KR100751448B1 - 정족수-감지 신호를 제거함으로써 세균성 질병들을조절하는 세균 균주, 유전자 및 효소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자가유도인자 불활성화 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자에 관한 것으로서, 상기 코딩된 단백질은 ¹⁰⁴HXHXDH¹⁰⁹~59aa~H¹⁶⁹~21aa~D¹⁹¹, 및 ¹⁰³HXHXDH¹⁰⁸~71aa~H¹⁸⁰~21aa~D²⁰²로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 또한 이를 포함하는 발현 벡터 및 형질전환된 식물 및 동물 세포들에 관한 것이다. 이러한 핵산 분자들에 의하여 코딩된 단백질들은, 민감성 식물 또는 동물에, 그 병독성이 자가유도인자에 의하여 조절되는 질병에 대한 증가된 내성을 제공한다. 또한 민감성 식물 및 동물들에서 질병 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.

정족수 감지 신호, 자가유도인자 저해인자

Description

정족수-감지 신호를 제거함으로써 세균성 질병들을 조절하는 세균 균주, 유전자 및 효소 {Bacterial strains, genes and enzymes for control of bacterial diseases by quenching quorum-sensing signals}

본 발명은 세균 대사의 조절인자들 (regulators)을 코딩하는 유전자들에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 정족수-감지 신호 (quorum-sensing signals)들을 제거 (quenching)하는 효소들을 코딩하는 유전자들에 관한 것이다. 본 발명은, 또한 자가유도인자 저해인자들 (autoinducer inhibitors)을 코딩하는 유전자들의 발현을 포함하는, 세균성 질병들의 조절 방법에 관한 것이다.

자가유도인자 (autoinducers: AIs)로 알려진 N-아실-호모세린 락톤류 (N-acyl-homoserine lactones)는, 많은 그람-음성 세균들의 정족수-감지 체계에 존재하는, 널리 보존된 신호 분자이다. AIs는 비브리오 종에서의 생발광 (bioluminescence) (Eberhard et al., 1981; Cao and Meighen, 1989), 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)에서의 Ti 플라스미드 접합성 전달 (conjugal transfer) (Zhang et al., 1993), 에르위니아 카로토보라 (Erwinia carotovora), 에르위니아 크리산테미 (Erw. chrysanthemi), 에르위니아 스테와르티 (Erw. stewartii), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나 스 솔라나세룸 (P. solanacerum) 및 제노합두스 네마토필루스 (Xenorhabdus nematophilus)에서의 독성 유전자들의 유도 (Jones et al., 1993; Passador et al., 1993; Pirhonen et al., 1993; Pearson et al., 1994; Beck von Bodman and Farrand, 1995; Flavier et al., 1998; Costa and Loper, 1997; Nasser et al., 1998), 슈도모나스 아우레오파시엔스 (P. aureofaciens) 및 에르위니아 카로토보라 (Erw. carotovora)에서의 항생제 생산의 조절 (Costa and Loper, 1997; Pierson et al., 1994), 세라티아 리퀴파시엔스 (Serratia liquifaciens)에서의 무리 운동성 (swarming motility)의 조절 (Eberl et al., 1996), 및 슈도모나스 플루오레센스 (P. fluorescence) 및 슈도모나스 아에루기노사 (P. aeruginosa)에서의 생필름 형성을 포함하는 다양한 생물학적 기능들의 조절에 관여하는 것으로 알려졌다. 더욱 많은 세균종들이 AIs를 생산하는 것으로 알려지고 있으나, 관련된 생물학적 기능들은 아직까지 확립되어 있지 않다 (Bassler et al., 1997; Dumenyo et al., 1998; Cha et al., 1998). 생필름 형성은 세균 병원성에 특히 중요한데, 이는 생필름이 세균을 항생제 및 숙주 방어 반응들에 더욱 저항성을 갖게 하고, 의료 기기들 및 식수 송수관에 미생물 오염을 야기하기 때문이다.

다른 세균종들은 서로 다른 AIs를 생산할 수 있다. 모든 AI 유도체들이 동일한 호모세린 락톤 모이어티들 (moieties)을 공유하지만, 그 아실기의 길이 및 구조에 있어서 다르다. 비록 AIs에 의하여 조절되는 타겟 유전자들이 매우 다양하지만, AIs의 생합성 및 유전자 조절의 기본적인 메카니즘은 다양한 세균들에서 보존되어 있는 것으로 보인다. AIs에 의한 유전자 조절의 일반적 특징은, 정족수 감지 (quorum sensing)로도 알려진, 세포 밀도 의존성이다. 낮은 세포 밀도 하에서 AIs는 낮은 농도로 존재하지만, 높은 세포 밀도 하에서는 AIs가 연관된 조절 유전자들의 활성화에 충분한 농도로 축적될 수 있다 (Fuqua and Winans, 1996). AIs에 의하여 조절되는 생물학적 기능들은 상당한 과학적, 경제적 및 의학적 중요성을 갖는다. 세균 정족수 감지 시스템의 업 또는 다운 조절을 위한 새로운 시도들은, 과학 분야에서만이 아니라, 실용적 응용 분야들에 있어서도 중요한 가치를 갖는다.

자가유도 불활성화를 코딩하는 새로운 유전자 (aiiA)가 그람-포지티브 세균인 바실러스 (Bacillus) sp. 균주 240B1로부터 클로닝되었다고 최근에 보고된 바가 있다. 많은 식물들에서 무름병 (soft rot disease)을 야기하는 병원균인, 형질전환된 에르위니아 카로토보라 균주 SCG1에서의 aiiA의 발현은, AI의 방출을 심각하게 감소시키고, 세포외 펙틴용해효소 (pectrolytic enzyme) 활성을 감소시키며, 감자, 가지, 배추, 당근, 셀러리, 꽃양배추, 및 담배에 대한 병원성을 약화시킨다. 이러한 결과들은, 병독성이 정족수 감지 신호들에 의하여 조절되는 질병들의 예방을 위한 AI-불활성화 접근 방법 사용에 대한 유망한 가능성을 보여 준다.

N-아실 호모세린 락톤류 자가유도인자들의 효율적인 불활성화가 가능한 세균 균주들 및 효소들이 생명공학 응용분야에서 상당한 관심을 끈다. 본 발명에서는, 테스트된 모든 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) 균주들 및 그들과 밀접하게 연관된 종들이 AIs의 효소적 불활성화 능력이 있다는 것을 개시한다. Tn5 삽입 돌연변이화에 의하여 제조된, 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 A6의 한 가지 AI 합성 음성 돌연변이 역시 AI 불활성화 효소를 생산할 능력이 있는 것으로 밝혀졌다. AI 불활성화 효소들을 코딩하는 유전자들을 기능적 클로닝 접근방법 또는 선택된 세균 균주들로부터의 PCR 접근방법에 의하여 클로닝하였다. 펩티드 서열 비교는 이러한 효소들 모두가, 이전에 보고된 AiiA 효소와 35.4% 내지 94.0% 범위의 아미노산 동일성을 갖는, 메탈로히드로라아제 훼밀리 (metallohydrolase family)에 속한다는 사실을 나타낸다. 바실러스 투린지엔시스 균주는, AI를 생산하는 병원성 세균과 공동 배양되는 경우에 AI 활성을 효과적으로 제거시키며, 에르위니아 카로토보라에 의하여 야기되는 감자 무름병의 효과적인 생물학적 조절 방법을 제공한다. 상기 데이터는 병독성을 조절하는 생체신호들을 제거시키는 것이 질병 조절에 유용한 전략이며, 살충 활성을 갖는 것으로 알려진 바실러스 투린지엔시스 균주 또한, 병독성이 AI에 의하여 조절되는 질병들의 예방에 유망한 생조절 물질임을 암시한다.

AI 불활성화 효소들을 코딩하는 10개의 유전자들을 9개의 그람 포지티브 세균 분리주 (isolates) 및 1개의 그람 네가티브 세균 (아그로박테리움 투메파시엔스)으로부터 클로닝하였다. 유전자들은, 강한 AI 불활성화 활성을 갖는 추정 메탈로히드로라아제를 코딩하는, aiiA 유전자에 대하여 다른 수준의 상동성을 보였다 (Dong et al., 2000). AiiA와 유사하게, 이렇게 새로이 클로닝된 AI 불활성화 유전자들에 의하여 코딩되는 효소 단백질들에서도 아연 결합 모티프 (zinc binding motif) 영역이 고도로 보존되어 있다. 이러한 10개의 효소들은 또한 메탈로히드로라아제 훼밀리의 멤버이며, N-아실호모세린 락톤류 자가유도인자의 불활성화에 대 한 AiiA의 분자적 메카니즘과 동일한 메카니즘을 사용하는 것으로 보인다. 본 발명은 또한 AI 불활성화 효소들의 유전자 풀 (gene pool)을 더욱 풍부하게 한다.

아그로박테리움 투메파시엔스에 있어서, N-아실 호모세린 락톤류 자가유도인자, 주로 OOHL은, Ti 플라스미드 접합 수송 (conjugal transfer)의 조절에 관여한다 (Zhang et al., 1993). 아그로박테리움 투메파시엔스에서 OOHL의 생산은 근두암종 (crown gall tumors)에 의하여 분비되는 접합성 오파인 (opine)에 의하여 유도된다 (Zhang and Kerr, 1991). 생산된 OOHL은 tra 유전자의 발현을 유도한다. Tra 단백질들은 Ti 플라스미드 접합 수송의 과정을 완료시키는 역할을 담당하게 된다. 오파인 유도로부터 Ti 플라스미드 접합 수송의 완료까지는 단 수시간이 요구될 뿐이며, 따라서 Ti 플라스미드 접합 수송은 단지 일시적인 과정으로 간주될 수 있다. 본 발명의 일 구현예인, 아그로박테리움 투메파시엔스에서 확인된, N-아실 호모세린 락톤류 분해를 위한 aiiB 유전자는, 박테리아가 AI 신호 턴오버 (turn over)의 조절을 담당하는 정교한 메카니즘을 가지고 있을 가능성을 강조한다. Ti 플라스미드 접합 수송의 완료 이후에, AI가 아크로박테리움 내에서 분해되는 것으로 보인다.

AI 불활성화 능력이 있는 세균 분리주 대다수가, B. 투린지엔시스 및 이와 밀접하게 연관된 종들에 속하는 그람 포지티브 세균들인 것으로 밝혀졌다. 현재까지, 그람-네가티브 세균에서의 대부분의 특성화된 정족수 감지 신호들은 N-아실 호모세린 락톤류이고 (Fuqua et al., 1996), 반면에 그람-포지티브 세균은 정족수 감지 신호들로서 올리고펩티드류를 생산한다 (Dunny and Leonard, 1997).

바실러스 투린지엔시스 (Bt)는 지난 30년 동안 미생물 살충제로서 광범위하게 이용되어 왔다. 이 미생물은 그람-포지티브, 포자-형성 토양균이고, 포자형성 과정 중에 하나 또는 그 이상의 결정 (Cry) 단백질들로 구성된 결정성 연쇄포자체 (parasporal body)를 생산하며, 이는 인시목곤충 (lepidopteran), 파리목 (dipteran) 및 유충 단계의 딱정벌레목 (coleopteran) 곤충들과 같은 곤충과에 대하여 살충 활성을 보인다 (Lambert and Peferoen, 1992). 일부 Bt 균주들은, 진드기 (nematodes), 편형동물 (flatworms), 및 원생동물 (protozoa) 뿐만 아니라, 다른 곤충과들에 대하여도 활성을 보이는 것으로 또한 보고된 바 있다 (Feitelson et al., 1992). 다양한 Bt 균주들은 28가지 이상의 다르지만, 연관된 살충성 결정 단백질군들을 생산한다 (http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/). 결정 단백질들의 다양한 군들은 통상적으로 특정 범위 주의 곤충에 대해서만 활성을 보이고, 농업상 유용한 다른 곤충들에 대해서는 영향을 미치지 않는다. 현재, Bt-기초 제제들은 농업 분야에서 가장 널리 사용되고 가장 효과적인 미생물 살충제이다.

가치 있는 생조절 성분으로서, Bt는 표적 곤충들에 대한 특이성, 저개발비, 및 환경친화성을 포함하는 몇가지 장점들을 갖는다 (Lambert and Peferoen, 1992). Bt는 통상적으로 천연 토양에서 발견되며, 보통 세포 분화에 의하여 증식하지만, 양분이 고갈되거나 환경이 불리한 때에는 포자를 형성한다. 이러한 포자는 열 및 가뭄과 같은 스트레스 환경들에 대해 높은 내성을 가지므로, 박테리아가 스트레스 기간 동안 생존하는 것을 가능하게 한다. 이러한 포자형성 그람-포지티브 미생물 은, 곤충 또는 질병 생조절을 위하여 건조 분말과 같은 안정한 산물로 용이하게 제제화될 수 있다. Bt는 또한 많은 안전성 테스트들을 거쳤으며, 동물 또는 인간에 대하여 해로운 효과를 갖지 않는 것으로 나타났다.

Bt는, 그것이 통상적으로 세균 및 균류 (fungi)에 대한 효과적인 항생제를 생산해내지 않기 때문에 질병 조절을 위하여 사용되지 않았다. 본 발명에서는, 테스트된 모든 Bt 균주들이 AI를 불활성화시키는 능력을 가진다는 것을 밝혔으며, 따라서 Bt 균주들이 에르위니아 카로토보라 감염에 대한 효과적인 생조절을 제공할 수 있으나, AI 불활성화 유전자들을 갖지 않는 바실러스 푸시포르미스 및 대장균주들은 에르위니아 카로토보라에 대한 생조절을 제공할 수 없다는 것을 밝혔다. Bt 균주들은 어떠한 항생제도 생산해내지 않았으며, 병원체의 성장에 대하여 저해 효과를 갖지도 않았다. 이러한 데이터는 질병 생조절에 있어서 AI 불활성화 유전자들의 중요한 역할을 강하게 암시한다. AI가 세균 세포 내로 용이하게 확산되기 때문에, AI를 그 주변 환경으로부터 지속적으로 제거할 수 있는 능력을 지닌 Bt는, 에르위니아 카로토보라에 의하여 야기되는 식물 무름병의 조절을 위해서 뿐만이 아니라, 병독성 유전자들이 AIs에 의하여 조절되는 다른 질병들의 조절을 위해서도 유망한 생조절 성분이다.

따라서, 본 발명의 과제는, 자가유도인자 저해인자를 생산하는 능력이 있는 세균의 유효량을 식물 또는 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 병독성이 AI에 의하여 조절되는 질병들 [슈도모나스 아에루기노사, 에르위니아 스테와르티, 에르위니아 크리산테미, 슈도모나스 솔라나세룸, 및 크산토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris)에 의하여 야기되는 질병들 (Passador, et al., 1993; Pirhonen, et al., 1993; Pearson, et al., 1994; Beck von Bodman and Farrand, 1995; Barber, et al., 1997; Clough, et al., 1997; Costa and Loper, 1997; Nasser, et al., 1998) 및 특히 에르위니아 카로토보라에 의하여 야기되는 식물 무름병]에 대한 식물 또는 동물의 내성을 증가시키기 위한 방법을 제공하고자 하는 것이다. 본 발명의 이러한 태양에 대한 바람직한 구현예에서, 투여되는 세균은 바실러스 종이며, 더욱 바람직하게는 바실러스 투린지엔시스 변이주, 가장 바람직하게는 B1, B2, B17, B18, B20, B21, B22 및 B25로 이루어진 군으로부터 선택된 바실러스 투린지엔시스 변이주이다. 본 발명의 이러한 태양에 대한 다른 바람직한 구현예에서, 치료되는 동물은 인간이다.

본 발명의 또 다른 과제는, 자가유도인자 불활성화 단백질들을 코딩하는 분리된 핵산 분자들을 제공하는 것이다. 이러한 핵산 분자들은 보존된 아미노산 모티프 ¹⁰⁴HXHXDH¹⁰⁹~59aa~H¹⁶⁹~21aa~D¹⁹¹, 또는 유사 모티프 ¹⁰³HXHXDH¹⁰⁸~71aa~H¹⁸⁰~21aa-D²⁰²를 공유하는 자가유도인자 불활성화 단백질들을 코딩한다. 이러한 핵산 분자들의 바람직한 구현예들은 서열번호 11 내지 20의 단백질들을 코딩하고, 이러한 핵산 분자들의 가장 바람직한 구현예들은 서열번호 1 내지 10의 서열들을 갖는다.

본 발명의 또 다른 과제는, 자가유도인자 불활성화 단백질을 코딩하는 최소한 하나의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로서, 상기 코딩된 단백질은 보존된 아미노산 모티프 ¹⁰⁴HXHXDH¹⁰⁹~59aa~H¹⁶⁹~21aa~D¹⁹¹, 또는 유사 모티프 ¹⁰³HXHXDH¹⁰⁸~71aa~H¹⁸⁰~21aa~D²⁰²를 포함하며, 상기 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서 번식하는 발현 벡터를 제공하는 것이다. 이러한 발현 벡터의 바람직한 구현예들은 서열번호 11 내지 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 코딩하는 최소한 하나의 핵산 서열, 가장 바람직하게는 서열번호 1 내지 10의 핵산 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 과제는, 본 발명의 발현 벡터로 형질전환 (transformed) 또는 트랜스펙션된 (transfected) 원핵 또는 진핵 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 과제는, 자가유도 불활성화 활성을 가지며, 보존된 아미노산 서열 ¹⁰⁴HXHXDH¹⁰⁹~59aa~H¹⁶⁹~21aa~D¹⁹¹, 또는 유사 모티프 ¹⁰³HXHXDH¹⁰⁸~71aa~H¹⁸⁰~21aa~D²⁰²를 포함하는 분리된 단백질을 제공하는 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예들은 서열번호 11 내지 20의 아미노산 서열들을 갖는 단백질들을 포함한다.

본 발명의 또 다른 과제는, 식물 또는 동물에서 질병 내성을 증가시키기 위한 방법을 제공하는 것으로서, 상기 방법은 그와 같은 식물 또는 동물의 세포 내로 상기 세포가 상기 핵산 서열을 발현할 수 있도록 하는 방식으로 자가유도 불활성화 단백질을 코딩하는 최소한 하나의 핵산 분자를 도입하는 단계를 포함하며, 상기 자가유도 불활성화 단백질은 보존된 아미노산 서열 ¹⁰⁴HXHXDH¹⁰⁹~59aa~H¹⁶⁹~21aa~D¹⁹¹, 또는 유사 모티프 ¹⁰³HXHXDH¹⁰⁸~71aa~H¹⁸⁰~21aa~D²⁰²를 포함한다. 본 발명의 이러한 태양의 바람직한 구현예들은 서열번호 11 내지 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 최소한 하나의 핵산 분자를 도입하는 단계를 포함하며, 가장 바람직한 구현예들은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 최소한 하나의 핵산 서열을 도입하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 과제는, 식물 또는 동물에 대한 세균 피해를 예방 또는 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 그와 같은 예방 또는 감소가 필요한 식물 또는 동물에 최소한 하나의 자가유도인자 불활성화 단백질 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 단백질은 보존된 아미노산 서열 ¹⁰⁴HXHXDH¹⁰⁹~59aa~H¹⁶⁹~21aa~D¹⁹¹, 또는 유사 모티프 ¹⁰³HXHXDH¹⁰⁸~71aa~H¹⁸⁰~21aa~D²⁰²를 포함한다. 본 발명의 이러한 태양의 바람직한 구현예들은 서열번호 11 내지 20의 아미노산 서열들을 갖는 최소한 하나의 단백질을 제공하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 과제는 세균성 생필름의 형성을 예방 또는 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 생필름-형성 세균을 최소한 하나의 자가유도인자 저해인자 단백질에 노출시키는 단계를 포함하며, 상기 단백질은 보존된 아미노산 서열 ¹⁰⁴HXHXDH¹⁰⁹~59aa~H¹⁶⁹~21aa~D¹⁹¹, 또는 유사 모티프 ¹⁰³HXHXDH¹⁰⁸~71aa~H¹⁸⁰~21aa~D²⁰²를 포함한다. 본 발명의 이러한 태양의 바람직한 구현예들은 생필름-형성 세균을 서열번호 11 내지 20의 아미노산 서열들을 갖는 최소한 하나의 단백질에 노출시키는 단계를 포함한다.

그와 같은 균주들을 변형시키기 위하여 유전적 접근법을 사용함으로써, 예를 들어 부가적인, 또는 보다 활성이 있는 자가유도인자 저해인자들을 코딩하는 유전자들을 도입함으로써, Aii-생산 세균 균주들의 효율성을 더욱 증진시키는 것도 가능하다. 또한 인 비트로 DNA 진화 접근법에 의하여 aii 유전자들의 효소 활성을 최적화하는 것도 가능하다. aii 유전자를 강한 프로모터와 짝을 이루게 함으로써 Aii 효소들의 발현을 증가시키거나, Bt 세포들에서 aii 유전자의 카피 수를 증가시키는 것도 AI 신호들을 제거하는 Bt 균주들의 능력을 향상시키기 위한 또 다른 유용한 방법이 될 수 있다. AI 불활성화 효소를 분비하거나 또는 세포의 외막에 상기 효소를 포함하는, 유전적으로 변형된 Bt 균주들은 그들의 야생형 모계 균주보다 AI 신호들을 제거하는 데에 있어서 더 나은 효율성을 가질 수 있다. 이는 분비 또는 막 부착 신호 펩티드를 코딩하는 유전자에 aii 유전자를 융합시킴으로써 달성할 수 있다.

서열은 공지의 방법들에 의하여 식물 또는 동물 세포들 내로 도입될 수 있다. 진핵 세포들을 외계 핵산 서열들로 형질전환 또는 트랜스펙션시키기 위한 방법들로는 트랜스펙션, 프로젝타일 봄바드먼트 (projectile bombardment), 일렉트로포레이션 (electroporation) 또는 아그로박테리움 투메파시엔스에 의한 감염이 있다. 이러한 방법들은 분자 생물학 및 생명공학 분야의 당업자에게 친숙한 것들이며, 여기에서 상세하게 설명될 필요는 없다.

병원성 세균 세포들이 식물 조직들의 세포간 영역에 한정되어 있으므로, 세포간 공간을 Aii 단백질의 타겟으로 하는 것이 바람직하다. 이것은 분비 신호 펩티드를 Aii 단백질에 융합시킴으로써 달성된다 (Sato, et al., 1995; Firek, et al., 1993; Conrad and Fiedler, 1998; Borisjuk, et al., 1999). 다른 한편으로, 식물 막 부착 모티프는 Aii 효소를 식물 세포막의 외부 표면에 고정시키기 위하여 Aii의 펩티드 서열 내로 통합될 수도 있다.

본 발명은 또한 세포 손상을 치료 또는 예방하기 위하여 직접적으로 세균성 자가유도 불활성화 단백질을 사용하는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 상기 단백질은 그와 같은 치료 또는 예방이 필요한 식물들에 직접적으로 적용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 단백질은 상기 단백질 유효량 및 적당한 캐리어를 포함하는 조성물의 형태로 적용될 수 있다. 상기 조성물은, 용액, 분말, 에멀젼, 분산액, 페이스트, 에어로졸 등을 포함하는 다양한 형태를 가질 수 있다.

세균성 자가유도 불활성화 단백질은 인간을 포함하는 동물들에서 세균성 감염을 치료하기 위해서도 사용될 수 있다. 이러한 용도에 있어서, 유효량의 활성 성분이 그와 같은 치료를 필요로 하는 동물에 투여된다.

치료적 처리를 위하여, 활성 성분은, 유효량의 활성 성분에 더하여 약제학적으로 허용가능한 캐리어, 희석제, 완충제, 보존제, 표면 활성제 등을 포함하는 약제학적 조성물로 제제화될 수 있다. 조성물은 또한 필요하거나 또는 바람직한 경우에는 하나 또는 그 이상의 다른 활성 성분들을 포함할 수도 있다.

본 발명의 약제학적 조성물들은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 여러가지 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 국부적, 구강, 흡입 또는 비경구적으로 수행될 수도 있다. 국부적 제제들은 연고, 로숀, 크림, 겔, 드로프스, 좌제, 스프레이, 액체 또는 분말을 포함할 수 있다. 구강 제제들은 예를 들 어, 분말, 과립, 물 또는 비수성 매체 중의 현탁액 또는 용액, 캡슐 또는 정제를 포함한다. 점증제 (thickners), 향료, 희석제, 에멀젼화제, 분산 보조제 또는 결합제가 필요에 따라 사용될 수도 있다. 비경구적 제제는 완충용액, 희석제 및 다른 적당한 첨가제를 포함할 수도 있는 멸균 수성 용액을 포함할 수 있다. 복용량은 치료될 상태의 심각성 및 반응성과 같은, 용이하게 결정될 수 있는 많은 인자들에 의존한다.

통상적으로, 미생물 생조절은 항생제 또는 항생 화합물의 제조에 의존하여 왔다 (Cronin et al., 1997; Liao and Sapers, 1999; Emmert and Handelsman, 1999). 본 발명은, 병독성에 필수적인 생신호들의 제거에 기초한, 생조절을 위한 대체 전략을 제공한다.

실시예 1: 자가유도인자들을 불활성화 시킬 수 있는 세균 균주들

자가유도인자 신호들의 불활성화를 담당하는 유전자들을 확인하기 위하여, 400 종 이상의 야생 및 식물 세균 분리주 및 실험실 세균 배양 채집물 중 약 100개의 균주를 스크리닝하였다.

자가유도 신호들을 불활성화시키는 능력을 테스트하기 위하여 사용된 세균 균주들은 앞서 서술한 바와 같이 토양 및 식물 현탁액으로부터 분리하거나 (Dong et al., 2000), 또는 Bacillus Genetic Stock Centre (BGSC) 및 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 얻었다. 에르위니아 카로토보라 SCG1을 무름병 증상을 보이는 배추잎으로부터 분리하였다. 해당 균주인지 여부는 16S DNA 서열 및 자가유도인자의 특이적 생산 및 감자와 배추에서의 무름병의 유도에 의해 확인되었다.

이러한 균주들을 필요에 따라 진탕 하에 28℃에서 루리아-베르타니 (Luria-Bertani, LB) 배지에서 배양하였다. 아그로박테리움 투메파시엔스 균주들을 28℃에서 YEB, BM 최소 배지 (유일한 탄소원으로서 만니톨이 첨가된 기초 최소 영양 배지) 또는 영양 아가 플레이트 (Difco Laboratories) 상에서 배양하였다. 최종 농도 0.2%의 만니톨이 최소 배지 중의 유일한 탄소원으로서 사용되었다. 대장균 균주를 37℃에서 LB 또는 LB 아가 플레이트 상에서 배양하였다. 필요에 따라 항생제를 하기 농도로 첨가하였다: 림팜핀 (rimfampin) 50 ㎍/ml, 스트렙토마이신 (streptomycin) 100 ㎍/ml, 앰피실린 (ampicilin) 100 ㎍/ml, 카나마이신 (kanamycin) 50 ㎍/ml, 및 테트라사이클린 (tetracycline) 10㎍/ml. β-갈락토시다아제 효소 활성의 검출을 위하여 50 ㎍/ml로 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-B-D-갈락토피라노시드) (Promega)를 배지에 포함시켰다.

30개 이상의 균주가 서로 다른 수준의 AI 불활성화 활성을 보였다. 미지 분리주들을 특성화하기 위하여, 이러한 분리주들의 16S rRNA 서열들을 PCR 증폭 및 연이은 시퀀싱에 의하여 분석하였다. 서열분석 결과는 AI를 불활성화시킬 수 있는 능력이 있는 균주들의 16S rRNA 서열들이 바실러스 투린지엔시스 (Bt)의 그것과 매우 유사함을 보여주었다.

다른 바실러스 균주들도 AI 불활성화 활성을 갖는지를 테스트하기 위하여, B. 투린지엔시스, B. 세레우스 (B. cereus), B. 마이코이데스 (B. mycoides), 및 B. 스파에리쿠스 (B. sphaericus)의 기지 균주들을 생분석 (bioassay)을 위하여 선택하였다. 세균 균주 및 분리주들의 AI 불활성화 활성의 측정을 위하여, 자가유도인자, N-β-옥소-헥사노일-L-호모세린 락톤 (OHHL), 또는 N-β-옥소-옥타노일-L-호모세린 락톤 (OOHL)을, OD₆₀₀ = 1.1로 희석된 오버-나이트 세균 배양물, 또는 최종 농도 20μM로 단백질 추출액에 가하고, 28℃에서 30분 동안 배양하였다. 부유물 중의 잔류 AI를 앞서 서술한 바와 같이 측정하였다 (Zhang, 1993; Dong et al., 2000).

표 1은 선택된 균주들 및 일부 새로이 확인된 분리주들의 AI 불활성화 활성들을 보여주는 것이다. 모든 테스트되어진 세균 균주들은, B. 스파에리쿠스 및 B. 푸시포르미스를 제외하고는, 서로 다른 수준의 효소 활성으로 AI를 제거하였다 (20μM OHHL의 농도에서). 이러한 균주들은, 16S rDNA 서열분석에 의하여 확인된, 13가지의 기지 바실러스 종들 (표 1에서 "B"로부터 출발한 균주들), 1가지의 기지 아그로박테리움 및 9가지의 바실러스 종들을 포함하였다. 그들 중에서, 12가지의 세균 균주들이 높은 수준의 AI 불활성화 활성을 보였고 (> 30 μM/h/OD₆₀₀); 8가지는 중간 수준의 활성을 보였으며 (25-30 μM/h/OD₆₀₀); A. 투메파시엔스 균주 M103은 낮은 수준의 활성을 보였다 (4.5 μM/h/OD₆₀₀). A. 투메파시엔스를 제외하고는, 이러한 모든 AI-불활성화 균주들은 그람-포지티브였고, B.투린지엔시스 또는 그에 밀접하게 연관된 종들에 속한다.

[표 1]

세균 균주들 및 그들의 AI-불활성화 활성

효소 활성

균주 구입처 (μM/h/OD₆₀₀)

28-32 바실러스 투린지엔시스 본 실험 32.4 ±1.1

258-3 바실러스 투린지엔시스 본 실험 32.5 ±1.2

69 바실러스 투린지엔시스 본 실험 30.9 ±2.3

60-1 바실러스 투린지엔시스 본 실험 28.2 ±5.1

250 바실러스 투린지엔시스 본 실험 23.4 ±3.9

262 바실러스 투린지엔시스 본 실험 23.1 ±1.5

B18 바실러스 투린지엔시스 본 실험 27.4 ±3.0

B20 바실러스 투린지엔시스 본 실험 32.7 ±2.4

B21 바실러스 투린지엔시스 본 실험 33.1 ±0.8

B22 B. 투린지엔시스

ssp. kurstaki^* 본 실험 32.8 ±1.3

B23 B. 투린지엔시스

ssp. Israelensis^* BGSC (4Q7) 26.7 ±3.5

B1 B. 투린지엔시스

ssp. thuringiensis BGSC (4A3) 32.5 ±0.3

B2 B. 투린지엔시스

ssp. kurstaki BGSC (4D1) 33.0 ±0.6

B12 B. 투린지엔시스

ssp. Aizawai BGSC (4J4) 33.5 ±0.9

B17 B. 투린지엔시스

ssp. Wuhanensis Mycogen (PSS2A1) 28.8 ±4.1

B25 바실러스 세레우스 본 실험 33.7 ±0.8

B14579 바실러스 세레우스 ATCC (14579) 31.7 ±0.6

B6462 바실러스 마이코이데스 ATCC (6462) 29.8 ±2.2

240B 바실러스 sp. 본 실험 33.0 ±1.0

Cot 바실러스 투린지엔시스 본 실험 25.1 ±2.4

M103 아그로박테리움 투메파시엔스 본 실험 4.5

269 바실러스 푸시포르미스 본 실험 0

B29 바실러스 스파에리쿠스 BGSC (12A4) 0

* 플라스미드 마이너스

** 동일한 부피의 세균 현탁액 (오버 나이트 배양액으로부터 OD₆₀₀ = 1.1로 희석됨) 및 OHHL (40 μM)을 28℃에서 30분 동안 배양한 다음, 상등액 중의 잔류 OHHL을 앞서 서술한 바와 같이 측정하였다 (Zhang, 1993). 효소 활성은 세균 배양물의 OD₆₀₀ 당 시간 당 OOHL의 분해된 μM로서 나타내었다. 수치들은 4회 반복 실험 값의 평균 ±표준편차로 나타내었다. "B"로 시작하는 균주들은 공지의 바실러스 종들이다. 다른 바실러스 균주들은 16S rDNA 서열 분석에 의하여 확인되었다.

상기 증거는 AI 불활성화 유전자가 플라스미드가 아니라 염색체 DNA에 존재한다는 것을 암시하는데, 이는 Bt ssp. kurstaki 균주 B2 및 그 플라스미드 마이너스 유도체 균주 B22 모두가 비슷한 수준의 효소 활성을 나타냈기 때문이다. B. 투린지엔시스 ssp. Israelensids에 속하는 두 번째 플라스미드 마이너스 균주 B23 또한 AI의 효소적 불활성화 능력이 있다.

AI 불활성화를 담당하는 유전자들의 유전적 다양성을 조사하기 위하여, 고, 중 또는 저 수준의 AI 불활성화 활성을 보이는 대표적 세균 균주들을, 이후의 클로닝 실험들을 위하여 선택하였다.

실시예 2: 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 M103으로부터 aiiB 유전자의 기능적 클로닝

세균 현탁액이 카나마이신 (100 ㎍/ml)을 포함하는 BM 최소 플레이트 상에 도포된 점을 제외하고는, Garfinkle 및 Nester에 의하여 서술된 프로토콜 (1980)에 따라서, 아그로박테리움 투메파시엔스 옥토파인 (octopine) 균주 A6의 게놈 내로 트랜스포존 (transposon) Tn5 삽입을 도입하기 위하여 대장균 SM10 내의 자살 플라스미드 pSUP10 (Simon et al, 1983)을 사용하였다. 아그로박테리움 투메파시엔스 돌연변이 균주 M103의 총 DNA를 EcoRⅠ으로 부분적으로 절단하고, 20-30 kb 단편들을 저융점 아가로오즈 겔로부터 회수하고 정제하였다. 정제된 단편들을, 코스미드 벡터 pLAFR3의 탈인산화된 EcoRⅠ 부위에 결찰시켰다 (Staskawicz et al., 1987). 결찰 (ligation) 혼합물을 GigapackTMⅢ XL Packaging Extract (Stratagene)로 패키징하여, E. coli DH5α에 트랜스펙션시켰다. 테트라사이클린을 포함하는 선택 배지에서 배양된 약 2000개의 개별 콜로니들을 아그로박테리움 투메파시엔스 돌연변이 균주 M103의 게놈 라이브러리로서 유지하였다. Tn5를 포함하는 코스미드 클론들을 카나마이신을 포함하는 배지에서 선택하고, 전술한 생분석 방법을 사용함으로써 AI 불활성화 활성에 대하여 더 분석하였다. 통상적인 기술들 (Sambrook et al., 1989)에 의하여 시퀀싱 벡터 pGEM-7Zf(+)로의 서브클로닝을 수행하였다. ABI Prism dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems)를 사용하여 양쪽 가닥 모두에 대하여 시퀀싱을 수행하였다.

아그로박테리움 투메파시엔스 균주 A6는 Ti 플라스미드 접합 전달의 조절에 관여하는 N-아실 호모세린 락톤 자가유도인자들 (AI)을 생산한다 (Zhang and Kerr, 1991). 그러나, Tn5 삽입 돌연변이에 의하여 야기된 그 유도체 M103은 AI를 불활성화시키는 능력이 있다 (표 1 및 도 1). 균주 A6에서 AI의 분해를 코딩하는 유전자는 네가티브 조절인자에 의해 조절되며, Tn5 삽입은 AI 불활성화에 대한 유전자의 구조적 발현 (constitutive expression)을 야기하는 것으로 보인다.

AI 불활성화 유전자가 Tn5 삽입 부위의 하류쪽에 위치할 수 있다는 가정에 기초하여, Tn5 트랜스포존을 포함하는 코스미드 클론들이 카나마이신 내성 표현형에 의하여 선택되었다. 카나마이신에 대하여 내성이고 AI 불활성화 활성을 나타내는 2개의 코스미드 클론들을 M103의 코스미드 라이브러리로부터 얻었다. 제한효소 분석 및 생분석 결과는 5.2kb EcoRⅠ 단편이 AI 불활성화 활성을 부여한다는 것을 나타내었다. 계속된 서브클로닝은 이러한 영역을 1.5kb PstⅠ 단편으로 좁혔다 (도 2). 서열 분석 결과는 상기 단편 내에서, ATG 또는 UTG로 시작하는, 몇몇 추정되는 개방해독틀 (Open Reading Frames, ORFs)을 보여 주었다. ORF들 중의 하나는 이전에 확인된 아그로박테리움 투메파시엔스의 attM 유전자 (U59485)에 대하여 핵산 서열에서 96.8% 및 아미노산 서열에서 98%의 동일성을 나타내었다. 그러나, 발현 벡터 pKK223-3을 통하여 대장균 내에서 attM을 발현시키는 경우에 AI 불활성화 활성은 검출되지 않았다. 1.5 kb 단편의 검출 분석 결과는 AI 불활성화를 코딩하는 792bp ORF를 나타내었으며, 그 개시코돈은 통상의 ATG가 아닌 GTG임을 보여 주었다 (도 3). 상기 유전자는 aiiB로 명명되었다 (도 4). 그 생물학적 기능이 실험적으로 확인되지 않은 AttM과 비교하여, AiiB는 N 말단에 7개의 여분의 아미노산들을 가진다 (도 5). AiiB는 이전의 보고된 AiiB와 비교하여, 아미노산 수준에서 35.4%의 동일성을 나타내었다 (도 6).

실시예 3: 바실러스 투린지엔시스 균주 Cot1으로부터 aiiC 유전자의 기능적 클로닝

균주 Cot1의 현탁 배양물은 2시간 배양 이후에 AI (20μM)를 완전히 제거하였지만, 5분 동안 끓임으로써 사멸된 세균 세포들은 AI를 불활성화시키지 못했는데 (도 7A), 이는 효소에 의한 불활성화 메카니즘을 의미한다. Cot1으로부터 AI 불활성화를 코딩하는 유전자를 확인하기 위하여, 세균 분리주 Cot1의 게놈 DNA의 EcoRⅠ 부분 분해에 의하여 코스미드 라이브러리가 제조되었다. 게놈 DNA가 세균 분리주 Cot1으로부터 추출되었고, EcoRⅠ으로 부분 분해되었다. DNA 단편들을 코스미 드 벡터 pLAFR3의 탈인산화된 EcoRⅠ 부위에 결찰시켰다. 결찰된 DNA를 패키징하여 대장균 DH5α에 트랜스펙션시켰다. AI 불활성화 활성을 갖는 코스미드 클론들을 전술한 생분석 방법을 사용함으로써 확인하였다. 통상의 기술들에 의하여 시퀀싱 벡터 pGEM-7Zf(+) 또는 pBlueScript SK로의 서브클로닝을 수행하였다.

스크리닝된 1000개의 코스미드 클론들로부터 AI 불활성화 기능을 보이는 하나의 클론을 확인하였다. 제한효소 분석은 이러한 클론이 24 kb의 인써어트 (insert)를 포함하는 것을 보여 주었다. EcoRⅠ 완전 분해에 의하여 생성된 모두 5개의 단편들이 pGEM7 벡터로 서브클로닝되었다. 이러한 서브클론들의 생분석은 하나의 클론, 즉 5 kb의 인써어트를 갖는 pGEM7-aiiC가 AI 불활성화 활성을 갖는 것을 나타냈다. 계속된 서브클로닝은 AI 불활성화 기능을 담당하는 클론 pBS-AiiC에 포함된 1.4kb BamHⅠ 단편을 확인시켜 주었다 (도 7B). 클론 pBS-AiiC의 완전한 서열은 250 아미노산들을 코딩하는 750 bp 뉴클레오티드 (166 내지 918)의 ORF가 있다는 것을 보여 주었다 (도 8). 대장균 발현 벡터 중의 이러한 ORF의 클로닝은, 그것이 AiiC로 명명되는 기능적인 AI 불활성화 효소를 코딩한다는 것을 증명해 주었다. 펩티드 서열 수준에서, AiiC 유전자는, 각각 AiiA 및 AiiB에 대하여 91% 및 33%의 동일성을 나타내었다. aiiC 유전자는 FASTA 및 BLAST 분석에 의한 데이터베이스 중의 다른 공지의 서열들과 뉴클레오티드 또는 펩티드 수준에서 유의성 있는 유사성을 보이지 않았다.

실시예 4: 동일한 유전자 훼밀리에 속하는 Bt 중의 자가유도인자 불활성화 유전자들

테스트된 AI 불활성화 활성을 갖는 세균 분리주들 중에서, 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 M103을 제외하고는 모든 것들이 그람 포지티브였으며, 바실러스 투린지엔시스 (Bt) 또는 밀접하게 관련된 세균 종들에 속한다. 2종의 바실러스 균주들로부터의 aiiA 및 aiiC 유전자들은 높은 수준의 유사성을 보였다. aiiA 및 aiiC 유전자들은 바실러스 투린지엔시스 균주들 중에서 고도로 보존되어 있는 것으로 보인다. aiiC 단편을 프로브로서 사용하여 DNA 혼성화 (hybridisation) 분석 (Southern blot)을 수행하였다. 게놈 DNA를 18 종의 선택된 세균 균주들, 즉 Bl (Bt ssp. thuringiensis), B2, B3 및 B4 (Bt ssp. kurstaki), B22 (Bt ssp. kurstaki 플라스미드 마이너스), B12 (Bt ssp. Aizawai), B16 및 B17 (Bt ssp. Wuhanensis), B23 (Bt ssp. Israelensis), 및 B25 및 B26 (B. cereus) 뿐만 아니라 다른 Bt 균주들 B18, B20, B21, 240B1, 471W 및 Cot1, 및 B29 (B. sphaericus)로부터 분리되었다. EcoRⅠ으로 분해된 게놈 DNA (20 ㎍)를 0.8% 아가로오즈 겔에서 전기영동에 의하여 분리하고, DNA를 Hybond-N+ 막 (Amersham Pharmacia, Biotech.) 상에 제조회사의 사용 설명서에 따라서 전달하였다. aiiC 코돈 부위를 포함하는 1.4 kb BamHI 단편을 혼성화에 프로브로 사용하기 위하여 DIG로 표지하였다.

65℃에서 혼성화한 이후에, 막을 2 ×SSC, 0.1% SDS로 실온에서 5분 동안 세척하고, O.1 ×SSC, O.1 ×SDS로 65℃에서 15분 동안 2번 세척하였다. 세척 이후에, 막을 항-DIG-AP 접합체로 검출하고, NBT/BCIP 용액을 제조회사의 사용 프로토콜 (Boehringer Mannheim)에 따라서 색상 기질로 사용하였다.

결과는, B29 (B. sphaericus)를 제외하고는, 모든 테스트된 균주들로부터 하나의 혼성화 밴드가 명확하게 검출되는 것을 보여 주었다.

이러한 결과들은 aiiC에 유사한 서열을 갖는 단일 유전자가 테스트된 모든 바실러스 투린지엔시스 균주 및 그 밀접하게 관련된 종인 바실러스 세레우스에 존재한다는 것을 보여 주었다. 이는 생분석 데이터와 일치하는 것이다 (표 1).

실시예 5: 더 많은 세균 분리주들로부터의 다른 AI 불활성화 유전자들의 클로닝

AI 불활성화에 대한 유전자들은 고도로 보존되어 있기 때문에, 선택된 바실러스 투린지엔시스 분리주들로부터 다른 AI 불활성화 유전자들을 클로닝하기 위하여 PCR 방법을 사용하였다. 세균 분리주 B1, B2, B17, B18, B20, B21, B22 및 B25로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로서 사용하였다. 프라이머들은 aiiA 및 aiiC 유전자의 5' 및 3' 말단의 보존된 서열들에 기초하여 고안되었다. 선택된 세균 분리주들로부터 AI-불활성화 유전자들을 증폭하기 위하여 표준 PCR 조건들을 사용하였다. 프라이머 서열들은: C5f: 5'- ATG GGA TCC ATG ACA GTA AAG AAG CTT TAT -3'; C3r: 5'- GTC GAA TTC CTC AAC AAG ATA CTC CTA ATG -3'이었다. PCR 반응은 Perkin Elmer GenAmp PCR 시스템 2400을 사용하여 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분 동안, 35 싸이클 수행되었다. 증폭된 서열들에 에러가 없도록 하기 위하여 2 가지 별개의 PCR 반응이 수행되었다. PCR 산물들을 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)를 사용하여 정제하고, 정제된 PCR 단편을 pGEM-T 벡터 (Promega)에 결찰시켰다. 불활성화 자가유도인자 활성을 갖는 클론들을 이후의 연구들을 위하여 선택하였다. 각각의 균주로부터 2 가지의 그와 같은 클론들을 서열 분석하였다. 핵산 서열 데이터 및 추론된 아미노산 서열들을 DNASTARTM 서열 분석 소프트웨어 패키지 (DNASTAR Inc.) 및 GCG 서열 분석 소프트웨어 (Genetics Computer Group, Wisconsin)로 분석하였다. 데이터베이스 조사는 BLASTA 조사 알고리즘을 사용하여 수행되었다.

도 9a 내지 9c는 각각 Bt 균주 B1, B2, B17, B18, B20, B21, B22 및 B25로부터 클로닝된 8 가지 AI 불활성화 유전자들 (aiiD 내지 aiiK로 명명)의 뉴클레오티드 및 추론된 펩티드 서열들을 보여 준다. 각각의 서열들은 모두 750bp의 ORF를 포함하며, 이는 250개 아미노산들로 이루어진 단백질을 코딩한다.

실시예 6: 자가유도인자 불활성화 유전자들은 Bt 멤버들 및 밀접하게 관련된 바실러스 spp. 사이에서 고도로 보존되어 있다.

aiiB 유전자를 제외하고, 모든 다른 유전자들은 그람 포지티브 세균 분리주들로부터 클로닝되었다. 서열 분석은 그람 포지티브 세균성 분리주들로부터 클로닝된 aii 유전자들이 고도로 보존되어 있으며, AiiA와 비교하여 90.4% 내지 94.0%의 아미노산 동일성을 갖는다는 것을 보여 준다 (도 10). 그람 네가티브 아그로박테리움 투메파시엔스로부터 클로닝된 aiiB 유전자는 다른 aii 유전자들에 대하여 더 적은 유사성을 나타내었으며, 식물발생도 (phytogenetic tree)에서 단일의 군으로서 모여 있었다 (도 10). 이러한 결과들은 자가유도인자 불활성화 유전자들이 Bt 멤버들 및 밀접하게 관련된 바실러스 사이에서 고도로 보존되어 있다는 것을 나타낸다.

이러한 Aii 단백질 서열들에서, AiiB를 제외한 모든 서열들이 ¹⁰⁴HXHXDH¹⁰⁹~59aa~H¹⁶⁹~21aa~D¹⁹¹의 패턴을 나타내는 아스파르테이트 잔기들을 갖는 몇몇 불변 히스티딘들을 포함하며; 아그로박테리움 투메파시엔스의 AiiB는 유사하지만, 구별되는 모티프인 ¹⁰³HXHXDH^1O8~71aa~H¹⁸⁰~21aa~D²⁰²를 포함한다. 이러한 패턴은 메탈로히드로라아제 범주와 잘 부합되는 것이다 (Vallee and Galdes, 1984). 아라비돕시스 글리옥사라아제 (Arabidopsis glyoxalase) Ⅱ 중의 모티프 HXHXDH는 아연 이온에 결합하는 데에 관여하는 것으로 제안되었다 (Crowder et al., 1997). 사이트-디렉티드 돌연변이화 (site-directed mutagenesis)는 이 모티프 중의 첫 번째 히스티딘 (AiiA 중의 ¹⁰⁴H)을 제외하고 모든 이러한 잔기들이 AiiA 활성에 필요하다는 것을 보여 주었다. 이러한 불변 히스티딘 및 아스파르테이트 잔기들은 또한 AiiB 내지 AiiK 중에도 존재하며, 이는 그들이 동일한 군의 자가유도인자 메탈로히드로라아제들에 속한다는 것을 나타낸다.

실시예 7: 에르위니아 카로토보라에 의한 AI 생산에 미치는 Bt 균주의 영향

병원성 세균에 의한 AI 생산을 제거시키는 데에 미치는 Bt 균주들의 영향을 테스트하기 위하여, 에르위니아 카로토보라 SCG1을, 각각 Bt 균주 Cot1, B1, 대장균 DH5α 및 B. 푸시포르미스와 함께 배양하였다. AI를 실시예 1에서와 같이 분석하였다. SCG1 균주에 의하여 생산된 AI를 2 시간 배양한 후에 검출하였으며, 2 내지 6 시간 배양시에 급속한 증가가 관찰되었으나 (세포 수에 대하여, 도 14 참조), 반면에 AI 불활성화 효소들을 생산하는 Cot1 또는 B1 균주와 함께 배양된 SCG1의 배양물 상등액에서는 어떠한 AI도 검출되지 않았다. aii 유전자들을 포함하지 않 는 대장균 DH5α 또는 B. 푸시포르미스와 SCG1의 공동배양 상등액에서는, AI 생산 수준이 SCG1 배양물 단독에 대해 관찰한 것과 유사하게 검출되었다 (도 11). 이러한 결과들은, Bt 균주들이 에르위니아 카로토보라 SCG1과 함께 배양되는 경우에는 병원성 에르위니아 카로토보라 SCG1에 의하여 생산되는 AI 신호들을 효과적으로 제거시키는 것을 나타낸다.

실시예 8: 에르위니아 카로토보라의 병원성에 미치는 Bt 균주들의 영향

AI가 몇몇 병원성 세균 종들의 병독성 결정인자들의 조절에 중요한 역할을 담당한다는 것은 공지의 사실이다. Bt 균주들은 병원체에 의하여 의하여 생산된 AI 신호들을 효과적으로 제거시키기 때문에, 이러한 Bt 균주들의 새로운 기능은 질병 조절에 이용될 수 있을 것으로 보인다. 이러한 가능성을 시험하기 위하여, 무름병에 대한 생조절용 Bt 균주들의 효과를 조사하였다. 인근 상점에서 감자 (Solanum tuberosum L. cv. Bintje) 괴경을 구입하였다. 수도물로 세척하고 종이 타월 상에서 건조한 후에, 감자 괴경을 70% 에탄올로 표면-멸균하고, 3mm 두께로 균일하게 절편화하였다. 함침 처리를 위하여, 감자 절편들을 ml 당 5 ×10⁸ 콜로니 형성 단위 (CFU)의 농도로 희석된 Cot1 또는 다른 세균 균주들의 세균 현탁액에 약 20초 동안 함침시켰다. 멸균수를 대조군으로 사용하였다. 각각의 절편 상에 약 2 ×10⁸ 또는 2 ×10⁷ CFU/ml를 포함하는 에르위니아 카로토보라 SCG1 세균성 현탁액 2.5 ㎕를 접종하기 전에, 표면 수분을 제거하기 위하여 절편들을 라미나 플로우 캐비넷 (laminar flow cabinet) 내에서 약 20분 동안 건조시켰다. 혼합 처리를 위하 여, 각각의 테스트 유기체 (5 ×10⁸ CFU/ml) 또는 멸균수 동일 부피를 에르위니아 카로토보라 SCG1 세균 현탁액 (2 ×10⁸ 또는 2 ×10⁷ CFU/ml)과 혼합하였다. 혼합물 (2.5 ㎕)을 감자 절편들의 절단 표면에 접종하였다. 모든 감자 절편들은 28℃에서 페트리 접시에서 배양되었다. 배양 도중에 침연 (maceration) 면적을 측정하였다. 각 처리는 4 내지 12회 반복되었으며 (Cot1에 대하여 12회), 각 반복시마다 절편 상의 3곳에 접종하였다. 콜로니화 (colonisation) 실험을 위하여, 각각의 처리를 4회 반복하였고, 각각의 괴경 절편들에 대해 절편 중앙에 단 1회 접종하였다. 감자 괴경 절편들은 에르위니아 카로토보라 SCG1이 접종되기 전에 먼저 Bt 균주 Cot1 또는 다른 대조군들로 처리되거나, 또는 SCG1 세균이 감자 절편 상에 접종되기 전에 Cot1 또는 다른 대조군들과 혼합된다.

에르위니아 카로토보라 SCG1은 접종 20시간 이후에 감자 절편들의 심각한 조직 침연을 야기하였으나, 반면에 Bt 균주 Cot1으로 미리 처리된 감자 절편들에서는 침연 증상이 현저히 감소되었다 (도 12). SCG1을 Bt 균주와 공동접종하는 것, 특히 저농도로 접종하는 것 또한 무름병을 완화하였다. 반면에, 대조군 처리, 즉 감자 절편들을 SCG1의 접종 전에 대장균 또는 B. 푸시포르미스로 사전처리하거나 또는 대장균 및 B. 푸시포르미스로 각각 공동접종하는 경우에는 심각한 조직 해리 증후군이 관찰되었다 (도 12). 이러한 결과들은 Bt 균주들이 식물의 무름병에 대한 생조절 성분으로서 사용될 수 있다는 것을 암시한다.

실시예 9: Bt 균주와 에르위니아 카로토보라 SCG1 사이의 인 비트로 경합

에르위니아 카로토보라 SCG1에 대한 항생제의 생산에 대해 Bt 균주 Cot1 및 B1을 테스트하였다. Bt 균주와 에르위니아 카로토보라를 1:1의 비율로 공동접종함으로써 경합 실험들을 수행하였다. 각각의 균주들을, 에르위니아 카로토보라의 경우 약 1 ×10⁷ CFU/ml의 수준으로, 다른 균주들의 경우 1 ×10⁶ CFU/ml의 수준으로 접종하였다. 혼합물을 30℃에서 배양하였다. 서로 다른 시간 지점에서 AI 생산의 생분석을 위하여 세균 샘플들을 취하였고 (실시예 1에서와 같이 생분석을 수행), 콜로니 카운팅을 위해서 플레이트 상에 도포하기 위하여 적당한 농도들로 희석하였다. 실험은 4회 반복하였다. 콜로니화 (colonisation) 실험을 위하여 에르위니아 카로토보라로 접종된 감자 절편들을 정해진 시간대에서 취하고, 접종 부위 주변의 약 15 ×15mm 크기의 식물 조직들을 도려 내었다. 도려낸 조직들을 작은 조각으로 잘라서 0.1M NaCl 10ml에 담구었다. 30분 동안 진탕한 후, 상등액을 적당한 농도로 희석하였다. 생육할 수 있는 세균 세포들의 숫자를 세었다. 영양 (rich) 및 최소 (minimum) 배지 양쪽 모두의 플레이트 상에서, Bt 균주들은 SCG1의 성장에 대하여 어떠한 저해 효과도 보이지 않았다. 균주 SCG1 및 Bt 균주 Cot1 또는 B1이 공동접종되는 경우에는, Bt 균주들 및 SCG1 모두가 정상적으로 성장하였으며, 24시간에 걸쳐서 동일한 성장 트렌드를 나타내었다 (도 13).

실시예 10: 에르위니아 카로토보라에 의한 괴경 절편의 콜로니화에 미치는 Bt 균주의 영향

접종 이후에 감자 절편 상에서의 에르위니아 카로토보라 SCG1의 콜로니화를 조사하기 위하여, GFP 유전자를 포함하는 발현 벡터를 균주 SCG1 내로 형질전환시켰다. 발현 벡터는 균주 SCG1 내에서 선택 압력 없이 안정하게 유지될 수 있다. SCG1 (GFP)과 야생형 SCG1의 병독성 사이에는 차이점이 없었다. SCG1이 식물 상에서 생존 및 성장하는 데에 미치는 Bt 세균의 영향을 조사하기 위하여, 감자 괴경 절편들을 Cot1의 세균 현탁액에 침지시킨 다음 SCG1 (GFP)로 접종하거나, 또는 SCG1 (GFP) 및 Cot1으로 동시에 접종하였다. 세균 세포 숫자에 있어서의 변화 및 감자 조직의 무름병 증상의 진전을 4일 동안 매일 모니터하였다. 그 결과들은 Cot1-처리된 절편들 상의 SCG1 (GFP)과 물-처리된 절편들 상의 SCG1 (GFP)의 4일 배양하는 동안의 세포 숫자들 사이에는 커다란 차이점이 없다는 것을 보여 주었다 (도 14). 이러한 결과는 Bt 균주 Cot1이 감자 괴경 절편들 상의 SCG1 (GFP)의 성장에 심각하게 영향을 미치는 것은 아니며, 이는 Bt 균주 Cot1에 의한 에르위니아 SCG1 (GFP)의 병독성 완화는 SCG1 (GFP) 세포 성장의 저해로 인한 것이 아님을 암시한다.

참고문헌

도 1은 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 M103의 단백질 추출물에 의한, 시간 경과에 따른 AI (OOHL) 불활성화를 나타낸다. M103의 총 단백질은 1/15 M 인산염 완충용액 (pH 8.0) 중에서 세균 세포들을 음파 파괴함으로써 추출되었다. 동일한 부피의 M103 단백질 추출물 (1.46 mg/ml) 및 5000 nM OOHL을 혼합하고, 1.5ml 에펜도르프 (Eppendorf) 원심분리 튜브에서 28℃에서 배양하였다. 동일한 단백질 추출물을 5분 동안 끓임으로써 변성시키고, 대조군으로 사용하였다. 시료들을 반응 후 1, 3, 6시간이 경과한 때에 취하고, 3분 동안 끓임으로써 반응을 종료시켰다. 시료들에 대하여 AI 활성을 분석하였다.

도 2는 돌연변이 M103의 코스미드 (cosmid) 클론으로부터 AI 불활성화 영역을 클로닝하는 것을 보여준다. 코스미드 벡터 pLAFR3에는 2개의 코스미드 클론들이 포함되지만, 플라스미드 벡터 pBluescript Ⅱ SK (+)에는 4개의 서브-클론 (sub-clones)들이 포함된다. 기호: +, AI 불활성화에 있어서 포지티브; -, AI 불활성화에 있어서 네가티브; E: EcoRⅠ; P: PstⅠ.

도 3은 (A) 서열 분석 프로그램으로 예상한, 1.5kb AI 불활성화 영역 내의 가능한 ORF들; 및 (B) AI 불활성화 효소 (AiiB)를 코딩하는 ORF를 정의하기 위한 결실 분석 (deletion analysis)을 나타낸다. PCR 증폭된 단편들을 pBluescript Ⅱ SK (+) 벡터 (pBM 클론) 또는 pKK223-3 (pKM 클론) 벡터로 클로닝하였다. 각 클론 밑의 숫자들은 1.5 kb 영역의 뉴클레오티드 서열들에 대응하는 PCR 단편들의 개시 또는 정지 위치들을 나타낸다. 모든 구조체들은 서열 분석에 의하여 확인되었다. aiiB ORF의 개시 코돈 (GTG)과 정지 코돈 (TAA)을 클론 pKM103-315 밑에 나타내었다. 실선으로 된 화살표는 이러한 클론들에서 lac 및 tac 프로모터의 위치 및 방향을 나타내고, ORF는 속이 빈 화살표로 표시되었다. 기호: +, AI 불활성화 활성에 있어서 포지티브; -, AI 불활성화 활성에 있어서 네가티브.

도 4는 아그로박테리움 투메파시엔스 M103으로부터 클로닝된 aiiB 유전자의 (A) 뉴클레오티드 서열 (서열번호 1) 및 (B) 예상되는 펩티드 서열 (서열번호 11)을 나타낸다. 추정 리보솜 결합 (SD) 부위 및 두 개의 PstⅠ 제한 효소 부위들을 밑줄로 나타내었으며, 추정 전사 종결 코돈을 표시하였다.

도 5는 AiiB (서열번호 11)와, 아그로박테리움 투메파시엔스의 att 구역 내 attM 유전자에 의하여 코딩될 것으로 추정되지만 그 생물학적 기능은 실험적으로 설명되지 않은 (GenBank accession No. U59845), AttM (서열번호 21)의 단백질 서열을 비교한 것이다. 이러한 두 단백질들은 높은 정도의 유사성을 나타내지만 (중심 서열은 일치되는 서열을 나타내며, 4개의 단편들이 서열번호 11의 8-43, 45-158, 160-186 및 188-263 아미노산들과 동일하였다), 기능성 AiiB 단백질은 N-말단에 부가적인 7개의 아미노산들을 가지고 있다.

도 6은 AiiB (서열번호 11)와, 바실러스 sp. 240B1으로부터 클로닝된 AI를 불활성화시키는 추정 메탈로히드로라아제인, AiiA (서열번호 22)의 단백질 서열 비교를 나타낸다. 두 개의 보존성 아연 결합 부위를 밑줄로 나타내었다.

도 7은 aiiC 유전자의 기능적 클로닝을 나타낸다. (A) 세균 균주 Cot1의 현 탁 배양에 의한 AI의 효소적 불활성화. 세포 현탁 배양액 (OD₆₀₀ = 1.1) 및 40 μM OOHL을 동일한 부피로 혼합하고, 28℃에서 배양하였다 ( ▲). 동일한 농도의 끓인 배양물 및 OOHL을 대조군으로 사용하였다 ( ■). AI 활성 분석을 위하여 시료들을 표시되어 있는 시간대 별로 수집하였다. (B) 바실러스 투린지엔시스 Cot1의 pLAFR3-aiiC 코스미드 클론으로부터 AI-불활성화 영역의 직접적 서브클로닝 (subcloning). 코스미드 클론을 EcoRⅠ으로 절단하고, pGEM-7Z 벡터로 서브클로닝 하였다. 효소 활성 분석에 의하여 AI 불활성화 포지티브 클론 pGEM7-aiiC를 확인하였다. pGEM7-aiiC를 BamHⅠ절단 이후에 pBluescript Ⅱ SK (+) 벡터에서 추가적으로 서브클로닝하였다. pBS-aiiC 클론 내에 포함된 약 1.4kb 크기의 AI 불활성화 영역을 완전히 서열분석하였다. 제한 효소: E: EcoRⅠ; B: BamHⅠ.

도 8은 바실러스 투린지엔시스 Cot1으로부터 클로닝된 aiiC 유전자의 (A) 뉴클레오티드 서열 (서열번호 2) 및 (B) 예상되는 펩티드 서열 (서열번호 12)을 나타낸다. aiiC ORF의 뉴클레오티드 서열은 대문자들로 나타나 있고, 비번역된 영역들은 소문자들로 나타나 있다.

도 9a 내지 9c는, 각각 바실러스 투린지엔시스 균주 B1, B2, B17, B18, B20, B21, B22 및 B25로부터의 aiiD (서열번호 3 및 13), aiiE (서열번호 4 및 14), aiiF (서열번호 5 및 15), aiiG (서열번호 6 및 16), aiiH (서열번호 7 및 17), aiiI (서열번호 8 및 18), aiiJ (서열번호 9 및 19) 및 aiiK (서열번호 10 및 20) 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 예상되는 단백질 서열을 나타낸다.

도 10은 11개의 클로닝된 AI 불활성화 유전자들의 계통발생적 트리 분석 (phylogenetic tree analysis) 및 아미노산 동일성을 나타낸다. 계통발생적 트리는 DNASTAR 서열 분석 소프트웨어에 의하여 만들어졌다 (DNASTAR Inc.). 거리는 트리 밑에 표시되어 있다. 각 시료의 AiiA에 대한 아미노산 동일성을 그래프의 오른쪽에 나타나 있다.

도 11은 에르위니아 카로토보라에 의한 AI 생산에 대한 바실러스 투린지엔시스 균주의 영향을 나타낸다. 에르위니아 카로토보라 SCG1을 15ml LB 배지에 단독 접종하거나 ( ◆ ), 또는 바실러스 투린지엔시스 균주 Cot1 ( △ ) 및 B1 (

), E. coli DH5α( ▲) 및 바실러스 푸시포르미스 (fusiformis) ( ■)를 1:1의 비율로 동일 배지에 공동 접종하였다. 접종 농도 (T₀)는 SCG1에 대하여 1 ×10⁷ CFU/ml (밀리리터 당 콜로니 형성 단위)이고, 다른 균주들에 대하여 1 ×10⁶ CFU/ml이었다. 30℃에서 1, 2, 3, 4, 6 및 24시간 동안 배양한 후에, 세균 현탁액을 취하고, 생산된 AI를 생분석하기 위하여 상등액들을 이용하였다. 데이터는 4회 반복의 평균값이었다.

도 12는 에르위니아 카로토보라 SCG1에 의하여 야기되는 감자 무름병의 조절에 대한 바실러스 투린지엔시스 균주 Cot1의 영향을 나타낸 것이다. Dip: 감자 절편들을, 약 5 ×10⁸ CFU/ml 수준의 바실러스 투린지엔시스 균주 Cot1 (C), E. coli DH5α(D) 또는 바실러스 푸시포르미스 (Bf)의 현탁액 또는 물 (W)에 약 20초 동안 침지시키고, 멸균 공기 흐름 하에서 약 20분 동안 건조시켰다. 표면에 수분을 보이지 않는 절편들을, 5 ×10⁵ 또는 5 ×10⁴ CFU에 상당하는 SCG1 세포들을 포함하는 세균 현탁액 2.5㎕로 접종하였다. 혼합물: SCG1의 세포 배양물 (2 ×10⁸ 또는 2 ×10⁷ CFU/ml)을 각각 동일 부피의 Cot1 (C), E. coli DH5α(D), 바실러스 푸시포르미스 (Bf) (5 ×10⁸ CFU/ml) 또는 물 (W)과 혼합하였다. 혼합물 2.5㎕를 절편들의 상단에 접종하였다. 접종된 SCG1의 최종 세포수는, 그래프 아래의 두 번째 라인에 표시된 바와 같이, 2.5 ×10⁵ 또는 2.5 ×10⁴ CFU이었다. 28℃에서 20시간 동안 배양한 후에, 침연 영역 (maceration area)을 측정하였다. 데이터는 4 또는 12회 (Cot1에 대하여 12회) 반복 실험의 평균값이었다.

도 13은 에르위니아 카로토보라 SCG1의 성장에 대한 바실러스 투린지엔시스 균주 Cot1 및 B1의 영향을 나타낸 것이다. 에르위니아 카로토보라 SCG1 ( ■)을 단독으로 접종하거나 또는 바실러스 투린지엔시스 균주 Cot1 ( ◆ ) 및 B1 ( ▲)을 1:1 비율로, 15ml LB 배지에 각각 공동 접종하였다. 각 균주를, SCG1의 경우 최종 농도 약 1 ×10⁷ CFU/ml로, 다른 균주들의 경우 1 ×10⁶ CFU/ml로 T₀ 배지에 접종하였다. 30℃에서 2, 4, 6 및 24시간 배양한 후에, 세균 현탁액을 취하고 플레이트에 스프레딩 (spreading)하기 위해 적당히 희석하여 콜로니 카운팅 (colony counting)을 하였다. 실험은 4회 반복되었으며, 평균 데이터를 산출하였다. Top: SCG1, Cot1 및 B1을 배양하고 개별적으로 성장시켰다; Middle: SCG1을 Cot1과 함께 공동 접종하였다; Bottom: SCG1을 B1과 함께 공동 배양하였다.

도 14는 세균 세포 수의 변화 (A) 및 접종된 감자 절편 상의 무름병의 진전 (B)을 나타낸 것이다. 감자 절편들을 Cot1 현탁액 (5 ×10⁸ CFU/ml) ( ▲), 또는 물 ( ◆ )에 약 20초 동안 침지시키고, 라미나 플로우 (Laminar Flow)에서 20분 동안 건조시켰다. 절편들을 에르위니아 카로토보라 SCG1 (2 ×10⁹ CFU/ml) 5㎕로 접종하였다. 28℃에서 1, 2, 3 및 4일 동안 배양한 후에, 배양된 절편들을 작은 조각들로 절단하고, 세균 세포들을 재현탁시키기 위하여 0.1 M NaCl 용액 10ml를 부가하였다. 혼합물을 30분 동안 진탕하고, 현탁액을 적당히 희석하여 콜로니 카운팅을 위하여 플레이트 상에 스프레딩 하였다. SCG1의 콜로니 숫자는 log10 CFU/절편 ( ▲SCG1 단독; ■Cot1에 침지)으로 나타내었으며, Cot1 ( ◆ )의 숫자는 log10 CFU/mm²으로 나타내었다. 실험은 4회 반복되었으며, 평균 데이터가 제시되었다.

<110> Institute of Molecular Agrobiology Zhang, Lianhui Dong, Yihu Zhang, Haibao Xu, Jinling <120> Bacterial Strains, Genes and Enzymes for Control of Bacterial Diseases by Quenching Quorum-Sensing Signals <130> 2577-140 <160> 22 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 1581 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens M103 <220> <221> misc_feature <222> (315)..(1103) <223> Coding sequence <400> 1 ctgcagcgtc gctttatgcg gagcttgccg acgtgctggg tgttccgggt gaaggggatg 60 cggcaacccg ttcggatgcg ttcgttcagc atatggaaac gctgatggac gaaagcggcg 120 cgccgcgacg tctgcgcgat gtcggcgtga cggacaacac gctcgccatg cttgcgtccg 180 acgcaatgaa acagagccgt ctgttggtca ataatccggt cgaagtccgc gaagaggatg 240 cgcttgcgct ctaccgcgag gcgttctgac ccatttctga cagcaatatc ttcagtccca 300 agggaggaaa acgagtgacc gatatcagac tttacatgct tcagtcgggt acgctgaaat 360 gcaaggtaca caacatcaag atgaaccagg ggaacggtgc agactatgag atccccgttc 420 cgtttttcct gattacccat ccgggcgggc acaccgtgat cgacggcggc aacgcgattg 480 aagttgcaac ggatccgcgt ggccattggg gcggcatctg 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ttaaacttgc cggtttggtg ttatcttttg 120 gagacggaag aaggtcctat tttagtagac acaggtatgc cagaaagtgc agttaataat 180 gaagggcttt ttaacggtac atttgcaaaa ggacagattt taccgaaaat gactgaagaa 240 gatagaattg taactatttt aaaacgtgca gggtatgagc cagatgatct cctatatatt 300 attagttcgc acttgcattt tgatcatgca ggaggaaatg gtgctttttt gaatacgcca 360 atcattatac aacgtgctga atatgaggca gcgcagcata gagaggaata tttgaaagag 420 tgcatactac cagatttaaa ctacaaaatt attgaaggtg attatgaagt ggtacctggt 480 gttcggttat tgtatacacc aggacattct ccagggcatc agtcattatt aattgagacg 540 gaaaaatccg gtcctgtatt attaacgatt gatgcatctt atacgaaaga gaattttgaa 600 gatgaagtac cgtttgcggg atttgattcg gaattagcct tatcttcaat taaacgttta 660 aaagaagttg tgatgaaaga gaaaccgatt gttttctttg gacatgatat agaacaggaa 720 aagggatgta aagtgttccc tgaatatata tag 753 <210> 7 <211> 753 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis B20 <400> 7 atgacagtaa agaagcttta tttcatccca gcaggtcgtt gtatgttaga tcattcttct 60 gttaatagta cactcgcgcc ggggaattta ttgaacttac ctgtatggtg ttatcttttg 120 gagacagaag 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agttaataat 180 gaagggcttt ttaacggtac atttgttgaa ggacagattt taccgaaaat gactgaagaa 240 gatagaatcg tgaatatatt aaagcgtgta gggtatgagc cggacgacct tttatatatt 300 attagttctc acttacattt tgatcatgca ggaggaaacg gtgcttttac aaatacaccg 360 attattgtgc agcgagcgga atatgaggca gcacttcata gagaagaata tatgaaagaa 420 tgtatattac cgcatttgaa ctacaaaatt attgaagggg attatgaagt ggtaccaggt 480 gttcaattat tgtatacgcc aggtcattct ccaggccatc agtcgttatt cattgagacg 540 gacaattccg gttcagtttt attaacaatt gatgcatcgt acacgaaaga gaattttgaa 600 gatgaagtgc cgttcgcagg atttgatcca gaattagctt tatcttcaat caaacgttta 660 aaaggagttg tggcggaaga gaaaccaatt gttttctttg gtcatgatat agagcaggaa 720 aagggttgta gagtgttccc tgagtatata tag 753 <210> 9 <211> 753 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis B22 <400> 9 atgacagtaa agaagcttta tttcatccca gcaggtcgtt gtatgttaga tcattcttct 60 gttaatagta cactcgcgcc ggggaattta ttgaacttac ctgtatggtg ttatcttttg 120 gagacagaag aggggcctat tttagtagat acaggtatgc cagaaagtgc agttaataat 180 gaagggcttt ttaacggtac atttgttgaa ggacagattt taccgaaaat gactgaagaa 240 gatagaatcg tgaatatatt aaagcgtgta gggtatgagc cggacgacct tttatatatt 300 attagttctc acttacattt tgatcatgca ggaggaaacg gtgcttttac aaatacaccg 360 attattgtgc agcgagcgga atatgaggca gcacttcata gagaagaata tatgaaagaa 420 tgtatattac cgcatttgaa ctacaaaatt attgaagggg attatgaagt ggtaccaggt 480 gttcaattat tgtatacgcc aggtcattct ccaggccatc agtcgttatt cattgagacg 540 gagcaatccg gttcagtttt attaacaatt gatgcatcgt acacgaaaga gaattttgaa 600 gatgaagtgc cgttcgcagg atttgatcca gaattagctt tatcttcaat caaacgttta 660 aaaggagttg tggcggaaga gaaaccaatt gttttctttg gtcatgatat agagcaggaa 720 aagggttgta gagtgttccc tgagtatata tag 753 <210> 10 <211> 753 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis B25 <400> 10 atgacagtaa agaagcttta tttcatccca gcaggtcgtt gtatgttaga tcattcttct 60 gttaatggta cactcgcgcc ggggaattta ttgaacttac ctgtatggtg ttatcttttg 120 gagacagaag aaggggccat tttagtagat acaggtatgc cagaaagtgc agttaataat 180 gaagggcttt ttaacggtac atttgttgaa ggacagattt taccgaaaat gactgaagaa 240 gatagaatcg 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<400> 20 Met Thr Val Lys Lys Leu Tyr Phe Ile Pro Ala Gly Arg Cys Met Leu 1 5 10 15 Asp His Ser Ser Val Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Asn Leu Leu Asn 20 25 30 Leu Pro Val Trp Cys Tyr Leu Leu Glu Thr Glu Glu Gly Ala Ile Leu 35 40 45 Val Asp Thr Gly Met Pro Glu Ser Ala Val Asn Asn Glu Gly Leu Phe 50 55 60 Asn Gly Thr Phe Val Glu Gly Gln Ile Leu Pro Lys Met Thr Glu Glu 65 70 75 80 Asp Arg Ile Val Asn Ile Leu Lys Arg Val Gly Tyr Glu Pro Asp Asp 85 90 95 Leu Leu Tyr Ile Ile Ser Ser His Leu His Phe Asp His Ala Gly Gly 100 105 110 Asn Gly Ala Phe Thr Asn Thr Pro Ile Ile Val Gln Arg Thr Glu Tyr 115 120 125 Glu Ala Ala Leu His Arg Glu Glu Tyr Met Lys Glu Cys Ile Leu Pro 130 135 140 His Leu Asn Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Asp Tyr Glu Val Val Pro Gly 145 150 155 160 Val Gln Leu Leu Tyr Thr Pro Gly His Ser Pro Gly His Gln Ser Leu 165 170 175 Phe Ile Glu Thr Glu Gln Ser Gly Ser Val Leu Leu Thr Ile Asp Ala 180 185 190 Ser Tyr Thr Lys Glu Asn Phe Glu Asp Glu Val Pro Phe Ala Gly Phe 195 200 205 Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Lys Arg Leu Lys Gly Val Val 210 215 220 Ala Lys Glu Lys Pro Ile Val Phe Phe Gly His Asp Ile Glu Gln Glu 225 230 235 240 Lys Gly Cys Arg Val Phe Pro Glu Tyr Ile 245 250 <210> 21 <211> 256 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 21 Met Leu Gln Ser Gly Thr Leu Lys Cys Lys Val His Asn Ile Lys Met 1 5 10 15 Asn Gln Gly Asn Gly Ala Asp Tyr Glu Ile Pro Val Pro Phe Phe Leu 20 25 30 Ile Thr His Pro Ala Gly His Thr Val Ile Asp Gly Gly Asn Ala Ile 35 40 45 Glu Val Ala Thr Asp Pro Arg Gly His Trp Gly Gly Ile Cys Asp Val 50 55 60 Tyr Trp Pro Val Leu Asp Lys Asp Gln Gly Cys Val Asp Gln Ile Lys 65 70 75 80 Ala Leu Gly Phe Asp Pro Ala Asp Val Lys Tyr Val Val Gln Ser His 85 90 95 Leu His Leu Asp His Thr Gly Ala Ile Gly Arg Phe Pro Asn Ala Thr 100 105 110 His Ile Val Gln Arg Ser Glu Tyr Glu Tyr Ala Phe Thr Pro Asp Trp 115 120 125 Phe Ala Gly Gly Gly Tyr Ile Arg Lys Asp Phe Asp Lys Pro Gly Leu 130 135 140 Lys Trp Gln Phe Leu Asn Gly Ala Gln Asp Asp Tyr Tyr Asp Val Tyr 145 150 155 160 Gly Asp Gly Thr Leu Thr Thr Ile Phe Thr Pro Gly His Ala Pro Gly 165 170 175 His Gln Ser Phe Leu Val Arg Leu Pro Asn Ser Lys Pro Leu Leu Leu 180 185 190 Thr Ile Asp Ala Ala Tyr Thr Leu Asp His Trp Glu Glu Lys Ala Leu 195 200 205 Pro Gly Phe Leu Ala Ser Thr Val Asp Thr Val Arg Ser Val Gln Lys 210 215 220 Leu Arg Thr Tyr Ala Glu Lys His Asp Ala Thr Val Val Thr Gly His 225 230 235 240 Asp Pro Asp Ala Trp Ala Asn Phe Lys Lys Ala Pro Glu Phe Tyr Ala 245 250 255 <210> 22 <211> 248 <212> PRT <213> Bacillus sp. 240B1 <400> 22 Met Thr Val Lys Lys Leu Tyr Phe Val Pro Ala Gly Arg Cys Met Leu 1 5 10 15 Asp His Ser Ser Val Asn Ser Thr Leu Thr Pro Gly Glu Leu Leu Asp 20 25 30 Leu Pro Val Trp Cys Tyr Leu Leu Glu Thr Glu Glu Gly Pro Ile Leu 35 40 45 Val Asp Thr Gly Met Pro Glu Ser Ala Val Asn Asn Glu Gly Leu Phe 50 55 60 Asn Gly Thr Phe Val Glu Gly Gln Val Leu Pro Lys Met Thr Glu Glu 65 70 75 80 Asp Arg Ile Val Asn Ile Leu Lys Arg Val Gly Tyr Glu Pro Glu Asp 85 90 95 Leu Leu Tyr Ile Ile Ser Ser His Leu His Phe Asp His Ala Gly Gly 100 105 110 Asn Gly Ala Phe Ile Asn Thr Pro Ile Ile Val Gln Arg Ala Glu Tyr 115 120 125 Glu Ala Ala Gln His Ser Glu Glu Tyr Leu Lys Glu Cys Ile Leu Pro 130 135 140 Asn Leu Asn Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Asp Tyr Glu Val Val Pro Gly 145 150 155 160 Val Gln Leu Leu His Thr Pro Gly His Thr Pro Gly His Gln Ser Leu 165 170 175 Leu Ile Glu Thr Glu Lys Ser Gly Pro Val Leu Leu Thr Ile Asp Ala 180 185 190 Ser Tyr Thr Lys Glu Asn Phe Glu Asn Glu Val Pro Phe Ala Gly Phe 195 200 205 Asp Ser Glu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Lys Arg Leu Lys Glu Val Val 210 215 220 Met Lys Glu Lys Pro Ile Val Phe Phe Gly His Asp Ile Glu Gln Glu 225 230 235 240 Arg Gly Cys Lys Val Phe Pro Glu 245

Claims (32)

1. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자:

   (i) 식 103aa-아미노산 모티프 1-59aa를 갖는 250개 아미노산으로 이루어지는 단백질로서, 상기 아미노산 모티프 1은 HXHXDH-59aa-H-21aa-D로 이루어지며, 상기 단백질은 자가유도인자 불활성화 활성을 가지며, 서열번호 12 내지 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 및

   (ii) 식 102aa-아미노산 모티프 2-61aa를 갖는 263개 아미노산으로 이루어지는 단백질로서, 상기 아미노산 모티프 2는 HXHXDH-71aa-H-21aa-D로 이루어지며, 상기 단백질은 자가유도인자 불활성화 활성을 가지며, 서열번호 11로 이루어진 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
2. 제1항에 있어서, 서열번호 2 내지 10 및 서열번호 1로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
3. 제1항의 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
4. 제2항의 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
5. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질:

   (i) 식 103aa-아미노산 모티프 1-59aa를 갖는 250개 아미노산으로 이루어지는 단백질로서, 상기 아미노산 모티프 1은 HXHXDH-59aa-H-21aa-D로 이루어지며, 상기 단백질은 자가유도인자 불활성화 활성을 가지며, 서열번호 12 내지 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 및

   (ii) 식 102aa-아미노산 모티프 2-61aa를 갖는 263개 아미노산으로 이루어지는 단백질로서, 상기 아미노산 모티프 2는 HXHXDH-71aa-H-21aa-D로 이루어지며, 상기 단백질은 자가유도인자 불활성화 활성을 가지며, 서열번호 11로 이루어진 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
6. 병독성이 자가유도인자에 의하여 조절되는 질병에 대한 민감성 식물의 내성을 증가시키기 위한 방법으로서, 상기 자가유도인자 저해인자를 생산하는 능력이 있는, 세균의 유효량을 상기 식물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 저해인자는 제5항에 따른 자가유도인자 불활성화 단백질을 포함하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 투여되는 세균이 바실러스 sp.인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 바실러스 sp.가 바실러스 투린지엔시스의 변종 (variety)인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 바실러스 투린지엔시스 변종이 B1, B2, B17, B18, B20, B21, B22 및 B25로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 식물에서 질병의 내성을 증가시키기 위한 방법으로서, 자가유도인자 불활성화 단백질을 코딩하는 최소한 하나의 핵산 분자를 상기 식물의 세포가 상기 핵산 분자를 발현하도록 하는 방식으로 상기 식물의 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 핵산 분자는 제1항에 따른 핵산 분자를 포함하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 최소한 하나의 핵산이 서열번호 2 내지 10 및 서열번호 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 식물에 대한 세균성 피해를 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 감소를 필요로 하는 식물에 유효량의 자가유도인자 불활성화 단백질을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 자가유도인자 불활성화 단백질은 제5항에 따른 자가유도인자 불활성화 단백질을 포함하는 방법.
13. 병독성이 자가유도인자에 의하여 조절되는 질병에 대한 민감성 비인간 동물의 내성을 증가시키기 위한 방법으로서, 상기 자가유도인자 저해인자를 생산하는 능력이 있는, 세균의 유효량을 상기 비인간 동물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 저해인자는 제5항에 따른 자가유도인자 불활성화 단백질을 포함하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 투여되는 세균이 바실러스 sp.인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 바실러스 sp.가 바실러스 투린지엔시스의 변종 (variety)인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 바실러스 투린지엔시스 변종이 B1, B2, B17, B18, B20, B21, B22 및 B25로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 비인간 동물에서 질병의 내성을 증가시키기 위한 방법으로서, 자가유도인자 불활성화 단백질을 코딩하는 최소한 하나의 핵산 분자를 상기 비인간 동물의 세포가 상기 핵산 분자를 발현하도록 하는 방식으로 상기 비인간 동물의 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 핵산 분자는 제1항에 따른 핵산 분자를 포함하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 최소한 하나의 핵산이 서열번호 2 내지 10 및 서열번호 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 비인간 동물에 대한 세균성 피해를 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 감소를 필요로 하는 비인간 동물에 유효량의 자가유도인자 불활성화 단백질을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 자가유도인자 불활성화 단백질은 제5항에 따른 자가유도인자 불활성화 단백질을 포함하는 방법.
20. 생체 외에서(ex vivo) 세균성 생필름의 형성을 감소시키는 방법으로서, 생필름-형성 세균을 최소한 하나의 자가유도인자 저해인자 단백질에 노출시키는 단계를 포함하고, 상기 자가유도인자 불활성화 단백질은 제5항에 따른 자가유도인자 불활성화 단백질을 포함하는 방법.
21. 자가유도인자 불활성화 단백질을 코딩하는 최소한 하나의 핵산 분자에 의해 안정적으로 형질전환된 원핵 또는 진핵 세포로서, 상기 핵산 분자는 제1항에 따른 핵산 분자를 포함하는 세포.
22. 제21항에 있어서, 상기 최소한 하나의 핵산 분자는 서열번호 2 내지 10 및 서열번호 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
23. 자가유도인자 불활성화 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 자가유도인자 불활성화 단백질은 제5항에 따른 자가유도인자 불활성화 단백질을 포함하는 약학 조성물.
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