CN109385442A

CN109385442A - 生菜作为宿主在表达血清白蛋白中的应用

Info

Publication number: CN109385442A
Application number: CN201710667745.7A
Authority: CN
Inventors: 王跃驹; 马洁
Original assignee: Beijing Ruicheng Haiway Health Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Ruicheng Haiway Health Technology Co Ltd
Priority date: 2017-08-07
Filing date: 2017-08-07
Publication date: 2019-02-26

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及生菜作为宿主在表达血清白蛋白中的应用。本发明利用重组载体以及农杆菌介导真空渗透方法来表达血清白蛋白(HSA)。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4d后就可以收集。利用SDS‑PAGE法、免疫印迹法(Western法)确定重组HSA成功表达。细胞增值实验证明生菜生产的HSA具有生物学活性。本发明提供了一种低成本、方便、大量生产具有活性重组人HSA的方法。

Description

生菜作为宿主在表达血清白蛋白中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及生菜作为宿主在表达血清白蛋白中的应用。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性，球状和非糖基化的单体蛋白。HSA 是单体球状前原蛋白，其成熟形式由585个氨基酸(66.5kDa，17个二硫键) 的单个多肽链组成。它主要用作类固醇，脂肪酸和甲状腺激素的载体蛋白，并且在稳定细胞外液体体积中起重要作用。HSA是最广泛使用的静脉注射蛋白质，在临床上广泛用于治疗严重烧伤，出血性休克，低蛋白血症，胎儿成红细胞增多症和肝硬化引起的腹水。HSA还可用作疫苗或治疗性蛋白质药物的赋形剂，也可用作疫苗和药物生产中的细胞培养基补充剂。近来已经探索了生物应用中HSA的许多其他新用途，例如氧的载体，药物的纳米转运和多肽的融合。身体中白蛋白量的减少将导致不同种类的疾病，如血容量不足和低蛋白血症。

目前，世界各地的HSA市场年度需求估计超过500吨。HSA的商业生产主要是基于收集的人血浆，通过血清分馏而产生。由于血源供应不足，导致HSA产量远远达不到临床的需求量，致使HSA价格快速上涨。而且，血浆中潜在的病原体如肝炎和艾滋病毒导致从目前从血浆中来源的HSA存在各种风险。为了消除血浆病原体以及病毒污染的潜在风险，利用基因工程技术生产重组HSA(rHSA)可以作为大规模生产一种更安全以及低成本的HSA。

植物作为药物蛋白质的表达和生产系统，已经研究了近三十年。除了低成本和产量高等的优点外，基于植物的表达系统还降低了人和动物病原体从产生蛋白质的过程中传播到人类的风险。此外，植物真核蛋白内膜表达系统和分泌途径类似于哺乳动物细胞。植物表达系统可大量生产大分子量以及多亚基的药物蛋白质，且大大优于原核生物表达系统，比如大肠杆菌表达系统。如需要翻译后修饰的，糖基化的蛋白，以及需要组装的单克隆抗体，其不能用原核系统实现。利用植物生产的药用蛋白作为生物试剂已经商业化，或用作家禽的疫苗添加剂。2012年，美国食品和药物管理局(FDA)批准了用于治疗遗传疾病1型戈谢病的蛋白ELELYSO^TM(taliglucerase alfa)，而这种蛋白是利用胡萝卜生产的。在过去十年中，人们对药物蛋白质的需求急剧增加，所以FDA批准用于临床试验的植物药用蛋白质的数量也在不断增加。

植物瞬时表达系统可以大量生产重组蛋白用于临床研究或者应对突发性疾病。2014年，唯一用于有效抵抗埃博拉病毒爆发的抗体治疗药物， ZMappTM，就是农杆菌渗透方法在烟草叶片中生产。ZMapp的功效和安全性为推动植物制药业的行业开辟了道路。目前，烟草瞬间蛋白表达最常见的宿主植物，并且已经开发了各种载体和农杆菌渗透方法，用于在短时间内进行大规模生产。然而，烟草具有高纤维含量和潜在的有毒化合物，如生物碱尼古丁，显著增加了下游纯化过程中的成本，极大地阻碍了植物外源蛋白药物的进一步发展。与烟叶系统相比，生菜中含有更少的酚类和有毒化合物，因此，将生菜作为宿主在表达血清白蛋白具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供生菜作为宿主在表达血清白蛋白中的应用。本发明利用生菜作为重组蛋白生产的有效平台，消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本发明用生菜系统表达了HSA，并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明生菜表达平台可以用来生产重组人血清白蛋白。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了生菜作为宿主在表达血清白蛋白中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述人血清白蛋白为人血清白蛋白。

本发明还提供了一种表达载体，包括血清白蛋白的核苷酸序列和双元植物载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体中所述血清白蛋白为人血清白蛋白。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：

步骤1：在血清白蛋白的核苷酸序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl限制性酶切位点；所述血清白蛋白优选为人血清白蛋白；

步骤2：克隆到载体pUC57载体中，获得克隆载体；

步骤3：通过Xbal/Sacl从步骤2所得的克隆载体pUC57-HSA中获得基因片段HSA，克隆至双元植物载体pCam35S，获得表达载体p35S-HSA。

具体的，本发明提供的表达载体的构建方法为：将人HSA(GenBank Accession号：AF542069)密码子优化为植物偏好的密码子，由 GeneArt^TMGeneOptimizer^TM(ThermoFisher)设计并由金斯瑞公司合成。在优化的HSA序列5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl位点，并由金斯瑞公司克隆到pUC57载体中。人血清白蛋白基因片段HSA通过 Xbal/Sacl从pUC57-HSA中分离，并克隆到双元植物载体pCam35S，分别产生瞬时表达载体p35S-HSA。将植物表达构建体分别通过用Multiporator (Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5L YEB(酵母提取物肉汤， 5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/L MgSO4，pH7.2) 并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器 (220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mM MES，10mM MgSO₄)中至O.D.600为0.5。所述克隆HSA基因片段(图1)，并且构建两种基于双元植物表达载体p35S-HSA (图2)。在完成构建体后，用特异性限制酶消化证实基因片段是完整的。

在本发明中，HSA cDNA序列(GenBank:AF542069)如SEQ ID No.1 所示；HSA氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；密码子优化后的HSAcDNA序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了所述表达载体在表达血清白蛋白中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述血清白蛋白为人血清白蛋白。

本发明还提供了一种生菜作为宿主表达血清白蛋白的方法，将所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入生菜组织后，提取、分离蛋白质，获得血清白蛋白。

在本发明的一些具体实施方案中，所述方法中所述血清白蛋白为人血清白蛋白。

在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：

步骤1：抽真空25～45s；

步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；

步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d。

在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌为根癌土壤杆菌GV3101。

具体的，农杆菌介导真空渗透的方法为：将制备好的农杆菌培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(Welch Vacuum，Niles， IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3 次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。

渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4天后显示淡黄褐色区域。为了增加浸入叶组织的土壤农杆菌的数量，使用剪刀将10％的生菜从头切掉使得生菜叶组织尽可能的浸润在渗透液中，和释放。与更长的真空暴露时间相比，该方法减少了叶片组织坏死。

在本发明的一些具体实施方案中，提取、分离蛋白质具体为：

经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mM KPi，pH7.8；5mM EDTA；10mMβ-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至pH为8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g 离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60min。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于 5mL缓冲液(20mMKPi，pH 7.8；2mM EDTA；10mβ-巯基乙醇)中并在4℃下储存。

收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5uL)热变性 (95℃)加载缓冲液(Biorad，Hercules，CA，USA)在4～12％Bis-Tris Plus SDS-凝胶(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)跑电泳，然后用考马斯蓝G250(Biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。对于重组HSA的 Western Blot蛋白印迹杂交，10ul的重组样品以及hHSA标准品(Biovision) 分别在10～20％Bis-Tris Plus聚丙烯酰胺凝胶上分离，并将其电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用抗HSA的抗体(Abcam)分别进行免疫反应，稀释1：10000和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG (Beyotime)，稀释度分别为1:20000，并使用ECL plus(Amersham Biosciences) 显现，对显示图像进行拍照。

植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。本发明用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。重组HSA经过SDS-PAGE分离我们在泳道中观察到估计分子量大约为65kDa的条带(图3(A)，泳道1)，与阳性HSA条带一致(图3(A)，泳道2)。在隐形对照泳道中没有明显的对应条带(图3(A)，泳道3)。基于 Bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量为1.47mg/g。另外，Western印迹分析也检测到大约65kDa的条带(图3(B)，泳道1)，观察到的蛋白分子量(65kDa)与阳性对照组(图3(B)，泳道2)一致。

来自中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)细胞在含有5％(v/ v)胎牛血清(FBS，Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Gibco) 中于37℃，在5％CO ₂中培养。将CHO细胞在24孔板中生长至100％汇合。血清饥饿细胞16h，用无菌移液针头刮伤CHO表面，用PBS洗涤去除细胞碎片。然后用1mg/ml的剂量用纯化的HSA以及标准品刺激细胞48h。使用显微镜(尼康)对初始伤口和细胞在划伤区域。

通过细胞实验研究纯化的HSA的生物活性。首先，使用纯化的重组HSA 培养CHO细胞，使用相同的商业用HSA标准作为阳性对照。CHO的细胞增殖可以通过使用1mg/ml剂量的纯化重组HSA发现，在48h的时间点检查细胞生长结果表明，没有任何处理的CHO细胞生长较差。相比之下，使用纯化的重组HSA或相等的阳性对照HSA标准处理的CHO细胞生长良好；它们在划伤表面拉伸蔓延(图4)。这些结果表明，通过生菜系统瞬间表达的外源 HSA具有生物学活性，生菜系统可能是生物活性重组药物蛋白质批量生产的合适的生物反应器。

用于真空农杆菌渗透的烟草植物的生长时间通常为4至6周。本发明利用生菜作为重组蛋白生产的有效平台，消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本发明用生菜系统表达了HSA，并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明生菜表达平台可以用来生产人血清白蛋白。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1(A)示HSA克隆载体(金斯瑞公司构建合成)；

图1(B)示HSA基因片段酶切(XbaI/SacI)鉴定；

图2示植物瞬时表达载体p35S-HSA构建流程；利用限制性内切酶 (XbaI/SacI)双酶切，从图1克隆载体分别切下HSA片段，连接入pCam35S的 XbaI/SacI位点，生成植物瞬时表达载体p35S-HSA；

其中，35S，具有烟草花叶病毒(TMV)5‘UTR的CaMV 35S启动子；NPT II，用于卡那霉素抗性的编码nptII基因的表达；Nos 3’，终止子；

图3(A)示利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯化的重组成纤维细胞人血清白蛋白；泳道1:纯化重组HSA(5μg)；泳道2：阳性对照HSA (5μg)；泳道3：非真空渗透叶片洗脱液阴性对照；

图3(B)示Western印记杂交检测纯化的重组人血清白蛋白；泳道1:纯化重组HSA(5μg)；泳道2：阳性对照HSA(5μg)；泳道3：非真空渗透叶片洗脱液阴性对照；

图4示细胞增值实验；使用纯化的HSA处理划痕CHO细胞，进行愈合测定；48小时后，重组成纤维细胞人血清白蛋白明显促进细胞增殖活性。

具体实施方式

本发明公开了生菜作为宿主在表达人血清白蛋白中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明研究表明，生菜系统可以是有效的表达平台，为快速，瞬时表达重组蛋白质提供了方法。真空农杆菌渗透方法简单，快速，减少叶片坏死，而且可以提高重组蛋白产量。生菜可以通过承受真空压力而增加蛋白质产量，并允许每片叶子更完整的渗透。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其他瞬时表达植物，如烟草等更容易获得并且更便宜。并且由于不需要特殊设备或液氮，成本效益更高。本发明证明该方法可以用于短时间内大规模生产HSA重组蛋白质。

本发明提供了生菜作为宿主在表达人血清白蛋白中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1植物瞬时表达载体的构建

为了提供外援蛋白在植物中的高效表达，本发明将人HSA(GenBank Accession号：AF542069)密码子优化为植物偏好的密码子，由 GeneArt^TMGeneOptimizer^TM(ThermoFisher)设计并由金斯瑞公司合成。在优化的HSA以及FGF-2序列5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入 Sacl位点，并由金斯瑞公司克隆到pUC57载体中。人血清白蛋白基因片段HSA 通过Kpnl/Sacl从pUC57-HSA中分离，并克隆到双元植物载体pCam35S，分别产生瞬时表达载体p35S-HSA。将植物表达构建体分别通过用Multiporator (Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5L YEB(酵母提取物肉汤， 5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/L MgSO4，pH7.2) 并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器 (220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10 mM MES，10 mM MgSO₄)中至O.D.600为0.5。

所述克隆HSA基因片段(图1)，并且构建基于植物的双元表达载体 p35S-HSA(图2)。在完成构建体后，用特异性限制酶消化证实基因片段是完整的。

实施例2农杆菌介导的真空渗透

本发明优化了农杆菌真空渗透的方法(图2)。将制备好的农杆菌培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上) 并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(Welch Vacuum， Niles，IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。

实施例3蛋白质提取和分离

经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mM KPi，pH7.8；5mM EDTA；10m-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至pH为8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g 离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60分钟。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5mL 缓冲液(20mM KPi，pH 7.8；2mM EDTA；10mM β-巯基乙醇)中并在4℃下储存。

实施例4 SDS-PAGE凝胶电泳以及Western Blot蛋白印迹杂交

收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5uL)热变性 (95℃)加载缓冲液(Biorad，Hercules，CA，USA)在4～12％Bis-Tris Plus SDS-凝胶(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)跑电泳，然后用考马斯蓝G250(Biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。对于重组HSA的 Western Blot蛋白印迹杂交，10ul的重组样品以及hHSA和标准品 (Biovision)分别在10～20％Bis-Tris Plus聚丙烯酰胺凝胶上分离，并将其电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用抗hHSA的抗体(Abcam) 分别进行免疫反应，稀释1：10000和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(Beyotime)，稀释度分别为1:20000，并使用ECL plus(Amersham Biosciences)显现，对显示图像进行拍照。

植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。我们用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。重组HSA经过SDS-PAGE分离我们在泳道中观察到估计分子量大约为65kDa的条带(图3(A))，在隐形对照泳道中没有明显的对应条带。基于Bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量为1.47mg /g。另外，Western印迹分析也检测到大约65kDa的条带(图3(B))，观察到的蛋白分子量(65kDa)与阳性对照组一致。

实施例5细胞增值实验

来自中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)细胞在含有5％(v/ v)胎牛血清(FBS，Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Gibco) 中于37℃，在5％CO 2中培养。将CHO细胞在24孔板中生长至100％汇合。血清饥饿细胞16h，用无菌移液针头刮伤CHO表面，用PBS洗涤去除细胞碎片。然后用1mg/ml的剂量用纯化的HSA以及标准品刺激细胞48h。使用显微镜(尼康)对初始伤口和细胞在划伤区域。

实施例6

对照组：利用烟叶生产人血清白蛋白；

实验组：本发明提供的生菜生产人血清白蛋白；

表1人血清白蛋白

^*示与对照组相比P≤0.05；^#示与对照组相比P≤0.01；

由表1可知，与对照组的烟叶系统相比，生菜瞬时表达人血清白蛋白 (HSA)显著(P≤0.05)缩短了生产周期，显著(P≤0.05)提高了蛋白含量，显著(P≤0.05)提高了蛋白活性，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(P ≤0.01)降低了生产成本。

综合上述试验结果表明，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台。能够快速瞬时表达重组蛋白质，可以在短时间内大规模生产人酸性以及碱性成纤维细胞人血清白蛋白。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京惠升生物工程科技有限公司

<120> 生菜作为宿主在表达血清白蛋白中的应用

<130> MP1715548

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1830

<212> DNA

<213> HSA

<400> 1

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60

gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120

gaaaatttca aagccttagt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180

gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240

gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300

gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360

gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420

agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480

aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttacttct atgccccgga actccttttc 540

tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaggctgcc 600

tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660

aggctcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720

gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780

gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840

agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900

gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960

gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020

aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080

aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata taaaaccact 1140

ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200

tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260

cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320

caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380

tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440

ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc 1500

tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560

tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620

tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagcttgt gaaacacaag 1680

cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag 1740

aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt 1800

gctgcaagtc gagctgcctt aggcttataa 1830

<210> 2

<211> 609

<212> PRT

<213> HSA

<400> 2

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

20 25 30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

35 40 45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

115 120 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

130 135 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145 150 155 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

180 185 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

210 215 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

245 250 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

275 280 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

290 295 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305 310 315 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

325 330 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

340 345 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Lys Thr Thr Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385 390 395 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

405 410 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

450 455 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465 470 475 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

530 535 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545 550 555 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

565 570 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

580 585 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Arg Ala Ala Leu Gly

595 600 605

Leu

<210> 3

<211> 1758

<212> DNA

<213> 密码子优化后的HSA cDNA序列

<400> 3

gatgctcaca agtctgaagt tgcccacagg ttcaaggatc tcggcgaaga gaatttcaag 60

gccctcgtgc ttattgcttt cgcccaatac cttcagcagt gcccattcga ggatcacgtg 120

aagcttgtta acgaggtgac cgagttcgct aagacttgtg tggctgatga gtctgctgag 180

aactgcgata agtccctcca cactctcttc ggagataagt tgtgcactgt ggctaccctc 240

agggaaactt atggtgagat ggctgattgc tgcgccaagc aagagccaga aagaaacgag 300

tgcttcctcc agcacaagga cgacaatcca aaccttccaa ggcttgtgag gccagaggtt 360

gacgttatgt gcactgcttt ccacgacaac gaggaaacct tcctcaagaa gtacctctac 420

gagatcgcta ggcgtcaccc atacttttac gctcccgagc ttctgttctt cgccaagagg 480

tataaggctg ctttcactga gtgttgccag gctgctgata aggcagcttg tcttttgcca 540

aagctcgacg agttgcgtga tgaaggcaag gcttcttctg ctaagcagag gcttaagtgc 600

gctagccttc aaaagtttgg cgagagggct tttaaggctt gggctgttgc taggctttct 660

cagaggtttc caaaggctga gttcgccgag gttagcaagc ttgtgactga ccttactaag 720

gtgcacacag agtgctgcca cggtgatctt ttggagtgtg ctgatgatag ggctgacctc 780

gctaagtaca tttgcgagaa ccaggactcc atctcctcca agcttaaaga gtgttgcgag 840

aagccactcc tcgagaagtc tcattgcatt gccgaggttg agaacgacga gatgccagct 900

gatcttccat ctctcgctgc tgacttcgtt gagtctaagg acgtgtgcaa gaactacgct 960

gaggccaagg atgtgttcct cggaatgttc ctttacgagt acgctcgtag gcacccagat 1020

tactctgtgg tgcttctttt gaggctcgcc aagacttacg agactaccct tgagaagtgt 1080

tgcgctgctg ctgatccaca tgagtgctac gctaaggtgt tcgatgagtt caagccactc 1140

gttgaggaac cccagaacct cattaagcag aattgcgagc ttttcgagca gctcggcgag 1200

tacaagttcc agaacgctct tttggtgagg tacaccaaga aggtgccaca ggtttccact 1260

ccaactctgg ttgaagtgtc taggaacctc ggaaaggtgg gatccaagtg ttgtaagcac 1320

ccagaggcta agaggatgcc atgtgctgag gattacctca gcgttgtgct taaccagctt 1380

tgcgtgctcc acgaaaagac tccagtgtct gatagggtga caaagtgctg cactgagtct 1440

cttgtgaacc gtaggccatg cttctctgct cttgaagtgg atgagactta cgtgcccaaa 1500

gagttcaacg ccgagacttt cactttccac gctgatatct gcaccctctc cgagaaagag 1560

aggcagatca agaagcagac tgccctcgtt gaacttgtga agcacaagcc aaaggccacc 1620

aaagagcagc tcaaggctgt tatggatgac ttcgctgcct tcgtcgagaa gtgctgtaag 1680

gctgatgaca aagagacttg cttcgctgaa gagggcaaga agttggttgc tgcttctcaa 1740

gctgctctcg gactttga 1758

Claims

1.生菜作为宿主在表达血清白蛋白中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血清白蛋白为人血清白蛋白。

3.一种表达载体，其特征在于，包括血清白蛋白的核苷酸序列和双元植物载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述血清白蛋白为人血清白蛋白。

5.根据权利要求3或4所述的表达载体，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：

步骤1：在血清白蛋白的核苷酸序列的5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入Sacl限制性酶切位点；

步骤2：克隆到载体pUC57载体中，获得克隆载体pUC-HSA；

步骤3：通过Xbal/Sacl从步骤2所得的克隆载体pUC-HSA中获得基因片段HSA，克隆至双元植物载体pCam35S，获得表达载体p35S-HSA。

6.根据权利要求3至5任一项所述的表达载体在表达血清白蛋白中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述血清白蛋白为人血清白蛋白。

8.一种生菜作为宿主表达血清白蛋白的方法，其特征在于，将如权利要求3至5任一项所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入生菜组织后，提取、分离蛋白质，获得血清白蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述血清白蛋白为人血清白蛋白。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：

步骤1：抽真空25～45s；

步骤2：保持真空-95kPa压力30～60s；

步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d。