４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５４０４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８０２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５７７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５９９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６４６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７２６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２４２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７３０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２４３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７４７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２４９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７６８１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２５６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７７３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２５８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７８８６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８１４０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２７１４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８３６３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２７８８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８５７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８７７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８８２１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９４１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９１０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９３１７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１０６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９４６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３１５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９５７２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８４９０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２８３０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５９８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７７２１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２５７４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１９６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７６１８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８４８９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２８３０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７８５７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１２６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１４５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３３１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１０７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５７９１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６０７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２０２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７０２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９３８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１２７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８３６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２７８８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７７５８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２５８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２２２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５１０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５９５９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９８７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７０６０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９１００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９１４８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０５０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９８８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３２９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１４１４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４７２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１６８９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５８１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６４９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７８５６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８９７０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２９９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９３７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３１２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１１８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３９７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２８１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２９７９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ９９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３１６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４２８５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６０２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２００９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７８７７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３１０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４２２２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４０８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７４８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２４９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７８７８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９０７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１８５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４１１１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３７１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５６５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７７５７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２５８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８２４３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２７４８Ａｓｐ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８８７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９６０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８４８７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８６７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２５０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６１２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２０４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７６１７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８５７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８５９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８１７４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２７２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３１８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９３８１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１２７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２０９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６９９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１６４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５４８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８６０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３４１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４２４６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４１６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６４７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１５９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７３６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２４５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７５１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２５０６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８９６９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２９９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６４８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２９７８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ９９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７６１５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２５３９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９１０６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０３６Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、乳房卵巣癌を治療または予防する方法に関する。
リンチ症候群
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、リンチ症候群に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＭＳＨ６、ＭＳＨ２、ＥＰＣＡＭ、ＰＭＳ２、及びＭＬＨ１から選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．１０４５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３４９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１３８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００２３５４．２（ＥＰＣＡＭ）：ｃ．１３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００２３５４．２（ＥＰＣＡＭ）：ｃ．４２９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１４３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００２３５４．２（ＥＰＣＡＭ）：ｃ．５２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２６８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．３５０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１１７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２７３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ９１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３５５６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．３８８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．１９１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．１８９１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．４５４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１０３０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３４４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２３３０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２１９１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２７６４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９２２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２８１５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９３９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３０２０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１００７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３４３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１４６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３６４７－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３７７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３８３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．７０６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．７３０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２４４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１１７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１１９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１２２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４０９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１２７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１５２８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５１０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１６０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１６１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１６１４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１６２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１６８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１７３１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１７３１＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１７３２－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１８９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ６３２＝）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１９８９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１９９０－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１９９８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ６６６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２０８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２１０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２１３６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２２２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２３０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ７７Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．４３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．４４５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．５４５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１８２Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．７３１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２４４Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．８４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ２８１Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．８８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｌｅｕ２９４＝）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．９０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１０１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ３３８Ｇｌｕ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１０３４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１１２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１１８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１１８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３９７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１２０４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４０２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１２７６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１５２８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５１０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１５５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１７２０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５７４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１７７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１８８５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２０８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ６９６Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２２５１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ７５１Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２２９１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２２９２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２４４６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８１６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２４７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２５３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８４６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２５８１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２６３４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ８７８＝）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２６３５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８７９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．４７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．４７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．４８４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１６２Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．４９０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１６４Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．５４７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．５７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．６４３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．６４５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．６５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．７５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２５２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．７９２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．９４２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｎ３１４＝）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．９４９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３１７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．３０６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．６２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ２１Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１８６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ６２２Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．４２６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．７１５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．３５０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１１７Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１９１５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｈｉｓ６３９Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２７８５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ４４Ｐｈｅ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１２１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４０７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．３０６＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１８０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．１１４４＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１９８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．３８１－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．６３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．７９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．３６６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１００Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３０１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１００５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．６９４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．７４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２４８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１０３９－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１７９０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５９７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１９６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ６５４Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２１０３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２１３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．５８８＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．７９０＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１０３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１２５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１８６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２２６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２６５３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８８５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．５０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．８６２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．８９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．９７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．４００１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１３３４Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１６６２－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．１８８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６２８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．２１７４＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．２４０４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８０２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３９９１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１３３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２５０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．７１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１０３８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｎ３４６＝）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２４５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ８２Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ２８Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．８８４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｓｅｒ２９５Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．９８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３２８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１０４６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ３４９Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１１２０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３７４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１２８５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１４７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２１５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．７０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２１４１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７１４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１００９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１２１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４０６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３２０２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０６８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１１６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１９４３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ６４８Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２００Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ６７Ｇｌｕ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．７９３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２６５Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２０５９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６８７Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．６７７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２２６Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２０４１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ６８１Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１９４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ６４８Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．６７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２０３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．１４８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２１９４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７３２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３１０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．８９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１４５９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４８７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１７３１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｓｅｒ５７７＝）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１９７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６５９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１９９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ６７Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１０７６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１１４７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３８３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１８１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２１２－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２１３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．６９７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．１２６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２０４７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ６８３Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．４００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．１９２７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６４３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．１４４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２７３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．９４３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３１５Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＫＤＨＢ、ＤＢＴ、及びＤＬＤから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、リンチ症候群を治療または予防する方法に関する。
他の遺伝性疾患
追加の遺伝性疾患に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰはまた、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告され、表Ａに開示されており、マルファン症候群、ハーラー症候群、グリコーゲン貯蔵病、及び嚢胞性線維症が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明の態様は、以下に記載するこれらの疾患のいずれかに関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する方法に関する。
マルファン症候群
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、マルファン症候群に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＦＢＮ１遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１８７９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６２７Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１０５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３５１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６２Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．２８５５－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．３１６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ１０５５Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．３６８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ１２３Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４９５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ１６５２Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．７１８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２３９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．８２６７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２７５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１４９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ４９９Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．６８８６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２２９６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．３３７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．６４０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２１４Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．５０３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４３４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ１４５Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．２５６３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８５５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．７４６６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ２４８９Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．２０８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６９７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．５９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．６６９５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ２２３２Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．６１６４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．５６２７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ１８７６Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４０６１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１３５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１９８２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ６６１Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．６７８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２２６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．３６４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１２２Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．３２１７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ１０７３Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４４６０－８Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４７８６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５９６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．７８０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６０２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．２４７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．２４９５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ８３２Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４９３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．５５０４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ１８３５Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．５８６３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９５５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．６６５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２２２０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．７６０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２５３６Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．７９５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ２６５２Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．３０３７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１０１３Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．８０８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２６９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１６３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５４５Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．７２０５－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４６２１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５４１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１０９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１５８５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４７８１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１５９４Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．６４３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２１５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．３６６８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ１２２３Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．８３２６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２７７６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．６３５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｉｌｅ２１１８＝）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１４６８＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１５４６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５１６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４６１５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５３９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．５３６８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１７９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１２８５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４２９Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＦＢＮ１遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、マルファン症候群を治療または予防する方法に関する。
ハーラー症候群
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、ハーラー症候群に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、少なくともＩＤＵＡ遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）：ｃ．９７２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）：ｃ．１８５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）：ｃ．１５２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ５１Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）：ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）：ｃ．２０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）：ｃ．１０４５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ３４９Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）：ｃ．１６５０＋５Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＩＤＵＡ遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、ハーラー症候群を治療または予防する方法に関する。
グリコーゲン貯蔵病
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、グリコーゲン貯蔵病に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＧＡＡ、ＡＧＬ、ＰＨＫＢ、ＰＲＫＡＧ２、Ｇ６ＰＣ、ＰＧＡＭ２、ＧＢＥ１、ＰＹＧＭ、及びＰＦＫＭから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１９２７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ６４３Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．２１７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７２５Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．３９８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１３２７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．２０３９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ６８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２９３．２（ＰＨＫＢ）：ｃ．１５４６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５１６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１６２０３．３（ＰＲＫＡＧ２）：ｃ．１５９２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ５３１Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００１５１．３（Ｇ６ＰＣ）：ｃ．２４８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ８３Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００１５１．３（Ｇ６ＰＣ）：ｃ．７２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１５１．３（Ｇ６ＰＣ）：ｃ．８８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９５Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００１５１．３（Ｇ６ＰＣ）：ｃ．２４７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８３Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００１５１．３（Ｇ６ＰＣ）：ｃ．１０３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１５６１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ５２１Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．２５９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．３６８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１２２８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．１１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．２５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．２６８１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．２１５８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２９０．３（ＰＧＡＭ２）：ｃ．２３３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１５４８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５１６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．２０１４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６７２Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．５４６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｈｒ１８２＝）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１８０２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ６０１Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１７５４＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１０８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ３６１Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．２５６０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．６５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２１９Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１９３３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ６４５Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１９７９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ６６０Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１４６５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ４８９Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．２５１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１５８．３（ＧＢＥ１）：ｃ．１５４３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５１５Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００５６０９．３（ＰＹＧＭ）：ｃ．１７２６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５７６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００５６０９．３（ＰＹＧＭ）：ｃ．１８２７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｌｙｓ６０９＝）
ＮＭ＿００５６０９．３（ＰＹＧＭ）：ｃ．１４８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００５６０９．３（ＰＹＧＭ）：ｃ．６１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２０５Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００５６０９．３（ＰＹＧＭ）：ｃ．１３６６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ４５６Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００５６０９．３（ＰＹＧＭ）：ｃ．１７６８＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００１１６６６８６．１（ＰＦＫＭ）：ｃ．４５０＋１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＧＡＡ、ＡＧＬ、ＰＨＫＢ、ＰＲＫＡＧ２、Ｇ６ＰＣ、ＰＧＡＭ２、ＧＢＥ１、ＰＹＧＭ、及びＰＦＫＭから選択される少なくとも１つの遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、ならびにより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、グリコーゲン貯蔵病を治療または予防する方法に関する。
嚢胞性線維症
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、嚢胞性線維症に関連する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、病原性突然変異／ＳＮＰは、ＣＦＴＲ遺伝子に存在し、少なくとも以下のものが挙げられる：
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３７１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３４８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１７６６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１４７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２５３８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ８４６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２５５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８５１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３４７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１４７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ４９２Ｐｈｅ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６７９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ５６０Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３１９７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１０６６Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３８７３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３１９６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０６６Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２４９０＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３７１８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１７１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３９３７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３１３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２７４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ９２Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１０１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ３３８Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３２６６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１０８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１０５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３５２Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５５２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２６６８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３６１１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１２０４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１５８５－８Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６８０－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３４９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１７Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１２０３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１２４０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４１４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１２０２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１２０９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１１５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１１１６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１３９３－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１５７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６４＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ５６Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１７０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２０５３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６８５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２１２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７０９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２２９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２３５３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７８５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２３７４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７９２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２５３７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ８４６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２９８９－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３２９３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１０９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．４１４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．４２３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．４２３４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．５７９＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．５９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｈｉｓ１９９Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．６１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ２０５Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．６５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２２０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１１１７－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３２９４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１０９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１８６５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ６２２Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．７４３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６７９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６５７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６７５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ５５９Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６５－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ６７Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２８３４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ９４５Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３８４６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１２８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６５２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ５５１Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．４４２６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４７６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３：ｃ．３７１８－２４７７Ｃ＞Ｔ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２９８８＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２６５７＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２９８８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｎ９９６＝）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２７４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３６１２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１２０４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６４６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｓｅｒ５４９Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３７５２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｓｅｒ１２５１Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．４０４６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１３４９Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．５３２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１７８Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３７３１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１２４４Ｇｌｕ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６５１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ５５１Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１５８５－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１０００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３３４Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２５４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ８５Ｇｌｕ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１０４０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３４７Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２７３＋１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。従って、本発明の態様は、１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、特に、ＣＦＴＲ遺伝子に存在する１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰ、及びより詳細には、上述の１つ以上の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ突然変異／ＳＮＰを補正することによって、嚢胞性線維症を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性２型乳癌卵巣癌に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ２遺伝子（ＨＧＶＳ：Ｕ４３７４６．１：ｎ．７８２９＋１Ｇ＞Ａ）に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性２型乳癌卵巣癌を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、遺伝性第ＩＸ因子欠乏症に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、Ａｒｇ→Ｇｌｎ置換をもたらすＦ９遺伝子中のＧＲＣｈ３８：ＣｈｒＸ：１３９５３７１４５に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、遺伝性第ＩＸ因子欠乏症を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、ベータプラスサラセミア、ベータサラセミア、及びベータサラセミアメジャーに関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＨＢＢ遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１１：５２２６８２０に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、ベータプラスサラセミア、ベータサラセミア、及びベータサラセミアメジャーを治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、マルファン症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０００；４５（２）：１１５－８に報告されるように、ＦＢＮ１遺伝子（ＩＶＳ２ＤＳ、Ｇ－Ａ、＋１）に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、マルファン症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、Ｋｗａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）に報告されるように、ＷＡＳ遺伝子のイントロ６の－１位（ＩＶＳ６ＡＳ、Ｇ－Ａ、－１）に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、ウィスコット・アルドリッチ症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、嚢胞性線維症に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＣＦＴＲ遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ７：１１７５９０４４０に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、嚢胞性線維症を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、嚢胞性線維症及び遺伝性膵炎に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＣＦＴＲ遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ７：１１７６０６７５４に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、嚢胞性線維症及び遺伝性膵炎を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、嚢胞性線維症に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＣＦＴＲ遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ７：１１７５８７７３８に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、嚢胞性線維症を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、ターコット症候群及びリンチ症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＭＳＨ２遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ２：４７４７０９６４に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、ターコット症候群及びリンチ症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、嚢胞性線維症に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＣＦＴＲ遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ７：１１７６４２４３７に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、嚢胞性線維症を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、リンチ症候群ＩＩ及びリンチ症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＭＬＨ１遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ３：３７００１０５８に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、リンチ症候群ＩＩ及びリンチ症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、嚢胞性線維症に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＣＦＴＲ遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ７：１１７６４２５９４に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、嚢胞性線維症を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、嚢胞性線維症に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＣＦＴＲ遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ７：１１７５９２６５８に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、嚢胞性線維症を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性１型乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性がん素因症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０５７０５１に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性１型乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性がん素因症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、ジヒドロピリミジン脱水素酵素欠損症、ヒルシュスプルング病１、フルオロウラシル応答、ピリミジン類似体応答－毒性／ＡＤＲ、カペシタビン応答－毒性／ＡＤＲ、フルオロウラシル応答－毒性／ＡＤＲ、テガフール応答－毒性／ＡＤＲに関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＤＰＹＤ遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１：９７４５００５８に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、ジヒドロピリミジン脱水素酵素欠損症、ヒルシュスプルング病１、フルオロウラシル応答、ピリミジン類似体応答－毒性／ＡＤＲ、カペシタビン応答－毒性／ＡＤＲ、フルオロウラシル応答－毒性／ＡＤＲ、テガフール応答－毒性／ＡＤＲを治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、リンチ症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＭＳＨ２遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ２：４７４７８５２０に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、リンチ症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、リンチ症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＭＬＨ１遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ３：３７０１１８１９に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、リンチ症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、リンチ症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＭＬＨ１遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ３：３７０１４５４５に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、リンチ症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、リンチ症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＭＬＨ１遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ３：３７０１１８６７に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、リンチ症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、リンチ症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＭＬＨ１遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ３：３７０２５６３６に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、リンチ症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、リンチ症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＭＬＨ１遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ３：３７００４４７５に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、リンチ症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、リンチ症候群及び遺伝性がん素因症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＭＳＨ２遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ２：４７４１６４３０に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、リンチ症候群及び遺伝性がん素因症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、リンチ症候群及び遺伝性がん素因症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＭＳＨ２遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ２：４７４０８４００に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、リンチ症候群及び遺伝性がん素因症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、リンチ症候群及び遺伝性がん素因症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＭＬＨ１遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ３：３６９９６７１０に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、リンチ症候群及び遺伝性がん素因症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性１型乳癌卵巣癌に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０６７６９６に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性１型乳癌卵巣癌を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性２型乳癌卵巣癌及び遺伝性乳癌卵巣癌症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ２遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１３：３２３５６６１０に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性２型乳癌卵巣癌及び遺伝性乳癌卵巣癌症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、原発性拡張型心筋症及び原発性家族性肥大型心筋症に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＭＹＨ７遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１４：２３４１９９９３に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、原発性拡張型心筋症及び原発性家族性肥大型心筋症を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、原発性家族性肥大型心筋症、腰曲がり病、及び肥大型心筋症に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＭＹＨ７遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１４：２３４１５２２５に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、原発性家族性肥大型心筋症、腰曲がり病、及び肥大型心筋症を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性乳癌、家族性２型乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性がん素因症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ２遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１３：３２３５７７４１に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性乳癌、家族性２型乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性がん素因症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、原発性拡張型心筋症、肥大型心筋症、心筋症、及び左室緻密化障害に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＭＹＨ７遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１４：２３４３１５８４に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、原発性拡張型心筋症、肥大型心筋症、心筋症、及び左室緻密化障害を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性１型乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性がん素因症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０６７６０７に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性１型乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性がん素因症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性１型乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、遺伝性がん素因症候群、及び乳癌に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０４７６６６に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性１型乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、遺伝性がん素因症候群、及び乳癌を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性２型乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性がん素因症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ２遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１３：３２３７０５５８に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性２型乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性がん素因症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性１型乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、遺伝性がん素因症候群、及び乳癌に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０７４３３０に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性１型乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、遺伝性がん素因症候群、及び乳癌を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性１型乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性がん素因症候群に関連すると思われる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０８２４０３に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性１型乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性がん素因症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、嚢胞性線維症及び遺伝性膵炎に関連すると思われる病原性Ｃ→Ｔ（Ｃ＞Ｔ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰは、ＣＦＴＲ遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ７：１１７６３９９６１に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、嚢胞性線維症及び遺伝性膵炎を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性２型乳癌卵巣癌に関連すると思われる病原性Ｃ→Ｔ（Ｃ＞Ｔ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ２遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１３：３２３３６４９２に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性２型乳癌卵巣癌を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性１型乳癌卵巣癌に関連すると思われる病原性Ｃ→Ｔ（Ｃ＞Ｔ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０６３３６５に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性１型乳癌卵巣癌を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性１型乳癌卵巣癌に関連すると思われる病原性Ｃ→Ｔ（Ｃ＞Ｔ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０９３６１３に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性１型乳癌卵巣癌を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性乳癌、及び家族性１型乳癌卵巣癌に関連すると思われる病原性Ｃ→Ｔ（Ｃ＞Ｔ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０９３９３１に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性乳癌、及び家族性１型乳癌卵巣癌を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性肥大型心筋症１型、原発性家族性肥大型心筋症、及び肥大型心筋症に関連すると思われる病原性Ｃ→Ｔ（Ｃ＞Ｔ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰは、ＭＹＨ７遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１４：２３４２９２７９に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性肥大型心筋症１型、原発性家族性肥大型心筋症、及び肥大型心筋症を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性２型乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性がん素因症候群に関連すると思われる病原性Ｃ→Ｔ（Ｃ＞Ｔ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ２遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１３：３２３５６４７２に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性２型乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性がん素因症候群を治療または予防する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、家族性肥大型心筋症１型、原発性家族性肥大型心筋症、家族性拘束型心筋症、及び肥大型心筋症に関連すると思われる病原性Ｃ→Ｔ（Ｃ＞Ｔ）突然変異またはＳＮＰを補正し、病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰは、ＭＹＨ７遺伝子中のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１４：２３４２９００５に位置する。従って、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰを補正することによって、家族性肥大型心筋症１型、原発性家族性肥大型心筋症、家族性拘束型心筋症、及び肥大型心筋症を治療または予防する方法に関する。
追加の病原性Ａ＞Ｇ突然変異及びＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースで見られる。従って、本開示の追加の態様は、疾患またはそれに関連する状態を治療または予防するための、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を用いた、ＣｌｉｎＶａｒに記載の病原性Ａ＞Ｇ突然変異またはＳＮＰの補正に関する。
追加の病原性Ｃ＞Ｔ突然変異及びＳＮＰはまた、ＣｌｉｎＶａｒデータベースで見られる。従って、本開示の追加の態様は、疾患またはそれに関連する状態を治療または予防するための、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を用いた、ＣｌｉｎＶａｒに記載の病原性Ｃ＞Ｔ突然変異またはＳＮＰの補正に関する。
一態様では、本明細書に記載される本発明は、Ｔ（Ｕ）→ＣまたはＡ→Ｇ点突然変異または病原性一塩基多型（ＳＮＰ）によって引き起こされるかまたは引き起こされる可能性が高い病的状態を治療及び／または予防すること目的として、標的遺伝子座でシチジン残基を修飾する方法を提供する。
様々な疾患に関連する病原性Ｔ（Ｕ）→ＣまたはＡ→Ｇ突然変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースで報告されており、遺伝性疾患、がん、代謝性疾患、またはリソソーム蓄積症が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明の態様は、以下に記載するこれらの疾患のいずれかに関連する１つ以上の病原性Ｔ（Ｕ）→ＣまたはＡ→Ｇ突然変異／ＳＮＰを補正する方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告されている１つ以上の病原性Ｔ（Ｕ）→ＣまたはＡ→Ｇ突然変異／ＳＮＰを補正する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、「Ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題されたＷＯ２０１７／０７０６３２に開示される疾患または障害のいずれかに関連する１つ以上の病原性Ｔ（Ｕ）→ＣまたはＡ→Ｇ突然変異／ＳＮＰを補正する。その全体を参照により本明細書に組み込む。治療され得る例示的な疾患または障害としては、限定なしに、３－メチルグルタコン酸尿症２型、４６，ＸＹ性腺異形成、４－アルファ－ヒドロキシフェニルピルビン酸ヒドロキシラーゼ欠損症、６－ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素欠損症、色盲、酸不安定サブユニット欠損症、先端異骨症、手掌角化症、ＡＣＴＨ不応症、ＡＣＴＨ非依存性大結節性副腎皮質過形成、活性化ＰＢＫデルタ症候群、急性間欠性ポルフィリン症、急性骨髄性白血病、アダムズ・オリバー症候群１／５／６、アデニロコハク酸リアーゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、成人型神経セロイドリポフスチン症、眼球運動失行を伴う成人発症型失調症、睡眠相前進症候群、加齢黄斑変性、アラジール症候群、アレキサンダー病、アラン・ハーンドン・ダドリー症候群、Ｘ連鎖劣性アルポート症候群、小児交互性片麻痺、肺静脈のアラインメント不整を伴う肺胞毛細血管異形成、エナメル質形成不全症、アミロイド形成性トランスサイレチンアミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症、貧血（Ｇ６ＰＤ欠損症による非球状溶血性）、貧血（鉄芽球性、ピリドキシン不応性、常染色体劣性）、無爪症、アンチトロンビンＩＩＩ欠損症、大動脈瘤、再生不良性貧血、アポリポ蛋白質Ｃ２欠損症、見かけ上のミネラルコルチコイド過剰、アロマターゼ欠損症、不整脈原性右室心筋症、家族性肥大型心筋症、肥大型心筋症、先天性多発性関節拘縮症、アスパルチルグルコサミン尿症、窒息性胸郭ジストロフィー、ビタミンＥ欠損を伴う運動失調、運動失調（痙性）、心房細動、心房中隔欠損、非典型溶血性尿毒症症候群、常染色体優性ＣＤ１１Ｃ＋／ＣＤ１Ｃ＋樹状細胞欠損症、ミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性進行性外眼筋麻痺、バライトサー・ウィンター症候群、バーター症候群、基底核石灰化、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、良性家族性新生児痙攣、良性型肩甲腓骨型筋ジストロフィー、ベルナール・スーリエ症候群、ベータサラセミア・インターメディア、ベータ－Ｄ－マンノシドーシス、ビエッティクリスタリン角膜網膜ジストロフィー、胆汁酸吸収不良、ビオチニダーゼ欠損症、ベルエソン・フォルスマン・レーマン症候群、ブーシェ・ノイハウザー症候群、ボーエン・コンラディ症候群、短指症、ブラウン・ヴィアレット・ファンラール症候群、ブルガダ症候群、心臓不整脈、心臓顔皮膚症候群、心筋症、カルネヴァーレ症候群、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＩ欠損症、カーペンター症候群、白内障、カテコラミン誘発多形性心室頻拍、セントラルコア病、染色体１、９及び１６のセントロメア不安定性及び免疫不全、常染色体優性脳動脈症、脳・眼・顔・骨格症候群、セロイドリポフスチン症、シャルコー・マリー・トゥース病、コレスタノール蓄積症、軟骨石灰化症、軟骨異形成症、慢性進行性多発性硬化症、コエンザイムＱ１０欠損症、コーエン症候群、第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子複合欠損症、複合免疫不全、複合型酸化的リン酸化欠損症、複合型部分１７－アルファ－ヒドロキシラーゼ／１７，２０－リアーゼ欠損症、補体ｄ因子欠損症、複合型完全１７－アルファ－ヒドロキシラーゼ／１７，２０－リアーゼ欠損症、桿体錐体ジストロフィー、先天性拘縮性クモ状指趾症、グリコシル化の先天性異常、先天性脂肪腫性過成長、卵巣の新生物、ＰＩＫ３ＣＡ関連過成長スペクトラム、先天性ＱＴ拡張症候群、先天性筋ジストロフィー、先天性筋肥大・脳症候群、先天性筋無力症候群、線維タイプ不均等症を伴う先天性ミオパチー、アイヒスフェルト型先天性筋ジストロフィー、先天停止性夜盲、角膜ジストロフィー、コルネリア・デランゲ症候群、頭蓋骨幹端骨異形成症、クリグラー・ナジャール症候群、クルーゾン症候群、骨ジストロフィーを伴う皮膚弛緩症、チアノーゼ、嚢胞性線維症、シスチン症、チトクロムｃオキシダーゼ欠損症、ミトコンドリア複合体Ｉ欠損症、Ｄ－２－ヒドロキシグルタル酸尿症、ダノン病、迷路形成不全、小耳、及び小歯症を伴う難聴（ＬＡＭＭ）、難聴、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ欠損症、フェロキシダーゼ欠損症、ＵＤＰ－グルコース－ヘキソース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ欠損症、デジェリン・ソッタス病、デビュクオア症候群、ＤＦＮＡ、糖尿病２型、糖尿病・難聴症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、捻曲性骨異形成症、ジヒドロプテリジン還元酵素欠損症、ジヒドロピリミジナーゼ欠損症、拡張型心筋症、播種性非定型マイコバクテリア感染、遠位型関節拘縮症、遠位遺伝性運動ニューロパチー、ドナイ－バロー症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、遺伝性汎発性色素異常症、先天性角化不全症、ジストニア、早期乳児てんかん性脳症、エーラス・ダンロス症候群、アイヒスフェルト型先天性筋ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー、エナメル腎症候群、反対型栄養障害型表皮水疱症、疱疹状表皮水疱症、てんかん、反復発作性運動失調、変動性紅斑角皮症、赤芽球性プロトポルフィリン症、運動不耐、滲出性硝子体網膜症、ファブリー病、第Ｖ因子欠損症、第ＶＩＩ因子欠損症、第ｘｉｉｉ因子欠損症、家族性大腸腺腫症、乳癌、卵巣癌、寒冷蕁麻疹、慢性乳児神経皮膚関節症候群、片麻痺性片頭痛、高コレステロール血症、肥大型心筋症、低アルファリポ蛋白血症、低カリウム血症・低マグネシウム血症、若年性痛風、高リポ蛋白血症、限局性アミロイドーシス、ビタミンＤ不応性低リン血症性くる病、ＦＧ症候群、外眼筋線維症、フィンランド型先天性ネフローゼ症候群、焦点性てんかん、巣状分節性糸球体硬化症、前頭鼻異形成、前頭側頭型認知症、フルクトースビスホスファターゼ欠損症、ガムストープ・ウォールファールト症候群、ガングリオシドシアリダーゼ欠損症、ＧＡＴＡ１関連血小板減少症、ゴーシェ病、巨大軸索性ニューロパチー、グランツマン血小板無力症、糸球体嚢胞腎、糸球体症、グルココルチコイド不応症、グルコース－６－リン酸輸送障害、グルタル酸尿症、糖原病、ゴーリン症候群、全前脳胞症、ＧＲＡＣＩＬＥ症候群、出血性末梢血管拡張症、ヘモクロマトーシス、ヘモグロビンＨ症、溶血性貧血、血球貪食症候群、結腸の癌腫、マイアー症候群、白質脳症、遺伝性第ＩＸ因子欠乏症、遺伝性第ＶＩＩＩ因子欠乏症、遺伝性第ＸＩ因子欠損症疾患、遺伝性フルクトース尿症、遺伝性非ポリポーシス大腸新生物、遺伝性膵炎、遺伝性熱変形赤血球症、楕円赤血球症、ヘテロタキシー、異所性灰白質、組織球・骨髄細網症、組織球症・リンパ節腫大プラス症候群、アルドラーゼＡ欠損によるＨＮＳＨＡ、ホロカルボキシラーゼ合成酵素欠損症、ホモシステイン血症、ハウエル・エバンス症候群、胞状奇胎、高カルシウム尿性高カルシウム血症、高免疫グロブリンＤ、メバロン酸尿症、高インスリン血性低血糖症、高カリウム性周期性四肢麻痺、フォン・オイレンブルクの先天性パラミオトニー、高リポ蛋白血症、高マンガン血症、高メチオニン血症、高リン血症、高血圧、低マグネシウム血症、低ベータリポ蛋白血症、低カルシウム血症、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、低汗性外胚葉形成不全症、高ＩｇＭ免疫不全、低汗性Ｘ連鎖外胚葉形成不全症、低マグネシウム血症、副甲状腺機能低下症、特発性肺線維症、免疫不全、免疫グロブリンＡ欠損症、乳児低ホスファターゼ症、乳児ジストニア・パーキンソニズム、インスリン依存型糖尿病、中間型メープルシロップ尿症、坐骨膝蓋骨異形成、膵島細胞過形成、成長ホルモン単独欠損症、ルトロピン単独欠損症、イソ吉草酸血症、ジュベール症候群、若年性ポリポーシス症候群、若年網膜分離症、カルマン症候群、カルタゲナー症候群、クーゲルベルグ・ウェランダー病、格子状角膜ジストロフィー、レーバー先天性黒内障、レーバー遺伝性視神経萎縮症、左室緻密化障害、リー症候群、ミトコンドリア複合体Ｉ欠損症、妖精症、関節拘縮症、前角細胞病、白血球粘着不全症、白質ジストロフィー、白質脳症、卵巣白質ジストロフィー、Ｌ－フェリチン欠損症、リ・フラウメニ症候群、肢帯型筋ジストロフィー－ジストログリカノパチー、ロイス・ディーツ症候群、ＱＴ拡張症候群、大頭症／自閉症症候群、黄斑角膜ジストロフィー、黄斑ジストロフィー、悪性高熱症素因、前立腺の悪性腫瘍、メープルシロップ尿症、マーデンウォーカー様症候群、マルファン症候群、マリー・ウンナ遺伝性乏毛症、マスト細胞症、胎便関連性腸閉塞、中鎖アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症、メルニック・フレイザー症候群、精神遅滞、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、中皮腫、異染性白質ジストロフィー、骨幹端軟骨異形成症、メトヘモグロビン血症、メチルマロン酸尿症、ホモシスチン尿症、小頭症、脈絡網膜症、リンパ浮腫、小眼球症、軽症型非ＰＫＵ型高フェニルアラニン血症、ミッチェル・ライリー症候群、ミトコンドリア３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ欠損症、ミトコンドリア複合体Ｉ欠損症、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症、ミトコンドリアミオパチー、ムコリピドーシスＩＩＩ、ムコ多糖症、多種スルファターゼ欠損症、筋無力症候群、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ミエロペルオキシダーゼ欠損症、マイアー症候群、ミオクロニーてんかん、筋原線維性ミオパチー、ミオグロビン尿症、ミオパチー、近視、先天性ミオトニー、ナバホ神経肝症、ネマリンミオパチー、胃の新生物、腎性尿崩症、ネフロン癆、ネフローゼ症候群、神経線維腫症、中性脂肪蓄積症、ニーマン・ピック病、非ケトーシス型高グリシン血症、ヌーナン症候群、ヌーナン症候様異常、ノーラム病、黄斑変性、Ｎ末端アセチルトランスフェラーゼ欠損症、眼皮膚白皮症、眼歯指異形成、大堂症候群、視神経無形成、オルニチンカルバモイル基転移酵素欠損症、口腔顔面指趾症候群、骨形成不全症、大理石骨病、卵巣形成不全、爪甲肥厚、非表皮融解性掌蹠角化症、パピヨン・ルフェーブル症候群、ハイム・ムンク症候群、歯周炎、ピーリングスキン症候群、ペンドレッド症候群、ペルオキシソーム脂肪酸アシルＣｏＡレダクターゼ１異常、ペルオキシソーム生合成異常、ファイファー症候群、フェニルケトン尿症、フェニルケトン尿症、非ＰＫＵ型高フェニルアラニン血症、下垂体ホルモン欠損症、毛孔性紅色粃糠疹、結節性多発動脈炎、多発性嚢胞腎、多嚢胞性脂肪膜性骨異形成症、多小脳回症、橋小脳低形成症、汗孔角化症、脊髄後索型運動失調、原発性肢端紅痛症、高シュウ酸尿症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、進行性偽リウマチ性異形成症、プロピオン酸血症、仮性半陰陽、偽性低アルドステロン症、弾性線維性仮性黄色腫様異常、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症、ピリドキサール－５－リン酸依存性てんかん、腎異形成、網膜色素変性、小脳性運動失調、骨異形成、細網異形成症、網膜色素変性、アッシャー症候群、網膜芽細胞腫、網膜症、ＲＲＭ２Ｂ関連ミトコンドリア病、ルビンスタイン・テイビ症候群、シュナイダークリスタリン角膜ジストロフィー、脂腺腫瘍、重症先天性好中球減少症、乳児重症ミオクロニーてんかん、重症Ｘ連鎖ミオチュブラーミオパチー、指爪甲形成不全症、顔面異形、乏毛症、短肋骨胸郭異形成症、シアル酸蓄積症、シアリドーシス、鉄芽球性貧血、小径線維ニューロパチー、スミス・マゲニス症候群、
ソースビー眼底ジストロフィー、痙性運動失調、痙性対麻痺、精子形成不全、球状赤血球症、スフィンゴミエリン／コレステロールリピドーシス、脊髄小脳性運動失調、裂手裂足症、脊椎骨端骨幹端異形成症、致死性扁平椎異形成症、頭頸部の扁平上皮癌、スターガルト病、スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、乳幼児突然死症候群、大動脈弁上部狭窄症、サーファクタント代謝異常、タンジール病、タットン・ブラウン・ラーマン、胸部大動脈瘤及び大動脈解離、血栓傾向、甲状腺ホルモン不応症、ＴＮＦ受容体関連周期性発熱症候群（ＴＲＡＰＳ）、歯数不足症、トルサード・ド・ポワント、大血管転位、トリーチャー・コリンズ症候群、結節性硬化症症候群、チロシナーゼ陰性型眼皮膚白皮症、チロシナーゼ陽性型眼皮膚白皮症、チロシン血症、ＵＤＰグルコース－４－エピメラーゼ欠損症、ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー、ベスレムミオパチー、アッシャー症候群、ＵＶ高感受性症候群、ファンデルワウデ症候群、膝窩翼状片症候群、極長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、膀胱尿管逆流症、硝子体網膜脈絡膜症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、フォン・ヴィレブランド病、ワールデンブルグ症候群、ワルシャワ染色体不安定症候群、ＷＦＳ１関連異常、ウィルソン病、色素性乾皮症、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖遺伝性運動感覚ニューロパチー、Ｘ連鎖重症複合免疫不全、ならびにツェルウェーガー症候群が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、以下の表で提供される、１つ以上の病原性Ｔ（Ｕ）→ＣまたはＡ→Ｇ突然変異／ＳＮＰを補正する。
Figure 2023134462000033
いくつかの例示の実施形態は、以下の番号付けした段落で記載される。
１．ａ）ターゲティング成分または前記ターゲティング成分をコードするヌクレオチド配列、及びｂ）塩基編集成分または前記塩基編集成分をコードするヌクレオチド配列を含む、標的遺伝子座で核酸を改変するのに好適なエンジニアリングされた天然に存在しない系。
２．前記ターゲティングドメインが、ＤＮＡ結合タンパク質もしくはその機能性部分、またはＲＮＡ結合タンパク質もしくはその機能性部分である、段落１に記載の系。
３．前記ＤＮＡ結合タンパク質が、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１であり、前記系が、ガイド配列を含むガイド分子、または前記ガイド分子をコードするヌクレオチドをさらに含む、段落２に記載の系。
４．前記ＲＮＡ結合タンパク質が、Ｃａｓ１３タンパク質であり、前記系が、ガイド配列を含むガイド分子、または前記ガイド分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、段落２に記載の系。
５．前記Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、またはＣａｓ１３が、失活Ｃａｓ９、失活Ｃｐｆ１、または失活Ｃａｓ１３である、段落３または４に記載の系。
６．前記塩基編集成分が、アデノシンデアミナーゼまたはその触媒ドメインである、先行段落のいずれか１つに記載の系。
７．前記アデノシンデアミナーゼまたはその触媒ドメインが、前記ターゲティング成分に融合される、段落１に記載の系。
８．前記アデノシンデアミナーゼまたはその触媒ドメインが、リンカーによって前記ターゲティング成分に融合される、段落６に記載の系。
９．前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、ヒト、頭足類、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインである、先行段落のいずれか１つに記載の系。
１０．前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、ｈＡＤＡＲ２－Ｄアミノ酸配列のグルタミン酸４８８、または相同ＡＤＡＲタンパク質の対応する位置で突然変異を含むように改変されている、先行段落のいずれか１つに記載の系。
１１．４８８位または相同ＡＤＡＲタンパク質の対応する位置の前記グルタミン酸残基が、グルタミン残基（Ｅ４８８Ｑ）に置換される、段落１０に記載の系。
１２．前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、突然変異Ｅ４８８Ｑを含む突然変異型ｈＡＤＡＲ２ｄ、または突然変異Ｅ１００８Ｑを含む突然変異型ｈＡＤＡＲ１ｄである、先行段落のいずれか１つに記載の系。
１３．先行段落のいずれか１つに記載の系をコードする１つ以上のベクターを含む、ベクター系。
１４．段落１～１２のいずれか１つに記載の系を含む、インビトロまたはエキソビボの宿主細胞もしくはその子孫または細胞株もしくはその子孫。
１５．段落１～１２のいずれか１つに記載の系の送達を含む、標的遺伝子座のプログラム可能なかつ標的化された塩基編集の方法。
１６．目的の前記標的配列を決定すること、及び前記標的配列に存在する前記アデニンを最も効率的に脱アミノ化する前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを選択することをさらに含む、段落１５に記載の方法。
１７．目的の前記標的ＲＮＡ中の前記アデニンの前記脱アミノ化が、病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ点突然変異を含む転写物によって引き起こされる疾患を治す、段落１６に記載の方法。
１８．前記疾患が、マイヤー－ゴーリン症候群、セッケル症候群４、ジュベール症候群５、レーバー先天性黒内障１０；シャルコー・マリー・トゥース病２型；シャルコー・マリー・トゥース病２型；アッシャー症候群２Ｃ型；脊髄小脳失調症２８；脊髄小脳失調症２８；脊髄小脳失調症２８；ＱＴ拡張症候群２；シェーグレン・ラーソン症候群；遺伝性フルクトース尿症；遺伝性フルクトース尿症；神経芽細胞腫；神経芽細胞腫；カルマン症候群１；カルマン症候群１；カルマン症候群１；異染性白質ジストロフィー、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症１０型、リ・フラウメニ症候群、または表５に記載の疾患から選択される、段落１７に記載の方法。
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
アデニンデアミナーゼ（ＡＤ）は、二本鎖ＲＮＡ中の特異的部位でアデニンを脱アミノ化することができる。
いくつかのＡＤがＤＮＡ－ＲＮＡｎ ＲＮＡ二本鎖に対してアデニン脱アミノ化を施すことができるという事実（例えば、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１７）は、不活性Ｃａｓ１３によるＲＮＡガイドＤＮＡ結合中に形成されたＲループにおいてガイドＲＮＡとその相補性ＤＮＡ標的の間に形成されたＲＮＡ二本鎖を利用することによって、ＲＮＡガイドＡＤを開発する固有の機会を提示する。不活性Ｃａｓ１３を使用して、ＡＤを動員することによって、ＡＤ酵素は次いで、ＲＮＡ－ＤＮＡｎ ＲＮＡ二本鎖中のアデニンに作用するであろう。
一実施形態では、Ｃａｓ１３ｂなどの不活性Ｃａｓ１３は、以下の突然変異：Ｒ１１６Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｒ１１７７Ａ及びＨ１１８２Ａを用いて得られる。ＡＤによる編集の効率を増加させるため、突然変異型ＡＤＡＲ、例えば、突然変異Ｅ４８８Ｑを含む突然変異型ｈＡＤＡＲ２ｄを使用する。
ＡＤを特異的遺伝子座に動員するための設計：
１．ＮＬＳタグ付加不活性Ｃａｓ１３は、ＮまたはＣ末端のいずれかのＡＤに融合される。ＧＳＧ５（配列番号１０）などの可動性リンカーまたはＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲなどの可動性が低いリンカーを含む、様々なリンカーが使用される。
２．ガイドＲＮＡ足場は、ＭＳ２結合部位などのアプタマーで改変される（例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１５）。タンパク質融合物に結合するＮＬＳタグ付加ＡＤ－ＭＳ２は、（ＮＬＳタグ付加不活性またはＣａｓ１３ｂ）及び対応するガイドＲＮＡに沿って、標的細胞に同時導入される。
３．ＡＤは、ＮＬＳタグ付加不活性またはニッカーゼ Ｃａｓ１３の内部ループに挿入される。
ＲＮＡガイドの設計：
１．Ｃａｓ１３タンパク質の天然ガイド配列のものに対応する長さのガイド配列は、目的のＲＮＡを標的化するように設計される。
２．カノニカル長さよりも長いＲＮＡガイドを使用して、タンパク質－ガイドＲＮＡ－標的ＤＮＡ複合体の外にＲＮＡ二本鎖を形成する。
これらのＲＮＡガイド設計ごとに、標的ＲＮＡ鎖上のアデニンの反対側のＲＮＡ上の塩基は、Ｕとは対照的にＣとして特定されるであろう。
ＡＤの選択及び設計：
多くのＡＤを使用し、各々は、活性レベルが変化している。これらのＡＤは、
１．ヒトＡＤＡＲ（ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、ｈＡＤＡＲ３）
２．イカＯｃｔｐｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ＡＤＡＲ
３．イカＳｅｐｉａ ＡＤＡＲ；Ｄｏｒｙｔｅｕｓｔｈｉｓ ｏｐａｌｅｓｃｅｎｓＡＤＡＲ
ＡＤＡＴ（ヒトＡＤＡＴ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＡＤＡＴ）
また、突然変異を使用して、ＤＮＡ－ＲＮＡｎ ＲＮＡ二本鎖に対して反応するＡＤＡＲの活性を増加させることができる。例えば、ヒトＡＤＡＲ遺伝子に対して、ｈＡＤＡＲ１ｄ（Ｅ１００８Ｑ）またはｈＡＤＡＲ２ｄ（Ｅ４８８Ｑ）突然変異を用いて、ＤＮＡ－ＲＮＡ標的に対するそれらの活性を増加させる。
各ＡＤＡＲは、配列の関係要件のレベルが変化している。例えば、ｈＡＤＡＲ１ｄ（Ｅ１００８Ｑ）では、ｔＡｇ及びａＡｇ部位は、効率的に脱アミノ化される一方、ａＡｔ及びｃＡｃは、効率的に編集されず、ｇＡａ及びｇＡｃは、さらに効率的に編集されない。しかしながら、関係要件は、異なるＡＤＡＲごとに変化する。
系の１つのバージョンを示す概略図を図１に提供する。例示のＡＤタンパク質のアミノ酸配列を図４に提供する。
本明細書で例示として記載された実施形態は、本明細書で特に開示されていない任意のエレメント（単数または複数）の存在、限定（単数または複数）なしで、適当に実施されてもよい。従って、例えば、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、拡大して読まれるべきで限定されない。それに加えて、本明細書で使用される用語及び表現は、記載の用語として限定なしで使用されており、示された及び記載された特徴の任意の等価物またはそれらの部分を排除するような用語及び表現の使用の意図はないが、種々の改変が特許請求された技術の可能な範囲内であることが認識されている。それに加えて、語句「から本質的になる」は、特に挙げられたこれらのエレメントならびに特許請求された技術の基本的な及び新規な特性に実質的に影響しない追加のエレメントを含むと理解されるであろう。語句「からなる」は、特定されていないいかなるエレメントも排除する。
本開示は、本願に記載された特定の実施形態の文言に限定されるものではない。当業者にとり明白であるように、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、その多くの改変及び変形が可能である。本明細書において列挙された事柄に加えて、本発明の範囲内のものと、機能的に等価な方法、及び組成物は、先行する記載から、当業者にとり明白であろう。かかる改変及び変形も添付された特許請求の範囲に包含されることが意図される。本開示は、かかる特許請求範囲が、権利を与えられるものに対する等価物の全範囲とともに、添付の特許請求範囲の文言によってのみ限定される。本開示は、もちろん変化することのできる、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物系に限定されるものでないことを理解されたい。本明細書において用いられた専門用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、及び限定することを意図していないことも理解されたい。
加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群の表現で記載されている場合、当業者は、開示が、それによりマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはサブグループに関しても記載されていることを認識するであろう。
当業者により理解されるように、任意の及び全ての目的で、特に書面による明細書を提供することに関して、本明細書において開示される全ての範囲は、任意の及び全ての可能な部分範囲、ならびにその部分範囲の組み合わせも包含する。任意の記載された範囲は、十分に記載するものとして容易に理解され、同じ範囲が、少なくとも等しい二分の一、三分の一、四分の一、五分の一、十分の一等に分割されることを可能にする。非限定例として、本明細書において議論される各範囲は、容易にその下側の三分の一、真ん中の三分の一、及び上側の三分の一等に容易に分割され得る。やはり当業者により理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「を超える」、「未満」等の全ての言い回しは、挙げられた数を含み、上で論じた部分範囲に後で分割され得る範囲を指す。最後に、当業者により理解されるように、範囲は、各々個々のメンバーを含む。
本明細書で言及された全ての出版物、特許出願、発布された特許、及び他の文献は、あたかも各個の出版物、特許出願、発布された特許、または他の文献が、参照によりその全体で組み込まれると具体的に及び個々に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれるテキストに含有される定義は、それらが本開示における定義と矛盾する程度に応じて除外される。
実施例２
Ｃａｓ１３ａ／Ｃａｓ１３ｂ干渉のためのＣｌｕｃ／Ｇｌｕｃタイリング
Ｃａｓ１３ａとＣａｓ１３ｂの間のノックダウン効率を比較するため、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ及びＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ遺伝子を、２４または９６ガイドでそれぞれタイリングした（図１０）。ガイドは、Ｃａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ｂについて一致し、かつ、Ｃａｓ１３ｂのノックダウン効率の増加を示し、遺伝子ごとに１つを除く全てのガイドは、Ｃａｓ１３ｂのより高い効率を示す。
ＮＧＳによるＡＤＡＲ編集定量化
Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ ＲＮＡ編集効率は、ルシフェラーゼの発現を防止する成熟前終止コドンＵＡＧでルシフェラーゼレポーターを設計することによって試験した（図１１Ａ）。長さを変えた７つのガイドを設計し、ＵＡＧにおいてＡに対するＣミスマッチを全て含むＵＡＧ終止コドンに対して位置決めした。Ｃミスマッチは、編集部位でバブルを生成することが知られており、ＡＤＡＲ触媒ドメインには有利である。Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２によるＲＮＡ編集は、ＵＡＧをＵＩＧ（ＵＧＧ）に変換し、終止コドンの代わりにトリプトファンを導入することで、翻訳を続行することができる。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞中のガイド及びＣａｓ１３ｂ１２－ＡＤＡＲ２融合物の発現は、ルシフェラーゼ発現を様々なレベルに回復し、ガイド５に対して最も大きな回復が生じた（図１１Ｂ）。一般に、ダイレクトリピートであることによりタンパク質が結合するｃｒＲＮＡの３’末端から編集部位がさらに遠ざかるにつれて、ガイド１～５から編集レベルが増加する。これはおそらく、タンパク質によって結合されるｃｒＲＮＡ：標的二本鎖の一部が、ＡＤＡＲ触媒ドメインにアクセスできないことを示唆している。編集部位が、ＤＲ／タンパク質結合領域から遠いガイドの遠位端上であり、かつ、それらのガイドがはるかに長いことで、ＡＤＡＲには有利であるより長いＲＮＡ二本鎖を生成するために、ガイド５、６、及び７は、最も高い活性量を示す。ＡＤＡＲ活性は、編集部位がＲＮＡ二本鎖の中央である場合に最適である。ルシフェラーゼ活性の相対発現は、ノンターゲティングガイド条件に正規化される。
これらの試料の配列決定をして、ＲＮＡ編集効率を正確に定量化した（図１１Ｃ）。編集効率は、ガイド標識の隣の括弧に記載される。全体的に、シーケンシングにより同定されたパーセント編集は、図１１Ｂに見られるルシフェラーゼ発現回復の相対レベルと一致した。ガイド５は最も大きなＲＮＡ編集を示し、オンターゲットＡでのＧへの変換率は４５％であった。場合によっては、領域におけるオフターゲットＡ－Ｇ編集は少量である。これらは、ガイド配列中にＧミスマッチを導入することによって低下し得、これは、ＡＤＡＲ触媒ドメインには不利である。
ルシフェラーゼレポーター転写物の編集に加えて、ガイドは、ＫＲＡＳ及びＰＰＩＢ転写物においてアウトオブフレームＵＡＧ部位を編集するように設計され、２つのガイドは、各転写物を標的化する（図１２）。ガイドは、上記のガイド５と同じ原理で設計された（３’ＤＲから遠位の編集部位２７ｎｔ、及び編集部位アデノシンに対するＣミスマッチを有する、４５ｎｔスペーサー）。ＫＲＡＳガイドは、オンターゲットアデノシンで６．５％及び１３．７％編集を達成することができ、ＰＰＩＢガイドは、７．７％及び９．２％編集を達成することができた。これらのガイドのいくつかは、いくつかのオフターゲットにも存在し、近くにある可能なオフターゲットアデノシンに対してスペーサー中にＧミスマッチを設計することで減らすことができる。どうやら、オフターゲットは、標的アデノシンの二本鎖領域３’で起こるようである。
ＲＮＡ配列からのＣａｓ１３ａ／ｂ＋ｓｈＲＮＡ特異性
Ｃａｓ１３ｂ１２ノックダウンの特異性を決定するため、トランスクリプトームにわたる全てのｍＲＮＡでＲＮＡシーケンシングを行った（図１３Ａ）。Ｇｌｕｃ及びＫＲＡＳを標的化するガイドのノックダウンをノンターゲティングガイドと比較して、Ｃａｓ１３ａ２及びＣａｓ１３ｂ１２は、標的転写物の特異的ノックダウンをした一方（図１３Ａの赤色の点）、ｓｈＲＮＡは、分布におけるより大きな分散から明らかなように、多くのオフターゲットを有した。これらの条件ごとの有意なオフターゲットの数を図１３Ｂに示す。有意なオフターゲットは、ｔ検定によって測定し、２倍超または０．８倍未満に変化する任意のオフターゲット転写物にはＦＤＲ補正（ｐ＜０．０１）を行った。Ｃａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ｂ条件は、ｓｈＲＮＡ条件で見られる数百個のオフターゲットと比較して、非常に少ないオフターゲットを有した。条件ごとのノックダウン効率を図１３Ｃに示す。
オフターゲットを減らすためのミスマッチ特異性（Ａ：ＡまたはＡ：Ｇ）
標的アデノシン編集部位近くのアデノシンでのオフターゲットを減らすため、潜在的なオフターゲットアデノシンに対してＧまたはＡミスマッチを有するガイドを設計した（図１４及び以下の表）。ＧまたはＡとのミスマッチは、ＡＤＡＲ触媒ドメインによる活性には有利ではない。
Figure 2023134462000034
上記の表のガイドは、（上記からのＲＮＡシーケンシングに基づいて）編集すべきオンターゲットアデノシンに対してＣミスマッチ、及び公知のオフターゲット部位に対してＧまたはＡミスマッチを有するように設計された。スペーサー配列中のミスマッチを大文字にする。
オンターゲット活性のミスマッチ
標的Ａの反対側の異なる塩基がイノシン編集の量に影響を与え得ることが、ＡＤＡＲ２の触媒ドメインの先行研究により実証されている（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４５（６）：３３６９－３３７７）。具体的には、Ｕ及びＣは、天然ＡＤＡＲ編集されたＡの反対に見つかる一方、Ｇ及びＡは見つからない。編集されたＡを有するＡ及びＧミスマッチを使用して、ＡＤＡＲ活性を抑制することができるかどうか試験するため、Ｃミスマッチで活性であることが知られるガイドを、ルシフェラーゼレポーターアッセイで、他の３つ全ての可能な塩基で試験する（図１６）。相対活性は、ルシフェラーゼ活性を評価することで定量化する。ガイド配列を以下の表で提供する。
Figure 2023134462000035
ＲＮＡの化学的改変によるオフターゲット改変の編集及び減少の改善
Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ，５３：６２６７－６２７１，ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１４０２６３４）に例示するように化学的に改変されるｇＲＮＡは、オフターゲット活性を低下させて、オンターゲット効率を改善する。２’－Ｏ－メチル及びホスホチオエート改変ガイドＲＮＡは、一般的に、細胞中の編集効率を改善する。
モチーフ選好性
ＡＤＡＲは、編集されたＡの両側の隣接ヌクレオチドに対する選好性を示すことが知られている（ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｓｍｂ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ２３／ｎ５／ｆｕｌｌ／ｎｓｍｂ．３２０３．ｈｔｍｌ，Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２３（５）：４２６－４３３）。選好性は、標的化されたＡを取り囲む可変塩基を有するＣｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼ転写物を標的化することで体系的に試験される（図１７）。
ＲＮＡ編集効率を強化するためのより大きなバブル
好ましくない５’または３’隣接塩基上のＲＮＡ編集効率を強化するため、隣接塩基において意図的なミスマッチを導入し、好ましくないモチーフを編集できることがインビトロで実証されている（ｈｔｔｐｓ：／／ａｃａｄｅｍｉｃ．ｏｕｐ．ｃｏｍ／ｎａｒ／ａｒｔｉｃｌｅ－ｌｏｏｋｕｐ／ｄｏｉ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ２７２；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ，４２（１０）：ｅ８７）；Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｓｃｉｅｎｔｉｃｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４１４７８）。グアノシン置換などの追加のミスマッチを試験し、それらの天然の選好性を低下させるかどうかを確認する（図１８）。
転写物中の多数のＡの編集
ＡＤＡＲデアミナーゼドメインのターゲティングウィンドウにおけるＣの反対側のＡが、他の塩基を上回って優先的に編集されることを結果は示唆している。加えて、標的化塩基の数個の塩基内のＵと塩基対合したＡは、Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物による低レベルの編集を示し、酵素が多数のＡを編集する柔軟性があることを示唆している（図１９）。これらの２つの観察は、Ｃａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ融合物の活性ウィンドウにおける多数のＡは、Ｃで編集すべき全てのＡをミスマッチすることで編集用に特定できることを示唆している。これを試験するため、最適化実験から最も有望なガイドを採取し、活性ウィンドウにおける多数のＡ：Ｃミスマッチは、多数のＡ：Ｉ編集を生成する可能性を試験するように設計される。この実験の編集率は、ＮＧＳを用いて定量化する。活性ウィンドウにおける潜在的なオフターゲット編集を抑制するため、ノンターゲットＡは、（塩基選好性実験からの結果に依存して）ＡまたはＧと対合される。
ＲＮＡ編集のガイド長さ滴定
ＡＤＡＲは、長さが２０ｂｐ超の分子間または分子内ＲＮＡ二本鎖上で自然に働く（Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，７９：３２１－３４９も参照されたい）。より長いｃｒＲＮＡ（より長い二本鎖をもたらす）がより高い活性レベルを有することが結果により実証された。異なる長さのガイドの活性をＲＮＡ編集活性と体系的に比較するため、３０、５０、７０及び８４塩基のガイドを設計して、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける終止コドンを補正した（図２０Ａ～２０Ｆ及び以下の表）。編集されたＡの位置が、ｃｒＲＮＡの特異性決定領域の３’末端に対してｍＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二本鎖内の可能な全ての等距離で存在する（すなわち、＋２、＋４など）ように、これらのガイドを設計した。
Figure 2023134462000036
Figure 2023134462000037
Figure 2023134462000038
Figure 2023134462000039
Figure 2023134462000040
Figure 2023134462000041
Figure 2023134462000042
Figure 2023134462000043
Figure 2023134462000044
原因疾患の突然変異の反転
以下の表の３つの遺伝子は、成熟前終止停止部位を遺伝子に導入する病原性Ｇ＞Ａ突然変異で合成され、それらを非ヒト細胞株に組み込む。Ｃａｓ１３ｂ１２－ＡＤＡＲ２が、終止コドンＵＡＧをＵＩＧ（ＵＧＧ）に変えることで転写物を補正し、タンパク質翻訳を修復する能力について試験する。
Figure 2023134462000045
４８個のさらなる病原性Ｇ＞Ａ突然変異を、付随する疾患と共に以下の表５に示す。遺伝子全体ではなく、これらの突然変異のまわりの２００ｂｐ断片を合成し、ＧＦＰの前にクローニングした。成熟前終止部位を修復する場合、これによりＧＦＰの翻訳が可能になり、ＲＮＡシーケンシングに加えて、ハイスループットでの蛍光によって補正を測定することができる。
Figure 2023134462000046
Figure 2023134462000047
Figure 2023134462000048
実施例３
効率かつ正確な核酸編集は、特に、ＲＮＡレベルでの、遺伝性疾患の治療にかなり有望であり、ここで、疾患関連転写物をレスキューして、機能性タンパク質生成物を生成することができる。ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、プログラム可能な単一エフェクターＲＮＡガイドＲＮａｓｅ Ｃａｓ１３を含む。ここで、ロバストノックダウンが可能なＣａｓ１３オルソログをエンジニアリングするＶＩ型系の多様性をプロファイルして、かつ、触媒的に不活性なＣａｓ１３（ｄＣａｓ１３）を用いて、アデノシンデアミナーゼ活性を哺乳類細胞中の転写物に仕向けることで、ＲＮＡ編集を実証する。ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインをｄＣａｓ１３に融合して、ガイドＲＮＡをエンジニアリングして、最適なＲＮＡ二本鎖基質を生成することで、効率が日常的に２０～４０％及び最大で８９％の範囲に及ぶ特異的単一アデノシンのイノシン（翻訳中にグアノシンとして読み出される）への標的化編集を達成する。この系は、プログラム可能なＡ→Ｉ置換のためのＲＮＡ編集（ＲＥＰＡＩＲ）と呼ばれ、高い特異性を達成するためにさらにエンジニアリングすることができる。エンジニアリングされた変異体、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、ロバストなオンターゲットＡ→Ｉ編集を維持しながら、１７０倍超の特異性の増加を示す。ＲＥＰＡＩＲｖ２を使用して、公知の病原性突然変異を含む完全長転写物を編集し、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにパッケージングするのに好適な機能性短縮型を作成する。ＲＥＰＡＩＲは、研究、治療薬、及びバイオテクノロジーへの幅広い適用性を有する有望なＲＮＡ編集プラットフォームを提示する。正確な核酸編集技術は、細胞機能の研究、及び新規の治療薬として役立つ。Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどの現在の編集ツールは、ゲノム遺伝子座のプログラム可能な改変を達成することができるが、編集は、挿入もしくは欠失により異種性であることが多く、または正確な編集のためにドナー鋳型を必要とする。ｄＣａｓ９－ＡＰＯＢＥＣ融合物などの塩基エディターは、二本鎖破壊を生成することなく編集することができるが、シチジンデアミナーゼ活性の性質により正確さが欠如し得、標的ウィンドウにおけるいずれかのシチジンを編集する。さらに、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の要件は、可能な編集部位の数を制限する。ここで、ＶＩ型原核生物のクラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）適応免疫系由来のＲＮＡガイドＲＮＡターゲティングＣａｓ１３酵素を用いた、正確かつ柔軟なＲＮＡ塩基編集ツールの開発について説明する。
正確な核酸編集技術は、細胞機能の研究、及び新規の治療薬として役立つ。原核生物のクラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）会合ヌクレアーゼＣａｓ９（１～４）またはＣｐｆ１（５）などのプログラム可能なヌクレアーゼに基づく現在の編集ツールは、標的化ＤＮＡ開裂を媒介し、次いで、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を通じた標的化遺伝子破壊または鋳型依存性相同組換え修復（ＨＤＲ）を通じた正確な遺伝子編集をドライブするように広く適用されている（６）。ＮＨＥＪは、分裂細胞及び分裂終了細胞の両方において活性な宿主機械を利用して、挿入または欠失（インデル）突然変異の混合物を生成することによって効率的な遺伝子破壊をもたらし、タンパク質コード遺伝子中のフレームシフトをもたらすことができる。対照的に、ＨＤＲは、宿主機械によって媒介され、その発現は、複製細胞に大幅に制限される。従って、分裂終了細胞における遺伝子編集能力の開発には引き続き大きな課題が残っている。最近では、ＤＮＡ塩基エディター、例えば、シチジンデアミナーゼ活性を特異的ゲノム標的に標的化して、標的ウィンドウ内でシトシンからチミンへの変換をもたらすための触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）の使用は、ＤＮＡ二本鎖破壊を生成せずに編集することができ、インデルの形成を有意に低下させる（７、８）。しかしながら、ＤＮＡ塩基エディターのターゲティング範囲は、編集部位でのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）のためのＣａｓ９の要件により制限される（９）。ここで、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ会合ＲＮＡガイドＲＮａｓｅ Ｃａｓ１３を用いた、正確かつ柔軟なＲＮＡ塩基編集ツールの開発について説明する（１０～１３）。
Ｃａｓ１３酵素は、正確なＲＮＡ開裂を媒介する２つの高等真核生物及び原核生物ヌクレオチド結合（ＨＥＰＮ）ｅｎｄｏＲＮａｓｅドメインを有する（１０、１１）。３つのＣａｓ１３タンパク質ファミリーが、現在までに同定されている：Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２として既知）、Ｃａｓ１３ｂ、及びＣａｓ１３ｃ（１２、１３）。Ｃａｓ１３ａ酵素が、核酸検出（１４）ならびに哺乳類及び植物細胞ＲＮＡノックダウン及び転写物トラッキングのためのツールとして適応させることができることが最近報告された（１５）。Ｃａｓ１３酵素のＲＮＡガイド性質によりそれらをＲＮＡ結合及び摂動用途の魅力的なツールにさせる。
ＲＮＡ（ＡＤＡＲ）ファミリーの酵素で作用するアデノシンデアミナーゼは、アデノシンのイノシンへの加水分解脱アミノ化、翻訳及びスプライシングにおいてグアノシンと機能的に等価な核酸塩基を介して、転写物の内因性編集を媒介する（１６）。２つの機能性ヒトＡＤＡＲオルソログ、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２があり、これらは、Ｎ末端二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン及びＣ末端触媒性脱アミノ化ドメインからなる。ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２の内因性標的部位は、実質的な二本鎖同一性を含み、触媒ドメインは、インビトロ及びインビボでの効率的な編集に対して二本鎖領域を必要とする（１７、１８）。ＡＤＡＲタンパク質は、標的化の潜在的な柔軟性を制限することができる、編集に好適なモチーフを有するが、ＡＤＡＲ（Ｅ４８８Ｑ）（１９）などのハイパーアクティブ突然変異体は、配列制約を緩めて、アデノシンからイノシンへの編集率を改善する。ＡＤＡＲは、ＲＮＡ二本鎖において、シチジン塩基の反対側のアデノシンを優先的に脱アミノ化し（２０）、正確な塩基編集に対する有望な機会を提供する。以前のアプローチは、ＲＮＡガイドを介して、標的化ＡＤＡＲ融合物をエンジニアリングしていたが（２１－２４）、これらのアプローチの特異性は報告されておらず、これらそれぞれのターゲティングメカニズムは、標的認識及びストリンジェンシーを強化し得るタンパク質パートナーの助けなしでＲＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーションに依存する。
ここで、哺乳類細胞におけるＲＮＡノックダウン活性のためのＣａｓ１３酵素の全てのファミリーを評価し、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５－１２５（ＰｓｐＣａｓ１３ｂ）由来のＣａｓ１３ｂオルソログを、哺乳類細胞適用に最も効率的かつ特異的なものとして同定する。次いで、ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメイン（ＡＤＡＲＤＤ）を触媒的に不活性なＰｓｐＣａｓ１３ｂに融合して、レポーター及び内因性転写物、ならびに疾患関連突然変異のプログラム可能なＡ－ｔｏ－Ｉ（Ｇ）置換（ＲＥＰＡＩＲ）のＲＮＡ編集を実証する。最後に、ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ融合物の特異性を改善して、特異性が１７０倍超増加したＲＥＰＡＩＲｖ２を生成するための合理的な突然変異誘発スキームを採用する。
方法
細菌性構築物の設計及びクローニング
哺乳類コドン最適化されたＣａｓ１３ｂ構築物を、Ｌａｃプロモーターの制御下で、クロラムフェニコール耐性ｐＡＣＹＣ１８４ベクターにクローニングした。その後、ＢｓａＩ制限部位によって分離された２つの対応するダイレクトリピート（ＤＲ）配列を、ｐＪ２３１１９プロモーターの制御下で、Ｃａｓ１３ｂの下流に挿入した。最後に、スペーサーを標的化するためのオリゴを、Ｔ４ ＰＮＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてリン酸化し、アニーリングして、Ｔ７リガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を用いてＢｓａＩ消化ベクターに連結させて、ターゲティングＣａｓ１３ｂベクターを生成した。
細菌性ＰＦＳスクリーン
ＰＦＳスクリーンのためのアンピシリン耐性プラスミドは、Ｃａｓ１３ｂ標的を含むＰＣＲ生成物を挿入することによってクローニングし、２つの５’無作為化ヌクレオチドと４つの３’無作為化ヌクレオチドとは、ＮＥＢギブソンアセンブリを用いて、アンピシリン耐性遺伝子の開始コドンのすぐ下流の標的部位によって分離された（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。次いで、１００ｎｇのアンピシリン耐性標的プラスミドを、６５～１００ｎｇのクロラムフェニコール耐性Ｃａｓ１３ｂ細菌性ターゲティングプラスミドにより、Ｅｎｄｕｒａエレクトロコンピテント細胞に電気穿孔した。プラスミドを細胞に加え、氷上で１５分間インキュベートし、製造者のプロトコルを用いて電気穿孔した後、９５０ｕＬの回復培地を細胞に加え、３７℃で１時間過剰増殖させた。クロラムフェニコール及びアンピシリン二重選択プレート上に過剰増殖をプレーティングした。過剰増殖の連続希釈を使用して、ｃｆｕ／ｎｇ ＤＮＡを推定した。プレーティングの１６時間後、細胞をプレートから掻き落とし、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｉｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、生存しているプラスミドＤＮＡを収穫した。生存しているＣａｓ１３ｂ標的配列及びそれらの隣接領域をＰＣＲによって増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑを用いて配列決定した。ＰＦＳ選好性を評価するため、元のライブラリーにおける無作為化ヌクレオチドを含む位置を抽出し、両方のバイオレプリケートに存在するベクターのみの条件に対して枯渇した配列を、カスタムパイソンスクリプトを用いて抽出した。その後、ベクターのみの対照と比較した、Ｃａｓ１３ｂ条件におけるＰＦＳ存在比の－ｌｏｇ２を使用して、好ましいモチーフを算出した。具体的には、特定の閾値を上回る－ｌｏｇ２（試料／ベクター）枯渇比を有する全ての配列を用いて、配列モチーフのウェブロゴを生成した（ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ）。Ｃａｓ１３ｂオルソログごとのウェブロゴを生成するために使用した特定の枯渇比値を表９に記載する。
ＲＮＡ干渉のための哺乳類構築物の設計及びクローニング
哺乳類細胞におけるＣａｓ１３オルソログを試験するためのベクターを生成するため、哺乳類コドン最適化されたＣａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、及びＣａｓ１３ｃ遺伝子をＰＣＲ増幅し、ＥＦ１ａｌｐｈａプロモーターの制御下で、デュアルＮＬＳ配列及びＣ末端ｍｓｆＧＦＰを含む哺乳類発現ベクターにゴールデンゲートクローニングした。さらなる最適化のために、Ｃａｓ１３オルソログを、ＥＦ１ａｌｐｈａプロモーターの制御下で、異なるＣ末端局在化タグを含む目的ベクターにゴールデンゲートクローニングした。
ＮＥＢギブソンアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、Ｇａｕｓｓｉａ及びＣｙｐｒｉｄｉｎｉａルシフェラーゼコードＤＮＡ、ＥＦ１ａｌｐｈａ及びＣＭＶプロモーター及びアセンブリをＰＣＲ増幅することによって、デュアルルシフェラーゼレポーターをクローニングした。
Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、またはＣａｓ１３ｃオルソログの哺乳類ガイドＲＮＡの発現のため、対応するダイレクトリピート配列をゴールデンゲートアクセプター部位で合成し、制限消化クローニングを介して、Ｕ６発現下でクローニングした。その後、個々のガイドを、ゴールデンゲートクローニングによって、オルソログごとの対応する発現骨格にクローニングした。
Ｃａｓ１３干渉特異性のためのプールされたミスマッチライブラリーのクローニング
プールされたミスマッチライブラリー標的部位をＰＣＲによって作成した。標的内の各位置で、９４％の正確な塩基と２％の不正確な塩基の混合物を含むＧ－ルシフェラーゼにおいて半縮重標的配列を含むオリゴを１つのプライマーとして使用し、Ｇ－ルシフェラーゼのノンターゲティング領域に対応するオリゴは、ＰＣＲ反応における第２のプライマーとして使用した。その後、ミスマッチライブラリー標的は、ＮＥＢギブソンアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、野生型Ｇ－ルシフェラーゼの代わりにデュアルルシフェラーゼレポーターにクローニングした。
ＲＮＡ編集のための哺乳類構築物の設計及びクローニング
ＰｓｐＣａｓ１３ｂは、ＨＥＰＮドメインの触媒部位で、２つのヒスチジンからアラニンへの突然変異（Ｈ１３３Ａ／Ｈ１０５８Ａ）を介して触媒的に不活性に作成された（ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ）。ヒトＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメインを合成し、ＰＣＲ増幅し、ｐｃＤＮＡ－ＣＭＶベクター骨格にギブソンクローニングし、ＧＳまたはＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２９６）リンカーを介して、Ｃ末端でｄＰｓｐＣａｓ１３ｂに融合した。異なるリンカーについて試験した実験では、以下の追加のリンカー：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＥＡＡＡＫ（配列番号２９７）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２９８）、及びＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（ＸＴＥＮ）（配列番号２９９）を、ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂとＡＤＡＲ２ｄｄとの間にクローニングした。適切な突然変異体をｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ－ＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７６１）骨格にギブソンクローニングすることによって、特異性突然変異体を生成した。
ＲＮＡ編集活性を測定するためのルシフェラーゼレポーターベクターは、ノックダウン実験に使用したルシフェラーゼレポーターベクター中にＷ８５Ｘ突然変異（ＴＧＧ＞ＴＡＧ）を作成することによって生成した。このレポーターベクターは、正規化対照として機能性Ｇｌｕｃを発現するが、成熟前終止部位の付加により欠損Ｃｌｕｃである。ＡＤＡＲ編集モチーフ選好性を試験するため、Ｃｌｕｃのコドン８５（ＸＡＸ）でのアデノシンのまわりのありとあらゆるモチーフをクローニングした。
ＲＥＰＡＩＲのＰＦＳ選好性を試験するため、標的領域及びアデノシン編集部位の上流の６塩基対退化ＰＦＳ配列を含む、プールされたプラスミドライブラリーをクローニングした。ライブラリーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）からのウルトラマーとして合成し、配列のＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）フィル－インのプライマー及びＫｌｅｎｏｗ断片のアニーリングを介して、二本鎖を作製した。退化配列を含むこのｄｓＤＮＡ断片を消化レポーターベクターにギブソンクローニングした後、これをイソプロパノール沈殿させて、精製した。次いで、クローニングしたライブラリーをＥｎｄｕｒａコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に電気穿孔し、２４５ｍｍ×２４５ｍｍスクエアバイオアッセイプレート（Ｎｕｎｃ）上にプレーティングした。１６時間後、コロニーを収穫し、エンドトキシンフリーＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬミディプレップキットを用いてミディプレパレーションした。クローニングしたライブラリーは、次世代シーケンシングによって検証した。
ＲＥＰＡＩＲ活性の試験のための疾患関連突然変異をクローニングするため、ＣｌｉｎＶａｒに定義されるように疾病病因に関連する３４個のＧ＞Ａ突然変異を選択し、これらの突然変異を取り囲む２００ｂｐ領域は、ＣＭＶプロモーター下で、ｍＳｃａｒｌｅｔｔとＥＧＦＰの間にゴールデンゲートクローニングした。ＡＶＰＲ２及びＦＡＮＣＣ中の２つの追加のＧ＞Ａ突然変異を選択して、ＥＦ１ａｌｐｈａの発現下で全遺伝子配列をギブソンクローニングした。
ＲＥＰＡＩＲの哺乳類ガイドＲＮＡを発現するため、ＰｓｐＣａｓ１３ｂダイレクトリピート配列をゴールデンゲートアクセプター部位で合成し、制限消化クローニングを介してＵ６発現下でクローニングした。その後、個々のガイドを、ゴールデンゲートクローニングによってこの発現骨格にクローニングした。
哺乳類細胞培養
哺乳類細胞培養実験をＨＥＫ２９３ＦＴ株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））で行った（これは、高グルコース、ピルビン酸ナトリウム、及びＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を有し、１×ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１０％ウシ胎児血清（ＶＷＲ Ｓｅｒａｄｉｇｍ）をさらに補充したダルベッコ改変イーグル培地中で増殖させた）。細胞は、８０％以下の集密度で維持した。
特に明記しない限り、全てのトランスフェクションは、ポリ－Ｄ－リシン（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ）で被覆した９６ウェルプレートにおいてリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行った。トランスフェクション前に、おおよそ２０，０００細胞／ウェルで細胞を１６時間プレーティングし、トランスフェクションの時点で９０％の集密度を確実にした。プレート上のウェルごとに、トランスフェクションプラスミドをＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ減少血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と組み合わせて、合計で２５μｌにした。それとは別に、２４．５ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭを０．５ｕｌのリポフェクタミン２０００と組み合わせた。次いで、プラスミド及びリポフェクタミン溶液を組み合わせて、５分間インキュベートした後、細胞上にピペットで移した。
ＲＮＡノックダウン哺乳類細胞アッセイ
レポーター構築物で哺乳類細胞中のＲＮＡ標的化を評価するため、１５０ｎｇのＣａｓ１３構築物を、３００ｎｇのガイド発現プラスミド及び１２．５ｎｇのノックダウンレポーター構築物と同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、分泌ルシフェラーゼを含む培地を細胞から除去し、ＰＢＳ中で１：５に希釈し、注入プロトコルにより、プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２）上のＢｉｏＬｕｘ Ｃｙｐｒｉｄｉｎｉａ及びＢｉｏｌｕｘ Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で活性を測定した。行った全ての反復は、生物学的反復である。
内因性遺伝子の標的化では、１５０ｎｇのＣａｓ１３構築物を３００ｎｇのガイド発現プラスミドと同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を溶解し、ＲＮＡを収穫し、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－Ｃｔキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の前述した［ＣＩＴＥ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ］改変を用いて逆転写した。ＫＲＡＳ転写物のＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧＡＰＤＨ対照プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びＦａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたｑＰＣＲを介して、ｃＤＮＡ発現を測定した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）上でｑＰＣＲ反応を読み出し、５ｕｌの技術的反復は、３８４ウェル形態で４つであった。
ミスマッチ標的のプールされたライブラリーを用いたＲＮＡ特異性の評価
Ｃａｓ１３がミスマッチ標的ライブラリーに干渉する能力は、６ウェルプレートに播種されたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を用いて試験した。約７０％のコンフルエント細胞を、２４００ｎｇのＣａｓ１３ベクター、４８００ｎｇのガイド、及び２４０ｎｇのミスマッチ標的ライブラリーを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を収穫し、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）及びＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットを用いて、ＲＮＡを抽出した。製造者の遺伝子特異的プライミングプロトコルに従ったｑＳｃｒｉｐｔ Ｆｌｅｘ ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）、及びＧｌｕｃ特異的ＲＴプライマーを用いて、１ｕｇの抽出したＲＮＡを逆転写した。その後、ｃＤＮＡを増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑを用いて配列決定した。
シーケンシングは、１配列あたりのリードをカウントすることで分析し、ｌｏｇ２（－リードカウント比）値を決定することによって、枯渇スコアを算出した。ここで、リードカウント比は、ターゲティングガイド条件対ノンターゲティングガイド条件におけるリードカウントの比である。このスコア値は、配列上のＣａｓ１３活性レベルを表し、値が高ければ、より強い枯渇を表すため、Ｃａｓ１３短縮活性がより高くなる。シングルミスマッチ及びダブルミスマッチ配列の別々の分布を決定し、ミスマッチ同一性ごとの枯渇スコアと共にヒートマップとしてプロットした。ダブルミスマッチ配列では、所与の位置での全ての可能なダブルミスマッチの平均をプロットした。
ＲＮＡシーケンシングによる哺乳類細胞におけるＣａｓ１３のトランスクリプトームワイドプロファイリング
トランスクリプトームワイド特異性の測定では、１５０ｎｇのＣａｓ１３構築物、３００ｎｇのガイド発現プラスミド及び１５ｎｇのノックダウンレポーター構築物を同時トランスフェクトし；ｓｈＲＮＡ条件では、３００ｎｇのｓｈＲＮＡターゲティングプラスミド、１５ｎｇのノックダウンレポーター構築物、及び１５０ｎｇのＥＦ１－アルファ駆動ｍＣｈｅｒｒｙ（レポーター負荷のバランスを取るため）を同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＲＮｅａｓｙプラスミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）でＲＮＡを精製し、ＮＥＢＮｅｘｔポリ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気分離モジュール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｍＲＮＡを選択し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）用のＮＥＢＮｅｘｔウルトラＲＮＡライブラリープレップキットによるシーケンシングのために調製した。次いで、ＲＮＡシーケンシングライブラリーをＮｅｘｔＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した。
トランスクリプトームワイドシーケンシングデータを分析するため、デフォルトパラメーター［引用ＲＳＥＭ：参照ゲノムを伴うまたは伴わないＲＮＡ－Ｓｅｑデータからの正確な転写物定量化］によるＢｏｗｔｉｅ及びＲＳＥＭバージョン１．２．３１を用いて、リードをＲｅｆＳｅｑ ＧＲＣｈ３８アセンブリとアラインメントした。転写物発現をｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）として定量化し、ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）＞２．５で遺伝子をフィルタリングした。差次的発現遺伝子の選択のため、＞２または＜０．７５の差次的変化を有する遺伝子のみを考慮した。差次的発現の統計的有意性は、３つのターゲティング反復対ノンターゲティング反復におけるスチューデントｔ検定で評価し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順によって、＜０．０１％の偽発見率でフィルタリングした。
哺乳類細胞トランスフェクションにおけるＡＤＡＲ ＲＮＡ編集
哺乳類細胞におけるＲＥＰＡＩＲ活性を評価するため、１５０ｎｇのＲＥＰＡＩＲベクター、３００ｎｇのガイド発現プラスミド、及び４０ｎｇのＲＮＡ編集レポーターをトランスフェクトした。４８時間後、細胞由来のＲＮＡを収穫し、遺伝子特異的逆転写プライマーによる前述した方法［引用ＪＪ］を用いて逆転写した。次いで、抽出したｃＤＮＡに２ラウンドのＰＣＲを施し、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを加え、ＮＥＢＮｅｘｔハイフィデリティ２Ｘ ＰＣＲマスターミックスを用いて、バーコードをサンプリングした。その後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑまたはＭｉＳｅｑにおける次世代シーケンシングをライブラリーに施した。次いで、シーケンシングウィンドウ内の全てのアデノシンでＲＮＡ編集率を評価した。
ルシフェラーゼレポーターを標的化して、ＲＮＡ編集する実験では、ＲＮＡ収穫前にルシフェラーゼを分泌させた培地も収穫した。この場合には、補正したＣｌｕｃが低レベルであり得るため、培地を希釈しなかった。注入プロトコルにより、プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２）上のＢｉｏＬｕｘ Ｃｙｐｒｉｄｉｎｉａ及びＢｉｏｌｕｘ Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）でルシフェラーゼ活性を測定した。行った全ての反復は、生物学的反復である。
ＰＦＳ結合哺乳類スクリーン
編集効率に対するＰＦＳの寄与を決定するため、６２５ｎｇのＰＦＳ標的ライブラリー、４．７ｕｇのガイド、及び２．３５ｕｇのＲＥＰＡＩＲを、２２５ｃｍ２フラスコにプレーティングしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞上で同時トランスフェクトした。プラスミドを３３ｕｌのＰＬＵＳ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで５３３ｕｌにし、５分間インキュベートし、３０ｕｌのリポフェクタミン２０００及び５００ｕｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと組み合わせて、さらに５分間インキュベートした後、細胞上にピペットで移した。トランスフェクションの４８時間後、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙプラスミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で収穫し、遺伝子特異的プライマーを用いて、ｑＳｃｒｉｐｔ Ｆｌｅｘ（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）で逆転写し、ＮＥＢＮｅｘｔハイフィデリティ２Ｘ ＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、２ラウンドのＰＣＲで増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを加え、バーコードをサンプリングした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑを用いてライブラリーを配列決定し、標的アデノシンでのＲＮＡ編集率をＰＦＳ同一性にマッピングした。カバレッジを増加させるため、ＰＦＳを４ヌクレオチドに計算上崩壊させた。ＰＦＳごとのＲＥＰＡＩＲ編集率を算出し、対応するＰＦＳのノンターゲティング率を減算して、生物学的反復にわたって平均化した。
ＡＤＡＲ編集特異性を評価するための全トランスクリプトームシーケンシング
トランスクリプトームにわたるオフターゲットＲＮＡ編集部位を分析するため、ＲＮｅａｓｙプラスミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたトランスフェクションの４８時間後に、細胞から全てのＲＮＡを収穫した。その後、ＮＥＢＮｅｘｔポリ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気分離モジュール（ＮＥＢ）を用いて、ｍＲＮＡ画分を濃縮し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ）用のＮＥＢＮｅｘｔウルトラＲＮＡライブラリープレップキットを用いたシーケンシングのために、このＲＮＡを調製した。次いで、ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑを用いて配列決定し、試料あたり少なくとも５百万個のリードが存在するようにロードした。
標的化及びトランスクリプトームワイド実験のためのＲＮＡ編集分析
トランスクリプトームワイドＲＮＡ編集ＲＮＡシーケンシングデータを分析するため、配列ファイルを５百万個のリードに無作為にダウンサンプリングした。Ｇｌｕｃ及びＣｌｕｃ配列を加えたＲｅｆＳｅｑ ＧＲＣｈ３８アセンブリを用いて、インデックスを生成し、リードをアラインメントし、Ｂｏｗｔｉｅ／ＲＳＥＭバージョン１．３．０を用いて定量化した。その後、アラインメントＢＡＭを選別し、以下のパラメーター：－ｔ８－ｅ－ｄ－ｌ－Ｕ［ＡＧまたはＴＣ］－ｐ－ｕ－ｍ２０－Ｔ６－０－Ｗ－ｖ１－ｎ０．０によるＲＥＤｉツール［引用］を用いて、ＲＮＡ編集部位を分析した。非トランスフェクトまたはＥＧＦＰトランスフェクト条件で見られた任意の有意な編集は、トランスフェクションのＳＮＰまたはアーチファクトであると見なし、オフターゲットの分析から除外した。フィッシャーの正確確率検定により０．５未満のｐ値が得られ、かつ、３つの生物学的反復のうちの少なくとも２つが編集部位を同定した場合には、オフターゲットは有意と見なした。
各オフターゲットの予測された変異体効果を分析するため、オフターゲット編集部位のリストは、ＳＩＦＴ及びＰｏｌｙＰｈｅｎ－２注釈付けを用いたＵＣＳＣゲノムブラウザースイートツールの一部として、変異体の注釈付けインテグレーターを用いて分析した（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｈｇＶａｉ）。オフターゲット遺伝子が発がん性であるかどうかを宣告するため、がんにおける体細胞突然変異のＣＯＳＭＩＣカタログからの発がん性注釈付けのデータベース（ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）。
ＲＥＰＡＩＲ構築物がＲＮＡレベルを混乱させたかどうか分析するため、ＲＳＥＭ分析から出力された転写物百万分率（ＴＰＭ）値を発現カウントに使用して、ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）をとることでログスペースに変換した。差次的に調節された遺伝子を見つけるため、３つのターゲティングガイド反復対３つのノンターゲティングガイド反復に対してスチューデントｔ検定を行った。ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）値が２．５を超える遺伝子についてのみ統計分析を行い、遺伝子が２超または０．８未満の倍数変化を有した場合にのみ、差次的に調節されたと見なした。０．０１未満の偽発見率を有した場合には、それらの遺伝子を報告した。
結果
哺乳類細胞におけるＣａｓ１３ファミリーメンバーの包括的な特徴付け
哺乳類ノックダウン適用のためのＬｗａＣａｓ１３ａを以前に開発したが、ＬｗａＣａｓ１３ａは、効率的なノックダウンのためのｍｓｆＧＦＰ安定化ドメインを必要とし、その特異性は高いが、ノックダウン効率は、常に５０％以下ではなかった（１５）。遺伝的に多様なセットのＣａｓ１３ファミリーメンバーを特徴付けることによって、よりロバストなＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ系を同定し、哺乳類細胞におけるそれらのＲＮＡノックダウン活性を評価しようとした（図４９Ａ）。２１のＣａｓ１３ａ、１５のＣａｓ１３ｂ、及び７のＣａｓ１３ｃ哺乳類コドン最適化オルソログ（表６）を、Ｎ及びＣ末端核外搬出シグナル（ＮＥＳ）配列及びＣ末端ｍｓｆＧＦＰを有する発現ベクターにクローニングし、タンパク質安定性を強化した。哺乳類細胞における干渉を評価するため、別々のプロモーターの元で、オルソゴナルＧａｕｓｓｉａ（Ｇｌｕｃ）及びＣｙｐｒｉｄｉｎｉａ（Ｃｌｕｃ）ルシフェラーゼを発現するデュアルレポーター構築物を設計した。これは、一方のルシフェラーゼをＣａｓ１３干渉活性の指標として機能させ、他方を内部対照として役立たせることができる。オルソログごとに、アンピシリン干渉アッセイに由来するＣａｓ１３ｂ ＰＦＳモチーフ（図５５；表７）及びＣａｓ１３ａ活性の以前の報告からの３’Ｈ ＰＦＳを用いて、ＰＦＳ適合性のガイドＲＮＡを設計した（１０）。
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＣａｓ１３発現、ガイドＲＮＡ及びレポータープラスミドでトランスフェクトし、４８時間後に、標的化Ｇｌｕｃのレベルを定量化した。Ｃａｓ１３オルソログごとの２つのガイドＲＮＡを試験することで、活性レベルの範囲が明らかになった。例えば、５つのＣａｓ１３ｂオルソログは、近年特徴付けられたＬｗａＣａｓ１３ａと比べて、両方のガイドＲＮＡにわたる干渉が同様であるかまたは増加した（図４９Ｂ）。さらなるエンジニアリング用に、これら５つのＣａｓ１３ｂオルソログ、ならびにトップ２つのＣａｓ１３ａオルソログを選択した。
ロバスト活性のための安定化ドメインを必要としないオルソログを選択するために、ｍｓｆＧＦＰなしのＧｌｕｃのＣａｓ１３媒介性ノックダウンについて次に試験した。ｍｓｆＧＦＰに加えて、Ｃａｓ１３活性は、ＬｗａＣａｓ１３ａの最適化について以前に報告されたように、細胞内局在によって影響を受ける可能性があると仮説した（１５）。従って、ｍｓｆＧＦＰなしで、６つの異なる局在化タグのうちの１つにＣ末端融合した、７つの選択されたＣａｓ１３オルソログの干渉活性を試験した。ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、ＨＩＶ Ｒｅｖ遺伝子ＮＥＳにＣ末端融合したＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びＰｇｕＣａｓ１３ｂ、ならびにＭＡＰＫ ＮＥＳにＣ末端融合したＲａｎＣａｓ１３ｂが、最高レベルの干渉活性を有したことが判明した（図５６Ａ）。トップオルソログの活性レベルをさらに区別するため、位置が一致したガイドを用いて、ＫＲＡＳ転写物をノックダウンする能力について、３つの最適化Ｃａｓ１３ｂ構築物を最適なＬｗａＣａｓ１３ａ－ｍｓｆＧＦＰ融合物及びｓｈＲＮＡと比較した（図５６Ｂ）。ＰｓｐＣａｓ１３ｂの干渉レベルが最も高いことが観察されたため（平均ノックダウン：６２．９％）、これを選択して、ＬｗａＣａｓ１３ａとさらに比較した。
ＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びＬｗａＣａｓ１３ａの活性レベルをより厳密に定義するため、Ｇｌｕｃ及びＣｌｕｃの両方に沿ってタイリングする位置が一致したガイドを設計し、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、それらの活性を評価した。Ｇｌｕｃ及びＣｌｕｃをそれぞれ標的化する９３位及び２０位が一致したガイドを試験し、ＰｓｐＣａｓ１３ｂが、ＬｗａＣａｓ１３ａと比べて、ノックダウンレベルを一貫して増加させたことが判明した（ＰｓｐＣａｓ１３ｂの平均９２．３％ノックダウン対ＬｗａＣａｓ１３ａの平均４０．１％ノックダウン）（図４９Ｃ、４９Ｄ）。
Ｃａｓ１３哺乳類干渉活性の特異性
ＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びＬｗａＣａｓ１３ａの干渉特異性を特徴付けるため、標的配列ならびに３つの隣接する５’及び３’塩基対の全体にわたってシングルミスマッチ及びダブルミスマッチを含むルシフェラーゼ標的のプラスミドライブラリーを設計した（図５６Ｃ）。ＬｗａＣａｓ１３ａまたはＰｓｐＣａｓ１３ｂ、非改変標的配列を標的化する固定ガイドＲＮＡ、及び適切な系に対応するミスマッチ標的ライブラリーのいずれかでＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をトランスフェクトした。その後、非開裂転写物の標的化ＲＮＡシーケンシングを行い、ミスマッチ標的配列の枯渇を定量化した。ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂが、シングルミスマッチに比較的不寛容であった中央領域（ＰｓｐＣａｓ１３ｂ標的の塩基対１２～２６及びＬｗａＣａｓ１３標的の塩基対１３～２４からに伸長する）を有したことが判明した（図５６Ｄ）。ダブルミスマッチは、それぞれの標的においてＰｓｐＣａｓ１３ｂ標的の塩基対１２～２９及びＬｗａＣａｓ１３標的の塩基対８～２７から伸長する単一突然変異よりもはるかに耐性が低く、より大きなウィンドウにわたるノックダウン活性はほとんど観察されなかった（図５６Ｅ）。加えて、標的配列の５’及び３’末端に隣接する３つのヌクレオチドにミスマッチが含まれるため、Ｃａｓ１３ノックダウン活性におけるＰＦＳ制約を評価することができた。ほとんど全てのＰＦＳ組み合わせがロバストノックダウンすることができ、哺乳類細胞における干渉のＰＦＳ制約が、試験したいずれの酵素でもおそらく存在しないことを示すことが、シーケンシングにより示された。これらの結果は、Ｃａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ｂが、ミスマッチに対して同様の配列制約及び感受性を示すことを示唆している。
次に、トランスクリプトームのｍＲＮＡ画分にわたって、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びＬｗａＣａｓ１３ａの干渉特異性を特徴付けた。トランスクリプトームワイドｍＲＮＡシーケンシングを行って、有意に差次的発現した遺伝子を検出した。ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂは、Ｇｌｕｃのロバストノックダウンを示し（図４９Ｅ、４９Ｆ）、数百のオフターゲットを示した位置が一致したｓｈＲＮＡと比較して、非常に特異的であった（図４９Ｇ）。
Ｃａｓ１３－ＡＤＡＲ融合物は、標的化ＲＮＡ編集を可能にする
ＰｓｐＣａｓ１３ｂが、哺乳類細胞におけるｍＲＮＡの一貫して、ロバストかつ特異的なノックダウンを達成したことを考えると、それは、プログラム可能なＲＮＡ編集のためにＡＤＡＲ（ＡＤＡＲＤＤ）のデアミナーゼドメインを動員するＲＮＡ結合プラットフォームとして適応することができたと想定された。ヌクレアーゼ活性が欠如しているＰｓｐＣａｓ１３ｂ（ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ、ここからはｄＣａｓ１３ｂと呼ぶ）をエンジニアリングするため、ＨＥＰＮドメインにおいて保存触媒残基を変異させて、ルシフェラーゼＲＮＡノックダウン活性の損失が観察された（図５７Ａ）。ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲＤＤ融合物が、ガイドＲＮＡによって標的アデノシンに動員することができ、ハイブリダイズしたＲＮＡが、ＡＤＡＲ活性のための必須の二本鎖基質を生成することができることを仮定した（図５０Ａ）。標的アデノシン脱アミノ化率を強化するため、初期のＲＮＡ編集設計に２つの追加の改変を導入した：標的アデノシンの反対側のミスマッチシチジン（これは脱アミノ化頻度を増加させることが以前に報告されている）を導入し、Ｃａｓ１３ｂを、過剰活性化した突然変異を含むヒトＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメインと融合し、触媒活性（ＡＤＡＲ１ＤＤ（Ｅ１００８Ｑ）（２５）またはＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）（１９））を強化した。
ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲＤＤの活性を試験するため、ナンセンス突然変異（Ｗ８５Ｘ（ＵＧＧ→ＵＡＧ））を導入することによって、ＲＮＡ編集レポーターをＣｌｕｃ上に生成し、これは、Ａ→Ｉ編集を介して野生型コドンに機能的に修復された後（図５０Ｂ）、Ｃｌｕｃ発光の修復として検出することができた。標的アデノシンにわたって、３０、５０、７０または８４ヌクレオチドの長さのスペーサーを有するガイドを均等にタイリングして、最適なガイド配置及び設計を決定した（図５０Ｃ）。ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ１ＤＤは、Ｃｌｕｃレポーターを修復するためにより長いガイドが必要であった一方、ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤは、試験した全てのガイド長さで機能的であったことが判明した（図５０Ｃ）。野生型ＡＤＡＲ２ＤＤによるルシフェラーゼ回復が低下したため、ハイパーアクティブＥ４８８Ｑ突然変異が、編集効率を改善したことも判明した（図５７Ｂ）。この活性の実証から、ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）を選択して、さらに特徴付けて、プログラム可能なＡ－ｔｏ－Ｉ置換のためのＲＮＡ編集バージョン１（ＲＥＰＡＩＲｖ１）としてこのアプローチを指定した。
ルシフェラーゼ活性の回復が善意（ｂｏｎａ ｆｉｄｅ）の編集事象によるものであったことを検証するため、逆転写及び標的化した次世代シーケンシングを直接介してＲＥＰＡＩＲｖ１を受けたＣｌｕｃ転写物の編集を測定した。標的部位まわりの３０及び５０ｎｔスペーサーを試験し、両方のガイド長さが、予想されるＡ→Ｉ編集をもたらし、５０ｎｔスペーサーがより高い編集パーセンテージを達成したことが判明した（図５０Ｄ、Ｅ、図５７Ｃ）。おそらくは二本鎖ＲＮＡの増加領域により、５０ｎｔスペーサーが、ノンターゲティングアデノシンでの編集傾向を増加させることも観察された（図５０Ｅ、図５７Ｃ）。
次に、内因性遺伝子であるＰＰＩＢを標的にした。５０ｎｔスペーサータイリングＰＰＩＢを設計し、ＰＰＩＢ転写物を最大２８％の編集効率で編集することができたことが判明した（図５７Ｄ）。ＲＥＰＡＩＲをさらに最適化できたかどうか試験するため、ｄＣａｓ１３ｂとＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）の間のリンカーを改変し（図５７Ｅ、表８）、リンカー選択が、ルシフェラーゼ活性回復に適度に影響を及ぼしたことが判明した。
ＲＮＡ編集の配列パラメーターの定義
試験部位で正確なＲＮＡ編集を達成できたことを考えると、トランスクリプトームにおける任意のＲＮＡ標的に対して系をプログラミングするための配列制約と特徴付けたかった。配列制約は、ＰＦＳなどのｄＣａｓ１３ｂターゲティング制限、またはＡＤＡＲ配列選好性から生じる可能性がある（２６）。ＲＥＰＡＩＲｖ１のＰＦＳ制約を調査するため、Ｃｌｕｃ転写物上の標的部位５’末端に一連の４つの無作為化ヌクレオチドを担持するプラスミドライブラリーを設計した（図５１Ａ）。ＵＡＧまたはＡＡＣモチーフのいずれか内の中心アデノシンを標的化し、両方モチーフでは、全てのＰＦＳが、検出可能なレベルのＲＮＡ編集を示し、大多数のＰＦＳが、標的部位で５０％超の編集を有することが判明した（図５１Ｂ）。次に、ＡＤＡＲ２ＤＤについて以前に報告されているように、ＲＥＰＡＩＲｖ１におけるＡＤＡＲ２ＤＤが、標的化した塩基に直ちに隣接する任意の配列制約を有するかどうか決定しようとした（２６）。標的アデノシンを直接取り囲む５’及び３’隣接ヌクレオチドのありとあらゆる組み合わせを試験し（図５１Ｃ）、ＲＥＰＡＩＲｖ１が、全てのモチーフを編集することができたことが判明した（図５１Ｄ）。最後に、スペーサー配列における標的Ａの反対側の塩基の同一性が編集効率に影響を及ぼしたかどうか分析し、Ａ－Ｃミスマッチが最も高いルシフェラーゼ回復を有し、Ａ－Ｇ、Ａ－Ｕ、及びＡ－Ａが、ＲＥＰＡＩＲｖ１活性を激減させたことが判明した（図５７Ｆ）。
ＲＥＰＡＩＲｖ１を用いた疾患関連ヒト突然変異の補正
哺乳類細胞におけるＲＮＡ編集のためのＲＥＰＡＩＲｖ１系の幅広い適用性を実証するため、２つの疾患関連突然変異：Ｘ連鎖腎性尿崩症における８７８Ｇ＞Ａ（ＡＶＰＲ２ Ｗ２９３Ｘ）及びファンコニ貧血における１５１７Ｇ＞Ａ（ＦＡＮＣＣ Ｗ５０６Ｘ）に対するＲＥＰＡＩＲｖ１ガイドを設計した。これらの突然変異を担持する遺伝子のｃＤＮＡの発現構築物をＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトし、ＲＥＰＡＩＲｖ１が突然変異を補正できたかどうか試験した。５０ｎｔスペーサーを含むガイドＲＮＡを用いて、ＡＶＰＲ２の３５％補正及びＦＡＮＣＣの２３％補正を達成することができた（図５２Ａ～５２Ｄ）。その後、ＲＥＰＡＩＲｖ１が３４個の異なる疾患関連Ｇ＞Ａ突然変異を補正する能力を試験し（表９）、３３個の部位での有意な編集を最大２８％の編集効率で達成することができたことが判明した（図５２Ｅ）。選択した突然変異は、ＣｌｉｎＶａｒデータベースにおいて病原性Ｇ→Ａ突然変異（５，７３９）のほんの一部のみであり、これは、追加で１１，９４３個のＧ→Ａ変異体も含む（図５２Ｆ及び図５８）。配列制約がないため、特に、標的モチーフに関わらず有意な編集が観察されたことを考えると、ＲＥＰＡＩＲｖ１は、これら全ての疾患関連突然変異を潜在的に編集することができる（図５１Ｃ及び図５２Ｇ）。
ＲＥＰＡＩＲｖ１系を疾患細胞に送達することは、治療的使用の前提条件であるため、従って、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの治療上適切なウイルスベクターにパッケージングすることができるＲＥＰＡＩＲｖ１構築物を設計しようとした。ＡＡＶベクターは、４．７ｋｂのパッケージング制限を有し、プロモーター及び発現調節エレメントと共に、大きいサイズのｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲＤＤ（４４７３ｂｐ）を収容することができない。サイズを低下させるため、ＲＮＡ編集活性のためのＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）に融合したｄＣａｓ１３の様々なＮ末端及びＣ末端短縮を試験した。試験した全てのＣ末端短縮は、まだ機能しており、かつ、ルシフェラーゼシグナルを回復することができることが判明し（図５９）、最大の短縮であるＣ末端Δ９８４－１０９０（融合タンパク質４，１５２ｂｐの合計サイズ）は、ＡＡＶベクターのパッケージング制限内に収まるほど十分に小型であった。
ＲＥＰＡＩＲｖ１のトランスクリプトームワイド特異性
ＰｓｐＣａｓ１３ｂによるＲＮＡノックダウンは非常に特異的であったが、ルシフェラーゼタイリング実験では、ガイド：標的二本鎖内でオフターゲットアデノシン編集が観察された（図５０Ｅ）。これが広範な現象であるかどうか確認するため、内因性転写物のＫＲＡＳをタイリングし、標的アデノシン近くのオフターゲット編集の程度を測定した（図５３Ａ）。ＫＲＡＳでは、オンターゲット編集率が２３％であった一方、検出可能なＡ→Ｇ編集も有した標的部位のまわりに多くの部位があったことが判明した（図５３Ｂ）。
ガイド：標的二本鎖内の観察されたオフターゲット編集のため、全てのｍＲＮＡでＲＮＡシーケンシングを行うことによって、全ての可能なトランスクリプトームオフターゲットを評価した。有意な数のＡ→Ｇオフターゲット事象があることが、ＲＮＡシーケンシングにより明らかになった：ターゲティング条件では、１，７３２個のオフターゲット、ノンターゲティング条件では、９２５個のオフターゲット、８２８個のオフターゲットが重複した（図５３Ｃ、Ｄ）。トランスクリプトームにわたって全ての編集部位のうちで、オンターゲット編集部位は、最も高い編集率を有し、８９％がＡ→Ｇ変換した。
Ｃａｓ１３標的化の高い特異性を考えると、オフターゲットはＡＤＡＲから生じ得ると推論した。２つのＲＮＡガイドＡＤＡＲ系が、前述されている（図６０Ａ）。第１の設計は、小ウイルスタンパク質ラムダＮ（λＮ）に対するＡＤＡＲ２ＤＤの融合を利用し、これにより、ボックスＢ－λ ＲＮＡヘアピンに結合する（２２）。ダブルボックスＢ－λヘアピンを有するガイドＲＮＡは、ＡＤＡＲ２ＤＤを、ガイドＲＮＡでコードされた編集部位にガイドする（２３）。第２の設計は、完全長ＡＤＡＲ２（ＡＤＡＲ２）、及びＡＤＡＲ２の二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）が認識するヘアピンを有するガイドＲＮＡを利用する（２１、２４）。ＲＥＰＡＩＲｖ１と比較して、これら２つの系の編集効率を分析し、ボックスＢ－ＡＤＡＲ２及びＡＤＡＲ２系は、ＲＥＰＡＩＲｖ１によって達成された８９％の編集率と比較して、それぞれ６３％及び３６％の編集率を示したことが判明した（図６０Ｂ～Ｅ）。加えて、ボックスＢ及びＡＤＡＲ２系は、ＲＥＰＡＩＲｖ１ターゲティングガイド条件における１，２２９個のオフターゲットと比較して、ターゲティングガイド条件において、それぞれ２０１８個及び１７４個の観察されたオフターゲットを生成した。特に、２つのＡＤＡＲ２ＤＤベース系（ＲＥＰＡＩＲｖ１及びボックスＢ）での全ての条件は、それらのオフターゲットで高い割合の重複を示した一方、ＡＤＡＲ２系は、大きく異なるセットのオフターゲットを有した（図６０Ｆ）。ターゲティング条件とノンターゲティング条件の間、及びＲＥＰＡＩＲｖ１条件とボックスＢ条件の間のオフターゲットの重複は、ＡＤＡＲ２ＤＤがｄＣａｓ１３ターゲティングと無関係なオフターゲットを駆動したことを示唆する（図６０Ｆ）。
合理的タンパク質エンジニアリングを介したＲＥＰＡＩＲｖ１の特異性の改善
ＲＥＰＡＩＲの特異性を改善するため、ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）の構造ガイドタンパク質エンジニアリングを採用した。オフターゲットのガイドに依らない性質のため、ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）－ＲＮＡ結合の不安定化が、オフターゲット編集を選択的に減少させるが、ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）のｄＣａｓ１３ｂテザリングから標的部位への局所濃度の増加により、オンターゲット編集を維持することを仮定した。ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）バックグラウンド上の標的ＲＮＡ（図５４Ａ）（１８）の二本鎖領域に接触するように予め決められたＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）残基を突然変異させた。効率及び特異性を評価するため、検出されたノンターゲティング条件におけるバックグラウンドルシフェラーゼ回復がより広範なオフターゲット活性を示唆するという仮定の元に、ターゲティング及びノンターゲティングガイドの両方を有する１７個の単一突然変異体を試験した。選択された残基の突然変異は、ターゲティング及びノンターゲティングガイドのルシフェラーゼ活性に著しい効果を有することが判明した（図５４Ａ、５４Ｂ、図６１Ａ）。大多数の突然変異体は、ターゲティングガイドのルシフェラーゼ活性を著しく改善させるかまたは、ノンターゲティングガイド活性に対するターゲティング活性の比（特異性スコアと名付けた）を増加させた（図５４Ａ、Ｂ）。次世代シーケンシングによるトランスクリプトームワイド特異性プロファイリングのためのこれらの突然変異体のサブセット（図５４Ｂ）を選択した。予想通り、トランスクリプトームワイドシーケンシングから測定したオフターゲットは、突然変異体の特異性スコア（図６１Ｂ）と相関した。ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ／Ｒ４５５Ｅ）を除いて、配列決定した全てのＲＥＰＡＩＲｖ１突然変異体は、レポーター転写物を効率的に編集することができ（図５４Ｃ）、多くの突然変異体は、オフターゲットの数の減少を示した（図６１Ｃ、６２）ことが判明した。特異的突然変異体のオフターゲットの周辺モチーフをさらに探索し、ＲＥＰＡＩＲｖ１及びほとんどのエンジニアリングされた突然変異体が、特徴付けられたＡＤＡＲ２モチーフに一致して、編集において強い３’Ｇ選好性を呈したことが判明した（図６３Ａ）（２６）。突然変異体ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ／Ｔ３７５Ｇ）は、４つの突然変異体のパーセント編集が最も高く、トランスクリプトームワイドオフターゲットの数が最も少ないため、突然変異体ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ／Ｔ３７５Ｇ）をさらなる実験のために選択し、ＲＥＰＡＩＲｖ２と名付けた。ＲＥＰＡＩＲｖ１と比較して、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、特異性の増加を呈し、トランスクリプトームオフターゲットは、１７３２個から１０個に減少した（図５４Ｄ）。Ｃｌｕｃにおける標的化アデノシンを取り囲む領域では、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、オフターゲット編集を減少させ、シーケンシング痕跡を見ることができた（図５４Ｅ）。次世代シーケンシングから得られるモチーフでは、ＲＥＰＡＩＲｖ１は、３’Ｇへの強い選好性を示したが、全てのモチーフのオフターゲティング編集を示した（図６３Ｂ）；これに対し、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、最も強いオフターゲットモチーフのみを編集した（図６３Ｃ）。転写物上の編集の分布は大きく歪み、高度に編集された遺伝子は、６０個を上回る編集を有する一方（図６４Ａ、６４Ｂ）、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、１つの転写物（ＥＥＦ１Ａ１）のみを複数回編集した（図６４Ｄ～６４Ｆ）。ＲＥＰＡＩＲｖ１オフターゲット編集は、多くの変異体をもたらすことが予測され、例えば、９３個の発がん性事象（図６４Ｄ）を有する１０００個のミスセンス突然変異（図６４Ｃ）であった。これに対し、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、６個のミスセンス突然変異のみを有し（図６４Ｅ）、どれも発がん性の結果を有さなかった（図６４Ｆ）。予測されたオフターゲット効果の低下は、ＲＥＰＡＩＲｖ２を他のＲＮＡ編集アプローチと区別する。
ＲＥＰＡＩＲｖ２を内因性遺伝子に標的化して、特異性強化型突然変異が、高効率のオンターゲット編集を維持しながら、標的転写物における近くの編集を減少させたかどうか試験した。ＫＲＡＳまたはＰＰＩＢのいずれかを標的化するガイドでは、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、ＲＥＰＡＩＲｖ１とは異なり、検出可能なオフターゲット編集を有さず、オンターゲットアデノシンをそれぞれ２７．１％及び１３％で効率的に編集することができたことが判明した（図５４Ｆ、５４Ｇ）。この特異性は、ＲＥＰＡＩＲｖ１のノンターゲティング条件において高レベルのバックグラウンドを示す領域を含む、追加の標的部位、例えば、他のＫＲＡＳまたはＰＰＩＢ標的部位に伸長した（図６５Ａ～６５Ｃ）。全体的に、ＲＥＰＡＩＲｖ２は、編集されたアデノシンまわりの二本鎖領域におけるオフターゲットを排除し、トランスクリプトームワイド特異性の劇的な強化を示した。
結論
ＲＮＡガイドＲＮＡターゲティングＶＩ－Ｂ型エフェクターＣａｓ１３ｂは、非常に効率的かつ特異的なＲＮＡノックダウンをすることができ、必須遺伝子及び非コードＲＮＡを詮索し、ならびにトランスクリプトームレベルでの細胞プロセスを制御するための改善ツールの基礎を提供することを本明細書に示した。触媒的に不活性なＣａｓ１３ｂ（ｄＣａｓ１３ｂ）は、プログラム可能なＲＮＡ結合能力を保持し、ｄＣａｓ１３ｂをアデノシンデアミナーゼＡＤＡＲ２に融合することでレバレッジを掛けて、正確なＡ→Ｉ編集を達成し、系を、ＲＥＰＡＩＲｖ１（プログラム可能なＡ－ｔｏ－Ｉ置換のためのＲＮＡ編集バージョン１）と名付ける。系のさらなるエンジニアリングにより、ＲＥＰＡＩＲｖ２が得られ、これは、特異性が劇的に改善した現在の編集プラットフォームと比べて、活性が同等または増加した方法である。
Ｃａｓ１３ｂは高忠実度を呈するが、ｄＣａｓ１３ｂ－ＡＤＡＲ２ＤＤ融合物による初期結果は、数千個のオフターゲットを明らかにした。これに対処するため、合理的な突然変異誘発戦略を採用して、ＲＮＡ二本鎖に接触するＡＤＡＲ２ＤＤ残基を変化させ、ｄＣａｓ１３ｂに融合した場合に正確で効率的かつ非常に特異的な編集を行うことができる変異体、ＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ／Ｔ３７５Ｇ）を同定した。この変異体による編集効率は、２つの現在利用可能な系、ボックスＢ－ＡＤＡＲＤＤまたはＡＤＡＲ２編集で達成されたものと同等またはそれ以上であった。さらに、ＲＥＰＡＩＲｖ２系は、全トランスクリプトームにおいて１０個のみの観察可能なオフターゲットを生成し、両方の代替編集技術よりも少なくとも一桁良好であった。
ＲＥＰＡＩＲ系は、他の核酸編集ツールと比較して、多くの利点を提供する。第一に、正確な標的部位は、ガイド伸長内のシチジンを所望のアデノシンの向かい側に配置することによってガイドにコードされて、ＡＤＡＲ編集活性に理想的な良好なＡ－Ｃミスマッチを作成することができる。第二に、Ｃａｓ１３は、ＰＦＳまたはＰＡＭなどのターゲティング配列制約を有さず、かつ、標的アデノシンを取り囲むモチーフ選好性を有さないため、トランスクリプトームにおける任意のアデノシンを、ＲＥＰＡＩＲ系により潜在的に標的化することができる。しかしながら、ＤＮＡ塩基エディターは、センスまたはアンチセンス鎖のいずれかを標的にすることができる一方、ＲＥＰＡＩＲ系は、転写配列に限定されることで、標的にすることができる可能な編集部位の総数を制約することができることに留意されたい。しかしながら、ＲＥＰＡＩＲによる標的化のより柔軟な性質により、この系は、Ｃａｓ９－ＤＮＡ塩基エディターよりも、ＣｌｉｎＶａｒ（図５２Ｃ）内のより多くの編集に効果を有することができる。第三に、ＲＥＰＡＩＲ系は、標的アデノシンをイノシンに直接脱アミノ化して、塩基除去修復またはミスマッチ修復などの内因性修復経路に依存せず、所望の編集結果を生成する。従って、ＲＥＰＡＩＲは、他の編集形態を支持することができない非分裂細胞で可能でなければならない。第四に、ＲＮＡ編集は一過性であり得、編集結果にわたる潜在的な時間的制御を可能にする。この特性は、局所炎症などの細胞状態における一時的な変化が引き起こす疾患の治療におそらく有用であろう。
ＲＥＰＡＩＲ系は、追加のエンジニアリングに対する多くの機会を提供する。Ｃａｓ１３ｂは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡプロセシング活性（１３）を有し、単体では疾患リスクを変化させない場合があるが、一緒だと追加の効果及び疾患改変の可能性を有し得る多数の変異体の多重編集を可能にする。有望な突然変異の組み合わせなど合理的な設計アプローチの拡張は、系の特異性及び効率をさらに増すことができる一方、不偏のスクリーニングアプローチは、ＲＥＰＡＩＲ活性及び特異性を改善するための追加の残基を同定することができた。
現在、ＲＥＰＡＩＲによって達成可能な塩基変換は、アデノシンからイノシンの生成に制限され；ｄＣａｓ１３と他の触媒ＲＮＡ編集ドメインとの追加の融合物、例えば、ＡＰＯＢＥＣは、シチジン→ウリジン編集を可能にすることができた。加えて、ＡＤＡＲの突然変異誘発は、標的シチジンに対する基質選好性を緩めることができ、Ｃ→Ｕエディターによって利用されるべき二本鎖ＲＮＡ基質要件によって付与される特異性を強化することができる。また、ＤＮＡ基質上のアデノシン→イノシン編集は、ＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二本鎖標的（２７）の形成またはＡＤＡＲドメインの突然変異誘発のいずれかを通じて、ｄＣａｓ９またはｄＣｐｆ１などの触媒的に不活性なＤＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターによって可能になり得る。
ＲＥＰＡＩＲは、Ａ→Ｉ（Ａ→Ｇ）編集が疾患進行を反転または遅らせることができる広範な治療指標に向けて適用することができた（図６６）。第一に、疾患関連組織における原因となるメンデル型Ｇ→Ａ突然変異の標的化のためのＲＥＰＡＩＲの発現を使用して、有害な突然変異を戻して、疾患を治療することができた。例えば、脳組織中のＡＡＶを介した安定ＲＥＰＡＩＲ発現を使用して、焦点てんかんを引き起こすＧＲＩＮ２Ａミスセンス突然変異ｃ．２１９１Ｇ＞Ａ（Ａｓｐ７３１Ａｓｎ）（２８）または早期発症のアルツハイマー病を引き起こすＡＰＰミスセンス突然変異ｃ．２１４９Ｇ＞Ａ（Ｖａｌ７１７Ｉｌｅ）（２９）を補正することができた。第二に、ＲＥＰＡＩＲを使用して、疾患関連シグナル伝達に関与するタンパク質の機能を改変することによって疾患を治療することができた。例えば、ＲＥＰＡＩＲ編集は、キナーゼの標的であるいくつかのセリン、トレオニン及びチロシン残基を再コードすることができる（図６６）。疾患関連タンパク質におけるこれらの残基のリン酸化は、アルツハイマー病及び多数の神経変性状態を含む多くの障害の疾患進行に影響を及ぼす（３０）。第三に、ＲＥＰＡＩＲを使用して、発現したリスク改変するＧ→Ａ変異体の配列を変化させて、患者が疾患状態に入る可能性を先制的に減少させることができた。最も興味深い事例は、疾患状態に入る可能性を劇的に減少させて、場合によっては、追加の健康上の利点を与える「保護的な」リスク改変対立遺伝子である。例えば、ＲＥＰＡＩＲを使用して、心血管疾患及び乾癬性関節炎（３１）に対してそれぞれ保護するＰＣＳＫ９及びＩＦＩＨ１のＡ→Ｇ対立遺伝子を機能的に模倣することができた。最後に、ＲＥＰＡＩＲを使用して、エクソン調節療法のためのスプライスアクセプター及びドナー部位を治療的に改変することができる。ＲＥＰＡＩＲは、コンセンサス５’スプライスドナーまたは３’スプライスアクセプター部位とそれぞれ機能的に等価なＡＵ→ＩＵまたはＡＡ→ＡＩを変化させて、新しいスプライス接合部を作成することができる。加えて、ＲＥＰＡＩＲ編集は、ＡＧ→ＩＧからコンセンサス３’スプライスアクセプター部位を突然変異させて、隣接下流エクソンのスキッピングを促進することができ、この治療戦略は、ＤＭＤの治療のために大きな関心を受けている。スプライス部位の調節は、例えば、脊髄性筋萎縮症の治療のためのＳＭＮ２スプライシングの調節のために、アンチセンスオリゴがある程度の成功を収めた疾患において広範の適用を有することができた（３２）。
ＲＮＡノックダウン及びＲＮＡ編集ツールの両方としてＰｓｐＣａｓ１３ｂ酵素の使用を実証した。プログラム可能なＲＮＡ結合のためのｄＣａｓ１３ｂプラットフォームは、ライブの転写物イメージング、スプライシング改変、転写物の標的化局在化、ＲＮＡ結合タンパク質のプルダウン、及びエピトランスクリプトーム改変を含む多くの適用を有する。ここで、ｄＣａｓ１３を使用して、ＲＥＰＡＩＲを作成し、既存の一連の核酸編集技術に加えた。ＲＥＰＡＩＲは、遺伝性疾患を治療するかまたは保護対立遺伝子を模倣する新しいアプローチを提供し、遺伝機能を改変する有用なツールとしてＲＮＡ編集を確立する。
Figure 2023134462000049
Figure 2023134462000050
Figure 2023134462000051
Figure 2023134462000052
Figure 2023134462000053
Figure 2023134462000054
Figure 2023134462000055
Figure 2023134462000056
Figure 2023134462000057
Figure 2023134462000058
Figure 2023134462000059
Figure 2023134462000060
Figure 2023134462000061
Figure 2023134462000062
Figure 2023134462000063
Figure 2023134462000064
Figure 2023134462000065
Figure 2023134462000066
Figure 2023134462000067
Figure 2023134462000068
Figure 2023134462000069
Figure 2023134462000070
Figure 2023134462000071
Figure 2023134462000072
Figure 2023134462000073
Figure 2023134462000074
Figure 2023134462000075
Figure 2023134462000076
Figure 2023134462000077
Figure 2023134462000078
Figure 2023134462000079
Figure 2023134462000080
Figure 2023134462000081
Figure 2023134462000082
Figure 2023134462000083
Figure 2023134462000084
Figure 2023134462000085
Figure 2023134462000086
Figure 2023134462000087
Figure 2023134462000088
Figure 2023134462000089
Figure 2023134462000090
Figure 2023134462000091
Figure 2023134462000092
Figure 2023134462000093
Figure 2023134462000094
Figure 2023134462000095
参照文献
１．Ｐ．Ｄ．Ｈｓｕ，Ｅ．Ｓ．Ｌａｎｄｅｒ，Ｆ．Ｚｈａｎｇ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ １５７，１２６２－１２７８（２０１４）．
２．Ａ．Ｃ．Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｈ．Ｂａｄｒａｎ，Ｄ．Ｒ．Ｌｉｕ，ＣＲＩＳＰＲ－Ｂａｓｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｃｅｌｌ １６８，２０－３６（２０１７）．
３．Ｌ．Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９－８２３（２０１３）．
４．Ｐ．Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３－８２６（２０１３）．
５．Ｂ．Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｐｆ１ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ １６３，７５９－７７１（２０１５）．
６．Ｈ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １５，３２１－３３４（２０１４）．
７．Ａ．Ｃ．Ｋｏｍｏｒ，Ｙ．Ｂ．Ｋｉｍ，Ｍ．Ｓ．Ｐａｃｋｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｚｕｒｉｓ，Ｄ．Ｒ．Ｌｉｕ，Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４２０－４２４（２０１６）．
８．Ｋ．Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，（２０１６）．
９．Ｙ．Ｂ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｃｏｐｅ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９－ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３５，３７１－３７６（２０１７）．
１０．Ｏ．Ｏ．Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｓ１３ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ５５７３（２０１６）．
１１．Ｓ．Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６０，３８５－３９７（２０１５）．
１２．Ｓ．Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １５，１６９－１８２（２０１７）．
１３．Ａ．Ａ．Ｓｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｓ１３ｂ Ｉｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮａｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６５，６１８－６３０ ｅ６１７（２０１７）．
１４．Ｊ．Ｓ．Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃａｓ１３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５６，４３８－４４２（２０１７）．
１５．Ｏ．Ｏ．Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ．Ｎａｔｕｒｅ ｉｎ ｐｒｅｓｓ，（２０１７）．
１６．Ｋ．Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７９，３２１－３４９（２０１０）．
１７．Ｂ．Ｌ．Ｂａｓｓ，Ｈ．Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ａｎ ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｈａｔ ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｉｔｓ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｃｅｌｌ ５５，１０８９－１０９８（１９８８）．
１８．Ｍ．Ｍ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＡＤＡＲ２ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｄｓＲＮＡ ｒｅｖｅａｌ ｂａｓｅ－ｆｌｉｐｐｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｓｉｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３，４２６－４３３（２０１６）．
１９．Ａ．Ｋｕｔｔａｎ，Ｂ．Ｌ．Ｂａｓｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｅｄｉｔｉｎｇ－ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＡＤＡＲｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９，Ｅ３２９５－３３０４（２０１２）．
２０．Ｓ．Ｋ．Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓａｔｏ，Ｄ．Ｗ．Ｌａｚｉｎｓｋｉ，Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ａｎｄ ＡＤＡＲ２．ＲＮＡ ７，８４６－８５８（２００１）．
２１．Ｍ．Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｕｉｄｅ－ＲＮＡ ｆｏｒ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｔｉｌｉｓｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ａ－ｔｏ－Ｉ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，４１４７８（２０１７）．
２２．Ｍ．Ｆ．Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｉ．Ｖａｌｌｅｃｉｌｌｏ－Ｖｉｅｊｏ，Ｇ．Ａ．Ｙｕｄｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｂｙ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０，１８２８５－１８２９０（２０１３）．
２３．Ｍ．Ｆ．Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｉ．Ｃ．Ｖａｌｌｅｃｉｌｌｏ－Ｖｉｅｊｏ，Ｊ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｍＲＮＡｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４，ｅ１５７（２０１６）．
２４．Ｊ．Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌ，Ｐ．Ｒｅａｕｔｓｃｈｎｉｇ，Ｓ．Ｇｅｉｓｌｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ｋａｈｌｅ，Ｔ．Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ，Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＡＤＡＲ２ ｆｏｒ ＲＮＡ ｒｅｐａｉｒ － Ｒｅｃｏｄｉｎｇ ａ ＰＩＮＫ１ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｃｕｅｓ ｍｉｔｏｐｈａｇｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４５，２７９７－２８０８（２０１７）．
２５．Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｈａｖｅｌ，Ｐ．Ａ．Ｂｅａｌ，Ａ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ １．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０，２５１２－２５１９（２０１５）．
２６．Ｋ．Ａ．Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｂ．Ｌ．Ｂａｓｓ，Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ ＡＤＡＲ１ ａｎｄ ＡＤＡＲ２ ｈａｖｅ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９，１２８７５－１２８８４（２０００）．
２７．Ｙ．Ｚｈｅｎｇ，Ｃ．Ｌｏｒｅｎｚｏ，Ｐ．Ａ．Ｂｅａｌ，ＤＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ ｂｙ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ ｔｈａｔ ａｃｔ ｏｎ ＲＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４５，３３６９－３３７７（２０１７）．
２８．Ｋ．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｄｅ ｎｏｖｏ ｌｏｓｓ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ＧＲＩＮ２Ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｆｏｃａｌ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ａｎｄ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ａｐｈａｓｉａ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２，ｅ０１７０８１８（２０１７）．
２９．Ｈ．Ｍ．Ｌａｎｏｉｓｅｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＡＰＰ，ＰＳＥＮ１，ａｎｄ ＰＳＥＮ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ－ｏｎｓｅｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ： Ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｎｄ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｃａｓｅｓ．ＰＬｏＳ Ｍｅｄ １４，ｅ１００２２７０（２０１７）．
３０．Ｃ．Ｂａｌｌａｔｏｒｅ，Ｖ．Ｍ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｑ．Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｔａｕ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ８，６６３－６７２（２００７）．
３１．Ｙ．Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ｒａｒｅ ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ＩＦＩＨ１ ａｒｅ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １３０，２７６８－２７７２（２０１０）．
３２．Ｒ．Ｓ．Ｆｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆａｎｔｉｌｅ－ｏｎｓｅｔ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ ｗｉｔｈ ｎｕｓｉｎｅｒｓｅｎ： ａ ｐｈａｓｅ ２，ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ，ｄｏｓｅ－ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ ３８８，３０１７－３０２６（２０１６）．
実施例４
ｄＣａｓ１３ｂの短縮は、ＲＮＡ編集用に生成した。
２０アミノ酸間隔におけるＮ末端及びＣ末端からの短縮を生成し、Ａ→Ｉ ＲＮＡ編集の文脈で試験した。ｄＣａｓ１３ｂ６（Δ７９５－１０９５）－ＧＳ－ＨＩＶＮＥＳ－ＧＳ－ｈｕＡＤＡＲ２ｄｄを最終構築物として選択し、ＡＡＶにパッケージングした。
Ｃａｓ１３ｂ６（ＲａｎＣａｓ１３ｂ）、Ｃａｓ１３ｂ１１（ＰｇｕＣａｓ１３ｂ）、及びＣａｓ１３ｂ１２（ＰｓｐＣａｓ１３ｂ）を含むＣａｓ１３ｂオルソログを試験した。オルソログごとに、Ｃａｓ１３ｂオルソログのＮ末端（赤色）及びＣ末端（青色）の各々から２０アミノ酸を徐々に短縮した。その後、この短縮されたタンパク質をＡＤＡＲ２ｄｄ（Ｅ４８８Ｑ）に融合し、発現対照としてＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼを有するＣｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼにおける成熟前終止コドンのＲＮＡ編集活性のための融合タンパク質を評価した。Ｃａｓ１３ｂ６（ＲａｎＣａｓ１３ｂ）のＣ末端の３００アミノ酸を短縮することで、ＲＮＡ編集活性の約２／３を保持することができた一方、ＡＡＶのパッケージング制限に許容できるほど近くタンパク質を短くすることができたことが判明した。ＡＡＶは概して、約４．７ｋｂのゲノムをパッケージングすることができ、パッケージング効率は、大きいゲノムでは減少する。Ｃａｓ１３ｂ６、Ｃａｓ１３ｂ１１、及びＣａｓ１３ｂ１２の試験結果を図６７～６９にそれぞれ示す。
ｄＣａｓ１３ｂ６（Δ７９５－１０９５）－ＲＥＰＡＩＲ構築物を、ＡＡＶを用いて、一次ニューロン培養に送達した。一次ラット皮質ニューロン培養を使用して、ＭＡＰ２転写物の編集を試験した。送達する場合、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２ハイブリッドカプシドを使用した。ミスマッチ距離（ガイドＲＮＡスペーサー配列におけるダイレクトリピートからミスマッチ塩基までの距離）を測定した。
図７０の概略図と同様に、ＡＤＡＲ２ｄｄ（Ｅ４８８Ｑ）に融合したＣ末端から３００アミノ酸を除去したＣａｓ１３ｂ６を使用して、一次ラット皮質ニューロンにおけるＭＡＰ２転写物にサイレント突然変異を作成した。ＭＡＰ２は、ニューロン特異的マーカーであり、さらに、ＲＥＰＡＩＲタンパク質をヒトシナプシンプロモーター下で発現させて、系のニューロン特異的発現を増加させた。ＡＡＶ１／ＡＡＶ２ハイブリッドカプシドを用いて、これを一次ラット皮質ニューロン培養に送達し、標的部位にて特異的ガイドＲＮＡ設計を最大で２０％の編集を達成した（図７０）。
系をさらに使用して、一次ラット皮質ニューロン培養におけるＡＡＶ１／２ハイブリッドカプシドを用いて図７１に詳述する系を送達することによって、すでに天然ＡＤＡＲ２基質であるカリウムイオンチャネルＫｃｎａ１における部位の編集を調節した。ＲＥＰＡＩＲ系をこれらの細胞に送達することによって、編集された転写物のパーセントを増加させることができた一方、ガイドＲＮＡは、この活性を指示するために必ずしも必要ではなかったことが判明した。この理由はおそらく、ガイドＲＮＡは、すでにＡＤＡＲ２の天然基質であるため、ガイドＲＮＡは、この部位での編集を誘発するのに必要ではなかったと思われる。この結果は、ＡＤＡＲ２触媒ドメインを含んだ構築物の過剰発現が、これらの天然基質での飽和編集を開始するのに十分であった可能性を示唆している。
図７２は、ｄＣａｓ１３ｂ６（Δ７９５－１０９５）－ＧＳ－ＨＩＶＮＥＳ－ＧＳ－ｈｕＡＤＡＲ２ｄｄを含むプラスミドの概略図を示す。プラスミドの配列を以下の表に示す。
Figure 2023134462000096
Figure 2023134462000097
Figure 2023134462000098
Figure 2023134462000099
Figure 2023134462000100
Figure 2023134462000101
実施例５
ＲＮＡ編集用の哺乳類構築物の設計及びクローニング
短縮型のＣａｓ１２ｂを生成するため、ｄＣａｓ１３ｂをＰＣＲ増幅するようにプライマーを設計し、ｄＣａｓ１３ｂをＣ末端（合計で１５個の短縮）の６０ｂｐ（２０アミノ酸）から徐々に最大９００ｂｐまで短縮し、これらの短縮型Ｃａｓ１３ｂ遺伝子を、上述のｐｃＤＮＡ－ＣＭＶ－ＡＤＡＲ２骨格にギブソンクローニングした。Ｃｌｕｃを標的化するガイドＲＮＡを、ゴールデンゲートクローニングを用いて、Ｕ６プロモーターの元、スペーサー配列目的部位の３’末端で、このオルソログのダイレクトリピート配列を含む哺乳類発現ベクターにクローニングした。
使用したルシフェラーゼレポーターは、ＲＮＡ編集を測定するためにＣｏｘ ｅｔ．ａｌ．（２０１７）が使用したＣＭＶ－Ｃｌｕｃ（Ｗ８５Ｘ）ＥＦ１ａｌｐｈａ－Ｇｌｕｃ デュアルルシフェラーゼレポーターであった。このレポーターベクターは、正規化対照として機能性Ｇｌｕｃを発現するが、Ｗ８５Ｘ成熟前終止部位の付加により欠損Ｃｌｕｃであった。
哺乳類細胞におけるＲＥＰＡＩＲ編集
哺乳類細胞におけるＲＥＰＡＩＲ活性を評価するため、１５０ｎｇのＲＥＰＡＩＲベクター、３００ｎｇのガイド発現プラスミド、及び４５ｎｇのＲＮＡ編集レポーターをトランスフェクトした。その後、分泌ルシフェラーゼを含む培地を４８時間後に収穫し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中で培地１：１０に（１０μｌの培地を９０μｌのＰＢＳ中に）希釈した。注入プロトコルにより、プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２）上のＢｉｏＬｕｘ Ｃｙｐｒｉｄｉｎｉａ及びＢｉｏｌｕｘ Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）でルシフェラーゼ活性を測定した。行った全ての反復は、生物学的反復である。
ＡＤＡＲデアミナーゼドメインに融合したヌクレアーゼ失活Ｃａｓ１３ｂをＲＥＰＡＩＲに使用して、標的化ＲＮＡ塩基編集を達成した。ＡＡＶ媒介性送達は、遺伝子治療に一般的に使用されるが、ＲＥＰＡＩＲは、ＡＡＶのカーゴ容量のサイズ制限を超えていた。Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５－１２５（ＰｓｐＣａｓ１３ｂ）のＣ末端短縮が、ＲＥＰＡＩＲ活性を減少させなかったことを予め示した。Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ（ＰｇｕＣａｓ１３ｂ）由来のＣａｓ１３ｂの別のオルソログをさらに使用した。これは安定して発現され、ＰｂｕＣａｓ１３ｂとは対照的に、哺乳類細胞中で高い活性を示した。ＰｂｕＣａｓ１３ｂとＰｇｕＣａｓ１３ｂのアラインメントに基づいて、ＰｇｕＣａｓ１３ｂ短縮を作成して、ＨＥＰＮ２ドメインを除去し、それをＡＤＡＲに融合して、ＲＥＰＡＩＲ系による塩基編集を実行する能力について試験した。驚くべきことに、これらの短縮型突然変異体は、ＲＮＡ標的化を保持しただけでなく、いくつかは、ＲＮＡ編集で有意により効率的であった（図７３）。
本発明の記載された方法、医薬組成物、及びキットの種々の改変及び変形は、本発明の範囲及び精神を逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は、特定の実施形態に関連して記載されたが、本発明をさらに改変することができ、かつ、特許請求される発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際、当業者に明らかである本発明を実施するために記載される態様の種々の改変は、本発明の範囲内にあることが意図される。本出願は、本発明の任意の変形、使用、または適応を含むように意図され、これらは、一般的に本発明の原理に従い、本発明が属する分野内の公知または通常の実施内の本開示からのこのような逸脱を含み、本明細書で上記に記載の必須の特徴へ適用され得る。

Claims (34)

  1. 触媒的に不活性なＣａｓ１３エフェクタータンパク質（ｄＣａｓ１３）、または前記触媒的に不活性なＣａｓ１３エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、エンジニアリングされた天然に存在しない系。
  2. 前記ｄＣａｓ１３タンパク質が、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方で短縮される、請求項１に記載の系。
  3. 前記ｄＣａｓ１３が、前記Ｃ末端上の少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０、少なくとも２００、少なくとも２２０、少なくとも２４０、少なくとも２６０、または少なくとも３００アミノ酸短縮される、請求項２に記載の系。
  4. 前記ｄＣａｓ１３が、前記Ｎ末端上の少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０、少なくとも２００、少なくとも２２０、少なくとも２４０、少なくとも２６０、または少なくとも３００アミノ酸短縮される、請求項２に記載の系。
  5. 前記Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質の短縮型が、Ｃ末端Δ９８４－１０９０、Ｃ末端Δ１０２６－１０９０、Ｃ末端Δ１０５３－１０９０、Ｃ末端Δ９３４－１０９０、Ｃ末端Δ８８４－１０９０、Ｃ末端Δ８３４－１０９０、Ｃ末端Δ７８４－１０９０、またはＣ末端Δ７３４－１０９０で短縮されており、前記短縮のアミノ酸位置が、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する、請求項２に記載の系。
  6. 前記Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質の短縮型が、Ｃ末端Δ７９５－１０９５で短縮されており、前記短縮のアミノ酸位置が、Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する、請求項２に記載の系。
  7. 前記Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質の短縮型が、Ｃ末端Δ８７５－１１７５、Ｃ末端Δ８９５－１１７５、Ｃ末端Δ９１５－１１７５、Ｃ末端Δ９３５－１１７５、Ｃ末端Δ９５５－１１７５、Ｃ末端Δ９７５－１１７５、Ｃ末端Δ９９５－１１７５、Ｃ末端Δ１０１５－１１７５、Ｃ末端Δ１０３５－１１７５、Ｃ末端Δ１０５５－１１７５、Ｃ末端Δ１０７５－１１７５、Ｃ末端Δ１０９５－１１７５、Ｃ末端Δ１１１５－１１７５、Ｃ末端Δ１１３５－１１７５、Ｃ末端Δ１１５５－１１７５で短縮されており、アミノ酸位置が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する、請求項２に記載の系。
  8. 前記Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質の短縮型が、Ｎ末端Δ１－１２５、Ｎ末端Δ１－８８、またはＮ末端Δ１－７２で短縮されており、前記短縮のアミノ酸位置が、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する、請求項２に記載の系。
  9. 前記ｄＣａｓ１３が、前記Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質のＨＥＰＮドメインで、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質の短縮型を含む、請求項１に記載の系。
  10. 前記Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１３ａである、請求項１に記載の系。
  11. 前記Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１３ｂである、請求項１に記載の系。
  12. 前記Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１３ｃまたはＣａｓ１３ｄである、請求項１に記載の系。
  13. 機能性成分をさらに含む、または前記ヌクレオチド配列が、前記機能性成分をさらにコードする、請求項１に記載の系。
  14. 前記機能性成分が、塩基編集成分である、請求項１３に記載の系。
  15. 前記塩基編集成分が、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはその触媒ドメインを含む、請求項１４に記載の系。
  16. 前記アデノシンデアミナーゼ、前記シチジンデアミナーゼ、またはその前記触媒ドメインが、前記ｄＣａｓ１３に融合される、請求項１５に記載の系。
  17. 前記アデノシンデアミナーゼ、前記シチジンデアミナーゼ、またはその前記触媒ドメインが、リンカーによって、前記ｄＣａｓ１３に融合される、請求項１６に記載の系。
  18. 前記アデノシンデアミナーゼ、前記シチジンデアミナーゼ、またはその前記触媒ドメインが、前記ｄＣａｓ１３の内部ループに挿入される、請求項１５に記載の系。
  19. 前記アデノシンデアミナーゼ、前記シチジンデアミナーゼ、またはその前記触媒ドメインが、アダプタータンパク質に連結される、請求項１５に記載の系。
  20. 前記アダプタータンパク質が、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１から選択される、請求項１９に記載の系。
  21. 前記アデノシンデアミナーゼ、前記シチジンデアミナーゼ、またはその前記触媒ドメインが、ヒト、頭足類、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａタンパク質である、請求項１５に記載の系。
  22. 前記ｄＣａｓ１３が、スプリットＣａｓ１３エフェクタータンパク質である、請求項１に記載の系。
  23. 前記スプリットＣａｓ１３エフェクタータンパク質が、第１のスプリットＣａｓ１３エフェクタータンパク質であり、第２のスプリットＣａｓ１３エフェクタータンパク質に融合して、触媒的に活性なＣａｓ１３エフェクタータンパク質を形成することができる、請求項２２に記載の系。
  24. 前記第１及び前記第２のＣａｓ１３エフェクタータンパク質の融合が、誘導性である、請求項２３に記載の系。
  25. 前記機能性成分が、転写因子またはその活性ドメインである、請求項１３に記載の系。
  26. 前記ｄＣａｓ１３が、前記転写因子またはその前記活性ドメインと融合される、請求項２５に記載の系。
  27. ガイド配列をさらに含む、請求項１に記載の系。
  28. 先行請求項のいずれか１項に記載のｄＣａｓ１３をコードする１つ以上のベクターを含む、ベクター系。
  29. 請求項１～２７のいずれか１項に記載の系を含む、インビトロまたはエキソビボの宿主細胞もしくはその子孫または細胞株もしくはその子孫。
  30. 請求項１～２１のいずれか１項に記載の系を細胞に送達することを含む、標的配列のプログラム可能なかつ標的化された塩基編集の方法。
  31. 目的の前記標的配列を決定すること、及び前記標的配列に存在するアデニンまたはシチジンを最も効率的に脱アミノ化するアデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはその触媒ドメインを選択することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記脱アミノ化が、病原性Ｔ（Ｕ）→Ｃ、Ａ→Ｇ、Ｇ→Ａ、またはＣ→Ｔ点突然変異を含む転写物によって引き起こされる疾患を治す、請求項３１に記載の方法。
  33. 標的遺伝子座での核酸の改変方法であって、
    （１）請求項１に記載の系であって、前記ｄＣａｓ１３は、第１のスプリットＣａｓ１３エフェクタータンパク質である、前記系、及び（２）第２のスプリットＣａｓ１３エフェクタータンパク質であって、前記第１及び前記第２のスプリットＣａｓ１３エフェクタータンパク質は、触媒的に活性なＣａｓ１３エフェクタータンパク質を形成することができる、前記第２のスプリットＣａｓ１３エフェクタータンパク質、を送達することを含む、前記方法。
  34. 細胞中の標的遺伝子の調節方法であって、
    請求項１に記載の系を送達することを含み、前記ｄＣａｓ１３は、転写因子またはその活性ドメインに融合される、前記方法。
JP2023100415A 2017-09-21 2023-06-20 標的化核酸編集のための系、方法、及び組成物 Pending JP2023134462A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762561669P 2017-09-21 2017-09-21
US62/561,669 2017-09-21
JP2020516525A JP2020535802A (ja) 2017-09-21 2018-09-21 標的化核酸編集のための系、方法、及び組成物
JP2021152800A JP2022000041A (ja) 2017-09-21 2021-09-21 標的化核酸編集のための系、方法、及び組成物

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021152800A Division JP2022000041A (ja) 2017-09-21 2021-09-21 標的化核酸編集のための系、方法、及び組成物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023134462A true JP2023134462A (ja) 2023-09-27

Family

ID=65810620

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020516525A Pending JP2020535802A (ja) 2017-09-21 2018-09-21 標的化核酸編集のための系、方法、及び組成物
JP2021152800A Pending JP2022000041A (ja) 2017-09-21 2021-09-21 標的化核酸編集のための系、方法、及び組成物
JP2023100415A Pending JP2023134462A (ja) 2017-09-21 2023-06-20 標的化核酸編集のための系、方法、及び組成物

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020516525A Pending JP2020535802A (ja) 2017-09-21 2018-09-21 標的化核酸編集のための系、方法、及び組成物
JP2021152800A Pending JP2022000041A (ja) 2017-09-21 2021-09-21 標的化核酸編集のための系、方法、及び組成物

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11618896B2 (ja)
EP (1) EP3684397A4 (ja)
JP (3) JP2020535802A (ja)
KR (2) KR102338449B1 (ja)
CN (1) CN111511388A (ja)
AU (3) AU2018338318B2 (ja)
CA (1) CA3073848A1 (ja)
WO (1) WO2019060746A1 (ja)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4163374A1 (en) 2015-11-23 2023-04-12 The Regents of the University of California Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9
EP3622062A4 (en) 2017-05-10 2020-10-14 The Regents of the University of California DIRECTED EDITING OF CELLULAR RNA BY NUCLEAR ADMINISTRATION OF CRISPR / CAS9
EP3684397A4 (en) * 2017-09-21 2021-08-18 The Broad Institute, Inc. SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED EDITION OF NUCLEIC ACIDS
AU2018346527A1 (en) * 2017-10-04 2020-05-07 Massachusetts Institute Of Technology Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
US20210130800A1 (en) * 2017-10-23 2021-05-06 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
WO2019104094A2 (en) * 2017-11-21 2019-05-31 The Regents Of The University Of California Fusion proteins and methods for site-directed genome editing
KR20210070305A (ko) 2018-09-18 2021-06-14 브이엔브이 뉴코 인크. Arc 기반 캡시드 및 이의 용도
US20230053540A1 (en) 2019-02-19 2023-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Treatment of liver injury
US20220154282A1 (en) 2019-03-12 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Detection means, compositions and methods for modulating synovial sarcoma cells
WO2020186237A1 (en) 2019-03-13 2020-09-17 The Broad Institute, Inc. Microglial progenitors for regeneration of functional microglia in the central nervous system and therapeutics uses thereof
EP3937969A1 (en) 2019-03-14 2022-01-19 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating cgrp signaling to regulate intestinal innate lymphoid cells
US20220152148A1 (en) 2019-03-18 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Modulation of type 2 immunity by targeting clec-2 signaling
US20220142948A1 (en) 2019-03-18 2022-05-12 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating metabolic regulators of t cell pathogenicity
EP3947687A1 (en) 2019-03-29 2022-02-09 Massachusetts Institute of Technology Constructs for continuous monitoring of live cells
WO2020211780A1 (en) 2019-04-15 2020-10-22 Edigene Inc. Methods and compositions for editing rnas
WO2020214806A1 (en) * 2019-04-16 2020-10-22 The Regents Of The University Of California Protein translational control
WO2020232271A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for targeting multinucleated cells
WO2020243371A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for modulating immune responses
WO2020243661A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 The Broad Institute, Inc. Methods for treating metabolic disorders by targeting adcy5
US20220243194A1 (en) 2019-07-12 2022-08-04 Peking University Targeted rna editing by leveraging endogenous adar using engineered rnas
US20220282333A1 (en) 2019-08-13 2022-09-08 The General Hospital Corporation Methods for predicting outcomes of checkpoint inhibition and treatment thereof
US11793787B2 (en) 2019-10-07 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for enhancing anti-tumor immunity by targeting steroidogenesis
US11844800B2 (en) 2019-10-30 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia
WO2021169980A1 (en) * 2020-02-25 2021-09-02 Shanghaitech University Compositions and methods for detecting nucleic acid-protein interactions
WO2021209010A1 (zh) * 2020-04-15 2021-10-21 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种治疗赫勒氏综合征的方法和药物
WO2021231692A1 (en) * 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of otoferlin (otof)
EP4149518A1 (en) * 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of abca4
WO2021231679A1 (en) * 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of gap junction protein beta 2 (gjb2)
CA3182465A1 (en) * 2020-05-28 2021-12-02 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of serpina1
US11572565B2 (en) 2020-07-21 2023-02-07 Trustees Of Boston University Inducible control of gene expression
US20220073891A1 (en) * 2020-09-02 2022-03-10 Massachusetts Institute Of Technology Systems, methods, and compositions for rna-guided rna-targeting crispr effectors
CN114958920A (zh) * 2021-02-25 2022-08-30 北京中因科技有限公司 一种新型CRISPR-Cas9系统载体及其制备方法和应用
CN112892891B (zh) * 2021-03-03 2022-12-06 武汉伯瑞恒医药科技有限公司 一种抗白血病活性分子及中间体提取用离心装置
US20220301658A1 (en) * 2021-03-19 2022-09-22 X Development Llc Machine learning driven gene discovery and gene editing in plants
WO2023024504A1 (en) * 2021-08-22 2023-03-02 Huigene Therapeutics Co., Ltd. Crispr-cas13 system for treating sod1-associated diseases
WO2023112048A1 (en) * 2021-12-13 2023-06-22 Indian Institute Of Science Crispr-dcas13 system, composition, and method to induce translational readthrough across stop codons
WO2023144104A1 (en) * 2022-01-25 2023-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Base editing approaches for the treatment of βeta-thalassemia
WO2023196818A1 (en) 2022-04-04 2023-10-12 The Regents Of The University Of California Genetic complementation compositions and methods
CN116875633B (zh) * 2023-09-06 2023-11-24 北京首佳利华科技有限公司 雄性不育基因ZmSWEET6及其在创制玉米雄性不育系中的应用

Family Cites Families (314)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US4940835A (en) 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
ES2018274T5 (es) 1986-03-11 1996-12-16 Plant Genetic Systems Nv Celulas vegetales resistentes a los inhibidores de glutamina sintetasa, preparadas por ingenieria genetica.
US4975374A (en) 1986-03-18 1990-12-04 The General Hospital Corporation Expression of wild type and mutant glutamine synthetase in foreign hosts
JP2874751B2 (ja) 1986-04-09 1999-03-24 ジェンザイム・コーポレーション 希望する蛋白質をミルク中へ分泌する遺伝子移植動物
US5276268A (en) 1986-08-23 1994-01-04 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5273894A (en) 1986-08-23 1993-12-28 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5637489A (en) 1986-08-23 1997-06-10 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
EP0333033A1 (en) 1988-03-09 1989-09-20 Meiji Seika Kaisha Ltd. Glutamine synthesis gene and glutamine synthetase
US5906936A (en) 1988-05-04 1999-05-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Endowing lymphocytes with antibody specificity
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US6013861A (en) 1989-05-26 2000-01-11 Zeneca Limited Plants and processes for obtaining them
US5739082A (en) 1990-02-02 1998-04-14 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Method of improving the yield of herbicide-resistant crop plants
US5908810A (en) 1990-02-02 1999-06-01 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Method of improving the growth of crop plants which are resistant to glutamine synthetase inhibitors
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
AU7979491A (en) 1990-05-03 1991-11-27 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5266317A (en) 1990-10-04 1993-11-30 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Insect-specific paralytic neurotoxin genes for use in biological insect control: methods and compositions
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
DE4104782B4 (de) 1991-02-13 2006-05-11 Bayer Cropscience Gmbh Neue Plasmide, enthaltend DNA-Sequenzen, die Veränderungen der Karbohydratkonzentration und Karbohydratzusammensetzung in Pflanzen hervorrufen, sowie Pflanzen und Pflanzenzellen enthaltend dieses Plasmide
GB9104617D0 (en) 1991-03-05 1991-04-17 Nickerson Int Seed Pest control
US5851828A (en) 1991-03-07 1998-12-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
US6753162B1 (en) 1991-03-07 2004-06-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
US5912170A (en) 1991-03-07 1999-06-15 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by protein-tyrosine kinase chimeras
IL101147A (en) 1991-03-07 2004-06-20 Gen Hospital Corp Change of direction of cellular immunity by chimera receptors
US5843728A (en) 1991-03-07 1998-12-01 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US6004811A (en) 1991-03-07 1999-12-21 The Massachussetts General Hospital Redirection of cellular immunity by protein tyrosine kinase chimeras
GB9114259D0 (en) 1991-07-02 1991-08-21 Ici Plc Plant derived enzyme and dna sequences
GB9115909D0 (en) 1991-07-23 1991-09-04 Nickerson Int Seed Recombinant dna
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
US8211422B2 (en) 1992-03-18 2012-07-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric receptor genes and cells transformed therewith
DK39692D0 (da) 1992-03-25 1992-03-25 Danisco Biologisk materiale
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
EP0652965A1 (en) 1992-07-27 1995-05-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of agrobacterium-mediated transformation of cultured soybean cells
DE4227061A1 (de) 1992-08-12 1994-02-17 Inst Genbiologische Forschung DNA-Sequenzen, die in der Pflanze die Bildung von Polyfructanen (Lävanen) hervorrufen, Plasmide enthaltend diese Sequenzen sowie Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen
GB9218185D0 (en) 1992-08-26 1992-10-14 Ici Plc Novel plants and processes for obtaining them
ES2217254T3 (es) 1992-10-14 2004-11-01 Syngenta Limited Nuevas plantas y procesos para obtenerlas.
GB9223454D0 (en) 1992-11-09 1992-12-23 Ici Plc Novel plants and processes for obtaining them
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
US5789156A (en) 1993-06-14 1998-08-04 Basf Ag Tetracycline-regulated transcriptional inhibitors
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
WO1995004826A1 (en) 1993-08-09 1995-02-16 Institut Für Genbiologische Forschung Berlin Gmbh Debranching enzymes and dna sequences coding them, suitable for changing the degree of branching of amylopectin starch in plants
DE4330960C2 (de) 1993-09-09 2002-06-20 Aventis Cropscience Gmbh Kombination von DNA-Sequenzen, die in Pflanzenzellen und Pflanzen die Bildung hochgradig amylosehaltiger Stärke ermöglichen, Verfahren zur Herstellung dieser Pflanzen und die daraus erhaltbare modifizierte Stärke
KR960705938A (ko) 1993-11-09 1996-11-08 미리암 디. 메코너헤이 유전자 전환된 프럭탄 축적 작물 및 그의 제조 방법(Transgenic Fructan Accumulating Crops and Method for Their Production)
EP0754235A1 (en) 1994-03-25 1997-01-22 National Starch and Chemical Investment Holding Corporation Method for producing altered starch from potato plants
JP3555086B2 (ja) 1994-05-18 2004-08-18 プランテック バイオテクノロジスク ゲーエムベーハー フォーシュング アンド エンテゥウィックラング 植物、真菌および微生物中で直鎖型α−１，４グルカンの合成を促進することができる酵素をコードするＤＮＡ配列
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5824790A (en) 1994-06-21 1998-10-20 Zeneca Limited Modification of starch synthesis in plants
EP0802720A4 (en) 1994-06-21 1999-01-13 Zeneca Ltd NEW PLANTS AND THEIR PROCESS FOR OBTAINING
NL1000064C1 (nl) 1994-07-08 1996-01-08 Stichting Scheikundig Onderzoe Produktie van oligosacchariden in transgene planten.
US6007845A (en) 1994-07-22 1999-12-28 Massachusetts Institute Of Technology Nanoparticles and microparticles of non-linear hydrophilic-hydrophobic multiblock copolymers
DE4441408A1 (de) 1994-11-10 1996-05-15 Inst Genbiologische Forschung DNA-Sequenzen aus Solanum tuberosum kodierend Enzyme, die an der Stärkesynthese beteiligt sind, Plasmide, Bakterien, Pflanzenzellen und transgene Pflanzen enhaltend diese Sequenzen
DE4447387A1 (de) 1994-12-22 1996-06-27 Inst Genbiologische Forschung Debranching-Enzyme aus Pflanzen und DNA-Sequenzen kodierend diese Enzyme
AU4634396A (en) 1995-01-06 1996-07-24 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek (Cpro - Dlo) Dna sequences encoding carbohydrate polymer synthesizing enzymes and method for producing transgenic plants
US5712149A (en) 1995-02-03 1998-01-27 Cell Genesys, Inc. Chimeric receptor molecules for delivery of co-stimulatory signals
DE19509695A1 (de) 1995-03-08 1996-09-12 Inst Genbiologische Forschung Verfahren zur Herstellung einer modifizieren Stärke in Pflanzen, sowie die aus den Pflanzen isolierbare modifizierte Stärke
US5994627A (en) 1995-03-31 1999-11-30 Common Wealth Scientific And Industrial Research Organisation Genetic sequences conferring nematode resistance in plants and uses therefor
WO1996034968A2 (en) 1995-05-05 1996-11-07 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Improvements in or relating to plant starch composition
FR2734842B1 (fr) 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
US6284479B1 (en) 1995-06-07 2001-09-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Substitutes for modified starch and latexes in paper manufacture
US5712107A (en) 1995-06-07 1998-01-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Substitutes for modified starch and latexes in paper manufacture
DK0851934T3 (da) 1995-09-19 2006-07-31 Bayer Bioscience Gmbh Planter, som syntetiserer en modificeret stivelse, fremgangsmåder til deres fremstilling samt modificeret stivelse
GB9524938D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Zeneca Ltd Modification of starch synthesis in plants
DE19601365A1 (de) 1996-01-16 1997-07-17 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle aus Pflanzen codierend Enzyme, die an der Stärkesynthese beteiligt sind
DE19608918A1 (de) 1996-03-07 1997-09-11 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle, die neue Debranching-Enzyme aus Mais codieren
DE19618125A1 (de) 1996-05-06 1997-11-13 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle, die neue Debranching-Enzyme aus Kartoffel codieren
DE19619918A1 (de) 1996-05-17 1997-11-20 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle codierend lösliche Stärkesynthasen aus Mais
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
CZ389098A3 (cs) 1996-05-29 1999-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Molekuly nukleové kyseliny kódující enzymy z pšenice účastnící se syntézy škrobu
CA2257621C (en) 1996-06-12 2003-02-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Substitutes for modified starch in paper manufacture
WO1997047808A1 (en) 1996-06-12 1997-12-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Substitutes for modified starch in paper manufacture
WO1997047807A1 (en) 1996-06-12 1997-12-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Substitutes for modified starch in paper manufacture
US5846946A (en) 1996-06-14 1998-12-08 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Compositions and methods for administering Borrelia DNA
US5944710A (en) 1996-06-24 1999-08-31 Genetronics, Inc. Electroporation-mediated intravascular delivery
US5869326A (en) 1996-09-09 1999-02-09 Genetronics, Inc. Electroporation employing user-configured pulsing scheme
GB9907461D0 (en) 1999-03-31 1999-05-26 King S College London Neurite regeneration
GB9623095D0 (en) 1996-11-05 1997-01-08 Nat Starch Chem Invest Improvements in or relating to starch content of plants
US6232529B1 (en) 1996-11-20 2001-05-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of producing high-oil seed by modification of starch levels
DE19653176A1 (de) 1996-12-19 1998-06-25 Planttec Biotechnologie Gmbh Neue Nucleinsäuremoleküle aus Mais und ihre Verwendung zur Herstellung einer modifizierten Stärke
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
DE19708774A1 (de) 1997-03-04 1998-09-17 Max Planck Gesellschaft Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme die Fructosylpolymeraseaktivität besitzen
DE19709775A1 (de) 1997-03-10 1998-09-17 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle codierend Stärkephosphorylase aus Mais
DK0973928T3 (da) 1997-03-11 2010-08-09 Univ Minnesota DNA-baseret transposonsystem til indføring af nukleinsyre i DNA i en celle
GB9710049D0 (en) 1997-05-19 1997-07-09 Nycomed Imaging As Method
GB9718863D0 (en) 1997-09-06 1997-11-12 Nat Starch Chem Invest Improvements in or relating to stability of plant starches
GB9720465D0 (en) 1997-09-25 1997-11-26 Oxford Biomedica Ltd Dual-virus vectors
IL135776A0 (en) 1997-10-24 2001-05-20 Life Technologies Inc Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites
DE19749122A1 (de) 1997-11-06 1999-06-10 Max Planck Gesellschaft Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme, die Fructosyltransferaseaktivität besitzen
FR2770854B1 (fr) 1997-11-07 2001-11-30 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un tel gene, tolerantes aux herbicides
AU3478499A (en) 1998-04-09 1999-11-01 E.I. Du Pont De Nemours And Company Starch r1 phosphorylation protein homologs
DE19820608A1 (de) 1998-05-08 1999-11-11 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme aus Weizen, die an der Stärkesynthese beteiligt sind
DE19820607A1 (de) 1998-05-08 1999-11-11 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme aus Weizen, die an der Stärkesynthese beteiligt sind
PL197407B1 (pl) 1998-05-13 2008-03-31 Bayer Bioscience Gmbh Komórka rośliny transgenicznej, roślina transgeniczna, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, materiał rozmnożeniowy rośliny, zastosowanie cząsteczek kwasu nukleinowego i sposób wytwarzania zmodyfikowanej skrobi
AU758890B2 (en) 1998-06-15 2003-04-03 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Improvements in or relating to plants and plant products
US6750059B1 (en) 1998-07-16 2004-06-15 Whatman, Inc. Archiving of vectors
US6693185B2 (en) 1998-07-17 2004-02-17 Bayer Bioscience N.V. Methods and means to modulate programmed cell death in eukaryotic cells
DE19836099A1 (de) 1998-07-31 2000-02-03 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Nukleinsäuremoleküle kodierend für eine ß-Amylase, Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke
DE19836098A1 (de) 1998-07-31 2000-02-03 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke
DE19836097A1 (de) 1998-07-31 2000-02-03 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Nukleinsäuremoleküle kodierend für eine alpha-Glukosidase, Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke
AU6018399A (en) 1998-08-25 2000-03-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant glutamine: fructose-6-phosphate amidotransferase nucleic acids
CA2342124A1 (en) 1998-09-02 2000-03-16 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleic acid molecules encoding an amylosucrase
DE19924342A1 (de) 1999-05-27 2000-11-30 Planttec Biotechnologie Gmbh Genetisch modifizierte Pflanzenzellen und Pflanzen mit erhöhter Aktivität eines Amylosucraseproteins und eines Verzweigungsenzyms
DE59915126D1 (de) 1998-10-09 2010-03-04 Bayer Bioscience Gmbh Nucleinsäuremoleküle codierend ein verzweigungsenzym aus bakterien der gattung neisseria sowie verfahren zur herstellung von alpha-1,6-verzweigten alpha-1,4-glucanen
AU773808B2 (en) 1998-11-09 2004-06-10 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Nucleic acid molecules from rice and their use for the production of modified starch
US7160682B2 (en) 1998-11-13 2007-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Nucleic acid transfer vector for the introduction of nucleic acid into the DNA of a cell
US6531648B1 (en) 1998-12-17 2003-03-11 Syngenta Participations Ag Grain processing method and transgenic plants useful therein
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
DE19905069A1 (de) 1999-02-08 2000-08-10 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle codierend Alternansucrase
US7868149B2 (en) 1999-07-20 2011-01-11 Monsanto Technology Llc Plant genome sequence and uses thereof
DE19926771A1 (de) 1999-06-11 2000-12-14 Aventis Cropscience Gmbh Nukleinsäuremoleküle aus Weizen, transgene Pflanzenzellen und Pflanzen und deren Verwendung für die Herstellung modifizierter Stärke
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
DE19937348A1 (de) 1999-08-11 2001-02-22 Aventis Cropscience Gmbh Nukleinsäuremoleküle aus Pflanzen codierend Enzyme, die an der Stärkesynthese beteiligt sind
DE19937643A1 (de) 1999-08-12 2001-02-22 Aventis Cropscience Gmbh Transgene Zellen und Pflanzen mit veränderter Aktivität des GBSSI- und des BE-Proteins
AU7647000A (en) 1999-08-20 2001-03-19 Basf Plant Science Gmbh Increasing the polysaccharide content in plants
US6423886B1 (en) 1999-09-02 2002-07-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Starch synthase polynucleotides and their use in the production of new starches
GB9921830D0 (en) 1999-09-15 1999-11-17 Nat Starch Chem Invest Plants having reduced activity in two or more starch-modifying enzymes
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
AU4328801A (en) 2000-02-24 2001-09-03 Xcyte Therapies Inc Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6768044B1 (en) 2000-05-10 2004-07-27 Bayer Cropscience Sa Chimeric hydroxyl-phenyl pyruvate dioxygenase, DNA sequence and method for obtaining plants containing such a gene, with herbicide tolerance
GB0024550D0 (ja) 2000-10-06 2000-11-22 Oxford Biomedica Ltd
US6734340B2 (en) 2000-10-23 2004-05-11 Bayer Cropscience Gmbh Monocotyledon plant cells and plants which synthesise modified starch
ES2538471T3 (es) 2000-12-07 2015-06-22 Syngenta Limited Hidroxi fenil piruvato dioxigenasas (HPPD) derivadas de plantas y resistentes frente a herbicidas tricetónicos, y plantas transgénicas que contienen estas dioxigenasas
AU2002338233A1 (en) 2001-03-30 2002-10-15 Basf Plant Science Gmbh Glucan chain length domains
WO2002083911A1 (en) 2001-04-12 2002-10-24 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Production of plants with increased tolerance to drought stress or with increased transpiration
DE60226508D1 (de) 2001-06-12 2008-06-19 Bayer Cropscience Gmbh Transgene pflanzen die stärke mit hohem amylosegehalt herstellen
MXPA04001974A (es) 2001-08-31 2004-07-16 Avidex Ltd Receptor de celula t soluble.
WO2003045304A2 (en) 2001-09-26 2003-06-05 Mayo Foundation For Medical Education And Research Mutable vaccines
PL370416A1 (en) 2001-10-17 2005-05-30 Basf Plant Science, Gmbh Starch
GB0125216D0 (en) 2001-10-19 2001-12-12 Univ Strathclyde Dendrimers for use in targeted delivery
US20090100536A1 (en) 2001-12-04 2009-04-16 Monsanto Company Transgenic plants with enhanced agronomic traits
AU2002353231B2 (en) 2001-12-21 2008-10-16 Oxford Biomedica (Uk) Limited Method for producing a transgenic organism using a lentiviral expression vector such as EIAV
DE10208132A1 (de) 2002-02-26 2003-09-11 Planttec Biotechnologie Gmbh Verfahren zur Herstellung von Maispflanzen mit erhöhtem Blattstärkegehalt und deren Verwendung zur Herstellung von Maissilage
CA2498668C (en) 2002-03-27 2012-05-08 Agrinomics Llc Generation of plants with improved drought tolerance
AU2003231048A1 (en) 2002-04-22 2003-11-03 Regents Of The University Of Minnesota Transposon system and methods of use
US7901708B2 (en) 2002-06-28 2011-03-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Liposomal apparatus and manufacturing methods
GB0220467D0 (en) 2002-09-03 2002-10-09 Oxford Biomedica Ltd Composition
NZ539225A (en) 2002-10-09 2006-09-29 Avidex Ltd Single chain recombinant T cell receptors
AU2003284388A1 (en) 2002-11-01 2004-06-07 New England Biolabs, Inc. Organellar targeting of rna and its use in the interruption of environmental gene flow
DK1558643T3 (da) 2002-11-09 2009-09-07 Immunocore Ltd Cellereceptorpr sentation
PT1578973E (pt) 2002-12-19 2008-10-16 Bayer Cropscience Ag Células de plantas e plantas que sintetizam um amido com uma melhor viscosidade final
GB0304068D0 (en) 2003-02-22 2003-03-26 Avidex Ltd Substances
WO2004078983A2 (en) 2003-03-07 2004-09-16 Basf Plant Science Gmbh Enhanced amylose production in plants
BRPI0409363A (pt) 2003-04-09 2006-04-25 Bayer Bioscience Nv métodos e meios para o aumento da toleráncia de plantas a condições de tensão
MXPA05011585A (es) 2003-04-29 2006-05-25 Pioneer Hi Bred Int Genes de glifosato-n-acetil transferasa (gat) novedosos.
WO2005002359A2 (en) 2003-05-22 2005-01-13 Syngenta Participations Ag Modified starch, uses, methods for production thereof
US7985739B2 (en) 2003-06-04 2011-07-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enhanced sleeping beauty transposon system and methods for using the same
US7754945B2 (en) 2003-06-24 2010-07-13 Agrigenetics Inc. Generation of plants with improved drought tolerance
WO2005007196A2 (en) 2003-07-16 2005-01-27 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
CN1833026A (zh) 2003-07-31 2006-09-13 东洋纺织株式会社 生产透明质酸的植物
WO2005026372A1 (en) 2003-09-15 2005-03-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
AR046090A1 (es) 2003-09-30 2005-11-23 Bayer Cropscience Gmbh Plantas con actividad aumentada de una enzima de ramificacion de la clase 3
EP1687417B9 (en) 2003-09-30 2011-03-30 Bayer CropScience AG Plants with reduced activity of a class 3 branching enzyme
GB0325379D0 (en) 2003-10-30 2003-12-03 Oxford Biomedica Ltd Vectors
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
AR048024A1 (es) 2004-03-05 2006-03-22 Bayer Cropscience Gmbh Plantas con actividad aumentada de distintas enzimas fosforilantes del almidon
AR048025A1 (es) 2004-03-05 2006-03-22 Bayer Cropscience Gmbh Plantas con actividad aumentada de una enzima fosforilante del almidon
ATE541042T1 (de) 2004-03-05 2012-01-15 Bayer Cropscience Ag Pflanzen mit reduzierter aktivität des stärkephosphorylierenden enzyms phosphoglucan- wasser-dikinase
AR048026A1 (es) 2004-03-05 2006-03-22 Bayer Cropscience Gmbh Procedimientos para la identificacion de proteinas con actividad enzimatica fosforiladora de almidon
EP2319932B2 (en) 2004-04-30 2016-10-19 Dow AgroSciences LLC Novel herbicide resistance gene
SI1771206T1 (en) 2004-05-05 2018-06-29 Silence Therapeutics Gmbh LIPID LIPID COMPLEXES AND THEIR USE
DE602005011617D1 (de) 2004-05-19 2009-01-22 Medigene Ltd Hochaffiner ny-eso-t-zellen-rezeptor
DE602005009825D1 (de) 2004-05-19 2008-10-30 Medigene Ltd Verfahren zur verbesserung von t-zellrezeptoren
JP4764426B2 (ja) 2004-06-07 2011-09-07 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド カチオン性脂質および使用方法
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
DE102004029763A1 (de) 2004-06-21 2006-01-05 Bayer Cropscience Gmbh Pflanzen, die Amylopektin-Stärke mit neuen Eigenschaften herstellen
US8361794B2 (en) 2004-06-29 2013-01-29 Immunocore Limited Cells expressing a modified T cell receptor
JP4772045B2 (ja) 2004-07-16 2011-09-14 アメリカ合衆国 Ｃｍｖ／ｒ核酸コンストラクトを含むａｉｄｓに対するワクチン
ES2340183T3 (es) 2004-08-18 2010-05-31 Bayer Cropscience Ag Plantas con mayor actividad plastidica del enzima r3 fosforilante de almidon.
PL1805312T3 (pl) 2004-09-23 2009-12-31 Bayer Ip Gmbh Sposoby i środki do wytwarzania hialuronianu
GB0422877D0 (en) 2004-10-14 2004-11-17 Univ Glasgow Bioactive polymers
EP1807519B1 (en) 2004-10-29 2012-02-01 Bayer BioScience N.V. Stress tolerant cotton plants
EP1672075A1 (en) 2004-12-17 2006-06-21 Bayer CropScience GmbH Transformed plant expressing a dextransucrase and synthesizing a modified starch
BRPI0519468A2 (pt) 2004-12-27 2009-01-27 Silence Therapeutics Ag complexos de lipÍdeos revestido e seu uso
EP1679374A1 (en) 2005-01-10 2006-07-12 Bayer CropScience GmbH Transformed plant expressing a mutansucrase and synthesizing a modified starch
JP2006304779A (ja) 2005-03-30 2006-11-09 Toyobo Co Ltd ヘキソサミン高生産植物
EP1707632A1 (de) 2005-04-01 2006-10-04 Bayer CropScience GmbH Phosphorylierte waxy-Kartoffelstärke
EP1710315A1 (de) 2005-04-08 2006-10-11 Bayer CropScience GmbH Hoch Phosphat Stärke
EP1885754B1 (en) 2005-05-25 2011-02-09 Immunocore Ltd. T cell receptors which specifically bind to vygfvracl-hla-a24
ATE439449T1 (de) 2005-06-15 2009-08-15 Bayer Bioscience Nv Verfahren zum erhöhen der widerstandsfähigkeit von pflanzen gegen hypoxische bedingungen
AR054174A1 (es) 2005-07-22 2007-06-06 Bayer Cropscience Gmbh Sobreexpresion de sintasa de almidon en vegetales
PL1951030T3 (pl) 2005-10-05 2015-07-31 Bayer Ip Gmbh Udoskonalone sposoby i środki do wytwarzania hialuronianu
CA2624592C (en) 2005-10-05 2016-07-19 Bayer Cropscience Ag Gfat-expressing plants with increased hyaluronan production
CA2624496A1 (en) 2005-10-05 2007-04-12 Bayer Cropscience Ag Plants with an increased production of hyaluronan ii
WO2007048046A2 (en) 2005-10-20 2007-04-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Sirna silencing of filovirus gene expression
WO2007051303A1 (en) 2005-11-02 2007-05-10 Protiva Biotherapeutics, Inc. MODIFIED siRNA MOLECULES AND USES THEREOF
GB0526211D0 (en) 2005-12-22 2006-02-01 Oxford Biomedica Ltd Viral vectors
AU2007229005B2 (en) 2006-03-21 2012-05-31 Bayer Cropscience Nv Stress resistant plants
JP2009534342A (ja) 2006-04-20 2009-09-24 サイレンス・セラピューティクス・アーゲー 血管内皮に特異的に送達するためのリポプレックス処方剤
US7915399B2 (en) 2006-06-09 2011-03-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
JP2008078613A (ja) 2006-08-24 2008-04-03 Rohm Co Ltd 窒化物半導体の製造方法及び窒化物半導体素子
US8088379B2 (en) 2006-09-26 2012-01-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Modified T cell receptors and related materials and methods
WO2008042156A1 (en) 2006-09-28 2008-04-10 Northwestern University Maximizing oligonucleotide loading on gold nanoparticle
WO2008038002A2 (en) 2006-09-29 2008-04-03 Medigene Limited T cell therapies
US9309528B2 (en) 2006-11-21 2016-04-12 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Biofuel production methods and compositions
EP2225002A4 (en) 2007-12-31 2011-06-22 Nanocor Therapeutics Inc RNA INTERFERENCE FOR THE TREATMENT OF CARDIAC SUFFICIENCIES
EP3095869B1 (en) 2008-04-14 2019-06-19 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, dna sequence and isolation of plants which are tolerant to hppd inhibitor herbicides
ES2638448T3 (es) 2008-04-15 2017-10-20 Protiva Biotherapeutics Inc. Novedosas formulaciones de lípidos para la administración de ácidos nucleicos
EP2283029A1 (en) 2008-06-04 2011-02-16 Medical Research Council Peptides
US20110117189A1 (en) 2008-07-08 2011-05-19 S.I.F.I. Societa' Industria Farmaceutica Italiana S.P.A. Ophthalmic compositions for treating pathologies of the posterior segment of the eye
CA3006395C (en) 2008-11-07 2022-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
AU2009317161B2 (en) 2008-11-24 2014-09-11 Helmholtz Zentrum Munchen Deutsches Forschungszentrum Fur Gesundheit Und Umwelt Gmbh High affinity T cell receptor and use thereof
GB2465749B (en) 2008-11-25 2013-05-08 Algentech Sas Plant cell transformation method
US20120047601A1 (en) 2009-02-17 2012-02-23 The Regents Of The University Of California Method of Reducing Acetylation in Plants to Improve Biofuel Production
US20120164118A1 (en) 2009-05-04 2012-06-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Cocal vesiculovirus envelope pseudotyped retroviral vectors
US8283333B2 (en) 2009-07-01 2012-10-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid formulations for nucleic acid delivery
CA2767129C (en) 2009-07-01 2015-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein b
US8871730B2 (en) 2009-07-13 2014-10-28 Somagenics Inc. Chemical modification of short small hairpin RNAs for inhibition of gene expression
US8927807B2 (en) 2009-09-03 2015-01-06 The Regents Of The University Of California Nitrate-responsive promoter
US20110200582A1 (en) 2009-12-23 2011-08-18 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
US8372951B2 (en) 2010-05-14 2013-02-12 National Tsing Hua University Cell penetrating peptides for intracellular delivery
WO2011146862A1 (en) 2010-05-21 2011-11-24 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for inducing selective apoptosis
DK2575894T3 (en) 2010-05-28 2015-05-26 Oxford Biomedica Ltd FEED lentiviral vectors FOR BRAIN
US9193827B2 (en) 2010-08-26 2015-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Poly(beta-amino alcohols), their preparation, and uses thereof
US9405700B2 (en) 2010-11-04 2016-08-02 Sonics, Inc. Methods and apparatus for virtualization in an integrated circuit
SG10201510092QA (en) 2010-12-09 2016-01-28 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
US9499592B2 (en) 2011-01-26 2016-11-22 President And Fellows Of Harvard College Transcription activator-like effectors
EP2691443B1 (en) 2011-03-28 2021-02-17 Massachusetts Institute of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
DE12722942T1 (de) 2011-03-31 2021-09-30 Modernatx, Inc. Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren
US20130071414A1 (en) 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
US20120295960A1 (en) 2011-05-20 2012-11-22 Oxford Biomedica (Uk) Ltd. Treatment regimen for parkinson's disease
SI2755997T1 (sl) 2011-09-15 2018-11-30 The United States of America, as represented by Secretary, Department of Health and Human Services, Office of Technology Transfer, National Institutes of Health T-celični receptorji, ki prepoznajo HLA-A1- ali HLA-CW7-omejeni mage
EP3692794A1 (en) 2011-09-16 2020-08-12 Baylor College of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
WO2013046247A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Sumitomo Chemical Company, Limited Plant disease control composition and its use
US8450107B1 (en) 2011-11-30 2013-05-28 The Broad Institute Inc. Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors
LT2791160T (lt) 2011-12-16 2022-06-10 Modernatx, Inc. Modifikuotos mrnr sudėtys
US20130185823A1 (en) 2012-01-16 2013-07-18 Academia Sinica Mesoporous silica nanoparticle-mediated delivery of dna into arabidopsis root
IN2014MN01573A (ja) 2012-02-17 2015-05-08 Keygene Nv
JP2015515530A (ja) 2012-04-18 2015-05-28 アローヘッド リサーチ コーポレイション インビボ核酸送達のためのポリ（アクリラート）ポリマー
CN107557334B (zh) 2012-05-03 2021-06-25 弗雷德哈钦森癌症研究中心 增强亲和力的t细胞受体及其制备方法
BR112014029417B1 (pt) 2012-05-25 2023-03-07 Cellectis Método ex vivo para a preparação de células t para imunoterapia
AU2013289970A1 (en) 2012-07-13 2015-01-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for regulating CAR T cells
EP3494997B1 (en) 2012-07-25 2019-09-18 The Broad Institute, Inc. Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
MX2015000979A (es) 2012-07-27 2015-11-23 Univ Illinois Ingenieria de receptores de celulas t.
WO2014059173A2 (en) 2012-10-10 2014-04-17 Sangamo Biosciences, Inc. T cell modifying compounds and uses thereof
GB2508414A (en) 2012-11-30 2014-06-04 Max Delbrueck Centrum Tumour specific T cell receptors (TCRs)
EP2931892B1 (en) 2012-12-12 2018-09-12 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP2784162B1 (en) 2012-12-12 2015-04-08 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation
WO2014093701A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
PL2931898T3 (pl) 2012-12-12 2016-09-30 Le Cong Projektowanie i optymalizacja systemów, sposoby i kompozycje do manipulacji sekwencją z domenami funkcjonalnymi
EP4234696A3 (en) 2012-12-12 2023-09-06 The Broad Institute Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
IL300461A (en) 2012-12-12 2023-04-01 Harvard College Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
IL239344B1 (en) 2012-12-12 2024-02-01 Broad Inst Inc Systems engineering, methods and optimal guiding components for sequence manipulation
DK2931897T3 (en) 2012-12-12 2018-02-05 Broad Inst Inc CONSTRUCTION, MODIFICATION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION AND THERAPEUTICAL APPLICATIONS
WO2014118272A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates
IL298125A (en) 2013-02-26 2023-01-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Preparations and methods for immunotherapy
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
WO2014172606A1 (en) 2013-04-19 2014-10-23 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods for modulating immune responses during chronic immune conditions by targeting metallothioneins
WO2014184744A1 (en) 2013-05-13 2014-11-20 Cellectis Methods for engineering highly active t cell for immunotherapy
CA2913830C (en) 2013-05-29 2021-06-29 Cellectis Methods for engineering t cells for immunotherapy by using rna-guided cas nuclease system
EP3011033B1 (en) 2013-06-17 2020-02-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
KR20160030187A (ko) 2013-06-17 2016-03-16 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 간의 표적화 및 치료를 위한 ＣＲＩＳＰＲ­Ｃａｓ 시스템, 벡터 및 조성물의 전달 및 용도
EP3011034B1 (en) 2013-06-17 2019-08-07 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components
AU2014281027A1 (en) 2013-06-17 2016-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Optimized CRISPR-Cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
WO2014204724A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP3011035B1 (en) 2013-06-17 2020-05-13 The Broad Institute, Inc. Assay for quantitative evaluation of target site cleavage by one or more crispr-cas guide sequences
SG11201510327TA (en) 2013-06-17 2016-01-28 Broad Inst Inc Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for targeting and modeling diseases and disorders of post mitotic cells
KR102285485B1 (ko) 2013-07-10 2021-08-04 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 유전자 조절 및 편집을 위한 직교 cas9 단백질
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
WO2015058052A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 The Broad Institute Inc. Spatial and cellular mapping of biomolecules in situ by high-throughput sequencing
AU2014346559B2 (en) 2013-11-07 2020-07-09 Editas Medicine,Inc. CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAs
US9074199B1 (en) 2013-11-19 2015-07-07 President And Fellows Of Harvard College Mutant Cas9 proteins
AU2014359716A1 (en) 2013-12-05 2016-06-09 Silence Therapeutics Gmbh Means for lung specific delivery
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
BR112016013520A2 (pt) 2013-12-12 2017-10-03 Broad Inst Inc Composições e métodos de uso de sistemas crispr-cas em distúrbios de repetições de nucleotídeos
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
CA2932475A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
EP3079725B1 (en) * 2013-12-12 2019-10-16 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing
RU2016128077A (ru) 2013-12-12 2018-12-06 Те Брод Инститьют Инк. Доставка, применение и применения в терапии систем и композиций crispr-cas для лечения обусловленных hbv и вирусных заболеваний и нарушений
CA2932439A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular cas enzymes
EP4219699A1 (en) 2013-12-12 2023-08-02 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
US10557146B2 (en) 2014-01-21 2020-02-11 The Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Modified plants
WO2015138855A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 The Regents Of The University Of California Vectors and methods for fungal genome engineering by crispr-cas9
JP5937635B2 (ja) 2014-03-28 2016-06-22 ファナック株式会社 電磁接触器の溶着検出機能を有するモータ駆動装置
CN104004782B (zh) 2014-05-16 2016-06-08 安徽省农业科学院水稻研究所 一种延长水稻生育期的育种方法
US11898141B2 (en) 2014-05-27 2024-02-13 The Broad Institute, Inc. High-throughput assembly of genetic elements
WO2016049258A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems
EP3230452A1 (en) * 2014-12-12 2017-10-18 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
WO2016094874A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
WO2016094867A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
CA2970370A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 Massachusetts Institute Of Technology Crispr having or associated with destabilization domains
AU2016245347B2 (en) 2015-04-10 2021-01-28 Feldan Bio Inc. Polypeptide-based shuttle agents for improving the transduction efficiency of polypeptide cargos to the cytosol of target eukaryotic cells, uses thereof, methods and kits relating to same
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
US20170211142A1 (en) 2015-10-22 2017-07-27 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
US20190225955A1 (en) 2015-10-23 2019-07-25 President And Fellows Of Harvard College Evolved cas9 proteins for gene editing
EP3596207B1 (en) 2017-03-15 2023-12-20 The Broad Institute, Inc. Novel cas13b orthologues crispr enzymes and systems
WO2019005886A1 (en) * 2017-06-26 2019-01-03 The Broad Institute, Inc. CRISPR / CAS-CYTIDINE DEAMINASE COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETED EDITING OF NUCLEIC ACIDS
JP7454494B2 (ja) * 2017-06-26 2024-03-22 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 標的化された核酸編集のためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ－アデニンデアミナーゼ系の組成物、系及び方法
EP3684397A4 (en) 2017-09-21 2021-08-18 The Broad Institute, Inc. SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED EDITION OF NUCLEIC ACIDS

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020202810A1 (en) 2020-05-21
AU2018338318B2 (en) 2022-12-22
WO2019060746A1 (en) 2019-03-28
CN111511388A (zh) 2020-08-07
US20210009986A1 (en) 2021-01-14
AU2018338318A1 (en) 2020-04-30
AU2023201781A2 (en) 2023-07-27
EP3684397A1 (en) 2020-07-29
AU2020202810B2 (en) 2021-06-10
EP3684397A4 (en) 2021-08-18
US20200291382A1 (en) 2020-09-17
KR20200066616A (ko) 2020-06-10
US11685916B2 (en) 2023-06-27
CA3073848A1 (en) 2019-03-28
AU2023201781A1 (en) 2023-06-15
KR102338449B1 (ko) 2021-12-10
US11618896B2 (en) 2023-04-04
JP2020535802A (ja) 2020-12-10
JP2022000041A (ja) 2022-01-04
KR20200064168A (ko) 2020-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11685916B2 (en) Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
US20240076651A1 (en) Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
JP7454494B2 (ja) 標的化された核酸編集のためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ－アデニンデアミナーゼ系の組成物、系及び方法
EP3625342B1 (en) Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
US20210130800A1 (en) Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
US20210009972A1 (en) Systems methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
US20200248169A1 (en) Crispr/cas-cytidine deaminase based compositions, systems, and methods for targeted nucleic acid editing

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230714

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230714