KR20220013460A - 바이러스 내성 세포 및 이의 용도 - Google Patents

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호아퀴나 마스카르나스
오드리 창
데이비드 오니온스
헨리 조오지
케빈 카이세르
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시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨
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Abstract

본 발명은, 포유동물 세포주가 바이러스 진입 및/또는 전파에 내성이도록 유전적으로 조작된 포유동물 세포주를 제공하고, 생물학적 생산계의 바이러스 오염을 감소 또는 예방하기 위하여 상기 세포주를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

바이러스 내성 세포 및 이의 용도{VIRAL RESISTANT CELLS AND USES THEREOF}
본 개시 내용은, 생물학적 생산계(biologic production system)의 바이러스 오염을 감소 또는 예방하기 위하여, 바이러스 내성을 갖도록 설계된 포유동물 세포주 및 상기 세포주의 용도에 관한 것이다.
많은 질환 또는 병태, 예컨대 암 및 자가면역 질환의 치료를 위한 재조합으로 생산된 치료성 단백질의 사용이 계속적으로 증가하고 있다. 그러나, 이러한 단백질 치료제의 대규모 생산은 아직 도전 과제에 직면해 있다. 예를 들어, 상업적 제조 공정은, 오직 미량의 오염물질만을 허용하는, 바람직하게는 오염물질이 없는, 극도로 순수한 산물을 생산하는 다운스트림 공정으로 확실히 높은 산출량을 달성해야 한다.
동물 성분이 없는 배지의 사용은 우연한 바이러스 감염의 사건을 유의미하게 감소시켰다. 추가로, 한외여과, 고온 단시간 공정 및/또는 벌크 물질의 UVC 조사와 같은 절차의 수행은 감염 사건을 더욱 감소시켰다. 그러나, 바이러스 감염의 위험은 여전히 남아있다. 감염 사건은, 산물의 손실, 시장에 대한 일시적 후퇴, 및 탈오염 비용 확대의 관점에서 제조자에게 매우 불리할 것이다. 따라서, 바이러스 감염에 대한 증가된 내성을 갖는 포유동물 세포주에 대한 필요성이 존재한다.
요약
본 개시 내용의 다양한 양태 중, 세포 내 바이러스 진입 및/또는 바이러스 전파를 방해 또는 예방하도록 조작된 포유동물 세포주를 제공한다. 일부 구현예에서, 포유동물 세포주는 유전적으로 변형되며, 이로써 적어도 하나의 바이러스의 진입 및/또는 전파는, 비변형된 친계 세포주와 비교하여, 감소되거나 제거된다. 다양한 구현예에서, 본원에 개시된 포유동물 세포주는 적어도 하나의 변형된 염색체 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, 변형된 염색체 서열은 비활성화되고, 이로써 세포주는 암호화된 단백질 산물을 감소된 수준으로 생산하거나 생산하지 않는다.
일 구현예에서, 세포주는 코어 1 효소 샤프론 (COSMC)을 암호화하는, 적어도 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, COSMC를 암호화하는 염색체 서열의 모든 사본은 비활성화되고, 세포주는 COSMC를 생산하지 않는다. 대안적인 구현예에서, 세포주는 용질 담체 패밀리 35 (CMP-시알산 수송체) 구성원 A1 (Slc35A1)을 암호화하는, 적어도 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, Slc35A1를 암호화하는 염색체 서열의 모든 사본은 비활성화되고, 세포주는 Slc35A1를 생산하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 세포주는 코어 1 신장 효소 (C1GalT1)를 암호화하는, 적어도 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, C1GalT1를 암호화하는 염색체 서열의 모든 사본은 비활성화되고, 세포주는 C1GalT1를 생산하지 않는다. 추가 구현예에서, 세포주는 St3 베타-갈락토시드 알파-2,3-시아릴전달효소 1 (St3Gal1)를 암호화하는, 적어도 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, St3Gal1를 암호화하는 염색체 서열의 모든 사본은 비활성화되고, 세포주는 St3Gal1를 생산하지 않는다. 대안적 구현예에서, 세포주는 St3 베타-갈락토시드 알파-2,3-시아릴전달효소 2 (St3Gal2)를 암호화하는, 적어도 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, St3Gal2를 암호화하는 염색체 서열의 모든 사본은 비활성화되고, 세포주는 St3Gal2를 생산하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 세포주는 St3 베타-갈락토시드 알파-2,3-시아릴전달효소 3 (St3Gal3)를 암호화하는, 적어도 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, St3Gal3를 암호화하는 염색체 서열의 모든 사본은 비활성화되고, 세포주는 St3Gal3를 생산하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 세포주는 St3 베타-갈락토시드 알파-2,3-시아릴전달효소 4 (St3Gal4)를 암호화하는, 적어도 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, St3Gal4를 암호화하는 염색체 서열의 모든 사본은 비활성화되고, 세포주는 St3Gal4를 생산하지 않는다. 대안적 구현예에서, 세포주는 St3 베타-갈락토시드 알파-2,3-시아릴전달효소 5 (St3Gal5)를 암호화하는, 적어도 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, St3Gal5를 암호화하는 염색체 서열의 모든 사본은 비활성화되고, 세포주는 St3Gal5를 생산하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 세포주는 St3 베타-갈락토시드 알파-2,3-시아릴전달효소 6 (St3Gal6)를 암호화하는, 적어도 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, St3Gal6를 암호화하는 염색체 서열의 모든 사본은 비활성화되고, 세포주는 St3Gal6를 생산하지 않는다. 대안적인 구현예에서, 세포주는 St3Gal1, St3Gal2, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal5, 및 St3Gal6 중 임의의 2개를 암호화하는 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 세포주는 St3Gal1, St3Gal2, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal5, 및 St3Gal6 중 임의의 3개를 암호화하는 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, COSMC, Slc35A1, C1GalT1, St3Gal1, St3Gal2, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal5, 및/또는 St3Gal6를 암호화하는 비활성화된 염색체 서열을 포함하는 세포주는, 추가로 하기를 암호화하는 비활성화된 염색체 서열을 포함한다: 만노실 (알파-1,3-)-당단백질 베타-1,2-N-아세틸글루코스아미닐전달효소 1 (Mgat1), 만노실 (알파-1,6-)-당단백질 베타-1,2-N-아세틸글루코스아미닐전달효소 2 (Mgat2), 만노실 (알파-1,4 -)-당단백질 베타-1,4-N-아세틸글루코스아미닐전달효소 3 (Mgat3), 만노실 (알파-1,3-)-당단백질 베타-1,4-N-아세틸글루코스아미닐전달효소 4 (Mgat4), 및/또는 만노실 (알파-1,6-)-당단백질 베타-1,6-N-아세틸글루코스아미닐전달효소 5 (Mgat5). 변형된 염색체 서열을 포함하는 포유동물 세포주는, 비변형된 친계 세포주와 비교하여, 바이러스 진입 및/또는 바이러스 전파에 대한 증가된 내성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, St3Gal1, St3Gal2, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal5, 및/또는 St3Gal6를 암호화하는 비활성화된 염색체 서열을 포함하는 세포주는 하기를 제조하기 위한 원인으로 작용하는 적어도 하나의 시아릴전달효소를 과발현시키기 위하여 추가로 조작된다: 2,6-연결기 (예를 들면, St6 베타-갈락토사마이드 알파-2,6-시아릴전달효소 1 (St6Gal1), St6 베타-갈락토사마이드 알파-2,6-시아릴전달효소 2 (St6Gal2), St6 (알파-N-아세틸-뉴라미닐-2,3-베타-갈락토실-1,3)-N-아세틸갈락토스아미나이드 1 (St6GalNac1), St6 (알파-N-아세틸-뉴라미닐-2,3-베타-갈락토실-1,3)-N-아세틸갈락토스아미나이드 2 (St6GalNac2), St6 (알파-N-아세틸-뉴라미닐-2,3-베타-갈락토실-1,3)-N-아세틸갈락토스아미나이드 3 (St6GalNac3), St6 (알파-N-아세틸-뉴라미닐-2,3-베타-갈락토실-1,3)-N-아세틸갈락토스아미나이드 4 (ST6GalNac4), St6 (알파-N-아세틸-뉴라미닐-2,3-베타-갈락토실-1,3)-N-아세틸갈락토스아미나이드 5 (St6GalNac5), 및/또는 St6 (알파-N-아세틸-뉴라미닐-2,3-베타-갈락토실-1,3)-N-아세틸갈락토스아미나이드 6 (St6GalNac6).
일부 구현예에서, 포유동물 세포주는 비-인간 세포주이다. 다른 구현예에서, 포유동물 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다. 특정한 구현예에서, 세포주는 COSMC, Slc35A1, C1GalT1, St3Gal1, St3Gal2, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal5, St3Gal6, 또는 이의 조합을 암호화하는 비활성화된 염색체 서열을 포함하는 CHO 세포주이다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 포유동물 세포주는 하기로부터 선택된 바이러스의 진입 및/또는 전파에 대한 내성을 나타낸다: 파보바이러스, 레오바이러스, 로타바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 칼리시바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 풍진 바이러스, 코로나바이러스, 노로바이러스, 엔세팔로마이오카디티스 바이러스, 폴리오마바이러스, 또는 이의 조합. 일부 구현예에서, 파로바이러스(parovirus)는 마우스 (MVM), 마우스 파보바이러스 유형-1, 마우스 파보바이러스 유형-2, 마우스 파보바이러스 유형-3, 돼지 파보바이러스 1, 소 파로바이러스 1, 인간 파로바이러스 B19, 인간 파로바이러스 4, 인간 파로바이러스 5, 또는 이의 조합의 미세 바이러스이다. 추가 구현예에서, 레오바이러스는 포유동물 레오바이러스-3, 포유동물 오르토레오바이러스, 조류 오르토레오바이러스, 또는 이의 조합이다.
다양한 구현예에서, 본원에 개시된 포유동물 세포주는 표적화 엔도뉴클레아제-매개된 게놈 변형 기술을 사용하여 적어도 하나의 염색체 서열을 변형시킴으로써 제조된다. 표적화 엔도뉴클레아제는 하기일 수 있다: 아연 핑거 뉴클레아제, CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제, 전사 활성제-유사 효과기 (TALE) 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 부위-특이적인 엔도뉴클레아제, 또는 인공 표적화된 DNA 이중 가닥 절단 유도제. 특정한 구현예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 한 쌍의 아연 핑거 뉴클레아제이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 포유동물 세포주는, 하기에서 선택된 재조합 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 추가로 포함한다: 항체, 항체 단편, 백신, 성장 인자, 시토카인, 호르몬, 응고 인자, 또는 기타 치료성 단백질.
본 개시내용의 또 다른 양태는 재조합 단백질 산물의 바이러스 감염을 감소 또는 예방하기 위한 방법을 포괄하며, 상기 방법은 본원에 개시된 바이러스 내성 포유동물 세포주를 수득하는 단계 및 세포주 내의 재조합 단백질 산물을 발현하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 추가 양태는 생물학적 생산계의 바이러스 오염 위험을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 생물학적 생산계 내의 용도를 위하여 본원에 개시된 바이러스 내성 포유동물 세포주를 제공하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 본원에 개시된 바이러스 내성 포유동물 세포주를 포함하는 조성물 및 적어도 하나의 바이러스를 포괄하고, 여기서 상기 세포주는 상기 적어도 하나의 바이러스에 의한, 감염에 대한 내성을 나타낸다.
개시내용의 다른 양태 및 반복은 하기에 더욱 상세히 기술된다.
도 1은 서던 블롯 분석으로 검정 시, MVM 바이러스 감염의 시간 경과를 제시한다. 야생형 세포 (CHOZN GS-/-), Slc35A1 KO, COSMC KO, COSMC KO 클론 F07, COSMC KO 클론 G03, 및 COSMC KO 클론 H05에 대한 제24, 제48, 제72, 및 제96 시간에서 검출된 MVM 바이러스 DNA의 상대량으로 도시됨 클론 H05는 12 bp의 틀-내(in-frame) 결실 (즉, 틀 이동 돌연변이 없음)을 갖는다.
도 2는 플라크(plaque) 검정으로 검출 시, MVM 바이러스 감염의 시간 경과를 나타낸다. 야생형 세포 (CHOZN), Slc35A1 KO, COSMC KO, COSMC KO 클론 F07, COSMC KO 클론 G03, 및 COSMC KO 클론 H05에 대한 제24, 제48, 제72, 및 제96 시간에서 검출된 pfu/mL이 도시된다.
도 3은 세포 성장에서 MMV 감염의 효과를 예시한다. 1 또는 8의 MOI에서, MVM 바이러스의 부재 (실선) 및 존재 (점선)에서 야생형 (2E3) (A) 및 COSMC KO 클론 F07 (B) 세포에 대하여, 120시간의 경과에 걸친 생세포 (세포/ml)의 수가 도시된다.
도 4는 MMV 감염 후 세포-연관된 바이러스의 시간 경과를 제시한다. 1 (A) 또는 8 (B)의 MOI에서, MVM 바이러스의 존재 하에서, 야생형 (2E3) (실선) 및 COSMC KO 클론 F07 (점선) 세포에 대한 120 시간의 경과에 걸친, qPCR를 통해 검출 시, 세포 당 MVM 바이러스 게놈 사본 (vgc)이 도시된다 (각 감염된 세포가 4 2 x 104 vgc를 생산할 수 있다는 추정에 기반하여).
도 5는 지시된 세포주 내의 MMV 복제의 시간 경과를 나타낸다. 0.3 (A) 또는 0.03 (B)의 MOI에서, MVM 바이러스로의 감염 후, 제0 및 제21 시간에서의 vgc/샘플이 도시된다.
도 6은 지시된 세포주 내의 레오바이러스-3 복제의 시간 경과를 제시한다. 레오-3 바이러스로의 감염 후, 제0 및 제24 시간에서의 야생형 세포 (2E3)와 비교한 vgc/샘플이 도시된다.
도 7은 MVM 바이러스의 부재 (UN) 또는 존재 (In)에서 성장한 세포에 대한, 성장 검정을 제시한다. 패널 A는 10일에 걸친, 야생형 (GS), Slc35A1 KO, COSMC KO 클론 F07, 및 COSMC KO 클론 G03에 대한 생세포 밀도(VCD)를 제시한다. 패널 B는 8일에 걸친, 야생형 (GS), IgG 생산 클론 71H1 및 71C3 (COSMC KO 클론 F07로부터 유래)에 대한 VCD를 제시한다.
도 8은 MVM 바이러스의 부재 (UN) 또는 존재 (In)에서 성장한 세포에 대한, 성장 검정을 제시한다. 9일에 걸친, 야생형 (GS), St3Gal4 KO 클론 7D10, St3Gal4 KO 클론 1B08, 및 St3Gal4 KO 클론 1B10에 대한 VCD가 도시된다.
본 개시내용은 세포주 내의 바이러스 진입 및/또는 바이러스 전파를 방해 또는 예방하도록 조작된 포유동물 세포주를 제공한다. 바이러스 내성을 갖는 조작된 세포주는 변형된 (예를 들어, 비활성화된) 염색체 서열을 함유하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 또한, 재조합 단백질의 생산을 위한, 본원에 개시된 세포주의 사용 방법이 제공되며, 여기서 상기 재조합 단백질 산물은 필수적으로 바이러스 오염이 없다. 바이러스 감염에 내성이 있는 세포주의 사용은, 그러므로, 생물학적 생산계 및 생산된 단백질 산물의 바이러스 오염의 위험을 감소 또는 제거한다.
(I) 바이러스 내성 세포주
본 개시내용의 일 양태는 바이러스 내성을 갖도록 조작된 포유동물 세포주를 포괄한다. 달리 언급하면, 본원에 개시된 세포주는, 비변형된, 친계 세포주와 비교하여, 적어도 하나의 바이러스에 의한 감염에 증가된 내성을 갖는다. 더 구체적으로, 바이러스의 진입 및/또는 바이러스의 전파는, 비변형된 친계 세포주와 비교하여, 본원에 개시된 조작된 세포주에서 감소 또는 제거된다. 일부 구현예에서, 포유동물 세포주는 유전적으로 변형되고, 적어도 하나의 변형된 염색체 서열을 함유한다. 일반적으로, 변형된 서열은 돌연변이를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 염색체 서열은 비활성화 (또는 녹아웃)되며, 이로써 암호화된 단백질 산물은 상기 세포주에 의해 생산되지 않는다.
일반적으로, 바이러스 감염에 대한 내성 (또는 민감성)은, 상동한 바이러스 유발에 대한 (비-조작된) 친계 세포의 반응으로, 바이러스 또는 바이러스들에 대한 노출에 대해 조작된 포유동물 세포주의 반응을 비교함으로써 측정될 수 있다. 세포주의 바이러스 감염 및/또는 세포주 내의 바이러스 전파는 다양한 기술에 의하여 분석될 수 있다. 적절한 기술의 비제한적 예시는 하기를 포함한다: 핵산 검출 방법 (예를 들어, 특정 바이러스 핵산의 존재를 검출하기 위한 서던 핵산 블로팅 검정, 바이러스 핵산을 검출하기 위한 PCR 또는 RT-PCR, 시퀀싱 방법, 등), 항체-기반 기술 (예를 들어, 항-바이러스 단백질 항체를 사용한 웨스턴 면역검정 기술, ELISA 방법, 등), 생체검정 (예를 들어, 플라크 검정, 세포변성 검정, 등), 및 현미경 기술 (예를 들어, 바이러스 입자를 검출하기 위한 전자 현미경, 등). 일부 구현예에서, 조작된 포유동물 세포주 내의 바이러스의 감염 및/또는 전파는, 비변형된 친계 세포의 그것과 비교하여, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 99%, 또는 99% 초과로 감소될 수 있다. 특정 구현예에서, 조작된 포유동물 세포주는, 바이러스 감염에 대해 내성이 있으며, 이는 즉, 상기 바이러스가 조작된 포유동물 세포주 내에서 진입 및/또는 전파가 불가능하게 되는 것이다.
본원에 개시된 포유동물 세포주는, 바이러스 내성을 부여하기 위하여 다양한 상이한 방법으로 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포주는 변형되어, 이로써 세포 표면 수용체를 통한 바이러스 진입이 감소 또는 제거된다. 다른 구현예에서, 세포주는 복제 및/또는 감염력과 연관된 특이적 바이러스 단백질을 억제 또는 차단하는 분자를 발현하도록 조작될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 세포주는 특이적 세포 항바이러스 단백질을 과발현하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조작은 유전적일 수 있고, 여기서 게놈 또는 염색체 서열은 변형된다. 달리 언급하면, 세포주는 유전적으로 변형된다. 다른 구현예에서, 상기 조작은 후성적 또는 염색체외적일 수 있다.
(a) 바이러스 내성의 기전
(i) 세포 표면 수용체의 섭동
특정 구현예에서, 포유동물 세포주는 변경된 세포 표면 수용체를 함유하도록 조작된다. 바이러스는, 세포 표면 상에서, 상보적인 수용체에 대한 특이적 부착을 통하여 세포에 진입할 수 있다. 많은 바이러스에 있어서, 이러한 세포 표면 수용체는 단백질 (또는 지방)에 연결된 글리칸 구조를 포함한다. 시알산 또는 이의 유도체 내에서 종결되는 글리칸은 많은 바이러스의 경우 수용체로 작용한다 (Matrosovich et al., 2013, Top Curr Chem, DOI: 10.1007/128_2013_466). 따라서, 말단 시알산 잔기를 갖는 O-연결된 또는 N-연결된 글리칸을 포함하는 당단백질은 다수 바이러스에 있어서 세포 표면 수용체로 작용할 수 있다. 시알산은 뉴라민산의 유도체를 지칭하며, 예를 들어, N-아세틸뉴라민산 (Neu5Ac 또는 NANA) 및 N-글리콜릴뉴라민산 (Neu5Gc 또는 NGNA)을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포주는 말단 시알산 잔기가 없는 당단백질을 포함하도록 조작된다. 말단 시알산 잔기는 글리칸 쇄의 합성과 연관된 효소 및/또는 단백질의 결실 (즉, 녹 아웃) 또는 변경에 의하여 제거될 수 있다. 적절한 표적은, O-연결된 글리칸의 합성과 연관된 효소 또는 단백질, N-연결된 글리칸의 합성과 연관된 효소 또는 단백질, 및/또는 시알산의 합성 또는 수송과 연관된 효소 또는 단백질을 포함한다.
특정 구현예에서, 세포주는 상기 언급된 표적화된 효소 또는 단백질 (또는 상기 언급된 표적의 임의의 조합) 중 적어도 하나가 결핍될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, “결핍된”은 표적화된 효소 또는 단백질의 감소된, 또는 비-검출가능한 수준, 또는 표적화된 효소 또는 단백질의 감소된, 또는 비-검출가능한 활성을 지칭한다. 표적화된 효소 또는 단백질의 양 또는 활성은, 효소의 표적화된 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 염색체 서열을 변형함으로써 감소 또는 제거될 수 있다. 예를 들어, 염색체 서열은 하기를 함유하도록 변형될 수 있다: 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이의 조합. 따라서, 결실(들), 삽입(들), 및/또는 치환(들)은 염색체 서열의 해독틀을 이동할 수 있으며, 이로써 단백질 산물이 생산되지 않는다 (즉, 염색체 서열이 비활성화된다). 대안적으로, 변형된 염색체 서열에서의 결실(들), 삽입(들), 및/또는 치환(들)은 변경된 단백질 산물의 생산을 야기할 수 있다. 관심 염색체 서열의 변형은, 표적화된 엔도뉴클레아제-매개된 게놈 편집 기술을 사용하여 달성될 수 있으며, 이는 하기 섹션 (III)(a)에 상세화된다. 표적화된 효소 또는 단백질을 암호화하는 일 염색체 서열이 비활성화되는 경우, 조작된 세포주는 감소된 수준의 표적화된 효소 또는 단백질을 생산한다. 표적화된 효소 또는 단백질을 암호화하는 염색체 서열(들)의 모든 사본이 비활성화되는 다른 경우, 조작된 세포주는 표적화된 효소 또는 단백질을 생산하지 않는다 (즉, 세포주는 녹아웃 또는 KO이다). 또 다른 구현예에서, 표적화된 효소 또는 단백질 수준은 RNA 간섭 매개된 기전을 사용하여 감소 또는 제거될 수 있으며, 이는 하기 섹션 (III)(b)에서 기술된다.
일부 구현예에서, 표적화된 효소 또는 단백질 수준은 적어도 약 5%, 약 5 내지 10%, 약 10 내지 20%, 약 20 내지 30%, 약 30 내지 40%, 약 40 내지 50%, 약 50 내지 60%, 약 60 내지 70%, 약 70 내지 80%, 약 80 내지 90%, 또는 약 90 내지 약 100% 만큼 감소될 수 있다. 다른 구현예에서, 표적화된 효소 또는 단백질 수준은 본 분야에서의 기술 표준 (예를 들어, 웨스턴 면역블로팅 검정, ELISA 효소 검정, 등)을 사용하여 비-검출가가능한 수준으로 감소될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포주는 O-연결된 글리코실화와 연관된 효소 또는 단백질이 결핍될 수 있다. 예를 들어, 세포주는 코어 1 신장 효소 (또한 코어 1 신타제 당단백질-N-아세틸갈락토사민 3-베타-갈락토실전달효소 1 또는 C1GalT1), 코어 1 효소 샤프론 (또한 C1GalT1-특이적 샤프론 또는 COSMC), 또는 둘 모두가 결핍될 수 있다. COSMC는 접힘, 안정화, 및 활성 C1GalT1를 촉진하며, 이는 갈락토오스 잔기의, 단백질의 세린 또는 트레오닌과 O-연결된 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 잔기로의 이동을 촉진한다. 특정 구현예에서, 세포주는 C1GalT1, COSMC, 또는 둘 모두가 결핍되어 있다. 상기 결핍은 C1GalT1 및/또는 COSMC을 암호화하는 비활성화된 염색체 서열에 기인한 것일 수 있고, 이로써 제조된 C1GalT1 및/또는 COSMC 단백질 수준이 감소되거나 제조되지 않는다. 일부 경우에서, C1GalT1 및/또는 COSMC을 암호화하는 적어도 하나의 염색체 서열이 비활성화된다. 다른 경우에서, C1GalT1 및/또는 COSMC을 암호화하는 염색체 서열의 모든 사본이 비활성화되며, 이로써 세포주는 C1GalT1 단백질 및/또는 COSMC 단백질이 없다.
다른 구현예에서, 세포주는 적어도 하나의 시아릴전달효소 (ST)가 결핍된다. 시아릴전달효소는 알파-2,3 연결 배좌에서 갈락토오스에 시알산을 첨가하는 시아릴전달효소, 알파-2,6 연결 배좌에서 갈락토오스 또는 N-아세틸갈락토사민에 시알산을 첨가하는 시아릴전달효소, 또는 알파-2,8 연결 배좌에서 다른 시알산 단위에 시알산을 첨가하는 시아릴전달효소일 수 있다. 적합한 시아릴전달효소의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: St3 베타-갈락토시드 알파-2,3-시아릴전달효소 1 (St3Gal1), St3 베타-갈락토시드 알파-2,3-시아릴전달효소 2 (St3Gal2), St3 베타-갈락토시드 알파-2,3-시아릴전달효소 3 (St3Gal3), St3 베타-갈락토시드 알파-2,3-시아릴전달효소 4 (St3Gal4), St3 베타-갈락토시드 알파-2,3-시아릴전달효소 5 (St3Gal5), St3 베타-갈락토시드 알파-2,3-시아릴전달효소 6 (St3Gal6), St6 베타-갈락토사마이드 알파-2,6-시아릴전달효소 1 (St6Gal1), St6 베타-갈락토사마이드 알파-2,6-시아릴전달효소 2 (St6Gal2), St6 (알파-N-아세틸-뉴라미닐-2,3-베타-갈락토실-1,3)-N-아세틸갈락토스아미나이드 1 (St6GalNac1), St6 (알파-N-아세틸-뉴라미닐-2,3-베타-갈락토실-1,3)-N-아세틸갈락토스아미나이드 2 (St6GalNac2), St6 (알파-N-아세틸-뉴라미닐-2,3-베타-갈락토실-1,3)-N-아세틸갈락토스아미나이드 3 (St6GalNac3), St6 (알파-N-아세틸-뉴라미닐-2,3-베타-갈락토실-1,3)-N-아세틸갈락토스아미나이드 4 (ST6GalNac4), St6 (알파-N-아세틸-뉴라미닐-2,3-베타-갈락토실-1,3)-N-아세틸갈락토스아미나이드 5 (St6GalNac5), St6 (알파-N-아세틸-뉴라미닐-2,3-베타-갈락토실-1,3)-N-아세틸갈락토스아미나이드 6 (St6GalNac6), St8 알파-N-아세틸-뉴라미니드 알파-2,8-시아릴전달효소 1 (St8Sia1), St8 알파-N-아세틸-뉴라미니드 알파-2,8-시아릴전달효소 2 (St8Sia2), St8 알파-N-아세틸-뉴라미니드 알파-2,8-시아릴전달효소 3 (St8Sia3), St8 알파-N-아세틸-뉴라미니드 알파-2,8-시아릴전달효소 4 (St8Sia4), St8 알파-N-아세틸-뉴라미니드 알파-2,8-시아릴전달효소 5 (St8Sia5), 또는 St8 알파-N-아세틸-뉴라미니드 알파-2,8-시아릴전달효소 6 (St8Sia6).
특정한 구현예에서, 세포주는 적어도 하나의 알파-2,3-시아릴전달효소 (예를 들면, St3Gal1, St3Gal2, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal5, 및/또는 St3Gal6)가 결핍될 수 있다. 상기 결핍은 적어도 하나의 알파-2,3-시아릴전달효소를 암호화하는 비활성화된 염색체 서열에 기인할 수 있으며, 이로써 상기 적어도 하나의 알파-2,3-시아릴전달효소의 감소된 수준 또는 이의 부재가 달성된다. 일부 경우에서, 적어도 하나의 알파-2,3-시아릴전달효소를 암호화하는 적어도 하나의 염색체 서열은 비활성화될 수 있다. 다른 사례에서, 적어도 하나의 알파-2,3-시아릴전달효소를 암호화하는 염색체 서열의 모든 사본은 비활성화될 수 있으며, 이로써 상기 세포주는 적어도 하나의 알파-2,3-시아릴전달효소가 없다. 또 다른 방법을 언급한다면, St3Gal 1, 2, 3, 4, 5, 및/또는 6을 암호화하는 염색체 서열은 녹아웃(knocked out)될 수 있다.
세포주가 적어도 하나의 알파-2,3-시아릴전달효소(예를 들면, St3Gal1, St3Gal2, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal5, 및/또는 St3Gal6)를 암호화하는 적어도 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함하는 일부 예에서, 세포주는 하기를 제조하는데 원인으로 작용하는 적어도 하나의 시아릴전달효소를 과발현시키기 위하여 추가로 조작될 수 있다: 2,6-연결기 (예를 들면, St6Gal 1, St6Gal 2, St6GalNac1, St6GalNac2, St6GalNac3, ST6GalNac4, St6GalNac5, 및/또는 St6GalNac6). 따라서, 그러한 세포주는 감소된 수의 (또는 부재의) 말단 2,3-연결된 시알산 잔기 및 증가된 수의 말단 2,6-연결된 시알산 잔기를 갖는 당단백질을 포함할 수 있다.
추가 구현예에서, 세포주는 시알산 합성 또는 수송과 연관된, 적어도 하나의 효소 또는 단백질이 결핍될 수 있다. 시알산 합성 또는 수송과 연관된, 효소 또는 단백질의 예시는 하기를 비제한적으로 포함한다: 글루코사민 (UDP-N-아세틸)-2-에피머라제/N-아세틸만노스아민 키나제 (GNE), N-아세틸뉴라민산 합성효소 (NANS), N-아세틸뉴라민산 포스파타제 (NANP), 시티딘 모노포스페이트 N-아세틸뉴라민산 합성효소 (CMAS), 및 시티딘 모노포스페이트 N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제 (CMAH), 용질 담체 패밀리 35 (CMP-시알산 수송체), 구성원 A1 (Slc35A1). 특정 구현예에서, 세포주는, 골지체(Golgi)로 CMP-시알산을 수송하는, Slc35A1이 결핍될 수 있다. 일부 경우에서, Slc35A1을 암호화하는 적어도 하나의 염색체 서열은 비활성화될 수 있다. 다른 사례에서, Slc35A1을 암호화하는 염색체 서열의 모든 사본은 비활성화될 수 있고, 이로써 상기 세포는 Slc35A1 단백질이 없다.
추가 구현예에서, 세포주는 N-글리코실화와 연관된 적어도 하나의 효소 또는 단백질이 결핍될 수 있다. 일부 예에서, N-글리코실화와 연관된 효소 또는 단백질은 N-아세틸글루코실아미닐전달효소일 수 있으며, 이는 N-연결된 글리칸의 베타-연결된 만노스 잔기에 GlcNAc 잔기를 첨가한다. 예는 하기를 포함한다: 만노실 (알파-1,3-)-당단백질 베타-1,2-N-아세틸글루코스아미닐전달효소 1 (Mgat-1), 만노실 (알파-1,6-)-당단백질 베타-1,2-N-아세틸글루코스아미닐전달효소 2 (Mgat-2), 만노실 (알파-1,4 -)-당단백질 베타-1,4-N-아세틸글루코스아미닐전달효소 3 (Mgat-3), 만노실 (알파-1,3-)-당단백질 베타-1,4-N-아세틸글루코스아미닐전달효소 4 (Mgat-4), 및 만노실 (알파-1,6-)-당단백질 베타-1,6-N-아세틸글루코스아미닐전달효소 5 (Mgat-5). 다른 예에서, N-글리코실화와 연관된 효소 또는 단백질은 갈락토실전달효소일 수 있으며, 이는 N-연결된 글리칸의 GlcNAc 잔기에 베타 1,4 연결부에서의 갈락토오스 잔기를 첨가한다. 갈락토실전달효소는 하기일 수 있다: UDP-Gal:베타GlcNAc 베타 1,4- 갈락토실전달효소, 폴리펩티드 1 (B4GalT1), UDP-Gal:베타GlcNAc 베타 1,4- 갈락토실전달효소, 폴리펩티드 2 (B4GalT2), UDP-Gal:베타GlcNAc 베타 1,4- 갈락토실전달효소, 폴리펩티드 3 (B4GalT3), UDP-Gal:베타GlcNAc 베타 1,4- 갈락토실전달효소, 폴리펩티드 4 (B4GalT4), UDP-Gal:베타GlcNAc 베타 1,4- 갈락토실전달효소, 폴리펩티드 5 (B4GalT5), UDP-Gal:베타GlcNAc 베타 1,4- 갈락토실전달효소, 폴리펩티드 6 (B4GalT6), 또는 UDP-Gal:베타GlcNAc 베타 1,4- 갈락토실전달효소, 폴리펩티드 7 (B4GalT7). 특정 경우에서, 세포주는 적어도 하나의 N-아세틸글루코일아미닐전달효소 및/또는 갈락토실전달효소가 결핍된다. 일부 반복에서, 적어도 하나의 N-아세틸글루코일아미닐전달효소 및/또는 갈락토실전달효소를 암호화하는 적어도 하나의 염색체 서열은 비활성화될 수 있다. 다른 사례에서, 적어도 하나의 N-아세틸글루코일아미닐전달효소 및/또는 갈락토실전달효소를 암호화하는 염색체 서열의 모든 사본은 비활성화될 수 있으며, 이로써 상기 세포주는 적어도 하나의 N-아세틸글루코일아미닐전달효소 및/또는 갈락토실전달효소가 없다.
(ii) 바이러스 단백질로의 간섭
다른 구현예에서, 포유동물 세포주는 복제 및/또는 감염력을 억제 또는 차단하는 분자를 발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 세포주는 복제 및/또는 감염력과 연관된 특정 바이러스 단백질에 대한 적어도 하나의 RNA 간섭 (RNAi) 제제를 안정적으로 발현하도록 조작될 수 있다. 적절한 바이러스 단백질의 비제한적인 예시는 NS1 또는 NS2와 같은 비구조적 단백질 및 VP1 또는 VP2와 같은 캡시드 단백질을 포함한다. RNAi 제제는 전사체 절단의 절단을 매개하는 것 또는 전사체 번역을 파괴하는 것에 의하여, 단백질 발현을 예방하고, 표적 전사체에 결합한다.
일부 구현예에서, RNAi 제제는 짧은 간섭 RNA (siRNA)일 수 있다. 일반적으로, siRNA는 길이 범위가 약 15 내지 약 29개의 뉴클레오티드이고, 더욱 일반적으로는 길이가 약 19 내지 23개 뉴클레오티드 이중-가닥 RNA 분자를 포함한다. 특정 구현예에서, siRNA는 길이가 약 21개의 뉴클레오티드일 수 있다. siRNA는 임의로, 1 또는 2개의 단일-가닥 오버행, 예를 들어, 하나 또는 양자 말단 상의 3’오버행을 추가가 포함할 수 있다. siRNA는, 함께 혼성화되는 2개 RNA 분자로부터 형성될 수 있거나, 대안적으로, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)로부터 생산될 수 있다 (하기 참고). 일부 구현예에서, siRNA의 2개 가닥은 완전히 상보적일 수 있으며, 이로써 2개의 서열 사이에서 형성된 이중나선 영역에서 미스매치 또는 벌지(bulge)가 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, siRNA의 2개 가닥은 실질적으로 상보적일 수 있으며, 이로써 2개의 서열 사이에서 형성된 이중나선 영역에서 하나 이상의 미스매치 또는 벌지(bulge)가 존재한다. 특정 구현예에서, siRNA의 5' 말단의 하나 또는 양자는 인산기를 가질 수 있으며, 한편 다른 구현예에서, 5' 말단의 하나 또는 양자는 인산기가 없을 수 있다.
siRNA의 일 가닥 (“안티센스 가닥” 또는 “가이드 가닥”으로 지칭됨)은 표적 전사체로 혼성화되는 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA의 안티센스 가닥은 표적 전사체 영역에 완전히 상보적일 수 있으며, 즉, 이는 siRNA의 길이에 걸쳐 단일 미스매치 또는 벌지가 없는 표적 전사체에 혼성화된다. 다른 구현예에서, 안티센스 가닥은 표적 영역에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 즉, 하나 이상의 미스매치 및/또는 벌지가 안티센스 가닥 및 표적 전사체에 의하여 형성된 이중나선 내에 존재할 수 있다. 전형적으로, siRNA는 표적 전사체의 엑손 서열에 표적화된다. 본 분야의 숙련가는 표적 전사체에 대한 siRNA를 설계하는 프로그램, 알고리즘, 및/또는 상업적 서비스를 잘 알고 있다.
다른 구현예에서, RNAi 제제는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)일 수 있다. 일반적으로, shRNA는 (상기 기술된) RNA 간섭을 매개하기에 충분히 긴 이중-가닥 구조를 형성하기 위해 혼성화할 수 있거나 혼성화되는 적어도 2개의 상보적 부분 및 이중나선을 형성하는 shRNA의 영역을 연결하는 루프를 형성하는 적어도 하나의 단일 가닥 부분을 포함하는 RNA 분자이다. 구조는 줄기-루프 구조로 또한 지칭될 수 있다 (여기서 줄기는 이중나선 부분이다). 일부 구현예에서, 구조의 이중나선 부분은 완전히 상보적일 수 있으며, 이로써 shRNA의 이중나선 영역에서 미스매치 또는 벌지(bulge)가 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, 구조의 이중나선 부분은 실질적으로 상보적일 수 있으며, 이로써 shRNA의 이중나선 부분에서 하나 이상의 미스매치 또는 벌지(bulge)가 존재할 수 있다. 구조의 루프는 길이가 약 1 내지 약 20개의 뉴클레오티드일 수 있고, 특히 길이가 약 6 내지 약 9개의 뉴클레오티드일 수 있다. 루프는 표적 전사체에 상보적인 영역의 5’ 또는 3' 말단 중 하나(즉, shRNA의 안티센스 부분)에 위치할 수 있다.
shRNA는 5’또는 3’ 말단 상에서 오버행을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 오버행은 구조의 루프는 길이가 약 1 내지 약 20개의 뉴클레오티드일 수 있고, 더욱 특히, 길이가 약 2 내지 약 15개의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 오버행은 하나 이상의 U 잔기, 예를 들어 약 1 내지 약 5개의 U 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, shRNA의 5' 말단은 인산기를 가질 수 있다. 일반적으로, shRNA는 보존된 세포 RNAi 기작에 의하여 siRNA로 처리된다. 따라서, shRNA는 siRNA의 전구체이고, shRNA의 부분 (즉, shRNA의 안티센스 부분)에 상보적인 표적 전사체 발현을 유사하게 억제할 수 있다. 본 분야에서의 숙련가는 shRNA의 설계 및 합성을 위하여 이용가능한 자원을 잘 알고 있다. 예시적인 예는 MISSION® shRNA (Sigma-Aldrich)이다.
siRNA 또는 shRNA는 RNAi 발현 작제물로부터 생체내 발현될 수 있다. 적절한 작제물은 하기를 포함한다: 플라스미드 벡터, 파스미드, 코스미드, 인공/미니-염색체, 트랜스포존, 및 바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터 등). 일 구현예에서, RNAi 발현 작제물은 플라스미드 벡터 (예를 들어, pUC, pBR322, pET, pBluescript, 및 이의 변이체)일 수 있다. RNAi 발현 작제물은 2개의 프로모터 조절 서열을 포함할 수 있고, 여기서 각각은 작동가능하게 연결된 적절한 암호화 서열이고, 이로써 2개의 개별, 상보적 siRNA 가닥은 전사될 수 있다. 2개의 프로모터 조절 서열은 상동한 배향 또는 반대의 배향일 수 있다. 또 다른 구현예에서, RNAi 발현 벡터는 2개의 상보적 영역을 포함하는 단일 RNA 분자의 전사를 유도하는 프로모터 조절 서열을 함유할 수 있으며, 이로써 상기 전사체는 shRNA를 형성한다. 일반적으로, 프로모터 조절 서열(들)은 RNA 폴리머라아제 III (Pol III) 프로모터, 예컨대 U6 또는 H1 프로모터일 것이다. 다른 구현예에서, RNA 폴리머라아제 II (Pol II) 프로모터 조절 서열이 사용될 수 있다 (상동한 예시가 하기에 제시됨). RNAi 발현 작제물은 추가 서열 요소, 예컨대 전사 종결 서열, 선택가능한 마커 서열 등을 함유할 수 있다. RNAi 발현 작제물은 표준 절차를 사용하여 관심 세포주에 도입될 수 있다. RNAi 발현 작제물은 안정한 발현을 위하여 세포주 내에서 염색체 통합될 수 있다. 대안적으로, RNAi 발현 작제물은 안정한 발현을 위하여 세포주 내에서 염색체외 (예를 들어, 에피솜)일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 세포주는 복제 및/또는 감염력과 연관된 바이러스 단백질의 우성(dominant) 음성 형태를 안정적으로 발현하도록 조작될 수 있다. 단백질의 우성 음성 형태는 변경 또는 변이되어, 이로써 이는 야생형 단백질과 경쟁하거나 이를 억제한다. 적절한 단백질의 비제한적인 예시는 NS1 또는 NS2와 같은 비구조적 단백질 및 VP1 또는 VP2와 같은 캡시드 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포주는 하나 이상의 NS1 단백질의 우성 음성 형태를 발현하도록 조작될 수 있다.
우성 음성 단백질은, 야생형 단백질과 비교하여, 결실, 삽입, 및/또는 치환을 가질 수 있다 (Lagna et al., 1998, Curr. Topics Dev. Biol, 36:75-98). 결실, 삽입, 및/또는 치환은 단백질 내의 N-말단, C-말단, 또는 이의 내부에 있을 수 있다. (부위-지시된 돌연변이생산, PCR-기반 돌연변이생산을 통한) 돌연변이체 단백질 생산을 위한 수단은 본 분야에서, 우성 음성 효과를 갖는 것들을 동정하기 위한 수단으로서, 본 분야에서 잘 알려져 있다. 세포주는 우성 음성 단백질(들)을 암호화하는 서열을 포함하는 발현 작제물(들) (상기 참고)로 형질감염될 수 있으며, 여기서 암호화 서열은 발현을 위하여 Pol II 프로모터 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 프로모터 조절 서열은 구성적, 조절된, 또는 조직-특이적일 수있다.
적합한 항시적 프로모터 조절 서열은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 사이토메갈로바이러스 전초기 프로모터 (CMV), 유인원 바이러스 (SV40) 프로모터, 아데노바이러스 주후기 프로모터, 루 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 연신율 인자 (ED1)-알파 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 튜불린 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 그것의 단편, 또는 전술한 것의 임의의 조합. 적절한 조절된 프로모터 조절 서열의 예시는 비제한적으로 열 충격, 금속, 스테로이드, 항생제, 또는 알코올에 의하여 조절된 것들을 비제한적으로 포함한다. 조직-특이적 프로모터의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: B29 프로모터, CD14 프로모터, CD43 프로모터, CD45 프로모터, CD68 프로모터, 데스민 프로모터, 엘라스타제-1 프로모터, 엔도글린 프로모터, 파이브로넥틴 프로모터, Flt-1 프로모터, GFAP 프로모터, GPIIb 프로모터, ICAM-2 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, NphsI 프로모터, OG-2 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, 및 WASP 프로모터. 프로모터 서열은 야생형일 수 있고, 이는 더욱 효율적이거나 효력이 있는 발현을 위하여 변형될 수 있다.
발현 작제물은 하기를 포함할 수 있다: 추가의 발현 조절 서열 (예를 들면, 인핸서 서열, 코작 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열, 등), 선별 마커 서열 (예를 들면, 항생제 내성 유전자), 복제 기점, 등. 추가 정보는 하기에서 찾아볼 수 있다: “Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 또는 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001.
(iii) 항-바이러스 반응과 연관된 세포 단백질의 과발현
대안적인 구현예에서, 포유동물 세포주는 숙주 세포 항-바이러스 반응과 연관된 세포 단백질을 과발현하도록 조작될 수 있다. 항-바이러스 반응과 연관된 단백질의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 이중-가닥 RNA-활성화된 단백질 키나제 R (PKR, 진핵 번역 개시 인자 2-알파 키나제 2 또는 Eif2ak2로도 또한 알려짐), 수용체 상호작용 단백질 키나제 2 (RIPK2), 인터페론 (예를 들면, 유형 I 및 유형 II), 인터류킨 (예를 들면, IL-1 및 IL-6), 종양 괴사 인자 알파, 인터페론 조절 인자 1, STATs, p53, 활성화 전사 인자 3, NF-κB, 진핵 개시 인자 2 (eIF2), 세포자멸사 단백질 (IAPs) 억제제, 및 아연-핑거 항바이러스 단백질 (ZAP). 특정 구현예에서, 세포주는 PKR을 과발현하도록 조작될 수 있다.
과발현은 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 하나 이상의 외인성 사본을 도입함으로써 달성될 수 있다. 관심 세포 단백질을 암호화하는 서열은 Pol II 프로모터 조절 서열에 일반적으로 작동가능하게 연결된다 (상기 참고). 암호화 서열의 다중 사본은 병렬로 연결되고, 단일 프로모터 조절 서열의 조절 하에서 위치할 수 있다. 관심 단백질을 암호화하는 서열(들)은 발현 작제물의 일부로서 세포주에 도입될 수 있다 (상기 참고). 따라서, 발현 작제물은 염색체 위치로 삽입될 수 있고, 대안적으로, 발현 작제물은 안정한 발현을 위하여 염색체외 (예를 들어, 에피솜)일 수 있다.
과발현은 관심 단백질을 암호화하는 내인성 염색체 서열의 프로모터 조절 서열을 변형함으로써 또한 달성될 수 있다. 예를 들어, 내인성 프로모터 조절 서열은, 적어도 하나의 외인성 “강한” 프로모터 조절 서열 (즉, RNA 폴리머라아제 및/또는 연관된 인자)를 삽입함에 의하여 변형될 수 있다 (이의 예시는 상기에 제시됨). 대안적으로, 내인성 프로모터 조절 서열의 서열은 “강한” 프로모터 조절 서열을 모방하도록 변형될 수 있다. 내인성 염색체 서열은 섹션 (III)에 하기 구체화된 표적화 엔도뉴클레아제-매개된 게놈 변형 기술을 사용하여 변형될 수 있다.
(b) 세포 유형
본원에 개시된 바이러스 내성 세포주는 포유동물 세포주이다. 일부 구현예에서, 바이러스성 감염에 내성을 갖는 세포주는 하기로부터 유도될 수 있다: 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포; 마우스 골수종 NS0 세포; 어린 햄스터 신장 (BHK) 세포; 마우스 배아 섬유아세포 3T3 세포 (NIH3T3); 마우스 B 림프종 A20 세포; 마우스 흑색종 B16 세포; 마우스 근아세포 C2C12 세포; 마우스 골수종 SP2/0 세포; 마우스 배아 간엽 C3H-10T1/2 세포; 마우스 암종 CT26 세포, 마우스 전립선 DuCuP 세포; 마우스 유방 EMT6 세포; 마우스 간종양 Hepa1c1c7 세포; 마우스 골수종 J5582 세포; 마우스 상피성 MTD-1A 세포; 마우스 심근 MyEnd 세포; 마우스 신장 RenCa 세포; 마우스 췌장 RIN-5F 세포; 마우스 흑색종 X64 세포; 마우스 림프종 YAC-1 세포; 래트 교모세포종 9L 세포; 래트 B 림프종 RBL 세포; 래트 신경교세포종 B35 세포; 래트 간종양 세포 (HTC); 버팔로 래트 간 BRL 3A 세포; 갯과 신장 세포 (MDCK); 갯과 유선 (CMT) 세포; 래트 골육종 D17 세포; 래트 단핵구/대식세포 DH82 세포; 원숭이 신장 SV-40 형질전환된 섬유아세포 (COS7) 세포; 원숭이 신장 CVI-76 세포; 아프리카 녹색 원숭이 신장 (VERO-76) 세포; 인간 배아 신장 세포 (HEK293, HEK293T); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 인간 U2-OS 골육종 세포, 인간 A549 세포, 인간 A-431 세포, 또는 인간 K562 세포. 포유동물 세포주의 광범위한 목록은 미국 종균 협회 카탈로그 (ATCC, Manassas, VA)에서 찾아볼 수 있다. 다른 구현예에서, 바이러스 내성을 갖는 세포주는 비-인간, 포유동물 세포주이다. 추가 구현예에서, 바이러스 내성을 갖는 세포주는 비-인간, 비-마우스, 포유동물 세포주이다. 특정 구현예에서, 바이러스 내성을 갖는 세포주는 CHO 세포주이다. 수많은 CHO 세포주는 ATCC로부터 이용가능하다. 적합한 CHO 세포주는 비제한적으로, 하기를 포함한다: CHO-K1 세포 및 이의 유도체.
다양한 구현예에서, 세포주는 글루타민 합성효소 (GS), 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실전달효소 (HPRT), 또는 이의 조합이 결핍될 수 있다. 예를 들면, GS, DHFR, 및/또는 HPRT를 암호화하는 염색체 서열은 비활성화될 수 있다. 특정한 구현예에서, GS를 암호화하는 모든 염색체 서열은 세포주 내에서 비활성화된다.
(c) 바이러스
바이러스 내성을 갖는 조작된 포유동물 세포주는 다양한 포유동물 바이러스에 내성이 있을 수 있다. 바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스일 수 있고, 바이러스는 봉입(enveloped)되거나 비-봉입 ("naked")될 수 있다. 시알산 수용체를 통하여 포유동물 세포에 결합할 수 있거나 이에 진입할 수 있는 바이러스의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 파보바이러스, 레오바이러스, 로타바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 칼리시바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 풍진 바이러스, 코로나바이러스, 노로바이러스, 엔세팔로마이오카디티스 바이러스, 및 폴리오마바이러스. 일부 구현예에서, 조작된 포유동물 세포주는, 적어도 하나의 파보바이러스에 의하여, 감염에 대해 내성이 있다. 적합한 파보바이러스의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 마우스 (MVM)의 미세 바이러스 (마우스 미세 바이러스 (MMV) 또는 설치류 프로토파보바이러스 1로도 또한 알려짐), 마우스 파보바이러스 유형-1 (MPV-1), 마우스 파보바이러스 유형-2 (MPV-2), 마우스 파보바이러스 유형-3 (MPV-3), 돼지 파보바이러스 1, 소 파로바이러스 1, 및 인간 파보바이러스 (예를 들면, 인간 파로바이러스 B19, 인간 파로바이러스 4, 인간 파로바이러스 5, 등). 특정 구현예에서, 파보바이러스는 MVM일 수 있다. 다른 구현예에서, 바이러스는 레오바이러스 (예컨대 포유동물 레오바이러스-3, 포유동물 오르토레오바이러스, 조류 오르토레오바이러스, 등)일 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스성 감염에 대성을 갖는 조작된 포유동물 세포주는 또한 몰리쿠테스강 유기체에 의하여 감염에 대해 또한 내성을 가질 수 있다. 특히, 본원에 개시된 세포주는 마이코플라스마 또는 스피로플라즈마 속에 의하여 감염에 대해 내성이 있을 수 있다.
(d) 재조합 단백질을 암호화하는 임의의 핵산
*일부 구현예에서, 바이러스 감염에 대한 내성을 갖는 포유동물 세포주는, 재조합 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 재조합 단백질은 이형이며, 이는 상기 단백질이 세포에 천연이 아니라는 것을 의미한다. 재조합 단백질은 비제한적으로, 하기로부터 선택된 치료성 단백질: 항체, 항체 단편, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간화된 단클론성 항체, 키메라 항체, IgG 분자, IgG 중쇄, IgG 경쇄, IgA 분자, IgD 분자, IgE 분자, IgM 분자, 백신, 성장 인자, 시토카인, 인터페론, 인터류킨, 호르몬, 응고 (또는 응집) 인자, 혈액 성분, 효소, 치료성 단백질, 기능성식품 단백질, 상기 중 임의의 기능적 단편 또는 기능적 변이체, 또는 상기 단백질 중 임의의 것 및/또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질을 암호화하는 핵산은 하기를 암호화하는 서열과 연결될 수 있으며: 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실전달효소 (HPRT), 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 및/또는 글루타민 합성효소 (GS), 이로써, HPRT, DHFR, 및/또는 Gs는 증폭가능한 선별 마커로 사용될 수 있다. 재조합 단백질을 암호화하는 핵산은 또한 적어도 하나의 항생 내성 유전자를 암호화하는 서열 및/또는 형광 단백질과 같은 마커 단백질을 암호화하는 서열에 또한 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질을 암호화하는 핵산은 발현 작제물의 부분일 수 있다. 다른 부분에서 구체화된 바와 같이, 발현 작제물 또는 벡터는 하기를 포함할 수 있다: 추가의 발현 조절 서열 (예를 들면, 인핸서 서열, 코작 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열, 등), 선별 마커 서열, 복제 기점, 등. 추가의 정보는 하기에서 찾아볼 수 있다: Ausubel et al. 2003, (상기), 및 Sambrook & Russell, 2001, (상기).
일부 구현예에서, 재조합 단백질을 암호화하는 핵산은 염색체외 위치할 수 있다. 즉, 재조합 단백질을 암호화하는 핵산은 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체, 미니염색체, 또는 다른 염색체외 작제물로부터 일시적으로 발현될 수 있다. 다른 구현예에서, 재조합 단백질을 암호화하는 핵산은 세포의 게놈으로 염색체 통합될 수 있다. 통합은 랜덤이거나 표적화될 수 있다. 따라서, 재조합 단백질은 안정적으로 발현될 수 있다. 이러한 구현예의 일부 반복에서, 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 적절한 이형 발현 조절 서열 (즉, 프로모터)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다른 반복에서, 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 내인성 발현 조절 서열의 조절 하에 위치될 수 있다. 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열은, 동형 재조합, 표적화 엔도뉴클레아제-매개 게놈 편집, 바이러스 벡터, 트랜스포존, 플라스미드, 및 다른 잘 알려진 수단을 사용하여 세포주에 통합될 수 있다. 추가의 안내사항은 하기에서 찾아볼 수 있다: Ausubel et al. 2003, (상기) 및 Sambrook & Russell, 2001, (상기).
(e) 조성물
특정 구현예에서, 바이러스 내성을 나타내도록 조작된 포유동물 세포주는 조성물의 부분일 수 있으며, 이는 또한 적어도 하나의 바이러스를 포함할 수 있다. 상기 조성물은, 그러므로 본원에 개시된 조작된 세포주 (임의로 재조합 단백질을 암호화하는 핵산을 추가로 포함) 및 바이러스를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 바이러스의 진입 및/또는 전파는 조작된 포유동물 세포주 내에서 감소 또는 제거된다. 따라서, 상기 조성물 내 세포는 전파가능하나, 상기 조성물 내 바이러스는 전파가 불가능하며, 이는 상기 세포 내의 진입 및/또는 복제가 감소 또는 제거되기 때문이다. 상기 조성물은 조작된 포유동물 세포주 세포의 성장을 지지하기 위하여 적어도 하나의 세포 성장 배지를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 세포 성장 배지는 동물 성분이 없는 배지이다.
(f) 예시적인 구현예
특정 구현예에서, 바이러스 내성을 갖는 포유동물 세포주는 CHO 세포주이다. 바이러스 내성 CHO 세포주는, 마우스의 미세 바이러스 (MVM)에 의한 감염 (마우스 미세 바이러스 (MMV) 또는 설치류 프로토파보바이러스 1로 또한 알려짐) 및/또는 포유동물 레오바이러스 3에 의한 감염에 대해 내성이 있을 수 있다. 특히, 유전적으로로 변형된 CHO 세포주는, 비변형된 친계 CHO 세포주와 비교하여, MVM 또는 레오바이러스-3 감염에 대해 증가된 내성을 갖는다. 일부 구현예에서, 비변형된 친계 세포주는 CHO (GS -/-) 세포주이다.
바이러스 내성 CHO 세포주는 하기를 암호화하는 적어도 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함한다: COSMC, Slc35A1, C1GalT1, St3Gal1, St3Gal2, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal5, 및/또는 St3Gal6. 일부 구현예에서, COSMC, Slc35A1, C1GalT1, St3Gal1, St3Gal2, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal5, 및/또는 St3Gal6를 암호화하는 염색체 서열의 모든 사본은 CHO 세포주 내에서 비활성화 또는 녹아웃된다. 다른 구현예에서, COSMC, Slc35A1, C1GalT1, St3Gal1, St3Gal2, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal5, 및/또는 St3Gal6를 암호화하는 비활성화된 염색체 서열을 포함하는 CHO 세포는 추가로 Mgat1, Mgat2, Mgat3, Mgat4, 및/또는 Mgat5를 암호화하는 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, St3Gal1, St3Gal2, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal5, 및/또는 St3Gal6를 암호화하는 비활성화된 염색체 서열을 포함하는 CHO 세포는 추가로 St6Gal 1, St6Gal 2, St6GalNac1, St6GalNac2, St6GalNac3, ST6GalNac4, St6GalNac5, 및/또는 St6GalNac6를 과발현하도록 조작된다.
(II) 바이러스 오염을 감소 또는 예방하는 방법
본 개시내용의 또 다른 양태는 재조합 단백질 산물의 바이러스 오염을 감소 또는 예방하거나, 또는 생물학적 생산계의 바이러스 오염의 위험을 감소시키기 위한 방법을 포괄한다. 일반적으로, 상기 방법은 적어도 하나의 바이러스의 진입 및/또는 전파가 감소 또는 제거되는 조작된 포유동물 세포주를 제공하는 단계; 및 재조합 단백질의 생산을 위하여 상기 세포주를 사용하는 단계를 포함한다. 조작된 포유동물 세포주는 상기 섹션 (I)에서 구체화된다. 조작된 포유동물 세포주는, 비변형된 친계 세포주와 비교하여, 바이러스 감염에 대한 증가된 내성을 나타낸다. 조작된 포유동물 세포주는 섹션 (I)(c)에 기술된 바이러스에 내성을 나타낸다. 적절한 재조합 단백질은 섹션 (I)(d)에 기술된다. 재조합 단백질을 생산 또는 제조하기 위한 수단은 본 분야에 달 알려져 있다 (참고: 예를 들면: “Biopharmaceutical Production Technology”, Subramanian (ed), 2012, Wiley-VCH; ISBN: 978-3-527-33029-4). 특정 구현예에서, 조작된 포유동물 세포주는 유전적으로 변형되어 적어도 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하고, 이로써 상기 세포주는 바이러스 감염에 내성이 있다.
일반적으로, 본원에 개시된 조작된 포유동물 세포주는 발효기 또는 기타 생체생산 용기 내에서 복제하기 위한 바이러스의 능력을 감소시키고, 이로써 복제가능한 바이러스가 미량, 또는, 이상적으로는, 산업 표준 최적 실시방법으로 검출 불가능한 수준이 된다. 적절한 방법은 하기를 포함한다: 핵산 검출 방법 (예를 들어, 바이러스 핵산을 검출하기 위한 서던 핵산 블로팅 검정, 바이러스 핵산을 검출하기 위한 PCR 또는 RT-PCR, 시퀀싱 방법, 등), 항체-기반 기술 (예를 들어, 항-바이러스 단백질 항체를 사용한 웨스턴 면역검정 기술, ELISA 방법, 등), 및 현미경 기술 (예를 들어, 세포변성 효과 검정, 바이러스 입자를 검출하기 위한 전자 현미경, 등).
(III) 바이러스 내성 세포주의 제조 방법
본 개시내용의 또 다른 양태는 섹션 (I)(a)(i)에 상기 상세화된 바와 같이, 변경된 세포 표면 수용체를 갖는 바이러스 내성 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 글리칸 쇄의 합성과 연관된 효소 또는 단백질을 암호화하는 염색체 서열은 바이러스 내성 세포주를 생산하는 다양한 기술을 사용하여 녹다운 또는 녹아웃될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 내성 세포주는 표적화 엔도뉴클레아제-매개 게놈 변형 공정에 의하여 제조될 수 있다. 다른 구현예에서, 바이러스 내성 세포주는 RNA 간섭-매개 기전에 의하여 제조될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 바이러스 내성 세포주는 부위-특이적 재조합 시스템, 무작위 돌연변이생산, 또는 본 분야에 알려진 다른 방법에 의하여 제조될 수 있다.
(a) 표적화 엔도뉴클레아제-매개 게놈 편집
표적화 엔도뉴클레아제는 관심 특정 염색체 서열을 변형 (즉, 비활성화 또는 변경)하기 위하여 사용될 수 있다. 특정 염색체 서열은, 표적화 엔도뉴클레아제 또는 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산을 세포에 도입함으로써 비활성화될 수 있으며, 이는 특정 염색체 서열을 표적화한다. 일 구현예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 특정 염색체 서열을 인식하고, 이에 결합하고, 비-동형 말단-결합 (NHEJ) 보수 공정에 의하여 보수된 이중-가닥 파단을 도입한다. NHEJ가 적어도 하나의 뉴클레오티드의 실수 유발(error prone)이고, 결실, 삽입, 및/또는 치환이 발생할 수 있으므로, 이로써 염색체 서열의 해독 틀을 파괴하여 단백질 산물이 생산되지 않는다. 다른 구현예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 또한 표적화된 염색체 서열의 부분과 실질적인 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 공-도입함에 의하여 동형 재조합 반응을 통한 염색체 서열을 변경하는데 또한 사용할 수 있다. 표적화 엔도뉴클레아제에 의하여 도입된 이중 가닥 파단은 상동성-지시된 보수 공정에 의하여 보수되며, 이로써 염색체 서열은 변화 또는 변경된 염색체 서열을 초래하는 방식으로 폴리뉴클레오티드와 상호교환된다.
다양한 표적화 엔도뉴클레아제는 관심 염색체 서열(들)을 변형하기 위하여 사용될 수 있다. 표적화 엔도뉴클레아제는 천연-발생 단백질 또는 조작된 단백질일 수 있다. 적절한 표적화 엔도뉴클레아제는 비제한적으로 하기를 포함할 수 있다: 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제, 전사 활성제-유사 효과기 (TALE) 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제, 부위-특이적인 엔도뉴클레아제, 또는 인공 표적화된 DNA 이중 가닥 절단 유도제.
아연 핑거 뉴클레아제
*특정 구현예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)일 수 있다. ZFN은 특정 표적화된 서열에 결합하고, 상기 표적화된 서열에 이중-가닥 파단을 도입한다. 전형적으로, ZFN은 DNA 결합 도메인 (즉, 아연 핑거) 및 절단 도메인 (즉, 뉴클레아제)를 포함하고, 이의 각각은 하기에 기술된다.
DNA 결합 도메인 DNA 결합 도메인 또는 아연 핑거는 선택된 임의의 핵산 서열을 인식하고 이에 결합하도록 조작된다. (문헌참조: 예를 들어, Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Zhang et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(43):33850-33860; Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:702-708; 및 Santiago et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:5809-5814). 조작된 아연 핑거 결합 도메인은, 천연-발생 아연 핑거 단백질과 비교하여, 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 비제한적으로, 합리적인 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함한다. 합리적인 선택은 예를 들어, 이중항, 삼중항, 및/또는 사중항 뉴클레오티드 서열 및 개별 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하고, 여기서 각 이중, 삼중, 또는 사중 뉴클레오티드 서열은 특정 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 연관된다. 예를 들어 다음을 참조: 미국 특허 번호 6,453,242 및 6,534,261 (이의 전문이 본원에 참조로서 인용됨). 예로서, 미국 특허 6,453,242에서 기술된 알고리즘은 사전 선택된 서열을 표적화하는 아연 핑거 결합 도메인을 설계하기 위하여 사용될 수 있다. 대안적인 방법, 예컨대 비-퇴화 인식 코드 표를 사용한 합리적 설계는 특정 서열을 표적화하는 아연 핑거 결합 도메인을 설계하도록 또한 사용될 수 있다 (Sera et al. (2002) Biochemistry 41:7074-7081). DNA 서열 내의 잠재적 표적 부위를 동정하기 위한, 공공 이용가능한 웹기반 도구, 뿐만 아니라 아연 핑거 결합 도메인을 설계하는 것은 본 분야에 알려져 있다. 예를 들어, DNA 서열 내의 잠재적 표적 부위를 동정하기 위한 도구는 하기에서 찾아볼 수 있다: http://www.zincfingertools.org. 아연 핑거 결합 도메인을 설계하기 위한 도구는 하기에서 찾아볼 수 있다: http://zifit.partners.org/ZiFiT. (또한, 참고: Mandell et al. (2006) Nuc. Acid Res. 34:W516-W523; Sander et al. (2007) Nuc. Acid Res. 35:W599-W605.)
아연 핑거 결합 도메인은 길이 범위가 약 3개 뉴클레오티드 내지 약 21개 뉴클레오티드인 DNA 서열을 인식하고 이에 결합하도록 설계될 수 있다. 일 구현예에서, 아연 핑거 결합 도메인은 길이 범위가 약 9개 내지 약 18개 뉴클레오티드인 DNA 서열을 인식하고 이에 결합하도록 설계될 수 있다. 일반적으로, 본원에 사용된 아연 핑거 뉴클레아제의 아연 핑거 결합 도메인은 적어도 3개의 아연 핑거 인식 영역 또는 아연 핑거를 포함하고, 각 아연 핑거는 3개의 뉴클레오티드에 결합한다. 일 구현예에서, 아연 핑거 결합 도메인은 4개의 인식 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 아연 핑거 결합 도메인은 5개의 인식 영역을 포함한다. 또한 다른 구현예에서, 아연 핑거 결합 도메인은 6개의 인식 영역을 포함한다. 아연 핑거 결합 도메인은 임의의 적절한 표적 DNA 서열에 결합하도록 설계될 수 있다. 예를 들어 다음을 참조: 미국 특허 번호 6,607,882; 6,534,261 및 6,453,242, (개시내용의 전문이 본원에 참조로서 인용됨).
아연 핑거 인식 영역을 선택하는 예시적인 방법은 파지 디스플레이 및 2-혼성체 시스템을 포함하며, 이는 하기에 기술된다: 미국 특허 번호 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; 뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237, (이의 각각의 전문이 본원에 참조로서 인용됨). 또한, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 개선은 예를 들면, WO 02/077227에 기술되어 있으며, 이의 전체 개시내용은 본원에 참조로 편입된다.
융합 단백질의 설계 및 작제를 위한 방법 및 아연 핑거 결합 도메인 (및 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)은 본 분야의 숙련가에게 알려져 있으며, 하기에 상세히 기술된다: 예를 들어, 미국 특허 번호 7,888,121 (이의 전문이 본원에 참조로서 인용됨). 아연 핑거 인식 영역 및/또는 다중-핑거 아연 핑거 단백질은 예를 들어, 길이가 5개 이상의 아미노산인 링커를 포함하는 적절한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. (참조: 미국 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949, 길이가 6개 이상의 아미노산의 링커 서열의 비제한적인 예시로, 이의 개시내용 전문이 본원에 참조로서 인용됨). 본원에 기술된 아연 핑거 결합 도메인은 단백질의 개별 아연 핑거 사이의 적절한 링커의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 핵 국지화 신호 또는 서열 (NLS)를 추가로 포함한다. NLS는 염색체 내 표적 서열에서 이중 가닥을 도입하기 위하여 핵으로 아연 핑거 뉴클레아제 단백질의 표적화를 촉진하는 아미노산 서열이다. 핵 국지화 신호는 본 분야에 알려져 있다. (문헌참조: 예를 들어, Makkerh et al. (1996) Current Biology 6:1025-1027).
절단 도메인 아연 핑거 뉴클레아제는 또한 절단 도메인을 포함한다. 아연 핑거 뉴클레아제의 절단 도메인 부분은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 엔도뉴클레아제의 비제한적인 예시는 비제한적으로 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소(homing) 엔도뉴클레아제를 포함한다. 예를 들어, 하기를 참조: New England Biolabs Catalog 또는 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. DNA를 절단하는 추가의 효소가 알려져 있다 (예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두(mung bean) 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코칼 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제). (또한, 참고: Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). 이러한 효소 중 하나 이상 (이의 기능성 단편)은 절단 도메인의 공급원으로 사용될 수 있다.
절단 도메인은 또한, 절단 활성을 위한 이량체화를 필요로하는, 상기 기술된 효소 또는 이의 부분으로부터 유래될 수 있다. 각 뉴클레아제가 활성 효소 이량체의 단량체를 포함하므로, 2개의 아연 핑거 뉴클레아제는 절단을 위하여 요구될 수 있다. 대안적으로, 단일 아연 핑거 뉴클레아제는 활성 효소 이량체를 생산하는 단량체 둘 모두를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이,“활성 효소 이량체”는 핵산 분자를 절단할 수 있는 효소 이량체이다. 2개의 절단 단량체는 상동한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능적 단편)으로부터 유래하거나, 각 단량체는 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능적 단편)으로부터 유래될 수 있다.
2개의 절단 단량체가 활성 효소 이량체를 형성하기 위해 사용될 때, 2개 아연 핑거 뉴클레아제에 대한 인식 부위는 바람직하게 배치되어, 상기 2개 아연 핑거 뉴클레아제의 이의 각각의 인식 부위에 대한 결합이 서로에 대래 공간적 배향 내에 절단 단량체를 위치시켜 상기 절단 단량체가 활성 효소 이량체를, 예를 들어 이량체화에 의하여 형성하도록 한다. 결과로서, 인식 부위의 근거리 엣지(edge)는 약 5 내지 약 18개 뉴클레오티드에 의하여 분리될 수 있다. 예를 들어, 근거리 엣지는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 뉴클레오티드에 의하여 분리될 수 있다. 그러나, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍의 임의의 진정수(integral number)는 2개 인식 부위 (예컨대 약 2 내지 약 50개 이상의 뉴클레오티드 쌍) 사이에서 개재될 수 있다. 아연 핑거 뉴클레아제의 인식 부위의 근거리 엣지, 예컨대 예로 본원에 자세히 기술된 것들은 6개 뉴클레오티드에 의하여 분리될 수 있다. 일반적으로, 절단 부위는 인식 부위 사이에 위치한다.
제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 많은 종 내에서 존재하고, DNA에 대한 서열-특이적 결합 (인식 부위에서의) 및 결합 부위에서, 또는 이에 근접한 위치에서 DNA의 절단이 가능하다. 특정 제한 효소 (예를 들어, IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하고 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 갖는다. 예를 들어, 유형 IIS 효소 FokI는 일 가닥 상에서 이의 인식 부위로부터의 9개 뉴클레오티드에서, 그리고 다른 가닥 상에서 이의 인식 부위로부터의 13개 뉴클레오티드에서, DNA의 이중 가닥 절단을 촉진한다. 예를 들어 다음을 참조, 미국 특허 번호 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 또한 Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31978-31982을 참고한다. 따라서, 아연 핑거 뉴클레아제는, 조작될 수 있거나 조작될 수 없는, 적어도 하나의 유형 IIS 제한 효소 및 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인으로부터의 절단 부위를 포함할 수 있다. 예시적인 유형 IIS 제한 효소는, 예를 들면, 국제 공보 WO 07/014,275에 기술되며, 이것의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 편입된다. 추가의 제한 효소는 또한 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 함유하고, 이들은 또한 본 개시내용에 의하여 고려된다. (문헌참조: 예를 들어, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420).
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한, 예시적인 유형 IIS 제한 효소는 FokI이다. 이러한 특정 효소는 이량체로서 활성이다 (Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10, 570-10, 575). 따라서, 본 개시내용의 목적을 위하여, 아연 핑거 뉴클레아제 내에서 사용된 FokI 효소의 부분은 절단 단량체로 고려된다. 따라서, FokI 절단 도메인을 사용한 표적화된 이중 가닥 절단에 대하여, 각각 FokI 절단 단량체를 포함하는, 2개 아연 핑거 뉴클레아제는 활성 효소 이량체를 재구성하기 위하여 사용될 수 있다. 대안적으로, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개 FokI 절단 단량체를 함유하는 단일 폴리펩티드가 또한 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 절단 도메인은 동형이량체화를 최소화 또는 예방하는 하나 이상의 조작된 절단 단량체를 포함한다. 비제한적인 예로서, FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538에서의 아미노산 잔기는 모두 FokI 절단 절반-도메인의 이량체화에 영향을 주기 위한 표적이다. 오블리게이트(obligate) 이종이량체를 형성하는 FokI의 예시적인 조작된 절단 단량체는, 제1 절단 단량체가 FokI의 아미노산 잔기 위치 490 및 538에서 돌연변이를 포함하고, 제2 절단 단량체가 아미노산 잔기 위치 486 및 499에서 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다.
따라서, 조작된 절단 단량체의 일 구현예에서, 아미노산 위치 490에서의 돌연변이가 Glu (E)를 Lys (K)로 대체하고, 아미노산 잔기 538에서의 돌연변이가 Iso (I)를 Lys (K)로 대체하고, 아미노산 잔기 486에서의 돌연변이가 Gln (Q)를 Glu (E)로 대체하고; 그리고 아미노산 위치 499에서의 돌연변이가 Iso (I)를 Lys (K)로 대체한다. 특히, 조작된 절단 단량체는 하기에 의하여 제조될 수 있다: 위치 490을 E에서 K로, 538을 I에서 K로, 일 절단 단량체에서 변이시켜 조작된 절단 단량체 지정된 "E490K:I538K”를 생산하는 것; 및 위치 486을 Q에서 E로, 499를 I에서 K로, 다른 절단 단량체에서 변이시켜 조작된 절단 단량체 지정된 "Q486E:I499K”를 생산하는 것. 상기 기술된 조작된 절단 단량체는, 비정상 절단이 최소화 또는 제거되는 오블리게이트 이종이량체 돌연변이체이다. 조작된 절단 단향체는 적절한 방법을 사용하여, 예를 들어, 하기에 기술된 바와 같이 야생형 절단 단량체 (FokI)의 부위-지시된 돌연변이생산에 의하여, 제조될 수 있다: 미국 특허 번호 7,888,121 (이의 전문이 본원에 인용됨).
추가 도메인 일부 구현예에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 적어도 하나의 핵 국지화 서열 (NLS)를 추가로 포함한다. NLS는, 염색체 내의 표적 서열에서의 이중 가닥 파단을 도입하기 위하여, 아연 핑거 뉴클레아제 단백질의 핵으로의 표적화를 촉진하는 아미노산 서열이다. 핵 국지화 신호는 본 분야에 알려져 있다 (참고, 예를 들어: Lange et al., J. Biol. Chem., 2007, 282:5101-5105). 예를 들어, 일 구현예에서, NLS는 단독(monopartite) 서열, 예컨대 PKKKRKV (서열 번호: 1) 또는 PKKKRRV (서열 번호: 2)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, NLS는 이분(bipartite) 서열일 수 있다. 또한 다른 구현예에서, NLS는 KRPAATKKAGQAKKKK (서열 번호: 3)일 수 있다. NLS은 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치내에 위치할 수 있다.
추가 구현예에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 적어도 하나의 세포-침투 도메인을 또한 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 세포-침투 도메인은 HIV-1 TAT 단백질로부터 유래된 세포-침투 펩티드 서열일 수 있다. 예시로서, TAT 세포-침투 서열은 GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (서열 번호: 4)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 세포-침투 도메인은 TLM (PLSSIFSRIGDPPKKKRKV; 서열 번호: 5), 인간 간염 B 바이러스로부터 유래된 세포-침투 펩티드 서열 일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 세포-침투 도메인은 MPG (GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV; 서열 번호: 6 또는 GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; 서열 번호: 7)일 수 있다. 추가 구현예에서, 세포-침투 도메인은 Pep-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV; 서열 번호: 8), VP22, 헤르페스 바이러스로부터 유래된 세포 침투 펩티드 또는 폴리아르기닌 펩티드 서열일 수 있다. 세포-침투 도메인은 아연 핑거 뉴클레아제의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치내에 위치할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 적어도 하나의 마커 도메인을 또한 포함할 수 있다. 마커 도메인의 비제한적인 예시는 형광 단백질, 정제 태그 및 에피토프 태그를 포함한다. 일 구현예에서, 마커 도메인은 형광 단백질일 수 있다. 적절한 형광 단백질의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 녹색 형광 단백질 (예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, EGFP, Emerald, 아자미 그린(Azami Green), 단량체 아자미 그린(Monomeric Azami Green), CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), 황색 형광 단백질 (예를 들어, YFP, EYFP, 시트린(Citrine), 비너스(Venus), YPet, PhiYFP, ZsYellow1), 청색 형광 단백질 (예를 들어, EBFP, EBFP2, 남동석(Azurite), mKalama1, GFPuv, 사파이어(Sapphire), T-사파이어(T-sapphire)), 청록색(cyan) 형광 단백질 (예를 들어, ECFP, 세룰리언(Cerulean), CyPet, AmCyan1, 미도리시-시안(Midoriishi-Cyan)), 적색 형광 단백질 (mKate, mKate2, mPlum, DsRed monomer, mCherry, mRFP1, DsRed-익스프레스(Express), DsRed2, DsRed-단량체(Monomer), HcRed-텐덤(Tandem), HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred), 및 주황색 형광 단백질 (mOrange, mKO, 쿠사비라-오렌지(Kusabira-Orange), 단량체 쿠사비라-오렌지(Monomeric Kusabira-Orange), mTangerine, tdTomato) 또는 임의의 다른 적절한 형광 단백질. 또 다른 구현예에서, 마커 도메인은 정제 태그 및/또는 에피토프 태그일 수 있다. 적절한 태그는 비제한적으로 하기를 포함한다: 글루타티온-S-전달효소 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토스 결합 단백질, 티오레독신 (TRX), 폴리(NANP), 직렬 친화성 정제 (TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, 소프트태그(Softag) 1, 소프트태그(Softag) 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 비오틴 카복실 담체 단백질 (BCCP), 및 칼모둘린. 마커 도메인은 아연 핑거 뉴클레아제의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치내에 위치할 수 있다.
마커 도메인은 2A 펩티드에 의한 아연 핑거 뉴클레아제에 연결될 수 있다 (Szymczak et al., 2004, Nat. Biotechnol., 589(5):589-94). 2A 펩티드는 본래 양성 가닥 RNA 바이러스를 특징으로 하며, 이는 성숙 개별 단백질로의 번역 동안 “절단된” 다단백질을 생산한다. 더욱 특히, 2A 펩티드 영역 (~20개 아미노산)은 이의 C-말단에서 “절단”을 매개하여 다단백질의 다운스트림 영역으로부터 그 자신을 방출시킨다. 일반적으로, 2A 펩티드 서열은 글리신 및 프롤린 잔기로 종료된다. 2A 펩티드의 번역 동안, 리보솜은 글리신 잔기 후 휴지하여, 발생기 폴리펩티드 쇄의 방출을 초래한다. 번역은, 2A 서열의 프롤린 잔기가 다운스트림 단백질의 제1 아미노산이 되면서 재개된다.
(ii) CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제
다른 구현예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제일 수 있다. CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제는 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제이다. 세균 및 고세균은, 침입 바이러스 또는 플라스미드를 검출 및 파괴하기 위한, CRISPR (클러스터 일정 산재 짧은 회문 반복부) 및 Cas (CRISPR-연관된) 단백질을 사용한 RNA-기반 적응성 면역계로 발달되었다. CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제는 표적-특이적 합성 가이드 RNA를 제공함에 의하여 표적화된 부위-특이적 이중 가닥 파단을 도입하도록 프로그래밍될 수 있다 (Jinek et al., 2012, Science, 337:816-821).
엔도뉴클레아제 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제는 CRISPR/Cas 유형 I, 유형 II, 또는 유형 III 시스템으로부터 유래될 수 있다. 적절한 CRISPR/Cas 단백질의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (또는 CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (or CasA), Cse2 (or CasB), Cse3 (or CasE), Cse4 (or CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3,Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csz1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cu1966.
일 구현예에서, CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제는 유형 II CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 예시적인 구현예에서, CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질로부터 유래된다. Cas9 단백질은 하기로부터 유래할 수 있다: 스트렙토코쿠스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 테모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus sp.), 노르카르디옵시스 닷손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포란지움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포란지움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바실러스 악시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루엑키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 마이크로스실라 마리나(Microscilla marina), 버크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종(Polaromonas sp.), 크로코페라 왓소니(Crocosphaera watsonii), 시아노테체 종 (Cyanothece sp.), 마이크로사이스티스 에어루기노사(Microcystis aeruginosa), 사이네초코쿠스 종(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시(Ammonifex degensii), 칼디세룰로시룹토르 베크시(Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데설포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 테모필러스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마컬럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 악시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 악시디티오바실러스 페록시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노섬(Allochromatium vinosum), 마리노박터 종 (Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 왓소니 (Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플랑크티스 (Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미페르 (Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼 (Methanohalobium evestigatum), 아나바에나 바리알비리스 (Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미제나 (Nodularia spumigena), 노스톡 종(Nostoc sp.), 아트로스피라 맥시마 (Arthrospira maxima), 아트로스피라 플레이텐시스 (Arthrospira platensis), 아트로스피라 종(Arthrospira sp.), 링비아 종 (Lyngbya sp.), 마이크로콜러스 크토노플라스테스 (Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 종 (Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 테모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 또는 아카리오콜리스 마리나(Acaryochloris marina). 하나의 특정 구현예에서, Cas9 단백질은 스트렙토코쿠스 파이오제네스로부터 유래된다.
일반적으로, CRISPR/Cas 단백질은 적어도 하나의 RNA 인식 및/또는 RNA 결합 도메인을 포함한다. RNA 인식 및/또는 RNA 결합 도메인은 가이드 RNA와 상호작용하고, 이로써 CRISPR/Cas 단백질은 특정 염색체 또는 염색체 서열 (즉, 표적 부위)에 지시된다. CRISPR/Cas 단백질은 또한 하기를 포함할 수 있다: 뉴클레아제 도메인 (즉, DNase 또는 Rnase 도메인), DNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 이량체화 도메인, 뿐만 아니라 기타 도메인.
CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제는 하기로부터 유도도될 수 있다: 야생형 CRISPR/Cas 단백질, 변형된 CRISPR/Cas 단백질, 또는 변형된 CRISPR/Cas 단백질의 야생형의 단편. CRISPR/Cas 단백질은 핵산 결합 친화도 및/또는 특이성을 증가시키고, 효소 활성을 변경하고, 및/또는 단백질의 또 다른 특성을 변경하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, CRISPR/Cas 단백질의 뉴클레아제 (즉, DNase, Rnase) 도메인은 변형, 결실, 또는 비활성화될 수 있다. CRISPR/Cas 단백질은 단백질의 기능에 필수적인 도메인을 제거하기 위하여 절단될 수 있다. CRISPR/Cas 단백질은 또한, CRISPR/Cas 단백질과 융합된 단백질 또는 효과기 도메인의 활성을 최적화하도록 절단 또는 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제는 야생형 Cas9 단백질 또는 이의 단편으로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서, CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제는 변형된 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, Cas9 단백질의 아미노산 서열은 변형되어 단백질의 하나 이상의 특성 (예컨대, 뉴클레아제 활성, 친화성, 안정성 등)을 변경할 수 있다. 대안적으로, RNA-유도된 절단과 연관되지 않은 Cas9 단백질의 도메인은 단백질로부터 제거될 수 있으며, 이로써 변형된 Cas9 단백질은 야생형 Cas9 단백질보다 작다.
일반적으로, Cas9 단백질은 적어도 2개의 뉴클레아제 (즉, DNase) 도메인을 포함한다. 예를 들어, Cas9 단백질은 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. RuvC 및 HNH 도메인은 함께 작용하여 단일 가닥을 절단하고, DNA 내 이중 가닥을 제조한다 (Jinek et al., Science, 337: 816-821). 일 구현예에서, CRISPR-기반 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질로부터 유래되고, 2 기능 뉴클레아제 도메인을 포함한다.
천연 발생 CRISPR/Cas 시스템에 의하여 인식된 표적 부위의 길이는 전형적으로 약 14-15 bp이다 (Cong et al., Science, 339:819-823). 가이드 RNA의 5' 말단에 상보적인 서열 (즉, 프로토스페이서 서열로 불림) 후에 (3’또는 다운스트림) 공통 서열이 오는 것을 제외하고, 표적 부위는 순서 제한을 갖지 않는다. 이러한 공통 서열은 프로토스페이서 인접 모티프 (또는 PAM)으로 또한 알려져 있다. PAM의 예시는 비제한적으로 하기를 포함한다: NGG, NGGNG, 및 NNAGAAW (여기서 N은 임의의 뉴클레오티드로 정의되고, W는 A 또는 T로 정의된다). 전형적 길이에서, 표적 부위의 오직 약 5-7%가 표적 게놈 내에서 특이적일 적이며, 이는 오프 타겟 효과가 유의미할 수 있다는 것을 나타낸다. 표적 부위의 길이는 2건의 결합 사건을 요구함에 의하여 확대될 수 있다. 예를 들어, CRISPR-기반 엔도뉴클레아제는 변형되어, 이로써 그들이 이중-가닥 서열의 한 가닥만을 절단할 수 있다 (즉, 틈내기효소(nickases)로 전환됨). 따라서, 2개의 상이한 가이드 RNA와 조합한, CRISPR-기반 틈내기효소의 사용은 표적 부위의 길이를 필수적으로 2배로 할 것이며, 한편 여전히 이중 가닥 파괴를 초래할 것이다.
일부 구현예에서, 따라서, Cas9-유래된 엔도뉴클레아제는 적어도 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인 (RuvC-유사 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인)을 함유하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, Cas9-유도된 단백질은 변형될 수 있으며, 이로써 뉴클레아제 도메인 중 하나는 결실 또는 변이되어 더이상 기능적이지 않다 (즉, 도메인은 뉴클레아제 활성이 없다). 뉴클레아제 도메인 중 하나가 비활성화되는 일부 구현예에서, Cas9-유도된 단백질은 이중 가닥 핵산으로 틈을 도입 (그러한 단백질은 “틈내기효소”로 지칭됨)할 수 있으나, 이중 가닥 DNA를 절단할 수는 없다. 예를 들어, RuvC-유사 도메인 내의 아스파르트산염의 알라닌 (D10A)로의 전환은 Cas9-유도된 단백질을 “HNH” 틈내기효소로 전환시킨다. 마찬가지로, HNH 도메인 내에서의 히스티딘의 알라닌 (H840A)으로의 전환 (일부 경우에서, 히스티딘은 위치 839에 위치됨)은 Cas9-유도된 단백질을 “RuvC” 틈내기효소로 전환시킨다. 따라서, 예를 들어, 일 구현예에서, Cas9-유도된 틈내기효소는 RuvC-유사 도메인 내에서 아스파르트산염의 알라닌 (D10A)으로의 전환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, Cas9-유도된 틈내기효소는 HNH 도메인 내에서 히스티딘의 알라닌 (H840A 또는 H839A) 전환을 갖는다. Cas9-유도된 틈내기효소의 RuvC-유사 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인은 잘 알려진 방법, 예컨대 부위-지시적 돌연변이생산, PCR-매개 돌연변이생산, 및 총 유전자 합성, 뿐만 아니라 본 분야에서 알려진 다른 방법을 사용하여 변형될 수 있다.
추가 도메인 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 또는 틈내기효소는 일반적으로 적어도 하나의 핵 국지화 신호 (NLS)를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, NLS는 단독(monopartite) 서열, 예컨대 PKKKRKV (서열 번호: 1) 또는 PKKKRRV (서열 번호: 2)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, NLS는 이분(bipartite) 서열일 수 있다. 또한 다른 구현예에서, NLS는 KRPAATKKAGQAKKKK (서열 번호:3)일 수 있다. NLS은 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치내에 위치할 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 또는 틈내기효소는 적어도 하나의 세포-침투 도메인을 또한 포함할 수 있다. 세포-침투 도메인은 HIV-1 TAT 단백질로부터 유래된 세포-침투 펩티드 서열일 수 있다. 예시로서, TAT 세포-침투 서열은 GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (서열 번호: 4)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 세포-침투 도메인은 TLM (PLSSIFSRIGDPPKKKRKV; 서열 번호: 5), 인간 간염 B 바이러스로부터 유래된 세포-침투 펩티드 서열 일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 세포-침투 도메인은 MPG (GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV; 서열 번호: 6 또는 GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; 서열 번호: 7)일 수 있다. 추가 구현예에서, 세포-침투 도메인은 Pep-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV; 서열 번호: 8), VP22, 헤르페스 바이러스로부터 유래된 세포 침투 펩티드 또는 폴리아르기닌 펩티드 서열일 수 있다. 세포-침투 도메인은 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치내에 위치할 수 있다.
또 다른 구현예에서, CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 또는 틈내기효소는 적어도 하나의 마커 도메인을 또한 포함할 수 있다. 마커 도메인의 비제한적인 예시는 형광 단백질, 정제 태그 및 에피토프 태그를 포함한다. 일 구현예에서, 마커 도메인은 형광 단백질일 수 있다. 적절한 형광 단백질의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 녹색 형광 단백질 (예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, EGFP, 에메랄드(Emerald), 아자미 그린(Azami Green), 단량체 아자미 그린(Monomeric Azami Green), CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), 황색 형광 단백질 (예를 들어, YFP, EYFP, 시트린(Citrine), 비너스(Venus), YPet, PhiYFP, ZsYellow1), 청색 형광 단백질 (예를 들어, EBFP, EBFP2, 남동석(Azurite), mKalama1, GFPuv, 사파이어(Sapphire), T-사파이어(T-sapphire)), 청록색(cyan) 형광 단백질 (예를 들어, ECFP, 세룰리언(Cerulean), CyPet, AmCyan1, 미도리시-시안(Midoriishi-Cyan)), 적색 형광 단백질 (mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체, mCherry, mRFP1, DsRed-익스프레스(Express), DsRed2, DsRed-단량체(Monomer), HcRed-텐덤(Tandem), HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred), 및 주황색 형광 단백질 (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, 단량체 쿠사비라-오렌지(Monomeric Kusabira-Orange), mTangerine, tdTomato) 또는 임의의 다른 적절한 형광 단백질. 또 다른 구현예에서, 마커 도메인은 정제 태그 및/또는 에피토프 태그일 수 있다. 적절한 태그는 비제한적으로 하기를 포함한다: 글루타티온-S-전달효소 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토스 결합 단백질, 티오레독신 (TRX), 폴리(NANP), 직렬 친화성 정제 (TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, 소프트태그(Softag) 1, 소프트태그(Softag) 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 비오틴 카복실 담체 단백질 (BCCP), 및 칼모둘린. 마커 도메인은 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치내에 위치할 수 있다. 마커 도메인은 2A 펩티드에 의한 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제에 연결될 수 있다 (Szymczak et al., 2004, Nat. Biotechnol., 589(5):589-94).
가이드 RNA . CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제는 가이드 RNA에 의하여 표적화된 부위로 안내된다. 가이드 RNA는, 염색체 내 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 또는 틈내기효소가 이중 가닥 서열의 적어도 하나의 가닥을 절단하는 부위에서, CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 및 표적 부위 둘 모두와 상호작용한다. 가이드 RNA는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 또는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제와 함께 세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA 둘 모두를 암호화하는 DNA는 세포 내로 도입될 수 있다.
가이드 RNA는 하기와 같은 3개의 영역을 포함한다: 표적 부위에서의 서열에 상보적인 5' 말단에서의 제1 영역, 줄기 루프 구조를 형성하는 제2 내부 영역, 및 필수적으로 단일 가닥인 것으로 남아있는 제3 3’영역. 각 가이드 RNA의 제1 영역은 상이하며, 이로써 각 가이드 RNA는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 또는 틈내기효소를 특정 표적 부위로 유도한다. 각 가이드 RNA의 제2 및 제3 영역 (또한 스캐폴드 영역으로 지칭됨)은 모든 가이드 RNA 내에서 상동할 수 있다.
가이드 RNA의 제1영역은 표적 부위에서의 서열 (즉, 프로토스페이서 서열)에 상보적이며, 이로써 상기 가이드 RNA의 제1 영역은 표적 부위에서의 서열과 염기쌍을 이룬다. 일반적으로, 가이드 RNA의 제1 영역의 서열 및 표적 부위에서의 서열 사이에 미스매치가 없다 (즉, 상보성이 완전하다). 다양한 구현예에서, 가이드 RNA의 제1 영역은 약 10개 뉴클레오티드 내지 약 25개 초과의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA의 제1 영역 및 염색체 서열 내의 표적 부위 사이의 염기 짝짓기 영역은 길이가 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 또는 25 초과의 뉴클레오티드일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 가이드 RNA의 제1 영역은 길이가 약 19 또는 20개 뉴클레오티드이다.
가이드 RNA는 또한 2차 구조를 형성하는 제2 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 2차 구조는 줄기 (또는 헤어핀) 및 루프를 포함한다. 루프 및 줄기의 길이는 가변할 수 있다. 예를 들어, 루프는 길이의 범위가 약 3 내지 약 10개의 뉴클레오티드일 수 있고, 줄기는 길이의 범위가 약 6 내지 약 20개의 염기쌍일 수 있다. 줄기는 1 내지 약 10개 뉴클레오티드의 하나 이상의 벌지를 포함할 수 있다. 따라서, 제2 영역의 전체 길이는 길이 범위가 약 16 내지 약 60개 뉴클레오티드일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 루프는 길이가 약 4개 뉴클레오티드이고, 줄기는 약 12개 염기쌍을 포함한다.
가이드 RNA는 또한 필수적으로 단일 가닥으로 남아있는 3' 말단에서의 제3 영역을 포함한다. 따라서, 제3 영역은 관심 세포 내에서 임의의 염색체 서열에 상보성을 갖지 않으며, 가이드 RNA의 나머지에 대해서도 상보성을 갖지 않는다. 제3 영역의 길이는 가변할 수 있다. 일반적으로, 제3 영역은 길이가 약 4개 초과의 뉴클레오티드이다. 예를 들어, 제3 영역의 길이는 길이 범위가 약 5 내지 약 60개 뉴클레오티드일 수 있다.
가이드 RNA의 제2 및 제3 영역 (또는 스캐폴드)의 조합된 길이는 길이 범위가 약 30 내지 약 120개 뉴클레오티드일 수 있다. 일 양태에서, 가이드 RNA의 제2 및 제3 영역의 조합된 길이는 길이 범위가 약 70 내지 약 100개 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 모든 3개 영역을 포함하는 1개 분자를 포함한다. 다른 구현예에서, 가이드 RNA는 2개의 개별 분자를 포함한다. 제1 RNA 분자는 가이드 RNA의 제1 영역 및 가이드 RNA의 제2 영역의 “줄기”의 일 절반을 포함할 수 있다. 제2 RNA 분자는 가이드 RNA의 제2 영역 및 가이드 RNA의 제3 영역의 “줄기”의 다른 절반을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 분자는 각각 서로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 분자는 각각 기능적 가이드 RNA를 형성하는 다른 서열과 염기 쌍을 이루는 (약 6 내지 약 20개 뉴클레오티드의) 서열을 포함한다.
(iii) 다른 표적화 엔도뉴클레아제
추가 구현예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제일 수 있다. 메가뉴클레아제는 긴 인식 서열을 특징으로 하는 엔도데옥시리보뉴클레아제이며, 이는 즉 상기 인식 서열이 일반적으로 약 12개 염기쌍 내지 약 40개 염기쌍을 범위로 한다는 것이다. 이러한 요구의 결과로서, 상기 인식 서열은 일반적으로 임의의 주어진 게놈에서 오직 1회 발생한다. 메가뉴클레아제 중, 귀소 엔도뉴클레아제의 패밀리 (LAGLIDADG 로 불림)는 게놈 및 게놈 공학 연구를 위한 가치있는 도구가 되었다 (예를 들어, 참고: Arnould et al., 2011, Protein Eng Des Sel, 24(1-2):27-31). 메가뉴클레아제는 본 분야의 숙련가에게 잘 알려진 기술을 사용하여, 이의 인식 서열을 변형함에 의하여 특정 염색체 서열에 표적화될 수 있다.
추가 구현예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 전사 활성인자-유사 효과기 (TALE) 뉴클레아제일 수 있다. TALE은, 새로운 DNA 표적에 결합하도록 용이하게 조작될 수 있는 식물 병원체 산토모나스로부터 유래된 전사 인자이다. TALE 또는 이의 절단된 형태는 FokI와 같은 엔도뉴클레아제의 촉매 도메인에 연결되어 TALE 뉴클레아제 또는 TALEN로 불리우는 표적화 엔도뉴클레아제를 생산할 수 있다 (Sanjana et al., 2012, Nat Protoc, 7(1):171-192),
또 다른 구현예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 부위-특이적 엔도뉴클레아제일 수 있다. 특히, 부위-특이적 엔도뉴클레아제는 인식 서열이 게놈 내에서 드물게 발생하는 “레어-커터(rare-cutter)” 엔도뉴클레아제일 수 있다. 대안적으로, 부위-특이적 엔도뉴클레아제는 관심 부위를 절단하도록 조작될 수 있다 (Friedhoff et al., 2007, Methods Mol Biol 352:1110123). 일반적으로, 부위-특이적 엔도뉴클레아제의 인식 서열은 게놈 내에서 오직 1회 발생한다. 대안적인 추가 구현예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 인공 표적화된 DNA 이중 가닥 파단 유도 제제일 수 있다.
(iv) 임의의 폴리뉴클레오티드
표적화된 게놈 변형을 위한 방법은 추가로 하기를 포함할 수 있다: 표적화된 절단 부위의 적어도 하나의 측면 상에서의 서열에 대한 실질적인 서열 동일성을 간는 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 상기 세포로 도입하여, 이로써 표적화 엔도뉴클레아제에 의하여 도입된 이중 가닥 파단은 상동성-지시된 보수 공정에 의하여 보수될 수 있고, 폴리뉴클레오티드의 상기 서열이 내인성 염색체 서열과 상호교환되어, 이로써 상기 내인성 염색체 서열을 변형시킨다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 표적화된 절단 부위의 일 측면 상에서의 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제1 서열, 및 표적화된 절단 부위의 다른 측면 상에서의 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제2 서열을 포함한다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 표적화된 절단 부위의 일 측면 상에서의 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제1 서열, 및 표적화된 절단 부위로부터 멀리 떨어져 위치한 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제2 서열을 포함한다. 표적화된 절단 부위로부터 멀리 떨어져 위치한 서열은 표적화된 절단 부위의 업스트림 또는 다운스트림에서 수십, 수백, 또는 수천개의 뉴클레오티드일 수 있다.
표적화된 염색체 서열 내에서의 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 내에서의 제1 및 제2 서열의 길이는 가변될 수 있고 가변될 것이다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드 내의 제1 및 제2 서열 각각은 길이가 적어도 약 10개 뉴클레오티드이다. 다양한 구현예에서, 염색체 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 길이가 약 15개 뉴클레오티드, 약 20개 뉴클레오티드, 약 25개 뉴클레오티드, 약 30개 뉴클레오티드, 약 40개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 또는 100개 초과의 뉴클레오티드일 수 있다.
어구 “실질적인 서열 동일성”은, 폴리뉴클레오티드 내의 서열이 관심 염색체 서열과 적어도 약 75%의 서열 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 내 서열은 관심 염색체 서열과 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다.
폴리뉴클레오티드의 길이는 가변될 수 있고, 가변될 것이다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 약 20개 뉴클레오티드의 길이 내지 약 200,000개 뉴클레오티드의 길이 범위일 수 있다. 다양한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 길이 범위는약 20개 뉴클레오티드 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1000개 뉴클레오티드 내지 약 10,000개 뉴클레오티드, 약 10,000개 뉴클레오티드 내지 약 100,000개 뉴클레오티드, 또는 약 100,000개 뉴클레오티드 내지 약 200,000개 뉴클레오티드이다.
전형적으로, 폴리뉴클레오티드는 DNA일 수 있다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 하기일 수 있다: DNA 플라스미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인동 염색체 (YAC), 바이러스 벡터, DNA의 선형 단편, PCR 단편, 네이키드(naked) 핵산, 또는 리포좀 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 단일가닥이다. 예시적인 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 약 200개 미만의 뉴클레오티드를 포함하는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 마커를 추가로 포함한다. 그러한 마커는 표적화된 통합에 대한 스크리닝을 가능케할 수 있다. 일부 구현예에서, 마커는 제한 엔도뉴클레아제 부위이다. 다른 구현예에서, 마커는 형광 단백질, 정제 태그 또는 에피토프 태그이다. 적절한 형광 단백질의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 녹색 형광 단백질 (예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, EGFP, 에메랄드(Emerald), 아자미 그린(Azami Green), 단량체 아자미 그린(Monomeric Azami Green), CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), 황색 형광 단백질 (예를 들어, YFP, EYFP, 시트린(Citrine), 비너스(Venus), YPet, PhiYFP, ZsYellow1), 청색 형광 단백질 (예를 들어, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), 청록색(cyan) 형광 단백질 (예를 들어, ECFP, 세룰리언(Cerulean), CyPet, AmCyan1, 미도리시-시안(Midoriishi-Cyan)), 적색 형광 단백질 (mKate, mKate2, mPlum, DsRed monomer, mCherry, mRFP1, DsRed-익스프레스(Express), DsRed2, DsRed-단량체(Monomer), HcRed-탠덤(Tandem), HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred), 및 주황색 형광 단백질 (mOrange, mKO, 쿠사비라-오렌지(Kusabira-Orange), 단량체 쿠사비라-오렌지(Monomeric Kusabira-Orange), mTangerine, tdTomato) 또는 임의의 다른 적절한 형광 단백질. 다른 구현예에서, 마커는 정제 태그 및/또는 에피토프 태그일 수 있다. 예시적인 태그는 비제한적으로 하기를 포함한다: 글루타티온-S-전달효소 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토스 결합 단백질, 티오레독신 (TRX), 폴리(NANP), 직렬 친화성 정제 (TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, 소프트태그(Softag) 1, 소프트태그(Softag) 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 비오틴 카복실 담체 단백질 (BCCP), 및 칼모둘린.
(v) 세포로의 전달
상기 방법은 관심 세포로 표적화 엔도뉴클레아제를 도입하는 단계를 포함한다. 표적화 엔도뉴클레아제는 정제된 단리된 단백질로서, 또는 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산으로서 세포로 도입될 수 있다. 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 암호화 핵산은 mRNA인 구현예에서, mRNA는 5’캡핑되고/되거나 3’ 폴리아데닐화될 수 있다. 암호화 핵산은 DNA인 구현예에서, DNA는 선형 또는 원형일 수 있다. DNA는 벡터의 부분일 수 있으며, 여기서 암호화 DNA는 적절한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 분야의 숙련가는 관심 세포로 벡터를 도입하는 적절한 벡터, 프로모터, 기타 조절 요소, 및 수단을 잘 알고 있다.
상기 기술된 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들) 및 임의의 폴리뉴클레오티드(들)은 다양한 수단에 의하여 상기 세포에 도입될 수 있다. 적합한 전달 수단은 하기를 포함한다: 미세주입, 전기천공, 초음파천공법, 바이오리스틱(biolistics), 칼슘 포스페이트-매개된 형질감염, 양이온성 형질감염, 리포좀 형질감염, 덴드리머 형질감염, 열충격 형질감염, 뉴클레오펙션(nucleofection) 형질감염, 마그네토펙션(magnetofection), 리포펙션, 임페일펙션(impalefection), 핵산의 광학적 형질감염, 전매 제제-증대된 흡수, 및 리포좀, 면역리포좀, 바이로좀, 또는 인공 비리온을 통한 전달. 특정 구현예에서, 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들) 및 폴리뉴클레오티드(들)은 뉴클레오펙션에 의하여 상기 세포에 도입될 수 있다.
1 초과의 표적화 엔도뉴클레아제 분자 및 1 초과의 폴리뉴클레오티드가 세포로 도입되는 구현예에서, 분자는 동시에, 또는 순차적으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 표적화된 절단 부위 (및 임의의 폴리뉴클레오티드)에 각각 특이적인, 표적화 엔도뉴클레아제 분자는 동시에 도입될 수 있다. 대안적으로, 각각의 표적화 엔도뉴클레아제 분자, 뿐만 아니라 임의의 폴리뉴클레오티드(들)는 순차적으로 도입될 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제 분자(들) 대 임의의 폴리뉴클레오티드의 비율은 가변될 수 있고 가변될 것이다. 일반적으로, 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들) 대 폴리뉴클레오티드(들)의 비율은 약 1:10 내지 약 10:1 범위이다. 다양한 구현예에서, 표적화 엔도뉴클레아제 분자(들) 내지 폴리뉴클레오티드(들)의 비율은 약 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 또는 10:1일 수 있다. 일 구현예에서, 비율은 약 1:1이다.
(vi) 세포 배양
상기 방법은 적절한 조건 하에서 세포를 유지하여, 이로써 표적화 엔도뉴클레아제에 의하여 도입된 이중 가닥 파단이 하기에 의하여 보수될 수 있는 단계를 추가로 포함한다: (i) 염색체 서열이 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 삽입, 및/또는 치환에 의하여 변형되는 비-상동 말단-결합(non-homologous end-joining) 보수 공정; 또는 임의로, (ii) 염색체 서열이 폴리뉴클레오티드의 서열과 상호교환되어, 이로써 염색체 서열이 변형되는, 상동성-지시된(homology-directed) 보수 공정. 표적화 엔도뉴클레아제(들)을 암호화하는 핵산(들)이 세포에 도입되는 구현예에서, 상기 방법은 적절한 조건 하에서 상기 세포를 유지하여, 이로써 상기 세포가 표적화 엔도뉴클레아제(들)을 발현하는 단계를 포함한다.
일반적으로, 세포는 세포 성장 및/또는 유지에 적절한 조건 하에서 유지된다. 적절한 세포 배양 조건은 본 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 하기에 기술된다: Santiago et al. (2008) PNAS 105:5809-5814; Moehle et al. (2007) PNAS 104:3055-3060; Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651; 및 Lombardo et al (2007) Nat. Biotechnology 25:1298-1306. 본 분야의 숙련가는, 본 분야에 알려진 세포 배양 방법이 세포 유형에 따라 가변될 수 있고 가변될 것이라는 것을 알 것이다. 일상적인 최적화가, 모든 사례에서, 특정 세포 유형에 대해 최적의 기술을 결정하기 위하여 사용될 수 있다.
상기 공정의 이러한 단계 동안에, 표적화 엔도뉴클레아제(들)은 염색체 서열 내의 표적화된 절단 부위(들)에서의 이중 가닥 파단(들)을 인식하고, 이에 결합하고, 그리고 이를 생산하고, 상기 이중 가닥 파단(들)의 보수 동안에, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 삽입, 및/또는 치환이 표적화된 염색체 서열에 도입된다. 특정 구현예에서, 표적화된 염색체 서열은 비활성화된다.
관심 염색체 서열이 변형된었다는 확인 상에서, 단일 세포 클론은 단리되고, 유전자형화될 수 있다(DNA 시퀀싱 및/또는 단백질 분석을 통하여). 일 변형된 염색체 서열을 포함하는 세포는 추가의 염색체 서열을 변형하기 위하여 하나 이상의 추가 횟수의 표적화된 게놈 변형을 겪을 수 있다 (예를 들어, 실시예 1 참고).
(b) RNA 간섭
또 다른 구현예에서, 바이러스 내성 세포주는 표적 mRNA 또는 전사체의 발현을 억제하는 RNA 간섭 (RNAi) 제제를 사용하여 제조될 수 있다. RNAi 제제는 표적 mRNA 또는 전사체의 절단을 야기할 수 있다. 대안적으로, RNAi 제제는 표적 mRNA의 단백질로의 번역을 예방 또는 파괴할 수 있다.
일부 구현예에서, RNAi 제제는 짧은 간섭 RNA (siRNA)일 수 있다. 일반적으로, siRNA는 길이 범위가 약 15 내지 약 29개의 뉴클레오티드인 이중-가닥 RNA 분자를 포함한다. siRNA는 길이가 적어도 약 16-18, 17-19, 21-23, 24-27, 또는 27-29개의 뉴클레오티드일 수 있다. 특정 구현예에서, siRNA는 길이가 약 21개의 뉴클레오티드일 수 있다. siRNA는 임의로, 1 또는 2개의 단일-가닥 오버행, 예를 들어, 하나 또는 양자 말단 상의 3’오버행을 추가가 포함할 수 있다. siRNA는, 함께 혼성화되는 2개 RNA 분자로부터 형성될 수 있거나, 대안적으로, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)로부터 생산될 수 있다 (하기 참고). 일부 구현예에서, siRNA의 2개 가닥은 완전히 상보적이며, 이로써 2개의 서열 사이에서 형성된 이중나선 영역에서 미스매치 또는 벌지(bulge)가 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, siRNA의 2개 가닥은 실질적으로 상보적이며, 이로써 2개의 서열 사이에서 형성된 이중나선 영역에서 하나 이상의 미스매치 또는 벌지(bulge)가 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, siRNA의 5' 말단의 하나 또는 양자는 인산기를 가지며, 한편 다른 구현예에서, 5' 말단의 하나 또는 양자는 인산기가 없다. 다른 구현예에서, siRNA의 3' 말단의 하나 또는 양자는 하이드록실 기를 가지며, 한편 다른 구현예에서, 5' 말단의 하나 또는 양자는 하이드록실 기가 없다.
siRNA의 일 가닥 (“안티센스 가닥” 또는 “가이드 가닥”으로 지칭됨)은 표적 전사체로 혼성화되는 부분을 포함한다. 특정 구현예에서, siRNA의 안티센스 가닥은 표적 전사체의 영역과 완전히 상보적이고, 이는 즉 이것이 길이가 약 15 내지 약 29개 뉴클레오티드, 바람직하게는 길이가 적어도 16개 뉴클레오티드, 그리고 가장 바람직하게는 길이가 약 18-20개 뉴클레오티드인 표적 영역에 걸쳐 단일 미스매치 또는 벌지가 없는 표적 전사체에 혼성화되는 것이다. 다른 구현예에서, 안티센스 가닥은 표적 영역에 실질적으로 상보적이며, 즉, 하나 이상의 미스매치 및/또는 벌지가 안티센스 가닥 및 표적 전사체에 의하여 형성된 이중나선 내에 존재할 수 있다. 전형적으로, siRNA는 표적 전사체의 엑손 서열에 표적화된다. 본 분야의 숙련가는 표적 전사체에 대한 siRNA를 설계하는 프로그램, 알고리즘, 및/또는 상업적 서비스를 잘 알고 있다. 예시적인 예시는 로제타(Rosetta) siRNA 설계 알고리즘 (Rosetta Inpharmatics, North Seattle, WA) 및 MISSION® siRNA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)이다. siRNA는 본 분야의 숙련가에게 잘 알려진 방법을 사용하여 시험관내 효소적으로 합성될 수 있다. 대안적으로, siRNA는 본 분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
다른 구현예에서, RNAi 제제는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)일 수 있다. 일반적으로, shRNA는 (상기 기술된) RNA 간섭을 매개하기에 충분히 긴 이중-가닥 구조를 형성하기 위해 혼성화할 수 있거나 혼성화되는 적어도 2개의 상보적 부분 및 이중나선을 형성하는 shRNA의 영역을 연결하는 루프를 형성하는 적어도 하나의 단일 가닥 부분을 포함하는 RNA 분자이다. 구조는 줄기-루프 구조로 또한 지칭된 (여기서 줄기는 이중나선 부분이다). 일부 구현예에서, 구조의 이중나선 부분은 완전히 상보적이며, 이로써 shRNA의 이중나선 영역에서 미스매치 또는 벌지(bulge)가 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, 구조의 이중나선 부분은 실질적으로 상보적이며, 이로써 shRNA의 이중나선 부분에서 하나 이상의 미스매치 또는 벌지(bulge)가 존재한다. 구조의 루프는 길이가 약 1 내지 약 20개의 뉴클레오티드일 수 있고, 바람직하게 길이가 약 4 내지 약 10개 뉴클레오티드, 그리고 더욱 바람직하게 길이가 약 6 내지 약 9개의 뉴클레오티드일 수 있다. 루프는 표적 전사체에 상보적인 영역의 5’또는 3' 말단 중 하나 (즉, shRNA의 안티센스 부분)에 위치할 수 있다.
shRNA는 5’또는 3’말단 상에서 오버행을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 오버행은 구조의 루프는 길이가 약 1 내지 약 20개의 뉴클레오티드일 수 있고, 더욱 바람직하게는, 길이가 약 2 내지 약 15개의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 오버행은 하나 이상의 U 잔기, 예를 들어 약 1 내지 약 5개의 U 잔기를 포함한다. shRNA의 5' 말단은 일부 구현예에서 인산기를 가지며, 한편 다른 구현예에서는 그렇지 않다. 다른 구현예에서, shRNA의 3' 말단은 일부 구현예에서 하이드록실기를 가지며, 한편 다른 구현예에서는 그렇지 않다. 일반적으로, shRNA는 보존된 세포 RNAi 기작에 의하여 siRNA로 처리된다. 따라서, shRNA는 siRNA의 전구체이고, shRNA의 부분 (즉, shRNA의 안티센스 부분)에 상보적인 표적 전사체 발현을 유사하게 억제할 수 있다. 본 분야에서의 숙련가는 shRNA의 설계 및 합성을 위하여 이용가능한 자원을 (상기 구체화한 바와 같이) 잘 알고 있다.
또 다른 구현예에서, RNAi 제제는 RNAi 발현 벡터일 수 있다. 전형적으로, RNAi 발현 벡터는 RNAi 제제, 예컨대 siRNA 또는 shRNA의 세포내 (생체내) 합성을 위하여 사용된다. 일 구현예에서, 2개의 개별, 상보적 siRNA 가닥은 2개의 프로모터를 함유하는 단일 벡터를 사용하여 전사되고, 이의 각각은 단일 siRNA 가닥의 전사를 지시한다 (즉, 각 프로모터는 siRNA에 대한 주형에 작동가능하게 연결되어, 이로써 전사가 발생할 수 있다). 2개 프로모터는 동일한 배향에 있으며, 이 경우 각각은 상보적 siRNA 가닥 중 하나에 대한 주형에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 2개 프로모터는 반대 배향에서 단일 주형을 플랭킹하여, 이로써 상기 프로모터에 대한 전사가 2개의 상보적 siRNA 가닥의 합성을 초래할 수 있다. 또 다른 구현예에서, RNAi 발현 벡터는 2개의 상보적 영역을 포함하는 단일 RNA 분자의 전사를 유도하는 프로모터를 함유할 수 있으며, 이로써 상기 전사체는 shRNA를 형성한다.
본 분야의 숙련가는 1 초과의 전사 단위의 전사를 통하여 생체내 생산되는 것이 siRNA 및 shRNA 제제에 바람직하다는 것을 알 것이다. 일반적으로, 하나 이상의 siRNA 및 shRNA 전사 단위의 생체내 발현을 지시하는데 이용되는 프로모터는 RNA 폴리머라아제 III (Pol III)에 대한 프로모터일 수 있다. 특정 Pol III 프로모터, 예컨대 U6 또는 H1 프로모터는, 전사된 영역 내의 시스-작용 조절 요소를 필요로하지 않으며, 따라서 특정 구현예에서 바람직하다. 다른 구현예에서, Pol II 에 대한 프로모터는 1 이상의 siRNA 및 shRNA 전사 단위의 발현을 구동하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 조직-특이적, 세포-특이적, 또는 유도가능한 Pol II 프로모터가 사용될 수 있다.
siRNA 또는 shRNA의 합성을 위한 주형을 제공하는 작제물은 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 생산되고 진핵 세포 내 발현에 적절한 상이한 광범위한 벡터 중 임의의 것으로 삽입된다. 재조합 DNA 기술은 하기에 기술된다: Ausubel et al, 2003, (상기) 및 Sambrook & Russell, 2001, (상기). 본 분야의 숙련가는 벡터가 추가의 조절 서열 (예를 들어, 종결 서열, 번역 조절 서열 등), 뿐만 아니라 선택가능한 마커 서열을 포함할 수 있다는 것을 또한 알 것이다. pBR322, PUC 등에 기반한 것들을 포함하는, DNA 플라스미드는 본 분야에 잘 알려져 있다. 많은 발현 벡터가 이미 적절한 프로모터 또는 프로모터들을 함유하므로, 프로모터에 관한 적절한 위치에서 관심 RNAi 제제를 암호화하는 핵산 서열을 삽입하는 것만이 필요할 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 RNAi 제제의 세포내 발현을 제공하기 위하여 사용될 수 있다. 적절한 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 등을 포함한다. 특정 구현예에서, RNAi 발현 벡터는 shRNA 렌티바이러스계 벡터 또는 렌티바이러스 입자, 예컨대 MISSION® TRC shRNA 산물에 제공된 것 (Sigma-Aldrich)이다.
RNAi 제제 또는 RNAi 발현 벡터는 본 분야의 숙련가에게 잘 알려진 방법을 사용하여 세포로 도입될 수 있다. 그러한 기술은 하기에 기술된다: 예를 들어, Ausubel et al, 2003, (상기) 또는 Sambrook & Russell, 2001, (상기). 특정 구현예에서, RNAi 발현 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터는 세포의 게놈에 안정적으로 통합되어, Mgat1 발현은 차후 세포 생산에 걸쳐 파괴된다.
(c) 부위-특이적 재조합
대안적 구현예에서, 바이러스 내성 세포주는 부위-특이적 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 부위-특이적 재조합 기술은 관심 염색체 서열의 전체 또는 부분을 결실시키거나, 또는 관심 염색체 서열로 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 도입시키는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 관심 염색체 서열은 Cre-loxP 부위-특이적 재조합 시스템, Flp-FRT 부위-특이적 재조합 시스템, 또는 이의 변이체를 사용하여 표적화된다. 그러한 재조합 시스템은 상업적으로 이용가능하며, 이러한 기술에 대한 추가의 교시는 예를 들어 Ausubel et al., 2003 (상기)에서 찾아볼 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 기술의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 하기 참조는 당업자에게 본 발명에서 사용된 용어중 다수의 일반적인 정의를 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본원에 사용되는 바와 같이, 하기 용어들은 달리 명시되지 않는 한, 이들에 부여된 의미를 갖는다.
본 개시내용 또는 이의 바람직한 구현예(들)의 요소를 도입할 때, 관사 ("a", "an", "the" 및 "said”)는 상기 요소가 하나 이상 존재한다는 것을 의미하도록 의도된다. 용어 “포함하는(comprising)”, “포함하는(including)”, 및 “갖는”은 포괄적이며, 열거된 요소 이외의 추가 요소가 있을 수 있다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, “결핍된”은 표적화된 효소 또는 단백질의 감소된, 또는 비-검출가능한 수준, 또는 표적화된 효소 또는 단백질의 감소된, 또는 비-검출가능한 활성을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “내인성 서열”은 세포에 천연인 염색체 서열을 지칭한다.
용어 “외인성 서열”은 세포에 천연이 아닌 염색체 서열 또는 상이한 염색체 위치에 이동된 염색체 서열을 지칭한다.
“유전적으로 변형된” 세포는 게놈이 변형된 세포를 지칭하며, 이는 즉, 상기 세포가 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환을 함유하도록 조작된 적어도 하나의 염색체 서열을 함유한다는 것이다.
용어 “게놈 변형” 및 “게놈 편집”은 특정 염색체 서열이 변화되어, 이로써 염색체 서열이 변형되는 공정을 지칭한다. 염색체 서열은 하기를 포함하도록 변형될 수 있다: 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환. 변형된 염색체 서열은 비활성화되며, 이로써 산물이 제조되지 않는다. 대안적으로, 염색체 서열은 변형되어, 이로써 변형된 산물이 제조될 수 있다.
“유전자”는, 본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 산물을 암호화하는 DNA 영역 (엑손 및 인트론 포함), 뿐만 아니라 유전자 산물의 생산 (그러한 조절 서열이 암호화 및/또는 전사된 서열에 인접한지 여부)을 조절하는 모든 DNA 영역을 지칭한다. 따라서, 유전자는 비제한적으로 하기를 포함한다: 프로모터 서열, 종결자, 번역 조절 서열 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 유입 부위, 인핸서, 사일런서, 절연체, 경계 요소, 복제 기점, 매트릭스 부착 부위, 및 좌위 조절 영역.
용어 “이형(heterologous)”은 관심 세포 또는 종에 천연이 아닌 단위체를 지칭한다.
용어 “핵산” 및 “폴리뉴클레오티드”는 선형 또는 원형 배좌 내에서의, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위하여, 이러한 용어는 중합체의 길이에 대하여 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다. 상기 용어는 천연 뉴클레오티드의 얄려진 유사체, 뿐만 아니라 염기, 당, 및/또는 포스페이트 모이어티 내에 변형된 뉴클레오티드를 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 상동한 염기쌍 특이성을 가지며, 이는 즉, A의 유사체가 T와 염기쌍을 이룰 것이다. 핵산 또는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드는 포스포디에스테르, 포스포티오에이트, 포스포아미다이트, 포스포르디아미다이트 결합, 또는 이의 조합에 의하여 연결될 수 있다. .
용어 “뉴클레오티드”는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드는, 표준 뉴클레오티드 (즉, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘, 및 우리딘) 또는 뉴클레오티드 유사체일 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 변형된 리보오스 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 유사체는 천연 발생 뉴클레오티드 (예컨대, 이노신) 또는 비-천연 발생 뉴클레오티드일 수 있다. 뉴클레오티드의 당 또는 염기 모이어티 상의 변형의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 아세틸기, 아미노기, 카복실기, 카복시메틸기, 하이드록실기, 메틸기, 포스포릴기, 및 티올기의 부가 (또는 제거), 뿐만 아니라 다른 원자 (예를 들면, 7-데아자 퓨린)에 의한 염기의 탄소 및 질소 원자의 치환. 뉴클레오티드 유사체는 또한 하기를 포함한다: 디데옥시 뉴클레오티드, 2’-O-메틸 뉴클레오티드, 잠금 핵산 (LNA), 펩티드 핵산 (PNA) 및 모르폴리노.
상기 용어 "폴리펩티드” 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “표적 부위” 또는 “표적 서열”은 변형될, 또는 편집된 염색체 서열의 부분을 정의하고, 표적화 엔도뉴클레아제가 이를 인식하고 이에 결합되는 핵산 서열을 지칭한다 (결합이 존재하기에 충분한 조건 하에서 제공됨).
용어 “업스트림” 및 “다운스트림”은 고정된 위치와 비교하여 핵산 서열 내의 위치를 지칭한다. 업스트림은 상기 위치에 5’인 영역 (즉, 가닥의 5’ 말단에 근접한) 영역을 지칭하고, 다운스트림은 상기 위치에 3’인 영역 (즉, 가닥의 3’ 말단에 근접한) 영역을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, “바이러스 내성”은 바이러스 감염에 저항하는 세포 능력을 지칭한다. 더 구체적으로, 바이러스의 진입 및/또는 바이러스의 전파는, 비변형된 친계 세포주와 비교하여, 본원에 개시된 조작된 세포주에서 감소 또는 제거된다.
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 측정하는 기술은 본 분야에 알려져 있다. 전형적으로, 그러한 기술은 하기를 포함한다: 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 측정하는 것, 및/또는 암호화된 아미노산 서열을 측정함으로써 이러한 서열을 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열은 또한 이러한 방식으로 측정되고 비교된다. 일반적으로, 동일성은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 상응성을 지칭한다. 2개 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)은 이의 퍼센트 동일성을 측정함에 의하여 비교될 수 있다. 핵산 또는 아미노산 서열, 2개 서열의 동일성 퍼센트는, 더 짧은 서열의 길이로 나누고, 100을 곱한, 2개의 정렬된 서열 사이의 정확한 매치(match)의 수이다. 핵산 서열에 대한 적절한 정렬은 하기에 제공된다: 스미스 및 워터맨의 국지 상동성 알고리즘, (Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)). 이러한 알고리즘은 하기에 의하여 발전되고: Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, 그리고 하기에 의하여 정규화된: Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986) 스코어링 매트릭스를 사용함에 의하여 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 퍼센트 동일성을 측정하기 위한 이러한 알고리즘의 예시적인 수행은 "베스트핏(BestFit)" 유틸리티 어플리케이션 내에서 하기로 제공된다: the Genetics Computer Group (Madison, Wis.). 서열 사이의 퍼센트 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 다른 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터와 함께 사용되는 BLAST이다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP는 하기 디폴트 파라미터를 사용하여 사용될 수 있다: 유전자암호=표준; 필터=없음; 가닥=양쪽; 컷오프=60; 예상=10; 매트릭스=BLOSUM62; 설명=50 서열; 분류수단=HIGH SCORE; 데이타베이스=중복 안 됨, 유전자은행+EMBL+DDBJ+PDB+유전자은행 CDS 번역+Swiss단백질+SPupdate+PIR. 이러한 프로그램의 세부사항은 유전자은행 웹사이트에서 찾아볼 수 있다. 본원에 기술된 서열에 관하여, 서열 동일성의 원하는 정도의 범위는 약 80% 내지 100%이고, 이의 사이의 임의의 정수 값이다. 전형적으로, 서열 간 퍼센트 동일성은 적어도 70-75%, 바람직하게는 80-82%, 더욱 바람직하게는 85-90%, 더 더욱 바람직하게는 92%, 특히 더욱 바람직하게는 95%, 그리고 가장 바람직하게는 98%의 서열 동일성이다.
상기 기술된 세포 및 방법 내에서 다양한 변화가 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서 행해질 수 있으며, 상기의 기술 및 하기 제시된 실시예에 함유된 모든 면이 예시적이며 비제한적인 것으로 해석되어야 한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 어떤 측면을 예증한다.
실시예 1: 표적화된 유전자 변형된 CHO 세포주의 제조
N- 또는 O-연결된 당화 반응에 연루된 효소 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 비활성화 (즉, 녹 아웃(knock out))하기 위해 ZFN-매개된 유전자 변형 기술을 이용했다. 일반적으로, 목적하는 유전자의 암호화 영역 내의 특정 부위를 표적화하는 ZFN의 쌍을 전용 알고리즘(proprietary algorithm)을 사용하여 설계했다. 표준 절차를 사용하여 ZFN 발현 작제물을 제조하고, ZFN mRNA를, 시험관내 전사, mRNA 폴리-아데닐화 및 캡핑 방법을 사용하여 COMPOZr® 녹아웃 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 제품 정보에 기재된 바와 같이 ZFN 플라스미드 DNA로부터 제조했다. 간단히 언급하면, 플라스미드 ZFN DNA를 선형화하고 페놀/클로로포름 DNA 추출법을 사용하여 정제했다. 메시지맥스(MessageMax)™ T7 ARCA-캡핑된 메시지 전사 키트 (셀 스크립트 인코포레이티드(Cell Script Inc.))를 사용하여 선형화된 DNA를 캡핑했다. 폴리(A) 폴리머라제 테일링 키트(Poly(A) Polymerase Tailing Kit, 에피센터(EpiCentre))를 사용하여 폴리(A) 테일을 부가했다. ZFN mRNA를 메가클리어(MEGAclear)™ 키트 (앰비온(Ambion))를 사용하여 정제했다. 친계 세포(Parental cell)를 엑스-셀(EX-CELL)® CHO CD 융합 배지 (시그마-알드리치) 중에서 현탁 배양물로서 유지시켰다. 세포를 형질감염 1일 전에 생물반응기 튜브에 0.5 × 106 세포/mL로 시딩했다. 전형적으로, 각각의 형질감염에는 150 μL 성장 배지 중의 1 × 106 세포, 및 5 μg ZFN DNA 또는 mRNA를 함유했다. 형질감염은 0.2 cm 큐벳에서 140 V 및 950 μF에서의 전기천공에 의해 수행되었다. 전기천공된 세포를 6-웰 플레이트 정적 배양(static culture) 중 2 mL 성장 배지에 두었다.
형질감염 후 3일 및 10일에, 세포를 배양물로부터 제거하고 게놈 DNA를 진일루트™ 포유동물 게놈 DNA 미니프렙 키트(GeneElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit, 시그마-알드리치)를 사용하여 단리했다. ZFN-유도된 절단을, CompoZr® 녹아웃 ZFN 제품 정보에 기재된 바와 같이, Cel-1 뉴클레아제 검정을 사용하여 확인했다. 이러한 검정은 이전에 기재된 바와 같이 ZFN-매개된 유전자 돌연변이의 효율을 결정하기 위해 수행된다 (Miller et al., Nat. Biotechnol. 2007, 25:778-785). 상기 검정은 ZFN-유도된 DNA 이중 가닥 절단의 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)-매개된 불완전한 치유의 결과로서 야생형으로부터 벗어난 표적화된 좌위(locus)의 대립유전자를 검출한다. ZFN-처리된 세포의 풀(pool)로부터 표적화된 영역의 PCR 증폭에 의해 야생형 (WT) 및 돌연변이 앰플리콘의 혼합물이 생산된다. 이러한 혼합물의 용융 및 재어닐링(reannealing)은 WT와 돌연변이 대립유전자의 헤테로듀플렉스 사이에 미스매치(mismatch) 형성을 야기한다. 미스매치 부위에서 형성된 DNA "버블(bubble)"은 서베이어(surveyor) 뉴클레아제 Cel-1에 의해 절단되고, 절단 산물은 겔 전기영동에 의해 분할될 수 있다.
ZFN 활성의 확인시, ZFN 형질감염된 세포를 한계 희석법을 사용하여 단일-세포 클로닝하였다. 이를 위해, 세포를, 80% CHO 무혈청 클로닝 배지, 20% 조정된 배지(conditioned media) 및 4 mM L-글루타민의 혼합물을 사용하여 약 0.5 세포/웰의 근사 밀도로 플레이팅했다. 클론형성능(clonality) 및 성장을 각각 플레이팅 후 7일 및 14에 현미경으로 확인했다. 성장된 클론은 팽창되었고, 이를 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 유전자형 분석하였다.
Mgat1 KO 세포주 . Mgat1은 복합 N-글리칸 합성의 일부로서 Man5GlcNAc2 N-연결된 글리칸 구조물에 GlnNac를 부가한다. 한 쌍의 ZFN을, CHO Mgat1 유전자에서 5'-AACAAGTTCAAGTTCccagcaGCTGTGGTAGTGGAGGAC-3' (서열식별번호: 9; 대문자 표시는 ZFN 결합 부위이고 소문자 표시는 절단 부위임)를 표적화하도록 설계했다. 친계 세포주는 글루타메이트 합성효소가 녹아웃된 CHOK1 (GS -/-) (시그마 알드리치)이었다. 이러한 친계 세포주는 야생형 N- 및 O-글리칸 구조물을 생산한다. CHOK1 (GS -/-) 세포주를 본질적으로 상기 상세히 기재한 바와 같이 Mgat1 ZFN DNA로 형질감염시켰다. Cel-1 검정에 의해 형질감염 후 3일 및 10일 모두에서 ZFN 활성을 나타내는 2개의 절단 단편, 220 및 197 bp의 존재를 확인하였다. 단일-세포 클론은 하나의 대립유전자에서 2 bp 내지 55 bp에 이르는 결실이 확인되었다 (제2 대립유전자에서는 검출되지 않았다). 이러한 세포주는 5개의 만노스 잔기 (즉, Man5NeuAc2 글리코형)로 종료된 절단된 N-연결된 구조물 및 야생형 O 글리칸 구조물을 생산한다.
COSMC KO 세포주 . O-글리코실화에서 가장 흔한 제2 생합성 단계는 코어-1 신장(core-1 elongation)이다. 코어-1 신장은 기능을 위해 전용 차폐론, COSMC를 필요로 하는 단일 효소 C1GalT1 (aka T-합성효소)에 의해 촉매된다. COSMC는 T-합성효소에 특이적으로 결합하는 것으로 보이고, 골지(Golgi)에서 그것의 완전한 활성을 보장하는 ER 단백질이다. COSMC 유전자를 파괴하기 위해, CHOK1 (GS -/-) 세포를, CHO COSMC 유전자에서 서열 5'-GCCTTCTCAGTGTTCCGGAaaagtgTCCTGAACAAGGTGGGAT-3' (서열식별번호: 10)를 표적화하도록 설계된 ZFN을 암호화하는 DNA 또는 RNA으로 형질감염시켰다. Cel-1 뉴클레아제 검정에 의해 ZFN 형질감염된 세포에서 3개의 절단 단편 (즉, 318, 184, 134 bp)의 존재를 확인하였다. COSMC의 하나의 대립유전자에서 4 bp 결실을 갖는 단일 세포 클론을 단리했다 (제2 대립유전자에서는 검출되지 않았다). 상기 세포주는 절단된 (즉, 미성숙한) O-글리칸 구조물 및 야생형 N-글리칸을 생산한다.
COSMC/Mgat3 KO 세포주 . 한 쌍의 ZFN을 Mgat3의 암호화 영역에서 5'-TTCCTGGACCACTTCCCAcccggtGGCCGGCAGGATGGC-3' (서열식별번호: 11)를 표적화하도록 설계했다. 상기 상세히 기재된 COSMC KO 세포주를 상기 상세히 기재한 바와 같이 ZFN DNA로 형질감염시켰다. ZFN 절단의 확인 후, 단일 세포 클론을 단리했다. 서열분석에 의해, 돌연변이 클론이 Mgat3 유전자에서 9, 10, 11 또는 41 bp 결실을 가졌음을 보여주었다. 이러한 세포주는 야생형 N-글리칸 및 절단된 O-글리칸을 생산한다 (즉, 이는 친계 세포주와 유사하다).
COSMC/Mgat3/Mgat5 KO 세포주 . 상기 상세히 기재된 COSMC/Mgat3 KO 세포주를 Mgat5의 암호화 영역에서 5'-TTCTGCACTTCACCATCCAgcagcgGACTCAGCCTGAGAGCAGCT-3' (서열식별번호: 12)를 표적화하도록 설계된 ZFN을 암호화하는 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. Mgat5 유전자에서 129 bp 결실을 갖는 단일 세포 클론을 단리했다. 이러한 세포주는 더 적게 측면 분지화된 N-글리칸 및 절단된 O-글리칸을 생산한다.
실시예 2: 바이러스 감염 및 바이러스 내성 시험 검정
상기-기재된 CHO 세포주를 성장시키고, 이를 원형 MVM 바이러스 (균주 MVMp)로 접종 후 감염을 지지하거나 저항하는 그것의 능력에 대해 시험했다. 간단히 언급하면, 세포를 적절한 배지에서 성장시키고 MVMp 바이러스를 1 또는 10의 감염 다중도 (MOI)로 부가하고, 감염된 세포를 검정 전에 추가 24, 48 또는 72시간 동안 인큐베이션했다. 대조군으로서의 세포를 성장시키고 바이러스 없이 인큐베이션했다. 미감염된 세포를 또한 효소 뉴라미니다제로 처리하여 표면 글리칸 (N 및 O-연결된 표면 글리칸 모두)으로부터 말단 시알산을 제거한 후 지시된 MOI에서 감염시켰다.
감염된 및 미감염된 세포를 세포병리적 효과 (CPE)의 존재에 대해 시각적으로 조사하고, 지시된 시점에, 세포를 원심분리하여 수확했다. 바이러스 DNA 감염력 및 생산을 총 게놈 DNA에 대해 서던 블롯 분석을 사용하고, 항-바이러스 단백질 항체를 사용하는 웨스턴 면역블롯 분석을 사용하여 스크리닝했다. 서던 분석의 경우, 24시간에 채취된 중복 샘플로부터의 세포 펠렛을 수확하고 총 게놈 DNA를 단리했다. DNA를 나노드롭 분광학(Nanodrop spectroscopy)을 통해 정량화하고, 샘플을, 크기 분별을 위한 아가로스 겔 상에 동등한 로딩이 보장되도록 정규화했다. 크기 분별된 DNA를 충전된 막으로 이동시키고 (서던 블롯팅), 32P-표지된 바이러스 DNA 프로브를 사용하여 바이러스 DNA 합성에 대해 상기 막을 탐침했다. 특정 32P-표지된 바이러스 이중가닥 DNA 밴드의 정량화를 포스포르 영상화로 수행했고, 상대 값은 표 1에 보고된다.
표 1. 바이러스 수준
세포주 MOI 뉴라미니다제
처리 		바이러스 DNA
(상대 값)
야생형 10 133.35
야생형 10 처리함 25.59
Mgat1 KO 10 49.56
COSMC KO 10 24.01
야생형 10 121.36
야생형 10 처리함 31.38
COSMC/Mgat3 KO 10 23.78
COSMC/Mgat3/Mgat5 KO 10 28.87
야생형 1 36.28
야생형 1 처리함 4.16
Mgat1 KO 1 17.263
COSMC KO 1 1.58
야생형 1 85.61
야생형 1 처리함 11.65
COSMC/Mgat3 KO 1 0.45
COSMC/Mgat3/Mgat5 KO 1 0.54
웨스턴 분석을 위해, 24시간에 수확된 세포 펠렛을 SDS 완충제에 용해시키고, SDS-PAGE를 사용하여 단백질을 분리했다. 전기영동 후, 단백질을 PVDF 막으로 이동시키고, 차단하고, 항-NS1 항체를 사용하여 바이러스 NS1 단백질의 존재에 대해 면역블롯팅했다 (웨스턴 면역검정). 웨스턴 블롯팅을 통해 검출된 바이러스 단백질의 수준은 표 2에 표시된다.
표 2. 웨스턴 분석의 요약
세포주 생성된 글리칸 구조물 바이러스 생성
야생형 야생형 O- 및 N-연결된 글리칸 모든 MOI에서 +++++
야생형 + 뉴라미니다제 말단 시알산의 제거 (O- 및 N-연결된 글리칸) MOI=10에서 +
Mgat1 KO 야생형 O-연결된 글리칸; 절단된 N-연결된 글리칸 모든 MOI에서 +++
COSMC KO 야생형 N-연결된 글리칸; 절단된 O-연결된 글리칸 MOI=1에서 -
MOI=10에서 +
COSMC/Mgat3 KO 절단된 O-연결된 글리칸; 추측상 야생형 글리칸 MOI=1에서 -
MOI=10에서 +
COSMC/Mgat3/Mgat5 절단된 O-연결된 글리칸; 변형된 N-연결된 글리칸 (더 적게 측면 분지됨) MOI=1에서 -
MOI=10에서 +
바이러스의 MVMp 균주로 감염되는 경우, 친계 세포주 CHOK1 (GS -/-) (즉, 야생형 글리칸 구조물을 가짐)은 예상된 고전적 감염력 및 바이러스 DNA 및 단백질 합성 생산을 보여주었다. 바이러스 DNA 및 바이러스 단백질 산물은 세포를 어느 MOI에서 감염시키든 감염 24시간 후 분명했다. 강력한 바이러스 산물의 생산은 이후 시점에서도 마찬가지로 관찰되었다. 미감염된 야생형 세포는, 시점과 무관하게, 예상대로, 감염의 증거가 나타나지 않았다.야생형 세포를 효소 뉴라미니다제 (NA)로 처리하여 세포 표면 시알산을 제거한 후 세포를 MVMp로 감염시킨 경우, 바이러스의 생산 감소 (이는 감염 감소를 나타냄)가 또한 관측되었다 (MOI=10에서 5.32배 내지 MOI=1에서 7.34배에 이름). NA 처리된 세포가 여전히 감염에 대해 약간의 민감성을 보여주지만, CHO 세포는 이러한 처리 후 시알산 (SA) 구조물을 빠르게 재생시키는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 관찰된 낮은 수준의 감염은 바이러스를 위한 진입구를 제공하는 말단 SA 글리칸을 재생하는 세포로부터 기인할 수 있다.
CHO Mgat1 유전자가 비활성화되고 Mgat1 효소가 생산되지 않는 Mgat1 KO 세포의 바이러스 감염은 바이러스 감염에 대해 단지 약간의 내성을 야기했다 (예를 들면, 블롯의 포스포르 영상화에 의해 측정될 때, 2.1배 내지 2.7배 감소). 이러한 세포주는 절단된 N-글리칸을 가지므로, 이들 결과는 2-3 연결된 시알산을 갖는 고차 N-글리칸 수용체가 초기 바이러스 캡시드 결합 및 세포 내로의 바이러스 진입에서 소수의 역할만을 할 수 있음을 시사한다.
COSMC KO 세포를 MVMp 바이러스로 감염시키는 경우, 이러한 세포주는 바이러스 감염에 대해 유의미한 내성을 나타냈다. (야생형 세포주와 비교할 때) 폴드 내성(fold resistance)은 5.5배 (MOI=10) 내지 190배 (MOI=1)에 이르렀다. (CHO 세포에서 위유전자(pseudogene)인 것으로 추정되는) Mgat3 유전자 및 (고차 N-연결된 분지화를 담당하는) Mgat5 유전자를 표적화하는 추가의 유전자 녹아웃은 유사한 결과를 제공했다. 웨스턴 블롯 분석에 의해서도 유사한 결과를 나타냈으며, 이는 바이러스 내성이, O-글리칸 구조물의 끝이 잘리는 경우 발생한다는 것을 나타낸다. 이들 연구에 의해, 시알산 수용체의 파괴가 MVM 결합 및/또는 세포 내로의 진입을 급격하게 감소시켰음을 보여주었다.
실시예 3: 추가의 COSMC KO 및 Slc35A1 KO 세포주의 생산
신규 COSMC KO 세포주 클론을 CHOK1 (GS -/-) 세포, 및 CHO COSMC 유전자의 엑손 2에서 서열 5'-GCCTTCTCAGTGTTCCGGAaaagtgTCCTGAACAAGGTGGGAT-3' (서열식별번호: 10)를 표적화하도록 설계된 한 쌍의 ZFN을 사용하여 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 생산했다. Cel-1 뉴클레아제 검정에 의해 ZFN 형질감염된 세포에서 3개의 절단 단편 (즉, 318, 184, 134 bp)의 존재를 확인하였다. 5개의 단일 세포 클론을 단리하고, 서열분석하여 이하에서 보여진 바와 같이 1 내지 12 bp의 결실을 보여주었다.
Figure pat00001
클론 F07은 표준 절차를 사용하여 인간 IgG를 발현시키도록 추가로 변형되었다. 확인된 다수의 클론 중, 2개의 IgG 생산 클론을 추가의 시험을 위해 단리했다 (그리고 71H1, 71C3로서 확인했다) (하기 참고).
뉴클레오티드 당 수송체 (CMP-시알산 수송체)를 암호화하는 Slc35A1 유전자를, CHO Slc35A1 유전자의 엑손 1에서 5'-AGCTTATACCGTAGCTTTaagataCACAAGGACAACAGCTAAA-3' (서열식별번호: 13)를 표적화하도록 설계된 ZFN 또는 5'-TTCAAGCTATACTGCTTGGCAGTGATGACTCTGGTGGCT-3' (서열식별번호: 17)를 표적화하도록 설계된 ZFN을 사용하여 CHOK1 (GS-/-) 세포에서 녹아웃하였다. Cel-1 뉴클레아제 검정에 의해 ZFN 형질감염된 세포에서 2개의 절단 단편의 존재를 확인하였다. 1개의 단일 세포 클론 (B12)을 단리하고 서열분석하여 ZFN 결합 부위 주위에서 1 bp 결실을 보여주었다. Slc35A1 KO 세포주는 말단 시알산이 없는 N 및 O 연결된 글리칸 구조물을 형성한다.
바이오티닐화된 매키아 아무렌시스 렉틴(Maackia Amurensis lectin II, MALII; 20 μg/mL) 및 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647-표지된 스트렙타비딘 (5 μg/mL)으로의 염색에 의해, 친계 세포주와 비교하여 COSMC KO 클론 F07, COSMC KO 클론 G03 및 Slc35A1 KO 세포주에서 유의미하게 감소된 염색을 보여주었다 (이는 KO 세포주에서 말단 시알산 잔기의 부재를 나타냄).
실시예 4: MMV 바이러스에 대한 C OSMC KO 및 Slc35A1 KO 세포주의 내성
야생형 (즉, CHOZN GS-/-), COSMC KO (상기 실시예 1 및 3에서 생산됨), 및 Slc35A1 KO (상기 실시예 3에서 생산됨) 세포를 본질적으로 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 0.3의 MOI에서 MVMp 바이러스로 감염시켰다. 감염을 (본질적으로 상기에서 기재된 바와 같은) 서던 분석 및 표준 플라크 검정을 통해 분석했다.
도 1에서 보여주는 바와 같이, 야생형 세포는 높은 수준의 바이러스 DNA를 나타내지만, Slc35A1 KO 및 COSMC KO 세포주는 매우 낮은 수준의 바이러스 DNA를 가졌으며; COSMC F07 KO 및 COSMC G03 KO 클론은 낮은 수준의 바이러스 DNA를 가졌고; 12 bp 결실을 갖는 COSMC H05 FO 클론은 친계 세포주와 유사한 바이러스 DNA 수준을 가졌다. H05에서의 결실이 인프레임(in-frame)이므로 세포가 거의 야생형 수준의 바이러스 민감성을 나타낸다는 것은 놀라운 일이 아니다. 플라크 검정 결과는 도 2에서 보여준다. Slc35A1 KO, COSMC KO, COSMC F07 KO, 및 COSMC G03 KO 세포는 대단히 낮은 바이러스 수준을 가졌다.
추가의 바이러스 내성 시험을 야생형 (즉, CHOZN GS-/-, 또한 소위 2E3), COSMC KO 클론 F07 및 G03, 및 Slc35A1 KO 클론 B12를 사용하여 수행했다. 세포를 6 mM L-글루타민이 보충된 배지에서 성장시키고 1 또는 8의 MOI에서 MMVp로 감염시키고 적당한 조건 하에 인큐베이션했다. 세포 샘플을 0, 24, 48, 72, 96 및 120시간에 제거하고; 세포 생존력을 트립판 블루 염색으로 분석하고 MMV 정량화를 qPCR로 결정했다.
세포 생존력은 도 3에 제공된다. 감염 후 120시간에, 세포 생존력은 야생형 세포 (즉, 2E3)에서 약 50% 감소되었고 (패널 A 참고), 반면에 COSMC 클론 F07에서는 적어도 93%의 세포가 감염 후 120시간에 생존했다 (패널 B 참고). 도 4는 1의 MOI (패널 A 참고) 또는 8의 MOI (패널 B 참고)에서 야생형 (2E3) 및 COSMC 클론 F07에서의 MMV 감염 후 경시적인 세포-관련된 바이러스(cell-associated virus) (바이러스 게놈 카피 (vgc)/세포)를 보여준다 (계산은 각각의 감염된 세포가 2 x 104 vgc를 생산할 수 있다는 가정을 기초로 했다). 각각의 조건 하에 감염된 세포의 분율은 하기 제공된다.
표 3. 감염된 세포의 퍼센트
MOI 세포 유형 반복 0시간 24 시간 48 시간 72 시간 96 시간 120 시간
% 세포
1 2E3 A 44 21 28 36 24 55
B 41 27 26 30 32 14
F07 A 5 2.1 1.7 1.6 0.5 1.9
B 6 2.2 2.0 1.4 0.7 2.5
8 2E3 A 115 70 91 42 65 118
B 105 85 113 55 60 90
F07 A 32 14 12 6.9 1.1 5.5
B 27 14 11 3.4 4.8 7.5
야생형 (즉, 2E3), COSMC KO 클론 F07, G03, & H04, 및 Slc35A1 KO 클론 B12 세포를 0.3 또는 0.03의 MOI에서 MMVp로 -3 시간 시점에 감염시켰다. 0 시간 시점에서, 세포를 성장 배지로 3회 세정한 후 21시간 동안 인큐베이션했다 (즉, 단일 복제 사이클). 바이러스 복제를 0 및 21시간에 세포-관련된 바이러스를 결정함으로써 분석했다. 도 5에서 보여주는 바와 같이, COSMC KO 세포주에서는 바이러스 복제가 감소되었고 Slc35A1 KO 세포주에서는 바이러스 복제가 사라졌다. 실시예 5: 레오바이러스-3에 대한 C OSMC KO 및 Slc35A1 KO 세포주의 내성
야생형 (즉, 2E3), COSMC KO 클론 F07, 및 Slc35A1 KO 클론 B12 세포를 -3 시간 시점에 2개의 희석도 (TCID50 = 5.6E+07 및 5.6E+06)에서 레오바이러스-3으로 감염시켰다. 0 시간 시점에서, 세포를 3회 세정한 후 24시간 동안 인큐베이션했다 (즉, 단일 복제 사이클). 바이러스 복제를 0 및 24시간에 세포-관련된 바이러스를 결정함으로써 분석했다. 세포-관련된 바이러스의 수준은 COSMC KO 클론에서 24시간에 급격하게 감소되었고 Slc35A1 KO 클론에서는 거의 사라졌다 (도 6 참고).
실시예 6: C OSMC KO 및 Slc35A1 KO 세포주의 성장 검정
야생형 (즉, CHOZN GS-/-), COSMC KO 클론 F07 & G03, 및 Slc35A1 KO 클론 B12 세포를 MVMp 바이러스의 부재 또는 존재 (0.1의 MOI에서) 하에 8 내지 10일 동안 성장시켰다. 세포 성장을 0, 1, 2, 3, 6, 7, 8 및 10일에 생존 세포 밀도를 (트립판 블루 염색을 통해) 측정함으로써 모니터링했다. 도 7의 패널 A에서 보여주는 바와 같이, 다양한 KO 세포는 바이러스의 존재 및 부재 하에 유사한 성장 프로파일을 나타냈으며, 이는 바이러스 주입에 대해 내성이 있는 것을 나타낸다. 그에 반해서, 야생형 세포는 미감염된 배양물과 비교하여 고전적 감염력, 손상된 성장, 및 낮은 세포 생존력을 나타냈다.
COSMC KO 클론 F07의 야생형 및 IgG 생산 클론 (즉, 71H1 및 71C3)의 세포 성장을 본질적으로 상기 상세히 기재된 바와 같이 바이러스의 부재 또는 존재 하에 모니터링했다. 도 7의 패널 B에서 보여주는 바와 같이, IgG 생산 KO 세포주도 또한 바이러스 감염에 대해 유의미한 내성을 보여주었다. 감염된 배양물을 미감염된 배양물과 유사한 속도에서 그리고 피크 세포 밀도로 성장시켰다. 이들 데이타는, 세포 표면 IgG의 분비가 COSMC KO 친계에 의해 나타나는 바이러스 내성의 정도에 인식가능한 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다. IgG 생산 세포주 모두가 야생형 세포와 비교하여 더 느린 속도로 성장할지라도, IgG 생산 세포주 둘 모두는 바이러스 감염에 대해 내성을 나타냈다 (즉, 미감염된 배양물과 비교하여 차이가 없다).
실시예 7: St3Gal4 KO 세포주의 생산 및 세포 성장 검정
St3Gal4 KO 세포를 CHO St3Gal4 유전자에서 5'-GGCAGCCTCCAGTGTCGTC gttgtgTTGTGGTGGGGAATGGGC (서열식별번호: 14)를 표적화하도록 설계된 ZFN을 사용하여 본질적으로 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 생산했다. Cel-1 뉴클레아제 검정에 의해, ZFN 형질감염된 세포에서 3개의 절단 단편 (즉, 344 bp, 210 bp 및 135 bp)의 존재를 확인했다. 4개의 단일 세포 클론을 단리하고 서열분석하여 하기 돌연변이를 나타냈다. St3Gal4 KO 세포는 2-3 연결된 시알산 구조물의 수준을 감소시켰다.
Figure pat00002
St3Gal4 KO (즉, 클론 7D10, 1B8 및 1B10) 및 야생형 세포를 0.1의 MOI에서 MVMp 바이러스의 부재 또는 존재 하에 성장시키고 세포 성장을 9일 동안 모니터링했다. St3Gal4 KO 세포는 또한 도 8에서 보여주는 바와 같이 바이러스 감염에 대한 유의미한 내성을 보여주었다. 감염된 KO 배양물을 미감염된 KO 배양물과 유사한 속도에서 그리고 피크 세포 밀도로 성장시켰다. 이들 연구에 의해, 세포 표면 상의 특정 2-3 연결된 시알산 구조물의 파괴가 또한 그와 같은 세포 내로의 MVM 도입을 급격하게 감소시키는 것처럼 보이는 것으로 나타났다.
실시예 8: St3Gal4 및 St3Gal6 이중 KO 세포주의 생산
St3Gal4 KO (즉, 클론 7D10, 1B8 및 1B10) 세포주를, 녹아웃된 St3Gal6 유전자를 또한 함유하는 세포주를 생산하기 위한 출발 세포로서 사용했다. ZFN을 5'- CGGTACCTCTGATTTTGCT ttgccCTATGGGACAAGGCC-3' (서열식별번호: 15)를 표적화하도록 설계하고, 유전자 교정(gene editing)을 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행했다. Cel-1 뉴클레아제 검정에 의해, ZFN 형질감염된 세포에서 3개의 절단 단편 (즉, 308 bp, 171 bp 및 137 bp)의 존재를 확인했다. 6개의 단일 세포 클론을 단리하고 서열분석하여 하기 돌연변이를 나타냈다.
Figure pat00003
실시예 9: C1GalT1 KO 세포주의 생산
C1GalT1 유전자를, 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 5'-ACCCTCATGCTAGACatttaGATGATAACGAACCCAGTC-3' (서열식별번호: 16)를 표적화하도록 설계된 ZFN을 사용하여 CHOK1 (GS -/-) 세포에서 녹아웃했다. Cel-1 뉴클레아제 검정에 의해, ZFN 형질감염된 세포에서 2개의 절단 단편 (즉, 223 bp 및 148 bp)의 존재를 확인했다. 7개의 단일 세포 클론을 단리하고 서열분석하여 하기 돌연변이를 나타냈다.
Figure pat00004
바이오티닐화된 MALII 및 알렉사 플루오르 647-표지된 스트렙타비딘으로의 염색에 의해, 친계 세포주와 비교하여 C1GalT1 KO 클론 2C12에서의 염색이 유의미하게 감소되었음을 보여주었다.
실시예 10: St6Gal1 과발현 세포주의 생산
MVM 바이러스가 알파-2,6 연결된 시알산과 결합하지 않는다고 가정되었으므로, St6Gal1을 과발현시키는 CHO 세포주를 생산했다. 차이니즈 햄스터 St6Gal1의 암호화 서열을 유전자은행 (AB492855) 및 chogenome.org AQ2 (AFTD01061789 및 AFTD01061790)로부터 입수했다. 열린 해독틀(open reading frame)은 5'-미번역된 영역 (UTR)에 부가된 코작 서열(Kozak sequence) (5'-GCCGCCACCAatg-3'; 서열식별번호: 18)에 의해 상업적으로 합성되었다. 합성된 단편을 발현 벡터 pJ602 (DNA2.0; Menlo Park, CA) 내로 클로닝했다. CHO (GS-/-) 숙주 세포주 및 IgG-발현 CHO 세포주를 이러한 작제물로 (전기천공을 통해) 형질감염시켰다. 단일 세포 클론을 FACSAriaTM III 세포 정렬기를 사용하여 단리했다. 이를 위해, 세포를 α-2,6 연결된 시알산과 결합하는 FITC-콘주게이트된 삼부커스 니그라 렉틴 (FITC-conjugated Sambucus Nigra lectin, FITC-SNA)으로 염색하고, 상위 5% 형광을 갖는 세포를 1 세포/웰로 플레이팅하고 배양했다. 단일 세포 클론을 α-2,3 연결된 시알산과 결합하는 바이오티닐화된 MALII, 및 알렉사 플루오르 647-표지된 스트렙타비딘으로 염색한 후 MACSQuantVR 분석기 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 캘리포니아 샌디에이고 소재) 상에서 2-색 FACS 분석에 적용했다. St6Gal1 과발현 단일 세포 클론은 비-형질감염된 친계 세포주와 비교하여 알렉사플루오르에 대한 FITC의 비가 증가되었다.
IgG를 2개의 St6Gal1 과발현 클론 (즉, 클론 31 및 클론 32) 및 친계 세포 클론으로부터 단리했다. IgG 또는 총 세포성 단백질 추출물을 표준 절차에 따라서 감소시키고 카복시아미도메틸화시킨 후 37℃에서 밤새 (12-16시간) 트립신처리했다. 트립신을 100℃에서 5분 동안 가열하여 탈활성화했다. 단편의 정제를 C18 SPE 카트리지 (워터스(Waters), 300 mg 팩킹)를 사용하여 수행했다. 5% 아세트산 (AcOH)으로의 세정 후, 펩티드/글리코펩티드를 20% 이소프로판올/5% AcOH, 40% 이소프로판올/5% AcOH 및 100% 이소프로판올로 순차적으로 용출시켰다. 용출물을 건조시키고, PNGase F를 함유하는 인산염 완충제에 재구성시키고, 37℃에서 밤새 인큐베이션했다. 방출된 글리칸을 C18 카트리지를 사용하여 정제하고, 퍼메틸화시키고, 1 mM 리튬 카보네이트/50% MeOH로 희석하고, 나노스프레이 이온화를 위해 0.5 mL/분의 유속에서 LTQ 오비트랩 디스커버리 질량 분광분석기 (LTQ Orbitrap Discovery Mass Spectrometer, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 내로 직접 주입했다. 각각의 샘플에 대한 완전 푸리에 변환 질량 분광분석법 (FTMS) 스펙트럼을 30,000 분해능에서 수득하여 글리칸이 시알산을 함유하는지를 결정했다. 시아릴화된 글리칸의 시알산 연결부를 MSn 분석으로 결정했다. 각각의 샘플을 이온 트랩 내의 다중 이온 선택 및 단편화 단계에 적용하여 복합체-유형 글리칸을 단일 갈락토오스로 분해한 후 단편화 패턴을 관측했다.
GS (-/-) 숙주-세포주와 2개의 St6Gal1 과발현 세포주 (즉, 클론 31 및 32)의 N-글리칸 프로파일 간에 현저한 차이가 존재했다. 특히, 시아릴화되지 않은 글리칸은 그것의 낮은 존재비로 인해 숙주-세포주에서 확인되지 않았다. 반대로, 모노-, 바이-, 트리- 및 테트라시아릴화된 N-글리칸은 St6Gal1 과발현 세포주 모두에서 확인되었다. 특히, 클론 32에서 1개를 제외한 모든 시아릴화된 집단은 α-2,3- 및 α-2,6-연결기 둘 모두를 함유하는 것으로 나타났다.
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Claims (15)

  1. 적어도 하나의 바이러스의 진입 및/또는 전파가 비변형된 친계 세포주와 비교하여, 감소되거나 제거된, 유전적으로 변형된 포유동물 세포주로서, 이때 유전적으로 변형된 세포주는 만노실 (알파-1,3-)-당단백질 베타-1,2-N-아세틸글루코스아미닐전달효소 1 (Mgat1)을 암호화하는 비활성화된 염색체 서열을 포함하는 변형된 염색체 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 포유동물 세포주.
  2. 청구항 1에 있어서, 변형된 염색체 서열은 표적화 엔도뉴클레아제-매개 게놈 변형 기술을 사용하여 변형되는, 유전적으로 변형된 포유동물 세포주.
  3. 청구항 2에 있어서, 표적화 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제인, 유전적으로 변형된 포유동물 세포주.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 항체, 항체 단편, 백신, 성장 인자, 시토카인, 호르몬, 또는 응고 인자에서 선택된 재조합 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 추가로 포함하는, 유전적으로 변형된 포유동물 세포주.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 파보바이러스, 레오바이러스, 로타바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 칼리시바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 풍진 바이러스, 코로나바이러스, 노로바이러스, 엔세팔로마이오카디티스 바이러스, 폴리오마바이러스, 또는 이의 조합인, 유전적으로 변형된 포유동물 세포주.
  6. 청구항 5에 있어서, 파보바이러스는 마우스 (MVM), 마우스 파보바이러스 유형-1, 마우스 파보바이러스 유형-2, 마우스 파보바이러스 유형-3, 돼지 파보바이러스 1, 소 파로바이러스 1, 인간 파로바이러스 B19, 인간 파로바이러스 4, 인간 파로바이러스 5, 또는 이의 조합의 미세 바이러스인, 유전적으로 변형된 포유동물 세포주.
  7. 청구항 5에 있어서, 레오바이러스는 포유동물 레오바이러스-3, 포유동물 오르토레오바이러스, 조류 오르토레오바이러스, 또는 이의 조합인, 유전적으로 변형된 포유동물 세포주.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 세포주는 비-인간 세포주인, 유전적으로 변형된 포유동물 세포주.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주인, 유전적으로 변형된 포유동물 세포주.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 글루타민 합성효소를 암호화하는 적어도 하나의 비활성화 염색체 서열을 추가로 포함하는, 유전적으로 변형된 포유동물 세포주.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 생산계 (biologic production system)에 사용하기 위한, 유전적으로 변형된 포유동물 세포주.
  12. 청구항 11에 있어서, 생물학적 생산계는 바이러스 오염에 내성인, 유전적으로 변형된 포유동물 세포주.
  13. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 유전적으로 변형된 포유동물 세포주 및 적어도 하나의 바이러스를 포함하는 조성물로서, 이때 세포주는 바이러스 감염에 대하여 내성을 나타내는, 조성물.
  14. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 유전적으로 변형된 포유동물 세포주를 생물학적 생산계에 사용하기 위하여 제공하는 단계를 포함하는, 생물학적 생산계의 바이러스 오염 위험을 감소시키는 방법.
  15. 다음 단계를 포함하는, 재조합 단백질 산물의 바이러스 오염을 감소 또는 예방하는 방법:
    a) 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 유전적으로 변형된 포유동물 세포주를 수득하는 단계; 및
    b) 상기 유전적으로 변형된 포유동물 세포주에서 재조합 단백질 산물을 발현하는 단계.
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