ES2714154T3 - Modificación y regulación del genoma en base a CRISPR - Google Patents

Modificación y regulación del genoma en base a CRISPR Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de modificar una secuencia cromosómica de una célula eucariota mediante la integración de una secuencia donadora, comprendiendo el procedimiento: a) introducir en la célula eucariota (i) al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una seña de localización nuclear o ácido nucleico que codifica al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una señal de localización nuclear, en la que la al menos una endonucleasa guiada por ARN es un sistema de proteínas repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)/(Cas) asociado a CRISPR (CRISPR /Cas) de tipo II y el sistema de proteínas CRISPR/Cas de tipo II es una proteína Cas9, (ii) al menos un ARN o ADN guía que codifica al menos un ARN guía, y (iii) un polinucleótido donador que comprende la secuencia donadora; y b) cultivar la célula eucariota de manera que cada ARN guía guíe una endonucleasa guiada por ARN a un sitio diana en la secuencia cromosómica, la endonucleasa guiada por ARN introduce una rotura de doble cadena en el sitio diana, y la rotura de doble cadena se repara mediante un proceso de reparación de ADN, de manera que la secuencia cromosómica se modifica mediante la inserción o la sustitución de la secuencia donadora en la secuencia cromosómica, en la que el sitio diana en la secuencia cromosómica está seguido inmediatamente por un motivo adyacente de protoespaciador (PAM), el procedimiento no comprende un proceso de modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano y, en el que el procedimiento no comprende un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.

Description

DESCRIPCION
Modificacion y regulacion del genoma en base a CRISPR
Campo de la invencion
La presente divulgacion se refiere a una modificacion dirigida del genoma. En particular, la divulgacion se refiere a endonucleasas guiadas por ARN que comprenden la protema de tipo CRISPR/Cas y procedimientos para usar dichas protemas para modificar y regular secuencias cromosomicas dirigidas.
Antecedentes de la invencion
La modificacion genomica dirigida es una herramienta poderosa para la manipulacion genetica de las celulas eucariotas, de embriones y de animales. Por ejemplo, las secuencias exogenas se pueden integrar en localizaciones genomicas dirigidas y/o las secuencias cromosomicas endogenas espedficas se pueden eliminar, desactivar o modificar. Los procedimientos actuales se basan en el uso de enzimas nucleasas disenadas geneticamente, tales como, por ejemplo, las nucleasas de dedos de cinc (ZFN, del ingles zinc finger nucleases) o nucleasas de tipo activadores de transcripcion (TALEN, del ingles transcription activator-like effector nucleases). Estas nucleasas quimericas contienen modulos de union a ADN programables y espedficos de secuencia unidos a un dominio de escision de ADN no espedfico. Cada nueva diana genomica, sin embargo, requiere el diseno de una nueva ZFN o TALEN que comprende un nuevo modulo de union a ADN espedfico de secuencia. Por lo tanto, estas nucleasas disenadas a medida tienden a ser costosas y requieren mucho tiempo para prepararse. Por otra parte, las especificidades de ZFN y TALEN son tales que pueden mediar en escisiones fuera de la diana.
Por lo tanto, existe una necesidad de una tecnologfa de modificacion de genoma dirigida que no requiera el diseno de una nueva nucleasa para cada nueva localizacion genomica dirigida. Ademas, existe una necesidad de una tecnologfa con especificidad aumentada con pocos o sin efectos fuera de la diana.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona un procedimiento para modificar una secuencia cromosomica en una celula eucariota integrando una secuencia donadora, comprendiendo el procedimiento (a) introducir en la celula eucariota (i) al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una senal de localizacion nuclear o acido nucleico que codifica al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una senal de localizacion nuclear, en la que la al menos una endonucleasa guiada por ARN es un sistema de protemas de repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR, del ingles clustered regularly interspersed short palindromic repeats)/(Cas) asociado a CRISPR de tipo II y el sistema de protemas CRISPR/Cas de tipo II es una protema Cas9, (ii) al menos un ARN o ADN grna que codifica al menos un ARN grna, y, (iii) un polinucleotido donador que comprende una secuencia donadora; y (b) cultivar la celula eucariota de manera que cada ARN grna grne una endonucleasa guiada por ARN a un sitio diana en la secuencia cromosomica donde la endonucleasa guiada por ARN introduce una rotura de doble cadena en el sitio diana, y la rotura de doble cadena se repara mediante un proceso de reparacion de ADN de manera que la secuencia cromosomica se modifica mediante insercion o sustitucion de la secuencia donadora en la secuencia cromosomica, en el que el sitio diana en la secuencia cromosomica esta seguido inmediatamente por un motivo adyacente de protoespaciador (PAM), en el que el procedimiento no comprende un proceso de modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano y, en el que el procedimiento no comprende un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugfa o terapia. La invencion tambien proporciona un procedimiento ex vivo o in vitro para modificar una secuencia cromosomica en una celula eucariota integrando una secuencia donadora, comprendiendo el procedimiento: a) introducir en la celula eucariota (i) al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una sena de localizacion nuclear o acido nucleico que codifica al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una senal de localizacion nuclear, en la que la al menos una endonucleasa guiada por a Rn es un sistema de protemas repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR, del ingles clustered regularly interspersed short palindromic repeats)/(Cas) asociado a CRISPR de tipo II y el sistema de protemas CRISPR/Cas de tipo II es una protema Cas9, (ii) al menos un ARN o ADN grna que codifica al menos un ARN grna, y (iii) un polinucleotido donador que comprende la secuencia donadora; y b) cultivar la celula eucariota de manera que cada ARN grna grne una endonucleasa guiada por ARN a un sitio diana en la secuencia cromosomica donde la endonucleasa guiada por ARN introduce una rotura de doble cadena, y la rotura de doble cadena se repara mediante un proceso de reparacion de ADN de manera que la secuencia cromosomica se modifica mediante insercion o sustitucion de la secuencia donadora en la secuencia cromosomica, en el que la secuencia diana en la secuencia cromosomica esta seguida inmediatamente por un motivo adyacente de protoespaciador (PAM), y en el que el procedimiento no comprende un proceso de modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano.
En una realizacion, la endonucleasa guiada por ARN puede derivar de una protema Cas9. En otra realizacion, el acido nucleico que codifica la endonucleasa guiada por ARN introducida en la celula puede ser ARNm. En una realizacion adicional, el acido nucleico que codifica la endonucleasa guiada por ARN introducida en la celula puede ser ADN. En una realizacion adicional, el ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN puede ser parte de un vector que comprende adicionalmente una secuencia que codifica el ARN grna. En determinadas realizaciones, la celula eucariota puede ser una celula humana, una celula de mairnfero no humano, una celula madre, una celula de vertebrado no mai^ero, una celula de invertebrado, una celula vegetal, o un organismo eucariota unicelular. En otras determinadas realizaciones, la celula eucariota es un embrion unicelular de animal no humano.
Otros aspectos y repeticiones de la divulgacion se detallan a continuacion.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG. 1 representa el grafico de la modificacion del genoma usando dos endonucleasas guiadas por ARN, en la que las roturas de doble cadena se generan mediante dos endonucleasas guiadas por ARN que tienen actividad endonucleasa.
La FIG. 2 el clasificador de celulas activadas por fluorescencia (FACS) de celulas K562 humanas transfectadas con acido nucleico de Cas9, ARN que grna Cas9 y donador de ADN AAVS1-GFP. El eje Y representa la intensidad de auto fluorescencia en un canal rojo, y el eje X representa la intensidad de fluorescencia verde. (A) celulas K562 transfectadas con 10 |jg de ARNm de Cas9 transcrito con un analogo de casquete anti-inverso, 0,3 nmol de doble cadena de ARNcr-ARNtracr prealineada, y 10 jg ADN del plasmido AAVSI-GfP; (B) celulas K562 transfectadas con 10 jg de ARNm de Cas9 transcrito con un analogo de casquete anti-inverso, 0,3 nmol de ARN quimerico y 10 jg ADN del plasmido AAVS1-GFP; (C) celulas K562 transfectadas con 10 jg de ARNm de Cas9 con casquete mediante la reaccion de postranscripcion de casquete, 0,3 nmol de ARN quimerico y 10 jg ADN del plasmido AAVS1-GFP; (D) celulas K562 transfectadas con 10 jg de ADN del plasmido de Cas9, 5 jg de ADN del plasmido de ARN quimerico con U6, y 10 jg de ADN del plasmido AAVS1-GFP; (E) celulas K562 transfectadas con 10 jg de ADN del plasmido AAVS1-GFP; (F) celulas K562 transfectadas solo con reactivos de transfeccion.
La FIG. 3 presenta un analisis de PCR de union que documenta la integracion dirigida de GFP en el locus AAVS1 en celulas humanas. Carril M: marcadores moleculares de ADN de 1 kb; Carril A: celulas K562 transfectadas con 10 jg de ARNm de Cas9 transcrito con un analogo de casquete anti-inverso, 0,3 nmol de doble cadena de ARNcr-ARNtracr prealineada, y 10 jg ADN del plasmido AAVS1-GFP; Carril B: celulas K562 transfectadas con 10 jg de ARNm de Cas9 transcrito con un analogo de casquete anti-inverso, 0,3 nmol de ARN quimerico y 10 jg ADN del plasmido AAVS1-GFP; Carril C: celulas K562 transfectadas con 10 jg de ARNm de Cas9 con casquete mediante la reaccion de postranscripcion de casquete, 0,3 nmol de ARN quimerico y 10 jg ADN del plasmido AAVS1-GFP; Carril D: celulas K562 transfectadas con 10 jg de ADN del plasmido de Cas9, 5 jg de ADN del plasmido de ARN quimerico con U6, y 10 jg de ADN del plasmido AAVS1-GFP; Carril E: celulas K562 transfectadas con 10 jg de ADN del plasmido AAVS1-GFP; Carril F: celulas K562 transfectadas solo con reactivos de transfeccion.
Descripcion detallada de la invencion
En el presente documento se desvelan endonucleasas guiadas por ARN, que comprenden al menos una senal de localizacion nuclear, al menos un dominio nucleasa, y al menos un dominio que interacciona con un ARN grna para dirigir la endonucleasa a una secuencia de nucleotidos espedfica para la escision. Tambien se desvelan acidos nucleicos que codifican las endonucleasas guiadas por ARN, asf como procedimientos para usar las endonucleasas guiadas por ARN para modificar las secuencias cromosomicas de celulas eucariotas o embriones. La endonucleasa guiada por ARN interacciona con los ARN grna espedficos, cada uno de los cuales dirige la endonucleasa a un sitio espedfico dirigido, en cuyo sitio la endonucleasa guiada por ARN introduce una rotura de doble cadena que se puede reparar mediante un proceso de reparacion de ADN de manera que la secuencia cromosomica se modifica. Dado que la especificidad la proporciona el ARN grna, la endonucleasa basada en ARN es universal y se puede usar con diferentes ARN grnas para dirigirse a diferentes secuencias genomicas. Los procedimientos desvelados en el presente documento se pueden usar para dirigirse y modificar secuencias cromosomicas espedficas y/o introducir secuencias exogenas en localizaciones diana en el genoma de celulas o embriones. Se excluyen los procedimientos que comprenden un proceso para modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano. Por otro lado, el direccionamiento es espedfico con efectos limitados fuera de la diana.
(I) Endonucleasas guiadas por ARN
Un aspecto de la presente divulgacion proporciona endonucleasas guiadas por ARN que comprenden al menos una senal de localizacion nuclear, que permite la entrada de la endonucleasa en el nucleo de celulas eucariotas y embriones tales como, por ejemplo, embriones unicelulares no humanos. Las endonucleasas guiadas por ARN tambien comprenden al menos un dominio nucleasa y al menos un dominio que interacciona con un ARN grna. Una endonucleasa guiada por ARN se dirige a una secuencia espedfica de acido nucleico (o sitio diana) mediante un ARN grna. El ARN grna interacciona con la endonucleasa guiada por ARN asf como con el sitio diana de manera que, una vez dirigida al sitio diana, la endonucleasa guiada por ARN es capaz de introducir una rotura de doble cadena en el sitio diana de la secuencia de acido nucleico. Dado que el ARN grna proporciona la especificidad para la escision dirigida, la endonucleasa de la endonucleasa guiada por ARN es universal y se puede usar con diferentes ARN grna para escindir diferentes secuencias diana de acido nucleico. En el presente documento se desvelan endonucleasas guiadas por ARN, acidos nucleicos aislados (es decir, ARN y ADN) que codifica las endonucleasas guiadas por ARN, los vectores que comprenden acidos nucleicos que codifican las endonucleasas guiadas por ARN y los complejos de protema-ARN que comprenden la endonucleasa guiada por ARN mas un ARN gma.
La endonucleasa guiada por ARN puede provenir de un sistema de repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)/(Cas) asociado a CRISPR. El sistema CRISPR/Cas puede ser un sistema de tipo I, de tipo II o de tipo III. Los ejemplos no limitantes de protemas CRISPR/Cas incluyen Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (o CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (o CasA), Cse2 (o CasB), Cse3 (o CasE), Cse4 (o CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csz1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 y Cu1966.
Tal como se desvela en el presente documento, la endonucleasa guiada por ARN proviene de un sistema CRISPR/Cas de tipo II, mas espedficamente una protema Cas9. La protema Cas9 puede ser de Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, Alicyclobacillus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor becscii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Marinobacter sp., Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalteromonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus, o Acaryochloris marina.
En general, las protemas CRISPR/cas comprenden al menos un dominio de reconocimiento de ARN y/o un dominio de union a ARN. Los dominios de reconocimiento de ARN y/o de union a ARN interaccionan con los ARN gma. Las protemas CRISPR/Cas tambien pueden comprender dominios nucleasa (es decir, dominios DNasa o RNasa), dominios de union a ADN, dominios helicasa, dominios RNAsa, dominios de interaccion protema-protema, dominios de dimerizacion, asf como otros dominios.
La protema de tipo CRISPR/Cas puede ser una protema CRISPR/Cas de tipo silvestre, una protema CRISPR/Cas modificada, o un fragmento de una protema CRISPR/Cas de tipo silvestre o modificada. La protema de tipo CRISPR/Cas se puede modificar para aumentar la afinidad y/o especificidad de union a acido nucleico, alterar una actividad enzimatica y/o cambiar otra propiedad de la protema. Por ejemplo, los dominios nucleasa (es decir, DNasa, RNasa) de la protema de tipo CRISPR/Cas se pueden modificar, eliminar o desactivar. Como alternativa, se puede truncar la protema de tipo CRISPR/Cas para retirar dominios que no son esenciales para la funcion de la protema de fusion. La protema de tipo CRISPR/Cas tambien se puede truncar o modificar para optimizar la actividad del dominio efector de la protema de fusion.
En algunas realizaciones, la protema de tipo CRISPR/Cas puede provenir de una protema Cas9 de tipo silvestre o de un fragmento de la misma. En otras realizaciones, la protema de tipo CRISPR/Cas puede provenir de una protema Cas9 modificada. Por ejemplo, la secuencia de aminoacidos de la protema Cas9 se puede modificar para alterar una o mas propiedades (por ejemplo, actividad, afinidad, estabilidad de nucleasa, etc.) de la protema. Como alternativa, los dominios de la protema Cas9 no implicados en la escision guiada por ARN se pueden eliminar de la protema, de manera que la protema Cas9 modificada es mas pequena que la protema Cas9 de tipo silvestre.
En general, una protema Cas9 comprende al menos dos dominios nucleasas (es decir, DNasa). Por ejemplo, una protema Cas9 puede comprender un dominio de nucleasa de tipo RuvC y un dominio de nucleasa de tipo HNH. Los dominios de RuvC y HNH funcionan juntos para cortar cadenas unicas para generar una cadena de rotura doble en DNA (Jinek y col., Science, 337: 816-821).
La endonucleasa guiada por ARN desvelada en el presente documento comprende al menos una senal de localizacion nuclear. En general, una SLN comprende un tramo de aminoacidos basicos. Las senales de localizacion nuclear se conocen en la materia (vease, por ejemplo, Lange y col., J. Biol. Chem., 2007, 282:5101-5105). Por ejemplo, en una realizacion, la SLN puede ser una secuencia monopartita, tal como PKKKRKV (SEQ ID NO:1) o PKKKRRV (SEQ ID NO:2). En otra realizacion, la SLN puede ser una secuencia bipartita. En otra realizacion mas, la SLN puede ser KRPAAt KkAGQAKKKK (SEQ ID NO:3). La SLN se puede localizar en el extremo N-terminal, en el C-terminal o en una localizacion interna de la endonucleasa guiada por ARN.
La endonucleasa guiada por ARN puede comprender adicionalmente al menos un dominio de penetracion celular. El dominio de penetracion celular puede ser una secuencia de peptido de penetracion celular que proviene de la protema TAT del VIH-1. A modo de ejemplo, la secuencia de penetracion celular de tAt puede ser GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (SEQ ID NO:4). Como alternativa, el dominio de penetracion celular puede ser TLM (PLSSIFSRIGDPPKKKRKV; SEQ ID NO:5, una secuencia de peptido de penetracion celular que proviene del virus de la hepatitis B. En otra alternativa, el dominio de penetracion celular puede ser MPG (GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV; SEQ ID NO:6 o GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; SEQ ID NO:7). En una alternativa adicional, el dominio de penetracion celular puede ser Pep-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV; SEQ ID NO:8), VP22, un peptido de penetracion celular del virus Herpes simplex, o una secuencia de peptido de poliarginina. El dominio de penetracion celular se puede localizar en el extremo N-terminal, en el extremo C-terminal o en una localizacion interna de la protema.
La endonucleasa guiada por ARN tambien puede comprender adicionalmente al menos un dominio marcador. Los ejemplos no limitantes de dominios marcadores incluyen protemas fluorescentes, etiquetas de purificacion y etiquetas de epftopo. En un ejemplo, el dominio marcador puede ser una protema fluorescente. Los ejemplos no limitantes de protemas fluorescentes adecuadas incluyen protemas verdes fluorescentes (por ejemplo, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFp, AceGFP, ZsGreenl), protemas amarillas fluorescentes (por ejemplo, YFP, EYFP, Citrina, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellowl,), protemas azules fluorescentes (por ejemplo EBFP, EBFP2, Azurita, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), protemas cyan fluorescentes (por ejemplo ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl, Midoriishi-Cyan), protemas rojas fluorescentes (mKate, mKate2, mPlum, monomero DsRed, mCherry, mRFPI, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomero, HcRed-Tandem, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred), y protemas naranjas fluorescentes (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Kusabira-Orange monomerica, mTangerine, tdTomato) o cualquier otra protema fluorescente adecuada. En otros ejemplos, el dominio marcador puede ser una etiqueta de purificacion y/o una etiqueta de epftopo. Las etiquetas ejemplares incluyen, aunque no de forma limitativa, glutation-S-transferasa (GST), protema de union a quitina (CBP), protema de union a maltosa, tiorredoxina (TRX), poli(NANP), etiqueta de purificacion por afinidad en tandem (TAP), myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S i, T7, V5, VSV-G, 6xHis, protema transportadora de carboxil biotina (BCCP) y calmodulina.
En determinados ejemplos, la endonucleasa guiada por ARN puede ser parte de un complejo protema-ARN que comprende un ARN grna. El ARN grna interacciona con la endonucleasa guiada por ARN para dirigir la endonucleasa a un sitio diana espedfico, en el que el extremo 5' del ARN grna alinea sus bases con una secuencia de protoespaciador espedfica.
(II) Acidos nucleicos que codifican endonucleasas guiadas por ARN
Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona acidos nucleicos que codifican cualquiera de las endonucleasas guiadas por ARN descritas anteriormente en la seccion (I). El acido nucleico puede ser ARN o ADN. En un ejemplo, el acido nucleico que codifica la endonucleasa guiada por ARN es ARNm. El ARNm puede tener casquete en 5' y/o estar poliadenilado en 3'. En otro ejemplo, el acido nucleico que codifica la endonucleasa guiada por ARN es a Dn . El ADN puede estar presente en un vector (vease a continuacion).
El acido nucleico que codifica la endonucleasa guiada por ARN puede tener un codon optimizado para una traduccion eficaz a protema en la celula eucariota o animal de interes. Por ejemplo, se pueden optimizar codones para la expresion en seres humanos, ratones, ratas, hamsteres, vacas, cerdos, gatos, perros, peces, anfibios, plantas, levadura, insectos, etcetera (vease la base de datos del uso de codones en www.kazusa.or.jp/codon/). Los programas para la optimizacion de codones estan disponibles como programas de dominio publico (por ejemplo, OPTIMIZER en genomes.urv.es/OPTIMIZER; OptimumGene™ de GenScript en www.genscript.com/codon_opt.html). Los programas comerciales de optimizacion de codones tambien estan disponibles.
El ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN se puede enlazar de manera operativa con al menos una secuencia de control del promotor. En algunas repeticiones, la secuencia codificante de ADN se puede unir de manera operativa a una secuencia de control del promotor para la expresion en la celula eucariota o animal de interes. La secuencia de control del promotor puede ser constitutiva, regulada o espedfica de tejido. Las secuencias de control del promotor constitutivas adecuadas incluyen, pero sin limitacion, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), el promotor del virus del simio (SV40), el promotor tardm principal de adenovirus, el promotor del virus del sarcoma de Rous (VSR), el promotor del virus del tumor mamario del raton (MMTV), el promotor de la fosfoglicerato cinasa (PGK), el promotor del factor de elongacion (EDI)-alfa, los promotores de ubiquitina, los promotores de actina, los promotores de tubulina, los promotores de inmunoglobulina, fragmentos de los mismos o combinaciones de cualquiera de los anteriores. Los ejemplos de secuencias de control del promotor reguladas incluyen sin limitacion aquellas reguladas por choque termico, metales, esteroides, antibioticos o alcohol. Los ejemplos no limitantes de promotores espedficos de tejido incluyen el promotor B29, el promotor de CD14, el promotor de CD43, el promotor de CD45, el promotor de CD68, el promotor de desmina, el promotor de elastasa-1, el promotor de endoglina, el promotor de fibronectina, el promotor de Flt-1, el promotor de GFAP, el promotor de GPIIb, el promotor de ICAM-2, el promotor de INF-p, el promotor de Mb, el promotor Nphsl, el promotor de OG-2, el promotor de SP-B, el promotor de SYN1 y el promotor de WASP. La secuencia del promotor puede ser de tipo silvestre o se puede modificar para una expresion mas eficiente o eficaz. En un ejemplo, el ADN codificante puede unirse de manera operativa a un promotor de CMV para la expresion constitutiva en celulas de mairnfero.
La secuencia que codifica la endonucleasa guiada por ARN puede estar unida de manera operativa a una secuencia de promotor que es reconocida por una ARN polimerasa del fago para la smtesis in vitro de ARNm. En tales ejemplos, el ARN transcrito in vitro se puede purificar para su uso en los procedimientos detallados anteriormente en la seccion (III). Por ejemplo, la secuencia del promotor puede ser una secuencia del promotor T7, T3 o SP6 o una variacion de la secuencia del promotor T7, T3 o SP6. En una realizacion a modo de ejemplo, el ADN que codifica la protema esta unido de manera operativa a un promotor T7 para la smtesis in vitro de ARNm usando una ARN polimerasa de T7.
En una alternativa, la secuencia que codifica la endonucleasa guiada por ARN puede estar unida de manera operativa a una secuencia del promotor para la expresion in vitro de la endonucleasa guiada por ARN en celulas bacterianas o eucariotas. En esos casos, la protema expresada se puede purificar para su uso en los procedimientos detallados a continuacion en la seccion (III). Los promotores bacterianos adecuados incluyen, sin lfmite, promotores T7, promotores del operon lac, promotores trp, variaciones de los mismos, y combinaciones de los mismos. Un promotor bacteriano ejemplar es tac, que es un tnbrido de los promotores trp y lac. Los ejemplos no limitantes de los promotores eucarioticos se enumeran anteriormente.
En aspectos adicionales, el ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN tambien puede estar unida a una senal de poliadenilacion (por ejemplo, senal poliA del SV40, senal poliA de la hormona de crecimiento bovina (BGH), etc.) y/o al menos una secuencia de terminacion transcripcional. Ademas, la secuencia que codifica la endonucleasa guiada por ARN tambien puede estar unida a la secuencia que codifica al menos una senal de localizacion nuclear, al menos un dominio de penetracion celular y/o al menos un dominio marcador, que se detallan anteriormente en la seccion (I).
En diversas realizaciones, el ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN puede estar presente en un vector. Los vectores adecuados incluyen vectores de plasmidos, fagemidos, cosmidos, minicromosomas artificiales, transposones y vectores vmcos (por ejemplo, vectores lentivmcos, vectores vmcos adenoasociados, etc.). En un ejemplo, el a Dn que codifica la endonucleasa guiada por ARN esta presente en un vector de plasmido. Los ejemplos no limitantes de vectores de plasmidos adecuados incluyen pUC, pBR322, pET, pBluescript, y variantes de los mismos. El vector puede comprender secuencias adicionales de control de la expresion (por ejemplo, secuencias potenciadoras, secuencias de Kozak, secuencias de poliadenilacion, secuencias de terminacion transcripcional, etc.), secuencias de marcador seleccionable (por ejemplo, genes de resistencia a antibioticos), ongenes de replicacion y similares. La informacion adicional se puede encontrar en Current Protocols in Molecular Biology" de Ausubel y col., John Wiley & Sons, Nueva York, 2003 o "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" de Sambrook y Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3a edicion, 2001.
En algunos ejemplos, el vector de expresion que comprende la secuencia que codifica la endonucleasa guiada por ARN puede comprender adicionalmente la secuencia que codifica un ARN grna. La secuencia que codifica el ARN grna generalmente esta unido de manera operativa a al menos una secuencia de control de la transcripcion para la expresion del ARN grna en la celula o embrion de interes. Por ejemplo, el ADN que codifica el ARN grna se puede unir de manera operativa a una secuencia del promotor que se reconoce mediante la ARN polimerasa III (Pol III). Los ejemplos de promotores de Pol III incluyen, pero sin limitacion, los promotores de ARN U6, U3, H1 y 7SL de marnffero.
(III) Procedimiento para modificar una secuencia cromosomica usando una endonucleasa guiada por ARN Como se ha indicado anteriormente, la presente invencion abarca un procedimiento para modificar una secuencia cromosomica en una celula eucariota integrando la secuencia donadora, comprendiendo el procedimiento (a) introducir de la celula eucariota (i) al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una sena de localizacion nuclear o acido nucleico que codifica al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una senal de localizacion nuclear, en la que la al menos una endonucleasa guiada por ARN es un sistema de protemas repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR, del ingles clustered regularly interspersed short palindromic repeats)/(Cas) asociado a CRISPR de tipo II y el sistema de protemas CRISPR/Cas de tipo II es una protema Cas9, (ii) al menos un ARN o ADN grna que codifica al menos un ARN grna, y, (iii) al menos un polinucleotido donador que comprende una secuencia donadora; y (b) cultivar la celula de manera que cada ARN grna dirija una endonucleasa guiada por ARN a un sitio diana en la secuencia cromosomica donde la endonucleasa guiada por ARN introduce una rotura de doble cadena en el sitio diana, y la rotura de doble cadena se repara mediante un proceso de reparacion de ADN de manera que la secuencia cromosomica se modifica mediante la insercion o la sustitucion de la secuencia donadora en la secuencia cromosomica, en la que el sitio diana en la secuencia cromosomica esta seguido inmediatamente por un motivo adyacente al protoespaciador (PAM), en el que el procedimiento no comprende un proceso de modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano y, en el que el procedimiento no comprende un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugfa o terapia.
La invencion tambien proporciona un procedimiento ex vivo o in vivo de modificar una secuencia cromosomica en una celula eucariota integrando una secuencia donadora, comprendiendo el procedimiento:
(a) introducir en la celula eucariota (i) al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una sena de localizacion nuclear o acido nucleico que codifica al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una senal de localizacion nuclear, en la que la al menos una endonucleasa guiada por a Rn es un sistema de protemas repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR, del ingles clustered regularly interspersed short palindromic repeats)/(Cas) asociado a CRISPR de tipo II y el sistema de protemas CRISPR/Cas de tipo II es una protema Cas9, (ii) al menos un ARN o ADN gma que codifica al menos un ARN gma, y (iii) un polinucleotido donador que comprende la secuencia donadora; y b) cultivar la celula eucariota de manera que cada ARN gma gme una endonucleasa guiada por ARN a un sitio diana en la secuencia cromosomica, la endonucleasa guiada por ARN introduce una rotura de doble cadena en el sitio diana, y la rotura de doble cadena se repara mediante un proceso de reparacion de ADN de manera que la secuencia cromosomica se modifica por insercion o sustitucion de la secuencia donadora en la secuencia cromosomica, en la que el sitio diana en la secuencia cromosomica esta seguido inmediatamente por un motivo adyacente de protoespaciador (PAM) y, en el que el procedimiento no comprende un proceso de modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano.
En algunas realizaciones, estos procedimientos pueden comprender la introduccion de una endonucleasa guiada por ARN (o acido nucleico codificante) y un ARN gma (o ADN codificante) en una celula o embrion, en la que la endonucleasa guiada por ARN introduce una rotura de doble cadena en la secuencia cromosomica dirigida. La secuencia donadora en el polinucleotido donador se puede intercambiar con o integrar en la secuencia cromosomica en el sitio dirigido durante la reparacion de la rotura de doble cadena. Por ejemplo, en realizaciones en las que la secuencia donadora esta flanqueada aguas arriba y aguas abajo por secuencias que tienen una identidad de secuencia sustancial con las secuencias de aguas arriba y aguas abajo, respectivamente, del sitio dirigido en la secuencia cromosomica, la secuencia donadora se puede intercambiar con o integrar en la secuencia cromosomica en el sitio dirigido durante la reparacion mediada por un proceso de reparacion dirigido por la homologfa. Como alternativa, en realizaciones en las que la secuencia donadora esta flanqueada por proyecciones compatibles (o las proyecciones compatibles se generar in situ mediante la endonucleasa guiada por ARN) la secuencia donadora se puede enlazar directamente con la secuencia cromosomica escindida mediante un proceso de reparacion no homologo durante la reparacion de la rotura de doble cadena. El intercambio o la integracion de la secuencia donadora en la secuencia cromosomica modifica la secuencia cromosomica dirigida o introduce una secuencia exogena en la secuencia cromosomica de la celula o embrion.
En otras realizaciones, el procedimiento puede comprender la introduccion de dos endonucleasas guiadas por ARN (o acido nucleico codificante) y dos ARN gmas (o ADN codificantes) en una celula, en la que las endonucleasas guiadas por ARN introducen roturas de doble cadena en la secuencia cromosomica. Vease la FIG. 1. Las dos roturas pueden estar en varios pares de bases, en decenas de pares de bases o pueden estar separados por varios miles de pares de bases. La secuencia donadora en el polinucleotido donador se puede intercambiar con o integrar en la secuencia cromosomica durante la reparacion de las roturas de doble cadena bien mediante un proceso de reparacion basado en homologfa (por ejemplo, en realizaciones en las que la secuencia donadora esta flanqueada aguas arriba y aguas abajo por secuencias que tienen una identidad de secuencia sustancial con las secuencias de aguas arriba y aguas abajo, respectivamente, de los sitios dirigidos en la secuencia cromosomica) o bien un proceso de reparacion no homologa (por ejemplo, en realizaciones en las que la secuencia donadora esta flanqueada por proyecciones compatibles).
(a) Endonucleasa guiada por ARN
El procedimiento comprende introducir en una celula al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una sena de localizacion nuclear o acido nucleico que codifica al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una senal de localizacion nuclear. Tales endonucleasas guiadas por ARN y acidos nucleicos que codifican las endonucleasas guiadas por ARN se describen anteriormente en las secciones (I) y (II), respectivamente. Sin embargo, los procedimientos reivindicados excluyen los que comprenden un proceso para modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano.
En algunas realizaciones, la endonucleasa guiada por ARN se puede introducir en la celula o embrion como una protema aislada. En dichas realizaciones, la endonucleasa guiada por ARN puede comprender adicionalmente al menos un dominio de penetracion celular, que facilita la captacion celular de la protema. En otras realizaciones, la endonucleasa guiada por ARN se puede introducir en la celula o embrion como una molecula de ARNm. Aun en otras realizaciones, la endonucleasa guiada por ARN se puede introducir en la celula o embrion como una molecula de ADN. En general, la secuencia de ADN que codifica la protema esta unida de manera operativa a una secuencia del promotor que funcionara en la celula o embrion de interes. La secuencia de ADN puede ser lineal, o la secuencia de ADN puede ser parte de un vector. Aun en otras realizaciones, se puede introducir la protema en la celula o embrion como un complejo ARN-protema que comprende la protema y el ARN gma.
En realizaciones alternativas, el ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN puede comprender adicionalmente la secuencia que codifica un ARN gma. En general, cada una de las secuencias que codifican la endonucleasa guiada por ARN y el ARN gma estan unidas de manera operativa la secuencia de control del promotor apropiada que permite la expresion de la endonucleasa guiada por ARN y el ARN gma, respectivamente, en la celula o embrion. La secuencia de ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN y el ARN gma puede comprender ademas secuencia(s) de control de la expresion, reguladoras y/o de procesamiento. La secuencia de ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN y el ARN gma puede ser lineal o puede ser parte de un vector.
(b) ARN grna
El procedimiento tambien comprende la introduccion en una celula o embrion de al menos un ARN grna o ADN que codifica al menos un ARN guia. Un ARN guia interacciona con la endonucleasa guiada por ARN para dirigir la endonucleasa a un sitio diana espedfico, en cuyo sitio, el extremo 5' del ARN grna alinea sus bases con una secuencia de protoespaciador espedfica en la secuencia cromosomica.
Cada ARN guia comprende tres regiones: una primera region en el extremo 5' que es complementaria con el sitio diana en la secuencia cromosomica, una segunda region interna que forma una estructura en tallo-bucle, y una tercera region 3' que esencialmente permanece monocatenaria. La primera region de cada ARN guia es diferente, de manera que cada ARN guia a una protema de fusion hacia un sitio diana espedfico. La segunda y tercera regiones de cada ARN guia pueden ser las mismas en todos los ARN guia.
La primera region del ARN guia es complementaria con la secuencia (es decir, la secuencia del protoespaciador) en el sitio diana en la secuencia cromosomica de manera que la primera region del ARN grna puede alinear sus bases con el sitio dirigido. En diversas realizaciones, la primera region del ARN grna puede comprender desde aproximadamente 10 nucleotidos a mas de aproximadamente 25 nucleotidos. Por ejemplo, la region del alineamiento de bases entre la primera region del ARN grna y el sitio diana en la secuencia cromosomica puede ser de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25 o mas de 25 nucleotidos de longitud. En una realizacion a modo de ejemplo, la primera region de ARN grna es de aproximadamente 19, 20 o 21 nucleotidos de longitud.
El ARN grna tambien comprende una segunda region que forma una estructura secundaria. En algunas realizaciones, la estructura secundaria comprende un tallo (u horquilla) y un bucle. La longitud del bucle y del tallo puede variar. Por ejemplo, el bucle puede variar desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10 nucleotidos de longitud, y el tallo puede variar desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 20 pares de bases de longitud. El tallo puede comprender una o mas protuberancias de 1 a aproximadamente 10 nucleotidos. De este modo, la longitud global de la segunda region puede variar desde aproximadamente 16 hasta aproximadamente 60 nucleotidos de longitud. En una realizacion ejemplar, el bucle es de aproximadamente 4 nucleotidos de longitud y el tallo comprende aproximadamente 12 pares de bases.
El ARN grna tambien comprende una tercera region en el extremo 3' que permanece esencialmente monocatenario. De este modo, la tercera region no tiene complementariedad con ninguna secuencia cromosomica en la celula de interes y no tiene complementariedad con el resto del ARN grna. La longitud de la tercera region puede variar. En general, la tercera region es mas de aproximadamente 4 nucleotidos de longitud. Por ejemplo, la longitud de la tercera region puede variar desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 60 nucleotidos de longitud.
La longitud combinada de la segunda y tercera region (tambien llamada la region universal o estructural) del ARN grna puede variar desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 120 nucleotidos de longitud. En un aspecto, la longitud combinada de la segunda y tercera region del ARN grna vana desde aproximadamente 70 hasta aproximadamente 100 nucleotidos de longitud.
En algunas realizaciones, el ARN grna comprende una unica molecula que comprende las tres regiones. En otras realizaciones, el ARN grna puede comprender dos moleculas separadas. La primera molecula de ARN puede comprender la primera region del ARN grna y una mitad del "tallo" de la segunda region del ARN grna. La segunda molecula de a Rn puede comprender la otra mitad del "tallo" de la segunda region del ARN grna y la tercera region del ARN grna. De este modo, en esta realizacion, la primera y segunda molecula de ARN contiene cada una una secuencia de nucleotidos que son complementarias entre sf. Por ejemplo, en una realizacion, la primera y segunda molecula de ARN comprende cada una una secuencia (de aproximadamente 6 a aproximadamente 20 nucleotidos) que alinea sus bases con la otra secuencia para formar un a Rn grna funcional.
En algunas realizaciones, el ARN grna se puede introducir en la celula o embrion como una molecula de ARN. La molecula de ARN se puede transcribir in vitro. Como alternativa, la molecula de ARN se puede sintetizar qmmicamente.
En otras realizaciones, el ARN grna se puede introducir en la celula o embrion como una molecula de ADN. En esos casos, el ADN que codifica el ARN grna se puede unir de manera operativa a la secuencia de control del promotor para la expresion del ARN grna en la celula o embrion de interes. Por ejemplo, la secuencia codificante de ARN se puede unir de manera operativa a una secuencia del promotor que se reconoce mediante la ARN polimerasa III (Pol III). Los ejemplos de promotores de Pol III incluyen, pero sin limitacion, promotores U6 o H1 de mairnfero. En una realizacion ejemplar, la secuencia codificante de ARN se enlaza a un promotor U6 humano o de raton. En otras realizaciones ejemplares, la secuencia codificante de ARN se enlaza a un promotor H1 humano o de raton.
La molecula de ADN que codifica el ARN grna puede ser lineal o circular. En algunas realizaciones, la secuencia de ADN que codifica el ARN grna puede ser parte de un vector. Los vectores adecuados incluyen vectores de plasmidos, fagemidos, cosmidos, minicromosomas artificiales, transposones y vectores vmcos. En una realizacion a modo de ejemplo, el ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN esta presente en un vector de plasmido. Los ejemplos no limitantes de vectores de plasmidos adecuados incluyen pUC, pBR322, pET, pBluescript, y variantes de los mismos. El vector puede comprender secuencias adicionales de control de la expresion (por ejemplo, secuencias potenciadoras, secuencias de Kozak, secuencias de poliadenilacion, secuencias de terminacion transcripcional, etc.), secuencias de marcador seleccionable (por ejemplo, genes de resistencia a antibioticos), ongenes de replicacion y similares.
En realizaciones en las que tanto la endonucleasa guiada por ARN como el ARN gma se introducen en la celula como moleculas de ADN, cada una puede ser parte de una molecula separada (por ejemplo, un vector que contiene secuencia codificante de protema y un segundo vector que contiene la secuencia codificante de ARN gma) o ambas pueden ser parte de la misma molecula (por ejemplo, un vector que contiene la secuencia codificante (y reguladora) tanto para la protema como para el ARN gma).
(c) Sitio diana
Una endonucleasa guiada por ARN junto con un ARN gma se dirige a un sitio diana en la secuencia cromosomica, en la que la endonucleasa guiada por ARN introduce una rotura de doble cadena en la secuencia cromosomica. El sitio diana no tiene limitacion de secuencia excepto en que la misma secuencia va seguida de manera inmediata (aguas abajo) de una secuencia consenso. Esta secuencia consenso tambien se conoce como motivo adyacente al protoespaciador (PAM, del ingles protospacer adjacent motif). Los ejemplos de PAM incluyen, pero sin limitacion, NGG, NGGNG y NNAGAAW (en los que N se define como cualquier nucleotido y W se define bien como A o como T). Tal como se detalla anteriormente en la seccion (III)(b), la primera region (en el extremo 5') del ARN gma es complementaria con el protoespaciador de la secuencia diana. Normalmente, la primera region del ARN gma es de aproximadamente 19 a 21 nucleotidos de longitud. De este modo, en determinados aspectos, la secuencia del sitio diana en la secuencia cromosomica es 5’-Nig-2 i -A/GG-3’. El PAM esta en letras cursivas.
El sitio diana puede estar en la region codificante de un gen, en un intron de un gen, en una region de control de un gen, en una region no codificante entre genes, etc. El gen puede ser un gen codificante de protema o un gen codificante de ARN. El gen puede ser cualquier gen de interes.
(d) Polinucleotido donador
El procedimiento comprende adicionalmente introducir al menos un polinucleotido donador en la celula o embrion. Un polinucleotido donador comprende al menos una secuencia donadora. En algunos aspectos, una secuencia donadora del polinucleotido donador se corresponde con una secuencia cromosomica endogena o natural. Por ejemplo, la secuencia donadora puede ser esencialmente identica a una parte de la secuencia cromosomica en cerca del sitio dirigido, pero que comprende al menos un cambio de nucleotido. Por lo tanto, la secuencia donadora puede comprender una version modificada de la secuencia de tipo silvestre en el sitio dirigido de manera que, tras la integracion o el intercambio con la secuencia natural, la secuencia en la localizacion cromosomica dirigida comprende al menos un cambio de nucleotido. Por ejemplo, el cambio puede ser una insercion de uno o mas nucleotidos, una delecion de uno o mas nucleotidos, una sustitucion de uno o mas nucleotidos, o combinaciones de los mismos. Como consecuencia de la integracion de la secuencia modificada, la celula o el embrion/animal puede producir un producto genico modificado de la secuencia cromosomica dirigida.
En otros aspectos, la secuencia donadora del polinucleotido donador se corresponde con una secuencia exogena. Tal como se usa en el presente documento, una secuencia "exogena" se refiere a una secuencia que no es natural para la celula o embrion, o una secuencia cuya localizacion natural en el genoma de la celula o embrion esta en una localizacion diferente. Por ejemplo, la secuencia exogena puede comprender secuencia codificante de protema, que puede estar unida de manera operativa a una secuencia de control del promotor de manera que, tras la integracion en el genoma, la celula o el embrion animal es capaz de expresar la protema codificada por la secuencia integrada. Como alternativa, la secuencia exogena se puede integrar en la secuencia cromosomica de manera que su expresion se regule mediante una secuencia de control del promotor endogena. En otras repeticiones, la secuencia exogena puede ser una secuencia de control transcripcional, otra secuencia de control de la expresion, una secuencia codificante de ARN, etcetera. La integracion de una secuencia exogena en una secuencia cromosomica se denomina "insercion".
Como se apreciara por los expertos en la materia, la longitud de la secuencia donadora puede variar y lo hara. Por ejemplo, la secuencia donadora puede variar en longitud desde varios nucleotidos hasta cientos de nucleotidos hasta cientos de miles de nucleotidos.
Polinucleotido donador que comprende secuencias aguas arriba y aguas abajo. En algunas realizaciones, la secuencia donadora en el polinucleotido donador esta flanqueado por una secuencia aguas arriba y una secuencia aguas abajo, que tiene identidad de secuencia sustancial con secuencias localizadas aguas arriba y aguas abajo, respectivamente, del sitio dirigido en la secuencia cromosomica. Debido a estas similitudes de secuencia, las secuencias aguas arriba y aguas abajo del polinucleotido donador permiten la recombinacion homologa entre el polinucleotido donador y la secuencia cromosomica dirigida de manera que la secuencia del donador se puede integrar en (o intercambiar con) la secuencia cromosomica.
La secuencia aguas arriba, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de acido nucleico que comparte la identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosomica aguas arriba del sitio dirigido. De forma analoga, la secuencia aguas abajo se refiere a una secuencia de acido nucleico que comparte la identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosomica aguas abajo del sitio dirigido. Tal como se usa en el presente documento, la frase "identidad de secuencia sustancial" se refiere a secuencias que tienen al menos aproximadamente el 75 % de identidad de secuencia. De este modo, las secuencias aguas arriba y aguas abajo en el polinucleotido donador pueden tener aproximadamente el 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia aguas arriba o aguas abajo del sitio dirigido. En una realizacion ejemplar, las secuencias aguas arriba y aguas abajo en el polinucleotido donador pueden tener aproximadamente el 95 % o el 100 % de identidad de secuencia con las secuencias cromosomicas aguas arriba o aguas abajo del sitio dirigido. En una realizacion, la secuencia aguas arriba comparte la identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosomica localizada inmediatamente aguas arriba del sitio dirigido (es decir, adyacente al sitio dirigido). En otras realizaciones, la secuencia aguas arriba comparte la identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosomica que se localizan en aproximadamente cien (100) nucleotidos aguas arriba del sitio dirigido. Por lo tanto, por ejemplo, la secuencia de aguas arriba puede compartir identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosomica que se localiza de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 21 a aproximadamente 40, de aproximadamente 41 a aproximadamente 60, de aproximadamente 61 a aproximadamente 80, o de aproximadamente 81 a aproximadamente 100 nucleotidos aguas arriba desde el sitio dirigido. En una realizacion, la secuencia aguas abajo comparte la identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosomica localizada inmediatamente aguas abajo del sitio dirigido (es decir, adyacente al sitio dirigido). En otras realizaciones, la secuencia aguas abajo comparte la identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosomica que se localizan en aproximadamente cien (100) nucleotidos aguas abajo del sitio dirigido. Por lo tanto, por ejemplo, la secuencia de aguas abajo puede compartir identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosomica que se localiza de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 21 a aproximadamente 40, de aproximadamente 41 a aproximadamente 60, de aproximadamente 61 a aproximadamente 80, o de aproximadamente 81 a aproximadamente 100 nucleotidos aguas abajo desde el sitio dirigido.
Cada secuencia aguas arriba o aguas abajo puede variar en longitud desde aproximadamente 20 nucleotidos a aproximadamente 5000 nucleotidos. En algunas realizaciones, las secuencias aguas arriba y aguas abajo pueden comprender aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2800, 3000, 3200, 3400, 3600, 3800, 4000, 4200, 4400, 4600, 4800, o 5000 nucleotidos. En una realizacion ejemplar, las secuencias aguas arriba o aguas abajo pueden variar en longitud desde aproximadamente 50 a aproximadamente 1500 nucleotidos.
Los polinucleotidos donadores que comprenden las secuencias aguas arriba y aguas abajo con similitud de secuencia con la secuencia cromosomica dirigida pueden ser lineales o circulares. En realizaciones en las que el polinucleotido donador es circular, puede ser parte de un vector. Por ejemplo, el vector puede ser un vector de plasmido.
Polinucleotidos donadores que comprenden sitio(s) de escision dirigido(s). En otras realizaciones, el polinucleotido donador puede comprender adicionalmente al menos un sitio de escision dirigido que se reconoce mediante la endonucleasa guiada por ARN. El sitio de escision dirigido anadido al polinucleotido donador se puede colocar aguas arriba o aguas abajo o ambos, aguas arriba y aguas abajo de la secuencia donadora. Por ejemplo, la secuencia donadora puede estar flanqueada mediante sitios de escision dirigidos de manera que, tras la escision por la endonucleasa guiada por ARN, la secuencia donadora esta flanqueada por proyecciones que son compatibles con las de la secuencia cromosomica generadas tras la escision mediante la endonucleasa guiada por ARN. Por consiguiente, la secuencia donadora se puede unir con la secuencia cromosomica escindida durante la reparacion de la rotura de doble cadena mediante un proceso de reparacion no homologa. Generalmente, los polinucleotidos donadores que comprenden el(los) sitio(s) de escision seran circulares (por ejemplo, pueden ser parte de un vector de plasmido).
Polinucleotido donador que comprende una secuencia donadora corta con proyecciones opcionales. En mas realizaciones alternativas, el polinucleotido donador puede ser una molecula lineal que comprende una secuencia donadora corta con proyecciones cortas opcionales que son compatibles con las proyecciones generadas mediante la endonucleasa guiada por ARN. En dichas realizaciones, la secuencia donadora se puede unir directamente con la secuencia cromosomica escindida durante la reparacion de la rotura de doble cadena. En algunos casos, la secuencia donadora puede ser menor de aproximadamente 1.000, menor de aproximadamente 500, menor de aproximadamente 250, o menor de aproximadamente 100 nucleotidos. En determinados casos, el polinucleotido donador puede ser una molecula lineal que comprende una secuencia donadora corta con extremos romos. En otras repeticiones, el polinucleotido donador puede ser una molecula lineal que comprende una secuencia donadora corta con proyecciones en 5' y/o 3'. Las proyecciones pueden comprender 1, 2, 3, 4 o 5 nucleotidos.
Normalmente, el polinucleotido donador sera ADN. El ADN puede ser monocatenario o bicatenario y/o lineal o circular. El polinucleotido donador puede ser un plasmido de ADN, un cromosoma artificial bacteriano (BAC, del ingles bacterial artificial chromosome), un cromosoma artificial de levadura (YAC, del ingles yeast artificial chromosome), un vector vmco, una parte lineal de ADN, un fragmento de PCR, un acido nucleico desnudo, o un acido nucleico que forma complejo con un vehmulo de administracion tal como un liposoma o un poloxamero. En determinadas realizaciones, el polinucleotido donador que comprende la secuencia donadora puede ser parte de un vector de plasmido. En cualquiera de estas situaciones, el polinucleotido donador que comprende la secuencia donadora puede comprender adicionalmente al menos una secuencia adicional.
(e) Introduccion en la celula o embrion
La(s) endonucleasa(s) dirigida(s) por ARN (o el acido nucleico codificante), el(los) ARN gma(s) (o ADN codificante) y el(los) polinucleotido(s) donador(es) opcional(es) se pueden introducir en una celula o embrion mediante una variedad de medios. En algunas realizaciones, se transfecta la celula o el embrion. Los procedimientos de transfeccion adecuados incluyen la transfeccion mediada por fosfato calcico, la nucleofeccion (o electroporacion), la transfeccion por polfmeros cationicos (por ejemplo, DEAE-dextrano o polietilenimina), la transduccion vmca, la transfeccion por virosoma, la transfeccion por virion, la transfeccion por liposoma, la transfeccion por liposoma cationico, la transfeccion por inmunoliposoma, la tranfeccion por lfpido no liposoma, la transfeccion por dendnmero, la transfeccion por choque termico, la magnetofeccion, la lipofeccion, la biobaKstica, la impalefeccion, la sonoporacion, la transfeccion optica y la captacion de acidos nucleicos potenciada por un agente patentado. Los procedimientos de transfeccion son bien conocidos en la materia (vease, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel y col., John Wiley & Sons, Nueva York, 2003 o "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" de Sambrook y Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3a Edicion, (2001). En otras realizaciones, las moleculas se introducen en la celula o el embrion mediante microinyeccion. Normalmente, el embrion en un embrion de etapa unicelular fecundado de la especie de interes. Por ejemplo, las moleculas se pueden inyectar en los pronucleos de embriones unicelulares.
La(s) endonucleasa(s) dirigida(s) por ARN (o el acido nucleico codificante), el(los) ARN grna(s) (o los ADN que codifican el ARN grna) y el(los) polinucleotido(s) donador(es) opcional(es) se pueden introducir en la celula o embrion de manera simultanea o de manera secuencial. La proporcion de endonucleasa(s) dirigida(s) por ARN (o acido nucleico codificante) frente al(los) ARN grna (o ADN codificante), generalmente sera de aproximadamente una estequiometna tal que puedan formar un complejo ARN-protema. En una realizacion, el a Dn que codifica una endonucleasa dirigida por ARN y el ADN que codifica un ARN grna se administran juntos en el vector de plasmido.
(f) Cultivo de la celula o embrion
El procedimiento ademas comprende el mantenimiento de la celula o embrion en condiciones apropiadas, de manera que el(los) ARN grna dirija a la(s) endonucleasa(s) guiada(s) por ARN al(los) sitios dirigido(s) en la secuencia cromosomica, y la(s) endonucleasa(s) guiada por ARN introduzca(n) al menos una rotura de doble cadena en la secuencia cromosomica. Una rotura de doble cadena se puede reparar mediante un proceso de reparacion de ADN de manera que la secuencia cromosomica se modifique mediante una delecion de al menos un nucleotido, una insercion de al menos un nucleotido, una sustitucion de al menos un nucleotido o una combinacion de las mismas.
Si no se introducen polinucleotidos donadores en la celula o embrion, la rotura de doble cadena podna repararse mediante un proceso de reparacion por union de extremos no homologos (NHEJ, del ingles non-homologous end­ joining). Dado que la NHEJ es propensa a errores, las deleciones de al menos un nucleotido, las inserciones de al menos un nucleotido, las sustituciones de al menos un nucleotido o las combinaciones de las mismas pueden tener lugar durante la reparacion de la rotura. Por consiguiente, la secuencia en la secuencia cromosomica se puede modificar de manera que el marco de lectura de una region codificante se pueda desplazar y la secuencia cromosomica se inactive o se "suprima". Una secuencia cromosomica inactivada que codifica una protema no produce la protema codificada por la secuencia cromosomica de tipo silvestre.
En realizaciones en las que un polinucleotido donador que comprende secuencias aguas arriba y aguas abajo se introduce en la celula o embrion, la rotura de doble cadena se puede reparar mediante un proceso de reparacion dirigida por homologfa (HDR, del ingles homology-directed repair) de manera que la secuencia donadora se integra en la secuencia cromosomica. Por consiguiente, se puede integrar una secuencia exogena en el genoma de la celula o embrion, o la secuencia cromosomica dirigida se puede modificar mediante el intercambio de una secuencia modificada por la secuencia cromosomica de tipo silvestre.
En realizaciones en las que un polinucleotido donador que comprende el sitio de escision se introduce en la celula o embrion, la endonucleasa guiada por ARN puede escindir tanto la secuencia cromosomica dirigida como el polinucleotido donador. El polinucleotido donador linealizado se puede integrar en la secuencia cromosomica en el sitio de la rotura de doble cadena mediante union entre el polinucleotido donador y la secuencia cromosomica escindida mediante un proceso de NHEJ.
En realizaciones en las que un polinucleotido donador lineal que comprende una secuencia donadora corta se introduce en la celula o embrion, la secuencia donadora corta se puede integrar en la secuencia cromosomica en el sitio de la rotura de doble cadena mediante un proceso de NHEJ. La integracion puede tener lugar mediante la union de extremos romos entre la secuencia donadora corta y la secuencia cromosomica en el sitio de la rotura de doble cadena. Como alternativa, la integracion puede tener lugar mediante la union de los extremos cohesivos (es decir, que tienen proyecciones en 5' o en 3') entre una secuencia donadora corta que esta flanqueada por proyecciones que son compatibles con las generadas mediante la endonucleasa de direccionamiento de ARN en la secuencia cromosomica escindida.
En general, la celula se mantiene en condiciones apropiadas para el crecimiento celular y/o su conservacion. Las condiciones adecuadas de cultivo celular son bien conocidas en la materia y se describen, por ejemplo, en Santiago y col. (2008) PNAS 105:5809-5814; Moehle y col. (2007) PNAS 104:3055-3060; Urnov y col. (2005) Nature 435:646­ 651; y Lombardo y col. (2007) Nat. Biotechnology 25:1298-1306. Los expertos en la materia aprecian que los procedimientos para el cultivo de celulas son conocidos en la materia y pueden variar y lo haran dependiendo del tipo celular. Se puede usar la optimizacion habitual, en todos los casos, para determinar las mejores tecnicas para un tipo celular en particular.
Se puede cultivar un embrion in vitro (por ejemplo, en cultivo celular). Normalmente, el embrion se cultiva a una temperatura apropiada y en medios apropiados con la proporcion de O2/CO2 necesaria como para permitir la expresion de la endonucleasa guiada por ARN y del ARN gma, si fuese necesario. Los ejemplos no limitantes adecuados de medios incluyen los medios M2, M16, KSOM, BMOC y HTF. Un experto en la materia apreciara que las condiciones del cultivo pueden variar y lo haran dependiendo de la especie del embrion. Se puede usar la optimizacion habitual, en todos los casos, para determinar las mejores condiciones de cultivo para una especie particular de embrion. En algunos casos, una lmea celular puede provenir de un embrion cultivado in vitro (por ejemplo, una lmea de celulas madre embrionarias).
Como alternativa, se puede cultivar un embrion in vivo transfiriendo el embrion al utero de un hospedador femenino. Hablando de manera general, el hospedador femenino es de la misma especie o similar que la del embrion. Preferentemente, el hospedador femenino esta pseudoembarazado. Los procedimientos para preparar hospedadores femeninos pseudoembarazados se conocen en la materia. Ademas, los procedimientos para transferir un embrion en un hospedador femenino son conocidos. El cultivo de un embrion in vivo permite el desarrollo del embrion y pueden dar como resultado un nacimiento vivo de un animal que proviene del embrion. Tal animal comprendena la secuencia cromosomica modificada en cada celula del cuerpo. Se excluyen se manera espedfica del ambito de la invencion los procedimientos que comprenden un proceso para modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano.
(g) Tipos de celulas y embriones
Una variedad de celulas eucariotas y embriones son adecuados para su uso en el procedimiento. Por ejemplo, la celula puede ser una celula humana, una celula de mamffero no humano, una celula de vertebrado no mamffero, una celula de invertebrado, una celula de insecto, una celula vegetal, una levadura, o un organismo eucariota unicelular. En general, el embrion es un embrion de mamffero no humano. En realizaciones espedficas, los embriones pueden ser un embrion unicelular de mamffero no humano. Los embriones ejemplares, incluyendo los embriones unicelulares, incluyen sin limitacion los embriones de raton, de rata, de hamster, de roedor, de conejo, de gato, de perro, de oveja, de cerdo, de vaca, de caballo y de primate. Aun en otras realizaciones, la celula puede ser una celula madre. Las celulas madre adecuadas incluyen sin limitacion las celulas madre embrionarias, las celulas madre de tipo ES, celulas madre fetales, celulas madre de adulto, celulas madre pluripotenciales, celulas madre de pluripotencialidad inducida, celulas madre multipotentes, celulas madre oligopotentes, celulas madre unipotentes y otras. En realizaciones ejemplares, la celula es una celula de mairnfero.
Los ejemplos no limitantes de celulas de mamffero adecuadas incluyen las celulas de ovario de hamster chino (CHO), las celulas renales de cna de hamster (BHK); las celulas NS0 de mieloma de raton, las celulas 3T3 de fibroblasto embrionario de raton (NIH3T3), las celulas A20 de linfoma de linfocitos B de raton; las celulas B16 de melanoma de raton; las celulas C2C12 de mioblasto de raton; las celulas SP2/0 de mieloma de raton; las celulas C3H-10T1/2 mesenquimales embrionarias de raton; las celulas CT26 de carcinoma de raton, las celulas DuCuP de prostata de raton; las celulas EMT6 de mama de raton; las celulas Hepa1c1c7 de hepatoma de raton; las celulas J5582 de mieloma de raton; las celulas MTD-1A epiteliales de raton; las celulas MyEnd de miocardio de raton; las celulas RenCa renales de raton; las celulas RIN-5F pancreaticas de raton; las celulas X64 de melanoma de raton; las celulas YAC-1 de linfoma de raton; las celulas 9L de glioblastoma de rata; las celulas RBL de linfoma de linfocitos B de rata; las celulas B35 de neuroblastoma de rata; las celulas de hepatoma de rata (HTC); las celulas BRL 3A de hngado de rata; las celulas renales caninas (MDCK); las celulas (CMT) mamarias caninas; las celulas D17 de osteosarcoma de rata; las celulas DH82 de monocito/macrofago de rata; las celulas (COS7) de fibroblastos de rinon de mono transformados por el virus SV-40; las celulas CVI-76 de rinon de mono; celulas (VERO-76) de rinon de mono verde africano; celulas (HEK293, HEK293T) de rinon embrionario humano; celulas (HELA) de carcinoma de cuello uterino humano; celulas (W138) de pulmon humano; celulas (Hep G2) de hngado humano; celulas de osteosarcoma U2-OS humano, celulas A549 humanas, celulas A-431 humanas, y celulas K562 humanas. Se puede encontrar una lista extensa de lmeas celulares de marnfferos en el catalogo de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA).
(IV) Celulas y animales modificados geneticamente
La presente divulgacion abarca celulas embriones no humanos y animales no humanos modificados geneticamente, que comprenden al menos una secuencia cromosomica que se ha modificado usando el proceso mediado por endonucleasa guiada por ARN, usando los procedimientos descritos en el presente documento. La divulgacion proporciona celulas que comprenden al menos una molecula de ADN o de ARN que codifica una endonucleasa guiada por ARN dirigida hacia una secuencia cromosomica de interes, al menos un ARN grna y uno o mas polinucleotidos donadores. La divulgacion tambien proporciona embriones no humanos que comprenden al menos una molecula de ADN o de ARN que codifica una endonucleasa guiada por ARN dirigida hacia una secuencia cromosomica de interes, al menos un ARN grna y uno o mas polinucleotidos donadores.
La presente divulgacion proporciona animales no humanos, embriones no humanos o celulas animales modificados geneticamente que comprenden al menos una secuencia cromosomica modificada. La secuencia cromosomica modificada se modifica de manera que comprenda una secuencia integrada. La secuencia cromosomica se modifica con un proceso mediado por endonucleasa guiada por ARN, usando los procedimientos descritos en el presente documento.
Tal como se ha tratado, un aspecto de la presente divulgacion proporciona un animal modificado geneticamente en el que se ha modificado al menos una secuencia cromosomica. En una realizacion, el animal modificado geneticamente comprende al menos una secuencia cromosomica inactivada. La secuencia cromosomica modificada se puede inactivar de manera que la secuencia no se transcriba y/o no se produzca una protema funcional. Por lo tanto, un animal modificado geneticamente que comprende una secuencia cromosomica inactivada puede denominarse un "animal genomanipulado por supresion genica" o un "animal genomanipulado secundariamente por supresion genica". La secuencia cromosomica inactivada puede incluir una mutacion de delecion (es decir, delecion de uno o mas nucleotidos), una mutacion de insercion (es decir, insercion de uno o mas nucleotidos), o una mutacion interruptora (es decir, sustitucion de un unico nucleotido por otro nucleotido de manera que se introduzca un codon de parada). Como consecuencia de la mutacion, la secuencia cromosomica dirigida se inactiva y no se produce una protema funcional. La secuencia cromosomica inactivada no comprende una secuencia introducida de manera exogena. Tambien se incluyen en el presente documento animales modificados geneticamente en los que dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez o mas secuencias cromosomicas estan inactivadas.
En otra realizacion, la secuencia cromosomica modificada se puede alterar de manera que codifique un producto variante de protema. Por ejemplo, un animal modificado geneticamente que comprende una secuencia cromosomica modificada puede comprender una(s) mutacion(es) puntual(es) dirigidas u otra modificacion de manera que se produzca un producto de protema alterada. En una realizacion, la secuencia cromosomica se puede modificar de manera que al menos un nucleotido se cambie y la protema expresada comprenda un resto de aminoacido cambiado (mutacion de aminoacido). En otra realizacion, la secuencia cromosomica se puede modificar para que comprenda mas de una mutacion de aminoacido de manera que se cambie mas de un aminoacido. Ademas, la secuencia cromosomica se puede modificar para que tenga una delecion o insercion de tres nucleotidos de manera que la protema expresada comprenda una unica delecion o insercion de aminoacido. La protema variante o alterada puede tener propiedades o actividades alteradas en comparacion con la protema de tipo silvestre, tal como una especificidad por el sustrato alterada, una actividad enzimatica alterada, unas tasas cineticas alteradas, etc.
En otra realizacion, el animal modificado geneticamente puede comprender al menos una secuencia integrada en el cromosoma. Un animal modificado geneticamente que comprende una secuencia integrada puede denominarse un "animal genomanipulado por insercion genica" o un "animal genomanipulado secundariamente por insercion genica". La secuencia integrada en el cromosoma puede, por ejemplo, codificar una protema ortologa, una protema endogena o combinaciones de ambas. En una realizacion, una secuencia que codifica una protema ortologa o una protema endogena se puede integrar en una secuencia cromosomica que codifica una protema de manera que la secuencia cromosomica se inactiva, pero la secuencia exogena se expresa. En tal caso, la secuencia que codifica la protema ortologa o la protema endogena puede estar unida de manera operativa a una secuencia de control del promotor. Como alternativa, una secuencia que codifica una protema ortologa o una protema endogena se puede integrar en una secuencia cromosomica sin afectar a la expresion de una secuencia cromosomica. Por ejemplo, una secuencia que codifica una protema se puede integrar en un locus "de sitio seguro", tal como el locus Rosa26, el locus HPRT, o el locus AAV. La presente divulgacion tambien abarca animales modificados geneticamente en los que dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez o mas secuencias, incluyendo secuencias que codifican protema(s), se integran en el genoma.
La secuencia integrada en el cromosoma que codifica una protema puede codificar la forma de tipo silvestre de una protema de interes o puede codificar una protema que comprende al menos una modificacion de manera que se produce una version alterada de la protema. Por ejemplo, una secuencia integrada en el cromosoma que codifica una protema relacionada con una enfermedad o trastorno puede comprender al menos una modificacion de manera que la version alterada de la protema producida provoque o potencie el trastorno asociado. Como alternativa, la secuencia integrada en el cromosoma que codifica una protema relacionada con una enfermedad o trastorno puede comprender al menos una modificacion de manera que la version alterada de la protema proteja frente al desarrollo del trastorno asociado.
En un ejemplo adicional, el animal modificado geneticamente puede ser un animal "humanizado" que comprende al menos una secuencia integrada en el cromosoma que codifica una protema humana funcional. La protema humana funcional puede no tener el correspondiente ortologo en el animal modificado geneticamente. Como alternativa, el animal de tipo silvestre del que proviene el animal modificado geneticamente puede comprender un ortologo correspondiente con la protema humana funcional. En este caso, la secuencia ortologa en el animal "humanizado" esta inactivada de manera que no se crean protemas funcionales y el animal "humanizado" comprende al menos una secuencia integrada en el cromosoma que codifica la protema humana.
En otro ejemplo mas, el animal modificado geneticamente puede comprender al menos una secuencia cromosomica modificada que codifica una protema de manera que el patron de expresion de la protema esta alterado. Por ejemplo, las regiones reguladoras que controlan la expresion de la protema, tal como un promotor o un sitio de union a factor de transcripcion, se pueden alterar de manera que la protema se sobreproduce, o se modifique la expresion temporal o espedfica de tejido de la protema, o una combinacion de los mismos. Como alternativa, el patron de expresion de la protema se puede alterar usando un sistema de animal genomodificado secundariamente por supresion genica. Un ejemplo no limitante de un sistema de animal genomodificado secundariamente por supresion genica incluye un sistema de recombinacion Cre-Iox. Un sistema de recombinacion Cre-Iox comprende una enzima recombinasa Cre, una ADN recombinasa espedfica de sitio que puede catalizar la recombinacion de una secuencia de acido nucleico entre sitios espedficos (sitios lox) en una molecula de acido nucleico. Los procedimientos para usar este sistema para producir expresion temporal y espedfica de tejido son conocidos en la materia. En general, un animal modificado geneticamente se genera con sitios lox que flanquean una secuencia cromosomica. En animal modificado geneticamente que comprende una secuencia cromosomica flanqueada por lox se puede cruzar entonces con otro animal modificado geneticamente que exprese la recombinasa Cre. Los animales de la progenie que comprende la secuencia cromosomica flanqueada por lox y la Cre recombinasa se producen entonces, y la secuencia cromosomica flanqueada por lox se recombina, llevando a una delecion o inversion de la secuencia cromosomica que codifica la protema. La expresion de la recombinasa Cre se puede regular de manera temporal y secundaria para efectuar una recombinacion regulada de manera temporal y secundaria de la secuencia cromosomica.
En cualquiera de estas realizaciones, el animal modificado geneticamente desvelado en el presente documento puede ser heterocigotico para la secuencia cromosomica modificada. Como alternativa, el animal modificado geneticamente puede ser homocigotico para la secuencia cromosomica modificada.
Los animales modificados geneticamente desvelados en el presente documento se pueden cruzarse para crear animales que comprendan mas de una secuencia cromosomica modificada o para crear animales que sean homocigoticos para una o mas secuencias cromosomicas modificadas. Por ejemplo, dos animales que comprenden la misma secuencia cromosomica modificada se pueden cruzar para crear un animal homocigotico para la secuencia cromosomica modificada. Como alternativa, los animales con diferentes secuencias cromosomicas modificadas se pueden cruzar para crear un animal que comprenda ambas secuencias cromosomicas modificadas.
Por ejemplo, un primer animal que comprende un gen "x" de una secuencia cromosomica inactivada se puede cruzar con un segundo animal que comprende que comprende una secuencia integrada en el cromosoma que codifica una protema "X" de gen humano para dar lugar a una descendencia "X" de genes "humanizados" que comprende tanto la secuencia cromosomica del gen inactivado "x" como la secuencia "X" del gen humano integrado en el cromosoma. Asimismo, un animal con gen "X" humanizado se puede cruzar con un animal con gen "Y" humanizado para crear una descendencia con genes X/Y humanizados. Los expertos en la materia apreciaran que son posibles muchas combinaciones.
En otras realizaciones, un animal que comprende una secuencia cromosomica modificada se puede cruzar para combinar la secuencia cromosomica modificada con otros acervos geneticos. A modo de ejemplo no limitante, otros acervos geneticos pueden incluir los acervos geneticos de tipo silvestre, los acervos geneticos con mutaciones de delecion, los acervos geneticos con otra integracion dirigida y los acervos geneticos con integraciones no dirigidas.
El termino "animal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un animal no humano. El animal puede ser un embrion, un juvenil o un adulto. Los animales adecuados incluyen vertebrados tales como mairnferos, aves, reptiles, anfibios, moluscos y peces. Los ejemplos de mamfferos adecuados incluyen, sin limitacion, roedores, animales de comparM a, ganado y primates. Los ejemplos no limitantes de roedores incluyen ratones, ratas, hamsteres, jerbos y cobayas. Los animales de comparM a adecuados incluyen, pero sin limitacion, gatos, perros, conejos, erizos y hurones. Los ejemplos no limitantes de ganado incluyen caballos, cabras, ovejas, cerdos, vacas, llamas y alpacas. Los primates adecuados incluyen, pero sin limitacion, monos capuchinos, chimpances, lemures, macacos, titfes, tamarinos, monos arana, monos ardilla y monos de Vervet. Los ejemplos no limitantes de aves incluyen gallinas, pavos, patos y gansos. Como alternativa, el animal puede ser un invertebrado tal como un insecto, un nematodo y similares. Los ejemplos no limitantes de insectos incluyen Drosohila y mosquitos. Un animal ejemplar es una rata. Los ejemplos no limitantes de las cepas de rata incluyen Dahl Salt-Sensitive, Fischer 344, Lewis, Long Evans Hooded, Sprague-Dawley y Wistar. En una realizacion, el animal no es un raton modificado geneticamente. En cada una de las repeticiones precedentes de animales adecuados para la invencion, el animal no incluye secuencias de transposones introducidas de forma exogena e integradas de manera aleatorizada.
Un aspecto adicional de la presente divulgacion proporciona celulas o lmeas celulares modificadas geneticamente que comprenden al menos una secuencia cromosomica modificada. La celula o lmea celular modificada geneticamente puede provenir de cualquiera de los animales modificados geneticamente desvelados en el presente documento. Como alternativa, la secuencia cromosomica se puede modificar en una celula tal como se describe anteriormente en el presente documento (en los parrafos que describen las modificaciones de secuencias cromosomicas en animales) usando los procedimientos descritos en el presente documento. La divulgacion tambien abarca un lisado de dichas celulas o lmeas celulares.
Las celulas son celulas eucariotas. Las celulas hospedadoras adecuadas incluyen hongos o levaduras, tales como Pichia, Saccharomyces, o Schizosaccharomyces; celulas de insecto, tales como celulas SF9 Spodoptera frugiperda o celulas S2 de Drosophila melanogaster; y celulas de animales, tales como raton, rata, hamster, primate no humano o celulas humanas. Las celulas ejemplares son de mairnfero. Las celulas de mairnfero pueden ser celulas primarias. En general, se puede usar cualquier celula primaria que sea sensible a las roturas de doble cadena. Las celulas pueden ser de una variedad de tipos celulares, por ejemplo, fibroblastos, mioblastos, linfocitos T o B, macrofagos, celulas epiteliales, etcetera.
Cuando se usan lmeas celulares de mairnfero, la lmea celular puede ser cualquier lmea celular establecida o una lmea de celulas primarias que no se haya descrito aun. La lmea celular puede ser adherente o no adherente o la lmea celular puede crecer en condiciones que estimulen el crecimiento adherente, no adherente u organotfpico usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia. Los ejemplos no limitantes de celulas y lmeas celulares de mairnfero se proporcionan en el presente documento en la seccion (IV)(g). Aun en otras realizaciones, la celula puede ser una celula madre. Los ejemplos no limitantes de celulas madre adecuadas se proporcionan en la seccion (IV)(g).
La presente divulgacion tambien proporciona un embrion no humano modificado geneticamente que comprende al menos una secuencia cromosomica modificada. La secuencia cromosomica se puede modificar en un embrion tal como se describe anteriormente en el presente documento (en los parrafos que describen las modificaciones de secuencias cromosomicas en animales) usando los procedimientos descritos en el presente documento. En una realizacion, el embrion en un embrion no humano de etapa unicelular fecundado de la especie animal de interes. Los embriones ejemplares, incluyendo los embriones unicelulares, incluyen sin limitacion, de raton, de rata, de hamster, de roedor, de conejo, de gato, de perro, de oveja, de cerdo, de vaca, de caballo y embriones de primates.
Definiciones
Salvo que se defina de otra manera, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en el presente documento tienen el significado comunmente entendido por un experto en la materia a la cual pertenece la presente invencion. Las siguientes referencias a un experto en la materia una definicion general de muchos de los terminos usados en la presente invencion: Singleton y col., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5a Ed., R. Rieger y col. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale y Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Tal como se usa en el presente documento, los siguientes terminos tienen los significados que se les atribuyen a menos que se especifique lo contrario.
Cuando se introducen elementos de la presente divulgacion o de la(s) realizacion(es) preferida(s) de la(s) misma(s), los artmulos "un", "una", "el", "la" y "dicho" pretenden significar que son uno o mas de los elementos. Las expresiones "que comprende", "que incluye" y "que tiene" pretenden ser inclusivas y significar que pueden ser elementos adicionales que no sean los elementos enumerados.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion "secuencia endogena" se refiere a una secuencia cromosomica que es natural para la celula.
El termino "exogena", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia se refiere a una secuencia que no es natural para la celula, o una secuencia cuya localizacion natural en el genoma de la celula esta en una localizacion cromosomica diferente.
Un "gen", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una region de ADN (incluyendo exones e intrones) que codifica un producto genico, asf como a todas las regiones de ADN que regulan la produccion del producto genico, tanto si tales secuencias reguladoras son adyacentes o no a secuencias codificantes y/o transcritas. En consecuencia, un gen incluye, pero no se limita necesariamente a, secuencias promotoras, terminadores, secuencias reguladoras de la traduccion tales como sitios de union a ribosomas y sitios de entrada interna en ribosomas, potenciadores, silenciadores, aislantes, elementos limitantes, ongenes de replicacion, sitios de union a matriz y regiones de control de locus.
El termino "heterologo" se refiere a una entidad que no es endogena o natural para la celula de interes. Por ejemplo, una protema heterologa se refiere a una protema que proviene de o que originalmente proviene de una fuente exogena, tal como una secuencia de acido nucleico introducida de manera exogena. En algunos casos, la protema heterologa no se produce normalmente por la celula de interes.
Las expresiones "acido nucleico" y "polinucleotido" se refieren a un poKmero de desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos, de conformacion lineal o circular y en forma monocatenaria o bicatenaria. Para los fines de la presente divulgacion, estos terminos no deben interpretarse como limitantes con respecto a la longitud de un polfmero. Estos terminos pueden abarcar los analogos conocidos de los nucleotidos naturales, as ^como nucleotidos que se modifican en la base, restos de azucar y/o fosfatos (por ejemplo, estructuras principales de fosforotioatos). En general, un analogo de un nucleotido particular tiene la misma especificidad de emparejamiento de bases; es decir, un analogo de A emparejara su base con T.
El termino "nucleotido" se refiere a desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos. Los nucleotidos pueden ser nucleotidos covencionales (es decir, adenosina, guanosina, citidina, timidina y uridina) o analogos de nucleotido. Un analogo de nucleotido se refiere a un nucleotido que tiene una base de purina o de pirimidina modificada o un resto de ribosa modificado. Un analogo de nucleotido puede ser un nucleotido de origen natural (por ejemplo, inosina) o un nucleotido de origen no natural. Los ejemplos no limitantes de modificaciones en los restos de azucar o de base de un nucleotido incluyen la adicion (o eliminacion) de grupos acetilo, grupos amino, grupos carboxilo, grupos carboximetilo, gupos hidroxilo, grupos metilo, grupos fosforilo y grupos tiol, asf como la sustitucion de los atomos de carbono y nitrogeno de las bases por otros atomos (por ejemplo, 7-deaza purinas). Los analogos de nucleotidos tambien incluyen didesoxinucleotidos, 2'-O-metil nucleotidos, acidos nucleicos bloqueados (LNA), acidos peptidonucleicos (PNA) y morfolinos.
Los terminos "polipeptido" y "protema" se usan de manera intercambiable para referirse a un polfmero de restos de aminoacidos.
Las tecnicas para determinar la identidad de secuencia de acido nucleico y de aminoacidos se conocen en la materia. Normalmente, tales tecnicas incluyen la determinacion de la secuencia de nucleotidos de un ARNm para un gen y/o la determinacion de la secuencia de aminoacidos codificada por la misma, y la comparacion de estas secuencias con una segunda secuencia de nucleotidos o de aminoacidos. Las secuencias genomicas tambien se pueden determinar y comparar de esta manera. En general, identidad se refiere a una correspondencia exacta nucleotido a nucleotido o aminoacido a aminoacido de dos polinucleotidos o secuencias polipeptfdicas, respectivamente. Dos o mas secuencias (de polinucleotidos o aminoacidos) se pueden comparar determinando su porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad de dos secuencias, sean secuencias de acido nucleico o de aminoacidos, es el numero de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas dividido entre la longitud de las secuencias mas cortas y multiplicado por 100. Un alineamiento aproximado para las secuencias de acido nucleico se proporciona mediante el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Este algoritmo se puede aplicar a las secuencias de aminoacidos usando la matriz de puntuacion desarrollada por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 supl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EEUU, y normalizada por Gribskov, Nucl. Acids Res.
14(6):6745-6763 (1986). Una implementacion ejemplar de este algoritmo para determinar el porcentaje de identidad de una secuencia se proporciona por el Genetics Computer Group (Madison, Wis.) en la aplicacion de utilidad "BestFit". Otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o la similitud entre secuencias son generalmente conocidos en la materia, por ejemplo, otro programa de alineamiento es BLAST, usado con parametros por defecto. Por ejemplo, se pueden usar BLASTN y BLASTP usando los siguientes parametros por defecto: genetic code=standard; filter=none; strand=both; cutoff=60; expect=10; Matrix=BLOSUM62; Descriptions=50 sequences; sort by=HIGH SCORE; Databases=non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. Los detalles de estos programas se pueden encontrar en la pagina web de GenBank.
Como se pueden hacer diversos cambios en las celulas mencionadas y procedimientos sin apartarse del ambito de la invencion, se pretende que toda la materia contenida en la descripcion anterior y en los ejemplos que figuran a continuacion, se puedan interpretar como ilustrativos y no en un sentido limitante.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran determinados aspectos de la invencion.
Ejemplo 1: Modificacion del gen Cas9 para la expresion en mam^feros
Un gen Cas9 de la cepa MGAS15252 de Streptococcus pyogenes (Numero de referencia YP_005388840.1) se optimizo con el codon de Homo sapiens de preferencia para potenciar su traduccion en celulas de mairnfero. El gen Cas9 tambien se modifico anadiendo una senal de localizacion PKKKRKV (SEQ ID NO:1) en el extremo C-terminal para dirigir la protema a los nucleos de las celulas de mamffero. La Tabla 1 presenta la secuencia de aminoacidos de Cas9 modificada, con la secuencia de localizacion nuclear subrayada. La Tabla 2 presenta la secuencia de ADN de Cas9 modificada y optimizada con codon.
Figure imgf000017_0002
Figure imgf000017_0001
continuacion
Figure imgf000018_0001
(continuacion)
Figure imgf000019_0002
______________________________________________________________
La secuencia de ADN de Cas9 modificada se coloco en el control del promotor de citomegalovirus (CMV) para la expresion constituyente en celulas de mairnfero. La secuencia de ADN de CAs9 modificada tambien se coloco en el promotor de control T7 para la smtesis in vitro de ARNm con la ARN polimerasa T7. La transcripcion in vitro de ARN se realizo usando el kit MessageMAX T7 ARCA-Capped Message Transcription y el sistema de produccion de ARNm T7 mScript Standard (Cellscript).
Ejemplo 2: Cas9 de direccionamiento
El locus del sitio de integracion 1 del virus adenoasociado (AAVS1) se uso como una diana para la modificacion del genoma humano mediada por Cas9. El locus AAVS1 humano se localiza en el intron 1 (4427 pb) de la protema fosfatasa 1, subunidad reguladora 12C (PPP1 R12C). La Tabla 3 presenta el primer exon (sombreado en gris) y el primer intron de PPP1 R12C. La secuencia subrayada en el intron es el sitio de modificacion dirigida (es decir, el locus AAVS1).
Figure imgf000019_0001
continuacion
Figure imgf000020_0001
________________________________________(continuacion)_______________________________________ Tabla 3. Primer exon e intron de PPP1R12C (5’-3’)
CAGCCCT GT CTACCAGGCTGCCTTTTGGGT GGATT CT CCT CCAACT GTGGGGTG
ACT GCTT GGCAAACT CACT CTT CGGGGT AT CCCAGGAGGCCT GGAGCATT GGG
GT GGGCT GGGGTT CAGAGAGGAGGGATT CCCTT CT CAGGTT ACGT GGCCAAGA
AGCAGGGGAGCTGGGTTTGGGTCAGGTCTGGGTGTGGGGTGACCAGCTTATGC
T GTTT GCCCAGGACAGCCT AGTTTT AGCACT GAAACCCT CAGT CCT AGGAAAACA
GGGAT GGTT GGT CACT GT CT CT GGGT GACT CTT GATT CCCGGCCAGTTT CT CCA
CCT GGGGCTGT GTTT CT CGT CCT GCAT CCTT CT CCAGGCAGGT CCCCAAGCAT C
GCCCCCCT GCT GT GGCT GTT CCCAAGTT CTTAGGGT ACCCCACGT GGGTTTAT C
AACCACTTGGT GAGGCT GGTACCCT GCCCCCATT CCT GCACCCCAATT GCCTT A
GTGGCTAGGGGGTTGGGGGCTAGAGTAGGAGGGGCTGGAGCCAGGATTCTTAG
GGCT GAACAGAGAAGAGCT GGGGGCCT GGGCT CCT GGGTTT GAGAGAGGAGG
GGCTGGGGCCTGGACTCCTGGGTCCGAGGGAGGAGGGGCTGGGGCCTGGACT
CCTGGGTCTGAGGGTGGAGGGACTGGGGGCCTGGACTCCTGGGTCCGAGGGA
GGAGGGGCTGGGGCCTGGACTCGTGGGTCTGAGGGAGGAGGGGCTGGGGGC
CT GGACTT CTGGGT CTT AGGGAGGCGGGGCT GGGCCT GGACCCCT GGGT CT GA
AT GGGGAGAGGCTGGGGGCCT GGACT CCTT CAT CT GAGGGCGGAAGGGCT GG
GGCCT GGCCT CCT GGGTT GAAT GGGGAGGGGTT GGGCCTGGACT CT GGAGTCC
CT GGTGCCCAGGCCT CAGGCAT CTTT CACAGGGAT GCCT GT ACT GGGCAGGT C
CTT GAAAGGGAAAGGCCCATTGCT CT CCTT GCCCCCCT CCCCT ATCGCCAT GAC
AACT GGGT GGAAAT AAACGAGCCGAGTT CAT CCCGTT CCCAGGGCACGT GCGG
CCCCTT CACAGCCCGAGTTT CCAT GACCT CATGCT CTT GGCCCT CGT AGCT CCC
T CCCGCCT CCT CCAGAT GGGCAGCTTT GGAGAGGT GAGGGACTT GGGGGGT AA
TTTAT CCCGT GGAT CT AGGAGTTT AGCTT CACTCCTT CCT CAGCT CCAGTT CAGG
T CCCGGAGCCCACCCAGT GT CCACAAGGCCTGGGGCAAGT CCCT CCT CCGACC
CCCT GGACTT CGGCTTTT GT CCCCCCAAGTTTT GGACCCCT AAGGGAAGAAT GA
GAAACGGTGGCCCGTGTCAGCCCCTGGCTGCAGGGCCCCGTGCAGAGGGGGC
CT CAGT GAACT GGAGT GT GACAGCCT GGGGCCCAGGCACACAGGT GT GCAGCT
GT CT CACCCCT CT GGGAGTCCCGCCCAGGCCCCT GAGT CT GTCCCAGCACAGG
GTGGCCTTCCTCCACCCTGCATAGCCCTGGGCCCACGGCTTCGTTCCTGCAGA
GT AT CT GCT GGGGT GGTTT CCGAGCTT GACCCTT GGAAGGACCT GGCT GGGTTT
AAGGCAGGAGGGGCTGGGGGCCAGGACTCCTGGCTCTGAAGGAGGAGGGGCT
GGAACCT CTT CCCT AGT CT GAGCACT GGAAGCGCCACCT GTGGGTGGT GACGG
GGGTTTT GCCGT GT CT AACAGGT ACCAT GT GGGGTT CCCGCACCCAGAT GAGAA
GCCCCCTCCCTT CCCCGTT CACTT CCT GTTT GCAGATAGCCAGGAGT CCTTT CGT
GGTTT CCACT GAGCACT GAAGGCCT GGCCGGCCT GACCACT GGGCAACCAGGC
GT AT CTT AAACAGCCAGT GGCCAGAGGCT GTT GGGT CATTTT CCCCACT GT CCT A
GCACCGT GT CCCT GGAT CT GTTTTCGTGGCT CCCT CTGGAGT CCCGACTT GCTG
GGACACCGT GGCT GGGGTAGGTGCGGCT GACGGCT GTTT CCCACCCCCAG
(SEQ ID NO:11)_________________________________________________________________
Los ARN grnas de Cas9 se disenaron para el direccionamiento del locus humano AAVS1. Un ARN de 42 nucleotidos (denominado en el presente documento como una secuencia "ARNcr") que comprende (de 5' a 3') una secuencia de reconocimiento diana (es decir, una secuencia complementaria con la hebra no codificante de la secuencia diana) y secuencia de protoespaciador; un ARN de 85 nucleotidos (denominado en el presente documento como una secuencia de "ARNtracr") que comprende la secuencia 5' con complementariedad con la secuencia 3' del ARNcr y una secuencia de horquilla adicional; y un ARN quimerico que comprende los nucleotidos 1-32 del ARNcr, un bucle GAAA y los nucleotidos 19-45 del ARNtracr se preparo. El ARNcr se sintetizo qmmicamente por Sigma-Aldrich. El ARNtracr y el ARN quimerico se sintetizo mediante transcripcion in vitro con a Rn polimerasa T7 usando el kit T7-Scribe Standard RNA IVT (Cellscript). La secuencia codificante de ARN quimerico tambien se coloco en el control del promotor humano U6 para la transcripcion in vivo en celulas humanas. La Tabla 4 presenta las secuencias de los Ar N grnas.
Figure imgf000022_0001
Ejemplo 3: Preparacion del polinucleotido donador para controlar la modificacion del genoma
Se uso la integracion dirigida de una protema GFP en el extremo N-terminal de PPP1 R12C para controlar la modificacion del genoma mediada por Cas9. Para mediar la integracion mediante recombinacion homologa se preparo un polinucleotido donador. El donador de ADN de AAVS1-GFP contema en 5' un brazo homologo del locus AAVS1 (1185 pb), un receptor de corte y empalme de ARN, una secuencia codificante de turbo GFP, un finalizador de transcripcion en 3', y un brazo homologo del locus AAVS1 en 3' (1217 pb). La Tabla 5 presenta las secuencias del receptor de corte y empalme de ARN y la secuencia codificante de GFP seguida por el finalizador de transcripcion en 3'. El ADN del plasmido se preparo usando el kit GenElute Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep (Sigma).
Figure imgf000022_0002
continuacion
Figure imgf000023_0001
La integracion de genes dirigida dara como resultado una protema de fusion entre los primeros 107 aminoacidos de la PPP1 R12C y la turbo GFP. La protema de fusion esperada contiene los primeros 107 restos de aminoacidos de PPP1R12C (resaltado en gris) de corte y empalme de ARN entre el primer exon de PPP1 R12C y el receptor de corte y empalme disenado por ingeniena genetica (vease la Tabla 6).
Tabla 6. Secuencia de aminoacidos predicha de la protema de fusion PPP1R12C-GFP.
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Ejemplo 4: Integracion dirigida mediada por Cas9
La transfeccion se realizo en celulas K562 humanas. La lmea celular K562 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivo en medio de Dulbecco modificado por Iscove, suplementado con FBS al 10 % y L-glutamina 2 mM. Todos los medios y suplementos se obtuvieron de Sigma-Aldrich. Los cultivos se dividieron un d^ a antes de la transfeccion (a aproximadamente 0,5 millones de celulas por ml antes de la transfeccion). Las celulas se transfectaron con Solucion V de Nucleofector (Lonza) en un Nucleofector (Lonza) con el programa T-016. Cada nucleofeccion contema aproximadamente 0,6 millones de celulas. Los tratamientos de transfeccion se detallan en la Tabla 7. Las celulas se cultivaron a 37 °C y CO2 al 5 % inmediatamente tras la nucleofeccion.
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La clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) se realizo 4 dfas tras la transfeccion. Los datos de FACS se presentan en la FIG. 2. El porcentaje de GFP detectada en cada uno de los cuatro tratamientos experimentales (A-D) fue mayor que en los tratamientos de control (E, F), confirmando la integracion de la secuencia donadora y la expresion de la protema de fusion.
Ejemplo 5: Confirmacion por PCR de la integracion dirigida
El ADN genomico se extrajo de las celulas transfectadas con el kit GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep (Sigma) 12 dfas despues de la transfeccion. El ADN genomico se amplifico entonces por PCR con un cebador hacia delante localizado fuera del brazo homologo en 5' del donador del plasmido AAVSl-GFP y un cebador inverso localizado en la region 5' de la GFP. El cebador hacia delante fue 5'-CCACTCTGTGCTGACCACTCT-3' (SEQ ID NO:18) y el cebador inverso fue 5'-GCGGCACTCGATCTCCA-3' (SEQ ID NO:19). El tamano del fragmento esperado de la PCR de union fue de 1388 pb. La amplificacion se llevo a cabo con JumpStart Taq ReadyMix (Sigma), usando las siguientes condiciones de ciclacion: 98 °C durante 2 minutos para la desnaturalizacion inicial; 35 ciclos de 98 °C durante 15 segundos, 62 °C durante 30 segundos, y 72 °C durante 1 minuto y 30 segundos; y una extension final a 72 °C durante 5 minutos. Los productos de PCR se resolvieron en gel de agarosa al 1 %.
Las celulas transfectadas con 10 |jg de ARNm de Cas9 transcrito con un analogo de casquete anti-inverso, 0,3 nmol de doble cadena de ARNct-ARNtracr prealineada, y 10 jg ADN del plasmido AAVS1-GFP presentaron un producto de PCR del tamano esperado (vease el carril A, FIG. 3).
El locus Rosa26 de raton se puede dirigir para modificaciones genomicas. La Tabla 8 presenta una porcion de la secuencia de Rosa26 de raton en la que los posibles sitios diana se muestran en negrita. Cada sitio diana comprende un protoespaciador.
Figure imgf000025_0001
Los ARN gmas se disenaron para direccionar cada uno de los sitios diana en el locus Rosa26 de raton. Estas secuencias se muestran en la Tabla 9, cada una es de 42 nucleotidos de longitud y la region 5' es complementaria a la hebra que no se presenta en la Tabla 8 (es decir, la hebra que es complementaria a la hebra mostrada en la Tabla 8).
Figure imgf000025_0002
Los ARNcr se sintetizaron qmmicamente y se prealinearon con el ARNtracr (SEQ ID NO:13; vease el Ejemplo 2). El ARNcr / ARNtracr prealineado y el ARNm transcrito in vitro que codifica la protema Cas9 modificada (s Eq ID NO. 9; vease el Ejemplo 1) se pueden microinyectar en los pronucleos de embriones de raton fecundados. Tras la gma hacia la diana establecida por el ARNcr, la protema Cas9 escinde el sitio diana, y la rotura de doble cadena resultante se puede reparar mediante un proceso de reparacion por union de extremos no homologos (NHEJ). Los embriones inyectados se pueden incubar bien a 37 °C, con CO2 al 5 % durante la noche o durante hasta 4 dfas, seguido por el analisis de genotipado, o los embriones inyectados se pueden implantar en los ratones hembra receptores de manera que se puedan genotipar los animales nacidos vivos. Los embriones incubados in vitro o los tejidos de los animales nacidos vivos se pueden explorar para la presencia de una mutacion inducida por Cas9 en el locus Rosa usando los procedimientos convencionales. Por ejemplo, los embriones o tejidos de fetos o animales nacidos vivos se pueden recolectar para la extraccion y el analisis de ADN. El ADN se puede aislar usando procedimientos convencionales. La region dirigida del locus Rosa26 se puede amplificar por PCR usando cebadores apropiados. Dado que la NHEJ es propensa a errores, las deleciones de al menos un nucleotido, las inserciones de al menos un nucleotido, las sustituciones de al menos un nucleotido o las combinaciones de las mismas pueden tener lugar durante la reparacion de la rotura. Las mutaciones se pueden detectar usando procedimientos de genotipado basados en PCR, tales como los ensayos de emparejamiento incorrecto Cel-l y de secuenciacion de ADN.
Ejemplo 7: Modificacion de genoma en embriones de raton basada en Cas9
El locus Rosa26 se puede modificar en embriones de raton mediante coinyeccion de un polinucleotido donador, tal como se detalla anteriormente en la seccion (III)(d), junto con el ARNcr / ARNtracr prealineado y el ARNm que codifica la Cas9 modificada tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 6. Los embriones incubados in vitro o los tejidos de animales nacidos vivos (tal como se describe en el Ejemplo 6) se pueden explorar para un locus Rosa26 usando procedimientos de genotipado basados en PCR, tales como los ensayos RFLP, PCR de union, y secuenciacion de ADN.
Ejemplo 8: Modificacion de genoma en embriones de rata basada en Cas9
El locus Rosa26 de rata se puede dirigir para modificaciones genomicas. La Tabla 10 presenta una porcion de la secuencia de rata en la que los posibles sitios diana se muestran en negrita. Cada sitio diana comprende un protoespaciador.
Figure imgf000026_0001
Los ARN grnas se disenaron para direccionar cada uno de los sitios diana en el locus Rosa26 de rata. Estas secuencias se muestran en la Tabla 11, cada una es de 42 nucleotidos de longitud y la region 5' es complementaria a la hebra que no se presenta en la Tabla 10 (es decir, la hebra que es complementaria a la hebra mostrada en la Tabla 10).
Figure imgf000026_0002
Los ARNcr se sintetizaron qmmicamente y se prealinearon con el ARNtracr (SEQ ID NO:13; vease el Ejemplo 2). El ARNcr / ARNtracr prealineado y el ARNm transcrito in vitro que codifica la protema Cas9 modificada (s Eq ID NO. 9; vease el Ejemplo 1) se pueden microinyectar en los pronucleos de embriones de rata fecundados. Tras la grna hacia el sitio diana por el ARNcr, la protema Cas9 escinde el sitio diana, y la rotura de doble cadena resultante se puede reparar mediante un proceso de reparacion por union de extremos no homologos (NHEJ). Los embriones inyectados se pueden incubar bien a 37 °C, con CO2 al 5 % durante la noche o durante hasta 4 dfas, seguido por el analisis de genotipado, o los embriones inyectados se pueden implantar en los ratones hembra receptores de manera que se puedan genotipar los animales nacidos vivos. Los embriones incubados in vitro o los tejidos de los animales nacidos vivos se pueden explorar para la presencia de una mutacion inducida por Cas9 en el locus Rosa usando los procedimientos convencionales. Por ejemplo, los embriones o tejidos de fetos o animales nacidos vivos se pueden recolectar para la extraccion y el analisis de ADN. El ADN se puede aislar usando procedimientos convencionales. La region dirigida del locus Rosa26 se puede amplificar por PCR usando cebadores apropiados. Dado que la NHEJ es propensa a errores, las deleciones de al menos un nucleotido, las inserciones de al menos un nucleotido, las sustituciones de al menos un nucleotido o las combinaciones de las mismas pueden tener lugar durante la reparacion de la rotura. Las mutaciones se pueden detectar usando procedimientos de genotipado basados en PCR, tales como los ensayos de emparejamiento incorrecto Cel-l y de secuenciacion de ADN.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de modificar una secuencia cromosomica de una celula eucariota mediante la integracion de una secuencia donadora, comprendiendo el procedimiento:
a) introducir en la celula eucariota
(i) al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una sena de localizacion nuclear o acido nucleico que codifica al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una senal de localizacion nuclear, en la que la al menos una endonucleasa guiada por ARN es un sistema de protemas repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)/(Cas) asociado a cRlSPR (CRISPR /Cas) de tipo II y el sistema de protemas CRISPR/Cas de tipo II es una protema Cas9, (ii) al menos un ARN o ADN grna que codifica al menos un ARN grna, y
(iii) un polinucleotido donador que comprende la secuencia donadora; y
b) cultivar la celula eucariota de manera que cada ARN grna grne una endonucleasa guiada por ARN a un sitio diana en la secuencia cromosomica, la endonucleasa guiada por ARN introduce una rotura de doble cadena en el sitio diana, y la rotura de doble cadena se repara mediante un proceso de reparacion de ADN, de manera que la secuencia cromosomica se modifica mediante la insercion o la sustitucion de la secuencia donadora en la secuencia cromosomica, en la que
el sitio diana en la secuencia cromosomica esta seguido inmediatamente por un motivo adyacente de protoespaciador (PAM), el procedimiento no comprende un proceso de modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano y, en el que el procedimiento no comprende un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugfa o terapia.
2. Un procedimiento ex vivo o in vitro de modificar una secuencia cromosomica en una celula eucariota mediante integracion de una secuencia donadora, comprendiendo el procedimiento:
a) introducir en la celula eucariota
(i) al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una sena de localizacion nuclear o acido nucleico que codifica al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una senal de localizacion nuclear, en la que la al menos una endonucleasa guiada por ARN es un sistema de protemas repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)/(Cas) asociado a CRISPR (CRISPR /Cas) de tipo II y el sistema de protemas CRISPR/Cas de tipo II es una protema Cas9, (ii) al menos un ARN o ADN grna que codifica al menos un ARN grna, y
(iii) un polinucleotido donador que comprende la secuencia donadora; y
b) cultivar la celula eucariota de manera que cada ARN grna grne una endonucleasa guiada por ARN a un sitio diana en la secuencia cromosomica donde la endonucleasa guiada por ARN introduce una rotura de doble cadena en el sitio diana, y la rotura de doble cadena se repara mediante un proceso de reparacion de ADN, de manera que la secuencia cromosomica se modifica mediante insercion o sustitucion de la secuencia donadora en la secuencia cromosomica, en la que
el sitio de diana en la secuencia cromosomica esta inmediatamente seguido por un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) y, en el que
el procedimiento no comprende un proceso de modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano.
3. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que el sitio diana es un locus Rosa26, un locus HPRT, o un locus AAVS1.
4. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que la al menos una senal de localizacion nuclear se localiza en el extremo C-terminal de la endonucleasa.
5. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que cada ARN grna comprende una primera region que es complementaria con el sitio diana en la secuencia cromosomica.
6. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que cada ARN grna comprende una segunda region que interacciona con la endonucleasa guiada por ARN.
7. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que la secuencia donadora en el polinucleotido donador tiene al menos un cambio de nucleotido en relacion con la secuencia cromosomica cerca del sitio diana en la secuencia cromosomica.
8. El procedimiento de cualquier reivindicacion previa, en el que la secuencia donadora en el polinucleotido donador esta flanqueada por secuencias que tienen identidad de secuencia sustancial con secuencias localizadas aguas arriba y aguas abajo del sitio diana en la secuencia cromosomica.
9. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que el polinucleotido donador comprende adicionalmente un sitio de escision dirigido que se reconoce mediante la endonucleasa guiada por ARN.
10. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que el acido nucleico que codifica la endonucleasa guiada por ARN es ARNm.
11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el acido nucleico que codifica la endonucleasa guiada por ARN es ADN.
12. El procedimiento de la reivindicacion 11, en el que el ADN es parte de un vector que comprende adicionalmente una secuencia que codifica el ARN grna.
13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que la celula eucariota es una celula humana, una celula de mairnfero no humano, o un embrion de mairnfero no humano.
14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que la celula eucariota es una celula de invertebrado, una celula de insecto, una celula vegetal, una levadura o un organismo eucariota unicelular.
15. El procedimiento de la reivindicacion 14, en el que la celula eucariota es una celula vegetal.
16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el que la celula eucariota esta in vitro.
17. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que el al menos un ARN grna se sintetiza qmmicamente.
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Families Citing this family (379)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008027558A2 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Codon Devices, Inc. Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
EP2638157B1 (en) 2010-11-12 2015-07-22 Gen9, Inc. Methods and devices for nucleic acids synthesis
EP4039363A1 (en) 2010-11-12 2022-08-10 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
CA2853829C (en) 2011-07-22 2023-09-26 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
LT2944693T (lt) 2011-08-26 2019-08-26 Gen9, Inc. Kompozicijos ir būdai, skirti nukleorūgščių didelio tikslumo sąrankai
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
GB201122458D0 (en) * 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9637739B2 (en) * 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
EP4001427A1 (en) 2012-04-24 2022-05-25 Gen9, Inc. Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning
ES2683071T3 (es) 2012-04-25 2018-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Direccionamiento mediado por nucleasas con grandes vectores de direccionamiento
WO2013163628A2 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Duke University Genetic correction of mutated genes
DK2800811T3 (en) 2012-05-25 2017-07-17 Univ Vienna METHODS AND COMPOSITIONS FOR RNA DIRECTIVE TARGET DNA MODIFICATION AND FOR RNA DIRECTIVE MODULATION OF TRANSCRIPTION
BR112014031891A2 (pt) 2012-06-19 2017-08-01 Univ Minnesota direcionamento genético nas plantas utilizando vírus de dna
CN104685116A (zh) 2012-06-25 2015-06-03 Gen9股份有限公司 用于核酸组装和高通量测序的方法
JP2015527889A (ja) * 2012-07-25 2015-09-24 ザ ブロード インスティテュート， インコーポレイテッド 誘導可能なｄｎａ結合タンパク質およびゲノム撹乱ツール、ならびにそれらの適用
SG11201503059XA (en) * 2012-10-23 2015-06-29 Toolgen Inc Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
US10415024B2 (en) 2012-11-16 2019-09-17 Poseida Therapeutics, Inc. Site-specific enzymes and methods of use
KR102243092B1 (ko) 2012-12-06 2021-04-22 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
EP3031921A1 (en) 2012-12-12 2016-06-15 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
DK3064585T3 (da) 2012-12-12 2020-04-27 Broad Inst Inc Konstruering og optimering af forbedrede systemer, fremgangsmåder og enzymsammensætninger til sekvensmanipulation
SG11201504523UA (en) * 2012-12-12 2015-07-30 Broad Inst Inc Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
EP4286402A3 (en) 2012-12-12 2024-02-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
KR20150105633A (ko) * 2012-12-12 2015-09-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 시스템, 방법 및 최적화된 가이드 조성물의 조작
US8697359B1 (en) * 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
CN105121641A (zh) * 2012-12-17 2015-12-02 哈佛大学校长及研究员协会 Rna-引导的人类基因组工程化
EP2922393B2 (en) 2013-02-27 2022-12-28 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
EP2971184B1 (en) 2013-03-12 2019-04-17 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
EP2971167B1 (en) 2013-03-14 2019-07-31 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
JP2016512048A (ja) * 2013-03-15 2016-04-25 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用した植物ゲノム操作
IL289396B2 (en) 2013-03-15 2023-12-01 The General Hospital Coporation Using tru-grnas to increase the specificity of RNA-guided genome editing
US20140273230A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US20160186208A1 (en) * 2013-04-16 2016-06-30 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of Mutating, Modifying or Modulating Nucleic Acid in a Cell or Nonhuman Mammal
RS62263B1 (sr) 2013-04-16 2021-09-30 Regeneron Pharma Ciljana modifikacija genoma pacova
CN116083487A (zh) * 2013-05-15 2023-05-09 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗遗传病状的方法和组合物
CA2913865C (en) * 2013-05-29 2022-07-19 Cellectis A method for producing precise dna cleavage using cas9 nickase activity
US20140356956A1 (en) 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
EP3603679B1 (en) * 2013-06-04 2022-08-10 President and Fellows of Harvard College Rna-guided transcriptional regulation
EP3004370B1 (en) * 2013-06-05 2024-08-21 Duke University Rna-guided gene editing and gene regulation
US20160145631A1 (en) 2013-06-14 2016-05-26 Cellectis Methods for non-transgenic genome editing in plants
KR20160056869A (ko) 2013-06-17 2016-05-20 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 바이러스 구성성분을 사용하여 장애 및 질환을 표적화하기 위한 crispr-cas 시스템 및 조성물의 전달, 용도 및 치료 적용
CA2915845A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for targeting and modeling diseases and disorders of post mitotic cells
CA2915842C (en) 2013-06-17 2022-11-29 The Broad Institute, Inc. Delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
EP4245853A3 (en) 2013-06-17 2023-10-18 The Broad Institute, Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
CN106062197A (zh) 2013-06-17 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的串联指导系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
WO2014204727A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
US10011850B2 (en) 2013-06-21 2018-07-03 The General Hospital Corporation Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing
US10563225B2 (en) 2013-07-26 2020-02-18 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
MX2016002306A (es) 2013-08-22 2016-07-08 Du Pont Promotor u6 de polimerasa iii de soja y metodos de uso.
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
DE202014010413U1 (de) * 2013-09-18 2015-12-08 Kymab Limited Zellen und Organismen
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
US10584358B2 (en) 2013-10-30 2020-03-10 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-II CRISPR-Cas system in Lactobacillus buchneri
CA2930015A1 (en) 2013-11-07 2015-05-14 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions with governing grnas
EP3460063B1 (en) 2013-12-11 2024-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
RU2725520C2 (ru) 2013-12-11 2020-07-02 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
CA2932472A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
KR20160097327A (ko) 2013-12-12 2016-08-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 유전자 산물, 구조 정보 및 유도성 모듈형 ｃａｓ 효소의 발현의 변경을 위한 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템 및 방법
WO2015089462A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
US10787654B2 (en) * 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
EP4063503A1 (en) 2014-02-11 2022-09-28 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Crispr enabled multiplexed genome engineering
BR112016019068A2 (pt) 2014-02-18 2017-10-10 Univ Duke construto, vetor recombinante, composição farmacêutica, método de inibição de replicação viral ou expressão de uma sequência alvo em uma célula infectada com um vírus, polipeptídeo de sau cas9 recombinante, construto de sau cas9 recombinante, construto recombinante para expressão de um rna guia individual e kit
EP3114227B1 (en) 2014-03-05 2021-07-21 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
WO2015138510A1 (en) 2014-03-10 2015-09-17 Editas Medicine., Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10)
AU2015236128A1 (en) * 2014-03-25 2016-11-10 Editas Medicine Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating HIV infection and AIDS
EP3981876A1 (en) 2014-03-26 2022-04-13 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
CA2944978C (en) 2014-04-08 2024-02-13 North Carolina State University Methods and compositions for rna-directed repression of transcription using crispr-associated genes
CN111647627A (zh) 2014-04-28 2020-09-11 重组股份有限公司 多重基因编辑
WO2015188065A1 (en) 2014-06-05 2015-12-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
EP3708671A1 (en) 2014-06-06 2020-09-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modifying a targeted locus
AU2015277369B2 (en) * 2014-06-16 2021-08-19 The Johns Hopkins University Compositions and methods for the expression of CRISPR guide RNAs using the H1 promoter
US20170107541A1 (en) * 2014-06-17 2017-04-20 Poseida Therapeutics, Inc. A method for directing proteins to specific loci in the genome and uses thereof
CA2953499C (en) 2014-06-23 2023-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated dna assembly
US9902971B2 (en) 2014-06-26 2018-02-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for producing a mouse XY embryonic (ES) cell line capable of producing a fertile XY female mouse in an F0 generation
US20170198268A1 (en) * 2014-07-09 2017-07-13 Gen9, Inc. Compositions and Methods for Site-Directed DNA Nicking and Cleaving
EP3169776A4 (en) * 2014-07-14 2018-07-04 The Regents of The University of California Crispr/cas transcriptional modulation
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
CN113789317B (zh) * 2014-08-06 2024-02-23 基因工具股份有限公司 使用空肠弯曲杆菌crispr/cas系统衍生的rna引导的工程化核酸酶的基因编辑
US10450584B2 (en) 2014-08-28 2019-10-22 North Carolina State University Cas9 proteins and guiding features for DNA targeting and genome editing
EP3188763B1 (en) 2014-09-02 2020-05-13 The Regents of The University of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification
MX2017002930A (es) 2014-09-12 2017-06-06 Du Pont Generacion de sitios de integracion especifica de sitio para loci de rasgos complejos en maiz y soja, y metodos de uso.
CA2963840A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Long poly(a) plasmids and methods for introduction of long poly(a) sequences into the plasmid
CN113930455A (zh) * 2014-10-09 2022-01-14 生命技术公司 Crispr寡核苷酸和基因剪辑
ES2741387T3 (es) 2014-10-15 2020-02-10 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para generar o mantener células pluripotentes
US20170306306A1 (en) * 2014-10-24 2017-10-26 Life Technologies Corporation Compositions and Methods for Enhancing Homologous Recombination
EP3708155A1 (en) * 2014-10-31 2020-09-16 Massachusetts Institute Of Technology Massively parallel combinatorial genetics for crispr
US10208298B2 (en) 2014-11-06 2019-02-19 E.I. Du Pont De Nemours And Company Peptide-mediated delivery of RNA-guided endonuclease into cells
CA2963820A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
CN107532142A (zh) * 2014-11-11 2018-01-02 应用干细胞有限公司 使用同源重组改造间充质干细胞
KR20160059994A (ko) 2014-11-19 2016-05-27 기초과학연구원 두 개의 벡터로부터 발현된 Cas9 단백질을 이용한 유전자 발현 조절 방법
SI3221457T1 (sl) 2014-11-21 2019-08-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postopki in sestavki za ciljno genetsko modifikacijo z uporabo vodilnih RNK v parih
GB201421096D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Imp Innovations Ltd Genome editing methods
AU2015355546B2 (en) 2014-12-03 2021-10-14 Agilent Technologies, Inc. Guide RNA with chemical modifications
EP3229586A4 (en) 2014-12-10 2018-10-24 Regents of the University of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
WO2016094867A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016100819A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeted genetic modification through single-step multiple targeting
US10196613B2 (en) 2014-12-19 2019-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stem cells for modeling type 2 diabetes
EP3250688B1 (fr) 2015-01-29 2021-07-28 Meiogenix Procede pour induire des recombinaisons meiotiques ciblees
EP3280803B1 (en) 2015-04-06 2021-05-26 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Chemically modified guide rnas for crispr/cas-mediated gene regulation
JP2018522249A (ja) 2015-04-24 2018-08-09 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド Ｃａｓ９分子／ガイドｒｎａ分子複合体の評価
WO2016176617A2 (en) 2015-04-29 2016-11-03 New York University Method for treating high-grade gliomas
US11845928B2 (en) 2015-05-04 2023-12-19 Tsinghua University Methods and kits for fragmenting DNA
EP3294896A1 (en) 2015-05-11 2018-03-21 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
EP4039816A1 (en) 2015-05-29 2022-08-10 North Carolina State University Methods for screening bacteria, archaea, algae, and yeast using crispr nucleic acids
WO2016196887A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Dna editing using single-stranded dna
JP7396783B2 (ja) 2015-06-09 2023-12-12 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド 移植を改善するためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ関連方法および組成物
JP7051438B2 (ja) 2015-06-15 2022-04-11 ノース カロライナ ステート ユニバーシティ 核酸およびｒｎａに基づく抗菌剤の効率的な送達のための方法および組成物
JP2018521689A (ja) * 2015-06-17 2018-08-09 ポセイダ セラピューティクス， インコーポレイテッド タンパク質をゲノム内の特定の遺伝子座に導くための組成物および方法
CN109536474A (zh) 2015-06-18 2019-03-29 布罗德研究所有限公司 降低脱靶效应的crispr酶突变
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
US20160376610A1 (en) * 2015-06-24 2016-12-29 Sigma-Aldrich Co. Llc Cell cycle dependent genome regulation and modification
EP3328399B1 (en) 2015-07-31 2023-12-27 Regents of the University of Minnesota Modified cells and methods of therapy
EP3334746B1 (en) 2015-08-14 2021-11-24 The University Of Sydney Connexin 45 inhibition for therapy
EP3341727B1 (en) 2015-08-25 2022-08-10 Duke University Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using rna-guided endonucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
CA2996888A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US11667911B2 (en) 2015-09-24 2023-06-06 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve CRISPR/CAS-mediated genome editing
KR101795999B1 (ko) 2015-09-25 2017-11-09 전남대학교산학협력단 Crispr/cas9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체
KR101745863B1 (ko) 2015-09-25 2017-06-12 전남대학교산학협력단 Crispr/cas9 시스템을 이용한 프로히비틴2 유전자 제거용 시발체
EP3356533A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 North Carolina State University Methods and compositions for sequence specific antimicrobials
WO2017066497A2 (en) 2015-10-13 2017-04-20 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
PL3846375T3 (pl) 2015-10-22 2023-04-24 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Sposoby i aparat związane z selektywnym wzmacnianiem sygnałów
IL294014B2 (en) * 2015-10-23 2024-07-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
US20180230489A1 (en) 2015-10-28 2018-08-16 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
WO2017079406A1 (en) 2015-11-03 2017-05-11 President And Fellows Of Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
CN106893739A (zh) 2015-11-17 2017-06-27 香港中文大学 用于靶向基因操作的新方法和系统
US10240145B2 (en) * 2015-11-25 2019-03-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University CRISPR/Cas-mediated genome editing to treat EGFR-mutant lung cancer
WO2017112620A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of crispr based antimicrobials
KR20180095719A (ko) 2016-01-11 2018-08-27 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 키메라 단백질 및 면역요법 방법
IL260532B2 (en) 2016-01-11 2023-12-01 Univ Leland Stanford Junior Systems containing chaperone proteins and their uses for controlling gene expression
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
EP3433364A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (a1at) deficiency
US11597924B2 (en) 2016-03-25 2023-03-07 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
EP4047092A1 (en) 2016-04-13 2022-08-24 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
AU2017250683A1 (en) * 2016-04-14 2018-11-01 Boco Silicon Valley, Inc. Genome editing of human neural stem cells using nucleases
CN116200465A (zh) 2016-04-25 2023-06-02 哈佛学院董事及会员团体 用于原位分子检测的杂交链反应方法
CN109715803B (zh) * 2016-04-25 2023-07-07 巴塞尔大学 等位基因编辑及其应用
AU2017268458B2 (en) 2016-05-20 2022-07-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide RNAS
EP3907286A1 (en) * 2016-06-02 2021-11-10 Sigma-Aldrich Co., LLC Using programmable dna binding proteins to enhance targeted genome modification
BR112018074930A2 (pt) * 2016-06-03 2019-03-12 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) ácido nucleico, vetor de ácido nucleico, partícula de entrega, composição farmacêutica, célula hospedeira, método para edição do genoma e método e kit para prevenção e/ou tratamento de uma doença
WO2017213896A1 (en) * 2016-06-03 2017-12-14 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Negative feedback regulation of hiv-1 by gene editing strategy
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
US10337051B2 (en) 2016-06-16 2019-07-02 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for detecting a target RNA
US10253316B2 (en) 2017-06-30 2019-04-09 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
JP2019518478A (ja) 2016-06-24 2019-07-04 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイトＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＯＬＯＲＡＤＯ，ａ ｂｏｄｙ ｃｏｒｐｏｒａｔｅ バーコードを付けたコンビナトリアルライブラリーを生成する方法
US11603533B2 (en) 2016-07-12 2023-03-14 Washington University Incorporation of internal polya-encoded poly-lysine sequence tags and their variations for the tunable control of protein synthesis in bacterial and eukaryotic cells
EP4230648A3 (en) 2016-07-28 2023-10-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Gpr156 variants and uses thereof
AU2017302657A1 (en) 2016-07-29 2019-02-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice comprising mutations resulting in expression of c-truncated fibrillin-1
BR112019001887A2 (pt) 2016-08-02 2019-07-09 Editas Medicine Inc composições e métodos para o tratamento de doença associada a cep290
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
IL308426A (en) 2016-08-03 2024-01-01 Harvard College Adenosine nuclear base editors and their uses
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
JP2019524149A (ja) * 2016-08-20 2019-09-05 アベリノ ラボ ユーエスエー インコーポレイテッドＡｖｅｌｌｉｎｏ Ｌａｂ ＵＳＡ， Ｉｎｃ． 一本鎖ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、及びそれらの使用方法
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
WO2018048827A1 (en) * 2016-09-07 2018-03-15 Massachusetts Institute Of Technology Rna-guided endonuclease-based dna assembly
CN106636197B (zh) * 2016-09-22 2019-09-03 南京市妇幼保健院 一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
JP2019532644A (ja) * 2016-09-30 2019-11-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Ｒｎａ誘導型核酸修飾酵素及びその使用方法
JP2019534890A (ja) * 2016-10-11 2019-12-05 ステムジェニクス， インコーポレイテッド 遺伝子編集ツールによって機能化されたナノ粒子および関連する方法
KR20190067209A (ko) 2016-10-14 2019-06-14 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 후성적으로 조절되는 부위-특이적 뉴클레아제
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
GB201617559D0 (en) 2016-10-17 2016-11-30 University Court Of The University Of Edinburgh The Swine comprising modified cd163 and associated methods
GB2604416B (en) 2016-10-18 2023-03-15 Univ Minnesota Tumor infiltating lymphocytes and methods of therapy
KR20240043810A (ko) * 2016-11-02 2024-04-03 유니버시타트 바셀 세포 치료에 사용하기 위한 면역학적으로 식별 가능한 세포 표면 변이체
EP3561059B1 (en) * 2016-12-23 2024-10-09 Institute for Basic Science Composition for base editing for animal embryo and base editing method
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11859219B1 (en) 2016-12-30 2024-01-02 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA
EP4095263A1 (en) 2017-01-06 2022-11-30 Editas Medicine, Inc. Methods of assessing nuclease cleavage
KR102619197B1 (ko) 2017-01-23 2024-01-03 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Hsd17b13 변종 및 이것의 용도
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
CN106978438B (zh) * 2017-02-27 2020-08-28 北京大北农生物技术有限公司 提高同源重组效率的方法
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
EP3592777A1 (en) 2017-03-10 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cytosine to guanine base editor
EP3596217A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
JP7191388B2 (ja) 2017-03-23 2022-12-19 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸によってプログラム可能なｄｎａ結合蛋白質を含む核酸塩基編集因子
WO2018195129A1 (en) 2017-04-17 2018-10-25 University Of Maryland, College Park Embryonic cell cultures and methods of using the same
US11834670B2 (en) 2017-04-19 2023-12-05 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Site-specific DNA modification using a donor DNA repair template having tandem repeat sequences
US12058986B2 (en) 2017-04-20 2024-08-13 Egenesis, Inc. Method for generating a genetically modified pig with inactivated porcine endogenous retrovirus (PERV) elements
WO2018195545A2 (en) 2017-04-21 2018-10-25 The General Hospital Corporation Variants of cpf1 (cas12a) with altered pam specificity
WO2018201086A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide rna molecules
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
AU2018273968A1 (en) 2017-05-25 2019-11-28 The General Hospital Corporation Using split deaminases to limit unwanted off-target base editor deamination
CA3065938A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. B4galt1 variants and uses thereof
WO2018227114A1 (en) 2017-06-09 2018-12-13 Editas Medicine, Inc. Engineered cas9 nucleases
MX2019015188A (es) 2017-06-15 2020-08-03 Univ California Inserciones de adn no virales orientadas.
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
SG11201911886PA (en) 2017-06-27 2020-01-30 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized asgr1 locus
EP3645021A4 (en) 2017-06-30 2021-04-21 Intima Bioscience, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY
IL309801B1 (en) 2017-07-11 2024-08-01 Sigma Aldrich Co Llc Use of protein domains interacting with the nucleosome to enhance targeted genome modification
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
BR112019027673A2 (pt) 2017-07-31 2020-09-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. animal não humano, e, métodos para testar a recombinação induzida por crispr/cas e para otimizar a capacidade de crispr/cas
US11021719B2 (en) 2017-07-31 2021-06-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for assessing CRISPER/Cas-mediated disruption or excision and CRISPR/Cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo
KR20200017479A (ko) * 2017-07-31 2020-02-18 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr/cas 활성제 시스템용 합성 유도 rna
CA3067872A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cas-transgenic mouse embryonic stem cells and mice and uses thereof
KR102631985B1 (ko) * 2017-08-09 2024-02-01 라이스텍, 인크. 게놈을 변형시키기 위한 조성물 및 방법
US10738327B2 (en) 2017-08-28 2020-08-11 Inscripta, Inc. Electroporation cuvettes for automation
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
EP3678680A4 (en) * 2017-09-05 2021-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ADMINISTRATION OF A GENE EDITING SYSTEM CONTAINING A SINGLE RETROVIRAL PARTICLE AND METHODS OF GENERATION AND USE
WO2019050899A1 (en) 2017-09-06 2019-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. SINGLE IMMUNOGLOBULIN INTERLEUKIN 1 (SIGIRR) RELATED INTERCEPTOR-RELATED VARIANTS AND USES THEREOF
AU2018330458A1 (en) 2017-09-07 2020-03-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Solute Carrier Family 14 Member 1 (SLC14A1) variants and uses thereof
BR112020003609A2 (pt) 2017-09-29 2020-09-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. sistema e método para formar uma emulsão
US10435713B2 (en) 2017-09-30 2019-10-08 Inscripta, Inc. Flow through electroporation instrumentation
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
US11634716B2 (en) 2017-10-16 2023-04-25 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Genetically modified mesenchymal stem cells for use in cardiovascular prosthetics
KR20200065045A (ko) 2017-10-16 2020-06-08 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 코눌린(crnn) 변이체 및 이의 용도
IL274179B2 (en) 2017-10-27 2024-02-01 Univ California Targeted replacement of endogenous T cell receptors
WO2019089808A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 The Regents Of The University Of California Class 2 crispr/cas compositions and methods of use
US20190141966A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-Human Animals Comprising SLC30A8 Mutation And Methods Of Use
EP3710583A1 (en) * 2017-11-16 2020-09-23 Astrazeneca AB Compositions and methods for improving the efficacy of cas9-based knock-in strategies
KR102709884B1 (ko) 2017-11-30 2024-09-26 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화된 trkb 유전자좌를 포함하는 비인간 동물
WO2019126578A1 (en) * 2017-12-20 2019-06-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
US11293019B2 (en) 2017-12-22 2022-04-05 Gflas Life Sciences, Inc. Chimeric genome engineering molecules and methods
CN111566121A (zh) 2018-01-12 2020-08-21 巴斯夫欧洲公司 小麦7a染色体上决定每穗小穗数QTL的基因
WO2019147302A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 Bauer Daniel E Targeting bcl11a distal regulatory elements with a cas9-cas9 fusion for fetal hemoglobin reinduction
KR102465067B1 (ko) 2018-02-15 2022-11-10 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 진핵 게놈 변형을 위한 조작된 cas9 시스템
WO2019165168A1 (en) 2018-02-23 2019-08-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 orthologs
SG11202008956XA (en) 2018-03-14 2020-10-29 Editas Medicine Inc Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
JP7334178B2 (ja) 2018-03-19 2023-08-28 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用した動物での転写モジュレーション
AU2019241967A1 (en) 2018-03-29 2020-11-19 Inscripta, Inc. Automated control of cell growth rates for induction and transformation
WO2019200004A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
JP7555822B2 (ja) 2018-04-19 2024-09-25 ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・カリフオルニア ゲノム編集のための組成物および方法
US10557216B2 (en) 2018-04-24 2020-02-11 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US10508273B2 (en) 2018-04-24 2019-12-17 Inscripta, Inc. Methods for identifying selective binding pairs
US20210324381A1 (en) * 2018-04-27 2021-10-21 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Therapeutic genome editing in x-linked hyper igm syndrome
WO2019213430A1 (en) * 2018-05-03 2019-11-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for nicking target dna sequences
SG11202010837XA (en) 2018-05-10 2020-11-27 Auxolytic Ltd Gene therapy methods and compositions using auxotrophic regulatable cells
CN112105732A (zh) * 2018-05-10 2020-12-18 先正达参股股份有限公司 用于多核苷酸的靶向编辑的方法和组合物
CN108624622A (zh) * 2018-05-16 2018-10-09 湖南艾佳生物科技股份有限公司 一种基于CRISPR-Cas9系统构建的能分泌小鼠白细胞介素-6的基因工程细胞株
KR20210045360A (ko) 2018-05-16 2021-04-26 신테고 코포레이션 가이드 rna 설계 및 사용을 위한 방법 및 시스템
EP3575402A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-04 Algentech SAS Gene targeting
CN112384063A (zh) 2018-06-07 2021-02-19 以色列国家农业部、农村发展农业研究组织·沃尔卡尼中心 再生及转殖大麻的方法
US11827892B2 (en) 2018-06-07 2023-11-28 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Nucleic acid constructs and methods of using same
CN112469834A (zh) * 2018-06-25 2021-03-09 生物纳米基因公司 Dna的标记
CA3108767A1 (en) 2018-06-30 2020-01-02 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
BR112021001904A2 (pt) * 2018-08-03 2021-05-04 Beam Therapeutics Inc. editores de nucleobase multiefetores e métodos de usar os mesmos para modificar uma sequência alvo de ácido nucleico
GB201813011D0 (en) 2018-08-10 2018-09-26 Vib Vzw Means and methods for drought tolerance in crops
US10752874B2 (en) 2018-08-14 2020-08-25 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
US10532324B1 (en) 2018-08-14 2020-01-14 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
KR102103103B1 (ko) 2018-08-16 2020-04-21 (주)라트바이오 인위적 뉴클레아제를 생산하는 형질전환 동물 및 형질전환 배아
WO2020041313A1 (en) * 2018-08-21 2020-02-27 Sigma-Aldrich Co. Llc Down-regulation of the cytosolic dna sensor pathway
WO2020081149A2 (en) 2018-08-30 2020-04-23 Inscripta, Inc. Improved detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
CN109055379B (zh) * 2018-09-10 2022-04-15 石铭 一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法
KR102121817B1 (ko) * 2018-09-12 2020-06-26 한국화학연구원 Crispr 편집 기술을 이용한 재조합 항원을 발현시키는 벡터 및 이를 동시에 다중 삽입시키는 방법
CA3112612C (en) 2018-09-13 2024-02-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Complement factor h gene knockout rat as a model of c3 glomerulopathy
EP3861120A4 (en) 2018-10-01 2023-08-16 North Carolina State University RECOMBINANT TYPE I CRISPR-CAS SYSTEM
WO2020076976A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Three-dimensional spatial molecular indexing
JP7460643B2 (ja) 2018-10-16 2024-04-02 ブルーアレル， エルエルシー 遺伝子へのｄｎａの標的化挿入のための方法
EP3870697A4 (en) 2018-10-22 2022-11-09 Inscripta, Inc. MODIFIED ENZYMES
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
US20220380740A1 (en) * 2018-10-24 2022-12-01 The Broad Institute, Inc. Constructs for improved hdr-dependent genomic editing
KR20200071198A (ko) 2018-12-10 2020-06-19 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 Nrf2 발현 조절 기반 T 세포 항암면역치료법
CN113166744A (zh) 2018-12-14 2021-07-23 先锋国际良种公司 用于基因组编辑的新颖crispr-cas系统
JP2022515124A (ja) 2018-12-19 2022-02-17 キングス カレッジ ロンドン 免疫療法および組成物
CA3120799A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated repeat expansion
AU2020204917A1 (en) * 2019-01-04 2021-08-19 The University Of Chicago Systems and methods for modulating RNA
US20220136004A1 (en) * 2019-01-11 2022-05-05 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Targeted In Vivo Genome Modification
EP3921417A4 (en) 2019-02-04 2022-11-09 The General Hospital Corporation ADENINE DNA BASE EDITOR VARIANTS WITH REDUCED OFF-TARGET RNA EDITING
US10982200B2 (en) 2019-02-14 2021-04-20 Metagenomi Ip Technologies, Llc Enzymes with RuvC domains
EP3924477A4 (en) * 2019-02-14 2023-03-29 Metagenomi, Inc. ENZYMES WITH RUVC DOMAINS
KR20210139271A (ko) 2019-02-15 2021-11-22 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr/cas 융합 단백질 및 시스템
GB201902277D0 (en) 2019-02-19 2019-04-03 King S College London Therapeutic agents
CA3130789A1 (en) 2019-03-07 2020-09-10 The Regents Of The University Of California Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof
IL286357B2 (en) 2019-03-18 2024-10-01 Regeneron Pharmaceuticals Inc A CRISPR/CAS screening platform to identify genetic modifiers of tau seeding or aggregation
WO2020190927A1 (en) 2019-03-18 2020-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
WO2020191243A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
AU2020247900A1 (en) 2019-03-25 2021-11-04 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
WO2020206162A1 (en) 2019-04-03 2020-10-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for insertion of antibody coding sequences into a safe harbor locus
SG11202108454RA (en) 2019-04-04 2021-09-29 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus
CA3133359C (en) 2019-04-04 2023-04-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors
GB201905360D0 (en) 2019-04-16 2019-05-29 Univ Nottingham Fungal strains, production and uses thereof
US20220220495A1 (en) 2019-05-10 2022-07-14 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
JP2022534867A (ja) 2019-06-04 2022-08-04 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ベータスリップ変異を有するヒト化ｔｔｒ遺伝子座を含む非ヒト動物と使用方法
AU2020288623A1 (en) 2019-06-06 2022-01-06 Inscripta, Inc. Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing
CN113939595A (zh) 2019-06-07 2022-01-14 瑞泽恩制药公司 包括人源化白蛋白基因座的非人动物
WO2020252340A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Models of tauopathy
US10907125B2 (en) 2019-06-20 2021-02-02 Inscripta, Inc. Flow through electroporation modules and instrumentation
EP3986909A4 (en) 2019-06-21 2023-08-02 Inscripta, Inc. GENOME-WIDE RATIONAL DESIGNED MUTATIONS LEADING TO INCREASED LYSINE PRODUCTION IN E. COLI
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
WO2021050398A1 (en) * 2019-09-10 2021-03-18 The Regents Of The University Of California Synthetic lethality screening platform for cells undergoing alt
US20230203515A1 (en) 2019-09-12 2023-06-29 Basf Se Regulatory Nucleic Acid Molecules for Enhancing Gene Expression in Plants
EP4028063A1 (en) 2019-09-13 2022-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems delivered by lipid nanoparticles
WO2021069387A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
CN110628825A (zh) * 2019-10-14 2019-12-31 上海捷易生物科技有限公司 一种依赖nhej的报告基因敲入组合物及其使用方法
CN114746125A (zh) 2019-11-08 2022-07-12 瑞泽恩制药公司 用于x连锁青少年型视网膜劈裂症疗法的crispr和aav策略
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
EP4069852A1 (en) 2019-12-03 2022-10-12 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
EP4069837A4 (en) 2019-12-10 2024-03-13 Inscripta, Inc. NEW MAD NUCLEASES
US10704033B1 (en) 2019-12-13 2020-07-07 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US20230042273A1 (en) 2019-12-16 2023-02-09 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Improved genome editing using paired nickases
US11008557B1 (en) 2019-12-18 2021-05-18 Inscripta, Inc. Cascade/dCas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
US20230059309A1 (en) * 2020-01-09 2023-02-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Two-step gene swap
US10689669B1 (en) 2020-01-11 2020-06-23 Inscripta, Inc. Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems
CA3157061A1 (en) 2020-01-27 2021-08-05 Christian SILTANEN Electroporation modules and instrumentation
EP4096396A1 (en) 2020-01-28 2022-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use
WO2021158883A1 (en) 2020-02-07 2021-08-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized klkb1 locus and methods of use
KR20230004456A (ko) 2020-03-04 2023-01-06 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 면역 요법에 대한 종양 세포의 감작화를 위한 방법 및 조성물
US20230102342A1 (en) 2020-03-23 2023-03-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
CN116096877A (zh) 2020-03-31 2023-05-09 宏基因组学公司 Ii类ii型crispr系统
WO2021202938A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Creyon Bio, Inc. Oligonucleotide-based machine learning
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
DE112021002672T5 (de) 2020-05-08 2023-04-13 President And Fellows Of Harvard College Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
EP4171215A2 (en) 2020-06-26 2023-05-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ace2 locus
CN111849986A (zh) * 2020-07-24 2020-10-30 江苏集萃药康生物科技有限公司 一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用
EP4214314A4 (en) 2020-09-15 2024-10-16 Inscripta Inc CRISPR EDITING TO EMBED NUCLEIC ACID LANDING PADS INTO LIVING CELL GENOMES
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
EP4256052A1 (en) 2020-12-02 2023-10-11 Decibel Therapeutics, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
US20240058390A1 (en) * 2020-12-16 2024-02-22 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Wnt+ adipocytes, exosomes from wnt+ adipocytes, and methods of making and using them
EP4271802A1 (en) 2021-01-04 2023-11-08 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
AU2022210762A1 (en) * 2021-01-22 2023-08-24 Metagenomi, Inc. Novel engineered and chimeric nucleases
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
GB202103131D0 (en) 2021-03-05 2021-04-21 Biosystems Tech Limited Method for preparation of research organisms
US20240247285A1 (en) 2021-05-10 2024-07-25 Sqz Biotechnologies Company Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof
WO2022251644A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
EP4347826A1 (en) 2021-06-02 2024-04-10 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
JP2024534945A (ja) 2021-09-10 2024-09-26 アジレント・テクノロジーズ・インク 化学修飾を有するプライム編集のためのガイドｒｎａ
AU2022366987A1 (en) 2021-10-14 2024-05-16 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells having co-expressed shrnas and logic gate systems
KR20240082391A (ko) 2021-10-14 2024-06-10 론자 세일즈 아게 세포외 소포 생산을 위한 변형된 생산자 세포
CN118251491A (zh) 2021-10-28 2024-06-25 瑞泽恩制药公司 用于敲除C5的CRISPR/Cas相关方法及组合物
CA3237300A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
WO2023081847A1 (en) 2021-11-04 2023-05-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a modified cacng1 locus
KR20240117571A (ko) 2021-12-08 2024-08-01 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 돌연변이 마이오실린 질환 모델 및 이의 용도
GB202118058D0 (en) 2021-12-14 2022-01-26 Univ Warwick Methods to increase yields in crops
US20230279442A1 (en) 2021-12-15 2023-09-07 Versitech Limited Engineered cas9-nucleases and method of use thereof
WO2023122506A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci
IL313765A (en) 2021-12-22 2024-08-01 Tome Biosciences Inc Joint provision of a gene editor structure and a donor template
WO2023129974A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Generation of landing pad cell lines
WO2023150181A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating cancer
WO2023150620A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-mediated transgene insertion in neonatal cells
WO2023150798A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
WO2023212677A2 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
WO2023215831A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Tome Biosciences, Inc. Guide rna compositions for programmable gene insertion
WO2023220603A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
WO2023225665A1 (en) 2022-05-19 2023-11-23 Lyell Immunopharma, Inc. Polynucleotides targeting nr4a3 and uses thereof
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
WO2023235726A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr interference therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023250384A2 (en) * 2022-06-22 2023-12-28 The Regents Of The University Of California Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof
WO2023250511A2 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for reducing low-density lipoprotein through targeted gene repression
GB2621813A (en) 2022-06-30 2024-02-28 Univ Newcastle Preventing disease recurrence in Mitochondrial replacement therapy
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
WO2024026488A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a modified transferrin receptor locus
WO2024031053A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Aggregation-resistant variants of tdp-43
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
WO2024073606A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody resistant modified receptors to enhance cell-based therapies
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024083579A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
WO2024098002A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
WO2024107765A2 (en) 2022-11-14 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes
WO2024107670A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric proteins comprising membrane bound il-12 with protease cleavable linkers
WO2024138194A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Tome Biosciences, Inc. Platforms, compositions, and methods for in vivo programmable gene insertion
WO2024159071A1 (en) 2023-01-27 2024-08-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified rhabdovirus glycoproteins and uses thereof

Family Cites Families (168)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
WO1988008450A1 (en) 1987-05-01 1988-11-03 Birdwell Finlayson Gene therapy for metabolite disorders
US5350689A (en) 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
US5767367A (en) 1990-06-23 1998-06-16 Hoechst Aktiengesellschaft Zea mays (L.) with capability of long term, highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize plants having a heterologous gene, and their preparation
US7150982B2 (en) 1991-09-09 2006-12-19 Third Wave Technologies, Inc. RNA detection assays
FR2763797B1 (fr) * 1997-05-30 1999-07-16 Tabacs & Allumettes Ind Cigarette a tres faible taux de goudron presentant un gout de tabac comparable a celui d'une cigarette classique a plus fort taux de goudron
US20040186071A1 (en) 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US20020182673A1 (en) 1998-05-15 2002-12-05 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypedies and therapeutic uses thereof
JP2002535995A (ja) 1999-02-03 2002-10-29 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレイション 染色体標的部位での二本鎖ｄｎａ切断の誘導を含む遺伝子修復
US8183339B1 (en) * 1999-10-12 2012-05-22 Xigen S.A. Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
WO2002026967A2 (en) 2000-09-25 2002-04-04 Thomas Jefferson University Targeted gene correction by single-stranded oligodeoxynucleotides
EP1328543B1 (en) 2000-10-27 2009-08-12 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
US7033744B2 (en) * 2001-03-16 2006-04-25 Naoya Kobayashi Method for proliferating a liver cell, a liver cell obtained thereby, and use thereof
CA2921821A1 (en) 2001-07-12 2003-01-23 University Of Massachusetts In vivo production of small interfering rnas that mediate gene silencing
US20060253913A1 (en) 2001-12-21 2006-11-09 Yue-Jin Huang Production of hSA-linked butyrylcholinesterases in transgenic mammals
AU2003251286B2 (en) 2002-01-23 2007-08-16 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
EP2368982A3 (en) 2002-03-21 2011-10-12 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
WO2003087993A2 (en) 2002-04-09 2003-10-23 Beattie Kenneth L Oligonucleotide probes for genosensor chips
AU2003233719A1 (en) * 2002-06-06 2003-12-22 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Modifying the dna recombination potential in eukaryotes
WO2004037977A2 (en) 2002-09-05 2004-05-06 California Institute Of Thechnology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
DE10260805A1 (de) * 2002-12-23 2004-07-22 Geneart Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Optimieren einer Nucleotidsequenz zur Expression eines Proteins
US20070134796A1 (en) * 2005-07-26 2007-06-14 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
CA2534296C (en) * 2003-08-08 2013-03-26 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
WO2005070948A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Intronn, Inc. Correction of alpha-1-antitrypsin genetic defects using spliceosome mediated rna trans splicing
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US20050220796A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Dynan William S Compositions and methods for modulating DNA repair
US7919277B2 (en) 2004-04-28 2011-04-05 Danisco A/S Detection and typing of bacterial strains
JP2008525029A (ja) * 2004-12-22 2008-07-17 ニュークレオニクス・インコーポレイテッド 遺伝子サイレンシングに有用なｈｂｖおよびｈｃｖ保存配列
US7892224B2 (en) 2005-06-01 2011-02-22 Brainlab Ag Inverse catheter planning
US7534819B2 (en) 2005-06-10 2009-05-19 University Of Washington Compositions and methods for intracellular delivery of biotinylated cargo
US20060282289A1 (en) 2005-06-14 2006-12-14 Healthmatch Solutions, Llc System and method for health care financing
WO2007014181A2 (en) * 2005-07-25 2007-02-01 Johns Hopkins University Site-specific modification of the human genome using custom-designed zinc finger nucleases
US10022457B2 (en) 2005-08-05 2018-07-17 Gholam A. Peyman Methods to regulate polarization and enhance function of cells
US10066233B2 (en) 2005-08-26 2018-09-04 Dupont Nutrition Biosciences Aps Method of modulating cell resistance
KR100877824B1 (ko) * 2005-11-11 2009-01-12 한국생명공학연구원 Ｅ2ｅｐｆ ｕｃｐ-ｖｈｌ 상호작용 및 그 용도
ES2448491T3 (es) * 2006-03-02 2014-03-14 The Ohio State University Research Foundation Perfil de expresión de microARN asociado con cáncer de páncreas
EP1994182B1 (en) 2006-03-15 2019-05-29 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Degenerate nucleobase analogs
US20080300385A1 (en) * 2006-03-28 2008-12-04 Victoria Sharma Covalently-linked complexes of HIV Tat and Env proteins
US9193974B2 (en) 2006-05-10 2015-11-24 Deinove Process for chromosomal engineering using a novel dna repair system
ES2590925T3 (es) 2006-05-19 2016-11-24 Dupont Nutrition Biosciences Aps Microorganismos marcados y métodos de marcado
WO2007139982A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
AU2007258872A1 (en) 2006-06-16 2007-12-21 Danisco A/S Bacterium
EP2518155B1 (en) * 2006-08-04 2014-07-23 Georgia State University Research Foundation, Inc. Enzyme sensors, methods for preparing and using such sensors, and methods of detecting protease activity
TR201905633T4 (tr) 2007-03-02 2019-05-21 Dupont Nutrition Biosci Aps İyileştirilmiş faj direnci olan kültürler.
GB0806086D0 (en) 2008-04-04 2008-05-14 Ulive Entpr Ltd Dendrimer polymer hybrids
US8546553B2 (en) 2008-07-25 2013-10-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic RNAi-like system and methods of use
KR20160015400A (ko) 2008-08-22 2016-02-12 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 표적화된 단일가닥 분할 및 표적화된 통합을 위한 방법 및 조성물
WO2010030963A2 (en) 2008-09-15 2010-03-18 Children's Medical Center Corporation Modulation of bcl11a for treatment of hemoglobinopathies
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
WO2010054108A2 (en) 2008-11-06 2010-05-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cas6 polypeptides and methods of use
RU2570562C2 (ru) 2008-11-07 2015-12-10 ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС Последовательности crispr бифидобактерий
EP2367938B1 (en) 2008-12-12 2014-06-11 DuPont Nutrition Biosciences ApS Genetic cluster of strains of streptococcus thermophilus having unique rheological properties for dairy fermentation
WO2010075424A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 The Regents Of University Of California Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
GB0823658D0 (en) 2008-12-30 2009-02-04 Angiomed Ag Stent delivery device
US8392349B2 (en) 2009-02-23 2013-03-05 Shalini Vajjhala Global adaptation atlas and method of creating same
WO2010117464A1 (en) 2009-04-09 2010-10-14 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration into stem cells
SG175839A1 (en) 2009-04-30 2011-12-29 San Raffaele Centro Fond Gene vector
CA2767377A1 (en) 2009-07-24 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Llc Method for genome editing
US20120192298A1 (en) * 2009-07-24 2012-07-26 Sigma Aldrich Co. Llc Method for genome editing
AU2010281705B2 (en) 2009-07-28 2015-02-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating trinucleotide repeat disorders
KR101418355B1 (ko) 2009-10-23 2014-07-11 (주)바이오니아 고밀도 유전자 합성기
DE102009052674B4 (de) 2009-11-12 2012-10-18 Karl Weinhold Verfahren und Vorrichtung zum Verbinden von Doppelmantelrohren
US20110294114A1 (en) 2009-12-04 2011-12-01 Cincinnati Children's Hospital Medical Center Optimization of determinants for successful genetic correction of diseases, mediated by hematopoietic stem cells
US8586363B2 (en) 2009-12-10 2013-11-19 Regents Of The University Of Minnesota TAL effector-mediated DNA modification
JP2013518602A (ja) 2010-02-09 2013-05-23 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 部分的に一本鎖のドナー分子による標的化ゲノム改変
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
BR112012028805A2 (pt) 2010-05-10 2019-09-24 The Regents Of The Univ Of California E Nereus Pharmaceuticals Inc composições de endorribonuclease e métodos de uso das mesmas.
EP3156062A1 (en) * 2010-05-17 2017-04-19 Sangamo BioSciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof
EP2392208B1 (en) * 2010-06-07 2016-05-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Fusion proteins comprising a DNA-binding domain of a Tal effector protein and a non-specific cleavage domain of a restriction nuclease and their use
US20140148361A1 (en) 2010-06-07 2014-05-29 Barry L. Stoddard Generation and Expression of Engineered I-ONUI Endonuclease and Its Homologues and Uses Thereof
US20110201118A1 (en) 2010-06-14 2011-08-18 Iowa State University Research Foundation, Inc. Nuclease activity of tal effector and foki fusion protein
KR20180121665A (ko) * 2010-07-23 2018-11-07 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 표적화 엔도뉴클레아제 및 단일-가닥 핵산을 사용하는 게놈 편집
DK2601611T3 (da) 2010-08-02 2021-02-01 Integrated Dna Tech Inc Fremgangsmåder til forudsigelse af stabilitet og smeltetemperaturer for nukleinsyreduplekser
DK2630156T3 (en) 2010-10-20 2018-12-17 Dupont Nutrition Biosci Aps CRISPR-CAS SEQUENCES OF LACTOCOCCUS
US9403880B2 (en) * 2010-11-26 2016-08-02 Institut Pasteur Identification of a human gyrovirus and applications
US20120214241A1 (en) 2010-12-22 2012-08-23 Josee Laganiere Zinc finger nuclease modification of leucine rich repeat kinase 2 (lrrk2) mutant fibroblasts and ipscs
KR20120096395A (ko) 2011-02-22 2012-08-30 주식회사 툴젠 뉴클레아제에 의해 유전자 변형된 세포를 농축시키는 방법
US20140113376A1 (en) 2011-06-01 2014-04-24 Rotem Sorek Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
CN103917644A (zh) 2011-09-21 2014-07-09 桑格摩生物科学股份有限公司 调控转基因表达的方法和组合物
EP2780460B1 (en) 2011-11-16 2018-07-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Modified dna-binding proteins and uses thereof
US8450107B1 (en) 2011-11-30 2013-05-28 The Broad Institute Inc. Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
ES2641840T3 (es) 2012-02-24 2017-11-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Composiciones y métodos para el tratamiento de hemoglobinopatías
AU2013225950B2 (en) 2012-02-29 2018-02-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
AU2013204327B2 (en) 2012-04-20 2016-09-01 Aviagen Cell transfection method
CN104245940A (zh) 2012-04-23 2014-12-24 拜尔作物科学公司 植物中的靶向基因组工程
ES2683071T3 (es) 2012-04-25 2018-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Direccionamiento mediado por nucleasas con grandes vectores de direccionamiento
AU2013256240B2 (en) 2012-05-02 2018-09-20 Corteva Agriscience Llc Targeted modification of malate dehydrogenase
CN104471067B (zh) 2012-05-07 2020-08-14 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于核酸酶介导的转基因靶向整合的方法和组合物
US11120889B2 (en) 2012-05-09 2021-09-14 Georgia Tech Research Corporation Method for synthesizing a nuclease with reduced off-site cleavage
DK2800811T3 (en) * 2012-05-25 2017-07-17 Univ Vienna METHODS AND COMPOSITIONS FOR RNA DIRECTIVE TARGET DNA MODIFICATION AND FOR RNA DIRECTIVE MODULATION OF TRANSCRIPTION
IN2014DN10996A (es) 2012-05-30 2015-09-25 Baylor College Medicine
WO2013188037A2 (en) 2012-06-11 2013-12-19 Agilent Technologies, Inc Method of adaptor-dimer subtraction using a crispr cas6 protein
BR112014031080A2 (pt) 2012-06-12 2018-05-08 Genentech Inc métodos e composições de geração de alelos knock-out condicionais.
EP2674501A1 (en) 2012-06-14 2013-12-18 Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation,de l'environnement et du travail Method for detecting and identifying enterohemorrhagic Escherichia coli
WO2013188638A2 (en) 2012-06-15 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Endoribonucleases and methods of use thereof
BR112014031891A2 (pt) 2012-06-19 2017-08-01 Univ Minnesota direcionamento genético nas plantas utilizando vírus de dna
JP6329537B2 (ja) 2012-07-11 2018-05-23 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 生物学的薬剤の送達のための方法および組成物
EP3196301B1 (en) 2012-07-11 2018-10-17 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of monogenic diseases
JP2015527889A (ja) 2012-07-25 2015-09-24 ザ ブロード インスティテュート， インコーポレイテッド 誘導可能なｄｎａ結合タンパク質およびゲノム撹乱ツール、ならびにそれらの適用
WO2014022702A2 (en) 2012-08-03 2014-02-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
DK2890780T3 (da) 2012-08-29 2020-09-21 Sangamo Therapeutics Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af en genetisk tilstand
JP6775953B2 (ja) 2012-09-07 2020-10-28 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー Ｆａｄ３性能座および標的化切断を誘導可能である対応する標的部位特異的結合タンパク質
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
US20150267176A1 (en) 2012-10-12 2015-09-24 The General Hospital Corporation Transcription activator-like effector (tale) - lysine-specific demethylase 1 (lsd1) fusion proteins
SG11201503059XA (en) * 2012-10-23 2015-06-29 Toolgen Inc Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
WO2014070887A1 (en) 2012-10-30 2014-05-08 Recombinetics, Inc. Control of sexual maturation in animals
US20150291967A1 (en) 2012-10-31 2015-10-15 Luc Mathis Coupling herbicide resistance with targeted insertion of transgenes in plants
US20140127752A1 (en) 2012-11-07 2014-05-08 Zhaohui Zhou Method, composition, and reagent kit for targeted genomic enrichment
KR102243092B1 (ko) 2012-12-06 2021-04-22 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
DK3064585T3 (da) 2012-12-12 2020-04-27 Broad Inst Inc Konstruering og optimering af forbedrede systemer, fremgangsmåder og enzymsammensætninger til sekvensmanipulation
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
SG11201504523UA (en) 2012-12-12 2015-07-30 Broad Inst Inc Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
EP4286402A3 (en) 2012-12-12 2024-02-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
KR20150105633A (ko) 2012-12-12 2015-09-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 시스템, 방법 및 최적화된 가이드 조성물의 조작
EP3031921A1 (en) 2012-12-12 2016-06-15 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
JP6473419B2 (ja) 2012-12-13 2019-02-20 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 部位特異的ヌクレアーゼ活性のｄｎａ検出方法
CN105121641A (zh) * 2012-12-17 2015-12-02 哈佛大学校长及研究员协会 Rna-引导的人类基因组工程化
FI3491915T3 (fi) 2012-12-27 2023-08-29 Keygene Nv Menetelmä kohdistetun translokaation indusointiin kasvissa
CA2898184A1 (en) 2013-01-16 2014-07-24 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
CN103233028B (zh) 2013-01-25 2015-05-13 南京徇齐生物技术有限公司 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列
WO2014127287A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Massachusetts Institute Of Technology Method for in vivo tergated mutagenesis
JP6475172B2 (ja) 2013-02-20 2019-02-27 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ラットの遺伝子組換え
US10227610B2 (en) 2013-02-25 2019-03-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
EP2971167B1 (en) 2013-03-14 2019-07-31 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
JP2016512048A (ja) 2013-03-15 2016-04-25 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用した植物ゲノム操作
IL289396B2 (en) 2013-03-15 2023-12-01 The General Hospital Coporation Using tru-grnas to increase the specificity of RNA-guided genome editing
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US20140364333A1 (en) 2013-03-15 2014-12-11 President And Fellows Of Harvard College Methods for Live Imaging of Cells
WO2014165825A2 (en) 2013-04-04 2014-10-09 President And Fellows Of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
KR102192599B1 (ko) 2013-04-05 2020-12-18 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 식물의 게놈 내의 외인성 서열의 통합을 위한 방법 및 조성물
RS62263B1 (sr) 2013-04-16 2021-09-30 Regeneron Pharma Ciljana modifikacija genoma pacova
CN103224947B (zh) 2013-04-28 2015-06-10 陕西师范大学 一种基因打靶系统
AU2014262867B2 (en) 2013-05-10 2019-12-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
WO2014190181A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Northwestern University Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
US9873907B2 (en) 2013-05-29 2018-01-23 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic DNA using CAS9
US20140356956A1 (en) 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
EP4245853A3 (en) 2013-06-17 2023-10-18 The Broad Institute, Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
WO2014204727A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
KR20160056869A (ko) 2013-06-17 2016-05-20 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 바이러스 구성성분을 사용하여 장애 및 질환을 표적화하기 위한 crispr-cas 시스템 및 조성물의 전달, 용도 및 치료 적용
CA2915842C (en) 2013-06-17 2022-11-29 The Broad Institute, Inc. Delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
CA2915845A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for targeting and modeling diseases and disorders of post mitotic cells
CN103343120B (zh) 2013-07-04 2015-03-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
CN103382468B (zh) * 2013-07-04 2015-04-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种水稻基因组定点改造方法
CN105517579B (zh) 2013-07-10 2019-11-15 哈佛大学校长及研究员协会 用于RNA向导的基因调节和编辑的正交Cas9蛋白
CN103388006B (zh) 2013-07-26 2015-10-28 华东师范大学 一种基因定点突变的构建方法
US10421957B2 (en) 2013-07-29 2019-09-24 Agilent Technologies, Inc. DNA assembly using an RNA-programmable nickase
NZ746567A (en) 2013-11-04 2019-09-27 Dow Agrosciences Llc Optimal soybean loci
EP3066109A4 (en) 2013-11-04 2017-11-29 Dow AgroSciences LLC Optimal soybean loci
KR102269769B1 (ko) 2013-11-04 2021-06-28 코르테바 애그리사이언스 엘엘씨 최적 메이즈 유전자좌
CA2930015A1 (en) 2013-11-07 2015-05-14 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions with governing grnas
RU2725520C2 (ru) 2013-12-11 2020-07-02 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
US9850525B2 (en) 2014-01-29 2017-12-26 Agilent Technologies, Inc. CAS9-based isothermal method of detection of specific DNA sequence
WO2015117041A1 (en) 2014-01-30 2015-08-06 Nair Ramesh B Gene modification-mediated methods and compositions for generating dominant traits in eukaryotic systems
US20150225801A1 (en) 2014-02-11 2015-08-13 California Institute Of Technology Recording and mapping lineage information and molecular events in individual cells
AU2015218576B2 (en) 2014-02-24 2020-02-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
CA2942762C (en) 2014-03-18 2023-10-17 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression

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IL291129A (en) 2022-05-01

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