KR101141787B1 - 쿼럼센싱 저해제를 스크리닝하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 쿼럼센싱 (Quorum sensing) 저해제를 스크리닝하기 위한 발현 카세트로 이루어진 벡터 및 상기 벡터가 도입된 균주를 이용한 쿼럼센싱 저해제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 상세하게는 아실 호모세린 락톤을 인식하여 결합하는 전사조절 단백질을 인코딩하는 유전자, 상기 전사조절 단백질에 의해 전사가 조절되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 항생제 분해 효소 저해 단백질을 인코딩하는 유전자, 및 상기 항생제 분해 효소 저해 단백질에 의해 활성이 전해되는 항생제 분해 효소를 인코딩하는 유전자를 포함하는, 쿼럼센싱 저해제를 스크리닝하기 위한 발현 카세트로 이루어진 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 균주, 상기 균주에 쿼럼센싱 저해제 후보물질과 접촉시켜 쿼럼센싱 저해제를 스크리닝하는 방법 및 상기 방법에 의해 스크리닝된 쿼럼센싱 저해제에 관한 것이다.

쿼럼센싱, 아실 호모세린 락톤, LuxI, LuxR, β-락타마제 저해 단백질, TEM-1 β-락타마제

Description

쿼럼센싱 저해제를 스크리닝하는 방법{Method for Screening of Quorum Sensing Inhibitors}

본 발명은 쿼럼센싱 (Quorum sensing) 저해제를 스크리닝하기 위한 발현 카세트로 이루어진 벡터 및 상기 벡터가 도입된 균주를 이용한 쿼럼센싱 저해제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 상세하게는 아실 호모세린 락톤을 인식하여 결합하는 전사조절 단백질을 인코딩하는 유전자, 상기 전사조절 단백질에 의해 전사가 조절되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 항생제 분해 효소 저해 단백질을 인코딩하는 유전자, 및 상기 항생제 분해 효소 저해 단백질에 의해 활성이 전해되는 항생제 분해 효소를 인코딩하는 유전자를 포함하는, 쿼럼센싱 저해제를 스크리닝하기 위한 발현 카세트로 이루어진 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 균주, 상기 균주에 쿼럼센싱 저해제 후보물질과 접촉시켜 쿼럼센싱 저해제를 스크리닝하는 방법 및 상기 방법에 의해 스크리닝된 쿼럼센싱 저해제에 관한 것이다.

세균은 일정 수준의 세포농도에 도달하면, 자신이 생산하는 화학적 언어를 이용하여 세포들 서로 간에 신호를 전달하고 이를 통해 특정 유전자의 발현을 조절하는데, 이렇게 유전자의 발현이 개체 밀도에 의존하는 기작을 쿼럼센싱 (quorum sensing)이라 한다. 쿼럼센싱 기작은, 각각의 세균 개체들이 자기유도 물질 (autoinducer)이나 페로몬 (pheromone)과 같은 저분자의 신호전달 물질들을 세포 외부에 축적하여 활발한 증식을 유도하고 일정 정족수(quorum)를 채워 유전자 발현을 유도하는 일련의 생물 현상으로서 특정 신호물질을 이용한 세균들 사이의 의사소통 메커니즘을 의미하며 세균들은 이 과정을 통하여 단백질 발현, 생물막 형성, 이동, 공생, 개체수 조절 등 생존에 필요한 다양한 생리적 활성을 조절한다. 쿼럼센싱은 신호물질을 합성하는 단백질과 그 신호물질과 결합하여 유전자의 발현을 조절하는 전사조절 단백질에 의해 이루어진다.

그람 음성 세균 (Gram-negative bacteria)의 경우, 상기 쿼럼센싱에 주로 아실 호모세린 락톤 (N-acyl homoserine lactone, AHL)을 사용한다. 아실 호모세린 락톤은 LuxI 단백질의 유도 단백질들에 의해 합성되며, LuxR 단백질의 유도 단백질들에 의해 인식된 후 특정 유전자 발현을 하는 데에 필요한 전사인자 (transcription factor)로 작용하게 된다. 아실 호모세린 락톤은 아실기 (acyl chain)를 형성하는 탄화수소 사슬의 길이에 따라 다양한 구조를 나타내며, 각 종마다 아실기의 길이와 모양, 및 사용되는 탄소 원자의 개수가 모두 다른 것으로 알려져 있다. 아실 호모세린 락톤 이외에 그람 음성 세균이 사용하는 자가유도물질로는 3-하이드록시-팔미틱 에시드 메틸 에스테르 (3-hydroxy-palmitic acid methyl ester) 및 PQS (Pseudomonas quinolone signal)인 헵틸-하이드록시-쿼놀린 (heptyl-hydroxy-quinolone) 등의 물질이 사용된다고 알려져 있다 (Int . J. Infect . Dis . 2004. 8, 81-95).

포유동물과 같은 개체에서 발병하는 병원균에 의한 감염성 질병 또한 쿼럼센싱을 통한 분자적 기작의 결과물이며, 그 중 쿼럼센싱을 통한 다양한 발병요소 생산을 조절하여 병원성을 일으키는 대표적인 병원균의 예는 다음과 같다. 섬유성낭포증환자의 호흡기 감염에 대한 원인균인 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 버크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia)와 포유류에 대한 기회적 병원균인 세라티아 리퀴파시엔스 (Serratia liquefacience), 어병균인 에어로모나스 히드로필라 (Aeromonas hydrophila) 또는 비브리오 안귈라룸 (Vibrio anguillarum), 식물병원균인 어위니아 카로토보라 (Erwinia carotovora) 또는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 등을 들 수 있다. 한편 식품, 특히 냉장이나 냉동 식품에 존재하는 미생물이 평소엔 병원성을 일으키지 않다가 어떠한 환경변화에 의해 신호 물질을 생성하여 병원성을 일으킬 수 있는데, 한편 이러한 시료 중의 신호물질을 조사함으로써 시료 중에 존재하는 세균을 검출하고, 세균의 양을 정량할 수 있다. 이러한 식품뿐 아니라 농작물, 어류 등을 포함한 다양한 동식물과 인간을 숙주로 하여 병원성을 일으키는 데에도 쿼럼센싱이 관여하는 것으로 알려지고 있다. 따라서, 상기와 같은 병원균에 의한 감염성 질환을 예방 또는 치료하기 위해 쿼럼센싱을 저해하는 저해제에 대한 연구가 지속적으로 진행되어 왔다. 대부분의 쿼럼센싱 저해제 개발을 통한 질병 치료에 관한 연구는 신호물질과 화학적인 유사성을 지니는 유도체를 쿼럼센싱의 길항제 (Antagonist)로서 개발하거나, 쿼럼센싱의 신호물질을 특이적으로 분해하는 효소를 이용하여 저해 (Quenching)하고자 하는 방식으로 이루어져 왔다. 이러한 접근들은 세균의 생존을 막아 질병을 치료하는 방식의 기존 항생제와 달리 질병 유발의 직접적인 기작만을 선택적으로 차단하는 방식이므로 치료로 인한 내성균 출현의 문제를 극복할 수 있어 새로운 치료제로 기대를 모으고 있다. 이러한 기대에 부응하여 많은 연구자들이 AHL 유도체를 설계 및 합성하고 있으나, 구조-활성 관계 (structure-activity relationship) 또는 종 선택성 (species selectivity) 등에 대한 명확한 결론을 도출하고 있지 못하고 있는 실정이다.

또한, 이처럼 쿼럼센싱 저해제의 의학적 산업적 가능성은 매우 큼에도 불구하고 효과적인 저해제 개발을 위해 필수적인 대량의 고속 선별 (High Throughput Screening) 방법에 대한 연구는 아직 초기단계이다. 최근에는 자가유도물질인 아실 호모세린 락톤의 황유도체 (thiolactone)를 기질로 사용하여, 이것의 분해를 인지하여 결합하는 형광 색소, 그리고 형광의 밝기에 따라 분리하는 유세포분석기 (FACS)를 이용하여 쿼럼센싱 저해 효소를 개발하는 방법이 보고된 바 있으나 (Nat . Methods. 2006. 3, 561-570) 이 방법은 특정 황유도체를 분해하는 효소만을 선별하는 것으로 스크리닝 방법으로서 다소 한정적이다. 또한 최근 비브리오 피셔리 (Vibrio fisheri)의 쿼럼센싱에 관여되는 발광오페론을 이용하여 쿼럼센싱의 저해제를 선별하는 방법이 제안되었으나 (Biochemistry . 2009. 48, 4344-4353), 이 방법은 저해력이 클수록 오히려 발광의 세기가 반대로 어두워지는 방식이라 선별의 정확도가 떨어지는 단점이 있다.

따라서 자연계 혹은 합성된 대량의 후보물질에서 의학적 산업적으로 가치있는 쿼럼센싱 저해제를 발견, 개발 및 개량을 위해서는 보다 효과적인 선별 방법의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 쿼럼센싱 저해제를 선별하기 위한 스크리닝 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 쿼럼센싱의 저해 정도를 항생제 저항성과 연계하여, 쿼럼센싱 저해 활성이 클수록 스크리닝 시스템으로 이용되는 숙주세포의 항생제 저항성이 증가하는 새로운 유전적 회로 시스템을 개발하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 (i) 아실 호모세린 락톤을 인식하여 결합하는 전사조절 단백질을 인코딩하는 유전자; (ii) 전사조절 단백질에 의해 전사가 조절되는 프로모터 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 항생제 분해 효소 저해 단백질을 인코딩하는 유전자; 및 (iii) 항생제 분해 효소 저해 단백질에 의해 활성이 저해되는 항생제 분해 효소를 인코딩하는 유전자를 포함하는, 쿼럼센싱 저해제를 스크리닝하기 위한 발현 카세트로 이루어진 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 벡터가 도입된 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (i) 상기 균주의 성장이 억제되는 아실 호모세린 락톤 및 항생제의 농도를 결정하는 단계; (ii) 상기 성장이 억제된 균주를 쿼럼센싱 저해제 후보물질과 접촉시키는 단계; 및 (iii) 상기 저해제 후보물질과 접촉된 균주가 상기 (i) 단계에서 결정된 농도 이상의 아실 호모세린 락톤 또는 결정된 농도 이상의 항생제 조건에서 자라는 경우, 상기 후보물질을 쿼럼센싱 저해제라고 판단하는 단계를 포함하는, 쿼럼센싱 저해제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 스크리닝 방법으로 스크리닝 된 쿼럼센싱 저해제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (i) 아실 호모세린 락톤을 인식하여 결합하는 전사조절 단백질을 인코딩하는 유전자; (ii) 전사조절 단백질에 의해 전사가 조절되는 프로모터 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 항생제 분해 효소 저해 단백질을 인코딩하는 유전자; 및 (iii) 항생제 분해 효소 저해 단백질에 의해 활성이 저해되는 항생제 분해 효소를 인코딩하는 유전자를 포함하는, 쿼럼센싱 (Quorum sensing) 저해제를 스크리닝하기 위한 발현 카세트로 이루어진 벡터들에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "쿼럼센싱"이란, 세균의 환경 변화에 반응하여 특정한 물질을 합성하여 세포 외로 배출하고 흡수하는 방법을 사용한 서로 간의 의사소통을 의미한다. 이때 신호전달을 매개하는 저분자량 물질을 오토인듀서 (autoinducer)라 하며 일반적으로 그람 음성 세균은 아실 호모세린 락톤 (acyl homoserine lactone)을 그람 양성 세균은 펩타이드 단편을 오토인듀서로 사용한다. 상기 "쿼럼"이란 "정족수"를 뜻하는 단어로, 세균의 개체 수가 얼마 되지 않을 때는 이런 신호 전달이 일어나지 않으나, 개체수가 증가하여 아실 호모세린 락톤의 농도가 일정수준 이상이 되면 자신들의 개체밀도를 감지하게 된다. 신호 전달 물질들이 일정 농도에 도달하면 조절 단백질과 결합하여 특정 유전자의 발현을 촉진 혹은 억제하여 발병뿐 아니라 생체발광, 생물막 (biofilm formation)을 형성하여 항생제에 대한 내성을 가지게 되는 현상 등을 초래한다.

본 발명에서 용어 "아실 호모세린 락톤"이란 그람 음성 세균에서 쿼럼센싱의 신호 전달 물질인 오토인듀서를 의미한다. 아실 호모세린 락톤을 매개로 하는 쿼 럼센싱은 많은 병원성 세균에 광범위하게 존재하며 그 기작이 매우 유사하여 새로운 항-감염요법의 대상이 된다. 본 발명에서 아실 호모세린 락톤은 그람 음성 세균의 쿼럼센싱의 신호전달 물질인 일반적 호모세린 락톤 고리 구조를 공유하는 화합물 그룹을 의미하며, 그 예로, 옥소 헥사노일 호모세린 락톤(N-β-oxo-hexanoyl-L-homoserine lactone), 옥소 옥타노일 호모세린 락톤 (N-β-oxo-octanoyl-Lhomoserine lactone), 옥소 데카노일 호모세린 락톤 (N-β-oxo-decanoyl-L-homoserine lactone), 헥사노일 호모세린 락톤 (N-hexanoyl-L-homoserine lactone), 부타노일 호모세린 락톤 (N-butanoyl-homoserine lactone), 옥소 도데카노일 호모세린 락톤(N-β-oxo-dodecanoyl-L-homoserine lactone) 등이 포함되나, 상기 예에 의해 사용가능한 아실 호모세린 락톤의 종류가 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 아실 호모세린 락톤은 헥사노일 호모세린 락톤을 사용할 수 있다.

상기 아실 호모세린 락톤을 인식하여 결합하는 전사조절 단백질은 오토인듀서인 아실 호모세린 락톤과 결합하여 표적 유전자의 전사를 조절할 수 있는 단백질을 의미하며, 아실 호모세린 락톤과 결합하여 표적 유전자의 전사를 조절할 수 있는 단백질은 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 LuxR-type 전사조절 단백질인 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래의 LasR과 RhlR, 버크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia) 유래의 CepR, 세라티아 리퀴파시엔스 (Serratia liquefacience) 유래의 SwrR, 에어로모나스 히드로필라 (Aeromonas hydrophila) 유래의 AhyR, 비브리오 안귈라룸 (Vibrio anguillarum) 유래의 VanR, 어위니아 카로토보라 (Erwinia carotovora) 유래의 ExpR과 CarR, 또는 아그로박테 리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 유래의 TraR, 비브리오 피셔리 (Vibrio fischeri) 유래의 LuxR을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 비브리오 피셔리 (Vibrio fischeri) 유래의 LuxR이다.

상기 전사조절 단백질에 의해 전사가 조절되는 프로모터는 균주 내의 다양한 전사조절 단백질에 의한 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 프로모터를 의미하며, 아실 호모세린 락톤과 결합한 전사조절 단백질에 의해 다운스트림에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 on-off 시킬 수 있는 프로모터를 의미한다. 상기 프로모터는 다양한 쿼럼센싱 유도 프로모터가 제한 없이 사용될 수 있으며, 그 예로 LuxI-type 프로모터인 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래의 LasI 프로모터와 RhlI 프로모터, 버크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia) 유래의 CepI 프로모터, 세라티아 리퀴파시엔스 (Serratia liquefacience) 유래의 SwrI 프로모터, 에어로모나스 히드로필라 (Aeromonas hydrophila) 유래의 AhyI 프로모터, 비브리오 안귈라룸 (Vibrio anguillarum) 유래의 VanI 프로모터, 어위니아 카로토보라 (Erwinia carotovora) 유래의 ExpI 프로모터과 CarI 프로모터, 또는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 유래의 TraI 프로모터, 비브리오 피셔리 (Vibrio fischeri) 유래의 LuxI 프로모터를 사용할 수 있고, 이는 발현 카세트에 포함되는 각각의 종에서 유래된 전사조절 단백질과 조합되어 쌍을 이룰 수 있는 프로모터를 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 LuxR과 한 쌍을 이루는 비브리오 피셔리 (Vibrio fischeri) 유래의 LuxI 프로모터이다.

본 발명에서 용어 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은, 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되면 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편의 영향을 받지만, 이들 핵산 단편의 여러 가능한 결합 조합 중에서 각 단편이 그 기능을 수행하는데 있어 검출할 만한 영향이 없는 상태의 결합을 의미한다. 즉, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 아울러, 본 발명의 발현 카세트는 전사를 조절하기 위한 임의의 전사 시작 조절 서열 및 전사 종결 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다. 작동가능한 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "항생제 분해효소"란 상기 벡터를 도입한 숙주세포인 균주의 쿼럼센싱의 저해 정도를 항생제 저항성과 연계하여, 쿼럼센싱 저해 활성이 클수록 선별 시스템으로 이용되는 숙주세포의 항생제 저항성이 증가되는 것을 판단하기 위한 구성요소로 항생제 분해효소 저해 단백질 및 상기 저해 단백질에 의해 항생제 분해 활성이 감소하는 항생제 분해효소를 인코딩하는 유전자를 하나의 발현 카세트에 포함시킬 수 있다. 상기 항생제 분해효소는 균주의 선별을 위하여 사용된 항생제의 종류에 따라 당업계에 공지된 항생제의 분해효소를 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 β-락탐계 항생제 분해효소 (Extended spectrum beta lactamase, ESBL)인 TEM, SHV 및 AmpC형 효소가 있으나 상기 예로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 본 발명의 항생제 분해효소는 TEM-1 β-락타마제 (TEM-1 β-lactamase)이다.

바람직한 일 실시태양으로 상기 균주는, 상기 발현 카세트의 각 구성요소의 정상적인 구현이 가능한 모든 균주를 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 그람 음성 세균인 액티노바실루스 액티노마이세템코미탄스 (Actinobacillus actinomycetemcomitans), 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 보르데텔라 퍼투시스 (Bordetella pertussis), 브루셀라 속 (Brucella sp.), 캄필로박터 속 (Campylobacter sp.), 카프노사이토파가 속 (Capnocytophaga sp.), 카르디오박테륨 호미니스 (Cardiobacterium hominis), 아이케넬라 코로덴스 (Eikenella corrodens), 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 헤모필루스 듀크레이 (Haemophilus ducreyi), 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzue), 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori), 킹겔라 킹가이 (Kingella kingae), 레기오엘라 프네우모필라 (Legionella pneumophila), 파스튜렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida), 시트로박터 속 (Citrobacter sp.), 엔테로박터 속 (Enterobacter sp.), 대장균 (Escherichia coli), 클레브시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 프로테우스 속 (Proteus sp.), 살모넬라 엔테리디티스 (Salmonella enteriditis), 살모넬라 타이피 (Salmonella typhi), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 시겔라 속 (Shigella sp.), 예르시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 나이세리아 고노레아 (Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis), 모락셀라 카타르할리스 (Moraxella catarrhalis), 베일로넬라 속 (Veillonella sp.), 박테로이디즈 프라질리스 (Bacteroides fragilis), 박테리오디 즈 속 (Bacteroides sp.), 프레보텔라 속 (Prevotella sp.), 푸소박테륨 속 (Fusobacterium sp.), 스피릴룸 미누스 (Spirillum minus), 에어로모나스 속(Aeromonas sp.), 플레시오모나스 시겔로이디즈 (Plesiomonas shigelloides), 비브리오 속, 비브리오 피셔리, 비브리오 콜레리(Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤몰리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스 (Vibrio vulnificus), 아시네토박테르 속 (Acinetobacter sp.), 플라보박테륨 속 (Flavobacterium sp.), 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 부르크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia), 부르크홀데리아 슈도말레이 (Burkholderia pseudomallei), 잔토모나스 말토필리아 (Xanthomonas maltophilia), 또는 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophila)등이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 대장균이다.

본 발명에서 용어 "항생제 분해효소 저해 단백질"이란 상기 항생제 분해효소, 예를 들어 다양한 종류의 ESBL을 표적으로 기능을 저해하는 단백질을 의미하며, 선택된 항생제 분해효소의 종류에 따라 당업계에 공지된 상기 항생제 분해효소의 기능을 억제하는 다양한 단백질을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 β-락타마제 저해 단백질 (β-lactamase inhibitor protein, BLIP)이다.

본 발명에서 용어 "쿼럼센싱 저해제"란 쿼럼센싱을 저해할 수 있는 모든 물질을 제한 없이 포함할 수 있고, 오토인듀서인 아실 호모세린 락톤의 유사체나 아실 호모세린 락톤을 분해 혹은 결합하는 효소나 단백질, 쿼럼센싱 전사조절 단백질에 결합하여 활성을 방해하는 길항제나 결합 단백질, 쿼럼센싱 프로모터에 특이적 으로 결합하여 발현을 억제하는 단백질 등 가능한 모든 쿼럼센싱 저해제를 포함할 수 있으며, 또한 상기 쿼럼센싱을 저해할 수 있는 RNAi와 같은 핵산, 화합물 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는 아실 호모세린 락톤을 분해할 수 있는 락토나제이다.

본 발명에서 용어 "발현 카세트"란 아실 호모세린 락톤을 인식하여 결합하는 전사조절 단백질을 발현할 수 있는 단위, 아실 호모세린 락톤이 결합된 전사조절 단백질에 의해 전사가 조절되는 프로모터 및 프로모터에 연결되어 발현이 조절되는 항생제 분해 효소 저해 단백질을 발현할 수 있는 단위, 및 상기 항생제 분해 효소 저해 단백질의 표적이 되는 항생제 분해 효소를 발현할 수 있는 단위로 구성된 카세트를 의미한다.

또한, 본 발명에서 용어,"벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바람직하게는, 서열번호 1의 pQS 플라스미드, 서열번호 4의 pPROTrc2, 서열번호 10의 pZS*24DNluc을 사용할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

바람직한 일 실시태양으로, 쿼럼센싱 저해제를 스크리닝하기 위한 발현 카세트로 이루어진 벡터는 비브리오 피셔리의 LuxR 단백질을 인코딩하는 유전자와 LuxI 프로모터, 스트렙토마이시스 크라뷰리거러스 (Streptomyces clavuligerus) 유래의 β-락타마제 저해 단백질을 인코딩하는 유전자 및 TEM-1 β-락타마제를 인코딩하는 유전자로 구성된 서열번호 1의 플라스미드 pQS이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 쿼럼센싱 저해제를 스크리닝하기 위한 발현 벡터가 도입된 균주를 제공하는 것이다.

본 발명에서 용어 "도입"이란 형질전환 또는 형질도입에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질전환은 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등의 당 업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염 (infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.

바람직한 일 실시태양으로 상기 균주는 전술한 그람 음성 세균을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 대장균, 더욱 바람직하게는 2009년 10월 27일에 한국생명공학연구원 생물자원센터 (대전시 유성구 과학로 111)에 기탁한 서열번호 1의 pQS로 형질전환된 대장균인 기탁번호 KCTC 11579BP일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (i) 쿼럼센싱 저해제 스크리닝용 균주의 성장이 억제되는 아실 호모세린 락톤 및 항생제의 농도를 결정하는 단계; (ii) 상기 성장이 억제된 균주를 쿼럼센싱 저해제 후보물질과 접촉시키는 단계; 및 (iii) 상기 저해제 후보물질과 접촉된 균주가 상기 (i) 단계에서 결정된 농도 이상의 아실 호모세린 락톤 또는 결정된 농도 이상의 항생제 조건에서 자라는 경우, 상기 후보물질을 쿼럼센싱 저해제라고 판단하는 단계를 포함하는, 쿼럼센싱 저해제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서 용어 "쿼럼센싱 저해제 후보물질"이란 쿼럼센싱 기작을 다양한 단계에서 저해하여 쿼럼센싱이 원할하게 진행되지 못하도록 하는 물질을 의미하며, 화합물, 효소, 단백질 또는 핵산 등을 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "항생제"란 쿼럼센싱 저해제 스크리닝용 균주를 선별하기 위해 사용되는 항생제로 쿼럼센싱 저해제 스크리닝용 균주에 도입된 항생제 분해효 소의 표적이 되는 항생제를 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 β-락탐계 또는 비-β-락탐계의 항생제를 모두 포함하며, 분류체계에 따라 페니실린계, 세파계 (cephalosporin), 쿼놀론계 (quinolone), 또는 아미노글리코사이드계 (aminoglycoside)의 항생제를 모두 포함한다. 또한 목적에 따라 당업자에 의해 적절한 항생제가 선택되는 경우 선택된 항생제에 따라 본 발명의 벡터에 포함되는 항생제 분해효소를 인코딩하는 유전자 및 항생제 분해효소 저해 단백질을 인코딩하는 유전자를 적절하게 선택함으로써 발현 카세트를 제조할 수 있다. 바람직하게는 β-락탐 항생제, 더욱 바람직하게는 카베니실린일 수 있다.

본 발명의 쿼럼센싱 저해제 스크리닝 방법은 쿼럼센싱의 저해 정도를 항생제 저항성과 연계하여, 쿼럼센싱 저해 활성이 클수록 스크리닝 시스템으로 이용되는 숙주세포의 항생제 저항성이 증가하는 유전적 회로 (genetic circuit) 방식으로 고안되었다.

본 발명의 쿼럼센싱 저해제 스크리닝 방법의 개념도는 도 1에 나타낸 바와 같이, 전사조절 단백질이 아실 호모세린 락톤과 결합하여 쿼럼센싱 프로모터를 활성화하면 그 정도에 따라 프로모터 다운스트림에 연결된 β-락타마제 저해 단백질의 발현량이 조절된다. 쿼럼센싱이 원활하여, 발현되는 β-락타마제 저해 단백질의 양이 증가하면 β-락타마제의 항생제 분해 활성이 방해를 받아 균주가 항생제 환경에서 성장이 억제된다. 이러한 원리에 따라 쿼럼센싱이 원활하여 균주가 자라지 못하게 되는 아실 호모세린 락톤의 농도를 결정할 수 있게 된다. 반대로, 쿼럼센싱이 저해를 받아 β-락타마제 저해 단백질의 발현량이 적으면 β-락타마제의 항 생제 분해 활성이 유지되어 균주가 항생제에 저항성을 가지게 되어, 쿼럼센싱이 원할하여 균주가 자라지 못하는 아실 호모세린 락톤의 농도에서 균주가 자라게 된다.

따라서, 특정 후보 물질을 균주에 처리한 경우, 이러한 쿼럼센싱 회로 중 어느 하나의 경로를 방해할 수 있는 물질이라면, 해당 후보물질 처리에 의해 균주의 성장이 변화하게 되어 항생제에 대한 균주의 성장 분석을 통해 후보물질의 성질을 쉽게 선별할 수 있다. 가령, 신호물질인 아실 호모세린 락톤을 분해하는 효소나 단백질, 쿼럼센싱 전사조절 단백질에 결합하여 활성을 방해하는 길항제나 결합 단백질, 쿼럼센싱 프로모터에 특이적으로 결합하여 발현을 억제하는 단백질인 경우, 본 발명 균주의 성장이 증가하는 바, 해당 신호를 통해 가능한 모든 쿼럼센싱 저해제를 스크리닝 할 수 있다.

바람직한 일 실시태양으로 상기 쿼럼센싱 저해제 스크리닝용 균주는 쿼럼센싱 저해제 스크리닝하기 위한 발현 카세트로 이루어진 벡터가 형질전환된 균주를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 pQS가 형질전환된 대장균 균주일 수 있고, 더욱 바람직하게는 기탁번호 KCTC 11579BP인 균주를 사용할 수 있다.

바람직한 일 실시태양으로 본 발명은 상기 (i) 단계의 균주에 야생형 락토나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 추가로 도입시킬 수 있다. 이로 인해, 기존에 알려져 있던 쿼럼센싱 저해제로서, 아실 호모세린 락톤을 분해하는 효소인 야생형 락토나제가 도입된 균주의 성장이 억제되는 농도를 결정하여 스크리닝을 진행할 경우, 기존의 저해제보다 저해력이 높은 저해제를 스크리닝할 수 있다.

바람직한 일 실시태양으로, 상기 (ii) 단계의 쿼럼센싱 스크리닝용 균주를 쿼럼센싱 저해제 후보물질과 접촉시키는 방법은 본 발명의 유전적 회로에 영향을 미칠 수 있도록 후보물질을 처리하는 모든 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들면 저해제 후보물질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 상기 균주에 도입시키거나 저해제 후보물질을 상기 균주의 배지에 처리하는 방법 등을 사용할 수 있다.

바람직한 일 실시태양으로 본 발명은 상기 (ii) 단계의 쿼럼센싱 저해제 후보물질과 접촉시키는 방법은 쿼럼센싱 저해제인 락토나제 (lactonase) 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 도입시켜서, 상기 (iii) 단계의 균주가 상기 (i) 단계에서 조절된 농도 이상에서 자라는 경우, 상기 선별된 락토나제 변이체를 개선된 쿼럼센싱 저해제라고 판단하는 단계를 포함하는, 쿼럼센싱 저해제의 스크리닝 방법일 수 있다.

본 발명의 쿼럼센싱 저해제 스크리닝 방법은 아실 호모세린 락톤 혹은 β-락탐 항생제의 농도를 다르게 하여, 쿼럼센싱 정도에 따른 균주의 항생제 민감도를 조절하면, 아실 호모세린 락톤과 β-락탐 항생제의 농도가 높을수록 쿼럼센싱 저해력이 높은 저해제를 가진 균주만이 성장할 수 있으므로 이를 이용해 보다 우수한 저해제를 스크리닝할 수 있다.

본 발명자들은 바람직한 일 실시예에서, 쿼럼센싱 저해제 스크리닝용 균주를 비브리오 피셔리의 쿼럼센싱 전사조절 단백질인 LuxR을 인코딩하는 유전자, 이에 의해 전사가 조절되는 LuxI 프로모터, 스트렙토마이시스 크라뷰리거러스 (Streptomyces clavuligerus) 유래의 TEM-1 β-락타마제를 인코딩하는 유전자 및 이의 표적인 β-락타마제 저해 단백질을 인코딩하는 유전자로 이루어진 서열번호 1의 pQS 벡터 (도 2)를 대장균 DH5α에 형질전환하여 기탁번호 KCTC 11579BP로 기탁한 균주를 제작하였다. 그 후, 다양한 헥사노일 호모세린 락톤을 처리하여, 락톤 농도가 높아질수록 쿼럼센싱이 활발하게 일어나 β-락타마제가 저해를 받아 락톤 농도 10 nM 이상인 쿼럼센싱 수준에서 균주의 성장이 억제되는 것을 확인하였다 (도 3). 이에 본 발명자들은 쿼럼센싱 저해제가 존재하면 상기 락톤 농도에서 균주가 자랄 것이라고 예상하고 발현 벡터인 서열번호 4의 pPROTrc2를 제작하였다. 구체적으로, MCS (muticlonig site)의 NocI 및 HindIII 부위로 기존에 아실 호모세린 락톤을 분해하는 가수분해효소이며 쿼럼센싱 저해제로 알려진 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) 유래의 락토나제를 삽입하였고, 상기 방법에 의해 제작된 벡터인 락토나제가 포함된 pPROTrc2를 상기 균주에 형질전환하는 한편 (도 4), 형질전환된 균주에 다양한 농도의 헥사노일 호모세린 락톤을 처리하여 락토나제가 없을 경우 자라지 못하던 10 nM 이상의 농도에서 상기 균주가 자라는 것을 확인하였다 (도 5). 상기와 같은 실험으로부터 본 발명의 스크리닝 균주 및 스크리닝 방법이 쿼럼센싱 저해제를 효과적으로 스크리닝할 수 있음을 검증하였으며, 이는 저해제의 유무에 따른 균주의 생장 유무가 달라지게 되는 적절한 아실 호모세린 락톤 농도를 결정하고, 해당 농도에서 생장하는 균주를 선별하는 간단한 과정을 통하여 쿼럼센싱 저해제의 스크리닝이 가능함을 확인한 것이다.

또한, 본 발명자들은 바람직한 일 실시예에서, 기존의 바실러스 투린지엔시 스 락토나제의 락톤 분해 활성이 헥사노일 호모세린 락톤에 대해 k_cat/K_M = 1.0×10⁴ M^-1s^-1 수준으로 낮은 편이며 아실기의 길이와 모양이 다른 다양한 락톤에 대해서도 비슷한 수준의 활성을 갖고 있어서 상기 락토나제를 개선하고자 실험을 수행하였다. 야생형 락토나제를 가진 균주는 자라지 않으면서 활성이 개선된 락토나제 변이체를 가진 숙주세포는 자랄 수 있는 아실 호모세린 락톤 농도를 정하기 위해, 락토나제의 균주 내 발현량을 최소화하도록 라이브러리용 벡터 플라스미드로 낮은 복제수와 약한 발현 프로모터를 가진 서열번호 10의 pZS*24DNluc를 제작하고 상기 벡터를 NcoI 및 XbaI을 처리하여 야생형 락토나제를 삽입한 벡터 락토나제/pZS*24DN을 기탁번호 KCTC 11579BP인 균주에 형질 전환하여 헥사노일 호모세린 락톤 농도 100 nM이 성장 한계 농도임을 확인하였다 (도 6). 그 후 상기 서열번호 10의 pZS*24DNluc를 다양하게 돌연변이시킨 락토나제 변이체를 삽입하여 기탁번호 KCTC 11579BP인 균주에 형질전환하여 다양한 아미노산 서열로 변이된 락토나제 변이체 라이브러리를 구축하고, 상기 성장 한계 농도인 100 nM 이상인 1μM의 헥사노일 호모세린 락톤에서 성장하는 균주를 스크리닝하여 두 개의 변이체를 확인하였고, 염기서열 분석을 통해 그 중 하나는 효소 활성부위에서 기질인 아실 호모세린 락톤의 아실기가 향하는 위치 근처의 69번 아미노산 Val (Valine, V)이 Leu (Leucine, L)으로 치환되었음을 확인하고 변이체 V69L이라고 명명하였다 (서열번호 13). 또한, 나머지 하나는 효소 활성부위에서 기질인 아실 호모세린 락톤의 아실기가 향하는 위치 근처의 69번 아미노산 Val이 Leu으로, 190번 아미노산 Ile (Isoleucine, I)이 Phe (Phenylalanine, F)으로 치환되었음을 확인하고 변이체 V69L/I190F이라고 명명하였다 (서열번호 14). 각각의 변이체가 야생형 균주보다 더 높은 락톤 농도에서 성장할 수 있음을 확인하였을 뿐만 아니라 (도 7 및 도 8), 변이체 V69L의 활성이 헥사노일 호모세린 락톤에 대해 k_cat/K_M=3.5×10⁴ M^-1s^-1 수준으로 야생형과 대비하여 3배 정도 증가하였고, 변이체 V69L/I190F의 활성이 헥사노일 호모세린 락톤에 대해 k_cat/K_M=5.5×10⁴ M^-1s^-1 수준으로 야생형과 대비하여 5배 이상 증가했음을 확인하여서 본 발명의 스크리닝 방법이 종래의 저해제를 보다 우수하게 개선한 저해제를 스크리닝할 수 있음을 확인하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 스크리닝 방법으로 스크리닝 된 쿼럼센싱 저해제를 제공한다.

바람직한 일 실시태양으로 상기 쿼럼센싱 저해제는 화합물, 효소, 단백질 또는 핵산일 수 있으며, 바람직하게는 기존의 저해제인 야생형 바실러스 투린지엔시스 락토나제의 69번 아미노산 Val이 Leu으로 치환된 서열번호 13의 락토나제 변이체 V69L, 또는 기존의 저해제인 야생형 바실러스 투린지엔시스 락토나제의 69번 아미노산 Val이 Leu으로, 190번 아미노산 Ile이 Phe으로 각각 치환된 서열번호 14의 락토나제 변이체 V69L/I190F이다.

본 발명의 쿼럼센싱 저해제의 스크리닝 방법을 사용할 경우, 숙주세포의 항생제에 대한 성장 분석을 통해 쉽게 쿼럼센싱 저해제를 선별할 수 있으며, 대량의 화학물 라이브러리, 메타지놈 라이브러리, 변이체 라이브러리 및 인위적인 각종 유전체 라이브러리 등에서 쿼럼센싱 저해 효과를 지닌 화학물, 효소 혹은 단백질을 손쉽게 스크리닝할 수 있고, 개선된 저해제를 스크리닝할 수 있다.

또한, 본 발명의 쿼럼센싱 저해제를 스크리닝하는 방법은 의약용 감염성 질병 치료제 및 산업용 향균제 개발에 광범위하게 활용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않으며 다양한 응용 및 수정이 가능하다.

실시예 1 : 쿼럼센싱 저해 선별 시스템 설계 및 구축

발명의 구성요소로서 쿼럼센싱 전사조절 단백질과 쿼럼센싱 프로모터는 비브리오 피셔리 (Vibrio fischeri)의 쿼럼센싱 전사조절단백질인 LuxR 단백질과 LuxI 프로모터를 각각 이용하였다. 또한 스트렙토마이시스 크라뷰리거러스 (Streptomyces clavuligerus) 유래의 β-락타마제 저해 단백질 (β-lactamase inhibitor protein, BLIP)과 그것의 타깃으로서 TEM-1 β-락타마제를 이용하여 도 2와 같은 플라스미드를 제작하여 pQS로 명명하였다. β-락타마제와 LuxR 단백질은 발현량은 일정하게 유지되며, β-락타마제 저해 단백질은 LuxI 프로모터에 의해 발현량이 조절된다. 제작된 플라스미드 pQS의 서열을 서열번호 1로 표기하였다.

숙주세포로서 대장균 DH5α를 사용하여 상기의 플라스미드에 의한 쿼럼센싱 회로를 구현하였으며, 서열번호 1의 pQS로 형질전환된 대장균을 Escherichia coli DH5＠/pQS로 명명하였고, 2009년 10월 27일에 생명공학연구원 생물자원센터 (대전시 유성구 과학로 111)에 기탁번호 KCTC 11579BP로 기탁하였다. 아실 호모세린 락톤의 하나인 헥사노일 호모세린 락톤 (Hexanoyl-L-homo serine lactone, C6-L-HSL)을 신호물질로, 카베니실린 (Carbenicillin)을 β-락탐 항생제로서 사용하였다. 다양한 농도의 C6-L-HSL, 100㎍/㎖의 카베니실린이 포함된 LB 고체 배지에서 30℃, 2일간 배양하였을 때 대장균은 도 3과 같은 생장패턴을 보였다. 즉, 락톤 농도가 점차 높아질수록 쿼럼센싱은 더욱 활발하게 일어나고 이에 따라 β-락타마제가 점점 더 저해를 받게 되며 락톤 농도가 10 nM 이상일 때의 쿼럼센싱 수준에서는 대장균 숙주세포는 더 이상 자라지 못하게 된다. 만일 쿼럼센싱을 방해하는 저해제가 존재할 경우 그 저해 정도에 따라 대장균 숙주세포가 자라지 않던 높은 농도의 락톤 농도에서도 대장균 숙주세포가 자라게 된다.

실시예 2 : 쿼럼센싱 저해제인 바실러스 투린지엔시스 ( Bacillus thuringiensis ) 유래 락토나제 ( Lactonase )를 통한 쿼럼센싱 선별 시스템의 검증

바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) 유래 락토나제 (Lactonase)는 아실 호모세린 락톤을 분해하는 가수분해 효소로서 의학적 산업적 가치가 높은 쿼럼센싱 저해 단백질이다 (서열번호 5, PNAS. 2005, 102, 17609-17611). 상기 실시예 1에서 설계된 쿼럼센싱 저해 선별 시스템에 이 효소를 도입하여 쿼럼센싱의 저해 효과를 검증하였다.

1) 락토나제 발현용 벡터 제작

대장균 숙주세포 내 락토나제 도입, 발현을 위해 사용된 벡터 플라스미드는 Trc 프로모터와 멀티클로닝사이트 (MCS), 카나마이신 저항 유전자, Col E1 복제 오리진 (Replication origin)을 가지는 것을 특징으로 하며 다음과 같은 방식으로 제작되었다.

Trc 프로모터 및 MCS :

표현발현 벡터 pTrc99A의 Trc 프로모터와 MCS 부분, 전사종결서열 부분을 주형으로 AatII의 절단부위를 가진 프라이머 (서열번호 2)와 AvrII의 절단부위를 가진 프라이머 (서열번호 3)을 사용한 PCR (95℃ 4 분/ 95℃ 1 분; 55℃ 30 초; 72℃ 50 초; 20 사이클/ 72℃ 1 분)을 통해 해당 서열 부분을 증폭하였다. 그 후, 제한효소 AatII와 AvrII를 이용하여 증폭된 유전자 서열의 양 끝단을 절단하였다.

카나마이신 저항 유전자 :

표현발현 벡터 pPROLar.A122 (Clontech)의 카나마이신 저항 유전자가 포함된 서열을 SacI과 AatII 절단부위를 이용해 제한효소로 절단, 분리하였다.

Col E1 복제 오리진 :

표현발현 벡터 pPROTet.E133 (Clontech)의 Col E1 복제 오리진이 포함된 서열을 AvrII와 SacI 절단부위를 이용해 제한효소로 절단, 분리하였다.

상기 과정을 통해 얻은 세 개의 서열을 리가아제 (Ligase) 반응을 통해 연결하여 표현발현 벡터 플라스미드를 제작하였으며 pPROTrc2로 명명하였다 (서열번호 4).

2) 쿼럼센싱 저해 분석을 위한 락토나제 유전자 삽입

바실러스 투린지엔시스 락토나제는 NcoI의 절단부위를 가진 N-말단 프라이머 (서열번호 6)와 HindIII의 절단부위를 가진 C-말단 프라이머 (서열번호 7)를 사용한 PCR (95℃ 3 분/ 95℃ 1 분; 55℃ 30 초; 72℃ 50 초; 25 사이클/ 72℃ 1 분), 및 NcoI 및 HindIII 제한효소처리를 통해 플라스미드 pPROTrc2의 멀티 클로닝 사이트에 삽입하였다.

3) 락토나제에 의한 쿼럼센싱 저해 효과 검증

상기에서 제작된 락토나제가 포함된 pPROTrc2 플라스미드를 쿼럼센싱 저해 선별 플라스미드 pQS와 함께 대장균 숙주세포 DH5α에 넣었다 (도 4). 그 후, 다양한 농도의 C6-L-HSL, 100 ㎍/㎖ 카베니실린, 50 ㎍/㎖의 카나마이신, 0.1 mM ZnSO₄가 포함된 LB 고체 배지에서 30℃, 2 일간 배양하였을 때 숙주세포는 도 5와 같은 생장패턴을 보였다. 즉, 저해제가 없는 경우 숙주세포가 자랄 수 없는 쿼럼센싱 수준 (C6-L-HSL 10 nM 이상)에서 저해제인 락토나제가 발현되었을 때 숙주세포가 성장할 수 있음을 보여준다.

이는 저해제의 유무에 따라 숙주세포의 생장 유무가 달라지게 되는 적절한 아실 호모세린 락톤 농도를 정하고 그 농도에서 생장하는 숙주세포를 고르는 간단한 과정을 통해 쿼럼센싱 저해제의 선별이 가능함을 보여주는 예시라 할 수 있다. 가령, 상기와 같은 조건에서 C6-L-HSL의 농도가 10 nM 이상인 농도, 100 nM, 1μM 등에서 자라는 대장균 숙주세포의 경우 쿼럼센싱 저해제를 포함하고 있다고 할 수 있다. 또한 이는 락토나제에 한정되지 않고 쿼럼센싱을 방해하는 모든 저해제에도 적용가능하다.

실시예 3 : 방향적 진화( Directed evolution )에 의해 활성이 개선된 락토나제( Lactonase )의 선별 및 개량

본 발명의 쿼럼센싱 저해 선별 시스템에서는 아실 호모세린 락톤 혹은 β-락 탐 항생제의 농도를 다르게 함으로써, 쿼럼센싱 정도에 따른 숙주세포의 항생제 민감도를 조절할 수 있다. 아실 호모세린 락톤과 β-락탐 항생제의 농도가 높을수록 쿼럼센싱 저해력이 높은 저해제를 가진 숙주세포만이 성장할 수 있으므로 이를 이용하면 보다 우수한 저해제를 선별, 개량할 수 있다.

기존의 바실러스 투린지엔시스 락토나제는 락톤 분해 활성이 헥사노일 호모세린 락톤 (C6-L-HSL)에 대해 k_cat/K_M = 1.0×10⁴ M^-1s^-1 수준으로 낮은 편이며, 아실기의 길이와 모양이 다른 다양한 락톤에 대해서도 비슷한 수준의 활성을 가진다. 활성 및 기질특이성이 뛰어난 쿼럼센싱 저해 효소는 효과적인 감염성 질병 치료 후보물질이다. 이에 본 발명의 쿼럼센싱 저해 선별 시스템을 이용하여 락토나제의 활성을 개선하였다.

1) 락토나제 라이브러리용 벡터 플라스미드

야생형 (Wild type) 락토나제를 가진 숙주세포는 자라지 않으면서, 활성이 개선된 락토나제 변이체를 가진 숙주세포는 자랄 수 있는 아실 호모세린 락톤 농도를 정하기 위하여 우선, 락토나제의 숙주세포 내 발현량을 최소화할 필요가 있다. 따라서 라이브러리용 벡터 플라스미드로 낮은 복제수 (Copy number)와 약한 발현 프로모터를 가진 pZS*24luc 플라스미드 (Expressys)를 사용하였다.

pZS*24luc 플라스미드 전체를 주형으로 서열번호 8과 서열번호 9의 프라이머와 PrimeStar™ HS 중합효소 (polymerase) (TaKaRa)를 이용해 PCR 증폭 (95℃ 5 분/ 95℃ 1 분; 55℃ 1 분; 72℃ 6 분; 20 사이클/ 72℃ 6 분) 하여 pZS*24luc 내의 카나마이신 저항 유전자 서열에 있는 NcoI 절단부위인 5'-CCATGG-3'를 5'-CCGTGG-3'로 바꾸어 제거하였으며, 이렇게 만들어진 플라스미드는 pZS*24DNluc로 명명하였다 (서열번호 10).

락토나제는 NcoI의 절단부위를 가진 N-말단 프라이머 (서열번호 11)과 XbaI의 절단부위를 가진 C-말단 프라이머 (서열번호 12)를 사용한 PCR (95℃ 3 분 / 95℃ 1 분; 55℃ 30 초; 72℃ 30 초; 25 사이클/ 72℃ 1 분), 및 NcoI 및 XbaI 제한효소처리를 통해 플라스미드 pZS*24DNluc에서 루시퍼라제 유전자를 대체하여 삽입하였다. 이를 락토나제/pZS*24DN으로 명명하였다.

야생형 락토나제/pZS*24DN과 쿼럼센싱 저해 선별 플라스미드 pQS가 함께 형질 전환된 대장균 DH5α의 성장한계농도는 C6-L-HSL 100 nM임을 보였다 (도 6). pPROTrc2를 발현 벡터로 사용한 상기 실시예 2의 경우보다 더 낮은 락톤 농도까지만 숙주세포가 자라는 것은 pZS*24DN에서의 락토나제 발현량이 pPROTrc2를 사용한 경우보다 적기 때문이다.

본 발명의 쿼럼센싱 저해 선별 시스템에서 야생형 락토나제보다 활성이 증가 된 변이체의 경우는 야생형보다 더 높은 락톤 농도에서 숙주세포가 자랄 수 있을 것이다.

2) 락토나제 변이체 라이브러리 제작

락토나제 변이체는 중합효소 중 정확도가 떨어지는 Taq 중합효소를 사용하고, 반응 구성 성분 중의 MgCl₂, MnCl₂, dNTP를 조절함으로써 증폭의 정확성을 떨어뜨려 임의의 부위에서 유전자의 돌연변이가 일어나게끔 에러-프론 PCR (error-prone PCR) 반응을 통해 제작하였다. 반응 조건은, 야생형 락토나제 유전자 주형 (~1pg), 1×Taq 중합효소 버퍼 (75 mM Tris-HCl, pH8.8, 20 mM (NH₄)₂SO₄, 0.01 % (v/v) Tween 20, 1.25 mM MgCl₂), dNTP (dATP 및 dGTP, 1.0 mM; dCTP 및 dTTP, 0.2 mM), 5.5 mM MgCl₂, 0.1 mM MnCl₂, 2.5 U Taq 중합효소, 100 pmol N-말단 프라이머 (서열번호 11)와 C-말단 프라이머 (서열번호 12)이다.

상기와 같은 과정을 통해 얻어진 락토나제 변이 유전자들은 양 말단을 제한효소인 NcoI과 XbaI으로 절단하여 발현 벡터 pZS*24DN에 클로닝하고 pQS를 이미 가지고 있는 대장균 DH5α에 형질 전환시켜 다양한 아미노산 서열로 변이된 락토나제 변이체 라이브러리를 구축하였다.

3) 활성이 개선된 락토나제 변이체 선별 및 개량

상기에서 제작된 변이체 라이브러리를 야생형 락토나제를 가진 대장균의 경우에는 자랄 수 없는 조건 (LB 고체 배지, C6-L-HSL 1μM, 100 ㎍/㎖의 카베니실린, 30 ㎍/㎖의 카나마이신, 0.1 mM ZnSO₄)에서 30℃, 2 일간 배양하여 자라나는 대장균을 골라내었다. 가양성 (False positive) 변이체를 제거하기 위하여, 자라난 대장균에서 락토나제 변이체/pZS*24DN 플라스미드를 다시 추출하였고 이를 다시 pQS 포함 대장균에 넣는 과정(retransformation)의 반복을 통해 5×10⁵가지의 락토나제 변이체 라이브러리에서 두 개의 변이체를 찾았다.

염기서열 분석을 통해 상기 변이체들 중 하나는 효소 활성부위에서 기질인 아실 호모세린 락톤의 아실기가 향하는 위치 근처의 69번 아미노산 Val이 Leu으로 치환되어 있음을 확인하였고, 이를 변이체 V69L이라고 명명하였다 (서열번호 13). 또한, 나머지 하나의 변이체는 69번 아미노산 Val이 Leu으로 190번 아미노산 Ile이 Phe으로 치환되었음을 확인하였고, 이를 변이체 V69L/I190F이라고 명명하였다 (서열번호 14). 야생형 락토나제와 비교하여 각각의 변이체들인 변이체 V69L, V69L/I190F 락토나제를 가진 대장균 숙주세포들이 더 높은 락톤 농도에서 성장할 수 있음을 확인하였으며 (도 7 및 도 8), 변이체 V69L의 활성은 C6-L-HSL에 대해서 k_cat/K_M=3.5×10⁴ M^-1s^-1 수준으로 야생형과 대비하여 3배 정도 증가하였고, 변이체 V69L/I190F의 활성은 C6-L-HSL에 대해서 k_cat/K_M=5.5×10⁴ M^-1s^-1 수준으로 야생형과 대비하여 5배 이상 증가했음을 확인하였다.

도 1은 본 발명에 의한 쿼럼센싱 저해제 선별을 위해 설계된 쿼럼센싱 회로도를 간략히 도시화한 것이다.

도 2는 도 1의 회로를 구현하기 위해 제작된 쿼럼센싱 저해 선별 플라스미드 pQS를 간략히 도시화한 것이다.

도 3은 도 2의 플라스미드 pQS가 형질전환된 대장균 숙주세포의 C6-L-HSL 농도에 따른 성장패턴을 보여주는 것이다.

도 4는 쿼럼센싱 저해제로서 락토나제를 발현하는 플라스미드와 쿼럼센싱 저해 선별 플라스미드가 함께 대장균에 형질전환된 것을 간략히 도시화한 것이다.

도 5는 쿼럼센싱 저해제인 락토나제의 유?무에 따른 대장균 숙주세포의 C6-L-HSL 농도에 따른 다른 성장패턴을 보여주는 것이다.

도 6은 약한 발현 벡터인 pZS*24DN 벡터에 클로닝된 락토나제가 형질전환된 대장균 숙주세포의 C6-L-HSL 농도에 따른 성장패턴을 보여주는 것이다.

도 7은 야생형 락토나제와 활성이 개선된 락토나제 변이체 V69L을 가진 대장 균 숙주세포의 C6-L-HSL 농도에 따른 다른 성장패턴을 보여주는 것이다.

도 8은 야생형 락토나제와 활성이 개선된 락토나제 변이체 V69L/I190F를 가진 대장균 숙주세포의 C6-L-HSL 농도에 따른 다른 성장패턴을 보여주는 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Method for Screening of Quorum Sensing Inhibitors <130> PA090398/KR <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 4296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pQS plasmid <400> 1 gacgtcagtc ctttgattct aataaattgg atttttgtca cactattgta tcgctgggaa 60 tacaattact taacataagc acctgtagga tcgtacaggt ttacgcaaga aaatggtttg 120 ttatagtcga ataaacgcaa gggaggttgg tatgctttta tataaaatgt gtgacaatca 180 aaattatggg gttacttaca tgaagttttt attggcattt tcgcttttaa taccatccgt 240 ggtttttgca agtagtgcag gtgttatgac aggagcaaaa ttcacgcaga tccagtttgg 300 tatgacacgt cagcaggtcc tcgacatagc aggtgctgag aactgtgaga ctggtggatc 360 gttcggtgac agcatccatt gtcgtggaca tgcagcagga gactattatg catacgcaac 420 cttcggcttc accagcgcag ctgcagacgc aaaggtggat tcgaaaagcc aggaaaaact 480 gcttgcacca agcgcaccaa ctcttactct tgctaagttc aaccaagtca ctgttggtat 540 gactagagca caagtacttg ctaccgtcgg acagggttct tgtaccactt ggagtgagta 600 ctatccagca tatccatcga cggcaggagt gactctcagc 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tgcgtgcaat ccatcttgtt caatcatgcg aaacgatcct 5460 catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc agatccttgg cggcaagaaa 5520 gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag agggcgcccc agctggcaat 5580 tcc 5583 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Lactonase variant <400> 11 aataccatgg gaacagtaaa gaaactttat ttc 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Lactonase variant <400> 12 aatatctaga ttatatatat tccgggaaca ctc 33 <210> 13 <211> 753 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus thuringiensis Lactonase variant V69L <400> 13 atgacagtaa agaaacttta tttcatccca gcaggtcgtt gcatgttgga tcattcgtct 60 gttaacagtg cgttaacacc ggggaaacta ttaaacttgc cggtgtggtg ttatcttttg 120 gagacggaag aaggtcctat tttagtagac acaggtatgc cagaaagtgc agttaataat 180 gaagggcttt ttaacggtac atttcttgaa ggacagatct taccgaaaat gactgaagaa 240 gatagaatcg tgaatatatt aaagcgtgta gggtatgagc cggacgacct tttatatatt 300 attagttctc acttacattt 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Claims (16)

1. (i) 아실 호모세린 락톤을 인식하여 결합하는 LasR 단백질, RhlR 단백질, CepR 단백질, SwrR 단백질, AhyR 단백질, VanR 단백질, ExpR 단백질, CarR 단백질, TraR 단백질 및 LuxR 단백질로 구성된 군에서 선택된 하나의 전사조절 단백질을 인코딩하는 유전자;

   (ii) 상기 전사조절 단백질에 의해 전사가 조절되는 LasI 프로모터, RhlI 프로모터, CepI 프로모터, SwrI 프로모터, AhyI 프로모터, VanI 프로모터, ExpI 프로모터, CarI 프로모터, TraI 프로모터 및 LuxI 프로모터로 구성된 군에서 선택된 하나의 프로모터 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 β-락타마제 저해 단백질(β-lactamase inhibitor protein, BLIP)을 인코딩하는 유전자; 및

   (iii) 상기 β-락타마제 저해 단백질에 의해 활성이 저해되는 β-락타마제를 인코딩하는 유전자를 포함하는, 쿼럼센싱 저해제를 스크리닝하기 위한 발현 카세트로 이루어진 벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 β-락타마제는 TEM-1 β-락타마제인 벡터.
3. 제1항에 있어서, 상기 전사조절 단백질은 LuxR 이며, 상기 프로모터는 LuxI 프로모터인 벡터.
4. 제3항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 1의 플라스미드 pQS인 벡터.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 벡터가 도입된 균주.
6. 제5항에 있어서, 상기 균주는 그람 음성 세균인 균주.
7. 제6항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCTC 11579BP인 균주.
8. (i) 제1항의 벡터가 도입된 균주의 성장이 억제되는 아실 호모세린 락톤 및 항생제의 농도를 결정하는 단계;

   (ii) 상기 성장이 억제된 균주를 쿼럼센싱 저해제 후보물질과 접촉시키는 단계; 및

   (iii) 상기 저해제 후보물질과 접촉된 균주가 상기 (i) 단계에서 결정된 농도 이상의 아실 호모세린 락톤 또는 상기 결정된 농도 이상의 항생제 조건에서 자라는 경우, 상기 후보물질을 쿼럼센싱 저해제로 판단하는 단계를 포함하는, 쿼럼센싱 저해제의 스크리닝 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCTC 11579BP인 균주인 스크리닝 방법.
10. 제8항에 있어서, 상기 (ii) 단계의 쿼럼센싱 저해제 후보물질과 접촉시키는 방법은 저해제 후보물질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 상기 균주에 도입시키거나 저해제 후보물질을 상기 균주의 배지에 처리하는 방법인 스크리닝 방법.
11. 제8항에 있어서, 상기 (i) 단계에 야생형 락토나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 추가로 도입시키는 것을 포함하는 스크리닝 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 (ii) 단계의 쿼럼센싱 저해제 후보물질과 접촉시키는 방법은 쿼럼센싱 저해제인 락토나제 (lactonase) 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 상기 균주에 도입시키는 것을 포함하는 스크리닝 방법.
13. 삭제
14. 삭제
15. 서열번호 13의 락토나제 변이체 V69L인 쿼럼센싱 저해제.
16. 서열번호 14의 락토나제 변이체 V69L/I190F인 쿼럼센싱 저해제.

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