CN111849986A - 一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种减少CRISPR‑Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用。所述方法包括如下步骤:使用限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切载体得到双链DNA,再将所述双链DNA与CRISPR‑Cas9反应体系混合,转入待编辑的细胞中;其中,所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为同向突出非同尾酶或非同向突出酶,所得双链DNA具有同向突出但是不能互补配对的粘性末端或者非同向突出的粘性末端,且粘性末端在体内被抹平的难度较大,因此该方法能够明显减少CRISPR‑Cas9基因编辑中双链DNA片段的串联率。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域,涉及一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用。
背景技术
非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)和同源重组(Homologousrecombination,HR)是DNA双链断裂(Double strand breaks,DSBs)的两种修复方式。
其中,NHEJ通过DNA连接酶将DSBs末端直接链接,不依赖于同源DNA序列。Ku蛋白(Ku70/Ku80)复合物识别结合到DSBs末端,Ku-DNA复合物招募DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)激活其激酶活性,将自身磷酸化启动NHEJ通路,吸引重组酶Artemis加入处理DNA末端,然后召集XRCC4-DNAligase4-XLF复合物促使DNA末端进行连接。NHEJ修复迅速高效,但是可能造成一些序列缺失,同时也会造成一些片段的插入,不够精确。
HR需要以未受伤的姐妹染色单体的同源序列作为修复的模板。MRN复合物(包括MRE11、Rad50、Nbs1三种蛋白质)识别DSBs,结合到DNA末端,首先对DNA末端进行修剪,MRN复合物和转录因子CtIP(CtBP-interacting protein)促进DNA末端切割过程,造成5′末端DNA降解,产生3′单链DNA(ssDNA),3′ssDNA被复制蛋白A(Replication protein A,RPA)包被,使其免受核酸酶的降解,去除二级结构;然后由BRCA2蛋白介导,RPA被重组酶RAD51替换,形成核蛋白丝寻找姐妹染色单体上的同源序列,RAD51蛋白介导侵入DNA双链模板,与同源DNA序列配对形成D-Loop结构,D-Loop延伸或与另一个末端连接,完成修复过程。HR这一修复方式较为精准,但是修复速度较慢,效率较低。
随着人们对这两种修复方式的深入研究和解读,这一修复机制被逐渐应用于基因编辑技术,用于定向改造基因。研究者采用核酸酶技术使DNA双链有目的性的产生断裂,利用这一机制调控目的基因表达或引入选择性标记。以CRISPR/Cas9技术为例,Cas9蛋白剪切DNA双链形成DSBs,利用NHEJ修复机制,随机缺失或插入碱基造成移码突变,目的基因实现敲除;在剪切同时引入一段外源基因,NHEJ会将其接入DSBs位点,实现基因插入;或者在两端分别设置剪切位点,中间片段游离,两端通过NHEJ机制连接形成大片段基因敲除。同时,在剪切的同时加入带外源基因及同源序列,HR机制作用下可实现基因定点精确的敲进和替换。
CRISPR-Cas9介导的同源定向DNA修复是在包括小鼠和人类在内的多种模式生物中进行精确基因编辑的首选方法。生物医学界广泛使用改进了这种方法,使其更加高效和序列特异。尽管如此,快速发展的技术仍然存在缺陷。有研究发现,在六种不同条件敲除小鼠模型的建立过程中,供体DNA模板出现多次不必要的头尾串联现象。在大多数情况下,传统的PCR分析未能识别出这些多重整合事件,这严重影响了该技术的精确性(详见SkryabinBV,et al.Pervasive head-to-tail insertions of DNAtemplates mask desiredCRISPR-Cas9-mediated genome editing events.Sci Adv.2020;6(7):eaax2941.)。
在CRISPR-Cas9基因打靶过程中,重组DNA片段存在头对尾的串联现象,串联导致基因打靶失败。本领域通常用Southern、qPCR,PCR等方法检测是否有串联,但是尚未见有效的减少串联的方法。
因此,如何降低CRISPR-Cas9基因打靶中重组DNA片段的串联率是本领域亟需解决的问题。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题,本发明提供一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用。所述方法采用同向突出非同尾酶或非同向突出酶切割得到目标双链DNA,得到同向突出但是不能互补配对的粘性末端或者非同向突出的粘性末端,减少串联的概率。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法,所述方法包括如下步骤:
使用限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切载体得到双链DNA(dsDNA),再将所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合,转入待编辑的细胞中;其中,所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为同向突出非同尾酶或非同向突出酶。
本发明中,使用同向突出非同尾酶或非同向突出酶酶切载体得到dsDNA,所得dsDNA具有同向突出但是不能互补配对的粘性末端或者非同向突出的粘性末端,以此种方式切割之后的dsDNA之间不容易发生串联。
其中,同向突出非同尾酶得到的粘性末端不互补,所以若两个dsDNA以头尾(head-to-tail)相连的方式串联,则需要细胞内酶将粘性末端加工成平端,例如5′-3′外切酶或DNA聚合酶将突出粘性末端抹平,两个dsDNA才能以头尾相连的方式串联;而非同向突出酶切后粘性末端为头对头(head-to-head)不存在互补序列,对比同向突出非同尾酶,非同向突出酶切粘性末端抹平至少需要两种酶,即5′-3′外切酶和3′-5′外切酶的组合,或者DNA聚合酶和3′-5′外切酶的组合,所以理论上非同向突出酶酶切后的粘性末端被抹平的难度更大大,串联概率较同向突出非同尾酶更小。
作为本发明优选的技术方案,所述酶切的温度为36.5~37.5℃,例如可以是36.6℃、36.7℃、36.8℃、36.9℃、37℃、37.1℃、37.2℃、37.3℃或37.4℃等,优选为37℃;
优选地,所述酶切的时间为4~8h,例如可以是4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h或8h等。
优选地,所述限制性内切酶I的工作浓度为0.3~1U/μL,例如可以是0.4U/μL、0.5U/μL、0.6U/μL、0.7U/μL、0.8U/μL、0.9U/μL或1U/μL等。
优选地,所述限制性内切酶II的工作浓度为0.3~1U/μL,例如可以是0.4U/μL、0.5U/μL、0.6U/μL、0.7U/μL、0.8U/μL、0.9U/μL或1U/μL等。
作为本发明优选的技术方案,所述dsDNA与CRISPR-Cas9反应体系混合后的浓度为2~10ng/μL,例如可以是2ngμL、3ng/μL、4ng/μL、5ng/μL、6ng/μL、7ng/μL、8ng/μL、9ng/μL或10ng/μL等。
优选地,所述CRISPR-Cas9反应体系包括sgRNA和cas9 mRNA。
作为本发明优选的技术方案,所述sgRNA的工作浓度为2~8ng/μL,例如可以是2ng/μL、3ng/μL、4ng/μL、5ng/μL、6ng/μL、7ng/μL或8ng/μL等。
优选地,所述Cas9 mRNA的工作浓度为5~15ng/μL,例如可以是5ng/μL、6ng/μL、8ng/μL、10ng/μL、12ng/μL、14ng/μL或15ng/μL等。
本发明中,所述CRISPR-Cas9反应体系用于基因编辑,包括基因插入和基因敲除等,所述反应体系的工作浓度和具体成分会对基因编辑的效率产生影响。因此,本发明中以上述工作浓度配合酶切后的dsDNA,导入待编辑的细胞后,能够更加精准的实现基因打靶,降低串联率,降低脱靶概率,提高成功率。
作为本发明优选的技术方案,所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为同向突出非同尾酶,即:所述限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为5′-3′;或者,所述限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为3′-5′。
作为本发明优选的技术方案,所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为非同向突出酶,即:所述限制性内切酶I酶切后形成的粘性末端为5′-3′,所述限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为3′-5′;
或者,所述限制性内切酶I酶切后形成的粘性末端为3′-5′,所述限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为5′-3′。
需要说明的是,本发明并不限制具体限制性内切酶的种类,只要是能够满足本发明中说明的酶切之后具有同向突出但是不能互补配对的粘性末端或者非同向突出的粘性末端,则所述限制性内切酶的组合即可作为本发明中所述的限制性内切酶I和限制性内切酶II。
作为本发明优选的技术方案,所述酶切后双链DNA经过纯化。
优选地,所述纯化的方法为琼脂糖凝胶电泳法。
示例性地,所述双链DNA可以采用如下方法进行合成:
首先,将微量注射用的供体DNA模板(即双链DNA)克隆到pUC57或pBlueScript载体中,所述载体使用质粒提取试剂盒纯化,使用限制性内切酶I和限制性内切酶II将包含供体DNA模板的序列切割下来;
再用1%琼脂糖凝胶电泳分离供体dsDNA片段,使用胶回收试剂盒纯化,保存于ddH2O中。
作为本发明优选的技术方案,所述待编辑的细胞包括小鼠受精卵。
本发明中,可以在M2培养基中,使用转射器和微操作器在倒置显微镜上进行细胞显微微注射。注射存活的受精细胞被转移到假妊娠小鼠的输卵管中,并进行足月妊娠。用PCR和Southern印迹分析从尾部活检组织中分离出的基因组DNA,鉴定出阳性靶向的F0动物。
作为本发明优选的技术方案,所述方法包括如下步骤:
使用限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切质粒,酶切的温度为37℃,时间为4-12h,限制性内切酶I的工作浓度为0.3-1U/μL,限制性内切酶II的工作浓度为0.3-1U/μL,得到双链DNA,使用琼脂糖凝胶电泳法进行纯化;
其中,所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为同向突出非同尾酶或非同向突出酶;
再将所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合,所述CRISPR-Cas9反应体系中sgRNA的工作浓度为2~8ng/μL,cas9 mRNA的工作浓度为5~15ng/μL的,所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合后的浓度为2~10ng/μL,转入小鼠受精卵中,得到基因编辑后的受精卵细胞。
第二方面,如第一方面所述的方法在构建CRISPR-Cas9基因编辑方法中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值,还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值,限于篇幅及出于简明的考虑,本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比,本发明至少具有以下有益效果:
(1)本发明中使用同向突出非同尾酶或非同向突出酶酶切得到dsDNA,所得dsDNA具有同向突出但是不能互补配对的粘性末端或者非同向突出的粘性末端,以此种方式切割之后的dsDNA之间不容易发生串联,串联率可以由63.2%分别降低至35.3%和30.0%,明显减少了串联发生的几率,且使用非同向突出酶酶切得到dsDNA的串联率较同向突出非同尾酶酶切后串联率更低;
(2)利用同向突出非同尾酶或非同向突出酶酶切得到dsDNA与CRISPR-Cas9反应体系混合之后,转入待编辑的细胞例如小鼠受精卵细胞中,由于串联率的下降,配合CRISPR-Cas9反应体系,所得卵母细胞的一次通过率增加,提高了实验效率,降低了实验成本。
附图说明
图1为实施例1中使用BamH1和Xba1酶切后的dsDNA片段示意图。
图2为实施例1中将dsDNA注射至原核时的显微图片。
图3为实施例2中使用BamH1和Sac1酶切后的dsDNA片段示意图。
图4为对比例1中使用BamH1酶切后的dsDNA片段示意图。
图5为对比例2中使用EcoRV酶切后的dsDNA片段示意图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案,但下述的实例仅仅是本发明的简易例子,并不代表或限制本发明的权利保护范围,本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中,雌鼠(C57BL/6JGpt,4周龄)、雄鼠(C57BL/6JGpt,>8周龄):均产自江苏集萃药康生物科技有限公司;
以下实施例中,所用试剂包括:透明质酸酶工作液、D-PBS工作液、注射缓冲液、PMSG/HCG工作液、M16、M2、75%酒精、矿物油;
所用仪器包括:倒置显微镜、显微操作系统、微型装样器、拉针仪、煅针仪、CO2培养箱、冰箱、体视显微镜;
所用耗材包括:GD-1玻璃针、微量加样器、3.5cm dish、固定管、移卵管、1mL注射器、手术器械等均可由常规渠道购得。
实施例1
本实施例中,采用同向突出非同尾酶BamH1/Xba1酶切得到dsDNA。
(1)酶切
酶切体系:BamH1 3μL、Xba1 3μL、质粒(Plsmid)25μL(浓度为2μg/μL)、Buffersmart 10μL、ddH2O 59μL;
酶切过程:时间8h;温度37℃;
所得dsDNA片段的示意图如图1所示;
酶切完成后纯化,并用TE buffer稀释dsDNA至5ng/uL。
(2)小鼠受精卵显微注射
获取受精卵,制备固定管和注射管,准备操作皿和培养皿,再将注射样品用微量加样器加入到注射管中;
注射过程如下:
1、将注射管和固定管装入操作手臂;
2、将在M16中培养的受精卵转移入准备好的M2液滴中,并且排成一长列;
3、将注射碟子放在倒置显微镜的载物台上;
4、将注射管和固定管伸入M2液滴中,并置于视野中央;
5、打开注射器,在注射管管中产生一个恒定压力,显微镜调到能够清楚的看到原核;
6、用固定管吸住一个卵子,用注射管调整其位置,使原核清晰可见;
7、将注射管刺入原核,打入DNA混合体系,如图2所示;
8、用注射管将卵子推向下方或上方,并吸住一个新的卵子进行注射,如此重复直到全部卵子注射完毕;
9、注射结束后将胚胎转移至含有M16培养将存活的受精卵移植到假孕受体输卵管内;
(3)移植、繁育与鉴定
将上述培养的受精卵移植到代孕小鼠的输卵管中,约20天后F0小鼠出生;
出生一周后剪尾,提取鼠尾基因组,进行PCR与测序鉴定,统计串联率。
实施例2
本实施例中,采用非同向突出酶BamH1/Sac1酶切得到dsDNA,所得dsDNA片段的示意图如图3所示;其余步骤与实施例1相同。
对比例1
本对比例中,采用同一粘性末端酶BamH1酶切得到dsDNA,所得dsDNA片段的示意图如图4所示;其余步骤与实施例1相同。
对比例2
本对比例中,采用同一平末端酶EcoRV酶切得到dsDNA,所得dsDNA片段的示意图如图5所示;其余步骤与实施例1相同。
串联率统计
通过实施例1~2和对比例1~2提供的不同酶切方式制备dsDNA后,注射400枚小鼠受精卵,移植后培养;
出生F0小鼠,对F0小鼠进行PCR检测串联。
检测原理为:
在dsDNA两端设计向外侧的PCR引物,如片段不串联则无产物,如串联则会扩增出产物,此处统计的串联率为串联小鼠/阳性小鼠;
PCR及串联结果如表1所示:
表1
由上表结果可知,对比例1和对比例2中提供的同一粘性末端酶与同一平末端酶酶切,其串联率分别为63.2%和50.0%,而实施例1和实施例2中同向突出非同尾酶与非同向突出酶的串联率分别为35.3%和30.0%;本发明提供的方法其串联率明显低于对比例;
同时,实施例1和实施例2相比,非同向突出酶酶切后的串联率比同向突出非同尾酶更低,分析其原因可能是,由于非同向突出酶得到的粘性末端为头对头,对比同向突出非同尾酶,体内酶将突出粘性末端抹平只需要一种酶如5′-3′外切酶或DNA聚合酶;但非同向突出酶切粘性末端抹平至少需要两种酶,即5′-3′外切酶和3′-5′外切酶或者DNA聚合酶和3′-5′外切酶,所以非同向突出酶酶切被抹平的难度变大,串联概率减小。
申请人声明,以上所述仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,所属技术领域的技术人员应该明了,任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
使用限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切载体得到双链DNA,再将所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合,转入待编辑的细胞中;
其中,所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为同向突出非同尾酶或非同向突出酶。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述酶切的温度为36.5~37.5℃,优选为37℃;
优选地,所述酶切的时间为4~8h;
优选地,所述限制性内切酶I的工作浓度为0.3~1U/μL;
优选地,所述限制性内切酶II的工作浓度为0.3~1U/μL。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合后的浓度为2~10ng/μL;
优选地,所述CRISPR-Cas9反应体系包括sgRNA和cas9 mRNA。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述sgRNA的工作浓度为2~8ng/μL;
优选地,所述Cas9 mRNA的工作浓度为5~15ng/μL。
5.根据权利要求1~4任一项所述的方法,其特征在于,所述限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为5′-3′;
或者,所述限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为3′-5′。
6.根据权利要求1~5任一项所述的方法,其特征在于,所述限制性内切酶I酶切后形成的粘性末端为5′-3′,所述限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为3′-5′;
或者,所述限制性内切酶I酶切后形成的粘性末端为3′-5′,所述限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为5′-3′。
7.根据权利要求1~6任一项所述的方法,其特征在于,所述酶切后双链DNA经过纯化;
优选地,所述纯化的方法为琼脂糖凝胶电泳法。
8.根据权利要求1~7任一项所述的方法,其特征在于,所述待编辑的细胞包括小鼠受精卵。
9.根据权利要求1~8任一项所述的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
使用限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切质粒,酶切的温度为37℃,时间为4~8h,限制性内切酶I的工作浓度为0.3~1U/μL,限制性内切酶II的工作浓度为0.3~1U/μL,得到双链DNA,使用琼脂糖凝胶电泳法进行纯化;
其中,所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为同向突出非同尾酶或非同向突出酶;
再将所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合,所述CRISPR-Cas9反应体系中sgRNA的工作浓度为2~8ng/μL,cas9 mRNA的工作浓度为5~15ng/μL的,所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合后的浓度为2~10ng/μL,转入小鼠受精卵中,得到基因编辑后的受精卵细胞。
10.如权利要求1~9任一项所述的方法在构建CRISPR-Cas9基因编辑方法中的应用。
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