CN116323939A

CN116323939A - 病毒不易感动物及其构建方法

Info

Publication number: CN116323939A
Application number: CN202180060541.1A
Authority: CN
Inventors: 饶毅; 杨海元; 戴一凡; 李琳; 胡前进
Original assignee: Chuangguan Suzhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Rao Yi
Priority date: 2020-07-17
Filing date: 2021-07-16
Publication date: 2023-06-23
Also published as: WO2022012663A1

Abstract

提供一种病毒不易感动物及构建其的方法，该方法包括敲除动物中编码唾液酸转移酶的基因的全部或部分，例如敲除编码2,3‑半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,3Gal)受体的基因和/或编码2,6‑半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,6Gal)受体的基因的全部或部分，从而使所述动物成为病毒不易感的动物。

Description

病毒不易感动物及其构建方法

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种病毒不易感动物及其构建方法。

背景技术

由于动物(例如猪品系)感染流感病毒是一个较为复杂的生理病理过程，涉及多种受体信号通路，流感病毒在受感染动物(例如猪品系)的体内又有可能发生变异，因此会产生变异后的流感病毒进一步感染人的风险。

CRISPR/Cas9系统可以实现在真核细胞中高度灵活且特异的基因组编辑，是目前基因组编辑领域最受欢迎的新一代基因组编辑技术，目前该技术已被用于构建各类基因敲除细胞系和基因敲除动物模型。

唾液酸转移酶参与细胞粘附、迁徙和突触形成，并且参与神经系统的发育和重塑。

发明内容

本申请提供了一种构建病毒不易感动物的方法，以及借助该方法构建获得的病毒不易感动物。使用本申请所述方法获得的动物(例如猪品系)敲除了编码唾液酸转移酶的基因的全部或部分，成为了病毒不易感动物，避免感染人流感病毒和/或禽流感病毒，避免了该动物本身作为不同流感病毒的中间宿主，也避免该动物作为流感病毒重组变异的温床的风险。

一方面，本申请提供了一种构建病毒不易感动物的方法，所述方法包括敲除动物中编码唾液酸转移酶的基因的全部或部分，从而使所述动物成为病毒不易感的动物。

在某些实施方式中，所述编码唾液酸转移酶的基因包括ST3Gal4基因、ST6Gal1基因、ST3Gal3基因和/或ST3Gal6基因。

在某些实施方式中，所述唾液酸转移酶包括2,3-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,3Gal)受体，和/或2,6-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,6Gal)受体。

在某些实施方式中，所述编码2,3-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,3Gal)受体的基因包括ST3Gal4基因。

在某些实施方式中，所述编码2,3-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,6Gal)受体的基因包括 ST6Gal1基因。

在某些实施方式中，所述动物包括家畜。

在某些实施方式中，所述动物包括猪科动物。

在某些实施方式中，所述敲除包括在所述编码唾液酸转移酶的基因中添加、替换和/或删除一个或多个核苷酸，使所述编码唾液酸转移酶的基因的表达量降低，和/或，使所述编码唾液酸转移酶的基因基本上不表达；和/或，使所述唾液酸转移酶的氨基酸序列改变，和/或，使所述唾液酸转移酶失活。

在某些实施方式中，所述方法包括敲除动物中编码2,3-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,3Gal)受体的基因的全部或部分，和/或敲除动物中编码2,6-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,6Gal)受体的基因的全部或部分，从而使所述动物成为病毒不易感的动物。

在某些实施方式中，所述敲除包括在所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因中添加、替换和/或删除一个或多个核苷酸，使所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因的表达量降低，和/或，使所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因基本上不表达；和/或，使所述SAα2,3Gal受体和/或所述SAα2,3Gal受体的氨基酸序列改变，和/或，使所述SAα2,3Gal受体和/或所述SAα2,3Gal受体失活。

在某些实施方式中，所述敲除涉及敲除所述ST3Gal4基因的2个或多个外显子的全部或部分。

在某些实施方式中，所述敲除涉及敲除所述ST6Gal1基因的1个或多个外显子的全部或部分。

在某些实施方式中，所述方法包括以下的步骤：使用一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因内或其附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，从而使得所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因的一个或更多个外显子全部或部分缺失。

在某些实施方式中，所述DNA内切酶包括Cas核酸酶。

在某些实施方式中，所述Cas核酸酶包括Cas9核酸酶、其同源物、其天然存在分子的重组体、其密码子优化版本，和/或其经修饰版本。

在某些实施方式中，所述方法还包括使用一种或多种向导RNA(gRNA)。

在某些实施方式中，所述gRNA为单链向导RNA(sgRNA)。

在某些实施方式中，所述gRNA能够特异性结合所述ST3Gal4基因中可以包含SEQ ID NO:5-6和20中任一项所示核酸序列的靶区域。

在某些实施方式中，能够特异性结合所述ST3Gal4基因的所述gRNA可以包含SEQ ID NO:9-10和21-22中任一项所示核酸序列。

在某些实施方式中，所述gRNA能够特异性结合所述ST6Gal1基因中可以包含SEQ ID NO:7-8中任一项所示核酸序列的靶区域。

在某些实施方式中，能够特异性结合所述ST6Gal1基因的所述gRNA可以包含SEQ ID NO:11-12和23-24中任一项所示核酸序列。

在某些实施方式中，所述gRNA的5’端包括(X)n所示的核酸序列，其中所述中X为选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。在某些实施方式中，所述n为13或2。

在某些实施方式中，所述gRNA的3’端包括骨架序列。

在某些实施方式中，所述方法包括：(1)提供一种细胞，所述细胞可以包含一种或多种包含所述gRNA的载体或所述载体的体外转录产物；(2)将所述细胞在培养液中进行培养；(3)将培养后的细胞移植至受体雌性非人哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人哺乳动物的子宫中发育；和(4)鉴定步骤(3)的怀孕雌性的后代基因改造的非人哺乳动物中的种系传递。

在某些实施方式中，所述病毒包括流感病毒。在某些实施方式中，所述流感病毒包括人流感病毒和/或禽流感病毒。

在某些实施方式中，所述病毒不易感动物基本上不表达能够与所述病毒的表面蛋白相互作用的内源性的所述SAα2,3Gal受体和/或所述SAα2,6Gal受体。

在某些实施方式中，所述病毒不易感动物基本上不表达内源性的所述SAα2,3Gal受体和/或所述SAα2,6Gal受体。

另一方面，本申请提供一种特异性结合ST3Gal4基因的gRNA，其中所述gRNA特异性结合可以包含SEQ ID NO:5-6和20中任一项所示核酸序列的靶区域。

在某些实施方式中，所述gRNA靶向所述ST3Gal4基因中2个以上不同的外显子。

在某些实施方式中，所述的gRNA可以包含SEQ ID NO:9-10和21-22中任一项所示核酸序列。

另一方面，本申请提供一种特异性结合ST6Gal1基因的gRNA，其中所述gRNA特异性结合可以包含SEQ ID NO:7-8中任一项所示核酸序列的靶区域。

在某些实施方式中，所述gRNA靶向所述ST6Gal1基因中1个外显子。

在某些实施方式中，所述gRNA可以包含SEQ ID NO:11-12和23-24中任一项所示核酸序列。

在某些实施方式中，所述gRNA为单链向导RNA(sgRNA)。

在某些实施方式中，所述gRNA的5’端包括(X)n所示的核酸序列，其中所述中X为选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。

在某些实施方式中，所述n为13或2。

在某些实施方式中，所述gRNA的3’端包括骨架序列。

另一方面，本申请提供一种核酸分子，其编码本申请所述的gRNA。

另一方面，本申请提供可以包含本申请所述的gRNA的序列的载体。

另一方面，本申请提供一种细胞，其可以包含一种或多种本申请所述的gRNA，本申请所述的核酸分子，本申请所述的gRNA载体，和/或本申请所述的gRNA载体的体外转录产物。

另一方面，本申请提供本申请所述的gRNA，本申请所述的核酸分子，本申请所述的gRNA载体，本申请所述的gRNA载体的体外转录产物，和/或本申请所述的细胞在敲除ST3Gal4基因和/或ST6Gal1基因中的用途，或在构建病毒不易感动物中的用途。

另一方面，本申请提供一种ST3Gal4基因缺失细胞株，其是使用本申请所述的gRNA，本申请所述的核酸分子，本申请所述的gRNA载体，本申请所述的gRNA载体的体外转录产物，和/或本申请所述的细胞制备获得的。

在某些实施方式中，所述病毒不易感动物基本上不表达能够与病毒表面蛋白相互作用的内源性SAα2,3Gal受体。

在某些实施方式中，所述病毒不易感动物基本上不表达内源性SAα2,3Gal受体。

另一方面，本申请提供一种ST6Gal1基因缺失细胞株，其是使用本申请所述的gRNA，本申请所述的核酸分子，本申请所述的gRNA载体，本申请所述的gRNA载体的体外转录产物，和/或本申请所述的细胞制备获得的。

另一方面，本申请提供根据本申请所述的方法制备获得的病毒不易感动物，其中所述病毒不易感动物基本上不表达能够与病毒表面蛋白相互作用的内源性SAα2,6Gal受体。

在某些实施方式中，所述病毒不易感动物基本上不表达内源性SAα2,6Gal受体。

另一方面，本申请提供一种制备病毒不易感动物的方法，所述方法包括：

(a)提供本申请所述的病毒不易感动物；以及

(b)将步骤(a)获得的病毒不易感动物与其它动物交配或体外授精或对基于步骤(a)获得的病毒不易感动物进一步进行基因编辑或将人组织、细胞移植至步骤(a)获得的病毒不易感动物中，并进行筛选，得到病毒不易感动物。

在某些实施方式中，所述方法包括：将本申请所述的基本上不表达内源性SAα2,3Gal受体的病毒不易感动物与本申请任一项所述的基本上不表达内源性SAα2,6Gal受体的病毒不易感动物杂交。

在某些实施方式中，所述方法包括：所述杂交后筛选基本上不表达所述内源性SAα2,3Gal受体且不基本上不表达所述内源性SAα2,6Gal受体的动物，得到病毒不易感动物。

另一方面，本申请提供根据本申请所述的方法制备获得的病毒不易感动物。

在某些实施方式中，所述的病毒不易感动物包括家畜。在某些实施方式中，所述的病毒不易感动物包括猪科动物。

另一方面，本申请提供一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其中所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于本申请所述的病毒不易感动物或者其后代。

另一方面，本申请提供一种组织或器官或其培养物，其中所述组织或器官或其培养物来源于本申请所述的病毒不易感动物或者其后代。

另一方面，本申请提供一种特异靶向敲除ST3Gal4基因的CRISPR/Cas9系统，其使用含有本申请所述的能够特异的靶向ST3Gal4基因的gRNA的DNA序列。

另一方面，本申请提供一种能够特异性靶向ST3Gal4基因的核酸分子试剂盒，其中，所述试剂盒包括本申请所述的gRNA。

另一方面，本申请提供一种能够特异的靶向ST3Gal4基因的成套核酸分子，其中，所述成套核酸分子包括本申请所述的sgRNA和编码Cas9蛋白的核酸分子。

另一方面，本申请提供一种特异靶向敲除ST6Gal1基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，使用含有本申请所述的能够特异的靶向ST6Gal1基因的gRNA的DNA序列。

另一方面，本申请提供一种能够特异性靶向ST6Gal1基因的核酸分子试剂盒，其中，所述试剂盒包括本申请所述的gRNA。

另一方面，本申请提供一种能够特异的靶向ST6Gal1基因的成套核酸分子，其中，所述成套核酸分子包括本申请所述的sgRNA和编码Cas9蛋白的核酸分子。

另一方面，本申请提供本申请所述的病毒不易感动物在抗病毒产品开发，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。

另一方面，本申请提供本申请所述的病毒不易感动物在筛选、验证、评价或研究抗病毒药物或组合药物、和/或药效研究方面的应用。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：

图1显示的是扩增巴马小型猪和长白猪的ST3Gal4基因的测序比对结果。猪的ST3Gal4基因可以如GenBank Gene ID：396602所记载。

图2显示的是扩增巴马小型猪和长白猪的ST6Gal1基因的测序比对结果。猪的ST6Gal1基因可以如GenBank Gene ID：100302026所记载。

图3显示的是猪基因敲除载体质粒图谱的结果。

图4显示的是抗性载体质粒图谱的结果。

图5显示的是猪的ST3Gal4基因敲除测序产物结果。猪的ST3Gal4基因可以如GenBank Gene ID：396602所记载。

图6显示的是猪的ST6Gal1基因敲除测序产物结果。猪的ST6Gal1基因可以如GenBank Gene ID：100302026所记载。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

术语定义

在本申请中，术语“唾液酸转移酶”通常是指哺乳动物唾液酸转移酶家族。所述唾液酸转移酶可以包括α2,3-、α2,6-、α2,8-等亚型。所述唾液酸转移酶具有二型糖蛋白拓扑结构，并在催化区上具备L唾液酸修饰区和S唾液酸修饰区。所述唾液酸转移酶参与细胞粘附、迁徙和突触形成，并且参与神经系统的发育和重塑。所述编码唾液酸转移酶的基因可以包括ST3Gal4基因、ST6Gal1基因、ST3Gal3基因和/或ST3Gal6基因。

在本申请中，术语“2,3-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,3Gal)受体”通常是指一种唾液酸转移酶，其也可称为Sialyltransferase 4C(Beta-Galactoside Alpha-2,3-Sialytransferase。其可以位于动物细胞(例如哺乳动物的细胞，例如猪的体细胞)的表面。例如，所述SAα2,3Gal受体可以位于动物的呼吸道上皮细胞。本申请中，所述唾液酸可以指一类化合物，其可以作为病毒(例如流感病毒)的受体决定簇。所述唾液酸可以分为5-N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和5-N-羟乙酰神经氨酸(Neu5GC)，也可以包括O-乙酰-5-N-乙酰神经氨酸。所述唾液酸可以通过其第二位的碳原子以糖苷键(例如SAα2,3Gal或SAα2,6Gal)链接于糖链末端的半乳糖基上。不同的(流感)病毒可以特异性地识别不同结构域的糖链(例如,3-半乳糖唾液酸即SAα2,3Gal)，并将其作为结合的受体。

在本申请中，术语“2,6-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,6Gal)受体”通常是指一种唾液酸转移酶，其也可称为Sialyltransferase 1(Beta-Galactoside Alpha-2,6-Sialyltransferase)。类似于所述2,3-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,3Gal)受体，所述2,6-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,6Gal)受体也可以位于动物的呼吸道上皮细胞。也可以被(流感)病毒特异性识别，并将其作为结合的受体。

在本申请中，术语“ST3Gal4基因”通常是指编码2,3-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,3Gal)受体的基因。在猪中，ST3Gal4基因在GenBank中的Gene ID为396602。猪ST3Gal4基因可以包括16个外显子。猪ST3Gal4基因可以有多个转录本(isoform)，例如可以包括X3、X6、X2、X5和X1。

在本申请中，术语“ST6Gal1基因”通常是指编码2,6-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,6Gal)受体的基因。在猪中，ST6Gal1基因在GenBank中的GeneID为100302026。猪ST6Gal1基因可以包括14个外显子。猪ST6Gal1基因可以有多个转录本(isoform)，例如可以包括X3、X2和X1。

在本申请中，术语“病毒不易感的动物”通常是指不会或不容易被病毒(例如流感病毒)感染的动物。

在本申请中，术语“敲除”通常是指通过一定的途径使机体特定的基因(例如，编码2,3-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,3Gal)受体的基因和/或编码“2,6-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,6Gal)受体的基因)失活或缺失。在本申请中，所述敲除的途径包括DNA同源重组、插入突变、iRNA 等，例如，可以使用CRISPR/Cas9系统进行敲除。

在本申请中，术语“病毒易感”通常是指生物体容易被病毒(例如流感病毒)感染的状态。在本申请中，所述感染可以指病毒侵入生物体并在体内繁殖的病理现象。所述感染可以引起组织损伤甚至临床症状。所述感染可以包括隐性感染(silent infection)，即仅引起机体产生特异性的免疫应答，不引起或只引起轻微的组织损伤，因而在临床上不显出任何症状。

在本申请中，术语“家畜”通常是指人类饲养驯化，且可以人为控制其繁殖的动物(例如哺乳动物)。所述家畜可以包括猪、牛、羊、马、猫、狗、骆驼和/或家兔。

在本申请中，术语“猪科动物”通常是指Suidae，即偶蹄目猪形亚目的一科。在本申请中，所述猪科动物可以包括属于猪属Sus的动物。例如，所述猪科动物可以包括家猪(Sus scrofa domesticus)。

在本申请中，术语“巴马小型猪”通常是指巴马香猪，其也可以称为“两头乌”。所述巴马小型猪具有头臀黑、其余白的毛色特点，耐粗饲、多产、性早熟。

在本申请中，术语“长白猪”通常是指丹麦猪和约克夏猪杂交获得的瘦肉型猪种。其体躯特长，毛色全白，体躯呈楔形，前轻后重，生长快、饲料利用率高，瘦肉率高。长白猪多用于培育瘦肉型品种和制备杂交猪种。长白猪存在体质较弱、抗逆性较差等缺陷。

在本申请中，术语“表达量降低”通常是指与野生型相比，ST3Gal4基因和/或ST6Gal1基因在生物体的转录和/或表达水平降低。在本申请中，所述降低可以指与野生型的所述动物(例如可以为野生型的猪)相比，降低了至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多。在本申请中，所述降低可以为在生物体中基本上不转录和/或不表达。

在本申请中，术语“基本上不表达”通常是指与野生型的所述动物(例如可以为野生型的猪)相比，SAα2,3Gal受体和/或SAα2,6Gal受体在生物体中的表达水平降低至约15％以下、至约14％以下、至约13％以下、至约12％以下、至约11％以下、至约10％以下、至约9％以下、至约8％以下、至约7％以下、至约6％以下、至约5％以下、至约4％以下、至约3％以下、至约2％以下、至约1％以下、至约0.5％以下或更少。

在本申请中，术语“核酸内切酶”通常是指水解DNA分子链内部磷酸二酯键生成寡/寡聚核苷酸的一类核酸水解酶。所述核酸内切酶可以具备严格的酶切位点。在本申请中，所述核酸内切酶可以具有碱基特异性。在本申请中，所述核酸内切酶可以包括分解DNA的酶。

在本申请中，术语“单链断裂(SSB)”通常是指DNA双链中仅单链发生断裂的DNA损伤。在所述单链断裂发生后，细胞可能会利用多种DNA损伤发现和修复机制对其进行修复，例如，可以包括非同源末端连接(NHEJ，即可以不依赖于同源DNA序列，通过DNA连接酶将断裂的DNA末端直接链接)修复和同源重组(HR)修复。在本申请中，针对所述单链断裂的修复可以为NHEJ修复。所述NHEJ修复可以带来缺失突变。

在本申请中，术语“双链断裂(DSB)”通常是指DNA双链均发生断裂的DNA损伤。在本申请中，针对所述单链断裂的修复也可以带来缺失突变。

在本申请中，术语“Cas核酸酶”通常是指与CRISPR序列互补的一类酶，能够使用CRISPR序列作为向导(guide)，从而识别和切割特定的DNA链。Cas蛋白的非限制性实例包括：Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csxl2)、CaslO、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4，和/或他们的同系物、或其修饰形式。在一些实施例中，该Cas蛋白是Cas9蛋白。

在本申请中，术语“Cas9核酸酶”，也称为Csn1或Csx12，通常是指II型CRISPR/Cas系统中一类既参与crRNA生物合成又参与摧毁入侵DNA的蛋白质。Cas9蛋白通常包括RuvC核酸酶结构域和HNH核酸酶结构域，分别切割双链DNA分子的两条不同的链。已经在不同的细菌物种如嗜热链球菌(S.thermophiles)、无害利斯特氏菌(Listeria innocua)(Gasiunas，Barrangou et al.2012；Jinek，Chylinski et al.2012)和化脓性链球菌(S.Pyogenes)(Deltcheva，Chylinski et al.2011)中描述了Cas9蛋白。例如，化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白，其氨基酸序列参见SwissProt数据库登录号Q99ZW2；脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号A1IQ68；嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号Q03LF7；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号J7RUA5。

在本申请中，术语“向导RNA(gRNA)”通常是指CRISPR中可以包含的RNA组分，也可称为guide RNA(gRNA)。向导RNA一般可以包含向导序列(spacer)和骨架序列，这两个序列可以在同一个分子中或不同的分子中。向导RNA的作用可以包括引导Cas9蛋白切割与所述向导序列互补的DNA位点(即可以引导Cas9蛋白切割靶区域)。在本申请中，所述向导序列可以是与所述靶区域具有足够互补性，以便所述向导序列与该靶区域杂交，并且引导CRISPR复合物与所述靶区域特异性结合的任何多核苷酸序列。在本申请中，所述向导序列与其对应的所述靶区域之间的互补程度可以为约50％以上或更多。在本申请中，所述向导序列的长度为可以为约12个以上核苷酸或更多。在本申请中，所述靶区域可以为DNA双链区域，其可以包括可以包含直接与所述向导RNA互补的核苷酸序列的DNA单链，也可以包括与该DNA单链相互补的另一DNA单链。

在本申请中，骨架序列可以为向导RNA中必须的除向导序列之外的其余序列。例如，所述骨架序列可以包含crRNA序列(tracr配对序列，CRISPR RNA)和tracrRNA(反式激活crRNA)序列，这些序列一般不会因为靶区域的变化而改变。在某些情况下，所述crRNA序列可以被认为包括所述向导序列的核苷酸序列。

在本申请中，所述向导RNA可以为单链向导RNA(sgRNA)，也可以为由crRNA和tracrRNA组成的双链向导RNA。在本申请中，骨架序列的结构可以来源自任何市售和/或序列已知的载体/质粒和/或文献。例如，本申请涉及的骨架载体可以如文献(Nowak et al.Nucleic Acids Research 2016.44:9555-9564)的Figure 1(图1)中A和B，Figure 3(图3)中A、B、C，以及Figure 4(图4)中A、B、C、D、E中所记载的除spacer序列之外的部分。

在本申请中，术语“单链向导RNA(sgRNA)”通常是嵌合型单链向导RNA，一般可以包含向导序列(spacer)、crRNA序列和tracrRNA序列。在某些情况下，所述crRNA序列可以被认为可以包含了所述向导序列。在此情况下，所述单链向导RNA可以被认为包括crRNA序列和tracrRNA序列。其中所述crRNA序列和tracrRNA序列可以通过环形成序列(linker loop)连接成为单个分子。在本申请中，所述环形成序列在长度上可以为四个核苷酸，例如可以为GAAA。也可以使用更长或更短的环形成序列，例如可以包括三联体(例如，AAA)、和另外的核苷酸(例如C或G)。在本申请中，所述环形成序列可以包括CAAA和AAAG。在本申请中，所述环形成序列的数目可以为2个或以上。在本申请中，所述单链向导RNA可以进一步包括一种转录终止序列，例如一个Poly-U序列。

在本申请中，术语“特异性结合”通常是指特定的一种核苷酸序列可结合另一种核苷酸序列。例如，所述向导序列(spacer)可以特异性结合相应的靶区域。所述特异性可以通过亲和力和/或结合强度等指标来测定。

在本申请中，术语“5’-N _(17-20)-NGG3’”通常是指靶区域的结构，其自5’端起依次包括与向导序列(spacer)互补的核苷酸序列N _17-20和PAM。其中，PAM序列可以为-NGG的形式，“N”可以是A,T,C,G中的任何一个。Cas9可以使PAM序列前形成双链断裂(Double Strand Break)。在本申请中，N _17-20可以为17-20个长度的核苷酸。

在本申请中，术语“gRNA载体”通常是指能够表达向导RNA的载体。在本申请中，所述gRNA载体在体内转录后可以产生gRNA，例如，可以产生sgRNA(例如，针对于猪ST3Gal4 基因和/或ST6Gal1基因的sgRNA)。在本申请中，所述gRNA还可以表达Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶。在本申请中，所述gRNA载体可以为双链载体，也可以为单链载体。

在本申请中，术语“体外转录产物”通常是指发生在体外的转录过程所得到的产物。在本申请中，所述体外转录产物可以包括sgRNA和/或Cas9mRNA。所述体外转录可以使用RNA聚合酶、NTP、转录缓冲液、PCR Mix和/或去RNA酶H ₂O等试剂。在本申请中，所述体外转录可以使用sgRNA体外转录试剂盒，并且可以根据其中的说明书进行操作

在本申请中，术语“种系传递”通常是指在种系的繁殖过程中可以留存的遗传特征。在本申请中，所述种系可以为自世系的初期来源相同或相近的一小群物种。例如，在本申请所述动物的种系内和/或种系间繁殖(例如杂交)产生后代(例如子代)的基因组中，其ST3Gal4基因和/或ST6Gal1基因的全部或部分可以继续为被敲除的形式。

在本申请中，术语“流感病毒”通常是指一种能够导致流感的病毒。所述流感病毒可以称为正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)病毒。所述流感病毒可以属于负链RNA病毒。所述流感病毒可以感染人、哺乳动物和/或鸟类。例如，所述流感病毒可以微为三类：甲型流感病毒(例如可以感染人和鸟类)；乙型流感病毒(例如可以感染人)和丙型流感病毒(例如可以感染人和哺乳动物)。

在本申请中，术语“禽流感病毒”通常是指能够引起鸟禽类流行性感冒(Avian Influenza，AI)的病毒。一般禽流感病毒可以感染鸟类，少数情况下可以感染猪。根据其套膜上的血凝素(16个亚型，H1-H16)和神经氨酸酶(9个亚型，N1-N9)的抗原型。在本申请中，所述禽流感病毒(例如H5N1)也可以感染给猪和/或人类。例如，所述禽流感病毒可以包括甲型H5N1、甲型H7N9、甲型H7N7和甲型H9N2。

在本申请中，术语“人流感病毒”通常是指流行性感冒(Influenza)等传染性疾病的病毒。在本申请中，所述人流感病毒可以包括甲型流感病毒；乙型流感病毒和丙型流感病毒。所述流行性感冒的症状可以包括高烧、流鼻水、喉咙痛、肌肉酸痛、头痛、咳嗽和/或疲倦感。例如，猪流感病毒也可以感染人类。所述猪流感病毒可以包括甲型H1N1和H3N2。

在本申请中，术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。

在本申请中，术语“可以包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。

在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。

发明详述

在本申请中，例如，所述编码唾液酸转移酶的基因可以包括ST3Gal4基因、ST6Gal1基因、ST3Gal3基因和/或ST3Gal6基因。例如，所述编码唾液酸转移酶的基因中的至少一个基因(例如，1个、2个、3个、4个或更多个)基因可以被敲除。

在本申请中，例如，所述唾液酸转移酶可以包括2,3-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,3Gal)受体，和/或2,6-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,6Gal)受体。

例如，所述编码2,3-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,3Gal)受体的基因可以包括ST3Gal4基因。例如，所述编码2,3-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,6Gal)受体的基因可以包括ST6Gal1基因。

在本申请中，所述动物可以包括家畜。例如，所述动物可以包括猪科动物。例如，所述猪科动物可以为家猪，例如可以为长白猪。

在本申请中，例如，所述敲除可以包括在所述编码唾液酸转移酶的基因中添加、替换和/或删除一个或多个核苷酸，使所述编码唾液酸转移酶的基因的表达量降低(例如，与野生型的猪相比，所述编码唾液酸转移酶的基因的在体内的转录和/或表达水平降低了至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多)，和/或，使所述编码唾液酸转移酶的基因基本上不表达(例如，与野生型的猪相比，所述编码唾液酸转移酶的基因在体内的转录和/或表达水平降低至15％以下、至14％以下、至13％以下、至12％以下、至11％以下、至10％以下、至9％以下、至8％以下、至7％以下、至6％以下、至5％以下、至4％以下、至3％以下、至2％以下、至1％以下、至0.5％以下、至0.1％以下或更少，甚至可以达到利用本领域常规的检测手段难以检测出的水平)；和/或，使所述唾液酸转移酶的氨基酸序列改变，和/或，使所述唾液酸转移酶失活。

在某些实施方式中，所述方法可以包括敲除动物中编码2,3-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,3Gal)受体的基因的全部或部分，和/或敲除动物中编码2,6-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,6Gal)受体的基因的全部或部分，从而使所述动物成为病毒不易感的动物。

在本申请中，例如，所述敲除可以包括在所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因中添加、替换和/或删除一个或多个核苷酸，使所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因的表达量降低(例如，与野生型的猪相比，所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因的在体内的转录和/或表达水平降低了至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多)，和/或，使所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因基本上不表达(例如，与野生型的猪相比，所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因在体内的转录和/或表达水平降低至15％以下、至14％以下、至13％以下、至12％以下、至11％以下、至10％以下、至9％以下、至8％以下、至7％以下、至6％以下、至5％以下、至4％以下、至3％以下、至2％以下、至1％以下、至0.5％以下、至0.1％以下或更少，甚至可以达到利用本领域常规的检测手段难以检测出的水平)；

和/或，使所述SAα2,3Gal受体和/或所述SAα2,6Gal受体的氨基酸序列改变，和/或，使所述SAα2,3Gal受体和/或所述SAα2,6Gal受体失活。

所述敲除可以使用本领域任意已知能够实现将所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因中任意碱基对和/或核苷酸进行添加、替换和/或删除的技术(例如使用CRISPR/Cas系统、ZFN、TALENs等技术)，以及这些技术的任意组合。

在本申请中，例如，所述敲除可以涉及敲除所述ST3Gal4基因的2个或多个外显子的全部或部分。

在本申请中，例如，所述敲除可以涉及敲除所述ST6Gal1基因的1个或多个外显子的全部或部分。

在本申请中，例如，所述方法可以包括以下的步骤：使用一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因内或其附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，从而使得所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因的一个或更多个外显子全部或部分缺失。

在本申请中，例如，所述DNA内切酶可以包括Cas核酸酶。

在本申请中，例如，所述Cas核酸酶可以包括Cas9核酸酶、其同源物、其天然存在分子的重组体、其密码子优化版本，和/或其经修饰版本。

在本申请中，Cas9核酸酶序列和结构可以为本领域技术人员所公知的(参见例如"Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes,Ferretti J.J.,McShan ff.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.expand/collapse author list McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001)；uCRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602- 607(2011)；及"A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity,Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.，Hauer M.，Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)。

在本申请中，所述Cas9同源物包括但不限于酿脓链球菌(S.pyogenes)和嗜热链球菌(S.thermophilus)。其它合适的Cas9核酸酶和序列基于本申请内容对于本领域技术人员也是显然的，其序列可以参见Chylinski，Rhun，and Charpentier,"The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems"(2013)RNA Biology 10:5，726-737。

在本申请中，所述Cas9核酸酶可以包括可以包含Cas9蛋白质或其片段的蛋白质，例如可以可以包含与野生型Cas9相比至少约70％相同的，至少约80％相同的，至少约90％相同的，至少约95％相同的，至少约98％相同的，至少约99％相同的，至少约99.5％相同的，或至少约99.9％相同的氨基酸序列。

在本申请中，例如，所述方法还可以包括使用一种或多种向导RNA(gRNA)。

在本申请中，例如，所述gRNA可以为单链向导RNA(sgRNA)。

在本申请中，例如，所述gRNA能够特异性结合所述ST3Gal4基因中可以包含SEQ ID NO:5-6中任一项所示核酸序列的靶区域。例如，所述gRNA能够特异性结合所述ST3Gal4基因中可以包含SEQ ID NO:5-6和20中任一项所示核酸序列的靶区域。

在本申请中，能够特异性结合所述ST3Gal4基因的所述gRNA的数量可以为1个以上(例如，可以为1个、2个或更多)。例如，可以使用2个(1对)所述特异性结合所述ST3Gal4基因的gRNA。1个以上能够特异性结合所述ST3Gal4基因的所述gRNA可以靶向所述ST3Gal4基因中不同的外显子，也可以靶向所述ST3Gal4基因中的同一个外显子。

此时，这2个所述gRNA可以位于同一表达载体上(例如，位于同一敲除载体上)，也可以分别位于不同的表达载体上。分别包含不同的所述gRNA的表达载体，可以同时向受试的动物(例如猪)施用，也可以存在先后和/或间隔地向受试的动物施用。

当所述gRNA的数量为2个以上时，所述gRNA所特异性结合的靶序列可以存在一定的间距/间隔。例如，2个所述gRNA所特异性结合的靶序列之间的碱基的数目为3n+1，其中n为0以上的整数。例如，在ST3Gal4基因中，2个所述gRNA所特异性结合的靶序列之间间隔的碱基的数目为4个、7个、10个、13个或更多。

在本申请中，例如，能够特异性结合所述ST3Gal4基因的所述gRNA可以包含SEQ ID NO:9-10中任一项所示核酸序列。例如，能够特异性结合所述ST3Gal4基因的所述gRNA可以包含SEQ ID NO:9-10和21-22中任一项所示核酸序列。

在本申请中，例如，所述gRNA能够特异性结合所述ST6Gal1基因中可以包含SEQ ID NO:7-8中任一项所示核酸序列的靶区域。

在本申请中，能够特异性结合所述ST6Gal1基因的所述gRNA的数量可以为1个以上(例如，可以为1个、2个或更多)。例如，可以使用2个(1对)所述特异性结合所述ST6Gal1基因的gRNA。1个以上能够特异性结合所述ST6Gal1基因的所述gRNA可以靶向所述ST3Gal4基因中不同的外显子，也可以靶向所述ST6Gal1基因中的同一个外显子。

当所述gRNA的数量为2个以上时，所述gRNA所特异性结合的靶序列可以存在一定的间距/间隔。例如，2个所述gRNA所特异性结合的靶序列之间的碱基的数目为3n+1，其中n为0以上的整数。例如，在ST6Gal1基因中，2个所述gRNA所特异性结合的靶序列之间间隔的碱基的数目为4个、7个、10个、13个或更多。

在本申请中，例如，能够特异性结合所述ST6Gal1基因的所述gRNA可以包含SEQ ID NO:11-12中任一项所示核酸序列。例如，能够特异性结合所述ST6Gal1基因的所述gRNA可以包含SEQ ID NO:11-12和23-24中任一项所示核酸序列。

在本申请中，例如，所述gRNA的5’端可以包括(X)n所示的核酸序列，其中所述中X为选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。在本申请中，例如，所述n可以为13或2。

在本申请中，例如，所述gRNA的3’端可以包括骨架序列。

在本申请中，例如，所述方法可以包括：(1)提供一种细胞，所述细胞可以包含一种或多种所述gRNA载体或所述gRNA载体的体外转录产物；(2)将所述细胞在培养液中进行培养；(3)将培养后的细胞移植至受体雌性非人哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人哺乳动物的子宫中发育；和(4)鉴定步骤(3)的怀孕雌性的后代基因改造的非人哺乳动物中的种系传递。

在本申请中，具体而言，所述方法可以包括：第一步，可以按照本申请所述的方法制备获得能够表达所述gRNA的sgRNA载体。第二步，可以将获得的所述sgRNA载体的体外转录产物(例如，还可以包括Cas9mRNA)进行混合，将混合液注射到所述动物受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移到培养液中进行培养。第三步，挑选发育良好的细胞期胚胎移植至所述雌性非人哺乳动物的输卵管中继续发育，得到所述非人哺乳动物的F0代。第四步，将所述F0代提取基因组利用PCR技术进行检验，验证细胞中的所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因是否被成功敲除。

在本申请中，例如，所述病毒可以包括流感病毒。在本申请中，例如，所述流感病毒可以包括人流感病毒和/或禽流感病毒。

在本申请中，例如，所述病毒不易感动物可以基本上不表达能够与所述病毒的表面蛋白相互作用的内源性的所述SAα2,3Gal受体和/或所述SAα2,6Gal受体(例如，与野生型的猪相比，内源性的所述SAα2,3Gal受体和/或所述SAα2,6Gal受体的表达水平降低至15％以下、至14％以下、至13％以下、至12％以下、至11％以下、至10％以下、至9％以下、至8％以下、至7％以下、至6％以下、至5％以下、至4％以下、至3％以下、至2％以下、至1％以下、至0.5％以下、至0.1％以下或更少，甚至可以达到利用本领域常规的检测手段难以检测出的水平)。

在本申请中，例如，所述病毒不易感动物可以基本上不表达内源性的所述SAα2,3Gal受体和/或所述SAα2,6Gal受体(例如，与野生型的猪相比，内源性的所述SAα2,3Gal受体和/或所述SAα2,6Gal受体的表达水平降低至15％以下、至14％以下、至13％以下、至12％以下、至11％以下、至10％以下、至9％以下、至8％以下、至7％以下、至6％以下、至5％以下、至4％以下、至3％以下、至2％以下、至1％以下、至0.5％以下、至0.1％以下或更少，甚至可以达到利用本领域常规的检测手段难以检测出的水平)。

另一方面，本申请提供一种特异性结合ST3Gal4基因的gRNA，其中所述gRNA特异性结合可以包含SEQ ID NO:5-6中任一项所示核酸序列的靶区域。例如，其中所述gRNA特异性结合可以包含SEQ ID NO:5-6和20中任一项所示核酸序列的靶区域。

在本申请中，例如，所述gRNA可以靶向所述ST3Gal4基因中2个以上不同的外显子。

在本申请中，例如，所述的gRNA可以包含SEQ ID NO:9-10中任一项所示核酸序列。例如，所述的gRNA可以包含SEQ ID NO:9-10和21-22中任一项所示核酸序列。

另一方面，本申请提供一种特异性结合ST6Gal1基因的gRNA，其中所述gRNA特异性结合包含SEQ ID NO:7-8中任一项所示核酸序列的靶区域。

在本申请中，例如，所述gRNA可以靶向所述ST6Gal1基因中1个外显子。

在本申请中，例如，所述gRNA可以包含SEQ ID NO:11-12中任一项所示核酸序列。例如，所述gRNA可以包含SEQ ID NO:11-12和23-24中任一项所示核酸序列。

在本申请中，例如，所述gRNA可以为单链向导RNA(sgRNA)。

在本申请中，所述gRNA可以符合5’-N(17-20)-NGG3’或5’-CCN-N(17-20)-3’的序列排列规则。例如，所述NGG和/或CCN可以为PAM序列。

在本申请中，例如，所述gRNA的5’端可以包括(X)n所示的核酸序列，其中所述中X为选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。

在本申请中，例如，所述n可以为13，又例如，所述n可以为2。

在本申请中，例如，所述gRNA的3’端可以包括骨架序列。

在本申请中，所述核酸分子可以涵盖RNA以及单链和/或双链DNA。所述核酸分子可以是天然存在的，例如，在基因组、转录物、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、snRNA、质粒、粘粒、染色体、染色单体、或其它天然存在的核酸分子的背景中。所述核酸分子也可以是非天然存在的分子，例如重组DNA或RNA、人工染色体、工程化基因组、或其片段、或合成DNA、RNA、DNA/RNA杂合物，或者包括非天然存在的核苷酸或核苷。例如，在化学合成分子的情况中，所述核酸分子可以包含核苷类似物，诸如具有经化学修饰的碱基或糖的类似物，和主链修饰。

另一方面，本申请提供包含本申请所述的gRNA的序列的载体。

在本申请中，所述载体也可以包含能够翻译得到所述gRNA序列的核苷酸序列的载体。在本申请中，所述载体可以包括质粒、病毒载体、粘粒、人工染色体和噬菌粒。所述载体可以含有一种或多种适合于用于鉴定和/或选择细胞的标志物序列。例如，所述标志物可以包括编码提高或降低对抗生素(例如卡那霉素、氨苄青霉素)或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因、编码其活性通过本领域中已知的标准测定法可检测的酶(例如半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或萤光素酶)的基因、和明显影响经转化的或经转染的细胞、宿主、集落或噬斑的表型的基因。例如，所述载体可以为PX系列、pUC系列、pGEM系列、pET系列、pBAD系列、pTET系列、或pGEX序列的载体。

另一方面，本申请提供一种细胞，其包含一种或多种本申请所述的gRNA，本申请所述的核酸分子，本申请所述的gRNA载体，和/或本申请所述的gRNA载体的体外转录产物。

在本申请中，所述细胞可以包括真核细胞。例如，所述细胞可以包括哺乳动物细胞。例如，所述细胞可以包括CHO细胞、HEK细胞和/或猪体细胞。例如，所述细胞可以为成纤维细胞，例如可以为猪成纤维细胞。

在本申请中，由于动物(例如猪)内源性的ST3Gal4基因和/或ST6Gal1基因被敲除，使得猪的SAα2,3Gal受体和/或SAα2,6Gal受体的表达量显著下调(甚至不表达)，和/或分别丧失了SAα2,3Gal受体与禽流感病毒的表面蛋白的结合能力，SAα2,6Gal受体与人流感病毒的表面蛋白的结合能力，从而至少避免动物(例如猪)同时感染禽流感病毒和人流感病毒，避免动物(例如猪)作为禽流感病毒和人流感病毒重组变异的容器(mixing vessel)和中间宿主。利用本申请所述的gRNA等构建的病毒不易感动物，不会作为上述的中间宿主在同时感染禽流感病毒和人流感病毒，从而不会产生新的可以感染哺乳动物(例如猪和/或人)的新的流感病毒，增加安全性。

另一方面，本申请提供一种ST3Gal4基因缺失细胞株，其是使用本申请所述的特异性结合ST3Gal4基因的靶序列的gRNA，本申请所述的核酸分子，本申请所述的gRNA载体，本申请所述的gRNA载体的体外转录产物，和/或本申请所述的细胞制备获得的。

在本申请中，例如，所述病毒不易感动物可以基本上不表达能够与病毒表面蛋白相互作用的内源性SAα2,3Gal受体。

在本申请中，例如，所述病毒不易感动物可以基本上不表达内源性SAα2,3Gal受体。

另一方面，本申请提供一种ST6Gal1基因缺失细胞株，其是使用本申请所述的特异性结合ST6Gal1基因的gRNA，本申请所述的核酸分子，本申请所述的gRNA载体，本申请所述的gRNA载体的体外转录产物，和/或本申请所述的细胞制备获得的。

在本申请中，例如，所述病毒不易感动物可以基本上不表达内源性SAα2,6Gal受体。

另一方面，本申请提供一种制备病毒不易感动物的方法，所述方法可以包括：

(a)提供本申请所述的病毒不易感动物；以及

在本申请中，例如，所述方法可以包括：将本申请所述的基本上不表达内源性SAα2,3Gal受体的病毒不易感动物与本申请任一项所述的基本上不表达内源性SAα2,6Gal受体的病毒不易感动物杂交。

在本申请中，例如，所述方法可以包括：所述杂交后筛选基本上不表达所述内源性SAα2,3Gal受体且不基本上不表达所述内源性SAα2,6Gal受体的动物，得到病毒不易感动物。

例如，可以将敲除ST3Gal4基因的纯合子ST3Gal4基因敲除猪品系中的猪与敲除ST6Gal1 基因的纯合子ST6Gal1基因敲除猪品系中的猪杂交，通过进一步有性生殖(例如杂交，利用杂交后进一步自交)，扩大种群数量，建立稳定的ST6Gal1和ST3Gal4双基因敲除猪品系。

另一方面，本申请提供了一种根据本申请所述的方法制备获得的病毒不易感动物。

在本申请中，例如，所述的病毒不易感动物可以包括家畜。在本申请中，例如，所述的病毒不易感动物可以包括猪科动物。例如，所述的病毒不易感动物可以包括猪。

在本申请所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物中，或者是在本申请所述的组织或器官或其培养物中，编码唾液酸转移酶的基因表达量可以被降低，例如所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因的表达量可以被降低(例如，与野生型的猪相比，所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因的在体内的转录和/或表达水平降低了至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多)，和/或，编码唾液酸转移酶的基因基本上不表达，例如所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因基本上不表达(例如，与野生型的猪相比，所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因在体内的转录和/或表达水平降低至15％以下、至14％以下、至13％以下、至12％以下、至11％以下、至10％以下、至9％以下、至8％以下、至7％以下、至6％以下、至5％以下、至4％以下、至3％以下、至2％以下、至1％以下、至0.5％以下、至0.1％以下或更少，甚至可以达到利用本领域常规的检测手段难以检测出的水平)；

和/或，在本申请所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物中，或者是在本申请所述的组织或器官或其培养物中，所述SAα2,3Gal受体和/或所述SAα2,6Gal受体的氨基酸序列被改变，和/或，所述SAα2,3Gal受体和/或所述SAα2,6Gal受体丧失了活性(例如丧失了与病毒的蛋白特异性结合的能力)。

另一方面，本申请提供一种能够特异性靶向ST3Gal4基因的核酸分子试剂盒，其中，所述试剂盒可以包括本申请所述的gRNA。

另一方面，本申请提供一种能够特异的靶向ST3Gal4基因的成套核酸分子，其中，所述成套核酸分子可以包括本申请所述的sgRNA和编码Cas9蛋白的核酸分子。

另一方面，本申请提供一种能够特异性靶向ST6Gal1基因的核酸分子试剂盒，其中，所述试剂盒可以包括本申请所述的gRNA。

另一方面，本申请提供一种能够特异的靶向ST6Gal1基因的成套核酸分子，其中，所述成套核酸分子可以包括本申请所述的sgRNA和编码Cas9蛋白的核酸分子。

在本申请中，所述试剂盒可以包括Cas蛋白，和/或编码Cas蛋白的核酸分子。所述试剂盒可以包括打靶载体。

在本申请中，所述的成套核酸分子中，所述sgRNA和编码Cas9蛋白的核酸分子可以位于同一载体中，也可以位于不同的载体中。

在本申请中，所述药理学、免疫学、微生物学和医学研究的常规方法，以及筛选、验证、评价或研究抗病毒药物的方法和抗病毒药物的药效研究的方法均为本领域常规的方法，本领域技术人员可以参考本领域公开的文献和教科书获悉。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的病毒不易感动物、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。

实施例

实施例1扩增目的基因

分别获得巴马小型猪和长白猪的基因组DNA，将该基因组DNA作为扩增模板，利用表1中的引物，分别扩增ST3Gal4基因(长度约537bp或约664bp)和ST6Gal1基因(长度约698bp或约958bp)。例如，ST3Gal4对应的正向引物的序列可以如SEQ ID：1所示，ST3Gal4对应的反向引物的序列可以如SEQ ID：2所示，例如，ST6Gal1对应的正向引物的序列可以如SEQ ID：3所示，ST6Gal1对应的反向引物的序列可以如SEQ ID：4所示。

表1扩增ST3Gal4基因和ST6Gal1基因的引物

PCR反应体系如下：

基因组DNA 2μL

正向引物(10pM)1μL；反向引物(10pM)1μL

2X Taq酶预混液25μL

dd H ₂O 21μL

总计 50μL

PCR反应条件如下：

将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳(1％，即1g琼脂糖凝胶加入到100mL电泳缓冲液中)，电泳结束后在紫外线下切下目的条带，然后使用胶回收试剂盒(QIAGEN)回收目的条带并进行测序(结果参见图1和图2)。

结果发现无论是巴马小型猪还是长白猪，其ST3Gal4基因和ST6Gal1基因的序列均与数据库记载的核苷酸序列完全一致(参见表2)。可见已正确扩增得到了巴马小型猪和长白猪的ST3Gal4基因和ST6Gal1基因。

表2目标序列

物种	基因名称	GenBank Gene ID
猪	ST3Gal4	396602
猪	ST6Gal1	100302026

实施例2敲除(Knock out)sgRNA设计

利用在线设计工具Cas-Designer(http://www.rgenome.net/cas-designer/)分别输入猪的ST3Gal4基因和ST6Gal1基因的核苷酸序列进行sgRNA设计。

选择sgRNA序列进行后续敲除实验。为了进一步提高敲除效率，每一个基因都设计了一对sgRNA，从而可以同时使用进行敲除。

sgRNA所对应的靶序列的核苷酸序列参见表3。其中标下划线(_)的核苷酸为PAM区域。其中，特异性结合ST3Gal4基因的sgRNA1和sgRNA2的靶序列分别位于ST3Gal4基因的2个不同的外显子。特异性结合ST6Gal1基因的sgRNA1和sgRNA2的靶序列位于ST6Gal1基因的同一个外显子。

表3敲除ST3Gal4基因和ST6Gal1基因的sgRNA

实施例3构建敲除(Knock out)载体

1、载体采用购置于addgene公司的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，载体具体序列见http://www.addgene.org/42230/sequences/；

2、f1ori为单链DNA复制起始位点，Cas9为CRISPR-Cas9系统中Cas9蛋白编码序列，AmpR promoter为AmpR基因启动子，AmpR为Amp抗性编码序列，ori为复制起始位点，U6 promoter为U6启动子，chickenβ-actin promoter为鸡β珠蛋白启动子，CMV enhancer为CMV增强子，Bbs I为限制性内切酶Bbs I酶切位点，其中sgRNA表示转录后可以产生sgRNA的对应DNA序列(质粒图谱参见图)。具体涉及的sgRNA序列如表4所示，分别得到猪、猫、狗的ST3Gal4基因或ST6Gal1敲除载体。载体中包含的序列如表5所示。

表4敲除ST3Gal4基因的打靶载体的序列

表5敲除ST6Gal1基因的打靶载体的序列

3、抗性载体(pHY58_Puro)：pHY58_Puro中，PGK promoter为真核基因表达启动子，PuroR为puro抗性编码序列，ori为复制起始位点，AmpR promoter为AmpR基因启动子，AmpR为Amp抗性编码序列，(质粒图谱见图4)。

实施例4构建ST3Gal4和ST6Gal1基因敲除动物模型

应用CRISPR/Cas9技术构建猪ST3Gal4基因敲除成纤维细胞。取猪的次级卵母细胞，体外培养至成熟。使用显微注射仪移除卵细胞细胞核，再利用体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)技术将构建好的ST3Gal4基因敲除细胞移植入去核卵母细胞中，然后通过电融合技术激活移植后的细胞。将细胞在体外短暂培养，然后移植至受体母猪的输卵管中发育，将获得的基因敲除猪通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的ST3Gal4基因敲除猪品系。

应用CRISPR/Cas9技术构建猪ST6Gal1基因敲除成纤维细胞。取猪的次级卵母细胞，体外培养至成熟。使用显微注射仪移除卵细胞细胞核，再利用体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)技术将构建好的ST6Gal1基因敲除细胞移植入去核卵母细胞中，然后通过电融合技术激活移植后的细胞。将细胞在体外短暂培养，然后移植至受体母猪的输卵管中发育，将获得的基因敲除猪通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的ST6Gal1基因敲除猪品系。

将敲除ST3Gal4基因的纯合子ST3Gal4基因敲除猪品系中的猪与敲除ST6Gal1基因的纯合子ST6Gal1基因敲除猪品系中的猪杂交，通过进一步杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的ST6Gal1和ST3Gal4双基因敲除猪品系。

例如，可以应用CRISPR/Cas9技术构建猪ST3Gal4和ST6Gal1基因敲除成纤维细胞。取猪的次级卵母细胞，体外培养至成熟。使用显微注射仪移除卵细胞细胞核，再利用体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)技术将构建好的ST3Gal4/ST6Gal1基因敲除细胞移植入去核卵母细胞中，然后通过电融合技术激活移植后的细胞。将细胞在体外短暂培养，然后移植至受体母猪的输卵管中发育，将获得的基因敲除猪通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的ST3Gal4/ST6Gal1基因敲除猪品系。具体而言，

1猪源ST3Gal4/ST6Gal1两基因敲除成纤维细胞系的构建

(1)将怀孕35-40天的猪胎儿(带有完整胎膜)从母体子宫中剖取出来，在75％乙醇中清洗，使用DPBS将猪胎儿胎膜表面的酒精清洗去除，剪破胎膜，取出完整猪胎儿，剪取猪胎儿腹部、背部及四肢的皮肤组织；

(2)将皮肤组织尽量剪碎，加入4-5mL 200U/mL胶原酶，吹打混匀后放入37℃细胞培养箱内消化约30min；

(3)显微镜下观察，当组织变得疏松透明后立即终止消化，离心，吸弃上清消化液，然后用含有16％FBS的DMEM完全培养基4ml重悬管底的组织沉淀；

(4)弃上清，用含有16％FBS的DMEM完全培养基重悬细胞，38.5℃，5％CO ₂培养；

(5)待细胞长至对数生长期后，用0.05％胰酶消化收集细胞，调整为一份细胞悬液中约有1.5×10 ⁶个细胞总量，使用Lonza公司的核转染仪和哺乳动物成纤维细胞转染试剂盒，按照以下步骤进行核转染：

a)一个反应需要100μl核转反应液，每一份反应液需要提前混合82μl NucleofectorTM Basic Solution加上18μl Supplement 1，即按照4.5∶1的比例来混合并将其恢复到室温；

b)按ST3Gal4-Cas9打靶载体质粒∶ST6Gal1-Cas9打靶载体质粒∶抗性质粒＝2μg∶2μg∶1μg的比例(总量小于8ug)加入到一份100μl的反应液中；

c)将一份细胞悬液用DPBS洗一遍，1500g，5min离心后尽量去上清，沉淀用一份含有Cas9质粒和抗性质粒的核转反应液重悬；

d)将该核转体系使用小心加入到试剂盒带有的电转杯中。电转杯放置于Lonza核转仪的杯槽内，选择最优核转程序(例如程序U023)，电击转染后立即在超净台内将电转杯中液体轻柔吸出，转入到含2ml 16％FBS的DMEM完全培养基中，轻轻混匀；

(6)将细胞悬液以合适的体积分别在20个10cm皿内铺板；

(7)放入细胞培养箱中，38.5℃，5％CO ₂培养。核转分盘后，24h后换液为含puromycin(嘌呤霉素)的完全培养基，首次药物筛选的浓度为0.8μg/mL，之后每2—3天换液；

(8)根据显微镜下细胞状态来降低药物的浓度。当培养皿内开始出现单细胞克隆时(一般为10-14天)，需将puromycin药物最终浓度维持在0.2μg/mL；

(9)4倍镜视野下选取长满整个视野的单细胞克隆，在克隆所在位置的皿底外侧用油性笔划出克隆作为标记，使用克隆环将其小心挑取后在24孔板内培养；

(10)细胞长至对数生长期时，用胰酶消化细胞，取4/5的细胞量接种于12孔板或6孔板内，剩余1/5在原孔内继续培养用于后续的基因型鉴定；

(11)待12孔板或6孔板中细胞长满，胰酶消化离心收集细胞后，用细胞冻存液重悬，根据细胞量与细胞状态分别冻存2-5管，标记编号，冻存管放入程序降温盒内，于-80℃冰箱缓慢降温12h后可取出冻存管冻存于液氮中，待用；

(12)待24孔板中细胞长满，消化收集细胞后，根据细胞量加入适量NP-40裂解液(约10-25μl)重悬细胞沉淀，然后裂解提取基因组DNA，裂解程序如下：

55℃ 1小时

95℃ 5min

4℃ +∞

(13)裂解得到的基因组DNA对应标记编号后可存放于-20℃，待用。

2猪源ST3Gal4/ST6Gal1两基因敲除猪模型的构建

(1)复苏ST3Gal4/ST6Gal1基因敲除单克隆细胞；

(2)从新鲜母猪卵巢中获取未成熟的卵子，洗卵液清洗后在显微镜下挑选质量较好的卵子于成熟液中，并将其在38.5℃，5％CO2细胞培养箱中培养42-44h直至卵母细胞成熟；

(3)将已成熟的卵母细胞去除位于透明带外的颗粒细胞。随后，挑选出已去除颗粒细胞并排出第一极体的卵母细胞，再将其细胞核去除，放于38.5℃培养箱中待用；

(4)将ST3Gal4/ST6Gal1基因敲除单克隆细胞注入去核的卵母细胞中，每个卵母细胞注射一枚细胞；

(5)电击融合，重构胚激活，转移至胚胎成熟液中，置于38.5℃，5％CO2细胞培养箱中培养至囊胚形成；

(6)胚胎移植：将发育情况良好的胚胎移植到同期发情的代孕母猪子宫内，小心护理代孕母猪，1个月后使用B超检测受体猪的怀孕情况。若受体猪怀孕，密切监控，直至分娩。

实施例5敲除动物模型的表型鉴定

利用基因测序技术检验实施例4构建的ST3Gal4基因敲除猪品系和ST6Gal1和ST3Gal4双基因敲除猪品系的体细胞中的ST3Gal4基因是否被敲除。检测发现所得的猪为阳性猪。且实验证实，实施例4构建的猪品系尽管敲除了ST3Gal4基因，然而生长发育良好。

利用基因测序技术检验实施例4构建的ST6Gal1基因敲除猪品系和ST6Gal1和ST3Gal4双基因敲除猪品系的体细胞中的ST6Gal1基因是否被敲除。检测发现所得的猪为阳性猪。且实验证实，实施例4构建的猪品系尽管敲除了ST6Gal1基因，然而生长发育良好。

例如，具体而言，

1猪源ST3Gal4/ST6Gal1两基因敲除成纤维细胞系的鉴定

(1)针对猪的ST3Gal4和ST6Gal1基因CDS区序列分别设计测序引物，引物序列如表1所示。

(2)PCR反应：

根据引物Tm值选择合适的退火温度进行PCR，PCR结束后将PCR产物送至北京擎科新业生物技术技术有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果与相对应的基因组序列进行比对。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳(1％，即1g琼脂糖凝胶加入到100mL电泳缓冲液中)，电泳结束后在紫外线下切下目的条带，然后使用胶回收试剂盒(QIAGEN)回收目的条带并进行测序。

鉴定结果参见图5和图6，说明PCR产物测序结果显示已成功将猪的ST3Gal4和ST6Gal1基因敲除。

由于动物(例如猪)内源性的ST3Gal4基因和/或ST6Gal1基因被敲除，使得猪的SAα2,3Gal受体和/或SAα2,6Gal受体的表达量显著下调(甚至不表达)，和/或分别丧失了SAα2,3Gal受体与禽流感病毒的表面蛋白的结合能力，SAα2,6Gal受体与人流感病毒的表面蛋白的结合能力，从而至少避免动物(例如猪)同时感染禽流感病毒和人流感病毒，避免动物(例如猪)作为禽流感病毒和人流感病毒重组变异的容器(mixing vessel)和中间宿主。利用本申请所述的gRNA等构建的病毒不易感动物，不会作为上述的中间宿主在同时感染禽流感病毒和人流感病毒，从而不会产生新的可以感染哺乳动物(例如猪和/或人)的新的流感病毒，增加安全性。使用本申请所述方法获得的猪品系能够避免同时感染人流感病毒和禽流感病毒，从而避免使猪作为不同流感病毒的中间宿主，避免为流感病毒提供重组变异的温床。

以上详细描述了本申请的实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。

Claims

一种构建病毒不易感动物的方法，所述方法包括敲除动物中编码唾液酸转移酶的基因的全部或部分，从而使所述动物成为病毒不易感的动物。
根据权利要求1所述的方法，其中所述编码唾液酸转移酶的基因包括ST3Gal4基因、ST6Gal1基因、ST3Gal3基因和/或ST3Gal6基因。
根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述唾液酸转移酶包括2,3-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,3Gal)受体，和/或2,6-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,6Gal)受体。
根据权利要求3所述的方法，其中所述编码2,3-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,3Gal)受体的基因包括ST3Gal4基因。
根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述编码2,6-半乳糖唾液酸寡糖(SAα2,6Gal)受体的基因包括ST6Gal1基因。
根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述动物包括家畜。
根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述动物包括猪科动物。
根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述敲除包括在所述编码唾液酸转移酶的基因中添加、替换和/或删除一个或多个核苷酸，使所述编码唾液酸转移酶的基因的表达量降低，和/或，使所述编码唾液酸转移酶的基因基本上不表达；和/或，

使所述唾液酸转移酶的氨基酸序列改变，和/或，使所述唾液酸转移酶失活。
根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其中所述敲除包括在所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因中添加、替换和/或删除一个或多个核苷酸，使所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因的表达量降低，和/或，使所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因基本上不表达；和/或，

使所述SAα2,3Gal受体和/或所述SAα2,3Gal受体的氨基酸序列改变，和/或，使所述SAα2,3Gal受体和/或所述SAα2,3Gal受体失活。
根据权利要求4-9中任一项所述的方法，其中所述敲除涉及敲除所述ST3Gal4基因的2个或多个外显子的全部或部分。
根据权利要求5-10中任一项所述的方法，其中所述敲除涉及敲除所述ST6Gal1基因的1个或多个外显子的全部或部分。
根据权利要求4-11中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下的步骤：

使用一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因内或其附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，从而使得所述ST3Gal4基因和/或所述ST6Gal1基因的一个或更多个外显子全部或部分缺失。
根据权利要求12所述的方法，其中所述DNA内切酶包括Cas核酸酶。
根据权利要求13所述的方法，其中所述Cas核酸酶包括Cas9核酸酶、其同源物、其天然存在分子的重组体、其密码子优化版本，和/或其经修饰版本。
根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使用一种或多种向导RNA(gRNA)。
根据权利要求15所述的方法，其中所述gRNA为单链向导RNA(sgRNA)。
根据权利要求15-16中任一项所述的方法，其中所述gRNA能够特异性结合所述ST3Gal4基因中包含SEQ ID NO:5-6和20中任一项所示核酸序列的靶区域。
根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中能够特异性结合所述ST3Gal4基因的所述gRNA包含SEQ ID NO:9-10和21-22中任一项所示核酸序列。
根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述gRNA能够特异性结合所述ST6Gal1基因中包含SEQ ID NO:7-8中任一项所示核酸序列的靶区域。
根据权利要求15-19中任一项所述的方法，其中能够特异性结合所述ST6Gal1基因的所述gRNA包含SEQ ID NO:11-12和23-24中任一项所示核酸序列。
根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中所述gRNA的5’端包括(X)n所示的核酸序列，其中所述中X为选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。
根据权利要求21所述的方法，其中所述n为13或2。
根据权利要求15-22中任一项所述的方法，其中所述gRNA的3’端包括骨架序列。
根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述方法包括：

(1)提供一种细胞，所述细胞包含一种或多种包含所述gRNA的载体或所述载体的体外转录产物；

(2)将所述细胞在培养液中进行培养；

(3)将培养后的细胞移植至受体雌性非人哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人哺乳动物的子宫中发育；

和(4)鉴定步骤(3)的怀孕雌性的后代基因改造的非人哺乳动物中的种系传递。
根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述病毒包括流感病毒。
根据权利要求25所述的方法，其中所述流感病毒包括人流感病毒和/或禽流感病毒。
根据权利要求3-26中任一项所述的方法，其中所述病毒不易感动物基本上不表达能够与所述病毒的表面蛋白相互作用的内源性的所述SAα2,3Gal受体和/或所述SAα2,6Gal受体。
根据权利要求3-27中任一项所述的方法，其中所述病毒不易感动物基本上不表达内源性的所述SAα2,3Gal受体和/或所述SAα2,6Gal受体。
一种特异性结合ST3Gal4基因的gRNA，其中所述gRNA特异性结合包含SEQ ID NO:5-6和20中任一项所示核酸序列的靶区域。
根据权利要求29所述的gRNA，其靶向所述ST3Gal4基因中2个以上不同的外显子。
根据权利要求29-30中任一项所述的gRNA，其包含SEQ ID NO:9-10和21-22中任一项所示核酸序列。
一种特异性结合ST6Gal1基因的gRNA，其中所述gRNA特异性结合包含SEQ ID NO:7-8中任一项所示核酸序列的靶区域。
根据权利要求32所述的gRNA，其靶向所述ST6Gal1基因中1个外显子。
根据权利要求32-33中任一项所述的gRNA，其包含SEQ ID NO:11-12和23-24中任一项所示核酸序列。
根据权利要求29-34中任一项所述的gRNA，其中所述gRNA为单链向导RNA(sgRNA)。
根据权利要求29-35中任一项所述的gRNA，其中所述gRNA的5’端包括(X)n所示的核酸序列，其中所述中X为选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。
根据权利要求36所述的gRNA，其中所述n为13或2。
根据权利要求29-37中任一项所述的gRNA，其中所述gRNA的3’端包括骨架序列。
核酸分子，其编码权利要求29-38中任一项所述的gRNA。
包含权利要求29-38中任一项所述的gRNA的序列的载体。
一种细胞，其包含一种或多种权利要求29-38中任一项所述的gRNA，权利要求39所述的核酸分子，权利要求40所述的gRNA载体，和/或权利要求40所述的gRNA载体的体外转录产物。
权利要求29-38中任一项所述的gRNA，权利要求39所述的核酸分子，权利要求40所述的gRNA载体，和/或权利要求40所述的gRNA载体的体外转录产物，和/或权利要求41所述的细胞在敲除ST3Gal4基因和/或ST6Gal1基因中的用途，或在构建病毒不易感动物中的用途。
一种ST3Gal4基因缺失细胞株，其是使用权利要求29-31中任一项所述的gRNA，权利要求39所述的核酸分子，权利要求40所述的gRNA载体，和/或权利要求40所述的gRNA载体的体外转录产物，和/或权利要求41所述的细胞制备获得的。
根据权利要求1-28中任一所述的方法制备获得的病毒不易感动物，其中所述病毒不易感动物基本上不表达能够与病毒表面蛋白相互作用的内源性SAα2,3Gal受体。
根据权利要求1-28中任一所述的方法制备获得的病毒不易感动物，其中所述病毒不易感动物基本上不表达内源性SAα2,3Gal受体。
一种ST6Gal1基因缺失细胞株，其是使用权利要求32-34中任一项所述的gRNA，权利要求39所述的核酸分子，权利要求40所述的gRNA载体，权利要求40所述的gRNA载体的体外转录产物，和/或权利要求41所述的细胞制备获得的。
根据权利要求1-28中任一所述的方法制备获得的病毒不易感动物，其中所述病毒不易感动物基本上不表达能够与病毒表面蛋白相互作用的内源性SAα2,6Gal受体。
根据权利要求1-28中任一所述的方法制备获得的病毒不易感动物，其中所述病毒不易感动物基本上不表达内源性SAα2,6Gal受体。
一种制备病毒不易感动物的方法，所述方法包括：

(a)提供权利要求1-28中任一项所述的方法制备获得的病毒不易感动物；以及

(b)将步骤(a)获得的病毒不易感动物与其它动物交配或体外授精或对基于步骤(a)获得的病毒不易感动物进一步进行基因编辑或将人组织、细胞移植至步骤(a)获得的病毒不易感动物中，并进行筛选，得到病毒不易感动物。
根据权利要求49所述的方法，其中所述方法包括：将权利要求44-45中任一项所述的基本上不表达内源性SAα2,3Gal受体的病毒不易感动物与权利要求47-48中任一项所述的基本上不表达内源性SAα2,6Gal受体的病毒不易感动物有性繁殖。
根据权利要求50所述的方法，其中所述方法包括：所述杂交后筛选基本上不表达所述内源性SAα2,3Gal受体且不基本上不表达所述内源性SAα2,6Gal受体的动物，得到病毒不易感动物。
根据权利要求49-51中任一项所述的方法制备获得的病毒不易感动物。
根据权利要求52所述的病毒不易感动物，其包括家畜。
根据权利要求52-53中任一项所述的病毒不易感动物，其包括猪科动物。
根据权利要求52-54中任一项所述的病毒不易感动物，其中所述病毒包括流感病毒。
根据权利要求55所述的病毒不易感动物，其中所述流感病毒包括人流感病毒和/或禽流感病毒。
一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其中所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于权利要求52-56中任一项所述的病毒不易感动物或者其后代。
一种组织或器官或其培养物，其中所述组织或器官或其培养物来源于权利要求52-56中任一项所述的病毒不易感动物或者其后代。
一种特异靶向敲除ST3Gal4基因的CRISPR/Cas9系统，其使用含有权利要求29-31中任一项所述的能够特异的靶向ST3Gal4基因的gRNA的DNA序列。
一种能够特异性靶向ST3Gal4基因的核酸分子试剂盒，其中，所述试剂盒包括权利要求29-31中任一所述的gRNA。
一种能够特异的靶向ST3Gal4基因的成套核酸分子，其中，所述成套核酸分子包括权利要求29-31中任一项所述的gRNA和编码Cas9蛋白的核酸分子。
一种特异靶向敲除ST6Gal1基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，使用含有权利要求32-34中任一项所述的能够特异的靶向ST6Gal1基因的gRNA的DNA序列。
一种能够特异性靶向ST6Gal1基因的核酸分子试剂盒，其中，所述试剂盒包括权利要求32-34中任一所述的gRNA。
一种能够特异的靶向ST6Gal1基因的成套核酸分子，其中，所述成套核酸分子包括权利要求32-34中任一项所述的gRNA和编码Cas9蛋白的核酸分子。
权利要求44-45、47-48和52-56中任一项所述的病毒不易感动物在抗病毒产品开发，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。
权利要求44-45、47-48和52-56中任一项所述的病毒不易感动物在筛选、验证、评价或研究抗病毒药物或组合药物、和/或药效研究方面的应用。