JP2009534342A - 血管内皮に特異的に送達するためのリポプレックス処方剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、担体に含有される、および／または担体を含有する脂質組成物であって、少なくとも第１の脂質成分、少なくとも第１のヘルパー脂質、およびインビボ条件下において、任意で脂質組成物から除去することができる遮蔽化合物を含む組成物であり、担体を含有する脂質組成物のオスモル濃度が、約５０から６００ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、好ましくは、約２５０〜３５０ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、およびより好ましくは、約２８０〜３２０ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇであって、かつ／または、第１の脂質成分、および／または担体中のヘルパー脂質および遮蔽化合物の一方またはその両方よって形成されたリポソームの粒子サイズが、約２０から２００ｎｍ、好ましくは、約３０から１００ｎｍ、より好ましくは、約４０から８０ｎｍである組成物に関する。

Description

本発明は、脂質組成物およびその使用に関する。

薬学的活性化合物の送達は、過去に既にかなりの注意を引いて来たが、細胞の中で活性であるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ分子など、新しい治療剤の出現によって、細胞内への送達の必要性がより重要になり、これまでに様々な方策が追求されている。

ｓｉＲＮＡ治療剤の開発に向けた最初の段階において、ｓｉＲＮＡ分子の安定性は、これらの分子をヌクレアーゼによる分解から防ぐ、様々な化学的骨格修飾を取り込むことによって強化された（Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ，２００３；Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００４）。例えば、両鎖に交互の２’−Ｏ−メチル修飾パターンを有する平滑末端のｓｉＲＮＡ分子を開発したが、それらは、非修飾のｓｉＲＮＡよりも血漿由来ヌクレアーゼに対して有意に抵抗性が強く、形質転換後の哺乳動物細胞における遺伝子発現のサイレンシングを行う能力を有する（Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。安定性の問題に加えて、インビボにおけるｓｉＲＮＡ分子の機能的な送達が、依然としてｓｉＲＮＡ治療薬を開発する上での主な障害であり、必須の条件となっている（Ｕｐｒｉｃｈａｒｄ，２００５）。ｓｉＲＮＡを利用した治療薬の有効で非毒性の全身への投与法は、適当な非ウイルス性の送達技術が存在しないため、未だ臨床応用するためには開発されていない。

特に、ｓｉＲＮＡなどの細胞内活性剤の場合における良好な送達技術は、強く負に荷電したｓｉＲＮＡを機能的に細胞内に取り込むこと、インビボ送達に特異的な器官および細胞型の薬力学的性質、および最後には、ｓｉＲＮＡを処方することによる有毒な副作用の可能性を含む、いくつかの問題に対処する必要がある。これらの問題を克服するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボ送達について広範に調べられた方法は、核酸の直接的化学変質法である。これらの化学的修飾法は、骨格の修飾（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００５）か、または輸送ペプチド（Ｍｕｒａｔｏｖｓｋａ ａｎｄ Ｅｃｃｌｅｓ、２００４；Ｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｓｈａｄｉｄｉ ａｎｄ Ｓｉｏｕｄ、２００３；Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）または疎水性残基（例えば、コレステロール（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００４））のような、取り込みを仲介する実体とのコンジュゲートである。いくつかの試薬が、マウスにおいて、ｓｉＲＮＡの共有結合修飾に代わるものとして、ｓｉＲＮＡの全身への静脈内投与に使用されている。正に荷電した担体、例えば、プロタミン−抗体融合タンパク質、ナノ粒子、シクロデキストリン含有ポリカチオン、ＰＥＩ、およびアテロコラーゲンなどが、インビボにおいて適用するために、ｓｉＲＮＡとのコンジュゲート形成について調べられている（Ｃｈａｅ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｌａｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｕｒｂａｎ−Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。より細胞型特異的なｓｉＲＮＡ送達を行うために、いくつかのグループは、細胞標的化のための受容体リガンド（Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）、または抗体の取り込み、または結合を行った（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）。

インビトロにおける哺乳動物細胞への核酸送達には、カチオン性脂質が日常的に使用され（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７）、リポプレックス（カチオン性脂質、中性ヘルパー脂質、および核酸から構成されている）の全身静脈内投与が、インビボにおける遺伝子およびｓｉＲＮＡの送達に利用されている（Ｂａｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｃｈａｅ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｎｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）。しかし、これまでの研究のほとんどは、概念を実証するために設計され、利用されるｓｉＲＮＡ処方剤の薬力学的挙動および毒性である可能性についての情報を提供するものではなかった。この情報は、さらなる臨床開発をするために、具体的な送達技術を正しくリスク便益評価する上で必要なものである。例えば、生体利用能、細胞型特異的送達、およびインビボにおける薬物動態（投与経路に依存する。ｉ．ｖ．、皮下、経口）が、インビボにおける遺伝子サイレンシング効果を明らかにすること以外にも評価すべき重要なパラメーターである。これまでに多数の研究で、様々な修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボでの性質が報告されているが、非処方ｓｉＲＮＡまたは処方ｓｉＲＮＡおよびインビボにおいて化学修飾されたそれらの類似体の薬力学的挙動についてはほとんど知られていない。化学修飾されたｓｉＲＮＡを静脈内注射したところ、広範に組織分布したが、肝臓、空腸、および腎臓に選択的に蓄積した（Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００４）。別の研究では、放射性標識されたｓｉＲＮＡは、ＰＥＩ複合体として腹腔内投与されると、異種移植されたマウスの筋肉組織および腫瘍組織で主に検出され、肝臓および腎臓ではほとんど検出されない（Ｕｒｂａｎ−Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。しかし、これらの研究は、各器官に存在する多様な細胞型への送達を区別していなかった。

本発明の基礎にある課題は、限定されないが、ｓｉＲＮＡなどの機能的な核酸のための送達剤を提供することである。さらに、本発明の基礎にある課題は、限定されないが、ｓｉＲＮＡなどの機能的な核酸のための送達剤を提供することによって、その送達が内皮に対して特異的、より具体的には血管内皮に対して特異的であることである。

これらおよびその他の問題は、本発明の内容によって解決される。より好ましい実施形態は、従属請求項から得ることができる。

本発明の基礎にある課題は、第１の態様において、担体に含有されるか、担体を含有する脂質組成物であって、
少なくとも第１の脂質成分、
少なくとも第１のヘルパー脂質、および
インビボ条件下において、脂質組成物から任意で除去することができる遮蔽化合物を含む組成物であって、
前記担体を含有する脂質組成物が、約５０から６００ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、好ましくは、約２５０〜３５０ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、およびより好ましくは、約２８０〜３２０ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇのオスモル濃度であり、かつ／または、
第１の脂質成分、および／または担体中のヘルパー脂質および遮蔽化合物の一方または両方よって形成されるリポソームの粒子径が約２０から２００ｎｍ、好ましくは、約３０から１００ｎｍ、より好ましくは、約４０から８０ｎｍである脂質組成物によって解決される。

本発明の第１の態様の実施形態において、遮蔽化合物は、ＰＥＧ、ＨＥＧ、ポリヒドロキシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）、およびポリプロピレンからなる群から選択される。

本発明の第１の態様の実施形態において、遮蔽化合物はＰＥＧ２０００またはＰＥＧ５０００である。

本発明の第１の態様の実施形態において、組成物は、さらなる構成成分および／または第２のヘルパー脂質を含む。

本発明の第１の態様の実施形態において、遮蔽化合物は、ＰＥＧとセラミドのコンジュゲートである。

本発明の第１の態様の実施形態において、セラミドは、６個から１０個の炭素原子、好ましくは、８個の炭素原子からなる、少なくとも１つの短鎖炭素置換基を含む。

本発明の第１の態様の実施形態において、セラミドが第１のヘルパー脂質である。

本発明の第１の態様の別の実施形態において、セラミドは第２のヘルパー脂質である。

本発明の第１の態様の実施形態において、遮蔽化合物は、ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性成分を含む。

本発明の第１の態様の好ましい実施形態において、このリンカーまたは部分はアニオン性リンカーまたはアニオン性部分である。

本発明の第１の態様のより好ましい実施形態において、このアニオン性リンカーまたはアニオン性部分は酸性環境においてアニオン性が低いか中性であるが、これにより、好ましくは、そのような酸性環境はエンドソームである。

本発明の第１の態様の実施形態において、ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分は、オリゴ（グルタミン酸）、オリゴフェノラート、およびジエチレントリアミン五酢酸を含む群から選択される。

本発明の第１の態様の実施形態において、第１の脂質成分は、下記の化学式（Ｉ）に記載された化合物であって、

式中、Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ独立して、アルキルを含む基から選択され、ｎは１から４までの任意の整数であり、Ｒ_３は、下記の化学式（ＩＩ）に記載のリシル、オルニチル、２，４−ジアミノブチリル、ヒスチジル、およびアシル部分であって、

式中、ｍは１から３までの任意の整数であり、ＮＨ_３ ^＋は、任意で存在しなくてもよく、Ｙ⁻は薬学的に許容されるアニオンである。

本発明の第１の態様の好ましい実施形態において、Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ独立して、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、およびオレイルを含む基から選択される。

本発明の第１の態様の実施形態において、Ｒ_１がラウリル、およびＲ_２がミリスチル、またはＲ_１がパルミチル、およびＲ_２がオレイルである。

本発明の第１の態様の実施形態において、ｍは１または２である。

本発明の第１の態様の実施形態において、化合物はカチオン性脂質であり、好ましくは、アニオンＹ⁻と結合している。

本発明の第１の態様の実施形態において、Ｙ⁻は、ハロゲン化合物、酢酸、およびトリフルオロ酢酸を含む群から選択される。

本発明の第１の態様の実施形態において、化合物は、以下の群
β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸、

β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸、および

ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸

から選択される。

本発明の第１の態様の実施形態において、オスモル濃度は、糖によってほとんど決定されるが、この糖は、好ましくは、ショ糖、トレハロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、イヌリン、ラフィノース、およびこれらを組み合わせたものを含む群から選択され、より好ましくは、ショ糖、トレハロース、イヌリン、ラフィノース、およびこれらを組み合わせたものを含む群から選択される。

本発明の第１の態様の実施形態において、組成物は、１種類または数種類の塩基性化合物を含み、このような塩基性化合物は、好ましくは、塩基性アミノ酸、および弱塩基を含む群から選択される。

本発明の第１の態様の実施形態において、このアミノ酸は、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンを含む群から選択される。

本発明の第１の態様の別の実施形態において、弱塩基は、ＴＲＩＳおよびエタノールアミンを含む群から選択される。

本発明の第１の態様の実施形態において、塩基性化合物は、ｐＨ調整のために提供されている。

本発明の第１の態様の実施形態において、脂質組成物は核酸を含み、このような核酸は、好ましくは、さらなる構成成分である。

本発明の第１の態様の好ましい実施形態において、核酸は、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピーゲルマーを含む群から選択される。

本発明の第１の態様の実施形態において、遮蔽化合物は核酸に結合している。

本発明の第１の態様の好ましい実施形態において、遮蔽化合物は、リンカー部分によって核酸に結合、好ましくは、リンカー部分によって核酸に共有結合している。

本発明の第１の態様の好ましい実施形態において、リンカー部分は、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ペプチド、Ｓ−Ｓリンカー、およびｐＨ感受性リンカーを含む群から選択される。

本発明の第１の態様の実施形態において、核酸は、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｉＮＡを含む群から選択され、リンカーは、センス鎖の３’末端に結合している。

本発明の第１の態様の実施形態において、組成物は核酸を含み、この核酸は、リポソームとともにリポプレックスを形成する。

本発明の第１の態様の実施形態において、担体中の脂質濃度は、リポプレックスによって提供される脂質の全体量に基づいて、約０．０１から１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０１から４０ｍｇ／ｍｌ、およびより好ましくは約０．０１から２５ｍｇ／ｍｌである。

本発明の第１の態様の実施形態において、核酸はｓｉＲＮＡであり、脂質組成物のｓｉＲＮＡの濃度が約０．２から０．４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２８ｍｇ／ｍｌであり、総脂質濃度が約１．５から２．７ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２．１７ｍｇ／ｍｌである。

本発明の基礎にある課題は、第２の態様において、本発明の第１の態様に係る組成物、および任意には薬学的活性化合物、および好ましくは、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物によって解決される。

本発明の第２の態様の実施形態において、薬学的活性化合物および／または更なる構成成分は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、および核酸を含む群から選択される。

本発明の第２の態様の実施形態において、タンパク質は抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。

本発明の第２の態様の実施形態において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、およびＬＮＡを含む群から選択される。

本発明の第２の態様の実施形態において、核酸は機能的核酸であり、好ましくは、この機能的核酸は、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピーゲルマーを含む群から選択される。

本発明の第１および第２の態様の実施形態において、第１のヘルパー脂質および／または第２のヘルパー脂質は、リン脂質およびステロイドを含む群から選択されるが、ただし、好ましくは、第１および／または第２のヘルパー脂質はセラミドではない。

本発明の第１および第２の態様の実施形態において、第１および／または第２のヘルパー脂質またはヘルパー脂質成分は、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび１，２?ジオレイル?ｓｎ?グリセロ?３?ホスホエタノールアミンを含む群から選択される。

本発明の第１および第２の態様の実施形態において、ヘルパー脂質成分の含有量は、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約２０モル％から約８０モル％である。

本発明の第１および第２の態様の実施形態において、ヘルパー脂質成分の含有量は、約３５モル％から約６５モル％である。

本発明の第１および第２の態様の実施形態において、脂質はβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸であり、ヘルパー脂質は１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンである。

本発明の第１および第２の態様の実施形態において、脂質は５０モル％であり、ヘルパー脂質は、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の５０モル％である。

本発明の第１および第２の態様の実施形態において、組成物は、さらに第２のヘルパー脂質を含む。

本発明の第１および第２の態様の実施形態において、第１および／または第２のヘルパー脂質は、ＰＥＧ部分、ＨＥＧ部分、ポリヒドロキシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）部分、およびポリプロピレン部分を含む群から選択される基を含み、その部分が、好ましくは、約５００から１００００Ｄａ、より好ましくは、約２０００から５０００Ｄａの分子量を提供する。

本発明の第１および第２の態様の実施形態において、ＰＥＧ部分を含むヘルパー脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む群から選択される。

本発明の第１および第２の態様の実施形態において、ヘルパー脂質のＰＥＧ部分が、約２，０００から５，０００Ｄａの分子量、好ましくは２，０００Ｄａの分子量を有する。

本発明の第１および第２の態様の実施形態において、組成物は、脂質成分としてβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸を、第１のヘルパー脂質として１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを、また第２のヘルパー脂質として１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ２０００を含む。

本発明の第１および第２の態様の実施形態において、第２のヘルパー脂質の含有量は、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約０．０５モル％から４．９モル％、好ましくは、約１から２モル％である。

本発明の第１および第２の態様の実施形態において、組成物は、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約１から１０モル％、より好ましくは１から７．５モル％、および最も好ましくは１から５モル％のＰＥＧとセラミドとのコンジュゲートを含有する。

本発明の第１および第２の態様の実施形態において、セラミドはＣ８ｍであり、ＰＥＧはＰＥＧ２０００であり、かつ、ＰＥＧとセラミドのコンジュゲートの含有量は、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約１から５モル％である。

本発明の第１および第２の態様の別の好ましい実施形態において、セラミドはＣ８ｍであり、ＰＥＧはＰＥＧ５０００であり、かつ、ＰＥＧとセラミドのコンジュゲートの含有量は、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約１から５モル％である。

本発明の第１および第２の態様の実施形態において、第１の脂質成分の含有量は、約４２．５モル％から５０モル％、第１のヘルパー脂質の含有量は、約４２．５モル％から５０モル％であって、第１の脂質成分、第１のヘルパー脂質、およびＰＥＧとセラミドのコンジュゲートの含有量の合計が１００モル％である。

本発明の第１および第２の態様のいずれかの実施形態において、組成物は、核酸、好ましくは、機能的な核酸、より好ましくは、二本鎖リボ核酸、および最も好ましくは、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、およびリボザイムを含む群から選択される核酸であって、好ましくは、カチオン性脂質に対するＲＮＡｉのモル比は、約０から０．０７５、好ましくは、約０．０２から０．０５、およびさらにより好ましくは０．０３７である核酸をさらに含む。

本発明の第１および第２の態様のいずれかの実施形態において、担体は水性媒体であり、好ましくは、糖含有等張性水溶液であって、この担体に含有される脂質組成物が分散物として、好ましくは、リポソームおよび／またはリポプレックスの分散物として存在している。

本発明の第１および第２の態様のいずれかの実施形態において、脂質組成物は、約５０モル％のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸、約４８から４９モル％の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、および約１から２モル％の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレン−グリコールを含み、この担体は水溶液である。

本発明の基礎にある課題は、第３の態様において、リポプレックスによって解決されるが、リポプレックスは、好ましくは、本発明の第１および第２の態様のいずれかに係る組成物であるか、またはその組成物に含有され、以下を含む。
ａ）以下のものからなる正に荷電したリポソーム、
ａａ）約５０モル％のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸、好ましくは、（β−（Ｌ−アルギニル）−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸）
ａｂ）約４８から４９モル％の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）
ａｃ）約１から２モル％の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレン−グリコール、好ましくは、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩；および
ｂ）機能的核酸、好ましくはｓｉＲＮＡ。

本発明の第３の態様の実施形態において、リポプレックスのζ電位は約４０から５５ｍＶ、好ましくは約４５から５０ｍＶである。

本発明の第３の態様の実施形態において、リポプレックスは、ＱＥＬＳによって測定すると、約８０から２００ｎｍ、好ましくは、約１００から１４０ｎｍ、より好ましくは、約１１０ｎｍから１３０ｎｍのサイズを有する。

別の実施形態において、リポプレックスは、好ましくはＱＥＬＳによって測定すると、約６０ｎｍのサイズを有する。

本発明の第１および第２の態様の実施形態において、組成物は、本発明の第３の態様に係るリポプレックスを含む。

本発明の基礎にある課題は、第４の態様において、第１および第２の態様のいずれかに記載された組成物、または本発明の第３の態様に記載されたリポプレックスを薬剤の製造のために使用することによって解決される。

本発明の第４の態様の実施形態において、薬剤は、核酸、好ましくは機能的核酸を、内皮、好ましくは血管内皮に送達するためのものである。

本発明の第４の態様の実施形態において、薬剤は、血管形成依存性疾患を治療するためのものである。

本発明の第４の態様の実施形態において、疾患は、癌疾患、より好ましくは固形腫瘍である。

本発明の第４の態様の実施形態において、疾患は、腫瘍性疾患を含む群から選択され、より好ましくは、疾患は、骨癌、乳癌、前立腺癌、消化器官系の癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、膵臓癌、下垂体癌、精巣癌、眼窩癌（ｏｒｂｉｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、中枢神経系の癌、および呼吸器官系の癌を含む群から選択される。

本発明の第４の態様の実施形態において、薬剤は、１つまたはいくつかの他の治療法と併用して用いられる。

本発明の第４の態様の実施形態において、治療法は、化学療法、寒冷療法、温熱療法、抗体療法、および放射線療法を含む群から選択される。

本発明の基礎にある課題は、第５の態様において、第１および第２の態様のいずれかに記載された組成物、または本発明の第３の態様に記載されたリポプレックスを移動剤（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として使用することによって解決される。

本発明の第５の態様の実施形態において、移動剤は核酸を移動させ、この核酸は、好ましくは、組成物に含有される核酸であるか、この核酸は、好ましくは、リポプレックスの核酸成分である。

本発明の第５の態様の実施形態において、核酸は機能的核酸であり、好ましくはｓｉＲＮＡである。

本発明の第５の態様の実施形態において、移動剤は、内皮、好ましくは血管内皮に特異的である。

本発明の第５の態様の実施形態において、移動剤は、薬学的活性成分および／または更なる構成成分を細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞の中に移動させる。

本発明の基礎にある課題は、第６の態様において、薬学的活性化合物および／または更なる構成成分を、細胞内へ、または膜、好ましくは細胞膜を通過して移動させる方法であって、以下の工程を含む方法によって解決される。
細胞または膜を提供するステップと、
本発明の第１および第２の態様のいずれかに記載された組成物、または本発明の第３の態様に記載されたリポプレックスであって、組成物が、任意で、薬学的活性化合物および／または更なる構成成分を含むものを提供する工程ステップと、
細胞または膜を、本発明の第１および第２の態様のいずれかに記載された組成物、または本発明の第３の態様に記載されたリポプレックスに接触させるステップ。

本発明の第６の態様の実施形態において、本方法は、さらに以下のステップを含む。
細胞内および／または膜の向こう側で薬学的活性化合物および／または更なる構成成分を検出するステップ。

本発明者らは、意外にも、未修飾のｓｉＲＮＡ分子または非処方ｓｉＲＮＡ分子とは対照的に、ｓｉＲＮＡ−リポプレックスが血管内皮によって強力に取り込まれたことを見出した。この観察されたｓｉＲＮＡ−リポプレックスのインビボにおける取り込みは、ノックダウン解析によると、ＲＮＡｉの有効性と相関があった。標的特異的なｓｉＲＮＡ−リポプレックスを反復して全身に静脈内投与すると、内皮特異的に発現される標的遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質が明確にノックダウンされ、機能的取り込みおよびＲＮＡｉによるサイレンシング活性を示した。従って、本明細書に記載の脂質組成物は、特異的な送達、または内皮／内皮細胞、より特異的には、血管内皮を標的とするのに特に有用である。

更に、本発明者らは、第１の脂質成分に関して、本発明の脂質組成物があると、先行技術の脂質組成物と比較して少量の脂質により、ｓｉＲＮＡ分子との複合体を形成できることに気づいた。また、意外なことに、本発明の脂質組成物を用いると、ＨｅＬａ細胞においてインターフェロン応答性のＯＡＳ−１遺伝子およびＯＡＳ−２遺伝子の発現が増加することによって示される、非特異的なインターフェロン応答性も、サイトカインであるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２の誘導も、本発明に従って脂質組成物を用いると観察されなかった。

最後に、本発明者らは、意外にも、本発明の脂質組成物を用いると、そのような組成物およびそれから形成されるリポプレックスの比較的特異的な取り込みだけでなく、より重要なことには、血管内皮細胞によるエンドサイトーシス取り込みの後に、エンドソームから細胞特異的な機能的送達および放出がみられることを見出した。機能的核酸（具体的にはｓｉＲＮＡ）などの機能的な活性因子が放出されただけで、細胞レベルでその作用を発揮できる限りにおいて、後者は非常に重要である。

この点から見て、本明細書に開示されている脂質組成物およびリポプレックスは、特に、限定ではないが、ｓｉＲＮＡなどの機能的な核酸を送達するための薬学的処方剤として使用されると、様々な疾患のそれぞれの治療および予防に用いることができる。様々な疾患は、限定ではないが、白血病および血管形成依存性固形癌などであり、これらは、癌腫、肉腫ならびにリンパ腫のカテゴリ、ならびに、その他の新生物、例えば、骨、乳房、前立腺、消化器系、直腸結腸、肝臓、肺、腎臓、泌尿生殖器、膵臓、下垂体、精巣、眼窩、頭頸部、中枢神経系、呼吸器などのそれぞれのがんおよび腫瘍などを含むが、これらに限定されない。そのような薬剤および薬学的処方剤を用いることができる更なる疾患は、脳卒中、潰瘍、アテローム性動脈硬化症、および関節リウマチであり、これらは全部、血管形成の過剰または不足を特徴としている。言い換えれば、本発明の脂質組成物およびリポプレックスはそれぞれ、血管新生を促進および抑制する療法、従って血管新生を改善または強化する薬物、または血管新生を低下させる薬物の製造に用いることができる。

さらに、この種の薬剤および薬学的処方剤はそれぞれ、他の治療法、例えば、化学療法、凍結療法、温熱療法、モノクローナル抗体療法、特にＶＥＧＦ−モノクローナル抗体療法などの抗体療法、放射線療法などと併用することが可能であろう。

このような種類の薬学的処方剤、およびこのような脂質組成物およびリポプレックスをそれぞれ含む薬剤を使用して原理上治療可能な、更なる具体的な疾患は、以下のリストから選ばれることが可能である：（成人）急性リンパ芽球性白血病、（小児）急性リンパ芽球性白血病、（成人）急性骨髄性白血病、（小児）急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、（小児）副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、（小児）星状細胞腫、（小児）小脳星状細胞腫、（小児）大脳星状細胞腫、胆管癌、肝外胆管癌、膀胱癌、（小児）膀胱癌、骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、（小児）脳幹グリオーマ、（成人）脳腫瘍、（小児）脳幹グリオーマ脳腫瘍、（小児）小脳星状細胞腫脳腫瘍、（小児）大脳星状細胞腫／悪性グリオーマ脳腫瘍、（小児）上衣細胞腫脳腫瘍、（小児）髄芽腫脳腫瘍、（小児）テント上原始神経外胚葉腫脳腫瘍、（小児）視経路および視床下部膠腫、（小児）脳腫瘍、乳癌、（小児）乳癌、男性乳癌、（小児）気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、（小児）カルチノイド腫瘍、カルチノイド腫瘍、消化器カルチノイド腫瘍、原発不明癌腫、中枢神経権リンパ腫、原発性中枢神経権リンパ腫、（小児）小脳星状細胞腫、（小児）大脳星状細胞腫／悪性グリオーマ、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、（小児）直腸結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮体癌、（小児）上衣細胞腫、食道癌、（小児）食道癌、ユーイング腫瘍、（小児）頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、眼内黒色腫、眼癌、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、（小児）胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、（小児）頭蓋外胚細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、（成人）脳幹グリオーマ、（小児）脳幹グリオーマ、（小児）大脳星状細胞腫グリオーマ、（小児）視経路および視床下部グリオーマ、有毛細胞白血病、頭頸部癌、（成人）（原発性）肝細胞癌（肝癌）、（小児）（原発性）肝細胞癌（肝癌）、（成人）ホジキンリンパ腫、（小児）ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、（小児）視床下部および視経路グリオーマ、眼内黒色腫、（膵臓内分泌部）島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、（小児）腎臓癌、喉頭癌、（小児）喉頭癌、（成人）急性リンパ性白血病、（小児）急性リンパ性白血病、（成人）急性骨髄性白血病、（小児）急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、口唇・口蓋癌、（原発性）（成人）肝臓癌、（原発性）（小児）肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、ＡＩＤＳ関連性リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、（成人）ホジキンリンパ腫、（小児）ホジキンリンパ腫、（成人）非ホジキンリンパ腫、（小児）非ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫、マクログロブリン血症、ワンデルシュレーム骨悪性線維性組織球腫／骨肉腫、（小児）髄芽腫、（眼球）眼内黒色腫、メルケル細胞腫、悪性（成人）中皮腫、（小児）中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、（小児）多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、急性（成人）骨髄性白血病、急性（小児）骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、口蓋および副鼻腔の癌、上咽頭癌、（小児）上咽頭癌、神経芽細胞腫、（成人）非ホジキンリンパ腫、（小児）非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、（小児）口腔癌、口蓋癌、口唇および中咽頭癌、骨髄腫／悪性骨繊維性組織球腫、（小児）卵巣癌、上皮性卵巣癌、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、（小児）膵臓癌、膵島細胞癌、副鼻腔・口蓋癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、（小児）松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、脳下垂体腫瘍、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠期乳癌、妊娠期ホジキンリンパ腫、妊娠期非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、（小児）腎細胞（腎臓）癌、腎盂および尿菅の移行細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、（小児）横紋筋肉腫、唾液腺癌、（小児）唾液腺癌、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、（成人）軟部組織肉腫、（小児）軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、（非メラノーマ）皮膚癌、（小児）皮膚癌、（メラノーマ）皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、（成人）軟部組織肉腫、（小児）軟部組織肉腫、扁平上皮癌、原発不明の頸部扁平上皮癌、転移性胃癌、（小児）胃癌、（小児）テント上原始神経外胚葉性腫瘍、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、（小児）胸腺腫、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、（小児）甲状腺癌、腎盂および尿管の移行細胞癌、妊娠性絨毛性腫瘍、腎盂および尿管の絨毛性腫瘍、尿道癌移行細胞癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視路および視床下部膠腫、（小児）視路および視床下部膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍。

このような特異性を示す脂質組成物およびリポプレックスの特徴を以下に述べる。

本発明者らは、驚くべきことに、核酸、特に、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｉＮＡなど、小型の核酸のインビボでの用途における非常に効率のよい送達を、少なくとも第１の脂質成分、少なくとも第１のヘルパー脂質、および遮蔽化合物を含む脂質組成物を利用することによって達成できることを見出した。好ましくは、第１のヘルパー脂質は、中性、すなわち電荷中性または無電荷のヘルパー脂質である。このような脂質組成物は、典型的には、担体に含有されるが、凍結乾燥状態で存在することも可能である。担体に含有される脂質組成物は、通常、分散体を形成している。より好ましくは、担体は、本明細書においても更に詳しく特徴が述べられている水性溶媒または水溶液である。脂質組成物は、一般的には、担体内でリポソームを形成するが、そのようなリポソームも、好ましくは、内部に担体を含有する。

担体内に含有される脂質組成物、および担体は、それぞれ、オスモル濃度が、好ましくは約５０〜６００ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、好ましくは約２５０〜３５０ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、およびより好ましくは約２８０〜３２０ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇである。

第１の脂質成分によって、また、任意には、第１のヘルパー脂質によって、好ましくは第１の脂質成分との組み合わせによって形成されるリポソームの粒子径は、約２０〜２００ｎｍ、好ましくは約３０〜１００ｎｍ、およびより好ましくは約４０〜８０ｎｍである。

更に、粒子のサイズが一定の分布に従うものと理解される。あくまで代表的な粒子サイズの分布が図１ｃに示されているのであって、これは、原則として、他の平均サイズの粒子にも、すなわち、リポソームおよびリポプレックスのそれぞれにも適用可能である。

本発明に係る脂質組成物の更なる選択的な特徴は、担体のｐＨ値が、好ましくは約４．０〜６．０であることである。しかし、他のｐＨ範囲、例えば、４．５〜８．０、好ましくは約５．５〜７．５、およびより好ましくは約６．０〜７．０なども本発明の範囲に含まれる。

これらの具体的な特徴を実現するために、当分野において周知されているような、様々な手段をとることができる。例えば、オスモル濃度の調節するについては、糖または糖類の配合物が特に有用である。その限りにおいて、本発明の脂質組成物は、以下の糖類のうちの１つまたはいくつかを含むことができる。ショ糖、トレハロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、マルトース、ラクツロース、イヌリン、およびラフィトース、ただし、ショ糖、トレハロース、イヌリン、およびラフィトースが特に好ましい。特に好ましい実施形態において、主に糖の添加によって調節されるオスモル濃度は約３００ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇであり、これは２７０ｍＭのショ糖溶液または２８０ｍＭのグルコース溶液に相当する。好ましくは、担体は、そのような脂質組成物が投与されることになる体液と等張である。本明細書において、主に糖の添加によって調節されるオスモル濃度という用語は、オスモル濃度の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％が、前記糖または前記糖類配合物によってもたらされることを意味する。

本発明の脂質組成物のｐＨを調節する場合、基本的には当業者に知られているような緩衝物質を用いて、これを行う。好ましくは、カチオン性脂質、より具体的には、カチオン性頭部基のアンモニウム基の塩基性の性質を補うのに適した塩基性物質を用いる。塩基性アミノ酸および弱塩基などの塩基性物質をそれぞれ添加するときは、上記のオスモル濃度を考慮すべきである。そのような脂質組成物およびそのような脂質組成物によって形成されるリポソームの粒子サイズは、好ましくは、動的光散乱（ＱＥＬＳ）によって、例えば、製造業者の指示に従って、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒのＮ５サブミクロン粒子サイズ解析装置を使用することによって決定される。

脂質組成物が１個または数個の核酸を含有していれば、そのような脂質組成物は、通常、リポプレックス複合体、すなわち、リポソームおよび核酸からなる複合体を形成する。好ましくは等張性の２７０ｍＭショ糖または２８０ｍＭグルコース中のリポプレックスにおける総脂質含有量の、より好ましい濃度は、約０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜４０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１〜２５ｍｇ／ｍｌである。この濃度は、適当な保存液を調製するために、一般的には、２〜３倍まで上げることができると理解されるべきである。このことに基づいて、オスモル濃度が上記で規定された範囲内になるように希釈液を調製することも、本発明の範囲に含まれる。より好ましくは、この希釈液は、脂質組成物に関して使用された担体、またはその中に脂質組成物が含まれている担体と同一であるか、または機能の点から見て、より具体的には、オスモル濃度の点から見て類似している担体中で調製される。脂質が核酸、より好ましくは、限定ではないが、ｓｉＲＮＡなどの機能的核酸を含む、本発明の脂質組成物の実施形態において、脂質組成物中のｓｉＲＮＡの濃度は、約０．２〜０．４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２８ｍｇ／ｍｌであり、総脂質濃度は約１．５〜２．７ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２．１７ｍｇ／ｍｌである。核酸画分と脂質画分の間のこの質量比が、それによって実現される電荷比に関しても、特に好ましいと理解されるべきである。本発明の脂質組成物の更なる濃度もしくは希釈度に関しては、そのような濃度もしくは希釈度にかかわらず、この具体的な実施形態において実現される質量比および電荷比のそれぞれが、維持されることが好ましい。

例えば、薬学的組成物において用いられる、このような濃度は、適量の媒体、好ましくは生理学的に許容される緩衝液、または本明細書に記載されているいずれかの担体中に脂質を分散させることによってか、あるいは、適当な手段で濃縮することによって得ることができる。そのような適当な手段は、例えば、クロスフロー限外濾過法などの限外濾過法である。濾過膜の細孔幅は、約１，０００〜３００，０００Ｄａの分画分子量（ＭＷＣＯ）または５ｎｍ〜１μｍである。特に好ましいのは、約１０，０００〜１００，０００ＤａＭＷＣＯの細孔幅である。脂質組成物、より具体的には、本発明に係るリポプレックスが、凍結乾燥状態で存在し得ることを、当業者は理解する。このような凍結乾燥状態は、典型的には、リポプレックスの保存期間を延ばすのに適している。特に、適当なオスモル濃度をもたらすために添加された糖が、それに関しては、抗凍結剤として用いられる。それに関して、前記したオスモル濃度、ｐＨ、およびリポプレックス濃度の特徴は、担体中で溶解、懸濁または分散している脂質組成物の状態を指すが、そのような担体は、原則として、本明細書に記載されている担体のいずれかであって、典型的には、水または生理学的に許容される緩衝液、好ましくは等張性緩衝液もしくは等張液などの水性担体である。

遮蔽化合物によって、インビボにおける循環時間が延長され、その結果、核酸を含有する脂質組成物の生体内分布が改善される。このような機序によって、静脈内投与を行う場合、脂質組成物は、通常は脈菅系の内壁である、注射部位の周りの組織によって直ちに分解されないため、そのような脂質組成物の投与部位から比較的離れている、ヒトまたは動物の体内の部位、より具体的には、哺乳動物の体内の部位を標的化することが可能である。本明細書で用いられるとき、遮蔽化合物とは、好ましくは、脂質組成物が、血清化合物、または他の体液の化合物、または、好ましくは、脂質組成物が好ましく投与される血菅系内壁の細胞質膜の化合物と直ちに相互作用するのを防止する化合物である。遮蔽という用語は、そのような脂質組成物が投与された身体の免疫系またはその他の防御機構もしくは除去機構の要素が、脂質組成物と直ちに相互作用せずに、生体内における循環時間を再度延長することを意味する。この限りにおいて、遮蔽化合物は、抗オプソニン化化合物として作用する。いかなる機構または理論に拘泥しようとするものではないが、遮蔽化合物は、外部環境との相互作用に利用可能な、脂質組成物の表面積を減少させる被覆または被膜を形成し、それを形成しなければ、そのような相互作用が起こるのには早すぎる時期に他の脂質と融合したり、人体もしくは動物の体のそれぞれの因子が結合してきたりする脂質組成物にしてしまうと思われる。ただし、より後期（すなわち、脂質組成物を投与してから長時間経過後）には、リポソームおよびリポプレックスのペイロードが送達されるためには、このような相互作用は、少なくとも一定の程度までは好ましい、または望ましいと理解しなければならない。遮蔽化合物の観察された有効性に依拠していると考えられる別の機序は、脂質化合物、特に、核酸、好ましくは、本明細書に規定されているような機能的核酸、より好ましくは、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、およびＲＮＡｉを含有する脂質化合物の総電荷の遮蔽である。ここでも、脂質化合物の相互作用が影響を受けるが、この効果は、脂質成分の遮断ではなく、電荷の遮断から生じると思われる。本開示に関しては、組成物は、１種類の脂質しか含むことができないと理解されるべきである。

遮蔽化合物は、好ましくは、生物学的に不活性な化合物である。より好ましくは、遮蔽化合物は、その表面上、またはその分子自体にも電荷をもたない。従って、特に好ましい遮蔽化合物は、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルグルコースベースのポリマー、ポリヒドロキシエチルスターチ（ｐｏｌｙＨＥＳ）、およびポリプロピレンであるが、該化合物のいずれも、好ましくは約５００〜１００００Ｄａ、より好ましくは約２０００〜５０００Ｄａの分子量を有する。

インビボ条件下で、好ましくは、遮蔽化合物を脂質組成物から除去できるということは、本発明の重要な特徴である。このような除去は、一つの実施形態では、遮蔽化合物自体を除去することを含むことができるが、異なった実施形態では、遮蔽化合物が、好ましくは共有結合している化合物とともに遮蔽化合物を除去することも含むことができる。このような除去によって、脂質組成物のその他の成分、またはそれらの一部が、動物の体または人体などの環境に曝露され、最終的には、脂質組成物に含まれた核酸などの化合物の放出および送達がそれぞれ可能となる。インビボ条件という用語は、好ましくは、動物、より好ましくは哺乳動物の体、または人体の中、好ましくは、血液、溶液、間質、および細胞内液などの体液中に存在する状況、ならびに／またはエンドソームおよび／もしくはリソソーム中に存在する状況を意味する。遮蔽化合物の設計に応じて、以下でより詳しく説明されるような様々な方法で、除去が影響を受けることがあるかもしれない。

遮蔽剤が失われることから生じる更なる効果は、特に、遮蔽剤がＰＥＧである場合には、ＰＥＧを有する脂質処方剤を提供する (ＰＥＧ化とも呼ばれる) ことで、そのような脂質処方剤によって細胞質に送達されるべき核酸分子の機能的な送達がしばしば損なわれる結果になるという事実によるものである。脂質処方剤にＰＥＧが大量に存在すると、典型的には脂質処方剤によって形成されるリポソームのエンドソームへの取り込みが損なわれるか、または、脂質化合物に含有されているか、それに結合している核酸が、必要なエンドソーム脱出を妨害する。

一つの実施形態において、遮蔽化合物は、セラミドに結合、好ましくは、共有結合している、ＰＥＧ、ＨＥＧ、ポリヒドロキシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）、およびポリプロピレンからなる群から選択される。セラミドは、脂質化合物と相互作用し、存在すれば、ヘルパー脂質と相互作用する。その限りにおいて、セラミドは、第１のヘルパー脂質であっても、第２のヘルパー脂質であってもよい。ＰＥＧに結合したセラミドは、第１のヘルパー脂質とは異なっていることが好ましい。セラミドは、一般的に、好ましくは、第１の脂質成分および第１のヘルパー脂質によって形成された脂質組成物の脂質画分に埋め込まれ、比較的短い炭化水素鎖によって、一定の速度で放出される。セラミドが脂質組成物からこのように放出されると、遮蔽剤も同様に放出される。従って、この実施形態では、インビトロ条件によって脂質処方剤の分解が可能になり、それによって、脂質組成物のインビボにおける寿命または循環時間が延長される。

更なる実施形態において、遮蔽剤は、脂質組成物に含有されるか、それに結合している核酸に結合している。好ましくは、遮蔽剤は、核酸に共有結合し、最も好ましくはリンカーを介して共有結合している。より好ましい実施形態において、リンカーは、生理学的条件下、すなわち、動物またはヒトの体内に広く存在する状況下で切断されるように設計されている。好ましい実施形態において、一定の割合の核酸のみが、リンカーを介して、そのような多量体を実際に備える。いかなる理論にも拘泥するものではないが、該脂質組成物に遮蔽効果をもたらすためには、脂質組成物の一部を形成する一定の数の核酸分子だけがそのような巨大成分を持てば十分である。好ましくは、核酸分子の部分は約０〜２０％、より好ましくは３〜１０％、さらに好ましくは６〜１０％の範囲内にある。遮蔽剤を有する核酸（本明細書において遮蔽化合物とも呼ばれている）の好ましい含有量は、約０〜３％、３〜６％、６〜１０％および１０〜２０％であるが、本段落において、および本出願全体を通して使用されている％は、特に明記しない限り、モル％である。

このようなリンカーは一本鎖ＲＮＡリンカーであってもよく、より好ましくは、インビボの状態において、もしくはインビボ条件下で存在するＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性によって切断される１〜２０個のヌクレオチドを含む一本鎖ＲＮＡリンカーであってもよい。更なる実施形態において、このリンカーは、インビボ状態において、もしくはインビボ条件下でも存在するＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断される一本鎖ＤＮＡリンカーによって形成されている。更なる実施形態において、このリンカーは、二本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡによって形成させることができる。核酸からなるリンカーの安定性は、一般的には以下の通りである。ｓｓＲＮＡ＜ｄｓＲＮＡ＜ｓｓＤＮＡ＜＜ｄｓＤＮＡ。このように安定性が多様であるため、それぞれが、前記リンカーを含む、そのようにして改変された核酸および脂質組成物の残留時間を特異的に設計すること可能になる。

更なる実施形態において、リンカーは、インビボの状態もしくはインビボ条件下で存在するプロテアーゼによって切断されるオリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質によって形成されることができる。更なる実施形態によって、酸化還元状態に感受性が高いＳ−Ｓ結合を含むリンカーが提供される。

更なる実施形態において、リンカーはｐＨ感受性リンカーである。ｐＨ感受性リンカーという概念は、脂質組成物（原則としてリポプレックスまたはリポソームのいずれかであり得る）の取り込みにおいて、遮蔽剤（取り込まれる前の脂質組成物の保護に取りかかる場合には明らかに有益である）が、細胞内に輸送された化合物の更なる使用に制限を加えるという観察結果によるものである。本明細書において、遮蔽剤は、好ましい実施形態においてアニオン性部分であるか、またはこれを含む、ｐＨ感受性リンカーと結合している。エンドソームなどの酸性環境においては、このようなアニオン性部分の電荷が変化する。それによって、静電学に基づいた、脂質処方剤に含まれたカチオン性脂質とのｐＨ感受性リンカーの相互作用も変化するが、通常は低下し、その結果、ｐＨ感受性リンカーが、程度の差はあるが、脂質処方剤を含むカチオン性脂質から徐々に放出される。その結果、リポソームまたはリポプレックスは遮蔽剤を失って、その影響を細胞の外および／または中に及ぼすことができる。この種のリンカーは、当分野において知られているようなリンカー、およびこの種の新規のリンカー、すなわち、この種の特徴を有する新規のリンカーを含む。好ましくは、そのようなリンカーは、リンカーが上述のように反応することを可能にする電荷特性を有するリンカーである。そのようなｐＨ感受性リンカーの代表的なものは、オリゴ（グルタミン酸）、オリゴフェノラート、およびジエチレントリアミン五酢酸などを含む。そのようなリンカーを遮蔽剤に結合させること、およびそのようなリンカーを、一般に遮蔽剤の部分と言われている遮蔽剤に取り込ませることは、両方とも当業者に知られている。

本明細書において本発明に係る化合物とも称される、本発明に係る脂質組成物の第１の脂質成分として用いられる化合物は、図１に示されているように、Ｒ１−Ｎ−Ｒ２部分によって形成された親油基、Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＮＨ_３ ^＋）（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ成分によって形成されたリンカー基、およびＲ３成分によって形成された頭部基を含むものと見なすことができる。本発明者らは、驚いたことに、リンカー基において正電荷を示す、この種の化合物が、細胞膜全面に、より好ましくは細胞内に、より好ましくは動物細胞内に生物活性化合物を移動させるのに特に適していることを見出した。また、本発明者らは、驚いたことに、生物活性化合物が、核酸、好ましくはｓｉＲＮＡおよびｓｉＮＡである場合には、本発明に係る化合物によって仲介される移動が特に効率的であることを見出した。

本明細書において好ましく使用されている、アルキルという用語は、８〜２０個の炭素原子、好ましくは、１２〜１８個の炭素原子を含有する飽和型脂肪族置換基、または８〜３０個の炭素原子を含有し、少なくとも１つの二重結合または三重結合をそれぞれ含む、一価もしくは多価の不飽和型脂肪族置換基を意味する。従って、好ましい実施形態において、アルキルという用語はアルケニルまたはアルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）も含む。アルキルは、分岐型および非分岐型、すなわち、非線形型または直鎖型のアルキル基を意味する。好ましい直鎖型アルキル基は、８〜３０個の炭素原子を含む。より好ましいアルキル基は、１２〜１８個の炭素原子を含む。好ましい分岐型アルキル基は、８〜３０個の炭素原子を含むが、８〜３０個の炭素原子という数は、そのような分岐型アルキル基の骨格を形成している炭素原子の数を意味する。分岐型アルキル基の骨格は、骨格から分岐している、少なくとも１つのアルキル基を含むが、このアルキル基は、本明細書において定義されているアルキル基であり、より好ましくは、短鎖アルキル基を含むアルキル基であり、より好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜３個、および最も好ましくは１個の炭素原子を含む。より好ましいのは、骨格に１２〜１８個の炭素原子を含む分岐型アルキル基で、その分岐アルキル基が上記で定義されているものである。特に好ましいアルキル基はフィタニル基である。

別の実施形態において、アルキルは、上記に定義されている不飽和型の分岐型アルキル基または非分岐型アルキル基である。より好ましくは、そのような不飽和型脂肪族炭化水素置換基が１つ、２つ、または３つ、または４つの二重結合を含むが、二重結合を１つ有する遊離基が特に好ましい。最も好ましいものは、Ｃ１８：Ｉｄｅｌｔａ９、すなわち、１８個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素であって、９位に、９番炭素原子を１０番炭素原子に結びつける一重結合ではなく、ｃｉｓ型二重結合が示されているオレイル基である。

本明細書において、ｎは１から４の間の任意の整数であって、ｎが１、２、３、および４であり得ることを意味する。本明細書において、ｍは１から３の間の任意の整数であって、ｍが１、２、および３であり得ることを意味する。

本発明に係る化合物は、好ましくはカチオン性脂質であると理解されるべきである。より好ましくは、本発明に係る化合物に存在するＮＨ基またはＮＨ_２基はどちらも、プロトン化型として存在する。典型的には、本発明に係る化合物の正電荷は、アニオンの存在によって相殺される。そのようなアニオンは、一価アニオンまたは多価アニオンであってもよい。好ましいアニオンは、ハロゲン化物、酢酸、およびトリフルオロ酢酸である。本明細書におけるハロゲン化物は、好ましくはフッ化物、塩化物、ヨウ化物、および臭化物である。塩化物が最も好ましい。カチオン性脂質が、細胞内に移動する前の生物活性化合物に結合すると、ハロゲン化物のアニオンが、１個または数個の負電荷を好ましくは示す生物活性化合物によって置換される。ただし、生物活性化合物の全電荷は負であるとは限らないと認識されるべきである。

化学式（Ｉ）に記載された任意の化合物は、少なくとも２つの不斉炭素原子を含むと認認されるべきである。本明細書に記載された、そのような化合物のあらゆる可能な鏡像異性体、すなわち、特にＲ−Ｒ；Ｓ−Ｓ；Ｒ−ＳおよびＳ−Ｒという鏡像異性体が本明細書に開示されていることも、本発明の範囲に含まれる。

本発明に係る化合物は、組成物を形成したり、組成物の一部となったりすることができ、そのような組成物は担体を含む。本明細書において脂質組成物とも言われる、そのような組成物において、本発明に係る化合物も脂質成分を指す。そのような担体は、好ましくは液体担体である。好ましい液体担体は、水性担体または非水性担体である。好ましい水性担体は、水、水性緩衝系、より好ましくは、生理学的緩衝強度および生理食塩濃度を有する緩衝系である。好ましい非水性担体は、溶媒、好ましくは、エタノール、およびｔｅｒｔ−ブタノールなどの有機溶媒である。いかなる理論にも拘泥するつもりはないが、原則として、任意の水混和性有機溶媒も利用することができる。従って、組成物、より具体的には脂質組成物は、このようにリポソームとして存在したり、リポソームを形成したりすることができるものと認識されるべきである。本発明の脂質組成物に関して規定されているオスモル濃度およびｐＨ、ならびにリポプレックス濃度は、それぞれ、脂質組成物およびリポプレックス、ならびに前記担体を含む系を意味することも、本発明の範囲に含まれる。

本発明に係る組成物は、本明細書においてヘルパー脂質成分とも呼ばれているヘルパー脂質を１つ以上含むことができる。ヘルパー脂質成分は、好ましくは、リン脂質およびステロイドからなる群から選択される。リン脂質は、好ましくは、リン酸ジエステルおよびリン酸モノエステルである。リン脂質の好ましいメンバーはホスホグリセリドおよびスフィンゴ脂質である。本明細書において、ステロイドは、部分的に水素化したシクロペンタ［ａ］フェナントレンに基づく天然化合物および合成化合物である。好ましくは、ステロイドは２１〜３０個の炭素原子を含有する。特に好ましいステロイドはコレステロールである。

特に好ましいヘルパー脂質は、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。

本発明に係る特に好ましい組成物は、ＤＰｈｙＰＥと一緒に、β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸［♯６］、β−アルギニル−２，３−ジアモノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸［♯１１］またはε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸［♯１５］のいずれかを含み、ＤＰｈｙＰＥの含有量が、約９０〜２０モル％、好ましくは、８０モル％、６５モル％、５０モル％、および３５モル％である。ただし、モル％という用語は、組成物の総脂質含有量、すなわち、本発明に係るカチオン性脂質、および任意のヘルパー脂質など、別の任意の脂質を含むがこれらに限定されない、組成物の脂質含有量の百分率を意味する。

本発明に係る組成物が、好ましくは、本発明に係る化合物および／または本明細書に開示されているヘルパー脂質のうちの１つもしくはいくつかを含み、本発明に係る化合物、すなわち、カチオン性脂質、および／またはヘルパー脂質成分が、水性媒体中に分散物として存在していることは、本発明の範囲に含まれる。あるいは、本発明に係る化合物、すなわち、カチオン性脂質、および／またはヘルパー脂質成分は、水混和性溶媒中で溶液として存在している。水性媒体として、好ましくは、本明細書に開示されている水性担体のいずれかを使用する。好ましい水混和性溶媒は、任意の比率で水と均質相を形成する任意の溶媒である。好ましい溶媒はエタノールおよびｔｅｒｔ−ブタノールである。組成物、より具体的には、脂質組成物は、このように、リポソームとして存在しているか、リポソームを形成することができると認識されるべきである。

本発明に係る組成物は、その様々な実施形態において、薬学的組成物として用い、かつ用いることができると認められるべきである。後者の場合、薬学的組成物は、薬学的活性化合物、および任意で、薬学的に許容される担体を含む。このような薬学的に許容される担体は、好ましくは、本発明に係る組成物に関して本明細書において定義されている担体の群から選択することができる。本明細書に記載されている組成物はいずれも、その成分およびその任意の組み合わせが薬学的に許容されれば、原則として、薬学的組成物としても使用することができることが当業者によって理解される。薬学的組成物は薬学的活性化合物を含む。そのような薬学的活性化合物は、好ましくは、任意の生物学的活性化合物、より好ましくは、本明細書に開示されている任意の生物活性化合物である、本発明に係る組成物の更なる構成成分と同じものであり得る。更なる構成成分、薬学的活性化合物、および／または生物活性化合物は、好ましくは、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび核酸からなる群から選択される。

好ましくは、そのような生物活性化合物はいずれも、負に荷電した分子である。本発明者らは、いかなる理論にも拘泥するつもりはないが、負に荷電した分子という用語は、本発明に係るカチオン性脂質の正荷電を有する基とイオン対合することができる、少なくとも１つの負に電荷した基を有する分子を含むことを意味する。原則として、リンカー部分における正電荷も、リンカーそれ自体、またはカチオン性脂質と負に荷電した分子、すなわち、生物活性化合物との間で形成される複合体のいずれかの全体的な構造にいくらかの影響を与えるかもしれない。その一方で、Ｘｕ Ｙ，Ｓｚｏｋａ ＦＣ Ｊｒ．；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；１９９６ Ｍａｙ ０７，３５（１８）：５６１６−２３によって教示されているように、本発明に係る脂質に導入された更なる正荷電は、米国特許第６，３９５，７１３号に開示されているカチオン性脂質と比較して、この脂質の毒性を強めるのに寄与するはずである。当業者がこの先行技術文書から期待したものとは対照的に、本発明に係る化合物は、本明細書において開示されている様々な目的に特に適し、特に、毒性を欠いているか、または毒性を増加させない。

本明細書において好ましく使用されるペプチドは、好ましくは、ペプチド結合を介して、相互に共有結合している、少なくとも２個のアミノ酸からなる任意のポリマーである。より好ましくは、ペプチドは２個から１０個のアミノ酸からなる。このペプチドの特に好ましい実施形態は、更に一層好ましくは、約１０個〜約１００個のアミノ酸を含むオリゴペプチドである。本明細書において、好ましく使用されるタンパク質は、相互に共有結合している複数のアミノ酸からなるポリマーである。好ましくは、そのようなタンパク質は、少なくとも約１００個のアミノ酸またはアミノ酸残基を含む。

本発明に係るカチオン性脂質および組成物に関して使用することができる好ましいタンパク質は、任意の抗体、好ましくは任意のモノクローナル抗体である。

特に好ましい生物活性化合物、すなわち、薬学的活性化合物、および本発明に係る組成物に関連して使用される更なる構成成分は核酸である。そのような核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、またはそれらの任意の混合物であってもよい。より好ましくは、核酸は機能的な核酸である。本明細書において好ましく用いられているような機能的核酸は、ペプチドおよびタンパク質をコードしていない核酸である。好ましい機能的核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマーおよびスピーゲルマーであり、これらはすべて当分野において公知である。

ｓｉＲＮＡは、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ０３／０８６６６号に記載されている低分子の干渉ＲＮＡである。典型的には、これらの分子は、相互に塩基対形成している、すなわち、典型的にはワトソン−クリック塩基対によって、本質的に相互に相補的である１５〜２５個、好ましくは、１８〜２３個の間のヌクレオチド対を含む二本鎖ＲＮＡ構造物からなる。この二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖は標的核酸、好ましくは、ｍＲＮＡと本質的に相補的であるのに対し、該二本鎖ＲＮＡ分子のもう一方の鎖は該標的核酸の鎖と本質的に同一である。ｓｉＲＮＡ分子は、両側および両鎖のそれぞれに、必ずしも塩基対合する必要のない、いくつかの付加的なオリゴヌクレオチドが配置されていてもよい。

ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡと本質的に同じ設計を有するが、これらの分子はｓｉＲＮＡと比較して有意に長い。ＲＮＡｉ分子は、典型的に、５０個以上のヌクレオチドおよび塩基対をそれぞれ含む。

ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡｉと同じ作用様式に基づいて活性である、更なる種類の機能的核酸がｓｉＮＡである。ｓｉＮＡは、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７４６５４に記載されている。より具体的には、ｓｉＮＡはｓｉＲＮＡに対応しているが、ｓｉＮＡは、リボヌクレオチドを全く含まない。

本明細書において好ましく使用されているアンチセンス核酸は、標的ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡとの塩基相補性に基づいてハイブリダイズして、ＲＮａｓｅＨを活性化させるオリゴヌクレオチドである。ＲＮａｓｅＨは、リン酸ジエステルおよびリン酸チオエートに結合したＤＮＡによって活性化される。しかし、リン酸ジエステルに結合したＤＮＡで、リン酸チオエートに結合したＤＮＡ以外のものは、細胞内ヌクレアーゼによって急速に分解される。このように、アンチセンスポリヌクレオチドは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド複合体としてのみ効果的である。アンチセンス核酸の好ましい長さは、１６〜２３ヌクレオチドの範囲である。この種のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、特に、米国特許第５，８４９，９０２号および第５，９８９，９１２号に記載されている。

機能的核酸の更なる群が、基本的に２つの成分を含むＲＮＡからなる、好ましくは、触媒活性を有する核酸であるリボザイムである。第１の成分は触媒活性を示すが、第２の成分は標的核酸との特異性相互作用に関与する。典型的には、ハイブリダイズする２本の鎖上にある本質的に相補的な塩基鎖のハイブリダイゼーションおよびワトソン−クリック塩基対形成によって、標的核酸とリボザイムの第２の成分が相互作用すると、触媒活性を有する成分が活性化する可能性があるが、これは、リボザイムの触媒活性がホスホジエルテル活性であるならば、そのような成分が標的核酸を分子内または分子間で切断することを意味する。リボザイム、その使用法および設計原理は当業者に公知であり、例えば、ＤｏｈｅｒｔｙおよびＤｏｕｄｎａ（Ａｎｎｕ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌｓｔｒｕｃｔ．２０００；３０：４５７−７５）に記載されている。

機能的核酸の更なる群がアプタマーである。アプタマーは、一本鎖型または二本鎖型いずれかのＤ型核酸であって、標的分子と特異的に相互作用する。アプタマーの製造または選択は、例えば、欧州特許ＥＰ０５３３８３８号に記載されている。ＲＮＡｉ，ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンスヌクレオチド、およびリボザイムとは対照的に、アプタマーは、標的ｍＲＮＡを全く分解しないが、タンパク質などの標的化合物の二次構造物または三次構造物と特異的に相互作用する。標的と相互作用すると、標的は、典型的には、その生物活性に変化を示す。アプタマーの長さは、典型的には、わずか１５ヌクレオチドから８０ヌクレオチドにも及び、好ましくは、約２０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドの範囲にある。

機能的核酸の別のグループが、例えば、国際特許出願第ＷＯ９８／０８８５６号に記載されているスピーゲルマーである。スピーゲルマーは、アプタマーに類似した分子である。しかし、スピーゲルマーはアプタマーとは対照的に、全部または大部分が、Ｄ型ヌクレオチドではなくＬ型ヌクレオチドからなる。それ以外では、特にスピーゲルマーの可能な長さについては、アプタマーに関して概説したことがスピーゲルマーに適用される。

前述したように、本発明者らは、驚くべきことに、本発明に係る化合物、および該化合物を含む各々の組成物が、ＲＮＡｉ、より具体的には、ｓｉＲＮＡおよびｓｉＮＡを血管内皮細胞の中に移動させるのに特に有効となり得ることを見出した。いかなる理論にも拘泥するつもりはないが、ヘルパー脂質が、ＰＥＧ非含有ヘルパー脂質であっても、あるいは、特定の実施形態においては、ＰＥＧ含有ヘルパー脂質であってもよいが、本発明に係る脂質組成物に含有されるヘルパー脂質の特定のモル百分率のために、より具体的には、この種のヘルパー脂質のいずれかの含有量が、本明細書に規定されている濃度範囲内に含有されれば、驚くべき効果を実現することができることに注目すべきである。このことに関して、本発明に係る脂質組成物が、ＰＥＧ部分を含むヘルパー脂質を含有する場合には、そのようなＰＥＧ由来ヘルパー脂質含有組成物を用いた送達もしくは形質転換の作用が、核酸、具体的にはＲＮＡｉ分子、最も具体的には、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンスヌクレオチドおよびリボザイムを送達する上で有効であることが特に注目される。

この理由は、本発明者らが、驚くべきことに、少なくとも第１の脂質成分、および少なくとも第１のヘルパー脂質によって形成され、約４％以上のＰＥＧ含有ヘルパー脂質を含有するリポソームは活性がないが、４％未満（好ましくは０％以上３％未満）を含むリポソームは機能的な送達を媒介するが、ただし、ある程度の送達は、原理上、このような限界を超えても観察されることを見出した。基本的には、本発明者らによって、本発明に係る脂質組成物中の特定量のＰＥＧが、内皮細胞の効率的な形質転換および内皮細胞への送達を行うのに適していることが発見された。

更なる態様において、本発明者らは、驚くべきことに、好ましくはリポプレックスまたはリポソームとして存在する、本発明に係る脂質組成物が、好ましくは、全体的にカチオン性電荷を示し、少なくとも１つの余分な正電荷を示すことを見出した。より好ましくは、脂質組成物では、負：正の形の電荷比が約１：１．３〜１：５であることを示す。従って、本発明は、更なる態様において、負：正の形の電荷比が約１：１．３〜１：５である、少なくとも１つのカチオン性脂質および１つの核酸、また、好ましくはＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｉＮＡ、もしくは本明細書に定義されているその他の機能的核酸のいずれかを含む任意の脂質組成物に関係している。カチオン性脂質は、好ましくは、本明細書に記載されているカチオン性脂質である。脂質組成物は、好ましい実施形態においては、本明細書に記載されているヘルパー脂質またはヘルパー脂質を組み合わせたものを含む。

また、本発明者らは、特に、核酸含有脂質処方剤の全体的なカチオン性電荷に関連して上記した内容に鑑みて、特に、ｓｉＲＮＡおよびカチオン性脂質のモル比が、本発明に係る脂質組成物の適用の成功に不可欠であるかもしれないことも見出した。いかなる理論にも拘泥するつもりはないが、１モルのカチオン性脂質で、特に、本明細書に開示されているものは、１分子あたり最大３つの正の電荷を生じさせることができるが、一方で、核酸、より具体的には、本明細書に開示されているｓｉＲＮＡ分子は、１分子あたり最大４０個の負の電荷を生じる。本発明に係るｓｉＲＮＡ含有脂質処方剤を全体的に正に荷電させるためには、モル比が、好ましくは、０から最大０．０７５の範囲にわたることができる。好ましいモル比の範囲は約０．０２〜０．０５であり、さらに好ましくは、約０．０３７である。本発明の組成物およびリポプレックスのそれぞれの更なる実施形態において、ｓｉＲＮＡの重量に対する全脂質の重量比は、典型的には、２：１〜１０００：１（ｍ／ｍ）であるが、ただし、５：１〜１５：１（ｍ／ｍ）の比が好ましく、６：１〜９：１（ｍ／ｍ）の比が更に好ましい。

組成物、より具体的には、本発明に係る組成物が、薬学的活性化合物として、および更なる構成成分としてそれぞれ、本発明に係る組成物に含まれ得る前記の生物活性化合物の１つ以上を含有し得るということは、本発明の範囲内にあることである。これらの化合物の任意のものを、原則として、薬学的化合物として使用できることが、当業者には理解できる。このような薬学的化合物は、典型的には、疾患の病理学的機序に関与する標的分子に向けられたものである。様々な生物活性化合物、従って、本発明の態様に関連して使用される薬学的活性化合物の基礎にある一般的な設計原理および作用様式のために、事実上いかなる標的も対象とすることができる。従って、本発明に係る化合物およびこれを含有するそれぞれの組成物は、この種の生物活性化合物を用いて処置、予防および／または治療することができる疾患または病態を治療または予防するために使用することができる。これらの生物活性化合物以外に、その他の生物活性化合物も、本発明の任意の実施形態に係る組成物の一部となり得る。好ましくは、そのような他の生物学的活性化合物は、好ましくは、そのような他の生物活性化合物が、本発明に係る化合物、より好ましくは、カチオン性脂質として存在する本発明に係る化合物と相互作用するか、複合体を形成する条件下で、少なくとも１つの負荷電を含む。

本明細書において、生物活性化合物は、好ましくは、生物学的に活性があり、好ましくは、何らかの生物学的、化学的、および／または物理的な効果を生体系に対して示す任意の化合物である。このような生体系は、好ましくは、任意の生化学反応、任意の細胞、好ましくは、任意の動物細胞、より好ましくは、任意の脊椎動物細胞、最も好ましくは、任意の哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない、任意のヒト細胞、任意の組織、任意の器官、および任意の生物などである。このような任意の生物、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、家禽、サル、およびヒトからなる群から選択される。

本発明に係る組成物のいずれか、より具体的には、本発明に係る薬学的組成物のいずれかは、さらに何らかの薬学的活性化合物を含むことができるということも、本発明の範囲内にある。

組成物、具体的には、本発明に係る薬学的組成物は、様々な形の投与法に使用することができるが、局所投与および全身投与が特に好ましい。さらに好ましいのは、筋肉内、経皮、皮下、静脈内および肺内投与からなる群から選択される投与経路である。本明細書において好ましく使用される、局所投与とは、組成物および生物活性化合物のそれぞれを投与すべき細胞、組織、および器官のそれぞれと空間的に近接した関係で、それぞれの組成物を投与することを意味する。本明細書において、全身投与とは、局所投与とは異なった投与法であって、より好ましくは、血液および溶液など、それぞれの体液の中に投与し、それによって、体液が、その組成物および生物活性化合物がそれぞれ送達されるべき細胞、組織、および器官に組成物を輸送する。しかし、器官移植の場合のようなエクスビボ投与も、本発明に含まれる。

本明細書において、本発明に係る化合物および組成物のそれぞれによって生物活性化合物が移動して行く細胞膜に沿った細胞は、好ましくは、真核生物細胞、より好ましくは、脊椎動物細胞、さらに好ましくは、哺乳動物細胞である。最も好ましい細胞はヒト細胞である。いずれの場合も、当該細胞は内皮細胞である。

本発明に係る化合物および組成物をそれぞれ用いて製造することができる任意の薬剤は、それぞれ、患者における疾患を治療および予防するためのものである。好ましくは、そのような患者は脊椎動物であり、より好ましくは、哺乳動物であり、さらに好ましくは、そのような哺乳動物はマウス、ラット、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、家禽、サル、およびヒトである。さらなる態様において、本発明に係る化合物および組成物は、移動剤として使用することができ、より好ましくは、形質転換剤として使用することができる。

本明細書において好ましく使用される移動剤は、本明細書において前述されているように、膜、好ましくは、細胞膜を通して化合物、より好ましくは、薬学的活性化合物のような生物学的活性化合物を移動させる、より好ましく、細胞内にそのような化合物を移動させるのに適した任意の薬である。更に好ましくは、そのような移動は、エンドソームおよび／またはリソソームからの放出も含む。好ましい実施形態において、細胞膜という用語は、小胞膜、エンドソームおよびリソソームの膜など、細胞内部にある膜も含む。

更なる態様において、本発明は、生物活性化合物によって細胞を移動させる、より具体的には、形質転換する方法に関係している。工程の順序は必ずしも限定されず、具体的には、以下に概説する工程順序に限定されないが、第１のステップにおいて、細胞および細胞膜がそれぞれ提供される。第２のステップにおいて、本発明に係る化合物もしくは組成物、および薬学的活性化合物などの生物活性化合物が提供される。この反応は、細胞および膜をそれぞれ接触させることができ、本発明に係る化合物および組成物の生物物理学的特性のために、生物学的活性化合物は、膜の片側から反対側に、あるいは膜が細胞を形成する場合は、細胞の外側から内側に移動する。細胞および膜をそれぞれ接触させる前に、生物活性化合物、および本発明に係る化合物もしくは組成物を接触させると、好ましくは、複合体が形成され、そのような複合体を細胞および膜のそれぞれと接触させることは、本発明の範囲に含まれる。

本発明の更なる態様において、生物活性化合物および薬学的活性化合物それぞれを移動させる方法は、細胞および膜のそれぞれを提供するステップ、本発明に係る組成物を提供するステップ、および組成物および細胞ならびに膜をそれぞれ接触させるステップを含む。細胞および膜のそれぞれを接触させる前またはその過程で、組成物を形成させることができることは、本発明の範囲に含まれる。

本明細書に開示されている生物活性化合物を移動させる任意の方法の実施形態において、この方法は、さらなるステップ、好ましくは、生物活性化合物が移動したか否かを検出するステップを含むことができる。そのような検出反応は、本方法に従って移動させられる生物活性化合物の種類に強く依存し、当業者には容易に明白である。本明細書に記載されている細胞、組織、器官、および生物に、そのような方法を実施することは、本発明の範囲に含まれる。

更なる実施形態において、遮蔽剤は、本明細書に記載した通り、本発明に係る脂質組成物の脂質成分に、より好ましくは、カチオン性脂質に結合していると認識されよう。

本明細書において、疾患の治療という用語は、そのような疾患を予防することも含む。

本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明されるが、それらから、更なる特徴、実施形態および長所を理解することができる。

実施例１：材料および方法
＜ｓｉＲＮＡ＞
本研究で使用されるｓｉＲＮＡ分子（ＡｔｕＲＮＡｉ）は、両鎖に対する交互２’−Ｏ−メチル修飾によって安定化された、平滑で１９重合体の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり（詳細については、（Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，２００３）参照）、ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ社（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａ．Ｍ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成されたものである。本研究において使用されたｓｉＲＮＡの配列を表１に列挙した。

＜ｓｉＲＮＡ−リポプレックスの調製および特徴＞
脂質膜を、ＲＮａｓｅフリーの３００ｍＭ滅菌ショ糖溶液で、総脂質濃度４．３４，ｇ／ｍｌの３００ｍＭショ糖、ｐＨ＝４．５〜６．０に再水和することによって、β−Ｌ−アルギニル−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸である新規のカチオン性脂質ＡｔｕＦＥＣＴ０１（Ａｔｕｇｅｎ ＡＧ（Ｂｅｒｌｉｎ））、中性／ヘルパー脂質リン脂質である１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）、およびＰＥＧ化脂質であるＮ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を５０／４９／１というモル比で含むカチオン性リポソームを調製した。そして、この多重膜分散液を、ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ Ｃ３装置（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）を用いた高圧ホモジナイズ法（７５０バールにて２２サイクル、そして１０００バールにて５サイクル）によってさらに処理した。ｓｉＲＮＡ−リポプレックス（ＡｔｕＰＬＥＸ）を生成させるために、得られたリポソーム分散液を、等量の３００ｍＭショ糖液中０．５６２５ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ溶液と混合したところ、核酸のリン酸骨格対カチオン性脂質の窒素原子の計算電荷比が約１：４となった。リポソームとリポプレックス分散物のサイズを、準弾性光散乱法（Ｎ５ Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）によって決定し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いてζ電位を測定した。

ｓｉＲＮＡ−リポプレックスを二重標識するには、蛍光標識されたトレーサー脂質であるＴｅｘａｓＲｅｄ（登録商標）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミントリエチルアンモニウム塩（ＴｅｘａｓＲｅｄ（登録商標）−ＤＨＰＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を以下の比率で加えて、蛍光標識されたリポソームを生成させた。５０モル％カチオン性脂質（ＡｔｕＦＥＣＴ０１）／４４モル％ヘルパー脂質ＤＰｈｙＰＥ／１モル％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ／５モル％ＴｅｘａｓＲｅｄ（登録商標）ＤＨＰＥ。このリポソームは、混合する前に４００ｎｍポリカーボネート膜に通す射出サイクルを５１回行って処理し、脂質については全部で最終濃度２．１７ｍｇ／ｍｌ、また０．２８ｍｇ／ｍｌ ｓｉＲＮＡが得られた（２００μｌを３０ｇのマウスに注射するのは、１．８８ ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡおよび１４．５ｍｇ／ｋｇ脂質に相当する）。

＜インビトロにおける形質転換およびイムノブロッティング＞
ヒトＨｅＬａ細胞株およびマウスＥＯＭＡ細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手して、ＡＴＣＣの推奨するところに従って培養した。上記したカチオン性リポソームを用いて、細胞株をｓｉＲＮＡにより形質転換した。簡潔に説明すると、細胞を播種してから約１２時間後に、１０％血清含有培地に希釈した様々な量のｓｉＲＮＡ−リポプレックス溶液を細胞に加えて、形質転換濃度が１〜５０ｎＭのｓｉＲＮＡの範囲になるようにした。形質転換（４８時間）後の細胞を溶解し、（Ｋｌｉｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８）に記載されているようにしてイムノブロッティングを行った。全タンパク質を抽出するには、組織を切り出して、直ちに液体窒素内で急冷凍結した。２０ｍｇの組織を、Ｍｉｘｅｒ Ｍｉｌｌ ＭＭ ３０１（Ｒｅｔｓｃｈ ＧｍｂＨ，Ｈａａｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内で、タングステンカーバイドビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてホモジナイズし、タンパク質をＮＰ４０−溶解バッファー内で抽出した。ＤＣタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてタンパク質濃度を決定し、以下の抗体を用いてイムノブロッティング解析を行うために等量をロードした。ウサギ抗ＰＴＥＮ（Ａｂ−２，Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）、モノクローナルｐ１１０α（Ｋｌｉｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、ウサギ抗ＰＫＮ３（Ｌｅｅｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）、ヤギ抗ＣＤ３１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗Ｔｉｅ−２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。

＜細胞培養およびマウスにおけるｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３の取り込み実験＞
細胞内における非処方ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３分子の取り込み研究では、細胞を、血清含有培地内で所定量のｓｉＲＮＡ溶液とともに一晩インキュベートした。リポプレックス化ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３の取り込みは、上記のとおり、一晩形質転換して行った。処理した細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、顕微鏡観察する前に１５分間、４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液で固定した。蛍光標識されたｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３を用いたインビボにおける送達実験は、処方されたｓｉＲＮＡおよび未修飾のｓｉＲＮＡを静脈内に投与して行った。最終用量が１．８８ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３および１４．５ｍｇ／ｋｇの脂質となるように２００μｌの単回静脈注射によってマウスを処理し、所定の時点で殺処分して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片またはＯＣＴ固定凍結組織切片のいずれかに対し、蛍光の取り込みを顕微鏡によって調べた。

＜組織学的解析および顕微鏡観察＞
マウスを殺処分した後、組織を直ちに４．５％緩衝ホルマリンで１６時間固定し、それによって、パラフィン包埋のための処理をした。４μｍの切片を切り出し、スライドガラスに載せた。組織切片を、ヤギポリクローナル抗ＣＤ３１抗体／ＰＥＣＡＭ−Ｉ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（あるいは、凍結切片にはラットＣＤ３１、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色して、パラフィン切片内の内皮細胞を可視化した。標準的なプロトコールに従って、パラフィン組織切片に対する免疫組織化学的検査およびヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＋Ｅ）染色法を行った。蛍光標識されたｓｉＲＮＡのインビボでの取り込みを研究するために、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡を用いた落射蛍光顕微鏡検査法によってパラフィン切片を直接調べた。画像を記録し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５画像化ソフトウェアを用いて処理した。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡を用いてｓｉＲＮＡ取り込みの精密顕微鏡分析を行った。そのために、切片をキシレンで脱パラフィン化し、エタノールで段階的に洗浄して再水和化し、Ｓｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ １００ｎＭ）で対比染色して洗浄し、最後に、顕微鏡検査するためにＦｌｕｏｒＳａｖｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に載せた。

＜ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）によるｍＲＮＡの定量＞
組織を切り出して、直ちに液体窒素内で急冷凍結した。約２０ｍｇの組織を、Ｍｉｘｅｒ Ｍｉｌｌ ＭＭ ３０１（Ｒｅｔｓｃｈ ＧｍｂＨ，Ｈａａｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内で、タングステンカーバイドビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてホモジナイズし、全ＲＮＡを、Ｉｎｖｉｓｏｒｂ Ｓｐｉｎ組織ＲＮＡミニキット（Ｉｎｖｉｔｅｋ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて調製した。以下の単位複製配列セット（ＢｉｏＴｅｚ ＧｍＢＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた定量的ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲには、組織に応じて２５〜１００ｎｇの全ＲＮＡを用いた（ＵＰＲ：上流側プライマー、ＬＷＲ：顆粒側プライマー、ＰＲＢ：プローブ）：マウスｍＲＮＡに対しＣＤ３１特異的、ＵＰＲ ５’ＧＧＧＡＡＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＡＧＡＣ３’、ＬＷＲ ５’ＣＡＴＴＡＡＧＧＧＡＧＣＣＴＴＣＣＧＴＴＣ３’、ＰＲＢ ＦＡＭ−５’ＣＧＧＡＡＧＧＴＣＧＡＣＣＣＴＡＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡ３’−ＴＡＭＲＡ；両マウススプライスバリアントに対しＣＤ３４特異的、ＵＰＲ ５’ＧＡＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＡＧＴ３’；ＬＷＲ ５’ＣＡＧＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＧＧＣＣＴＡＡＣＣ３’；ＰＲＢ ＦＡＭ−５’ＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＣＴＴＣＴＡＧＣＣＣＡＧＴＣＴＧＡ３’−ＴＡＭＲＡ；マウスｍＲＮＡに対しＴｉｅ２特異的、ＵＰＲ ５’ＡＴＧＣＣＴＣＴＧＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＧ３’；ＬＷＲ ５’ＴＣＴＧＧＣＡＡＡＴＣＣＴＣＴＡＴＣＴＧＴＧ３’；ＰＲＢ ＦＡＭ−５’ＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＴ３’−ＢＨＱｌ。ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲ反応は、プライマーを濃度３００ｎＭ、またはプローブを１００ｎＭとし、ＲＴ−ＰＣＲ用の標準的プロトコール（４８℃３０分間、９５℃ ｌ０分間、４０×（９５℃１５秒間、６０℃１分間）を用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出装置（Ｓｏｆｔｗａｒｅ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｖｌ．６．３（ＡＢＩ））で行った。ＴａｑＭａｎデータは、比較Ｃ_Ｔ法を用いて計算した。ここで、標的ｍＲＮＡ（ＣＤ３１またはＴｉｅ２）の量は、内部参照（ＣＤ３４）に対して標準化され、キャリブレーター（ショ糖群）に対して相対的なものであるが、式２^−ΔΔＣ _Ｔによって与えられる。個々のマウスに関するデータは、ＣＤ３１のｍＲＮＡ、ＣＤ３４のｍＲＮＡ、またはＴｉｅ２のｍＲＮＡのＣ_Ｔとして示され、３回反復の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している。処理群に関するデータは、内部参照に対して標準化された、ショ糖に対して相対的なΔΔＣ_Ｔとして示され、群当たり６〜８匹のマウスの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している。

＜ＥＬＩＳＡによる可溶型Ｔｉｅ２の定量＞
血清解析には、０日目と５日目に、麻酔をかけたマウスから眼窩静脈叢出血により採血した。製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡにより可溶型Ｔｉｅ２を測定した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）。

＜ＥＬＩＳＡによるインターロイキン−１２の定量＞
オスのＣ５７ＢＬ／６マウスに、ポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはｓｉＲＮＡ−リポプレックス溶液（最終用量が１．８８ ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡまたはＰｏＩｙ（Ｉ：Ｃ）、および１４．５ ｍｇ／ｋｇのｌｉｐｉｄ）を２００μｌ尾静脈に単回注射した。注射後２時間目と２４時間目に、麻酔をかけたマウスから眼窩静脈叢出血により採血し、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）により血清ＩＬ−１２（ｐ４０）およびインターフェロン−αのレベルを測定した。

＜マウス研究＞
免疫不全のオスＨｓｄ：ＮＭＲＩ−ｎｕ／ｎｕヌードマウス（９週齢）を、インビボにおけるｓｉＲＮＡ−リポプレックスの毒性を評価するため、ならびにＲＮＡｉ（インビボにおけるノックダウン解析）およびＴｉｅ２のＥＬＩＳＡを検出するために用いた。蛍光標識されたｓｉＲＮＡ−リポプレックスの器官分布および細胞型分布の顕微鏡による解析、ならびにＩＬ−１２のＥＬＩＳＡ解析は、免疫適格オスＣ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢）を用いて行った。動物の維持管理および実験は、認可されたプロトコールに従い、労働保護・健康保護ならびに技術的安全性に関する州庁、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ（Ｎｏ．Ｇ０２６４／９９）のガイドラインに則って行われた。

＜統計学的解析＞
データは、平均値±平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）で表示されている。差異の統計的有意性は、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定によって決定した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意であると見なした。

実施例２：インビトロにおけるｓｉＲＮＡ−リポプレックスの特性
本発明者らは、３’突出を持たない１９重合体のｓｉＲＮＡ二重鎖であって、両鎖上を交互に２’−Ｏ−メチル糖修飾し、実施例１の表１に図示されているように、修飾されていないヌクレオチドが修飾されたヌクレオチドと反対鎖同士で向き合うようにすることによって化学的に安定化されている（Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，２００３）ｓｉＲＮＡ二重鎖を用いた。

これら特別に修飾された分子が、ＲＮＡｉ活性を保持しつつ、血清ヌクレアーゼに対する抵抗性を促進することが、これまでに細胞培養（エクスビボ）（Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，２００３）において明らかにされている。まず、本発明者らは、これらの分子が、カチオン性リポソームと複合体を形成するか、あるいは非処方（「未修飾」）で、細胞培養においてＲＮＡｉをもたらすか否かを解析した。本目的のため、本発明者らは、新規に設計され、ＡｔｕＦＥＣＴ０１と名付けられたカチオン性脂質を、市販されているヘルパー脂質であって、その構造を図１ａに示した脂質と組み合わせて合成した。この新規の脂質は、高電荷の頭部基に特徴があり、他の市販されているカチオン性脂質、例えば、ＤＯＴＡＰやＤＯＴＭＡに比べて効率のよいｓｉＲＮＡ結合ができるようになっている。以下の研究では、本発明者らは、正に荷電したリポソーム（５０モル％カチオン性脂質ＡｔｕＦＥＣＴ０１、４９モル％中性／ヘルパー脂質ＤＰｈｙＰＥ、および１モル％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）からなるｓｉＲＮＡ−リポプレックスを、様々な標的特異的ｓｉＲＮＡ分子と組み合わせて用いた。ＱＥＬＳ（９０°の角度における単一モード解析）およびζ電位測定によって、サイズと電荷について、リポソームおよびｓｉＲＮＡ−リポプレックスの特徴を調べた。その結果を図１ｃおよび１ｄに示す。代表的なカチオン性脂質処方剤のζ電位は＋６３ｍＶであったが、本発明に係るリポプレックス処方剤は、＋４６ｍＶというζ電位を示した。

インビトロ送達について行ったイムノブロット解析によって、図２ａから分かるように、ｓｉＲＮＡ−リポプレックスではナノモル濃度が使用されているのに対し、未修飾のｓｉＲＮＡは、マイクロモル濃度でも遺伝子のサイレンシングが起こらなかったことが実証された。遺伝子サイレンシングが起こらなかったことが、アニオン性ｓｉＲＮＡと負に帯電した細胞膜との間に反発作用があるために細胞内取り込みが不効率になった結果であるか否かを解析するために、本発明者らは、３’蛍光（Ｃｙ３）標識したｓｉＲＮＡを用いて、共焦点顕微鏡により、それらの取り込みを調べた。本発明者らは、それ以前に、アンチセンス分子の３’末端を蛍光標識しても、送達媒体で形質転換すれば、ＲＮＡのサイレンシング活性を損なうことはないことを明らかにしていた。（Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ，２００２；Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。驚いたことに、本発明者らは、図２ｂに示したように、高濃度の（１０μＭ）のｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３分子を適用すると、形質転換用試薬がなくても、蛍光標識されたｓｉＲＮＡの有意な取り込みが行われることを観察した。これに対し、１０００倍低いｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３濃度（１０ｎＭ）にてＡｔｕＦＥＣＴ０１により形質転換させると、同等のｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３取り込みが生じた。これらの結果は、ｓｉＲＮＡ−リポプレックスによって、ｓｉＲＮＡの機能的な送達にとって以下の２つの有益な効果がもたらされることを示している。細胞内取り込みの向上、さらに重要なのは、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡ分解が起きる、細胞質の中へのエンドサイトーシス／エンドソーム経路から免れることができる（Ｚｅｌｐｈａｔｉ ａｎｄ Ｓｚｏｋａ，１９９６）点である。

実施例３：ＰＥＧ化されたｓｉＲＮＡ−リポプレックスはインビトロで機能するとともに、インビボでの適用にも適している。
カチオン性リポソーム粒子が、負に荷電した血清タンパク質と相互作用するか、または他の血清成分に結合することができるということが示唆されている。これらの非特異的相互作用は、インビボにおけるリポソーム処方剤の分配・送達特性に消極的な影響を与える恐れがある。この問題を克服するために、多くのリポソーム担体は、ポリマーであるポリ（エチレングリコール）、すなわちＰＥＧで被覆され、血清タンパク質または補体系によって担体がクリアランスされるのを防止して循環時間を向上させている。また、ＰＥＧの取り込みは、マクロファージクリアランスを遮蔽および低減させることによってリポソームを安定化するのにも役立ち得る（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。

ｓｉＲＮＡ−リポプレックスの場合におけるＰＥＧ化の利点を明らかにするため、本発明者らは、ＰＥＧ化脂質を用いた実験と用いない実験を行った。以下の実験において、本発明者らは、正に荷電したリポソーム（カチオン性脂質Ａｔｕｆｅｃｔ０１、中性／ヘルパー脂質ＤＰｈｙＰＥ、および様々な量のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００）を含んでなるｓｉＲＮＡ−リポプレックスを、様々な標的特異的ｓｉＲＮＡ分子と組み合わせて用いた。まず、本発明者らは、インビトロにおいて、ＲＮＡ干渉活性に対する様々な量のＰＥＧ化の効果を測定した。ｓｉＲＮＡ^ＰＴＥＮによる遺伝子サイレンシングは、５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００が存在すると完全に無効になったが、処方剤中に１〜２モル％存在する場合には維持された。これらの結果は、ＨｅＬａ細胞の形質転換による、様々なモル％のＰＥＧを含むｓｉＲＮＡリポソーム処方剤のウエスタンブロット解析検査を示す図３ａに示されている（２０ｎＭ（左図）または５ｎＭ（右図）のｓｉＲＮＡ濃度；ｕｔ：非処理）が、ここでは、抗抗ＰＴＥＮおよび抗ｐ１１０αをプローブにしてタンパク質抽出物が調べられた。図３ｂに示されているように、１〜２％ＰＥＧ化を、大型の核周辺小胞から小型で均一の小胞に変えたところ、蛍光標識されたｓｉＲＮＡ−リポプレックスの細胞内分布が変化した。これに対し、５モル％のＰＥＧ化では、図３ｂの左図から分かるように、リポプレックス化ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３が主に細胞表面に結合してしまうため、ＲＮＡｉは観察されず（図３ａ）、取り込みが遮断されていると考えられる。ＰＴＥＮ遺伝子またはＰＫＮ３遺伝子の標的配列に相補的なｓｉＲＮＡを、１モル％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００の存在下または不在下で処方すると、図３ｃから分かるように、ＰＥＧ化されているにも関わらず、特異的なｓｉＲＮＡによるタンパク質ノックダウンが観察された。しかし、ＰＥＧ化された変異体と比較すると（図３ｃ、１ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を比較）、非ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ−リポプレックスの方が、より低い濃度で僅かに効率よくタンパク質ノックダウンを生じさせたものの、高い用量（２０ｎＭ、図３ｃ）で適用すると、非特異的なノックダウン効果も見られた（ｓｉＲＮＡ^ＰＫＮ３−リポプレックスに関するＰＴＥＮローディング用対照参照）。このような非標的タンパク質レベルの非特異的阻害は、おそらく、インビトロにおける非ＰＥＧ化リポプレックスのより強い毒性作用によるものである。

ｓｉＲＮＡ−リポプレックスのＰＥＧ化が、インビボでも毒性を低下させることができるか否かを解析するために、本発明者らは、同一用量のＰＥＧ化（１モル％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００）および非ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ−リポプレックスを尾静脈注射によってマウスに適用した。非ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ−リポプレックス（以下の４種類のｓｉＲＮＡ配列を用いた。ｓｉＲＮＡ^Ｌｕｃ、ｓｉＲＮＡ^ＰＫＮ３、ｓｉＲＮＡ^ＣＤ３１、およびｓｉＲＮＡ^ＰＴＥＮ）を、全身投与（ｉ．ｖ．）によって毎日連続して（１〜５日目）処理すると、時間とともに体重が減少した。一方、図３ｄから分かるように、同じ日用量のＰＥＧ化変異体（１モル％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００）で処理されたマウスには変化が見られなかった。

ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ−リポプレックスおよび非ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ−リポプレックスによる処理後の体重減少の差異を解明するために、リポプレックス処理に対する免疫反応の可能性を検討した。そのために、非複合体化ポリ（Ｉ：Ｃ）（陽性対照）、またはＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ−リポプレックス、または非ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ−リポプレックス（ｓｉＲＮＡ^ＰＴＥＮ、ｓｉＲＮＡ^Ｌｕｃ）の静脈内ボーラス単回注入後、免疫適格マウスにおけるインターロイキン−１２（ＩＬ−２）の量を測定した（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＥＬＩＳＡ解析によって、図３ｅから分かるように、ＰＥＧ化したにも関わらず、ｓｉＲＮＡ−リポプレックス処理によってＩＬ−１２の増加は起きなかったことが明らかになった。従って、非ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ−リポプレックスで処理した時に、非特異的なサイトカイン反応によって、観察された体重減少が起きたとは考えにくい。まとめると、これらのデータは、ｓｉＲＮＡ−リポプレックス処方剤中１モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００で、充分にインビトロにおけるＲＮＡｉ効果の顕著な消失を起こすことなく、インビボにおける非特異的副作用を抑制できることを示している。従って、一定のＰＥＧ化度が、本明細書において特徴づけられているｓｉＲＮＡ−リポプレックスの安全で効率的なインビボ適用を行うための重要な必要条件であると考えられる。

実施例４：血管内皮へのリポプレックス化ｓｉＲＮＡの特異的取り込みおよび未修飾のｓｉＲＮＡの腎排泄
次の工程で、本発明者らは、マウスの全身処理後の非処方ｓｉＲＮＡとの比較したｓｉＲＮＡ−リポプレックスの生体内分布および動態を調べることにした。本目的で、本発明者らは、Ｃｙ３蛍光標識されたｓｉＲＮＡの単回用量を、脂質と複合体を形成させて（２００μｌを１．８８ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３、および１４．５ｍｇ／ｋｇの脂質という最終用量で静脈内注射）、あるいは非処方で（１５μＭに等しいｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３：０．１８８ｍｇ／ｍｌ）、免疫適格マウスに注射し、落射蛍光顕微鏡法および共焦点顕微鏡法で調べるために、９つの時点（５分から４８時間）で６種類の異なる器官を切り出した。最初の顕微鏡解析によって、図４ａの下側の図に示したように、ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスによる処理後２０分の動物から解析した組織のすべてで蛍光が検出された。Ｃｙ３−蛍光は、各器官について異なる染色パターンとなって現れた。この器官特異的Ｃｙ３−染色パターンは、組織内皮の分布に似ている。これに対し、未修飾のｓｉＲＮＡは、注射後２０分には、主に腎臓で見られたが、他の器官では検出できるシグナルはなかった。これは、非処方ｓｉＲＮＡ分子が速やかに腎排泄されることを示唆している（図４ａ、上列）。また、適用された未修飾のｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３は、注射後５分で近位尿細管の極および管腔の中、および尿中に蓄積するが、これは、リポプレックス化ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３では見られなかった。結論として、非処方ｓｉＲＮＡは、全身投与後のインビボで解析された組織のいかなる細胞型にも標的とされなかったが、これは、即座に腎排泄されるためである可能性が最も高い。しかし、ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスでは、顕微鏡による蛍光データによって、ｓｉＲＮＡ分子が、様々な器官の血管系内皮によって、顕著に遅いクリアランス速度で取り込まれたことが示唆されている。ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスの薬理動態をより詳しく解析するために、本発明者らは、様々な時点におけるｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスの取り込みをより詳細に比較した。この解析のため、注射（２００μｌを１．８８ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３、および１４．５ｍｇ／ｋｇの脂質という最終用量で静脈内注射）して２０分後に最も高いＣｙ３蛍光量もつ４種類の器官（肺、心臓、肝臓、および脾臓）を選択した。同じ記録用パラメーターを用いた顕微鏡検査によってＣｙ３−蛍光を比較した。図４ｂから分かるように、これらの器官すべてにおいて相当量のリポプレックス化ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３が、注射後５分から蓄積していた。この蛍光量は、心臓と肺の組織では、その後２時間内に次第に減少して行った。それに対し、ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックス投与後２０分では、ほとんどの蛍光が脾臓で検出され、この組織では２０時間後までそれが続いた。肝臓では、長時間にわたってｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスが蓄積し、注射後２時間でＣｙ３蛍光が最も高量になり、その後４〜２０時間をかけて次第に減少して行った。驚いたことには、各組織におけるｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスの異なった蛍光染色パターンは、時間がたっても変化せず、ｓｉＲＮＡ分子が組織全体にわたって拡散しないことを示唆していた。この顕微鏡アッセイ法によって解析した試料のいずれにおいても、ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスの単回投与後４８時間目にはＣｙ３蛍光は観察されなかった。これらの結果は、リポプレックスに処方されたｓｉＲＮＡ分子は、未修飾のｓｉＲＮＡとして投与されたｓｉＲＮＡ分子と比較して、より良好な器官取り込みを達成することを示している。

しかし、器官によるｓｉＲＮＡ取り込みが向上したことは、送達されたｓｉＲＮＡが機能するための必要条件ではあるが、これらの分子の細胞内または細胞型に特異的な取り込みを必ずしも示すものではない。処方されたｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３の心臓および肺への取り込みを共焦点顕微鏡検査によってさらに詳しく解析したところ、細胞レベルでは、蛍光染色が、主に血管の内壁に存在することが明らかになり、内皮細胞に送達されることを示唆した。抗ＣＤ３１抗体を用いた免疫組織化学検査によって、心臓の血管内皮を可視化した。結果を図４ｃに示す。ＣＤ３１を発現する内皮細胞を染色すると、心筋細胞に沿って多数の毛細血管が存在することが示される（図４ｃ；矢印：毛細血管の横断面と縦断面）。これらの毛細管構造は、共焦点顕微鏡検査によって明らかになったように、ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスの単回静脈内注射によって処理したマウスの心臓内で標識されていた（図４ｃ、右図）。

ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスで処理したマウスの肺切片の共焦点顕微鏡検査によって、図４ｄから分かるように、肺胞壁が強調して染色されるが、細気管支内皮は強調して染色されないことが明らかになった。抗ＣＤ３１による染色によって可視化された通り、肺胞壁には、肺胞の毛細管が縦横に行き交っている（図４Ｄ、左図）。そのため、本発明者らは、本明細書記載のリポソームを用いてリポプレックス化されたｓｉＲＮＡは、肺の毛細血管内皮に送達されるようになると結論する。同じような内皮細胞特異的ｓｉＲＮＡ取り込みが、肝臓、膵臓、腎臓、小腸、胃など、他の器官でも観察された。まとめると、これらデータは、カチオン性脂質に基づいたｓｉＲＮＡの処方剤が、ｓｉＲＮＡの生体内分布特性を改善して、身体全体の内皮細胞へのｓｉＲＮＡの主な取り込みを可能にすることを明らかにしている。

実施例５：肺、心臓、および肝臓の血管系における、ｓｉＲＮＡ−リポプレックスに仲介されるＲＮＡｉ
ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスで全身処理したマウスは、様々な器官の内皮区画へのｓｉＲＮＡの送達を示唆している。この観察を行った後、本発明者らは、ｓｉＲＮＡの取り込みと分布を、具体的な器官におけるＲＮＡ干渉の有効性と関連づけようとした。本目的のため、本発明者らは、以下のインビボ実験を設計した。ヌードマウス（１コホート当たり６〜８匹）を、３種類の標的特異的ｓｉＲＮＡ−リポプレックスで４日間続けて静脈内注射（日用量：１．８８ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３、および１４．５ｍｇ／ｋｇの脂質）によって処理した。２種類の内在遺伝子標的であるＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−Ｉ）およびＴｉｅ２に特異的な強力なｓｉＲＮＡをインビトロで同定し、選択された器官の血管系におけるＲＮＡｉサイレンシングを明らかにするために適用した。重要なことに、これら２種類の遺伝子の発現は、内皮細胞に強く限定されている。別のマウス群を、非特異的作用に対する対照として、並行してショ糖液、またはマウスＰＴＥＮのコード配列に特異的なｓｉＲＮＡ−リポプレックスによって処理した。ＣＤ３１およびＴｉｅ２とは対照的に、ＰＴＥＮは、マウスのすべての細胞型において普遍的に発現している。最後にｓｉＲＮＡ−リポプレックス処理してから２４時間後に、ＲＴ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡ量の変化を測定し、イムノブロット法およびＥＬＩＳＡ法によってタンパク質量の変化を測定して、遺伝子発現を評価した。これらの結果を図５に示す。全ＲＮＡを、対応する処理群（ショ糖、ｓｉＲＮＡ^ＰＴＥＮ、ｓｉＲＮＡ^Ｔｉｅ２、ｓｉＲＮＡ^ＣＤ３１）の肺、心臓、および肝臓から調製し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）によって、２種類の標的遺伝子の内皮におけるｍＲＮＡのノックダウンを解析した。血管内皮細胞に発現が限定されているもう一つの遺伝子であるＣＤ３４のｍＲＮＡ量を測定し、内皮細胞のＲＮＡの同等量に対して標準化した。ＣＤ３４のｍＲＮＡ量に対する標準化したＣＤ３１またはＴｉｅ２のｍＲＮＡ量の平均割合を図５ａに示す。それぞれのｍＲＮＡ定量データで明らかになったように、ｓｉＲＮＡ^Ｔｉｅ２−およびｓｉＲＮＡ^ＣＤ３１−リポプレックスで処理された動物に由来する試料においてのみ、ＣＤ３１またはＴｉｅ２のｍＲＮＡ量が有意に減少した。ｓｉＲＮＡ^Ｔｉｅ２−リポプレックス処理群におけるＴｉｅ２のｍＲＮＡ量の減少、またはｓｉＲＮＡ^ＣＤ３１−リポプレックス群におけるＣＤ３１のｍＲＮＡの減少は、ｓｉＲＮＡ処理が標的特異的であることを実証している。肝臓において、ｍＲＮＡ量のノックダウンは、Ｔｉｅ２よりも顕著であった（図５ａ、下側の図）が、一方、肺および心臓では、どちらの標的遺伝子の発現も同じように阻害された。両方の標的遺伝子のｓｉＲＮＡによる阻害を確認するために、本発明者らは、イムノブロットによりＴｉｅ２タンパク質の発現の阻害の確認に着手した（図５ｂ）。ｓｉＲＮＡ^Ｔｉｅ２−リポプレックス処理群またはｓｉＲＮＡ^ＣＤ３１−リポプレックス処理群の６〜７匹の個々の動物から器官のタンパク質ライセートを調製し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法によって分離し、対応するイムノブロットを、抗Ｔｉｅ２および抗ＰＴＥＮ（ローディング対照）をプローブとして調べた。ｓｉＲＮＡ^Ｔｉｅ２−リポプレックス処理された動物の３種類の器官すべてにおいてＴｉｅ２タンパク質の有意な減少が見られた。肝臓からのタンパク質ライセートでは、本発明者らは、イムノブロットによって、有意な量のＣＤ３１を検出することができなかった。しかし、肺および心臓では、有意なｓｉＲＮＡ^ＣＤ３１−リポプレックス特異的ＣＤ３１タンパク質量の減少が明らかになった。まとめると、これらのデータは、マウスの血管内皮において、ｍＲＮＡ量およびタンパク質量に対するｓｉＲＮＡによる「遺伝子サイレンシング」があることを実証している。

解析した３種類の器官すべてのタンパク質ライセートにおいて、Ｔｉｅ−２タンパク質の量が有意に減少したため、本発明者らは、ｓｉＲＮＡ^Ｔｉｅ２−リポプレックス処理された動物の血液において、Ｔｉｅ２の可溶型の量が減少していることを検出することができるか否かを検討した。Ｔｉｅ２タンパク質は、そのリガンドであるアンギオポエチンと協調して、専ら内皮細胞の中で受容体型チロシンキナーゼとして働き、血管の再構築と完全性に寄与している（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，２００３）。Ｔｉｅ２の可溶型であるｓ−Ｔｉｅ２は、受容体の細胞外ドメインをタンパク質切断した産物であり、ＥＬＩＳＡアッセイによって血液中から簡単に検出することができる。本発明者らは、ｓ−Ｔｉｅ２ ＥＬＩＳＡの読み取り結果を用いて、ｓｉＲＮＡ−リポプレックス処理の前後における血清中のｓ−Ｔｉｅ２の変化を観察した。検査した４つのマウス群のすべてが、処理前には、同じようなｓ−Ｔｉｅ２量を示していた（０日目；図５ｃ、左図）。ｓｉＲＮＡ^Ｔｉｅ２−リポプレックス処理されたマウスは、対照コホートの処理マウス（ショ糖、ｓｉＲＮＡ^ＰＴＥＮ、ｓｉＲＮＡ^ＣＤ３１）と比較すると、処理日程の５日目で、有意なｓ−Ｔｉｅ２量の減少を示した（５日目；図５ｃ、右図）。この結果は、ｓｉＲＮＡ^Ｔｉｅ２−リポプレックスの全身投与によって、おそらく、身体の血管系内皮においてＴｉｅ２タンパク質の発現が抑制されることによって、インビボにおける全体的なＴｉｅ２遺伝子発現が影響を受けたことを意味している。結論として、ＡｔｕＦＥＣＴ０１に基づくｓｉＲＮＡ−リポプレックスは、静脈内注射後、多くの組織の血管内皮に標的される。ｓｉＲＮＡ−リポプレックスを繰り返し投与したところ、肺、心臓、および肝臓などの組織において標的特異的にＲＮＡおよび内皮遺伝子発現のタンパク質のノックダウンが生じた。

実施例６：ｓｉＲＮＡリポプレックスの調製法
＜平均粒子サイズが約１２０ｎｍであるｓｉＲＮＡリポプレックス＞
本出願のリポプレックスをクロロホルム内（ｃ＝２０ｍｇ／ｍｌ）で形成する脂質の溶液を、混合液内におけるカチオン性脂質のβ−（Ｌ−アルギニル）−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸（ＡｔｕＦＥＣＴ０１）：ヘルパー脂質の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）：ＰＥＧ脂質のＮ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）の比率が５０モル％：４９モル％：１モル％になるように、１００ｍｌの丸底フラスコに分注した。その後、真空下で溶媒を除去し、得られた脂質膜を高真空下で４時間乾燥させる。乾燥した脂質に、２７０ｍＭの滅菌ショ糖液を加え、４．３３５ｍｇ／ｍｌの総脂質濃度にする。超音波洗浄機の中で５分間、短い超音波処理を行った後、脂質を分散させ、その後、高圧ホモジナイズ処理によってホモジナイズする（Ａｖｅｓｔｉｎ Ｃ３）。リポソームのこのようなホモジナイズは、それらを７５０バールで２１サイクル、１２５０バールで５２サイクル処理することによって行われる。このようにして得られたリポソームは、図６に示されているように、ＱＥＬＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｎ５およびＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮＳ）によって決定すると約８５ｎｍの平均粒子径を有する。

これらのリポソームを、無菌条件下でさらに処理する。本目的では、それらを、同量の２７０ｍＭショ糖内ｓｉＲＮＡ溶液（ｃ＝０．５６２５ｍｇ／ｍｌ）と混合する。１５００ｒｐｍで振とうしながら、シリンジを用いて、ｓｉＲＮＡ溶液をリポソームに加える。この結果、平均粒子径が約１２０ｎｍのリポプレックスが形成される。

このようにして得られたリポプレックスのサイズ分布を図７に示す。粒子径は、ＱＥＬＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｎ５およびＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮＳ）によって決定された。

＜平均粒子サイズが約６０ｎｍであるｓｉＲＮＡリポプレックス＞
平均粒子径が約１２０ｎｍであるｓｉＲＮＡ−リポプレックスの調製物（上記の比率５０：４９：１で、ｃ＝８６．５ｍｇ／ｍｌの総脂質）に関して上記で特定した脂質を、含む３０％のｔｅｒｔ−ブタノール中に含む溶液の１ｍｌを、無菌条件下、１５００ｒｐｍで振とうしながら、シリンジを用いて、滅菌した２７０ｍＭショ糖溶液１９ｍｌに１分間以内に加える。このようにすることによって、約３０ｎｍの平均粒子径を有するリポソームを得ることができる。図８は、それぞれのサイズ分布を示している。粒子のサイズは、ＱＥＬＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｎ５およびＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮＳ）によって決定した。

このようにして得られたリポソーム溶液を１．６ｍｌの等量液を、５ｍｌの凍結乾燥用バイアルに入れた後、−８０℃に急速凍結してから凍結乾燥した。

リポプレックスを調製するために、１３５ｍｌの滅菌ショ糖溶液中０．２８ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ溶液３．２ｍｌを、凍結乾燥物とも呼ばれる凍結乾燥リポソームを含有するバイアルに注入する。その後、凍結乾燥物と溶液を含有するバイアルを振とうして、凍結乾燥によって形成された固形物が完全に溶解させた。このようにして得られたリポプレックスは、図９に示すように、約６０ｎｍの平均粒子径を有する。粒子のサイズは、ＱＥＬＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｎ５およびＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮＳ）によって決定した。

参考文献
本明細書において、様々な先行技術文書に言及される限り、当該文書は、その完全な書誌データは以下の通りであり、それらの全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。

本明細書、特許請求の範囲、および／または図面において開示されている本発明の特徴が、別々にでも、それらを組み合わせてでも、様々な形態で本発明を実施するための材料となる。

本発明に係る脂質組成物の構成成分の構造を示す。 本発明に係る脂質組成物によって形成されるリポソーム、および脂質組成物とｓｉＲＮＡ分子によって形成される本発明に係るｓｉＲＮＡリポプレックスの略図が示され、ｓｉＲＮＡ分子は、リポソームに含有されるのではなく、リポソームの外面に主に複合体を形成し、これにより負に荷電したｓｉＲＮＡはカチオン性脂質の正の荷電との静電相互作用によって複合される。 本発明に係る脂質組成物および本発明に係るｓｉＲＮＡリポプレックスによって形成されるリポソームのサイズを示した図表である。 本発明に係る脂質組成物および本発明に係るｓｉＲＮＡリポプレックスによって形成されるリポソームのζ電位を示す図表である。 ＨｅＬａ細胞における、リポプレックス化ｓｉＲＮＡおよび未修飾のｓｉＲＮＡのそれぞれによる、ＰＫＮ３タンパク質発現の濃度依存的阻害をウエスタンブロット解析した結果を示す。ただし、ＰＴＥＮがローディング対照として用いられている。 Ｃｙ３で標識された、未修飾の、または本発明に係るリポプレックスとして投与されたｓｉＲＮＡで処理されたＨｅＬａ細胞を共焦点顕微鏡で撮影した写真を示す。 様々なモル％のＰＥＧを含むリポソーム製剤を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す。 ０、１、２、および５モル％のＰＥＧを含むｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスの細胞内取り込みの共焦点顕微鏡写真を示す。蛍光標識されたｓｉＲＮＡ−リポプレックスでＥＯＭＡ細胞を形質転換した。注記：５モル％ＰＥＧで、最も多くのリポプレックスが細胞表面を修飾している（矢印）。 ウエスタンブロット解析、より具体的には、様々な量のＰＥＧ（１モル％）化されているか、ＰＥＧ化されていないｓｉＲＮＡ^ＰＫＮ３−リポプレックス（上図）またはｓｉＲＮＡ^ＰＴＥＮ−リポプレックス（下図）によって形質転換されたＨＵＶＥＣ細胞の抽出物を用いたイムノブロットの結果を示す。ｓｉＲＮＡの最終濃度が示されている（１〜２０ｎＭ；ｕｔ：非処理）。イムノブロットを抗ＰＴＥＮおよび抗ＰＫＮ３をプローブとして調べた。 様々な処方剤で５日間にわたって処理されたヌードマウスの体重の変化を示す多様な図表を示す。ここで、マウスは、５日間にわたってｓｉＲＮＡ^Ｌｕｃ、ｓｉＲＮＡ^ＰＫＮ３、ｓｉＲＮＡ^ＣＤ３１、およびｓｉＲＮＡ^ＰＴＥＮのＰＥＧ化されたリポプレックス（三角形）またはＰＥＧ化されていないリポプレックス（四角形）で処理された（１〜５日目に単回静脈内（ｉ．ｖ．）注射）。体重の相対的変化が、各処理群当たり７匹のマウスの平均±ｓ．ｅ．ｍで示されている。 Ｃ５７／ＢＬ６マウス（各群につきマウス２匹）をポリ（Ｉ：Ｃ）、または図に表示されたｓｉＲＮＡ−リポプレックスで２時間（暗灰色）または２４時間（明灰色）単回処理したものから採取した血液試料のＩＬ−１２についてのＥＬＩＳＡの結果を示した図表である。 尾静脈注射から２０分後の様々な組織における、未修飾の（中段）またはリポプレックス化された（下段）ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３（１．８８ｍｇ／ｋｇ）の分布を可視化した、パラフィン包埋切片の落射蛍光顕微鏡写真を示す。 ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３−リポプレックスの単回全身静脈内注射後の様々な時点において解析された、心臓、肺、脾臓、および肝臓の落射蛍光顕微鏡写真を示す。組織試料は、（各器官につき）同一の顕微鏡設定で記録した。サイズバー：１００μｍ、ただし、肝臓および脾臓については２００μｍ。 毛細血管の横断面と縦断面をラベルする抗ＣＤ３１抗体（矢印）を用いたＩＨＣによって明らかにされた（左側の写真）、心臓における内皮細胞の分布の共焦点顕微鏡写真である。血管系内の内皮細胞がＣｙ３染色されている（右側の写真、矢印）。 肺の中の肺毛細血管をラベルする抗ＣＤ３１抗体を用いたＩＨＣによって明らかにされた（左側の写真）、肺における内皮細胞の分布の共焦点顕微鏡写真である（矢印、血管；２倍の矢印、肺胞マクロファージ）。血管系内の内皮細胞がＣｙ３染色されている（右側の写真、矢印）。肺胞マクロファージも強い蛍光を示している（右側の写真、小さな矢印）。 ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲによって定量すると、ショ糖、ｓｉＲＮＡ^ＣＤ３１−リポプレックス、ｓｉＲＮＡ^ＰＴＥＮ−リポプレックス、またはｓｉＲＮＡ^Ｔｉｅ２−リポプレックスで４連続日毎日処理された動物の肺、心臓、および肝臓の組織におけるＴｉｅ２（右側の図表）またはＣＤ３１（左側の図表）のｍＲＮＡ量がノックダウンしていることを示す図表である。表示されているｍＲＮＡ量は、ショ糖群と比較した割合であり、ＣＤ３４のｍＲＮＡ量に対して標準化されている。数値は、各群のすべての動物から得られた割合の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。 ｓｉＲＮＡ^ＣＤ３１−リポプレックスまたはｓｉＲＮＡ^Ｔｉｅ２−リポプレックスのいずれかによって処理された６〜７個体のマウスからの肺、心臓、肝臓のタンパク質抽出物を抗Ｔｉｅ２、または抗ＣＤ３１および抗ＰＴＥＮ（ローディング対照）でプローブしたイムノブロットを示す。注記：タンパク質の発現量は、Ｔｉｅ−２またはＣＤ３１においてのみ、適用されたリポプレックスに比例して変化しているが、ＰＴＥＮの発現量は変化しなかった。 ｓ−Ｔｉｅ２を様々な処方剤の関数として示す、すなわち、ｓｉＲＮＡ^Ｔｉｅ２−リポプレックスで４日間毎日処理すると可溶型Ｔｉｅ２（ｓ−Ｔｉｅ２）は減少するが（５日目、左側図表）、対照であるリポプレックス（ｓｉＲＮＡ^ＰＴＥＮ、ｓｉＲＮＡ^ＣＤ３１）およびショ糖では減少していないことを示す図表である。処理群毎に各マウスで測定されたｓ−Ｔｉｅ２量がひし形で示され、処理前（０日目）のマウスの可溶型Ｔｉｅ２量が左側の図表に、処理後のものが右側の図表に示されている。各群についてのｓ−Ｔｉｅ２の平均値を線で示す。 約１２０ｎｍの平均粒子サイズを有するリポプレックスの調製に適した、平均粒子サイズが約８５ｎｍであるリポソームのサイズ分布を示す図表である。 約１２０ｎｍの平均粒子サイズを有するリポプレックスのサイズ分布を示す図表である。 約６０ｎｍの平均粒子サイズを有するリポプレックスの調製に適した、平均粒子サイズが約３０ｎｍであるいくつかのバッチのサイズ分布を示す図表である。 平均粒子サイズが約６０ｎｍであるリポプレックスのサイズ分布を示す図表である。

Claims (75)

1. 担体に含有される、および／または担体を含有する脂質組成物であって、
   少なくとも第１の脂質成分と、
   少なくとも第１のヘルパー脂質と、
   インビボ条件下において、脂質組成物から任意で除去することができる遮蔽化合物と
   を含む組成物であって、
   前記担体を含有する前記脂質組成物が、約５０から６００ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、好ましくは、約２５０〜３５０ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、およびより好ましくは、約２８０〜３２０ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇのオスモル濃度を有し、かつ／または、
   前記第１の脂質成分、および／または前記担体中の前記ヘルパー脂質および前記遮蔽化合物の一方または両方よって形成されるリポソームの粒子径が約２０から２００ｎｍ、好ましくは、約３０から１００ｎｍ、より好ましくは、約４０から８０ｎｍである脂質組成物。
2. 前記遮蔽化合物が、ＰＥＧ、ＨＥＧ、ポリヒドロキシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）、およびポリプロピレンからなる群から選択される、請求項１に記載の脂質組成物。
3. 前記遮蔽化合物がＰＥＧ２０００またはＰＥＧ５０００である、請求項２に記載の脂質組成物。
4. さらなる構成成分および／または第２のヘルパー脂質を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の脂質組成物。
5. 前記遮蔽化合物が、ＰＥＧとセラミドのコンジュゲートである、請求項１から４のいずれか１項に記載の脂質組成物。
6. 前記セラミドが、６個から１０個の炭素原子、好ましくは、８個の炭素原子からなる、少なくとも１つの短鎖炭素置換基を含む、請求項５に記載の脂質組成物。
7. 前記セラミドが前記第１のヘルパー脂質である、請求項５または６に記載の脂質組成物。
8. 前記セラミドが前記第２のヘルパー脂質である、請求項５または６に記載の脂質組成物。
9. 前記遮蔽化合物が、ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の脂質組成物。
10. 前記リンカーまたは部分がアニオン性リンカーまたはアニオン性部分である、請求項９に記載の脂質組成物。
11. 前記アニオン性リンカーまたはアニオン性部分が、酸性環境においてはアニオン性が低いか中性であって、好ましくは、前記酸性環境がエンドソームである、請求項１０に記載の脂質組成物。
12. 前記ｐＨ感受性リンカーまたは前記ｐＨ感受性部分が、オリゴ（グルタミン酸）、オリゴフェノラート、およびジエチレントリアミン五酢酸を含む群から選択される、請求項９から１１のいずれか１項に記載の脂質組成物。
13. 前記第１の脂質成分が、下記の化学式（Ｉ）に記載された化合物であって、
    

    

    式中、Ｒ_１およびＲ_２がそれぞれ独立して、アルキルを含む基から選択され、
    ｎが１から４までの任意の整数であり、
    Ｒ_３が、下記の化学式（ＩＩ）に記載のリシル、オルニチル、２，４−ジアミノブチリル、ヒスチジル、およびアシル部分であって、
    

    

    式中、ｍが１から３までの任意の整数であり、ＮＨ_３ ^＋が、任意では存在しなくてもよく、また、
    Ｙ⁻が薬学的に許容されるアニオンである、請求項１から１２のいずれか１項に記載の脂質組成物。
14. Ｒ_１およびＲ_２がそれぞれ独立して、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、およびオレイルを含む群から選択される、請求項１３に記載の脂質組成物。
15. Ｒ_１がラウリルおよびＲ_２がミリスチルであり、または、
    Ｒ_１がパルミチルおよびＲ_２がオレイルである、請求項１３または１４に記載の脂質組成物。
16. ｍが１または２である、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の脂質組成物。
17. 前記化合物がカチオン性脂質であり、好ましくは、アニオンＹ⁻と結合している、請求項１３から１６のいずれか１項に記載の脂質組成物。
18. Ｙ⁻が、ハロゲン化合物、酢酸、およびトリフルオロ酢酸を含む群から選択される、請求項１３から１７のいずれか１項に記載の脂質組成物。
19. 前記化合物が、以下の群、
    β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸、
    

    

    β−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸、および
    

    

    ε−アルギニル−リジン−Ｎ−ラウリル−Ｎ−ミリスチル−アミド三塩酸
    

    

    から選択される、請求項１３から１８のいずれか１項に記載の脂質組成物。
20. 前記オスモル濃度が、糖によってほとんど決定され、前記糖が、好ましくは、ショ糖、トレハロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、イヌリン、ラフィノース、およびこれらを組み合わせたものを含む群から選択され、より好ましくは、ショ糖、トレハロース、イヌリン、ラフィノース、およびこれらを組み合わせたものを含む群から選択される、請求項１から１９のいずれか１項に記載の脂質組成物。
21. １種類または数種類の塩基性化合物を含有し、該塩基性化合物が、好ましくは、塩基性アミノ酸および弱塩基を含む群から選択される、請求項１から２０のいずれか１項に記載の脂質組成物。
22. 前記アミノ酸が、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンを含む群から選択される、請求項２１に記載の脂質組成物。
23. 前記弱塩基が、ＴＲＩＳおよびエタノールアミンを含む群から選択される、請求項２１に記載の脂質組成物。
24. 前記塩基性化合物が、ｐＨ調整のために提供されている、請求項２１から２３のいずれか１項に記載の脂質組成物。
25. 前記脂質組成物が核酸を含み、該核酸が、好ましくは、さらなる構成成分である、請求項１から２４のいずれか１項に記載の脂質組成物。
26. 前記核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピーゲルマーを含む群から選択される、請求項２５に記載の脂質組成物。
27. 前記遮蔽化合物が核酸に結合している、請求項１から２６のいずれか１項に記載の脂質組成物。
28. 前記遮蔽化合物が、リンカー部分によって核酸に結合している、好ましくは、リンカー部分によって核酸に共有結合している、請求項２７に記載の脂質組成物。
29. 前記リンカー部分が、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ペプチド、Ｓ−Ｓリンカー、およびｐＨ感受性リンカーを含む群から選択される、請求項２８に記載の脂質組成物。
30. 前記核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｉＮＡを含む群から選択され、前記リンカーが、センス鎖の３’末端に結合している、請求項２７から２９のいずれか１項に記載の脂質組成物。
31. 組成物が核酸を含み、前記核酸が、リポソームとともにリポプレックスを形成する、請求項１から３０のいずれか１項に記載の脂質組成物。
32. 前記担体中の脂質濃度が、リポプレックスによって提供される脂質の全体量に基づいて、約０．０１から１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０１から４０ｍｇ／ｍｌ、およびより好ましくは約０．０１から２５ｍｇ／ｍｌである、請求項１から３１のいずれか１項に記載の脂質組成物。
33. 前記核酸がｓｉＲＮＡであり、前記脂質組成物のｓｉＲＮＡの濃度が約０．２から０．４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２８ｍｇ／ｍｌであり、総脂質濃度が約１．５から２．７ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２．１７ｍｇ／ｍｌである、請求項３１から３２のいずれかに記載の脂質組成物。
34. 請求項１から３３のいずれかに記載の組成物、および任意には薬学的活性化合物、および好ましくは、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
35. 前記薬学的活性化合物および／または更なる構成成分が、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、および核酸を含む群から選択される、請求項３４に記載の組成物。
36. 前記タンパク質が抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である、請求項３５に記載の組成物。
37. 前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、およびＬＮＡを含む群から選択される、請求項３５に記載の組成物。
38. 前記核酸が機能的核酸であって、好ましくは、前記機能的核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、およびスピーゲルマーを含む群から選択される、請求項３５または３７のいずれか１項に記載の組成物。
39. 前記第１のヘルパー脂質および／または前記第２のヘルパー脂質が、リン脂質およびステロイドを含む群から選択されるが、ただし、好ましくは、第１および／または第２のヘルパー脂質がセラミドではない、請求項１から３８のいずれか１項に記載の組成物。
40. 前記第１および／または第２のヘルパー脂質またはヘルパー脂質成分が、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび１，２?ジオレイル?ｓｎ?グリセロ?３?ホスホエタノールアミンを含む群から選択される、請求項３９に記載の組成物。
41. 前記ヘルパー脂質成分の含有量が、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約２０モル％から約８０モル％である、請求項３９から４０のいずれかに記載の組成物。
42. 前記ヘルパー脂質成分の含有量が約３５モル％から約６５モル％である、請求項４１に記載の組成物。
43. 前記脂質がβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸であり、前記ヘルパー脂質が１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンである、請求項４０から４２のいずれか１項に記載の組成物。
44. 前記脂質が５０モル％であり、前記ヘルパー脂質が、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の５０モル％である、請求項４３に記載の組成物。
45. さらに第２のヘルパー脂質を含む、請求項１から４４のいずれか１項に記載の組成物。
46. 前記第１および／または第２のヘルパー脂質が、ＰＥＧ部分、ＨＥＧ部分、ポリヒドロキシエチルスターチ（ポリＨＥＳ）部分、およびポリプロピレン部分を含む群から選択される基を含み、前記成分が、好ましくは、約５００から１０００Ｄａ、より好ましくは、約２０００から５０００Ｄａの分子量を提供する、請求項１から４５のいずれか１項に記載の組成物。
47. 前記ＰＥＧ部分を含む前記ヘルパー脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む群から選択される、請求項４６に記載の組成物。
48. 前記ヘルパー脂質の前記ＰＥＧ部分が、約２，０００から５，０００Ｄａの分子量、好ましくは２，０００Ｄａの分子量を有する、請求項４６に記載の組成物。
49. 組成物が、前記脂質成分としてβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸を、第１のヘルパー脂質として１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを、および第２のヘルパー脂質として１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ２０００を含む、請求項４８に記載の組成物。
50. 前記第２のヘルパー脂質の含有量が、前記組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約０．０５モル％から４．９モル％、好ましくは、約１から２モル％である、請求項４５から４９のいずれか１項に記載の組成物。
51. 前記組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約１から１０モル％、より好ましくは１から７．５モル％、および最も好ましくは１から５モル％のＰＥＧとセラミドとの複合体を含む、請求項１から５０のいずれか１項に記載の組成物。
52. 前記セラミドがＣ８ｍであり、ＰＥＧがＰＥＧ２０００であり、かつ、ＰＥＧとセラミドの複合体の含有量が、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約１から５モル％である、請求項５１に記載の組成物。
53. 前記セラミドがＣ８ｍであり、ＰＥＧがＰＥＧ５０００であり、かつ、ＰＥＧとセラミドの前記複合体の含有量が、組成物またはリポプレックスの総脂質含有量の約１から５モル％である、請求項５１に記載の組成物。
54. 前記第１の脂質成分の含有量が、約４２．５モル％から５０モル％、前記第１のヘルパー脂質の含有量が、約４２．５モル％から５０モル％であって、前記第１の脂質成分、第１のヘルパー脂質、およびＰＥＧとセラミドとの前記複合体の含有量の合計が１００モル％である、請求項５０から５３のいずれか１項に記載の組成物。
55. 核酸、好ましくは、機能的な核酸、より好ましくは、二本鎖リボ核酸、および最も好ましくは、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、およびリボザイムを含む群から選択される核酸であって、好ましくは、カチオン性脂質に対するＲＮＡｉのモル比が、約０から０．０７５、好ましくは、約０．０２から０．０５、およびさらにより好ましくは０．０３７である核酸をさらに含む、請求項１から５４のいずれか１項に記載の組成物。
56. 前記担体が水性媒体であり、好ましくは、糖含有等張性水溶液であって、前記担体に含有される脂質組成物が分散物として、好ましくは、リポソームおよび／またはリポプレックスの分散物として存在している、請求項１から５５のいずれか１項に記載の組成物。
57. 前記脂質組成物が、約５０モル％のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸、約４８から４９モル％の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、および約１から２モル％の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレン−グリコールを含み、前記担体が水溶液である、請求項１から５６のいずれか１項に記載の、好ましくは請求項３１に記載の組成物。
58. 好ましくは請求項１から５７のいずれか１項に記載の組成物であるか、または該組成物に含有されるリポプレックスであって、
    ｃ）以下のものからなる正に荷電したリポソーム、
    ａａ）約５０モル％のβ−アルギニル−２，３−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸、好ましくは、（β−（Ｌ−アルギニル）−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミド三塩酸）
    ａｂ）約４８から４９モル％の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）
    ａｃ）約１から２モル％の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレン−グリコール、好ましくは、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩；および
    ｄ）機能的核酸、好ましくはｓｉＲＮＡ
    を含むリポプレックス。
59. 前記リポプレックスのζ電位が約４０から５５ｍＶ、好ましくは約４５から５０ｍＶである、請求項５８に記載のリポプレックス。
60. 前記リポプレックスが、ＱＥＬＳによって測定すると、約８０から２００ｎｍ、好ましくは約１００から１４０ｎｍ、より好ましくは約１１０ｎｍから１３０ｎｍのサイズである、請求項５８または５９に記載のリポプレックス。
61. 請求項５８から６０のいずれかに記載のリポプレックスを含む、請求項１から５７のいずれか１項に記載の組成物。
62. 前記薬剤を製造するための請求項１から５７および６１のいずれか１項に記載の組成物、または請求項５８から６０のいずれか１項に記載のリポプレックスの使用。
63. 前記薬剤が、核酸、好ましくは機能的核酸を、内皮、好ましくは血管内皮に送達するためのものである、請求項６２に記載の使用。
64. 前記薬剤が、血管形成依存性疾患を治療するためのものである、請求項６２または６３に記載の使用。
65. 前記疾患はがん疾患、より好ましくは固形腫瘍である、請求項６４に記載の使用。
66. 前記疾患が、腫瘍性疾患を含む群から選択されるが、より好ましくは、前記疾患が、骨がん、乳がん、前立腺がん、消化器官系のがん、結腸直腸がん、肝臓がん、肺がん、腎臓がん、泌尿生殖器がん、膵臓がん、下垂体がん、精巣がん、眼窩がん（ｏｒｂｉｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部がん、中枢神経系のがん、および呼吸器官系のがんを含む群から選択される、請求項６３から６５のいずれか１項に記載の使用。
67. 前記薬剤が、１つまたはいくつかの他の治療法と併用して用いられる、請求項６２から６６のいずれか１項に記載の使用。
68. 前記治療法が、化学療法、寒冷療法、温熱療法、抗体療法、および放射線療法を含む群から選択される、請求項６７に記載の使用。
69. 移動剤（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）としての請求項１から５７および６１のいずれか１項に記載の組成物、または請求項５８から６０のいずれか１項に記載のリポプレックスの使用。
70. 前記移動剤が核酸を移動させ、前記核酸は、好ましくは、組成物に含有されている核酸であるか、または前記核酸は、好ましくは、リポプレックスの核酸成分である、請求項６９に記載の使用。
71. 前記核酸が機能的核酸であり、好ましくはｓｉＲＮＡである、請求項７０に記載の使用。
72. 前記移動剤が、内皮、好ましくは血管内皮に特異的である、請求項６９から７１のいずれか１項に記載の使用。
73. 前記移動剤が、薬学的活性成分および／または更なる構成成分を細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞の中に移動させる、請求項６９から７２のいずれか１項に記載の使用。
74. 薬学的活性化合物および／または更なる構成成分を、細胞に、または膜を通過して、好ましくは細胞膜を通過して移動させる方法であって、
    細胞または膜を提供するステップと、
    請求項１から５７および６１のいずれかに記載の組成物、または請求項５８から６０のいずれかに記載のリポプレックスであって、前記組成物が、任意で、薬学的活性化合物および／または更なる構成成分を含むものを提供する工程ステップと、
    細胞または膜を、請求項１から５７および６１のいずれかに記載の組成物、または請求項５８から６０のいずれかに記載のリポプレックスに接触させるステップと
    を含む方法。
75. 細胞内および／または膜の向こう側で薬学的活性化合物および／または更なる構成成分を検出するステップをさらに含む、請求項７４に記載の方法。

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