CN108913676A - 基于crispr的基因组修饰和调控 - Google Patents

基于crispr的基因组修饰和调控 Download PDF

Info

Publication number
CN108913676A
CN108913676A CN201810574719.4A CN201810574719A CN108913676A CN 108913676 A CN108913676 A CN 108913676A CN 201810574719 A CN201810574719 A CN 201810574719A CN 108913676 A CN108913676 A CN 108913676A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
rna
cell
domain
endonuclease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810574719.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108913676B (zh
Inventor
F.陈
G.D.戴维斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sigma Aldrich Co LLC
Original Assignee
Sigma Aldrich Co LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50883989&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN108913676(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Sigma Aldrich Co LLC filed Critical Sigma Aldrich Co LLC
Priority to CN201810574719.4A priority Critical patent/CN108913676B/zh
Publication of CN108913676A publication Critical patent/CN108913676A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108913676B publication Critical patent/CN108913676B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/10—Ophthalmic agents for accommodation disorders, e.g. myopia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/463—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from amphibians
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/21—Endodeoxyribonucleases producing 5'-phosphomonoesters (3.1.21)
    • C12Y301/21004—Type II site-specific deoxyribonuclease (3.1.21.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供经工程改造用于在真核细胞或胚胎中表达的RNA指导的核酸内切酶，和在真核细胞或胚胎中将RNA指导的核酸内切酶用于靶基因组修饰的方法。也提供融合蛋白，其中各融合蛋白包含CRISPR/Cas样蛋白或其片段和效应子结构域。效应子结构域可以是剪切结构域、表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录抑制子结构域。也提供使用融合蛋白修饰染色体序列或调控染色体序列表达的方法。

Description

基于CRISPR的基因组修饰和调控
本申请是申请日为2013年12月5日，申请号为201380072477.4，发明名称为“基于CRISPR的基因组修饰和调控”的发明专利的分案申请。
技术领域
本公开内容涉及靶基因组修饰。具体而言，本公开涉及RNA指导的核酸内切酶或包含CRISPR/Cas样蛋白的融合蛋白和使用所述蛋白修饰修饰或调控靶染色体序列的方法。
发明背景
靶基因组修饰是用于真核细胞、胚胎和动物的基因操作的有力的工具。例如，外源序列可以被整合在靶基因组位置和/或特定的内源染色体序列可以被缺失、失活或修饰。当前的方法依赖于工程化核酸酶的使用，工程化核酸酶例如，锌指核酸酶(ZFNs)或转录激活子样效应子核酸酶(TALENs)。这些嵌合核酸酶含有与非特异性DNA剪切结构域连接的可编程的、序列特异性的DNA结合组件。但是，各个新的基因组靶需要设计包含新的序列特异性的DNA-结合组件的新ZFN或TALEN。因此，这些用户定制设计的核酸酶往往制备昂贵且耗时。此外，ZFNs和TALENS的特异性使得它们能介导脱靶剪切。
因此，需要不要求针对每个新的靶基因组位置设计新的核酸酶的靶基因组修饰技术。另外，需要特异性增加的具有很少或没有脱靶作用的技术。
发明概述
在本公开内容的不同方面之中提供分离的RNA指导的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶包含至少一个核定位信号、至少一个核酸酶结构域和至少一个与指导RNA相互作用以将核酸内切酶靶向用于剪切的特定核苷酸序列的结构域。在一个实施方案中，所述核酸内切酶可衍生自Cas9蛋白。在另一实施方案中，所述核酸内切酶可经修饰而缺失至少一个功能性核酸酶结构域。在其它实施方案中，所述核酸内切酶可进一步包含细胞穿透结构域、标志物结构域，或二者。在进一步的实施方案中，所述核酸内切酶可以是包含指导RNA的蛋白-RNA复合物的一部分。在一些情况下，所述指导RNA可以是包含与靶位点互补的5’区域的单分子。也提供编码任一本文公开的RNA指导的核酸内切酶的分离的核酸。在一些实施方案中，所述核酸可以是针对在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中翻译而最优化的密码子。在其它实施方案中，编码RNA指导的核酸内切酶的核酸序列可以与启动子控制序列可操作性地连接，并任选地可以是载体的一部分。在其它实施方案中，包含可以与启动子控制序列可操作性地连接的编码RNA指导的核酸内切酶的序列的载体也可包含可以与启动子控制序列可操作性连接的编码指导RNA的序列。
本发明的另一方面包括用于在真核细胞或胚胎中修饰染色体序列的方法。该方法包括向真核细胞或胚胎中引入(i)至少一种包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶或编码至少一种如本文所定义的RNA指导的核酸内切酶的核酸，(ii)至少一种指导RNA或编码至少一种指导RNA的DNA，和任选(iii)至少一种包含供体序列的供体多核苷酸。该方法进一步包括培养所述细胞或胚胎以便各指导RNA将RNA指导的核酸内切酶定向至染色体序列中的靶位点，其中所述RNA指导的核酸内切酶将双链断裂引入所述靶位点，并且所述双链断裂通过DNA修复过程而修复以便修饰染色体序列。在一个实施方案中，所述RNA指导的核酸内切酶可以衍生自Cas9蛋白。在另一实施方案中，编码引入细胞或胚胎中的RNA指导的核酸内切酶的核酸可以是mRNA。在进一步的实施方案中，其中编码引入细胞或胚胎的RNA指导的核酸内切酶的核酸可以是DNA。在进一步的实施方案中，编码RNA指导的核酸内切酶的DNA可以是另外包含编码指导RNA的序列的载体的一部分。在某些实施方案中，所述真核细胞可以是人细胞、非人哺乳动物细胞、干细胞、非哺乳动物的脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、植物细胞或单细胞真核生物。在某些其它实施方案中，所述胚胎是非人单细胞动物胚胎。
本公开内容的另外方面提供包含CRISPR/Cas样蛋白或其片段和效应子结构域的融合蛋白。一般而言，所述融合蛋白包含至少一个核定位信号。融合蛋白的效应子结构域可以是剪切结构域、表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录抑制子结构域。在一个实施方案中，融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白可以衍生自Cas9蛋白。在一个重复中，所述Cas9蛋白可经修饰而缺失至少一个功能性核酸酶结构域。在备选的重复中，所述Cas9蛋白可以被修饰而缺失全部核酸酶活性。在一个实施方案中，所述效应子结构域可以是剪切结构域，例如，FokI核酸内切酶结构域或修饰的FokI核酸内切酶结构域。在另一实施方案中，一种融合蛋白可与另一融合蛋白形成二聚体。所述二聚体可以是同源二聚体或异源二聚体。在另一实施方案中，所述融合蛋白可与锌指核酸酶形成异源二聚体，其中融合蛋白和锌指核酸酶二者的剪切结构域是FokI核酸内切酶结构域或修饰的FokI核酸内切酶结构域。在仍另一实施方案中，所述融合蛋白包含衍生自经修饰而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白的CRISPR/Cas样蛋白，并且所述效应子结构域是FokI核酸内切酶结构域或修饰的FokI核酸内切酶结构域。在仍另一实施方案中，所述融合蛋白包含衍生自经修饰而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白的CRISPR/Cas样蛋白，并且所述效应子结构域可以是表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录抑制子结构域。在另外的实施方案中，本文公开的融合蛋白中任一种可包含至少一个选自核定位信号、细胞穿透结构域和标志物结构域的另外的结构域。也提供编码本文提供的融合蛋白中任一种的分离的核酸。
本公开内容的仍另一方面包括用于在细胞或胚胎中修饰染色体序列或调控染色体序列的表达的方法。所述方法包括向细胞或胚胎中引入：(a)至少一种融合蛋白或编码至少一种融合蛋白的核酸，其中所述融合蛋白包含CRISPR/Cas样蛋白或其片段和效应子结构域，和(b)至少一种指导RNA或编码至少一种指导RNA的DNA，其中所述指导RNA将融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白指导至染色体序列中的靶位点，并且融合蛋白的效应子结构域修饰染色体序列或调控染色体序列的表达。在一个实施方案中，所述融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白可以衍生自Cas9蛋白。在另一实施方案中，所述融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白可经修饰而缺失至少一个功能性核酸酶结构域。在仍另一实施方案中，所述融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白可经修饰而缺失全部核酸酶活性。在其中融合蛋白包含经修饰而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白和FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域的一个实施方案中，该方法可包括向所述细胞或胚胎引入一种融合蛋白或编码一种融合蛋白的核酸和两种指导RNA或编码两种指导RNA的DNA，并且其中一个双链断裂被引入染色体序列。在其中所述融合蛋白包含经修饰而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白和FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域的另一实施方案中，所述方法可包括向所述细胞或胚胎中引入两种融合蛋白或编码两种融合蛋白的核酸和两种指导RNA或编码两种指导RNA的DNA，并且其中两个双链断裂被引入所述染色体序列。在其中所述融合蛋白包含经修饰而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白和FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域的仍另一实施方案中，所述方法可包括向细胞或胚胎中引入一种融合蛋白或编码一种融合蛋白的核酸、一种指导RNA或编码一种指导RNA的核酸和一种锌指核酸酶或编码一种锌指核酸酶的核酸，其中所述锌指核酸酶包含FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域，并且其中一个双链断裂被引入所述染色体序列。在其中所述融合蛋白包含剪切结构域的某些实施方案中，所述方法可进一步包含向细胞或胚胎引入至少一种供体多核苷酸。在其中所述融合蛋白包含选自表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录抑制子结构域的效应子结构域的实施方案中，所述融合蛋白可包含经修饰而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白，且所述方法可以包括向细胞或胚胎中引入一种融合蛋白或编码一种融合蛋白的核酸和一种指导RNA或编码一种指导RNA的核酸，并且其中修饰所述靶染色体序列的结构或表达。在某些实施方案中，所述真核细胞可以是人细胞、非人哺乳动物细胞、干细胞、非哺乳动物的脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、植物细胞或单细胞真核生物。在某些其它实施方案中，所述胚胎是非人单细胞动物胚胎。
本公开内容的其它方面和重复在下面详述。
附图简述
图1图示使用蛋白二聚体的基因组修饰。(A)描绘了由两种融合蛋白组成的二聚体所产生的双链断裂，所述两种融合蛋白的每一种包含用于DNA结合的Cas样蛋白和FokI剪切结构域。(B)描绘了由二聚体所产生的双链断裂，所述二聚体由包含Cas样蛋白和FokI剪切结构域的融合蛋白以及包含锌指(ZF)DNA-结合结构域和FokI剪切结构域的锌指核酸酶组成。
图2表明使用包含基因调控结构域的RNA指导的融合蛋白调控基因表达。(A)描绘了包含用于DNA结合的Cas样蛋白和激活或抑制基因表达的“A/R”结构域的融合蛋白。(B)图示包含用于DNA结合的Cas样蛋白和通过邻近的DNA或蛋白的共价修饰而影响表观遗传状态的表观遗传修饰结构域(“Epi-mod’)的融合蛋白。
图3图示使用两种RNA指导的核酸内切酶的基因组修饰。
(A)描绘了由已经转化为切口酶的两种RNA指导的核酸内切酶产生的双链断裂。(B)描绘了由具有核酸内切酶活性的两种RNA指导的核酸内切酶产生的两个双链断裂。
图4显示了用Cas9核酸、Cas9指导的RNA和AAVS1-GFP DNA供体转染的人K562细胞的荧光激活细胞分选术(FACS)。Y轴表示在红色通道的自发荧光强度，和X轴表示绿色荧光强度，(A)用以下转染的K562细胞：10μg的用Anti-Reverse帽类似物转录的Cas9mRNA、0.3nmol的预退火的crRNA-tracrRNA双链体和10μg的AAVS1-GFP质粒DNA；(B)用以下转染的K562细胞：10μg的用Anti-Reverse帽类似物转录的Cas9mRNA、0.3nmol的嵌合RNA和10μg的AAVS1-GFP质粒DNA；(C)用以下转染的K562细胞：10μg的通过转录后加帽反应加帽的Cas9mRNA、0.3nmol的嵌合RNA和10μg的AAVS1-GFP质粒DNA；(D)用10μg的Cas9质粒DNA、5μg的U6-嵌合RNA质粒DNA和10μg的AAVS1-GFP质粒DNA转染的K562细胞；(E)用10μg的AAVS1-GFP质粒DNA转染的K562细胞；(F)仅用转染试剂转染的K562细胞。
图5显示证明GFP靶向整合至人细胞的AAVS1基因座的连接PCR分析。泳道M:1kbDNA分子标记；泳道A:用以下转染的K562细胞：用Anti-Reverse帽类似物转录的10μg的Cas9mRNA、0.3nmol的预退火的crRNA-tracrRNA双链体和10μg的AAVS1-GFP质粒DNA；泳道B:用以下转染的K562细胞：用Anti-Reverse帽类似物转录的10μg的Cas9mRNA、0.3nmol的嵌合RNA和10μg的AAVS1-GFP质粒DNA；泳道C:用通过转录后加帽反应加帽的10μg的Cas9mRNA、0.3nmol的嵌合RNA和10μg的AAVS1-GFP质粒DNA转染的K562细胞；泳道D:用10μg的Cas9质粒DNA、5μg的U6-嵌合RNA质粒DNA和10μg的AAVS1-GFP质粒DNA转染的K562细胞；泳道E:用10μg的AAVS1-GFP质粒DNA转染的K562细胞；泳道F:仅用转染试剂转染的K562细胞。
发明详述
本文提供RNA指导的核酸内切酶，其包含至少一个核定位信号、至少一个核酸酶结构域和至少一个与指导RNA相互作用以将所述核酸内切酶靶向用于剪切的特异性核苷酸序列的结构域。也提供了编码RNA指导的核酸内切酶的核酸，和使用RNA指导的核酸内切酶修饰真核细胞或胚胎的染色体序列的方法。所述RNA指导的核酸内切酶与特异性的指导RNA相互作用，所述特异性的指导RNA的每一种将所述核酸内切酶定向至特定靶位点，在所述位点该RNA指导的核酸内切酶引起双链断裂，其可通过DNA修复过程而修复使得修复染色体序列。因为特异性通过所述指导RNA提供，因此基于RNA的核酸内切酶是通用的，并且可以与不同的指导RNA一起使用以靶向不同基因组序列。本文公开的方法可用于靶向和修饰特定的染色体序列和/或将外源序列引入到细胞或胚胎的基因组中的靶位置。此外，靶向是特异性的，具有有限的脱靶效果。
本公开内容提供了融合蛋白，其中融合蛋白包含CRISPR/Cas样蛋白或其片段和效应子结构域。合适的效应子结构域包括但不限于剪切结构域、表观遗传修饰结构域、转录激活结构域和转录抑制子结构域。通过特异性指导RNA将各融合蛋白指导至具体的染色体序列，其中所述效应子结构域介导靶基因组修饰或基因调控。在一个方面，所述融合蛋白可用作二聚体，从而增加靶位点的长度和增加其在基因组中的唯一性的可能性(从而，降低脱靶效果)。例如，内源的CRISPR系统基于大约13-20bp的DNA结合字长度而修饰基因组位置(Cong等人,Science,339:819-823)。在此字长，仅5-7％的靶位点在基因组内是唯一的(Iseli等人,PLos One 2(6):e579)。相比之下，锌指核酸酶的DNA结合字长范围通常为30-36bp，这产生大约85-87％在人基因组内唯一的靶位点。基于CRISPR的系统所利用的较小大小的DNA结合位点限制了在所需位置附近的基于靶向CRISP的核酸酶的设计并使其复杂化，所述所需位置例如疾病SNPs、小外显子、起始密码子和终止密码子，以及在复杂的基因组中的其它位置。本公开内容不仅提供了用于扩展CRISPR DNA结合字长的方式(即，以便限制脱靶活性)，而且进一步提供具有修饰功能性的CRISPR融合蛋白。因此，所公开的CRISPR融合蛋白具有增加的靶特异性和唯一的功能性。本文也提供使用融合蛋白以修饰或调控靶染色体序列的表达的方法。
(I)RNA指导的核酸内切酶
本公开内容的一个方面提供包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶，所述核定位信号允许核酸内切酶进入真核细胞和胚胎(例如，非人单细胞胚胎)的胞核。RNA指导的核酸内切酶也包含至少一个核酸酶结构域和至少一个与指导RNA相互作用的结构域。RNA指导的核酸内切酶被指导RNA定向至特定的核酸序列(或靶位点)。所述指导RNA与RNA指导的核酸内切酶和靶位点相互作用使得一旦定向至靶位点，RNA指导的核酸内切酶就能够向靶位点核酸序列中引入双链断裂。因为所述指导RNA提供针对靶向剪切的特异性，RNA指导的核酸内切酶的核酸内切酶是通用的并且可以与不同指导RNA一起使用以剪切不同靶核酸序列。本文提供了分离的RNA指导的核酸内切酶、编码RNA指导的核酸内切酶的分离的核酸(即，RNA或DNA)、包含编码RNA指导的核酸内切酶的核酸的载体、以及包含RNA指导的核酸内切酶加上指导RNA的蛋白-RNA复合物。
RNA指导的核酸内切酶可衍生自成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关的(Cas)系统。CRISPR/Cas系统可以是类型I、类型II或类型III系统。合适的CRISPR/Cas蛋白的非限制性实例包括Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966。
在一个实施方案中，RNA指导的核酸内切酶衍生自类型II CRISPR/Cas系统。在特定实施方案中，RNA指导的核酸内切酶衍生自Cas9蛋白。Cas9蛋白可来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌(Streptococcus sp.)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、绿色产色链霉菌、玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、玫瑰链孢囊菌、酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、Bacillus selenitireducens、Exiguobacteriumsibiricum、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、海洋微颤蓝细菌(Microscilla marina)、Burkholderiales bacterium、Polaromonas naphthalenivorans、Polaromonas sp.、Crocosphaera watsonii、蓝杆藻(Cyanothece sp.)、铜绿微囊蓝细菌(Microcystis aeruginosa)、聚球菌(Synechococcussp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、Ammonifex degensii、Caldicelulosiruptor becscii、Candidatus Desulforudis、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、丙酸互营细菌(Pelotomaculumthermopropionicum)、Acidithiobacillus caldus、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、紫色硫细菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌(Marinobacter sp.)、嗜盐硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、Nitrosococcuswatsoni、Pseudoalteromonas haloplanktis、Ktedonobacter racemifer、Methanohalobium evestigatum、多鱼腥蓝细菌(Anabaena variabilis)、产泡沫节球蓝细菌(Nodularia spumigena)、Nostoc sp.、最大节螺蓝细菌(Arthrospira maxima)、Arthrospiraplatensis、节螺蓝细菌属(Arthrospira sp.)、鞘丝蓝细菌属(Lyngbya sp.)、原型体微鞘蓝细菌(Microcoleus chthonoplastes)、颤蓝细菌属(Oscillatoria sp.)、Petrotoga mobilis、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)或Acaryochloris marina。
一般而言，CRISPR/Cas蛋白包含至少一个RNA识别和/或RNA结合结构域。RNA识别和/或RNA结合结构域与指导RNA相互作用。CRISPR/Cas蛋白也可包含核酸酶结构域(即，DNA酶或RNA酶结构域)、DNA结合结构域、解螺旋酶结构域、RNA酶结构域、蛋白-蛋白相互作用结构域、二聚结构域和其它结构域。
CRISPR/Cas样蛋白可以是野生型CRISPR/Cas蛋白、修饰的CRISPR/Cas蛋白或野生型或修饰的CRISPR/Cas蛋白的片段。CRISPR/Cas样蛋白可以经修饰以增加核酸结合亲和力和/或特异性，改变酶活性和/或改变蛋白的另一性质。例如，CRISPR/Cas样蛋白的核酸酶(即，DNA酶、RNA酶)结构域可以被修饰、缺失或失活。备选地，CRISPR/Cas样蛋白可以被截短以除去对于融合蛋白的功能并非必要的结构域。CRISPR/Cas样蛋白也可被截短或修饰以使融合蛋白的效应子结构域的活性最优化。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas样蛋白可以衍生自野生型Cas9蛋白或其片段。在其它实施方案中，CRISPR/Cas样蛋白可以衍生自修饰的Cas9蛋白。例如，Cas9蛋白的氨基酸序列可以被修饰而改变蛋白的一种或多种性质(例如，核酸酶活性、亲和力、稳定性等)。备选地，不涉及RNA指导的剪切的Cas9蛋白的结构域可以从蛋白中排除以便修饰的Cas9蛋白与野生型Cas9蛋白相比更小。
一般而言，Cas9蛋白包含至少两个核酸酶(即，DNA酶)结构域。例如，Cas9蛋白可以包含RuvC样核酸酶结构域和HNH样核酸酶结构域。RuvC和HNH结构域一起起作用以切开单链从而在DNA中产生双链断裂。(Jinek等人,Science,337:816-821)。在一些实施方案中，Cas9衍生的蛋白可以被修饰而仅含有一个功能性核酸酶结构域(RuvC样或HNH样核酸酶结构域)。例如，Cas9衍生的蛋白可以被修饰使得核酸酶结构域的一个被缺失或突变使得它不再有功能(即，缺少核酸酶活性)。在其中核酸酶结构域之一无活性的一些实施方案中，Cas9衍生的蛋白能够将切口引入双链核酸中(这样的蛋白称为“切口酶”)，但并不剪切双链DNA。例如，在RuvC样结构域中天冬氨酸至丙氨酸(D10A)的转换将Cas9衍生的蛋白转化成切口酶。同样，在HNH结构域中组氨酸至丙氨酸(H840A或H839A)的转换将Cas9衍生的蛋白转化成切口酶。各核酸酶结构域可以使用众所周知的方法而修饰，例如位点定向诱变、PCR介导的诱变，和全基因合成以及本领域已知的其它方法。
本文公开的RNA指导的核酸内切酶包含至少一个核定位信号。一般而言，NLS包含一段碱性氨基酸序列。核定位信号是本领域已知的(参见，例如，Lange等人,J.Biol.Chem.,2007,282:5101-5105)。例如，在一个实施方案中，NLS可以是单分型序列(monopartitesequence)，例如PKKKRKV(SEQ ID NO:1)或PKKKRRV(SEQ ID NO:2)。在另一实施方案中，NLS可以是二分型序列(bipartite sequence)。在仍另一实施方案中，NLS可以是KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:3)。NLS可以位于RNA指导的核酸内切酶的N-末端、C-末端或内部位置。
在一些实施方案中，RNA指导的核酸内切酶可以进一步包含至少一个细胞穿透结构域。在一个实施方案中，细胞穿透结构域可以是衍生自HIV-1TAT蛋白的细胞穿透肽序列。例如，TAT细胞穿透序列可以是GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV(SEQ ID NO:4)。在另一实施方案中，细胞穿透结构域可以是TLM(PLSSIFSRIGDPPKKKRKV；SEQ ID NO:5)，衍生自人乙型肝炎病毒的细胞穿透肽序列。在仍另一实施方案中，细胞穿透结构域可以是MPG(GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV；SEQ ID NO:6或GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV；SEQ ID NO:7)。在另外的实施方案中，细胞穿透结构域可以是Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV；SEQ IDNO:8)、VP22，来自单纯疱疹病毒的细胞穿透肽或多精氨酸肽序列。细胞穿透结构域可定位于蛋白的N-末端、C-末端或内部位置。
在仍其它的实施方案中，RNA指导的核酸内切酶也可以包含至少一个标志物结构域。标志物结构域的非限制性实例包括荧光蛋白、纯化标签和表位标签。在一些实施方案中，标志物结构域可以是荧光蛋白。合适的荧光蛋白的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色荧光蛋白(例如YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、蓝色荧光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、蓝绿色荧光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1,Midoriishi-Cyan)、红色荧光蛋白(mKate、mKate2、mPlum、DsRed monomer、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)和橙色荧光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、MonomericKusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)或任何其它合适的荧光蛋白。在其它实施方案中，标志物结构域可以是纯化标签和/或表位标签。例示性的标签包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)、串联亲和力纯化(TAP)标签、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、生物素羧基载体蛋白(BCCP)和钙调蛋白。
在某些实施方案中，RNA指导的核酸内切酶可以是包含指导RNA的蛋白-RNA复合物的一部分。指导RNA与RNA指导的核酸内切酶相互作用以将核酸内切酶定向至特定的靶位点，其中指导RNA的5’端与特定的原间隔序列(protospacer sequence)碱基配对。
(II)融合蛋白
本公开内容的另一方面提供了包含CRISPR/Cas样蛋白或其片段和效应子结构域的融合蛋白。通过指导RNA将CRISPR/Cas样蛋白定向至靶位点，在该位点效应子结构域可修饰靶核酸序列或使其生效。效应子结构域可以是剪切结构域、表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录抑制子结构域。融合蛋白可以进一步包含至少一个选自核定位信号、细胞穿透结构域或标志物结构域的另外的结构域。
(a)CRISPR/Cas样蛋白
融合蛋白包含CRISPR/Cas样蛋白或其片段。CRISPR/Cas样蛋白在上面的部分(I)中详述。CRISPR/Cas样蛋白可以定位于融合蛋白的N-末端、C-末端或内部位置。
在一些实施方案中，融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白可以衍生自Cas9蛋白。Cas9衍生的蛋白可以是野生型、修饰的或其片段。在一些实施方案中，Cas9衍生的蛋白可以经修饰以仅包含一个功能性核酸酶结构域(RuvC样或HNH样核酸酶结构域)。例如，Cas9衍生的蛋白可以被修饰使得核酸酶结构域之一被删除或突变使得它不再有功能(即，缺乏核酸酶活性)。在其中核酸酶结构域之一是无活性的一些实施方案中，Cas9衍生的蛋白能够将切口引入双链核酸(这类蛋白被称为“切口酶”)，但不剪切双链DNA。例如，在RuvC样结构域中天冬氨酸至丙氨酸(D10A)的转换将Cas9衍生的蛋白转化成切口酶。同样，在HNH结构域中组氨酸至丙氨酸(H840A或H839A)的转换将Cas9衍生的蛋白转化成切口酶。在其它实施方案中，RuvC样核酸酶结构域和HNH样核酸酶结构域两者都可被修饰或消除使得Cas9衍生的蛋白不能够在双链核酸上切口或剪切双链核酸。在仍其它的实施方案中，Cas9衍生的蛋白的全部核酸酶结构域可以被修饰或消除使得Cas9衍生的蛋白缺失全部核酸酶活性。
在任一上述实施方案中，任何或所有核酸酶结构域可以通过一个或多个缺失突变、插入突变和/或置换突变使用众所周知的方法而失活，所述方法例如位点定向诱变、PCR介导的诱变和全基因合成，以及本领域已知的其它方法。在例示性实施方案中，融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白衍生自其中全部核酸酶结构域已经被失活或缺失的Cas9蛋白。
(b)效应子结构域
融合蛋白也包含效应子结构域。效应子结构域可以是剪切结构域、表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录抑制子结构域。效应子结构域可以定位于融合蛋白的N-末端、C-末端或内部位置。
(i)剪切结构域
在一些实施方案中，效应子结构域是剪切结构域。本文使用的“剪切结构域”是指剪切DNA的结构域。剪切结构域自任何核酸内切酶或核酸外切酶获得。可自其衍生剪切结构域的核酸内切酶的非限制性实例包括但不限于限制核酸内切酶和归巢核酸内切酶。见，例如，New England Biolabs Catalog或Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388。剪切DNA的另外的酶是已知的(例如，S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸内切酶)。也参见Linn等人(eds.)Nucleases,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1993。可将这些酶(或其功能片段)中的一种或多种用作剪切结构域的来源。
在一些实施方案中，剪切结构域可以衍生自类型II-S核酸内切酶。类型II-S核酸内切酶在通常距离识别位点几个碱基对的位点剪切DNA并且，因此具有可分开的识别和剪切结构域。这些酶通常是单体，其短暂地缔合以形成二聚体以剪切在错开的位置上的DNA的每条链。合适的类型II-S核酸内切酶的非限制性实例包括BfiI、BpmI、BsaI、BsgI、BsmBI、BsmI、BspMI、FokI、MboII和SapI。在例示性的实施方案中，融合蛋白的剪切结构域是FokI剪切结构域或其衍生物。
在某些实施方案中，类型II-S剪切可以被修饰以促进两种不同剪切结构域(两种不同剪切结构域的每一种与CRISPR/Cas样蛋白或其片段连接)的二聚化。例如，FokI的剪切结构域可以通过突变某些氨基酸残基而修饰。作为非限制性实例，在FokI剪切结构域的位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538的氨基酸残基是用于修饰的靶。例如，形成专性异源二聚体的FokI的修饰的剪切结构域包括这样的配对，其中第一修饰剪切结构域包含在氨基酸位置490和538的突变和第二修饰剪切结构域包含在氨基酸位置486和499的突变(Miller等人,2007,Nat.Biotechnol,25:778-785；Szczpek等人,2007,Nat.Biotechnol,25:786-793)。例如，在位置490的Glu(E)可被改变为Lys(K)，在位置538的Ile(I)可被改变为在一个结构域(E490K,I538K)的K，在位置486的Gln(Q)可被改变为E，在位置499的I可被改变为在另一剪切结构域(Q486E,I499L)的Leu(L)。在其它实施方案中，修饰的FokI剪切结构域可包括三个氨基酸变化(Doyon等人2011,Nat.Methods,8:74-81)。例如，一个修饰的FokI结构域(其被称为ELD)可包含Q486E、I499L、N496D突变，另一修饰的FokI结构域(其被称为KKR)可包含E490K、I538K、H537R突变。
在例示性的实施方案中，融合蛋白的效应子结构域是FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域。
在其中效应子结构域是剪切结构域且CRISPR/Cas样蛋白衍生自Cas9蛋白的实施方案中，Cas9衍生的蛋白可以如上文所讨论而被修饰使得它的核酸内切酶活性被消除。例如，Cas9衍生的蛋白可以通过突变RuvC和HNH结构域而修饰使得它们不再具有核酸酶活性。
(ii)表观遗传修饰结构域
在其它实施方案中，融合蛋白的效应子结构域可以是表观遗传修饰结构域。一般而言，表观遗传修饰结构域改变组蛋白结构和/或染色体结构，而不改变DNA序列。改变组蛋白和/或染色质结构可导致基因表达的改变。表观遗传修饰的实例包括但不限于组蛋白中赖氨酸残基的乙酰化或甲基化，和DNA中的胞嘧啶残基的甲基化。合适的表观遗传修饰结构域的非限制性实例包括组蛋白乙酰基转移酶结构域、组蛋白脱乙酰基酶结构域、组蛋白甲基转移酶结构域、组蛋白脱甲基酶结构域、DNA甲基转移酶结构域和DNA脱甲基酶结构域。
在其中效应子结构域是组蛋白乙酰基转移酶(HAT)结构域的实施方案中，HAT结构域可以自EP300(即，E1A结合蛋白p300)、CREBBP(即，CREB结合蛋白)、CDY1、CDY2、CDYL1、CLOCK、ELP3、ESA1、GCN5(KAT2A)、HAT1、KAT2B、KAT5、MYST1、MYST2、MYST3、MYST4、NCOA1、NCOA2、NCOA3、NCOAT、P/CAF、Tip60、TAFII250或TF3C4衍生。在一个这类实施方案中，HAT结构域是p300。
在其中效应子结构域是表观遗传修饰结构域且CRISPR/Cas样蛋白衍生自Cas9蛋白的实施方案中，Cas9衍生的蛋白可以如上文所讨论而被修饰使得它的核酸内切酶活性被消除。例如，Cas9衍生的蛋白可以通过突变RuvC和HNH结构域而修饰使得它们不再具有核酸酶活性。
(iii)转录激活结构域
在其它实施方案中，融合蛋白的效应子结构域可以是转录激活结构域。一般而言，转录激活结构域与转录控制元件和/或转录调控蛋白(即，转录因子，RNA聚合酶等)相互作用以增加和/或激活基因的转录。在一些实施方案中，转录激活结构域可以是而不限于单纯疱疹病毒VP16激活结构域、VP64(其为VP16的四聚衍生物)、NFκB p65激活结构域、p53激活结构域1和2、CREB(cAMP反应元件结合蛋白)激活结构域、E2A激活结构域和NFAT(激活的T-细胞的核因子)激活结构域。在其它实施方案中，转录激活结构域可以是Gal4、Gcn4、MLL、Rtg3、Gln3、Oaf1、Pip2、Pdr1、Pdr3、Pho4和Leu3。转录激活结构域可以是野生型，或它可以是原始转录激活结构域的修饰形式。在一些实施方案中，融合蛋白的效应子结构域是VP16或VP64转录激活结构域。
在其中效应子结构域是转录激活结构域且CRISPR/Cas样蛋白衍生自Cas9蛋白的实施方案中，Cas9衍生的蛋白可以如本文讨论而修饰使得它的核酸内切酶活性被消除。例如，Cas9衍生的蛋白可以是通过突变RuvC和HNH结构域而修饰使得它们不再具有核酸酶活性。
(iv)转录抑制子结构域
在仍其它的实施方案中，融合蛋白的效应子结构域可以是转录抑制子结构域。一般而言，转录抑制子结构域与转录控制元件和/或转录调控蛋白(即，转录因子、RNA聚合酶等)相互作用以减少和/或终止基因的转录。合适的转录抑制子结构域的非限制性实例包括可诱导的cAMP早期抑制子(ICER)结构域、Kruppel相关的盒A(KRAB-A)抑制子结构域、YY1富含甘氨酸的抑制子结构域,Sp1-样抑制子、E(spl)抑制子、IκB抑制子和MeCP2。
在其中效应子结构域是转录抑制子结构域且CRISPR/Cas样蛋白衍生自Cas9蛋白的实施方案中，Cas9衍生的蛋白可以如本文讨论而修饰使得它的核酸内切酶活性被消除。例如，cas9可以通过突变RuvC和HNH结构域而修饰使得它们不具有核酸酶活性。
(c)另外的结构域
在一些实施方案中，融合蛋白进一步包含至少一个另外的结构域。合适的另外的结构域的非限制性实例包括核定位信号、细胞穿透或易位结构域和标志物结构域。合适的核定位信号、细胞穿透结构域和标志物结构域的非限制性实例展示于上面的部分(I)中。
(d)融合蛋白二聚体
在其中融合蛋白的效应子结构域是剪切结构域的实施方案中，可以形成包含至少一种融合蛋白的二聚体。二聚体可以是同源二聚体或异源二聚体。在一些实施方案中，异源二聚体包含两种不同的融合蛋白。在其它实施方案中，异源二聚体包含一种融合蛋白和一种另外的蛋白。
在一些实施方案中，二聚物是同源二聚体，其中两个融合蛋白单体关于一级氨基酸序列是相同的。在其中二聚体是同源二聚体的一个实施方案中，Cas9衍生的蛋白经修饰使得它们的核酸内切酶活性被消除，即，使得它们不具有功能性核酸酶结构域。在其中Cas9衍生的蛋白经修饰使得它们的核酸内切酶活性被消除的某些实施方案中，各个融合蛋白单体包含相同的Cas9样蛋白和相同的剪切结构域。剪切结构域可以是任何剪切结构域，例如本文提供的任一例示性剪切结构域。在一个具体实施方案中，剪切结构域是FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域。在这类实施方案中，特异性指导RNA将融合蛋白单体定向至不同但紧密毗连的位点使得在二聚体形成时，两个单体的核酸酶结构域将在靶DNA中产生双链断裂。
在其它实施方案中，二聚体是两种不同融合蛋白的异源二聚体。例如，各融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白可以衍生自不同的CRISPR/Cas蛋白或衍生自来自不同细菌种类的直向同源CRISPR/Cas蛋白。例如，每种融合蛋白可包含Cas9-样蛋白，所述Cas9-样蛋白自不同细菌种类衍生。在一些实施方案中，
各融合蛋白会识别不同靶位点(即，由原间隔基和/或PAM序列限定)。例如，指导RNA可以将异源二聚体放到不同但紧密毗连的位点使得它们的核酸酶结构域在靶DNA中产生有效的双链断裂。异源二聚体也可具有具备切口活性的修饰的Cas9蛋白使得切口位置不同。
备选地，异源二聚体的两种融合蛋白可具有不同效应子结构域。在其中效应子结构域是剪切结构域的实施方案中，各融合蛋白可以含有不同的修饰的剪切结构域。例如，各融合蛋白可以含有不同的修饰的FokI剪切结构域，如在上面的部分(II)(b)(i)中详细描述。在这些实施方案中，Cas-9蛋白可以经修饰使得它们的核酸内切酶活性被消除。
本领域技术人员应该理解的是，形成异源二聚体的两种融合蛋白可以在CRISPR/Cas样蛋白结构域和效应子结构域二方面都不同。
在以上描述的实施方案的任一个中，同源二聚体或异源二聚体可以包含选自如上面详述的核定位信号(NLSs)、细胞穿透、易位结构域和标志物结构域的至少一个另外的结构域。
在以上描述的实施方案的任一个中，Cas9衍生的蛋白之一或二者可以被修饰使得它的核酸内切酶活性被消除或修饰。
在仍备选的实施方案中，异源二聚体包含一种融合蛋白和一种另外的蛋白。例如，另外的蛋白可以是核酸酶。在一个实施方案中，核酸酶是锌指核酸酶。锌指核酸酶包含锌指DNA结合结构域和剪切结构域。锌指识别并结合三个(3)核苷酸。锌指DNA结合结构域可包含从约三个锌指至约七个锌指。锌指DNA结合结构域可以衍生自天然存在的蛋白或它可以是工程化的。参见，例如，Beerli等人(2002)Nat.Biotechnol.20:135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等人(2001)Nat.Biotechnol.19:656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；Zhang等人(2000)J.Biol.Chem.275(43):33850-33860；Doyon等人(2008)Nat.Biotechnol.26:702-708；和Santiago等人(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:5809-5814。锌指核酸酶的剪切结构域可以是上面部分(II)(b)(i)中详述的任何剪切结构域。在例示性的实施方案中，锌指核酸酶的剪切结构域是FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域。所述锌指核酸酶会与包含FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域的融合蛋白二聚化。
在一些实施方案中，锌指核酸酶可包含至少一个选自上面详述的核定位信号、细胞穿透或易位结构域的另外的结构域。
在某些实施方案中，上面详述的融合蛋白的任一种或包含至少一种融合蛋白的二聚体可以是包含至少一种指导RNA的蛋白-RNA复合物的一部分。指导RNA与融合蛋白的CRISPR-Cas0样蛋白相互作用以将融合蛋白定向至特定的靶位点，其中指导RNA的5’端与特定的原间隔序列碱基配对。
(III)编码RNA指导的核酸内切酶或融合蛋白的核酸
本公开内容的另一方面分别提供编码在上面部分(I)和(II)中描述的RNA指导的核酸内切酶或融合蛋白的任一种的核酸。核酸可以是RNA或DNA。在一个实施方案中，编码RNA指导的核酸内切酶或融合蛋白的核酸是mRNA。mRNA可以被5'加帽和/或3'多聚腺苷酸化。在另一实施方案中，编码RNA指导的核酸内切酶或融合蛋白的核酸是DNA。DNA可以存在于载体中(参见以下)。
可将编码RNA指导的核酸内切酶或融合蛋白的核酸经密码子最优化用于在目标真核细胞或动物中有效翻译成蛋白。例如，可将密码子最优化用于人、小鼠、大鼠、仓鼠、奶牛、猪、猫、狗、鱼、两栖动物、植物、酵母、昆虫等(参见在www.kazusa.or.jp/codon/的密码子使用数据库)中的表达。用于密码子最优化的程序作为免费软件是可得的(例如，在genomes.urv.es/OPTIMIZER的OPTIMIZER；在www.genscript.com/codon_opt.html的来自GenScript的OptimumGeneTM)。市售密码子最优化程序也是可得的。
在一些实施方案中，编码RNA指导的核酸内切酶或融合蛋白的DNA可以与至少一个启动子控制序列可操作性地连接。在一些重复中，DNA编码序列可以与启动子控制序列可操作性地连接用于在目标真核细胞或动物中表达。启动子控制序列可以是组成型的、受调控的或组织特异性的。合适的组成型的启动子控制序列包括但不限于巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、猿猴病毒(SV40)启动子、腺病毒主要晚期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、延长因子(ED1)-α启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、其片段或以上任一种的组合。合适的受调控的启动子控制序列的实例包括但不限于被热激、金属、类固醇、抗生素或醇调控的那些。组织特异性启动子的非限制性实例包括B29启动子、CD14启动子、CD43启动子、CD45启动子、CD68启动子、结蛋白启动子、弹性蛋白酶-1启动子、内皮糖蛋白启动子、纤连蛋白启动子、Flt-1启动子、GFAP启动子、GPIIb启动子、ICAM-2启动子、INF-β启动子、Mb启动子、NphsI启动子、OG-2启动子、SP-B启动子、SYN1启动子和WASP启动子。启动子序列可以是野生型或它可经修饰用于更高效或有效表达。在一个例示性的实施方案中，可将编码DNA与CMV启动子可操作性地连接用于在哺乳动物细胞中的组成型表达。
在某些实施方案中，可将编码RNA指导的核酸内切酶或融合蛋白的序列与被用于体外mRNA合成的噬菌体RNA聚合酶识别的启动子序列可操作性地连接。在这类实施方案中，可将体外转录的RNA纯化用于下面部分(IV)和(V)中详述的方法。例如，启动子序列可以是T7、T3或SP6启动子序列或T7、T3或SP6启动子序列的变体。在例示性实施方案中，将编码融合蛋白的DNA与T7启动子可操作性地连接用于使用T7RNA聚合酶的体外mRNA合成。
在替代实施方案中，可将编码RNA指导的核酸内切酶或融合蛋白的序列与启动子序列可操作性地连接用于RNA指导的核酸内切酶或融合蛋白在细菌或真核细胞中的体外表达。在这类实施方案中，可将表达的蛋白纯化用于下面部分(IV)和(V)中详述的方法。合适的细菌启动子包括但不限于T7启动子、lac操纵子启动子、trp启动子、其变体和其组合。例示性的细菌启动子是tac，其为trp和lac启动子的杂合物。合适的真核启动子的非限制性实例在下面列出。
在另外的方面，编码RNA指导的核酸内切酶或融合蛋白的DNA也可与多聚腺苷酸化信号(例如，SV40polyA信号、牛生长激素(BGH)polyA信号等)和/或至少一个转录终止序列连接。此外，编码RNA指导的核酸内切酶或融合蛋白的序列也可与在上面的部分(I)中详述的编码至少一个核定位信号、至少一个细胞穿透结构域和/或至少一个标志物结构域的序列连接。
在不同实施方案中，编码RNA指导的核酸内切酶或融合蛋白的DNA可存在于载体中。合适的载体包括质粒载体、噬菌粒、黏粒、人工/小-染色体、转座子和病毒载体(例如，慢病毒载体、腺伴随病毒载体等)。在一个实施方案中，编码RNA指导的核酸内切酶或融合蛋白的DNA存在于质粒载体中。合适的质粒载体的非限制性实例包括pUC、pBR322、pET、pBluescript和其变体。载体可包含另外的表达控制序列(例如，增强子序列、Kozak序列、多聚腺苷酸化序列、转录终止序列等)、选择标记序列(例如，抗生素抗性基因)、复制起点等。另外的信息可以在以下找到：“Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学当前实验设计)"Ausubel等人,John Wiley&Sons,纽约,2003或"Molecular Cloning:ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)"Sambrook和Russell,Cold Spring HarborPress,Cold SpringHarbor,NY,第三版,2001。
在一些实施方案中，包含编码RNA指导的核酸内切酶或融合蛋白的序列的表达载体可进一步包括编码指导RNA的序列。编码指导RNA的序列通常与至少一个转录控制序列可操作性地连接用于在目的细胞或胚胎中表达该指导RNA。例如，可将编码指导RNA的DNA与被RNA聚合酶III(Pol III)识别的启动子序列可操作性地连接。合适的Pol III启动子的实例包括但不限于哺乳动物U6、U3、H1和7SLRNA启动子。
(IV)使用RNA指导的核酸内切酶修饰染色体序列的方法
本公开内容的另一方面包括在真核细胞或胚胎中修饰染色体序列的方法。所述方法包括向真核细胞或胚胎引入：(i)至少一种包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶或编码至少一种包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶的核酸、(ii)至少一种指导RNA或编码至少一种指导RNA的DNA和任选(iii)至少一种包含供体序列的供体多核苷酸。所述方法进一步包括培养细胞或胚胎使得各指导RNA将RNA指导的核酸内切酶定向至染色体序列中的靶位点，其中RNA指导的核酸内切酶将双链断裂引入靶位点，并且双链断裂通过DNA修复过程修复使得染色体序列被修饰。
在一些实施方案中，该方法可包括将一种RNA指导的核酸内切酶(或编码核酸)和一种指导RNA(或编码DNA)引入细胞或胚胎，其中所述RNA指导的核酸内切酶将一个双链断裂引入靶染色体序列。在其中不存在任选供体多核苷酸的实施方案中，染色体序列中的双链断裂可通过非同源末端连接(NHEJ)修复过程修复。因为NHEJ是易错的，在断裂的修复期间可发生至少一个核苷酸的缺失、至少一个核苷酸的插入、至少一个核苷酸的置换或其组合。因此，靶染色体序列可被修饰或失活。例如，单核苷酸改变(SNP)可导致改变的蛋白产物，或编码序列的阅读框移位可失活或“敲除”序列使得不产生该蛋白产物。在其中存在任选供体多核苷酸的实施方案中，供体多核苷酸中的供体序列在修复双链断裂期间可以与靶位点的染色体序列交换或整合入靶位点的染色体序列。例如，在其中供体序列被分别与染色体序列中的靶位点的上游和下游序列具有基本序列同一性的上游和下游序列侧接的实施方案中，供体序列可以在由同源性指导的修复过程所介导的修复期间与位于靶位点的染色体序列交换或整合入位于靶位点的染色体序列。备选地，在其中供体序列被相容的突出端侧接(或者相容的突出端由RNA指导的核酸内切酶原位生成)的实施方案中，供体序列可在修复双链断裂期间通过非同源性修复过程与剪切的染色体序列直接连接。供体序列交换到染色体序列或供体序列整合到染色体序列修饰靶染色体序列或将外源序列引入细胞或胚胎的染色体序列。
在其它实施方案中，所述方法可包括将两种RNA指导的核酸内切酶(或编码核酸)和两种指导RNA(或编码DNA)引入细胞或胚胎，其中所述RNA指导的核酸内切酶将两个双链断裂引入染色体序列。参见图3B。两个断裂可以是在多个碱基对内，几十个碱基配内或可以被数千个碱基对分开。在其中不存在任选供体多核苷酸的实施方案中，生成的双链断裂可通过非同源修复过程修复使得在断裂的修复期间缺失两个剪切位点之间的序列和/或可以发生至少一个核苷酸的缺失、至少一个核苷酸的插入、至少一个核苷酸的置换或其组合。在其中存在任选供体多核苷酸的实施方案中，在供体多核苷酸中的供体序列在通过基于同源性的修复过程(例如，其中供体序列被分别与染色体序列中的靶位点的上游和下游序列具有基本序列同一性的上游和下游序列侧接的实施方案中)或非同源修复过程(例如，在其中供体序列通过相容的突出端侧接的实施方案中)的双链断裂修复期间可以与染色体序列交换或整合入染色体序列。
在仍其它的实施方案中，所述方法可包括将经修饰以剪切双链序列的一条链的一种RNA-指导的核酸内切酶(或编码核酸)和两种指导RNA(或编码DNA)引入细胞或胚胎，其中各指导RNA将RNA指导的核酸内切酶定向至特异性靶位点，在该位点修饰的核酸内切酶剪切该双链染色体序列的一条链(即，切口)，并且其中两个切口是在相对的链上，并且足够靠近而构成双链断裂。参见图3A。在其中不存在任选供体多核苷酸的实施方案中，生成的双链断裂可通过非同源修复过程修复使得在修复断裂期间可发生至少一个核苷酸的缺失、至少一个核苷酸的插入、至少一个核苷酸的置换或其组合。在其中存在任选供体多核苷酸的实施方案中，供体多核苷酸中的供体序列在通过基于同源性的修复过程(例如，其中供体序列被分别与染色体序列中的靶位点的上游和下游序列具有基本序列同一性的上游和下游序列侧接的实施方案中)或非同源修复过程(例如，在其中供体序列通过相容的突出端侧接的实施方案中)的双链断裂的修复期间可以与染色体序列交换或整合入染色体序列。
(a)RNA指导的核酸内切酶
所述方法包括向细胞或胚胎引入至少一种包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶或编码至少一种包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶的核酸。这样的RNA指导的核酸内切酶和编码RNA指导的核酸内切酶的核酸分别在上面部分(I)和(III)中描述。
在一些实施方案中，可将RNA指导的核酸内切酶作为分离的蛋白引入细胞或胚胎。在这些实施方案中，RNA指导的核酸内切酶可进一步包含至少一个细胞穿透结构域，其促进蛋白的细胞摄取。在其它实施方案中，可将RNA指导的核酸内切酶作为mRNA分子引入细胞或胚胎。在仍其它的实施方案中，可将RNA指导的核酸内切酶作为DNA分子引入细胞或胚胎。一般而言，将编码融合蛋白的DNA序列与会在目标细胞或胚胎中起作用的启动子序列可操作性地连接。DNA序列可以是线性的，或DNA序列可以是载体的一部分。在仍其它的实施方案中，可将融合蛋白作为包含融合蛋白和指导RNA的RNA-蛋白复合物引入细胞或胚胎。
在备选实施方案中，编码RNA指导的核酸内切酶的DNA可进一步包含编码指导RNA的序列。一般而言，将编码RNA指导的核酸内切酶的各序列和指导RNA可操作性地连接到合适的启动子控制序列，其允许在细胞或胚胎中分别表达RNA指导的核酸内切酶和指导RNA。编码RNA指导的核酸内切酶和指导RNA的DNA序列可进一步包括另外的表达控制、调控和/或加工序列。编码RNA指导的核酸内切酶和指导RNA的DNA序列可以为线性的或可以是载体的一部分。
(b)指导RNA
所述方法也包括向细胞或胚胎引入至少一种指导RNA或编码至少一种指导RNA的DNA。指导RNA与RNA指导的核酸内切酶相互作用以将核酸内切酶定向至特定的靶位点，在该位点指导RNA的5’端与在染色体序列中的特异性原间隔序列碱基配对。
各指导RNA包含三个区域：在与染色体序列中的靶位点互补的5’端的第一个区域、形成茎环结构的第二内部区域和基本上保持单链的第三3’区域。每一种指导RNA的第一区域不同使得每一种指导RNA指导融合蛋白至特异性靶位点。每一个指导RNA的第二和第三区域在全部指导RNA中可以相同。
指导RNA的第一区域与在染色体序列中的靶位点的序列(即，原间隔序列)互补使得指导RNA的第一区域可与靶位点碱基配对。在不同实施方案中，指导RNA的第一区域可包含约10个核苷酸至超过约25个核苷酸。例如，指导RNA的第一区域和染色体序列中的靶位点之间的碱基配对的区域长度可以为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25个或超过25个核苷酸。在例示性实施方案中，指导RNA的第一区域长度是约19、20或21个核苷酸。
指导RNA也包含形成二级结构的第二区域。在一些实施方案中，二级结构包含茎(或发夹)和环。环和茎的长度可变。例如，环长度可在约3-约10个核苷酸的范围内，茎长度可在约6-约20个核苷酸的范围内。茎可包含一个或多个1-约10个核苷酸的凸起。因此，第二区域的总体长度可以在约16-约60个核苷酸的范围内。在例示性实施方案中，环长度是约4个核苷酸和茎包含约12个碱基对。
指导RNA也包含在3’端的基本上保持单链的第三区域。因此，第三区域不具有与目标细胞中任何染色体序列的互补性并且不具有与指导RNA的余下部分的互补性。第三区域的长度可变化。一般而言，第三区域长度超过约4个核苷酸。例如，第三区域的长度可以在约5-约60个核苷酸的长度范围内。
指导RNA的第二和第三区域(也称为通用或支架区域)的组合长度可以在约30-约120个核苷酸的长度范围内。在一个方面，指导RNA的第二和第三区域的组合长度在约70-约100个核苷酸长度的范围内。
在一些实施方案中，指导RNA包括包含全部三个区域的单分子。在其它实施方案中，指导RNA可包括两个分开的分子。第一RNA分子可包含指导RNA的第一区域和指导RNA的第二区域的“茎”的一半。第二RNA分子可包含指导RNA的第二区域的“茎”的另一半和指导RNA的第三区域。因此，在此实施方案中，第一和第二RNA分子各包含相互互补的核苷酸序列。例如，在一个实施方案中，第一和第二RNA分子各自包含与另一序列碱基配对的序列(约6-约20个核苷酸)以形成功能性指导RNA。
在一些实施方案中，可将指导RNA作为RNA分子引入细胞或胚胎。RNA分子可在体外转录。备选地，RNA分子可以是化学合成的。
在其它实施方案中，可将指导RNA作为DNA分子引入细胞或胚胎。在这种情况下，可将编码指导RNA的DNA与启动子控制序列可操作性地连接用于在目标细胞或胚胎中表达指导RNA。例如，可将RNA编码序列与被RNA聚合酶III(Pol III)识别的启动子序列可操作性地连接。合适的Pol III启动子的实例包括但不限于哺乳动物的U6或H1启动子。在例示性的实施方案中，将RNA编码序列与小鼠或人U6启动子连接。在其它例示性的实施方案中，将RNA编码序列与小鼠或人H1启动子连接。
编码指导RNA的DNA分子可以是线性的或环形的。在一些实施方案中，编码指导RNA的DNA序列可以是载体的一部分。合适的载体包括质粒载体、噬菌粒、黏粒、人工/小-染色体、转座子和病毒载体。在例示性实施方案中，编码RNA指导的核酸内切酶的DNA存在于质粒载体中。合适的质粒载体的非限制性实例包括pUC、pBR322、pET、pBluescript和其变体。载体可包括另外的表达控制序列(例如，增强子序列、Kozak序列、多腺苷酸化序列、转录终止序列等)、选择标记序列(例如，抗生素抗性基因)、复制起点等等。
在其中将RNA指导的核酸内切酶和指导RNA二者作为DNA分子引入细胞的实施方案中，每一种都可以是不同的分子(例如，含有融合蛋白编码序列的一种载体和含有指导RNA编码序列的第二载体)的一部分或二者都可以是相同分子(例如，一种包含融合蛋白和指导RNA二者的编码(和调控)序列的载体)的一部分。
(c)靶位点
将与指导RNA连接的RNA指导的核酸内切酶定向至在染色体序列中的靶位点，其中RNA指导的核酸内切酶将双链断裂引入染色体序列。除了紧接着(下游)共有序列之外，靶位点不具有序列限制。此共有序列也被称为原间隔毗连基序(PAM)。PAM的实例包括但不限于NGG、NGGNG和NNAGAAW(其中N被限定为任何核苷酸和W被限定为A或T)。如在上面的部分(IV)(b)中详述，指导RNA的第一区域(在5’端)与靶序列的原间隔基互补。通常，指导RNA的第一区域长度是约19-21个核苷酸。因此，在某些方面，染色体序列中靶位点的序列是5’-N19-21-NGG-3’。PAM呈斜体。
靶位点可以在基因的编码区中、在基因的内含子中、在基因的控制区中、在基因之间的非编码区中等。基因可以是蛋白编码基因或RNA编码基因。基因可以是任何目标基因。
(d)任选供体多核苷酸
在一些实施方案中，所述方法进一步包括将至少一种供体多核苷酸引入胚胎。供体多核苷酸包含至少一个供体序列。在一些方面，供体多核苷酸的供体序列与内源或天然染色体序列相对应。例如，供体序列可与在靶位点或靶位点附近的染色体序列的一部分基本相同，但其包含至少一个核苷酸改变。因此，供体序列可包含在靶位点的野生型序列的修饰形式，使得当与天然序列整合或交换时，在靶染色体位置的序列包含至少一个核苷酸变化。例如，变化可以是一个或多个核苷酸的插入、一个或多个核苷酸的缺失、一个或多个核苷酸的置换或其组合。作为修饰序列整合的结果，细胞或胚胎/动物可产生相对于靶染色体序列的修饰的基因产物。
在其它方面，供体多核苷酸的供体序列与外源序列相对应。本文使用的“外源”序列是指对于细胞或胚胎而言非天然的序列，或其在细胞或胚胎的基因组中的天然位置是在不同位置的序列。例如，外源序列可包含蛋白编码序列，其可以与外源的启动子控制序列可操作性地连接使得，当整合入基因组时，细胞或胚胎/动物能够表达由整合的序列编码的蛋白。备选地，可将外源序列整合入染色体序列使得它的表达由内源启动子控制序列调控。在其它重复中，外源序列可以是转录控制序列、另一表达控制序列、RNA编码序列等。将外源序列整合入染色体序列被称为“敲入”。
本领域技术人员可以理解的是，供体序列的长度可以并且会变化。例如，供体序列长度可以从几个核苷酸变化至几百个核苷酸至几十万个核苷酸。
包含上游和下游序列的供体多核苷酸。在一些实施方案中，供体多核苷酸中的供体序列被上游序列和下游序列侧接，其分别与位于染色体序列中的靶位点的上游和下游的序列具有基本序列同一性。因为这些序列类似性，供体多核苷酸的上游和下游序列允许供体多核苷酸和靶染色体序列之间的同源重组，使得供体序列可以被整合入染色体序列(或与染色体序列交换)。
本文使用的上游序列是指与靶位点上游的染色体序列具有基本序列同一性的核酸序列。类似地，下游序列是指与靶位点下游的染色体序列具有基本序列同一性的核酸序列。本文使用的短语"基本序列同一性"是指具有至少约75％序列同一性的序列。因此，供体多核苷酸中的上游和下游序列可与靶位点上游或下游的序列具有约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在例示性实施方案中，供体多核苷酸中的上游和下游序列可具有与靶位点的上游或下游的染色体序列约95％或100％序列同一性。在一个实施方案中，上游序列与紧接位于靶位点上游(即，与靶位点毗连)的染色体序列具有基本序列同一性。在其它实施方案中，上游序列与位于自靶位点上游约一百(100)个核苷酸内的染色体序列具有基本序列同一性。因此，例如，上游序列可与位于自靶位点上游约1-约20、约21-约40、约41-约60、约61-约80或约81-约100个核苷酸的染色体序列具有基本序列同一性。在一个实施方案中，下游序列与紧接位于靶位点下游(即，与靶位点毗连)的染色体序列具有基本序列同一性。在其它实施方案中，下游序列与位于自靶位点下游约一百(100)个核苷酸内的染色体序列具有基本序列同一性。因此，例如，下游序列可以与位于自靶位点下游约1-约20、约21-约40、约41-约60、约61-约80或约81-约100个核苷酸的染色体序列具有基本序列同一性。
各上游或下游序列长度可在约20个核苷酸-约5000个核苷酸的范围内。在一些实施方案中，上游和下游序列可包含约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4200、4400、4600、4800或5000个核苷酸。在例示性的实施方案中，上游和下游序列长度可以在约50-约1500个核苷酸的范围内。
包含具有与靶染色体序列的序列相似性的上游和下游序列的供体多核苷酸可以是线性或环形的。在其中供体多核苷酸是环形的实施方案中，它可以是载体的一部分。例如，载体可以是质粒载体。
包含靶剪切位点的供体多核苷酸。在其它实施方案中，供体多核苷酸可以另外包含至少一个被RNA指导的核酸内切酶识别的靶剪切位点。加入供体多核苷酸的靶剪切位点可位于供体序列的上游或下游或上游和下游二者。例如，供体序列可以侧接靶剪切位点，使得当被RNA指导的核酸内切酶剪切时，供体序列与突出端侧接，所述突出端与被RNA指导的核酸内切酶剪切时生成的在染色体序列中那些突出端相容。因此，供体序列可以在通过非同源修复过程修复双链断裂期间与剪切的染色体序列连接。通常，包含靶剪切位点的供体多核苷酸会是环形的(例如，可以为质粒载体的一部分)。
包含具有任选突出端的短供体序列的供体多核苷酸。在仍备选的实施方案中，供体多核苷酸可以是包含短供体序列的线性分子，所述线性分子具有与由RNA指导的核酸内切酶生成的突出端相容的任选短突出端。在这类实施方案中，供体序列可以在修复双链断裂期间直接与剪切的染色体序列连接。在一些例子中，供体序列可以是小于约1,000、小于约500、小于约250或小于约100个核苷酸。在某些情况下，供体多核苷酸可以是包含具有平端的短供体序列的线性分子。在其它重复中，供体多核苷酸可以是包含具有5’和/或3’突出端的短供体序列的线性分子。突出端可包含1、2、3、4或5个核苷酸。
通常，供体多核苷酸是DNA。DNA可以是单链的或双链的和/或线性的或环形的。供体多核苷酸可以是DNA质粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、病毒载体、线性的DNA段、PCR片段、裸核酸或与递送载体如脂质体或泊洛沙姆(poloxamer)复合的核酸。在某些实施方案中，包含供体序列的供体多核苷酸可以是质粒载体的一部分。在这些任一种情况下，包含供体序列的供体多核苷酸可进一步包含至少一种另外的序列。
(e)引入细胞或胚胎
RNA-靶向的核酸内切酶(或编码核酸)，指导RNA(或编码DNA)，和任选供体多核苷酸可通过各种方式引入细胞或胚胎。在一些实施方案中，转染细胞或胚胎。合适的转染方法包括磷酸钙-介导的转染、核转染(或电穿孔)、阳离子聚合物转染(例如，DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺)、病毒转导、病毒颗粒(virosome)转染、病毒粒子(virion)转染、脂质体转染、阳离子脂质体转染、免疫脂质体转染、非脂质体型脂质转染、树形分子(dendrimer)转染、热激转染、磁转染、脂质转染、基因枪递送、穿刺转染(impalefection)、声孔效应、光学转染和专利品(proprietary agent)增强的核酸摄取。转染方法是本领域周知的(参见，例如，"CurrentProtocols in Molecular Biology(分子生物学当前实验设计)"Ausubel等人,JohnWiley&Sons,New York,2003或"Molecular Cloning:ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)"Sambrook和Russell,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,第三版,2001)。在其它实施方案中，将分子通过显微注射引入细胞或胚胎。通常，胚胎是目标物种的受精的单细胞期胚胎。例如，可将分子注射入单细胞胚胎的前核。
可将RNA-靶向的核酸内切酶(或编码核酸)、指导RNA(或编码指导RNA的DNA)和任选供体多核苷酸同时地或贯序地引入细胞或胚胎。RNA-靶向的核酸内切酶(或编码核酸)相对于指导RNA(或编码DNA)的比率通常为约化学计量比，使得它们可以形成RNA-蛋白复合物。在一个实施方案中，将编码RNA-靶向的核酸内切酶的DNA和编码指导RNA的DNA在质粒载体内一起递送。
(f)培养细胞或胚胎
所述方法进一步包含将细胞或胚胎维持在合适的条件下，使得指导RNA将RNA指导的核酸内切酶定向至在染色体序列中的靶位点，和RNA指导的核酸内切酶将至少一个双链断裂引入染色体序列。双链断裂可通过DNA修复过程修复使得染色体序列通过至少一个核苷酸的缺失,至少一个核苷酸的插入,至少一个核苷酸的置换或其组合而修饰。
在其中没有供体多核苷酸被引入细胞或胚胎的实施方案中，双链断裂可以通过非同源末端连接(NHEJ)修复过程而修复。因为NHEJ是易错的，因此在断裂修复期间可发生至少一个核苷酸的缺失、至少一个核苷酸的插入、至少一个核苷酸的置换或其组合。因此，在染色体序列的序列可被修饰使得编码区阅读框可被移位并且染色体序列被失活或“敲除”。失活的蛋白编码染色体序列不产生由野生型染色体序列编码的蛋白。
在其中将包含上游和下游序列的供体多核苷酸引入细胞或胚胎的实施方案中，双链断裂可以通过同源性定向的修复(HDR)过程修复使得供体序列被整合入染色体序列。因此，外源序列可被整合入细胞或胚胎的基因组，或可通过用修饰的序列替换野生型染色体序列而修饰靶染色体序列。
在其中将包含靶剪切位点的供体多核苷酸引入细胞或胚胎的实施方案中，RNA指导的核酸内切酶可剪切靶染色体序列和供体多核苷酸二者。可将线性化的供体多核苷酸通过NHEJ过程通过将供体多核苷酸和剪切的染色体序列之间连接而整合入双链断裂位点的染色体序列。
在其中将包含短供体序列的线性的供体多核苷酸引入细胞或胚胎的实施方案中，短供体序列可通过NHEJ过程整合入双链断裂位点的染色体序列。整合可通过将短供体序列和在双链断裂位点的染色体序列之间的平端连接而进行。或者，整合可以通过将侧接突出端的短供体序列之间的粘性末端(即，具有5’或3’突出端)连接而进行，所述突出端与由RNA-靶向核酸内切酶在剪切的染色体序列中生成的那些突出端是相容的。
一般而言，将细胞维持在适合于细胞生长和/或维持的条件下。合适的细胞培养条件是本领域周知的，并描述于，例如，Santiago等人(2008)PNAS 105:5809-5814；Moehle等人(2007)PNAS 104:3055-3060；Urnov等人(2005)Nature 435:646-651；和Lombardo等人(2007)Nat.Biotechnology 25:1298-1306。本领域技术人员理解的是，用于培养细胞的方法是本领域已知的并且可以和会根据细胞类型而改变。在全部情况下，可使用常规的最优化以确定用于特定细胞种类的最好的技术。
胚胎可在体外(例如，在细胞培养中)培养。通常，如果必要，将胚胎于合适的温度下和在合适的培养基中用必要的O2/CO2比率培养以允许RNA核酸内切酶和指导RNA的表达。培养基的合适的非限制性实例包括M2、M16、KSOM、BMOC和HTF培养基。技术人员会理解的是，培养条件可以并会根据胚胎的种类而改变。在全部情况下，可使用常规的最优化以确定用于特定胚胎种类的最好的培养条件。在一些情况下，细胞系可以衍生自体外培养的胚胎(例如，胚胎干细胞系)。
或者，可通过将胚胎转移至雌性宿主的子宫在体内培养胚胎。通常而言，雌性宿主来自与胚胎相同或类似的种类。优选地，雌性宿主是假孕的。制备假孕的雌性宿主的方法是本领域已知的。此外，将胚胎转移入雌性宿主的方法是本领域已知的。在体内培养胚胎允许胚胎发育并可以产生由胚胎衍生的动物的活产。这类动物在身体的每一个细胞中包含修饰的染色体序列。
(g)细胞和胚胎类型
多种真核细胞和胚胎适合用于该方法。例如，细胞可以是人细胞、非人哺乳动物细胞、非哺乳动物的脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞或单细胞真核生物。一般而言，胚胎是非人哺乳动物胚胎。在特定实施方案中，胚胎可以是单细胞非人哺乳动物胚胎。包括单细胞胚胎的例示性的哺乳动物的胚胎包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、啮齿动物、兔、猫、犬、羊、猪、牛、马和灵长类动物胚胎。在仍其它的实施方案中，细胞可以是干细胞。合适的干细胞包括但不限于胚胎干细胞、ES样干细胞、胎儿干细胞、成体干细胞、多能性干细胞、诱导的多能性干细胞、多能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞等等。在例示性的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。
合适的哺乳动物细胞的非限制性实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞；小鼠骨髓瘤NS0细胞、小鼠胚胎成纤维细胞3T3细胞(NIH3T3)、小鼠B淋巴瘤A20细胞；小鼠黑色素瘤B16细胞；小鼠成肌细胞C2C12细胞；小鼠骨髓瘤SP2/0细胞；小鼠胚胎间充质细胞C3H-10T1/2细胞；小鼠癌CT26细胞、小鼠前列腺DuCuP细胞、小鼠乳腺EMT6细胞；小鼠肝癌Hepa1c1c7细胞；小鼠骨髓瘤J5582细胞；小鼠上皮MTD-1A细胞；小鼠心肌MyEnd细胞；小鼠肾RenCa细胞；小鼠胰RIN-5F细胞；小鼠黑色素瘤X64细胞；小鼠淋巴瘤YAC-1细胞；大鼠成胶质细胞瘤9L细胞；大鼠B淋巴瘤RBL细胞；大鼠成神经细胞瘤B35细胞；大鼠肝癌细胞(HTC)；牛鼠(buffalo rat)肝BRL3A细胞；犬肾细胞(MDCK)；犬乳腺(CMT)细胞；大鼠骨肉瘤D17细胞；大鼠单核细胞/巨噬细胞DH82细胞；猴肾SV-40转化成纤维细胞(COS7)细胞；猴肾CVI-76细胞；非洲绿猴肾(VERO-76)细胞；人胚胎肾细胞(HEK293，HEK293T)；人颈癌细胞(HELA)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；人U2-OS骨肉瘤细胞、人A549细胞、人A-431细胞和人K562细胞。哺乳动物细胞系的详尽的列表可在美国模式培养物保藏所目录(ATCC,Mamassas,VA)中找到。
(V)使用融合蛋白以修饰染色体序列或调控染色体序列的表达的方法
本公开内容的另一方面包括一种用于在细胞或胚胎中修饰染色体序列或调控染色体序列表达的方法。所述方法包括向细胞或胚胎中引入(a)至少一种融合蛋白或编码至少一种融合蛋白的核酸，其中所述融合蛋白包含CRISPR/Cas样蛋白或其片段和效应子结构域，和(b)至少一种指导RNA或编码该指导RNA的DNA，其中所述指导RNA指导该融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白至染色体序列中的靶位点，并且该融合蛋白的效应子结构域修饰染色体序列或调控染色体序列的表达。
包含CRISPR/Cas样蛋白或其片段和效应子结构域的融合蛋白在上面的部分(II)中详述。一般而言，本文公开的融合蛋白进一步包含至少一个核定位信号。编码融合蛋白的核酸在上面的部分(III)中详述。在一些实施方案中，融合蛋白可以作为分离的蛋白(其可以进一步包含细胞穿透结构域)引入细胞或胚胎。此外，分离的融合蛋白可以是包含指导RNA的蛋白-RNA复合物的一部分。在其它实施方案中，可将融合蛋白作为RNA分子(其可以被加帽和/或多聚腺苷酸化)引入细胞或胚胎。在仍其它的实施方案中，可将融合蛋白作为DNA分子引入细胞或胚胎。例如，可将融合蛋白和指导RNA作为离散的DNA分子或相同的DNA分子的一部分引入细胞或胚胎。这类DNA分子可以是质粒载体。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向细胞或胚胎引入至少一种锌指核酸酶。锌指核酸酶在上面的部分(II)(d)中描述。在仍其它的实施方案中，所述方法进一步包括向细胞或胚胎引入至少一种供体多核苷酸。供体多核苷酸在上面的部分(IV)(d)中详述。用于将分子引入细胞或胚胎的方式，和用于培养细胞或胚胎的方式分别在上面的部分(IV)(e)和(IV)(f)中描述。合适的细胞和胚胎在上面的部分(IV)(g)中描述。
在其中融合蛋白的效应子结构域是剪切结构域(例如，FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域)的某些实施方案中，所述方法可包括向细胞或胚胎引入一种融合蛋白(或编码一种融合蛋白的核酸)和两种指导RNA(或编码两种指导RNA的DNA)。所述两种指导RNA将融合蛋白定向至染色体序列中的两个不同靶位点，其中融合蛋白二聚化(例如，形成同源二聚体)使得所述两个剪切结构域可将双链断裂引入染色体序列。参见图1A。在其中不存在任选供体多核苷酸的实施方案中，染色体序列中的双链断裂可通过非同源末端连接(NHEJ)修复过程而修复。因为NHEJ是易错的，所以在断裂修复期间可发生至少一个核苷酸的缺失、至少一个核苷酸的插入、至少一个核苷酸的置换或其组合。因此，靶染色体序列可以被修饰或失活。例如，单核苷酸改变(SNP)可产生改变的蛋白产物，或编码序列阅读框的移位可以失活或“敲除”序列使得不产生该蛋白产物。在其中存在任选供体多核苷酸的实施方案中，供体多核苷酸中的供体序列可在双链断裂的修复期间与靶位点的染色体序列置换或整合入靶位点的染色体序列。例如，在其中供体序列被分别与染色体序列中的靶位点的上游和下游序列具有基本序列同一性的上游和下游序列侧接的实施方案中，供体序列在通过同源性指导修复过程介导的修复期间可与靶位点的染色体序列置换或整合入靶位点的染色体序列。或者，在其中供体序列被相容的突出端侧接(或相容的突出端由RNA指导的核酸内切酶原位生成)的实施方案中，供体序列在双链断裂的修复期间可以通过非同源修复过程与剪切的染色体序列直接连接。供体序列至染色体序列的置换或整合修饰靶染色体序列或将外源序列引入细胞或胚胎的染色体序列。
在其中融合蛋白的效应子结构域是剪切结构域(例如，FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域)的其它实施方案中，所述方法可以包括向细胞或胚胎中引入两种不同的融合蛋白(或编码两种不同的融合蛋白的核酸)和两种指导RNA(或编码两种指导RNA的DNA)。融合蛋白可以如在上面部分(II)中详述而不同。各指导RNA将融合蛋白定向至染色体序列中的具体靶位点，其中所述融合蛋白二聚化(例如，形成异源二聚体)使得两个剪切结构域可将双链断裂引入染色体序列。在其中不存在任选供体多核苷酸的实施方案中，生成的双链断裂可通过非同源修复过程修复，使得在断裂修复期间可发生至少一个核苷酸的缺失、至少一个核苷酸的插入、至少一个核苷酸的置换或其组合。在其中存在任选供体多核苷酸的实施方案中，供体多核苷酸中的供体序列可与在通过基于同源性的修复过程(例如，在其中供体序列被分别与染色体序列中的靶位点的上游和下游序列具有基本序列同一性的上游和下游序列侧接的实施方案中)或非同源修复过程(例如，在其中供体序列被相容的突出端侧接的实施方案中)的双链断裂的修复期间与染色体序列置换或整合入染色体序列。
在其中融合蛋白的效应子结构域是剪切结构域(例如，FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域)的仍其它实施方案中，所述方法可包括向细胞或胚胎引入一种融合蛋白(或编码一种融合蛋白的核酸)，一种指导RNA(或编码一种指导RNA的DNA)和一种锌指核酸酶(或编码锌指核酸酶的核酸)，其中锌指核酸酶包含FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域。指导RNA将融合蛋白定向至具体的染色体序列，并且锌指核酸酶被定向至另一染色体序列，其中所述融合蛋白和锌指核酸酶二聚化使得融合蛋白的剪切结构域和锌指核酸酶的剪切结构域可以将双链断裂引入染色体序列。参见图1B。在其中不存在任选供体多核苷酸的实施方案中，生成的双链断裂可以通过非同源修复过程而修复，使得在断裂的修复期间可以发生至少一个核苷酸的缺失、至少一个核苷酸的插入、至少一个核苷酸的置换或其组合。在其中存在任选供体多核苷酸的实施方案中，供体多核苷酸中的供体序列在通过基于同源性的修复过程(例如，在其中供体序列被分别与染色体序列中的靶位点的上游和下游序列具有基本序列同一性的上游和下游序列侧接的实施方案中)或非同源修复过程(例如，在其中供体序列被相容的突出端侧接的实施方案中)期间可以与染色体序列置换或整合入染色体序列。
在其中融合蛋白的效应子结构域是转录激活结构域或转录抑制子结构域的仍其它实施方案中，所述方法可包括向细胞或胚胎引入一种融合蛋白(或编码一种融合蛋白的核酸)和一种指导RNA(或编码一种指导RNA的DNA)。指导RNA将融合蛋白定向至具体的染色体序列，其中所述转录激活结构域或转录抑制子结构域分别激活或抑制靶染色体序列的表达。参见图2A。
在其中融合蛋白的效应子结构域是表观遗传修饰结构域的备选实施方案中，所述方法可包括向细胞或胚胎引入一种融合蛋白(或编码一种融合蛋白的核酸)和一种指导RNA(或编码一种指导RNA的DNA)。指导RNA将融合蛋白定向至具体的染色体序列，其中表观遗传修饰结构域修饰靶染色体序列的结构。参见图2A。表观遗传修饰包括组蛋白的乙酰化、甲基化和/或核苷酸甲基化。在一些例子中，染色体序列的结构修饰导致染色体序列的表达的变化。
(VI)遗传修饰的细胞和动物
本公开内容包括遗传修饰的细胞、非人胚胎和非人动物，其包含至少一个使用RNA指导的核酸内切酶-介导的或或融合蛋白-介导的过程(例如，使用本文描述的方法)修饰的染色体序列。本公开内容提供细胞，其包含至少一种编码RNA指导的核酸内切酶或靶向至目标染色体序列的融合蛋白或融合蛋白的DNA或RNA分子、至少一种指导RNA，和任选一种或多种供体多核苷酸。本公开内容也提供非人胚胎，其包含至少一种编码RNA指导的核酸内切酶或靶向至目标染色体序列的融合蛋白的DNA或RNA分子，至少一种指导RNA和任选一种或多种供体多核苷酸。
本公开内容提供遗传修饰的非人动物、非人胚胎或动物细胞，其包含至少一个修饰的染色体序列。修饰的染色体序列可以被修饰使得它(1)失活，(2)具有改变的表达，或产生改变的蛋白产物，或(3)包含整合的序列。使用本文描述的方法，将染色体序列用RNA指导的核酸内切酶-介导的或融合蛋白-介导的过程修饰。
如讨论的，本公开内容的一个方面提供其中至少一个染色体序列已经被修饰的遗传修饰的动物。在一个实施方案中，遗传修饰的动物包含至少一个失活的染色体序列。修饰的染色体序列可以被失活使得序列不被转录和/或不产生功能性蛋白产物。因此，包含失活的染色体序列的遗传修饰的动物可以称为"敲除"或"条件性敲除"。失活的染色体序列可以包括缺失突变(即，一个或多个核苷酸的缺失)，插入突变(即，一个或多个核苷酸的插入)或无义突变(即，用单核苷酸置换另一核苷酸使得终止密码子被引入)。作为突变的结果，靶染色体序列被失活并且不产生功能性蛋白。失活的染色体序列包含非内源引入的序列。本文还包括遗传修饰的动物，其中2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个染色体序列被失活。
在另一实施方案中，修饰的染色体序列可以被改变使得它编码变体蛋白产物。例如，包含修饰的染色体序列的遗传修饰的动物可以包含靶点突变或其它修饰使得产生改变的蛋白产物。在一个实施方案中，染色体序列可以被修饰使得至少一个核苷酸被改变并且该表达的蛋白包含一个改变的氨基酸残基(错义突变)。在另一实施方案中，染色体序列可以被修饰以包含超过一个错义突变使得改变超过一个氨基酸。此外，染色体序列可以被修饰以具有3个核苷酸的缺失或插入使得表达的蛋白含有单氨基酸缺失或插入。改变的或变体蛋白与野生型蛋白相比可以具有改变的性质或活性，例如改变的底物特异性、改变的酶活性、改变的动力学速率等。
在另一实施方案中，遗传修饰的动物可以包含至少一个染色体整合的序列。包含整合序列的遗传修饰的动物可以被称为"敲入"或"条件性敲入"。染色体整合的序列可以，例如，编码直向同源蛋白、内源蛋白或两者的组合。在一个实施方案中，编码直向同源蛋白或内源蛋白的序列可以被整合入编码蛋白的染色体序列使得染色体序列失活，但是外源序列表达。在这类情况下，编码直向同源蛋白或内源蛋白的序列可以被可操作性地连接至启动子控制序列。或者，编码直向同源蛋白或内源蛋白的序列可以被整合入染色体序列，而不影响染色体序列的表达。例如，编码蛋白的序列可以被整合入"安全港(safe harbor)"基因座，例如Rosa26基因座、HPRT基因座或AAV基因座。本公开内容也包含遗传修饰的动物，其中2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个序列(包括编码蛋白的序列)被整合入基因组。
染色体整合的编码蛋白的序列可以编码目标蛋白的野生型形式或可以编码包含至少一个修饰的蛋白使得产生改变形式的蛋白。例如，染色体整合的编码涉及疾病或病症的蛋白的序列可以包含至少一个修饰，使得产生的改变形式的蛋白引起相关病症或使得所述相关病症成为可能。或者，染色体整合的编码涉及疾病或病症的蛋白的序列可以包含至少一个修饰使得改变形式的蛋白防止所述相关病症的发展。
在另外的实施方案中，遗传修饰的动物可以是"人源化"动物，其包含至少一个编码功能性人蛋白的染色体整合的序列。功能性人蛋白在遗传修饰的动物中可以不具有对应的直向同源物。或者，由其衍生出遗传修饰的动物的野生型动物可以包括与功能性人蛋白对应的直向同源物。在这种情况下，"人源化"动物中的直向同源序列被失活使得不产生功能性蛋白，并且"人源化"动物包含至少一个染色体整合的编码人蛋白的序列。
在更另一实施方案中，遗传修饰的动物可包含至少一个修饰的编码蛋白的染色体序列使得蛋白的表达模式被改变。例如，控制蛋白表达的调控区域，例如启动子或转录因子结合位点，可以被改变，使得蛋白过量产生，或蛋白的组织特异性或时间性表达被改变，或其组合。或者，蛋白的表达模式可以使用条件性敲除系统改变。条件性敲除系统的非限制性实例包括Cre-lox重组系统。Cre-lox重组系统包括Cre重组酶、位点-特异性DNA重组酶，其可以催化在核酸分子中的特异性位点(lox位点)之间的核酸序列的重组。使用此系统以产生时间性的和组织特异性表达的方法是本领域已知的。一般而言，遗传修饰的动物用侧接染色体序列的lox位点生成。包含lox-侧接的染色体序列的遗传修饰的动物可以随后与表达Cre重组酶的另一遗传修饰的动物杂交。包含lox-侧接的染色体序列和Cre重组酶的子代动物随后产生，并且lox-侧接的染色体序列被重组，这导致编码该蛋白的染色体序列缺失或倒位。Cre重组酶的表达可以被时间性地和条件性地调控以实现时间性和条件性调控的染色体序列的重组。
在这些实施方案的任一个中，本文公开的遗传修饰的动物对于修饰的染色体序列而言可以是杂合的。或者，遗传修饰动物对于修饰的染色体序列而言可以是纯合的。
本文公开的遗传修饰的动物可经杂交以生成包含超过一个修饰的染色体序列的动物或生成对于一个或多个修饰的染色体序列而言是纯合的动物。例如，包含相同修饰的染色体序列的两个动物可经杂交以生成对于修饰的染色体序列而言纯合的动物。或者，具有不同修饰的染色体序列的动物可经杂交以生成包含两种修饰的染色体序列的动物。
例如，包含失活的染色体序列基因“x”的第一动物可以与包含编码人基因“X”蛋白的染色体整合的序列的第二动物杂交以产生包含失活的基因“x”染色体序列和染色体整合的人基因“X”序列二者的"人源化"基因“X”子代。同样，人源化基因“X”动物可以与人源化基因“Y”动物杂交以生成人源化基因X/基因Y子代。本领域技术人员会理解许多组合是有可能的。
在其它实施方案中，包含修饰的染色体序列的动物可经杂交以将修饰的染色体序列和其它遗传背景组合。作为非限制性实例，其它遗传背景可以包括野生型遗传背景、具有缺失突变的遗传背景、具有另一靶整合的遗传背景和具有非靶整合的遗传背景。
本文使用的术语"动物"是指非人动物。动物可以是胚胎、幼体或成体。合适的动物包括脊椎动物例如哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、甲壳类动物和鱼类。合适的哺乳动物的实例包括但不限于啮齿动物、陪伴动物、家畜和灵长类动物。啮齿动物的非限制性实例包括小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠和豚鼠。合适的陪伴动物包括但不限于猫、狗、兔、刺猬和雪貂。家畜的非限制性实例包括马、山羊、绵羊、猪、牛、美洲驼和羊驼。合适的灵长类动物包括但不限于僧帽猴、黑猩猩、狐猴、恒河猴、狨、绢毛猴、蜘蛛猿、松鼠猴和长尾猴(vervetmonkey)。鸟类的非限制性实例包括鸡、火鸡、鸭和鹅。或者，动物可以是无脊椎动物例如昆虫、线虫等等。昆虫的非限制性实例包括果蝇和蚊子。例示性的动物是大鼠。合适的大鼠品系的非限制性实例包括Dahl Salt-Sensitive、Fischer 344、Lewis、Long Evans Hooded、Sprague-Dawley和Wistar。在一个实施方案中，动物不是遗传修饰的小鼠。在对于本发明合适的动物的上文重述的每一种中，动物不包括内源引入的，随机整合的转座子序列。
本公开内容的进一步方面提供包含至少一个修饰的染色体序列的遗传修饰的细胞或细胞系。遗传修饰的细胞或细胞系可以自本文公开的遗传修饰的动物的任一种衍生。或者，染色体序列可以在细胞中如上文所描述(在描述动物中染色体序列修饰的段落中)使用本文描述的方法修饰。本公开内容也包括所述细胞或细胞系的裂解液。
一般而言，细胞是真核细胞。合适的宿主细胞包括真菌或酵母，例如毕赤酵母属(Pichia,Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)；昆虫细胞，例如来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的SF9细胞或来自果蝇(Drosophila melanogaster)的S2细胞；和动物细胞例如小鼠、大鼠、仓鼠、非人灵长类动物或人细胞。例示性的细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是原代细胞。一般而言，可以使用对于双链断裂敏感的任何原代细胞。细胞可以是多种细胞类型，例如，成纤维细胞、成肌细胞、T或B细胞、巨噬细胞、上皮细胞等等。
当使用哺乳动物细胞系时，细胞系可以是任何已建立的细胞系或还没描述过的原代细胞系。细胞系可以是附着的或非附着的，或细胞系可以使用本领域技术人员已知的标准技术，在促进附着的、附着的或器官型生长的条件下生长。合适的哺乳动物细胞和细胞系的非限制性实例在本文的部分(IV)(g)中提供。在仍其它的实施方案中，细胞可以是干细胞。合适的干细胞的非限制性实例在部分(IV)(g)中提供。
本公开内容也提供遗传修饰的非人胚胎，其包含至少一个修饰的染色体序列。染色体序列可以在胚胎中如本文上面所描述(在描述动物中的染色体序列修饰的段落中)使用本文描述的方法来修饰。在一个实施方案中，胚胎是非人受精的目标动物种类的单细胞期胚胎。包括一个细胞胚胎的例示性的哺乳动物胚胎包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、啮齿动物、兔、猫、犬、羊、猪、牛、马和灵长类动物胚胎。
定义
除非另外定义，本文使用的全部技术和科学术语具有此发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献给技术人员提供了在本发明中使用的许多术语的通用定义：Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(微生物和分子生物学字典)(第2版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(科学和技术剑桥字典)(Walker ed.,1988)；The Glossary of Genetics(遗传学词汇表),第5版,R.Rieger等人(eds.),Springer Verlag(1991)；和Hale与Marham,The Harper CollinsDictionary of Biology(生物学的Harper Collins字典)(1991)。本文使用的以下术语具有属于它们的含义，除非另有说明。
当提出本公开内容或其优选实施方案的要素时，冠词“一个”、“一种”、“该”和“所述”意指有一个或多个要素。术语“包含”、“含有”和“具有”意图为包容性的，意指除了列举的要素之外可有另外的要素。
本文使用的术语"内源序列"是指对细胞而言是天然的染色体序列。
本文使用的术语“外源的”是指对于细胞而言是非天然的序列，或其在细胞的基因组中的天然位置是在不同染色体位置的染色体序列。
本文使用的"基因"是指编码基因产物的DNA区域(其包括外显子和内含子)，以及调控该基因产物的产生的全部DNA区域(无论所述调控序列是否与编码和/或转录序列毗连)。因此，基因包括但不必然限定于启动子序列、终止子、翻译调控序列例如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区域。
术语"异源的"是指对于目标细胞而言并非内源或天然的实体。例如，异源的蛋白是指由内源的来源衍生的或最初由内源的来源衍生的蛋白，例如内源引入的核酸序列。在一些例子中，异源的蛋白通常不是由目标细胞产生。
术语“核酸”和“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，呈线性的或环形的构象的和呈单链或双链形式的。用于本公开内容的目的，这些术语不应理解为关于聚合物的长度受限制。术语可以包含天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分(例如，硫代磷酸酯主链)中修饰的核苷酸。一般而言，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即，A的类似物会与T碱基配对。
术语"核苷酸"是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。核苷酸可以是标准核苷酸(即，腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和尿苷)或核苷酸类似物。核苷酸类似物是指具有修饰的嘌呤或嘧啶碱基或修饰的核糖部分的核苷酸。核苷酸模拟物可以是天然存在的核苷酸(例如，肌苷)或非天然存在的核苷酸。对核苷酸的糖或碱基部分的修饰的非限制性实例包括添加(或除去)乙酰基基团、氨基基团、羧基基团、羧甲基基团、羟基基团、甲基基团、磷酰基基团和巯基基团，以及用其它原子取代碱基的碳原子和氮原子(例如，7-脱氮嘌呤)。核苷酸类似物也包括双脱氧核苷酸、2’-O-甲基核苷酸、锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉基寡聚核苷酸(morpholinos)。
术语“多肽”和“蛋白”可互换地用于指氨基酸残基的聚合物。
用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术是本领域已知的。通常，这些技术包括确定基因的mRNA的核苷酸序列和/或确定由此编码的氨基酸序列，和将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列比较。基因组序列也可以按这种方法确定和比较。一般而言，同一性是指两个多核苷酸或多肽序列各自精确的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸一致性。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可以通过确定它们的百分比同一性而比较。两个序列(无论核酸或氨基酸序列)的百分比同一性是两个比对的序列之间的精确匹配的数量除以较短序列的长度并乘以100。核酸序列的大概比对由Smith和Waterman,Advances in AppliedMathematics(应用数学进展)2:482-489(1981)的局部同源性算法提供。此算法可通过使用由Dayhoff,Atlas of Protein Sequences and Structure(蛋白质序列和结构的图谱),M.O.Dayhoff ed.,5suppl.3:353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA,开发的并由Gribskov,Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763(1986)标准化的得分矩阵而应用于氨基酸序列。此算法用于确定序列百分比同一性的例示性实施，由Genetics Computer Group(Madison,Wis.)提供于"BestFit(最佳匹配)"实用应用中。其它合适的用于计算序列之间的百分比同一性或相似性的程序通常是本领域已知的，例如，另一比对程序是BLAST，其与默认参数一起使用。例如，BLASTN和BLASTP可以使用以下默认参数而使用：遗传密码＝标准；过滤＝无；链＝二者；截止＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排列方法＝高分；数据库＝非冗余的，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。这些程序的详情可以在GenBank网站上找到。
因为在不背离本发明范围的情况下可对上述细胞和方法作出各种改变，意图包含在上面的说明书中和下面给出的实施例中的全部情况应理解为例示性的而不是限制性的。
实施例
以下实施例说明了本发明的某些方面。
实施例1：修饰Cas9基因用于哺乳动物的表达
来自酿脓链球菌菌株MGAS15252(登录号YP_005388840.1)的Cas9基因用人密码子偏好性最优化以增强它在哺乳动物细胞中的翻译。Cas9基因也通过将核定位信号PKKKRKV(SEQID NO:1)添加到C末端而修饰用于将蛋白靶向至哺乳动物细胞的胞核。表1展示了修饰的Cas9氨基酸序列，其中核定位序列加下划线。表2展示了密码子优化的，修饰的Cas9DNA序列。
将修饰的Cas9DNA序列置于巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下用于在哺乳动物细胞中的组成性表达。修饰的Cas9DNA序列也被置于T7启动子的控制下用于用T7RNA聚合酶的体外mRNA合成。体外RNA转录通过使用MessageMAX T7 ARCA-Capped MessageTranscription Kit和T7 mScript Standard mRNAProduction System(Cellscript)进行。
实施例2：靶向Cas9
腺伴随病毒整合位点1(AAVS1)基因座被用作Cas9-介导的人基因组修饰的靶。人AAVS1基因座位于蛋白磷酸酶1，调控亚基12C(PPP1R12C)的内含子1(4427bp)。表3展示了PPP1R12C的第一外显子(阴影灰色)和第一内含子。在内含子中的加下划线的序列是靶修饰位点(即，AAVS1基因座)。
Cas9指导RNA被设计用于靶向人AAVS1基因座。制备包含(5’-3’)靶识别序列(即，与靶序列的非编码链互补的序列)和原间隔序列的42个核苷酸RNA(在本文中被称为“crRNA”序列)；包含与crRNA的3’序列互补的5’序列和另外的发夹序列的85个核苷酸RNA(本文称为“tracrRNA”序列)；和包含所述crRNA的核苷酸1-32、GAAA环和所述tracrRNA的核苷酸19-45的嵌合RNA。crRNA由Sigma-Aldrich化学合成。tracrRNA和嵌合RNA通过使用T7-Scribe Standard RNA IVT Kit(Cellscript)用T7RNA聚合酶体外转录而合成。嵌合RNA编码序列也被置于人U6启动子的控制下用于在人细胞中的体内转录。表4展示了指导RNA的序列。
实施例3：制备供体多核苷酸以监测基因组修饰
将GFP蛋白靶向整合入PPP1R12C的N末端，用于监测Cas9-介导的基因组修饰。为通过同源重组介导整合，制备供体多核苷酸。AAVS1-GFP DNA供体包含5’(1185bp)AAVS1基因座同源臂、RNA剪接受体、turbo GFP编码序列、3’转录终止子和3’(1217bp)AAVS1基因座同源臂。表5展示RNA剪接受体的序列和GFP编码序列，接着是3’转录终止子。质粒DNA通过使用GenElute Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit(Sigma)而制备。
靶向的基因整合会产生PPP1R12C的前107个氨基酸和turbo GFP之间的融合蛋白。预期的融合蛋白含有PPP1R12C的前107个氨基酸残基(以灰色突出显示)，其来自PPP1R12C的第一外显子和工程改造的剪接受体之间的RNA剪接(参见表6)。
实施例4：Cas9-介导的靶向整合
转染在人K562细胞上实施。K562细胞系从美国模式培养物保藏所(ATCC)获得并且在用10％FBS和2mM L-谷氨酰胺补充的Iscove’s改良的Dulbecco’s培养基中生长。全部培养基和补充物都从Sigma-Aldrich获得。在转染前一天将培养物分开(以在转染前约50万个
细胞每毫升)。将细胞用Nucleofector Solution V(Lonza)在Nucleofector(Lonza)上使用T-016程序来转染。各核转染(nucleofection)含有大约60万个细胞。转染处理详述在表7中。细胞在核转染之后立即于37℃和5％CO2下生长。
荧光激活细胞分选术(FACS)在转染之后4天进行。FACS数据展示于图4中。在4个实验处理(A-D)的每一个中检测到的GFP百分比大于对照处理(E,F)，这证实供体序列的整合和融合蛋白的表达。
实施例5：PCR证实靶向整合
在转染后12天用GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit(Sigma)从转染的细胞中提取基因组DNA。随后用定位于AAVS1-GFP质粒供体的5’同源臂外部的正向引物和定位于GFP的5’区域的反向引物经PCR扩增基因组DNA。正向引物为5’-CCACTCTGTGCTGACCACTCT-3’(SEQ ID NO:18)和反向引物为5’-GCGGCACTCGATCTCCA-3’(SEQID NO:19)。自连接PCR的预期的片段大小是1388bp。扩增用JumpStart Taq ReadyMix(Sigma)，使用以下循环条件实施：98℃维持2分钟用于最初的变性；35个循环：98℃维持15秒，62℃维持30秒和72℃维持1分钟30秒；和最终延伸：72℃维持5分钟。PCR产物在琼脂糖凝胶上分离。
采用10μg用Anti-Reverse帽类似物转录的Cas9mRNA、0.3nmol预退火的crRNA-tracrRNA双链体和10μg AAVS1-GFP质粒DNA转染的细胞显示预期大小的PCR产物(参见泳道A，图5)。
实施例6：在小鼠胚胎中基于Cas9的基因组编辑
可靶向小鼠Rosa26基因座用于基因组修饰。表8展示了小鼠Rosa26序列的一部分，其中潜在的靶位点以粗体显示。每个靶位点包含原间隔基。
指导RNA被设计以靶向在小鼠Rosa26基因座中的各个靶位点。序列示于表9，每一个长度为42个核苷酸并且5’区域与没有展示于表8中的链(即，与表8中示出的链互补的链)互补。
化学合成crRNA，并与tracrRNA(SEQ ID NO:13；参见实施例2)预退火。可将预退火的crRNA/tracrRNA和体外转录的编码修饰的Cas9蛋白(SEQ ID NO.9；参见实施例1)的mRNA显微注射入受精的小鼠胚胎的前核。当通过crRNA指导至靶位点时，Cas9蛋白剪切靶位点，并且生成的双链断裂可以通过非同源末端连接(NHEJ)修复过程而修复。经注射的胚胎可以在37℃,5％CO2下孵育过夜或孵育多至4天，接着基因分型分析，或者经注射的胚胎可以移植入受者雌性小鼠使得活产动物可以被基因分型。来自活产动物的体外孵育的胚胎或组织可以使用标准方法针对在Rosa基因座的Cas9诱导突变的存在进行筛选。例如，可收获来自胎儿或活产动物的胚胎或组织用于DNA提取和分析。DNA可以使用标准的程序分离。Rosa26基因座的靶向区域可以使用合适的引物经PCR扩增。因为NHEJ是易错的，所以在断裂的修复期间可以发生至少一个核苷酸的缺失、至少一个核苷酸的插入、至少一个核苷酸的置换或其组合。突变可以使用基于PCR的基因分型方法(例如Cel-I错配测定和DNA测序)检测。
实施例7：在小鼠胚胎中基于Cas9的基因组修饰
Rosa26基因座可以通过将如在上面部分(IV)(d)中详述的供体多核苷酸与如在上面实施例6中描述的预退火的crRNA/tracrRNA和编码修饰的Cas9的mRNA一起共注射而在小鼠胚胎中被修饰。来自活产动物(如在实施例6中所描述)的体外孵育的胚胎或组织可以针对修饰的Rosa26基因座使用基于PCR的基因分型方法(例如RFLP测定、连接PCR和DNA测序)筛选。
实施例8：在大鼠胚胎中基于Cas9的基因组编辑
可靶向大鼠Rosa26基因座用于基因组修饰。表10展示了大鼠序列的一部分，其中潜在的靶位点以粗体示出。每个靶位点包含原间隔基。
指导RNA被设计以靶向大鼠Rosa26基因座中的靶位点。序列示出于表11中，每一个长度为42个核苷酸且5’区域与在表10中没有呈现的链(即，与示出于表10中的链互补的链)互补。
化学合成crRNA，并与tracrRNA(SEQ ID NO:13；参见实施例2)预退火。可将预退火的crRNA/tracrRNA和体外转录的编码修饰的Cas9蛋白的mRNA(SEQ ID NO.9；参见实施例1)显微注射入受精的大鼠胚胎的前核。在由crRNA指导至靶位点时，Cas9蛋白剪切靶位点，并且生成的双链断裂可以通过非同源末端连接(NHEJ)修复过程修复。注射的胚胎可以在37℃,5％CO2下孵育过夜或孵育多至4天，接着基因分型分析，或者注射的胚胎可被移植入受者雌性小鼠使得活产动物可以被基因分型。来自活产动物的体外孵育的胚胎或组织可以使用标准方法针对在Rosa基因座的Gas9诱导突变的存在进行筛选。例如，可收获来自胎儿活活产动物的胚胎或组织用于DNA提取和分析。DNA可以使用标准程序分离。Rosa26基因座的靶向区域可以使用合适的引物经PCR扩增。因为NHEJ是易错的，所以在断裂的修复期间可以发生至少一个核苷酸的缺失、至少一个核苷酸的插入、至少一个核苷酸的置换或其组合。可以使用基于PCR的基因分型方法，例如Cel-I错配测定和DNA测序检测突变。
实施例9：在大鼠胚胎中基于Cas9的基因组修饰
Rosa26基因座可以通过将如在上面部分(IV)(d)中详述的供体多核苷酸与如在上面实施例8中所描述的预退火的crRNA/tracrRNA和编码修饰Cas9的mRNA一起共注射而在大鼠胚胎中被修饰。来自活产大鼠的体外孵育的胚胎或组织(如在实施例8中所描述)可以针对修饰的Rosa26基因座使用基于PCR的基因分型方法(例如RFLP测定、连接PCR和DNA测序)进行筛选。
<110> SIGMA-ALDRICH CO. LLC
CHEN, Fuqiang
DAVIS, Gregory D.
KANG, Qiaohua
KNIGHT, Scott W.
<120> 基于CRISPR的基因组修饰和调控
<130> 047497-465606
<150> US 61/734,256
<151> 2012-12-06
<150> US 61/758,624
<151> 2013-01-30
<150> US 61/761,046
<151> 2013-02-05
<150> US 61/794,422
<151> 2013-03-15
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Pro Lys Lys Lys Arg Arg Val
1 5
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Pro Lys Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Val
20
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro Pro Lys Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys Val
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1 5 10 15
Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 7
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1 5 10 15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 9
<211> 1374
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Asp Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Gly Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Ala Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Ile Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Arg Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Arg Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Ser Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Ala Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Gly Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly His Ser Leu
705 710 715 720
His Glu Gln Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Ile Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr
755 760 765
Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu
770 775 780
Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val
785 790 795 800
Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln
805 810 815
Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu
820 825 830
Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Ile Lys Asp
835 840 845
Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly
850 855 860
Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn
865 870 875 880
Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe
885 890 895
Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys
900 905 910
Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys
915 920 925
His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu
930 935 940
Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys
945 950 955 960
Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu
965 970 975
Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val
980 985 990
Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val
995 1000 1005
Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys
1010 1015 1020
Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr
1025 1030 1035
Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn
1040 1045 1050
Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr
1055 1060 1065
Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg
1070 1075 1080
Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu
1085 1090 1095
Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg
1100 1105 1110
Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys
1115 1120 1125
Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu
1130 1135 1140
Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser
1145 1150 1155
Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe
1160 1165 1170
Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu
1175 1180 1185
Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe
1190 1195 1200
Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu
1205 1210 1215
Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn
1220 1225 1230
Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro
1235 1240 1245
Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His
1250 1255 1260
Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg
1265 1270 1275
Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr
1280 1285 1290
Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile
1295 1300 1305
Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe
1310 1315 1320
Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr
1325 1330 1335
Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly
1340 1345 1350
Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Pro
1355 1360 1365
Lys Lys Lys Arg Lys Val
1370
<210> 10
<211> 4122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
atggacaaga agtacagcat cggcctggac atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg 60
atcaccgacg actacaaggt gcccagcaag aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120
cacagcatca agaagaacct gatcggcgcc ctgctgttcg gctctggcga aacagccgag 180
gccacccggc tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gacggaagaa ccggatctgc 240
tatctgcaag agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga 300
ctggaagagt ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360
aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag 420
aagctggccg acagcaccga caaggccgac ctgagactga tctacctggc cctggcccac 480
atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540
gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag atctacaatc agctgttcga ggaaaacccc 600
atcaacgcca gcagagtgga cgccaaggcc atcctgagcg ccagactgag caagagcaga 660
cggctggaaa atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaagc ggaatggcct gttcggcaac 720
ctgattgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780
gatgccaaac tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840
cagatcggcg accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 900
ctgctgagcg acatcctgag agtgaacagc gagatcacca aggcccccct gtccgcctct 960
atgatcaaga gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg 1020
cagcagctgc ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080
ggctacatcg atggcggagc cagccaggaa gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140
gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga acagagagga cctgctgcgg 1200
aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg agagctgcac 1260
gccattctgc ggcggcagga agatttttac ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc 1320
gagaagatcc tgaccttcag aatcccctac tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc 1380
agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa 1440
gtggtggaca agggcgccag cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag 1500
aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560
tacaacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa tgcggaagcc cgcctttctg 1620
agcggcgagc agaaaaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc 1680
gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgacag cgtggaaatc 1740
agcggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc ctgggcgcct atcacgatct gctgaaaatt 1800
atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg acattctgga agatatcgtg 1860
ctgaccctga cactgtttga ggaccggggc atgatcgagg aacggctgaa aacctatgcc 1920
cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc ggagatacac cggctggggc 1980
aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agtccggcaa gacaatcctg 2040
gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100
agcctgacct ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt ccggccaggg acactctctg 2160
cacgagcaga tcgccaatct ggccggatcc cccgccatta agaagggcat cctgcagaca 2220
gtgaagattg tggacgagct cgtgaaagtg atgggccaca agcccgagaa catcgtgatc 2280
gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2340
aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2400
gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2460
atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccacatt 2520
gtgccccagt ccttcatcaa ggacgactcc atcgataaca aagtgctgac tcggagcgac 2580
aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2640
tactggcgcc agctgctgaa tgccaagctg attacccaga ggaagttcga caatctgacc 2700
aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcattaa gcggcagctg 2760
gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2820
aagtacgacg agaacgacaa actgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 2880
ctggtgtccg acttcagaaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 2940
caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3000
cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gattacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060
atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3120
atcatgaact ttttcaagac cgagatcaca ctggccaacg gcgagatcag aaagcggcct 3180
ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3240
acagtgcgga aagtgctgtc catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3300
accggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga actccgacaa gctgatcgcc 3360
agaaagaagg attgggaccc taagaagtac ggcggctttg acagccccac cgtggcctac 3420
tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3480
gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3540
ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3600
tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag cggatgctgg cttctgccgg cgaactgcag 3660
aagggaaacg agctggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720
tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3780
cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagattagcg agttctccaa gcgcgtgatc 3840
ctggccgatg ccaacctgga caaggtgctg agcgcctaca acaagcaccg ggataagccc 3900
atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaacct gggagcccct 3960
gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4020
gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4080
ctgtctcagc tgggaggcga ccccaagaaa aagcgcaaag tg 4122
<210> 11
<211> 4764
<212> DNA
<213> 人
<400> 11
gcgggcgggc ggtgcgatgt ccggagagga tggcccggcg gctggcccgg gggcggcggc 60
ggcggctgcc cgggagcggc gacgggagca gctgcggcag tggggggcgc gggcgggcgc 120
cgagcctggc cccggagagc gccgcgcccg caccgtccgc ttcgagcgcg ccgccgagtt 180
cctggcggcc tgtgcgggcg gcgacctgga cgaggcgcgt ctgatgctgc gcgccgccga 240
ccctggcccc ggcgccgagc tcgaccccgc cgcgccgccg cccgcccgcg ccgtgctgga 300
ctccaccaac gccgacggta tcagcgccct gcaccaggtc agcgcccccc gcccggcgtc 360
tcccggggcc aggtccaccc tctgctgcgc cacctggggc atcctccttc cccgttgcca 420
gtctcgatcc gccccgtcgt tcctggccct gggctttgcc accctatgct gacaccccgt 480
cccagtcccc cttaccattc cccttcgacc accccacttc cgaattggag ccgcttcaac 540
tggccctggg cttagccact ctgtgctgac cactctgccc caggcctcct taccattccc 600
cttcgaccta ctctcttccg cattggagtc gctttaactg gccctggctt tggcagcctg 660
tgctgaccca tgcagtcctc cttaccatcc ctccctcgac ttcccctctt ccgatgttga 720
gcccctccag ccggtcctgg actttgtctc cttccctgcc ctgccctctc ctgaacctga 780
gccagctccc atagctcagt ctggtctatc tgcctggccc tggccattgt cactttgcgc 840
tgccctcctc tcgcccccga gtgcccttgc tgtgccgccg gaactctgcc ctctaacgct 900
gccgtctctc tcctgagtcc ggaccacttt gagctctact ggcttctgcg ccgcctctgg 960
cccactgttt ccccttccca ggcaggtcct gctttctctg acctgcattc tctcccctgg 1020
gcctgtgccg ctttctgtct gcagcttgtg gcctgggtca cctctacggc tggcccagat 1080
ccttccctgc cgcctccttc aggttccgtc ttcctccact ccctcttccc cttgctctct 1140
gctgtgttgc tgcccaagga tgctctttcc ggagcacttc cttctcggcg ctgcaccacg 1200
tgatgtcctc tgagcggatc ctccccgtgt ctgggtcctc tccgggcatc tctcctccct 1260
cacccaaccc catgccgtct tcactcgctg ggttcccttt tccttctcct tctggggcct 1320
gtgccatctc tcgtttctta ggatggcctt ctccgacgga tgtctccctt gcgtcccgcc 1380
tccccttctt gtaggcctgc atcatcaccg tttttctgga caaccccaaa gtaccccgtc 1440
tccctggctt tagccacctc tccatcctct tgctttcttt gcctggacac cccgttctcc 1500
tgtggattcg ggtcacctct cactcctttc atttgggcag ctcccctacc ccccttacct 1560
ctctagtctg tgctagctct tccagccccc tgtcatggca tcttccaggg gtccgagagc 1620
tcagctagtc ttcttcctcc aacccgggcc cctatgtcca cttcaggaca gcatgtttgc 1680
tgcctccagg gatcctgtgt ccccgagctg ggaccacctt atattcccag ggccggttaa 1740
tgtggctctg gttctgggta cttttatctg tcccctccac cccacagtgg ggccactagg 1800
gacaggattg gtgacagaaa agccccatcc ttaggcctcc tccttcctag tctcctgata 1860
ttgggtctaa cccccacctc ctgttaggca gattccttat ctggtgacac acccccattt 1920
cctggagcca tctctctcct tgccagaacc tctaaggttt gcttacgatg gagccagaga 1980
ggatcctggg agggagagct tggcaggggg tgggagggaa gggggggatg cgtgacctgc 2040
ccggttctca gtggccaccc tgcgctaccc tctcccagaa cctgagctgc tctgacgcgg 2100
ccgtctggtg cgtttcactg atcctggtgc tgcagcttcc ttacacttcc caagaggaga 2160
agcagtttgg aaaaacaaaa tcagaataag ttggtcctga gttctaactt tggctcttca 2220
cctttctagt ccccaattta tattgttcct ccgtgcgtca gttttacctg tgagataagg 2280
ccagtagcca gccccgtcct ggcagggctg tggtgaggag gggggtgtcc gtgtggaaaa 2340
ctccctttgt gagaatggtg cgtcctaggt gttcaccagg tcgtggccgc ctctactccc 2400
tttctctttc tccatccttc tttccttaaa gagtccccag tgctatctgg gacatattcc 2460
tccgcccaga gcagggtccc gcttccctaa ggccctgctc tgggcttctg ggtttgagtc 2520
cttggcaagc ccaggagagg cgctcaggct tccctgtccc ccttcctcgt ccaccatctc 2580
atgcccctgg ctctcctgcc ccttccctac aggggttcct ggctctgctc ttcagactga 2640
gccccgttcc cctgcatccc cgttcccctg catccccctt cccctgcatc ccccagaggc 2700
cccaggccac ctacttggcc tggaccccac gagaggccac cccagccctg tctaccaggc 2760
tgccttttgg gtggattctc ctccaactgt ggggtgactg cttggcaaac tcactcttcg 2820
gggtatccca ggaggcctgg agcattgggg tgggctgggg ttcagagagg agggattccc 2880
ttctcaggtt acgtggccaa gaagcagggg agctgggttt gggtcaggtc tgggtgtggg 2940
gtgaccagct tatgctgttt gcccaggaca gcctagtttt agcactgaaa ccctcagtcc 3000
taggaaaaca gggatggttg gtcactgtct ctgggtgact cttgattccc ggccagtttc 3060
tccacctggg gctgtgtttc tcgtcctgca tccttctcca ggcaggtccc caagcatcgc 3120
ccccctgctg tggctgttcc caagttctta gggtacccca cgtgggttta tcaaccactt 3180
ggtgaggctg gtaccctgcc cccattcctg caccccaatt gccttagtgg ctagggggtt 3240
gggggctaga gtaggagggg ctggagccag gattcttagg gctgaacaga gaagagctgg 3300
gggcctgggc tcctgggttt gagagaggag gggctggggc ctggactcct gggtccgagg 3360
gaggaggggc tggggcctgg actcctgggt ctgagggtgg agggactggg ggcctggact 3420
cctgggtccg agggaggagg ggctggggcc tggactcgtg ggtctgaggg aggaggggct 3480
gggggcctgg acttctgggt cttagggagg cggggctggg cctggacccc tgggtctgaa 3540
tggggagagg ctgggggcct ggactccttc atctgagggc ggaagggctg gggcctggcc 3600
tcctgggttg aatggggagg ggttgggcct ggactctgga gtccctggtg cccaggcctc 3660
aggcatcttt cacagggatg cctgtactgg gcaggtcctt gaaagggaaa ggcccattgc 3720
tctccttgcc cccctcccct atcgccatga caactgggtg gaaataaacg agccgagttc 3780
atcccgttcc cagggcacgt gcggcccctt cacagcccga gtttccatga cctcatgctc 3840
ttggccctcg tagctccctc ccgcctcctc cagatgggca gctttggaga ggtgagggac 3900
ttggggggta atttatcccg tggatctagg agtttagctt cactccttcc tcagctccag 3960
ttcaggtccc ggagcccacc cagtgtccac aaggcctggg gcaagtccct cctccgaccc 4020
cctggacttc ggcttttgtc cccccaagtt ttggacccct aagggaagaa tgagaaacgg 4080
tggcccgtgt cagcccctgg ctgcagggcc ccgtgcagag ggggcctcag tgaactggag 4140
tgtgacagcc tggggcccag gcacacaggt gtgcagctgt ctcacccctc tgggagtccc 4200
gcccaggccc ctgagtctgt cccagcacag ggtggccttc ctccaccctg catagccctg 4260
ggcccacggc ttcgttcctg cagagtatct gctggggtgg tttccgagct tgacccttgg 4320
aaggacctgg ctgggtttaa ggcaggaggg gctgggggcc aggactcctg gctctgaagg 4380
aggaggggct ggaacctctt ccctagtctg agcactggaa gcgccacctg tgggtggtga 4440
cgggggtttt gccgtgtcta acaggtacca tgtggggttc ccgcacccag atgagaagcc 4500
ccctcccttc cccgttcact tcctgtttgc agatagccag gagtcctttc gtggtttcca 4560
ctgagcactg aaggcctggc cggcctgacc actgggcaac caggcgtatc ttaaacagcc 4620
agtggccaga ggctgttggg tcattttccc cactgtccta gcaccgtgtc cctggatctg 4680
ttttcgtggc tccctctgga gtcccgactt gctgggacac cgtggctggg gtaggtgcgg 4740
ctgacggctg tttcccaccc ccag 4764
<210> 12
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
accccacagu ggggccacua guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 13
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
ggaaccauuc aaaacagcau agcaaguuaa aauaaggcua guccguuauc aacuugaaaa 60
aguggcaccg agucggugcu uuuuuu 86
<210> 14
<211> 62
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
accccacagu ggggccacua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cg 62
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
ctgacctctt ctcttcctcc cacag 25
<210> 16
<211> 1009
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
gccaccatgg actacaaaga cgatgacgac aaggtcgact ctagagctgc agagagcgac 60
gagagcggcc tgcccgccat ggagatcgag tgccgcatca ccggcaccct gaacggcgtg 120
gagttcgagc tggtgggcgg cggagagggc acccccgagc agggccgcat gaccaacaag 180
atgaagagca ccaaaggcgc cctgaccttc agcccctacc tgctgagcca cgtgatgggc 240
tacggcttct accacttcgg cacctacccc agcggctacg agaacccctt cctgcacgcc 300
atcaacaacg gcggctacac caacacccgc atcgagaagt acgaggacgg cggcgtgctg 360
cacgtgagct tcagctaccg ctacgaggcc ggccgcgtga tcggcgactt caaggtgatg 420
ggcaccggct tccccgagga cagcgtgatc ttcaccgaca agatcgtccg cagcaacgcc 480
accgtggagc acctgcaccc catgggcgat aacgatctgg atggcagctt cacccgcacc 540
ttcagcctgc gcgacggcgg ctactacagc tccgtggtgg acagccacat gcacttcaag 600
agcgccatcc accccagcat cctgcagaac gggggcccca tgttcgcctt ccgccgcgtg 660
gaggaggatc acagcaacac cgagctgggc atcgtggagt accagcacgc cttcaagacc 720
ccggatgcag atgccggtga agaatgaaga tctctgtgcc ttctagttgc cagccatctg 780
ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 840
cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 900
gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 960
atgcggtggg ctctatggac tcgaggttta aacgtcgacg cggccgcgt 1009
<210> 17
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
Met Ser Gly Glu Asp Gly Pro Ala Ala Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Arg Glu Arg Arg Arg Glu Gln Leu Arg Gln Trp Gly Ala Arg
20 25 30
Ala Gly Ala Glu Pro Gly Pro Gly Glu Arg Arg Ala Arg Thr Val Arg
35 40 45
Phe Glu Arg Ala Ala Glu Phe Leu Ala Ala Cys Ala Gly Gly Asp Leu
50 55 60
Asp Glu Ala Arg Leu Met Leu Arg Ala Ala Asp Pro Gly Pro Gly Ala
65 70 75 80
Glu Leu Asp Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Arg Ala Val Leu Asp Ser
85 90 95
Thr Asn Ala Asp Gly Ile Ser Ala Leu His Gln Ala Thr Met Asp Tyr
100 105 110
Lys Asp Asp Asp Asp Lys Val Asp Ser Arg Ala Ala Glu Ser Asp Glu
115 120 125
Ser Gly Leu Pro Ala Met Glu Ile Glu Cys Arg Ile Thr Gly Thr Leu
130 135 140
Asn Gly Val Glu Phe Glu Leu Val Gly Gly Gly Glu Gly Thr Pro Glu
145 150 155 160
Gln Gly Arg Met Thr Asn Lys Met Lys Ser Thr Lys Gly Ala Leu Thr
165 170 175
Phe Ser Pro Tyr Leu Leu Ser His Val Met Gly Tyr Gly Phe Tyr His
180 185 190
Phe Gly Thr Tyr Pro Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Phe Leu His Ala Ile
195 200 205
Asn Asn Gly Gly Tyr Thr Asn Thr Arg Ile Glu Lys Tyr Glu Asp Gly
210 215 220
Gly Val Leu His Val Ser Phe Ser Tyr Arg Tyr Glu Ala Gly Arg Val
225 230 235 240
Ile Gly Asp Phe Lys Val Met Gly Thr Gly Phe Pro Glu Asp Ser Val
245 250 255
Ile Phe Thr Asp Lys Ile Val Arg Ser Asn Ala Thr Val Glu His Leu
260 265 270
His Pro Met Gly Asp Asn Asp Leu Asp Gly Ser Phe Thr Arg Thr Phe
275 280 285
Ser Leu Arg Asp Gly Gly Tyr Tyr Ser Ser Val Val Asp Ser His Met
290 295 300
His Phe Lys Ser Ala Ile His Pro Ser Ile Leu Gln Asn Gly Gly Pro
305 310 315 320
Met Phe Ala Phe Arg Arg Val Glu Glu Asp His Ser Asn Thr Glu Leu
325 330 335
Gly Ile Val Glu Tyr Gln His Ala Phe Lys Thr Pro Asp Ala Asp Ala
340 345 350
Gly Glu Glu
355
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
ccactctgtg ctgaccactc t 21
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
gcggcactcg atctcca 17
<210> 20
<211> 711
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 20
gagcggctgc ggggcgggtg caagcacgtt tccgacttga gttgcctcaa gaggggcgtg 60
ctgagccaga cctccatcgc gcactccggg gagtggaggg aaggagcgag ggctcagttg 120
ggctgttttg gaggcaggaa gcacttgctc tcccaaagtc gctctgagtt gttatcagta 180
agggagctgc agtggagtag gcggggagaa ggccgcaccc ttctccggag gggggagggg 240
agtgttgcaa tacctttctg ggagttctct gctgcctcct ggcttctgag gaccgccctg 300
ggcctgggag aatcccttcc ccctcttccc tcgtgatctg caactccagt ctttctagaa 360
gatgggcggg agtcttctgg gcaggcttaa aggctaacct ggtgtgtggg cgttgtcctg 420
caggggaatt gaacaggtgt aaaattggag ggacaagact tcccacagat tttcggtttt 480
gtcgggaagt tttttaatag gggcaaataa ggaaaatggg aggataggta gtcatctggg 540
gttttatgca gcaaaactac aggttattat tgcttgtgat ccgcctcgga gtattttcca 600
tcgaggtaga ttaaagacat gctcacccga gttttatact ctcctgcttg agatccttac 660
tacagtatga aattacagtg tcgcgagtta gactatgtaa gcagaatttt a 711
<210> 21
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
cuccagucuu ucuagaagau guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 22
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
ugaacaggug uaaaauugga guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 23
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
ugucgggaag uuuuuuaaua guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 24
<211> 642
<212> DNA
<213> Rattus rattus
<400> 24
gggattcctc cttgagttgt ggcactgagg aacgtgctga acaagaccta cattgcactc 60
cagggagtgg atgaaggagt tggggctcag tcgggttgta ttggagacaa gaagcacttg 120
ctctccaaaa gtcggtttga gttatcatta agggagctgc agtggagtag gcggagaaaa 180
ggccgcaccc ttctcaggac gggggagggg agtgttgcaa tacctttctg ggagttctct 240
gctgcctcct gtcttctgag gaccgccctg ggcctggaag attcccttcc cccttcttcc 300
ctcgtgatct gcaactggag tctttctgga agataggcgg gagtcttctg ggcaggctta 360
aaggctaacc tggtgcgtgg ggcgttgtcc tgcagaggaa ttgaacaggt gtaaaattgg 420
aggggcaaga cttcccacag attttcgatt gtgttgttaa gtattgtaat aggggcaaat 480
aagggaaata gactaggcac tcacctgggg ttttatgcag caaaactaca ggttattatt 540
gcttgtgatc cgccctggag aatttttcac cgaggtagat tgaagacatg cccacccaaa 600
ttttaatatt cttccacttg cgatccttgc tacagtatga aa 642
<210> 25
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
agggggaagg gaaucuucca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 26
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
ucugcaacug gagucuuucu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 27
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
aggcgggagu cuucugggca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42

Claims (26)

1.一种工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其包含：
指导RNA，其包含：
(i)与真核生物染色体序列中的靶位点互补的第一区域，所述第一区域可与靶位点碱基配对，所述第一区域包含约10个核苷酸至超过约25个核苷酸，
(ii)形成茎和环结构的第二区域，和
(iii)基本单链的第三区域，
其中(i)、(ii)和(iii)以5'至3'方向排列，并且指导RNA包含两个分开的分子，
其中在指导RNA和II型CRISPR/Cas9蛋白之间形成蛋白-RNA复合物，其进一步包含核定位信号，并且通过指导RNA、II型CRISPR/Cas9蛋白和靶位点之间的相互作用将蛋白-RNA复合物指导至靶位点。
2.权利要求1的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中指导RNA的第二区域的长度为约16个至约60个核苷酸。
3.权利要求1或2的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中指导RNA的第三区域的长度为约5个至约60个核苷酸。
4.权利要求1至3中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中指导RNA的第一分子包含指导RNA的第一区域和指导RNA的第二区域的茎的一半。
5.权利要求1至4中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中指导RNA的第二分子包含指导RNA的第二区域的茎的另一半和指导RNA的第三区域。
6.权利要求1至5中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白仅包含一个功能性核酸酶结构域。
7.权利要求6的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白包含非功能性RuvC样结构域。
8.权利要求6的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白包含非功能性HNH样结构域。
9.权利要求1至8中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白来自链球菌物种。
10.权利要求9的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白来自酿脓链球菌。
11.权利要求1至10中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白由针对真核表达优化的DNA编码。
12.权利要求11的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中DNA可操作连接至启动子控制序列用于真核表达。
13.权利要求11或12的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中编码工程化RNA指导的核酸内切酶的DNA包含在载体中。
14.权利要求1至13中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中指导RNA的第一分子是化学合成的，并且指导RNA的第二分子是通过体外转录合成的。
15.权利要求1至13中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中指导RNA的第一和第二分子由可操作连接至启动子控制序列用于真核表达的DNA编码。
16.权利要求15的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中编码指导RNA的DNA包含在载体中。
17.权利要求1至16中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中靶位点位于原间隔毗连基序(PAM)的上游。
18.权利要求17的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中PAM紧邻靶位点的下游。
19.权利要求17或18的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中PAM是NGG或NGGNG，其中N被限定为任何核苷酸。
20. 权利要求1-19中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物和任选的包含供体序列的至少一种供体多核苷酸用于修饰染色体序列的用途，
其中所述用途不包括用于修饰人类的种系遗传身份的过程，和
其中所述用途不包括用于治疗人或动物身体的方法。
21.权利要求20的用途，其中染色体序列通过DNA修复过程来修复，使得染色体序列通过缺失至少一个核苷酸、插入至少一个核苷酸、置换至少一个核苷酸或其组合而修饰。
22.权利要求21的用途，其中DNA修复过程是非同源末端连接(NHEJ)修复过程。
23.权利要求21的用途，其进一步包含含有上游和下游序列的供体多核苷酸，其中DNA修复过程是同源性定向的修复(HDR)，并且供体序列整合入染色体序列。
24.权利要求20至23中任一项的用途，其中染色体序列在真核细胞中，其中真核细胞是人细胞、非人哺乳动物细胞或非人哺乳动物胚胎。
25.权利要求20至23中任一项的用途，其中染色体序列在真核细胞中，其中真核细胞是无脊椎动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞或单细胞真核生物。
26.权利要求25的用途，其中真核细胞是植物细胞。
CN201810574719.4A 2012-12-06 2013-12-05 基于crispr的基因组修饰和调控 Active CN108913676B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810574719.4A CN108913676B (zh) 2012-12-06 2013-12-05 基于crispr的基因组修饰和调控

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261734256P 2012-12-06 2012-12-06
US61/734256 2012-12-06
US201361758624P 2013-01-30 2013-01-30
US61/758624 2013-01-30
US201361761046P 2013-02-05 2013-02-05
US61/761046 2013-02-05
US201361794422P 2013-03-15 2013-03-15
US61/794422 2013-03-15
CN201810574719.4A CN108913676B (zh) 2012-12-06 2013-12-05 基于crispr的基因组修饰和调控
PCT/US2013/073307 WO2014089290A1 (en) 2012-12-06 2013-12-05 Crispr-based genome modification and regulation
CN201380072477.4A CN105142669B (zh) 2012-12-06 2013-12-05 基于crispr的基因组修饰和调控

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380072477.4A Division CN105142669B (zh) 2012-12-06 2013-12-05 基于crispr的基因组修饰和调控

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108913676A true CN108913676A (zh) 2018-11-30
CN108913676B CN108913676B (zh) 2023-11-03

Family

ID=50883989

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810540449.5A Pending CN108715602A (zh) 2012-12-06 2013-12-05 基于crispr的基因组修饰和调控
CN201810574719.4A Active CN108913676B (zh) 2012-12-06 2013-12-05 基于crispr的基因组修饰和调控
CN201380072477.4A Active CN105142669B (zh) 2012-12-06 2013-12-05 基于crispr的基因组修饰和调控

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810540449.5A Pending CN108715602A (zh) 2012-12-06 2013-12-05 基于crispr的基因组修饰和调控

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380072477.4A Active CN105142669B (zh) 2012-12-06 2013-12-05 基于crispr的基因组修饰和调控

Country Status (17)

Country Link
US (15) US20160017366A1 (zh)
EP (11) EP3617309A3 (zh)
JP (6) JP6620018B2 (zh)
KR (6) KR101844123B1 (zh)
CN (3) CN108715602A (zh)
AU (9) AU2013355214B2 (zh)
BR (1) BR112015012375A2 (zh)
CA (3) CA2977152C (zh)
DK (6) DK3363902T3 (zh)
ES (6) ES2713243T3 (zh)
HK (1) HK1218389A1 (zh)
IL (5) IL300199A (zh)
LT (4) LT3138912T (zh)
PL (6) PL2928496T3 (zh)
PT (6) PT3138912T (zh)
SG (4) SG10201800585VA (zh)
WO (1) WO2014089290A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110628825A (zh) * 2019-10-14 2019-12-31 上海捷易生物科技有限公司 一种依赖nhej的报告基因敲入组合物及其使用方法
CN113728099A (zh) * 2019-02-15 2021-11-30 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 Crispr/cas融合蛋白和系统

Families Citing this family (363)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008027558A2 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Codon Devices, Inc. Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
EP2638157B1 (en) 2010-11-12 2015-07-22 Gen9, Inc. Methods and devices for nucleic acids synthesis
EP4039363A1 (en) 2010-11-12 2022-08-10 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
EP3594340B1 (en) 2011-08-26 2021-06-30 Gen9, Inc. Compositions and methods for high fidelity assembly of nucleic acids
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
EP3543350B1 (en) 2012-04-24 2021-11-10 Gen9, Inc. Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning
IN2014DN09261A (zh) 2012-04-25 2015-07-10 Regeneron Pharma
EP3597741A1 (en) 2012-04-27 2020-01-22 Duke University Genetic correction of mutated genes
MA37663B1 (fr) 2012-05-25 2019-12-31 Univ California Procédés et compositions permettant la modification de l'adn cible dirigée par l'arn et la modulation de la transcription dirigée par l'arn
EP2861737B1 (en) 2012-06-19 2019-04-17 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
WO2014004393A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Gen9, Inc. Methods for nucleic acid assembly and high throughput sequencing
CN116622704A (zh) * 2012-07-25 2023-08-22 布罗德研究所有限公司 可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用
KR102182847B1 (ko) * 2012-10-23 2020-11-27 주식회사 툴젠 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도
CN105051204B (zh) 2012-11-16 2023-07-21 波赛伊达治疗学股份有限公司 位点特异性酶和使用方法
EP3617309A3 (en) 2012-12-06 2020-05-06 Sigma Aldrich Co. LLC Crispr-based genome modification and regulation
KR20150105634A (ko) * 2012-12-12 2015-09-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 개선된 시스템, 방법 및 효소 조성물의 유전자 조작 및 최적화
US8697359B1 (en) * 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
IL293526A (en) * 2012-12-12 2022-08-01 Harvard College Providing, engineering and optimizing systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
WO2014093595A1 (en) * 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP3064585B1 (en) 2012-12-12 2020-02-05 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
PT2771468E (pt) * 2012-12-12 2015-06-02 Harvard College Engenharia de sistemas, métodos e composições-guia otimizadas para manipulação de sequências
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
DK2931898T3 (en) 2012-12-12 2016-06-20 Massachusetts Inst Technology CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH FUNCTIONAL DOMAINS
ES2741951T3 (es) 2012-12-17 2020-02-12 Harvard College Modificación por ingeniería genética del genoma humano guiada por ARN
JP2016507244A (ja) 2013-02-27 2016-03-10 ヘルムホルツ・ツェントルム・ミュンヒェン・ドイチェス・フォルシュンクスツェントルム・フューア・ゲズントハイト・ウント・ウムベルト（ゲーエムベーハー）Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ Ｚｅｎｔｒｕｍ ＭｕｅｎｃｈｅｎＤｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ ｆｕｅｒ Ｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔ ｕｎｄ Ｕｍｗｅｌｔ （ＧｍｂＨ） Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる卵母細胞における遺伝子編集
EP2971184B1 (en) 2013-03-12 2019-04-17 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
RU2018122288A (ru) 2013-03-14 2019-03-06 Карибо Биосайенсиз, Инк. Композиции и способы с участием нуклеиновых кислот, нацеленных на нуклеиновые кислоты
AU2014227653B2 (en) 2013-03-15 2017-04-20 The General Hospital Corporation Using RNA-guided foki nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-guided genome editing
US20140273230A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US20140273235A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota ENGINEERING PLANT GENOMES USING CRISPR/Cas SYSTEMS
SI2986729T1 (sl) 2013-04-16 2019-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ciljana sprememba genoma podgane
WO2014172470A2 (en) * 2013-04-16 2014-10-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of mutating, modifying or modulating nucleic acid in a cell or nonhuman mammal
CA2910489A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
US20160122774A1 (en) * 2013-05-29 2016-05-05 Cellectis A method for producing precise dna cleavage using cas9 nickase activity
US20140356956A1 (en) 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
MY197877A (en) * 2013-06-04 2023-07-22 Harvard College Rna-guided transcriptional regulation
JP7085716B2 (ja) * 2013-06-05 2022-06-17 デューク ユニバーシティ Ｒｎａガイド遺伝子編集及び遺伝子調節
US20160145631A1 (en) 2013-06-14 2016-05-26 Cellectis Methods for non-transgenic genome editing in plants
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
SG11201510284XA (en) 2013-06-17 2016-01-28 Broad Inst Inc Delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
ES2767318T3 (es) * 2013-06-17 2020-06-17 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para generar modelos y actuar sobre enfermedades y trastornos de células posmitóticas
CN106062197A (zh) * 2013-06-17 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的串联指导系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
AU2014281027A1 (en) * 2013-06-17 2016-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Optimized CRISPR-Cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP3011034B1 (en) * 2013-06-17 2019-08-07 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components
US10011850B2 (en) 2013-06-21 2018-07-03 The General Hospital Corporation Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing
US11306328B2 (en) * 2013-07-26 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
CA3221516A1 (en) 2013-08-22 2015-02-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Plant genome modification using guide rna/cas endonuclease systems and methods of use
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
ES2844174T3 (es) * 2013-09-18 2021-07-21 Kymab Ltd Métodos, células y organismos
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
WO2015066119A1 (en) 2013-10-30 2015-05-07 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-ii crispr-cas system in lactobacillus buchneri
CN106459995B (zh) 2013-11-07 2020-02-21 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
MX2016007654A (es) 2013-12-11 2017-08-15 Regeneron Pharma Metodos y composiciones para la modificacion dirigida de un genoma.
SI3080279T1 (sl) 2013-12-11 2019-01-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postopki in sestavki za ciljano spremembo genoma
BR112016013520A2 (pt) 2013-12-12 2017-10-03 Broad Inst Inc Composições e métodos de uso de sistemas crispr-cas em distúrbios de repetições de nucleotídeos
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
KR20160089527A (ko) 2013-12-12 2016-07-27 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 게놈 편집을 위한 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템 및 조성물의 전달, 용도 및 치료적 응용
WO2015089427A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular cas enzymes
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
US20150166985A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting von willebrand factor point mutations
US10787654B2 (en) * 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
WO2015123339A1 (en) 2014-02-11 2015-08-20 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Crispr enabled multiplexed genome engineering
AU2015219167A1 (en) 2014-02-18 2016-09-08 Duke University Compositions for the inactivation of virus replication and methods of making and using the same
US11028388B2 (en) 2014-03-05 2021-06-08 Editas Medicine, Inc. CRISPR/Cas-related methods and compositions for treating Usher syndrome and retinitis pigmentosa
DK3116997T3 (da) 2014-03-10 2019-08-19 Editas Medicine Inc Crispr/cas-relaterede fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af lebers kongenitale amaurose 10 (lca10)
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
WO2015148670A1 (en) * 2014-03-25 2015-10-01 Editas Medicine Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating hiv infection and aids
EP3122880B1 (en) 2014-03-26 2021-05-05 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
CN106460003A (zh) 2014-04-08 2017-02-22 北卡罗来纳州立大学 用于使用crispr相关基因rna引导阻遏转录的方法和组合物
WO2015188056A1 (en) * 2014-06-05 2015-12-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
CN106795521B (zh) 2014-06-06 2021-06-04 瑞泽恩制药公司 用于修饰所靶向基因座的方法和组合物
CA2952697A1 (en) * 2014-06-16 2015-12-23 The Johns Hopkins University Compositions and methods for the expression of crispr guide rnas using the h1 promoter
US20170107541A1 (en) * 2014-06-17 2017-04-20 Poseida Therapeutics, Inc. A method for directing proteins to specific loci in the genome and uses thereof
EP3354732B1 (en) * 2014-06-23 2020-01-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated dna assembly
AU2015279642B2 (en) 2014-06-26 2021-03-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeted genetic modifications and methods of use
US20170198268A1 (en) * 2014-07-09 2017-07-13 Gen9, Inc. Compositions and Methods for Site-Directed DNA Nicking and Cleaving
CA2954791A1 (en) * 2014-07-14 2016-01-21 The Regents Of The University Of California Crispr/cas transcriptional modulation
EP4079847A1 (en) 2014-07-30 2022-10-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
CN106922154B (zh) * 2014-08-06 2022-01-07 基因工具股份有限公司 使用空肠弯曲杆菌crispr/cas系统衍生的rna引导的工程化核酸酶的基因编辑
US10450584B2 (en) 2014-08-28 2019-10-22 North Carolina State University Cas9 proteins and guiding features for DNA targeting and genome editing
EP3188763B1 (en) 2014-09-02 2020-05-13 The Regents of The University of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification
WO2016040030A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Generation of site-specific-integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use
CA2963840A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Long poly(a) plasmids and methods for introduction of long poly(a) sequences into the plasmid
CN107002078A (zh) * 2014-10-09 2017-08-01 生命技术公司 Crispr寡核苷酸和基因剪辑
WO2016061374A1 (en) 2014-10-15 2016-04-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating or maintaining pluripotent cells
WO2016065364A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-28 Life Technologies Corporation Compositions and methods for enhancing homologous recombination
CN107429246B (zh) * 2014-10-31 2021-06-01 麻省理工学院 用于crispr的大规模并行组合遗传学
DK3215611T3 (da) * 2014-11-06 2019-11-25 Du Pont Peptid-medieret indgivelse af rna-guidet endonuklease i celler
EP3215617B1 (en) 2014-11-07 2024-05-08 Editas Medicine, Inc. Systems for improving crispr/cas-mediated genome-editing
WO2016077273A1 (en) * 2014-11-11 2016-05-19 Q Therapeutics, Inc. Engineering mesenchymal stem cells using homologous recombination
JP2017534294A (ja) 2014-11-19 2017-11-24 インスティチュート フォー ベーシック サイエンスＩｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ 二つのベクターから発現されたｃａｓ９タンパク質を利用した遺伝子発現調節方法
ES2731437T3 (es) 2014-11-21 2019-11-15 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para la modificación genética dirigida mediante el uso de pares de ARN guías
GB201421096D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Imp Innovations Ltd Genome editing methods
CA2969619A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Agilent Technologies, Inc. Guide rna with chemical modifications
CN116059378A (zh) 2014-12-10 2023-05-05 明尼苏达大学董事会 用于治疗疾病的遗传修饰的细胞、组织和器官
EP3230451B1 (en) 2014-12-12 2021-04-07 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016100857A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stem cells for modeling type 2 diabetes
EP3232774B1 (en) 2014-12-19 2019-10-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeted genetic modification through single-step multiple targeting
US11248240B2 (en) 2015-01-29 2022-02-15 Meiogenix Method for inducing targeted meiotic recombinations
EP3280803B1 (en) 2015-04-06 2021-05-26 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Chemically modified guide rnas for crispr/cas-mediated gene regulation
EP3286571B1 (en) 2015-04-24 2021-08-18 Editas Medicine, Inc. Evaluation of cas9 molecule/guide rna molecule complexes
WO2016176617A2 (en) 2015-04-29 2016-11-03 New York University Method for treating high-grade gliomas
EP3292219B9 (en) 2015-05-04 2022-05-18 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Methods and kits for fragmenting dna
AU2016261358B2 (en) 2015-05-11 2021-09-16 Editas Medicine, Inc. Optimized CRISPR/Cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
AU2016270649B2 (en) 2015-05-29 2022-04-21 North Carolina State University Methods for screening bacteria, archaea, algae, and yeast using crispr nucleic acids
EP3303585A4 (en) 2015-06-03 2018-10-31 Board of Regents of the University of Nebraska Dna editing using single-stranded dna
WO2016201047A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for improving transplantation
FI3307872T3 (fi) 2015-06-15 2023-10-16 Univ North Carolina State Menetelmiä ja koostumuksia nukleiinihappojen ja rna-pohjaisten antimikrobien tehokkaaseen antamiseen
AU2016278226B2 (en) * 2015-06-17 2021-08-12 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
EP3129393B1 (en) 2015-06-18 2021-08-04 The Broad Institute Inc. Crispr enzyme mutations reducing off-target effects
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
CN107949400A (zh) * 2015-06-24 2018-04-20 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 细胞周期依赖性基因组调控和修饰
US20170119820A1 (en) 2015-07-31 2017-05-04 Regents Of The University Of Minnesota Modified cells and methods of therapy
US10709726B2 (en) 2015-08-14 2020-07-14 The University Of Sydney Connexin 45 inhibition for therapy
IL288662B2 (en) 2015-08-25 2023-09-01 Univ Duke Preparations and methods for improving specificity in genomic engineering using RNA-guided endonucleases
WO2017040348A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US11667911B2 (en) 2015-09-24 2023-06-06 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve CRISPR/CAS-mediated genome editing
KR101745863B1 (ko) 2015-09-25 2017-06-12 전남대학교산학협력단 Crispr/cas9 시스템을 이용한 프로히비틴2 유전자 제거용 시발체
KR101795999B1 (ko) 2015-09-25 2017-11-09 전남대학교산학협력단 Crispr/cas9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체
US11286480B2 (en) 2015-09-28 2022-03-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence specific antimicrobials
EP3362571A4 (en) * 2015-10-13 2019-07-10 Duke University GENOMIC ENGINEERING WITH TYPE I CRISPRISMS IN EUKARYOTIC CELLS
CN108370303B (zh) 2015-10-22 2022-03-08 瑞典爱立信有限公司 与无线电信号的选择性增强有关的方法和设备
JP7067793B2 (ja) * 2015-10-23 2022-05-16 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸塩基編集因子およびその使用
US20180230489A1 (en) 2015-10-28 2018-08-16 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
GB2559526B (en) 2015-11-03 2021-02-17 Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
US11905521B2 (en) 2015-11-17 2024-02-20 The Chinese University Of Hong Kong Methods and systems for targeted gene manipulation
US10240145B2 (en) * 2015-11-25 2019-03-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University CRISPR/Cas-mediated genome editing to treat EGFR-mutant lung cancer
US11542466B2 (en) 2015-12-22 2023-01-03 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of CRISPR based antimicrobials
IL260532B2 (en) 2016-01-11 2023-12-01 Univ Leland Stanford Junior Systems containing chaperone proteins and their uses for controlling gene expression
EA201891614A1 (ru) 2016-01-11 2019-02-28 Те Борд Оф Трастиз Оф Те Лилэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити Химерные белки и способы иммунотерапии
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
US11597924B2 (en) 2016-03-25 2023-03-07 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
US11512311B2 (en) 2016-03-25 2022-11-29 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency
EP3443086B1 (en) 2016-04-13 2021-11-24 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
WO2017180926A1 (en) * 2016-04-14 2017-10-19 Boco Silicon Valley. Inc. Genome editing of human neural stem cells using nucleases
EP3449016A4 (en) 2016-04-25 2019-10-02 President and Fellows of Harvard College HYBRIDIZATION CHAIN REACTION PROCESS FOR IN-SITU MOLECULE DETECTION
WO2017186718A1 (en) * 2016-04-25 2017-11-02 Universität Basel Allele editing and applications thereof
KR102661748B1 (ko) 2016-05-20 2024-05-31 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 다중 가이드 RNAs를 이용한 면역학적 내성 파괴 방법
KR102458395B1 (ko) * 2016-06-02 2022-10-25 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 사용한, 표적화된 게놈 변형의 개선
AU2017277810A1 (en) * 2016-06-03 2018-12-06 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Negative feedback regulation of HIV-1 by gene editing strategy
CA3025591A1 (en) * 2016-06-03 2017-12-07 Philippe Ravassard Diet controlled expression of a nucleic acid encoding cas9 nuclease and uses thereof
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
US10337051B2 (en) 2016-06-16 2019-07-02 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for detecting a target RNA
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
EP3474669B1 (en) 2016-06-24 2022-04-06 The Regents of The University of Colorado, A Body Corporate Methods for generating barcoded combinatorial libraries
US11603533B2 (en) 2016-07-12 2023-03-14 Washington University Incorporation of internal polya-encoded poly-lysine sequence tags and their variations for the tunable control of protein synthesis in bacterial and eukaryotic cells
AU2017302611B2 (en) 2016-07-28 2021-12-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. GPR156 variants and uses thereof
BR112019001783A2 (pt) 2016-07-29 2019-05-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. mamífero não humano, e, métodos para produzir o mamífero não humano e de triagem de um composto.
CA3032822A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating cep290 associated disease
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
KR102547316B1 (ko) 2016-08-03 2023-06-23 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
JP2019524149A (ja) * 2016-08-20 2019-09-05 アベリノ ラボ ユーエスエー インコーポレイテッドＡｖｅｌｌｉｎｏ Ｌａｂ ＵＳＡ， Ｉｎｃ． 一本鎖ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、及びそれらの使用方法
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
US20180105806A1 (en) * 2016-09-07 2018-04-19 Massachusetts Institute Of Technology Method for rna-guided endonuclease-based dna assembly
CN106636197B (zh) * 2016-09-22 2019-09-03 南京市妇幼保健院 一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
MX2019003674A (es) 2016-09-30 2021-01-08 Univ California Enzimas modificadoras de ácido nucleico guiadas por arn y métodos de uso de estas.
US20190233820A1 (en) * 2016-10-11 2019-08-01 Stemgenics, Inc. Nanoparticles functionalized with gene editing tools and related methods
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
WO2018071892A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 Joung J Keith Epigenetically regulated site-specific nucleases
GB201617559D0 (en) 2016-10-17 2016-11-30 University Court Of The University Of Edinburgh The Swine comprising modified cd163 and associated methods
GB2573406B (en) 2016-10-18 2021-11-10 Univ Minnesota Tumor infiltrating lymphocytes and methods of therapy
KR20190072639A (ko) * 2016-11-02 2019-06-25 유니버시타트 바셀 세포 치료에 사용하기 위한 면역학적으로 식별 가능한 세포 표면 변이체
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
KR102151065B1 (ko) * 2016-12-23 2020-09-02 기초과학연구원 동물 배아의 염기 교정용 조성물 및 염기 교정 방법
US11859219B1 (en) 2016-12-30 2024-01-02 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA
KR20190111067A (ko) 2017-01-23 2019-10-01 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 하이드록시스테로이드 17-베타 탈수소효소 13 (hsd17b13) 변이체 및 이의 용도
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
CN106978438B (zh) * 2017-02-27 2020-08-28 北京大北农生物技术有限公司 提高同源重组效率的方法
WO2018165504A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
EP3592777A1 (en) 2017-03-10 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cytosine to guanine base editor
EP3596217A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
IL306092A (en) 2017-03-23 2023-11-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
WO2018195129A1 (en) 2017-04-17 2018-10-25 University Of Maryland, College Park Embryonic cell cultures and methods of using the same
US11834670B2 (en) 2017-04-19 2023-12-05 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Site-specific DNA modification using a donor DNA repair template having tandem repeat sequences
CN110799525A (zh) 2017-04-21 2020-02-14 通用医疗公司 具有改变的PAM特异性的CPF1(CAS12a)的变体
EP3615672A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide rna molecules
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
CA3063449A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 The General Hospital Corporation Using split deaminases to limit unwanted off-target base editor deamination
CA3065938A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. B4galt1 variants and uses thereof
US10428319B2 (en) 2017-06-09 2019-10-01 Editas Medicine, Inc. Engineered Cas9 nucleases
CA3067382A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 The Regents Of The University Of California Targeted non-viral dna insertions
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
AU2018295358A1 (en) 2017-06-27 2020-01-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ASGR1 locus
RU2755308C2 (ru) 2017-06-30 2021-09-15 Инскрипта, Инк. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток (варианты)
EP3645021A4 (en) 2017-06-30 2021-04-21 Intima Bioscience, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
RU2019143568A (ru) 2017-07-31 2021-09-02 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для оценки crispr/cas-индуцированной рекомбинации с экзогенной донорной нуклеиновой кислотой in vivo
BR112020001996A2 (pt) 2017-07-31 2020-08-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. animal não humano, e, métodos para testar e para otimizar a capacidade de uma crispr/cas nuclease de excisar um ácido nucleico genômico in vivo, para testar a recombinação induzida por crispr/cas de um ácido nucleico genômico com um ácido nucleico de doador exógeno in vivo e para otimizar a capacidade de crispr/cas de induzir a recombinação de um ácido nucleico genômico com um ácido nucleico de doador exógeno in vivo.
AU2018311695A1 (en) * 2017-07-31 2020-01-16 Sigma-Aldrich Co. Llc Synthetic guide RNA for CRISPR/Cas activator systems
BR112020001364A2 (pt) 2017-07-31 2020-08-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. métodos para testar e modificar a capacidade de uma crispr/cas nuclease.
WO2019030695A1 (en) * 2017-08-09 2019-02-14 Benson Hill Biosystems, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODIFYING GENOMES
US10738327B2 (en) 2017-08-28 2020-08-11 Inscripta, Inc. Electroporation cuvettes for automation
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
EP3678680A4 (en) * 2017-09-05 2021-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ADMINISTRATION OF A GENE EDITING SYSTEM CONTAINING A SINGLE RETROVIRAL PARTICLE AND METHODS OF GENERATION AND USE
CN111373053A (zh) 2017-09-06 2020-07-03 雷杰纳荣制药公司 单免疫球蛋白白介素-1受体相关分子(sigirr)变体及其用途
CN111278851A (zh) 2017-09-07 2020-06-12 雷杰纳荣制药公司 溶质运载体家族14成员1(slc14a1)变体及其用途
NZ761329A (en) 2017-09-29 2023-04-28 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized ttr locus and methods of use
WO2019068022A1 (en) 2017-09-30 2019-04-04 Inscripta, Inc. CONTINUOUS FLOW ELECTROPORATION INSTRUMENTATION
WO2019079195A1 (en) * 2017-10-16 2019-04-25 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education GENETICALLY MODIFIED MESENCHYMAL STEM CELLS FOR USE IN CARDIOVASCULAR PROSTHESES
JP2021500036A (ja) 2017-10-16 2021-01-07 ザ ブロード インスティテュート, インコーポレーテッドThe Broad Institute, Inc. アデノシン塩基編集因子の使用
SG11202002822XA (en) 2017-10-16 2020-04-29 Regeneron Pharma Cornulin (crnn) variants and uses thereof
CA3080415A1 (en) 2017-10-27 2019-05-02 The Regents Of The University Of California Targeted replacement of endogenous t cell receptors
WO2019089808A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 The Regents Of The University Of California Class 2 crispr/cas compositions and methods of use
CA3076371C (en) 2017-11-10 2022-11-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising slc30a8 mutation and methods of use
US20210180059A1 (en) * 2017-11-16 2021-06-17 Astrazeneca Ab Compositions and methods for improving the efficacy of cas9-based knock-in strategies
IL274740B2 (en) 2017-11-30 2024-06-01 Regeneron Pharma Non-human animals containing a human TRKB locus
WO2019126578A1 (en) * 2017-12-20 2019-06-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
KR102098915B1 (ko) * 2017-12-22 2020-04-09 (주)지플러스 생명과학 키메라 게놈 조작 분자 및 방법
CN111566121A (zh) 2018-01-12 2020-08-21 巴斯夫欧洲公司 小麦7a染色体上决定每穗小穗数QTL的基因
WO2019147302A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 Bauer Daniel E Targeting bcl11a distal regulatory elements with a cas9-cas9 fusion for fetal hemoglobin reinduction
KR102494449B1 (ko) 2018-02-15 2023-01-31 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 진핵 게놈 변형을 위한 조작된 cas9 시스템
KR20240038811A (ko) 2018-03-19 2024-03-25 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 CRISPR/Cas 시스템을 사용한 동물에서의 전사 조절
CN112204131A (zh) 2018-03-29 2021-01-08 因思科瑞普特公司 用于诱导和转化的细胞生长速率的自动化控制
WO2019200004A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
SG11202009783WA (en) 2018-04-19 2020-11-27 Univ California Compositions and methods for gene editing
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US10526598B2 (en) 2018-04-24 2020-01-07 Inscripta, Inc. Methods for identifying T-cell receptor antigens
WO2019209926A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of peptide libraries
KR20210005178A (ko) * 2018-04-27 2021-01-13 시애틀 칠드런즈 호스피탈 디/비/에이 시애틀 칠드런즈 리서치 인스티튜트 X-연관 고 igm 증후군에서의 치료적 게놈 편집
WO2019217803A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 Auxolytic Ltd. Gene therapy methods and compositions using auxotrophic regulatable cells
CN112105732A (zh) * 2018-05-10 2020-12-18 先正达参股股份有限公司 用于多核苷酸的靶向编辑的方法和组合物
CN108624622A (zh) * 2018-05-16 2018-10-09 湖南艾佳生物科技股份有限公司 一种基于CRISPR-Cas9系统构建的能分泌小鼠白细胞介素-6的基因工程细胞株
JP2021523745A (ja) 2018-05-16 2021-09-09 シンテゴ コーポレイション ガイドｒｎａ設計および使用のための方法およびシステム
EP3575402A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-04 Algentech SAS Gene targeting
CA3102975A1 (en) 2018-06-07 2019-12-12 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Methods of regenerating and transforming cannabis
WO2019234754A1 (en) 2018-06-07 2019-12-12 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Nucleic acid constructs and methods of using same
CA3104649A1 (en) * 2018-06-25 2020-12-21 Bionano Genomics, Inc. Labeling of dna
EP3813974A4 (en) 2018-06-30 2022-08-03 Inscripta, Inc. INSTRUMENTS, MODULES AND METHODS FOR ENHANCED DETECTION OF EDITED SEQUENCES IN LIVING CELLS
CN112805379A (zh) * 2018-08-03 2021-05-14 比姆医疗股份有限公司 多效应核碱基编辑器和使用其修饰核酸靶序列的方法
GB201813011D0 (en) 2018-08-10 2018-09-26 Vib Vzw Means and methods for drought tolerance in crops
US10752874B2 (en) 2018-08-14 2020-08-25 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US10532324B1 (en) 2018-08-14 2020-01-14 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
KR102103103B1 (ko) * 2018-08-16 2020-04-21 (주)라트바이오 인위적 뉴클레아제를 생산하는 형질전환 동물 및 형질전환 배아
SG11202101382VA (en) * 2018-08-21 2021-03-30 Sigma Aldrich Co Llc Down-regulation of the cytosolic dna sensor pathway
WO2020081149A2 (en) 2018-08-30 2020-04-23 Inscripta, Inc. Improved detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
CN109055379B (zh) * 2018-09-10 2022-04-15 石铭 一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法
KR102121817B1 (ko) * 2018-09-12 2020-06-26 한국화학연구원 Crispr 편집 기술을 이용한 재조합 항원을 발현시키는 벡터 및 이를 동시에 다중 삽입시키는 방법
US20220053741A1 (en) 2018-09-13 2022-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Complement Factor H Gene Knockout Rat as a Model of C3 Glomerulopathy
EP3861120A4 (en) 2018-10-01 2023-08-16 North Carolina State University RECOMBINANT TYPE I CRISPR-CAS SYSTEM
GB2611929B (en) 2018-10-16 2023-11-22 Blueallele Corp Methods for targeted insertion of DNA in genes
AU2019368215B2 (en) 2018-10-22 2023-05-18 Inscripta, Inc. Engineered enzymes
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
WO2020086908A1 (en) * 2018-10-24 2020-04-30 The Broad Institute, Inc. Constructs for improved hdr-dependent genomic editing
KR20200071198A (ko) 2018-12-10 2020-06-19 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 Nrf2 발현 조절 기반 T 세포 항암면역치료법
CA3117228A1 (en) 2018-12-14 2020-06-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel crispr-cas systems for genome editing
CA3124039A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 King's College London Immunotherapeutic methods and compositions
IL301193A (en) 2018-12-20 2023-05-01 Regeneron Pharma Nuclease-mediated repeat expansion
MX2021008153A (es) * 2019-01-04 2021-08-11 Univ Chicago Sistemas y metodos para modular arn.
WO2020146899A1 (en) * 2019-01-11 2020-07-16 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Targeted in vivo genome modification
US11946040B2 (en) 2019-02-04 2024-04-02 The General Hospital Corporation Adenine DNA base editor variants with reduced off-target RNA editing
US20220298494A1 (en) * 2019-02-14 2022-09-22 Metagenomi Ip Technologies, Llc Enzymes with ruvc domains
GB201902277D0 (en) 2019-02-19 2019-04-03 King S College London Therapeutic agents
MX2021010559A (es) 2019-03-07 2021-12-15 Univ California Polipéptidos efectores de crispr-cas y métodos de uso de estos.
IL286357B1 (en) 2019-03-18 2024-06-01 Regeneron Pharma A CRISPR/CAS screening platform to identify genetic modifiers of tau seeding or aggregation
SG11202108090XA (en) 2019-03-18 2021-08-30 Regeneron Pharma Crispr/cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
AU2020242032A1 (en) 2019-03-19 2021-10-07 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for editing nucleotide sequences
EP3947691A4 (en) 2019-03-25 2022-12-14 Inscripta, Inc. SIMULTANEOUS MULTIPLEX GENOME EDITING IN A YEAST
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
BR112021019512A2 (pt) 2019-04-03 2022-02-15 Regeneron Pharma Métodos para inserir uma sequência de codificação de proteína de ligação ao antígeno e para tratar ou efetuar a profilaxia de uma doença em um animal, animal, célula, genoma, ácido nucleico doador exógeno, gene de porto seguro, e, agente de nuclease ou um ou mais ácidos nucleicos
IL286917B (en) 2019-04-04 2022-09-01 Regeneron Pharma Methods for scar-free insertion of targeted modifications into targeted vectors
ES2966625T3 (es) 2019-04-04 2024-04-23 Regeneron Pharma Roedores que comprenden un locus del factor de coagulación 12 humanizado
GB201905360D0 (en) 2019-04-16 2019-05-29 Univ Nottingham Fungal strains, production and uses thereof
AU2020274594A1 (en) 2019-05-10 2022-01-20 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
AU2020286382A1 (en) 2019-06-04 2021-11-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
CN113939593A (zh) 2019-06-06 2022-01-14 因思科瑞普特公司 用于递归的核酸指导的细胞编辑的处治
EP3796776A1 (en) 2019-06-07 2021-03-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized albumin locus
US11845957B2 (en) 2019-06-14 2023-12-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Models of tauopathy
US10907125B2 (en) 2019-06-20 2021-02-02 Inscripta, Inc. Flow through electroporation modules and instrumentation
AU2020297499A1 (en) 2019-06-21 2022-02-03 Inscripta, Inc. Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in E. coli
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
WO2021050398A1 (en) * 2019-09-10 2021-03-18 The Regents Of The University Of California Synthetic lethality screening platform for cells undergoing alt
EP4028530A1 (en) 2019-09-12 2022-07-20 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
US20210079394A1 (en) 2019-09-13 2021-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems delivered by lipid nanoparticles
WO2021069387A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
BR112022008861A2 (pt) 2019-11-08 2022-08-23 Regeneron Pharma Construto de ácido nucleico, vetor, nanopartícula lipídica, célula, composição para uso na expressão de retinosquisina, método para integrar uma sequência de codificação, e, método para modificar um gene rs1
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
AU2020396138A1 (en) 2019-12-03 2022-06-16 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
WO2021118626A1 (en) 2019-12-10 2021-06-17 Inscripta, Inc. Novel mad nucleases
US10704033B1 (en) 2019-12-13 2020-07-07 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
KR20220116485A (ko) 2019-12-16 2022-08-23 바스프 아그리컬쳐럴 솔루션즈 시드 유에스 엘엘씨 쌍을 형성한 닉카제를 이용하는 개선된 게놈 편집
EP4069851A4 (en) 2019-12-18 2023-11-22 Inscripta, Inc. CASCADE/DCAS3 COMPLEMENTATION ASSAYS FOR IN VIVO DETECTION OF NUCLEIC ACID-GUIDED NUCLEASE-MODIFIED CELLS
BR112022013772A2 (pt) * 2020-01-09 2022-10-11 Pioneer Hi Bred Int Troca de genes em duas etapas
US10689669B1 (en) 2020-01-11 2020-06-23 Inscripta, Inc. Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems
EP4096770A1 (en) 2020-01-27 2022-12-07 Inscripta, Inc. Electroporation modules and instrumentation
EP4096396A1 (en) 2020-01-28 2022-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use
EP4099821A1 (en) 2020-02-07 2022-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <smallcaps/>? ? ?klkb1? ? ? ? ?non-human animals comprising a humanizedlocus and methods of use
AU2021232598A1 (en) 2020-03-04 2022-09-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for sensitization of tumor cells to immune therapy
US20230102342A1 (en) 2020-03-23 2023-03-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
EP4127156A4 (en) 2020-03-31 2024-03-27 Metagenomi Inc CLASS II TYPE II CRISPR SYSTEMS
WO2021202938A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Creyon Bio, Inc. Oligonucleotide-based machine learning
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
BR112022022603A2 (pt) 2020-05-08 2023-01-17 Broad Inst Inc Métodos e composições para edição simultânea de ambas as fitas de sequência alvo de nucleotídeos de fita dupla
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
WO2021263146A2 (en) 2020-06-26 2021-12-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ace2 locus
CN111849986A (zh) * 2020-07-24 2020-10-30 江苏集萃药康生物科技有限公司 一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用
US11299731B1 (en) 2020-09-15 2022-04-12 Inscripta, Inc. CRISPR editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
WO2022120022A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
WO2022133139A2 (en) * 2020-12-16 2022-06-23 Administrators Of The Tulane Educational Fund Wnt+ adipocytes, exosomes from wnt+ adipocyte, and methods of making and using them
US11306298B1 (en) 2021-01-04 2022-04-19 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
GB202103131D0 (en) 2021-03-05 2021-04-21 Biosystems Tech Limited Method for preparation of research organisms
EP4337769A1 (en) 2021-05-10 2024-03-20 SQZ Biotechnologies Company Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof
WO2022251644A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
AU2022286947A1 (en) 2021-06-02 2023-12-14 Lyell Immunopharma, Inc. NR4A-deficient cells expressing c-Jun and uses thereof
KR20240055811A (ko) 2021-09-10 2024-04-29 애질런트 테크놀로지스, 인크. 프라임 편집을 위한 화학적 변형을 갖는 가이드 rna
CN118119702A (zh) 2021-10-14 2024-05-31 隆萨销售股份有限公司 用于细胞外囊泡产生的经修饰的生产者细胞
WO2023077053A2 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5
WO2023077148A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
AU2022381205A1 (en) 2021-11-04 2024-03-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a modified cacng1 locus
AU2022408167A1 (en) 2021-12-08 2024-06-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutant myocilin disease model and uses thereof
GB202118058D0 (en) 2021-12-14 2022-01-26 Univ Warwick Methods to increase yields in crops
US20230279442A1 (en) 2021-12-15 2023-09-07 Versitech Limited Engineered cas9-nucleases and method of use thereof
WO2023122506A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci
WO2023122764A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
AU2022424002A1 (en) 2021-12-29 2024-06-13 Bristol-Myers Squibb Company Generation of landing pad cell lines
WO2023150181A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating cancer
WO2023150620A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-mediated transgene insertion in neonatal cells
WO2023150798A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
WO2023212677A2 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
WO2023215831A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Tome Biosciences, Inc. Guide rna compositions for programmable gene insertion
WO2023220603A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
WO2023225665A1 (en) 2022-05-19 2023-11-23 Lyell Immunopharma, Inc. Polynucleotides targeting nr4a3 and uses thereof
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
WO2023235726A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr interference therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023250384A2 (en) * 2022-06-22 2023-12-28 The Regents Of The University Of California Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof
GB2621813A (en) 2022-06-30 2024-02-28 Univ Newcastle Preventing disease recurrence in Mitochondrial replacement therapy
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
WO2024026488A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a modified transferrin receptor locus
WO2024031053A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Aggregation-resistant variants of tdp-43
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
WO2024073606A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody resistant modified receptors to enhance cell-based therapies
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024083579A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
US20240182561A1 (en) 2022-11-04 2024-06-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
US20240173426A1 (en) 2022-11-14 2024-05-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes
WO2024107670A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric proteins comprising membrane bound il-12 with protease cleavable linkers

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
US20110217739A1 (en) * 2008-11-06 2011-09-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cas6 polypeptides and methods of use
WO2011154393A1 (en) * 2010-06-07 2011-12-15 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Fusion proteins comprising a dna-binding domain of a tal effector protein and a non-specific cleavage domain of a restriction nuclease and their use

Family Cites Families (165)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
WO1988008450A1 (en) 1987-05-01 1988-11-03 Birdwell Finlayson Gene therapy for metabolite disorders
US5350689A (en) 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
US5767367A (en) 1990-06-23 1998-06-16 Hoechst Aktiengesellschaft Zea mays (L.) with capability of long term, highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize plants having a heterologous gene, and their preparation
US7150982B2 (en) 1991-09-09 2006-12-19 Third Wave Technologies, Inc. RNA detection assays
FR2763797B1 (fr) * 1997-05-30 1999-07-16 Tabacs & Allumettes Ind Cigarette a tres faible taux de goudron presentant un gout de tabac comparable a celui d'une cigarette classique a plus fort taux de goudron
US20040186071A1 (en) 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US20020182673A1 (en) 1998-05-15 2002-12-05 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypedies and therapeutic uses thereof
CA2361191A1 (en) 1999-02-03 2000-08-10 The Children's Medical Center Corporation Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site
US8183339B1 (en) * 1999-10-12 2012-05-22 Xigen S.A. Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
WO2002026967A2 (en) 2000-09-25 2002-04-04 Thomas Jefferson University Targeted gene correction by single-stranded oligodeoxynucleotides
JP4254931B1 (ja) 2000-10-27 2009-04-15 カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ Ａ群連鎖球菌およびｂ群連鎖球菌由来の核酸およびタンパク質
US7033744B2 (en) * 2001-03-16 2006-04-25 Naoya Kobayashi Method for proliferating a liver cell, a liver cell obtained thereby, and use thereof
IL159756A0 (en) 2001-07-12 2004-06-20 Univ Massachusetts IN VIVO PRODUCTION OF SMALL INTERFERING RNAs THAT MEDIATE GENE SILENCING
US20060253913A1 (en) 2001-12-21 2006-11-09 Yue-Jin Huang Production of hSA-linked butyrylcholinesterases in transgenic mammals
BR0307383A (pt) 2002-01-23 2005-04-26 Univ Utah Res Found Mutagênese cromossomica alvo utilizando nucleases de ramificações de zinco
WO2003080809A2 (en) 2002-03-21 2003-10-02 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
AU2003224897A1 (en) 2002-04-09 2003-10-27 Kenneth L. Beattie Oligonucleotide probes for genosensor chips
AU2003233719A1 (en) * 2002-06-06 2003-12-22 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Modifying the dna recombination potential in eukaryotes
JP2006502748A (ja) 2002-09-05 2006-01-26 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 遺伝子ターゲッティングを誘発するキメラヌクレアーゼの使用方法
DE10260805A1 (de) * 2002-12-23 2004-07-22 Geneart Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Optimieren einer Nucleotidsequenz zur Expression eines Proteins
EP1651660B1 (en) * 2003-08-08 2018-01-24 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US8053232B2 (en) 2004-01-23 2011-11-08 Virxsys Corporation Correction of alpha-1-antitrypsin genetic defects using spliceosome mediated RNA trans splicing
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US20050220796A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Dynan William S Compositions and methods for modulating DNA repair
US7919277B2 (en) 2004-04-28 2011-04-05 Danisco A/S Detection and typing of bacterial strains
AU2005319306B9 (en) * 2004-12-22 2012-04-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conserved HBV and HCV sequences useful for gene silencing
US7892224B2 (en) 2005-06-01 2011-02-22 Brainlab Ag Inverse catheter planning
US7534819B2 (en) 2005-06-10 2009-05-19 University Of Washington Compositions and methods for intracellular delivery of biotinylated cargo
US20060282289A1 (en) 2005-06-14 2006-12-14 Healthmatch Solutions, Llc System and method for health care financing
US20100055793A1 (en) * 2005-07-25 2010-03-04 Johns Hopkins University Site-specific modification of the human genome using custom-designed zinc finger nucleases
KR20080033455A (ko) 2005-07-26 2008-04-16 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 외래 핵산 서열의 표적화된 통합 및 발현
US10022457B2 (en) 2005-08-05 2018-07-17 Gholam A. Peyman Methods to regulate polarization and enhance function of cells
NZ597299A (en) 2005-08-26 2013-03-28 Dupont Nutrition Biosci Aps Use of a cas gene in combination with CRISPR repeats for modulating resistance in a cell
KR100877824B1 (ko) * 2005-11-11 2009-01-12 한국생명공학연구원 Ｅ2ｅｐｆ ｕｃｐ-ｖｈｌ 상호작용 및 그 용도
EP2522749A1 (en) * 2006-03-02 2012-11-14 The Ohio State University MicroRNA expression profile associated with pancreatic cancer
US9677123B2 (en) 2006-03-15 2017-06-13 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Degenerate nucleobase analogs
WO2007126856A2 (en) * 2006-03-28 2007-11-08 Novartis Ag Covalently-linked complexes of hiv tat and env proteins
ATE513053T1 (de) 2006-05-10 2011-07-15 Deinove Sa Verfahren zur chromosomenmanipulation unter verwendung eines neuen dna-reparatursystems
US9399801B2 (en) 2006-05-19 2016-07-26 Dupont Nutrition Biosciences Aps Tagged microorganisms and methods of tagging
EP2019839B1 (en) 2006-05-25 2011-12-07 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
ES2610811T3 (es) 2006-06-16 2017-05-03 Dupont Nutrition Biosciences Aps Bacteria Streptococcus thermophilus
WO2008019123A2 (en) * 2006-08-04 2008-02-14 Georgia State University Research Foundation, Inc. Enzyme sensors, methods for preparing and using such sensors, and methods of detecting protease activity
MX2009009071A (es) 2007-03-02 2009-09-24 Danisco Cultivos con resistencia mejorada a fagos.
GB0806086D0 (en) 2008-04-04 2008-05-14 Ulive Entpr Ltd Dendrimer polymer hybrids
US8546553B2 (en) 2008-07-25 2013-10-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic RNAi-like system and methods of use
AU2009283194B2 (en) 2008-08-22 2014-10-16 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration
DK2334794T3 (en) 2008-09-15 2017-02-20 Children's Medical Center Corp MODULATION OF BCL11A FOR TREATMENT OF HEMOGLOBINOPATHIES
DK2362915T3 (en) 2008-11-07 2017-03-27 Dupont Nutrition Biosci Aps CRISPR SEQUENCES OF BIFIDOBACTERIA
EP2789687A1 (en) 2008-12-12 2014-10-15 DuPont Nutrition Biosciences ApS Genetic cluster of strains of Streptococcus thermophilus having unique rheological properties for dairy fermentation
WO2010075424A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 The Regents Of University Of California Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
GB0823658D0 (en) 2008-12-30 2009-02-04 Angiomed Ag Stent delivery device
US8392349B2 (en) 2009-02-23 2013-03-05 Shalini Vajjhala Global adaptation atlas and method of creating same
AU2010235161B2 (en) 2009-04-09 2015-01-22 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted integration into stem cells
PT2424571T (pt) 2009-04-30 2020-05-06 Ospedale San Raffaele Srl Vetor génico
AU2010275432A1 (en) 2009-07-24 2012-02-02 Sigma-Aldrich Co. Llc. Method for genome editing
US20120192298A1 (en) * 2009-07-24 2012-07-26 Sigma Aldrich Co. Llc Method for genome editing
EP2727600B1 (en) 2009-07-28 2019-03-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Zinc finger fusion proteins for repressing a huntington gene
KR101418355B1 (ko) 2009-10-23 2014-07-11 (주)바이오니아 고밀도 유전자 합성기
DE102009052674B4 (de) 2009-11-12 2012-10-18 Karl Weinhold Verfahren und Vorrichtung zum Verbinden von Doppelmantelrohren
US20110294114A1 (en) 2009-12-04 2011-12-01 Cincinnati Children's Hospital Medical Center Optimization of determinants for successful genetic correction of diseases, mediated by hematopoietic stem cells
DK2816112T3 (en) 2009-12-10 2018-11-19 Univ Minnesota TAL effector-mediated DNA modification
EP2534163B1 (en) 2010-02-09 2015-11-04 Sangamo BioSciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
JP5926242B2 (ja) 2010-05-10 2016-05-25 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア エンドリボヌクレアーゼ組成物およびその使用方法
EP3156062A1 (en) 2010-05-17 2017-04-19 Sangamo BioSciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof
US20140148361A1 (en) 2010-06-07 2014-05-29 Barry L. Stoddard Generation and Expression of Engineered I-ONUI Endonuclease and Its Homologues and Uses Thereof
AU2011265733B2 (en) 2010-06-14 2014-04-17 Iowa State University Research Foundation, Inc. Nuclease activity of TAL effector and Foki fusion protein
SG187075A1 (en) * 2010-07-23 2013-03-28 Sigma Aldrich Co Llc Genome editing using targeting endonucleases and single-stranded nucleic acids
US9081737B2 (en) 2010-08-02 2015-07-14 Integrated Dna Technologies, Inc. Methods for predicting stability and melting temperatures of nucleic acid duplexes
DK2630156T3 (en) 2010-10-20 2018-12-17 Dupont Nutrition Biosci Aps CRISPR-CAS SEQUENCES OF LACTOCOCCUS
WO2012069657A1 (en) * 2010-11-26 2012-05-31 Institut Pasteur Identification of a human gyrovirus and applications.
WO2012087756A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger nuclease modification of leucine rich repeat kinase 2 (lrrk2) mutant fibroblasts and ipscs
KR20120096395A (ko) 2011-02-22 2012-08-30 주식회사 툴젠 뉴클레아제에 의해 유전자 변형된 세포를 농축시키는 방법
WO2012164565A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
IL277027B (en) 2011-09-21 2022-07-01 Sangamo Therapeutics Inc Methods and preparations for regulating transgene expression
JP6144691B2 (ja) * 2011-11-16 2017-06-07 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 修飾されたｄｎａ結合タンパク質およびその使用
US8450107B1 (en) 2011-11-30 2013-05-28 The Broad Institute Inc. Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
SG10201606959PA (en) 2012-02-24 2016-09-29 Hutchinson Fred Cancer Res Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
CA2865011C (en) 2012-02-29 2021-06-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
AU2013204327B2 (en) 2012-04-20 2016-09-01 Aviagen Cell transfection method
CN104245940A (zh) 2012-04-23 2014-12-24 拜尔作物科学公司 植物中的靶向基因组工程
IN2014DN09261A (zh) 2012-04-25 2015-07-10 Regeneron Pharma
BR112014027227B1 (pt) 2012-05-02 2022-04-19 Sangamo Biosciences, Inc. Métodos para produzir uma planta que apresenta expressão reduzida do gene endógeno de malato desidrogenase (mdh), e para aumentar o rendimento da cultura
CN104471067B (zh) 2012-05-07 2020-08-14 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于核酸酶介导的转基因靶向整合的方法和组合物
US11120889B2 (en) 2012-05-09 2021-09-14 Georgia Tech Research Corporation Method for synthesizing a nuclease with reduced off-site cleavage
MA37663B1 (fr) * 2012-05-25 2019-12-31 Univ California Procédés et compositions permettant la modification de l'adn cible dirigée par l'arn et la modulation de la transcription dirigée par l'arn
MX2014014650A (es) 2012-05-30 2015-10-14 Univ Washington Minivectores superenrollados como una herramienta para la reparacion, alteración y reemplazo de ácido desoxirribonucleico.
WO2013188037A2 (en) 2012-06-11 2013-12-19 Agilent Technologies, Inc Method of adaptor-dimer subtraction using a crispr cas6 protein
MX2014015204A (es) 2012-06-12 2015-08-07 Genentech Inc Metodos y composiciones para generar alelos con inactivacion condicional.
EP2674501A1 (en) 2012-06-14 2013-12-18 Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation,de l'environnement et du travail Method for detecting and identifying enterohemorrhagic Escherichia coli
US9688971B2 (en) 2012-06-15 2017-06-27 The Regents Of The University Of California Endoribonuclease and methods of use thereof
EP2861737B1 (en) 2012-06-19 2019-04-17 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
JP6329537B2 (ja) 2012-07-11 2018-05-23 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 生物学的薬剤の送達のための方法および組成物
ES2813080T3 (es) 2012-07-11 2021-03-22 Sangamo Therapeutics Inc Métodos y composiciones para el tratamiento de enfermedades por almacenamiento lisosomal
CN116622704A (zh) 2012-07-25 2023-08-22 布罗德研究所有限公司 可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用
WO2014022702A2 (en) 2012-08-03 2014-02-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
EA039384B1 (ru) 2012-08-29 2022-01-20 Сангамо Байосаенсез, Инк. Белок "цинковые пальцы" для модулирования экспрессии гена bcl11a и способ модулирования экспрессии глобинового гена
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
AU2013312538B2 (en) 2012-09-07 2019-01-24 Corteva Agriscience Llc FAD3 performance loci and corresponding target site specific binding proteins capable of inducing targeted breaks
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
US20150267176A1 (en) 2012-10-12 2015-09-24 The General Hospital Corporation Transcription activator-like effector (tale) - lysine-specific demethylase 1 (lsd1) fusion proteins
KR102182847B1 (ko) 2012-10-23 2020-11-27 주식회사 툴젠 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도
WO2014070887A1 (en) 2012-10-30 2014-05-08 Recombinetics, Inc. Control of sexual maturation in animals
WO2014071006A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 Cellectis Coupling herbicide resistance with targeted insertion of transgenes in plants
US20140127752A1 (en) 2012-11-07 2014-05-08 Zhaohui Zhou Method, composition, and reagent kit for targeted genomic enrichment
EP3617309A3 (en) 2012-12-06 2020-05-06 Sigma Aldrich Co. LLC Crispr-based genome modification and regulation
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
KR20150105634A (ko) 2012-12-12 2015-09-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 개선된 시스템, 방법 및 효소 조성물의 유전자 조작 및 최적화
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
DK2931898T3 (en) * 2012-12-12 2016-06-20 Massachusetts Inst Technology CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH FUNCTIONAL DOMAINS
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
IL293526A (en) 2012-12-12 2022-08-01 Harvard College Providing, engineering and optimizing systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
PT2771468E (pt) 2012-12-12 2015-06-02 Harvard College Engenharia de sistemas, métodos e composições-guia otimizadas para manipulação de sequências
WO2014093595A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP3064585B1 (en) 2012-12-12 2020-02-05 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
AR093979A1 (es) 2012-12-13 2015-07-01 Dow Agrosciences Llc Metodos de deteccion de adn para actividad de nucleasa especifica de sitio
ES2741951T3 (es) 2012-12-17 2020-02-12 Harvard College Modificación por ingeniería genética del genoma humano guiada por ARN
EP2938184B1 (en) 2012-12-27 2018-10-31 Keygene N.V. Method for removing genetic linkage in a plant
CN113005148A (zh) 2013-01-16 2021-06-22 爱默蕾大学 Cas9-核酸复合物及其相关用途
CN103233028B (zh) 2013-01-25 2015-05-13 南京徇齐生物技术有限公司 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列
WO2014127287A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Massachusetts Institute Of Technology Method for in vivo tergated mutagenesis
RU2690352C2 (ru) 2013-02-20 2019-05-31 Регенерон Фармасютикалс, Инк. Генетическая модификация крыс
AU2014218621B2 (en) 2013-02-25 2019-11-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
RU2018122288A (ru) 2013-03-14 2019-03-06 Карибо Биосайенсиз, Инк. Композиции и способы с участием нуклеиновых кислот, нацеленных на нуклеиновые кислоты
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
AU2014227653B2 (en) 2013-03-15 2017-04-20 The General Hospital Corporation Using RNA-guided foki nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-guided genome editing
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
US20140364333A1 (en) 2013-03-15 2014-12-11 President And Fellows Of Harvard College Methods for Live Imaging of Cells
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US20140273235A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota ENGINEERING PLANT GENOMES USING CRISPR/Cas SYSTEMS
WO2014165825A2 (en) 2013-04-04 2014-10-09 President And Fellows Of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
CA2908512C (en) 2013-04-05 2023-10-24 Dow Agrosciences Llc Methods and compositions for integration of an exogenous sequence within the genome of plants
SI2986729T1 (sl) 2013-04-16 2019-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ciljana sprememba genoma podgane
CN103224947B (zh) 2013-04-28 2015-06-10 陕西师范大学 一种基因打靶系统
CA2910427C (en) 2013-05-10 2024-02-20 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
EP2999788B1 (en) 2013-05-22 2020-07-08 Northwestern University Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
US11414695B2 (en) 2013-05-29 2022-08-16 Agilent Technologies, Inc. Nucleic acid enrichment using Cas9
US20140356956A1 (en) 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
ES2767318T3 (es) 2013-06-17 2020-06-17 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para generar modelos y actuar sobre enfermedades y trastornos de células posmitóticas
AU2014281027A1 (en) 2013-06-17 2016-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Optimized CRISPR-Cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
SG11201510284XA (en) 2013-06-17 2016-01-28 Broad Inst Inc Delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
EP3011034B1 (en) 2013-06-17 2019-08-07 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
CN103343120B (zh) 2013-07-04 2015-03-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
CN103382468B (zh) * 2013-07-04 2015-04-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种水稻基因组定点改造方法
IL282489B (en) 2013-07-10 2022-07-01 Harvard College Cas9 proteins are orthogonal to the regulation and editing of guided genes - RNA
CN103388006B (zh) 2013-07-26 2015-10-28 华东师范大学 一种基因定点突变的构建方法
US10421957B2 (en) 2013-07-29 2019-09-24 Agilent Technologies, Inc. DNA assembly using an RNA-programmable nickase
EP3065540B1 (en) 2013-11-04 2021-12-15 Corteva Agriscience LLC Optimal maize loci
MX362066B (es) 2013-11-04 2019-01-07 Dow Agrosciences Llc Loci óptimos de soya.
TWI672378B (zh) 2013-11-04 2019-09-21 陶氏農業科學公司 最適大豆基因座（一）
CN106459995B (zh) 2013-11-07 2020-02-21 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
MX2016007654A (es) 2013-12-11 2017-08-15 Regeneron Pharma Metodos y composiciones para la modificacion dirigida de un genoma.
US9850525B2 (en) 2014-01-29 2017-12-26 Agilent Technologies, Inc. CAS9-based isothermal method of detection of specific DNA sequence
WO2015117041A1 (en) 2014-01-30 2015-08-06 Nair Ramesh B Gene modification-mediated methods and compositions for generating dominant traits in eukaryotic systems
US20150225801A1 (en) 2014-02-11 2015-08-13 California Institute Of Technology Recording and mapping lineage information and molecular events in individual cells
EP3110454B1 (en) 2014-02-24 2020-11-18 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
US9624498B2 (en) 2014-03-18 2017-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
US20110217739A1 (en) * 2008-11-06 2011-09-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cas6 polypeptides and methods of use
WO2011154393A1 (en) * 2010-06-07 2011-12-15 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Fusion proteins comprising a dna-binding domain of a tal effector protein and a non-specific cleavage domain of a restriction nuclease and their use

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GIEDRIUS GASIUNAS ET AL: "Cas9–crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria", 《PNAS》 *
MARTIN JINEK等: "A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity", 《SCIENCE》 *
张伟峰等: "锌指核酸酶技术的应用", 《生命的化学》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113728099A (zh) * 2019-02-15 2021-11-30 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 Crispr/cas融合蛋白和系统
US11965184B2 (en) 2019-02-15 2024-04-23 Sigma-Aldrich Co. Llc CRISPR/Cas fusion proteins and systems
CN110628825A (zh) * 2019-10-14 2019-12-31 上海捷易生物科技有限公司 一种依赖nhej的报告基因敲入组合物及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
DK3363902T3 (da) 2020-01-02
KR20150091052A (ko) 2015-08-07
KR20230003624A (ko) 2023-01-06
US20160298133A1 (en) 2016-10-13
US20210388396A1 (en) 2021-12-16
PT2928496T (pt) 2019-11-11
EP3363902A1 (en) 2018-08-22
CN108715602A (zh) 2018-10-30
US20160298125A1 (en) 2016-10-13
ES2653212T3 (es) 2018-02-06
KR20200098727A (ko) 2020-08-20
PT3363902T (pt) 2019-12-19
EP3138911B1 (en) 2018-12-05
HK1218389A1 (zh) 2017-02-17
CA2977152A1 (en) 2014-06-12
KR101844123B1 (ko) 2018-04-02
KR102006880B1 (ko) 2019-08-02
DK3138911T3 (en) 2019-01-21
PL3138911T3 (pl) 2019-04-30
AU2023216829A1 (en) 2023-09-14
CA2891347A1 (en) 2014-06-12
PL3138910T3 (pl) 2018-01-31
KR20180011351A (ko) 2018-01-31
IL238856B (en) 2018-03-29
US20160298134A1 (en) 2016-10-13
AU2018229489B2 (en) 2018-12-06
CA2977152C (en) 2019-04-09
US20160298135A1 (en) 2016-10-13
EP2928496B1 (en) 2019-10-09
JP2019037231A (ja) 2019-03-14
ES2713243T3 (es) 2019-05-20
AU2020273316B2 (en) 2023-05-18
IL291129B1 (en) 2023-03-01
LT3138911T (lt) 2019-02-25
EP3617309A2 (en) 2020-03-04
PT3360964T (pt) 2019-10-29
DK3360964T3 (da) 2019-10-28
AU2019201344B2 (en) 2020-09-03
DK3138912T3 (en) 2019-01-21
LT3138910T (lt) 2017-11-10
IL257178B (en) 2019-07-31
KR102479178B1 (ko) 2022-12-19
JP7478772B2 (ja) 2024-05-07
ES2757808T3 (es) 2020-04-30
US20160298136A1 (en) 2016-10-13
EP3611263A1 (en) 2020-02-19
EP3360964A1 (en) 2018-08-15
PL2928496T3 (pl) 2020-04-30
ES2757325T3 (es) 2020-04-28
JP2022115994A (ja) 2022-08-09
SG10202107423UA (en) 2021-08-30
US20160298132A1 (en) 2016-10-13
CN105142669B (zh) 2018-07-03
IL267598A (en) 2019-08-29
AU2020230246A1 (en) 2020-10-01
US20200140897A1 (en) 2020-05-07
AU2022200330B2 (en) 2023-11-09
US10745716B2 (en) 2020-08-18
KR20210045515A (ko) 2021-04-26
KR102145760B1 (ko) 2020-08-19
EP3617309A3 (en) 2020-05-06
KR102243092B1 (ko) 2021-04-22
IL300199A (en) 2023-03-01
AU2013355214A1 (en) 2015-06-04
EP2928496A4 (en) 2017-03-01
US20160298137A1 (en) 2016-10-13
EP3138909A1 (en) 2017-03-08
AU2020230243A1 (en) 2020-10-01
LT3138912T (lt) 2019-02-25
AU2018229489A1 (en) 2018-10-04
AU2017204031B2 (en) 2018-06-14
PT3138912T (pt) 2018-12-28
US20160298138A1 (en) 2016-10-13
CA3034794A1 (en) 2014-06-12
EP3360964B1 (en) 2019-10-02
SG10201800585VA (en) 2018-02-27
US10731181B2 (en) 2020-08-04
PL3363902T3 (pl) 2020-05-18
SG10201910987SA (en) 2020-01-30
DK2928496T3 (da) 2019-11-11
IL291129A (en) 2022-05-01
WO2014089290A1 (en) 2014-06-12
AU2017204031A1 (en) 2017-07-06
IL291129B2 (en) 2023-07-01
JP2017192392A (ja) 2017-10-26
AU2020230246B2 (en) 2020-11-05
JP2020120674A (ja) 2020-08-13
DK3138910T3 (en) 2017-10-16
EP3135765A1 (en) 2017-03-01
AU2022200330A1 (en) 2022-02-17
EP3138910A1 (en) 2017-03-08
US20160017366A1 (en) 2016-01-21
EP3363902B1 (en) 2019-11-27
KR102531576B1 (ko) 2023-05-11
PT3138911T (pt) 2018-12-28
CA2891347C (en) 2018-02-27
BR112015012375A2 (pt) 2017-09-26
AU2019201344A1 (en) 2019-03-21
KR20190093680A (ko) 2019-08-09
EP2928496A1 (en) 2015-10-14
PL3138912T3 (pl) 2019-04-30
IL267598B (en) 2022-05-01
CN105142669A (zh) 2015-12-09
KR20230070065A (ko) 2023-05-19
AU2020273316A1 (en) 2020-12-17
EP3138912B1 (en) 2018-12-05
US20210207173A1 (en) 2021-07-08
ES2714154T3 (es) 2019-05-27
JP6620018B2 (ja) 2019-12-11
SG11201503824SA (en) 2015-06-29
PL3360964T3 (pl) 2020-03-31
ES2769310T3 (es) 2020-06-25
US20170191082A1 (en) 2017-07-06
US20210079427A1 (en) 2021-03-18
AU2013355214B2 (en) 2017-06-15
EP3138910B1 (en) 2017-09-20
IL238856A0 (en) 2015-06-30
AU2019201344C1 (en) 2020-12-24
AU2020230243B2 (en) 2021-10-21
EP3138912A1 (en) 2017-03-08
IL257178A (en) 2018-03-29
JP2016502840A (ja) 2016-02-01
LT3363902T (lt) 2020-02-10
US20170073705A1 (en) 2017-03-16
EP3138911A1 (en) 2017-03-08
CN108913676B (zh) 2023-11-03
PT3138910T (pt) 2017-10-18
EP3141604A1 (en) 2017-03-15
JP2021101706A (ja) 2021-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022200330B2 (en) Crispr-based genome modification and regulation
KR102676910B1 (ko) Crispr-기초된 유전체 변형과 조절

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40001091

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant