CN110305908A

CN110305908A - 一种高效精准靶向的基因整合系统及其应用

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Publication number: CN110305908A
Application number: CN201910628110.5A
Authority: CN
Inventors: 荣知立; 林瑛; 马淑凤; 王新龙; 吕杰; 刘成芳
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2019-10-08
Anticipated expiration: 2039-07-12
Also published as: CN110305908B

Abstract

本发明公开了一种高效精准靶向的基因整合系统及其应用，系统包括表达外源性融合蛋白系统、向导RNA和供体载体；表达外源性融合蛋白系统包括Cas9或SB或Cas9与SB、N123、N57、SB100XE279D其中之一组成的融合蛋白；向导RNA为靶向基因组区域和供体载体两端的20bp的长序列；供体载体两端有向导RNA靶向位点、SB结合位点和中间的目的基因整合片段。本发明可同时实现基因的靶向、切割和整合；本发明利用SB转座酶结合转座子供体形成四聚体，可使供体载体定向到靶位点，更有利于基因的靶向整合；本发明利用体内线性化元件，可使供体载体体内线性化，更有利于基因的整合；本发明实现基因敲入的方法是基于SB转座酶和基因修复机制中的NHEJ，这将使本发明更加高效的实现基因的整合。

Description

一种高效精准靶向的基因整合系统及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物技术领域，涉及一种由CRISPR/Cas9的精准靶向切割目标基因、SB特异性结合引导供体载体和高效基因整合作用，实现在哺乳动物细胞和哺乳动物体内高效精准靶向的基因整合系统的构建及其应用。

背景技术

人类的遗传物质是DNA，决定了人类的各种特性，由于各种原因导致人类的基因发生了变异，且很多是不利变异，并伴随着各种基因的疾病的到来，因此能高效安全有效的实现基因修复是人类生存发展的重要任务，因此，基因治疗也受到了大家关注。基因整合系统是基因治疗的基础，它分为两种类型，病毒整合系统和非病毒整合系统，病毒性整合系统出现比较早，应用比较多，包括腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒和慢病毒等，它优点是感染速度快效率高，但是也有很大不足，包括基因毒性，致瘤性、载体构建周期长，价格昂贵等缺点。非病毒整合系统主要包括，CRISPR、ZFNs、TALEs、纳米粒子和转座子等。基中CRISPR、ZFNs、TALEs、纳米粒子等是本身不具备基因整合功能的，它们依赖机体的修复来完成整合特性，转座子不同于上述，自身具有基因整合特性。非病毒整合系统相比于病毒性整合系统，此系统主要优点在于安全，高效和大容量等，这也是临床应用的必要性。

CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated systems)，全名是常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统，是细菌及古生菌的一种获得性免疫系统，能够通过单链RNA识别外来双链DNA，并借助Cas9核酸酶切割外来DNA，抵御外来DNA侵袭。自2013年张锋等科学家首次报道了CRISPR-Cas9系统在哺乳动物基因组编辑中的应用后，人们开启了CRISPR-Cas9强大的基因编辑功能成为生命科学领域的新星，获得广泛研究和应用。

目前常用的转座子有piggyBac Tn5和SB，其中，SB(sleeping beauty)全名是睡美人，是一种合成的DNA转座子系统，是在哺乳动物细胞水平应用最早的转座子系统，目的是将DNA片段插入到脊椎动物的染色体中，它是Tc1类型转座子，由转座酶和转座子两部分组成，转座酶通过剪切和粘贴机制将转座子插入到受体DNA的TA碱基位点并伴有TA重复。SB转座子系统有其特有的优势，包括DNA整合效率高、大容量、DNA插入无区域偏好和不受转录活性的影响。

非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HDR)，是机体DNA受到损伤时常见的DNA修复机制，其中，NHEJ为主，HDR为辅，目前，基因敲入方法主要是基于后者HDR机制，此方法具有精确基因编辑的效果，但是存在效率低问题，当在大规模进行基因整合时，这将给实验带来很大不方便，因此本发明利用了NHEJ高效修复机制。

现有的非病毒整合系统可以实现相对精准的基因定位，这一特点为将来基因治疗提供安全性的保障，而病毒整合系统可以实现高效率的整合功能，这一优势决定了基因治疗的功效潜能，但是两者缺少对方的优势，因此，有必要提出一种可以实现高效精准靶向的基因整合系统。

本发明结合CRISPR系统和SB转座子系统的优势，利用CRISPR-Cas9的靶向切割特点、SB转座子的特异性结合引导供体载体和高效基因整合功能，同时辅助利用机体的自身的NHEJ修复机制，可实现高效精准靶向的基因整合。这不仅可以实现基础研究中基因低整合的困难，也大大扩展了其在临床实践的应用，包括基因治疗。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种高效精准靶向的基因整合系统、构建方法及其应用。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为，一种高效精准靶向的基因整合系统，包括表达外源性融合蛋白系统、一种向导RNA和供体载体；

表达外源性融合蛋白系统包括Cas9或SB或Cas9与SB、N123、N57、SB100XE279D其中之一组成的融合蛋白；

向导RNA为可靶向基因组区域和供体载体两端的20bp的长序列；

供体载体两端分别均有向导RNA靶向位点、SB结合位点和中间的目的基因整合片段，其中最外侧两端是向导RNA靶向位点，挨着内侧两端是SB结合位点，中心是目的基因的整合片段。

表达外源性融合蛋白系统可以表达Cas9蛋白；表达外源性融合蛋白系统可以表达SB蛋白；表达外源性融合蛋白系统可以同时表达Cas9和SB构成的融合蛋白；表达外源性融合蛋白系统可以同时表达Cas9和N123构成的融合蛋白；表达外源性融合蛋白系统可以同时表达Cas9和N57构成的融合蛋白；表达外源性融合蛋白系统可以同时表达Cas9和SB100XE279D构成的融合蛋白。

进一步地，表达外源性融合蛋白系统还包括CAG启动子和聚合腺嘌呤(polyA)。

进一步地，向导RNA包括U6启动子、gRNA识别序列、gRNA骨架序列、U6启动子的终止序列。

进一步地，基因组区域位于AAVS1、ACTB、GAPDH、PGK1和Rosa26。

进一步地，供体载体包括以下四个部分：

第一部分，敲入基因表达元件，具体包括启动子、目的基因表达序列、polyA；

第二部分，体内线性化元件，具体包括位于整个供体载体两端方向相同的20bp的gRNA识别序列识别位点和3bp的向导RNA识别的PAM序列，即NGG；

第三部分，SB结合元件，具体包括位于邻位的体内线性化元件内部的2个IRs，其中每一个IR中均包含两个15-20bp长度的SB的结合序列，可以与SB转座酶的N端结合并形成四聚体；

第四部分，抗性筛选元件，包括T2A、puromycin抗性基因表达序列、bGH polyA。

进一步的，上述供体载体元件在同一个载体上，顺序依次为：20bp的gRNA识别序列识别位点、3bp PAM区、IR、T2A、puromycin抗性基因表达序列、bGH polyA、SV40polyA、目的基因表达序列、启动子、IR和20bp的gRNA识别序列识别位点、3bp PAM区。

上述所述的高效精准靶向的基因整合系统的构建方法，通过CRISPR-CAS9切割基因组靶向位点和供体载体两端向导RNA识别位点，以同时实现靶向位点基因的开放和供体载体体内线性化；通过SB、N123、N57或SB100XE279D将所述的体内线性化的供体载体引导到所述的开放的靶向基因位点，并利用非同源末端直接连接把所述供体载体敲入基因组靶位点。

进一步地，通过CRISPR-CAS9切割基因组位点和供体载体两端向导RNA识别位点中，所述基因组区域位于AAVS1、ACTB、GAPDH、PGK1和Rosa26。

进一步地，体内线性化的外源基因无需同源臂可直接实现靶向基因组靶位点整合。

上述所述的高效精准靶向的基因整合系统在哺乳动物细胞和哺乳动物体内实现高效精准靶向的基因整合中的应用。

上述构建的高效精准靶向的基因整合系统在基因工程、生物技术和临床中的应用。

进一步地，高效精准靶向的基因整合系统在哺乳动物细胞实现高效精准靶向的基因整合中的应用包括如下步骤：

a1、构建表达外源性融合蛋白系统、向导RNA和供体载体；

a2、将步骤a1所得表达外源性融合蛋白系统、向导RNA和供体载体转入细胞系内；

a3、将步骤a2所转染的细胞进行单个细胞来源的克隆挑取，并提取单克隆细胞的DNA进行基因整合验证，并统计效率；

高效精准靶向的基因整合系统在哺乳动物体内实现高效精准靶向的基因整合中的应用，包括如下步骤：

b1、构建表达外源性融合蛋白系统、向导RNA和供体载体；

b2、将步骤b1所得载体转入到哺乳动物体内；

b3、将步骤b2所转染的哺乳动物靶位组织提取，并对靶位组织进行目的基因整合分析。

上述构建的高效精准靶向的基因整合系统，可实现在体内和体外靶向位点高效外源基因整合。利用上述所构建的质粒，通过脂质体转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)将载体转入细胞内，然后在细胞内，质粒表达Cas9-SB核酸酶-转座酶和向导RNA，在向导RNA的牵引下，分别识别基因组中靶向位点和环状供体质粒两端的位点，实现了基因组的切割和供体质粒体内线性化的作用，然后SB转座酶通过其N端结合转座子供体两端的IR形成四聚体，使其与Cas9-gRNA系统一起到达靶向位点，然后机体通过NHEJ，实现外源基因的高效敲入，并经过一系列的鉴定，包括基因水平和蛋白水平等实验，可证明本发明成功实现了高效精准基因整合。

本发明的有效益如下四点：

(1)本发明可同时实现基因的靶向、切割和整合；

(2)本发明利用SB转座酶结合转座子供体形成四聚体，可使供体载体定向到靶位点，更有利于基因的靶向整合；

(3)本发明利用体内线性化元件，可使供体载体体内线性化，更有利于基因的整合；

(4)本发明实现基因敲入的方法是基于SB转座酶和基因修复机制中的NHEJ，这将使本发明更加高效的实现基因的整合。

附图说明

图1是pCAG-Cas9-mChery质粒图谱；

图2是pCAG-SB100X-mChery质粒图谱；

图3是pCAG-Cas9-SB100X质粒图谱；

图4是pCAG-Cas9-N123质粒图谱；

图5是pCAG-Cas9-N57质粒图谱；

图6是pCAG-Cas9-SB100XE279D质粒图谱；

图7是pBluSKP-AAVS1-AAVS1质粒图谱；

图8是pT3-SB-IR质粒图谱；

图9是pT3-EF1aH c-Met质粒图谱；

图10是lenti-miniCMV-CV1-SIRPa-WPRE-polyA-EGFP-EF1a质粒图谱；

图11是pT3-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR质粒图谱；

图12是pBluSKP-AAVS1-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-AAVS1质粒图谱；

图13是pBluSKP质粒图谱；

图14是LOX2272-pCAG-Neo-LOX2272-IRES-mCherry质粒图谱；

图15是pBluSKP-ACTB-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-ACTB质粒图谱；

图16是pBluSKP-GADPH-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-GAPDH质粒图谱；

图17是pBluSKP-PGK1-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-PGK1质粒图谱；

图18是pBluSKP-AAVS1-Cas9-p300-M2rtTA-AAVS1质粒图谱；

图19是pBluSKP-AAVS1-IR-T2A-Puro-Cas9p300-M2rtTA-EGFP-EF1α-IR-AAVS1质粒图谱；

图20是pBluSKP-Rosa26-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-Rosa26质粒图谱；

图21是pu6-sgFEgRNA质粒图谱；

图22是pu6-gAAVS1质粒图谱；

图23是pu6-gACTB质粒图谱；

图24是pu6-gGAPDH质粒图谱；

图25是pu6-gPGK1质粒图谱；

图26是pu6-gRosa26质粒图谱；

图27是利用本发明系统在AAVS1位点上，可实现高效精准基因整合的相关图，其中，A，本发明系统的构建，设计并构建靶向AAVS1位点的绿色荧光报告基因整合系统的模式图；B，本发明在AAVS1位点上实现绿色荧光报告基因整合图，流式结果显示，Cas9-SB、Cas9-N123、Cas9-N57和Cas9-SBZ279D系统比单独Cas9和SB整合阳性率高；C，本发明在AAVS1位点上可实现高效精准基因整合，多次重复实验后统计图，结果与上述一致；D，本发明所得的基因整合细胞系在基因水平上的验证图，把本发明系统转入细胞后，挑取单个细胞来源的克隆，提取基因组DNA鉴定，PCR凝胶电脉结果显示，成功实现了靶向位点的整合；E，二代测序验证本发明所得的基因整合细胞系图，提取图D中PCR凝胶电脉的端口产物，进行测序，结果与预测结果一致；

图28是利用本发明系统在ACTB位点上，可实现高效精准基因整合的相关图，其中，A，本发明系统的构建，设计并构建靶向ACTB位点的绿色荧光报告基因整合系统的模式图；B，本发明在ACTB位点上实现绿色荧光报告基因整合图，流式结果显示，Cas9-SB、Cas9-N123、Cas9-N57和Cas9-SBZ279D系统比单独Cas9和SB整合阳性率高；C，本发明所得的基因整合细胞系在基因水平上的验证图，把本发明系统转入细胞后，挑取单个细胞来源的克隆，提取基因组DNA鉴定，PCR凝胶电脉结果显示，成功实现了靶向位点的整合；D，二代测序验证本发明所得的基因整合细胞系图，提取图C中PCR凝胶电脉的端口产物，进行测序，结果与预测结果一致；E，本发明构建整合报告基因的效率，统计挑取单细胞克隆的阳性整合效率图，结果显示，Cas9-SB、Cas9-N123、Cas9-N57和Cas9-SBZ279D系统比单独Cas9和SB整合阳性率高；

图29是利用本发明系统在GAPDH位点上，可实现高效精准基因整合的相关图，其中，A，本发明系统的构建，设计并构建靶向GAPDH位点的绿色荧光报告基因整合系统的模式图；B，本发明在GAPDH位点上实现绿色荧光报告基因整合图，流式结果显示，Cas9-SB、Cas9-N123、Cas9-N57和Cas9-SBZ279D系统比单独Cas9和SB整合阳性率高；C，本发明所得的基因整合细胞系在基因水平上的验证图，把本发明系统转入细胞后，挑取单个细胞来源的克隆，提取基因组DNA鉴定，PCR凝胶电脉结果显示，成功实现了靶向位点的整合；D，二代测序验证本发明所得的基因整合细胞系图，提取图C中PCR凝胶电脉的端口产物，进行测序，结果与预测结果一致；E，本发明构建整合报告基因的效率，统计挑取单细胞克隆的阳性整合效率图，结果显示，Cas9-SB、Cas9-N123、Cas9-N57和Cas9-SBZ279D系统比单独Cas9和SB整合阳性率高；

图30是利用本发明系统在PGK1位点上，可实现高效精准基因整合相关图，其中，A，本发明系统的构建，设计并构建靶向PGK1位点的绿色荧光报告基因整合系统的模式图；B，本发明在PGK1位点上实现绿色荧光报告基因整合图，流式结果显示，Cas9-SB、Cas9-N123、Cas9-N57和Cas9-SBZ279D系统比单独Cas9和SB整合阳性率高；C，本发明所得的基因整合细胞系在基因水平上的验证图，把本发明系统转入细胞后，挑取单个细胞来源的克隆，提取基因组DNA鉴定，PCR凝胶电脉结果显示，成功实现了靶向位点的整合；D，二代测序验证本发明所得的基因整合细胞系图，提取图C中PCR凝胶电脉的端口产物，进行测序，结果与预测结果一致；E，本发明构建整合报告基因的效率，统计挑取单细胞克隆的阳性整合效率图，结果显示，Cas9-SB、Cas9-N123、Cas9-N57和Cas9-SBZ279D系统比单独Cas9和SB整合阳性率高；

图31是利用本发明系统在AAVS1位点上，可实现大片段的插入高效精准基因整合相关图，其中，A，本发明系统的构建，设计并构建靶向AAVS1位点基因整合系统的模式图；B，本发明在AAVS1位点上实现大片段的报告基因整合图，流式结果显示，Cas9-SB、Cas9-N123、Cas9-N57和Cas9-SBZ279D系统比单独Cas9和SB整合阳性率高；C，本发明所得的大片段基因整合细胞系在基因水平上的验证图，把本发明系统转入细胞后，挑取单个细胞来源的克隆，提取基因组DNA鉴定，PCR凝胶电脉结果显示，成功实现了靶向位点的整合；D，二代测序验证本发明所得的基因整合细胞系图，提取图C中PCR凝胶电脉的端口产物，进行测序，结果与预测结果一致；

图32是利用本发明系统在动物体内可实现高效精准基因整合，靶向Rosa26位点的相关图，A，本发明系统的构建，设计并构建靶向Rosa26位点基因整合系统的模式图；B，本发明在Rosa26位点上实现报告基因整合图，流式结果显示，Cas9-SB、Cas9-N123、Cas9-N57和Cas9-SBZ279D系统比单独Cas9和SB整合阳性率高；C，本发明系统导入动物体内的模式图，利用尾静脉水动力法把本发明系统打入老鼠体内；D-E，本发明系统可以实现动物体内的高效精准基因整合，将本发明系统通过静脉水动力法导入动物体内后，5周后，分离老鼠肝脏进行冰冻切片，荧光显微镜下观察的绿色荧光EGFP的表达情况图(D)；对D图的EGFP阳性切片进行统计图(E)；

图33是本发明系统的功效模式图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清晰，以下结合实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。

实施例1 pCAG-SB100X-mChery质粒(图2)构建

设计合成SB100X-Template质粒，具体序列如下：

ACCGGTGGTGGAGGCGGAGGTTCTGGGGGAGGAGGTAGTGGCGGTGGTGGTTCAGGAGGCGGCGGAAGCTTGGATCCAGGTGGAGGTGGAAGCGGTGTTAACATGGGAAAATCAAAAGAAATCAGCCAAGACCTCAGAAAAAGAATTGTAGACCTCCACAAGTCTGGTTCATCCTTGGGAGCAATTTCCAAACGCCTGGCGGTACCACGTTCATCTGTGCAAACAATAGTACGCAAGTATAAACACCATGGGACCACGCAGCCGTCATACCGCTCAGGAAGGAGACGCGTTCTGTCTCCTAGAGATGAACGTACTTTGGTGCGAAAAGTGCAAATCAATCCCAGAACAACAGCAAAGGACCTTGTGAAGATGCTGGAGGAAACAGGTACAAAAGTATCTATATCCACAGTAAAACGAGTCCTATATCGACATAACCTGAAAGGCCACTCAGCAAGGAAGAAGCCACTGCTCCAAAACCGACATAAGAAAGCCAGACTACGGTTTGCAACTGCACATGGGGACAAAGATCGTACTTTTTGGAGAAATGTCCTCTGGTCTGATGAAACAAAAATAGAACTGTTTGGCCATAATGACCATCGTTATGTTTGGAGGAAGAAGGGGGAGGCTTGCAAGCCGAAGAACACCATCCCAACCGTGAAGCACGGGGGTGGCAGCATCATGTTGTGGGGGTGCTTTGCTGCAGGAGGGACTGGTGCACTTCACAAAATAGATGGCATCATGGACGCGGTGCAGTATGTGGATATATTGAAGCAACATCTCAAGACATCAGTCAGGAAGTTAAAGCTTGGTCGCAAATGGGTCTTCCAACACGACAATGACCCCAAGCATACTTCCAAAGTTGTGGCAAAATGGCTTAAGGACAACAAAGTCAAGGTATTGGAGTGGCCATCACAAAGCCCTGACCTCAATCCTATAGAAAATTTGTGGGCAGAACTGAAAAAGCGTGTGCGAGCAAGGAGGCCTACAAACCTGACTCAGTTACACCAGCTCTGTCAGGAGGAATGGGCCAAAATTCACCCAAATTATTGTGGGAAGCTTGTGGAAGGCTACCCGAAACGTTTGACCCAAGTTAAACAATTTAAAGGCAATGCTACCAAATACTAGGGGCCCTAACCGCGGGCGGCCGCTATATGTACAGGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTT(SEQ ID NO：1)

以SB100X-Template质粒为模版进行PCR，设计合成PCR引物序列如下：

SB-1-OL-F:GGGCATTCACCGCGGGGTACCCATGGGAAAATCAAAAGAAAT(SEQ IDNO：2)

SB-1-OL-R:TAGTAGCTCCGCTGCCACCGGTGTATTTGGTAGCATTGCCTT(SEQ IDNO：3)

用AgeI+KpnI+BamHI限制性内切酶切割(具体见下文)pCAG-Cas9-mChery质粒(图1)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物和PCR(具体见下文)产物，切胶回收分别5208bp和1064bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pCAG-Cas9-mChery质粒与PCR产物通过NEB公司购买的Gibsion Assembly连接试剂盒连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pCAG-SB100X-mChery(图2)。

酶切体系50μL，具体包括：

AgeI-HF:0.5μL；KpnI:0.5μL；BamHI-HF:0.5μL；10ⅹcutsmart buffer:5μL；质粒：3μg；ddH₂O:至50μL。

PCR体系如下：

模版序列:1μL(10ng)；前向引物:1μL(10μM)；后向引物:1μL(10μM)；2ⅹTaq酶混合物:25μL；ddH2O:至50μL。

PCR程序如下：

①95℃:2min；②95℃:30s；③58℃:30s；④72℃:3min；②③④循环39次；⑤72℃:2min；⑥16℃保存。

Gibsion assembly反应体系如下：

Gibsion assembly混合物：3μL；PCR产物：1μL；酶切产物：2μL。

实施例2 pCAG-Cas9-SB100X质粒(图3)构建

用AgeI+BsrGI限制性内切酶切割(具体见下文)pCAG-Cas9-mChery质粒(图1)和SB100X-Template质粒，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物，切胶回收分别8570bp和1152bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pCAG-Cas9-mChery质粒与SB100X-Template通过NEB公司购买的T4DNA连接酶连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pCAG-Cas9-SB100X(图3)。

酶切体系50μL，具体包括：

AgeI-HF:0.5μL；BsrGI-HF:0.5μL；10ⅹcutsmart buffer:5μL；质粒：3μg；ddH₂O:至50μL。

T4连接体系10μL，具体如下：

T4ligase:1μL；10x T4ligase buffer:1μL；线性化Cas9-M2rtTA-puro质粒:2μL；线性化pBLuSKP-AAVS1-AAVS1质粒:2μL；ddH₂O:4μL。

反应条件：25℃水浴1h。

实施例3 pCAG-Cas9-N123质粒(图4)构建

N57-123-OL-F:CAAGAAGAAGAGGAAGGTGACCGGTGGTGGAGGCGGAGGTTCTGG(SEQ ID NO：4)

N123-OL-R:AGATCCCCGCGCTGCAGTTACTTGTACATATAGCGGCCGCTCAGAGCAGTGGCTTCTTC(SEQ ID NO：5)

用AgeI+BsrGI限制性内切酶切割(具体见下文)pCAG-Cas9-mChery质粒(图1)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物和PCR(具体见下文)产物，切胶回收分别8570bp和533bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pCAG-Cas9-mChery质粒与PCR产物通过NEB公司购买的Gibsion Assembly连接试剂盒连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pCAG-Cas9-N123(图4)。

酶切体系50μL，具体包括：

PCR体系如下：

模版质粒:1μL(10ng)；前向引物:1μL(10μM)；后向引物:1μL(10μM)；2ⅹTaq酶混合物:25μL；ddH2O:至50μL。

PCR程序如下：

Gibsion assembly反应体系如下：

Gibsion assembly混合物：3μL；PCR产物：1μL；酶切产物：2μL。

实施例4 pCAG-Cas9-N57质粒(图5)构建

N57-123-OL-F:CAAGAAGAAGAGGAAGGTGACCGGTGGTGGAGGCGGAGGTTCTGG(SEQ ID NO：4)

N57-OL-R:GATCCCCGCGCTGCAGTTACTTGTACATATAGCGGCCGCTCAGCGGTATGACGGCTGCG(SEQ ID NO：6)

用AgeI+BsrGI限制性内切酶切割(具体见下文)pCAG-Cas9-mChery质粒(图1)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物和PCR(具体见下文)产物，切胶回收分别8570bp和334bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pCAG-Cas9-mChery质粒与PCR产物通过NEB公司购买的Gibsion Assembly连接试剂盒连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pCAG-Cas9-N57(图5)。

酶切体系50μL，具体包括：

PCR体系如下：

模版质粒:1μL(10ng)；前向引物:1μL(10μM)；后向引物:1μL(10μM)；2ⅹTaq酶混合物:25μL；ddH₂O:至50μL。

PCR程序如下：

Gibsion assembly反应体系如下：

Gibsion assembly混合物：3μL；PCR产物：1μL；酶切产物：2μL。

实施例5 pCAG-Cas9-SB100XE279D质粒(图6)构建

PCR产物1：

N57-123-OL-F:CAAGAAGAAGAGGAAGGTGACCGGTGGTGGAGGCGGAGGTTCTGG(SEQ ID NO：4)

E279D-OL-R:CCCACAAATTGTCTATAGGATTGAGGTCAGGGCTTTGTGATGG(SEQ IDNO：7)

PCR产物2：

E279D-OL-F:CAATCCTATAGACAATTTGTGGGCAGAACTGAAAAAGCGTGTG(SEQID NO：8)

E279D-OL-2-R:TCCCCGCGCTGCAGTTACTTGTACATATAGCGGCCGCCCGCGGTTAGGGCCCCTAGT(SEQ ID NO：9)

用AgeI+BsrGI限制性内切酶切割(具体见下文)pCAG-Cas9-mChery质粒(图1)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物、PCR产物1和PCR产物2(具体见下文)，切胶回收分别8570bp、976bp和397bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pCAG-Cas9-mChery质粒与PCR产物通过NEB公司购买的Gibsion Assembly连接试剂盒连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pCAG-Cas9-SB100XE279D(图6)。

酶切体系50μL，具体包括：

PCR体系如下：

PCR程序如下：

Gibsion assembly反应体系如下：

Gibsion assembly混合物：3μL；PCR产物1：1μL；PCR产物2：1μL；酶切产物：1μL。

实施例6 pBluSKP-AAVS1-AAVS1质粒(图7)构建

设计合成gAAVS1-HindIII-gAAVS1碱基序列，具体如下：

OLIGO-F:5’-TCGAGGTCACCAATCCTGTCCCTAGTGGAAGCTTGTCACCAATCCTGTCCCTAGTGG-3’(SEQ ID NO：10)

OLIGO-R:5’-GGCCGCCCACTAGGGACAGGATTGGTGACAAGCTTCCACTAGGGACAGGATTGGTGACC-3’(SEQ ID NO：11)

两条部分互补配对单链DNA片段合成双链的DNA片段，具体步骤如下：

10ul 100uM Oligo-F和10ul 100uM Oligo-R预混于1.5ml EP管中，用烧杯煮沸800ml的蒸馏水，将1.5ml EP管置于沸水中5分钟，取出1.5ml EP管室温放置过夜，用XholI+NotI限制性内切酶切割(具体见下文)pBLuSKP质粒(图13)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物，切胶回收2888bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将切割后线性化的pBLuSKP质粒与上述双链的DNA片段通过T4DNA连接酶连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pBLuSKP-AAVS1-AAVS1(图7)。

酶切体系50μL，具体包括：

XholI-HF:0.5μL；NotI-HF:0.5μL；10ⅹcutsmart buffer:5μL；质粒：3μg；ddH₂O:至50μL。

T4连接体系10μL，具体包括：

T4ligase:1μL；10xT4ligase buffer:1μL；稀释15倍的双链的DNA片段:2μL；线性化pBLuSKP质粒:2μL；ddH₂O:4μL。

反应条件：25℃水浴1h。

实施例7 pT3-SB-IR质粒(图8)构建

以pT3-EF1aH c-Met质粒(图9)为模版进行PCR，设计合成PCR引物序列如下：

IR-OL-F:AATGATGTCATGGCTTTAGAAGCTTCTAAAGCCATGACATCATTT(SEQ IDNO：12)

IR-OL-R:CTATGACCATGATTACGCCACCGGTGCATGCCTGCAGGTCGACTC(SEQ IDNO：13)

用HindIII限制性内切酶切割(具体见下文)pT3-EF1aH c-Met质粒(图9)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物和PCR(具体见下文)产物，切胶回收分别2940bp和364bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pT3-EF1aH c-Met质粒与PCR产物通过NEB公司购买的Gibsion Assembly连接试剂盒连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pT3-SB-IR(图8)。

酶切体系50μL，具体包括：

HindIII-HF:0.5μL；10ⅹcutsmart buffer:5μL；质粒：3μg；ddH2O:至50μL。

PCR体系如下：

PCR程序如下：

Gibsion assembly反应体系如下：

Gibsion assembly混合物：3μL；PCR产物1：1μL；酶切产物：2μl。

实施例8 pT3-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR质粒(图8)构建

以lenti-miniCMV-CV1-SIRPa-WPRE-polyA-EGFP-EF1a质粒(图10)为模版进行PCR，设计合成PCR产物1引物序列如下：

EGFP-OL-F:TAAGCTGCAATAAACAAGTTGATATCTTACTTGTACAGCTCGTCCA(SEQID NO：14)

EGFP-OL-R:AATGATGTCATGGCTTTAGAAGCTTACTAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCC(SEQ IDNO：15)

以pBluSKP-AAVS1-Cas9-p300-M2rtTA-AAVS11质粒(图18)为模版进行PCR，设计合成PCR产物2引物序列如下：

Puro-OL-F:AATGATGTCATGGCTTTAGAAGCTTACGCGTCTGACCTCTTCTCTTCCTCC(SEQ IDNO：16)

Puro-OL-R:GATATCAACTTGTTTATTGCAGCTTA(SEQ ID NO：17)

用HindIII限制性内切酶切割(具体见下文)pT3-SB-IR质粒(图8)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物、PCR产物1和PCR产物2(具体见下文)，切胶回收分别3260bp、1169bp和1062bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pT3-SB-IR质粒与PCR产物通过NEB公司购买的Gibsion Assembly连接试剂盒连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pT3-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR(图11)。

酶切体系50μL，具体包括：

PCR体系如下：

PCR程序如下：

Gibsion assembly反应体系如下：

实施例9 pBluSKP-AAVS1-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-AAVS1质粒(图12)构建

以pT3-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR质粒(图11)为模版进行PCR，设计合成PCR引物序列如下：

SB-AAVS1-OL-F:CCAATCCTGTCCCTAGTGGACCGGTTACAGTTGAAGTCGGAAGTT(SEQ IDNO：18)

SB-AAVS1-OL-R:GACAGGATTGGTGACAAGCTAGCTACAGTTGAAGTCGGAAGTT(SEQ ID NO：19)

用HindIII限制性内切酶切割(具体见下文)pBluSKP-AAVS1-AAVS1质粒(图7)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物和PCR(具体见下文)产物，切胶回收分别2947bp和2657bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pBluSKP-AAVS1-AAVS质粒与PCR产物通过NEB公司购买的Gibsion Assembly连接试剂盒连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pBluSKP-AAVS1-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-AAVS1(图12)。

酶切体系50μL，具体包括：

HindIII-HF:0.5μL；10ⅹcutsmart buffer:5μL；质粒：3μg；ddH₂O:至50μL。

PCR体系如下：

PCR程序如下：

Gibsion assembly反应体系如下：

Gibsion assembly混合物：3μL；PCR产物1：1μL；酶切产物：2μl。

实施例10 pBluSKP-ACTB-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-ACTB质粒(图15)构建

以pBluSKP-AAVS1-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-AAVS1(图12)为模版进行PCR，设计合成PCR引物序列如下：

PCR产物1:

IR-ACTB-OL-F1:CGGGCCCCCCCTCGAGGTAACAACGCATCTCATATTTGGACCGGTTACAGTTGAAGTCG(SEQ ID NO：20)

IR-Comon-OL-R1:GGAGGGAGAGGGGCGGAATTAAGCTTCTAAAGCCATGACA(SEQID NO：21)

PCR产物2:

IRES-F:AATTCCGCCCCTCTCCCTCC(SEQ ID NO：22)

IRES-R:GGTTGTGGCCATATTATCAT(SEQ ID NO：23)

以LOX2272-pCAG-Neo-LOX2272-IRES-mCherry(图11)为模版进行PCR，设计合成PCR引物序列如下：

PCR产物3:

IR-Comon-OL-F2:ATGATAATATGGCCACAACCATGACCGAGTACAAGCCCAC(SEQ IDNO：24)

IR-ACTB-OL-R2:GCTCCACCGCGGTGGCCCAAATATGAGATGCGTTGTTACGCTAGCTACAGTTGAAGTCG(SEQ ID NO：25)

用XholI+NotI限制性内切酶切割(具体见下文)pBluSKP质粒(图13)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物和PCR产物1、PCR产物2和PCR产物3(具体见下文)，切胶回收分别2888bp、300bp、2204bp和590bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pBluSKP质粒与PCR产物通过NEB公司购买的Gibsion Assembly连接试剂盒连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pBluSKP-ACTB-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-ACTB质粒(图15)。

酶切体系50μL，具体包括：

PCR体系如下：

PCR程序如下：

Gibsion assembly反应体系如下：

Gibsion assembly混合物：6μL；PCR产物1：1μL；PCR产物2：1μL；PCR产物3：1μL；酶切产物：3μL。

实施例11 pBluSKP-GADPH-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-GAPDH质粒(图16)构建

PCR产物1:

IR-GAPDH-OL-F1:CGGGCCCCCCCTCGAGCCTCTTGTGCTCTTGCTGGGGCTACCGGTTACAGTTGAAGTCG(SEQ ID NO：26)

IR-Comon-OL-R1:GGAGGGAGAGGGGCGGAATTAAGCTTCTAAAGCCATGACA(SEQID NO：21)

PCR产物2:

IRES-F:AATTCCGCCCCTCTCCCTCC(SEQ ID NO：22)

IRES-R:GGTTGTGGCCATATTATCAT(SEQ ID NO：23)

PCR产物3:

IR-Comon-OL-F2:ATGATAATATGGCCACAACCATGACCGAGTACAAGCCCAC(SEQ IDNO：24)

IR-GAPDH-OL-R2:GCTCCACCGCGGTGGCAGCCCCAGCAAGAGCACAAGAGGGCTAGCTACAGTTGAAGTCG(SEQ ID NO：27)

用XholI+NotI限制性内切酶切割(具体见下文)pBluSKP质粒(图13)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物、PCR产物1、PCR产物2和PCR产物3(具体见下文)，切胶回收分别2888bp、300bp、2204bp和590bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pBluSKP质粒与PCR产物通过NEB公司购买的Gibsion Assembly连接试剂盒连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pBluSKP-GADPH-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-GAPDH(图16)。

酶切体系50μL，具体包括：

PCR体系如下：

PCR程序如下：

Gibsion assembly反应体系如下：

实施例12 pBluSKP-PGK1-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-PGK1质粒(图17)构建

PCR产物1:

IR-PGK1-OL-F1:CGGGCCCCCCCTCGAGAGGTTTTAGCTAATGCCAAGTGGACCGGTTACAGTTGAAGTCG(SEQ ID NO：28)

IR-Comon-OL-R1:GGAGGGAGAGGGGCGGAATTAAGCTTCTAAAGCCATGACA(SEQID NO：21)

PCR产物2:

IRES-F:AATTCCGCCCCTCTCCCTCC(SEQ ID NO：22)

IRES-R:GGTTGTGGCCATATTATCAT(SEQ ID NO：23)

PCR产物3:

IR-Comon-OL-F2:ATGATAATATGGCCACAACCATGACCGAGTACAAGCCCAC(SEQ IDNO：24)

IR-PGK1-OL-R2:GCTCCACCGCGGTGGCCCACTTGGCATTAGCTAAAACCTGCTAGCTACAGTTGAAGTCG(SEQ ID NO：29)

用XholI+NotI限制性内切酶切割(具体见下文)pBluSKP质粒(图13)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物、PCR产物1、PCR产物2和PCR产物3(具体见下文)，切胶回收分别2888bp、300bp、2204bp和590bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pBluSKP质粒与PCR产物通过NEB公司购买的Gibsion Assembly连接试剂盒连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pBluSKP-PGK1-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-PGK1质粒(图17)。

酶切体系50μL，具体包括：

PCR体系如下：

PCR程序如下：

①95℃:2min；②95℃:30s；③58℃:30s；④72℃:3min；②③④循环39次；⑤72℃2min；⑥16℃保存。

Gibsion assembly反应体系如下：

实施例13 pBluSKP-AAVS1-IR-T2A-Puro-Cas9p300-M2rtTA-EGFP-EF1α-IR-AAVS1质粒(图19)构建

以pBluSKP-AAVS1-Cas9-p300-M2rtTA-AAVS1(图18)为模版进行PCR，设计合成PCR引物序列如下：

PCR产物1:

OL-1-F:AATAAACAAGTTGATGAGTTTACTCCCTATCAGTG(SEQ ID NO：30)

OL-1-R:GGTCTTTGTAGTCCATGGTG(SEQ ID NO：31)

PCR产物2:

OL-2-F:GGTAACAATTGTTGTTGTT(SEQ ID NO：32)

OL-2-R:CTGTACAAGTAAGATCTGTGCCTTCTAGTTGCCAG(SEQ ID NO：33)

用EcoR V限制性内切酶切割(具体见下文)pBluSKP-AAVS1-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-AAVS1质粒(图12)，用Hpa I+Nhe I限制性内切酶切割(具体见下文)pBluSKP-AAVS1-Cas9-p300-M2rtTA-AAVS1(图18)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物、PCR产物1和PCR产物2(具体见下文)，切胶回收分别5563bp、9157bp、420bp、和348bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pBluSKP-AAVS1-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-AAVS1质粒、线性化的pBluSKP-AAVS1-Cas9-p300-M2rtTA-AAVS1质粒与PCR产物通过NEB公司购买的GibsionAssembly连接试剂盒连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pBluSKP-AAVS1-IR-T2A-Puro-Cas9p300-M2rtTA-EGFP-EF1α-IR-AAVS1质粒(图19)。

pBluSKP-AAVS1-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-AAVS1(图12)载体的酶切产物1：

酶切体系50μL，具体包括：

EcoR V-HF:0.5μL；10ⅹcutsmart buffer:5μL；质粒：3μg；ddH₂O:至50μL。

pBluSKP-AAVS1-Cas9-p300-M2rtTA-AAVS(图18)载体的酶切产物2：

酶切体系50μL，具体包括：

Hpa I-HF:0.5μL；Nhe I-HF:0.5μL；10ⅹcutsmart buffer:5μL；质粒：3μg；ddH₂O:至50μL。

PCR体系如下：

PCR程序如下：

Gibsion assembly反应体系如下：

Gibsion assembly混合物：6μL；PCR产物1：1μL；PCR产物2：1μL；酶切产物1：2μl；酶切产物2：2μl。

实施例14 pBluSKP-Rosa26-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-Rosa26质粒(图20)构建

以pBluSKP-AAVS1-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-AAVS1质粒(图12)为模版进行PCR，设计合成PCR引物序列如下：

Rosa26-OL-F1:GGTACCGGGCCCCCCCCCATCTTCTAGAAAGACTGGAGTACCGGTTACAGTTGAAGTCG(SEQ ID NO：34)

Rosa26-OL-R1:CACCGCGGTGGCGGCCACTCCAGTCTTTCTAGAAGATGGAAGCTAGCTACAGTTGAAGT(SEQ ID NO：35)

用XholI+NotI限制性内切酶切割(具体见下文)pBluSKP质粒(图13)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物和PCR(具体见下文)产物，切胶回收分别2888bp和2700bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pBluSKP质粒与PCR产物通过NEB公司购买的Gibsion Assembly连接试剂盒连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pBluSKP-Rosa26-IR-T2A-Puro-EGFP-EF1α-IR-Rosa26质粒(图20)。

酶切体系50μL，具体包括：

XholI:0.5μL；NotI-HF:0.5μL；10ⅹcutsmart buffer:5μL；质粒：3μg；ddH₂O:至50μL。

PCR体系如下：

PCR程序如下：

Gibsion assembly反应体系如下：

Gibsion assembly混合物：3μL；PCR产物：1μL；酶切产物：2μl。

实施例15 pu6-gAAVS1质粒(图22)构建

设计并合成包含AAVS1位点的gRNA序列具体如下:

gRNA-AAVS1-F:TCACCAATCCTGTCCCTAGGTTTA(SEQ ID NO：36)

gRNA-AAVS1-R:CTAGGGACAGGATTGGTGACGGTG(SEQ ID NO：37)

两条部分互补配对单链DNA片段合成双链的DNA片段，具体步骤如下:

10ul 100uM Oligo-F和10ul 100uM Oligo-R预混于1.5ml EP管中，用烧杯煮沸800ml的蒸馏水，将1.5ml EP管置于沸水中5分钟，取出1.5ml EP管室温放置过夜，用baeI限制性内切酶切割(具体见下文)pU6-sgFEgRNA(图21)质粒，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物，切胶回收条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pU6-sEFgRNA质粒与上述双链的DNA片段通过T4DNA连接酶连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pu6-gAAVS1质粒(图22)。

酶切体系50μL，具体包括：

baeI:0.5μL；10ⅹcutsmart buffer:5μL；质粒：3μg；ddH₂O:至50μL。

T4连接体系10μL，具体包括：

T4ligase:1μL；10x T4ligase buffer:1μL；稀释15倍的双链的DNA片段:2μL；线性化pu6-sgFEgRNA原始质粒:2μL；ddH₂O:4μL。

反应条件：25℃水浴1h。

实施例16 pu6-gACTB质粒(图23)构建

设计并合成包含AAVS1位点的gRNA序列具体如下:

gRNA-ACTB-F:TAACAACGCATCTCATATTGTTTA(SEQ ID NO：38)

gRNA-ACTB-R:AATATGAGATGCGTTGTTACGGTG(SEQ ID NO：39)

10ul 100uM Oligo-F和10ul 100uM Oligo-R预混于1.5ml EP管中，用烧杯煮沸800ml的蒸馏水，将1.5ml EP管置于沸水中5分钟，取出1.5ml EP管室温放置过夜，用baeI限制性内切酶切割(具体见下文)pU6-sgFEgRNA(图21)质粒，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物，切胶回收条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pU6-sEFgRNA质粒与上述双链的DNA片段通过T4DNA连接酶连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pu6-gACTB质粒(图23)。

酶切体系50μL，具体包括：

baeI:0.5μL；10ⅹcutsmart buffer:5μL；质粒：3μg；ddH₂O:至50μL。

T4连接体系10μL，具体包括：

反应条件：25℃水浴1h。

实施例17 pu6-gGAPDH质粒(图24)构建

设计并合成包含AAVS1位点的gRNA序列具体如下:

gRNA-GAPDH-F:GCCCCAGCAAGAGCACAAGGTTTA(SEQ ID NO：40)

gRNA-GAPDH-R:CTTGTGCTCTTGCTGGGGCCGGTG(SEQ ID NO：41)

10ul 100uM Oligo-F和10ul 100uM Oligo-R预混于1.5ml EP管中，用烧杯煮沸800ml的蒸馏水，将1.5ml EP管置于沸水中5分钟，取出1.5ml EP管室温放置过夜，用baeI限制性内切酶切割(具体见下文)pU6-sgFEgRNA(图21)质粒，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物，切胶回收条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pU6-sEFgRNA质粒与上述双链的DNA片段通过T4DNA连接酶连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pu6-gGAPDH质粒(图24)。

酶切体系50μL，具体包括：

baeI:0.5μL；10ⅹcutsmart buffer:5μL；质粒：3μg；ddH₂O:至50μL。

T4连接体系10μL，具体包括：

反应条件：25℃水浴1h。

实施例18 pu6-gPGK1质粒(图25)构建

设计并合成包含AAVS1位点的gRNA序列具体如下:

gRNA-PGK1-F:GGTTTTAGCTAATGCCAAGGTTTA(SEQ ID NO：42)

gRNA-PGK1-R:CTTGGCATTAGCTAAAACCCGGTG(SEQ ID NO：43)

10ul 100uM Oligo-F和10ul 100uM Oligo-R预混于1.5ml EP管中，用烧杯煮沸800ml的蒸馏水，将1.5ml EP管置于沸水中5分钟，取出1.5ml EP管室温放置过夜，用baeI限制性内切酶切割(具体见下文)pU6-sgFEgRNA(图21)质粒，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物，切胶回收条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pU6-sEFgRNA质粒与上述双链的DNA片段通过T4DNA连接酶连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pu6-gPGK1质粒(图25)。

酶切体系50μL，具体包括：

baeI:0.5μL；10ⅹcutsmart buffer:5μL；质粒：3μg；ddH₂O:至50μL。

T4连接体系10μL，具体包括：

反应条件：25℃水浴1h。

实施例19 pu6-gRosa26质粒(图26)构建

设计并合成包含AAVS1位点的gRNA序列具体如下:

gRNA-Rosa26-F:CTCCAGTCTTTCTAGAAGAGTTTA(SEQ ID NO：44)

gRNA-Rosa26-R:TCTTCTAGAAAGACTGGAGCGGTG(SEQ ID NO：45)

10ul 100uM Oligo-F和10ul 100uM Oligo-R预混于1.5ml EP管中，用烧杯煮沸800ml的蒸馏水，将1.5ml EP管置于沸水中5分钟，取出1.5ml EP管室温放置过夜，用baeI限制性内切酶切割(具体见下文)pU6-sgFEgRNA(图21)质粒，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物，切胶回收条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pU6-sEFgRNA质粒与上述双链的DNA片段通过T4DNA连接酶连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pu6-gRosa26质粒(图26)。

酶切体系50μL，具体包括：

baeI:0.5μL；10ⅹcutsmart buffer:5μL；质粒：3μg；ddH₂O:至50μL。

T4连接体系10μL，具体包括：

反应条件：25℃水浴1h。

实施例20 利用高效精准基因整合系统实现外源基因的整合

培养人类乳腺癌细胞MCF7于1640全培中，于24孔板铺中均匀种植1*106个细胞，置于37℃，5％CO₂孵箱培养18-28小时，至细胞密度为65-70％，使用脂质体转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)转染质粒，具体方法如下：

制备PEI(10ⅹ):1mg/ml，PH:7.0

转染条件：DNA:500ng每孔，PEI：total DNA＝5:1(g/g)

先将待转染质粒预混于30μl OPTI-MEN中，室温静置5min，再与PEI混合，室温静置10min后均匀的加入24孔板孔中，置于37℃，5％CO₂孵箱培养，12h后换新鲜的全培基，5day后，换用有2μg/mL puro抗性的培养液，筛选4天，再换新鲜的全培基，培养14天后挑取单克隆，并进行基因型鉴定(具体见下文)。

利用高效精准基因整合系统可实现外源基因的整合，设计针对不同位点处的基因整合，包括AAVS1、ACTB、GPADH和PGK1，均成功实现了高效精准基因整合，具体如下：

针对AAVS1位点，报告供体载体的构建如图27-A，供体载体包括两个部分，一部分是利用内源的AAVS1启动子通过T2A元件实现抗性基因Puro的表达，最后用于筛选整合细胞；另一部分是利用人工合成的EF1α启动子表达EGFP，用于流式细胞术阳性整合系统的检测。

针对AAVS1位点，把上述报告供体载体系统转染到MCF7细胞内，具体质粒转染如下述表格所示，转染后3周，利用流式细胞术进行EGFP阳性细胞比例的统计，并挑取单克隆，进行靶位点基因型鉴定(具体见下文)。

利用流式细胞术进行EGFP阳性细胞检测，结果显示，CRISPR Cas9系统与SB结合的系统明显优于两者任意单独，具体结果如图27-B、C；

PCR基因型鉴定具体如下：

设计引物位点分别位于敲入基因位点的上游下游和中间，具体位置如图27-A所示，引物序列具体如下：

SB-5-F：GTTCTCCTGTGGATTCGGGT(SEQ ID NO：46)

SB-5-R：TAGATGTCCTAACTGACTTGCC(SEQ ID NO：47)

SB_3_F2：AGAACGTTCACGGCGACTACT(SEQ ID NO：48)

SB_3_R2：GGAATCTGCCTAACAGGAGGTG(SEQ ID NO：49)

收取单克隆细胞并提取基因组的DNA进行PCR，鉴定条带大小如下表格所示，鉴定结果如图27-D所示，结果显示基因整合成功，将图27-D的PCR产物纯化，进行测序，结果与预测结果无差异，具体结果如图27-E所示，因此，证明本发明可实现精准高效的基因整合。

PCR名称	引物组合	KI
			5-PCR	SB-5-F+SB-5-R	425bp
3-PCR	SB_3_F2+SB_3_R2	579bp
			WT-PCR	SB-5-F+SB_3_R2	400

为证明本系统的应用广泛性，设计并针对体内其它不同的位点进行基因整合，包括ACTB、GAPDH和PGK1，为了实现上述设想，以下主要进行了两方面的实验操作，包括：报告供体载体的构建和细胞的转染。

针对ACTB位点的报告供体载体的构建如图28-A，供体载体包括两个部分，一部分是利用内源的ACTB启动子通过IRES元件实现抗性基因Puro的表达，最后用于筛选整合细胞；另一部分是利用人工合成的EF1α启动子表达EGFP，用于流式细胞术阳性整合系统的检测。

针对ACTB位点，转染下述表格质粒，利用流式细胞术进行EGFP阳性细胞比例的统计，并挑取单克隆，进行靶位点基因型鉴定(具体见下文)。

利用流式细胞术进行EGFP阳性细胞检测，结果显示，CRISPR Cas9系统与SB结合的系统明显优于两者任意单独，具体结果如图28-B；

PCR基因型鉴定具体如下：

设计引物位点分别位于敲入基因位点的上游下游和中间，具体结果如图28-A所示，引物序列具体如下：

ACTB-SB-F1：CCACCATGTACCCTGGCATT(SEQ ID NO：50)

ACTB-SB-R1：TGTGTGGACTTGGGAGAGGA(SEQ ID NO：51)

收取单克隆细胞并提取基因组的DNA进行PCR，鉴定条带大小如下表格所示，鉴定结果如图28-C所示，结果显示基因整合成功，将图28-C的PCR产物纯化，进行测序，结果与预测结果无差异，具体结果如图28-D所示，对整合阳性的克隆统计显示，CRISPR Cas9系统与SB结合的系统明显优于两者任意单独，具体结果如图28-E，因此，证明本发明可实现精准高效的基因整合。

PCR名称	引物组合	KI
			5-PCR	ACTB-SB-F1+SB-5-R	722bp
3-PCR	SB_3_F2+ACTB-SB-R1	586bp
			WT-PCR	ACTB-SB-F1+ACTB-SB-R1	685bp

针对GAPDH位点的报告供体载体的构建如图29-A，供体载体包括两个部分，一部分是利用内源的GAPDH启动子通过IRES元件实现抗性基因Puro的表达，最后用于筛选整合细胞；另一部分是利用人工合成的EF1α启动子表达EGFP，用于流式细胞术阳性整合系统的检测。

针对GAPDH位点，转染下述表格质粒，利用流式细胞术进行EGFP阳性细胞比例的统计，并挑取单克隆，进行靶位点基因型鉴定(具体见下文)。

利用流式细胞术进行EGFP阳性细胞检测，结果显示，CRISPR Cas9系统与SB结合的系统明显优于两者任意单独，具体结果如图29-B；

PCR基因型鉴定具体如下：

设计引物位点分别位于敲入基因位点的上游下游和中间，具体结果如图29-A所示，引物序列具体如下：

GADPH-SB-F1：CACATGGCCTCCAAGGAGTAA(SEQ ID NO：52)

GADPH-SB-R1：GCCCCAGACCCTAGAATAAGAC(SEQ ID NO：53)

收取单克隆细胞并提取基因组的DNA进行PCR，鉴定条带大小如下表格所示，鉴定结果如图29-C所示，结果显示基因整合成功，将图29-C的PCR产物纯化，进行测序，结果与预测结果无差异，具体结果如图29-D所示，对整合阳性的克隆统计显示，CRISPR Cas9系统与SB结合的系统明显优于两者任意单独，具体结果如图29-E，因此，证明本发明可实现精准高效的基因整合。

PCR名称	引物组合	KI
			5-PCR	GADPH-SB-F1+SB-5-R	186bp
3-PCR	SB_3_F2+GADPH-SB-R1	695bp
			WT-PCR	GADPH-SB-F1+GADPH-SB-R1	256bp

针对PGK1位点的报告供体载体的构建如图30-A，供体载体包括两个部分，一部分是利用内源的PGK1启动子通过IRES元件实现抗性基因Puro的表达，最后用于筛选整合细胞；另一部分是利用人工合成的EF1α启动子表达EGFP，用于流式细胞术阳性整合系统的检测。

针对PGK1位点，转染下述表格质粒，利用流式细胞术进行EGFP阳性细胞比例的统计，并挑取单克隆，进行靶位点基因型鉴定(具体见下文)。

利用流式细胞术进行EGFP阳性细胞检测，结果显示，CRISPR Cas9系统与SB结合的系统明显优于两者任意单独，具体结果如图30-B；

PCR基因型鉴定具体如下：

设计引物位点分别位于敲入基因位点的上游下游和中间，具体结果如图30-A所示，引物序列具体如下：

PGK1-SB-F1：GGGTGGATGCTCTCAGCAAT(SEQ ID NO：54)

PGK1-SB-R1：GTTCCTGGCACTGCATCTCT(SEQ ID NO：55)

收取单克隆细胞并提取基因组的DNA进行PCR，鉴定条带大小如下表格所示，鉴定结果如图30-C所示，结果显示基因整合成功，将图30-C的PCR产物纯化，进行测序，结果与预测结果无差异，具体结果如图30-D所示，对整合阳性的克隆统计显示，CRISPR Cas9系统与SB结合的系统明显优于两者任意单独，具体结果如图30-E，因此，证明本发明可实现精准高效的基因整合。

PCR名称	引物组合	KI
			5-PCR	PGK1-SB-F1+SB-5-R	226bp
3-PCR	SB_3_F2+PGK1-SB-R1	555bp
			WT-PCR	PGK1-SB-F1+PGK1-SB-R1	158bp

上述已经成功构建了高效精准基因整合系统，并设计针对不同位点处的基因整合，包括AAVS1、ACTB、GPADH和PGK1，均成功实现了高效精准基因整合效果，因此，本发明的高效精准基因整合系统无位点的依赖。

针对基因整合系统，上述已经成功实现高效精准的小片段(2.5kb)的整合，但是，供体载体的大小严重影响了整合的效率，为了进一步解决目前整合大片段容量的问题，设计并构建大片段的供体载体，12.5kb，均成功实现了高效精准基因整合效果，因此，本发明的高效精准基因整合系统可实现大片段的整合。

针对大片段基因整合系统的构建：

设计并构建供体载体pBluSKP-AAVS1-IR-T2A-Puro-Cas9p300-M2rtTA-EGFP-EF1α-IR-AAVS1如图19

针对AAVS1位点的大片段报告供体载体的构建如图31-A，供体载体包括两个部分，一部分是利用内源的PGK1启动子通过IRES元件实现抗性基因Puro的表达，最后用于筛选整合细胞；另一部分是利用人工合成的EF1α启动子表达EGFP，用于流式细胞术阳性整合系统的检测。

利用流式细胞术进行EGFP阳性细胞检测，结果显示，CRISPR Cas9系统与SB结合的系统明显优于两者任意单独，具体结果如图31-B，

PCR基因型鉴定具体如下：

设计引物位点分别位于敲入基因位点的上游下游和中间，具体结果如图31-A所示，引物序列具体如下：

SB-5-F：GTTCTCCTGTGGATTCGGGT(SEQ ID NO：46)

SB-5-R：TAGATGTCCTAACTGACTTGCC(SEQ ID NO：47)

SB_3_F2：AGAACGTTCACGGCGACTACT(SEQ ID NO：48)

SB_3_R2：GGAATCTGCCTAACAGGAGGTG(SEQ ID NO：49)

收取单克隆细胞并提取基因组的DNA进行PCR，鉴定条带大小如下表格所示，鉴定结果如图31-C所示，结果显示基因整合成功，将图31-C的PCR产物纯化，进行测序，结果与预测结果无差异，具体结果如图，31-D所示，因此，证明本发明可实现精准高效的基因整合。

上述已经成功利用本系统实现高效精准的基因整合，且本系统还具有位点非依赖和和大片段整合特性。

上述已经在细胞水平实现了高效精准的基因整合，同时本系统也可以在动物水平上实现动物体内的高效精准的基因整合，具体设计如下，选取设计针对老鼠基因位点Rosa26的基因整合，并构建整合的报告基因供体载体如图32-A，首先在小鼠细胞NIH3T3上验证敲入效果，再利用尾静脉水动力方式把CRISPR/Cas9-SB切割和整合系统和表达外源基因的转座子供体系统导入到小鼠肝细胞内，组织切片查看报告基因EGFP的表达情况。

针对Rosa26位点，把报告供体载体系统转染到NIH3T3细胞内，转染质粒具体如下，转染3周后，利用流式细胞术进行EGFP阳性细胞比例的统计(具体见下文)。

利用流式细胞术进行EGFP阳性细胞检测，结果显示，CRISPR Cas9系统与SB结合的系统明显优于两者任意单独，具体结果如图32-B；

利用尾静脉水动力方式把CRISPR/Cas9-SB切割和整合系统和表达外源基因的转座子供体系统导入到小鼠肝细胞内，5周后收取小鼠肝组织并切片，在荧光显微镜下检测EGFP绿色荧光报告基因的表达并统计，结果如图32-C、D、E显示，CRISPR Cas9系统与SB结合的系统明显优于两者任意单独。

综上，本系统可以实现高效精准的基因整合，因此本系统发明至关重要，将为生命科学的体外研究、动物模型构建，临床的应用提供了新的手段。

本发明公开了在哺乳动物细胞内，利用Cas9切割系统在基因组和供体载体两端的向导RNA识别位点同时进行切割，实现供体载体体内线性化和基因组位点开放，再利用机体非同源修复，实现无需同源臂的外源DNA供体整合。本发明公开了一种可以利用CRISPRCas9的精准靶向目标基因、SB特异性结合引导供体载体和高效基因整合作用，实现在哺乳动物细胞和哺乳动物体内实现高效精准靶向的基因整合效果，大大的扩展了CRISPR和SB在基础研究和临床实践中的应用。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 南方医科大学

<120> 一种高效精准靶向的基因整合系统及其应用

<160> 55

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1294

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

accggtggtg gaggcggagg ttctggggga ggaggtagtg gcggtggtgg ttcaggaggc 60

ggcggaagct tggatccagg tggaggtgga agcggtgtta acatgggaaa atcaaaagaa 120

atcagccaag acctcagaaa aagaattgta gacctccaca agtctggttc atccttggga 180

gcaatttcca aacgcctggc ggtaccacgt tcatctgtgc aaacaatagt acgcaagtat 240

aaacaccatg ggaccacgca gccgtcatac cgctcaggaa ggagacgcgt tctgtctcct 300

agagatgaac gtactttggt gcgaaaagtg caaatcaatc ccagaacaac agcaaaggac 360

cttgtgaaga tgctggagga aacaggtaca aaagtatcta tatccacagt aaaacgagtc 420

ctatatcgac ataacctgaa aggccactca gcaaggaaga agccactgct ccaaaaccga 480

cataagaaag ccagactacg gtttgcaact gcacatgggg acaaagatcg tactttttgg 540

agaaatgtcc tctggtctga tgaaacaaaa atagaactgt ttggccataa tgaccatcgt 600

tatgtttgga ggaagaaggg ggaggcttgc aagccgaaga acaccatccc aaccgtgaag 660

cacgggggtg gcagcatcat gttgtggggg tgctttgctg caggagggac tggtgcactt 720

cacaaaatag atggcatcat ggacgcggtg cagtatgtgg atatattgaa gcaacatctc 780

aagacatcag tcaggaagtt aaagcttggt cgcaaatggg tcttccaaca cgacaatgac 840

cccaagcata cttccaaagt tgtggcaaaa tggcttaagg acaacaaagt caaggtattg 900

gagtggccat cacaaagccc tgacctcaat cctatagaaa atttgtgggc agaactgaaa 960

aagcgtgtgc gagcaaggag gcctacaaac ctgactcagt tacaccagct ctgtcaggag 1020

gaatgggcca aaattcaccc aaattattgt gggaagcttg tggaaggcta cccgaaacgt 1080

ttgacccaag ttaaacaatt taaaggcaat gctaccaaat actaggggcc ctaaccgcgg 1140

gcggccgcta tatgtacagg atccagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac 1200

cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt 1260

atttgtaacc attataagct gcaataaaca agtt 1294

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gggcattcac cgcggggtac ccatgggaaa atcaaaagaa at 42

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tagtagctcc gctgccaccg gtgtatttgg tagcattgcc tt 42

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

caagaagaag aggaaggtga ccggtggtgg aggcggaggt tctgg 45

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

agatccccgc gctgcagtta cttgtacata tagcggccgc tcagagcagt ggcttcttc 59

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gatccccgcg ctgcagttac ttgtacatat agcggccgct cagcggtatg acggctgcg 59

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

cccacaaatt gtctatagga ttgaggtcag ggctttgtga tgg 43

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

caatcctata gacaatttgt gggcagaact gaaaaagcgt gtg 43

<210> 9

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

tccccgcgct gcagttactt gtacatatag cggccgcccg cggttagggc ccctagt 57

<210> 10

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

tcgaggtcac caatcctgtc cctagtggaa gcttgtcacc aatcctgtcc ctagtgggc 59

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

ggccgcccac tagggacagg attggtgaca agcttccact agggacagga ttggtgacc 59

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

aatgatgtca tggctttaga agcttctaaa gccatgacat cattt 45

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

ctatgaccat gattacgcca ccggtgcatg cctgcaggtc gactc 45

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

taagctgcaa taaacaagtt gatatcttac ttgtacagct cgtcca 46

<210> 15

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

aatgatgtca tggctttaga agcttactag tgggcagagc gcacatcgcc c 51

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

aatgatgtca tggctttaga agcttacgcg tctgacctct tctcttcctc c 51

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

gatatcaact tgtttattgc agctta 26

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

ccaatcctgt ccctagtgga ccggttacag ttgaagtcgg aagtt 45

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

gacaggattg gtgacaagct agctacagtt gaagtcggaa gtt 43

<210> 20

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

cgggcccccc ctcgaggtaa caacgcatct catatttgga ccggttacag ttgaagtcg 59

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

ggagggagag gggcggaatt aagcttctaa agccatgaca 40

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

aattccgccc ctctccctcc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

ggttgtggcc atattatcat 20

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

atgataatat ggccacaacc atgaccgagt acaagcccac 40

<210> 25

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

gctccaccgc ggtggcccaa atatgagatg cgttgttacg ctagctacag ttgaagtcg 59

<210> 26

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

cgggcccccc ctcgagcctc ttgtgctctt gctggggcta ccggttacag ttgaagtcg 59

<210> 27

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

gctccaccgc ggtggcagcc ccagcaagag cacaagaggg ctagctacag ttgaagtcg 59

<210> 28

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

cgggcccccc ctcgagaggt tttagctaat gccaagtgga ccggttacag ttgaagtcg 59

<210> 29

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

gctccaccgc ggtggcccac ttggcattag ctaaaacctg ctagctacag ttgaagtcg 59

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 30

aataaacaag ttgatgagtt tactccctat cagtg 35

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

ggtctttgta gtccatggtg 20

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

ggtaacaatt gttgttgtt 19

<210> 33

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 33

ctgtacaagt aagatctgtg ccttctagtt gccag 35

<210> 34

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 34

ggtaccgggc ccccccccat cttctagaaa gactggagta ccggttacag ttgaagtcg 59

<210> 35

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 35

caccgcggtg gcggccactc cagtctttct agaagatgga agctagctac agttgaagt 59

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 36

tcaccaatcc tgtccctagg ttta 24

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 37

ctagggacag gattggtgac ggtg 24

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 38

taacaacgca tctcatattg ttta 24

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 39

aatatgagat gcgttgttac ggtg 24

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 40

gccccagcaa gagcacaagg ttta 24

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 41

cttgtgctct tgctggggcc ggtg 24

<210> 42

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 42

ggttttagct aatgccaagg ttta 24

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 43

cttggcatta gctaaaaccc ggtg 24

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 44

ctccagtctt tctagaagag ttta 24

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 45

tcttctagaa agactggagc ggtg 24

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 46

gttctcctgt ggattcgggt 20

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 47

tagatgtcct aactgacttg cc 22

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 48

agaacgttca cggcgactac t 21

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 49

ggaatctgcc taacaggagg tg 22

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 50

ccaccatgta ccctggcatt 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 51

tgtgtggact tgggagagga 20

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 52

cacatggcct ccaaggagta a 21

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 53

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<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 54

gggtggatgc tctcagcaat 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 55

gttcctggca ctgcatctct 20

Claims

1.一种高效精准靶向的基因整合系统，其特征在于，包括表达外源性融合蛋白系统、一种向导RNA和供体载体；

所述表达外源性融合蛋白系统包括Cas9或SB或Cas9与SB、N123、N57、SB100XE279D其中之一组成的融合蛋白；

所述向导RNA为靶向基因组区域和供体载体两端的20bp的长序列；

所述供体载体两端分别均有向导RNA靶向位点、SB结合位点和中间的目的基因整合片段。

2.根据权利要求1所述的高效精准靶向的基因整合系统，其特征在于，所述表达外源性融合蛋白系统还包括CAG启动子和polyA。

3.根据权利要求1所述的高效精准靶向的基因整合系统，其特征在于，所述向导RNA包括U6启动子、gRNA识别序列、gRNA骨架序列、U6启动子的终止序列。

4.根据权利要求1所述的高效精准靶向的基因整合系统，其特征在于，所述基因组区域位于AAVS1、ACTB、GAPDH、PGK1和Rosa26。

5.根据权利要求1所述的高效精准靶向的基因整合系统，其特征在于，所述供体载体包括以下四个部分：

6.根据权利要求5所述的高效精准靶向的基因整合系统，其特征在于，所述供体载体的元件在同一个载体上，顺序依次为：20bp的gRNA识别序列识别位点、3bp PAM区、IR、T2A、puromycin抗性基因表达序列、bGH polyA、SV40polyA、目的基因表达序列、启动子、IR和20bp的gRNA识别序列识别位点、3bp PAM区。

7.权利要求1所述的高效精准靶向的基因整合系统的构建方法，其特征在于，通过CRISPR-CAS9切割基因组靶向位点和供体载体两端向导RNA识别位点，以同时实现靶向位点基因的开放和供体载体体内线性化；通过SB、N123、N57或SB100XE279D将所述的体内线性化的供体载体引导到所述的开放的靶向基因位点，并利用非同源末端直接连接把所述供体载体敲入基因组靶位点；其中所述通过CRISPR-CAS9切割基因组位点和供体载体两端向导RNA识别位点中，所述基因组区域位于AAVS1、ACTB、GAPDH、PGK1和Rosa26。

8.根据权利要求7所述的高效精准靶向的基因整合系统的构建方法，其特征在于，体内线性化的外源基因无需同源臂可直接实现靶向基因组靶位点整合。

9.权利要求1-6所述的高效精准靶向的基因整合系统在哺乳动物细胞和哺乳动物体内实现高效精准靶向的基因整合中的应用。

10.权利要求1-6所述的高效精准靶向的基因整合系统在基因工程、生物技术和临床中的应用。