JP2012179052A - 治療用タンパク質生成のための宿主細胞タンパク質ノックアウト細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】トロンビンポリペプチド(FII/FIIa)、第X因子ポリペプチド(FX/FXa)、第IX因子ポリペプチド(FIX/FIXa)、第VII因子ポリペプチド(FVII/FVIIa)、及び抗凝固プロテインCから選択される凝固因子、特に第VII因子ポリペプチドの組成物,特に、ビタミンK依存性タンパク質でもあるタンパク質混入物の減少又は除去のために有用な方法及び手段。
【選択図】なし
Description
本発明は、極僅か又は無視しうる量のタンパク質混入物を有するビタミンK依存性タンパク質を含有してなる組成物を生成するための方法及び該方法から得られる組成物に関する。このような方法は相対含量のタンパク質混入物を少なくするために単独で用いても、他の方法と組み合わせて用いてもよい。特に、本発明は、トロンビンポリペプチド(FII/FIIa)、第X因子ポリペプチド(FX/FXa)、第IX因子ポリペプチド(FIX/FIXa)、第VII因子ポリペプチド(FVII/FVIIa)、及び抗凝固プロテインCから選択される凝固因子、特に第VII因子ポリペプチドの組成物の調製に関する。
微生物又は細胞株の培養物からの組み換えタンパク質の生成において、最終的な生成工程は、対象とする生成物の回収と場合によって濃縮である。また、細胞が生育し、分泌されたタンパク質、特に対象とする細胞内タンパク質を含む細胞溶解物を含有する細胞培養物は、多かれ少なかれ、培地成分、核酸などの他の混入物以外に、細胞によって生成された他のタンパク質を含む。したがって、精製されたタンパク質生成物を得るために、対象とするタンパク質を含有する粗材料中の他のタンパク質やポリペプチド及び他の不純物から対象とするタンパク質を分離する必要がある。しかしながら、対象とするポリペプチドと同じ性質のドメインを含むタンパク質混入物を取り除くことは難しいことが多い。
ビタミンK依存性タンパク質は、分子のアミノ末端部分において共通の構造的特徴を共有することによって、他のタンパク質と区別される。Gla-ドメインとも称されるこれらのタンパク質のN末端は、γ-グルタミルカルボキシラーゼ酵素によって触媒されるビタミンK依存性反応においてグルタミン酸塩から合成される異常なアミノ酸γ-カルボキシグルタミン酸に豊富にある。およそ9〜12のGla残基があるために、Gla-ドメインは、Ca2+などの二価の陽イオンを結合しうるという特徴がある。金属イオンの結合の際に、これらのタンパク質は、円二色性及び蛍光発光などの様々な技術によって測定されうる立体配置的変化を生じる。
1980年代には、高次構造に金属誘発性の変化を起こさせるために、Gla含有タンパク質固有の性質を用いて高次構造特有の偽親和性クロマトグラフィが開発された。用いる固定した親和性リガンドがないという点で、偽親和性クロマトグラフィは従来の親和性クロマトグラフィと異なり、従来のクロマトグラフィの基質上で行われる(Yan S. B., J. Mol. Recog. 1996; 9, 211-218)。Glaタンパク質は、二価金属イオンを取り除くことによって陰イオン交換物質に吸着されうる。その後、Ca2+を溶出緩衝液に加えることによって溶出を行った。
Brown等 (Brown等, J. Biol. Chem. 2000; 275, 19795-19802.)は、Gla残基に特異的なモノクローナル抗体を報告している。これらの抗体は、すべての試験したGlaタンパク質:第VII因子、第IX因子、第II因子、プロテインC、プロテインS、GAS-6、骨マトリックスGlaタンパク質、コナントキンG(conantokin G)を認識しうる。あるGlaタンパク質に対して生じるいくつかの高次構造特有の抗体は他のGlaタンパク質との交差反応を示す(Furie B. and Furie B., J. Biol. Chem. 1979; 254, 9766-9771;Church等, J. Biol. Chem. 1988; 263, 6259-6267)。
Gla-ドメインを有するタンパク質は、以下のタンパク質:GAS-6、プロテインS、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインC、第VII因子、プロテインZ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質1、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質2、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質3、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質4、骨Glaタンパク質、マトリックスGlaタンパク質、及びオステオカルシンを含む。
宿主細胞は、ポリペプチドの使用の際に望ましくない免疫原性応答を引き起こしうるタンパク質混入物を有意な量で産生しうるので、対象とするGla-ドメイン含有ポリペプチドなどの、対象とするビタミンK依存性タンパク質をタンパク質混入物から効率的に分離する必要性は、細胞培養物中で産生される該ポリペプチドの精製を扱う際に特に関連する問題である。
本発明は、広義の態様では、対象とするビタミンK依存性タンパク質を含有してなる組成物であって、宿主細胞から発現される少なくとも一のタンパク質混入物がないかあるいは実質的にない組成物の生成に関する。
したがって、第一の態様では、本発明は、対象とするビタミンK依存性タンパク質を発現する宿主細胞であって、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように修飾されている宿主細胞に関する。一実施態様では、宿主細胞は、対象とするビタミンK依存性タンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトが形質移入されている。
本明細書中で用いる「修飾した」なる用語は、任意の合成分子又は産業に有用な細胞生物学的技術ないしは方法によって操作されている細胞に関する。
a) 場合によって対象とするビタミンK依存性タンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトを該細胞に形質移入する;及び、
b) 内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように該細胞を修飾する
という工程をいずれかの順序で含んでなる方法に関する。
更なる態様では、本発明は、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で有する対象とするビタミンK依存性タンパク質を含有してなる組成物の生成方法であって、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように修飾されている、対象とするビタミンK依存性タンパク質を発現する宿主細胞を成長培地中で生育させ、対象とするビタミンK依存性タンパク質を含んでなる該成長培地を回収する工程を含んでなる方法に関する。
a) 本発明に記載の宿主細胞を生成する;及び、
b) 成長培地中で該宿主細胞を生育させ、対象とするビタミンK依存性タンパク質を含んでなる該成長培地を回収する
という工程を含んでなる方法に関する。
更なる態様では、本発明は、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で有する対象とするビタミンK依存性タンパク質を含有してなる組成物の生成方法であって、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように修飾されている、対象とするビタミンK依存性タンパク質を発現する宿主細胞を成長培地中で生育させ、対象とするビタミンK依存性タンパク質を含んでなる該成長培地を回収する工程を含んでなる方法に関する。
更なる態様では、本発明は、対象とするビタミンK依存性タンパク質を含んでなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を少なくするか又は除去するための方法であって、このとき宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法に関する。
更なる態様では、本発明は、CHO細胞中のプロテインSをコードする新規の核酸配列に関する。
更なる態様では、本発明は、CHO細胞中のプロテインSの新規のアミノ酸配列に関する。
本発明は、組み換えタンパク質の生成のための宿主細胞であって、該宿主細胞が、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように修飾されている宿主細胞に関する。
混在タンパク質の発現を減少するための任意の方法又は技術が用いられうることが理解されるであろう。siRNAターゲティング、標的遺伝子ノックアウト、転写因子の形質移入、及びタンパク質混入物をコードするDNA鎖の部位特異的切断を含む方法の例は、いかなる形であれ限定して解釈されるものではない。原則として、任意の分子生物学、細胞生物学又は選別法を用いて、特定のタンパク質混入物の発現レベルを低減しうる。本発明は、対象とするビタミンK依存性タンパク質が一又は複数のタンパク質混入物と密接に関係している場合、例えばタンパク質混入物が第二のビタミンK依存性タンパク質である場合に特に有用である。対象とするビタミンK依存性タンパク質とタンパク質混入物との密接な関係のために、つまりタンパク質混入物が第二のビタミンK依存性タンパク質である場合、このようなタンパク質混入物は精製方法による除去が非常に困難でありうる。
本発明の一実施態様では、対象とするビタミンK依存性タンパク質は、GAS-6、プロテインS、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインC、第VII因子、プロテインZ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質1、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質2、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質3、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質4、骨Glaタンパク質、マトリックスGlaタンパク質、及びオステオカルシンからなる群から選択される。ビタミンK依存性タンパク質は活性型又は非活性型のいずれかでよく、例えば第II因子及び第IIa因子、並びに第X因子及び第Xa因子でよい。
本発明の一実施態様では、タンパク質混入物は第二の異なるビタミンK依存性タンパク質である。したがって、対象とするタンパク質とタンパク質混入物がともにビタミンK依存性タンパク質であってもよい。
本発明の一実施態様では、タンパク質混入物はプロテインSである。一実施態様では、タンパク質混入物はハムスタープロテインSである。
本発明の一実施態様では、宿主細胞は、CHO細胞、293(HEK293)細胞、BKH細胞、HKB11細胞、SP2/0細胞及びNS0細胞からなる群から選択される。
本明細書中で用いる「siRNA」なる用語は、分子生物学の分野で公知の短い干渉RNA又はサイレンシングRNAとして知られていることが多い、小干渉RNAを指す。
一実施態様では、宿主細胞は、宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードするmRNAを標的とする少なくとも一のsiRNAポリヌクレオチドコンストラクトを形質移入することによって修飾されている。
一実施態様では、対象とするビタミンK依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物を標的とするsiRNAコンストラクトを含んでなり、該タンパク質混入物は第二のビタミンK依存性タンパク質である。
また、本発明は、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物について破壊された遺伝子を含んでなる、対象とするビタミンK依存性タンパク質を発現する細胞に関する。
一実施態様では、宿主細胞は、宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の遺伝子ノックアウトによって破壊することによって修飾されている。一実施態様では、プロテインSをコードする内因性遺伝子は、エクソン1の遺伝子ノックアウトによって破壊されている。
一実施態様では、対象とするビタミンK依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物について破壊された遺伝子を含んでなり、該タンパク質混入物はプロテインSである。
一実施態様では、対象とするビタミンK依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、プロテインSについて破壊された遺伝子を含んでなり、該プロテインSはエクソン1の欠失によって破壊される。
一実施態様では、対象とするビタミンK依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする遺伝子のDNAエレメントに結合する少なくとも一の転写因子を形質移入することによって修飾されている。
一実施態様では、対象とするビタミンK依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードするDNA鎖の部位特異的な切断のために少なくとも一のヌクレアーゼ融合タンパク質を形質移入することによって修飾されている。
一実施態様では、対象とするビタミンK依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、少なくとも一のタンパク質混入物をコードするDNA配列に結合する転写因子を含んでなり、該タンパク質混入物は第二のビタミンK依存性タンパク質である。
一実施態様では、対象とするビタミンK依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、少なくとも一のタンパク質混入物をコードするDNA配列に結合する転写因子を含んでなり、該タンパク質混入物はプロテインSである。
本発明の一実施態様では、転写因子はZincフィンガータンパク質である。本発明の一実施態様では、Zincフィンガータンパク質は、配列番号35の配列を含んでなるDNAエレメントを結合する。
本発明の一実施態様では、Zincフィンガータンパク質はGGAGAGGAGGGGGGG DNAエレメントを結合する。
また、本発明は、対象とするビタミンK依存性タンパク質を含有してなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を低減するための方法であって、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法に関する。
一実施態様では、対象とするビタミンK依存性タンパク質を含有してなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を低減するための方法であって、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法は、siRNAの使用を含んでなる方法である。
一実施態様では、対象とするビタミンK依存性タンパク質を含有してなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を低減するための方法であって、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法は、ランダム突然変異誘発法の使用を含んでなる方法である。
一実施態様では、対象とするビタミンK依存性タンパク質を含有してなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を低減するための方法であって、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法は、ターゲティングノックアウトの使用を含んでなる方法である。
また、本発明は、配列番号4の配列を有するCHO プロテインSコード配列又はその任意の機能的断片を含んでなる核酸配列に関する。
本発明は、配列番号5の配列を有するCHO プロテインS配列又はその任意の機能的断片を含んでなるアミノ酸配列に関する。
「ポリペプチド」は、野生型タンパク質、並びにその「変異体」、「関連したポリペプチド」、「誘導体」及び「コンジュゲート」それぞれのアミノ酸配列を含んでなる任意のタンパク質を意味する。
特に、本明細書中で用いられる、「第VII因子ポリペプチド」又は「FVIIポリペプチド」なる用語は、野生型ヒト第VIIa因子(すなわち米国特許第4784950号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)のアミノ酸配列1−406、その変異体、並びに第VII因子関連のポリペプチド、第VII因子誘導体及び第VII因子コンジュゲートを含んでなる任意のタンパク質を意味する。これには、野生型ヒト第VIIa因子と相対的に同じか改善された生物学的活性を実質的に示すFVII変異体、第VII因子関連のポリペプチド、第VII因子誘導体及び第VII因子コンジュゲートが含まれる。
第VII因子の変異体は、安定性、リン脂質結合性、変更した特異的活性などを含む、ヒト第VII因子と相対的に異なる性質を表しうる。
また、上記の定義の範囲内の「第VII因子」又は「第VIIa因子」には、存在し、ある個体から他の個体に生じうる天然の対立遺伝子変異体が含まれる。また、グリコシル化又は他の翻訳後修飾の程度と位置は、選択した宿主細胞や宿主の細胞性環境の性質に応じて異なりうる。
本明細書中で用いられる「野生型ヒトFVIIa」は、米国特許第4784950号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
本明細書中で用いられる「組成物」は、任意の組成物、例えば水溶性の液体組成物などの液体組成物を意味する。
最も一般的には、対象とするビタミンK依存性タンパク質は細胞培養条件下で産生されたものである。すなわち、対象とするビタミンK依存性タンパク質は細胞培養物上清の成分として直接得られるか、一又は複数の続く精製方法の工程の後に細胞培養物上清から得られる。
本明細書中で用いられる「タンパク質混入物」及び「複数のタンパク質混入物」は、宿主細胞によって内因的に生産され、対象とするビタミンK依存性タンパク質との関係で不純物を構成するタンパク質ないしはポリペプチド成分を意味する。したがって、対象とするビタミンK依存性タンパク質は、明らかにタンパク質混入物とみなさない。
本明細書中で用いられる「〜がないか又は実質的にない」とは、組成物中のタンパク質混入物の総含量が多くとも500ppm、例えば多くとも100ppm、例えば多くとも10ppm、例えば多くとも1ppm、又は多くとも0.1ppmである組成物を指す。また一般的に、組成物中のプロテインS混入物の総含量は、多くとも500ppm、例えば多くとも100ppm、例えば多くとも10ppm、例えば多くとも1ppm、又は多くとも0.1ppmである。
特に関連のあるタンパク質混入物の種類は、対象とするビタミンK依存性タンパク質に非常に類似したタンパク質、例えばタンパク質:GAS-6、プロテインS、第II因子(プロトロンビン)、第Xa因子、第IXa因子、プロテインC、第VIIa因子、プロテインZ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質1、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質2、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質3、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質4、マトリックスGlaタンパク質、及びオステオカルシンを含む、Gla-ドメインを含有する任意の他のタンパク質である。
小干渉RNAであるsiRNAの安定した発現は、標的としたmRNAの減少、それによる哺乳動物細胞での標的とした遺伝子発現の抑制を可能にする新規の技術である(T. R. Brummelkamp, R. Bernards, 及びR. Agami. Science 296(5567): 550-553, 2002及びM. Mivaaishi及びK Taira. Nat Biotechnol 20(5): 497-200, 2002)。多くの個々のsiRNAは、参考文献において記述されるものと類似の方策で生成されている。これらのsiRNAのいくつかは有用であることが判明した(実施例2)。
ゲノムの破壊は、遺伝子ターゲティング又はノックアウト技術によって得られうる(実施例3)。ノックアウト細胞の生成は、内因性タンパク質の発現を無くすためによく記載される技術であり、CHOノックアウト細胞はYamane-Ohnuki等 Biotechnol. Bioeng. 87 (5): 614-622, 2004において最近記述された。
ゲノムプロテインSノックアウトプラスミドを生成し、CHO細胞に形質移入した。相同組み換えによって、CHO細胞中のプロテインS遺伝子を破壊した。この手順は、プロテインS遺伝子のすべての対立遺伝子が安定して取り除かれるまで繰り返した(実施例3)。
これらの方法は、理論的には、任意の望ましくない宿主細胞タンパク質混入物を除去するために好適でありうる。応用されるこれらの方法のすべてについて、混入タンパク質の遺伝子配列の情報が必要である。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)のプロテインSの配列は公的に利用可能でなく、実施例1に記載され配列番号1として開示されるCHOプロテインS cDNAのクローニングを行った。CHOプロテインSコード配列及びCHOプロテインSアミノ酸配列は、それぞれ配列番号2及び3として開示される。
1.宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物がないか又は実質的にない、対象とするビタミンK依存性タンパク質を含有してなる組成物。
2.前記の対象とするビタミンK依存性タンパク質が、GAS-6、プロテインS、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインC、第VII因子、プロテインZ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質1、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質2、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質3、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質4、骨Glaタンパク質、マトリックスGlaタンパク質、及びオステオカルシンからなる群から選択される、実施態様1に記載の組成物。
3.前記の少なくとも一のタンパク質混入物がビタミンK依存性タンパク質である、実施態様1に記載の組成物。
4.前記の少なくとも一のタンパク質混入物がプロテインSである、実施態様1に記載の組成物。
5.宿主細胞が、CHO細胞、293(HEK293)細胞、BKH細胞、HKB11細胞、SP2/0細胞及びNS0細胞からなる群から選択される、実施態様1に記載の組成物。
6.さらに、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物を標的とするsiRNAコンストラクトを含んでなる、実施態様1から5のいずれか一に記載の対象とするビタミンK依存性タンパク質を発現する細胞。
7.前記の少なくとも一のタンパク質混入物がビタミンK依存性タンパク質である、実施態様6に記載の細胞。
8.前記の少なくとも一のタンパク質混入物がプロテインSである、実施態様6又は7に記載の細胞。
9.さらに、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物について破壊された遺伝子を含んでなる、実施態様1から5のいずれか一に記載の対象とするビタミンK依存性タンパク質を発現する細胞。
10.前記の少なくとも一のタンパク質混入物がビタミンK依存性タンパク質である、実施態様9に記載の細胞。
11.前記の少なくとも一のタンパク質混入物がプロテインSである、実施態様9又は10に記載の細胞。
12.前記該プロテインS遺伝子がエクソン1の欠失によって破壊されている、実施態様9から11のいずれか一に記載の細胞。
13.さらに、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物に結合する転写因子を含んでなる、実施態様1から5のいずれか一に記載の対象とするビタミンK依存性タンパク質を発現する細胞。
14.前記の少なくとも一のタンパク質混入物がビタミンK依存性タンパク質である、実施態様13に記載の細胞。
15.前記の少なくとも一のタンパク質混入物がプロテインSである、実施態様13又は14に記載の細胞。
16.前記転写因子がZincフィンガータンパク質である、実施態様13から15のいずれか一に記載の細胞。
17.前記Zincフィンガータンパク質がGGAGAGGAGGGGGGG DNAエレメントを結合する、実施態様15又は16に記載の細胞。
18.対象とするビタミンK依存性タンパク質を含有してなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を低減するための方法であって、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法。
19.前記方法がsiRNAの使用を含んでなる、実施態様18に記載の方法。
20.前記方法がランダム突然変異誘発の使用を含んでなる、実施態様18に記載の方法。
21.前記方法がターゲティングノックアウトの使用を含んでなる、実施態様18に記載の方法。
22.配列番号1の配列を有するCHO プロテインS cDNA配列を含んでなる核酸配列。
23.配列番号2の配列を有するCHO プロテインSコード配列を含んでなる核酸配列。
24.配列番号3の配列を有するCHO プロテインS配列を含んでなるアミノ酸配列。
1a.対象とするビタミンK依存性タンパク質を発現する宿主細胞であって、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように修飾されている宿主細胞。
2a.前記の対象とするビタミンK依存性タンパク質が、GAS-6、プロテインS、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインC、第VII因子、プロテインZ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質1、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質2、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質3、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質4、骨Glaタンパク質、マトリックスGlaタンパク質、及びオステオカルシンからなる群から選択される、実施態様1aに記載の宿主細胞。
3a.前記タンパク質混入物がビタミンK依存性タンパク質である、実施態様1a又は2aに記載の宿主細胞。
4a.前記タンパク質混入物がプロテインSである、実施態様1aから3aのいずれか一に記載の宿主細胞。
5a.前記宿主細胞が、CHO細胞、293(HEK293)細胞、BKH細胞、HKB11細胞、SP2/0細胞及びNS0細胞からなる群から選択される、実施態様1aから4aのいずれか一に記載の宿主細胞。
6a.前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードするmRNAを標的とする少なくとも一のsiRNAポリヌクレオチドコンストラクトを形質移入することによって修飾されている、実施態様1aから5aのいずれか一に記載の宿主細胞。
7a.前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の遺伝子ノックアウトによって破壊することによって修飾されている、実施態様1aから6aのいずれか一に記載の宿主細胞。
8a.プロテインSをコードする内因性遺伝子がエクソン1の遺伝子ノックアウトによって破壊されている、実施態様7aに記載の宿主細胞。
9a.前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現される前記タンパク質混入物をコードする遺伝子のDNAエレメントに結合する少なくとも一の転写因子を形質移入することによって修飾されている、実施態様1aから8aのいずれか一に記載の宿主細胞。
10a.前記転写因子がZincフィンガータンパク質である、実施態様9aに記載の宿主細胞。
11a.前記Zincフィンガータンパク質が配列番号35の配列を含んでなるDNAエレメントを結合する、実施態様10aに記載の宿主細胞。
12a.前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の破壊のためにランダム突然変異誘発によって修飾されている、実施態様1aから11aのいずれか一に記載の宿主細胞。
13a.実施態様1aから12aのいずれか一に記載の宿主細胞の生成方法であって、
a) 場合によって対象とするビタミンK依存性タンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトを該細胞に形質移入する;及び、
b) 内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように該細胞を修飾する
という工程をいずれかの順序で含んでなる方法。
14a.前記の対象とするビタミンK依存性タンパク質が、GAS-6、プロテインS、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインC、第VII因子、プロテインZ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質1、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質2、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質3、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質4、骨Glaタンパク質、マトリックスGlaタンパク質、及びオステオカルシンからなる群から選択される、実施態様13aに記載の方法。
15a.前記タンパク質混入物が第二のビタミンK依存性タンパク質である、実施態様13a又は14aに記載の方法。
16a.前記タンパク質混入物がプロテインSである、実施態様13aから15aのいずれか一に記載の方法。
17a.前記宿主細胞が、CHO細胞、293(HEK293)細胞、BKH細胞、HKB11細胞、SP2/0細胞及びNS0細胞からなる群から選択される、実施態様13aから16aのいずれか一に記載の方法。
18a.前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードするmRNAを標的とする少なくとも一のsiRNAポリヌクレオチドコンストラクトを形質移入することによって修飾されている、実施態様13aから17aのいずれか一に記載の方法。
19a.前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の遺伝子ノックアウトによって破壊することによって修飾されている、実施態様13aから18aのいずれか一に記載の方法。
20a.プロテインSをコードする内因性遺伝子がエクソン1の遺伝子ノックアウトによって破壊されている、実施態様19aに記載の方法。
21a.前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現される前記タンパク質混入物をコードする遺伝子のDNAエレメントに結合する少なくとも一の転写因子を形質移入することによって修飾されている、実施態様13aから20aのいずれか一に記載の方法。
22a.前記転写因子がZincフィンガータンパク質である、実施態様21aに記載の方法。
23a.前記Zincフィンガータンパク質が配列番号35の配列を含んでなるDNAエレメントを結合する、実施態様22aに記載の方法。
24a.前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の破壊のためにランダム突然変異誘発によって修飾されている、実施態様13aから23aのいずれか一に記載の方法。
25a.内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で有する対象とするビタミンK依存性タンパク質を含有してなる組成物の生成方法であって、
a) 実施態様13aから24aのいずれか一に記載の方法に従って宿主細胞を生成する;及び、
b) 成長培地中で該宿主細胞を生育させ、対象とするビタミンK依存性タンパク質を含んでなる該成長培地を回収する
という工程を含んでなる方法。
26a.実施態様項25aに記載の方法によって生成される組成物。
27a.配列番号1の配列を含んでなる核酸配列。
28a.配列番号2の配列を含んでなる核酸配列。
29a.配列番号3の配列を含んでなるアミノ酸配列。
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)のプロテインS cDNA配列は、任意のヌクレオチド又はタンパク質データベースから公知でないが、他の齧歯動物のプロテインSのヌクレオチド配列に高い同一性を有することが予測された。
CHOプロテインS PCR断片を、マウスとラットとのプロテインS cDNA配列ないしはゲノム配列間の配列比較から設定したプライマーを用いてCHO cDNAから生成した。cDNA断片を配列決定して、CHOプロテインS遺伝子の完全長コード配列を形成するように集合体化(アセンブル)した。完全長CHOプロテインS cDNAを、プライマー「CHO ProtSフォワード」と「CHO ProtSリバース」及びCHO-K1由来のcDNAを鋳型として用いてPCRによりクローニングした。
予測されたCHOプロテインSアミノ酸配列は、ラットプロテインSに90.5%の同一性、及びマウスプロテインSに90.7%の同一性があった。
5'-GCCCAGGCTCGCAGCTCCTCTGG-3'
5'-CAGGTGACACCTGCCAGCTGGTG-3'
gcccaggctcgcagctcctctgggcggagcgccggctcggtccccgctgcgccagccgtgatccccggcagcctgctcagcaatgagggtcctgagcgcgcgctgtcggctactgctggtatgcctagccctggtgctgccagcctcggagacaaactttttgtcaaaagaacatgcctcgcaagtcctggtgaggaagcgccgcgcaaataccttgcttgaagaaactaaaaagggcaatcttgaaagagaatgcatcgaagagctctgcaataaagaggaagccagggaggtctttgaaaacaatcccgaaacggattatttttatccaaaatatttgggttgtctgggcatgttccgtgctggcctgttcagtgctgcgcggcagtctgttaatgcttaccccgacctcaggagctgtgtcaatgccatcccagaccaatgtgatcctatgccatgcaatgaagatgggtatctgagctgcaaagatggccaagctgctttcacatgcatctgcaaaccaggatggcaaggggacaaatgccagtttgatgtaaatgaatgtaaagatcccttaaatgtaaatgggggctgcagccagatttgtgacaacactcctggaagttaccactgctcctgcagaagtggctttgctatgctttcaaacaaaaaagactgcaaagatgtggatgaatgctctatgaagcccagtgtttgtggctcagctgtgtgcaagaacactccaggagactatgagtgtgaatgtcctgacggctacagatatgatccctcatcgaagtcttgcaaagatgtggacgaatgctctgagaacatgtgtgctcaattgtgtgtcaattaccctggaggctactcttgttactgtgatggaaagaaaggattcaagcttgcccaagatcagaagagttgtgagggtattccagtgtgccttcccttgaaccttgacaaaaattatgaattattgtacttggctgagcagtttgtaggagttgtcttatatctgaaatttcgtttgccagaaattaccagattttcagctgaatttgattttcggacatatgattcagagggcatcatcctgtatgcagaatctcttgatcactcaaattggctcctgattgcacttcgtgatggaaaaattgaagttcagtttaagaatgagttttcaacccaaatcacaaccggaggcaatgttattaacaatggtaaatggaacatggtatccgtggaagaattagacgacagtgttagcattaaaatagctaaagaagctgtgatgaatataaataaatttgggagcctctttaaacctacagatggatttctggacaccaaaatatactttgcaggattacctcgggtagtggaaagtgcactcattaaaccgattaaccctcgtctggatggatgtatacgaggctggaacttgatgaaacaaggagctttaggtgcaaaggaaattattcaaggaaaacaaaataagcattgcttcctcatggtggagaagggctcctactaccctggttctggaattgctcggttcagcatagattacaataatgtaaccaatgcagagggctggcaaataaatgtgaccttgaatattcgtccatccactggcactggaattatgcttgccttggtttctggagacaaagtgccctttgccttgtccttggtgggctccagctctgaaaattctcaggatattgtggtatttgttgaaaattcagtggtggctcgaatggaggccataactctgtgttctgaccagcaatcccaactgaaatgtaatgttaacagacatggcctagagctatggagcccactgaagaaagatgtcatctactctaaagatattcaaggacaactagcagtcttggacaaagcaatgaaaggaaacgtggccacttatctgggtggcattccagatctttccttcagtgccacgccagtgaatgccttctacagtggctgcatggaagtgaacatcaacggggtgcagttggatctggatgaagccatttctaaacataatgacatcagagctcactcatgtccttcagttaagaaaatccagaagaacgtctaatgtctgttttctgtgcttataatgcccctttccttgtaattatgctcacgcccctatcaccagctggcaggtgtcacctgtgaagtgcaatgtttgaaatgatgtggtactttgtccttcagatttttgttatataaaccacgttttttttttttttttaaagtctttcttctattgctgtctagaaattaaataa
atgagggtcctgagcgcgcgctgtcggctactgctggtatgcctagccctggtgctgccagcctcggagacaaactttttgtcaaaagaacatgcctcgcaagtcctggtgaggaagcgccgcgcaaataccttgcttgaagaaactaaaaagggcaatcttgaaagagaatgcatcgaagagctctgcaataaagaggaagccagggaggtctttgaaaacaatcccgaaacggattatttttatccaaaatatttgggttgtctgggcatgttccgtgctggcctgttcagtgctgcgcggcagtctgttaatgcttaccccgacctcaggagctgtgtcaatgccatcccagaccaatgtgatcctatgccatgcaatgaagatgggtatctgagctgcaaagatggccaagctgctttcacatgcatctgcaaaccaggatggcaaggggacaaatgccagtttgatgtaaatgaatgtaaagatcccttaaatgtaaatgggggctgcagccagatttgtgacaacactcctggaagttaccactgctcctgcagaagtggctttgctatgctttcaaacaaaaaagactgcaaagatgtggatgaatgctctatgaagcccagtgtttgtggctcagctgtgtgcaagaacactccaggagactatgagtgtgaatgtcctgacggctacagatatgatccctcatcgaagtcttgcaaagatgtggacgaatgctctgagaacatgtgtgctcaattgtgtgtcaattaccctggaggctactcttgttactgtgatggaaagaaaggattcaagcttgcccaagatcagaagagttgtgagggtattccagtgtgccttcccttgaaccttgacaaaaattatgaattattgtacttggctgagcagtttgtaggagttgtcttatatctgaaatttcgtttgccagaaattaccagattttcagctgaatttgattttcggacatatgattcagagggcatcatcctgtatgcagaatctcttgatcactcaaattggctcctgattgcacttcgtgatggaaaaattgaagttcagtttaagaatgagttttcaacccaaatcacaaccggaggcaatgttattaacaatggtaaatggaacatggtatccgtggaagaattagacgacagtgttagcattaaaatagctaaagaagctgtgatgaatataaataaatttgggagcctctttaaacctacagatggatttctggacaccaaaatatactttgcaggattacctcgggtagtggaaagtgcactcattaaaccgattaaccctcgtctggatggatgtatacgaggctggaacttgatgaaacaaggagctttaggtgcaaaggaaattattcaaggaaaacaaaataagcattgcttcctcatggtggagaagggctcctactaccctggttctggaattgctcggttcagcatagattacaataatgtaaccaatgcagagggctggcaaataaatgtgaccttgaatattcgtccatccactggcactggaattatgcttgccttggtttctggagacaaagtgccctttgccttgtccttggtgggctccagctctgaaaattctcaggatattgtggtatttgttgaaaattcagtggtggctcgaatggaggccataactctgtgttctgaccagcaatcccaactgaaatgtaatgttaacagacatggcctagagctatggagcccactgaagaaagatgtcatctactctaaagatattcaaggacaactagcagtcttggacaaagcaatgaaaggaaacgtggccacttatctgggtggcattccagatctttccttcagtgccacgccagtgaatgccttctacagtggctgcatggaagtgaacatcaacggggtgcagttggatctggatgaagccatttctaaacataatgacatcagagctcactcatgtccttcagttaagaaaatccagaagaacgtctaa
mrvlsarcrlllvclalvlpasetnflskehasqvlvrkrrantlleetkkgnlerecieelcnkeearevfennpetdyfypkylgclgmfraglfsaarqsvnaypdlrscvnaipdqcdpmpcnedgylsckdgqaaftcickpgwqgdkcqfdvneckdplnvnggcsqicdntpgsyhcscrsgfamlsnkkdckdvdecsmkpsvcgsavckntpgdyececpdgyrydpssksckdvdecsenmcaqlcvnypggyscycdgkkgfklaqdqkscegipvclplnldknyellylaeqfvgvvlylkfrlpeitrfsaefdfrtydsegiilyaesldhsnwllialrdgkievqfknefstqittggnvinngkwnmvsveelddsvsikiakeavmninkfgslfkptdgfldtkiyfaglprvvesalikpinprldgcirgwnlmkqgalgakeiiqgkqnkhcflmvekgsyypgsgiarfsidynnvtnaegwqinvtlnirpstgtgimlalvsgdkvpfalslvgsssensqdivvfvensvvarmeaitlcsdqqsqlkcnvnrhglelwsplkkdviyskdiqgqlavldkamkgnvatylggipdlsfsatpvnafysgcmevningvqldldeaiskhndirahscpsvkkiqknv
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞のプロテインSのmRNAは、小干渉RNA(siRNA)の細胞への導入によって分解されうる。siRNAは、細胞内で分離しうる短い二本鎖RNAであり、分子のアンチセンス部分は相補的なmRNAにハイブリダイズし、ダイサーヌクレアーゼが重要な役割を果たす様式によってこのmRNAの切断を誘導しうる。siRNAの作用は、Elbashir-SM等, Nature 411 (2001) 494-498において記述される。siRNAは、一本鎖RNAとして合成されてもよく、その後アニールして二本鎖siRNA分子形成しうる。その後、siRNA分子を細胞に一過性に形質移入してその機能を発揮させうる。あるいは、Brummelkamp TR; Bernards R; Agami R, Science 296 (2002) 550-553に記載のように、siRNAはポリメラーゼIIIプロモータの制御下でヘアピン分子として発現されうる。
個々のプロモーターによって各々2つの相補鎖の転写を可能にするベクターは、発明者等の研究所において開発した。ランダムなDNAが挿入されているのでこのベクターをRansiRNAと称し、挿入物の両方の鎖が転写されうる。RansiRNAベクターは、ヒトH1ポリメラーゼIIIプロモーター及びマウスU6ポリメラーゼIIIプロモーターを含有する。2つのプロモーターは、各々の方向からsiRNA鋳型に対して配位し、それぞれsiRNA分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖を転写する。また、ベクターはハイグロマイシン薬剤耐性遺伝子を有している。RansiRNAベクターは、Kaykas & Moon (Kaykas-A & Moon-RT, BMC Cell Biology Vol. 5 (1) pp. 16 (2004)によって記述されるpHippyベクターに似ているが同一ではない。
特定のsiRNAコンストラクトを、ヒトFVII類似体を発現しているCHO K1細胞株に、安定して形質移入した。細胞を、2×105細胞/ウェルの濃度で完全培地(10%FBS、非必須アミノ酸及びビタミンKを含有するDMEM培地)を含む6ウェルプレートに播いた。2日後に、細胞を90%の集密度に移した。製造業者の指示に従ってリポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いた形質移入を行った。48時間後に、細胞を選択培地へ移した。この選択培地は300μg/mlのハイグロマイシンが付加的に添加されている完全培地からなる。14日間の選別の後、限界希釈によって細胞をクローン化した。クローンが育った後、以下のELISAにおいてウシプロテインSの検出を避けるために、FBS含有完全培地を無血清培地(ビタミンKを添加したPF CHO、Hyclone)に変えた。各々のsiRNAコンストラクトについておよそ100のクローンからの上清を、ヒトプロテインSを標準物質として用いたプロテインS ELISAによってスクリーニングした。また、同じ上清を、ヒトFVII ELISAによってスクリーニングした。プロテインSを最も少なく発現し、FVIIの発現を失っていないクローンをさらに特徴付けた。親のCHO K1 FVII発現細胞株によって示される発現レベルのたった10%のレベルにプロテインSの発現を下方制御したクローンを単離した。
#821 siRNA1標的(配列番号7):
5'-agtgtgaatgtcctgacggct-3'
#821 siRNA1上方オリゴ(配列番号8):
5'-gatctaaaaaagtgtgaatgtcctgacggctttttta-3'
#821 siRNA1下方オリゴ(配列番号9):
5'-gatctaaaaaagccgtcaggacattcacactttttta-3'
5'-agctgcaaagatggccaagct-3'
#822 siRNA2上方オリゴ(配列番号11):
5'-gatctaaaaaagctgcaaagatggccaagctttttta-3'
#822 siRNA2下方オリゴ(配列番号12):
5'-gatctaaaaaagcttggccatctttgcagctttttta-3'
5'-agaacatgcctcgcaagtcct-3'
#835 siRNA4上方オリゴ(配列番号14):
5'-gatctaaaaaagaacatgcctcgcaagtcctttttta-3'
#835 siRNA4下方オリゴ(配列番号15):
5'-gatctaaaaaaggacttgcgaggcatgttctttttta-3'
5'-agaaactaaaaagggcaatct-3'
#836 siRNA5上方オリゴ(配列番号17):
5'-gatctaaaaaagaaactaaaaagggcaatctttttta-3'
#836 siRNA5下方オリゴ(配列番号18):
5'-gatctaaaaaagattgccctttttagtttctttttta-3'
5'-agccagatttgtgacaacact-3'
#837 siRNA6上方オリゴ(配列番号20):
5'-gatctaaaaaagccagatttgtgacaacactttttta-3'
#837 siRNA6下方オリゴ(配列番号21):
5'-gatctaaaaaagtgttgtcacaaatctggctttttta-3'
プロテインSのタンパク質発現を無効にする確実な方法は、遺伝子を破壊することである。マウスの「遺伝子ターゲティング」又は「遺伝子ノックアウト」の技術は長年知られている。また、培養細胞の遺伝子ターゲティングは十分に確立されており、CHOノックアウト細胞の例は近年Yamane-Ohnukiet等 Biotechnology and Bioengineering, 87(5): 614-622, 2004に記述された。
発明者等は、CHOプロテインS cDNAのヒト遺伝子に対するアライメントによって、CHOプロテインS遺伝子のエクソン構造を予測した。CHOプロテインSのエクソン1及びエクソン2において結合するように設定されたプライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に用い、CHOゲノムDNAを鋳型とした。増幅された4.4kb生成物を配列決定した。エクソン2及びエクソン3を結合するプライマーを用いてイントロン2のPCR増幅を行った。イントロン2を有する3.5kbの増幅された断片をクローニングして配列決定した。
遺伝子ターゲティングコンストラクトは、「1.6kbの5'UT/プロモーター断片」、「Plox-PGK-ハイグロマイシン耐性遺伝子-Plox」、「イントロン1」、「エクソン2」及び「PGK-TK」を結合するであろう。このコンストラクトは、アミノ酸MRVLSVRCRLLLVCLALVLPASETN(配列番号22)をコードする、CHOプロテインSのエクソン1コード配列を欠失している。ブラストサイジン薬剤耐性遺伝子を含有する第二のコンストラクトを同様な方法で作製することができる。
第二に、ブラストサイジン耐性遺伝子を有するターゲティングコンストラクトを、半接合CHO細胞に電気穿孔して、その後細胞を、10μg/mlブラストサイジンと1マイクロモルのガンシクロビルを用いて、ブラストサイジン耐性遺伝子に関して、そしてチミジンキナーゼ遺伝子に対して選択する。再び、細胞クローンを、コンストラクトに存在するプロモーターへのプライマー3'とブラストサイジン耐性遺伝子特異的プライマーを用いてPCR確認を行った。さらにポジティブクローンをサザンブロットによって試験する。
ホモ接合の破壊株は、Creリコンビナーゼ発現プラスミドを形質移入されている。Creリコンビナーゼは、lox部位を再結合して、薬剤耐性遺伝子を取り除く。
CHO-プロテインS-エクソン1-forw2(配列番号23):
5'-CTGCTGGTATGCCTAGCCCTGGTG-3'
CHO-プロテインS-エクソン2-rev2(配列番号24):
5'-TGCAGAGCTCTTCGATGCATTCTC-3'
CHO-プロテインS-エクソン2-forw2(配列番号25):
5'-AAGGGCAATCTTGAAAGAGAATGC-3'
CHO-プロテインS-エクソン3rev(配列番号26):
5'-CCAAATATTTTGGATAAAAATAATC-3'
PS-CHOプロモーターf2(配列番号27):
5'-AARCAACCCCTTTTGACCAT-3'
CHO-プロテインS.プロモーターRev1(配列番号28):
5'-CCCAGAGGAGCTGCGAGCCTG-3'
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プロテインSの発現は、プロテインS mRNAの転写の下方制御によって低減されるか無効にされうる。転写因子は、CHOプロテインS遺伝子のプロモーター領域中の特定のDNAエレメントを結合するように設定されうる。Zincフィンガータンパク質はこのような操作に適しており、一般的な手順はWolfe-SA等 Annu. Rev. Biophys. Struct. vol 3:183-212, 1999及びJamieson-AC等 Nature Reviews, vol 2:361-368, 2003に総説される。一般的に、単一のZincフィンガーは、同じDNA鎖の各々に隣接する3つの塩基と、相補鎖上の前方の塩基を結合する。したがって、いくつかのZincフィンガーが組み合わさって、所望のDNAエレメントを結合しうる。実際にゲノム中で普遍的でありうる15〜18塩基対のDNAエレメントの認識には、5〜6のZincフィンガーの組合せが必要である。
CHOプロテインSプロモーターの配列GGAGAGGAGGGGGGG(配列番号35)を有するDNAエレメントを選択して、DNAエレメントを結合するZincフィンガータンパク質を、Liu-PQ等, Journal of Biological Chemistry, Vol. 276 (14), pp. 11323-11334, 2001及びZhang-L等 Journal of Biological Chemistry, Vol. 275 (43), pp. 33850-33860, 2000による刊行物に基づいて予測した。Zhang-L等 Journal of Biological Chemistry, Vol. 275 (43), pp. 33850-33860, 2000の記載のように、SP1及びBTEB4に基づく合成した5つのZincフィンガータンパク質を、オーバーラップするオリゴヌクレオチドからのPCRによって作製する。Zincフィンガー5 CXXCXXXXXQSGHLQRHXXXH(配列番号36)はGGAgと相互作用する;Zincフィンガー4 CXXXXCXXXXXRSDNLARHXXXH(配列番号37)はGAGgと相互作用する;Zincフィンガー3 CXXCXXXXXRSDNLTRHXXXH(配列番号38)はGAGgと相互作用する;Zincフィンガー2 CXXXXCXXXXXRSDHLTRHXXXH(配列番号39)はGGGgと相互作用する;Zincフィンガー1 CXXXXCXXXXXRSDHLARHXXXH(配列番号40)はGGGaと相互作用する;そして、ZincフィンガーのN末端であるKOX1のKRABドメインが挿入される。
CHOプロテインSプロモーター領域(配列番号29)を、pGL3-ベーシック(Promega, Madison)にクローニングして、ZNF-PSの効果を決定するためにルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてレポーターコンストラクトとして用いた。ZNF-PS遺伝子をコードするプラスミドとCHOプロテインSレポータープラスミドとを、CHO-K1細胞に形質移入して、ルシフェラーゼ活性を決定した。ZNF-PSは、用量-反応非依存性の様式でプロテインS転写を50%下方制御しうる。図3aにプロテインSのZNF-PS下方制御を例示する。
同様な実験において、CHO-K1細胞に、ZNF-PSとpEGFP(高感度緑色蛍光タンパク質)を形質移入して、プロテインSとpEGFP mRNAをリアルタイムPCRにて測定した。pEGFPを形質移入コントロールとした。図3bにプロテインSの50%の下方制御を示す。
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22の染色体を有するチャイニーズハムスターと比較して、CHO-K1細胞株は21しか染色体を持っておらず、これら21の8のみが正常であった。13には、変化した染色体の転座、欠失及び動原体周囲の逆位が検出された(Deaven & Petersen, Chromosoma 1973; 41(2), 129-144)。プロテインS遺伝子が正常染色体と変化した染色体のどちらに存在するか、ないしはどのくらい多くの対立遺伝子がCHO-K1ゲノムに存在するかはわからない。
SeeDNA Biotech Inc. companyは、発明者等がクローン化して供給したpCR2.1(Invitrogen, Carlsbad)中にプロテインSイントロン1プローブ(配列番号43)を含有するプラスミドを用いて、CHO K1細胞(ATCC#CCL-61)のゲノムのFISH(蛍光インサイツハイブリダイゼーション)分析を行った。FISH分析の結果を図4に示す。
プロテインS遺伝子は、同じ中期で2つの異なる染色体上に配位する。遺伝子座A(矢印によって示される)を有する染色体はサブメタセントリックであり、大きさが小さく。遺伝子座B(矢頭によって示される)を有する染色体はメタセントリックであり、大きさが大きい。また、これら2つの染色体のバンドパターンは異なる。
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哺乳動物細胞において起こる体細胞組み換えは相同的であることがあまりないので、相同組み換えによる遺伝子ターゲティングは難しくて骨の折れる作業である。しかしながら、DNA鎖の部位特異的な切断は相同組み換えを促しうる。エンドヌクレアーゼに融合するDNA結合Zincフィンガーの操作により、DNA切断がどこに起こるのかをほぼ正確に設定することができる(Durai等, Nucleic Acids Research, 2005; 33(18), 5970-5990、及びSmith等, Nucleic Acids Research, 2000; 28(17), 3361-3369)。5'-GTCCTGAGC-3'(右のフィンガー)及び5'-GCTGGTATG-3'(左のフィンガー)エレメントを結合するように設定された、2つのZincフィンガータンパク質を、Mani等 (Mani等, Biochemical and Biophysical Research Communications 2005, 335; 447-457)によって公開されたフレームワーク内に作製した。ZincフィンガーのZincフィンガーDNA結合特異性は既に報告されている(Rebar-EJ,等 Nature Medicine 8 (2002) 1427-1432;Liu-PQ,等 Journal of Biological Chemistry 276 (2001) 11323-11334;Ren-D,等 Genes & Development 16 (2002) 27-32;Mani-M,等 Biochemical and Biophysical Research Communications 335 (2005) 447-457)。
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Claims (29)
- 対象とするビタミンK依存性タンパク質を発現する宿主細胞であって、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように修飾されている宿主細胞。
- 前記の対象とするビタミンK依存性タンパク質が、GAS-6、プロテインS、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインC、第VII因子、プロテインZ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質1、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質2、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質3、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質4、骨Glaタンパク質、マトリックスGlaタンパク質、及びオステオカルシンからなる群から選択される、請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記タンパク質混入物が第二のビタミンK依存性タンパク質である、請求項1又は2に記載の宿主細胞。
- 前記タンパク質混入物がプロテインSである、請求項1から3のいずれか一に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞が、CHO細胞、293(HEK293)細胞、BKH細胞、HKB11細胞、SP2/0細胞及びNS0細胞からなる群から選択される、請求項1から4のいずれか一に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードするmRNAを標的とする少なくとも一のsiRNAポリヌクレオチドコンストラクトを形質移入することによって修飾されている、請求項1から5のいずれか一に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の遺伝子ノックアウトによって破壊することによって修飾されている、請求項1から6のいずれか一に記載の宿主細胞。
- プロテインSをコードする内因性遺伝子がエクソン1の遺伝子ノックアウトによって破壊されている、請求項7に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現される前記タンパク質混入物をコードする遺伝子のDNAエレメントに結合する少なくとも一の転写因子を形質移入することによって修飾されている、請求項1から8のいずれか一に記載の宿主細胞。
- 前記転写因子がZincフィンガータンパク質である、請求項9に記載の宿主細胞。
- 前記Zincフィンガータンパク質が配列番号35の配列を含んでなるDNAエレメントを結合する、請求項10に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の破壊のためにランダム突然変異誘発によって修飾されている、請求項1から11のいずれか一に記載の宿主細胞。
- 請求項1から12のいずれか一に記載の宿主細胞の生成方法であって、
a) 場合によって対象とするビタミンK依存性タンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトを該細胞に形質移入する;及び、
b) 内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように該細胞を修飾する
という工程をいずれかの順序で含んでなる方法。 - 前記の対象とするビタミンK依存性タンパク質が、GAS-6、プロテインS、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインC、第VII因子、プロテインZ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質1、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質2、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質3、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質4、骨Glaタンパク質、マトリックスGlaタンパク質、及びオステオカルシンからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記タンパク質混入物が第二のビタミンK依存性タンパク質である、請求項13又は14に記載の方法。
- 前記タンパク質混入物がプロテインSである、請求項13から15のいずれか一に記載の方法。
- 宿主細胞が、CHO細胞、293(HEK293)細胞、BKH細胞、HKB11細胞、SP2/0細胞及びNS0細胞からなる群から選択される、請求項13から16のいずれか一に記載の方法。
- 前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードするmRNAを標的とする少なくとも一のsiRNAポリヌクレオチドコンストラクトを形質移入することによって修飾されている、請求項13から17のいずれか一に記載の方法。
- 前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の遺伝子ノックアウトによって破壊することによって修飾されている、請求項13から18のいずれか一に記載の方法。
- プロテインSをコードする内因性遺伝子がエクソン1の遺伝子ノックアウトによって破壊されている、請求項19に記載の方法。
- 前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現される前記タンパク質混入物をコードする遺伝子のDNAエレメントに結合する少なくとも一の転写因子を形質移入することによって修飾されている、請求項13から20のいずれか一に記載の方法。
- 前記転写因子がZincフィンガータンパク質である、請求項21に記載の方法。
- 前記Zincフィンガータンパク質が配列番号35の配列を含んでなるDNAエレメントを結合する、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の破壊のためにランダム突然変異誘発によって修飾されている、請求項13から23のいずれか一に記載の方法。
- 内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で有する対象とするビタミンK依存性タンパク質を含有してなる組成物の生成方法であって、
a) 請求項13から24のいずれか一に記載の方法に従って宿主細胞を生成する;及び、
b) 成長培地中で該宿主細胞を生育させ、対象とするビタミンK依存性タンパク質を含んでなる該成長培地を回収する
という工程を含んでなる方法。 - 請求項25に記載の方法によって生成される組成物。
- 配列番号1の配列を含んでなる核酸配列。
- 配列番号2の配列を含んでなる核酸配列。
- 配列番号3の配列を含んでなるアミノ酸配列。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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EP05106401 | 2005-07-13 | ||
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