JP2023040016A - 哺乳動物細胞におけるラクトジェニック活性の制御 - Google Patents

哺乳動物細胞におけるラクトジェニック活性の制御 Download PDF

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Abstract

【課題】目的の生成物、例えば組み換えタンパク質を製造するための方法、細胞、及び組成物を提供する。【解決手段】ラクトジェニック活性が低下した又は除去された哺乳動物細胞であって、ピルビン酸キナーゼ筋(PKM)ポリペプチドアイソフォームの発現がノックダウン又はノックアウトされており、前記PKMポリペプチドアイソフォームがPKM-1ポリペプチドアイソフォームを含む、哺乳動物細胞を提供する。また、細胞のラクトジェニック活性を低下させる又は除去するための方法及び組成物、並びに、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞を含む組成物、並びにこれらの使用方法も提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2018年3月29日に出願された米国特許出願第62/649,963号に対する優先権を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
配列表
本出願には、EFS-Webを介してASCIIフォーマットにて提出された配列表が含まれ、その全体が参照により本明細書に援用される。2019年3月28日に作成された該ASCIIコピーは、00B206_0785_SL.txtという名称であり、444,511バイトのサイズである。
1.発明の分野
本開示は、目的の生成物、例えば組み換えタンパク質を製造するための方法及び組成物に関する。特に、本開示は、目的の生成物を発現する哺乳動物細胞であって、細胞(例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞)が、制御されたラクトジェニック(lactogenic)活性を有する、哺乳動物細胞に関する。本開示はまた、哺乳動物細胞でピルビン酸キナーゼ筋(PKM)発現(例えば、PKM-1発現)を制御して、細胞におけるラクトジェニック活性を低下又は除去するための方法及び組成物、並びに、ラクトジェニック活性が低下又は除去された1つ以上の細胞を有する組成物、及びその使用方法にも関する。
2.背景
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、その、適切なタンパク質の折りたたみ、集合、及び翻訳後用途に対する能力故に、臨床用途のための治療用タンパク質の製造において、幅広く使用されている。通常、他の不死化細胞株と同様に、CHO細胞は、Warburg効果(Warburg,1956,Science 123(3191):309-14)として知られるプロセスである、好気的解糖により、グルコースを消費してラクテートを生成する傾向にある。生成培地におけるラクテートの蓄積は、細胞増殖、生存能、及び産生能に逆効果を及ぼし得る。このような、製造工程中におけるCHO細胞のラクトジェニック挙動(即ち、ラクテート生成挙動)により、生存能及び産生能の低下が引き起こされ得、生成される治療用タンパク質の質が変化する可能性がある。
処理条件を標的にするいくつかのアプローチが、ラクトジェニックCHO細胞株におけるラクテートの生成を緩和するために開発されてきた。例えば、銅の量を最適化することが、いくつかのCHO細胞株において、ラクトジェニック挙動を防止するのに効果的であることが示されている(Luo et al.,2012,Biotechnol.Bioeng.109(1):146-56;Xu et al.,2016,Bioprocess Biosyst.Eng.39(11):1689-702)。培地中のpHを上昇させることにより引き起こされる、栄養素供給制御を伴う別のアプローチ(ハイエンドpH制御グルコース送達、又はHIPDOG)が、大規模なCHO培地中でのラクテート蓄積を低下させる、又は除去するのに効果的であることが、示されている(Gagnon et al.,2011,Biotechnol.Bioeng.108(6):1328-37)。しかし、前者のアプローチは、全てのラクトジェニックCHO細胞株に適用できず、後者では、大規模な製造プロセスが複雑化する可能性があるため、これらのアプローチには制限がある。更に、これらのアプローチは、CHO細胞における、ラクトジェニック挙動の根底的なメカニズムを標的にしない。
したがって、細胞培養におけるラクテート生成を低下させるための技術が、当該技術分野において求められている。
3.概要
本開示は、目的の生成物、例えば組み換えタンパク質を製造するための方法、細胞、及び組成物に関する。特に、本明細書で記載した方法、細胞、及び組成物は、目的の生成物を発現する、細胞(例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞)が、制御されたラクトジェニック活性を有する改善された哺乳動物細胞を含む。本明細書に記載する方法及び組成物は、哺乳動物細胞のラクトジェニック活性を制御するために、ラクトジェニック活性と関連する、根底的な影響、例えば哺乳動物細胞の生存能及び産生能の低下、並びに、生成される目的の生成物の質の変化を低下させる、又は除去する。
本開示は更に、哺乳動物細胞でピルビン酸キナーゼ筋(PKM)発現(例えば、PKM-1発現)を制御することによって、細胞におけるラクトジェニック活性を低下させる、又は除去するための方法及び組成物、並びに、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞、及びその使用方法に関する。
一態様において、本開示は、ピルビン酸キナーゼ筋(PKM)ポリペプチドの1つ又は複数のアイソフォームの発現がノックダウン又はノックアウトされている、ラクトジェニック活性が低下した、又は除去された哺乳動物細胞に関する。特定の実施形態において、ノックアウト又はノックダウンされたPKMポリペプチドアイソフォームは、PKM-1ポリペプチドアイソフォームである。特定の実施形態において、ノックアウト又はノックダウンされたPKMポリペプチドアイソフォームは、PKM-1ポリペプチドアイソフォーム、及びPKM-2ポリペプチドアイソフォームの両方である。特定の実施形態において、哺乳動物細胞のラクトジェニック活性は、参照細胞のラクトジェニック活性の約50%未満、例えば約20%未満である。特定の実施形態において、参照細胞は、PKM遺伝子の1つ以上の野生型対立遺伝子を含む細胞である。例えば、PKM遺伝子の両方の対立遺伝子が野生型であるか、又は未改変である。特定の実施形態において、哺乳動物細胞のラクトジェニック活性は、産生期の14日目又は15日目に測定される。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、産生期の間に、約1.0g/L未満、又は約2.0g/L未満のラクテートを生成する、例えば、産生期の間に、振盪フラスコ内で約1.0g/L未満、又は約2.0g/L未満のラクテートを産生する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、産生期中にバイオリアクター中で、約2.0g/L未満のラクテートを産生する。本開示は、配列番号39~41からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、又は、配列番号37及び38に記載のヌクレオチド配列を含むPKM遺伝子の対立遺伝子を含む哺乳動物細胞を提供する。本開示は、本明細書にて開示した1つ以上の細胞、例えば哺乳動物細胞を含む組成物を更に提供する。
特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、目的の生成物をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態において、核酸配列は、標的化された位置における哺乳動物細胞の細胞ゲノムにて組み込まれる。あるいは、及び/又は更に、目的の生成物をコードする核酸は無作為に、哺乳動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれる。特定の実施形態において、哺乳動物細胞はCHO細胞である。
特定の実施形態において、目的の生成物はタンパク質、例えば組み換えタンパク質を含む。特定の実施形態において、目的の生成物は、抗体又はその抗原結合断片を含む。例えば、限定されるものではないが、抗体は多重特異性抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施形態において、抗体は、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる。特定の実施形態において、抗体はキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体、及び/又はモノクローナル抗体である。
別の態様においては、本開示は、細胞におけるラクトジェニック活性の低下又は除去方法に関する。特定の実施形態において、方法は、ピルビン酸キナーゼ筋(PKM)ポリペプチドアイソフォームの発現の、ノックダウン又はノックアウトを含む。特定の実施形態において、方法は、細胞に、ピルビン酸キナーゼ筋(PKM)ポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトする遺伝子組み換えシステムを投与することを含む。特定の実施形態において、遺伝子組み換えシステムは、CRISPR/Casシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)システム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態において、方法により、参照細胞のラクトジェニック活性の約50%未満、例えば約20%未満であるラクトジェニック活性を有する細胞がもたらされる。特定の実施形態において、参照細胞は、PKM遺伝子の1つ以上の野生型対立遺伝子を含む細胞である。例えば、PKM遺伝子の両方の対立遺伝子が野生型であるか、又は未改変である。特定の実施形態において、細胞のラクトジェニック活性は、産生期の14日目又は15日目に測定される。特定の実施形態において、細胞は、産生期の間に、約1.0g/L未満、又は約2.0g/L未満のラクテートを生成する、例えば、産生期の間に、振盪フラスコ内で約1.0g/L未満、又は約2.0g/L未満のラクテートを産生する。特定の実施形態において、細胞は、産生期中にバイオリアクター内で約2.0g/L未満のラクテートを産生する。
特定の非限定的実施形態において、本開示にて使用するための遺伝子組み換えシステムは、Cas9分子、及び、PKM遺伝子の標的配列に対して相補的な標的化ドメインを含む、1つ以上のガイドRNA(gRNA)を含むCRISPR/Cas9システムである。特定の実施形態において、標的配列は、PKM遺伝子の一部、PKM遺伝子のエクソン9に隣接する5’イントロン領域、PKM遺伝子のエクソン9に隣接する3’イントロン領域、PKM遺伝子のエクソン10に隣接する3’イントロン領域、PKM遺伝子のエクソン1内の領域、PKM遺伝子のエクソン2内の領域、PKM遺伝子のエクソン12内の領域、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態において、1つ以上のgRNAは、PKM遺伝子のエクソン9に隣接する5’イントロン領域に対して相補的な標的配列を含む第1のgRNA、及び、PKM遺伝子のエクソン9に隣接する3’イントロン領域に対して相補的な標的ドメインを含む第2のgRNAを含む。特定の実施形態において、1つ以上のgRNAは、PKM遺伝子のエクソン2内の領域に対して相補的な標的配列を含む第1のgRNA、PKM遺伝子のエクソン12内の領域に対して相補的な標的ドメインを含む第2のgRNAを含む。例えば、限定されるものではないが、1つ以上のgRNAは、配列番号33~34及び42~43からなる群から選択される配列、並びにこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態において、PKMポリペプチドアイソフォームの発現がノックアウト又はノックダウンされており、細胞のラクトジェニック活性が除去されている。特定の実施形態において、PKMポリペプチドアイソフォームは、PKM-1ポリペプチドアイソフォーム、又はPKM-1及びPKM-2ポリペプチドアイソフォームの組み合わせである。
特定の実施形態において、本開示にて使用するための遺伝子組み換えシステムは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)システム、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)システムである。特定の非限定的実施形態において、遺伝子組み換えシステムは、ショートヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、及びマイクロRNA(miRNA)からなる群から選択されるRNAを含み、RNAは、PKM遺伝子により発現されるmRNAに相補的である。特定の実施形態において、PKM遺伝子により発現されるmRNAは、PKM-1ポリペプチドアイソフォームをコードする。特定の実施形態において、PKM-1ポリペプチドアイソフォームの発現がノックダウンされ、細胞のラクトジェニック活性が低下している。特定の実施形態において、遺伝子組み換えシステムは、shRNA、siRNA、及びマイクロRNA miRNAからなる群から選択される第2のRNAを更に含み、第2のRNAは、PKM-2ポリペプチドアイソフォームをコードするPKM遺伝子により発現されるmRNAの一部に相補的である。特定の実施形態において、PKM-1及びPKM-2ポリペプチドアイソフォームの発現がノックアウト又はノックダウンされており、細胞のラクトジェニック活性が低下している。
更なる態様において、本開示は、例えば、本明細書にて開示した細胞からの、目的の生成物の製造方法を提供する。例えば、目的の生成物の製造方法は、ラクトジェニック活性が低下した、又は除去された哺乳動物細胞を培養して目的の生成物を生成することを含む。特定の実施形態において、本開示は、目的の生成物を発現する哺乳動物細胞の集団の培養方法であって、哺乳動物細胞が、低下した、又は除去されたラクトジェニック活性を有する、方法を提供する。特定の実施形態において、ラクトジェニック活性の低下又は除去は、哺乳動物細胞でピルビン酸キナーゼ筋(PKM)ポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトすることによりもたらされる。特定の実施形態において、PKMポリペプチドアイソフォームはPKM-1ポリペプチドアイソフォームである。特定の実施形態において、PKM-2ポリペプチドアイソフォームの発現もまたノックダウン又はノックアウトされている。特定の実施形態において、方法は、細胞培養液から目的の生成物を単離することもまた含むことができる。
mAb-1細胞株のラクテート量は、PKM-1の量と直接相関する。低ラクテート及び高ラクテートプロセス下でのmAb-1細胞株における、細胞生存率(図1A)、14日目の力価(図1B)、及びラクテート量(図1C)。(図1D)低ラクテート及び高ラクテートプロセス下での製造中における、異なる日での、mAb-1細胞可溶化物の、PKM-1及びPKM-2ウェスタンブロット分析。アクチンをローディング対照として使用した。アクチンに対して正規化した、相対的なPKM-1(図1E)及びPKM-2(図1F)量の定量化。 mAb-2細胞株のラクテート量は、PKM-1の量と直接相関する。低ラクテート及び高ラクテートプロセス下でのmAb-2細胞株における、細胞生存率(図2A)、14日目の力価(図2B)、及びラクテート量(図2C)。(図2D)低ラクテート及び高ラクテートプロセス下での製造中における、異なる日での、mAb-2細胞可溶化物の、PKM-1及びPKM-2ウェスタンブロット分析。アクチンをローディング対照として使用した。アクチンに対して正規化した、相対的なPKM-1(図2E)及びPKM-2(図2F)量の定量化。 CHO細胞はPKL/R酵素を発現しないが、これらの酵素の量は、生成培養物中でのラクテート量と相関しない。(図3A)2つの異なるCHO宿主細胞株(K1及びDHFR-/-)、並びにヒト293細胞における、PKL/Rタンパク質の細胞内発現の、ウェスタンブロット分析。アクチンをローディング対照として使用する。(図3B及び3C)mAb-1(図3B)及びmAb-2(図3C)細胞株の、高ラクテート及び低ラクテート製造プロセス中での、異なる日数における、PKL/Rの細胞内タンパク質量。(図3D及び3E)mAb-1(図3D)及びmAb-2(図3E)細胞株中でアクチンに対して正規化した、PKL/Rの相対量の定量化。 PKM-1を生成することにより、細胞株がノックアウトされる。(図4A)mAb-2細胞株でのエクソン-9の欠損を評価するために使用した、PKM遺伝子及びgRNA及びスクリーニングプライマーの、エクソン8~10の概略図。PKM遺伝子のエクソン9に隣接する2つのgRNAを、Cas9導入遺伝子と同時にトランスフェクションして、エクソン9の欠損を誘発した。トランスフェクト細胞は、クローニングした単一細胞であった。欠損領域に隣接するPCRプライマーを使用して、PKM対立遺伝子にてエクソン-9の欠損に成功した細胞株のスクリーニングを行った。(図4B)野生型(WT)mAb-2細胞、並びに、gRNA及びCas9導入遺伝子を介してエクソン-9の欠損が標的化された細胞株を、PCRプライマーをスクリーニングすることで分析した。上のバンドはWT PKM対立遺伝子を表す一方で、下のバンドは、エクソン9が欠損したPKM対立遺伝子を表す。KO:ノックアウト細胞株、HET:ヘテロ接合細胞株。(図4C)標的化細胞株における、エクソン-9 KO対立遺伝子と対比した、PKM WT対立遺伝子の配列比較。KO-15細胞株は、標的化PKM対立遺伝子中のエクソン-9の5’領域に、意図した(122bpまでの)欠損よりも大きい欠損を有することに注意されたい。 PKM-1の発現を停止する、又は低下させることにより、高ラクテートプロセス下においても、mAb-2細胞株におけるラクトジェニック挙動が防がれた。AMBR15バイオリアクターを使用する、14日間のバッチ供給生成アッセイの間の、WT、並びにPKM-1 HET及びKO mAb-2細胞株の、生残細胞計数(図5A)、細胞生存率(図5B)、14日目の力価(図5C)、14日目の特異的な産生能(図5D)、及びラクテート量(図5E)。プロセス制御は、図2における高ラクテートプロセスと同じであった。(図5F)PKM-1及びPKM-2タンパク質に対する、示した細胞株の細胞可溶化物のウェスタンブロットアッセイ。アクチンをローディング対照として使用する。(図5G及び5H)示した細胞株からのmAb-2の、凝集率(図5G)及び荷電バリアントの割合(図5H)を含む、抗体生成物の質。 細胞の年齢又は解凍後に関係なく、高ラクテートプロセスを使用することで、ラクトジェニック挙動は、PKM-1 KO又はHET mAb-2細胞株にて防がれる、又は低減される。AMBR15バイオリアクターを使用する、14日間のバッチ供給生成アッセイにおける、若い細胞年齢での、示した細胞株の生残細胞計数(図6A)、細胞生存率(図6B)、14日目の力価(図6C)、14日目の特異的な産生能(図6D)、及びラクテート量(図6E)。(図6F及び6G)示した細胞株からのmAb-2の、凝集率(図6F)及び荷電バリアントの割合(図6G)を含む、抗体生成物の質。プロセス制御は、図5におけるものと同じであった。エラーバーは、4つの個別実験の標準誤差を表す。 PKM及びPKM-1 KO宿主細胞株に由来する、MAb-3産生プールは、(振盪フラスコ産生において)相当する、又は高いQp及び力価を有したが、低い増殖を有した。 PKM及びPKM-1 KO宿主細胞株に由来する、MAb-3産生プールは、振盪フラスコ産生において、少ないラクテートを生成した(図8A)が、より多くのグルコースを消費した(図8B)。 PKM及びPKM-1 KO宿主細胞株に由来する、MAb-3産生プールは、振盪フラスコ産生において、異なるアミノ酸合成/消費速度を示した。 長方形で囲まれる棒及び経路は、PKM KO宿主細胞株が3-ホスホグリセリン酸を蓄積したことを示す。 長方形で囲まれる棒及び経路は、WT宿主細胞株がピルベートを蓄積したことを示す。 長方形で囲まれる棒及び経路は、PKM-1 KO宿主細胞株が、TCAサイクル生成物であるα-ケトグルタレート(a-KG)を蓄積したことを示す。 長方形で囲まれる棒及び経路は、PKM-1 KO宿主細胞株が、TCAサイクル生成物であるオキザロ酢酸を蓄積したことを示す。 グルコース、ラクテート、及びアミノ酸の、宿主細胞の消費率又は生成率。 PKM及びPKM-1 KO宿主細胞株に由来する、MAb-3産生プールは、振盪フラスコ産生において、異なるグリコシル化プロファイルを示した。PKM KO宿主ではガラクトシル化が低下し、PKM KO及びPKM-1 KO宿主細胞株では、フコシル化がわずかに低下した。
5. 詳細な説明
限定を行うものではなく、明確化のために、本明細書にて開示する主題の詳細の説明を、以下の小節に分ける:
5.1 定義;
5.2 PKM発現の制御;
5.3 ラクトジェニック活性が低下した、又は除去された細胞;
5.4 細胞培養法;
5.5 生成物;及び
5.6 例示的実施形態。
5.1 定義
本明細書中で使用される用語は一般に、本開示の文脈内で、かつ、各用語が使用される具体的な文脈においての、当該技術分野における通常の意味を有する。特定の用語を以下で、又は、本明細書の他の箇所にて論じ、本開示の組成物及び方法、並びに、それらの作製及び使用方法について記載する、実践者向けの追加の案内を示す。
本明細書で使用する場合、特許請求の範囲、及び/又は明細書内で、用語「を含む」と共に用いられる場合、語句「a」又は「an」の使用は、「1つ」を意味し得るが、これは「1つ以上の」、「少なくとも1つの」、及び「1つ又は2つ以上」の意味とも一致する。
本明細書で使用する場合、用語「を含む(comprise(s)/include(s))」、「を有する(having/has)」、「することができる」、「を含有する」、及びこれらの変形は、追加の作用又は構造物の可能性を排除しない、オープンエンドの移行句、用語、又は単語であることが意図される。本開示はまた、明示的に記載されているかいないかに関わらず、本明細書にて提示される実施形態又は要素「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」他の実施形態を想到する。
本明細書で使用する場合、用語「ラクトジェニック挙動」又は「ラクトジェニック活性」とは、例えば、好気的解糖により、グルコースを消費してラクテートを生成することによる、細胞のラクテート生成活性を意味する。特定の実施形態において、細胞のラクトジェニック活性は、細胞培養培地中に蓄積したラクテートの量により測定することができる。
用語「約」又は「およそ」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、即ち、測定システムの制限事項にある程度依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野での1回の実施当たり3つ又は3つよりも多くの標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の、最大20%、好ましくは最大10%、より好ましくは最大5%、そしてより好ましくは更に、最大1%の範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的系又はプロセスに関して、この用語は、ある値の1桁以内、好ましくは5倍以内、及びより好ましくは2倍以内を意味することができる。
用語「細胞培養培地」及び「培地」とは、典型的には、以下のカテゴリーのうちの1つ以上からの、少なくとも1つの構成成分を提供する、哺乳動物細胞を増殖させるのに使用される栄養素溶液を意味する:
1) 通常、グルコースなどの炭水化物の形態でのエネルギー供給源;
2) 全ての必須アミノ酸、及び通常、20個のアミノ酸+システインの、塩基性のまとまり;
3) 低濃度で必要とされるビタミン及び/又は他の有機化合物;
4) 遊離脂肪酸;並びに
5) 微量元素(微量元素は、非常に低濃度、通常マイクロモル範囲で典型的には必要とされる、無機化合物又は天然に存在する元素として定義される)。
栄養素溶液は任意に、以下のカテゴリーのいずれかに由来する1つ以上の構成成分が補充されていることができる:
1) 例えばインスリン、トランスフェリン、及び上皮成長因子などの、ホルモン及び他の成長因子;
2) 例えばカルシウム、マグネシウム、及びホスフェートなどの、塩類及び緩衝液;
3) 例えばアデノシン、チミジン、及びヒポキサンチンなどの、ヌクレオシド及び塩基;並びに
4) タンパク質及び組織加水分解物。
細胞を「培養すること」とは、細胞を、細胞の生残及び/又は成長及び/又は増殖に好適な条件下にて、細胞培養培地と接触させることを意味する。
「バッチ培養液」とは、培養プロセスの開始時に、細胞培養のための全ての構成成分(細胞、及び全ての培養栄養素を含む)が、培養バイオリアクターに供給されている培養液を意味する。
本明細書で使用する場合、「流加培養細胞培養液」とは、細胞と培地が培養バイオリアクターに最初に供給され、追加の培養栄養素が、培養プロセス中に培養液に連続して、又は個別に増加して供給され、培養終了前に、周期的に細胞及び/又は生成物が回収される、又はされない、バッチ培養液を意味する。
場合によっては連続培養液と呼ばれる「還流培養液」とは、細胞が、例えば濾過、封入、マイクロ担体へのアンカリングなどにより培養液中に保持され、培地が連続して、段階的に、又は断続的に(又はこれらの任意の組み合わせで)導入され、培養バイオリアクターから取り除かれる培養液である。
本明細書で使用する場合、用語「細胞」とは、動物細胞、哺乳動物細胞、培養細胞、宿主細胞、組み換え細胞、及び組み換え宿主細胞を意味する。このような細胞は一般に、適切な栄養素及び/又は成長因子を含有する培地に配置されたときに、増殖及び生残可能な哺乳動物組織から入手される、又はその組織に由来する細胞株である。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」は同じ意味で用いられ、外因性核酸が導入された細胞を意味し、そのような細胞の後代を含む。宿主細胞としては、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び継代の数に関わらず宿主細胞に由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞の核酸含有量と完全に同一である必要はないが、変異を含むことができる。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか、又は選択されるのと同じ機能若しくは生体活性を有する変異体子孫が本発明に含まれる。
用語「哺乳動物宿主細胞」又は「哺乳動物細胞」とは、適切な栄養素及び成長因子を含有する培地内の、単一層培養液又は懸濁培養液のいずれかに配置したときに、増殖及び生残可能な哺乳動物に由来する細胞株を意味する。特定の細胞株に必要な成長因子は、例えばMammalian Cell Culture(Mather,J.P.ed.,Plenum Press,N.Y.1984)、及びBarnes and Sato,(1980)Cell,22:649に記載されているように、過度な実験をすることなく、実験により速やかに決定される。典型的には、細胞は、目的の、多量の特定のタンパク質、例えば糖タンパク質を、培地にて発現して分泌させることができる。本開示の文脈内で好適な哺乳動物宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO,Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216 1980);dp12.CHO細胞(1989年3月15日に出版された欧州特許第307,247号);CHO-K1(ATCC,CCL-61);SV40により形質転換したサル腎臓CV1株(COS-7,ATCC CRL 1651);ヒト胎児腎臓株(293細胞、又は、懸濁培養液中での増殖のためにサブクローニングされた293細胞、Graham et al.,J.Gen Virol.,36:59 1977);ベビーハムスター腎臓細胞(BHK,ATCC CCL 10);マウスセルトリ細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251 1980);サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL 70);アフリカミドリザルサル腎臓細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);ヒト子宮頚癌細胞(HELA,ATCC CCL 2);イヌ腎臓細胞(MDCK,ATCC CCL 34);バッファロー系ラット肝臓細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138,ATCC CCL 75);ヒト肝臓細胞(Hep G2,HB 8065);マウス乳癌(MMT 060562,ATCC CCL51);TRI細胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 1982);MRC 5細胞;FS4細胞;及びヒト肝癌株(Hep G2)を挙げることができる。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO,Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216 1980);dp12.CHO細胞(1989年3月15日に公開された欧州特許第307,247号)を含む。
本開示の文脈内での用語「ペプトン」とは、本質的に加水分解された動物性タンパク質である、培地補充物を指すことを意味する。このタンパク質の源は、屠殺したウマ由来の動物性副生成物、精製ゼラチン、又は植物物質であることができる。タンパク質は典型的に、酸、熱、又は様々な酵素調製物を用いて、加水分解される。
細胞培養物の「増殖期」とは、細胞が一般に、急速に分裂する、指数的に細胞が増殖する期間(対数期)を意味する。増殖期にて、細胞が維持される時間の長さは、例えば細胞の種類、細胞の増殖速度、及び/又は培地の状態に基づいて変化することができる。特定の実施形態において、この期の間に、細胞は一定期間(通常1~4日間)、細胞増殖が最大化されるような条件下において培養される。宿主細胞の増殖サイクルの決定は、過度な実験をすることなく想到される、特定の宿主細胞に対して決定される。「細胞増殖が最大化されるような期間及び条件下」などは、特定の細胞株に対して、細胞増殖及び分裂が最適であると測定される培養条件を意味する。特定の実施形態において、増殖期の間に、細胞は、特定の細胞株に対しての最適な増殖が達成されるように、一般に約30~40℃の加湿・制御大気下にて、必要な添加剤を含有する栄養素培地にて培養される。特定の実施形態において、細胞は、約1~4日間、通常は2~3日間の期間、増殖期で維持される。
細胞培養の「移行期」とは、産生期の培養条件が関与する期間を意味する。移行期の間、細胞培養液の温度、培地浸透圧などの環境因子は、増殖条件から産生条件へと移動する。
細胞培養の「産生期」とは、細胞増殖が停滞する/停滞を続ける期間を意味する。対数的な細胞増殖は典型的には、この期の前、又は間に低下し、タンパク質産生に引き継がれる。産生期の間、対数的な細胞増殖は終わり、タンパク質産生が主となる。この期間の間、培地は一般に、タンパク質の連続した産生を支え、所望の糖タンパク質生成物を得るために補充される。流加培養及び/又は還流細胞培養プロセスは、この期の間に細胞培養培地を補充し、又は新鮮な培地を供給して、所望の細胞密度、生存能、及び/又は組み換えタンパク質生成物の力価を達成する、及び/又は維持する。産生期は大規模に実施することができる。
用語「発現」又は「発現する」は、本明細書において、宿主細胞内で生じる転写及び翻訳を意味するように用いられる。宿主細胞内での産生遺伝子の発現度合いは、細胞内に存在する、対応するmRNAの量、又は、細胞により産生される産生遺伝子によりコードされるタンパク質の量のいずれかに基づいて測定することができる。例えば、産生遺伝子から転写されるmRNAは、ノーザンハイブリダイゼーションにより定量化されるのが望ましい。Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,pp.7.3-7.57(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。産生遺伝子によりコードされるタンパク質は、タンパク質の生物活性をアッセイすること、又は、そのような活性とは無関係な、タンパク質と反応可能な抗体を使用するウェスタンブロット若しくはラジオイムノアッセイなどのアッセイを用いることのいずれかにより定量化することができる。Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,pp.18.1-18.88(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」とは一般に、約10個を超えるアミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を意味する。ポリペプチドは、宿主細胞に相同であることができる、又は好ましくは、外因性であることができる。後者は、利用される宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞により産生されるヒトタンパク質、又は、哺乳動物細胞により産生される酵母ポリペプチドに対して異種である、即ち、外部のものである、ということを意味する。特定の実施形態において、哺乳動物ポリペプチド(元々、哺乳動物生命体に由来したポリペプチド)、より好ましくは、培地に直接分泌するポリペプチドを使用する。
用語「タンパク質」とは、鎖長が、より高度の三級及び/又は四級構造を産生するのに十分であるアミノ酸の配列を指すことを意味する。これは、「ペプチド」、又は、このような構造を有しない他の低分子量薬剤から、区別するためのものである。典型的には、本明細書のタンパク質は、少なくとも約15~20kD、好ましくは少なくとも約20kDの分子量を有する。本明細書の定義に包含されるタンパク質の例としては、全ての哺乳動物タンパク質、特に、治療用及び診断用抗体などの治療用及び診断用タンパク質、並びに、1つ以上の鎖間及び/又は鎖内ジスルフィド結合を含む多鎖ポリペプチドを含む、1つ以上のジスルフィド結合を含有する一般的なタンパク質が挙げられる。
用語「抗体」は、本明細書で最も広い意味で用いられ、所望の抗原結合活性を示すのであれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体(例えば、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列からなる抗体(このような対の多量体を含む))、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)及び抗体断片を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
本明細書で使用する場合、抗体の「抗体断片」、「抗原結合部」(若しくは単に「抗体部」)、又は、抗体の「抗原結合断片」とは、抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を意味する。抗体断片の例としては、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’);ダイアボディ;線状抗体;一本鎖抗体分子(例えばscFv及びscFab);単一ドメイン抗体(dAb);並びに、抗体断片から形成した多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体フラグメントの総説としては、Holliger and Hudson、Nature Biotechnology 23:1126-1136(2005)を参照のこと。
用語「キメラ」抗体とは、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の源又は種に由来する一方で、重鎖及び/又は軽鎖の残部が異なる源又は種に由来する抗体を意味する。
抗体の「クラス」とは、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には5つの主なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMがあり、これらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG、IgG、IgG、IgG、IgA、及びIgAに更に分けることができる。特定の実施形態において、抗体はIgGアイソタイプである。特定の実施形態において、抗体はIgGアイソタイプである。異なる免疫グロブリンのクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2つの種類のうちの1つに割り当てられることができる。
本明細書で使用する場合、用語「力価」とは、所与の量の培地体積で分けられた細胞培養液により産生された、組み換えにより発現した抗体の総量を意味する。力価は典型的には、1ミリリットル又は1リットルの培地当たりの、抗体のミリグラムの単位(mg/mL又はmg/L)にて表される。特定の実施形態において、力価は、1リットルの培地当たりの抗体のグラム(g/L)で表される。力価は、異なる培地条件下でタンパク質産生物を得ることと比較しての、力価の増加割合といった、相対的な測定値の観点から表現又は評価することができる。
「核酸」、「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」との用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び/又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基(即ち、シトシン(C)、グアニン(G)、アデニン(A)、チミン(T)又はウラシル(U))、糖(即ち、デオキシリボース又はリボース)、及びホスフェート基で構成される。多くの場合、核酸分子は塩基配列によって記述され、ここで、上記塩基は、核酸分子の一次構造(線形構造)を表す。塩基の配列は、典型的には、5’から3’へと表される。ここで、核酸分子との用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、例えば、相補性DNA(cDNA)及びゲノムDNA、リボ核酸(RNA)、特に、メッセンジャーRNA(mRNA)、DNA又はRNAの合成形態、及びこれらの分子の2つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線形又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子との用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。更に、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含んでいてもよい。誘導体化された糖又はホスフェート骨格結合又は化学修飾された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例としては、改変されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、例えば、宿主又は患者において、インビトロ及び/又はインビボで本開示の抗体を直接的に発現するためのベクターとして適したDNA分子及びRNA分子も包含する。このようなDNA(例えば、cDNA)又はRNA(例えば、mRNA)ベクターは、改変されていなくてもよく、又は改変されていてもよい。例えば、mRNAは、インビボで抗体を産生するために対象にmRNAを注入することができるように、RNAベクターの安定性及び/又はコードされた分子の発現を高めるように化学修飾されてもよい(例えば、Stadler et al、Nature Medicine 2017、2017年6月12日にオンラインで公開、doi:10.1038/nm.4356又は欧州特許第2 101 823 B1号を参照のこと)。
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」とは、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。
用語「ハイブリドーマ」とは、免疫原の不死化細胞株と、抗体産生細胞との融合により産生される、ハイブリッド細胞株を意味する。この用語は、ヒト細胞とマウス骨髄腫細胞株とを融合した後、トリオーマ細胞株として一般に知られる形質細胞と融合した結果である、ヘテロハイブリッド骨髄腫融合物の後代を包含する。更に、この用語は、抗体を産生する、あらゆる不死化ハイブリッド細胞株、例えばクアドローマなどを含むことを意味する。例えば、Milstein et al.,Nature,537:3053(1983)を参照のこと。
「ヒト抗体」とは、ヒト若しくはヒト細胞により作製した、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード化配列を利用した、非ヒト源由来の抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、詳細には非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトCDR由来のアミノ酸残基、及びヒトFR由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を意味する。特定の態様において、ヒト化抗体は、非ヒト抗体の可変ドメインに対応する全て又はほぼ全てのCDR、及びヒト抗体の可変ドメインに対応する全て又はほぼ全てのFRにおける、ほぼ全ての少なくとも1つ、通常2つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を受けた抗体を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「超可変領域」又は「HVR」とは、配列内で超可変可能であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」(CDR)のそれぞれを意味する。
一般的に、抗体は、6個のCDRを含み、VHに3個(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)、VLに3個(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)含む。本明細書における例示的なCDRとしては、
(a) アミノ酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及び96-101(H3)で生じる超可変ループ(Chothia and Lesk、J.Mol.Biol.196:901-917(1987));
(b) アミノ酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及び95-102(H3)に存在するCDR(Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed.Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD(1991));及び
(c) アミノ酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及び93-101(H3)で生じる抗原接触(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996));が挙げられる。
特に指示がない限り、CDRは、上記のKabatらに従い決定される。当業者は、CDRの表記は、上記Chothia、上記McCallum、又は、任意の他の、科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。
「免疫抱合体」とは、細胞傷害性剤を含むが、これに限定されない1つ以上の異種分子に抱合される抗体である。
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の母集団から得られる抗体を意味する。即ち、母集団を含む個々の抗体が、可能性のあるバリアント抗体(例えば、天然に存在する変異を含有する、又はモノクローナル抗体の調製中に生じ、このような変異が通常少量存在する)を除いて同一である、及び/又は同一のエピトープに結合する。異なる決定基(エピトープ)に対して異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体の調製と比べて、モノクローナル抗体の調製における各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。したがって修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の母集団から得られる抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本開示の主題に従ったモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えDNA法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない様々な技法によって作製することができ、そのような方法及び他の例示のモノクローナル抗体の作製方法は、本明細書に記載されている。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれVH及びVL)は、一般的に、同様の構造を有し、それぞれのドメインは、4つの保存されたフレームワーク領域(FR)と、3つの相補性決定領域(CDR)とを含む。例えば、Kindt et al.,Kuby Immunology,6th、W.H.Freeman and Co.,page 91(2007)を参照のこと。抗原結合特異性を与えるには、単一のVH又はVLドメインで十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体からのVH又はVLドメインを使用して相補的VL又はVHドメインのライブラリをそれぞれスクリーニングして、単離されてもよい。例えば、Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887(1993)、Clarkson et al.,Nature 352:624-628(1991)を参照のこと。
本明細書で使用する場合、用語「細胞密度」とは、所与の体積の培地中での、細胞の数を意味する。特定の実施形態において、より高いタンパク質産生能をもたらすという点で、高い細胞密度が望ましい。細胞密度は、培地からサンプルを抽出し、顕微鏡の下で細胞を分析すること、市販されている細胞計数装置を使用すること、又は、バイオリアクターそのもの(若しくは培地及び懸濁細胞が通過して、バイオリアクターに戻るループ)に導入した、市販されている好適なプローブを使用することを含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の任意の技術により監視することができる。
本明細書で使用する場合、用語「シーディング」とは、産生期の開始時に、培地に増殖細胞を添加又は播種することを意味する。更に、本明細書で使用する場合、用語「シードトレイン」とは、細胞株を維持するために、約20L以下の体積の培地で、細胞を継続して継代することを意味する。
本明細書で使用する場合、用語「組み換え細胞」とは、由来する元の親細胞に対して、いくらかの遺伝子組み換えを有する細胞を意味する。このような遺伝子組み換えは、遺伝子産物、例えば組み換えタンパク質を発現させるために異種遺伝子を導入した結果であることができる。
本明細書で使用する場合、用語「組み換えタンパク質」とは一般に、抗体を含む、ペプチド及びタンパク質を意味する。このような組み換えタンパク質は「異種」、即ち、利用される宿主細胞、例えばCHO細胞により産生した抗体に対して外来である。
本明細書で使用する場合、「PKMポリペプチド」とは、PKM遺伝子によりコードされたポリペプチドを意味する。PKMポリペプチドは、PKM-1ポリペプチドアイソフォーム及び/又はPKM-2ポリペプチドアイソフォームを含む。
5.2 PKM発現の制御
解糖は、哺乳動物細胞、例えばCHO細胞による、エネルギーを生み出すために使用されるグルコース代謝のプロセスである。解糖は高流動状態又は低流動状態にて生じることができる。グルコース量に対する細胞応答、及び、これらの流動状態間での切り替えは、細胞株、並びに、解糖経路に存在するアイソザイムの量及び組み合わせに応じて変化する可能性がある(Mulukutla et al.,2014,PLoS One 9(6):e98756)。通常の培養条件下にて、他の不死化細胞株と同様に、CHO細胞は、Warburg効果(Warburg,1956,Science 123(3191):309-14)として知られるプロセスである、好気的解糖により、グルコースを消費してラクテートを生成する傾向にある。産生培地中でラクテートが蓄積することにより、細胞増殖、生存能、及び産生能に悪影響を及ぼし得る。したがって、細胞エネルギー流動及び代謝の制御をてこ入れして、細胞培養産生期中のラクテートの蓄積により引き起こされる、望ましくない結果を回避することができる(Mulukutla et al.,2010,Trends Biotechnol.28(9):476-84;Luo et al.,2012,Biotechnol.Bioeng.109(1):146-56;Ahn and Antoniewicz,2012,Biotechnol.J.7(1):61-74)。
解糖プロセスの最終工程では、ピルビン酸キナーゼ(PK)酵素により媒介される、ホスホエノールピルベート(PEP)の、ピルベートへの転換が伴う。4つの異なるPKのアイソフォーム:PK肝臓(PKL)、PK赤血球(PKR)、PK筋1(PKM-1)、及びPK筋2(PKM-2)が識別されている。PK酵素は、2つの異なる遺伝子:PKLR及びPKMにより発現する。選択的エクソンスプライシングにより、異なるPKアイソフォームが生じる。PKLR遺伝子からのmRNA転写物に、エクソン1及び2が共に存在することにより、PKRタンパク質の発現がもたらされる一方、エクソン2で開始するmRNA転写物では、PKLタンパク質の発現が生じる。PKM遺伝子転写物でのエクソン9又は10の選択的スプライシングにより、それぞれPKM-1又はPKM-2が生じる。具体的には、PKM-1は、PAM遺伝子のエクソン9を含みエクソン10を除外し、PKM-2は、PKM遺伝子のエクソン10を含み、エクソン9を除外する。組織特異性プロモーター、転写因子、及び選択的スプライシングは、異なる組織及び細胞株での、これらのアイソフォームの発現を制御する(Chaneton and Gottlieb,2012,Trends.Biochem.Sci.37(8):309-16;Israelsen and Vander Heiden,2015,Semin Cell Dev Biol 43:43-51;Mazurek,2011,Int.J.Biochem.Cell Biol 43(7):969-80;Harada et al.,1978,Biochim.Biophys.Acta.524(2):327-39;Noguchi et al.,1986,J.Biol.Chem.261(29):13807-12;Noguchi et al.,1987,J.Biol.Chem.262(29):14366-71)。
PKM-2は、多量のグルコース消費及びラクテート産生を特徴とする、癌細胞代謝及び腫瘍増殖におけるその中心的な役割が故に、大規模に研究されてきた。PKM-1酵素は恒常的活性型である一方で、PKM-2活性はオリゴマー化、基質結合、及び翻訳後修飾により制御される(Christofk et al.,2008,Nature 452(7184):230-3;Chaneton and Gottlieb,2012,Trends Biochem.Sci.37(8):309-16;Israelsen and Vander Heiden,2015,Semin.Cell Dev.Biol 43:43-51)。例えば、フルクトース1,6-ビスホスフェート(FBP)は、PKM-2に可逆的に結合し、PKM-2の四量体化、及びそれ故の活性化を促進する(Ashizawa et al.,1991,J.Biol.Chem.266(25):16842-6;Dombrauckas et al.,2005,Biochemistry 44(27):9417-29)。チロシン105におけるPKM-2のリン酸化、又は、その他のホスホチロシンタンパク質へのPKM-2の結合は、FBP結合を遮断し、PKM-2の四量体化を防止することにより、PKM-2を不活性化する(Christofk et al.,2008,Nature 452(7184):181-6;Hitosugi et al.,2009,Sci.Signal 2(97):ra73)。しかし、解糖の度合いが増加することにより、代謝フィードバックループの一部としての、リジン305におけるPKM-2のアセチル化が促進され、シャペロン媒介自食作用により、分解に対してPKM-2を標的化する(Lv et al.,2011,Mol.Cell 42(6):719-30)(Macintyre and Rathmell,2011,Mol.Cell 42(6):713-4)。更に、PKM-2二量体は、PEPをホスフェートドナーとして利用して、プロテインキナーゼとして作用する細胞核に局在化し、STAT3のリン酸化、及びMEK5の活性化により、細胞増殖を促進することが示されている(Gao et al.,2012,Mol.Cell 45(5):598-609)。
一態様に従うと、本開示は、細胞におけるPKM発現、例えばPKMポリペプチド発現を制御することによる、哺乳動物細胞のラクトジェニック活性の制御方法に関する。例えば、哺乳動物細胞のラクトジェニック活性の制御方法としては、細胞内でのPKMポリペプチド発現をノックアウト又はノックダウンすることが挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態において、PKM-1の発現はノックダウン又はノックアウトされる。特定の実施形態において、PKM-2の発現はノックダウン又はノックアウトされる。特定の実施形態において、PKM-1及びPKM-2の両方の発現がノックダウン又はノックアウトされる。本明細書で使用する場合、ノックアウトされた発現とは、参照細胞と比較したときに、細胞内において、PKMポリペプチド、例えばPKM-1ポリペプチド及び/又はPKM-2ポリペプチドの発現を取り除くことを意味する。本明細書で使用する場合、ノックダウンされた発現とは、参照細胞と比較したときに、細胞内において、PKMポリペプチド、例えばPKM-1ポリペプチド及び/又はPKM-2ポリペプチドの発現を低減することを意味する。
特定の実施形態において、参照細胞は、PKMポリペプチド、例えばPKM-1及び/又はPKM-2の発現が制御されていない、例えば、低減されていない細胞である。特定の実施形態において、参照細胞は、PKM遺伝子の少なくとも1つ、又は両方の野生型対立遺伝子を含む細胞である。例えば、参照細胞は、両方の野生型PKM対立遺伝子を有する細胞であるが、これに限定されない。特定の実施形態において、参照細胞はWT CHO細胞である。
特定の実施形態において、PKMポリペプチドの発現をノックダウンするように改変された細胞におけるPKMポリペプチド、例えばPKM-1及び/又はPKM-2の発現は、参照細胞、例えばWT CHO細胞のPKMポリペプチド発現の、約90%未満、約80%未満、約70%未満、約60%未満、約50%未満、約40%未満、約30%未満、約20%未満、約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、又は約1%未満である。特定の実施形態において、PKM-1ポリペプチドの発現をノックダウンするように改変された細胞におけるPKM-1ポリペプチドの発現は、参照細胞、例えばWT CHO細胞のPKM-1ポリペプチド発現の、約90%未満、約80%未満、約70%未満、約60%未満、約50%未満、約40%未満、約30%未満、約20%未満、約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、又は約1%未満である。
特定の実施形態において、PKMポリペプチドの発現をノックダウンするように改変された細胞におけるPKMポリペプチド、例えばPKM-1及び/又はPKM-2の発現は、参照細胞、例えばWT CHO細胞のPKMポリペプチド発現の少なくとも約90%、少なくとも約80%、少なくとも約70%、少なくとも約60%、少なくとも約50%、少なくとも約40%、少なくとも約30%、少なくとも約20%、少なくとも約10%、少なくとも約5%、少なくとも約4%、少なくとも約3%、少なくとも約2%、又は少なくとも約1%である。特定の実施形態において、PKM-1ポリペプチドの発現をノックダウンするように改変された細胞におけるPKM-1ポリペプチドの発現は、参照細胞、例えばWT CHO細胞のPKM-1ポリペプチド発現の少なくとも約90%、少なくとも約80%、少なくとも約70%、少なくとも約60%、少なくとも約50%、少なくとも約40%、少なくとも約30%、少なくとも約20%、少なくとも約10%、少なくとも約5%、少なくとも約4%、少なくとも約3%、少なくとも約2%、又は少なくとも約1%である。
特定の実施形態において、PKMポリペプチドの発現をノックダウンするように改変された細胞におけるPKMポリペプチド、例えばPKM-1及び/又はPKM-2の発現は、参照細胞、例えばWT CHO細胞のPKMポリペプチド発現の約90%以下、約80%以下、約70%以下、約60%以下、約50%以下、約40%以下、約30%以下、約20%以下、約10%以下、約5%以下、約4%以下、約3%以下、約2%以下、又は約1%以下である。特定の実施形態において、PKMポリペプチドの発現をノックダウンするように改変された細胞におけるPKMポリペプチド、例えばPKM-1及び/又はPKM-2の発現は、参照細胞、例えばWT CHO細胞のPKMポリペプチド発現の約40%以下である。特定の実施形態において、PKM-1ポリペプチドの発現をノックダウンするようにされた細胞におけるPKM-1ポリペプチドの発現は、参照細胞、例えばWT CHO細胞のPKM-1ポリペプチド発現の約90%以下、約80%以下、約70%以下、約60%以下、約50%以下、約40%以下、約30%以下、約20%以下、約10%以下、約5%以下、約4%以下、約3%以下、約2%以下、又は約1%以下である。
特定の実施形態において、PKMポリペプチドの発現をノックダウンするように改変された細胞におけるPKMポリペプチド、例えばPKM-1及び/又はPKM-2の発現は、参照細胞、例えばWT CHO細胞のPKM-1ポリペプチド発現の約1%~約90%、約10%~約90%、約20%~約90%、約25%~約90%、約30%~約90%、約40%~約90%、約50%~約90%、約60%~約90%、約70%~約90%、約80%~約90%、約85%~約90%、約1%~約80%、約10%~約80%、約20%~約80%、約30%~約80%、約40%~約80%、約50%~約80%、約60%~約80%、約70%~約80%、約75%~約80%、約1%~約70%、約10%~約70%、約20%~約70%、約30%~約70%、約40%~約70%、約50%~約70%、約60%~約70%、約65%~約70%、約1%~約60%、約10%~約60%、約20%~約60%、約30%~約60%、約40%~約60%、約50%~約60%、約55%~約60%、約1%~約50%、約10%~約50%、約20%~約50%、約30%~約50%、約40%~約50%、約45%~約50%、約1%~約40%、約10%~約40%、約20%~約40%、約30%~約40%、約35%~約40%、約1%~約30%、約10%~約30%、約20%~約30%、約25%~約30%、約1%~約20%、約5%~約20%、約10%~約20%、約15%~約20%、約1%~約10%、約5%~約10%、約5%~約20%、約5%~約30%、約5%~約40%である。特定の実施形態において、PKM-1ポリペプチドの発現をノックダウンするようにされた細胞におけるPKM-1ポリペプチドの発現は、参照細胞、例えばWT CHO細胞のPKM-1ポリペプチド発現の約1%~約90%、約10%~約90%、約20%~約90%、約25%~約90%、約30%~約90%、約40%~約90%、約50%~約90%、約60%~約90%、約70%~約90%、約80%~約90%、約85%~約90%、約1%~約80%、約10%~約80%、約20%~約80%、約30%~約80%、約40%~約80%、約50%~約80%、約60%~約80%、約70%~約80%、約75%~約80%、約1%~約70%、約10%~約70%、約20%~約70%、約30%~約70%、約40%~約70%、約50%~約70%、約60%~約70%、約65%~約70%、約1%~約60%、約10%~約60%、約20%~約60%、約30%~約60%、約40%~約60%、約50%~約60%、約55%~約60%、約1%~約50%、約10%~約50%、約20%~約50%、約30%~約50%、約40%~約50%、約45%~約50%、約1%~約40%、約10%~約40%、約20%~約40%、約30%~約40%、約35%~約40%、約1%~約30%、約10%~約30%、約20%~約30%、約25%~約30%、約1%~約20%、約5%~約20%、約10%~約20%、約15%~約20%、約1%~約10%、約5%~約10%、約5%~約20%、約5%~約30%、約5%~約40%である。
特定の実施形態において、PKMポリペプチドの発現をノックダウンするように改変された細胞におけるPKMポリペプチド、例えばPKM-1及び/又はPKM-2の発現は、参照細胞、例えばWT CHO細胞のPKMポリペプチド発現の約5%~約40%である。特定の実施形態において、PKM-1ポリペプチドの発現をノックダウンするようにされた細胞におけるPKM-1ポリペプチドの発現は、参照細胞、例えばWT CHO細胞のPKM-1ポリペプチド発現の約5%~約40%である。異なる参照細胞(例えば、PKM遺伝子の少なくとも1つ又は両方の野生型対立遺伝子を含む細胞)における、PKMポリペプチド、例えばPKM-1及び/又はPKM-2の発現レベルは、変化する可能性がある。例えば、シードトレイン細胞、又は低ラクテート産生細胞は、少量のPKM-1を産生し得る一方で、高ラクテート産生細胞は、多量のPKM-1を産生し得る。
PKM遺伝子転写物でのエクソン9又は10の選択的スプライシングにより、それぞれPKM-1又はPKM-2が生じる。ノックダウン又はノックアウトされたPKM遺伝子は、ヒト由来のPKM遺伝子であることができる。特定の実施形態において、PKM遺伝子は、非ヒト、例えばアカゲザル、イヌ、ミドリザル、ニワトリ、ウシ、ブタ、マウス、チャイニーズハムスター、ラット、又はウサギに由来することができる。
特定の実施形態において、ノックダウン又はノックアウトされたPKM遺伝子は、チャイニーズハムスターPKM遺伝子であることができる。特定の実施形態において、チャイニーズハムスターPKM遺伝子配列は、NCBI参照配列ID NW_003613709.1(範囲:200602..223561)(配列番号44)を有する。特定の実施形態において、PKM遺伝子配列は、NW_003613709.1配列とは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、又はそれ以上のヌクレオチドが異なる。特定の実施形態において、PKM遺伝子配列は、配列番号44に記載の配列とは1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、又はそれ以上異なる。
PKM遺伝子の更なる非限定例としては、ヒトPKM遺伝子(例えばNC_000015.10(範囲72199029..72231624)(配列番号45))、アカゲザルPKM遺伝子(例えばNC_027899.1(範囲49211766..49245983)(配列番号46))、ミドリザルPKM遺伝子(例えばNC_023667.1(範囲11224332..11255538)(配列番号47))、イヌPKM遺伝子(例えばNC_006612.3(範囲35712853..35737643)(配列番号48))、マウスPKM遺伝子(例えばNC_000075.6(範囲59656368..59679375)(配列番号49))、ラットPKM遺伝子(例えばNC_005107.4(範囲64480963..64502957)(配列番号50))、ウサギPKM遺伝子(例えばNC_013685.1(範囲304096..317843)(配列番号51))、ニワトリPKM遺伝子(例えば、NC_006097.4(範囲1506428..1523684)(配列番号52))、ブタPKM遺伝子(例えばNC_010449.5(範囲60971807..61032780)(配列番号53))、及びウシPKM遺伝子(例えばAC_000167.1(範囲18965981..18992644)(配列番号54))が挙げられる。特定の実施形態において、PKM遺伝子配列は、配列番号45~54に記載の配列のいずれか1つとは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、又はそれ以上のヌクレオチドが異なる。特定の実施形態において、PKM遺伝子配列は、配列番号45~54に記載の配列のいずれか1つとは1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、又はそれ以上異なる。
当業者は、異なる哺乳動物細胞は、同一種に由来するもの、例えば2つの異なるCHO宿主細胞株であっても、同じPKM遺伝子配列を共有し得ないことを知っているであろう。PKM遺伝子の配列における小さな差、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個のヌクレオチドの違いが、同一種に由来する2つの哺乳動物細胞に存在し得る。
5.2.1 PKM発現の制御方法
特定の実施形態において、遺伝子組み換えシステムを使用して、PKMポリペプチドの発現(例えばPKM-1発現)を制御(例えば、ノックダウン又はノックアウト)する。当該技術分野において公知の様々な遺伝子組み換えシステムを、本明細書で開示される方法のために使用することができる。このようなシステムの非限定例としては、CRISPR/Casシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)システム、並びに、低分子干渉RNA(siRNA)、ショートヘアピンRNA(shRNA)、及びマイクロRNA(miRNA)などの、遺伝子サイレンシングによるタンパク質ノックダウンのための、他のツールの使用が挙げられる。従来の、改善された、又は修正されたCasシステム、及び、Cpf-1などの、その他の細菌ベースのゲノム切除ツールを含む、当該技術分野において公知の任意のCRISPR/Casシステムを、本明細書で開示される方法と共に使用することができる。
当該技術分野において公知の任意のPKM阻害剤を、本明細書で開示される方法と共に使用してPKM活性を制御することができ、故に、本明細書にて開示した細胞のラクトジェニック活性を制御することができる。PKM阻害剤の非限定例としては、モノフルオロリン酸ナトリウム、L-フェニルアラニン、クレアチンリン酸、Ca2+、フルオロホスフェート、及びピリドキサル5’-ホスフェートが挙げられる。
特定の実施形態において、PKM遺伝子の一部を欠失して、PKMポリペプチドの発現を制御、例えばノックダウン又はノックアウトする。特定の実施形態において、PKM遺伝子の少なくとも約2%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、又は少なくとも約90%が欠失される。特定の実施形態において、PKM遺伝子の約2%以下、約5%以下、約10%以下、約15%以下、約20%以下、約25%以下、約30%以下、約35%以下、約40%以下、約45%以下、約50%以下、約55%以下、約60%以下、約65%以下、約70%以下、約75%以下、約80%以下、約85%以下、又は約90%以下が欠失される。特定の実施形態において、約2%~約90%、約10%~約90%、約20%~約90%、約25%~約90%、約30%~約90%、約40%~約90%、約50%~約90%、約60%~約90%、約70%~約90%、約80%~約90%、約85%~約90%、約2%~約80%、約10%~約80%、約20%~約80%、約30%~約80%、約40%~約80%、約50%~約80%、約60%~約80%、約70%~約80%、約75%~約80%、約2%~約70%、約10%~約70%、約20%~約70%、約30%~約70%、約40%~約70%、約50%~約70%、約60%~約70%、約65%~約70%、約2%~約60%、約10%~約60%、約20%~約60%、約30%~約60%、約40%~約60%、約50%~約60%、約55%~約60%、約2%~約50%、約10%~約50%、約20%~約50%、約30%~約50%、約40%~約50%、約45%~約50%、約2%~約40%、約10%~約40%、約20%~約40%、約30%~約40%、約35%~約40%、約2%~約30%、約10%~約30%、約20%~約30%、約25%~約30%、約2%~約20%、約5%~約20%、約10%~約20%、約15%~約20%、約2%~約10%、約5%~約10%、又は約2%~約5%のPKM遺伝子が欠失される。
特定の実施形態において、PKM遺伝子の少なくとも1つのエクソンが、少なくとも部分的に欠失されている。本明細書で使用する場合、「部分的に欠失された」とは、例えば、エクソンの領域の少なくとも約2%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、約2%以下、約5%以下、約10%以下、約15%以下、約20%以下、約25%以下、約30%以下、約35%以下、約40%以下、約45%以下、約50%以下、約55%以下、約60%以下、約65%以下、約70%以下、約75%以下、約80%以下、約85%以下、約90%以下、約95%以下、約2%~約90%、約10%~約90%、約20%~約90%、約25%~約90%、約30%~約90%、約40%~約90%、約50%~約90%、約60%~約90%、約70%~約90%、約80%~約90%、約85%~約90%、約2%~約80%、約10%~約80%、約20%~約80%、約30%~約80%、約40%~約80%、約50%~約80%、約60%~約80%、約70%~約80%、約75%~約80%、約2%~約70%、約10%~約70%、約20%~約70%、約30%~約70%、約40%~約70%、約50%~約70%、約60%~約70%、約65%~約70%、約2%~約60%、約10%~約60%、約20%~約60%、約30%~約60%、約40%~約60%、約50%~約60%、約55%~約60%、約2%~約50%、約10%~約50%、約20%~約50%、約30%~約50%、約40%~約50%、約45%~約50%、約2%~約40%、約10%~約40%、約20%~約40%、約30%~約40%、約35%~約40%、約2%~約30%、約10%~約30%、約20%~約30%、約25%~約30%、約2%~約20%、約5%~約20%、約10%~約20%、約15%~約20%、約2%~約10%、約5%~約10%、又は約2%~約5%が欠失されていることを意味する。例えば、PKM遺伝子のエクソン9は、少なくとも部分的に欠損している、又は完全に欠損していることができるが、これに限定されない。特定の実施形態において、PKM遺伝子のエクソン10は、少なくとも部分的に欠損している、又は完全に欠損していることができる。特定の実施形態において、PKM遺伝子のエクソン9及び10は、少なくとも部分的に欠損している、又は完全に欠損していることができる。特定の実施形態において、エクソン1~12を包含する領域は、少なくとも部分的に欠損している、又は完全に欠損している。
特定の非限定的な実施形態において、CRISPR/Cas9システムを用いて、PKMポリペプチドの発現を制御する。クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し(CRISPR)システムは、原核細胞にて発見されたゲノム編集ツールである。ゲノム編集に利用する場合、システムは、Cas9(crRNAをガイドとして利用してDNAを改変可能なタンパク質)、CRISPR RNA(crRNA、Cas9により使用され、Cas9と活性の複合体を形成するtracrRNA(一般にヘアピンループ形態である)に結合する領域と共に、宿主DNAの正しい部分にcrRNAをガイドするためのRNAを含有する)、及び、トランス活性化crRNA(tracrRNA、crRNAに結合し、Cas9との活性の複合体を形成する)を含む。用語「ガイドRNA」及び「gRNA」とは、RNAによりガイドされる、Cas9などのヌクレアーゼの、細胞内のゲノム又はエピソーム配列などの標的配列への特異的会合(即ち「標的化」)を促進する、任意の核酸を意味する。gRNAは、単分子(一本鎖RNA分子を含み、代替的にキメラと呼ばれる)、又は、モジュラー式(通常、二本鎖化により互いに会合する、例えば2つ以上、典型的には2つの、個別のRNA分子、例えばcrRNA及びtracrRNAを含む)であることができる。CRISPR/Cas9法では、哺乳動物細胞をトランスフェクションするためのベクターを使用することができる。ガイドRNA(gRNA)は、Cas9を使用して、細胞内の標的DNAを識別して、直接結合するための配列であるため、各用途に対して設計することができる。複数のcrRNA及びtracrRNAを合わせてパッケージ化して、一本鎖ガイドRNA(sgRNA)を形成することができる。細胞内にトランスフェクションするために、sgRNAをCas9遺伝子と共に結合させ、ベクター内に組み入れることができる。
特定の実施形態において、1つ以上のPKMポリペプチドの発現を制御するために使用するためのCRISPR/Cas9は、Cas9分子、及び、PKM遺伝子の標的配列に相補的である標的化ドメインを含む、1つ以上のgRNAを含む。特定の実施形態において、標的遺伝子はPKM遺伝子の領域である。標的配列は、PKM遺伝子内の任意のエクソン又はイントロン領域であることができる。例えば、その標的は、PKM1及び/又はPKM2ポリペプチドの発現を取り除く、又は低減することである。特定の実施形態において、標的配列は、PKM遺伝子のエクソン1に隣接する5’領域、エクソン1内の領域、エクソン2に隣接する5’領域、エクソン2内の領域、エクソン9に隣接する5’領域、エクソン9に隣接する3’領域、エクソン10に隣接する3’領域、エクソン12内の領域、及び/又は、エクソン12に隣接する3’領域であることができる。例えば、標的配列は、PKM遺伝子のエクソン9に隣接する5’イントロン領域、PKM遺伝子のエクソン9に隣接する3’イントロン領域、PKM遺伝子のエクソン10に隣接する3’イントロン領域、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、PKM遺伝子のエクソン9に隣接する5’イントロン領域、及びPKM遺伝子のエクソン9に隣接する3’イントロン領域の両方を、本明細書にて開示したCRISPR/Cas9システムを使用して標的化する。例えば、CRISPR/Cas9システムは、PKM-1がノックダウン又はノックアウトされた細胞を生成するための、Cas9分子、PKM遺伝子のエクソン9に隣接する5’イントロン領域を標的化するgRNA、及び、PKM遺伝子のエクソン9に隣接する3’イントロン領域を標的化するgRNAを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、PKM遺伝子のエクソン9に隣接する5’イントロン領域を標的化するgRNAは、配列番号33に記載の配列を含む。特定の実施形態において、PKM遺伝子のエクソン9に隣接する3’イントロン領域を標的化するgRNAは、配列番号34に記載の配列を含む。
特定の実施形態において、標的配列は、エクソン1に隣接する5’領域、エクソン1内の領域、エクソン2に隣接する5’領域、エクソン2内の領域、エクソン12内の領域、エクソン12に隣接する3’領域、又はこれらの組み合わせであることができる。例えば、限定されるものではないが、本開示のCRISPR/Cas9システムは、例えば、PKM-1及びPKM-2の両方がノックダウン又はノックアウトされた細胞を生成するための、Cas9分子、PKM遺伝子のエクソン1内の領域を標的化するgRNA、PKM遺伝子のエクソン12内の領域を標的化するgRNAを含むことができる。特定の実施形態において、本開示のCRISPR/Cas9システムは、例えば、PKM-1及びPKM-2の両方がノックダウン又はノックアウトされた細胞を生成するための、Cas9分子、PKM遺伝子のエクソン2内の領域を標的化するgRNA、PKM遺伝子のエクソン12内の領域を標的化するgRNAを含むことができる。特定の実施形態において、PKM遺伝子のエクソン2内の領域を標的化するgRNAは、配列番号42に記載の配列を含む。特定の実施形態において、PKM遺伝子のエクソン12内の領域を標的化するgRNAは、配列番号43に記載の配列を含む。
特定の実施形態において、gRNAは単一のベクターで細胞に投与され、Cas9分子は第2のベクターで細胞に投与される。特定の実施形態において、gRNA及びCas9分子は、単一のベクターで細胞に投与される。あるいは、gRNA及びCas9分子のそれぞれが、別のベクターにより投与されることができる。特定の実施形態において、CRISPR/Cas9システムは、1つ以上のgRNAと複合体化したCas9タンパク質を含む、リボ核タンパク質複合体(RNP)として細胞に送達することができる、例えば、電気穿孔法により送達することができる(例えば、細胞にRNPを送達する更なる方法については、DeWitt et al.,Methods 121-122:9-15(2017)を参照のこと)。特定の実施形態において、細胞にCRISPR/Cas9システムを投与することにより、PKM-1ポリペプチドの発現のノックアウト又はノックダウンがもたらされる。特定の実施形態において、細胞にCRISPR/Cas9システムを投与することにより、PKM-1及びPKM-2ポリペプチドの両方の発現のノックアウト又はノックダウンがもたらされる。
特定の実施形態において、遺伝子組み換えシステムは、哺乳動物細胞内でのPKMポリペプチドの発現を制御するための、ZFNシステムである。ZFNは制限酵素として作用することができ、これは、ジンクフィンガーDNA結合ドメインを、DNA切断ドメインと組み合わせることにより作製される。ジンクフィンガードメインを改変して、特異的なDNA配列を標的化することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼが、ゲノム内で所望の配列を標的化することが可能になる。個々のZFNのDNA結合ドメインは典型的には、複数の、個別のジンクフィンガー反復を含有し、それぞれが複数の塩基対を認識することができる。新しいジンクフィンガードメインを生成するための、最も一般的な方法は、既知の特異性を有する小さいジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。最も一般的な、ZFNの切断ドメインは、II型制限エンドヌクレアーゼFokI由来の、非特異的切断ドメインである。ZFNは、標的DNA配列内で二本鎖の切断(DSB)を行うことにより、タンパク質の発現を調節し、これは、相同テンプレートの不存在下にて、非相同末端結合(NHEJ)により修復される。このような修復により、塩基対の欠失又は挿入をもたらすことができ、フレームシフトを生み出して、有害なタンパク質の産生を防止する(Durai et al.,Nucleic Acids Res.;33(18):5978-90(2005))。複数のZFN対もまた使用して、ゲノム配列の、全体の大きなセグメントを完全に除去することができる(Lee et al.,Genome Res.;20(1):81-9(2010))。特定の実施形態において、標的遺伝子はPKM遺伝子の一部である。特定の実施形態において、標的配列はPKM遺伝子のエクソン9である。特定の実施形態において、標的配列はPKM遺伝子のエクソン9及びエクソン10である。
特定の実施形態において、遺伝子組み換えシステムは、哺乳動物細胞内でのPKMポリペプチドの発現を制御するための、TALENシステムである。TALENは、改変してDNAの特異的な配列を切断することができる制限酵素である。TALENシステムは、ZFNに類似した原理で作動する。TALENは、転写活性化因子様エフェクターDNA結合ドメインを、DNA切断ドメインと組み合わせることにより生成される。転写活性化因子様エフェクター(TALE)は、特異的なヌクレオチドを強力に認識する2つの位置を備える、33~34個のアミノ酸反復モチーフで構成される。これらのTALEのアレイを組み立てることで、TALE DNA結合ドメインを改変して、所望のDNA配列に結合することができ、これにより、ヌクレアーゼを、ゲノムの特定の場所で切断するようにガイドする(Boch et al.,Nature Biotechnology;29(2):135-6(2011))。特定の実施形態において、標的遺伝子はPKM遺伝子の一部である。特定の実施形態において、標的配列はPKM遺伝子のエクソン9である。特定の実施形態において、標的配列はPKM遺伝子のエクソン9及びエクソン10である。
特定の実施形態において、PKMポリペプチドの発現は、PKM核酸に対する相補配列を有するオリゴヌクレオチド(例えば、PKM mRNA、PKM-1 mRNA、又はPKM-2 mRNA)を使用してノックダウンすることができる。このようなオリゴヌクレオチドの非限定例としては、低分子干渉RNA(siRNA)、ショートヘアピンRNA(shRNA)、及びマイクロRNA(miRNA)が挙げられる。特定の実施形態において、このようなオリゴヌクレオチドは、PKM核酸配列、例えばPKM、PKM-1、又はPKM-2核酸配列の少なくとも一部に対して相同であることができ、PKM核酸配列に対するその部分の相同性は、少なくとも約75、又は少なくとも約80、又は少なくとも約85、又は少なくとも約90、又は少なくとも約95、又は少なくとも約98%である。特定の非限定的な実施形態において、相補部分は、少なくとも10個のヌクレオチド、又は少なくとも15個のヌクレオチド、又は少なくとも20個のヌクレオチド、又は少なくとも25個のヌクレオチド、又は少なくとも30個のヌクレオチドを構成することができ、アンチセンス核酸、shRNA、mRNA、又はsiRNA分子は、最大15、又は最大20、又は最大25、又は最大30、又は最大35、又は最大40、又は最大45、又は最大50、又は最大75、又は最大100ヌクレオチド長であることができる。アンチセンス核酸、shRNA、mRNA、又はsiRNA分子は、DNA、又は非定型若しくは天然に存在しない残基、例えば、これに限定されないがホスホロチオエート残基を含むことができる。
本明細書にて開示した遺伝子組み換えシステムは、ウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターなどのレトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターを使用して哺乳動物細胞に送達することができる。キャプシドタンパク質が、ヒト細胞を感染させるのに機能的である場合、レトロウイルスベクターと、適切なパッケージング株の組み合わせが好適である。PA12(Miller,et al.(1985)Mol.Cell.Biol.5:431-437);PA317(Miller,et al.(1986)Mol.Cell.Biol.6:2895-2902);及びCRIP(Danos,et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464)を含むが、これらに限定されない、様々なアンホトロピックウイルス産生細胞株が知られている。非アンホトロピック粒子、例えば、VSVG、RD114、又はGALVエンベロープ、及び当該技術分野において公知の任意の他のものによる偽型化粒子もまた、好適である。可能な形質導入方法としては、例えば、Bregni,et al.(1992)Blood 80:1418-1422の方法による、細胞を、プロデューサー細胞と直接同時培養するもの、又は、例えば、Xu,et al.(1994)Exp.Hemat.22:223-230;及びHughes,et al.(1992)J.Clin.Invest.89:1817の方法による、ウイルス上清のみでの、又は、適切な成長因子及びポリカチオンを有する、若しくは有しない、濃縮ベクター原液による培養もまた挙げられる。
他の形質導入ウイルスベクターを使用して、本明細書にて開示した哺乳動物細胞を改変することができる。特定の実施形態において、選択したベクターは、高効率の感染、並びに安定した組み込み及び発現を示す(例えば、Cayouette et al.,Human Gene Therapy 8:423-430,1997;Kido et al.,Current Eye Research 15:833-844,1996;Bloomer et al.,Journal of Virology 71:6641-6649,1997;Naldini et al.,Science 272:263 267,1996;及びMiyoshi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10319,1997を参照のこと)。使用可能な他のウイルスベクターとしては例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、及びアデナ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、又はヘルペスウイルス、例えばエプスタイン・バールウイルスが挙げられる(例えば、Miller,Human Gene Therapy 15-14,1990;Friedman,Science 244:1275-1281,1989;Eglitis et al,BioTechniques 6:608-614,1988;Tolstoshev et al.,Current Opinion in Biotechnology 1:55-61,1990;Sharp,The Lancet 337:1277-1278,1991;Cometta et al.,Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322,1987;Anderson,Science 226:401-409,1984;Moen,Blood Cells 17:407-416,1991;Miller et al.,Biotechnology 7:980-990,1989;LeGal La Salle et al.,Science 259:988-990,1993;及びJohnson,Chest 107:77S-83S,1995のベクターも参照のこと)。レトロウイルスベクターが特に開発されており、臨床設定にて用いられている(Rosenberg et al.,N.Engl.J.Med 323:370,1990;Anderson et al.,米国特許第5,399,346号)。
非ウイルスアプローチもまた、本明細書にて開示した哺乳動物細胞の遺伝子組み換えに使用することができる。例えば、リポフェクションの存在下における核酸の投与(Feigner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413,1987;Ono et al.,Neuroscience Letters 17:259,1990;Brigham et al.,Am.J.Med.Sci.298:278,1989;Staubinger et al.,Methods in Enzymology 101:512,1983)、アシアロオロソムコイド-ポリリシンコンジュゲーション(Wu et al.,Journal of Biological Chemistry 263:14621,1988;Wu et al.,Journal of Biological Chemistry 264:16985,1989)、又は、外科的条件下におけるマイクロ注射(Wolff et al.,Science 247:1465,1990)により、核酸分子を哺乳動物細胞内に導入することができる。遺伝子導入のための、他の非ウイルス方法としては、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、電気穿孔法、及び原形質融合を用いる、インビトロでのトランスフェクションが挙げられる。リポソームもまた、核酸分子を細胞内に送達するのに、潜在的に有益である可能性がある。通常の遺伝子を、対象の感染組織に移植することもまた、通常の核酸を、エクスビボ培養が可能な細胞種(例えば、自己由来又は異種一次細胞又はそれらの後代)に移し、その後、細胞(又はその子孫)を、標的組織に注入する、又は全身注入することにより実行することができる。
5.3 ラクトジェニック活性が低下した、又は除去された細胞
一態様において、本開示は、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された1つ以上の細胞、例えば哺乳動物細胞を含む細胞又は組成物、及びその使用方法に関する。PKMポリペプチドの発現(例えば、PKM-1の発現)は細胞内でノックダウン又はノックアウトされており、これにより、細胞のラクトジェニック活性の低下又は除去がもたらされる。細胞の非限定例としては、CHO細胞(例えば、DHFR CHO細胞)、dp12.CHO細胞のCHO-K1(ATCC、CCL-61)、SV40により形質転換したサル腎臓CV1(例えば、COS-7 ATCC CRL-1651)、ヒト胎児腎臓株(例えば、懸濁培養液中で増殖のためにサブクローニングされた293又は293細胞)、ベビーハムスター腎臓細胞(例えば、BHK、ATCC CCL 10)、マウスセルトリ細胞(例えば、TM4)、サル腎臓細胞(例えば、CV1 ATCC CCL 70)、アフリカミドリザル腎臓細胞(例えば、VERO-76、ATCC CRL-1587)、ヒト子宮頚癌細胞(例えば、HELA、ATCC CCL 2)、イヌ腎臓細胞(例えば、MDCK、ATCC CCL 34)、バッファローラット肝臓細胞(例えば、BRL 3A、ATCC CRL 1442)、ヒト肺細胞(例えば、W138、ATCC CCL 75)、ヒト肝臓細胞(例えば、Hep G2、HB 8065)、マウス乳癌(例えば、MMT 060562、ATCC CCL51)、TRI細胞、MRC 5細胞、FS4細胞、ヒト肝癌株(例えば、Hep G2)、骨髄腫細胞株(例えば、Y0、NS0及びSp2/0)が挙げられる。特定の実施形態において、細胞はCHO細胞である。CHO宿主細胞の、更なる非限定例としては、CHO K1SV細胞、CHO DG44細胞、CHO DUKXB-11細胞、CHOK1S細胞、及びCHO KIM細胞が挙げられる。特定の実施形態において、PKM遺伝子の1つの対立遺伝子のみが、本開示の細胞内で改変される。特定の実施形態において、PKM遺伝子の両方の対立遺伝子が改変される。特定の実施形態において、本開示の細胞は、配列番号39~41からなる群から選択される配列を含むPKM遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子を含む、又は、配列番号37及び38に記載のヌクレオチド配列を含む(図4Cを参照のこと)。例えば、本開示の細胞は、配列番号39~41からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むPKM遺伝子の対立遺伝子を含む、又は、配列番号37及び38に記載のヌクレオチド配列を含むが、これに限定されない。特定の実施形態において、本開示の細胞は、配列番号39~41からなる群から選択される配列を含むPKM遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子を含む。特定の実施形態において、細胞はCHO細胞である。ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞の非限定例としては、本明細書にて開示するHET-3、HET-18、KO-2、及びKO-15が挙げられる。
特定の実施形態において、PKMポリペプチド(例えばPKM-1及び/又はPKM-2)の発現はノックアウトされ、参照細胞と比較して、細胞のラクトジェニック活性の除去がもたらされる。特定の実施形態において、PKMポリペプチドの発現は細胞内でノックアウトされ、参照細胞と比較して、細胞のラクトジェニック活性の低下がもたらされる。特定の実施形態において、参照細胞は、PKMポリペプチドの発現が制御されていない細胞である。特定の実施形態において、参照細胞は、少なくとも1つの野生型PKM対立遺伝子を有する細胞である。特定の実施形態において、参照細胞は、両方の野生型PKM対立遺伝子を有する細胞である。特定の実施形態において、参照細胞はWT CHO細胞である。
特定の実施形態において、細胞のラクトジェニック活性は、細胞の培養期間の間の、細胞培養培地中のラクテート濃度により示される。特定の実施形態において、細胞のラクトジェニック活性は、培養期間の、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、7日目、8日目、9日目、10日目、11日目、12日目、13日目、14日目、15日目、16日目、17日目、18日目、19日目、20日目、25日目、30日目、35日目、40日目、45日目、50日目、55日目、60日目、65日目、70日目、又は80日目における、細胞培養培地中のラクテート濃度により示される。特定の実施形態において、細胞のラクトジェニック活性は、培養を開始してから80日を超えた後の、細胞培養培地中のラクテート濃度により示される。特定の実施形態において、本明細書にて開示する細胞のラクトジェニック活性は、産生期中、例えば、細胞培養プロセスの産生期の2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、7日目、8日目、9日目、10日目、11日目、12日目、13日目、14日目、15日目、16日目、17日目、18日目、19日目、又は20日目の、細胞培養培地中のラクテート濃度により示される。特定の実施形態において、ラクテート濃度は産生期の6日目、7日目、10日目、11日目、14日目、及び/又は15日目に測定される。特定の実施形態において、ラクテート濃度は産生期の7日目、10日目、及び/又は14日目に測定される。
細胞のラクトジェニック活性を測定する、及び/又は、培地での細胞によるラクテート産生を測定する、任意の当該技術分野において既知の方法を、本明細書にて開示した主題と共に使用することができる。非限定的な例示の方法としては、TeSlaa and Teitell,Methods Enzymol(2014)542:91-114、及びLehman et al.,Med Sci Sports Exerc(1991)23(8):935-8に開示されているものが挙げられ、これら全体が本明細書に、参照により組み込まれている。例えば、限定されるものではないが、このような技術としては、商用の細胞外ラクテートキットを使用すること、細胞外バイオアナライザーの使用、細胞外での酸性化速度(ECAR)を、例えばSeahorse XF分析器を使用して測定すること、速度制限解糖酵素の活性を測定すること、及び、トレーサを使用してラクテートの産生を測定することが挙げられる。
特定の実施形態において、(例えば、細胞内のPKM遺伝子を制御して、PKMポリペプチドをノックダウン又はノックアウトさせたことにより)ラクトジェニック活性が低下した細胞のラクトジェニック活性は、参照細胞のラクトジェニック活性の約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%、又は約1%である。特定の実施形態において、(例えば、細胞内のPKM遺伝子を制御して、PKMポリペプチドをノックダウン又はノックアウトさせたことにより)ラクトジェニック活性が低下した細胞のラクトジェニック活性は、参照細胞のラクトジェニック活性の約80%未満、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%、又は約1%である。特定の実施形態において、細胞のラクトジェニック活性は、例えば細胞培養の産生期の14日目又は15日目に観察すると、参照細胞のラクトジェニック活性の約50%未満である。特定の実施形態において、細胞のラクトジェニック活性は、例えば細胞培養の産生期の14日目又は15日目に観察すると、参照細胞のラクトジェニック活性の約20%未満である。特定の実施形態において、細胞のラクトジェニック活性は、例えば細胞培養の産生期の14日目又は15日目に観察すると、参照細胞のラクトジェニック活性の約10%未満である。特定の実施形態において、参照細胞は、PKM遺伝子の少なくとも1つ、又は両方の野生型対立遺伝子を含む細胞である。
特定の実施形態において、本開示の細胞により作製される細胞培養培地中でのラクテート濃度は、例えば、細胞培養の産生期にて(例えば、産生期の2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、7日目、8日目、9日目、10日目、11日目、12日目、13日目、14日目、15日目、16日目、17日目、18日目、19日目、又は20日目において)、約15g/L未満、約14g/L未満、約13g/L未満、約12g/L未満、約101g/L未満、約10g/L未満、約9g/L未満、約8g/L未満、約7g/L未満、約6g/L未満、約5g/L未満、約4g/L未満、約3g/L未満、約2g/L未満、約1g/L未満、又は約0.5g/L未満である。特定の実施形態において、本開示の細胞により作製される細胞培養培地中でのラクテート濃度は、約5g/L未満、約2g/L未満、又は約1g/L未満である。特定の実施形態において、本開示の細胞により作製される細胞培養培地中でのラクテート濃度は、細胞培養の産生期の7日目、10日目、14日目、又は15日目において約5g/L未満、約2g/L未満、又は約1g/L未満である。特定の実施形態において、本開示の細胞により作製される細胞培養培地中でのラクテート濃度は、振盪フラスコ培養の産生期の間において、約1g/L未満、又は約2g/L未満である。特定の実施形態において、本開示の細胞により作製される細胞培養培地中でのラクテート濃度は、バイオリアクター内での細胞培養の産生期の間において、約2g/L未満である。
特定の実施形態において、本明細書で開示する、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞(例えば、PKMポリペプチドの発現をノックアウト又はノックダウンすることにより生成した細胞)は、通常のラクトジェニック活性を有する細胞(例えば、野生型細胞)に匹敵する力価、及び/又は特異的な産生能を有する。特定の実施形態において、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞と、通常のラクトジェニック活性を有する細胞との、力価及び/又は特異的な産生能の差は、通常のラクトジェニック活性を有する細胞(例えば参照細胞)の約1%未満、約5%未満、約10%未満、約15%未満、約20%未満、約25%未満、又は約30%未満である。特定の実施形態において、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞は、通常のラクトジェニック活性を有する細胞よりも、高い力価及び/又は特異的な産生能を有する。特定の実施形態において、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞の力価は、通常のラクトジェニック活性を有する細胞の力価より約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、又は約50%高い。特定の実施形態において、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞の力価は、通常のラクトジェニック活性を有する細胞の力価よりも約50%を超えて大きい。特定の実施形態において、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞の特異的な産生能(Qp)は、通常のラクトジェニック活性を有する細胞の特異的な産生能より、約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、又は約90%高い。特定の実施形態において、ラクトジェニック活性が低下した又は除去された細胞の特異的な産生能は、通常のラクトジェニック活性を有する細胞の特異的な産生能よりも、約90%を超えて大きい。
細胞培養培地中のラクテート濃度は、化学分析器又はラクテートアッセイキットにより測定することができる。化学分析器の非限定例としては、Bioprofile 400(Nova Biomedical)、Piccolo Xpress Chemistry Analyzer、Excel-Semi-automated Chemistry Analyzer、Indiko Clinical及びSpecialty Chemistry System、並びにACE Axcel(登録商標)Clinical Chemistry Systemが挙げられる。ラクテートアッセイキットの非限定例としては、L-Lactate Assay Kit(Colorimetric)(ab65331、Abeam)、BioVision Lactate Colorimetric/Fluorometric Assay Kit、PicoProbe(商標)Lactate Fluorometric Assay Kit、Lactate Colorimetric Assay Kit II、Cell Biolabs Lactate Assay Kitsが挙げられる。
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞は目的の生成物を発現する。特定の実施形態において、目的の生成物は組み換えタンパク質である。特定の実施形態において、目的の生成物はモノクローナル抗体である。目的の生成物の更なる非限定例は、セクション5.5に記載する。特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞を、商業的に有用な量の目的の生成物を作製するために使用することができる。
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞は、目的の生成物をコードする核酸を含むことができる。特定の実施形態において、核酸は1つ以上のベクター、例えば発現ベクターに存在することができる。1つの種類のベクターは「プラスミド」であり、これは、追加のDNAセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖DNAループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、追加のDNAセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得る。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製することができる(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。宿主細胞内に導入する際に、他のベクター(例えば非エピソーム哺乳動物ベクター)を宿主細胞のゲノム内に導入することにより、宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクター、発現ベクターは、それらが作用可能に結合する遺伝子の発現を指示することが可能である。一般に、組み換えDNA技法における利用される発現ベクターは、プラスミド(ベクター)の形態である場合が多い。本開示で使用するための発現ベクターの更なる非限定例としては、等価な機能的役割を果たすウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス)が挙げられる。
特定の実施形態において、目的の生成物をコードする核酸を、本明細書にて開示する宿主細胞に導入することができる。特定の実施形態において、核酸の細胞への導入は、トランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、核酸配列含有ウイルス又はバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、マイクロセル媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などにより実施することができる。特定の実施形態において、宿主細胞は真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ系細胞(例えばY0、NS0、Sp20細胞)である。
特定の実施形態において、目的の生成物をコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに無作為に組み込むことができる(「無作為的組み込み」又は「RI」)。例えば、限定されるものではないが、目的の生成物をコードする核酸は、PKMポリペプチド(例えばPKM-1)の発現をノックダウン又はノックアウトするように制御された細胞のゲノムに無作為に組み込むことができる。
特定の実施形態において、目的の生成物をコードする核酸は、標的化する方式で宿主細胞ゲノムに組み込むことができる(「標的組み込み」又は「TI」)。例えば、限定されるものではないが、目的の生成物をコードする核酸は、標的化する方式で、PKMポリペプチド(例えばPKM-1)の発現をノックダウン又はノックアウトするように制御された細胞のゲノムに組み込むことができる。「組み込み部位」は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される、宿主細胞ゲノム内の配列を含む。特定の実施形態において、組み込み部位は、宿主細胞ゲノムの2つの隣接するヌクレオチドの間にある。特定の実施形態において、組み込み部位はヌクレオチド配列の伸展を含む。特定の実施形態において、組み込み部位はTI宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座の中に位置する。特定の実施形態において、組み込み部位はTI宿主細胞の内因性遺伝子の中にある。当該技術分野において公知の任意の組み込み部位を、本明細書にて開示した主題を用いて制御及び使用することができる。標的組み込みは、当該技術分野において公知の方法及びシステムにより媒介することができる。例えば、限定されるものではないが、2018年12月21日に出願された国際出願第PCT/US18/067070号(その内容全体が本明細書に組み込まれている)に開示されている方法及びシステムを、標的組み込みのために使用することができる。
特定の実施形態において、目的の生成物をコードする核酸を、トランスポーゼース型組み込みを使用して宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。トランスポーゼース型組み込みは例えば、Trubitsyna et al.、Nucleic Acids Res.45(10):e89(2017)、Li et al.,PNAS 110(25):E2279-E2287(2013)、及び国際公開第2004/009792号(これら全体が、本明細書に参考として組み込まれる)に開示されている。
特定の実施形態において、目的の生成物をコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに無作為に組み込むことができる(「無作為的組み込み」又は「RI」)。特定の実施形態において、無作為組み込みは当該技術分野において公知の任意の方法又はシステムにより媒介されることができる。特定の実施形態において、無作為組み込みは、MaxCyte STX(登録商標)電気穿孔システムにより媒介される。
特定の実施形態において、標的組み込みは無作為組み込みと組み合わせることができる。特定の実施形態において、標的組み込みは無作為組み込みの後に続けることができる。特定の実施形態において、無作為組み込みは標的組み込みの後に続けることができる。例えば、限定されるものではないが、目的の生成物をコードする核酸は、PKMポリペプチド、例えばPKM-1の発現をノックダウン又はノックアウトするように制御された細胞のゲノムに無作為に組み込むことができ、目的の同じ生成物をコードする核酸を、標的化する方式で細胞のゲノムに組み込むことができる。
特定の実施形態において、宿主細胞はRI宿主細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞はTI宿主細胞である。
5.4 細胞培養法
一態様では、本開示は、本明細書にて開示した細胞を培養することを含む、目的の生成物の作製方法を提供する。当該技術分野において公知の、哺乳動物細胞に対して好適な培養条件は、本明細書に記載の細胞の培養に使用することができる(J.Immunol.Methods(1983)56:221-234)、又は、当事者により容易に測定することができる(例えば、Animal Cell Culture:A Practical Approach 2nd Ed.,Rickwood,D.and Hames,B.D.,eds.Oxford University Press,New York(1992)を参照のこと)。
哺乳動物細胞は、培養されている特定の細胞に好適な培地にて準備することができる。Ham’s F10(Sigma)、最小必須培地(MEM、Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、及びダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Sigma)などの市販の培地は、例示的な栄養素溶液である。更に、Ham and Wallace,(1979)Meth.Enz.,58:44;Barnes and Sato,(1980)Anal.Biochem.,102:255;米国特許第4,767,704号;同第4,657,866号;同第4,927,762号;同第5,122,469号、又は同第4,560,655号;国際公開第90/03430号;及び同第87/00195号に開示されている培地のいずれか(それらの開示全てが、参照により本明細書に組み込まれている)を、培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれかは、必要に応じてホルモン及び/又は他の成長因子(インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、緩衝液(HEPESなど)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えばゲンタマイシン(gentamycin/gentamicin))、微量元素(通常、終濃度にてマイクロモル範囲で存在する無機化合物として定義される)、脂質類(リノレン酸又は他の脂肪酸)及びそれらの好適な単体、並びにグルコース、又は等価なエネルギー供給源を補充することができる。任意の他の必要な補充物も、当業者に既知であろう適切な濃度で含まれ得る。
特定の実施形態において、PKMポリペプチドの発現を低下させる、及び/又は除去するように改変された哺乳動物細胞は、CHO細胞である。任意の好適な培地を使用して、CHO細胞を培養することができる。特定の実施形態において、CHO細胞を培養するのに好適な培地は、任意にグリシン、ヒポキサンチン、及びチミジンを含有する、アミノ酸、塩類、糖、及びビタミン;組み換えヒトインスリン、Primatone HS若しくはPrimatone RL(Sheffield,England)などの加水分解ペプトン、又は等価物;Pluronic F68又は等価なプルロニックポリオールなどの、細胞保護剤;ゲンタマイシン;及び微量元素などの、いくつかの構成成分の濃度が変更された、DMEM/HAM F-12系配合物などの、基礎培地構成成分(DMEM及びHAM F12培地の組成物に関しては、American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas,Sixth Edition,1988、346-349頁を参照のこと)(米国特許第5,122,469号に記載の培地の配合物が、特に適切である)を含有することができる。
特定の実施形態において、PKMポリペプチドの発現を低下させる、及び/又は除去するように改変された哺乳動物細胞は、組み換えタンパク質を発現する細胞である。組み換えタンパク質は、様々な細胞培養条件下にて、目的の生成物を発現する細胞を成長させることにより産生することができる。例えば、タンパク質の大規模又は小規模産生のための、細胞培養手順は、本開示の文脈にて、潜在的に有用である。流動床バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル培養、振盪フラスコ培養、又は撹拌槽バイオリアクターシステムが挙げられるがこれらに限定されない手順を使用することができ(後者の2つのシステムでは、マイクロ担体と共に、又は無しで)、代替的にバッチ式、流加培養式、又は連続モードで操作することができる。
特定の実施形態において、本開示の細胞培養は、撹拌槽バイオリアクターシステムで実施され、流加培養手順を用いる。流加培養培養液において、哺乳動物宿主細胞及び培地 を、まず培養容器に供給し、追加の培養栄養素が、培養中に培養液に連続して、又は個別に増加して供給され、培養終了前に、周期的に細胞及び/又は生成物が回収される、又はされない。流加培養培養液としては、例えば、周期的に全ての培養液(細胞と培地を含む)が取り除かれ、新鮮な培地で交換される、半連続式流加培養培養液を挙げることができる。流加培養培養液は、細胞培養のための全ての構成成分(細胞、及び全ての培養栄養素を含む)が、培養プロセスの開始時に培養容器に供給される、単純なバッチ培養液とは区別される。流加培養培養液は更に、上清がプロセス中に培養容器から取り除かれない限りにおいて、還流培養とは区別することができる(還流培養では、細胞は例えば、濾過、封入、マイクロ担体へのアンカリングにより、培養液中に保持される。そして培地が連続して、又は断続的に導入され、培養容器から取り除かれる)。
特定の実施形態において、想到される特定の宿主細胞及び特定の産生に好適であることができる、任意のスキーム又はルーティンに従い、培養液の細胞を、増殖させることができる。したがって、本開示は、単一工程又は複数工程の培養手順を想到する。単一工程培養において、宿主細胞を培養液環境に播種し、本開示のプロセスを、細胞培養の1回の産生期の間に用いる。あるいは、複数段階培養を想到する。複数段階培養において、細胞は多数の工程又は段階で培養することができる。例えば、細胞を、第1工程又は増殖期培養液中で成長させることができる。この段階において、場合により貯蔵庫から取り除かれた細胞が、成長及び高生存能を促進するのに好適な培地に播種される。新鮮な培地を宿主細胞培養液に添加することにより、細胞を好適な期間、増殖期で維持することができる。
特定の実施形態において、流培養又は連続細胞培養条件を考案して、細胞培養液の増殖期における哺乳動物細胞の成長を増強する。増殖期において、細胞は、増殖のために最大化された条件下、及び期間、増殖する。培養条件、例えば温度、pH、溶存酸素(dO)などは、特定の宿主で用いられるものであり、当業者には明らかであろう。一般に、酸(例えばCO)又は塩基(例えば、NaCO若しくはNaOH)のいずれかを使用して、pHは、約6.5~7.5のレベルに調節する。CHO細胞などの哺乳動物細胞を培養するのに好適な温度範囲は、約30~38℃であり、好適なdOは、空気飽和度の5~90%である。
特定の段階において、細胞を使用して、細胞培養の産生期又は産生工程を播種することができる。あるいは、上述のとおり、産生期又は工程を、播種又は増殖期又は工程と連続させることができる。
特定の実施形態において、本開示に記載される培養方法は、例えば、細胞培養の産生期に、細胞培養液から生成物を回収することを更に含むことができる。特定の実施形態において、本開示の細胞培養方法により作成した生成物を、第3のバイオリアクター、例えば製造バイオリアクターから回収することができる。例えば、限定されるものではないが、開示した方法は、細胞培養の産生期の完了時に、生成物を回収することを含むことができる。あるいは、又は更に、生成物は、産生期の完了前に回収することができる。特定の実施形態において、生成物は、特定の細胞密度が達成されたら、細胞培養液から回収することができる。例えば、限定されるものではないが、細胞密度は、回収前に、約2.0×10細胞/mL~約5.0×10細胞/mLであることができる。
特定の実施形態において、細胞培養液から生成物を回収することは、遠心分離、濾過、音波分離、凝集及び細胞除去技術のうちの1つ以上を含むことができる。
特定の実施形態において、目的の生成物を宿主細胞から分泌させることができる、又は、目的の生成物は、膜結合、サイトゾル、若しくは核タンパク質であることができる。特定の実施形態において、ポリペプチドの可溶形態を、細胞培養培地から精製することができ、発現する細胞から全ての膜画分を調製し、TRITON(登録商標)X-100(EMD Biosciences,San Diego,Calif.)などの非イオン性洗剤を用いて膜を抽出することにより、ポリペプチドの膜結合形態を精製することができる。特定の実施形態において、宿主細胞を(例えば、機械的な力、音波処理、及び/又は洗剤により)溶解させ、遠心分離により細胞膜画分を取り除き、上清を保持することにより、サイトゾル又は核タンパク質を調製することができる。
5.5 生成物
本開示の細胞及び/又は方法を使用して、本明細書にて開示した細胞により発現可能な、目的の任意の生成物を作製することができる。特定の実施形態において、本開示の細胞及び/又は方法をポリペプチド、例えば哺乳動物ポリペプチドの作製に使用することができる。このようなポリペプチドの非限定例としては、ホルモン、受容体、融合タンパク質、制御因子、成長因子、補体系因子、酵素、凝固因子、抗凝固因子、キナーゼ、サイトカイン、CDタンパク質、インターロイキン、治療用タンパク質、診断用タンパク質、及び抗体が挙げられる。本開示の細胞及び/又は方法は分子、例えば、作製される抗体に対して、特異的ではない。
特定の実施形態において、本開示の方法を、治療用及び診断用抗体、又はその抗原結合断片を含む抗体の作製に、使用することができる。特定の実施形態において、本開示の細胞及び方法により作製される抗体は、単一特異性抗体(例えば、一本鎖重鎖配列及び一本鎖軽鎖配列からなる、このような対の多量体を含む抗体)、多重特異性抗体及びその抗原結合断片であることができるが、これらに限定されない。例えば、限定されるものではないが、多重特異性抗体は、二重特異性抗体、二重エピトープ抗体、T細胞依存性二重特異性抗体(TDB)、二重作用FAb(DAF)、又はこれらの抗原結合断片であることができる。
5.5.1 多重特異性抗体
特定の態様において、本明細書において提供する細胞及び方法により作製される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。「多重特異性抗体」とは、少なくとも2つの異なる部分、即ち異なる抗原の異なるエピトープ(即ち、二重特異的)、又は、同じ抗原の異なるエピトープ(即ち、二重エピトープ)に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様において、多重特異性抗体は3つ以上の結合特異性を有する。多重特異性抗体は、本明細書に記載した完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖の、組み換え同時発現(Milstein and Cuello,Nature 305:537(1983)を参照のこと)、及び、「ノブ・イン・ホール」組み換え(例えば、米国特許第5,731,168号、及びAtwell et al.,J.Mol.Biol.270:26(1997)を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の改変(国際公開第2009/089004号);2つ以上の抗体若しくは断片の架橋(例えば、米国特許第4,676,980号、及びBrennan et al.,Science,229:81(1985)を参照のこと);ロイシンジッパーを使用した二重特異的抗体の産生(例えば、Kostelny et al.,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)、及び国際公開第2011/034605号を参照のこと);軽鎖のミスペアリング問題を回避するための、一般的な軽鎖技術の使用(例えば国際公開第98/50431号を参照のこと);二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用(例えば、Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)を参照のこと);及び、一本鎖Fv(sFv)二量体の使用(例えば、Gruber et al.,J.Immunol.,152:5368(1994)を参照);及び、例えばTutt et al.J.Immunol.147:60(1991)に記載されている三重特異的抗体の調製により作製することができる。
3つ以上の抗原結合部位を有する、例えば「オクトパス抗体」、又はDVD-Igなどの改変抗体もまた、本明細書に含まれる(例えば、国際公開第2001/77342号、及び同第2008/024715号を参照のこと)。3つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の別の非限定例は、国際公開第2010/115589号、同第2010/112193号、同第2010/136172号、同第2010/145792号、及び同第2013/026831号に見出すことができる。三重特異性抗体又はその抗原結合断片は、「二重作用FAb」又は「DAF」もまた含む(例えば、米国特許出願公開第2008/0069820号及び国際公開第2015/095539号を参照のこと)。
多重特異性抗体は、同じ抗原特異性を有する1つ以上の結合アームにおいて、ドメインクロスオーバを有する非対称形態でも、即ち、VH/VLドメインを交換する(例えば、国際公開第2009/080252号及び同第2015/150447号を参照のこと)、CH1/CLドメイン(例えば、国際公開第2009/080253号を参照のこと)、又は、完全なFabアームを交換する(例えば、国際公開第2009/080251号、同第2016/016299号を参照のこと、また、Schaefer et al,PNAS,108(2011)1187-1191,and Klein at al.,MAbs 8(2016)1010-20)も参照のこと)ことにより、提供されることができる。特定の実施形態において、多重特異性抗体はクロスFab断片を含む。「クロスFab断片」又は「xFab断片」又は「クロスオーバーFab断片」との用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたFab断片を指す。クロスFab断片は、軽鎖可変領域(VL)と重鎖定常領域1(CH1)とで構成されるポリペプチド鎖、及び重鎖可変領域(VH)と軽鎖定常領域(CL)とで構成されるポリペプチド鎖を含む。非対称Fabアームは、荷電又は非荷電アミノ酸変異をドメインインターフェースに導入して正しいFabペアリングを指示することによって操作することもできる。例えば、国際公開第2016/172485号を参照のこと。
多重特異性抗体の様々な、更なる分子フォーマットが当技術分野において既知であり、本明細書に含まれる(例えば、Spiess et al.,Mol.Immunol.67(2015)95-106を参照のこと)。
特定の実施形態において、本明細書にも含まれる、特定の種類の多重特異性抗体は、標的細胞、例えば腫瘍細胞上で、表面抗原、及びT細胞を再標的化するための、CD3などの、T細胞受容体(TCR)複合体の、活性化された不変の構成成分に同時に結合し、標的細胞を殺傷するように設計された二重特異性抗体である。
本目的に有用であることができる二重特異性抗体フォーマットの更なる非限定例としては、2つのscFv分子が柔軟なリンカーにより融合された、いわゆる「BiTE」(二重特異性T細胞エンゲージャー)(例えば、国際公開第2004/106381号、同第2005/061547号、同第2007/042261号、及び同第2008/119567号、Nagorsen and Baeuerle,Exp Cell Res 317,1255-1260(2011)を参照のこと);ダイアボディ(Holliger et al.,Prot.Eng.9,299-305(1996))及びその誘導体、例えばタンデム二重特異性抗体(「TandAb」;Kipriyanov et al.,J Mol Biol 293,41-56(1999));ダイアボディフォーマットに基づくが、更なる安定化のための、C末端ジスルフィド架橋を特徴とする「DART」(二重親和性再標的化)分子(Johnson et al.,J Mol Biol 399,436-449(2010))、及び、全ハイブリッドマウス/ラットIgG分子である、いわゆるトリオマブ(Seimetz et al.,Cancer Treat.Rev.36,458-467(2010)で確認される)が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に含まれる、具体的なT細胞二重特異性抗体フォーマットは、国際公開第2013/026833号、同第2013/026839号、同第2016/020309号;Bacac et al.,Oncoimmunology 5(8)(2016)el203498に記載されている。
5.5.2 抗体断片
特定の態様において、本明細書において提供する細胞及び方法により作製される抗体は、抗体断片である。例えば、限定されるものではないが、抗体断片はFab、Fab’、Fab’-SH、又はF(ab’)断片、特にFab断片である。インタクトな抗体をパパイン分解することにより、2つの同一の抗原結合断片、いわゆる、それぞれが、重鎖及び軽鎖可変ドメイン(それぞれVH及びVL)、並びに、軽鎖(CL)の定常ドメイン、及び重鎖(CH1)の第1の定常ドメインを含有する「Fab」断片が作製される。用語「Fab断片」はそれ故、VLドメイン及びCLドメインを含む軽鎖と、VHドメイン及びCH1ドメインを含む重鎖断片と、を含む抗体断片を意味する。「Fab’断片」は、抗体ヒンジ領域から1つ以上のシステインを含むCH1ドメインのカルボキシ末端にて、残基を添加することによって、Fab断片とは異なる。Fab’-SHは、定常ドメインのシステイン残基がチオール基を有するFab’断片である。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位(2つのFab断片)、及びFc領域の一部を有するF(ab’)断片が得られる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加したFab及びF(ab’)の議論には、米国特許第5,869,046号を参照されたい。
特定の実施形態において、抗体断片はダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディである。「ダイアボディ」は、二価又は二重特異性であってよい、2つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許出願公開第404,097号、国際公開第1993/01161号、Hudson et al.,Nat Med.9,129-134(2003)及びHollinger et al.,Proc Natl Acad Sci.USA 90,6444-6448(1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディについては、Hudson et al,Nat.Med.9:129-134(2003)にもまた記載されている。
更なる態様において、抗体断片は一本鎖Fab断片である。「一本鎖Fab断片」又は「scFab」は、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体重鎖定常ドメイン1(CH1)、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、抗体軽鎖定常ドメイン(CL)、及びリンカーからなるポリペプチドであり、上記抗体ドメイン及び上記リンカーは、N末端からC末端方向に、以下の順序:a)VH-CH1-リンカー-VL-CL、b)VL-CL-リンカー-VH-CH1、c)VH-CL-リンカー-VL-CH1、又はd)VL-CH1-リンカー-VH-CLのうちの1つを有する。特に、上記リンカーは、少なくとも30個のアミノ酸、好ましくは32~50個のアミノ酸のポリペプチドである。上記一本鎖Fab断片は、CLドメインとCH1ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。更に、これらの一本鎖Fab断片は、システイン残基の挿入(例えば、Kabat番号付けによれば、可変重鎖の44位及び可変軽鎖の100位)による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるであろう。
別の態様では、抗体断片は一本鎖可変断片(scFv)である。「一本鎖可変断片」又は「scFv」は、リンカーにより接続された、抗体の重鎖(VH)及び軽鎖(VL)の可変ドメインの融合タンパク質である。特に、リンカーは、10~25個のアミノ酸の短いポリペプチドであり、通常、柔軟性のためにグリシンが、かつ、溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、VHのN末端をVLのC末端と、又はこの逆のいずれかで、接続させることができる。このタンパク質は、定常領域が取り除かれ、リンカーが導入されているにもかかわらず、元の抗体の特異性を保持することができる。scFv断片の概説については、例えば、Plueckthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)を参照のこと。また、国際公開第93/16185号、並びに米国特許第5,571,894号及び同第5,587,458号も参照のこと。
別の態様では、抗体断片は単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。特定の態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である(Domantis,Inc.,Waltham,MA;例えば、米国特許第6,248,516B1号を参照のこと)。
抗体断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解が挙げられるがこれに限定されない、様々な技術により作製することができる。
5.5.3 キメラ抗体及びヒト化抗体
特定の態様において、本明細書において提供する細胞及び方法により作製される抗体は、キメラ抗体である。ある種のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号;及びMorrison et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)に開示されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類に由来の可変領域)、及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のそれらから変更している「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
特定の態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。一般的に、非ヒト抗体をヒト化すると、ヒトに対する免疫原性は低下するが、親非ヒト抗体の特異性及び親和性は維持される。通常、ヒト化抗体は、CDR(又はその一部)が非ヒト抗体に由来する1つ以上の可変ドメインを含み、FR(又はその一部)はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は所望により、ヒト定常領域の少なくとも一部もまた含む。特定の実施形態では、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を復元又は改善するために、非ヒト抗体(例えば、CDR残基が由来する抗体)由来の対応する残基で置換される。
ヒト化抗体及びその作成方法は例えば、Almagro及びFransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)で確認され、更に、例えばRiechmann et al.,Nature 332:323-329(1988);Queen et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989);米国特許第5,821,337号、同第7,527,791号、同第6,982,321号、及び同第7,087,409号;Kashmiri et al.,Methods 36:25-34(2005)(特異性決定領域(SDR)グラフトに関する記述);Padlan,Mol Immunol.28:489-498(1991)(「表面再構成」の記述);Dall’Acqua et al.,Methods 36:43-60(2005)(「FR再構成」の記述);並びにOsbourn et al.,Methods 36:61-68(2005)及びKlimka et al.,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(FR構築のための「誘導選択」アプローチの記述)に詳しく記載されている。
ヒト化に用いるヒトフレームワーク領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:「ベストフィット」法を用いて選択したフレームワーク領域(例えばSims et al.J.Immunol.151:2296(1993)を参照);重鎖又は軽鎖可変領域の特定の亜型のヒト抗体コンセンサス配列に由来するフレームワーク領域(例えば、Carter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);及びPresta et al.J.Immunol.,151:2623(1993)を参照);ヒト成熟(体細胞変異)フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域(例えば、Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)を参照);並びにFRライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域(例えば、Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及びRosok et al.,J Biol.Chem.271:22611-22618(1996)を参照)。
5.5.4 ヒト抗体
特定の態様において、本明細書において提供する細胞及び方法により作製される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において既知である様々な技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は通常、van Dijk及びvan de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及びLonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)に記載されている。
抗原投与に対して応答するヒト可変領域を有する完全なヒト抗体又は完全な抗体を産生するために修飾したトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより、ヒト抗体を調製することができる。そのような動物は通常、内在性イムノグロブリン遺伝子座を置き換える、又は染色体外に存在する、若しくは動物の染色体中に無作為に導入したヒトイムノグロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有する。そのようなトランスジェニックマウスでは、内在性免疫グロブリン遺伝子座は通常不活性である。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)を参照のこと。例えば、XENOMOUSE(商標)技術について記載した米国特許第6,075,181号及び同第6,150,584号;HUMAB(登録商標)技術について記載した米国特許第5,770,429号;K-M MOUSE(登録商標)技術について記載した米国特許第7,041,870号;並びにVELOCIMOUSE(登録商標)技術について記載した米国特許出願公開第2007/0061900号もまた参照のこと。そのような動物により産生された完全な抗体のヒト可変領域を、例えば異なるヒト定常領域を組み合わせることにより、更に修飾することができる。
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が説明されている。(例えば、Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987);及びBoemer et al.,J.Immunol.,147:86(1991)を参照のこと。)ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はまた、Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562,2006にも記載されている。更なる方法としては、例えば、米国特許第7,189,826号(ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の産生について記載)及びNi,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(ヒト-ヒトハイブリドーマについて記載)に記載されるものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)はまた、Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)及びVollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)にも記載されている。
5.5.5 標的分子
本明細書にて開示した細胞及び方法により作製した抗体により標的化されることができる分子の非限定例としては、可溶性血清タンパク質及びそれらの受容体、並びに、他の膜結合タンパク質(例えば付着因子)が挙げられる。特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞及び方法により作製した抗体は、8MPI、8MP2、8MP38(GDFIO)、8MP4、8MP6、8MP8、CSFI(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(αFGF)、FGF2(βFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFN81、IFNG、IFNWI、FEL1、FEL1(EPSELON)、FEL1(ZETA)、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBb3、LTA(TNF-β)、LTB、TNF(TNF-α)、TNFSF4(OX40リガンド)、TNFSF5(CD40リガンド)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27リガンド)、TNFSF8(CD30リガンド)、TNFSF9(4-1BBリガンド)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、HGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL 11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(レプチン)、PTN、及びTHPO.kからなる群から選択される、1つ、2つ又はそれ以上のサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、及びサイトカイン受容体に結合することができる。
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞及び方法により作製される抗体は、CCLI(1-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-Iα)、CCL4(MIP-Iβ)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCL11(エオタキシン)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-Iδ)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MDP-3b)、CCL20(MIP-3α)、CCL21(SLC/エクソダス-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/エオタキシン-2)、CCL25(TECK)、CCL26(エオタキシン-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCLI(GROI)、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL11(1-TAC)、CXCL12(SDFI)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYDI)、SCYEI、XCLI(リンホタクチン)、XCL2(SCM-Iβ)、BLRI(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCRI(CKRI/HM145)、CCR2(mcp-IRB IRA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/S TRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBII)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Rα)、IL8RB(IL8Rβ)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HDF1、HDF1α、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2、及びVHLからなる群から選択されるケモカイン、ケモカイン受容体、又はケモカイン関連タンパク質に結合することができる。
特定の実施形態において、本明細書にて開示した方法により作製した抗体(例えば、二重特異性抗体などの多重特異性抗体)は、以下から選択される1つ以上の標的分子に結合することができる:0772P(CA125、MUC16)(即ち、卵巣癌抗原)、ABCF1;ACVR1;ACVR1B;ACVR2;ACVR2B;ACVRL1;ADORA2A;アグリカン;AGR2;AICDA;AIF1;AIG1;AKAP1;AKAP2;AMH;AMHR2;アミロイドβ;ANGPTL;ANGPT2;ANGPTL3;ANGPTL4;ANPEP;APC;APOC1;AR;ASLG659;ASPHD1(アスパルテートβ-ヒドロキシラーゼドメイン含有1;LOC253982);AZGP1(亜鉛-a-糖タンパク質);B7.1;B7.2;BAD;BAFF-R(B細胞活性化因子受容体、BLyS受容体3、BR3;BAG1;BAI1;BCL2;BCL6;BDNF;BLNK;BLRI(MDR15);BMP1;BMP2;BMP3B(GDF10);BMP4;BMP6;BMP8;BMPR1A;BMPR1B(IB型骨形成タンパク質受容体);BMPR2;BPAG1(プレクチン);BRCA1;Brevican;C19orf10(IL27w);C3;C4A;C5;C5R1;CANT1;CASP1;CASP4;CAV1;CCBP2(D6/JAB61);CCL1(1-309);CCL11(エオタキシン);CCL13(MCP-4);CCL15(MIP1δ);CCL16(HCC-4);CCL17(TARC);CCL18(PARC);CCL19(MIP-3β);CCL2(MCP-1);MCAF;CCL20(MIP-3α);CCL21(MTP-2);SLC;exodus-2;CCL22(MDC/STC-1);CCL23(MPIF-1);CCL24(MPIF-2/エオタキシン-2);CCL25(TECK);CCL26(エオタキシン-3);CCL27(CTACK/ILC);CCL28;CCL3(MTP-Iα);CCL4(MDP-Iβ);CCL5(RANTES);CCL7(MCP-3);CCL8(mcp-2);CCNA1;CCNA2;CCND1;CCNE1;CCNE2;CCR1(CKRI/HM145);CCR2(mcp-IRβ/RA);CCR3(CKR/CMKBR3);CCR4;CCR5(CMKBR5/ChemR13);CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6);CCR7(CKBR7/EBI1);CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1);CCR9(GPR-9-6);CCRL1(VSHK1);CCRL2(L-CCR);CD164;CD19;CD1C;CD20;CD200;CD22(B-細胞受容体CD22-Bアイソフォーム);CD24;CD28;CD3;CD37;CD38;CD3E;CD3G;CD3Z;CD4;CD40;CD40L;CD44;CD45RB;CD52;CD69;CD72;CD74;CD79A(CD79α、免疫グロブリン-関連α、B細胞特異的タンパク質);CD79B;CDS;CD80;CD81;CD83;CD86;CDH1(E-カドヘリン);CDH10;CDH12;CDH13;CDH18;CDH19;CDH20;CDH5;CDH7;CDH8;CDH9;CDK2;CDK3;CDK4;CDK5;CDK6;CDK7;CDK9;CDKN1A(p21/WAF1/Cip1);CDKN1B(p27/Kip1);CDKN1C;CDKN2A(P16INK4a);CDKN2B;CDKN2C;CDKN3;CEBPB;CER1;CHGA;CHGB;キチナーゼ;CHST10;CKLFSF2;CKLFSF3;CKLFSF4;CKLFSF5;CKLFSF6;CKLFSF7;CKLFSF8;CLDN3;CLDN7(クローディン-7);CLL-1(CLEC12A、MICL、及びDCAL2);CLN3;CLU(クラステリン);CMKLR1;CMKOR1(RDC1);CNR1;COL18A1;COL1A1;COL4A3;COL6A1;補体因子D;CR2;CRP;CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、奇形癌由来の増殖因子);CSFI(M-CSF);CSF2(GM-CSF);CSF3(GCSF);CTLA4;CTNNB1(b-カテニン);CTSB(カテプシンB);CX3CL1(SCYDI);CX3CR1(V28);CXCL1(GRO1);CXCL10(IP-10);CXCL11(I-TAC/IP-9);CXCL12(SDF1);CXCL13;CXCL14;CXCL16;CXCL2(GRO2);CXCL3(GRO3);CXCL5(ENA-78/LIX);CXCL6(GCP-2);CXCL9(MIG);CXCR3(GPR9/CKR-L2);CXCR4;CXCR5(バーキットリンパ腫受容体1、Gタンパク質結合受容体);CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo);CYB5;CYC1;CYSLTR1;DAB2IP;DES;DKFZp451J0118;DNCLI;DPP4;E16(LAT1、SLC7A5);E2F1;ECGF1;EDG1;EFNA1;EFNA3;EFNB2;EGF;EGFR;ELAC2;ENG;ENO1;ENO2;ENO3;EPHB4;EphB2R;EPO;ERBB2(Her-2);EREG;ERK8;ESR1;ESR2;ETBR(エンドセリンB型受容体);F3(TF);FADD;FasL;FASN;FCER1A;FCER2;FCGR3A;FcRH1(Fc受容体様タンパク質1);FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(SH2ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質1a)、SPAP1B、SPAP1C);FGF;FGF1(αFGF);FGF10;FGF11;FGF12;FGF12B;FGF13;FGF14;FGF16;FGF17;FGF18;FGF19;FGF2(bFGF);FGF20;FGF21;FGF22;FGF23;FGF3(int-2);FGF4(HST);FGF5;FGF6(HST-2);FGF7(KGF);FGF8;FGF9;FGFR;FGFR3;FIGF(VEGFD);FEL1(EPSILON);FIL1(ZETA);FLJ12584;FLJ25530;FLRTI(フィブロネクチン);FLT1;FOS;FOSL1(FRA-1);FY(DARC);GABRP(GABAa);GAGEB1;GAGEC1;GALNAC4S-6ST;GATA3;GDF5;GDNF-Ra1(GDNFファミリー受容体α1;GFRA1;GDNFR;GDNFRA;RETL1;TRNR1;RET1L;GDNFR-α1;GFR-ALPHA-1);GEDA;GFI1;GGT1;GM-CSF;GNASI;GNRHI;GPR2(CCR10);GPR19(Gタンパク質結合受容体19;Mm.4787);GPR31;GPR44;GPR54(KISS1受容体;KISS1R;GPR54;HOT7T175;AXOR12);GPR81(FKSG80);GPR172A(Gタンパク質結合受容体172A;GPCR41;FLJ11856;D15Ertd747e);GRCCIO(CIO);GRP;GSN(Gelsolin);GSTP1;HAVCR2;HDAC4;HDAC5;HDAC7A;HDAC9;HGF;HIF1A;HOP1;ヒスタミン及びヒスタミン受容体;HLA-A;HLA-DOB(MHCクラスII 分子のβサブユニット(Ia抗原);HLA-DRA;HM74;HMOXI;HUMCYT2A;ICEBERG;ICOSL;1D2;IFN-a;IFNA1;IFNA2;IFNA4;IFNA5;IFNA6;IFNA7;IFNB1;IFNγ;DFNW1;IGBP1;IGF1;IGF1R;IGF2;IGFBP2;IGFBP3;IGFBP6;IL-1;IL10;IL10RA;IL10RB;IL11;IL11RA;IL-12;IL12A;IL12B;IL12RB1;IL12RB2;IL13;IL13RA1;IL13RA2;IL14;IL15;IL15RA;IL16;IL17;IL17B;IL17C;IL17R;IL18;IL18BP;IL18R1;IL18RAP;IL19;ILIA;IL1B;ILIF10;IL1F5;IL1F6;IL1F7;IL1F8;IL1F9;IL1HY1;IL1R1;IL1R2;IL1RAP;IL1RAPL1;IL1RAPL2;IL1RL1;IL1RL2、ILIRN;IL2;IL20;IL20Rα;IL21R;IL22;IL-22c;IL22R;IL22RA2;IL23;IL24;IL25;IL26;IL27;IL28A;IL28B;IL29;IL2RA;IL2RB;IL2RG;IL3;IL30;IL3RA;IL4;IL4R;IL5;IL5RA;IL6;IL6R;IL6ST(糖タンパク質130);インフルエンザA;インフルエンザB;EL7;EL7R;EL8;IL8RA;DL8RB;IL8RB;DL9;DL9R;DLK;INHA;INHBA;INSL3;INSL4;IRAKI;IRTA2(免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連2);ERAK2;ITGA1;ITGA2;ITGA3;ITGA6(a6インテグリン);ITGAV;ITGB3;ITGB4(b4インテグリン);α4β7及びαEβ7インテグリンヘテロ二量体;JAG1;JAK1;JAK3;JUN;K6HF;KAI1;KDR;KITLG;KLF5(GC Box BP);KLF6;KLKIO;KLK12;KLK13;KLK14;KLK15;KLK3;KLK4;KLK5;KLK6;KLK9;KRT1;KRT19(ケラチン19);KRT2A;KHTHB6(毛髪特異性H型ケラチン);LAMAS;LEP(レプチン);LGR5(ロイシン豊富な反復含有Gタンパク質結合受容体5;GPR49、GPR67);Lingo-p75;Lingo-Troy;LPS;LTA(TNF-b);LTB;LTB4R(GPR16);LTB4R2;LTBR;LY64(リンパ球抗原64(RP105)、ロイシン豊富な反復(LRR)ファミリーのI型膜タンパク質);Ly6E(リンパ球抗原6複合体、座位E;Ly67、RIG-E、SCA-2、TSA-l);Ly6G6D(リンパ球抗原6複合体、座位G6D;Ly6-D、MEGT1);LY6K(リンパ球抗原6複合体、座位K;LY6K;HSJ001348;FLJ35226);MACMARCKS;MAG又はOMgp;MAP2K7(c-Jun);MDK;MDP;MIB1;ミドカイン;MEF;MIP-2;MKI67;(Ki-67);MMP2;MMP9;MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核球増強因子、メソセリン);MS4A1;MSG783(RNF124、 仮想的タンパク質FLJ20315);MSMB;MT3(メタロチオネクチン-111);MTSS1;MUC1(ムチン);MYC;MY088;Napi3b(NaPi2bとしても知られている)(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質キャリアファミリー34(リン酸ナトリウム)、メンバー2、II型ナトリウム依存性ホスフェートトランスポーター3b);NCA;NCK2;ニューロカン;NFKB1;NFKB2;NGFB(NGF);NGFR;NgR-Lingo;NgR-Nogo66(Nogo);NgR-p75;NgR-Troy;NME1(NM23A);NOX5;NPPB;NR0B1;NR0B2;NR1D1;NR1D2;NR1H2;NR1H3;NR1H4;NR112;NR113;NR2C1;NR2C2;NR2E1;NR2E3;NR2F1;NR2F2;NR2F6;NR3C1;NR3C2;NR4A1;NR4A2;NR4A3;NR5A1;NR5A2;NR6A1;NRP1;NRP2;NT5E;NTN4;ODZI;OPRD1;0X40;P2RX7;P2X5(プリン作動
性受容体P2Xリガンドゲートイオンチャネル5);PAP;PARTI;PATE;PAWR;PC A3;PCNA;PD-L1;PD-L2;PD-1;POGFA;POGFB;PEC AMI;PF4(CXCL4);PGF;PGR;ホスファカン;PIAS2;PIK3CG;PLAU(uPA);PLG;PLXDC1;PMEL17(銀ホモログ;SILV;D12S53E;PMEL17;SI;SIL);PPBP(CXCL7);PPID;PRI;PRKCQ;PRKDI;PRL;PROC;PROK2;PSAP;PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008016Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12遺伝子);PTAFR;PTEN;PTGS2(COX-2);PTN;RAC2(p21 Rac2);RARB;RET(ret原型癌遺伝子;MEN2A;HSCR1;MEN2B;MTC1;PTC;CDHF12;Hs.168114;RET51;RET-ELE1);RGSI;RGS13;RGS3;RNF110(ZNF144);ROBO2;S100A2;SCGB1D2(リポフィリンB);SCGB2A1(マンマグロビン2);SCGB2A2(マンマグロビン1);SCYEI(内皮単核細胞活性化サイトカイン);SDF2;Serna 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、セマフォリン5b Hlog、セマドメイン、7つのトロンボスポンジン反復(1型及び1型様)、膜貫通ドメイン(TM)、及び短い細胞質ドメイン(セマフォリン)5B);SERPINA1;SERPINA3;SERP1NB5(マスピン);SERPINEl(PAI-l);SERPDMF1;SHBG;SLA2;SLC2A2;SLC33A1;SLC43A1;SLIT2;SPPI;SPRR1B(Sprl);ST6GAL1;STABI;STAT6;STEAP(6つの、前立腺の膜貫通上皮抗原);STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前立腺癌関連遺伝子1、前立腺癌関連タンパク質1、6つの、前立腺の膜貫通上皮抗原2、6つの膜貫通前立腺タンパク質);TB4R2;TBX21;TCPIO;TOGFI;TEK;TENB2(推定の膜貫通プロテオグリカン);TGFA;TGFBI;TGFB1II;TGFB2;TGFB3;TGFBI;TGFBRI;TGFBR2;TGFBR3;THIL;THBSI(トロンボスポンジン-1);THBS2;THBS4;THPO;TIE(Tie-1);TMP3;組織因子;TLR1;TLR2;TLR3;TLR4;TLR5;TLR6;TLR7;TLR8;TLR9;TLR10;TMEFF1(EGF様及びフォリスタチン様ドメイン1を有する膜貫通タンパク質;トモレグリン-1);TMEM46(シーサホモログ2);TNF;TNF-a;TNFAEP2(B94);TNFAIP3;TNFRSFIIA;TNFRSF1A;TNFRSF1B;TNFRSF21;TNFRSF5;TNFRSF6(Fas);TNFRSF7;TNFRSF8;TNFRSF9;TNFSF10(TRAIL);TNFSF11(TRANCE);TNFSF12(AP03L);TNFSF13(April);TNFSF13B;TNFSF14(HVEM-L);TNFSF15(VEGI);TNFSF18;TNFSF4(OX40リガンド);TNFSF5(CD40リガンド);TNFSF6(FasL);TNFSF7(CD27リガンド);TNFSFS(CD30リガンド);TNFSF9(4-1 BBリガンド);TOLLIP;Toll-様受容体;TOP2A(トポイソメラーゼEa);TP53;TPM1;TPM2;TRADD;TMEM118(RINGフィンガータンパク質、膜貫通2;RNFT2;FLJ14627);TRAF1;TRAF2;TRAF3;TRAF4;TRAF5;TRAF6;TREM1;TREM2;TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、一過性の受容体潜在性カチオンチャネル、サブファミリーM、メンバー4);TRPC6;TSLP;TWEAK;チロシナーゼ(TYR;OCAIA;OCA1A;チロシナーゼ;SHEP3);VEGF;VEGFB;VEGFC;バーシカン;VHL C5;VLA-4;XCL1(リンホタクチン);XCL2(SCM-1b);XCRI(GPR5/ CCXCRI);YY1;及びZFPM2。
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞及び方法により作製される抗体は、CD3、CD4、CD5、CD16、CD19、CD20、CD21(CR2(補体受容体2)又はC3DR(C3d/エプスタインバーウイルス受容体)、又はHs.73792);CD33;CD34;CD64;CD72(B細胞分化抗原CD72、Lyb-2);CD79b(CD79B、CD79P、IGb(免疫グロブリン関連β)、B29);EGF受容体、HER2、HER3、又はHER4受容体などの、ErbB受容体ファミリーのCD200メンバー;LFA-1、Mac1、pl50.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7インテグリン、及び、αv/β3インテグリン(これらのα又はβサブユニットのいずれかを含む)などの細胞接着分子(例えば、抗CD11a、抗CD18、又は抗CD11b抗体);VEGF-A、VEGF-C;組織因子(TF);αインターフェロン(αIFN)などの成長因子;IL-1β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IL-17AF、IL-1S、IL-13Rα1、IL13Rα2、IL-4R、IL-5R、IL-9R、IgEなどの、インターロイキンであるTNFα;血液群抗原、flk2/flt3受容体;肥満(OB)受容体;mpl受容体;CTLA-4;RANKL、RANK、RSV Fタンパク質、プロテインCなどのCDタンパク質に結合することができる。
特定の実施形態において、本明細書において提供する細胞及び方法を使用して、補体プロテインC5に特異的に結合する抗体(二重特異性抗体などの多重特異性抗体)(例えば、ヒトC5に特異的に結合する抗C5アゴニスト抗体)を産生することができる。特定の実施形態において、抗C5抗体は、(a)SSYYMA(配列番号1)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1;(b)AIFTGSGAEYKAEWAKG(配列番号26)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2;(c)DAGYDYPTHAMHY(配列番号27)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3;(d)RASQGISSSLA(配列番号28)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1;(e)GASETES(配列番号29)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2;及び、(f)QNTKVGSSYGNT(配列番号30)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3から選択される、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又は6つのCDRを含む。例えば、特定の実施形態において、抗05抗体は、(a)SSYYMA(配列番号1)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1;(b)AIFTGSGAEYKAEWAKG(配列番号26)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2;(c)DAGYDYPTHAMHY(配列番号27)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3;から選択される1つ、2つ、又は3つのCDRを含む重鎖可変ドメイン(VH)配列、並びに/又は、(d)RASQGISSSLA(配列番号28)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1;(e)GASETES(配列番号29)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2;及び、(f)QNTKVGSSYGNT(配列番号30)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3から選択される1つ、2つ、又は3つのCDRを含む軽鎖可変ドメイン(VL)配列を含む。上記重鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3、並びに、軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3の配列は、米国特許出願公開第2016/0176954号にそれぞれ、配列番号117、配列番号118、配列番号121、配列番号122、配列番号123、及び配列番号125として開示されている。(米国特許出願公開第2016/0176954号の表7及び8を参照のこと。)
特定の実施形態において抗C5抗体は、それぞれ、VH及びVL配列QVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTVH SSYYMAWVRQ APGKGLEWVG AIFTGSGAEY KAEWAKGRVT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCASD AGYDYPTHAM HYWGQGTLVT VSS(配列番号31)、
及び
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SSLAWYQQKP GKAPKLLIYG ASETESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN TKVGSSYGNT FGGGTKVEIK(配列番号32)を含む(これらの配列の翻訳後修飾を含む)。上記VH及びVL配列は、米国特許出願公開第2016/0176954号にそれぞれ、配列番号106及び配列番号111として開示されている。(米国特許出願公開第2016/0176954号の表7及び8を参照のこと。)特定の実施形態において、抗C5抗体は305L015である(米国特許出願公開第2016/0176954号を参照のこと)。
特定の実施形態において、本明細書にて開示した方法により作製した抗体は、OX40に結合することができる(例えば、ヒトOX40に特異的に結合する抗OX40アゴニスト抗体)。特定の実施形態において、抗OX40抗体は、(a)DSYMS(配列番号2)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1;(b)DMYPDNGDSSYNQKFRE(配列番号3)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2;(c)APRWYFSV(配列番号4)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3;(d)RASQDISNYLN(配列番号5)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1;(e)YTSRLRS(配列番号6)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2;及び、(f)QQGHTLPPT(配列番号7)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3から選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又は6つのCDRを含む。例えば、特定の実施形態において、抗OX40抗体は、(a)DSYMS(配列番号2)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1;(b)DMYPDNGDSSYNQKFRE(配列番号3)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2;及び(c)APRWYFSV(配列番号4)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3;から選択される1つ、2つ、又は3つのCDRを含む重鎖可変ドメイン(VH)配列、並びに/又は、(a)RASQDISNYLN(配列番号5)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1;(b)YTSRLRS(配列番号6)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2;及び、(c)QQGHTLPPT(配列番号7)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3から選択される1つ、2つ、又は3つのCDRを含む軽鎖可変ドメイン(VL)配列を含む。特定の実施形態において、抗OX40抗体は、それぞれ、VH及びVL配列EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DSYMSWVRQA PGQGLEWIGD MYPDNGDSSY NQKFRERVTI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCVLAP RWYFSVWGQG TLVTVSS(配列番号8)
及び
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GHTLPPTFGQ GTKVEIK(配列番号9)を含む(これらの配列の翻訳後修飾を含む)。
特定の実施形態において、抗OX40抗体は、(a)NYLIE(配列番号10)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1;(b)VINPGSGDTYYSEKFKG(配列番号11)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2;(c)DRLDY(配列番号12)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3;(d)HASQDISSYIV(配列番号13)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1;(e)HGTNLED(配列番号14)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2;及び、(f)VHYAQFPYT(配列番号15)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3から選択される1、2、3、4、5、又は6個のCDRを含む。例えば、特定の実施形態において、抗OX40抗体は、(a)NYLIE(配列番号10)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1;(b)VINPGSGDTYYSEKFKG(配列番号11)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2;及び(c)DRLDY(配列番号12)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3から選択される1、2、又は3つのCDRを含む重鎖可変ドメイン(VH)配列、並びに/又は、(a)HASQDISSYIV(配列番号13)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1;(b)HGTNLED(配列番号14)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;及び、(c)VHYAQFPYT(配列番号15)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3から選択される1、2、又は3つのCDRを含む軽鎖可変ドメイン(VL)配列を含む。特定の実施形態において、抗OX40抗体は、それぞれ、VH及びVL配列EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYAFT NYLIEWVRQA PGQGLEWIGV INPGSGDTYY SEKFKGRVTI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCARDR LDYWGQGTLV TVSS(配列番号16)
及び
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCHASQDIS SYIVWYQQKP GKAPKLLIYH GTNLEDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCVH YAQFPYTFGQ GTKVEIK(配列番号17)を含む(これらの配列の翻訳後修飾を含む)。
抗OX40抗体に関する更なる詳細が、国際公開第2015/153513号で開示されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞及び方法により作製した抗体は、インフルエンザウイルスBヘマグルチニン、即ち「fluB」に結合することができる(例えば、インビトロ及び/又はインビボでインフルエンザBウイルスのYamagataリネージ由来のヘマグルチニンに結合する、インフルエンザBウイルスのVictoriaリネージ由来のヘマグルチニンに結合する、インフルエンザBウイルスの祖先リネージ由来のヘマグルチニンに結合する、又は、インフルエンザBウイルスのYamagataリネージ、Victoriaリネージ、及び祖先リネージ由来のヘマグルチニンに結合する抗体)。抗FluB抗体に関する更なる詳細は国際公開第2015/148806号で開示されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞及び方法により作製した抗体は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質(LRP)-1又はLRP-8又はトランスフェリン受容体、並びに、β-セクレターゼ(BACE1又はBACE2)、α-セクレターゼ、γ-セクレターゼ、タウセクレターゼ、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、細胞死受容体6(DR6)、アミロイドβペプチド、α-シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、p75 NTR、CD40、及びカスパーゼ-6からなる群から選択される少なくとも1個の標的に結合することができる。
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞及び方法により作製した抗体は、CD40に対するヒトIgG2抗体である。特定の実施形態において、抗CD40抗体はRG7876である。
特定の実施形態において、本開示の細胞及び方法を使用して、ポリペプチドを作製することができる。例えば、限定されるものではないが、ポリペプチドは標的化された免疫サイトカインである。特定の実施形態において、標的化された免疫サイトカインはCEA-IL2v免疫サイトカインである。特定の実施形態において、CEA-IL2v免疫サイトカインはRG7813である。特定の実施形態において、標的化された免疫サイトカインはFAP-IL2v免疫サイトカインである。特定の実施形態において、FAP-IL2v免疫サイトカインはRG7461である。
特定の実施形態において、本明細書において提供する細胞又は方法により作製した多重特異性抗体(二重特異性抗体など)は、CEA、及び、少なくとも1つの追加の標的分子に結合することができる。特定の実施形態において、本明細書において提供する方法に従い作製した多重特異性抗体(二重特異性抗体など)は、腫瘍標的化サイトカイン、及び少なくとも1つの追加の標的分子に結合することができる。特定の実施形態において、本明細書において提供する方法に従い作製した多重特異性抗体(二重特異性抗体など)は、IL2v(即ち、インターロイキン2バリアント)に融合され、IL-1系免疫サイトカイン、及び少なくとも1つの追加の標的分子に結合する。特定の実施形態において、本明細書において提供する方法に従い作製した多重特異性抗体(二重特異性抗体など)は、T細胞二重特異性抗体(即ち、二重特異性T細胞エンゲージャー又はBiTE)である。
特定の実施形態において、本明細書において提供する方法に従い作製した多重特異性抗体(二重特異性抗体など)は、IL-1α及びIL-1β、IL-12及びIL-1S;IL-13及びIL-9;IL-13及びIL-4;IL-13及びIL-5;IL-5及びIL-4;IL-13及びIL-1β;IL-13及びIL-25;IL-13及びTARC;IL-13及びMDC;IL-13及びMEF;IL-13及びTGF-~;IL-13及びLHRアゴニスト;IL-12及びTWEAK、IL-13及びCL25;IL-13及びSPRR2a;IL-13及びSPRR2b;IL-13及びADAMS、IL-13及びPED2、IL17A及びIL17F、CEA及びCD3、CD3及びCD19、CD138及びCD20;CD 138及びCD40;CD19及びCD20;CD20及びCD3;CD3S及びCD13S;CD3S及びCD20;CD3S及びCD40;CD40及びCD20;CD-S及びIL-6;CD20及びBR3、TNFα及びTGF-β、TNFα及びIL-1β;TNFα及びIL-2、TNFα及びIL-3、TNFα及びIL-4、TNFα及びIL-5、TNFα及びIL6、TNFα及びIL8、TNFα及びIL-9、TNFα及びIL-10、TNFα及びIL-11、TNFα及びIL-12、TNFα及びIL-13、TNFα及びIL-14、TNFα及びIL-15、TNFα及びIL-16、TNFα及びIL-17、TNFα及びIL-18、TNFα及びIL-19、TNFα及びIL-20、TNFα及びIL-23、TNFα及びIFNα、TNFα及びCD4、TNFα及びVEGF、TNFα及びMIF、TNFα及びICAM-1、TNFα及びPGE4、TNFα及びPEG2、TNFα及びRANKリガンド、TNFα及びTe38、TNFα及びBAFF、TNFα及びCD22、TNFα及びCTLA-4、TNFα及びGP130、TNF a及びIL-12p40、VEGF及びアンジオポエチン、VEGF及びHER2、VEGF-A及びHER2、VEGF-A及びPDGF、HER1及びHER2、VEGFA及びANG2、VEGF-A及びVEGF-C、VEGF-C及びVEGF-D、HER2及びDR5、VEGF及びIL-8、VEGF及びMET、VEGFR及びMET受容体、EGFR及びMET、VEGFR及びEGFR、HER2及びCD64、HER2及びCD3、HER2及びCD16、HER2及びHER3;EGFR(HER1)及びHER2、EGFR及びHER3、EGFR及びHER4、IL-14及びIL-13、IL-13及びCD40L、JL4及びCD40L、TNFR1及びIL-1R、TNFR1及びIL-6R及びTNFR1及びIL-18R、EpCAM及びCD3、MAPG及びCD28、EGFR及びCD64、CSPGs及びRGM A;CTLA-4及びBTN02;IGF1及びIGF2;IGF 1/2及びErb2B;MAG及びRGM A;NgR及びRGM A;NogoA及びRGM A;OMGp及びRGM A;POL-1及びCTLA-4;及びRGM A及びRGM Bから選択される少なくとも2つの標的分子に結合することができる。
特定の実施形態において、本明細書において提供する方法に従い作製した多重特異性抗体(二重特異性抗体など)は、抗CEA/抗CD3二重特異性抗体である。特定の実施形態において抗CEA/抗CD3二重特異性抗体はRG7802である。特定の実施形態において、抗CEA/抗CD3二重特異性抗体は、以下に示す配列番号18~21に記載のアミノ酸配列を含む:
Figure 2023040016000001
Figure 2023040016000002
Figure 2023040016000003
Figure 2023040016000004
抗CEA/抗CD3二重特異性抗体に関する更なる詳細は、国際公開第2014/121712号に提供されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞及び方法により作製した多重特異性抗体(二重特異性抗体など)は、抗VEGF/抗アンジオポエチン二重特異性抗体である。特定の実施形態において、抗VEGF/抗アンジオポエチン二重特異性抗体二重特異性抗体はCrossmabである。特定の実施形態において、抗VEGF/抗アンジオポエチン二重特異性抗体はRG7716である。特定の実施形態において、抗CEA/抗CD3二重特異性抗体は、以下に示す配列番号22~25に記載のアミノ酸配列を含む:
Figure 2023040016000005
Figure 2023040016000006
Figure 2023040016000007
Figure 2023040016000008
特定の実施形態において、本明細書にて開示した方法により作製した多重特異性抗体(二重特異性抗体など)は、抗Ang2/抗VEGF二重特異性抗体である。特定の実施形態において、抗Ang2/抗VEGF二重特異性抗体はRG7221である。特定の実施形態において、抗Ang2/抗VEGF二重特異性抗体はCAS番号1448221-05-3である。
他の分子に任意でコンジュゲートされる可溶性抗原又はその断片は、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。受容体などの膜貫通分子の場合、これらの断片(例えば、受容体の細胞外ドメイン)が免疫原として使用され得る。代替的に、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として使用され得る。そのような細胞は、天然源(例えば、癌細胞株)に由来し得るか、又は膜貫通分子を発現するように組み換え技法によって形質転換された細胞であり得る。抗体の調製に有用な他の抗原及びその形態は、当業者には明らかであろう。
特定の実施形態において、本明細書にて開示した細胞及び方法により作製したポリペプチド(例えば抗体)は、結合により、染料又は細胞毒性剤、例えば化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、微生物、菌類、植物若しくは動物由来の酵素活性毒素、又はこれらの断片)、又は放射性同位体(即ち放射性抱合体)などの化学分子に更にコンジュゲートすることが可能となることができる。本明細書に記載の方法を使用して作製した抗体又は二重特異性抗体を含む免疫抱合体は、1つだけの重鎖、又は1つだけの軽鎖の定常領域にコンジュゲートした細胞毒性剤を含有することができる。
5.5.6 抗体バリアント
特定の態様において、本明細書において提供する抗体、例えば、セクション5.5.5に示す抗体のアミノ酸配列バリアントを想到する。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的性質を変化させることが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、適切な改変を、抗体をコードするヌクレオチド配列に組み込むことで、又はペプチド合成により調製することができる。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び/又は挿入、及び/又は置換を含む。最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換を任意に組み合わせることができるが、但し、その最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を保有することを条件とする。
5.5.6.1 置換、挿入、及び欠失バリアント
特定の態様において、1つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換による変異誘発に関して目的とする部位には、CDR及びFRが含まれる。保存的置換は、表1において、「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化は、表1において、「例示的な置換」の見出しの下に提供され、またアミノ酸側鎖クラスを参照して以下に更に記載されるとおりである。目的とする抗体中にアミノ酸置換を導入し、その産物を、所望の活性、例えば、保持/改善された抗原結合、低下した免疫原性、又は改善されたADCC若しくはCDCについてスクリーニングすることができる。
Figure 2023040016000009
アミノ酸は、共通の側鎖の性質に従い分類分けすることができる:
(1) 疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2) 中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3) 酸性:Asp、Glu;
(4) 塩基性:His、Lys、Arg;
(5) 鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro、
(6) 芳香族:Trp、Tyr、Phe。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを伴うことになる。
ある種類の置換型バリアントは、親抗体(例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体)の1つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる研究のために選択される、得られた変異体は、親抗体と比較して、ある特定の生物学的性質における修飾(例えば、改善)(例えば、親和性の増加、免疫原性の低減)を有し、及び/又は実質的に保持された親抗体のある特定の生物学的性質を有することになる。例示的な置換バリアントは、例えば、本明細書に記載されるものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して好都合に生成することができる、親和性成熟抗体である。要するに、1つ以上CDR残基が変異され、バリアント抗体がファージにディスプレイされ、特定の生物活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。
改変(例えば置換)を、CDRに加えて、例えば、抗体の親和性を改善することができる。そのような改変は、CDR「ホットスポット」、即ち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基(例えば、Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008)を参照のこと)、及び/又は抗原と接触する残基内で行われ得、結果として得られる多様体VH又はVLが結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築し、それから再選択することによる親和性成熟が、例えば、Hoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,(2001))に記載されている。親和性成熟のいくつかの態様では、多様な方法(例えば、エラープローンPCR、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指向性変異誘発)のいずれかによって、成熟のために選択される可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリが創出される。次いで、このライブラリは、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を特定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのCDR残基(例えば、一度に4~6個の残基)をランダム化する、CDR指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するCDR残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して、具体的に特定することができる。特に、CDR-H3及びCDR-L3が、しばしば標的化される。
特定の態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗体の抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、1つ以上のCDR内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的改変(例えば、本明細書に提供されるような保存的置換)が、CDR中で行われることができる。そのような改変は、例えば、CDR内の抗原接触残基の外側であっててもよい。上述の特定のバリアントVH及びVL配列において、各CDRは、改変されていないか、又は1つ、2つ、又は3つ以下のアミノ酸置換を有するかのいずれかである。
変異を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085によって記載されるように、「アラニンスキャニング突然変異生成」と呼ばれる。この方法では、一残基又は一群の標的残基(例えば、Arg、Asp、His、Lys、及びGluなどの荷電残基)が特定され、中性又は負に荷電したアミノ酸(例えば、アラニン又はポリアラニン)によって置き換えられて、抗体の抗原との相互作用が影響を受けたかどうかが決定される。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。代替的に、又は追加的に、抗原-抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との間の接触点を特定することができる。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は除去されてもよい。バリアントは、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列挿入として、1個の残基から100個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲のアミノ末端及び/又はカルボキシル末端の融合、並びに1個又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例として、N末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、酵素(例えば、ADEPT(抗体指向性酵素プロドラッグ治療法のための)又はポリペプチドへの抗体のN末端若しくはC末端の融合が挙げられ、これは抗体の血清半減期を増大させる。
5.5.6.2 グリコシル化バリアント
特定の態様において、本明細書において提供する抗体を変えて、抗体のグリコシル化の程度を増減させる。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、1つ以上のグリコシル化部位が作り出されるか、又は除去されるようにアミノ酸配列を改変させることにより好都合に達成され得る。
抗体がFc領域を含む場合、Fc領域に結合したオリゴ糖を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、N結合によってFc領域のCH2ドメインのAsn297に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright et al.TIBTECH 15:26-32(1997)を参照のこと。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」のGlcNAcに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの態様では、特定の改善された性質を有する抗体バリアントを作製するために、本開示の抗体中のオリゴ糖に修飾を加えることができる。
一態様では、非フコシル化オリゴ糖、即ち、Fc領域へのフコース結合(直接又は間接)が欠落した、オリゴ糖構造を有する抗体多様体を提供する。このような非フコシル化オリゴ糖(「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる)は特に、二分枝オリゴ糖構造の幹に第1のGlcNAcが結合したフコース残基を欠く、N結合オリゴ糖である。一態様では、内在性又は親抗体と比較して、Fc領域における非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した抗体バリアントを提供する。例えば、非フコシル化オリゴ糖の比率が、少なくとも約20%、少なくとも約40%、少なくとも約60%、少なくとも約80%、又は更に約100%(即ち、フコシル化オリゴ糖が存在しない)であることができる。非フコシル化オリゴ糖の割合は、例えば、国際公開第2006/082515号に記載のMALDI-TOF質量分析法により測定した、Asn297に結合した全てのオリゴ糖の合計(例えば、複合体、ハイブリッド、及びハイマンノース構造)に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の(平均)量である。Asn297とは、Fc領域のほぼ位置297(Fc領域残基のEUナンバリング)に位置するアスパラギン残基を意味するが、Asn297はまた、抗体の軽度の配列変異により、アミノ酸の位置297の上流又は下流約±3、即ち、位置294~300に位置することができる。Fc領域における非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した、このような抗体は、改善されたFcγRIIIa受容体結合、及び/又は改善されたエフェクター機能、特に改善されたADCC機能を有することができる。例えば、米国特許出願公開第2003/0157108号;同第2004/0093621号を参照のこと。
フコシル化が低下した抗体を産生可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化で欠失したLec13CHO細胞(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);米国特許出願公開第2003/0157108号;及び国際公開第2004/056312号特に実施例11)、及び、ノックアウト細胞株、例えばα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のFUT8ノックアウトCHO細胞(例えばYamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614-622(2004);Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006);及び国際公開第2003/085107号を参照のこと)、又は、GDP-フコース合成若しくはトランスポータータンパク質の活性が低下した、又は消滅した細胞(例えば、米国特許出願公開第2004259150号、同第2005031613号、同第2004132140号、同第2004110282号を参照のこと)が挙げられる。
更なる態様において、抗体バリアントは、例えば、抗体のFc領域に結合した二分枝オリゴ糖がGlcNAcにより二分されているバイセクトオリゴ糖と共に提供される。そのような抗体バリアントは、上述のとおり、低下したフコシル化、及び/又は改善されたADCCを有することができる。そのような抗体バリアントの例は、例えば、Umana et al.,Nat Biotechnol 17,176-180(1999);Ferrara et al.,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006);国際公開第99/54342号;同第2004/065540号、同第2003/011878号に記載されている。
Fc領域に結合したオリゴ糖内の少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体バリアントもまた提供する。そのような抗体バリアントは、改善されたCDC機能を有することができる。そのような抗体バリアントは、例えば、国際公開第1997/30087号、同第1998/58964号、及び同第1999/22764号に記載されている。
5.5.6.3 Fc領域バリアント
特定の態様では、1つ以上のアミノ酸改変は、本明細書で提示される抗体のFc領域に導入されてもよく、それにより、Fc領域バリアントを作成する。Fc領域バリアントは、1つ以上のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトFc領域配列(例えばヒトIgG、IgG、IgG又はIgG Fc領域)を含んでよい。
特定の態様において、本開示は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を有することで、抗体のインビボ半減期が重要でありながら、特定のエフェクター機能(例えば補体依存性細胞傷害(CDC)及び抗体依存性細胞傷害(ADCC))が不必要、又は有害である用途に対して望ましい候補となる、抗体バリアントを想到する。インビトロ及び/又はインビボ細胞傷害性アッセイを行って、CDC及び/又はADCC活性の低減/欠乏を確認してもよい。例えば、Fc受容体(FcR)結合アッセイを実行して、抗体がFcγR結合を欠く(故にADCC活性を欠く可能性が高い)が、FcRn結合能力を保持していることを確実にし得る。ADCC、NK細胞を媒介するための初代細胞は、FcγRIIIのみを発現するが、単球はFcγRI、FcγRIIを発現し、造血細胞内でのFcγRIII FcR発現は、Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)の464頁、表3にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するインビトロアッセイの非限定例は、米国特許第5,500,362号(例えば、Hellstrom,I.et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986)を参照)及びHellstrom,I et al,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985);5,821,337(Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987)を参照)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる(例えば、フローサイトメトリー用ACTI(商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA);及びCytoTox96(登録商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(Promega,Madison,WI)を参照のこと)。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球細胞(PBMC)及びナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられる。あるいは、又は更に、対象の分子のADCC活性は、例えば、Clynes et al.Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)に開示されているように、動物モデルにおいてインビボで評価することができる。C1q結合アッセイを実行して、抗体がC1qに結合することができないためにCDC活性を欠くことを確認することができる。例えば、国際公開第2006/029879号及び同第2005/100402号に記載されているC1q及びC3c結合ELISAを参照のこと。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを実施することができる(例えば、Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996);Cragg,M.S.et al.,Blood 101:1045-1052(2003);及びCragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004)を参照のこと)。FcRn結合、及びインビボでのクリアランス/半減期測定もまた、当該技術分野において既知の方法を使用して実施することができる(例えば、Petkova,S B.et al.,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006);国際公開第2013/120929A1号を参照のこと)。
エフェクター機能が低下した抗体としては、Fc領域の残基238、265、269、270、297、327及び329の1つ以上の置換を有するものが挙げられる(米国特許第6,737,056号)。このようなFc変異体としては、アミノ酸位置265、269、270、297及び327のうち2つ以上での置換を有するFc変異体が挙げられ、残基265及び297がアラニンに置換されている、いわゆる「DANA」Fc変異体を含む(米国特許第7,332,581号)。
FcRへの結合が向上又は低下した特定の抗体バリアントについて記載されている。(例えば、米国特許第6,737,056号;国際公開第2004/056312号,及びShields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)を参照のこと。)
特定の態様において、抗体バリアントは、ADCCを改善する1つ以上のアミノ酸置換、例えば、Fc領域の298、333、及び/又は334位(EU付番の残基)での置換を有するFc領域を含む。
特定の態様において、抗体バリアントは、FcγR結合を減少さあせる1つ以上のアミノ酸置換、例えば、Fc領域の位置234及び235(EU付番の残基)を有するFc領域を含む。一態様では、置換はL234A及びL235A(LALA)である。特定の態様において、抗体バリアントは、ヒトIgGFc領域に由来するFc領域に、D265A及び/又はP329Gを更に含む。一態様において、置換は、ヒトIgGFc領域に由来するFc領域における、L234A、L235A、及びP329G(LALA-PG)である。(例えば、国際公開第2012/130831号を参照のこと。)別の態様において、置換は、ヒトIgGFc領域に由来するFc領域における、L234A、L235A、及びD265A(LALA-DA)である。
いくつかの態様において、例えば米国特許第6,194,551号、国際公開第99/51642号、及びIdusogie et al.J.Immunol.164:4178-4184(2000)に記載されているように、C1q結合及び/又は補体依存性細胞傷害性(CDC)の変化(即ち、向上若しくは低下のいずれか)をもたらすFc領域内で変化が起こる。
半減期が増大し、胎生Fc受容体(FcRn)への結合が向上した、母体IgGを胎児に移行する役割を果たす抗体(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)及びKim et al.,J.Immunol.24:249(1994))は、米国特許出願公開第2005/0014934号(Hinton et al.)に記載されている。これらの抗体は、FcRnへのFc領域の結合を向上する1つ以上の置換基を有するFc領域を含む。そのようなFcバリアントとしては、Fc領域残基:238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、又は434の1つ以上において置換、例えば、Fc領域残基434の置換を有するものが挙げられる(例えば、米国特許第7,371,826号;Dall’ Acqua,W.F.,et al.J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524を参照のこと)。
マウスFcマウスFcRn相互作用に決定的なFc領域残基は、部位特異的突然変異誘発により識別されている(例えば、Dall’ Acqua,W.F.,et al.J.Immunol 169(2002)5171-5180を参照のこと)。残基I253、H310、H433、N434、及びH435(EUインデックス付番)が、相互作用に関与する(Medesan,C.,et al.,Eur.J.Immunol.26(1996)2533;Firan,M.,et al.,Int.Immunol.13(2001)993;Kim,J.K.,et al.,Eur.J.Immunol.24(1994)542)。残基I253、H310、及びH435が、ヒトFcとマウスFcRnの相互作用に決定的であることが発見された(Kim,J.K.,et al.,Eur.J.Immunol.29(1999)2819)。ヒトFc-ヒトFcRn複合体の研究により、残基I253、S254、H435、及びY436が相互作用に決定的であることが示されている(Firan,M.,et al.,Int.Immunol.13(2001)993;Shields,R.L.,et al.,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。Yeung,Y.A.,et al.(J.Immunol.182(2009)7667-7671)において、残基248~259、及び301~317、及び376~382、及び424~437の様々な変異が報告され、調査されている。
FcRn結合を低下させる1つ以上のアミノ酸置換、例えば、Fcの領域位置253、及び/又は310、及び/又は435(EU付番の残基)における変異を有するFc領域を含む。特定の態様において、抗体バリアントは、位置253、310、及び435におけるアミノ酸置換を有するFc領域を含む。一態様において、置換は、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域における、I253A、H310A、及びH435Aである。例えば、Grevys,A.,et al.,J.Immunol.194(2015)5497-5508を参照のこと。
FcRn結合を低下させる1つ以上のアミノ酸置換、例えば、Fc領域の位置310、及び/又は433、及び/又は436(EU付番の残基)における変異を有するFc領域を含む。特定の態様において、抗体バリアントは、位置310、433、及び436におけるアミノ酸置換を有するFc領域を含む。一態様において、置換は、ヒトIgG1 Fc領域に由来するFc領域における、H310A、H433A、及びY436Aである。(例えば、国際公開第2014/177460A1号を参照のこと。)
FcRn結合を増加させる1つ以上のアミノ酸置換、例えば、Fcの領域位置252、及び/又は254、及び/又は256(EU付番の残基)における変異を有するFc領域を含む。特定の態様において、抗体バリアントは、位置252、254、及び256におけるアミノ酸置換を有するFc領域を含む。一態様において、置換は、ヒトIgG Fc領域に由来するFc領域におけるM252Y、S254T、及びT256Eである。Fc領域バリアントのその他の例に関係するDuncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)米国特許第5,648,260号;同第5,624,821号;及び国際公開第94/29351号も参照のこと。
本明細書に報告されるような抗体の重鎖のC末端は、アミノ酸残基PGKで終わる完全なC末端であってもよい。重鎖のC末端は、C末端アミノ酸残基のうち1つ又は2つが除去された、短くなったC末端であってもよい。好ましい一態様では、重鎖のC末端は、PGで終わる短くなったC末端である。本明細書に報告される全ての態様のうちの1つの態様では、本明細書に明記されるC末端のCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体は、C末端グリシン-リシンジペプチドを含む(G446及びK447、EUインデックス付番のアミノ酸位置)。本明細書に報告される全ての態様のうちの1つの態様では、本明細書に明記されるC末端のCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体は、C末端グリシン残基を含む(G446、EUインデックス付番のアミノ酸位置)。
5.5.6.4 システイン改変抗体バリアント
特定の態様において、抗体の1つ以上の残基がシステイン残基で置換された、システイン改変抗体、例えばTHIOMAB(商標)抗体を作製するのが望ましい場合がある。特定の態様において、置換された残基は、抗体の利用しやすい部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体の接触可能部位に配置され、抗体を他の部位、例えば薬物部位、又はリンカー/薬物部位と結合させ、本明細書で更に記載する免疫抱合体を作製するのに用いることができる。システイン改変抗体は、例えば米国特許第7,521,541号、同第8,30,930号、同第7,855,275号、同第9,000,130号、又は国際公開2016040856号に記載されているとおりに作製することができる。
5.5.6.5 抗体誘導体
特定の態様において、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に好適な部分としては、限定するものではないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか)、及びデキストラン又はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレン(propropylene)グリコールホモポリマー、プロリプロピレン(prolypropylene)オキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは任意の分子量であることができ、かつ分枝又は非分枝であることができる。抗体に結合したポリマーの数は異なってもよく、2つ以上のポリマーが結合している場合、それらは同じ分子であっても、異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又は種類は、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下である療法に使用されるかなどを含むが、これらに限定されない、考慮すべき事項に基づいて決定され得る。
5.5.7 免疫抱合体
本開示はまた、1つ以上の治療薬、例えば細胞毒性剤、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えばタンパク質毒素、微生物、菌類、植物若しくは動物由来の酵素活性毒素、又はこれらの断片)、又は放射性同位元素にコンジュゲートした(化学結合した)、本明細書にて開示した抗体を含む免疫免疫抱合体を提供する。
一態様において、免疫抱合体は、抗体が、前述の治療薬の1つ以上に抱合した、抗体薬物抱合体(ADC)である。抗体は典型的には、リンカーを使用して、治療薬の1つ以上に接続される。治療薬及び薬剤及びリンカーの例を含む、ADC技術の概観は、Pharmacol Review 68:3-19(2016)に記載されている。
別の態様において、免疫抱合体は、本明細書に記載されるように、酵素活性毒素又はこれらの断片に結合する抗体を含む。これらは以下に限定されるわけではないが、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンA鎖(緑膿菌からのもの)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、αサルシン、シナアブラギリのタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウのタンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン(enomycin)、並びにトリコテセンを含む。
別の態様において、免疫抱合体は、放射性原子にコンジュゲートされ、放射性抱合体を形成する、本明細書に記載される抗体を含む。放射性抱合体の作製のために、種々の放射性同位元素が利用可能である。例としてはAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、及びLuの放射性同位元素が挙げられる。放射性抱合体を検出のために使用する場合、それは、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、tc99m若しくはI123、又は核磁気共鳴(NMR)画像法(別名、磁気共鳴画像法、MRI)のためのスピン標識、例えば、再びヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、若しくは鉄を含むことができる。
抗体及び細胞傷害性剤の抱合体は、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えば、アジプイミド酸ジメチルHCl)、活性エステル(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン2,6-ジイソシアネート)、及びビス-活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)などの多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al.,Science 238:1098(1987)に記載されているように調製することができる。炭素-14で標識された1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(MX-DTPA)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合体化のための例示的なキレート剤である。国際公開第94/11026号を参照のこと。リンカーは、細胞内において細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であることができる。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー(Chari et al,Cancer Res.52:127-131(1992);米国特許第5,208,020号)を使用することができる。
本明細書の免疫抱合体又はADCは、市販されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、並びにSVSB(サクシニミジル-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)(例えば、Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A製)を含むが、これらに限定されない架橋剤試薬で調製されるそのような抱合体を明示的に企図するが、これらに限定されない。
5.6 例示的な実施形態
A. 特定の非限定的な実施形態において、本明細書にて開示する主題は、ピルビン酸キナーゼ筋(PKM)ポリペプチドアイソフォームの発現がノックダウン又はノックアウトされ、PKMポリペプチドアイソフォームがPKM-1ポリペプチドアイソフォームを含む、ラクトジェニック活性が低下した、又は除去された哺乳動物細胞を提供する。
A1. PKM-2ポリペプチドアイソフォームの発現がノックダウン又はノックアウトされた、Aに記載の前述の哺乳動物細胞。
A2. 細胞がCHO細胞である、A又はA1に記載の前述の哺乳動物細胞。
A3. 目的の生成物をコードする核酸配列を含む、A~A2のいずれか1つに記載の前述の哺乳動物細胞。
A4. 目的の生成物がタンパク質を含む、A3に記載の前述の哺乳動物細胞。
A5. 目的の生成物が組み換えタンパク質を含む、A3又はA4に記載の前述の哺乳動物細胞。
A6. 目的の生成物が抗体又はその抗原結合断片を含む、A3~A5のいずれか1つに記載の前述の哺乳動物細胞。
A7. 抗体が多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、A6に記載の前述の哺乳動物細胞。
A8. 抗体が、単一の重鎖配列、及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、A6に記載の前述の哺乳動物細胞。
A9. 抗体がキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含む、A6~A8のいずれか1つに記載の前述の哺乳動物細胞。
A10. 抗体がモノクローナル抗体を含む、A6~A9のいずれか1つに記載の前述の哺乳動物細胞。
A11. 核酸配列が、標的化された位置にて、哺乳動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれている、A3~A10のいずれか1つに記載の前述の哺乳動物細胞。
A12. 哺乳動物細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれた目的の生成物をコードする核酸を更に含む、A11に記載の前述の哺乳動物細胞。
A13. 哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性の約50%未満である、A~A12のいずれか1つに記載の前述の哺乳動物細胞。
A14. 哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性の約20%未満である、A13に記載の前述の哺乳動物細胞。
A15. 参照細胞が、PKM遺伝子の野生型対立遺伝子を含む細胞である、A13又はA14に記載の前述の哺乳動物細胞。
A16. 哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、産生期の14日目又は15日目に測定される、A~A15のいずれか1つに記載の前述の哺乳動物細胞。
A17. 哺乳動物細胞が、産生期の間に約2.0g/L未満のラクテートを生成する、A~A16のいずれか1つに記載の前述の哺乳動物細胞。
A18. 哺乳動物細胞が、産生期の間に、振盪フラスコ内で約2.0g/L未満のラクテートを生成する、A~A16のいずれか1つに記載の前述の哺乳動物細胞。
A19. 哺乳動物細胞が、産生期の間に、バイオリアクター内で約2.0g/L未満のラクテートを生成する、A~A16のいずれか1つに記載の前述の哺乳動物細胞。
B. 特定の非限定的な実施形態において、本明細書にて開示する主題は、配列番号39~41からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は、配列番号37及び38に記載のヌクレオチド配列を含むPKM遺伝子の対立遺伝子を含む哺乳動物細胞を提供する。
C. 特定の非限定的な実施形態において、本明細書にて開示する主題は、A~A19に記載の前述の哺乳動物細胞のいずれかの哺乳動物細胞を含む組成物を提供する。
D. 特定の非限定的な実施形態において、本明細書にて開示する主題は、ピルビン酸キナーゼ筋(PKM)ポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトすることを含む、細胞におけるラクトジェニック活性を低下させる、又は除去する方法を提供する。
E. 特定の非限定的な実施形態において、本明細書にて開示する主題は、細胞におけるラクトジェニック活性を低下させる又は除去する方法であって、当該細胞に遺伝子組み換えシステムを投与することを含み、当該遺伝子組み換えシステムがピルビン酸キナーゼ筋(PKM)ポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトする方法を提供する。
E1. 遺伝子組み換えシステムが、CRISPR/Casシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)システム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、Eに記載の前述の方法。
E2. 遺伝子組み換えシステムがCRISPR/Cas9システムである、E又はE1に記載の前述の方法。
E3. CRISPR/Cas9システムが
(a) Cas9分子、及び
(b) PKM遺伝子内の標的配列に対して相補的な標的化配列を含む、1つ以上のガイドRNA(gRNA)
を含む、E2に記載の前述の方法。
E4. 標的配列が、PKM遺伝子の一部、エクソン1内の領域、エクソン2に隣接する5’領域、エクソン2内の領域、PKM遺伝子のエクソン9に隣接する5’イントロン領域、PKM遺伝子のエクソン9に隣接する3’イントロン領域、PKM遺伝子のエクソン10に隣接する3’イントロン領域、PKM遺伝子のエクソン1内の領域、PKM遺伝子のエクソン12内の領域、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、E3に記載の前述の方法。
E5. 1つ以上のgRNAが、配列番号33~34、及び42~43からなる群から選択される配列、並びにこれらの組み合わせを含む、E3~E4のいずれか1つに記載の前述の方法。
E6. 1つ以上のgRNAが、(1)PKM遺伝子のエクソン9に隣接する5’イントロン領域に対して相補的な標的配列を含む第1のgRNA;及び(2)PKM遺伝子のエクソン9に隣接する3’イントロン領域に対して相補的な標的ドメインを含む第2のgRNAを含む、E3又はE4に記載の前述の方法。
E7. 1つ以上のgRNAが、配列番号33~34からなる群から選択される配列、及びこれらの組み合わせを含む、E3~E6のいずれか1つに記載の前述の方法。
E8. 1つ以上のgRNAが、(1)PKM遺伝子のエクソン2内の領域に対して相補的な標的配列を含む第1のgRNA;及び(2)PKM遺伝子のエクソン12内の領域に対して相補的な標的ドメインを含む第2のgRNAを含む、E3又はE4に記載の前述の方法。
E9. 1つ以上のgRNAが、配列番号42~43からなる群から選択される配列、及びこれらの組み合わせを含む、E3~E5、及びE8のいずれか1つに記載の前述の方法。
E10. PKMポリペプチドアイソフォームの発現がノックアウトされ、細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性と比較して除去されている、又は低下している、D及びE~E9のいずれか1つに記載の前述の方法。
E11. PKMポリペプチドアイソフォームの発現がノックダウンされ、細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性と比較して低下している、D及びE~E9のいずれか1つに記載の前述の方法。
E12. 細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性の約50%未満である、E10又はE11に記載の前述の方法。
E13. 細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性の約20%未満である、E10又はE11に記載の前述の方法。
E14. 細胞のラクトジェニック活性が、産生期の14日目又は15日目に測定される、D及びE~E13のいずれか1つに記載の前述の方法。
E15. 細胞が、産生期の間に約2.0g/L未満のラクテートを生成する、D及びE~E14のいずれか1つに記載の前述の方法。
E16. 細胞が、産生期の間に振盪フラスコ内で約2.0g/L未満のラクテートを生成する、D及びE~E14のいずれか1つに記載の前述の方法。
E17. 細胞が、産生期の間にバイオリアクター内で約2.0g/L未満のラクテートを生成する、D及びE~E14のいずれか1つに記載の前述の方法。
E18. 参照細胞が、PKM遺伝子の野生型対立遺伝子を含む細胞である、E11~E17のいずれか1つに記載の前述の方法。
E19. PKMポリペプチドアイソフォームがPKM-1ポリペプチドアイソフォームである、D及びE~E18のいずれか1つに記載の前述の方法。
E20. PKMポリペプチドアイソフォームが、PKM-1ポリペプチドアイソフォーム及びPKM-2ポリペプチドアイソフォームである、D及びE~E19のいずれか1つに記載の方法。
E21. 遺伝子組み換えシステムが、ショートヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、及びマイクロRNA(miRNA)からなる群から選択されるRNAを含み、RNAは、PKM遺伝子により発現するmRNAの一部に対して相補的である、Eに記載の前述の方法。
E22. PKM遺伝子により発現するmRNAがPKM-1ポリペプチドアイソフォームをコードする、E21に記載の前述の方法。
E23. PKM-1ポリペプチドアイソフォームの発現がノックアウト又はノックダウンされ、細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性と比較して低下している、E22に記載の前述の方法。
E24. 遺伝子組み換えシステムが、shRNA、siRNA、及びマイクロRNA miRNAからなる群から選択される第2のRNAを更に含み、第2のRNAは、PKM-2ポリペプチドアイソフォームをコードするPKM遺伝子により発現するmRNAの一部に対して相補的である、E21~E23のいずれか1つに記載の前述の方法。
E25. PKM-1及びPKM-2ポリペプチドアイソフォームの発現がノックアウト又はノックダウンされ、細胞のラクトジェニック活性が低下した、E24に記載の前述の方法。
E26. 遺伝子組み換えシステムが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)システム又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)システムである、Eに記載の前述の方法。
E27. 細胞が哺乳動物細胞である、D及びE~E26に記載の前述の方法。
E28. 哺乳動物細胞がCHO細胞である、E27に記載の前述の方法。
E29. 細胞が目的の生成物を発現する、D及びE~E28に記載の前述の方法。
E30. 細胞により発現した目的の生成物が核酸配列によりコードされる、E29に記載の前述の方法。
E31. 核酸配列が、標的化された位置において細胞の細胞ゲノムに組み込まれる、E30に記載の前述の方法。
E32. 細胞により発現した目的の生成物が、哺乳動物細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれた核酸配列により更にコードされる、E26~E31のいずれか1つに記載の前述の方法。
E33. 目的の生成物がタンパク質を含む、E26~E31に記載の前述の方法。
E34. 目的の生成物が組み換えタンパク質を含む、E33に記載の前述の方法。
E35. 目的の生成物が抗体又はその抗原結合断片を含む、E26~E33のいずれか1つに記載の前述の方法。
E36. 抗体が多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、E35に記載の前述の方法。
E37. 抗体が、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、E35に記載の前述の方法。
E38. 抗体がキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である、E35~E37のいずれか1つに記載の前述の方法。
E39. 抗体がモノクローナル抗体である、E35~E38のいずれか1つに記載の前述の方法。
F. 特定の非限定的な実施形態において、本明細書にて開示する主題は、目的の生成物の作製方法であって、目的の生成物を発現する哺乳動物細胞を培養することを含み、哺乳動物細胞が目的の生成物を発現し、低下した、又は除去されたラクトジェニック活性を有する、方法を提供する。
G. 特定の非限定的な実施形態において、本明細書にて開示する主題は、目的の生成物を発現する哺乳動物細胞の集団の培養方法であって、哺乳動物細胞が、低下した、又は除去されたラクトジェニック活性を有する、方法を提供する。
G1. ラクトジェニック活性の低下又は除去が、哺乳動物細胞におけるピルビン酸キナーゼ筋(PKM)ポリペプチドアイソフォームの発現のノックアウト又はノックダウンにより生じる、F又はGに記載の前述の方法。
G2. PKMポリペプチドアイソフォームがPKM-1ポリペプチドアイソフォームである、G1に記載の前述の方法。
G3. PKMポリペプチドアイソフォームが、PKM-1ポリペプチドアイソフォーム又はPKM-2ポリペプチドアイソフォームである、G1に記載の前述の方法。
G4. 哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性の約50%未満である、F及びG~G3のいずれか1つに記載の前述の方法。
G5. 哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性の約20%未満である、F及びG~G3のいずれか1つに記載の前述の方法。
G6. 哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、産生期の14日目又は15日目に測定される、F及びG~G5のいずれか1つに記載の前述の方法。
G7. 哺乳動物細胞が、産生期の間に約2.0g/L未満のラクテートを生成する、F及びG~G6のいずれか1つに記載の前述の方法。
G8. 哺乳動物細胞が、産生期の間に浸透フラスコ内で約2.0g/L未満のラクテートを生成する、F及びG~G6のいずれか1つに記載の前述の方法。
G9. 哺乳動物細胞が、産生期の間にバイオリアクター内で約2.0g/L未満のラクテートを生成する、F及びG~G6のいずれか1つに記載の前述の方法。
G10. 参照細胞が、PKM遺伝子の少なくとも1つ又は両方の野生型対立遺伝子を含む細胞である、F及びG~G9のいずれか1つに記載の前述の方法。
G11. 哺乳動物細胞がCHO細胞である、F及びG~10のいずれか1つに記載の前述の方法。
G12. 哺乳動物細胞により発現した目的の生成物が核酸配列によりコードされる、F及びG~G11のいずれか1つに記載の前述の方法。
G13. 核酸配列が、標的化された位置において哺乳動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれる、G12に記載の前述の方法。
G14. 細胞により発現した目的の生成物が、哺乳動物細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれた核酸配列により更にコードされる、F及びG~G13のいずれか1つに記載の前述の方法。
G15. 目的の生成物がタンパク質を含む、F及びG~G14のいずれか1つに記載の前述の方法。
G16. 目的の生成物が組み換えタンパク質を含む、F及びG~G15のいずれか1つに記載の前述の方法。
G17. 目的の生成物が抗体又はその抗原結合断片を含む、F及びG~G16のいずれか1つに記載の前述の方法。
G18. 抗体が多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、G17に記載の前述の方法。
G19. 抗体が、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、G17に記載の前述の方法。
G20. 抗体がキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である、G17~G19のいずれか1つに記載の前述の方法。
G21. 抗体がモノクローナル抗体である、G17~G20のいずれか1つに記載の前述の方法。
G22. 目的の生成物を回収することを更に含む、F及びG~G21のいずれか1つに記載の前述の方法。
以下の実施例は、本明細書にて開示する主題を単に示すものであり、いかなる方法においても、限定とみなされるべきではない。
実施例1:PKM-1発現は、CHO細胞株におけるラクトジェニック挙動を駆動し、低い生存能及び産生能を引き起こす
細胞株開発(CLD)のプロセスにおいて、異なる抗体分子を発現する、2つのラクトジェニック細胞株を同定した。これらの細胞株のラクトジェニック挙動は、細胞株に応じて、栄養素の供給又は培養pHの最適化を通して、異なるように軽減することができる。解糖経路に関与する様々なタンパク質を分析することにより、ピルビン酸キナーゼ筋-1(PKM-1)アイソフォームと、ラクトジェニック挙動との直接相関が明らかになった。
CRISPR/Cas9を、エクソン-9の標的欠損のために使用して、PKM-1発現をノックアウトした。PKM-1発現をノックアウトすることにより、選択した2つの細胞株におけるラクトジェニック挙動が完全に消失し、軽減方法の必要性を無くした。1つの細胞株を同定すると、PKM-1及びPKM-2遺伝子の両方の発現が、成長及び生存能へのいかなる悪影響も伴わず、完全に消滅した。親及びCHO細胞株を更に分析することにより、これらは全て、PKL及びPKR版のピルビン酸キナーゼを発現して、これにより、理論に束縛されるものではないが、PKM発現の完全な欠如に対して細胞が耐性を有することができるようになることが明らかとなった。これらの細胞株のラクトジェニック挙動を制御するために使用した、独自の軽減方法により、代謝経路を移動させ、PKM-1転写及び発現のパターンを変更して、ラクトジェニック挙動を防止した、又は遅延させた。培養液中、及びバイオリアクター内で、得られた細胞株の挙動を分析するために、PKM遺伝子を完全にノックアウトする。
まとめると、本開示は、産生培養液中での、ラクトジェニック挙動と多くのPKM-1量との直接相関を描写する。更に、PKM-1発現を除去することにより、選択したCHO細胞株におけるラクトジェニック挙動が許容され、逆転した。したがって、CHO細胞における、この問題に関するPKM-1、又は全PKM遺伝子の永続的な欠損は、バイオリアクター内での産生中にラクトジェニック挙動が生じることを低減するのに、有益であることができる。
材料及び方法
細胞株
組み換えモノクローナル抗体mAb-1又はmAb-2を分泌する細胞株を、グルタミンシンセターゼ(GS)選択マーカーを利用して、CHO-K1宿主から抽出した。シードトレインを、選択剤としてメチオニンスルホキシミン(MSX)を含有する、専売のDMEM/F12ベースの培地に、浸透速度:150rpm、37℃、及び5% COにて維持した。細胞を、3又は4日毎に継代した。
2Lバイオリアクターの製造
Finesseコントローラ(Applikon,Foster City,CA)付きのガラス撹拌タンクバイオリアクター(Applikon,Foster City,CA)にて、2Lバイオリアクターの製造を実施した。全ての産生培地では、バイオリアクター内で3日間、1回の播種トレイン段階(N-1)を利用し、その後、14日続く産生段階(N)を播種した。N-1播種培地を、0.17%の目標のパック細胞体積(PCV)に対して、1.5~1.7Lの操作体積で播種した。これらを37℃、7.0のpH設定値、30%の溶存酸素(DO)設定値、及び275rpmでの撹拌で操作した。3日後、細胞を移して、0.25%の目標PCVにて1.4~1.7Lの体積で、産生(N)バイオリアクターに播種した。全てのバイオリアクターを37℃で、72時間で35℃への温度移動をさせて操作した。酸対照としてCO2、及び塩基対照として1M炭酸ナトリウムを使用して、0.03のデッドバンド、pH7.00にて、培養液を操作した。このpH操作の唯一の例外は、0.03の同じデッドバンド、6.80の一定のpHにて操作した、mAb-2のpHレベルであった。空気と酸素ガス流の組み合わせを利用してDOを一定に維持し、全ての培養液を350rpm及び30%のDOにて操作するように設定した。mAb-1の対照プロセス培養に関しては、供給は産生の3日目(72時間)にて生じ、その時点の、培養液の全体積は20%であった。向上した供給プロセスに関しては、各供給に対して、培養液の全体積の15%にて、供給は3日目(72時間)及び6日目(144時間)にて生じた。
AMBR15操作
AMBR15(Sartorius,Goettingen Germany)システム内での産生培養液を、37℃の温度、30%のDO、pH7.0、及び1400rpmの撹拌速度の設定値にて操作した。N-1播種トレインを4日間実施し、次に、産生(N)段階を、37℃の温度、30%のDO、pH7.0、及び1400rpmの撹拌速度で、13mLの全体積、100万細胞/mLにて播種した。これらの培養液に関して、2Lバイオリアクターのスケールダウンプロセスを実施した。
オフラインでのサンプル分析
上清及び細胞ペレットサンプルを、アッセイ又はウェスタンブロッティング分析に通すために収集した。生残細胞濃度(VCC)及び生存能に関して、Vi-Cell XR(Beckman Coulter)を使用して、及び、pO、pH、pCO、Na、グルコース、及びラクテートに関して、Bioprofile 400(Nova Biomedical)を使用して、サンプルを分析した。2L及びAMBRバイオリアクターの全てのサンプルを、サンプリングにより気体発生を最小限に抑えた後、BioProfile 400で数分間分析した。同じVi-Cell XR,BioProfile 400及び浸透圧計(Model 2020,Advanced Instruments)を全てのサンプルに使用し、機器間での変動性を取り除いた。プロテインAカラムを備える高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して、抗体力価を測定した。PhyTip(PhyNexus,San Jose,CA)プロテインAカラムにより精製した、細胞培養上清サンプルを使用して、抗体産生物の品質アッセイを実施した。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により、抗体分子サイズ分布を分析した。画像化キャピラリー等電点電気泳動(icIEF)を使用して、タンパク質電荷の不均質性を測定し、全ての電荷不均質サンプルを、カルボキシペプチダーゼBで前処理した。全てのタンパク質生成物の品質アッセイをインハウスで開発し、詳細の手順を公開した(Hopp et al.,2009,Biotechnol.Prog.25(5):1427-32)。
免疫ブロッティング
細胞ペレットを細胞溶解緩衝液(10mM Tris pH8.0、0.5% NP40、150mM NaCl、5mM MgCl、プロテアーゼ阻害剤含有)に溶解させ、氷上で20分間インキュベートした。次に、サンプルを13,000rpmにて10分間遠心沈殿させ、280nmにおける吸光度を用いるNanodrop 2000(Thermo Scientific,Wilmington DE)を使用して、上清を新しい管に移し、タンパク質濃度を測定した。15μLの溶解物を、5μLの4xランニング緩衝液(400μLの2x Invitrogenローディングバッファー+400μLの50%グリセロール+200μLの20% SDS+100μLのβ-メルカプトエタノール)と組み合わせ、90℃にて5分間加熱した。次に、等量のタンパク質を12ウェルの4~20% Tris-グリシンゲルにロードし、SDSランニング緩衝液を使用して、150Vにて1.5時間動かした。その後、タンパク質を、Thermo Fisher製iBlot2を使用して、ニトロセルロース膜に移した。1xTBST緩衝液で洗浄した後、5%の乳溶液にてブロットを最低1時間ブロックし、その後、一次抗体で一晩インキュベートした。次にブロットを洗浄し、最低1時間、二次抗体内でインキュベートし、再びTBST緩衝液で洗浄した。ECL試薬を使用し、続けてBio-Radイメージング機器(Bio-Rad,Hercules,CA)を使用して、ブロットをイメージングした。
PKM-1ノックアウト
PKM-1をノックアウトするために、PKM遺伝子のエクソン9に隣接する、5’及び3’イントロン領域の両方を標的化するガイドRNA(gRNA)を、Genentech製のgRNA発現ベクターにクローニングした。この構築物を、Cas9発現プラスミドと共に、mAb-2発現細胞に同時にトランスフェクションした。トランスフェクト細胞は、クローニングした単一細胞であり、エクソン9の欠損はゲノムDNA PCRにより確認した。以下のgRNAオリゴが、エクソン-9(PKM-1)の欠損には最も有効であり、これらのオリゴにより標的化したプールを使用して、PKM-1ノックアウトmAb-2細胞株を単離した:
5’gRNA:GTCCTTTGGGCAGAGACAG(配列番号33)
3’gRNA:GACCAGAGTACTCCCTCGT(配列番号34)
ゲノムDNA PCRプライマーの配列:
5’-プライマー:CCAGATTTGGTGAGGACGAT(配列番号35)
3’-プライマー:AGCTGTGTTGTGAGGCATTG(配列番号36)
結果
産生中のPKM-1量の増加は、CHO細胞のラクトジェニック挙動と相関する
mAb-1を発現する細胞株の、培養シードトレインを使用して、標準的又は増強した供給法を用い、バイオリアクター内に産生培養液を準備した。標準的な供給により、mAb-1細胞株でラクトジェニック挙動が引き起こされた一方で、増強した供給法では、ラクトジェニック挙動が軽減された。高ラクテート条件では、産生培養液中で10日後に細胞生存能の低下が引き起こされ(図1A)、低ラクテート条件と比較して、14日目の力価が低下した(図1B)。両方の培養条件が、7日目まで相当量のラクテートを有するものの、高ラクテート条件は、産生培養液中にて、7日目からラクテートの蓄積が著しく増加することを示し、14日目には上方の15g/Lに到達した。低ラクテート条件に関しては、ラクテートの量が高くなる傾向が出る(12日目~14日目)前に、3~4日の遅延が見られ、14日目までに、8g/Lに到達するのみであった(図1C)。
観察されたラクトジェニック挙動と相関し得る酵素を同定するために、細胞増殖シグナル伝達及び解糖通路に関与する様々なタンパク質に、ウェスタンブロット分析を実施した。高ラクテート条件においては、細胞生存能が10日後に急激に低下したため、このセットの、0、2、7、及び10日目のサンプルを、低ラクテート条件の0、7、10、及び14日目のサンプルと比較した(図1D~1F)。分析した全ての異なるタンパク質の中で(データは図示せず)、PKM-1量のみが、mAb-1発現細胞株のラクトジェニック挙動との直接相関を示した。図1D~1Fは、細胞ペレットにおけるPKM-1及びPKM-2タンパク質の量を示した。高ラクテートサンプルにおけるPKM-1の発現量は、低ラクテートサンプルと比較して、産生培養中にて、7日後に発散的に増加し始めた。興味深いことに、低ラクテート条件下においても、産生培養の終わりに向かってのPKM-1量の増加(図1E、10日目~14日目)は、培養中の高ラクテート量と共に傾向が見られた(図1C)ため、PKM-1量の増加は、ラクテートの蓄積と密接な傾向が見られた。しかし、PKM-2の量は、mAb-1発現細胞株におけるラクトジェニック挙動とは逆相関した(図1F)。
同様のバイオリアクター実験を、mAb-2発現細胞株に対して実施した。このような細胞株を、ラクトジェニック又は非ラクトジェニック挙動を促進する条件を有する産生培地にて培養した。産生培養の13及び14日目まで、高ラクテート条件と低ラクテート条件との間で、mAb-2細胞株の細胞生存能は同等であった(図2A)。これにより、低ラクテート条件に対して、高ラクテート条件では約25%の力価の低下がもたらされた(図2B)。産生プロセスを通して、培地でのラクテートの蓄積は、mAb-2細胞株実験の低ラクテート対照群で低かった。しかし、高ラクテート条件下において、ラクテートの量は7日目から発散し始め、産生培養の14日目までに、上方の15g/Lに到達した(図2C)。ウェスタンブロット分析により、PKM-1タンパク質の量は、産生のおよそ7日目に、低ラクテートサンプルと比較して、高ラクテートサンプルにて増加し始め、産生培養の終わりまで線形増加したことが明らかとなった(図2D及び2E)。PKM-1量のこの増加は、蓄積したラクテートの増加と密接に相関した(図2C及び2E)。mAb-1と同様に、低ラクテートmAb-2サンプルにおけるPKM-2の全体の量は、図2D(下面)及び図2Fに示すように、高ラクテートサンプルの量よりも多かった。これらを合わせると、これらのデータは、これらの細胞にて、mAb-1及びmAb-2を発現する細胞におけるラクトジェニック挙動と、PKM-1量との直接相関を示唆している。
PKL/Rタンパク質は、CHO細胞にて発現するが、ラクトジェニック挙動とは相関しない。
PKの他の形態(PKM以外)が、専売のCHO宿主細胞にて発現しているか否かを評価するために、2つの異なるCHO宿主細胞株(CHO-K1及びDHFR-/-)、並びにヒト(HEK293)細胞株の、PKL及びPKR(PKL/R)タンパク質の発現を分析した。両方のCHO細胞株、及び対照のHEK293細胞株は、PKL/R酵素の発現を示し(図3A)、PK遺伝子の全てのアイソフォーム(PKM-1、PKM-2、及びPKL/Rを含む)が、選択したCHO宿主にて発現することを示している。mAb-1及び/又はmAb-2発現細胞における、高/低ラクテート条件を比較する際に、PKL/Rの発現が異なって制御されたか否かを、次に評価した。PKL/Rの発現量は、mAb-1及びmAb-2細胞株の両方において、高/低ラクテート条件にて同等であり(タンパク質の量を、内部対照としてのアクチンに対して正規化すると)、このことは、これらの細胞株において、ラクトジェニック挙動との相関がないことを示している(図3B~3D)。図3Cにおける、7及び10日目における、mAb-2高ラクテートサンプルにおける少量のPKL/Rは、同じレーンでの低量のアクチン(ローディング対照として)により反映された、全体のタンパク質ローディングが低いことが原因であった。PKアイソフォームの他に、細胞増殖シグナル伝達及び解糖経路に関与するいくつかの異なるタンパク質の発現もまた、分析した。しかし、タンパク質の発現と、mAb-1又はmAb-2発現細胞株にて観察されたラクトジェニック挙動との間に、明確な相関はないことが観察された(データは図示せず)。異なるPKアイソフォームが、選択したCHO宿主細胞にて発現したという事実は、これらの細胞株が、PKの1つ以上のアイソフォームの標的欠損を許容することができる場合がある、ということを示唆した。産生期中に観察された、mAb-1及びmAb-2細胞株のラクトジェニック挙動と、PKM-1量との直接相関により、この酵素は、標的欠損の良好な候補となった。
CRISPR/Cas9が媒介する、PKM遺伝子におけるエクソン-9の標的欠損
PKM遺伝子は、PKM-1及びPKM-2酵素の両方の発現を担い、これらは、それぞれエクソン9又はエクソン10を代替的に含むことだけが異なる。選択したCHO細胞株は、配列決定されていない、又は注釈を付けられていないため、PKM対立遺伝子型、遺伝子コピー数、又は配列に関する情報を入手することはできなかった。それ故、PKM-1遺伝子の発現をなくすため、公開されているデータベースにて利用可能なCHO配列を使用して、エクソン9に隣接するイントロン領域を標的化するガイドRNA構築物を設計した(Kent et al.2002,Genome Res.12(6):996-1006)。5’スクリーニングPCRプライマーを、エクソン8と9の間のイントロン領域に一致するように設計し、3’スクリーニングPCRプライマーを、一致したエクソン10に対して設計した(図4A)。選択したCHO宿主のmRNA由来のPKM cDNAの増幅及び配列決定に基づき、エクソンの配列情報を入手した。mAb-2発現細胞株にCas9、及び様々なgRNA構築物をトランスフェクションした。最初のスクリーニングの後、最も効率的なエクソン9の標的化を示すプールを、単一細胞クローニングに通した。このプールの20個の細胞株を、エクソン-9の標的欠損のためにスクリーニングし、2つのヘテロ接合(HET-3及びHET-18)、並びに2つのノックアウト(KO-2及びKO-15)細胞株を、標的化した対立遺伝子の欠損が、PCR及び配列決定により完全に確認されたものについて同定した(図4B及び4C)。これらの細胞株の培養液を次に、バイオリアクターでの更なる評価のために拡大した。標的化した対立遺伝子の配列決定により、選択した全ての細胞株における、エクソン9の欠損が確認された(図4C)。3つの細胞株(KO-2、HET-3、及びHET-18)は、5’及び3’gRNA標的化部位にて、正確なエクソン9の欠損を有した(図4C)。KO-15細胞株に関しては、標的化対立遺伝子のPCRサイズは、他の細胞株で観察されたものより小さかった(図4B)。配列決定分析により、5’gRNAの上流の122塩基対(bp)が、KO-15細胞株にて欠損し、部分的に、無関係の挿入で置換されたが確認された(図4C、及びデータは図示せず)。この領域における欠損は、エクソン8と9の間のイントロンの一体性に影響を及ぼし得る。これに関係なく、配列決定分析によると、エクソン9は選択した全ての細胞株にて完全に欠損していた。
PKM-1発現をブロックする、又は低下させることにより、それぞれ、mAb-2細胞株におけるラクトジェニック挙動が回避された、又は低下した。
いくつかの(HET)、又は全ての(KO)対立遺伝子、及びWT mAb-2株における、エクソン-9の欠損を有する4つのmAb-2細胞株を全て源にし、AMBRバイオリアクターにおける、14日間の産生培養をセットアップした。PKM-1 KO、HET及びWT細胞株の増殖及び生存能を、図5A及び5Bに示す。PKM-1 HET又はmAb-2株は、WT mAb-2細胞株の力価及び特異的産生能と、比較的同じ力価及び特異的産生能を有した(図5C及び5D)。PKM-1 KO(KO-2及びKO-15)、並びに、HET mAb-2細胞株の1つ(HET-3)は、対照(ラクトジェニック)条件にて培養した際に、WT mAb-2細胞株(図5E)と比較して、非常に少ないラクテート量を有した。一方で、HET-18株は、10日目まで、WT mAb-2と比較して、同様のラクトジェニック挙動を示した。10日後、WT mAb-2株におけるラクテートの蓄積速度は増加し、14日目までに、HET-18株と比較しておよそ2倍になった(図5E)。
これらの細胞株をウェスタンブロット分析することにより、KO-2及びKO-15株は、PKM-1の発現を完全に損なっており、HET-3細胞株は、HET-18細胞株と比較して低いPKM-1発現を有したことが示された(図5F)。PKM-1 HET及びKO細胞株のラクトジェニック挙動が、いくつかの細胞株においてPKM-1タンパク質発現と直接相関したという事実は、ラクトジェニック挙動にて観察された変化が、他のクローンの違いによるもののみではないことを示唆した。完全長WT対立遺伝子に対応するバンドは、HET細胞株のゲノムDNAから増幅されたものである可能性がある(図4B)ため、これらの観察に関する、可能性のある説明としては、異なるCHO PKM対立遺伝子由来のPKM-1の、異なる発現;適切なエクソンスプライシングの破壊をもたらす、1つだけのgRNA構築物による、WT PKM対立遺伝子の標的化;gRNA標的化領域の反転、又は、対立遺伝子の組み換えにより媒介される4均質化が挙げられるが、これらに限定されない。
PKM-2の量は、WT mAb-2細胞株に関しては少なかった(相対差は、アクチンローディング対照が本サンプルでも低かったという警告と共に考慮した)が、HET-3、HET-18、及びKO-2細胞株では多かった(図5F)。興味深いことに、KO-15 mAb-2細胞株は、PKM-1に加えて、PKM-2の発現も完全に欠いていた(図5F)。これは、PKM対立遺伝子の5’gRNA標的化領域の上流で観察される、より大きな欠損による可能性が高く、恐らく、エクソン8と9の間におけるイントロン領域の機能性に影響を及ぼしている(図4C)。このことは、選択したCHO細胞は、恐らく、PKL/R酵素を発現する能力によって、PKM-1及びPKM-2酵素の両方の完全な欠落に対して耐性を有し得ることを示唆した(図3A)。
WT及びPKM-1 KO及びHET mAb2発現細胞株の間での、大きい分子量(アグリゲート)及び電荷バリアント種などの、生成物の品質属性を調査した。WT及びPKM-1 KO及びHET細胞株の間で、生成物の凝集度に有意差は観察されなかった(図5G)ものの、いくらかの変化が、mAb-2生成物電荷バリアント(図5H)プロファイルにて観察された。ラクテートの量と、生成物の品質属性との間には、明確な傾向又は相関関係がなかった(図5G及び5H)ため、観察された差は、細胞株誘導の間に生じ得る、通常の変化によるものである可能性がある。更に、これらの実験で使用した培地及びフィードを、PKM-1 KO又はHET細胞株ではなく、WT mAb-2細胞株に対して最適化した。PKMの量を変更することにより、これらの細胞株の代謝プロファイル全体に影響が及ぶ可能性があるため、細部調整をした培地及びフィードが、生成物の品質属性における完全な効果及び影響を調査するために、必要となる可能性がある。
細胞貯蔵及び解凍後の、あらゆる細胞株の挙動を分析することが重要であるため、PKM-1 KO及びHET mAb-2細胞株を貯蔵した後解凍し、培地に2.5週間、対照としてのWT細胞株と共に保持した。次に、これらの細胞を源にして、解凍後の性能を評価するために、各細胞株に対して4組の産生培地をセットアップした。PKM-1 KO及びHET細胞株の増殖、生存能、力価、特異的産生能、及びラクトジェニックプロファイルは、細胞貯蔵の前後で同等であったことを、データは示した(図5A~5D、及び6A~6D)。以前に観察されたように(データは図示せず)、新鮮な、解凍されたWT mAb-2細胞は、古い細胞(15g/L、図5E)に対して、ラクトジェニック性が低かった(10g/L、図6E)。しかし、細胞年齢が、mAb-2 PKM-1 KO及びHET細胞株のラクトジェニック挙動に有意な影響を有しなかった(図5E及び6E)ため、この挙動は、WT mAb-2細胞株に独自のものであった。全ての細胞株に関して、培地にて、産生培養の7日目までにラクテートが少しずつ蓄積したことが観察され、その後、PKM-1 KO及びHET-3細胞株がラクテートを消費した一方で、ラクテート消失プロファイルが、WT及びHET-18細胞株の両方で観察された(図6E)ことに注意されたい。若い細胞株(解凍後)は全て、年齢の高い細胞株(図5G)と比較して、比較的低い酸性ピーク率を有し(図6G)、これは細胞年齢に恐らく関係ある特徴であるものの、ラクトジェニック(WT又はPKM-1 HET-18)及び非ラクトジェニック(PKM-1 KO又はHET-3)細胞株との間に、生成物の品質に関する大きな差は存在しなかった(図6F~6G)。
考察
CHO細胞培養液におけるラクトジェニック挙動は、塩基を添加して、培養液のpH、負に影響を及ぼす生存能、VCC、及び最終的な産生力価を調節することの結果として、培養液の酸性化、及び高い浸透圧モル濃度を引き起こす可能性がある(Li et al.,2010,MAbs 2(5):466-79)。ラクテートの生成は、Warburg効果として一般に知られる挙動である好気的解糖により生じ(Warburg,1956,Science 123(3191):309-14)、多くの培養細胞、及び癌細胞にて観察される。これらの細胞は、解糖プロセスを利用してエネルギーを産生し、様々なエネルギー、及び代謝フラックスに応じて、このプロセスを制御する(Mulukutla et al.,2014,PLoS One 9(6):e98756;Mulukutla et al.2010,Trends Biotechnol.28(9):476-84;Luo et al.,2012,Biotechnol.Bioeng.109(1):146-56;Ahn and Antoniewicz,2012,Biotechnol.J.7(l):61-74)。いくつかのラクトジェニック挙動は、プロセス改変により制御することができる(Luo et al.,2012,Biotechnol.Bioeng.109(1):146-56;Gagnon et al.,2011,Biotechnol.Bioeng.108(6):1328-37)ものの、これらのアプローチは、観察された挙動の根本的原因を明らかにはしなかった。CHO宿主におけるラクトジェニック挙動をよりよく理解するために、供給法又は培養液のpHのいずれかを変更することによりラクトジェニック挙動を調整可能である、mAb-1又はmAb-2を発現する2つのラクトジェニック細胞株を同定した。ラクトジェニック挙動との可能性のある相関を描写するために、これらの独立して誘導した細胞株を、細胞増殖シグナル伝達又は解糖経路に関与するタンパク質及び酵素のパネルを分析する際のツールとして利用した。これらの知見により、mAb-1及びmAb-2細胞株の両方における、PKM-1発現とラクトジェニック挙動との直接相関が明らかとなった(図1D~1F、及び2D~2F)。
mAb-1及びmAb-2産生培養液の両方における、検出されたPKM-1の量は、産生中の初期の時点では低く、培養液中でのラクテートの量の増加に相関する形で、増加した。PKM-2の量は、これらの細胞株におけるラクトジェニック挙動とは逆相関した(図1D~1F、及び2D~2F)。これは、PKM遺伝子からのPKM-1又はPKM-2転写物の選択的スプライシングに関与するタンパク質の機能に依るものである可能性がある(Chaneton and Gottlieb,2012,Trends Biochem.Sci.37(8):309-16;Israelsen and Vander Heiden,2015,Semin.Cell Dev.Biol.43:43-51;Mazurek,2011,Int.J.Biochem.Cell Biol.43(7):969-80;Harada et al.,1978,Biochim.Biophys.Acta.524(2):327-39;Noguchi et al.,1986,J.Biol.Chem.261(29):13807-12;Noguchi et al.,1987,J.Biol.Chem.262(29):14366-71)。PKM遺伝子の2つのアイソフォームのうち、PKM-2は、代謝経路を変更するための中央スイッチとして機能し、癌細胞が、腫瘍環境内などの、生理学的に好ましくない条件下で生残し、増殖することができることが報告されている(Christofk et al.,2008,Nature 452(7184):230-3;Chaneton and Gottlieb,2012,Trends Biochem.Sci.37(8):309-16;Israelsen and Vander Heiden,2015,Semin.Cell Dev.Biol.43:43-51)。一方で、PKM-1アイソフォームは、発現したら恒常的に活性型となる。理論に束縛されるものではないが、産生培養液中での、PKM-1量とラクトジェニック挙動速度との相関は、この酵素による、PEPのピルベートへの制御不可能な転換、そしてその後に続く、LDHが媒介する、ピルベートのラクテートへの転換に依るものである可能性がある。
CRISPRは、エクソン-9の欠損を媒介し、それ故、mAb-2発現細胞内のPKM-1は、WT mAb-2発現細胞がラクトジェニック挙動を示す条件下において、PKM-1 KO細胞のラクトジェニック挙動の完全な逆転をもたらした(図5E)。2つのPKM-1 HET mAb-2細胞株は、異なる挙動を示した。HET-3 KO細胞株はごくわずかなラクテート(PKM-1 KO細胞株よりも少しだけ多く)を生成した一方で、HET-18細胞株はラクトジェニック性であり、WT mAb-2細胞のラクテートの、約2/3を生成した(図5E)。これらのPKM-1 HET細胞株のラクトジェニック挙動と、これらの細胞におけるより多量のPKM-1との直接相関もまた、観察された(図5F)。HET-3細胞株と比較しての、HET-18にて観察されるPKM-1量の差は、異なるPKM対立遺伝子からの、PKM-1の異なる発現、又は、HET-3細胞株における、gRNA構築物によるPKM対立遺伝子の部分標的化、又は、標的化したPKM対立遺伝子内の標的化領域の反転に依るものである可能性がある。
PKM-2タンパク質を発現できないPKM-1ノックアウト細胞株(KO-15)(図5F)が同定された。細胞株は、5’gRNA標的化領域の上流のイントロンにて、無作為な塩基の122bpの欠失、及び挿入を有する(図3C)。KO-15細胞株は、CHO細胞株がPKL/Rもまた発現する(図3A)ために、PKM-1及びPKM-2酵素の両方の喪失にも耐性を有することができ、これにより、PKM発現の欠如を補うことができる。WT、並びに全てのPKM-1 HET及びKO細胞株における、PKL/Rタンパク質の発現を、ウェスタンブロット分析により確認した(データは図示せず)。それにもかかわらず、PKM-1発現の欠如又は低下により、全てのPKM-1 KO又はHET細胞株において、それぞれ、力価又は特異的産生能に影響を与えることなく、より低いラクテートの生成がもたらされた(図5C~5D、及び6C~6D)。これらの細胞株において、ラクトジェニック挙動が存在しないこと、又は弱化することは再現可能であり、解凍後の若い細胞年齢、及び全ての複製物の間で一致した(図5A~5E、及び6A~6E)。
産生培養中にラクトジェニック挙動を制御することは、製造の実施から最適な力価及び生成物の品質を得るために重要である。それ故、宿主からのPKM-1発現をノックアウトすることは、CHO細胞のラクトジェニック挙動を取り扱う上で有利となり得る。PKL/R酵素はPKMの消失を補うことができるため、欠損のために、PKM-1又はPKM遺伝子全体を標的化する前に、CHO細胞における、他のPK酵素の発現を確認して監視することが重要である。PKM遺伝子全体をノックアウトすることは、CHO宿主にて許容されることができ、PKM KO CHO宿主は、WT宿主の力価及び生成物の品質に相当する力価及び生成物の品質を有する、対象の抗体又は生成物を発現することができる。これらのPKM KO宿主は、KO-2及びKO-15細胞株で観察されるように、ラクトジェニック挙動を低下させ、WT宿主よりも良好な増殖プロファイルを有することができる(図5A及び6A)。
実施例2:PKMノックアウト及びPKM-1ノックアウトCHO細胞株における、mAb-3の産生
PKM遺伝子又はPKM-1遺伝子をCHO-K1M細胞株にてノックアウトし、1つのPKM KO宿主細胞株、及び4つのPKM-1 KO宿主細胞株を作製した。標的組み込みにより、mAb-3をコードする導入遺伝子をWT CHO-K1M、PKM KO、及びPKM-1 KO宿主細胞株に導入し、同じ宿主細胞株からmAb-3を発現する3つのWTプール、同じ宿主細胞株からmAb-3を発現する3つのPKM KOプール、及び、4つの異なる宿主細胞株からmAb-3を発現する4つのPKM-1 KOプールを作製した。
PKM KO宿主を作製するためのgRNAが異なり、以下に示すとおりであることを除いて、実施例1に開示したとおりに以下の実験を実施した。PKM-1 KO宿主細胞を作製するために使用したgRNAは、実施例1で使用したものと同じである。
PKM KO宿主細胞を作製するためのgRNAは、以下の配列を有した:
5’-gRNA:CCCATCACGGCCCGCAACAC(配列番号42、PKM遺伝子のエクソン2内の領域を標的化)
3’-gRNA:CTTCTTCAAGACGGGGGATG(配列番号43、PKM遺伝子のエクソン12内の領域を標的化)
振盪フラスコ産生において、PKM及びPKM-1 KO宿主細胞株に由来するMAb-3産生プールは、WTプールに相当する、又はそれより高いQp及び力価を有したが、低い増殖を有した(積算生残細胞濃度(IVCC)により表される)(図7)。振盪フラスコ産生において、PKM及びPKM1 KO宿主細胞株に由来するMAb-3産生プールもまた、WT宿主細胞株よりも少ないラクテートを生成した(図8A)が、より多くのグルコースを消費した(図8B)。図8Aに示すように、WT宿主細胞は、振盪フラスコでの産生の15日目までに、約1.0g/Lのラクテートを産生した。振盪フラスコ産生の間、1~2.5g/Lのラクテート濃度は、高いものと考えられる。対照的に、15日目までに、PKM-1 KO宿主細胞はごくわずかのラクテートを産生し、PKM KO宿主細胞は0.2g/L未満のラクテートを産生し、PKM-1、又はPKM-1及びPKM-2の両方がノックアウトしたときに、80%を超えるラクテートの産生の低下をもたらした。
振盪フラスコ産生において、PKM/PKM-1 KO宿主細胞株に由来するMAb-3産生プールは、異なるアミノ酸合成/消費速度を有した(図9A及び図10)。例えば、PKM KO宿主細胞株は3-ホスホグリセリン酸を蓄積し、WT及びPKM-1宿主細胞と比較して、セリン及びグリシンの産生の増加をもたらした(図9B)。WT宿主細胞株は、PKM KO及びPKM-1宿主細胞と比較して、ピルベートを蓄積した(図9C)。特定の理論に限定されるものではないが、WT宿主細胞におけるピルベートの蓄積は、ラクテートの蓄積、及びアラニンの産生の増加をもたらす可能性がある(図10)。PKM-1 KO宿主細胞株は、オキザロ酢酸(アスパラギン酸及びアスパラギンの蓄積をもたらす(図9D))、並びにα-ケトグルタレート(a-KG)(グルタミン酸、アルギニン、及びグルタミンの蓄積をもたらす(図9E))などのTCAサイクル生成物を蓄積した。特定の理論に限定されるものではないが、これらの結果は、PKM-1及びPKM-2が、ピルベートが優先的にTCAサイクルに入るように、ピルベート生成物の量を制御するように機能することができることを示唆している。上記知見をまとめたものを、図10に示す。これらのデータに基づくと、PKM-1及びPKM KO細胞を培養するために使用した細胞培養培地及び条件を調節して、消費されるグルコースの量、及び/又は、消費若しくは合成されるアミノ酸の量を補うことができる。
PKM/PKM1 KO宿主細胞株に由来するMAb-3産生プールは、振盪フラスコ産生において、異なるグリコシル化プロファイルを有した。PKM KO宿主ではガラクトシル化が低下し、PKM KO及びPKM-1 KO宿主細胞株では、フコシル化がわずかに低下した(図11)。特定の理論に限定されるものではないが、グリコシル化におけるこれらの変化は、作製した抗体の活性に影響を及ぼさない可能性が高い。
本出願を通して引用される、全ての図面及び全ての参考文献、特許及び公開された特許出願、並びに寄託番号の内容物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれている。

Claims (84)

  1. ラクトジェニック活性が低下した又は除去された哺乳動物細胞であって、ピルビン酸キナーゼ筋(PKM)ポリペプチドアイソフォームの発現がノックダウン又はノックアウトされており、前記PKMポリペプチドアイソフォームがPKM-1ポリペプチドアイソフォームを含む、哺乳動物細胞。
  2. PKM-2ポリペプチドアイソフォームの発現がノックダウン又はノックアウトされている、請求項2に記載の哺乳動物細胞。
  3. 前記細胞がCHO細胞である、請求項1又は2に記載の哺乳動物細胞。
  4. 目的の生成物をコードする核酸配列を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
  5. 前記目的の生成物がタンパク質を含む、請求項4に記載の哺乳動物細胞。
  6. 前記目的の生成物が組み換えタンパク質を含む、請求項4又は5に記載の哺乳動物細胞。
  7. 前記目的の生成物が抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項4~6のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
  8. 前記抗体が多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、請求項7に記載の哺乳動物細胞。
  9. 前記抗体が、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、請求項7に記載の哺乳動物細胞。
  10. 前記抗体がキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含む、請求項7~9のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
  11. 前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項7~10のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
  12. 前記核酸配列が、標的化された位置において前記哺乳動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれている、請求項4~11のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
  13. 前記哺乳動物細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれた前記目的の生成物をコードする核酸を更に含む、請求項12に記載の哺乳動物細胞。
  14. 前記哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が参照細胞のラクトジェニック活性の約50%未満である、請求項1~13のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
  15. 前記哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が参照細胞のラクトジェニック活性の約20%未満である、請求項14に記載の哺乳動物細胞。
  16. 前記参照細胞が、PKM遺伝子の野生型対立遺伝子を含む細胞である、請求項14又は15に記載の哺乳動物細胞。
  17. 前記哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、産生期の14日目又は15日目に測定される、請求項1~16のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
  18. 前記哺乳動物細胞が、産生期の間に約2.0g/L未満のラクテートを産生する、請求項1~17のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
  19. 前記哺乳動物細胞が、産生期の間に振盪フラスコ内で約2.0g/L未満のラクテートを産生する、請求項1~17のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
  20. 前記哺乳動物細胞が、産生期の間にバイオリアクター内で約2.0g/L未満のラクテートを産生する、請求項1~17のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
  21. 配列番号39~41からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は、配列番号37及び38に記載のヌクレオチド配列を含むPKM遺伝子の対立遺伝子を含む哺乳動物細胞。
  22. 請求項1~21のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞を含む組成物。
  23. ピルビン酸キナーゼ筋(PKM)ポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトすることを含む、細胞におけるラクトジェニック活性を低下させる又は除去する方法。
  24. 細胞におけるラクトジェニック活性を低下させる又は除去する方法であって、前記細胞に遺伝子組み換えシステムを投与することを含み、前記遺伝子組み換えシステムがピルビン酸キナーゼ筋(PKM)ポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトする、方法。
  25. 前記遺伝子組み換えシステムが、CRISPR/Casシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)システム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
  26. 前記遺伝子組み換えシステムがCRISPR/Cas9システムである、請求項24又は25に記載の方法。
  27. 前記CRISPR/Cas9システムが
    (a)Cas9分子、及び
    (b)PKM遺伝子内の標的配列に対して相補的な標的化配列を含む、1つ以上のガイドRNA(gRNA)
    を含む、請求項26に記載の方法。
  28. 前記標的配列が、前記PKM遺伝子の一部、前記PKM遺伝子のエクソン9に隣接する5’イントロン領域、前記PKM遺伝子のエクソン9に隣接する3’イントロン領域、前記PKM遺伝子のエクソン10に隣接する3’イントロン領域、前記PKM遺伝子のエクソン1内の領域、前記PKM遺伝子のエクソン2内の領域、前記PKM遺伝子のエクソン12内の領域、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
  29. 前記1つ以上のgRNAが
    (i)(1)前記PKM遺伝子のエクソン9に隣接する5’イントロン領域に対して相補的な標的配列を含む第1のgRNA;及び(2)前記PKM遺伝子のエクソン9に隣接する3’イントロン領域に対して相補的な標的ドメインを含む第2のgRNA、又は
    (ii)(1)前記PKM遺伝子のエクソン2内の領域に対して相補的な標的配列を含む第1のgRNA;及び(2)前記PKM遺伝子のエクソン12内の領域に対して相補的な標的ドメインを含む第2のgRNA
    を含む、請求項27又は28に記載の方法。
  30. 前記1つ以上のgRNAが、配列番号33~34及び42~43からなる群から選択される配列、並びにこれらの組み合わせを含む、請求項27~29のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記PKMポリペプチドアイソフォームの発現がノックアウトされ、前記細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性と比較して除去されている、又は低下している、請求項23~30のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記PKMポリペプチドアイソフォームの発現がノックダウンされ、前記細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性と比較して低下している、請求項23~30のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記細胞のラクトジェニック活性が、前記参照細胞のラクトジェニック活性の約50%未満である、請求項31又は32に記載の方法。
  34. 前記細胞のラクトジェニック活性が、前記参照細胞のラクトジェニック活性の約20%未満である、請求項31又は32に記載の方法。
  35. 前記細胞のラクトジェニック活性が、産生期の14日目又は15日目に測定される、請求項23~34のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記細胞が、産生期の間に約2.0g/L未満のラクテートを生成する、請求項23~35のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記細胞が、産生期の間に振盪フラスコ内で約2.0g/L未満のラクテートを生成する、請求項23~35のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記細胞が、産生期の間にバイオリアクター内で約2.0g/L未満のラクテートを生成する、請求項23~35のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記参照細胞が、前記PKM遺伝子の野生型対立遺伝子を含む細胞である、請求項31~38のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記PKMポリペプチドアイソフォームがPKM-1ポリペプチドアイソフォームである、請求項23~39のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記PKMポリペプチドアイソフォームがPKM-1ポリペプチドアイソフォーム及びPKM-2ポリペプチドアイソフォームである、請求項23~39のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記遺伝子組み換えシステムが、ショートヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、及びマイクロRNA(miRNA)からなる群から選択されるRNAを含み、前記RNAが、前記PKM遺伝子により発現するmRNAの一部に対して相補的である、請求項24に記載の方法。
  43. 前記PKM遺伝子により発現される前記mRNAが、PKM-1ポリペプチドアイソフォームをコードする、請求項42に記載の方法。
  44. 前記PKM-1ポリペプチドアイソフォームの発現がノックアウト又はノックダウンされ、前記細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性と比較して低下している、請求項43に記載の方法。
  45. 前記遺伝子組み換えシステムが、shRNA、siRNA、及びマイクロRNA miRNAからなる群から選択される第2のRNAを更に含み、前記第2のRNAが、PKM-2ポリペプチドアイソフォームをコードする前記PKM遺伝子により発現するmRNAの一部に対して相補的である、請求項42~44のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記PKM-1及びPKM-2ポリペプチドアイソフォームの発現がノックアウト又はノックダウンされ、前記細胞のラクトジェニック活性が低下した、請求項45に記載の方法。
  47. 前記遺伝子組み換えシステムが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)システム又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)システムである、請求項24に記載の方法。
  48. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項23~47のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記哺乳動物細胞がCHO細胞である、請求項49に記載の方法。
  50. 前記細胞が目的の生成物を発現する、請求項23~49のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記細胞により発現した前記目的の生成物が核酸配列によりコードされる、請求項50に記載の方法。
  52. 前記核酸配列が、標的化された位置において前記細胞の細胞ゲノムに組み込まれる、請求項51に記載の方法。
  53. 前記細胞により発現した前記目的の生成物が、前記哺乳動物細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれた核酸配列により更にコードされる、請求項50~52のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記目的の生成物がタンパク質を含む、請求項50~53のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記目的の生成物が組み換えタンパク質を含む、請求項54に記載の方法。
  56. 前記目的の生成物が抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項50~55のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記抗体が多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、請求項56に記載の方法。
  58. 前記抗体が、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、請求項56に記載の方法。
  59. 前記抗体がキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である、請求項56~58のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項56~59のいずれか一項に記載の方法。
  61. 目的の生成物の作製方法であって、前記目的の生成物を発現する哺乳動物細胞を培養することを含み、前記哺乳動物細胞が前記目的の生成物を発現し、低下した又は除去されたラクトジェニック活性を有する、方法。
  62. 目的の生成物を発現する哺乳動物細胞の集団の培養方法であって、前記哺乳動物細胞が、低下した又は除去されたラクトジェニック活性を有する、方法。
  63. 前記ラクトジェニック活性の低下又は除去が、前記哺乳動物細胞におけるピルビン酸キナーゼ筋(PKM)ポリペプチドアイソフォームの発現のノックアウト又はノックダウンにより生じる、請求項61又は62に記載の方法。
  64. 前記PKMポリペプチドアイソフォームがPKM-1ポリペプチドアイソフォームである、請求項63に記載の方法。
  65. 前記PKMポリペプチドアイソフォームがPKM-1ポリペプチドアイソフォーム又はPKM-2ポリペプチドアイソフォームである、請求項63に記載の方法。
  66. 前記哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性の約50%未満である、請求項61~65のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、参照細胞のラクトジェニック活性の約20%未満である、請求項61~65のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記哺乳動物細胞のラクトジェニック活性が、産生期の14日目又は15日目に測定される、請求項61~67のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記哺乳動物細胞が、産生期の間に約2.0g/L未満のラクテートを産生する、請求項61~68のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記哺乳動物細胞が、産生期の間に振盪フラスコ内で約2.0g/L未満のラクテートを産生する、請求項61~68のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記哺乳動物細胞が、産生期の間にバイオリアクター内で約2.0g/L未満のラクテートを産生する、請求項61~68のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記参照細胞が、PKM遺伝子の少なくとも1つ又は両方の野生型対立遺伝子を含む細胞である、請求項66~71のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記哺乳動物細胞がCHO細胞である、請求項61~72のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記哺乳動物細胞により発現した前記目的の生成物が核酸配列によりコードされる、請求項61~73のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記核酸配列が、標的化された位置において前記哺乳動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれている、請求項74に記載の方法。
  76. 前記細胞により発現した前記目的の生成物が、前記哺乳動物細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれた核酸配列により更にコードされる、請求項61~75のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記目的の生成物がタンパク質を含む、請求項61~76のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記目的の生成物が組み換えタンパク質を含む、請求項61~77のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記目的の生成物が抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項61~79のいずれか一項に記載の方法。
  80. 抗体が多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、請求項79に記載の方法。
  81. 前記抗体が、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、請求項79に記載の方法。
  82. 前記抗体がキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である、請求項79~81のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項79~82のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記目的の生成物を回収することを更に含む、請求項61~83のいずれか一項に記載の方法。
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