BR112020019726A2 - células de mamífero, composição, métodos para reduzir ou eliminar a atividade lactogênica em uma célula, para produzir um produto de interesse e para cultivar uma população - Google Patents

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Abstract

“célulasde mamífero, composição, métodospara reduzir ou eliminar a atividade lactogênica em uma célula, para produzir um produto de interesseepara cultivar uma população”. a presente divulgação refere-se a métodos, células e composições para produzir um produto de interesse, por exemplo, uma proteína recombinante. em particular, a presente divulgação fornece células de mamífero aprimoradas que expressam o produto de interesse, em que as células (por exemplo, células de ovário de hamster chinês (cho)) têm atividade lactogênica modulada. a presente divulgação também refere-se a métodos e composições para modular a expressão do músculo piruvato quinase (pkm) (por exemplo, expressão de pkm-1) em uma célula de mamífero para, desse modo, reduzir ou eliminar a atividade lactogênica da célula, bem como composições compreendendo uma célula tendo atividade lactogênica reduzida ou eliminada e métodos de uso destas.

Description

“CÉLULAS DE MAMÍFERO, COMPOSIÇÃO, MÉTODOS PARA REDUZIR OU ELIMINAR A ATIVIDADE LACTOGÊNICA EM UMA CÉLULA, PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE INTERESSE E PARA CULTIVAR UMA POPULAÇÃO” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos EUA de nº 62/649.963, depositado em 29 de março de 2018, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi submetida em formato ASCII via EFS-Web e é incorporada por meio deste documento por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 28 de março de 2019, é chamada de 00B206_0785_SL.txt e tem o tamanho de 444.511 bytes.
1. CAMPO DA INVENÇÃO
[0003] A presente divulgação refere-se a métodos e composições para produzir um produto de interesse, por exemplo, uma proteína recombinante. Em particular, a presente divulgação é dirigida a células de mamífero que expressam um produto de interesse, onde as células (por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO)) têm atividade lactogênica modulada. A presente divulgação também é direcionada a métodos e composições para modular a expressão do músculo piruvato quinase (PKM) (por exemplo, expressão de PKM-1) em uma célula de mamífero para reduzir ou eliminar a atividade lactogênica da célula, bem como composições compreendendo uma ou mais células que reduziram ou eliminaram a atividade lactogênica e os métodos de uso destas.
2. ANTECEDENTES
[0004] As células de ovário de hamster chinês (CHO) têm sido amplamente usadas na produção de proteínas terapêuticas para aplicações clínicas devido à sua capacidade de dobramento, montagem e aplicação pós- traducional de proteínas adequadas. Normalmente, as células CHO, como outras linhagens celulares imortalizadas, tendem a consumir glicose e gerar lactato por meio da glicólise aeróbica, um processo conhecido como efeito Warburg (Warburg, 1956, Science 123(3191):309-14). O acúmulo de lactato na cultura de produção pode afetar adversamente o crescimento, a viabilidade e a produtividade celular. Tal comportamento lactogênico (ou seja, comportamento de geração de lactato) das células CHO durante os processos de fabricação pode causar um declínio na viabilidade e produtividade e pode alterar a qualidade das proteínas terapêuticas produzidas.
[0005] Várias abordagens direcionadas às condições do processo foram desenvolvidas para mitigar a geração de lactato em linhagens celulares CHO lactogênicas. Por exemplo, a otimização dos níveis de cobre demonstrou ser eficaz na prevenção do comportamento lactogênico em algumas linhagens celulares CHO (Luo et al., 2012, Biotechnol. Bioeng. 109(1): 146-56; Xu et al., 2016, Bioprocess Biosyst. Eng. 39(11): 1689-702). Outra abordagem envolvendo a alimentação controlada de nutrientes desencadeada pelo aumento do pH na cultura (entrega de alta qualidade de glicose controlada por pH, ou HIPDOG) também se mostrou eficaz na redução ou eliminação do acúmulo de lactato em culturas de CHO em grande escala (Gagnon et al., 2011, Biotechnol. Bioeng. 108(6):1328 -37). No entanto, essas abordagens têm suas limitações, já que a primeira abordagem não pode ser aplicada a todas as linhagens celulares CHO lactogênicas e a última pode complicar o processo de fabricação em grande escala. Além disso, essas abordagens não direcionam os mecanismos subjacentes do comportamento lactogênico nas células CHO.
[0006] Portanto, existe uma necessidade na técnica de técnicas para reduzir a produção de lactato em culturas de células.
3. DESCRIÇÃO RESUMIDA
[0007] A presente divulgação refere-se a métodos, células e composições para produzir um produto de interesse, por exemplo, uma proteína recombinante. Em particular, os métodos, células e composições descritos neste documento incluem células de mamífero aprimoradas que expressam o produto de interesse, em que as células (por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO)) têm atividade lactogênica modulada. Os métodos e composições descritos no presente documento modulam a atividade lactogênica de células de mamífero e, assim, reduzem ou eliminam os efeitos indesejados associados à atividade lactogênica, por exemplo, viabilidade e produtividade reduzidas das células de mamífero e qualidade alterada dos produtos de interesse produzidos.
[0008] Esta divulgação é ainda direcionada a métodos e composições para modular a expressão do músculo piruvato quinase (PKM) (por exemplo, expressão de PKM-1) em uma célula de mamífero para, assim, reduzir ou eliminar a atividade lactogênica da célula, bem como células tendo atividade lactogênica reduzida ou eliminada e métodos para usar as mesmas.
[0009] Em um aspecto, a presente divulgação refere-se a uma célula de mamífero tendo atividade lactogênica reduzida ou eliminada, na qual a expressão de uma isoforma de polipeptídeo do músculo piruvato quinase (PKM), ou isoformas, é silenciada (knock out) ou sofre knock down. Em certas modalidades, a isoforma de polipeptídeo PKM silenciada (knock out) ou em knock down é a isoforma de polipeptídeo PKM-1. Em certas modalidades, as isoformas do polipeptídeo PKM que são silenciadas (knock out) ou em knock down são a isoforma de polipeptídeo PKM-1 e a isoforma de polipeptídeo PKM-
2. Em certas modalidades, a atividade lactogênica da célula de mamífero é inferior a cerca de 50%, por exemplo, inferior a cerca de 20%, da atividade lactogênica de uma célula de referência. Em certas modalidades, a célula de referência é uma célula que compreende um ou mais alelos do tipo selvagem do gene PKM, por exemplo, ambos os alelos do gene PKM são do tipo selvagem ou não modificados. Em certas modalidades, a atividade lactogênica da célula de mamífero é determinada no dia 14 ou no dia 15 de uma fase de produção. Em certas modalidades, a célula de mamífero produz menos que cerca de 1,0 g/L, ou menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção, por exemplo, produz menos que cerca de 1,0 g/L, ou menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção em um frasco de agitação. Em certas modalidades, a célula de mamífero produz menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção em um biorreator. A presente divulgação fornece uma célula de mamífero compreendendo um alelo de um gene PKM que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 39-41, ou compreende as sequências de nucleotídeos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 37 e 38. A presente divulgação fornece ainda composições compreendendo uma ou mais células, por exemplo, células de mamífero, divulgadas neste documento.
[00010] Em certas modalidades, a célula de mamífero compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um produto de interesse. Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é integrada no genoma celular da célula de mamífero em um local direcionado.
Alternativamente e/ou adicionalmente, o ácido nucleico que codifica o produto de interesse é integrado aleatoriamente no genoma celular da célula de mamífero. Em certas modalidades, a célula de mamífero é uma célula CHO.
[00011] Em certas modalidades, o produto de interesse compreende uma proteína, por exemplo, uma proteína recombinante. Em certas modalidades, o produto de interesse compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste. Por exemplo, mas não como limitação,
o anticorpo é um anticorpo multiespecífico ou um fragmento de ligação ao antígeno deste. Em certas modalidades, o anticorpo consiste em uma sequência de cadeia única pesada e uma sequência de cadeia única leve ou fragmentos de ligação ao antígeno destas. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado e/ou um anticorpo monoclonal.
[00012] Em outro aspecto, a presente divulgação refere-se a um método para reduzir ou eliminar a atividade lactogênica em uma célula. Em certas modalidades, o método inclui nocautear ou nocautear negativamente a expressão de uma isoforma de polipeptídeo do músculo piruvato quinase (PKM). Em certas modalidades, o método inclui administrar à célula um sistema de engenharia genética, em que o sistema de engenharia genética silencia (knock out) ou aplica knock down na expressão de uma isoforma de polipeptídeo do músculo piruvato quinase (PKM). Em certas modalidades, o sistema de engenharia genética é selecionado a partir do grupo que consiste em um sistema CRISPR/Cas, um sistema de nuclease de dedo de zinco (ZFN), um sistema de nuclease efetora semelhante à ativadores de transcrição (TALEN) e uma combinação destes. Em certas modalidades, o método resulta na célula tendo uma atividade lactogênica que é inferior a cerca de 50%, por exemplo, inferior a cerca de 20%, da atividade lactogênica de uma célula de referência. Em certas modalidades, a célula de referência é uma célula que compreende um ou mais alelos do tipo selvagem do gene PKM, por exemplo, ambos os alelos do gene PKM são do tipo selvagem ou não modificados. Em certas modalidades, a atividade lactogênica da célula é determinada no dia 14 ou no dia 15 de uma fase de produção. Em certas modalidades, a célula produz menos que cerca de 1,0 g/L, ou menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção, por exemplo, produz menos que cerca de 1,0 g/L, ou menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção em um frasco de agitação. Em certas modalidades, a célula produz menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção em um biorreator.
[00013] Em certas modalidades não limitantes, um sistema de engenharia genética para uso na presente divulgação é um sistema CRISPR/Cas9 que inclui uma molécula Cas9 e um ou mais RNAs guia (gRNAs) compreendendo um domínio de direcionamento que é complementar a uma sequência alvo do gene PKM. Em certas modalidades, a sequência alvo é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma porção do gene PKM, uma região de íntron 5' flanqueando o éxon 9 do gene PKM, uma região de íntron 3' flanqueando o éxon 9 do gene PKM, uma região de íntron 3' flanqueando o éxon 10 do gene PKM, uma região dentro do éxon 1 do gene PKM, uma região dentro do éxon 2 do gene PKM, uma região dentro do éxon 12 do gene PKM e combinações destas. Em certas modalidades, um ou mais gRNAs compreendem um primeiro gRNA compreendendo uma sequência alvo que é complementar a uma região de íntron 5' flanqueando o éxon 9 do gene PKM e um segundo gRNA compreendendo um domínio alvo que é complementar a uma região de íntron 3' flanqueando o éxon 9 do gene PKM.
Em certas modalidades, um ou mais gRNAs compreendem um primeiro gRNA compreendendo uma sequência alvo que é complementar a uma região dentro do éxon 2 do gene PKM e um segundo gRNA compreendendo um domínio alvo que é complementar a uma região dentro do éxon 12 do PKM gene. Por exemplo, mas não a título de limitação, o um ou mais gRNAs compreendem uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 33-34 e 42-43 e uma combinação destas. Em certas modalidades, a expressão da isoforma de polipeptídeo PKM é silenciada (knock out) ou sofre knock down e a atividade lactogênica na célula é eliminada. Em certas modalidades, a isoforma de polipeptídeo PKM é uma isoforma de polipeptídeo PKM-1 ou uma combinação das isoformas do polipeptídeo PKM-1 e PKM-2.
[00014] Em certas modalidades, um sistema de engenharia genética para uso na presente divulgação é um sistema de nuclease de dedo de zinco (ZFN) ou um sistema de nuclease efetora semelhante à ativadores de transcrição (TALEN). Em certas modalidades não limitantes, o sistema de engenharia genética inclui um RNA selecionado a partir do grupo que consiste em um RNA de grampo curto (shRNA), um pequeno RNA de interferência (siRNA) e um microRNA (miRNA), em que o RNA é complementar a um mRNA expresso pelo gene PKM. Em certas modalidades, o mRNA expresso pelo gene PKM codifica uma isoforma de polipeptídeo PKM-1. Em certas modalidades, a expressão da isoforma de polipeptídeo PKM-1 sofre knock down e a atividade lactogênica da célula é reduzida. Em certas modalidades, o sistema de engenharia genética compreende ainda um segundo RNA selecionado a partir do grupo que consiste em um shRNA, um siRNA e um microRNA miRNA, em que o segundo RNA é complementar a uma porção de um mRNA expresso pelo gene PKM que codifica a isoforma de polipeptídeo PKM-2. Em certas modalidades, a expressão das isoformas dos polipeptídeos PKM-1 e PKM-2 são silenciadas (knock out) ou sofrem knock down e a atividade lactogênica da célula é reduzida.
[00015] Em um aspecto adicional, a presente divulgação fornece métodos para produzir um produto de interesse, por exemplo, a partir das células divulgadas neste documento. Por exemplo, um método para produzir um produto de interesse compreende cultivar células de mamífero para produzir o produto de interesse, em que as células de mamífero reduziram ou eliminaram a atividade lactogênica. Em certas modalidades, a presente divulgação fornece um método para cultivar uma população de células de mamífero que expressa um produto de interesse, em que as células de mamífero reduziram ou eliminaram a atividade lactogênica. Em certas modalidades, a redução ou eliminação da atividade lactogênica resulta do nocaute ou nocaute negativo da expressão de uma isoforma de polipeptídeo do músculo piruvato quinase (PKM) nas células de mamífero. Em certas modalidades, a isoforma de polipeptídeo PKM é a isoforma de polipeptídeo PKM-1. Em certas modalidades, a expressão da isoforma de polipeptídeo PKM-2 também é silenciada (knock out) ou sofre knock down. Em certas modalidades, o método pode compreender ainda isolar o produto de interesse da cultura de células.
4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00016] Figuras 1A-1F. Os níveis de lactato da linhagem celular mAb-1 se correlacionam diretamente com os níveis de PKM-1. Viabilidade celular percentual (Figura 1A), grau do dia 14 (Figura 1B) e níveis de lactato (Figura 1C) na linhagem celular mAb-1 sob processos de baixo e alto lactato.
(Figura 1D) Análise por Western blot de PKM-1 e PKM-2 de lisados de células mAb-1 em dias diferentes durante a produção sob os processos de baixo e alto lactato. Actina foi usada como o controle de carregamento. Quantificação dos níveis relativos de PKM-1 (Figura 1E) e PKM-2 (Figura 1F), normalizados contra Actina.
[00017] Figuras 2A-2F. Os níveis de lactato da linhagem celular mAb-2 se correlacionam diretamente com os níveis de PKM-1. Porcentagem de viabilidade celular (Figura 2A), grau do dia 14 (Figura 2B) e níveis de lactato (Figura 2C) na linhagem celular mAb-2 sob processos de baixo e alto lactato.
(Figura 2D) Análise por Western blot PKM-1 e PKM-2 de lisados de células de mAb-2 em dias diferentes durante a produção sob os processos de baixo e alto lactato. Actina foi usada como o controle de carregamento. Quantificação dos níveis relativos de PKM-1 (Figura 2E) e PKM-2 (Figura 2F), normalizados contra Actina.
[00018] Figuras 3A-3E. As células CHO expressam enzimas PKL/R, mas os níveis dessas enzimas não se correlacionam com os níveis de lactato na cultura de produção. (Figura 3A) Análise de Western blot da expressão intracelular de proteínas PKL/R em duas linhagens celulares CHO hospedeiras diferentes (K1 e DHFR -/-), bem como células 293 humanas.
Actina foi usada como o controle de carregamento. (Figuras 3B e 3C) Níveis de proteína intracelular de PKL/R em dias diferentes durante os processos de produção de baixo e alto lactato de linhagens celulares mAb-1 (Figura 3B) e mAb-2 (Figura 3C). (Figuras 3D e 3E) Quantificação dos níveis relativos de PKL/R normalizados contra Actina em linhagens celulares mAb-1 (Figura 3D) e mAb-2 (Figura 3E).
[00019] Figuras 4A-4C. Geração de linhagens celulares de silenciamento (knock out) de PKM-1. (Figura 4A) Diagrama esquemático dos éxons 8-10 do gene PKM e gRNA e iniciadores de rastreio usados para avaliar a deleção do éxon 9 na linhagem celular mAb-2. Dois gRNAs flanqueando o éxon 9 do gene PKM foram cotransfectados com o transgene Cas9 para induzir a deleção do éxon 9. As células transfectadas foram clonadas em células individuais. Os iniciadores de PCR flanqueando a região de deleção foram usados para rastrear linhagens celulares com deleção bem-sucedida do éxon 9 em alelo(s) PKM. (Figura 4B) Células mAb-2 do tipo selvagem (WT) e linhagens celulares com deleção direcionada do éxon 9 por meio de gRNAs e transgene Cas9 foram analisadas por rastreio de iniciadores de PCR. A banda superior representa alelo(s) PKM WT enquanto a banda inferior representa alelo(s) PKM com deleções do éxon 9. KO: linhagens celulares de silenciamento (knock out), HET: linhagens celulares heterozigóticas. (Figura 4C) Comparação da sequência do alelo PKM WT em contraste com o(s) alelo(s) KO do éxon 9 em linhagens celulares alvo. Observe que a linhagem celular KO-15 possui deleções maiores do que o pretendido (por 122 bp) na região 5' do éxon 9 em alelo(s) PKM direcionados.
[00020] Figuras 5A-5H. Abolir ou reduzir a expressão de PKM-1 evitou comportamentos lactogênicos na linhagem celular mAb-2, mesmo sob o processo de alto lactato. Contagem de células viáveis (Figura 5A), porcentagem de viabilidade celular (Figura 5B), grau do dia 14 (Figura 5C), produtividade específica do dia 14 (Figura 5D) e níveis de lactato (Figura 5E) de linhagens celulares mAb-2 PKM-1 HET e KO e WT durante um ensaio de produção em lote alimentado de 14 dias usando biorreatores AMBR15. O controle do processo foi o mesmo do processo com alto lactato na Figura 2.
(Figura 5F) Análise por Western blot de lisados celulares de linhagens celulares indicadas para proteínas PKM-1 e PKM-2. Actina foi usada como o controle de carregamento. (Figuras 5G e 5H) Qualidades do produto de anticorpo incluindo agregação percentual (Figura 5G) e variante de carga percentual (Figura 5H) de mAb-2 das linhagens celulares indicadas.
[00021] Figuras 6A-6G. O comportamento lactogênico é evitado ou reduzido em linhagens celulares mAb-2 PKM-1 KO ou HET ou, usando o processo de alto lactato, independentemente da idade celular ou pós- descongelamento. Contagem de células viáveis (Figura 6A), porcentagem de viabilidade celular (Figura 6B), grau do dia 14 (Figura 6C), produtividade específica do dia 14 (Figura 6D) e níveis de lactato (Figura 6E) das linhagens celulares indicadas, em uma idade celular jovem, em um ensaio de produção em lote alimentado de 14 dias usando biorreatores AMBR15. (Figuras 6F e 6G) Qualidades do produto de anticorpo incluindo agregação percentual (Figura 6F) e variante de carga percentual (Figura 6G) de mAb-2 das linhagens celulares indicadas. O controle do processo foi o mesmo da Figura 5. As barras de erro representam o erro padrão de quatro experimentos individuais.
[00022] Figura 7. Grupos produtores de MAb-3 derivados de linhagens celulares PKM e PKM-1 KO hospedeiras tinham Qp e graus comparáveis ou superiores, mas crescimento inferior (na produção em frasco de agitação).
[00023] Figuras 8A-8B. Grupos produtores de MAb-3 derivados de linhagens celulares PKM e PKM-1 KO hospedeiras geraram lactato inferior (Figura 8A), mas consumiram mais glicose (Figura 8B) na produção em frasco de agitação.
[00024] Figura 9A. Grupos produtores de MAb-3 derivados de linhagens celulares PKM e PKM-1 KO hospedeiras exibiram diferentes taxas de síntese/consumo de aminoácidos na produção em frasco de agitação.
[00025] Figura 9B. Barras e vias delimitadas por retângulos mostram que as linhagens celulares PKM KO hospedeiras acumularam 3- fosfoglicerato.
[00026] Figura 9C. Barras e vias delimitadas por retângulos mostram que as linhagens celulares WT hospedeiras acumularam piruvato.
[00027] Figura 9D. Barras e vias delimitadas por retângulos mostram que as linhagens celulares PKM-1 KO hospedeiras acumularam o produto do ciclo de TCA, alfa-cetoglutarato (α-KG).
[00028] Figura 9E. Barras e vias delimitadas por retângulos mostram que as linhagens celulares PKM-1 KO hospedeiras acumularam o produto do ciclo de TCA, oxaloacetato.
[00029] Figura 10. Consumo específico da célula hospedeira ou geração de glicose, lactato e aminoácidos.
[00030] Figura 11. Grupos produtores de MAb-3 derivados de linhagens celulares PKM e PKM-1 KO hospedeiras exibiram diferentes perfis de glicosilação na produção em frasco de agitação. A linhagem PKM KO hospedeira teve galactosilação diminuída, e as linhagens celulares PKM KO e PKM-1 KO hospedeiras tiveram fucosilação ligeiramente diminuída.
5. DESCRIÇÃO DETALHADA
[00031] Para maior clareza, mas não como forma de limitação, a descrição detalhada do assunto presentemente divulgado é dividida nas seguintes subseções:
5.1 Definições;
5.2 Modulação da expressão de PKM;
5.3 Células com atividade lactogênica reduzida ou eliminada;
5.4 Métodos de cultura de células;
5.5 Produtos; e
5.6 Modalidades exemplares.
5.1 DEFINIÇÕES
[00032] Os termos usados neste relatório descritivo geralmente têm seus significados comuns na técnica, dentro do contexto desta divulgação e no contexto específico onde cada termo é usado. Certos termos são discutidos abaixo, ou em outro lugar no relatório descritivo, são para fornecer orientação adicional ao médico na descrição das composições e métodos da presente divulgação e como fazê-los e usá-los.
[00033] Conforme usado neste documento, o uso da palavra "um" ou "uma" quando usado em conjunto com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou no relatório descritivo pode significar "um", mas também é consistente com o significado de "um ou mais", "pelo menos um" e "um ou mais do que um”.
[00034] Os termos "compreende(m)", "inclui(em)", "tendo", "tem", "pode", "contém" e suas variantes, tal como usadas no presente documento, destinam-se a ser frases de transição abertas, termos ou palavras que não excluem a possibilidade de atos ou estruturas adicionais. A presente divulgação também contempla outras modalidades "compreendendo", "consistindo em" e "consistindo essencialmente em" modalidades ou elementos apresentados neste documento, sejam explicitamente estabelecidas ou não.
[00035] Conforme usado neste documento, o termo "comportamento lactogênico" ou "atividade lactogênica" refere-se à atividade produzir lactato de uma célula, por exemplo, consumindo glicose e gerando lactato por meio de glicólise aeróbia. Em certas modalidades, a atividade lactogênica de uma célula pode ser medida pelo nível de lactato acumulado no meio de cultura de células.
[00036] O termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor particular, conforme determinado por alguém técnico no assunto, que dependerá em parte de como o valor é medido ou determinado, ou seja, as limitações do sistema de medição. Por exemplo, "cerca de" pode significar dentro de 3 ou mais de 3 desvios padrão, de acordo com a prática na técnica. Alternativamente, "cerca de" pode significar uma faixa de até 20%, preferencialmente até 10%, mais preferencialmente até 5% e mais preferencialmente ainda até 1% de um determinado valor. Alternativamente, particularmente no que diz respeito a sistemas ou processos biológicos, o termo pode significar dentro de uma ordem de magnitude, preferencialmente dentro de 5 vezes, e mais preferencialmente dentro de 2 vezes, de um valor.
[00037] Os termos "meio de cultura de células" e "meio de cultura" referem-se a uma solução nutritiva usada para o cultura de células de mamífero que normalmente fornece pelo menos um componente de uma ou mais das seguintes categorias: 1) uma fonte de energia, geralmente na forma de um carboidrato, tal como a glicose; 2) todos os aminoácidos essenciais e geralmente o conjunto básico de vinte aminoácidos mais cisteína; 3) vitaminas e/ou outros compostos orgânicos necessários em baixas concentrações; 4) ácidos graxos livres; e 5) oligoelementos, onde os oligoelementos são definidos como compostos inorgânicos ou elementos de ocorrência natural que são normalmente necessários em concentrações muito baixas, geralmente na faixa micromolar.
[00038] A solução nutritiva pode ser opcionalmente suplementada com um ou mais componentes de qualquer uma das seguintes categorias: 1) hormônios e outros fatores de crescimento como, por exemplo, insulina, transferrina e fator de crescimento epidérmico; 2) sais e tampões como, por exemplo, cálcio, magnésio e fosfato; 3) nucleosídeos e bases, tais como, por exemplo, adenosina, timidina e hipoxantina; e 4) hidrolisados de proteínas e tecidos.
[00039] “Cultivar” uma célula refere-se ao contato de uma célula com um meio de cultura de células sob condições adequadas para a sobrevivência e/ou crescimento e/ou proliferação da célula.
[00040] "Cultura em lote" refere-se a uma cultura em que todos os componentes para cultivar células (incluindo as células e todos os nutrientes da cultura) são fornecidos ao biorreator de cultura no início do processo de cultura.
[00041] "Cultura de células em lote alimentado", tal como usado neste documento, refere-se a uma cultura em lote em que as células e o meio de cultura são fornecidos ao biorreator de cultura inicialmente e nutrientes de cultura adicionais são alimentados, continuamente ou em incrementos discretos, à cultura durante o processo de cultura, com ou sem colheita periódica de células e/ou produtos antes do término da cultura.
[00042] "Cultura de perfusão", às vezes referida como cultura contínua, é uma cultura pela qual as células são restringidas na cultura por, por exemplo, filtração, encapsulação, ancoragem a microtransportadores, etc., e o meio de cultura é continuamente, etapa a etapa ou intermitentemente introduzido (ou qualquer combinação destes) e removido do biorreator de cultura.
[00043] Tal como usado no presente documento, o termo "célula" refere-se a células animais, células de mamífero, células cultivadas, células hospedeiras, células recombinantes e células hospedeiras recombinantes. Tais células são geralmente linhagens celulares obtidas ou derivadas de tecidos de mamíferos que são capazes de crescer e sobreviver quando colocados em meio contendo nutrientes apropriados e/ou fatores de crescimento.
[00044] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem celular hospedeira”, e “cultura de células hospedeiras” são usados indiferentemente e refere-sem às células hospedeiras nas quais foi introduzido o ácido nucleico exógeno, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e a progênie resultante desta, independentemente do número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica no conteúdo de ácido nucleico a uma célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica que a rastreada ou selecionada para na célula originalmente transformada está incluída neste documento.
[00045] O termo "célula hospedeira de mamífero" ou "célula de mamífero" refere-se a linhagens celulares derivadas de mamíferos que são capazes de crescimento e sobrevivência quando colocadas em cultura em monocamada ou em cultura em suspensão em um meio contendo os nutrientes e fatores de crescimento apropriados. Os fatores de crescimento necessários para uma linhagem celular particular são prontamente determinados empiricamente sem experimentação indevida, conforme descrito por exemplo em Mammalian Cell Culture (Mather, J. P. ed., Plenum Press, Nova Iorque, 1984) e Barnes e Sato, (1980) Cell, 22:649. Normalmente, as células são capazes de expressar e segregar grandes quantidades de uma proteína particular, por exemplo, glicoproteína, de interesse para o meio de cultura.
Exemplos de células hospedeiras de mamíferos adequadas no contexto da presente divulgação podem incluir células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 1980); células dp12.CHO (EP 307,247 publicada em 15 de março de 1989); CHO-K1 (ATCC, CCL-61); linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 1977); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 1980); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células renais caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 1982); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Em certas modalidades, as células de mamífero incluem células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 1980); células dp12.CHO (EP 307,247 publicada em 15 de março de 1989).
[00046] O termo "peptona" dentro do contexto da presente divulgação refere-se a um suplemento de meio que é essencialmente proteína animal hidrolisada. A fonte desta proteína pode ser subprodutos animais de matadouros, gelatina purificada ou material vegetal. A proteína é normalmente hidrolisada usando ácido, calor ou várias preparações enzimáticas.
[00047] A "fase de crescimento" da cultura de células refere-se ao período de crescimento exponencial das células (a fase log), onde as células geralmente se dividem rapidamente. A duração do tempo durante o qual as células são mantidas na fase de crescimento pode variar com base no tipo de célula, a taxa de crescimento das células e/ou as condições de cultura, por exemplo. Em certas modalidades, durante esta fase, as células são cultivadas por um período de tempo, geralmente entre 1 a 4 dias, e sob tais condições que o crescimento celular seja maximizado. A determinação do ciclo de crescimento da célula hospedeira pode ser determinada para a célula hospedeira particular prevista sem experimentação indevida. "Período de tempo e sob tais condições em que o crescimento celular é maximizado" e similares, referem-se às condições de cultura que, para uma linhagem celular particular, são determinadas como ideais para o crescimento e divisão celular.
Em certas modalidades, durante a fase de crescimento, as células são cultivadas em meio nutriente contendo os aditivos necessários geralmente a cerca de 30°-40°C em uma atmosfera controlada umidificada, de tal modo que o crescimento ideal seja alcançado para a linhagem celular particular. Em certas modalidades, as células são mantidas na fase de crescimento por um período de cerca de um a quatro dias, geralmente entre dois a três dias.
[00048] "Fase de transição" da cultura de células refere-se ao período de tempo durante o qual as condições de cultura para a fase de produção estão envolvidas. Durante a fase de transição, fatores ambientais, tais como temperatura da cultura de células, osmolalidade do meio e similares, são deslocados das condições de crescimento para as condições de produção.
[00049] "Fase de produção" da cultura de células refere-se ao período de tempo durante o qual o crescimento celular está/atingiu um platô. O crescimento celular logarítmico normalmente diminui antes ou durante esta fase e a produção de proteínas assume. Durante a fase de produção, o crescimento celular logarítmico terminou e a produção de proteínas é primária.
Durante este período de tempo, o meio é geralmente suplementado para apoiar a produção continuada de proteína e para alcançar o produto de glicoproteína desejado. Os processos em lote alimentado e/ou em cultura de células de perfusão suplementam o meio de cultura de células ou fornecem meio fresco durante esta fase para alcançar e/ou manter a densidade celular desejada, viabilidade e/ou grau de produto de proteína recombinante. Uma fase de produção pode ser conduzida em grande escala.
[00050] O termo "expressão" ou "expressa" é usado neste documento para referir-se à transcrição e tradução que ocorre dentro de uma célula hospedeira. O nível de expressão de um gene de produto em uma célula hospedeira pode ser determinado com base na quantidade de mRNA correspondente que está presente na célula ou na quantidade da proteína codificada pelo gene de produto que é produzido pela célula. Por exemplo, o mRNA transcrito de um gene de produto é desejavelmente quantificado por hibridização Northern. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 7.3-7.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A proteína codificada por um gene de produto pode ser quantificada por ensaio para a atividade biológica da proteína ou pelo emprego de ensaios que são independentes de tal atividade, tais como western blott ou radioimunoensaio usando anticorpos que são capazes de reagirem com a proteína. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 18.1-18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
[00051] Tal como usado neste documento, "polipeptídeo" refere- se geralmente a peptídeos e proteínas tendo mais de cerca de dez aminoácidos. Os polipeptídeos podem ser homólogos à célula hospedeira ou, preferencialmente, podem ser exógenos, o que significa que eles são heterólogos, ou seja, estranhos, à célula hospedeira sendo usada, tal como uma proteína humana produzida por uma célula de ovário de hamster chinês,
ou um polipeptídeo de levedura produzido por uma célula de mamífero. Em certas modalidades, polipeptídeos de mamífero (polipeptídeos que foram originalmente derivados de um organismo de mamífero) são usados, mais preferencialmente aqueles que são secretados diretamente para o meio.
[00052] O termo "proteína" refere-se a uma sequência de aminoácidos para a qual o comprimento da cadeia é suficiente para produzir os níveis mais elevados de estrutura terciária e/ou quaternária. Isso é para distinguir de "peptídeos" ou outros fármacos de pequeno peso molecular que não têm tal estrutura. Normalmente, a proteína deste documento terá um peso molecular de pelo menos cerca de 15 a 20 kD, de preferência pelo menos cerca de 20 kD. Exemplos de proteínas abrangidas pela definição neste documento incluem todas as proteínas de mamíferos, em particular, proteínas terapêuticas e de diagnóstico, tais como anticorpos terapêuticos e de diagnóstico e, em geral, proteínas que contêm uma ou mais ligações dissulfeto, incluindo polipeptídeos de cadeias múltiplas compreendendo uma ou mais ligações dissulfeto inter e/ou intracadeia.
[00053] O termo "anticorpo" é usado no presente documento no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpos, incluindo, mas não se limitando a, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos monoespecíficos (por exemplo, anticorpos que consistem em uma sequência de cadeia única pesada e uma sequência de cadeia única leve, incluindo multímeros de tais pares), anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade de ligação ao antígeno desejada.
[00054] Um "fragmento de anticorpo", "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo") ou "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo, como usado neste documento, refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende um porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não se limitam a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFv, e scFab); anticorpos de domínio único (dAbs); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpo, vide Holliger e Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005).
[00055] O termo anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie em particular, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado a partir de uma diferente fonte ou espécie.
[00056] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuído pela sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e vários destes podem ser ainda divididos em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Em certas modalidades, o anticorpo é do isotipo IgG 1.
Em certas modalidades, o anticorpo é do isotipo IgG 2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados α, δ, ε, γ e µ, respectivamente. A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída a um de dois tipos, denominados capa (κ) e lambda (λ), com base na sequência de aminoácidos do seu domínio constante.
[00057] O termo "grau", tal como usado no presente documento, refere-se à quantidade total de anticorpo expresso de forma recombinante produzida por uma cultura de células dividida por uma determinada quantidade de volume médio. O grau é normalmente expresso em unidades de miligramas de anticorpo por mililitro ou litro de meio (mg/ml ou mg/L). Em certas modalidades, o grau é expresso em gramas de anticorpo por litro de meio (g/L).
O grau pode ser expresso ou avaliado em termos de uma medição relativa, tal como um aumento percentual no grau em comparação com a obtenção do produto de proteína sob diferentes condições de cultura.
[00058] O termo "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" inclui qualquer composto e/ou substância que compreende um polímero de nucleotídeos. Cada nucleotídeo é composto de uma base, especificamente uma base de purina ou pirimidina (ou seja, citosina (C), guanina (G), adenina (A), timina (T) ou uracila (U)), um açúcar (ou seja, desoxirribose ou ribose) e um grupo fosfato. Frequentemente, a molécula de ácido nucleico é descrita pela sequência de bases, em que as referidas bases representam a estrutura primária (estrutura linear) de uma molécula de ácido nucleico. A sequência de bases é normalmente representada de 5’ a 3’. Aqui, o termo molécula de ácido nucleico abrange ácido desoxirribonucleico (DNA) incluindo, por exemplo, DNA complementar (cDNA) e DNA genômico, ácido ribonucleico (RNA), em particular RNA mensageiro (mRNA), formas sintéticas de DNA ou RNA e polímeros mistos compreendendo duas ou mais dessas moléculas. A molécula de ácido nucleico pode ser linear ou circular. Além disso, o termo molécula de ácido nucleico inclui fitas senso e antissenso, bem como formas de fita simples e fita dupla. Além disso, a molécula de ácido nucleico descrita neste documento pode conter nucleotídeos de ocorrência não natural ou que não ocorrem naturalmente. Exemplos de nucleotídeos de ocorrência não natural incluem bases modificadas de nucleotídeos com açúcares derivados ou ligações de cadeia principal de fosfato ou resíduos quimicamente modificados. Moléculas de ácido nucleico também abrangem moléculas de DNA e RNA que são adequadas como um vetor para expressão direta de um anticorpo da invenção in vitro e/ou in vivo, por exemplo, em um hospedeiro ou paciente. Tais vetores de DNA (por exemplo, cDNA) ou RNA (por exemplo, mRNA), podem ser modificados ou não modificados. Por exemplo, o mRNA pode ser modificado quimicamente para aperfeiçoar a estabilidade do vetor de RNA e/ou expressão da molécula codificada de modo que o mRNA possa ser injetado em um paciente para gerar o anticorpo in vivo (vide, por exemplo, Stadler et al, Nature Medicine 2017, publicado online em 12 de junho de 2017, doi: 10.1038/nm.4356 ou EP 2 101 823 B1).
[00059] Conforme usado neste documento, o termo "vetor" refere- se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ela foi ligada.
[00060] O termo "hibridoma" refere-se a uma linhagem celular híbrida produzida pela fusão de uma linhagem celular imortal de origem imunológica e uma célula produtora de anticorpos. O termo abrange a progênie de fusões de mieloma hetero-híbridas, que são o resultado de uma fusão com células humanas e uma linhagem celular de mieloma murino subsequentemente fundida com uma célula plasmática, comumente conhecida como linhagem celular de trioma. Além disso, o termo pretende incluir qualquer linhagem celular híbrida imortalizada que produza anticorpos, tais como, por exemplo, quadromas. Vide, por exemplo, Milstein et al., Nature, 537:3053 (1983).
[00061] Um “anticorpo humano” é um que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um ser humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que usa repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências que codificam anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno não humanos.
[00062] Um anticorpo "humanizado" refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos de CDRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em certos aspectos, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e normalmente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as CDRs correspondem às de um anticorpo não humano e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem às de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado opcionalmente pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que foi submetido à humanização.
[00063] O termo "região hipervariável" ou "HVR", tal como usado neste documento, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e que determinam a especificidade de ligação ao antígeno, por exemplo, "regiões determinantes de complementaridade" ("CDRs").
[00064] Geralmente, os anticorpos compreendem seis CDRs: três na VH (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) e três na VL (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3).
CDRs exemplares do presente documento incluem: (a) alças hipervariáveis que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); (b) CDRs que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 (L1), 50- 56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); e (c) contatos ao antígeno que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) e 93-101 (H3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)).
[00065] Salvo indicação em contrário, as CDRs são determinadas de acordo com Kabat et al., supra. Um técnico no assunto entenderá que as designações de CDR também podem ser determinadas de acordo com Chothia, supra, McCallum, supra, ou qualquer outro sistema de nomenclatura cientificamente aceito.
[00066] Um “imunoconjugado” é um anticorpo conjugado a uma ou mais molécula(s) heteróloga(s), incluindo, mas não se limitando a, um agente citotóxico.
[00067] O termo “anticorpo monoclonal”, tal como usado no presente documento, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto quanto a possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou que ocorrem durante a produção de uma preparação de anticorpos monoclonais, tais variantes geralmente estando presentes em quantidades menores. Em contraste a preparações de anticorpos policlonais, que normalmente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpos monoclonais é direcionado contra um único determinante em um antígeno. Assim, o modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser preparados por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não se limitando a, método de hibridomas, métodos de DNA recombinante, métodos de apresentação em fagos, e os métodos que usam animais transgênicos contendo todos ou parte dos loci de imunoglobulina humana, tais métodos e outros métodos exemplares para a produção de anticorpos monoclonais sendo descritos no presente documento.
[00068] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve (VL e VH, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões estruturais conservadas (FR) e três regiões determinantes de complementaridade (CDRs). (Vide, por exemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6ª ed., W.H. Freeman e Co., página 91 (2007)). Um domínio único VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno particular podem ser isolados usando um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano et al., J.
Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
[00069] Conforme usado neste documento, o termo "densidade celular" refere-se ao número de células em um determinado volume de meio.
Em certas modalidades, uma alta densidade celular é desejável, pois pode levar a uma maior produtividade de proteína. A densidade celular pode ser monitorada por qualquer técnica conhecida na técnica, incluindo, mas não se limitando a, extrair amostras de uma cultura e analisar as células sob um microscópio, usando um dispositivo de contagem de células disponível comercialmente ou usando uma sonda adequada comercialmente disponível introduzida no próprio biorreator (ou em uma alça através da qual o meio e as células suspensas são passados e, em seguida, retornados ao biorreator).
[00070] Conforme usado neste documento, o termo "semear" refere-se à adição ou inoculação de células em crescimento em um meio de cultura no início da fase de produção. Além disso, tal como usado neste documento, o termo "série de semeadura" refere-se a uma passagem contínua de células em volumes de meio de cultura de cerca de 20 L ou menos para a manutenção da linhagem celular.
[00071] Tal como usado no presente documento, o termo "célula recombinante" refere-se a células que têm alguma modificação genética das células parentais originais das quais são derivadas. Tal modificação genética pode ser o resultado de uma introdução de um gene heterólogo para a expressão do produto de gene, por exemplo, uma proteína recombinante.
[00072] Tal como usado aqui, o termo "proteína recombinante" refere-se geralmente a peptídeos e proteínas, incluindo anticorpos. Tais proteínas recombinantes são "heterólogas", ou seja, estranhas à célula hospedeira que está sendo usada, tal como um anticorpo produzido por células CHO.
[00073] Tal como usado neste documento, um "polipeptídeo PKM" refere-se a um polipeptídeo que é codificado pelo gene PKM. Um polipeptídeo PKM inclui a isoforma de polipeptídeo PKM-1 e/ou a isoforma de polipeptídeo PKM-2.
5.2 MODULANDO A EXPRESSÃO DE PKM
[00074] A glicólise é o processo do metabolismo da glicose usado pelas células de mamífero, por exemplo, células CHO, para gerar energia. A glicólise pode ocorrer em estados de fluxo alto ou baixo. A resposta celular aos níveis de glicose e a alteração entre esses estados de fluxo podem variar dependendo das linhagens celulares e dos níveis e combinações de isoenzimas presentes na via glicolítica (Mulukutla et al., 2014, PLoS One 9(6):e98756). Em condições normais de cultura, as células CHO, como outras linhagens celulares imortalizadas, tendem a consumir glicose e gerar lactato por meio da glicólise aeróbia, um processo conhecido como efeito Warburg (Warburg, 1956, Science 123(3191):309-14). O acúmulo de lactato nas culturas de produção pode afetar adversamente o crescimento, a viabilidade e a produtividade celulares. Portanto, a regulação do fluxo de energia celular e do metabolismo pode ser alavancada para evitar resultados indesejáveis causados pelo acúmulo de lactato durante a fase de produção de cultura de células (Mulukutla et al., 2010, Trends Biotechnol. 28(9):476-84; Luo et al., 2012, Biotechnol. Bioeng. 109(1):146-56; Ahn e Antoniewicz, 2012, Biotechnol.
J. 7(1):61-74).
[00075] A etapa final do processo de glicólise envolve a conversão de fosfoenolpiruvato (PEP) em piruvato, que é mediada pelas enzimas piruvato quinase (PK). Quatro diferentes isoformas de PK foram identificadas: fígado PK (PKL), glóbulos vermelhos PK (PKR), músculo 1 PK (PKM-1) e músculo 2 PK (PKM-2). As enzimas PK são expressas por dois genes diferentes, PKLR e PKM. O splicing de éxon alternativo dá origem a diferentes isoformas de PK. A presença de ambos os éxons 1 e 2 em um transcrito de mRNA do gene PKLR resulta na expressão da proteína PKR, enquanto um transcrito de mRNA que inicia com o éxon 2 resulta na expressão da proteína PKL. O splicing alternativo do éxon 9 ou 10 no transcrito do gene PKM dá origem a PKM-1 ou PKM-2, respectivamente. Especificamente, PKM-1 inclui o éxon 9 e exclui o éxon 10 do gene PKM, e PKM-2 inclui o éxon 10 e exclui o éxon 9 do gene PKM. Promotores específicos de tecido, fatores de transcrição e splicing alternativo regulam a expressão dessas isoformas em diferentes tecidos e linhagens celulares (Chaneton e Gottlieb, 2012, Trends. Biochem. Sci.
37(8):309-16; Israelsen e Vander Heiden, 2015, Semin Cell Dev Biol 43:43-51; Mazurek, 2011, Int. J. Biochem. Cell Biol 43(7):969-80; Harada et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta. 524(2):327-39; Noguchi et al., 1986, J. Biol. Chem.
261(29):13807-12; Noguchi et al., 1987, J. Biol. Chem. 262(29):14366-71).
[00076] PKM-2 foi amplamente estudado devido ao seu papel central no metabolismo d ecélulas cancerosas e no crescimento tumoral, marcado pelo alto consumo de glicose e produção de lactato. Enquanto a enzima PKM-1 é constitutivamente ativa, a atividade de PKM-2 é regulada por oligomerização, ligação ao substrato e modificações pós-traducionais (Christofk et al., 2008, Nature 452(7184):230-3; Chaneton e Gottlieb, 2012, Trends Biochem. Sci. 37(8):309-16; Israelsen e Vander Heiden, 2015, Semin. Cell Dev.
Biol 43:43-51). Por exemplo, frutose 1,6-bisfosfato (FBP) reversivelmente se liga a PKM-2, promovendo sua tetramerização e, portanto, ativação (Ashizawa et al., 1991, J. Biol. Chem. 266(25):16842-6; Dombrauckas et al., 2005, Biochemistry 44(27):9417-29). A fosforilação de PKM-2 na tirosina 105 ou sua ligação a outras proteínas fosfotirosina inativa PKM-2 bloqueando a ligação a FBP e prevenindo a tetramerização de PKM-2 (Christofk et al., 2008, Nature 452(7184):181-6; Hitosugi et al., 2009, Sci. Signal 2(97):ra73). Níveis aumentados de glicólise, no entanto, promovem a acetilação de PKM-2 na lisina 305 como parte de uma alça de feedback metabólica, que tem como alvo PKM-2 para sua degradação por meio de autofagia mediada por chaperona (Lv et al., 2011, Mol. Cell 42(6):719-30) (Macintyre e Rathmell, 2011, Mol. Cell 42(6):713-4). Além disso, foi demonstrado que os dímeros de PKM-2 se localizam no núcleo da célula agindo como proteínas quinases, usando PEP como um doador de fosfato, para promover a proliferação celular através da fosforilação de STAT3 e ativação de MEK5 (Gao et al., 2012, Mol. Cell 45(5):598-609).
[00077] De acordo com um aspecto, a presente divulgação refere- se a métodos para modular a atividade lactogênica de uma célula de mamífero por meio da modulação da expressão de PKM, por exemplo, expressão do polipeptídeo PKM, na célula. Por exemplo, mas não como limitação, os métodos para modular a atividade lactogênica de uma célula de mamífero incluem nocaute ou nocaute negativo da expressão do polipeptídeo PKM na célula. Em certas modalidades, a expressão de PKM-1 é silenciada (knock out) ou sofre knock down. Em certas modalidades, a expressão de PKM-2 é silenciada (knock out) ou sofre knock down. Em certas modalidades, a expressão de PKM-1 e PKM-2 é silenciada (knock out) ou sofre knock down.
Tal como usado no presente documento, a expressão silenciada (knock out) refere-se à eliminação da expressão de um polipeptídeo PKM, por exemplo, um polipeptídeo PKM-1 e/ou um polipeptídeo PKM-2, na célula em comparação a uma célula de referência. Tal como usado neste documento, expressão knock down refere-se a uma redução na expressão de um polipeptídeo PKM, por exemplo, um polipeptídeo PKM-1 e/ou um polipeptídeo PKM-2, na célula em comparação a uma célula de referência.
[00078] Em certas modalidades, as células de referência são células em que a expressão de um polipeptídeo PKM, por exemplo, PKM-1 e/ou PKM-2, não é modulada, por exemplo, reduzida. Em certas modalidades, uma célula de referência é uma célula que compreende pelo menos um ou ambos os alelos do tipo selvagem do gene PKM. Por exemplo, mas não como forma de limitação, uma célula de referência é uma célula que tem ambos os alelos PKM do tipo selvagem. Em certas modalidades, as células de referência são células CHO WT.
[00079] Em certas modalidades, a expressão de um polipeptídeo PKM, por exemplo, PKM-1 e/ou PKM-2, em uma célula que foi modificada para aplicar knock down na expressão do polipeptídeo PKM é inferior a cerca de 90%, inferior a cerca de 80%, inferior a cerca de 70%, inferior a cerca de 60%, inferior a cerca de 50%, inferior a cerca de 40%, inferior a cerca de 30%, inferior a cerca de 20%, inferior a cerca de 10%, inferior a cerca de 5%, inferior a cerca de 4%, inferior a cerca de 3%, inferior a cerca de 2% ou inferior a cerca de 1% da expressão do polipeptídeo PKM de uma célula de referência, por exemplo, uma célula CHO WT. Em certas modalidades, a expressão de um polipeptídeo PKM-1 em uma célula que foi modificada para aplicar knock down na expressão do polipeptídeo PKM-1 é inferior a cerca de 90%, inferior a cerca de 80%, inferior a cerca de 70%, inferior a cerca de 60%, inferior a cerca de 50%, inferior a cerca de 40%, inferior a cerca de 30%, inferior a cerca de 20%, inferior a cerca de 10%, inferior a cerca de 5%, inferior a cerca de 4%, inferior a cerca de 3%, inferior a cerca de 2% ou inferior a cerca de 1% da expressão do polipeptídeo PKM-1 de uma célula de referência, por exemplo, uma célula CHO WT.
[00080] Em certas modalidades, a expressão de um polipeptídeo PKM, por exemplo, PKM-1 e/ou PKM-2, em uma célula que foi modificada para aplicar knock down na expressão do polipeptídeo PKM é de pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 2% ou pelo menos cerca de 1% da expressão do polipeptídeo PKM de uma célula de referência, por exemplo, uma célula CHO WT. Em certas modalidades, a expressão de um polipeptídeo PKM-1 em uma célula que foi modificada para aplicar knock down na expressão do polipeptídeo PKM-1 é pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 2% ou pelo menos cerca de 1% da expressão do polipeptídeo PKM-1 de uma célula de referência, por exemplo, uma célula CHO WT.
[00081] Em certas modalidades, a expressão de um polipeptídeo PKM, por exemplo, PKM-1 e/ou PKM-2, em uma célula que foi modificada para nocautear negativamente a expressão do polipeptídeo PKM é não mais que cerca de 90%, não mais que cerca de 80%, não mais que cerca de 70%, não mais que cerca de 60%, não mais que cerca de 50%, não mais que cerca de 40%, não mais que cerca de 30%, não mais que cerca de 20%, não mais que cerca de 10%, não mais que cerca de 5%, não mais que cerca de 4%, não mais que cerca de 3%, não mais que cerca de 2%, ou não mais que cerca de 1% da expressão do polipeptídeo PKM de uma célula de referência, por exemplo, uma célula CHO WT. Em certas modalidades, a expressão de um polipeptídeo PKM, por exemplo, PKM-1 e/ou PKM-2, em uma célula que foi modificada para aplicar knock down na expressão do polipeptídeo PKM é não mais que cerca de 40% da expressão do polipeptídeo PKM de uma célula de referência, por exemplo, uma célula CHO WT. Em certas modalidades, a expressão de um polipeptídeo PKM-1 em uma célula que foi modificada para aplicar knock down na expressão do polipeptídeo PKM-1 é não mais que cerca de 90%, não mais que cerca de 80%, não mais que cerca de 70%, não mais que cerca de 60%, não mais que cerca de 50%, não mais que cerca de 40%, não mais que cerca de 30%, não mais que cerca de 20%, não mais que cerca de 10%, não mais que cerca de 5%, não mais que cerca de 4%, não mais que cerca de 3%, não mais que cerca de 2% ou não mais que cerca de 1% da expressão do polipeptídeo PKM-1 de uma célula de referência, por exemplo, uma célula CHO WT.
[00082] Em certas modalidades, a expressão de um polipeptídeo PKM, por exemplo, PKM-1 e/ou PKM-2, em uma célula que foi modificada para aplicar knock down na expressão do polipeptídeo PKM está entre cerca de 1% e cerca de 90%, entre cerca de 10% e cerca de 90%, entre cerca de 20% e cerca de 90%, entre cerca de 25% e cerca de 90%, entre cerca de 30% e cerca de 90%, entre cerca de 40% e cerca de 90%, entre cerca de 50% e cerca de 90%, entre cerca de 60% e cerca de 90%, entre cerca de 70% e cerca de 90%, entre cerca de 80% e cerca de 90%, entre cerca de 85% e cerca de 90%, entre cerca de 1% e cerca de 80%, entre cerca de 10% e cerca de 80%, entre cerca de 20% e cerca de 80%, entre cerca de 30% e cerca de 80%, entre cerca de
40% e cerca de 80%, entre cerca de 50% e cerca de 80%, entre cerca de 60%
e cerca de 80%, entre cerca de 70% e cerca de 80%, entre cerca de 75% e cerca de 80%, entre cerca de 1% e cerca de 70%, entre cerca de 10% e cerca de 70%, entre cerca de 20% e cerca de 70%, entre cerca de 30% e cerca de
70%, entre cerca de 40% e cerca de 70%, entre cerca de 50% e cerca de 70%,
entre cerca de 60% e cerca de 70%, entre cerca de 65% e cerca de 70%, entre cerca de 1% e cerca de 60%, entre cerca de 10% e cerca de 60%, entre cerca de 20% e cerca de 60%, entre cerca de 30% e cerca de 60%, entre cerca de 40% e cerca de 60%, entre cerca de 50% e cerca de 60%, entre cerca de 55%
e cerca de 60%, entre cerca de 1% e cerca de 50%, entre cerca de 10% e cerca de 50%, entre cerca de 20% e cerca de 50%, entre cerca de 30% e cerca de 50%, entre cerca de 40% e cerca de 50%, entre cerca de 45% e cerca de
50%, entre cerca de 1% e cerca de 40%, entre cerca de 10% e cerca de 40%,
entre cerca de 20% e cerca de 40%, entre cerca de 30% e cerca de 40%, entre cerca de 35% e cerca de 40%, entre cerca de 1% e cerca de 30%, entre cerca de 10% e cerca de 30%, entre cerca de 20% e cerca de 30%, entre cerca de
25% e cerca de 30%, entre cerca de 1% e cerca de 20%, entre cerca de 5% e cerca de 20%, entre cerca de 10% e cerca de 20%, entre cerca de 15% e cerca de 20%, entre cerca de 1% e cerca de 10%, entre cerca de 5% e cerca de
10%, entre cerca de 5% e cerca de 20%, entre cerca de 5% e cerca de 30%,
entre cerca de 5% e cerca de 40% da expressão do polipeptídeo PKM-1 de uma célula de referência, por exemplo, uma célula CHO WT.
Em certas modalidades, a expressão de um polipeptídeo PKM-1 em uma célula que foi modificada para aplicar knock down na expressão do polipeptídeo PKM-1 está entre cerca de 1% e cerca de 90%, entre cerca de 10% e cerca de 90%, entre cerca de 20% e cerca de 90%, entre cerca de 25% e cerca de 90%, entre cerca de 30% e cerca de 90%, entre cerca de 40% e cerca de 90%, entre cerca de
50% e cerca de 90%, entre cerca de 60% e cerca de 90%, entre cerca de 70% e cerca de 90%, entre cerca de 80% e cerca de 90%, entre cerca de 85% e cerca de 90%, entre cerca de 1% e cerca de 80%, entre cerca de 10% e cerca de 80%, entre cerca de 20% e cerca de 80%, entre cerca de 30% e cerca de 80%, entre cerca de 40% e cerca de 80%, entre cerca de 50% e cerca de 80%, entre cerca de 60% e cerca de 80%, entre cerca de 70% e cerca de 80%, entre cerca de 75% e cerca de 80%, entre cerca de 1% e cerca de 70%, entre cerca de 10% e cerca de 70%, entre cerca de 20% e cerca de 70%, entre cerca de 30% e cerca de 70%, entre cerca de 40% e cerca de 70%, entre cerca de 50% e cerca de 70%, entre cerca de 60% e cerca de 70%, entre cerca de 65% e cerca de 70%, entre cerca de 1% e cerca de 60%, entre cerca de 10% e cerca de 60%, entre cerca de 20% e cerca de 60%, entre cerca de 30% e cerca de 60%, entre cerca de 40% e cerca de 60%, entre cerca de 50% e cerca de 60%, entre cerca de 55% e cerca de 60%, entre cerca de 1% e cerca de 50%, entre cerca de 10% e cerca de 50%, entre cerca de 20% e cerca de 50%, entre cerca de 30% e cerca de 50%, entre cerca de 40% e cerca de 50%, entre cerca de 45% e cerca de 50%, entre cerca de 1% e cerca de 40%, entre cerca de 10% e cerca de 40%, entre cerca de 20% e cerca de 40%, entre cerca de 30% e cerca de 40%, entre cerca de 35% e cerca de 40%, entre cerca de 1% e cerca de 30%, entre cerca de 10% e cerca de 30%, entre cerca de 20% e cerca de 30%, entre cerca de 25% e cerca de 30%, entre cerca de 1% e cerca de 20%, entre cerca de 5% e cerca de 20%, entre cerca de 10% e cerca de 20%, entre cerca de 15% e cerca de 20%, entre cerca de 1% e cerca de 10%, entre cerca de 5% e cerca de 10%, entre cerca de 5% e cerca de 20%, entre cerca de 5% e cerca de 30%, entre cerca de 5% e cerca de 40% da expressão do polipeptídeo PKM-1 de uma célula de referência, por exemplo, uma célula CHO WT.
[00083] Em certas modalidades, a expressão de um polipeptídeo PKM, por exemplo, PKM-1 e/ou PKM-2, em uma célula que foi modificada para aplicar knock down na expressão do polipeptídeo PKM está entre cerca de 5% e cerca de 40% da expressão do polipeptídeo PKM de uma célula de referência, por exemplo, uma célula CHO WT. Em certas modalidades, a expressão de um polipeptídeo PKM-1 em uma célula que foi modificada para aplicar knock down na expressão do polipeptídeo PKM-1 está entre cerca de 5% e cerca de 40% da expressão do polipeptídeo PKM-1 de uma célula de referência, por exemplo, uma célula CHO WT. O nível de expressão do polipeptídeo PKM, por exemplo, PKM-1 e/ou PKM-2, em diferentes células de referência (por exemplo, células que compreendem pelo menos um ou ambos os alelos do tipo selvagem do gene PKM) pode variar. Por exemplo, as células da série de semeadura ou células que produzem baixo lactato podem produzir baixos níveis de PKM-1, enquanto as células que produzem alto lactato podem produzir altos níveis de PKM-1.
[00084] O splicing alternativo do éxon 9 ou 10 no transcrito do gene PKM dá origem a PKM-1 ou PKM-2, respectivamente. O gene PKM silenciado (knock out) ou em knock down pode ser um gene PKM de um humano. Em certas modalidades, o gene PKM pode ser de um não humano, por exemplo, um macaco Rhesus, canino, macaco verde, galinha, gado, porco, camundongo, hamster chinês, rato ou coelho.
[00085] Em certas modalidades, o gene PKM que é silenciado (knock out) ou em knock down é um gene PKM de hamster chinês. Em certas modalidades, a sequência do gene PKM de hamster chinês tem uma sequência de referência NCBI ID NW_003613709.1 (faixa: 200602..223561) (SEQ ID NO: 44). Em certas modalidades, a sequência do gene PKM difere em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos da sequência NW_003613709.1. Em certas modalidades, a sequência do gene PKM difere em 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% ou mais da sequência estabelecida na
SEQ ID NO: 44.
[00086] Exemplos não limitantes adicionais de genes PKM incluem o gene PKM humano (por exemplo, NC_000015.10 (faixa
72199029..72231624) (SEQ ID NO: 45)), o gene PKM de macaco Rhesus (por exemplo, NC_027899.1 (faixa 49211766..49245983) (SEQ ID NO: 46)), o gene PKM de macaco verde (por exemplo, NC_023667.1 (faixa
11224332..11255538) (SEQ ID NO: 47)), o gene PKM canino (por exemplo, NC_006612.3 (faixa 35712853..35737643) (SEQ ID NO: 48)), o gene PKM de camundongo (por exemplo, NC_000075.6 (faixa 59656368..59679375) (SEQ ID NO: 49)), o gene PKM de rato (por exemplo, NC_005107.4 (faixa
64480963..64502957) (SEQ ID NO: 50)), o gene PKM de coelho (por exemplo, NC_013685.1 (faixa 304096..317843) (SEQ ID NO: 51)), o gene PKM de frango (por exemplo, NC_006097.4 (faixa 1506428.. 1523684) (SEQ ID NO: 52)), o gene PKM de porco (por exemplo, NC_010449.5 (faixa 60971807..61032780) (SEQ ID NO: 53)) e o gene PKM de gado (por exemplo, AC_000167.1 (faixa
18965981.. 18992644) (SEQ ID NO: 54)). Em certas modalidades, a sequência do gene PKM difere em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos de qualquer uma das sequências estabelecidas nas SEQ ID NOs: 45-54. Em certas modalidades, a sequência do gene PKM difere em 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% ou mais de qualquer uma das sequências estabelecidas nas SEQ ID NOs: 45-54.
[00087] Um técnico no assunto saberia que diferentes linhagens celulares de mamíferos, mesmo aquelas da mesma espécie, por exemplo, duas linhagens celulares hospedeiras distintas de CHO, podem não compartilhar sequências do gene PKM idênticas. Pequenas diferenças nas sequências do gene PKM, por exemplo, diferenças de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos, podem existir entre duas linhagens celulares de mamíferos da mesma espécie.
5.2.1 MÉTODOS PARA MODULAR A EXPRESSÃO DE PKM
[00088] Em certas modalidades, um sistema de engenharia genética é empregado para modular (por exemplo, silenciar (knock out) ou aplicar knock down) a expressão de um polipeptídeo PKM (por exemplo, expressão de PKM-1). Vários sistemas de engenharia genética conhecidos na técnica podem ser usados para os métodos divulgados neste documento.
Exemplos não limitantes de tais sistemas incluem o sistema CRISPR/Cas, o sistema de nuclease de dedo de zinco (ZFN), o sistema de nuclease efetora semelhante à ativadores de transcrição (TALEN) e o uso de outras ferramentas para nocaute negativo de proteína por silenciamento de gene, tal como pequenos RNAs de interferência (siRNAs), RNA de grampo curto (shRNA) e microRNA (miRNA). Quaisquer sistemas CRISPR/Cas conhecidos na técnica, incluindo sistemas Cas tradicionais, aperfeiçoados ou modificados, bem como outras ferramentas de excisão de genoma com base em bactérias, tais como Cpf-1, podem ser usados com os métodos divulgados no presente documento.
[00089] Quaisquer inibidores de PKM conhecidos na técnica também podem ser usados com os métodos divulgados aqui para modular a atividade de PKM e, assim, modular a atividade lactogênica das células divulgadas neste documento. Exemplos não limitantes de inibidores de PKM incluem monofluorofosfato de sódio, L-fenilalanina, fosfato de creatina, Ca2+, fluroposfato e 5'-fosfato de piridoxal.
[00090] Em certas modalidades, uma porção do gene PKM é deletada para modular, por exemplo, silenciar (knock out) ou aplicar knock down, a expressão de um polipeptídeo PKM. Em certas modalidades, pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de
40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85% ou pelo menos cerca de 90% do gene PKM é deletado.
Em certas modalidades, não mais que cerca de 2%, não mais que cerca de 5%, não mais que cerca de 10%, não mais que cerca de 15%, não mais que cerca de 20%, não mais que cerca de 25%, não mais que cerca de 30%, não mais que cerca de 35%, não mais que cerca de 40%, não mais que cerca de 45%, não mais que cerca de 50%, não mais que cerca de 55%, não mais que cerca de 60%, não mais que cerca de 65%, não mais que cerca de 70%, não mais que cerca de 75%, não mais que cerca de 80%, não mais que cerca de 85% ou não mais que cerca de 90% do gene PKM é deletado. Em certas modalidades, entre cerca de 2% e cerca de 90%, entre cerca de 10% e cerca de 90%, entre cerca de 20% e cerca de 90%, entre cerca de 25% e cerca de 90%, entre cerca de 30% e cerca de 90%, entre cerca de 40% e cerca de 90%, entre cerca de 50% e cerca de 90%, entre cerca de 60% e cerca de 90%, entre cerca de 70% e cerca de 90%, entre cerca de 80% e cerca de 90%, entre cerca de 85% e cerca de 90%, entre cerca de 2% e cerca de 80%, entre cerca de 10% e cerca de 80%, entre cerca de 20% e cerca de 80%, entre cerca de 30% e cerca de 80%, entre cerca de 40% e cerca de 80%, entre cerca de 50% e cerca de 80%, entre cerca de 60% e cerca de 80%, entre cerca de 70% e cerca de 80%, entre cerca de 75% e cerca de 80%, entre cerca de 2% e cerca de 70%, entre cerca de 10% e cerca de 70%, entre cerca de 20% e cerca de 70%, entre cerca de 30% e cerca de 70%, entre cerca de 40% e cerca de 70%, entre cerca de 50% e cerca de 70%, entre cerca de 60% e cerca de 70%, entre cerca de 65% e cerca de 70%, entre cerca de 2% e cerca de 60%, entre cerca de 10% e um cerca de 60%, entre cerca de 20% e cerca de 60%, entre cerca de 30% e cerca de 60%, entre cerca de 40% e cerca de 60%, entre cerca de 50%
e cerca de 60%, entre cerca de 55% e cerca de 60%, entre cerca de 2% e cerca de 50%, entre cerca de 10% e cerca de 50%, entre cerca de 20% e cerca de 50%, entre cerca de 30% e cerca de 50%, entre cerca de 40% e cerca de 50%, entre cerca de 45% e cerca de 50%, entre cerca de 2% e cerca de 40%, entre cerca de 10% e cerca de 40%, entre cerca de 20% e cerca de 40%, entre cerca de 30% e cerca de 40%, entre cerca de 35% e cerca de 40%, entre cerca de 2% e cerca de 30%, entre cerca de 10% e cerca de 30%, entre cerca de 20% e cerca de 30%, entre cerca de 25% e cerca de 30%, entre cerca de 2% e cerca de 20%, entre cerca de 5% e cerca de 20%, entre cerca de 10% e cerca de 20%, entre cerca de 15% e cerca de 20%, entre cerca de 2% e cerca de 10%, entre cerca de 5% e cerca de 10%, ou entre cerca de 2% e cerca de 5% do gene PKM é deletado.
[00091] Em certas modalidades, pelo menos um éxon do gene PKM é pelo menos parcialmente deletado. "Parcialmente deletado", tal como usado no presente documento, refere-se a pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, não mais que cerca de 2%, não mais que cerca de 5%, não mais que cerca de 10%, não mais que cerca de 15%, não mais que cerca de 20%, não mais que cerca de 25%, não mais que cerca de 30%, não mais que cerca de 35%, não mais que cerca de 40%, não mais que cerca de 45%, não mais que cerca de 50%, não mais que cerca de 55%, não mais que cerca de 60%, não mais que cerca de 65%, não mais que cerca de 70%, não mais que cerca de 75%, não mais que cerca de
80%, não mais que cerca de 85%, não mais que cerca de 90%, não mais que cerca de 95%, entre cerca de 2% e cerca de 90%, entre cerca de 10% e cerca de 90%, entre cerca de 20% e cerca de 90%, entre cerca de 25% e cerca de
90%, entre cerca de 30% e cerca de 90%, entre cerca de 40% e cerca de 90%,
entre cerca de 50% e cerca de 90%, entre cerca de 60% e cerca de 90%, entre cerca de 70% e cerca de 90%, entre cerca de 80% e cerca de 90%, entre cerca de 85% e cerca de 90%, entre cerca de 2% e cerca de 80%, entre cerca de
10% e cerca de 80%, entre cerca de 20% e cerca de 80%, entre cerca de 30%
e cerca de 80%, entre cerca de 40% e cerca de 80%, entre cerca de 50% e cerca de 80%, entre cerca de 60% e cerca de 80%, entre cerca de 70% e cerca de 80%, entre cerca de 75% e cerca de 80%, entre cerca de 2% e cerca de
70%, entre cerca de 10% e cerca de 70%, entre cerca de 20% e cerca de 70%,
entre cerca de 30% e cerca de 70%, entre cerca de 40% e cerca de 70%, entre cerca de 50% e cerca de 70%, entre cerca de 60% e cerca de 70%, entre cerca de 65% e cerca de 70%, entre cerca de 2% e cerca de 60%, entre cerca de
10% e cerca de 60%, entre cerca de 20% e cerca de 60%, entre cerca de 30%
e cerca de 60%, entre cerca de 40% e cerca de 60%, entre cerca de 50% e cerca de 60%, entre cerca de 55% e cerca de 60%, entre cerca de 2% e cerca de 50%, entre cerca de 10% e cerca de 50%, entre cerca de 20% e cerca de
50%, entre cerca de 30% e cerca de 50%, entre cerca de 40% e cerca de 50%,
entre cerca de 45% e cerca de 50%, entre cerca de 2% e cerca de 40%, entre cerca de 10% e cerca de 40%, entre cerca de 20% e cerca de 40%, entre cerca de 30% e cerca de 40%, entre cerca de 35% e cerca de 40%, entre cerca de
2% e cerca de 30%, entre cerca de 10% e cerca de 30%, entre cerca de 20% e cerca de 30%, entre cerca de 25% e cerca de 30%, entre cerca de 2% e cerca de 20%, entre cerca de 5% e cerca de 20%, entre cerca de 10% e cerca de
20%, entre cerca de 15% e cerca de 20%, entre cerca de 2% e cerca de 10%,
entre cerca de 5% e cerca de 10%, ou entre cerca de 2% e cerca de 5% de uma região, por exemplo, do éxon, é deletada. Por exemplo, mas não a título de limitação, o éxon 9 do gene PKM pode ser pelo menos parcialmente deletado ou completamente deletado. Em certas modalidades, o éxon 10 do gene PKM pode ser pelo menos parcialmente deletado ou completamente deletado. Em certas modalidades, os éxons 9 e 10 do gene PKM podem ser pelo menos parcialmente deletados ou completamente deletados. Em certas modalidades, a região que abrange os éxons 1 a 12 é pelo menos parcialmente deletada ou completamente deletada.
[00092] Em certas modalidades não limitantes, um sistema CRISPR/Cas9 é empregado para modular a expressão de um polipeptídeo PKM. Um sistema de repetições palindrômicas curtas regularmente espaçadas (CRISPR) é uma ferramenta de edição de genoma descoberta em células procarióticas. Quando usado para edição de genoma, o sistema inclui Cas9 (uma proteína capaz de modificar DNA usando crRNA como seu guia), RNA CRISPR (crRNA, contém o RNA usado por Cas9 para guiá-lo à seção correta do DNA hospedeiro junto com uma região que se liga ao tracrRNA (geralmente em uma forma de alça em grampo) formando um complexo ativo com Cas9), e transativando o crRNA (tracrRNA, liga-se ao crRNA e forma um complexo ativo com Cas9). Os termos "RNA guia" e "gRNA" referem-se a qualquer ácido nucleico que promove a associação específica (ou "direcionamento") de uma nuclease guiada por RNA, tal como um Cas9, a uma sequência alvo, tal como uma sequência genômica ou epissomal em uma célula. Os gRNAs podem ser unimoleculares (compreendendo uma única molécula de RNA e, alternativamente, referidos como quiméricos) ou modulares (compreendendo mais de uma, e normalmente duas, moléculas de RNA separadas, tais como um crRNA e um tracrRNA, que geralmente estão associados entre si, por exemplo, por duplexação). As estratégias CRISPR/Cas9 podem empregar um vetor para transfectar a célula de mamífero. O RNA guia (gRNA) pode ser projetado para cada aplicação, conforme esta é a sequência que Cas9 usa para identificar e se ligar diretamente ao DNA alvo em uma célula. Vários crRNAs e o tracrRNA podem ser empacotados juntos para formar um RNA de guia único (sgRNA). O sgRNA pode ser unido ao gene Cas9 e transformado em um vetor para ser transfectado em células.
[00093] Em certas modalidades, o sistema CRISPR/Cas9 para uso na modulação da expressão de um ou mais polipeptídeos PKM compreende uma molécula Cas9 e um ou mais gRNAs compreendendo um domínio de direcionamento que é complementar a uma sequência alvo do gene PKM. Em certas modalidades, o gene alvo é uma região do gene PKM. A sequência alvo pode ser qualquer éxon ou região de íntron dentro do gene PKM, por exemplo, cujo direcionamento elimina ou reduz a expressão de polipeptídeos PKM1 e/ou PKM2. Em certas modalidades, a sequência alvo pode ser uma região 5' flanqueando o éxon 1, uma região dentro do éxon 1, uma região 5' flanqueando o éxon 2, uma região dentro do éxon 2, uma região 5' flanqueando o éxon 9, uma região 3' flanqueando éxon 9, uma região 3' flanqueando o éxon 10, uma região dentro do éxon 12 e/ou uma região 3' flanqueando o éxon 12 do gene PKM. Por exemplo, mas não a título de limitação, a sequência alvo é selecionada a partir do grupo que consiste em uma região de íntron 5' flanqueando o éxon 9 do gene PKM, uma região de íntron 3' flanqueando o éxon 9 do gene PKM, uma região de íntron 3' flanqueando éxon 10 do gene PKM e uma combinação destas.
[00094] Em certas modalidades, uma região de íntron 5' flanqueando o éxon 9 do gene PKM e uma região de íntron 3' flanqueando o éxon 9 do gene PKM são ambas direcionadas usando um sistema CRISPR/Cas9 divulgado neste documento. Por exemplo, mas não como limitação, o sistema CRISPR/Cas9 compreende uma molécula Cas9, um gRNA direcionando uma região de íntron 5' flanqueando o éxon 9 do gene PKM e um gRNA direcionando uma região de íntron 3' flanqueando o éxon 9 do gene PKM, por exemplo, para gerar células que têm PKM-1 silenciado (knock out) ou em knock down. Em certas modalidades, o gRNA direcionando uma região 5' do íntron flanqueando o éxon 9 do gene PKM compreende a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 33. Em certas modalidades, o gRNA direcionando uma região de íntron 3' flanqueando o éxon 9 do gene PKM compreende a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 34.
[00095] Em certas modalidades, a sequência alvo pode ser uma região 5' flanqueando o éxon 1, uma região dentro do éxon 1, uma região 5' flanqueando o éxon 2, uma região dentro do éxon 2, uma região dentro do éxon 12, uma região 3' flanqueando o éxon 12 ou uma combinação destas. Por exemplo, e não como limitação, um sistema CRISPR/Cas9 da presente divulgação pode compreender uma molécula Cas9, um gRNA direcionando uma região dentro do éxon 1 do gene PKM e um gRNA direcionando uma região dentro do éxon 12 do gene PKM, por exemplo, para gerar células que têm PKM-1 e PKM-2 silenciados (knock out) ou em knock down. Em certas modalidades, o sistema CRISPR/Cas9 da presente divulgação pode compreender uma molécula Cas9, um gRNA direcionando uma região dentro do éxon 2 do gene PKM e um gRNA direcionando uma região dentro do éxon 12 do gene PKM, por exemplo, para gerar células que têm PKM-1 e PKM-2 silenciados (knock out) ou em knock down. Em certas modalidades, o gRNA direcionando uma região dentro do éxon 2 do gene PKM compreende a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42. Em certas modalidades, o gRNA direcionando uma região dentro do éxon 12 do gene PKM compreende a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 43.
[00096] Em certas modalidades, os gRNAs são administrados à célula em um único vetor e a molécula Cas9 é administrada à célula em um segundo vetor. Em certas modalidades, os gRNAs e a molécula Cas9 são administrados à célula em um único vetor. Alternativamente, cada um dos gRNAs e molécula Cas9 pode ser administrado por vetores separados. Em certas modalidades, o sistema CRISPR/Cas9 pode ser liberado à célula como um complexo de ribonucleoproteína (RNP) que compreende uma proteína Cas9 complexada com um ou mais gRNAs, por exemplo, liberado por eletroporação (vide, por exemplo, DeWitt et al., Methods 121-122:9-15 (2017) para métodos adicionais de liberação de RNPs a uma célula). Em certas modalidades, a administração do sistema CRISPR/Cas9 à célula resulta no silenciamento (knock out) ou no knock down da expressão do polipeptídeo PKM-1. Em certas modalidades, a administração do sistema CRISPR/Cas9 à célula resulta no silenciamento (knock out) ou no knock down da expressão de ambos os polipeptídeos PKM-1 e PKM-2.
[00097] Em certas modalidades, o sistema de engenharia genética é um sistema ZFN para modular a expressão de um polipeptídeo PKM em uma célula de mamífero. O ZFN pode atuar como enzima de restrição, que é gerada pela combinação de um domínio de ligação ao DNA de dedo de zinco com um domínio de clivagem de DNA. Um domínio de dedo de zinco pode ser projetado para direcionar sequências de DNA específicas, o que permite que a nuclease de dedo de zinco direcione as sequências desejadas dentro dos genomas. Os domínios de ligação ao DNA de ZFNs individuais normalmente contêm uma pluralidade de repetições de dedo de zinco individuais e cada uma pode reconhecer uma pluralidade de pares de bases. O método mais comum para gerar um novo domínio de dedo de zinco é combinar “módulos” menores de dedo de zinco de especificidade conhecida. O domínio de clivagem mais comum em ZFNs é o domínio de clivagem não específico da endonuclease de restrição do tipo II FokI. ZFN modula a expressão de proteínas pela produção de quebras de fita dupla (DSBs) na sequência de DNA alvo, que irá, na ausência de um modelo homólogo, ser reparada por união de extremidade não homóloga (NHEJ). Tal reparo pode resultar na deleção ou inserção de pares de bases, produzindo mudança da matriz de leitura e prevenindo a produção da proteína prejudicial (Durai et al., Nucleic Acids Res.; 33(18):5978-90 (2005)).
Vários pares de ZFNs também podem ser usados para completamente remover grandes segmentos inteiros da sequência genômica (Lee et al., Genome Res.; 20(1):81-9 (2010)). Em certas modalidades, o gene alvo é parte do gene PKM. Em certas modalidades, a sequência alvo é o éxon 9 do gene PKM. Em certas modalidades, a sequência alvo é o éxon 9 e éxon 10 do gene PKM.
[00098] Em certas modalidades, o sistema de engenharia genética é um sistema TALEN para modular a expressão de um polipeptídeo PKM em uma célula de mamífero. TALENs são enzimas de restrição que podem ser projetadas para cortar sequências específicas de DNA. Os sistemas TALEN operam em um princípio semelhante aos ZFNs. Os TALENs são gerados pela combinação de um domínio de ligação ao DNA dos efetores semelhantes à ativadores de transcrição com um domínio de clivagem de DNA.
Efetores semelhantes à ativadores de transcrição (TALEs) são compostos de motivos de repetição de 33 a 34 aminoácidos com duas posições variáveis que têm um forte reconhecimento para nucleotídeos específicos. Ao montar matrizes desses TALEs, o domínio de ligação ao DNA do TALE pode ser projetado para ligar a sequência de DNA desejada e, assim, guiar a nuclease para cortar em locais específicos no genoma (Boch et al., Nature Biotechnology; 29(2):135- 6 (2011)). Em certas modalidades, o gene alvo é parte do gene PKM. Em certas modalidades, a sequência alvo é o éxon 9 do gene PKM. Em certas modalidades, a sequência alvo é o éxon 9 e éxon 10 do gene PKM.
[00099] Em certas modalidades, a expressão do polipeptídeo PKM pode ter aplicado knock down usando oligonucleotídeos que têm sequências complementares aos ácidos nucleicos de PKM (por exemplo, mRNA de PKM, mRNA de PKM-1 ou mRNA de PKM-2). Exemplos não limitantes de tais oligonucleotídeos incluem pequeno RNA de interferência (siRNA), RNA de grampo curto (shRNA) e microRNA (miRNA). Em certas modalidades, tais oligonucleotídeos podem ser homólogos a pelo menos uma porção de uma sequência de ácido nucleico de PKM, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de PKM, PKM-1 ou PKM-2, em que a homologia da porção em relação à sequência de ácido nucleico de PKM é pelo menos cerca de 75, ou pelo menos cerca de 80, ou pelo menos cerca de 85, ou pelo menos cerca de 90, ou pelo menos cerca de 95, ou pelo menos cerca de 98 por cento. Em certas modalidades não limitantes, a porção complementar pode constituir pelo menos 10 nucleotídeos, ou pelo menos 15 nucleotídeos, ou pelo menos 20 nucleotídeos, ou pelo menos 25 nucleotídeos, ou pelo menos 30 nucleotídeos, e as moléculas de ácido nucleico antissenso, shRNA, mRNA ou siRNA podem ser até 15, ou até 20, ou até 25, ou até 30, ou até 35, ou até 40, ou até 45, ou até 50, ou até 75, ou até 100 nucleotídeos de comprimento.
Moléculas de ácido nucleico antissenso, shRNA, mRNA ou siRNA podem compreender DNA ou resíduos atípicos ou não naturais, por exemplo, mas não se limitando a, resíduos de fosforotioato.
[000100] O sistema de engenharia genética divulgado neste documento pode ser liberado na célula de mamífero usando um vetor viral, por exemplo, vetores retrovirais, tais como vetores gama-retrovirais e vetores lentivirais. Combinações de vetor retroviral e uma linha de empacotamento apropriada são adequadas, onde as proteínas do capsídeo serão funcionais para infectar células humanas. Várias linhagens celulares produtoras de vírus anfotrópicas são conhecidas, incluindo, mas não se limitando a, PA12 (Miller et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437); PA317 (Miller, et al., (1986) Mol. Cell.
Biol. 6:2895-2902); e CRIP (Danos et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA
85:6460-6464). As partículas não anfotrópicas também são adequadas, por exemplo, partículas pseudotipadas com VSVG, RD114 ou envelope GALV e qualquer outro conhecido na técnica. Os métodos possíveis de transdução também incluem a cocultura direta das células com células produtoras, por exemplo, pelo método de Bregni et al., (1992) Blood 80:1418-1422, ou cultura com sobrenadante viral sozinho ou estoques de vetores concentrados com ou sem fatores de crescimento e policátions apropriados, por exemplo, pelo método de Xu et al., (1994) Exp. Hemat. 22:223-230; e Hughes et al., (1992) J.
Clin. Invest. 89:1817.
[000101] Outros vetores virais de transdução podem ser usados para modificar a célula de mamífero divulgada no presente documento. Em certas modalidades, o vetor escolhido exibe alta eficiência de infecção e integração e expressão estáveis (vide, por exemplo, Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997; Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996; Bloomer et al., Journal of Virology 71:6641-6649, 1997; Naldini et al., Science 272:263-267, 1996; e Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
94:10319, 1997). Outros vetores virais que podem ser usados incluem, por exemplo, adenovirais, lentivirais e vetores virais associados a adena, vírus vacínia, vírus do papiloma bovino ou vírus do herpes, como o vírus Epstein- Barr (vide também, por exemplo, o vetores de Miller, Human Gene Therapy 15- 14, 1990; Friedman, Science 244:1275-1281, 1989; Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614, 1988; Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991; Cometta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987; Anderson, Science 226:401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991; Miller et al., Biotechnology 7:980-990, 1989; LeGal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993; e Johnson, Chest 107:77S-83S, 1995). Os vetores retrovirais são particularmente bem desenvolvidos e têm sido usados em contextos clínicos
(Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323:370, 1990; Anderson et al., Patente dos EUA de nº 5.399.346).
[000102] As abordagens não virais também podem ser empregadas para a engenharia genética da célula de mamífero divulgada neste documento. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida na célula de mamífero pela administração do ácido nucleico na presença de lipofecção (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
84:7413,1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278,1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512, 1983), conjugação asialoorosomucoid-polilisina (Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989), ou por microinjeção sob condições cirúrgicas (Wolff et al., Science 247:1465, 1990). Outros meios não virais para transferência de genes incluem transfecção in vitro usando fosfato de cálcio, DEAE dextrano, eletroporação e fusão de protoplastos. Os lipossomas também podem ser potencialmente benéficos para a liberação de moléculas de ácido nucleico em uma célula. O transplante de genes normais nos tecidos afetados de um paciente também pode ser realizado pela transferência de um ácido nucleico normal para um tipo de célula cultivável ex vivo (por exemplo, uma célula primária autóloga ou heteróloga ou sua progênie), após o qual a célula (ou seus descendentes) são injetados em um tecido direcionado ou são injetados sistemicamente.
5.3 CÉLULAS COM ATIVIDADE LACTOGÊNICA REDUZIDA OU ELIMINADA
[000103] Em um aspecto, a presente divulgação refere-se a células ou composições compreendendo uma ou mais células, por exemplo, células de mamífero, tendo atividade lactogênica reduzida ou eliminada e métodos de uso destas. A expressão de um polipeptídeo PKM (por exemplo, expressão de PKM-1) é silenciada (knock out) ou sofre knock down na célula, o que resulta na na atividade lactogênica reduzida ou eliminada da célula.
Exemplos não limitantes das células incluem células CHO (por exemplo, células CHO DHFR),
células dp12.CHO, CHO-K1 (ATCC, CCL-61), linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (por exemplo, COS-7 ATCC CRL-1651), linhagem de rim embrionário humano (por exemplo, células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão), células de rim de hamster bebê (por exemplo, BHK, ATCC CCL 10), células de Sertoli de camundongo (por exemplo, TM4), células de rim de macaco (por exemplo, CV1 ATCC CCL 70),
células de rim de macaco verde africano (por exemplo, VERO-76, ATCC CRL- 1587), células de carcinoma cervical humano (por exemplo, HELA, ATCC CCL
2), células de rim canino (por exemplo, MDCK, ATCC CCL 34), células de fígado de rato búfalo (por exemplo, BRL 3A, ATCC CRL 1442), células de pulmão humano (por exemplo, W138, ATCC CCL 75), células de fígado humano (por exemplo, Hep G2, HB 8065), tumor mamário de camundongo (por exemplo, MMT 060562, ATCC CCL51), células TRI, células MRC 5, células
FS4, linhagem de hepatoma humano (por exemplo, Hep G2), linhagens celulares de mieloma (por exemplo, Y0, NS0 e Sp2/0). Em certas modalidades,
as células são células CHO.
Exemplos não limitantes adicionais de células hospedeiras CHO incluem células CHO K1SV, células CHO DG44, células
CHO DUKXB-11, células CHOK1S e células CHO K1M.
Em certas modalidades, somente um alelo do gene PKM é modificado em uma célula da presente divulgação.
Em certas modalidades, ambos os alelos do gene PKM são modificados.
Em certas modalidades, uma célula da presente divulgação compreende pelo menos um alelo do gene PKM que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 39-41,
ou compreende as sequências de nucleotídeos estabelecidas nas SEQ ID
NOs: 37 e 38 (vide Figura 4C). Por exemplo, mas não a título de limitação, uma célula da presente divulgação compreende um alelo de um gene PKM que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 39-41, ou compreende as sequências de nucleotídeos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 37 e 38. Em certas modalidades, uma célula da presente divulgação compreende pelo menos um alelo do gene PKM que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 39-41. Em certas modalidades, a célula é uma célula CHO. Exemplos não limitantes da célula tendo atividade lactogênica reduzida ou eliminada incluem HET-3, HET-18, KO-2 e KO-15, divulgados no presente documento.
[000104] Em certas modalidades, a expressão de um polipeptídeo PKM (por exemplo, PKM-1 e/ou PKM-2) é silenciada (knock out), o que resulta na eliminação da atividade lactogênica da célula em comparação a uma célula de referência. Em certas modalidades, a expressão de um polipeptídeo PKM sofre knock down na célula, o que resulta na redução da atividade lactogênica da célula em comparação a uma célula de referência. Em certas modalidades, as células de referência são células em que a expressão de um polipeptídeo PKM não é modulada. Em certas modalidades, as células de referência são células que têm pelo menos um alelo PKM do tipo selvagem. Em certas modalidades, as células de referência são células tendo ambos os alelos PKM do tipo selvagem. Em certas modalidades, as células de referência são células CHO WT.
[000105] Em certas modalidades, a atividade lactogênica das células é indicada pela concentração de lactato no meio de cultura de células durante o período de cultura das células. Em certas modalidades, a atividade lactogênica das células é indicada pela concentração de lactato no meio de cultura de células no dia 2, dia 3, dia 4, dia 5, dia 6, dia 7, dia 8, dia 9, dia 10, dia 11, dia 12, dia 13, dia 14, dia 15, dia 16, dia 17, dia 18, dia 19, dia 20, dia 25, dia 30, dia 35, dia 40, dia 45, dia 50, dia 55, dia 60, dia 65, dia 70 ou dia 80 do período de cultura. Em certas modalidades, a atividade lactogênica das células é indicada pela concentração de lactato no meio de cultura de células mais de 80 dias após o início da cultura. Em certas modalidades, a atividade lactogênica das células divulgadas no presente documento é indicada pela concentração de lactato no meio de cultura de células durante a fase de produção, por exemplo, no dia 2, dia 3, dia 4, dia 5, dia 6, dia 7, dia 8, dia 9, dia 10, dia 11, dia 12, dia 13, dia 14, dia 15, dia 16, dia 17, dia 18, dia 19 ou dia 20 da fase de produção de um processo de cultura de células. Em certas modalidades, a concentração de lactato é determinada no dia 6, dia 7, dia 10, dia 11, dia 14 e/ou dia 15 da fase de produção. Em certas modalidades, a concentração de lactato é determinada no dia 7, dia 10 e/ou dia 14 da fase de produção.
[000106] Quaisquer métodos conhecidos na técnica para medir a atividade lactogênica de uma célula e/ou para medir a produção de lactato por células em cultura podem ser usados com o assunto divulgado neste documento. Métodos exemplares não limitantes incluem aqueles divulgados em TeSlaa e Teitell, Methods Enzymol (2014) 542:91-114 e em Lehman et al., Med Sci Sports Exerc. (1991) 23(8):935-8, que são incorporados no presente documento para referência em sua totalidade. Por exemplo, mas não como limitação, tais técnicas incluem o uso de kits comerciais de lactato extracelulares, uso de um bioanalisador extracelular, medição da taxa de acidificação extracelular (ECAR), por exemplo, usando um analisador Seahorse XF, medição da atividade de enzimas glicolíticas limitantes da taxa e medição da produção de lactato por uso de traçadores.
[000107] Em certas modalidades, a atividade lactogênica das células tendo atividade lactogênica reduzida (por exemplo, por causa da modulação do gene PKM nas células para silenciar (knock out) ou aplicar knock down num polipeptídeo PKM) é de cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 60%, cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2% ou cerca de 1% da atividade lactogênica de uma célula de referência. Em certas modalidades, a atividade lactogênica das células tendo atividade lactogênica reduzida (por exemplo, por causa da modulação do gene PKM nas células para silenciar (knock out) ou aplicar knock down num polipeptídeo PKM) é inferior a cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 60%, cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2% ou cerca de 1% da atividade lactogênica da célula de referência. Em certas modalidades, a atividade lactogênica da célula é inferior a cerca de 50% da atividade lactogênica de uma célula de referência, por exemplo, conforme observado no dia 14 ou no dia 15 da fase de produção da cultura de células. Em certas modalidades, a atividade lactogênica da célula é inferior a cerca de 20% da atividade lactogênica de uma célula de referência, por exemplo, conforme observado no dia 14 ou no dia 15 da fase de produção da cultura de células. Em certas modalidades, a atividade lactogênica da célula é inferior a cerca de 10% da atividade lactogênica de uma célula de referência, por exemplo, conforme observado no dia 14 ou no dia 15 da fase de produção da cultura de células. Em certas modalidades, a célula de referência é uma célula que compreende pelo menos um ou ambos os alelos do tipo selvagem do gene PKM.
[000108] Em certas modalidades, a concentração de lactato no meio de cultura de células produzida pelas células da presente divulgação é inferior a cerca de 15 g/L, inferior a cerca de 14 g/L, inferior a cerca de 13 g/L, inferior a cerca de 12 g/L L, inferior a cerca de 101 g/L, inferior a cerca de 10 g/L, inferior a cerca de 9 g/L, inferior a cerca de 8 g/L, inferior a cerca de 7 g/L, inferior a cerca de 6 g/L, inferior a cerca de 5 g/L, inferior a cerca de 4 g/L, inferior a cerca de 3 g/L, inferior a cerca de 2 g/L, inferior a cerca de 1 g/L ou inferior a cerca de 0,5 g/L, por exemplo, na fase de produção da cultura de células (por exemplo, no dia 2, dia 3, dia 4, dia 5, dia 6, dia 7, dia 8, dia 9, dia 10, dia 11, dia 12, dia 13, dia 14, dia 15, dia 16, dia 17, dia 18, dia 19 ou dia 20 da fase de produção). Em certas modalidades, a concentração de lactato no meio de cultura de células produzida pelas células da presente divulgação é inferior a cerca de 5 g/L, menos que cerca de 2 g/L ou menos que cerca de 1 g/L. Em certas modalidades, a concentração de lactato no meio de cultura de células produzida pelas células da presente divulgação é inferior a cerca de 5 g/L, menos que cerca de 2 g/L ou menos que cerca de 1 g/L no dia 7, dia 10, dia 14 ou dia 15 da fase de produção da cultura de células. Em certas modalidades, a concentração de lactato no meio de cultura de células produzida pelas células da presente divulgação é inferior a cerca de 1 g/L, ou menos que cerca de 2 g/L durante a fase de produção de uma cultura em frasco de agitação. Em certas modalidades, a concentração de lactato no meio de cultura de células produzida pelas células da presente divulgação é inferior a cerca de 2 g/L durante a fase de produção de uma cultura de células em um biorreator.
[000109] Em certas modalidades, as células tendo atividade lactogênica reduzida ou eliminada conforme divulgado neste documento (por exemplo, células geradas por noucate ou nocaute negativo da expressão de um polipeptídeo PKM) têm grau comparável e/ou produtividade específica conforme células tendo atividade lactogênica regular (por exemplo, células do tipo selvagem). Em certas modalidades, a diferença no grau e/ou produtividade específica entre as células tendo atividade lactogênica reduzida ou eliminada e as células tendo atividade lactogênica regular é inferior a cerca de 1%, inferior a cerca de 5%, inferior a cerca de 10%, inferior a cerca de 15%, inferior a cerca de 20%, inferior a cerca de 25% ou inferior a cerca de 30% das células tendo atividade lactogênica regular (por exemplo, uma célula de referência). Em certas modalidades, as células tendo atividade lactogênica reduzida ou eliminada têm maior grau e/ou produtividade específica do que as células tendo atividade lactogênica regular. Em certas modalidades, o grau das células tendo atividade lactogênica reduzida ou eliminada é de cerca de 1%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45% ou cerca de 50% mais alto do que o grau das células tendo atividade lactogênica regular. Em certas modalidades, o grau das células tendo atividade lactogênica reduzida ou eliminada é mais que cerca de 50% mais alto do que o grau da célula tendo atividade lactogênica regular. Em certas modalidades, a produtividade específica (Qp) das células tendo atividade lactogênica reduzida ou eliminada é de cerca de 1%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85% ou cerca de 90% mais alta do que a produtividade específica das células tendo atividade lactogênica regular. Em certas modalidades, a produtividade específica da célula tendo atividade lactogênica reduzida ou eliminada é mais que cerca de 90% mais alta do que a produtividade específica da célula tendo atividade lactogênica regular.
[000110] A concentração de lactato no meio de cultura de células pode ser medida por um analisador químico ou um kit de ensaio de lactato.
Exemplos não limitantes de analisador químico incluem Bioprofile 400 (Nova Biomedical), Analisador Piccolo Xpress Chemistry, Analisador Químico Excel - Semiautomático, Sistema Químico Clínico e de Especialidade Indiko e Sistema Químico Clínico Axcel® ACE. Exemplos não limitantes de kit de ensaio de lactato incluem Kit de Ensaio de L-Lactato (Colorimétrico) (ab65331, Abeam), Kit de Ensaio de Lactato Colorimétrico/Fluorométrico da BioVision, Kit de Ensaio de Lactato Fluorométrico PicoProbe™, Kit de Ensaio de Lactato
Colorimétrico II, Kits de Ensaio de Lactato Celular da Biolabs.
[000111] Em certas modalidades, as células divulgadas no presente documento expressam um produto de interesse. Em certas modalidades, o produto de interesse é uma proteína recombinante. Em certas modalidades, o produto de interesse é um anticorpo monoclonal. Exemplos adicionais não limitantes de produtos de interesse são fornecidos na Seção 5.5.
Em certas modalidades, as células divulgadas neste documento podem ser usadas para a produção de quantidades comercialmente úteis do produto de interesse.
[000112] Em certas modalidades, as células divulgadas no presente documento podem compreender um ácido nucleico que codifica um produto de interesse. Em certas modalidades, o ácido nucleico pode estar presente em um ou mais vetores, por exemplo, vetores de expressão. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que refere-se a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais) são integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, portanto, são replicados junto com o genoma hospedeiro. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais eles estão operativamente ligados. Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos (vetores). Exemplos não limitantes adicionais de vetores de expressão para uso na presente divulgação incluem vetores virais (por exemplo, retrovírus de replicação defeituosa, adenovírus e vírus adeno-associados) que servem a funções equivalentes.
[000113] Em certas modalidades, o ácido nucleico que codifica um produto de interesse pode ser introduzido em uma célula hospedeira, divulgada no presente documento. Em certas modalidades, a introdução de um ácido nucleico em uma célula pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a, transfecção, eletroporação, microinjeção, infecção com um vetor viral ou bacteriófago contendo as sequências de ácido nucleico, fusão celular, transferência de genes mediada por cromossomos, transferência de genes mediada por microcélulas, fusão de esferoplastos, etc. Em certas modalidades, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfóide (por exemplo, célula Y0, NS0, Sp20).
[000114] Em certas modalidades, o ácido nucleico que codifica um produto de interesse pode ser integrado aleatoriamente no genoma de uma célula hospedeira ("Integração Aleatória" ou "RI"). Por exemplo, mas não como limitação, um ácido nucleico que codifica um produto de interesse pode ser integrado aleatoriamente no genoma de uma célula que foi modulada para ter silenciada (knock out) ou em knock down a expressão de um polipeptídeo PKM, por exemplo, PKM- 1.
[000115] Em certas modalidades, o ácido nucleico que codifica um produto de interesse pode ser integrado no genoma de uma célula hospedeira de uma maneira direcionada ("Integração direcionada" ou "TI"). Por exemplo, mas não a título de limitação, um ácido nucleico que codifica um produto de interesse pode ser integrado no genoma de uma célula que foi modulada para ter silenciada (knock out) ou em knock down a expressão de um polipeptídeo PKM, por exemplo, PKM-1, de maneira direcionada. Um "local de integração" compreende uma sequência de ácido nucleico dentro do genoma de uma célula hospedeira na qual uma sequência de nucleotídeo exógena é inserida.
Em certas modalidades, um local de integração está entre dois nucleotídeos adjacentes no genoma da célula hospedeira. Em certas modalidades, um local de integração inclui um trecho de sequências de nucleotídeos. Em certas modalidades, o local de integração está localizado dentro de um locus específico do genoma da célula hospedeira TI. Em certas modalidades, o local de integração está dentro de um gene endógeno da célula hospedeira TI.
Qualquer local de integração conhecido na técnica pode ser regulado e usado com o assunto divulgado neste documento. A integração direcionada pode ser mediada por métodos e sistemas conhecidos na técnica. Por exemplo, mas não a título de limitação, os métodos e sistemas divulgados no Pedido Internacional de nº PCT/US18/067070, depositado em 21 de dezembro de 2018, cujo conteúdo é incorporado no presente documento inteiramente, podem ser usados para integração direcionada.
[000116] Em certas modalidades, o ácido nucleico que codifica um produto de interesse pode ser integrado no genoma de uma célula hospedeira usando integração baseada em transposase. Técnicas de integração baseadas em transposase são divulgadas, por exemplo, em Trubitsyna et al., Nucleic Acids Res. 45(10):e89 (2017), Li et al., PNAS 110 (25):E2279-E2287 (2013) e WO 2004/009792, que são incorporados neste documento por referência em suas totalidades.
[000117] Em certas modalidades, o ácido nucleico que codifica um produto de interesse pode ser integrado aleatoriamente no genoma de uma célula hospedeira ("Integração Aleatória" ou "RI"). Em certas modalidades, a integração aleatória pode ser mediada por qualquer método ou sistemas conhecidos na técnica. Em certas modalidades, a integração aleatória é mediada pelo sistema de eletroporação MaxCyte STX®.
[000118] Em certas modalidades, a integração direcionada pode ser combinada com a integração aleatória. Em certas modalidades, a integração direcionada pode ser seguida por integração aleatória. Em certas modalidades, a integração aleatória pode ser seguida pela integração direcionada. Por exemplo, mas não como limitação, um ácido nucleico que codifica um produto de interesse pode ser integrado aleatoriamente no genoma de uma célula que foi modulada para ter silenciada (knock out) ou em knock down a expressão de um polipeptídeo PKM, por exemplo, PKM- 1, e um ácido nucleico que codifica o mesmo produto de interesse pode ser integrado no genoma da célula de uma maneira direcionada.
[000119] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula hospedeira RI. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula hospedeira TI.
5.4 MÉTODOS DE CULTURA DE CÉLULAS
[000120] Em um aspecto, a presente divulgação fornece um método para produzir um produto de interesse, compreendendo cultivar uma célula divulgada neste documento. As condições de cultura adequadas para células de mamífero conhecidas na técnica podem ser usadas para cultivar as células deste documento (J. Immunol. Methods (1983) 56:221-234) ou podem ser facilmente determinadas pelo técnico no assunto (vide, por exemplo, Animal Cell Culture: A Practical Approach, 2ª Ed., Rickwood, D. e Hames, BD, eds. Oxford University Press, New York (1992)).
[000121] A cultura de células de mamífero pode ser preparada em um meio adequado para a célula particular sendo cultivada. Os meios comercialmente disponíveis, tais como Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma) são soluções nutritivas exemplares. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham e Wallace, (1979) Meth. Enz., 58:44; Barnes e Sato, (1980) Anal. Biochem., 102:255; Patentes dos EUA de nº
4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 5.122.469 ou 4.560.655; Publicações
Internacionais de nº WO 90/03430; e WO 87/00195; as divulgações de todas as quais são incorporadas no presente documento por referência, podem ser usadas como meios de cultura. Qualquer um desses meios pode ser suplementado, conforme necessário, com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleosídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como gentamicina (gentamicina), oligoelementos (definidos como compostos inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar), lipídeos (tais como linoléico ou outros ácidos graxos) e seus transportadores adequados, e glicose ou uma fonte de energia equivalente.
Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidas pelos técnicos no assunto.
[000122] Em certas modalidades, a célula de mamífero que foi modificada para reduzir e/ou eliminar a expressão de um polipeptídeo PKM é uma célula CHO. Qualquer meio adequado pode ser usado para cultivar a célula CHO. Em certas modalidades, um meio adequado para cultivar a célula CHO pode conter um componente de meio basal, tal como uma formulação baseada em DMEM/HAM F-12 (para composição do meio DMEM e HAM F12, vide as formulações de meio de cultura em American Type Culture Collection Catalog of Cell Lines and Hybridomas, 6ª Edição, 1988, páginas 346-349) (a formulação do meio como descrito na Patente dos EUA de nº 5.122.469 é particularmente apropriada) com concentrações modificadas de alguns componentes, tais como aminoácidos, sais, açúcar e vitaminas, e opcionalmente contendo glicina, hipoxantina e timidina; insulina humana recombinante, peptona hidrolisada, tal como Primatone HS ou Primatone RL (Sheffield, Inglaterra), ou o equivalente; um agente de proteção celular, tal como Pluronic F68 ou o poliol plurônico equivalente; gentamicina; e oligoelementos.
[000123] Em certas modalidades, a célula de mamífero que foi modificada para reduzir e/ou eliminar a expressão de um polipeptídeo PKM é uma célula que expressa uma proteína recombinante. A proteína recombinante pode ser produzida cultivando células que expressam os produtos de interesse sob uma variedade de condições de cultura de células. Por exemplo, os procedimentos de cultura de células para a produção em grande ou pequena escala de proteínas são potencialmente úteis dentro do contexto da presente divulgação. Procedimentos incluindo, mas não se limitando a, um biorreator de leito fluidizado, biorreator de fibra oca, cultura em garrafa de rolo, cultura em frasco de agitação ou sistema de biorreator tipo tanque agitado podem ser usados, nos últimos dois sistemas, com ou sem microtransportadores, e operados alternativamente em um lote, lote alimentado ou modo contínuo.
[000124] Em certas modalidades, a cultura de células da presente divulgação é realizada em um sistema de biorreator tipo tanque agitado e um procedimento de cultura em lote alimentado é empregado. Na cultura em lote alimentado, as células hospedeiras de mamífero e o meio de cultura são fornecidos a um recipiente de cultura inicialmente e nutrientes de cultura adicionais são alimentados, continuamente ou em incrementos discretos, à cultura durante a cultura, com ou sem célula periódica e/ou colheita de produto antes término da cultura. A cultura em lote alimentado pode incluir, por exemplo, uma cultura em lote alimentado semicontínua, em que periodicamente toda a cultura (incluindo células e meio) é removida e substituída por meio fresco. A cultura em lote alimentado é distinta da cultura em lote simples, na qual todos os componentes para cultura de células (incluindo as células e todos os nutrientes da cultura) são fornecidos ao recipiente de cultura no início do processo de cultura. A cultura em lote alimentado pode ser ainda mais diferenciada da cultura de perfusão, na medida em que o sobrenadante não é removido do recipiente de cultura durante o processo (na cultura de perfusão, as células são restringidas na cultura por, por exemplo, filtração, encapsulamento, ancoragem a microtransportadores, etc. e o meio de cultura é continuamente ou intermitentemente introduzido e removido do recipiente de cultura).
[000125] Em certas modalidades, as células da cultura podem ser propagadas de acordo com qualquer esquema ou rotina que pode ser adequado para a célula hospedeira específica e o plano de produção específico contemplado. Portanto, a presente divulgação contempla um procedimento de cultura de única etapa ou de múltiplas etapas. Em uma cultura de única etapa, as células hospedeiras são inoculadas em um ambiente de cultura e os processos da presente divulgação são empregados durante uma única fase de produção da cultura de células. Alternativamente, uma cultura de múltiplas etapas é considerada. Na cultura de múltiplas etapas, as células podem ser cultivadas em várias etapas ou fases. Por exemplo, as células podem ser cultivadas em uma primeira etapa ou cultura em fase de crescimento em que as células, possivelmente removidas do armazenamento, são inoculadas em um meio adequado para promover o crescimento e alta viabilidade. As células podem ser mantidas na fase de crescimento por um período de tempo adequado pela adição de meio fresco à cultura de células hospedeiras.
[000126] Em certas modalidades, as condições do lote alimentado ou da cultura de células contínua são concebidas para aperfeiçoar o crescimento das células de mamífero na fase de crescimento da cultura de células. Na fase de crescimento, as células são cultivadas sob condições e por um período de tempo que é maximizado para o crescimento. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, oxigênio dissolvido (dO2) e similares, são aquelas usadas com o hospedeiro particular e serão evidentes para o técnico no assunto. Geralmente, o pH é ajustado para um nível entre cerca de 6,5 e 7,5, usando um ácido (por exemplo, CO2) ou uma base (por exemplo, Na2CO3 ou NaOH). Uma faixa de temperatura adequada para a cultura de células de mamífero, tais como células CHO, é entre cerca de 30°C a 38°C e um adequado dO2 está entre 5 a 90% da saturação do ar.
[000127] Em um estágio particular, as células podem ser usadas para inocular uma fase de produção ou etapa da cultura de células.
Alternativamente, conforme descrito acima, a fase ou etapa de produção pode ser contínua com a inoculação ou fase ou etapa de crescimento.
[000128] Em certas modalidades, os métodos de cultura descritos na presente divulgação podem incluir ainda a colheita do produto da cultura de células, por exemplo, da fase de produção da cultura de células. Em certas modalidades, o produto produzido pelos métodos de cultura de células da presente divulgação pode ser colhido a partir do terceiro biorreator, por exemplo, biorreator de produção. Por exemplo, mas não a título de limitação, os métodos divulgados podem incluir a colheita do produto na conclusão da fase de produção da cultura de células. Alternativamente ou adicionalmente, o produto pode ser colhido antes da conclusão da fase de produção. Em certas modalidades, o produto pode ser colhido a partir da cultura de células, uma vez que uma densidade celular particular foi alcançada. Por exemplo, mas não como limitação, a densidade celular pode ser de cerca de 2,0 x 107 células/mL a cerca de 5,0 x 107 células/mL antes da colheita.
[000129] Em certas modalidades, a colheita do produto da cultura de células pode incluir um ou mais dentre centrifugação, filtração, separação de ondas acústicas, floculação e tecnologias de remoção de células.
[000130] Em certas modalidades, o produto de interesse pode ser segregado das células hospedeiras ou pode ser uma proteína ligada à membrana, citosólica ou nuclear. Em certas modalidades, as formas solúveis do polipeptídeo podem ser purificadas a partir do meio de cultura de células condicionado e as formas ligadas à membrana do polipeptídeo podem ser purificadas preparando uma fração da membrana total das células que expressam e extraindo as membranas com um detergente não iônico, tal como TRITON® X-100 (EMD Biosciences, San Diego, Califórnia). Em certas modalidades, as proteínas citosólicas ou nucleares podem ser preparadas por lise das células hospedeiras (por exemplo, por força mecânica, sonicação e/ou detergente), removendo a fração da membrana celular por centrifugação e retendo o sobrenadante.
5.5 PRODUTOS
[000131] As células e/ou métodos da presente divulgação podem ser usados para produzir qualquer produto de interesse que pode ser expresso pelas células divulgadas aqui. Em certas modalidades, as células e/ou métodos da presente divulgação podem ser usados para a produção de polipeptídeos, por exemplo, polipeptídeos de mamíferos. Exemplos não limitantes de tais polipeptídeos incluem hormônios, receptores, proteínas de fusão, fatores reguladores, fatores de crescimento, fatores do sistema de complemento, enzimas, fatores de coagulação, fatores anticoagulação, quinases, citocinas, proteínas CD, interleucinas, proteínas terapêuticas, proteínas de diagnóstico e anticorpos. As células e/ou métodos da presente divulgação não são específicos para a molécula, por exemplo, anticorpo, que está sendo produzida.
[000132] Em certas modalidades, os métodos da presente divulgação podem ser usados para a produção de anticorpos, incluindo anticorpos terapêuticos e de diagnóstico ou fragmentos de ligação ao antígeno destes. Em certas modalidades, o anticorpo produzido pela célula e os métodos da presente divulgação podem ser, mas não estão limitados a, anticorpos monoespecíficos (por exemplo, anticorpos que consistem em uma sequência de cadeia única pesada e uma sequência de cadeia única leve, incluindo multímeros de tais pares), anticorpos multiespecíficos e fragmentos de ligação ao antígeno destes. Por exemplo, mas não como limitação, o anticorpo multiespecífico pode ser um anticorpo biespecífico, um anticorpo biepitópico, um anticorpo biespecífico dependente de células T (TDB), um FAb de dupla ação (DAF) ou fragmentos de ligação ao antígeno destes.
5.5.1 ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS
[000133] Em certos aspectos, um anticorpo produzido por células e métodos fornecidos no presente documento é um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. “Anticorpos multiespecíficos” são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois locais diferentes, ou seja, diferentes epítopos em diferentes antígenos (ou seja, biespecífico) ou diferentes epítopos no mesmo antígeno (ou seja, biepitópico). Em certos aspectos, o anticorpo multiespecífico tem três ou mais especificidades de ligação. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos, conforme descrito no presente documento.
[000134] As técnicas para a produção de anticorpos multiespecíficos incluem, mas não estão limitadas a, coexpressão recombinante de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina tendo especificidades diferentes (vide Milstein e Cuello, Nature 305:537 (1983)) e engenharia "knob-in-hole" (vide, por exemplo, Patente dos EUA de nº
5.731.168, e Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)). Os anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos por engenharia de efeitos de direção eletrostática para a produção de moléculas heterodiméricas Fc de anticorpos (vide, por exemplo, WO 2009/089004); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (vide, por exemplo, Patente dos EUA de nº 4.676.980 e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)); uso de zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Kostelny et al., J.
Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) e WO 2011/034605); uso da tecnologia de cadeia leve comum para contornar o problema de pareamento incorreto de cadeia leve (vide, por exemplo, WO 98/50431); uso da tecnologia de “diacorpo” para fazer fragmentos de anticorpo biespecíficos (vide, por exemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); uso de dímeros Fv (sFv) de cadeia simples (vide, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); e preparação de anticorpos triespecíficos como descrito, por exemplo, em Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991).
[000135] Anticorpos projetados com três ou mais locais de ligação ao antígeno, incluindo, por exemplo, "anticorpos de polvo" ou DVD-Ig, também estão incluídos neste documento (vide, por exemplo, WO 2001/77342 e WO 2008/024715). Outros exemplos não limitantes de anticorpos multiespecíficos com três ou mais locais de ligação ao antígeno podem ser encontrados em WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 e WO 2013/026831. O anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo também inclui um "FAb de ação dupla" ou "DAF" (vide, por exemplo, US 2008/0069820 e WO 2015/095539).
[000136] Os anticorpos multiespecíficos também podem ser fornecidos em uma forma assimétrica com um cruzamento de domínio em um ou mais braços de ligação da mesma especificidade de antígeno, ou seja, trocando os domínios VH/VL (vide, por exemplo, WO 2009/080252 e WO 2015/150447), os domínios CH1/CL (vide, por exemplo, WO 2009/080253) ou os braços Fab completos (vide, por exemplo, WO 2009/080251, WO 2016/016299, vide também Schaefer et al., PNAS, 108 (2011) 1187-1191, e Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20). Em certas modalidades, o anticorpo multiespecífico compreende um fragmento Fab cruzado. O termo “fragmento Fab cruzado” ou “fragmento xFab” ou “fragmento Fab de cruzamento” refere-se a um fragmento Fab, em que as regiões variáveis ou as regiões constantes de cadeia pesada e leve são trocadas. Um fragmento Fab cruzado compreende uma cadeia de polipeptídeo composta pela região variável de cadeia leve (VL) e a região constante de cadeia pesada 1 (CH1), e uma cadeia de polipeptídeo composta pela região variável de cadeia pesada (VH) e a região constante de cadeia leve (CL). Braços Fab assimétricos também podem ser projetados pela introdução de mutações de aminoácidos carregados ou não carregados em interfaces de domínio para direcionar o emparelhamento de Fab correto. Vide, por exemplo, WO 2016/172485.
[000137] Vários outros formatos moleculares para anticorpos multiespecíficos são conhecidos na técnica e estão incluídos neste documento (vide, por exemplo, Spiess et al., Mol. Immunol. 67 (2015) 95-106).
[000138] Em certas modalidades, o tipo particular de anticorpos multiespecíficos, também incluídos no presente documento, são anticorpos biespecíficos projetados para se ligarem simultaneamente a um antígeno de superfície em uma célula alvo, por exemplo, uma célula tumoral, e a um componente invariante de ativação do complexo do receptor de célula T (TCR), tal como o CD3, para redirecionamento de células T para matar células alvo.
[000139] Exemplos adicionais não limitantes de formatos de anticorpos biespecíficos que podem ser úteis para esta finalidade incluem, mas não estão limitados a, as chamadas moléculas "BiTE" (engajador de células T biespecífico), em que duas moléculas de scFv são fundidas por um ligante flexível (vide, por exemplo, WO 2004/106381, WO 2005/061547, WO 2007/042261 e WO 2008/119567, Nagorsen e Bäuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)); diacorpos (Holliger et al., Prot. Eng. 9, 299-305 (1996)) e derivados dos mesmos, tais como diacorpos em tandem ("TandAb"; Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-56 (1999)); moléculas "DART" (redefinição de afinidade dupla), que são baseadas no formato de diacorpo, mas apresentam uma ponte dissulfeto do C-terminal para estabilização adicional (Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)), e os chamados triomabs, que são moléculas de IgG de camundongo/rato híbridas inteiras (revisado em Seimetz et al., Cancer Treat. Rev. 36, 458-467 (2010)). Formatos de anticorpos biespecíficos de células T particulares incluídos neste documento são descritos em WO 2013/026833, WO 2013/026839, WO 2016/020309; Bacac et al., Oncoimmunology 5(8) (2016) el203498.
5.5.2 FRAGMENTOS DE ANTICORPO
[000140] Em certos aspectos, um anticorpo produzido pelas células e métodos fornecidos no presente documento é um fragmento de anticorpo.
Por exemplo, mas não como limitação, o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab, Fab', Fab'-SH ou F(ab')2, em particular um fragmento Fab. A digestão de anticorpos intactos com papaína produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", contendo cada um os domínios variáveis de cadeia pesada e leve (VH e VL, respectivamente) e também o domínio constante de cadeia leve (CL) e o primeiro domínio constante de cadeia pesada (CH1). O termo "fragmento Fab", portanto, refere- se a um fragmento de anticorpo compreendendo uma cadeia leve compreendendo um domínio VL e um domínio CL, e um fragmento de cadeia pesada compreendendo um domínio VH e um domínio CH1. Os fragmentos Fab’ diferem dos fragmentos Fab pela adição de resíduos no terminal carboxila do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH são fragmentos Fab’ em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contêm um grupo tiol livre. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que tem dois locais de ligação ao antígeno (dois fragmentos Fab) e uma parte da região Fc. Para a discussão de fragmentos Fab e F(ab’)2 compreendendo resíduos de epítopo de ligação ao receptor de salvamento e tendo um aumento na meia vida in vivo,
vide Patente dos EUA de nº 5.869.046.
[000141] Em certas modalidades, o fragmento de anticorpo é um diacorpo, um triacorpo ou um tetracorpo. Os "diacorpos" são fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Vide, por exemplo, EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
[000142] Em um aspecto adicional, o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab de cadeia única. Um “fragmento Fab de cadeia simples” ou “scFab” é um polipeptídeo que consiste em um domínio variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo, um domínio constante 1 (CH1) do anticorpo, um domínio variável de cadeia leve (VL) do anticorpo, um domínio constante de cadeia leve (CL) do anticorpo e um ligante, em que os referidos domínios do anticorpo e o referido ligante têm uma das seguintes ordens na direção do N- terminal N para o C-terminal: a) VH-CH1-ligante-VL-CL, b) VL-CL-ligante-VH- CH1, c) VH-CL-ligante-VL-CH1 ou d) VL-CH1-ligante-VH-CL. Em particular, o referido ligante é um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos, de preferência entre 32 e 50 aminoácidos. Os referidos fragmentos Fab de cadeia única são estabilizados por meio da ligação dissulfureto natural entre o domínio CL e o domínio CH1. Adicionalmente, essas moléculas Fab de cadeia única podem ser ainda estabilizadas pela geração de ligações dissulfureto de intercadeia através da inserção de resíduos de cisteína (por exemplo, posição 44 na cadeia pesada variável e posição 100 na cadeia leve variável de acordo com a numeração de Kabat).
[000143] Em outro aspecto, o fragmento de anticorpo é um fragmento variável de cadeia única (scFv). Um "fragmento variável de cadeia única" ou "scFv" é uma proteína de fusão dos domínios variáveis de cadeias pesada (VH) e leve (VL) de um anticorpo, conectada por um ligante. Em particular, o ligante é um polipeptídeo curto de 10 a 25 aminoácidos e geralmente é rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou treonina para solubilidade, e pode conectar o N-terminal do VH com o C-terminal do VL, ou vice-versa. Esta proteína retém a especificidade do anticorpo original, apesar da remoção das regiões constantes e da introdução do ligante. Para uma revisão dos fragmentos scFv, vide, por exemplo, Pluckthün, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., (Springer-Verlag, Nova Iorque), pp. 269-315 (1994); vide também WO 93/16185; e Patentes dos EUA de nº 5.571.894 e 5.587.458.
[000144] Em outro aspecto, o fragmento de anticorpo é um anticorpo de domínio único. Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo toda ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada ou toda ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; vide, por exemplo, Patente dos EUA de nº 6.248.516 B1).
[000145] Os fragmentos de anticorpo podem ser feitos através de várias técnicas, incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto.
5.5.3 ANTICORPOS QUIMÉRICOS E HUMANIZADOS
[000146] Em certos aspectos, um anticorpo produzido pelas células e métodos fornecidos no presente documento é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na Patente dos EUA de nº
4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).
Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em um outro exemplo, um anticorpo quimérico é um anticorpo de “classe alterada”, em que a classe ou a subclasse foi alterada a partir do anticorpo parental. Os anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação ao antígeno destes.
[000147] Em certas modalidades, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Normalmente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para humanos, embora mantendo a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis em que as CDRs (ou porções das mesmas) são derivadas de um anticorpo não humano e as FRs (ou porções das mesmas) são derivadas de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas modalidades, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de CDR são derivados), por exemplo, para restaurar ou aprimorar a especificidade ou a afinidade do anticorpo.
[000148] Anticorpos humanizados e métodos para produzi-los são revisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, REont. Biosci. 13:1619-1633 (2008), e são descritos adicionalmente, por exemplo, em Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989); Patentes dos EUA de nº 5.821.337, 7.527.791,
6.982.321 e 7.087.409; Kashmiri et al., Methods, 36:25-34 (2005) (descrevendo enxerto da região determinante de especificidade (SDR)); Padlan, Mol.
Immunol., 28:489-498 (1991) (descrevendo "ressurgimento"); Dall'Acqua et al., Methods, 36:43-60 (2005) (descrevendo "embaralhamento de FR"); e Osbourn et al., Methods, 36:61-68 (2005) e Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260
(2000) (descrevendo a abordagem de “seleção guiada” para embaralhamento de FR).
[000149] As regiões estruturais humanas que podem ser usadas para humanização incluem, mas não estão limitadas a: regiões estruturais selecionadas usando o método de “melhor ajuste” (vide, por exemplo, Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)); regiões estruturais derivadas da sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo particular de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (vide, por exemplo, Carter et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); e Presta et. al., J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiões estruturais maduras (mutadas somaticamente) humanas ou regiões estruturais da linhagem germinativa humana (vide, por exemplo, Almagro e Fransson, Front. Biosci., 13:1619-1633 (2008)); e regiões estruturais derivadas da triagem de bibliotecas de FR (vide, por exemplo, Baca et al., J. Biol. Chem., 272:10678-10684 (1997) e Rosok et al., J. Biol. Chem., 271:22611-22618 (1996)).
5.5.4 ANTICORPOS HUMANOS
[000150] Em certos aspectos, um anticorpo produzido pelas células e métodos fornecidos no presente documento é um anticorpo humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica. Os anticorpos humanos são descritos geralmente em van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001) e Lonberg, Curr. Opin.
Immunol. 20: 450-459 (2008).
[000151] Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração de um imunógeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico. Tais animais normalmente contêm toda ou uma porção dos loci de imunoglobulina humana, que substituem os loci endógenos de imunoglobulina, ou que estão presentes de forma extracromossal ou integrados aleatoriamente nos cromossomas do animal. Em tais camundongos transgênicos, os loci da imunoglobulina endógena geralmente foram inativados. Para uma revisão de métodos para obter anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, vide Lonberg, Nat.
Biotech. 23:1117-1125 (2005). Vide também, por exemplo, as patentes dos EUA de nº 6.075.181 e 6.150.584, que descrevem a tecnologia XENOMOUSE™; patente dos EUA de nº 5.770.429, que descreve a tecnologia HUMAB®; Patente dos EUA de nº 7.041.870, que descreve a tecnologia K-M MOUSE® e Publicação de Pedido de Patente dos EUA de nº 2007/0061900, que descreve a tecnologia VELOCIMOUSE®). As regiões variáveis humanas de anticorpos intactos geradas por tais animais podem ser adicionalmente modificadas, por exemplo, pela combinação com uma região constante humana diferente.
[000152] Os anticorpos humanos também podem ser produzidos por métodos à base de hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e de heteromieloma de camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas. (Vide, por exemplo, Kozbor J.
Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)). Anticorpos humanos gerados por meio de tecnologia de hibridoma de células B humanas também são descritos em Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006).
Métodos adicionais incluem aqueles descritos, por exemplo, na Patente dos EUA de nº 7.189.826 (descrevendo a produção de anticorpos IgM humanos monoclonais a partir de linhagens celulares de hibridoma) e em Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (descrevendo hibridomas humano-humano). A tecnologia de hibridoma humano (tecnologia Trioma) é também descrita em Vollmers e Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) e
Vollmers e Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
5.5.5 MOLÉCULAS ALVO
[000153] Exemplos não limitantes de moléculas que podem ser direcionadas por um anticorpo produzido pelas células e métodos divulgados neste documento incluem proteínas de soro solúveis e seus receptores e outras proteínas ligadas à membrana (por exemplo, adesinas). Em certas modalidades, um anticorpo produzido pelas células e métodos divulgados no presente documento é capaz de se ligar a uma, duas ou mais citocinas, proteínas relacionadas a citocinas e receptores de citocinas selecionados a partir do grupo que consiste em 8MPI, 8MP2, 8MP38 (GDFIO), 8MP4, 8MP6, 8MP8, CSFI (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGF1 (αFGF), FGF2 (βFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFN81, IFNG, IFNWI, FEL1, FEL1 (EPSELON), FEL1 (ZETA), IL 1A, IL 1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL 11, IL 12A, IL 12B, IL 13, IL 14, IL 15, IL 16, IL 17, IL 17B, IL 18, IL 19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBb3, LTA (TNF-β), LTB, TNF (TNF-α), TNFSF4 (OX40 ligand), TNFSF5 (ligante CD40), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (ligante CD27), TNFSF8 (ligante CD30), TNFSF9 (ligante 4-1 BB), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (AP03L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, IL1R1, IL1R2, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL 11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP
(leptina), PTN e THPO.k
[000154] Em certas modalidades, um anticorpo produzido por células e métodos divulgados no presente documento é capaz de se ligar a uma quimiocina, receptor de quimiocina ou uma proteína relacionada à quimiocina selecionada a partir do grupo que consiste em CCLI (1-309), CCL2 (MCP -1/MCAF), CCL3 (MIP-Iα), CCL4 (MIP-Iβ), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCL11 (eotaxina), CCL 13 (MCP-4), CCL 15 (MIP-Iδ), CCL 16 (HCC-4), CCL 17 (TARC), CCL 18 (PARC), CCL 19 (MDP-3b), CCL20 (MIP-3α), CCL21 (SLC/exodus-2), CCL22 (MDC/ STC-1), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2 /eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaxina-3), CCL27 (CTACK / ILC), CCL28, CXCLI (GROI), CXCL2 (GR02), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL 10 (IP 10), CXCL 11 (1-TAC), CXCL 12 (SDFI), CXCL 13, CXCL 14, CXCL 16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL 1 (SCYDI), SCYEI, XCLI (linfotactina), XCL2 (SCM-Iβ), BLRI (MDR15), CCBP2 (D6/JAB61), CCRI (CKRI/HM145), CCR2 (mcp-IRB IRA), CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/S TRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBII), CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR- L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L- CCR), XCR1 (GPR5/CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Rα), IL8RB (IL8Rβ), LTB4R (GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5, C5R1, CSF3, GRCC10 (C10), EPO, FY (DARC), GDF5, HDF1, HDF1α, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2 e VHL.
[000155] Em certas modalidades, um anticorpo produzido por métodos divulgados neste documento (por exemplo, um anticorpo multiespecífico, tal como um anticorpo biespecífico) é capaz de se ligar a uma ou mais moléculas alvo selecionadas a partir do seguinte: 0772P (CA125,
MUC16) (ou seja, antígeno de câncer de ovário), ABCF1; ACVR1; ACVR1B;
ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; ADORA2A; Aggrecan; AGR2; AICDA; AIF1; AIG1;
AKAP1; AKAP2; AMH; AMHR2; beta amilóide; ANGPTL; ANGPT2; ANGPTL3;
ANGPTL4; ANPEP; APC; APOC1; AR; ASLG659; ASPHD1 (contendo domínio
1 aspartato beta-hidroxilase; LOC253982); AZGP1 (zinco-α-glicoproteína);
B7.1; B7.2; BAD; BAFF-R (receptor de fator de ativação de células B, receptor
3 de BLyS, BR3; BAG1; BAI1; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRI (MDR15);
BMP1; BMP2; BMP3B (GDF10); BMP4; BMP6; BMP8; BMPR1A; BMPR1B (receptor de proteína morfogenética óssea do tipo I-B); BMPR2; BPAG1
(plectina); BRCA1; Brevican; C19orf10 (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANT1;
CASP1; CASP4; CAV1; CCBP2 (D6/JAB61); CCL1 (1-309); CCL11 (eotaxina);
CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP1δ); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18
(PARC); CCL19 (MIP-3β); CCL2 (MCP-1); MCAF; CCL20 (MIP-3α); CCL21
(MTP-2); SLC; exodus-2; CCL22 (MDC/STC-1); CCL23 (MPIF-1); CCL24
(MPIF-2/eotaxina-2); CCL25 (TECK); CCL26 (eotaxina-3); CCL27
(CTACK/ILC); CCL28; CCL3 (MTP-Iα); CCL4 (MDP-Iβ); CCL5(RANTES); CCL7
(MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2; CCR1
(CKRI/HM145); CCR2 (mcp-IRβ/RA);CCR3 (CKR/CMKBR3); CCR4; CCR5
(CMKBR5/ChemR13); CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/ DRY6); CCR7
(CKBR7/EBI1); CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1); CCR9 (GPR-9-6); CCRL1
(VSHK1); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD20; CD200; CD22
(Isoforma CD22-B do receptor de células B); CD24; CD28; CD3; CD37; CD38;
CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69;
CD72; CD74; CD79A (CD79α, alfa associada a imunoglobulina, uma proteína específica de células B); CD79B; CDS; CD80; CD81; CD83; CD86; CDH1 (E-
caderina); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7;
CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A
(p21/WAF1/Cip1); CDKN1B (p27/Kip1); CDKN1C; CDKN2A (P16INK4a);
CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB; Chitinase;
CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7;
CKLFSF8; CLDN3;CLDN7 (claudina-7); CLL-1 (CLEC12A, MICL, e DCAL2);
CLN3; CLU (clusterina); CMKLR1; CMKOR1 (RDC1); CNR1; COL 18A1;
COL1A1; COL4A3; COL6A1; fator complementar D; CR2; CRP; CRIPTO (CR,
CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma); CSFI (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA4;
CTNNB1 (b-catenina); CTSB (catepsina B); CX3CL1 (SCYDI); CX3CR1 (V28); CXCL1 (GRO1); CXCL10 (IP-10); CXCL11 (I-TAC/IP-9); CXCL12 (SDF1);
CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-
78/LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4;
CXCR5 (receptor 1 de linfoma de Burkitt, um receptor acoplado à proteína G);
CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB2IP; DES;
DKFZp451J0118; DNCLI; DPP4; E16 (LAT1, SLC7A5); E2F1; ECGF1; EDG1;
EFNA1; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3;
EPHB4; EphB2R; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; ETBR
(receptor de endotelina do tipo B); F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A;
FCER2; FCGR3A; FcRH1 (proteína 1 semelhante ao receptor Fc); FcRH2
(IFGP4, IRTA4, SPAP1A (domínio SH2 contendo proteína âncora de fosfatase
1a), SPAP1B, SPAP1C); FGF; FGF1 (αFGF); FGF10; FGF11; FGF12;
FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF);
FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-
2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR; FGFR3; FIGF (VEGFD); FEL1
(EPSILON); FIL1 (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRTI (fibronectina); FLT1;
FOS; FOSL1 (FRA-1); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEB1; GAGEC1;
GALNAC4S-6ST; GAT A3; GDF5; GDNF-Ra1 (receptor alfa 1 da família GDNF;
GFRA1; GDNFR; GDNFRA; RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-alfa1; GFR-
ALFA-1); GEDA; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNASI; GNRHI; GPR2 (CCR10);
GPR19 (receptor 19 acoplado à proteína G; Mm.4787); GPR31; GPR44;
GPR54 (receptor de KISS1; KISS1R; GPR54; HOT7T175; AXOR12); GPR81
(FKSG80); GPR172A (receptor 172A acoplado à proteína G; GPCR41;
FLJ11856; D15Ertd747e);GRCCIO (CIO); GRP; GSN (Gelsolin); GSTP1;
HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIF1A; HOP1; histamina e receptores de histamina; HLA-A; HLA-DOB (subunidade beta da molécula
MHC da classe II (antígeno Ia); HLA-DRA; HM74; HMOXI; HUMCYT2A;
ICEBERG; ICOSL; 1D2; IFN-a; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFNgamma; DFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2; IGFBP3;
IGFBP6; IL-1; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B;
IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17;
IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; ILIA; IL1B; ILIF10;
IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1R1; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1;
IL1RAPL2; IL1RL1; IL1RL2, ILIRN; IL2; IL20; IL20Rα; IL21 R; IL22; IL-22c;
IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB;
IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (glicoproteína
130); influenza A; influenza B; EL7; EL7R; EL8; IL8RA; DL8RB; IL8RB; DL9;
DL9R; DLK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAKI; IRTA2 (receptor 2 da superfamília da imunoglobulina associado à translocação); ERAK2; ITGA1;
ITGA2; ITGA3; ITGA6 (integrina a6); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (integrina b4);
heterodímeros das integrinas α4β7 e αEβ7; JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF;
KAI1; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLKIO; KLK12; KLK13; KLK14;
KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (Queratina 19);
KRT2A; KHTHB6 (queratina do tipo H específica para cabelo); LAMAS; LEP
(leptina); LGR5 (receptor 5 acoplado à proteína G contendo repetição rica em leucina; GPR49, GPR67); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-b); LTB;
LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; LY64 (antígeno linfocitário 64 (RP105),
proteína de membrana do tipo I da família de repetição rica em leucina (LRR);
Ly6E (complexo de antígeno linfocitário 6, locus E; Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-l);
Ly6G6D (complexo de antígeno linfocitário 6, locus G6D; Ly6-D, MEGT1);
LY6K (complexo de antígeno linfocitário 6, locus K; LY6K; HSJ001348;
FLJ35226); MACMARCKS; MAG ou OMgp; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MDP;
MIB1; midkine; MEF; MIP-2; MKI67; (Ki-67); MMP2; MMP9; MPF (MPF, MSLN,
SMR, fator de potencialização de megacariócitos, mesotelina); MS4A1;
MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315); MSMB; MT3
(metalotionectina-111); MTSS1; MUC1 (mucina); MYC; MY088; Napi3b (também conhecida como NaPi2b) (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família do transportador de soluto 34 (fosfato de sódio), membro 2, transportador de fosfato dependente de sódio do tipo II 3b); NCA; NCK2; neurocan; NFKB1;
NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66 (Nogo); NgR-p75;
NgR-Troy; NME1 (NM23A); NOX5; NPPB; NR0B1; NR0B2; NR1D1; NR1D2;
NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR112; NR113; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3;
NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1;
NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZI; OPRD1; 0X40; P2RX7;
P2X5 (canal de íons 5 bloqueado por ligante P2X do receptor purinérgico);
PAP; PARTI; PATE; PAWR; PC A3; PCNA; PD-L1; PD-L2; PD-1; POGFA;
POGFB; PEC AMI; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; fosfacano; PIAS2; PIK3CG;
PLAU (uPA); PLG; PLXDC1; PMEL17 (homólogo de prata; SILV; D12S53E;
PMEL17; SI; SIL); PPBP (CXCL7); PPID; PRI; PRKCQ; PRKDI; PRL; PROC;
PROK2; PSAP; PSCA hlg (gene 2700050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12); PTAFR; PTEN; PTGS2
(COX-2); PTN; RAC2 (p21 Rac2); RARB; RET (proto-oncogene RET; MEN2A;
HSCR1; MEN2B; MTC1; PTC; CDHF12; Hs. 168114; RET51; RET-ELE1);
RGSI; RGS13; RGS3; RNF110 (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2
(lipofilina B); SCGB2A1 (mammaglobina2); SCGB2A2 (mammaglobina1);
SCYEI (citocina ativadora de monócitos endoteliais); SDF2; Serna 5b
(FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog,
domínio sema, sete repetições de trombospondina (do tipo 1 e similar ao tipo
1), domínio transmembranar (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina)
5B); SERPINA1; SERPINA3; SERP1NB5 (maspin); SERPINEl(PAI-l);
SERPDMF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPI;
SPRR1B (Sprl); ST6GAL1; STABI; STAT6; STEAP (antígeno epitelial transmembranar seis da próstata); STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1,
STAMP1, STEAP2, STMP, gene 1 associado ao câncer de próstata, proteína 1 associada ao câncer de próstata, antígeno epitelial transmembranar seis da próstata 2, proteína transmembranar seis da próstata); TB4R2; TBX21; TCPIO;
TOGFI; TEK; TENB2 (proteoglicano transmembranar putativo); TGFA; TGFBI;
TGFB1II; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRI; TGFBR2; TGFBR3; THIL; THBSI
(trombospondina-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TMP3; fator de tecido;
TLR1; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TLR10; TMEFF1
(proteína transmembranar com domínios 1 do tipo EGF e dois similares a folistatina; Tomorregulina-1); TMEM46 (homólogo 2 shisa; TNF; TNF-a;
TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFIIA; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21;
TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSF10
(TRAIL); TNFSF11 (TRANCE); TNFSF12 (AP03L); TNFSF13 (April);
TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4
(ligante OX40); TNFSF5 (ligante CD40); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (CD27 ligand); TNFSFS (ligante CD30); TNFSF9 (ligante 4-1 BB); TOLLIP; receptores do tipo Toll; TOP2A (topoisomerase Ea); TP53; TPM1; TPM2; TRADD;
TMEM118 (proteína de dedo RING, transmembrana 2; RNFT2; FLJ14627);
TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM1; TREM2; TrpM4
(BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de cátion potencial de receptor transitório, subfamília M, membro 4); TRPC6; TSLP; TWEAK; Tirosinase (TYR;
OCAIA; OCA1A; tirosinase; SHEP3);VEGF; VEGFB; VEGFC; versicano; VHL C5; VLA-4; XCL1 (linfotactina); XCL2 (SCM-1b); XCRI(GPR5/ CCXCRI); YY1; e ZFPM2.
[000156] Em certas modalidades, um anticorpo produzido pelas células e métodos divulgados neste documento é capaz de se ligar a proteínas CD, tais como CD3, CD4, CD5, CD16, CD19, CD20, CD21 (CR2 (receptor 2 de complemento) ou C3DR (receptor do vírus C3d/Epstein Barr) ou Hs.73792); CD33; CD34; CD64; CD72 (antígeno de diferenciação de células B CD72, Lyb- 2); CD79b (CD79B, CD79P, IGb (beta associado a imunoglobulina), B29); membros CD200 da família do receptor ErbB, tais como o receptor EGF, HER2, HER3 ou receptor HER4; moléculas de adesão celular, tais como LFA- 1, Mac1, pl50.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, integrina alfa4/beta7 e integrina alfav/beta3 incluindo suas subunidades alfa ou beta (por exemplo, anticorpos anti-CD11a, anti-CD18 ou anti-CD11b); fatores de crescimento, tais como VEGF-A, VEGF-C; fator de tecido (TF); interferon alfa (alfaIFN); TNFalfa, uma interleucina, tal como IL-1 beta, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IL 17 AF, IL-1S, IL- 13R alfa1, IL13R alfa2, IL-4R, IL-5R, IL-9R, IgE; antígenos de grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidade (OB); receptor mpl; CTLA- 4; RANKL, RANK, proteína F RSV, proteína C, etc.
[000157] Em certas modalidades, as células e métodos fornecidos aqui podem ser usados para produzir um anticorpo (ou um anticorpo multiespecífico, tal como um anticorpo biespecífico) que se liga especificamente à proteína C5 complementar (por exemplo, um anticorpo agonista anti-C5 que especificamente se liga a C5 humano). Em certas modalidades, o anticorpo anti-C5 compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDRs selecionadas a partir de (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SSYYMA (SEQ ID NO: 1); (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de AIFTGSGAEYKAEWAKG (SEQ ID NO: 26); (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de DAGYDYPTHAMHY (SEQ ID NO: 27); (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de RASQGISSSLA
(SEQ ID NO: 28); (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de GASETES (SEQ ID NO: 29);
e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QNTKVGSSYGNT (SEQ ID NO: 30). Por exemplo, em certas modalidades, o anticorpo anti-05 compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma, duas ou três CDRs selecionadas a partir de: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de (SSYYMA (SEQ ID NO: 1); (b)
uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de AIFTGSGAEYKAEWAKG (SEQ ID NO: 26); (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de DAGYDYPTHAMHY (SEQ ID NO: 27); e/ou uma sequência de domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma, duas ou três CDRs selecionadas a partir de (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de RASQGISSSLA (SEQ ID NO:
28); (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de GASETES (SEQ ID NO: 29); e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de
QNTKVGSSYGNT (SEQ ID NO: 30). As sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada e CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia leve acima são divulgadas em US 2016/0176954 como SEQ ID NO:
117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123 e
SEQ ID NO: 125, respectivamente. (vide as Tabelas 7 e 8 em US
2016/0176954.)
[000158] Em certas modalidades, o anticorpo anti-C5 compreende as sequências de VH e VL QVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTVH
SSYYMAWVRQ APGKGLEWVG AIFTGSGAEY KAEWAKGRVT
ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCASD AGYDYPTHAM HYWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 31) e DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS
SSLAWYQQKP GKAPKLLIYG ASETESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN TKVGSSYGNT FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 32), respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais dessas sequências.
As sequências de VH e VL acima são divulgadas em US 2016/0176954 como SEQ ID NO: 106 e SEQ ID NO: 111, respectivamente. (vide as Tabelas 7 e 8 em US 2016/0176954.) Em certas modalidades, o anticorpo anti-C5 é 305L015 (vide US 2016/0176954).
[000159] Em certas modalidades, um anticorpo produzido por métodos divulgados no presente documento é capaz de se ligar a OX40 (por exemplo, um anticorpo agonista anti-OX40 que se liga especificamente a OX40 humano). Em certas modalidades, o anticorpo anti-OX40 compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDRs selecionadas a partir de (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DSYMS (SEQ ID NO: 2); (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de DMYPDNGDSSYNQKFRE (SEQ ID NO: 3); (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de APRWYFSV (SEQ ID NO: 4); (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 5); (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de YTSRLRS (SEQ ID NO: 6); e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQGHTLPPT (SEQ ID NO: 7). Por exemplo, em certas modalidades, o anticorpo anti-OX40 compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma, duas ou três CDRs selecionadas a partir de: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DSYMS (SEQ ID NO: 2); (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de DMYPDNGDSSYNQKFRE (SEQ ID NO: 3); e (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de APRWYFSV (SEQ ID NO: 4) e/ou uma sequência de domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma, duas ou três CDRs selecionadas a partir de (a) uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 5); (b) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de YTSRLRS (SEQ ID NO: 6); e (c) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQGHTLPPT (SEQ ID NO: 7). Em certas modalidades, o anticorpo anti-OX40 compreende as sequências de VH e VL EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DSYMSWVRQA
PGQGLEWIGD MYPDNGDSSY NQKFRERVTI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCVLAP RWYFSVWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 8) e DIQMTQSPSS
LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GHTLPPTFGQ GTKVEIK (SEQ ID NO: 9), respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais dessas sequências.
[000160] Em certas modalidades, o anticorpo anti-OX40 compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDRs selecionadas a partir de (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1compreendendo a sequência de aminoácidos de NYLIE (SEQ ID NO: 10); (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de VINPGSGDTYYSEKFKG (SEQ ID NO: 11); (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de DRLDY (SEQ ID NO: 12); (d)
uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de HASQDISSYIV (SEQ ID NO: 13); (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de HGTNLED (SEQ ID NO: 14); e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de VHYAQFPYT (SEQ ID NO: 15). Por exemplo, em certas modalidades, o anticorpo anti-OX40 compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma, duas ou três CDRs selecionadas a partir de: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de NYLIE (SEQ ID NO: 10); (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de VINPGSGDTYYSEKFKG (SEQ ID NO: 11); e (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de DRLDY (SEQ ID NO: 12) e/ou uma sequência de domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma, duas ou três CDRs selecionadas a partir de (a) uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de HASQDISSYIV (SEQ ID NO: 13); (b) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de HGTNLED (SEQ ID NO: 14); e (c) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de VHYAQFPYT (SEQ ID NO: 15). Em certas modalidades, o anticorpo anti-OX40 compreende as sequências de VH e VL EVQLVQSGAE
VKKPGASVKV SCKASGYAFT NYLIEWVRQA PGQGLEWIGV INPGSGDTYY
SEKFKGRVTI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCARDR LDYWGQGTLV TVSS (SEQ ID NO: 16) e DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCHASQDIS
SYIVWYQQKP GKAPKLLIYH GTNLEDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCVH YAQFPYTFGQ GTKVEIK (SEQ ID NO: 17), respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais dessas sequências.
[000161] Mais detalhes sobre anticorpos anti-OX40 são fornecidos em WO 2015/153513, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[000162] Em certas modalidades, um anticorpo produzido pelas células e métodos divulgados neste documento é capaz de se ligar à hemaglutinina do vírus influenza B, ou seja, "fluB" (por exemplo, um anticorpo, que se liga à hemaglutinina da linhagem Yamagata do vírus influenza B, se liga à hemaglutinina da linhagem Victoria do vírus influenza B, se liga a hemaglutinina de linhagens ancestrais do vírus influenza B ou se liga a hemaglutinina da linhagem Yamagata, da linhagem Victoria e linhagens ancestrais do vírus influenza B, in vitro e/ou in vivo). Detalhes adicionais sobre anticorpos anti-FluB são descritos em WO 2015/148806, que é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade.
[000163] Em certas modalidades, um anticorpo produzido pelas células e métodos divulgados neste documento é capaz de se ligar à proteína relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP)-1 ou LRP-8 ou receptor de transferrina, e pelo menos um alvo selecionado a partir do grupo que consiste em beta-secretase (BACE1 ou BACE2), alfa-secretase, gama- secretase, tau-secretase, proteína precursora de amiloide (APP), receptor 6 de morte (DR6), peptídeo beta amilóide, alfa-sinucleína, Parkin, Huntingtina, p75 NTR, CD40 e caspase-6.
[000164] Em certas modalidades, um anticorpo produzido pelas células e métodos divulgados no presente documento é um anticorpo IgG2 humano contra CD40. Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD40 é RG7876.
[000165] Em certas modalidades, as células e métodos da presente divulgação podem ser usados para produzir um polipeptídeo. Por exemplo, mas não como limitação, o polipeptídeo é uma imunocitoquina direcionada. Em certas modalidades, a imunocitoquina direcionada é uma imunocitoquina CEA-
IL2v. Em certas modalidades, a imunocitoquina CEA-IL2v é RG7813. Em certas modalidades, a imunocitoquina direcionada é uma imunocitoquina FAP- IL2v. Em certas modalidades, a imunocitoquina FAP-IL2v é RG7461.
[000166] Em certas modalidades, o anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico) produzido pelas células ou métodos fornecidos neste documento é capaz de se ligar a CEA e pelo menos uma molécula alvo adicional. Em certas modalidades, o anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico) produzido de acordo com os métodos fornecidos neste documento é capaz de se ligar a uma citocina direcionada ao tumor e a pelo menos uma molécula alvo adicional. Em certas modalidades, o anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico) produzido de acordo com os métodos fornecidos neste documento é fundido a IL2v (ou seja, uma variante de interleucina 2) e se liga a uma imunocitoquina baseada em IL1 e pelo menos uma molécula alvo adicional. Em certas modalidades, o anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico) produzido de acordo com os métodos fornecidos no presente documento é um anticorpo biespecífico de células T (ou seja, um engajador biespecífico de células T ou BiTE).
[000167] Em certas modalidades, o anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico) produzido de acordo com os métodos fornecidos neste documento é capaz de se ligar a pelo menos duas moléculas alvo selecionadas a partir de: IL-1 alfa e IL-1 beta, IL-12 e IL-1S; IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-5 e IL-4; IL-13 e IL-1beta; IL-13 e IL-25; IL-13 e TARC; IL-13 e MDC; IL-13 e MEF; IL-13 e TGF-~; IL-13 e agonista de LHR; IL- 12 e TWEAK, IL-13 e CL25; IL-13 e SPRR2a; IL-13 e SPRR2b; IL-13 e ADAMS, IL-13 e PED2, IL17A e IL17F, CEA e CD3, CD3 e CD19, CD138 e CD20; CD 138 e CD40; CD19 e CD20; CD20 e CD3; CD3S e CD13S; CD3S e CD20; CD3S e CD40; CD40 e CD20; CD-S e IL-6; CD20 e BR3, TNF alfa e TGF-beta, TNF alfa e IL-1 beta; TNF alfa e IL-2, TNF alfa e IL-3, TNF alfa e IL-
4, TNF alfa e IL-5, TNF alfa e IL6, TNF alfa e IL8, TNF alfa e IL-9, TNF alfa e IL- 10, TNF alfa e IL-11, TNF alfa e IL-12, TNF alfa e IL-13, TNF alfa e IL-14, TNF alfa e IL-15, TNF alfa e IL-16, TNF alfa e IL-17, TNF alfa e IL-18, TNF alfa e IL-19, TNF alfa e IL-20, TNF alfa e IL-23, TNF alfa e IFN alfa, TNF alfa e CD4, TNF alfa e VEGF, TNF alfa e MIF, TNF alfa e ICAM-1, TNF alfa e PGE4, TNF alfa e PEG2, TNF alfa e ligante RANK, TNF alfa e Te38, TNF alfa e BAFF, TNF alfa e CD22, TNF alfa e CTLA-4, TNF alfa e GP130, TNF a e IL-12p40, VEGF e angiopoietina, VEGF e HER2, VEGF-A e HER2, VEGF-A e PDGF, HER1 e HER2, VEGFA e ANG2, VEGF-A e VEGF-C, VEGF-C e VEGF-D, HER2 e DR5, VEGF e IL-8, VEGF e MET, receptor VEGFR e MET, EGFR e MET, VEGFR e EGFR, HER2 e CD64, HER2 e CD3, HER2 e CD16, HER2 e HER3; EGFR (HER1) e HER2, EGFR e HER3, EGFR e HER4, IL-14 e IL-13, IL-13 e CD40L, JL4 e CD40L, TNFR1 e IL-1 R, TNFR1 e IL-6R e TNFR1 e IL- 18R, EpCAM e CD3, MAPG e CD28, EGFR e CD64, CSPGs e RGM A; CTLA-4 e BTN02; IGF1 e IGF2; IGF 1/2 e Erb2B; MAG e RGM A; NgR e RGM A; NogoA e RGM A; OMGp e RGM A; POL-1 e CTLA-4; e RGM A e RGM B.
[000168] Em certas modalidades, o anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico) produzido de acordo com os métodos fornecidos no presente documento é um anticorpo biespecífico anti-CEA/anti- CD3. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 é RG7802. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 compreende as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 18-21 que são fornecidas abaixo:
DIQMTQSP LSASVGDR ITCKASAAV TYVAWYQQKP ASYRKRGV SS VT G GKAPKLLIYS PS RFSGSGS FTLTISSLQ EDFATYYC YYTYPLFTFG VAAPSVFIF GTD P HQ QGTKLEIKRT P PSDEQLKS ASVVCLLN YPREAKVQ VDNALQSGNS DSTYSLSS
GT NF WK QESVTEQDSK TL TLSKADYE KVYACEVT GLSSPVTK NRGEC (SEQ ID NO: KH HQ SF 18)
QAVVTQEP TVSPGGTV TCGSSTGA TSNYANWVQE GGTNKRAP SL TL VT KPGQAFRGLI GT PARFSGSL GKAALTLS QPEDEAEY ALWYSNLWVF SASTKGPS LG GA YC GGGTKLTVLS VF PLAPSSKS GGTAALGC KDYFPEPV SWNSGALTSG SGLYSLSS
TS LV TV VHTFPAVLQS VV TVPSSSLG TYICNVNH SNTKVDKK PKSC (SEQ ID NO: 19)
TQ KP VE QVQLVQS VKKPGASV SCKASGYT EFGMNWVRQA INTKTGEAT GAE KV FT PGQGLEWMGW Y VEEFKGRV TTDTSTST MELRSLRS TAVYYCARWD WGQGTTV TF AY DD FAYYVEAMDY TVS SASTKGPS PLAPSSKS GGTAALGC KDYFPEPVTV VHTFPAVL VF TS LV SWNSGALTSG QS SGLYSLSS TVPSSSLG TYICNVNH SNTKVDKKVE GGGGSEV VV TQ KP PKSCDGGGGS QLL ESGGGLV GSLRLSCA GFTFSTYA WVRQAPGKGL NNYATYYA QPG AS MN EWVSRIRSKY DS VKGRFTIS DSKNTLYL NSLRAEDT YYCVRHGNFG GQGTLVTV RD QM AV NSYVSWFAYW SS ASVAAPSV FPPSDEQL GTASVVCL NFYPREAKVQ NSQESVTE FI KS LN WKVDNALQSG QD SKDSTYSL TLTLSKAD KHKVYACE HQGLSSPVTK HTCPPCPA SS YE VT SFNRGECDKT PE AAGGPSVF PPKPKDTL SRTPEVTC VDVSHEDPEV VHNAKTKP LF MI VV KFNWYVDGVE RE EQYNSTYR SVLTVLHQ LNGKEYKC SNKALGAPIE REPQVYTL VV DW KV KTISKAKGQP PP CRDELTKN SLWCLVKG PSDIAVEW NGQPENNYKT FFLYSKLTV
QV FY ES TPPVLDSDGS D KSRWQQG SCSVMHEA NHYTQKSL SPGK (SEQ ID NO: 20)
NVF LH SL QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT EFGMNWVRQA PGQGLEWMG WINTKTGEATY VEEFKGRVTF TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARWD FAYYVEAMD YWGQGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTS GVHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDKTHT CPPCPAPEAAG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVH NAKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALGAPIEKTI SKAKGQPRE PQVCTLPPSRD ELTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFF LVSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K (SEQ ID
NO: 21)
[000169] Mais detalhes sobre os anticorpos biespecíficos anti- CEA/anti-CD3 são fornecidos no documento WO 2014/121712, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[000170] Em certas modalidades, um anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico) produzido pelas células e métodos divulgados no presente documento é um anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti- angiopoietina. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti- angiopoietina é um Crossmab. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-angiopoietina é RG7716. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 compreende as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 22-25 que são fornecidas abaixo:
EVQLVES LVQPGGSL SCAASGYD HYGMNWV PGKGLEW INTYTGEPT GGG RL FT RQA VGW Y AADFKRR SLDTSKST LQMNSLRA TAVYYCAK YYYGTSH DVWGQGT FTF AY ED YP WYF LVT VSSASTK VFPLAPSS TSGGTAAL LVKDYFPE TVSWNSG SGVHTFPA GPS KS GC PV ALT VL QSSGLYS VVTVPSSS TQTYICNV KPSNTKVD VEPKSCDK TCPPCPAP LSS LG NH KK TH EA AGGPSVF PKPKDTLM RTPEVTCV DVSHEDPE FNWYVDG HNAKTKPR LFP AS VV VK VEV EE QYNSTYR VLTVLAQD NGKEYKCK NKALGAPI TISKAKGQ EPQVYTLP VVS WL VS EK PR PC RDELTKN LWCLVKGF SDIAVEWE GQPENNY PPVLDSDG FLYSKLTV QVS YP SN KTT SF DK
SRWQQGNVFS CSVMHEALHN AYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO: 22)
QVQLVQS VKKPGASV SCKASGYT GYYMHWV PGQGLEW INPNSGGT GAE KV FT RQA MGW NY AQKFQGR TRDTSISTA MELSRLRS TAVYYCAR NPYYYDSS YYPGAFDI VTM Y DD SP GY WG QGTMVTV SVAAPSVFI PPSDEQLK TASVVCLL FYPREAKV KVDNALQS SSA F SG NN QW GN SQESVTE KDSTYSLS LTLSKADY HKVYACEV QGLSSPVT FNRGECDK QDS ST EK TH KS TH TCPPCPA AGGPSVFL PKPKDTLM RTPEVTCV DVSHEDPE FNWYVDG PEA FP AS VV VK VEV HNAKTKP QYNSTYRV VLTVLAQD NGKEYKC NKALGAPIE TISKAKGQ REE VS WL KVS K PR EPQVCTL RDELTKNQ LSCAVKGF SDIAVEWE GQPENNYK PPVLDSDG PPS VS YP SN TT SF
FLVSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN AYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO: 23)
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC (SEQ ID NO: 24)
SYVLTQPPSV SVAPGQTARI TCGGNNIGSK SVHWYQQKPG QAPVLVVYDD SDRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISRVEAG DEADYYCQVW DSSSDHWVFG GGTKLTVLSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT
VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSC (SEQ ID NO: 25)
[000171] Em certas modalidades, o anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico) produzido pelos métodos divulgados no presente documento é um anticorpo biespecífico anti-Ang2/anti-VEGF. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-Ang2/anti-VEGF é RG7221.
Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-Ang2/anti-VEGF é o número CAS 1448221-05-3.
[000172] Os antígenos solúveis ou fragmentos dos mesmos, opcionalmente conjugados a outras moléculas, podem ser usados como imunógenos para gerar anticorpos. Para moléculas transmembranares, tais como receptores, fragmentos destas (por exemplo, o domínio extracelular de um receptor) podem ser usados como o imunógeno. Alternativamente, as células que expressam a molécula transmembranar podem ser usadas como o imunógeno. Tais células podem ser derivadas de uma fonte natural (por exemplo, linhagens celulares cancerosas) ou podem ser células que foram transformadas por técnicas recombinantes para expressar a molécula transmembranar. Outros antígenos e formas úteis dos mesmos para preparar anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto.
[000173] Em certas modalidades, o polipeptídeo (por exemplo, anticorpos) produzido pelas células e métodos divulgados no presente documento é capaz de se ligar a pode ser ainda conjugado a uma molécula química, tal como um corante ou agente citotóxico, tal como um agente quimioterapêutico, um fármaco, um agente inibidor de crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos da mesma), ou um isótopo radioativo (ou seja., um radioconjugado). Um imunoconjugado compreendendo um anticorpo ou anticorpo biespecífico produzido usando os métodos descritos no presente documento pode conter o agente citotóxico conjugado a uma região constante de somente uma das cadeias pesadas ou somente uma das cadeias leves.
5.5.6 VARIANTES DE ANTICORPO
[000174] Em certos aspectos, as variantes da sequência de aminoácidos dos anticorpos fornecidos neste documento são contempladas, por exemplo, os anticorpos fornecidos na Seção 5.5.5. Por exemplo, pode ser desejável alterar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes da sequência de aminoácidos de um anticorpo podem ser preparadas através da introdução de modificações apropriadas na sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo, ou através de síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções de, e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo.
Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar ao construto final, desde que o construto final tenha as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno.
5.5.6.1 VARIANTES DE SUBSTITUIÇÃO, INSERÇÃO E EXCLUSÃO
[000175] Em certas modalidades, variantes de anticorpo tendo uma ou mais substituições de aminoácidos são fornecidas. Locais de interesse para a mutagênese substitucional incluem as CDRs e FRs. As substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sob o título "substituições preferidas". Alterações mais substanciais são fornecidas na Tabela 1 sob o título "substituições exemplares", e conforme descrito abaixo em referência às classes de cadeia lateral de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos rastreados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação ao antígeno retida/aprimorada, imunogenicidade reduzida, ou ADCC ou CDC aprimorada.
TABELA 1 Resíduo Substituições Substituições Original Exemplares Preferidas Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu Leu (L) Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu
[000176] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades de cadeia lateral comuns: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
[000177] As substituições não conservativas implicarão na troca de um membro de uma dessas classes por um membro de outra classe.
[000178] Um tipo de variante substitucional envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para um estudo mais aprofundado terá/terão modificações (por exemplo, aprimoramentos) em certas propriedades biológicas (por exemplo, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida) em relação ao anticorpo parental e/ou terá/terão retido substancialmente certas propriedades biológicas do anticorpo parental. Uma variante substitucional exemplar é um anticorpo maturado por afinidade, que pode ser gerado convenientemente, por exemplo, usando técnicas de maturação por afinidade à base de exibição em fagos, tais como aquelas descritas neste documento. Em suma, uma ou mais. Os resíduos de CDR são mutados e os anticorpos de variantes exibidos no fago e rastreados para uma atividade biológica particular (por exemplo, afinidade de ligação).
[000179] Alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em CDRs, por exemplo, para aprimorar a afinidade do anticorpo. Tais alterações podem ser feitas em "pontos de acesso" da CDR, ou seja, resíduos codificados por códons que sofrem mutação em alta frequência durante o processo de maturação somática (vide, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol.
Biol. 207:179-196 (2008)), e/ou resíduos que entram em contato com o antígeno, com a variante de VH ou VL resultante sendo testada quanto à afinidade de ligação. A maturação por afinidade pela construção e resseleção de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom et al., em Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press,
Totowa, NJ, (2001)). Em alguns casos de maturação por afinidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis escolhidos para maturação por qualquer uma de uma variedade de métodos (por exemplo, PCR propenso a erros, embaralhamento de cadeia ou mutagênese dirigida por oligonucleotídeo). É então criada uma biblioteca secundária. A biblioteca é então rastreada para identificar as variantes de anticorpo com a afinidade desejada. Outro método para introduzir diversidade envolve abordagens direcionadas a CDR, nas quais vários resíduos de CDR (por exemplo, 4 a 6 resíduos de cada vez) são randomizados. Os resíduos de CDR envolvidos na ligação ao antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, usando mutagênese de varredura de alanina ou modelagem. CDR-H3 e CDR- L3, em particular, são muitas vezes direcionadas.
[000180] Em certos casos, substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais CDRs, desde que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo de se ligar ao antígeno.
Por exemplo, as alterações conservativas (por exemplo, substituições conservativas como fornecidas no presente documento) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em CDRs. Tais alterações podem, por exemplo, estar fora dos resíduos que entram em contato com o antígeno nas CDRs. Em certas sequências de VH e VL de variantes fornecidas acima, cada CDR está inalterada ou contém não mais do que uma, duas ou três substituições de aminoácidos.
[000181] Um método útil para identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que pode ser direcionado para mutagênese é chamado "mutagênese de varredura de alanina", como descrito por Cunningham e Wells, (1989), Science, 244:1081-1085. Neste método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lys, e glu) são identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Outras substituições podem ser introduzidas nas localizações de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições iniciais. Alternativamente, ou adicionalmente, uma estrutura cristalina de um complexo antígeno-anticorpo pode ser usada para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser direcionados ou eliminados como candidatos para substituição. As variantes podem ser rastreadas para determinar se contêm as propriedades desejadas.
[000182] As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões do terminal amino e/ou carboxila variando em comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila do N- terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N-terminal ou C-terminal do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT (terapia com pró-fármaco enzimática direcionada por anticorpo)) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo.
5.5.6.2 VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO
[000183] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento é alterado para aumentar ou diminuir o grau em que o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de locais de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de tal modo que um ou mais locais de glicosilação sejam criados ou removidos.
[000184] Quando o anticorpo compreende uma região Fc, o oligossacarídeo a ela ligado pode ser alterado. Os anticorpos nativos produzidos por células de mamífero compreendem, normalmente, um oligossacarídeo ramificado e biantenário que é geralmente ligado por uma N-
ligação a Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright et al., TIBTECH, 15:26-32 (1997). O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil-glucosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc no “tronco” da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em alguns casos, as modificações do oligossacarídeo em um anticorpo da invenção podem ser feitas para criar variantes de anticorpo com certas propriedades aprimoradas.
[000185] Em um aspecto, as variantes do anticorpo são fornecidas tendo um oligossacarídeo não fucosilado, ou seja, uma estrutura de oligossacarídeo que não tem fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Tal oligossacarídeo não fucosilado (também referido como oligossacarídeo "afucosilado") é particularmente um oligossacarídeo N-ligado que não possui um resíduo de fucose ligado ao primeiro GlcNAc na haste da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em um aspecto, as variantes do anticorpo são fornecidas tendo uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados na região Fc, em comparação com um anticorpo nativo ou parental. Por exemplo, a proporção de oligossacarídeos não fucosilados pode ser pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 80% ou mesmo cerca de 100% (ou seja, nenhum oligossacarídeo fucosilado está presente). A porcentagem de oligossacarídeos não fucosilados é a quantidade (média) de oligossacarídeos que não possuem resíduos de fucose, em relação à soma de todos os oligossacarídeos ligados a Asn 297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e de alta manose), conforme medido por espectrometria de massa MALDI-TOF, como descrito em WO 2006/082515, por exemplo. Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado próximo da posição 297 na região Fc (numeração da UE dos resíduos da região Fc); no entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, ou seja,
entre as posições 294 e 300, devido a pequenas variações de sequência em anticorpos. Tais anticorpos tendo uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados na região Fc podem ter ligação ao receptor FcγRIIIa aprimorada e/ou função efetora aprimorada, em particular função ADCC aprimorada. Vide, por exemplo, US 2003/0157108; US 2004/0093621.
[000186] Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos com fucosilação reduzida incluem células CHO Lec13 deficientes em fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108; e WO 2004/056312, especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares de nocaute, tais como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO de nocaute (vide, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al.
Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); e WO 2003/085107), ou células com atividade reduzida ou abolida de uma síntese de GDP-fucose ou proteína transportadora (vide, por exemplo, US2004259150, US2005031613, US2004132140, US2004110282).
[000187] Em um aspecto adicional, as variantes de anticorpo são fornecidas com oligossacarídeos bissecionados, por exemplo, em que um oligossacarídeo biantenário ligado à região Fc do anticorpo é bissectado por GlcNAc. Tais variantes de anticorpos podem ter fucosilação reduzida e/ou função ADCC aprimorada, como descrito acima. Exemplos de tais variantes de anticorpos são descritos, por exemplo, em Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878.
[000188] As variantes de anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc são também fornecidas.
Tais variantes de anticorpo podem ter função CDC aprimorada. Tais variantes de anticorpo são descritas, por exemplo, em WO 1997/30087; WO 1998/58964; e WO 1999/22764.
5.5.6.3 VARIANTES DA REGIÃO FC
[000189] Em certos aspectos, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido neste documento, gerando assim uma variante da região Fc. A variante da região Fc pode compreender uma sequência da região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácidos (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos.
[000190] Em certos aspectos, a presente divulgação contempla uma variante de anticorpo que possui algumas, mas não todas, funções efetoras, o que a torna uma candidata desejável para aplicações em que a meia-vida do anticorpo in vivo é importante, mas certa funções efetoras (tais como citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC)) são desnecessárias ou deletérias. Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser realizados para confirmar a redução/depleção das atividades CDC e/ou ADCC. Por exemplo, os ensaios de ligação ao receptor Fc (FcR) podem ser realizados para garantir que o anticorpo não possua ligação a FcγR (portanto, provavelmente sem atividade ADCC), mas mantém a capacidade de ligação a FcRn. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam somente FcγRIII, enquanto a expressão dos monócitos que expressam FcγRI, FcγRII e FcγRIII FcR em células hematopoiéticas está em suma na Tabela 3, na página 464, de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991).
Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente dos EUA de nº 5.500.362 (vide, por exemplo, Hellstrom, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7059-7063 (1986)) e Hellstrom, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:1499-1502 (1985); Patente dos EUA de nº 5.821.337 (vide Bruggemann, et al., J. Exp. Med.,
166:1351-1361 (1987)). Alternativamente, métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (vide, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativa ACTI™ para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; e ensaio de citotoxicidade não radioativa CytoTox 96 ® (Promega, Madison, WI). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células natural killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como o divulgado em Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:652-656 (1998). Ensaios de ligação a C1q podem também ser efetuados para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar a C1q e, portanto, é desprovido de atividade CDC. Vide, por exemplo, ELISA de ligação a C1q e C3c em WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC pode ser realizado (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, MS et al., Blood 101:1045-1052 (2003); e Cragg, MS e MJ Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). A ligação a FcRn e as determinações de eliminação/meia-vida in vivo também podem ser realizadas usando métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Petkova, S B. et al., Int'l. Immunol.
18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929 A1).
[000191] Anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente dos EUA de nº 6.737.056). Tais mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o chamado mutante Fc “DANA” com substituição dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente dos EUA de nº 7.332.581).
[000192] Certas variantes de anticorpos com ligação aprimorada ou diminuída a FcRs são descritas. (Vide, por exemplo, Patente dos EUA de nº
6.737.056; WO 2004/056312, e Shields et al., J. Biol. Chem., 9(2):6591-6604
(2001)).
[000193] Em certos casos, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que aprimoram ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração da UE de resíduos).
[000194] Em certos aspectos, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que diminuem a ligação a FcγR, por exemplo, substituições nas posições 234 e 235 da região Fc (numeração da UE de resíduos). Em um aspecto, as substituições são L234A e L235A (LALA). Em certos aspectos, a variante de anticorpo compreende ainda D265A e/ou P329G em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG 1 humana. Em um aspecto, as substituições são L234A, L235A e P329G (LALA-PG) em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG 1 humana. (Vide, por exemplo, WO 2012/130831). Em outro aspecto, as substituições são L234A, L235A e D265A (LALA-DA) em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG 1 humana.
[000195] Em alguns casos, são feitas alterações na região Fc que resultam na ligação a C1q alterada (ou seja, aprimorada ou diminuída) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito na Patente dos EUA de nº 6.194.551, WO 99/51642 e em Idusogie et al., J. Immunol., 164:4178-4184 (2000).
[000196] Anticorpos com meia-vida aumentada e ligação aprimorada ao receptor Fc neonatal (FcRn), responsável pela transferência de IgGs maternais para o feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)), são descritos em US2005/0014934 (Hinton et al.). Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições na mesma que aprimoram a ligação da região Fc ao FcRn. Tais variantes Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais resíduos da região Fc: 238, 252, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição do resíduo da região Fc 434 (vide, por exemplo, Patente dos EUA de nº 7.371.826; Dall' Acqua, WF, et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514- 23524).
[000197] Os resíduos da região Fc críticos para a interação Fc- FcRn de camundongo foram identificados por mutagênese direcionada ao local (vide, por exemplo, Dall’ Acqua, W.F., et al., J. Immunol 169 (2002) 5171- 5180). Os resíduos I253, H310, H433, N434 e H435 (numeração do índice da UE) estão envolvidos na interação (Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Kim, JK, et al., Eur.
J. Immunol. 24 (1994) 542). Os resíduos I253, H310 e H435 foram considerados críticos para a interação de Fc humano com FcRn murino (Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819). Estudos do complexo Fc humano- FcRn humano mostraram que os resíduos I253, S254, H435 e Y436 são cruciais para a interação (Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Shields, RL, et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). Em Yeung, YA, et al., (J.
Immunol. 182 (2009) 7667-7671) vários mutantes dos resíduos 248 a 259 e 301 a 317 e 376 a 382 e 424 a 437 foram relatados e examinados.
[000198] Em certos aspectos, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos, que reduzem a ligação a FcRn, por exemplo, substituições nas posições 253 e/ou 310 e/ou 435 da região Fc (numeração da UE de resíduos). Em certos aspectos, a variante de anticorpo compreende uma região Fc com as substituições de aminoácidos nas posições 253, 310 e 435. Em um aspecto, as substituições são I253A, H310A e H435A em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG1 humana. Vide, por exemplo, Grevys, A., et al., J. Immunol.
194 (2015) 5497-5508.
[000199] Em certos casos, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que aprimoram ADCC, por exemplo, substituições nas posições 310, 433 e/ou 436 da região Fc (numeração da UE de resíduos). Em certos aspectos, a variante de anticorpo compreende uma região Fc com as substituições de aminoácidos nas posições 310, 433 e 436. Em um aspecto, as substituições são H310A, H433 A e Y436A em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG1 humana. (Vide, por exemplo, WO 2014/177460 A1).
[000200] Em certos casos, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que aprimoram ADCC, por exemplo, substituições nas posições 252, 254 e/ou 256 da região Fc (numeração da UE de resíduos). Em certos aspectos, a variante de anticorpo compreende uma região Fc com substituições de aminoácidos nas posições 252, 254 e 256. Em um aspecto, as substituições são M252Y, S254T e T256E em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG 1 humana. Vide também Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente dos EUA de nº
5.648.260; Patente dos EUA de nº 5.624.821; e WO 94/29351 em relação a outros exemplos de variantes da região Fc.
[000201] O C-terminal da cadeia pesada do anticorpo biespecífico, conforme relatado no presente documento, pode ser um C-terminal completo com os resíduos de aminoácidos PGK. O C-terminal da cadeia pesada pode ser um C-terminal encurtado no qual um ou dois dos resíduos de aminoácido do C-terminal foram removidos. Em um aspecto preferencial, o C-terminal da cadeia pesada é um C-terminal encurtado que termina em PG. Em um aspecto de todos os aspectos, conforme relatado neste documento, um anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada incluindo um domínio CH3 do C-terminal, como especificado aqui, compreende o dipeptídeo glicina-lisina do C-terminal (G446 e K447, numeração do índice da UE de posições de aminoácidos). Em uma modalidade de todos os aspectos, conforme relatado neste documento, um anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada incluindo um domínio CH3 do C-terminal, como especificado aqui, compreende um resíduo de glicina terminal C (G446, numeração do índice da UE de posições de aminoácidos).
5.5.6.4 VARIANTES DE ANTICORPO MANIPULADAS COM CISTEÍNA
[000202] Em certos casos, pode ser desejável criar anticorpos manipulados com cisteína, por exemplo, anticorpos THIOMAB™, nos quais um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em modalidades particulares, os resíduos substituídos ocorrem em locais acessíveis do anticorpo. Ao substituir os resíduos com cisteína, grupos tiol reativos são desse modo posicionados em locais acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo a outras frações moleculares, tais como frações de fármacos ou frações de ligante-fármaco, para criar um imunoconjugado, tal como descrito adicionalmente neste documento. Os anticorpos projetados com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, nas Patentes dos EUA de nº 7.521.541, 8.30.930, 7.855.275,
9.000.130 ou WO 2016040856.
5.5.6.5 DERIVADOS DE ANTICORPO
[000203] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento pode ser ainda modificado para conter frações não proteicas adicionais que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. As frações adequadas para derivatização do anticorpo incluem, mas não estão limitadas a, polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não estão limitados a polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1, 3, 6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona) polietilenoglicol, homopolímeros de propropilenoglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico e misturas destes. O polietilenoglicol propionaldeído pode ter vantagens na fabricação devido à sua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros ligados ao anticorpo pode variar e, se mais de um polímero estiver ligado, eles podem ser moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivatização pode ser determinado com base em considerações, incluindo, mas não se limitando a, as propriedades ou funções particulares do anticorpo a serem melhoradas, se o derivado de anticorpo será usado em uma terapia sob condições definidas, etc.
5.5.7 IMUNOCONJUGADOS
[000204] A presente divulgação também fornece imunoconjugados compreendendo um anticorpo, divulgado neste documento, conjugado (quimicamente ligado) a um ou mais agentes terapêuticos, tais como agentes citotóxicos, agentes quimioterápicos, fármacos, agentes inibidores de crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas de proteínas, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos das mesmas) ou isótopos radioativos.
[000205] Em um aspecto, um imunoconjugado é um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) no qual um anticorpo é conjugado a um ou mais dos agentes terapêuticos mencionados acima. O anticorpo é normalmente conectado a um ou mais dos agentes terapêuticos usando ligantes. Uma visão geral da tecnologia ADC, incluindo exemplos de agentes terapêuticos, fármacos e ligantes, é apresentada em Pharmacol Review 68:3-19 (2016).
[000206] Em outro aspecto, um imunoconjugado compreende um anticorpo, conforme descrito neste documento, conjugado a uma toxina enzimaticamente ativa ou fragmento da mesma, incluindo, mas não se limitando a, cadeia A da difteria, fragmentos ativos não vinculativos da toxina da difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas dianthin, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor da momordica charantia, curcina, crotina, inibidor da sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.
[000207] Em outro exemplo, um imunoconjugado compreende um anticorpo, como descrito neste documento, conjugado a um átomo radioativo para formar um radioconjugado. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de radioconjugados. Os exemplos incluem At 211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu.
Quando o radioconjugado é usado para detecção, ele pode compreender um átomo radioativo para estudos cintilográficos, por exemplo, tc99m ou I123, ou um marcador de rotação para imageamento de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecido como imageamento de ressonância magnética, mri), tal como iodo -123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio- 15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
[000208] Os conjugados de um anticorpo e agente citotóxico podem ser feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometil) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como HCl de adipimidato de dimetila), ésteres ativos (tais como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como hexanodiamina de bis(p-azidobenzoil)), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(p-diazôniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tais como 2,6-
diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativos (tais como 1,5-difluoro- 2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987). O ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminapenta-acético marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Vide WO 94/11026. O ligante pode ser um “ligante clivável” que facilita a liberação de um fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante lábil a ácidos, ligante sensível a peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetílico ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al., Cancer Res., 52:127-131 (1992); Patente dos EUA de nº 5.208.020) podem ser usados.
[000209] Os imunuoconjugados ou ADCs do presente documento contemplam expressamente, mas não estão limitados a, tais conjugados preparados com reagentes de reticulação incluindo, mas não se limitando a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4- vinilsulfona)benzoato), que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, da Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EUA).
5.6 MODALIDADES EXEMPLARES A. Em certas modalidades não limitantes, o assunto presentemente divulgado fornece uma célula de mamífero tendo atividade lactogênica reduzida ou eliminada, em que a expressão de uma isoforma de polipeptídeo do músculo piruvato quinase (PKM) é silenciada (knock out) ou sofre knock down, e em que a isoforma de polipeptídeo PKM compreende uma isoforma de polipeptídeo PKM-1.
A1. A célula de mamífero anterior de A, em que a expressão da isoforma de polipeptídeo PKM-2 é silenciada (knock out) ou sofre knock down.
A2. A célula de mamífero anterior de A ou A1, em que a célula é uma célula CHO.
A3. A célula de mamífero anterior de qualquer uma de A-A2, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um produto de interesse.
A4. A célula de mamífero anterior de A3, em que o produto de interesse compreende uma proteína.
A5. A célula de mamífero anterior de A3 ou A4, em que o produto de interesse compreende uma proteína recombinante. A6. A célula de mamífero anterior de qualquer uma de A3-A5, em que o produto de interesse compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
A7. A célula de mamífero anterior de A6, em que o anticorpo é um anticorpo multiespecífico ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
A8. A célula de mamífero anterior de A6, em que o anticorpo consiste em uma sequência de cadeia única pesada e uma sequência de cadeia única leve ou fragmentos de ligação ao antígeno destas.
A9. A célula de mamífero anterior de qualquer uma de A6-A8, em que o anticorpo compreende um anticorpo quimérico, um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado.
A10. A célula de mamífero anterior de qualquer uma de A6-A9, em que o anticorpo compreende um anticorpo monoclonal.
A11. A célula de mamífero anterior de qualquer uma de A3- A10, em que a sequência de ácido nucleico é integrada no genoma celular da célula de mamífero em um local direcionado.
A12. A célula de mamífero anterior de A11, compreendendo ainda um ácido nucleico que codifica o produto de interesse que é integrado aleatoriamente no genoma celular da célula de mamífero.
A13. A célula de mamífero anterior de qualquer uma de A-A12, em que a atividade lactogênica das células de mamífero é inferior a cerca de 50% da atividade lactogênica de uma célula de referência.
A14. A célula de mamífero anterior de A13, em que a atividade lactogênica das células de mamífero é inferior a cerca de 20% da atividade lactogênica de uma célula de referência.
A15. A célula de mamífero anterior de A13 ou A14, em que a célula de referência é uma célula que compreende alelos do tipo selvagem do gene PKM. A16. A célula de mamífero anterior de qualquer uma de A-A15, em que a atividade lactogênica da célula de mamífero é determinada no dia 14 ou no dia 15 de uma fase de produção.
A17. A célula de mamífero anterior de qualquer uma de A-A16, em que a célula de mamífero produz menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção.
A18. A célula de mamífero anterior de qualquer uma de A-A16, em que a célula de mamífero produz menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção em um frasco de agitação.
A19. A célula de mamífero anterior de qualquer uma de A-A16, em que a célula de mamífero produz menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção em um biorreator.
B. Em certas modalidades não limitantes, o assunto presentemente divulgado fornece uma célula de mamífero que compreende um alelo de um gene PKM que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 39-41, ou as sequências de nucleotídeos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 37 e 38.
C. Em certas modalidades não limitantes, o assunto presentemente divulgado fornece uma composição que compreende uma célula de mamífero de qualquer uma das células de mamífero anteriores de A- A19.
D. Em certas modalidades não limitantes, o assunto presentemente divulgado fornece um método para reduzir ou eliminar a atividade lactogênica em uma célula, compreendendo nocautear ou nocautear negativamente a expressão de uma isoforma de polipeptídeo do músculo piruvato quinase (PKM).
E. Em certas modalidades não limitantes, o assunto presentemente divulgado fornece um método para reduzir ou eliminar a atividade lactogênica em uma célula, compreendendo administrar à célula um sistema de engenharia genética, em que o sistema de engenharia genética silencia (knock out) ou aplica knock down na expressão de uma isoforma de polipeptídeo do músculo piruvato quinase (PKM).
E1. O método anterior de E, em que o sistema de engenharia genética é selecionado a partir do grupo que consiste em um sistema CRISPR/Cas, um sistema de nuclease de dedo de zinco (ZFN), um sistema de nuclease efetora semelhante à ativadores de transcrição (TALEN) e uma combinação destes.
E2. O método anterior de E ou E1, em que o sistema de engenharia genética é um sistema CRISPR/Cas9.
E3. O método anterior de E2, em que o sistema CRISPR/Cas9 compreende: (a) uma molécula Cas9, e (b) um ou mais RNAs guia (gRNAs) compreendendo uma sequência de direcionamento que é complementar a uma sequência alvo em um gene PKM.
E4. O método anterior de E3, em que a sequência alvo é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma porção do gene PKM, uma região dentro do éxon 1, uma região 5' flanqueando o éxon 2, uma região dentro do éxon 2, uma região de íntron 5' flanqueando o éxon 9 do gene PKM, uma região de íntron 3' flanqueando o éxon 9 do gene PKM, uma região de íntron 3' flanqueando o éxon 10 do gene PKM, uma região dentro do éxon 1 do gene PKM, uma região dentro do éxon 12 do gene PKM e combinações destas.
E5. O método anterior de qualquer uma de E3-E4, em que os um ou mais gRNAs compreendem uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 33-34, 42-43 e uma combinação destas.
E6. O método anterior de E3 ou E4, em que os um ou mais gRNAs compreendem (1) um primeiro gRNA compreendendo uma sequência alvo que é complementar a uma região de íntron 5' flanqueando o éxon 9 do gene PKM; e (2) um segundo gRNA compreendendo um domínio alvo que é complementar a uma região de íntron 3' flanqueando o éxon 9 do gene PKM.
E7. O método anterior de qualquer uma de E3-E6, em que os um ou mais gRNAs compreendem uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 33-34 e uma combinação destas.
E8. O método anterior de E3 ou E4, em que os um ou mais gRNAs compreendem (1) um primeiro gRNA compreendendo uma sequência alvo que é complementar a uma região dentro do éxon 2 do gene PKM; e (2) um segundo gRNA compreendendo um domínio alvo que é complementar à região dentro do éxon 12 do gene PKM.
E9. O método anterior de qualquer uma de E3-E5 e E8, em que os um ou mais gRNAs compreendem uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 42-43 e uma combinação destas.
E10. O método anterior de qualquer uma de D e E-E9, em que a expressão da isoforma de polipeptídeo PKM é silenciada (knock out) e a atividade lactogênica na célula é eliminada ou reduzida em comparação com a atividade lactogênica de uma célula de referência.
E11. O método anterior de qualquer uma de D e E-E9, em que a expressão da isoforma de polipeptídeo PKM sofre knock down e a atividade lactogênica na célula é reduzida em comparação com a atividade lactogênica de uma célula de referência.
E12. O método anterior de E10 ou E11, em que a atividade lactogênica da célula é inferior a cerca de 50% da atividade lactogênica da célula de referência.
E13. O método anterior de E10 ou E11, em que a atividade lactogênica da célula é inferior a cerca de 20% da atividade lactogênica da célula de referência.
E14. O método anterior de qualquer uma de D e E-E13, em que a atividade lactogênica da célula é determinada no dia 14 ou no dia 15 de uma fase de produção.
E15. O método anterior de qualquer uma de D e E-E14, em que a célula produz menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção.
E16. O método anterior de qualquer uma de D e E-E14, em que a célula produz menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção em um frasco de agitação.
E17. O método anterior de qualquer uma de D e E-E14, em que a célula produz menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção em um biorreator.
E18. O método anterior de qualquer uma de E11-E17, em que a célula de referência é uma célula que compreende alelos do tipo selvagem do gene PKM.
E19. O método anterior de qualquer uma de D e E-E18, em que a isoforma de polipeptídeo PKM é a isoforma de polipeptídeo PKM-1.
E20. O método anterior de qualquer uma de D e E-E19, em que a isoforma de polipeptídeo PKM é a isoforma de polipeptídeo PKM-1 e a isoforma de polipeptídeo PKM-2.
E21. O método anterior de E, em que o sistema de engenharia genética compreende um RNA selecionado a partir do grupo que consiste em: um RNA de grampo curto (shRNA), um pequeno RNA de interferência (siRNA) e um microRNA (miRNA), em que o RNA é complementar a uma porção de um mRNA expresso pelo gene PKM.
E22. O método anterior de E21, em que o mRNA expresso pelo gene PKM codifica uma isoforma de polipeptídeo PKM-1. E23. Método anterior de E22, em que a expressão da isoforma de polipeptídeo PKM-1 é silenciada (knock out) ou sofre knock down e a atividade lactogênica da célula é reduzida em comparação com a atividade lactogênica de uma célula de referência.
E24. O método anterior de qualquer uma de E21-E23, em que o sistema de engenharia genética compreende ainda um segundo RNA selecionado a partir do grupo que consiste em: um shRNA, um siRNA e um microRNA miRNA, em que o segundo RNA é complementar a uma porção de um mRNA expresso pelo gene PKM que codifica uma isoforma de polipeptídeo PKM-2.
E25. O método anterior de E24, em que a expressão das isoformas do polipeptídeo PKM-1 e PKM-2 são silenciadas (knock out) ou sofrem knock down e a atividade lactogênica da célula é reduzida.
E26. O método anterior de E, em que o sistema de engenharia genética é um sistema de nuclease de dedo de zinco (ZFN) ou um sistema de nuclease efetora semelhante à ativadores de transcrição (TALEN).
E27. O método anterior de D e E-E26, em que a célula é uma célula de mamífero.
E28. O método anterior de E27, em que a célula de mamífero é uma célula CHO.
E29. O método anterior de D e E-E28, em que a célula expressa um produto de interesse.
E30. O método anterior de E29, em que o produto de interesse expresso pelas células é codificado por uma sequência de ácido nucleico.
E31. O método anterior de E30, em que a sequência de ácido nucleico é integrada no genoma celular da célula em um local direcionado.
E32. O método anterior de qualquer uma de E26-E31, em que o produto de interesse expresso pelas células é ainda codificado por uma sequência de ácido nucleico que é integrada aleatoriamente no genoma celular da célula de mamífero.
E33. O método anterior de E26-E31, em que o produto de interesse compreende uma proteína.
E34. O método anterior de E33, em que o produto de interesse compreende uma proteína recombinante.
E35. O método anterior de qualquer uma de E26-E33, em que o produto de interesse compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
E36. O método anterior de E35, em que o anticorpo é um anticorpo multiespecífico ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
E37. O método anterior de E35, em que o anticorpo consiste em uma sequência de cadeia única pesada e uma sequência de cadeia única leve ou fragmentos de ligação ao antígeno destas.
E38. O método anterior de qualquer uma de E35-E37, em que o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado.
E39. O método anterior de qualquer uma de E35-E38, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
F. Em certas modalidades não limitantes, o assunto presentemente divulgado fornece um método para produzir um produto de interesse compreendendo cultivar células de mamífero que expressam o produto de interesse, em que as células de mamífero expressam o produto de interesse e têm atividade lactogênica reduzida ou eliminada.
G. Em certas modalidades não limitantes, o assunto presentemente divulgado fornece um método para cultivar uma população de células de mamífero que expressam um produto de interesse, em que as células de mamífero reduziram ou eliminaram a atividade lactogênica. G1. O método anterior de F ou G, em que a redução ou eliminação da atividade lactogênica resulta do silenciamento (knock out) ou knock down da expressão de uma isoforma de polipeptídeo do músculo piruvato quinase (PKM) nas células de mamífero.
G2. O método anterior de G1, em que a isoforma de polipeptídeo PKM é a isoforma de polipeptídeo PKM-1.
G3. O método anterior de G1, em que a isoforma de polipeptídeo PKM é a isoforma de polipeptídeo PKM-1 e a isoforma de polipeptídeo PKM-2.
G4. O método anterior de qualquer uma de F e G-G3, em que a atividade lactogênica das células de mamífero é inferior a cerca de 50% da atividade lactogênica de uma célula de referência.
G5. O método anterior de qualquer uma de F e G-G3, em que a atividade lactogênica das células de mamífero é inferior a cerca de 20% da atividade lactogênica de uma célula de referência.
G6. O método anterior de qualquer uma de F e G-G5, em que a atividade lactogênica das células de mamífero é determinada no dia 14 ou no dia 15 de uma fase de produção.
G7. O método anterior de qualquer uma de F e G-G6, em que as células de mamífero produzem menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção.
G8. O método anterior de qualquer uma de F e G-G6, em que as células de mamífero produzem menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção em um frasco de agitação.
G9. O método anterior de qualquer uma de F e G-G6, em que as células de mamífero produzem menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção em um biorreator.
G10. O método anterior de qualquer uma de F e G-G9, em que a célula de referência é uma célula que compreende pelo menos um ou ambos os alelos do tipo selvagem do gene PKM.
G11. O método anterior de qualquer uma de F e G-10, em que as células de mamífero são células CHO.
G12. O método anterior de qualquer uma de F e G-G11, em que o produto de interesse expresso pelas células de mamífero é codificado por uma sequência de ácido nucleico.
G13. O método anterior de G12, em que a sequência de ácido nucleico é integrada no genoma celular das células de mamífero em um local direcionado.
G14. O método anterior de qualquer uma de F e G-G13, em que o produto de interesse expresso pelas células é ainda codificado por uma sequência de ácido nucleico que é integrada aleatoriamente no genoma celular das células de mamífero.
G15. O método anterior de qualquer uma de F e G-G14, em que o produto de interesse compreende uma proteína.
G16. O método anterior de qualquer uma de F e G-G15, em que o produto de interesse compreende uma proteína recombinante.
G17. O método anterior de qualquer uma de F e G-G16, em que o produto de interesse compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
G18. O método anterior de G17, em que o anticorpo é um anticorpo multiespecífico ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
G19. O método anterior de G17, em que o anticorpo consiste em uma sequência de cadeia única pesada e uma sequência de cadeia única leve ou fragmentos de ligação ao antígeno destas.
G20. O método anterior de qualquer uma de G17-G19, em que o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado.
G21. O método anterior de qualquer uma de G17-G20, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
G22. O método anterior de qualquer uma de F e G-G21, compreendendo ainda a colheita do produto de interesse.
EXEMPLOS
[000210] Os exemplos a seguir são meramente ilustrativos do assunto presentemente divulgado e não devem ser considerados como limitações de forma alguma.
EXEMPLO 1: A EXPRESSÃO DE PKM-1 IMPULSIONOU O COMPORTAMENTO LACTOGÊNICO EM LINHAGENS CELULARES CHO, DESENCADEANDO MENOR
VIABILIDADE E PRODUTIVIDADE
[000211] No processo de desenvolvimento da linhagem celular (CLD), foram identificadas duas linhagens celulares lactogênicas que expressam diferentes moléculas de anticorpo. Os comportamentos lactogênicos dessas linhagens celulares podem ser mitigados diferencialmente por meio da otimização da alimentação de nutrientes ou do pH da cultura, dependendo da linhagem celular. A análise de várias proteínas envolvidas na via da glicólise revelou uma correlação direta entre os níveis da isoforma do músculo piruvato quinase-1 (PKM-1) e o comportamento lactogênico.
[000212] CRISPR/Cas9 foi usado para a deleção direcionada do éxon-9 para nocautear a expressão de PKM-1. O nocaute da expressão de PKM-1 aboliu completamente o comportamento lactogênico nas duas linhagens celulares selecionadas, eliminando a necessidade de estratégias de mitigação.
Uma única linhagem celular foi identificada na qual a expressão de ambos os genes PKM-1 e PKM-2 foi totalmente interrompida sem quaisquer efeitos adversos no crescimento e viabilidade. Uma análise mais aprofundada das linhagens celulares CHO e paternas revelou que todas elas expressavam versões de PKL e PKR da piruvato quinase, que, sem ser limitada pela teoria, poderia permitir que tolerassem a falta completa da expressão de PKM. As únicas estratégias de mitigação usadas para controlar o comportamento lactogênico dessas linhagens celulares mudaram suas vias metabólicas, alterando o padrão de transcrição e expressão de PKM-1, prevenindo ou retardando o comportamento lactogênico. O gene PKM é silenciado (knock out) inteiramente para analisar o comportamento das linhagens celulares resultantes em cultura e em biorreatores.
[000213] Em suma, a presente divulgação delineia uma correlação direta entre o comportamento lactogênico e altos níveis de PKM-1 em culturas de produção. Além disso, a eliminação da expressão de PKM-1 foi tolerada e reverteu o comportamento lactogênico nas linhagens celulares CHO selecionadas. Portanto, a deleção permanente de PKM-1, ou de todo o gene PKM, em células CHO, pode ser benéfica na redução de ocorrências do comportamento lactogênico durante a produção em biorreatores.
MATERIAIS E MÉTODOS LINHAGENS CELULARES
[000214] As linhagens celulares que secretam o anticorpo monoclonal mAb-1 ou mAb-2 recombinante foram derivadas de um hospedeiro
CHO-K1 usando um marcador de seleção de glutamina sintetase (GS). As séries de semeaduras foram mantidas em um meio baseado em DMEM/F12 proprietário contendo metionina sulfoximina (MSX) como um agente de seleção a 150 rpm de velocidade de agitação, 37°C e CO2 a 5%. As células foram passadas a cada 3 ou 4 dias.
PRODUÇÃO DE BIORREATOR DE 2-L
[000215] A produção de biorreator de 2 L foi realizada em biorreatores de tanque agitado de vidro (Applikon, Foster City, CA) com controladores Finesse (Applikon, Foster City, CA). Todas as culturas de produção usaram uma única etapa de trem de inóculo (N-1) por 3 dias nos biorreatores antes da inoculação da etapa de produção (N), com duração de 14 dias. As culturas de inoculação N-1 foram inoculadas entre 1,5 e 1,7 L de volume de trabalho para um volume de células alvo (PCV) de 0,17%. Eles foram operados a 37°C, um ponto de ajuste de pH de 7,0, um ponto de ajuste de oxigênio dissolvido (OD) de 30% e uma agitação de 275 rpm. Após três dias, as células foram transferidas para inocular os biorreatores de produção (N) para um volume entre 1,4 e 1,7 L em um PCV alvo de 0,25%. Todos os biorreatores foram operados a 37°C com uma mudança de temperatura para 35°C em 72 horas. As culturas foram realizadas a um pH de 7,00 com uma banda morta de 0,03 usando CO2 como controle de ácido e carbonato de sódio a 1 M como controle de base. A única exceção a esta operação de pH foi o nível de pH mAb-2 que foi operado a um pH constante de 6,80 com a mesma banda morta de 0,03. Todas as culturas foram configuradas para operar a 350 rpm e um DO de 30%, usando uma combinação de fluxos de gás de ar e oxigênio para manter o DO constante. Para as culturas do processo de controle de mAb-1, as alimentações ocorreram no dia 3 de produção (72 horas) e foram 20% do volume total da cultura naquele momento. Para o processo de alimentação aprimorado, as alimentações ocorreram no dia 3 (72 horas) e no dia 6 (144 horas) a 15% do volume total da cultura para cada alimentação.
OPERAÇÃO AMBR15
[000216] As culturas de produção no sistema AMBR15 (Sartorius, Goettingen Alemanha) foram operadas em pontos de ajuste de uma temperatura de 37°C, um DO de 30%, um pH de 7,0 e uma taxa de agitação de 1400 rpm. Os trens de inoculação N-1 foram executados por 4 dias e, em seguida, o estágio de produção (N) foi inoculado a 1 milhão de células/mL com um volume total de 13 mL com uma temperatura de 37°C, um OD de 30%, um pH de 7,0 e uma taxa de agitação de 1400 rpm. Para essas culturas, foi realizado um processo em escala reduzida do biorreator de 2 L.
ANÁLISES DE AMOSTRA OFF-LINE
[000217] Amostras do sobrenadante e do grânulo celular foram coletadas para serem submetidas a ensaios ou análise por Western blotting. As amostras foram analisadas quanto à concentração de células viáveis (VCC) e viabilidade usando o Vi-Cell XR (Beckman Coulter), e para pO2, pH, pCO2, Na+, glicose e lactato usando o Bioprofile 400 (Nova Biomedical). Todas as amostras de biorreatores de 2-L e AMBR foram analisadas no BioProfile 400 dentro de alguns minutos após a amostragem para minimizar a emissão de gás. O mesmo Vi-Cell XR, BioProfile 400 e osmômetro (Modelo 2020, Advanced Instruments) foram usados para todas as amostras para eliminar a variabilidade de instrumento para instrumento. O grau de anticorpo foi medido usando cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com uma coluna de proteína A. Os ensaios de qualidade do produto de anticorpo foram conduzidos usando amostras de sobrenadantes de cultura de células purificadas por coluna de proteína A PhyTip (PhyNexus, São José, CA). A distribuição do tamanho molecular do anticorpo foi analisada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). A heterogeneidade da carga da proteína foi medida usando focalização isoelétrica capilar (icIEF), e todas as amostras de heterogeneidade da carga foram pré-tratadas com carboxipeptidase B. Todos os ensaios de qualidade do produto da proteína foram desenvolvidos internamente e protocolos detalhados foram publicados (Hopp et al., 2009, Biotechnol, Prog.
25(5):1427-32).
IMMUNOBLOTTING
[000218] Os grânulos celulares foram lisados em tampão de lise (Tris de 10 mM, pH 8,0, NP40 a 0,5%, NaCl de 150 mM, MgCl 2 de 5 mM, com inibidores de protease) e incubados em gelo durante 20 minutos. As amostras foram então centrifugadas a 13.000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo para determinar a concentração de proteína usando um Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington DE) usando a absorvância a 280 nm. 15 µL do lisado foram combinados com 5 µL de tampão de corrida 4x (400 µL de tampão de carregamento 2x Invitrogen + 400 µL de glicerol a 50% + 200 µL de SDS a 20% + 100 µL de beta-mercaptoetanol) e aquecidos a 90°C por 5 minutos. Quantidades equivalentes de proteína foram então carregadas em um gel de 12 poços de Tris-Glicina a 4-20% e executadas por 1,5 horas a 150 V usando tampão de corrida SDS. Posteriormente, as proteínas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose usando o iBlot2 da Thermo Fisher. Após lavagem com tampão TBST 1x, os blots foram bloqueados em solução de leite a 5% por um mínimo de 1 hora, seguido de incubação com os anticorpos primários durante a noite. Os blots foram então lavados e incubados no anticorpo secundário por um mínimo de uma hora e lavados com tampão TBST novamente. Reagentes ECL foram usados seguido por imageamento dos blots usando a máquina de imageamento Bio-Rad (Bio- Rad, Hercules, CA).
SILENCIAMENTO (KNOCK OUT) DE PKM-1
[000219] Para silenciar (knock out) PKM-1, RNAs guia (gRNAs) direcionados às regiões de íntron 5' e 3' flanqueando o éxon 9 do gene PKM foram clonados em um vetor de expressão de gRNA Genentech. Esta construção foi então cotransfectada com o plasmídeo de expressão Cas9 em células que expressam mAb-2. As células transfectadas foram clonadas em uma única célula e a deleção do éxon 9 foi confirmada por PCR de DNA genômico. Os seguintes oligos de gRNA foram mais eficazes na deleção do éxon 9 (PKM-1) e os grupos direcionados a esses oligos foram usados para isolar linhagens celulares mAb-2 do nocaute de PKM-1: 5' gRNA: GTCCTTTGGGCAGAGACAG (SEQ ID NO: 33) 3’ gRNA: GACCAGAGTACTCCCTCGT (SEQ ID NO: 34)
[000220] Sequência de iniciadores de PCR de DNA genômico: 5'-iniciador: CCAGATTTGGTGAGGACGAT (SEQ ID NO: 35) 3'-iniciador: AGCTGTGTTGTGAGGCATTG (SEQ ID NO: 36)
RESULTADOS O AUMENTO NOS NÍVEIS DE PKM-1 DURANTE A PRODUÇÃO SE CORRELACIONA COM O
COMPORTAMENTO LACTOGÊNICO DAS CÉLULAS CHO
[000221] Uma série de semeaduras cultivadas da linhagem celular que expressa mAb-1 foi usada para originar culturas de produção em biorreatores usando estratégias de alimentação padrão ou aperfeiçoadas. A alimentação padrão desencadeou o comportamento lactogênico na linhagem celular mAb-1, enquanto uma estratégia de alimentação aperfeiçoada mitigou o comportamento lactogênico. As condições de alto lactato desencadearam uma queda da viabilidade celular após o dia 10 na cultura de produção (Figura 1A), resultando em graus mais baixos do dia 14 em comparação com as condições de baixo lactato (Figura 1B). Enquanto ambas as condições de cultura tiveram níveis comparáveis de lactato até o dia 7, as condições de alto lactato mostraram um aumento acentuado no acúmulo de lactato a partir do dia 7 na cultura de produção, atingindo mais de 15 g/L no dia 14. Para condições de baixo lactato, um atraso de 3 a 4 dias foi observado antes que os níveis de lactato começassem a aumentar (entre os dias 12 a 14) atingindo somente 8 g/L no dia 14 (Figura 1C).
[000222] Para identificar a(s) enzima(s) que pode(m) se correlacionar com o comportamento lactogênico observado, a análise por Western blot foi realizada em uma variedade de proteínas envolvidas na sinalização do crescimento celular e nas vias de glicólise. Uma vez que em condições de alto lactato a viabilidade celular caiu drasticamente após o dia 10, as amostras dos dias 0, 2, 7 e 10 deste conjunto foram comparadas às amostras dos dias 0, 7, 10 e 14 da condição de baixo lactato (Figuras 1D-1F). Entre todas as diferentes proteínas analisadas (dados não mostrados), somente os níveis de PKM-1 mostraram uma correlação direta com o comportamento lactogênico da linhagem celular que expressa mAb-1. As Figuras 1D-1F mostraram os níveis da proteína PKM-1 e PKM-2 em grânulos celulares. Os níveis de expressão de PKM-1 em amostras de alto lactato começaram a aumentar de forma divergente após o dia 7 na cultura de produção em relação às amostras de baixo lactato. Curiosamente, o aumento nos níveis de PKM-1 tendeu estreitamente com o aumento no acúmulo de lactato, uma vez que, mesmo sob condições de baixo lactato, o aumento nos níveis de PKM-1 no final da cultura de produção (Figura 1E, entre os dias 10 e 14) tendeu com os maiores níveis de lactato em cultura (Figura 1C). Os níveis de PKM-2, no entanto, correlacionaram-se inversamente com o comportamento lactogênico na linhagem celular que expressa mAb-1 (Figura 1F).
[000223] Experimentos do biorreator semelhantes foram conduzidas para a linhagem celular que expressa mAb-2. Tal linhagem celular foi cultivada em meios de produção com condições que promovem comportamentos lactogênicos ou não lactogênicos. A viabilidade celular para a linhagem celular mAb-2 foi comparável entre as condições de alto e baixo lactato até os dias 13 e 14 da cultura de produção (Figura 2A). Isso resultou em uma redução do grau de aproximadamente 25% para a condição de alto lactato em comparação com a condição de baixo lactato (Figura 2B). Ao longo do processo de produção, o acúmulo de lactato no meio foi baixo para o braço de controle de baixo lactato do experimento da linhagem celular mAb-2. No entanto, sob as condições de alto lactato, os níveis de lactato começaram a divergir a partir do dia 7, atingindo mais de 15 g/L no dia 14 da cultura de produção (Figura 2C). A análise por Western blot revelou que os níveis da proteína PKM-1 começaram a aumentar nas amostras com alto lactato, em relação às com baixo lactato, por volta do dia 7 de produção, e aumentaram linearmente até o final da cultura de produção (Figuras 2D e 2E). Este aumento nos níveis de PKM-1 correlacionou-se fortemente com o aumento no lactato acumulado (Figuras 2C e 2E). Semelhante ao mAb-1, os níveis gerais de PKM-2 em amostras de mAb-2 com baixo lactato foram maiores do que os de amostras com alto lactato, conforme ilustrado nas Figuras 2D (painéis inferiores) e Figura 2F. Tomados em conjunto, esses dados sugerem uma correlação direta entre o comportamento lactogênico em células que expressam mAb-1 e mAb-2 e os níveis de PKM-1 nessas células.
AS PROTEÍNAS PKL/R SÃO EXPRESSAS EM CÉLULAS CHO, MAS NÃO SE CORRELACIONAM COM O COMPORTAMENTO LACTOGÊNICO
[000224] Para avaliar se outras formas de PK (além de PKM) são expressas nas células CHO hospedeiras proprietárias, duas linhagens celulares CHO hospedeiras diferentes (CHO-K1 e DHFR-/-) e uma linhagem celular humana (HEK 293) foram analisadas quanto à expressão de proteínas PKL e PKR (PKL/R). Ambas as linhagens celulares CHO, bem como a linhagem celular HEK 293 de controle, mostraram expressão da enzima PKL/R (Figura 3A), indicando que todas as isoformas dos genes PK (incluindo PKM-1, PKM-2 e PKL/R) são expressas nos hospedeiros CHOs selecionados. A expressão de PKL/R que foi regulada diferencialmente ao comparar as condições de lactato alto versus baixo em linhagens celulares que expressam mAb-1 e/ou mAb-2 foi avaliada a seguir. Os níveis de expressão de PKL/R foram comparáveis (uma vez que os níveis de proteína foram normalizados contra actina como controle interno) entre condições de lactato alto e baixo em ambas as linhagens celulares mAb-1 e mAb-2, não mostrando correlação com o comportamento lactogênico nessas linhagens celulares (Figuras 3B-3D). Os níveis mais baixos de PKL/R em amostras de mAb-2 com alto lactato para os dias 7 e 10 na Figura 3C foram devido à carga geral da proteína mais baixa, conforme refletida por níveis mais baixos de actina (como controle de carga) nas mesmas vias. Além das isoformas de PK, a expressão de várias proteínas diferentes envolvidas na sinalização do crescimento celular e nas vias da glicólise também foram analisadas. No entanto, não foi observada nenhuma correlação clara entre a expressão destas proteínas e o comportamento lactogênico observado em linhagens celulares que expressam mAb-1 ou mAb- 2 (dados não apresentados). O fato de que diferentes isoformas de PK foram expressas em células CHO hospedeiras selecionadas sugeriu que essas linhagens celulares podem ser capazes de tolerar a deleção direcionada de uma ou mais isoformas de PK. A correlação direta observada entre os comportamentos lactogênicos das linhagens celulares mAb-1 e mAb-2 com os níveis de PKM-1 durante a fase de produção tornou esta enzima uma boa candidata para deleção direcionada.
DELEÇÃO DIRECIONADA MEDIADA POR CRISPR/CAS9 DO ÉXON 9 NO GENE PKM
[000225] O gene PKM é responsável pela expressão de ambas as enzimas PKM-1 e PKM-2, que diferem somente na inclusão alternativa do éxon 9 ou éxon 10, respectivamente. Uma vez que as linhagens celulares CHO selecionadas não foram sequenciadas e anotadas, nenhuma informação sobre os tipos dos alelos de PKM, números de cópias de genes ou sequência estava disponível. Portanto, para interromper a expressão do gene PKM-1, os construtos de RNA guia que direcionam as regiões de íntron flanqueando o éxon 9, usando as sequências de CHO disponíveis nos bancos de dados públicos, foram projetados (Kent et al., 2002, Genome Res. 12(6):996-1006).
O(s) iniciador(es) de PCR de rastreio 5' foi(ram) concebido(s) para corresponder à região de íntron entre os éxons 8 e 9, e o iniciador de PCR de rastreio 3' foi concebido para combinar o éxon 10 (Figura 4A). A informação da sequência de éxons foi obtida com base na amplificação e sequenciação de cDNA de PKM a partir de mRNAs de hospedeiros CHO selecionados. A linhagem celular que expressa mAb-2 foi transfectada com Cas9 e vários construtos de gRNA. Após a triagem inicial, o grupo que mostra o direcionamento mais eficiente do éxon 9 foi submetido a clonagem de célula única. Vinte linhagens celulares deste grupo foram rastreadas para deleção direcionada do éxon-9, e duas linhagens celulares heterozigotas (HET-3 e HET-18) e duas de nocaute (KO-2 e KO-15) foram identificadas para as quais a deleção do alelo direcionado foi totalmente confirmada por PCR e sequenciamento (Figuras 4B e 4C). Culturas para essas linhagens celulares foram então expandidas para avaliação adicional em biorreatores. O sequenciamento do(s) alelo(s) direcionado(s) confirmou a deleção do éxon 9 em todas as linhagens celulares selecionadas (Figura 4C). Três linhagens celulares (KO-2, HET-3 e HET-18) tiveram a deleção do éxon 9 exatamente nos locais de direcionamento de gRNA 5' e 3' (Figura 4C). Para a linhagem celular KO-15, o tamanho de PCR do(s) alelo(s) direcionado(s) foi menor do que aqueles observados para outras linhagens celulares (Figura 4B). A análise de sequenciação confirmou que 122 pares de bases (pb) a montante do gRNA 5' foram deletados na linhagem celular KO-15 e parcialmente substituídos por uma inserção não relacionada (Figura 4C e dados não mostrados). A deleção nesta região pode afetar a integridade do íntron entre os éxons 8 e 9.
Independentemente disso, o éxon 9 foi totalmente deletado em todas as linhagens celulares selecionadas de acordo com a análise de sequenciamento.
O BLOQUEIO OU DIMINUIÇÃO DA EXPRESSÃO DE PKM-1 EVITOU OU REDUZIU O COMPORTAMENTO LACTOGÊNICO NA LINHAGEM CELULAR MAB-2, RESPECTIVAMENTE.
[000226] As quatro linhagens celulares mAb-2 com deleção do éxon-9 em alguns (HET) ou todos (KO) alelos e a linhagem mAb-2 WT foram todas originadas para estabelecer uma cultura de produção de 14 dias em biorreatores AMBR. O crescimento e a viabilidade das linhagens celulares KO, HET e WT PKM-1 foram mostrados nas Figuras 5A e 5B. As linhagens mAb-2 PKM-1 HET ou KO tinham graus e produtividades específicas relativamente semelhantes às da linhagem celular mAb-2 WT (Figuras 5C e 5D). PKM-1 KO (KO-2 e KO-15) e uma das linhagens celulares mAB-2 HET (HET-3) tinham níveis de lactato muito baixos em comparação com a linhagem celular mAb-2 WT (Figura 5E), quando cultivadas sob condição de controle (lactogênica). A linhagem HET-18, por outro lado, exibiu comportamento lactogênico semelhante em comparação com a mAb-2 WT até o dia 10. Após o dia 10, a taxa de acumulação de lactato na linhagem mAb-2 WT aumentou, aproximadamente dobrou em relação à linhagem HET-18 no dia 14 (Figura 5E).
[000227] A análise por Western blot dessas linhagens celulares mostrou que as linhagens KO-2 e KO-15 eram totalmente deficientes na expressão de PKM-1 e a linhagem celular HET-3 tinha menor expressão de PKM-1 em comparação com a linhagem celular HET-18 (Figura 5F). O fato de que o comportamento lactogênico das linhagens celulares PKM-1 HET e KO se correlacionou diretamente com a expressão da proteína PKM-1 em várias linhagens celulares sugeriu que a alteração observada no comportamento lactogênico não se deve somente a outras diferenças clonais. Uma vez que uma banda correspondente ao alelo WT de comprimento total pode ser amplificada a partir do DNA genômico das linhagens celulares HET (Figura
4B), as possíveis explicações para essas observações podem incluir, mas não se limitar a: expressão diferencial de PKM-1 de diferentes alelos PKM CHO; direcionamento do(s) alelo(s) PKM WT por somente uma construção de gRNA, resultando na interrupção do splicing adequado do éxon; inversão da região alvo do gRNA, ou homogeneização 4 mediada por recombinação de alelo.
[000228] Os níveis de PKM-2 foram baixos para a linhagem celular mAb-2 WT (a diferença relativa foi considerada com a ressalva de que o controle de carregamento de actina também foi menor para esta amostra), enquanto foram maiores para as linhagens celulares HET-3, HET-18 e KO-2 (Figura 5F). Curiosamente, a linhagem celular mAb-2 KO-15 era completamente deficiente na expressão de PKM-2 além de PKM-1 (Figura 5F).
Isto foi provavelmente devido à(s) deleção(ões) maior(es) observada(s) a montante da região alvo 5' do gRNA do(s) alelo(s) PKM, possivelmente afetando a funcionalidade da região de íntron entre os éxons 8 e 9 (Figura 4C).
Isso sugeriu que as células CHO selecionadas poderiam tolerar a falta completa de ambas as enzimas PKM-1 e PKM-2, talvez devido à sua capacidade de expressar enzima(s) PKL/R (Figura 3A).
[000229] Foram investigados atributos de qualidade do produto, tais como alto peso molecular (agregados) e espécies variantes de carga entre linhagens celulares que expressam mAb2 PKM-1 KO e HET e WT. Embora não tenham sido observadas diferenças significativas nos níveis de agregação do produto entre as linhagens celulares PKM-1 KO e HET e WT (Figura 5G), algumas variações foram observadas para os perfis da variante de carga do produto mAb-2 (Figuras 5H). Uma vez que não houve tendências ou correlações claras entre os níveis de lactato e os atributos de qualidade do produto (Figuras 5G e 5H), as diferenças observadas podem ser devido a variações normais que podem ocorrer durante a derivação da linhagem celular.
Além disso, o meio e a alimentação usados nesses experimentos foram otimizados para a linhagem celular mAb-2 WT, não para as linhagens celulares PKM-1 KO ou HET. Uma vez que a alteração dos níveis de PKM pode afetar o perfil metabólico geral dessas linhagens celulares, o ajuste fino do meio e da alimentação pode ser necessário para explorar todos os seus efeitos e influência nos atributos de qualidade do produto.
[000230] Uma vez que é importante analisar o comportamento de qualquer linhagem celular após o armazenamento e descongelamento, as linhagens celulares mAb-2 PKM-1 KO e HET foram armazenadas e, em seguida, descongeladas e mantidas em cultura por 2,5 semanas, juntamente com a linhagem celular WT como controle. Essas células foram então usadas para montar culturas de produção, em quádruplos, para cada linhagem celular, a fim de avaliar seu desempenho pós-descongelamento. Os dados mostraram que o crescimento, a viabilidade, o grau, a produtividade específica e os perfis lactogênicos das linhagens celulares PKM-1 KO e HET foram comparáveis antes e após o banco de células (Figuras 5A-5D e 6A-6D). Como foi observado anteriormente (dados não mostrados), as células mAb-2 WT recém- descongeladas eram menos lactogênicas (10 g/L, Figura 6E) em relação às células mais antigas (15 g/L, Figura 5E). No entanto, este comportamento foi único para a linhagem celular mAb-2 WT, uma vez que a idade celular não teve efeitos significativos no comportamento lactogênico das linhagens celulares mAb-2 PKM-1 KO e HET (Figuras 5E e 6E). Observe que, para todas as linhagens celulares, um acúmulo gradual de lactato no meio foi observado no dia 7 da cultura de produção, após o qual as linhagens celulares PKM-1 KO e HET-3 consumiram o lactato, enquanto um perfil de fuga de lactato foi observado para ambas as linhagens celulares WT e HET-18 (Figura 6E).
Embora tenha sido observado que todas as linhagens celulares mais jovens (pós-descongelamento) tinham picos de ácidos de % relativamente mais baixa (Figura 6G) em comparação com as linhagens celulares mais antigas (Figura
5G), uma característica que talvez estivesse relacionada à idade celular, não havia principais diferenças no que diz respeito à qualidade do produto entre as linhagens celulares lactogênicas (WT ou PKM-1 HET-18) e não lactogênicas (PKM-1 KO ou HET-3) (Figuras 6F-6G).
DISCUSSÃO
[000231] O comportamento lactogênico em culturas de células CHO pode desencadear a acidificação da cultura e alta osmolaridade como o resultado da adição de base para controlar o pH da cultura, impactando negativamente a viabilidade, VCC e, eventualmente, o grau de produção (Li et al., 2010, MAbs 2(5):466 -79). A geração de lactato resulta da glicólise aeróbia, um comportamento que é comumente conhecido como efeito Warburg (Warburg, 1956, Science 123(3191):309-14), e é observada em muitas células cultivadas e cancerosas. Essas células usam o processo de glicólise para gerar energia e regular esse processo em resposta a vários fluxos de energia e metabólicos (Mulukutla et al., 2014, PLoS One 9(6):e98756; Mulukutla et al., 2010, Trends Biotechnol. 28(9):476-84; Luo et al., 2012, Biotechnol. Bioeng.
109(1):146-56; Ahn e Antoniewicz, 2012, Biotechnol. J. 7(1):61-74). Embora alguns comportamentos lactogênicos possam ser controlados pela engenharia de processo (Luo et al., 2012, Biotechnol. Bioeng. 109(1):146-56; Gagnon et al., 2011, Biotechnol. Bioeng. 108(6):1328-37), essas abordagens, no entanto, não revelaram a causa raiz do comportamento observado. Para ter uma melhor compreensão do comportamento lactogênico no hospedeiro CHO, duas linhagens celulares lactogênicas que expressam mAb-1 ou mAb-2 foram identificadas para as quais o comportamento lactogênico poderia ser restringido por meio da modificação da estratégia de alimentação ou do pH da cultura. Essas linhagens celulares derivadas independentemente foram usadas como ferramentas onde foi analisado um painel de proteínas e enzimas envolvidas na sinalização do crescimento celular ou nas vias de glicólise, a fim de delinear sua possível correlação com o comportamento lactogênico. Esses achados revelaram uma correlação direta entre a expressão de PKM-1 e o comportamento lactogênico em ambas as linhagens celulares mAb-1 e mAb-2 (Figuras 1D-1F e 2D-2F).
[000232] Os níveis detectados de PKM-1 em ambas as culturas de produção de mAb-1 e mAb-2 foram baixos nos momentos iniciais durante a produção e aumentaram de uma maneira correlacionada com o aumento nos níveis de lactato na cultura. Os níveis de PKM-2 foram inversamente correlacionados com o comportamento lactogênico nessas linhagens celulares (Figuras 1D-1F e 2D-2F). Isso pode ser devido à função de proteínas envolvidas no splicing alternativo de transcritos de PKM-1 ou PKM-2 do gene PKM (Chaneton e Gottlieb, 2012, Trends Biochem. Sci. 37(8):309-16; Israelsen e Vander Heiden, 2015, Semin. Cell Dev. Biol. 43:43-51; Mazurek, 2011, Int. J.
Biochem. Cell Biol. 43(7):969-80; Harada et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta.
524(2):327-39; Noguchi et al., 1986, J. Biol. Chem. 261(29):13807-12; Noguchi et al., 1987, J. Biol. Chem. 262(29):14366-71). Das duas isoformas do gene PKM, PKM-2 é relatada atuar como um interruptor central para alterar as vias metabólicas, permitindo que as células cancerosas sobrevivam e prosperem sob condições fisiologicamente desfavoráveis, tais como em um ambiente tumoral (Christofk et al., 2008, Nature 452 (7184):230-3; Chaneton e Gottlieb, 2012, Trends Biochem. Sci. 37(8):309-16; Israelsen e Vander Heiden, 2015, Semin. Cell Dev. Biol. 43:43-51). Por outro lado, a isoforma PKM-1 é constitutivamente ativa uma vez expressa. Sem desejar ser limitado pela teoria, a correlação do nível de PKM-1 com o comportamento lactogênico tardio na cultura de produção pode ser devido à conversão incontrolável de PEP em piruvato por esta enzima, seguida pela conversão de piruvato em lactato mediada por LDH.
[000233] A deleção mediada por CRISPR do éxon 9 e, portanto,
PKM-1 na linhagem celular que expressa mAb-2 resultou na reversão completa do comportamento lactogênico em células PKM-1 KO sob condições em que células que expressam mAb-2 WT exibiram comportamento lactogênico (Figura 5E). As duas linhagens celulares mAb-2 HET PKM-1 exibiram comportamentos distintos. Enquanto a linhagem celular HET-3 KO produzia muito pouco lactato (somente um pouco mais do que suas contrapartes PKM-1 KO), a linhagem celular HET-18 era lactogênica e gerava aproximadamente 2/3 da quantidade de lactato conforme as células mAb-2 WT (Figura 5E). Uma correlação direta entre o comportamento lactogênico dessas linhagens celulares HET PKM-1 e os níveis mais elevados de PKM-1 nessas células também foi observada (Figura 5F). As diferenças nos níveis de PKM-1 observados em HET-18 em comparação com linhagens celulares HET-3 podem ser devido a: expressão diferencial de PKM-1 de diferentes alelos PKM ou direcionamento parcial de alelo(s) PKM por um construto de gRNA na linhagem celular HET-3, ou inversão da região direcionada dentro do(s) alelo(s) PKM direcionado(s).
[000234] Foi identificada uma linhagem celular PKM-1de nocaute (knockout) (KO-15) que não foi capaz de expressar a proteína PKM-2 (Figura 5F). A linhagem celular tem uma deleção de 122 pb e inserção de bases aleatórias no íntron a montante da região de direcionamento 5' de gRNA (Figura 3C). A linhagem celular KO-15 pode tolerar a perda de ambas as enzimas PKM-1 e PKM-2 porque as linhagens celulares CHO também expressam PKL/R (Figura 3A), o que pode compensar a falta de expressão de PKM. A expressão de proteína(s) PKL/R no WT nas linhagens celulares WT e todas PKM-1 HET e KO foram confirmadas por meio de análise por Western blot (dados não mostrados). No entanto, a ausência ou redução da expressão de PKM-1 resultou em menor geração de lactato em todas as linhagens celulares PKM-1 KO ou HET, respectivamente, sem efeito no grau ou produtividade específica (Figuras 5C-5D e 6C-6D). A ausência ou atenuação do comportamento lactogênico nessas linhagens celulares foram reproduzíveis e consistentes em idades celulares mais jovens pós-descongelamento e entre todas as repetições (Figuras 5A-5E e 6A-6E).
[000235] O controle do comportamento lactogênico durante a cultura de produção é importante para obter o grau ideal e a qualidade do produto a partir das execuções de fabricação, portanto, nocauteando a expressão de PKM-1 dos hospedeiros pode ser vantajoso para lidar com o comportamento lactogênico de células CHO. É importante confirmar e monitorar a expressão de outras enzimas PK em células CHO antes de direcionar PKM-1 ou todo o gene PKM para deleção, porque as enzimas PKL/R podem compensar a ablação de PKM. O nocaute de todo o gene PKM pode ser tolerado em hospedeiros CHO, e os hospedeiros CHO PKM KO são capazes de expressar anticorpos ou produtos de interesse com grau e qualidade de produto comparáveis aos do hospedeiro WT. Esses hospedeiros KO de PKM podem reduzir o comportamento lactogênico e ter um perfil de crescimento melhor do que o hospedeiro WT, conforme observado nas linhagens celulares KO-2 e KO-15 (Figuras 5A e 6A).
EXEMPLO 2: PRODUÇÃO DE MAB-3 EM LINHAGENS CELULARES CHO PKM DE NOCAUTE (KNOCKOUT) E PKM-1 DE NOCAUTE (KNOCKOUT)
[000236] O gene PKM ou gene PKM-1 foi silenciado (knock out) em uma linhagem celular CHO-K1M, gerando uma linhagem celular hospedeira PKM KO e quatro linhagens celulares hospedeiras PKM-1 KO. Um transgene que codifica mAb-3 foi introduzido nas linhagens celulares hospedeiras CHO- K1M de WT, PKM KO e PKM-1 KO por integração de alvo, gerando três grupos de WT expressando mAb-3 a partir da mesma linhagem celular hospedeira, três grupos de PKM KO expressando mAb-3 da mesma linhagem celular hospedeira e quatro grupos PKM-1 KO expressando mAb-3 de quatro linhagens celulares hospedeiras diferentes.
[000237] Os experimentos a seguir foram realizados conforme divulgado no Exemplo 1, exceto que os gRNAs para gerar o hospedeiro KO de PKM são diferentes e fornecidos abaixo. Os gRNAs usados para gerar as células hospedeiras PKM-1 KO são os mesmos usados no Exemplo 1.
[000238] Os gRNAs para gerar as células hospedeiras PKM KO tinham as seguintes sequências: 5'-gRNA: CCCATCACGGCCCGCAACAC (SEQ ID NO: 42, direcionando uma região dentro do éxon 2 do gene PKM) 3'-gRNA: CTTCTTCAAGACGGGGGATG (SEQ ID NO: 43, direcionando uma região dentro do éxon 12 do gene PKM)
[000239] Grupos produtores de MAb-3 derivados de linhagens celulares hospedeiras PKM e PKM-1 KO tinham Qp e graus comparáveis ou superiores do que grupos WT, mas crescimento inferior (representado pela concentração de células viáveis integrais (IVCC)) na produção em frasco de agitação (Figura 7). Grupos produtores de MAb-3 derivados de linhagens celulares hospedeiras PKM e PKM1 KO também geraram lactato inferior às linhagens celulares hospedeiras WT (Figura 8A), mas consumiram mais glicose (Figura 8B) na produção em frasco de agitação. Conforme mostrado na Figura 8A, as células hospedeiras WT produziram cerca de 1,0 g/L de lactato no dia 15 de produção em um frasco de agitação. Durante a produção em frasco de agitação, uma concentração de lactato entre 1 a 2,5 g/L é considerada alta. Em contraste, as células hospedeiras PKM-1 KO produziram muito pouco lactato e as células hospedeiras PKM KO produziram menos de 0,2 g/L de lactato no dia 15, resultando em uma redução na produção de lactato de mais de 80% quando PKM -1 ou ambos PKM-1 e PKM-2 são silenciados (knock out).
[000240] Grupos produtores de MAb-3 derivados de linhagens celulares hospedeiras PKM/PKM-1 KO tiveram diferentes taxas de síntese/consumo de aminoácidos na produção em frasco de agitação (Figura 9A e Figura 10). Por exemplo, as linhagens celulares hospedeiras PKM KO acumularam 3-fosfoglicerato, o que levou ao aumento da produção de serina e glicina em comparação com as células hospedeiras WT e PKM-1 (Figura 9B).
As linhagens celulares hospedeiras WT acumularam piruvato em comparação com as células hospedeiras PKM KO e PKM-1 (Figura 9C). Sem se limitar a uma teoria particular, o acúmulo de piruvato nas células hospedeiras WT pode levar ao acúmulo de lactato e ao aumento da produção de alanina (Figura 10). As linhagens celulares hospedeiras PKM-1 KO acumularam produtos do ciclo de TCA, tais como oxaloacetato, o que levou ao acúmulo de ácido aspártico e asparagina (Figura 9D) e alfa-cetoglutarato (α-KG), o que levou ao acúmulo de ácido glutâmico, arginina e glutamina (Figura 9E). Sem se limitar a uma teoria específica, esses resultados sugerem que PKM-1 e PKM-2 podem funcionar para regular o nível de produção de piruvato, de modo que o piruvato preferencialmente entre no ciclo de TCA. Um sumário das conclusões acima é mostrado na Figura 10. Com base nesses dados, o meio de cultura de células e as condições usadas para cultivar as células PKM-1 e PKM KO podem ser ajustados para compensar a quantidade de glicose que é consumida e/ou a quantidade de aminoácidos que é consumida ou sintetizada.
[000241] Grupos produtores de MAb-3 derivados de linhagens celulares hospedeiras PKM/PKM1 KO tinham diferentes perfis de glicosilação na produção em frasco de agitação. O hospedeiro PKM KO teve galactosilação diminuída e as linhagens celulares hospedeiras PKM KO e PKM-1 KO tiveram fucosilação ligeiramente diminuída (Figura 11). Sem estar limitado a uma teoria particular, essas alterações na glicosilação provavelmente não afetarão a atividade do anticorpo gerado.
[000242] O conteúdo de todas as figuras e todas as referências,
patentes e pedidos de patentes publicados e números de acesso citados ao longo deste pedido são expressamente incorporados neste documento por referência.

Claims (84)

REIVINDICAÇÕES
1. CÉLULA DE MAMÍFERO, tendo atividade lactogênica reduzida ou eliminada, caracterizada pela expressão de uma isoforma de polipeptídeo do músculo piruvato quinase (PKM) ser silenciada (knock out) ou sofrer knock down, e em que a isoforma de polipeptídeo PKM compreende uma isoforma de polipeptídeo PKM-1.
2. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela expressão da isoforma de polipeptídeo PKM-2 ser silenciada (knock out) ou sofrer knock down.
3. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pela célula ser uma célula CHO.
4. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica um produto de interesse.
5. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo produto de interesse compreender uma proteína.
6. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo produto de interesse compreender uma proteína recombinante.
7. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizada pelo produto de interesse compreender um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
8. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo anticorpo ser um anticorpo multiespecífico ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
9. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo anticorpo consistir em uma sequência de cadeia única pesada e uma sequência de cadeia única leve ou fragmentos de ligação ao antígeno destas.
10. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo anticorpo compreender um anticorpo quimérico, um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado.
11. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizada pelo anticorpo compreender um anticorpo monoclonal.
12. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 11, caracterizada pela sequência de ácido nucleico ser integrada no genoma celular da célula de mamífero em um local direcionado.
13. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por compreender ainda um ácido nucleico que codifica o produto de interesse que é integrado aleatoriamente no genoma celular da célula de mamífero.
14. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pela atividade lactogênica das células de mamífero ser inferior a cerca de 50% da atividade lactogênica de uma célula de referência.
15. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pela atividade lactogênica das células de mamífero ser inferior a cerca de 20% da atividade lactogênica de uma célula de referência.
16. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada pela célula de referência ser uma célula que compreende alelos do tipo selvagem do gene PKM.
17. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pela atividade lactogênica da célula de mamífero ser determinada no dia 14 ou no dia 15 de uma fase de produção.
18. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pela célula de mamífero produzir menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção.
19. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pela célula de mamífero produzir menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção em um frasco de agitação.
20. CÉLULA DE MAMÍFERO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pela célula de mamífero produzir menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção em um biorreator.
21. CÉLULA DE MAMÍFERO, caracterizada por compreender um alelo de um gene PKM que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 39-41, ou nas sequências de nucleotídeos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 37 e 38.
22. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender uma célula de mamífero, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a
21.
23. MÉTODO PARA REDUZIR OU ELIMINAR A ATIVIDADE LACTOGÊNICA EM UMA CÉLULA, caracterizado por compreender silenciar (knock out) ou aplicar knock down na expressão de uma isoforma de polipeptídeo do músculo piruvato quinase (PKM).
24. MÉTODO PARA REDUZIR OU ELIMINAR A ATIVIDADE LACTOGÊNICA EM UMA CÉLULA, caracterizado por compreender administrar à célula um sistema de engenharia genética, em que o sistema de engenharia genética silencia (knock down) ou aplica knock down na expressão de uma isoforma de polipeptídeo do músculo piruvato quinase (PKM).
25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo sistema de engenharia genética ser selecionado a partir do grupo que consiste em um sistema CRISPR/Cas, um sistema de nuclease de dedo de zinco (ZFN), um sistema de nuclease efetora semelhante a ativadores de transcrição (TALEN) e uma combinação destes.
26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo sistema de engenharia genética ser um sistema CRISPR/Cas9.
27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo sistema CRISPR/Cas9 compreender: (a) uma molécula Cas9, e (b) um ou mais RNAs guia (gRNAs) compreendendo uma sequência de direcionamento que é complementar a uma sequência alvo em um gene PKM.
28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pela sequência alvo ser selecionada a partir do grupo que consiste em: uma porção do gene PKM, uma região de íntron 5' flanqueando o éxon 9 do gene PKM, uma região de íntron 3' flanqueando o éxon 9 do gene PKM, uma região de íntron 3' flanqueando o éxon 10 do gene PKM, uma região dentro do éxon 1 do gene PKM, uma região dentro do éxon 2 do gene PKM, uma região dentro do éxon 12 do gene PKM e combinações destas.
29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelos um ou mais gRNAs compreenderem: (i) (1) um primeiro gRNA compreendendo uma sequência alvo que é complementar a uma região de íntron 5' flanqueando o éxon 9 do gene PKM; e (2) um segundo gRNA compreendendo um domínio alvo que é complementar a uma região de íntron 3' flanqueando o éxon 9 do gene PKM; ou (ii) (1) um primeiro gRNA compreendendo uma sequência alvo que é complementar a uma região dentro do éxon 2 do gene PKM; e (2)
um segundo gRNA compreendendo um domínio alvo que é complementar a uma região dentro do éxon 12 do gene PKM.
30. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelos um ou mais gRNAs compreenderem uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 33-34 e 42-43, e uma combinação destas.
31. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 30, caracterizado pela expressão da isoforma de polipeptídeo PKM ser silenciada (knock out) e a atividade lactogênica na célula ser eliminada ou reduzida em comparação com a atividade lactogênica de uma célula de referência.
32. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 30, caracterizado pela expressão da isoforma de polipeptídeo PKM sofrer knock down e a atividade lactogênica na célula ser reduzida em comparação com a atividade lactogênica de uma célula de referência.
33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pela atividade lactogênica da célula ser inferior a cerca de 50% da atividade lactogênica da célula de referência.
34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pela atividade lactogênica da célula ser inferior a cerca de 20% da atividade lactogênica da célula de referência.
35. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 34, caracterizado pela atividade lactogênica da célula ser determinada no dia 14 ou no dia 15 de uma fase de produção.
36. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 35, caracterizado pela célula produzir menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção.
37. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 35, caracterizado pela célula produzir menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção em um frasco de agitação.
38. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 35, caracterizado pela célula produzir menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção em um biorreator.
39. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 38, caracterizado pela célula de referência ser uma célula que compreende alelos do tipo selvagem do gene PKM.
40. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 39, caracterizado pela isoforma de polipeptídeo PKM ser a isoforma de polipeptídeo PKM-1.
41. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 39, caracterizado pela isoforma de polipeptídeo PKM ser a isoforma de polipeptídeo PKM-1 e a isoforma de polipeptídeo PKM-2.
42. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo sistema de engenharia genética compreender um RNA selecionado a partir do grupo que consiste em: um RNA de grampo curto (shRNA), um pequeno RNA de interferência (siRNA), e um microRNA (miRNA), em que o RNA é complementar a uma porção de um mRNA expresso pelo gene PKM.
43. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo mRNA expresso pelo gene PKM codificar uma isoforma de polipeptídeo PKM-1.
44. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pela expressão da isoforma de polipeptídeo PKM-1 ser silenciada (knock out) ou sofrer knock down e a atividade lactogênica da célula ser reduzida em comparação com a atividade lactogênica de uma célula de referência.
45. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 44, caracterizado pelo sistema de engenharia genética compreender ainda um segundo RNA selecionado a partir do grupo que consiste em: shRNA, um siRNA e um microRNA miRNA, em que o segundo RNA é complementar a uma porção de um mRNA expresso pelo gene PKM que codifica uma isoforma de polipeptídeo PKM-2.
46. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pela expressão das isoformas do polipeptídeo PKM-1 e PKM-2 serem silenciadas (knock out) ou sofrerem knock down e a atividade lactogênica da célula ser reduzida.
47. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo sistema de engenharia genética ser um sistema de nuclease de dedo de zinco (ZFN) ou um sistema de nuclease efetora semelhante a ativadores de transcrição (TALEN).
48. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 47, caracterizado pela célula ser uma célula de mamífero.
49. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pela célula de mamífero ser uma célula CHO.
50. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 49, caracterizado pela célula expressar um produto de interesse.
51. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo produto de interesse expresso pelas células ser codificado por uma sequência de ácido nucleico.
52. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pela sequência de ácido nucleico ser integrada no genoma celular da célula em um local direcionado.
53. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 52, caracterizado pelo produto de interesse expresso pelas células ser ainda codificado por uma sequência de ácido nucleico que é integrada aleatoriamente no genoma celular da célula de mamífero.
54. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 53, caracterizado pelo produto de interesse compreender uma proteína.
55. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo produto de interesse compreender uma proteína recombinante.
56. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 55, caracterizado pelo produto de interesse compreender um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
57. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo multiespecífico ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
58. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo anticorpo consistir em uma sequência de cadeia única pesada e uma sequência de cadeia única leve ou fragmentos de ligação ao antígeno destas.
59. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 58, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo quimérico, um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado.
60. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 59, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo monoclonal.
61. MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE INTERESSE, caracterizado por compreender cultivar células de mamífero que expressam o produto de interesse, em que as células de mamífero expressam o produto de interesse e têm atividade lactogênica reduzida ou eliminada.
62. MÉTODO PARA CULTIVAR UMA POPULAÇÃO de células de mamífero que expressa um produto de interesse, caracterizado pelas células de mamífero reduzirem ou eliminarem atividade lactogênica.
63. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 61 ou 62, caracterizado pela redução ou eliminação da atividade lactogênica resultar do silenciamento (knock out) ou knock down da expressão de uma isoforma de polipeptídeo do músculo piruvato quinase (PKM) nas células de mamífero.
64. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pela isoforma de polipeptídeo PKM ser a isoforma de polipeptídeo PKM-1.
65. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pela isoforma de polipeptídeo PKM ser a isoforma de polipeptídeo PKM-1 e a isoforma de polipeptídeo PKM-2.
66. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 65, caracterizado pela atividade lactogênica das células de mamífero ser inferior a cerca de 50% da atividade lactogênica de uma célula de referência.
67. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 65, caracterizado pela atividade lactogênica das células de mamífero ser inferior a cerca de 20% da atividade lactogênica de uma célula de referência.
68. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 67, caracterizado pela atividade lactogênica das células de mamífero ser determinada no dia 14 ou no dia 15 de uma fase de produção.
69. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 68, caracterizado pelas células de mamífero produzirem menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção.
70. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 68, caracterizado pelas células de mamífero produzirem menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção em um frasco de agitação.
71. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 68, caracterizado pelas células de mamífero produzirem menos que cerca de 2,0 g/L de lactato durante uma fase de produção em um biorreator.
72. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 71, caracterizado pela célula de referência ser uma célula que compreende pelo menos um ou ambos os alelos do tipo selvagem do gene PKM.
73. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 72, caracterizado pelas células de mamífero serem células CHO.
74. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 73, caracterizado pelo produto de interesse expresso pelas células de mamífero ser codificado por uma sequência de ácido nucleico.
75. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pela sequência de ácido nucleico ser integrada no genoma celular das células de mamífero em um local direcionado.
76. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 75, caracterizado pelo produto de interesse expresso pelas células ser ainda codificado por uma sequência de ácido nucleico que é integrada aleatoriamente no genoma celular das células de mamífero.
77. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 76, caracterizado pelo produto de interesse compreender uma proteína.
78. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 77, caracterizado pelo produto de interesse compreender uma proteína recombinante.
79. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 79, caracterizado pelo produto de interesse compreender um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
80. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo multiespecífico ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
81. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo anticorpo consistir em uma sequência de cadeia única pesada e uma sequência de cadeia única leve ou fragmentos de ligação ao antígeno destas.
82. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 81, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo quimérico, um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado.
83. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 82, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo monoclonal.
84. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 83, caracterizado por compreender ainda a colheita do produto de interesse.
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