CN110628825A

CN110628825A - 一种依赖nhej的报告基因敲入组合物及其使用方法

Info

Publication number: CN110628825A
Application number: CN201910971141.0A
Authority: CN
Inventors: 杨通; 朱智; 陈珺
Original assignee: Shanghai Jieyi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Jieyi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-10-14
Filing date: 2019-10-14
Publication date: 2019-12-31

Abstract

本发明涉及一种依赖NHEJ的用于报告基因敲入的组合物，含以下组分：通用型报告基因敲入载体T‑sgX‑PAM‑IRES‑EGFP‑polyA；通用型sgRNA/Cas9质粒PX459‑sgX；任选的，包含待敲入位点信息的sgRNA/Cas9质粒。本发明具有如下有益效果：1)该组合物可以比传统的依赖HDR的敲入方式更为高效地完成报告基因的敲入；2)敲入载体可以通用，而不用像HDR方式换个待敲入位点就需要更换同源臂重新构建敲入载体。

Description

一种依赖NHEJ的报告基因敲入组合物及其使用方法

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种高效地将外源基因导入哺乳动物基因组指定位点的依赖NHEJ的报告基因敲入组合物及其使用方法。

背景技术

基因组编辑技术是一种可以对生物体基因组完成精确修饰的一种技术，利用基因组编辑技术可以将细胞内特定的基因进行敲除、敲入和突变等，从而改变生物体的遗传特性。目前基因组编辑的基本原理是利用某些方法在基因组特定的靶位点区诱发DNA双链缺口(double-strain break，DSB)，从而激活细胞内的DNA损伤修复机制来进行基因组的改造。细胞内主要修复DNA双链缺口的机制有两条：一条是非同源区的末端连接途径(Non-homologous End Joining，NHEJ)，在该途径中细胞对DNA断裂处进行部分酶切，使之产生粘性末端，再将两个末端连接起来，这个过程中往往会形成小片段的插入或缺失，因此使得该相应基因有几个氨基酸的增减或发生移码突变而被敲除。另一条重要的修复途径是同源重组修复途径(Homology directed repair，HDR)，若DNA损伤时的同时恰好遇到与该损伤位点同源性很高的另一条完整DNA时，损伤位点会以同源的DNA为模板进行操作修复，若同源基因中被人为引入了其它基因、元件或者点突变则可凭此修改细胞基因组。因此以HDR方式对基因组DNA进行修复具有更高的可控性，可以完全产生预期的基因组改变，并且能够在适当的位置引入特定的外源基因。例如可以在基因组特定基因后面加上报告基因，可以实时监测基因的表达调控情况以研究相应功能。

在细胞内，DSB产生基因组破坏所诱发的修复反应主要以NHEJ修复为主，虽然DSB可以极大的提高同源重组的概率，但依赖HDR介导的基因敲入效率仍是极低。最近Merkle等的研究报道，在没有筛选前提下，CRISPR/Cas9介导的依赖于HDR的基因敲入效率大概只有1X10^-5左右，这使得后期的筛选鉴定工作变得极为困难。并且利用HDR方式进行基因敲入时，每次都需要根据欲改造基因信息，构建插入基因两端含有同源臂的打靶载体。此外，有研究报道，在HDR介导的基因敲入过程中，研究者在混合细胞中能检测到部分细胞只有一条同源臂发生了同源重组，而打靶载体的另一端与非序列特异的方式插入基因组中。同时还有研究表明，外源基因可以不依赖于HDR的方式插入基因组的特定位置。最近还有研究证明，平末端的硫代寡聚脱氧核苷酸可以依赖于NHEJ修复途径高效地插入基因组DSB位置。这些都提示外源基因有可能可以以依赖NHEJ的方式更为高效地插入到基因组的特定位置。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种依赖NHEJ的用于报告基因敲入的组合物及其使用方法，并且以该组合物可以比依赖HDR的敲入方式更为高效地完成报告基因的敲入，而且敲入载体可以通用，不用像HDR方式换个敲入位点就需要重新换同源臂构建敲入载体。

为了达到上述的目的，本发明提供了一种依赖NHEJ的用于报告基因敲入的组合物，所述组合物包含以下组分：

通用型报告基因敲入载体T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA；

通用型sgRNA/Cas9质粒PX459-sgX。

进一步地，其中所述通用型报告基因敲入载体T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA的主要元件包含通用型sgRNA的PAM识别序列、IRES序列、报告基因编码序列和转录终止信号。

进一步地，其中所述的组合物还包含待敲入位点信息的sgRNA/Cas9质粒。

进一步地，其中所述通用型sgRNA/Cas9质粒PX459-sgX所转录的sgRNA能识别通用型报告基因敲入载体，并在通用型报告基因敲入载体上形成双链缺口。

进一步地，其中所述通用型报告基因敲入载体

T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA的构建方法包括：

1)根据UCSC数据库BLAST或NCBI数据库BLAST，挑选设计不识别人基因组的X-sgRNA(sgX)序列，序列如SEQ ID NO:1所示；

2)在sgX序列后加上NGG序列，构成sgX-PAM序列；

3)合成如SEQ ID NO:2所示的sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA序列；

4)以合成的sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA序列为模板，使用SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示的sgX-F和polyA-R为引物进行PCR扩增，将PCR产物克隆至T克隆载体，得到如SEQID NO:5所示的通用型报告基因敲入载体T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA。

进一步地，其中步骤2)中，所述NGG表示AGG、TGG、CGG或GGG中的任一种。

进一步地，其中步骤2)中，所述NGG表示sgX+CGG。

本发明还提供一种依赖NHEJ的基因敲入的方法，包括以下步骤：

利用CRISPR/Cas9在待改造的基因组DNA序列上和敲入载体上各产生1个双链DNA断裂；

利用细胞本身的NHEJ修复机制，将敲入载体上的核酸序列插入到该待改造的基因组DNA序列上。

进一步地，其中所述待改造的DNA序列和敲入载体通过CRISPR/Cas9形成双链DNA断裂。

本发明还提供了一种上述依赖NHEJ的用于报告基因敲入的组合物在制备ACTB报告基因中敲入HEK293T细胞系的用途，包括：

构建包含待标记基因ACTB位点信息的sgRNA质粒PX459-sgACTB-4；

将ACTB报告基因敲入组合物三个组份(T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA、PX459-sgX和PX459-sgACTB-4)共转染HEK-293T细胞；

细胞转染1～2天后，加3μg/mL嘌呤霉素处理1～3天；

嘌呤霉素处理后的细胞用有限稀释法挑选单克隆；

鉴定并扩增有绿色荧光表达的单克隆。

本发明具有如下有益效果：

1)该组合物可以比传统的依赖HDR的敲入方式更为高效地完成报告基因的敲入，本发明的敲入效率达到23％，而HDR的敲入方式在各种优化下仅能达到10％；2)敲入载体可以通用，而不用像HDR方式换个待敲入位点就需要更换同源臂重新构建敲入载体。

附图说明

图1为本发明组合物中通用型报告基因敲入载体T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA载体结构图。此载体主要元件为通用型sgRNA的PAM识别序列sgX-PAM、IRES序列、报告基因编码序列(EGFP编码序列)和转录终止信号(polyA序列)。

图2为本发明组合物中通用型sgRNA/Cas9质粒PX459-sgX的载体结构图。此载体可特异地识别并切割通用型报告基因敲入载体T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA。

图3为实施例3中PX459-sgACTB-4的载体结构图。此载体可特异地识别并切割人ACTB基因3’-UTR区。

图4为实施例3中报告基因敲入荧光照片。图中显示，NHEJ报告基因敲入组合物3个组份共转染HEK293T细胞后，细胞中有明显的荧光表达；而只转染组合物中二个通用组份，不转染PX459-sgACTB-4并没有荧光表达。提示荧光表达是由于报告基因敲入ACTB基因所致，而不是由于敲入载体瞬转引起。

图5为实施例3中报告基因敲入效率检测流式结果图。流式检测显示，本发明的NHEJ报告基因敲入组合物可达到23.3％的基因敲入效率，明显比常规HDR方式的敲入效率更高。

图6为实施例3中ACTB报告基因敲入的PCR扩增鉴定图。

图7为实施例3中ACTB报告基因敲入的阳性单克隆荧光照片。

图8为实施例3中依赖于本发明所用方法的原理模式图。从模式图中可知，利用CRISPR/Cas9(PX459-sgACTB-4和PX459-sgX)在欲加改造的DNA序列(ACTB基因3’-UTR区)上和敲入载体(T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA)上分别产生1个双链DNA断裂；然后利用细胞本身的NHEJ修复机制，将敲入载体上的核酸序列(IRES-EGFP-polyA)插入到欲加改造的DNA序列(ACTB基因3’-UTR区)上。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通方法人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了更好的阐述本发明组合物的使用方法，本发明具体实施方式提供了这一基因敲入组合物的构建方法和用这一组合物构建ACTB报告基因敲入HEK293T细胞系的方法。

实施例1通用型报告基因敲入载体T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA构建

5)根据UCSC数据库BLAST或NCBI数据库BLAST，挑选设计不识别人基因组的X-sgRNA(sgX)序列，序列如SEQ ID NO:1所示。

6)在sgX序列后加上NGG序列，构成sgX-PAM序列。NGG代表AGG、TGG、CGG或GGG任意一种，本发明选择sgX+CGG作为sgX-PAM序列；

7)合成sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA序列(见SEQ ID NO:2)；

8)以合成的sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA序列为模板，使用SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4的sgX-F和polyA-R为引物进行PCR扩增，将PCR产物克隆至T克隆载体(购自北京全式金生物)，得到通用型报告基因敲入载体T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA(见图1及序列SEQ IDNO:5)。

本实施例列举了以T克隆载体为骨架载体构建通用型报告基因敲入载体T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA，也可选用其它克隆载体作为骨架载体，在此不再一一赘述。

本实施例中的sgX序列也可替换成其它不以人基因组序列重复的序列，在此不再一一列举。

另外，本实施例中的通用型敲入载体，荧光报告基因也不限于EGFP，例如也可选用tdTomato、hrGFP、YFP等荧光基因，在此也不一一赘述。

实施例2特异性靶向通用型报告基因敲入载体的通用型sgRNA/Cas9质粒PX459-sgX构建

1)根据sgX序列(见SEQ ID NO:1)，合成寡聚核苷酸，具体序列如下：

sgX-Oligo 1：5’-CACCGGAGATCGAGTGCCGCATCAC-3’(SEQ ID NO:6)

sgX-Oligo 2：5’-TTTGGTGATGCGGCACTCGATCTCC-3’(SEQ ID NO:7)

下划线标注序列可与BbsI酶切末端互补，sgX-Oligo 1和sgX-Oligo 2包含向导序列sgX，退火后(具体方法见步骤2)与工具载体PX459质粒包含的骨架序列形成sgRNA。

2)将合成的包含sgX编码序列的Oligo按以下反应体系及反应条件退火并进行磷酸化；

反应体系如下：

反应条件为：37℃30分钟；95℃5分钟，并以每分钟5℃逐渐降低至25℃。

3)将PX459载体酶切线性化，酶切体系如下：

酶切条件为：37℃2小时。

用胶纯化试剂盒(购自北京天根公司)回收、纯化经BbsI线性化的PX459载体。

4)将退火及磷酸化的包含sgX编码序列的寡核苷酸连接入BbsI线性化的PX459载体，连接体系如下：

连接条件为：室温连接10分钟。

5)转化及鉴定：

将上述获得的连接产物转化DH5α感受态细胞(购自北京全式金生物)，并涂Amp+平板(50μg/mL)，挑取克隆。用U6通用引物，经常规测序方法鉴定获得阳性克隆。

U6通用引物为：GGACTATCATATGCTTACCG(SEQ ID NO:8)

6)37℃摇床摇菌过夜，培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit(AP-MN-P-250)试剂盒抽提质粒，获得特异性靶向通用型报告基因敲入载体的通用型PX459-sgX质粒(见图2，如SEQ ID NO:9所示)。

实施例3ACTB报告基因敲入HEK293T细胞系构建

1)针对ACTB基因待敲入位点设计sgRNA:

由于我们需要将报告基因“IRES-EGFP-polyA”序列敲入到ACTB基因的3’-UTR区，以达到标记ACTB基因的目的。所以以人ACTB基因(NCBI基因号：NM_001101)作为靶标，依据SpCas9编辑规则，在ACTB基因的3’-UTR上选择符合5’-(20N)NGG-3’的序列。在UCSC数据库中用BLAST，或NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA的靶序列是否唯一，以减少潜在的脱靶位点。最后设计出靶向人ACTB基因3’-UTR的sgRNA，命名为sgACTB-4，见SEQ ID NO:10所示。

2)特异性靶向人ACTB基因3’-UTR区的sgRNA的载体PX459-sgACTB-4构建

a)根据sgACTB-4的序列(SEQ ID NO:10)，合成寡聚核苷酸，具体序列如下：

sgACTB-4-Oligo 1：5’-CACCGGTAACAACGCATCTCATATT-3’(SEQ ID NO:11)

sgACTB-4-Oligo 2：5’-TTTGAATATGAGATGCGTTGTTACC-3’(SEQ ID NO:12)

下划线标注序列可与BbsI酶切末端互补，sgACTB-4-Oligo 1和sgACTB-4-Oligo 2包含向导序列sgACTB-4，退火(退火条件见步骤b)后与工具载体PX459质粒包含的骨架序列形成sgRNA。

b)将合成的包含sgACTB-4编码序列的Oligo按以下反应体系及反应条件退火并进行磷酸化；

反应体系如下：

反应条件为：37℃，30分钟；95℃，5分钟，并以每分钟5℃逐渐降低至25℃。

c)将PX459载体酶切线性化，酶切体系如下：

酶切条件为：37℃，2小时。

d)将退火及磷酸化的包含sgACTB-4编码序列的寡核苷酸连接入BbsI线性化的PX459载体，连接体系如下：

连接条件为：室温连接10分钟。

e)转化及鉴定：

将上述获得的连接产物转化DH5α感受态细胞(购自北京全式金生物)，并涂Amp+平板(50μg/mL)，挑取克隆。并用U6通用引物(SEQ ID NO:8)，经常规测序方法鉴定获得阳性克隆。

f)37℃摇床摇菌过夜，培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit(AP-MN-P-250)试剂盒抽提质粒，获得PX459-sgACTB-4质粒(见图3，如SEQ ID NO:13所示)

3)细胞转染及鉴定：

a)转染前24小时铺HEK-293T细胞(购自上海中科院细胞库)于一6孔板的3个孔中，细胞密度为5X10⁵个/孔。

b)待细胞密度达到80～90％时，以标准的Lipofectamine3000(Thermofisher)转染，将上述构建的NHEJ报告基因敲入组合物质粒共转染细胞。

转染分为三组：第1组为不转染质粒阴性对照，第2组转染1μg PX459+1μgPX459-sgX+1μgT-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA为只转敲入载体对照，第3组转染1μg PX459-sgACTB-4+1μgPX459-sgX+1μgT-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA为ACTB基因敲入组；具体转染方式参照Lipofectamine3000说明书。

c)转染第2天，第2组和第3组加嘌呤霉素(3μg/mL)培养1天，以富集成功转染的细胞(没有转染成功的细胞会被药杀死，转染成功的会有抗性)。

d)转染第3天，换液培养。

e)转染第5天，荧光显微镜下观察荧光表达情况，第1组和第2组基本无荧光，而第3组却有大量绿色荧光表达(见图4)，提示ACTB报告基因敲入成功。

f)继续传代培养扩增步骤e)得到的细胞，取部分细胞做流式细胞仪检测，发现第3组细胞中绿色荧光表达比率为23.3％(见图5)，提示ACTB报告基因敲入效率高达23.3％。

g)取部分细胞，提取基因DNA，并做PCR鉴定：将收集的细胞在裂解液(10μM Tris-HCl，0.4M NaCl，2μM EDTA，1wt％SDS)中用100μg/mL蛋白酶K裂解消化后，1mL酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。将上述提取的细胞基因组为模板，使用ACTB-det-F(位于sgACTB-4识别位点上游315bp处)和IRES-det-R(位于敲入载体IRES元件IRES上，距sgX识别位点162bp)为引物进行PCR扩增，得到477bp大小的PCR产物(见图6)，提示IRES-EGFP-polyA报告基因确实敲入到ACTB基因的3’-UTR区。

ACTB-det-F：CAGCAAGCAGGAGTATGACG(SEQ ID NO:14)

IRES-det-R：TCAAGAAGACAGGGCCAGG(SEQ ID NO:15)

4)有限稀释法挑选阳性单克隆：

a)取对数生长期的细胞，胰酶消化后制成单个细胞悬液并计数。

b)将细胞悬液移至刻度离心管中连续倍数稀释。稀释到5个细胞/mL。

c)将稀释好的细胞悬液接种到96孔板中，每孔加液0.1mL。然后放入培养箱内培养。

d)3-5天后，在倒置显微镜下观察培养板各孔细胞集落数，挑选只含一个细胞集落的孔(由于细胞悬液并不完全均一，所以有2-3个细胞集落的孔，也有没有细胞的孔)，做好标记并补加0.1mL培养液继续培养。

e)培养期间视培养基pH值变化，决定是否更换培养基，培养1～2周左右，孔中即形成较大克隆，此时，在荧光显微镜下观察，挑选其中表达绿色荧光蛋白的单克隆(见图7)，并传代扩增。

图8为实施例3中依赖于本发明所用方法的原理模式图。从图8中可知，利用CRISPR/Cas9(PX459-sgACTB-4和PX459-sgX)在欲加改造的DNA序列(ACTB基因3’-UTR区)上和敲入载体(T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA)上分别产生1个双链DNA断裂；然后利用细胞本身的NHEJ修复机制，将敲入载体上的核酸序列(IRES-EGFP-polyA)插入到欲加改造的DNA序列(ACTB基因3’-UTR区)上。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海捷易生物科技有限公司

<120> 一种依赖NHEJ的报告基因敲入组合物及其使用方法

<130> 2019 1 071CN

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 1

gagatcgagt gccgcatcac 20

<210> 2

<211> 1654

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 2

gagatcgagt gccgcatcac cgggctcctc ggatcccccc tctccctccc ccccccctaa 60

cgttactggc cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc 120

caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac 180

gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt 240

gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg 300

caggcagcgg aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata 360

agatacacct gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga 420

aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt 480

accccattgt atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc 540

gaggttaaaa aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca 600

cgatgataat atggatctaa tgccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 660

gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 720

gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 780

aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 840

agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 900

tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 960

gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 1020

gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 1080

atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 1140

gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 1200

cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 1260

aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 1320

ggcatggacg agctgtacaa gtaacgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag 1380

ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact 1440

gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt 1500

ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat 1560

gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg gggctctagg 1620

gggtatcccc acgcgccctg tagcggcgca ttaa 1654

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 3

gagatcgagt gccgcatca 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 4

ttaatgcgcc gctacaggg 19

<210> 5

<211> 5582

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> 敲入载体

<400> 5

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240

gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattgcc ctgagatcga 300

gtgccgcatc accgggctcc tcggatcccc cctctccctc ccccccccct aacgttactg 360

gccgaagccg cttggaataa ggccggtgtg cgtttgtcta tatgttattt tccaccatat 420

tgccgtcttt tggcaatgtg agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc 480

ctaggggtct ttcccctctc gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag 540

cagttcctct ggaagcttct tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc 600

ggaacccccc acctggcgac aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac 660

ctgcaaaggc ggcacaaccc cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca 720

aatggctctc ctcaagcgta ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt 780

gtatgggatc tgatctgggg cctcggtgca catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa 840

aaaacgtcta ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata 900

atatggatct aatgccatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat 960

cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga 1020

gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc 1080

cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta 1140

ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca 1200

ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt 1260

cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg 1320

caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc 1380

cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg 1440

cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct 1500

gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa 1560

gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga 1620

cgagctgtac aagtaacgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt 1680

tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc 1740

ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 1800

tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga 1860

tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc tggggctcta gggggtatcc 1920

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ag 5582

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<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> 寡聚核苷酸

<400> 7

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<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

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<223> 引物

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<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

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<223> 寡聚核苷酸

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<223> 引物

<400> 13

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg taacaacgca tctcatattg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 300

aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt tgttttagag 360

ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgtttttag cgcgtgcgcc aattctgcag 420

acaaatggct ctagaggtac ccgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc 480

gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 540

tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 600

gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attgtgccca 660

gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 720

taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 780

acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 840

gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg 900

gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag 960

gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgac 1020

gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 1080

tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 1140

agctgagcaa gaggtaaggg tttaagggat ggttggttgg tggggtatta atgtttaatt 1200

acctggagca cctgcctgaa atcacttttt ttcaggttgg accggtgcca ccatggacta 1260

taaggaccac gacggagact acaaggatca tgatattgat tacaaagacg atgacgataa 1320

gatggcccca aagaagaagc ggaaggtcgg tatccacgga gtcccagcag ccgacaagaa 1380

gtacagcatc ggcctggaca tcggcaccaa ctctgtgggc tgggccgtga tcaccgacga 1440

gtacaaggtg cccagcaaga aattcaaggt gctgggcaac accgaccggc acagcatcaa 1500

gaagaacctg atcggagccc tgctgttcga cagcggcgaa acagccgagg ccacccggct 1560

gaagagaacc gccagaagaa gatacaccag acggaagaac cggatctgct atctgcaaga 1620

gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga cgacagcttc ttccacagac tggaagagtc 1680

cttcctggtg gaagaggata agaagcacga gcggcacccc atcttcggca acatcgtgga 1740

cgaggtggcc taccacgaga agtaccccac catctaccac ctgagaaaga aactggtgga 1800

cagcaccgac aaggccgacc tgcggctgat ctatctggcc ctggcccaca tgatcaagtt 1860

ccggggccac ttcctgatcg agggcgacct gaaccccgac aacagcgacg tggacaagct 1920

gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca gctgttcgag gaaaacccca tcaacgccag 1980

cggcgtggac gccaaggcca tcctgtctgc cagactgagc aagagcagac ggctggaaaa 2040

tctgatcgcc cagctgcccg gcgagaagaa gaatggcctg ttcggaaacc tgattgccct 2100

gagcctgggc ctgaccccca acttcaagag caacttcgac ctggccgagg atgccaaact 2160

gcagctgagc aaggacacct acgacgacga cctggacaac ctgctggccc agatcggcga 2220

ccagtacgcc gacctgtttc tggccgccaa gaacctgtcc gacgccatcc tgctgagcga 2280

catcctgaga gtgaacaccg agatcaccaa ggcccccctg agcgcctcta tgatcaagag 2340

atacgacgag caccaccagg acctgaccct gctgaaagct ctcgtgcggc agcagctgcc 2400

tgagaagtac aaagagattt tcttcgacca gagcaagaac ggctacgccg gctacattga 2460

cggcggagcc agccaggaag agttctacaa gttcatcaag cccatcctgg aaaagatgga 2520

cggcaccgag gaactgctcg tgaagctgaa cagagaggac ctgctgcgga agcagcggac 2580

cttcgacaac ggcagcatcc cccaccagat ccacctggga gagctgcacg ccattctgcg 2640

gcggcaggaa gatttttacc cattcctgaa ggacaaccgg gaaaagatcg agaagatcct 2700

gaccttccgc atcccctact acgtgggccc tctggccagg ggaaacagca gattcgcctg 2760

gatgaccaga aagagcgagg aaaccatcac cccctggaac ttcgaggaag tggtggacaa 2820

gggcgcttcc gcccagagct tcatcgagcg gatgaccaac ttcgataaga acctgcccaa 2880

cgagaaggtg ctgcccaagc acagcctgct gtacgagtac ttcaccgtgt ataacgagct 2940

gaccaaagtg aaatacgtga ccgagggaat gagaaagccc gccttcctga gcggcgagca 3000

gaaaaaggcc atcgtggacc tgctgttcaa gaccaaccgg aaagtgaccg tgaagcagct 3060

gaaagaggac tacttcaaga aaatcgagtg cttcgactcc gtggaaatct ccggcgtgga 3120

agatcggttc aacgcctccc tgggcacata ccacgatctg ctgaaaatta tcaaggacaa 3180

ggacttcctg gacaatgagg aaaacgagga cattctggaa gatatcgtgc tgaccctgac 3240

actgtttgag gacagagaga tgatcgagga acggctgaaa acctatgccc acctgttcga 3300

cgacaaagtg atgaagcagc tgaagcggcg gagatacacc ggctggggca ggctgagccg 3360

gaagctgatc aacggcatcc gggacaagca gtccggcaag acaatcctgg atttcctgaa 3420

gtccgacggc ttcgccaaca gaaacttcat gcagctgatc cacgacgaca gcctgacctt 3480

taaagaggac atccagaaag cccaggtgtc cggccagggc gatagcctgc acgagcacat 3540

tgccaatctg gccggcagcc ccgccattaa gaagggcatc ctgcagacag tgaaggtggt 3600

ggacgagctc gtgaaagtga tgggccggca caagcccgag aacatcgtga tcgaaatggc 3660

cagagagaac cagaccaccc agaagggaca gaagaacagc cgcgagagaa tgaagcggat 3720

cgaagagggc atcaaagagc tgggcagcca gatcctgaaa gaacaccccg tggaaaacac 3780

ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta ctacctgcag aatgggcggg atatgtacgt 3840

ggaccaggaa ctggacatca accggctgtc cgactacgat gtggaccata tcgtgcctca 3900

gagctttctg aaggacgact ccatcgacaa caaggtgctg accagaagcg acaagaaccg 3960

gggcaagagc gacaacgtgc cctccgaaga ggtcgtgaag aagatgaaga actactggcg 4020

gcagctgctg aacgccaagc tgattaccca gagaaagttc gacaatctga ccaaggccga 4080

gagaggcggc ctgagcgaac tggataaggc cggcttcatc aagagacagc tggtggaaac 4140

ccggcagatc acaaagcacg tggcacagat cctggactcc cggatgaaca ctaagtacga 4200

cgagaatgac aagctgatcc gggaagtgaa agtgatcacc ctgaagtcca agctggtgtc 4260

cgatttccgg aaggatttcc agttttacaa agtgcgcgag atcaacaact accaccacgc 4320

ccacgacgcc tacctgaacg ccgtcgtggg aaccgccctg atcaaaaagt accctaagct 4380

ggaaagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa ggtgtacgac gtgcggaaga tgatcgccaa 4440

gagcgagcag gaaatcggca aggctaccgc caagtacttc ttctacagca acatcatgaa 4500

ctttttcaag accgagatta ccctggccaa cggcgagatc cggaagcggc ctctgatcga 4560

gacaaacggc gaaaccgggg agatcgtgtg ggataagggc cgggattttg ccaccgtgcg 4620

gaaagtgctg agcatgcccc aagtgaatat cgtgaaaaag accgaggtgc agacaggcgg 4680

cttcagcaaa gagtctatcc tgcccaagag gaacagcgat aagctgatcg ccagaaagaa 4740

ggactgggac cctaagaagt acggcggctt cgacagcccc accgtggcct attctgtgct 4800

ggtggtggcc aaagtggaaa agggcaagtc caagaaactg aagagtgtga aagagctgct 4860

ggggatcacc atcatggaaa gaagcagctt cgagaagaat cccatcgact ttctggaagc 4920

caagggctac aaagaagtga aaaaggacct gatcatcaag ctgcctaagt actccctgtt 4980

cgagctggaa aacggccgga agagaatgct ggcctctgcc ggcgaactgc agaagggaaa 5040

cgaactggcc ctgccctcca aatatgtgaa cttcctgtac ctggccagcc actatgagaa 5100

gctgaagggc tcccccgagg ataatgagca gaaacagctg tttgtggaac agcacaagca 5160

ctacctggac gagatcatcg agcagatcag cgagttctcc aagagagtga tcctggccga 5220

cgctaatctg gacaaagtgc tgtccgccta caacaagcac cgggataagc ccatcagaga 5280

gcaggccgag aatatcatcc acctgtttac cctgaccaat ctgggagccc ctgccgcctt 5340

caagtacttt gacaccacca tcgaccggaa gaggtacacc agcaccaaag aggtgctgga 5400

cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg cctgtacgag acacggatcg acctgtctca 5460

gctgggaggc gacaaaaggc cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa 5520

ggaattcggc agtggagagg gcagaggaag tctgctaaca tgcggtgacg tcgaggagaa 5580

tcctggccca atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc 5640

cagggccgta cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt 5700

cgatccggac cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt 5760

cgggctcgac atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac 5820

cacgccggag agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga 5880

gttgagcggt tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg 5940

gcccaaggag cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa 6000

gggtctgggc agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc 6060

cgccttcctg gagacctccg cgccccacaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac 6120

cgtcaccgcc gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc 6180

cggtgcctga gaattctaac tagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc 6240

cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 6300

actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 6360

attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga gaatagcagg 6420

catgctgggg agcggccgca ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc 6480

gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg 6540

gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg ggcgcctgat gcggtatttt 6600

ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgtc aaagcaacca tagtacgcgc 6660

cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac 6720

ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg 6780

ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt 6840

tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt tgggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc 6900

cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 6960

tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcgggcta ttcttttgat ttataaggga 7020

ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga 7080

attttaacaa aatattaacg tttacaattt tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 7140

atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg 7200

cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt 7260

gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc 7320

tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc 7380

ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 7440

cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 7500

gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 7560

ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 7620

tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 7680

aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta 7740

ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 7800

agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 7860

gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 7920

gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 7980

gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 8040

tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 8100

ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 8160

cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt ggaagccgcg 8220

gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 8280

cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 8340

tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 8400

aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 8460

aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 8520

gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 8580

cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 8640

ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc 8700

accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 8760

tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 8820

cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 8880

gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 8940

ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 9000

cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 9060

tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 9120

ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgt 9177

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 14

cagcaagcag gagtatgacg 20

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 15

tcaagaagac agggccagg 19

Claims

1.一种依赖NHEJ的用于报告基因敲入的组合物，其特征在于，所述组合物包含以下组分：

通用型报告基因敲入载体T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA；

通用型sgRNA/Cas9质粒PX459-sgX。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述通用型报告基因敲入载体T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA的主要元件包含通用型sgRNA的PAM识别序列、IRES序列、报告基因编码序列和转录终止信号。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，还包含待敲入位点信息的sgRNA/Cas9质粒。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述通用型sgRNA/Cas9质粒PX459-sgX所转录的sgRNA能识别通用型报告基因敲入载体，并在通用型报告基因敲入载体上形成双链缺口。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述通用型报告基因敲入载体T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA的构建方法包括：

1)根据UCSC数据库BLAST或NCBI数据库BLAST，挑选设计不识别人基因组的X-sgRNA序列，其序列如SEQ ID NO:1所示；

2)在sgX序列后加上NGG序列，构成sgX-PAM序列；

3)合成如SEQ ID NO:2所示的sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA序列；

4)以合成的sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA序列为模板，使用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的sgX-F和polyA-R为引物进行PCR扩增，将PCR产物克隆至T克隆载体，得到如SEQ IDNO:5所示的通用型报告基因敲入载体T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA。

6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，步骤2)中，所述NGG表示AGG、TGG、CGG或GGG中的任一种。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，步骤2)中，所述NGG表示sgX+CGG。

8.一种依赖NHEJ的基因敲入的方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待改造的基因组DNA序列和敲入载体通过CRISPR/Cas9形成双链DNA断裂。

10.一种权利要求1-7任一项所述的依赖NHEJ的用于报告基因敲入的组合物在制备ACTB报告基因中敲入HEK293T细胞系的用途，其特征在于，包括：

构建包含待标记基因ACTB位点信息的sgRNA质粒PX459-sgACTB-4；

将ACTB报告基因敲入组合物三个组份：T-sgX-PAM-IRES-EGFP-polyA、PX459-sgX和PX459-sgACTB-4共转染HEK-293T细胞；

细胞转染1～2天后，加入3μg/mL嘌呤霉素处理1～3天；

嘌呤霉素处理后的细胞用有限稀释法挑选单克隆；

鉴定并扩增有绿色荧光表达的单克隆。