CN112746083A - 一种通过单碱基编辑靶基因启动子失活基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过单碱基编辑靶基因启动子失活基因的方法，所述靶基因的启动子区域包含5’非翻译区(5’UTR)，所述方法包括，向靶细胞中导入靶向所述靶基因启动子的5’UTR区域的单碱基编辑系统；使靶基因产生1个或多个上游开放阅读框(uORF)从而导致靶基因失活。本发明具有不引发DNA双链断裂，精确高效以及对靶基因mRNA水平影响小等优点。

Description

一种通过单碱基编辑靶基因启动子失活基因的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域。具体涉及一种通过单碱基编辑靶基因启动子失活基因的方法及应用。

技术背景

基因功能性缺失(Loss of function)是研究基因功能的重要手段，也是理解生命活动，开发新药和进行动植物种质创新的基础途径。常规的使基因失活的方法主要包括EMS诱变和T-DNA随机插入。然而，此二者有着筛选工作强度高，所需实验空间大以及靶向性差等缺点，令多数研究者望而却步。近年来，随着以CRISPR/Cas9系统为代表的、高效精确的基因编辑工具迅速出现以及广泛应用，生物基因功能的研究获得了长足发展。该系统主要由核酸酶Cas9以及向导RNA (sgRNA)组成。在sgRNA的引导下，Cas9结合于目标基因位点处并行使核酸酶功能，产生DNA双链断裂，然后由宿主细胞内源修复机制带来突变。尽管如此，近期一些在哺乳动物细胞中的研究表明，由 CRISPR/Cas9基因编辑系统引发的DNA双链断裂，可能会导致如p53 通路的激活以及基因组大片段的倒置、易位和缺失等难以预料的后果。

上游开放阅读框(uORF)是存在于真核生物基因编码区前，通常被认为属于启动子区域的5’非翻译区(5‘UTR)中可能会发生翻译事件的开放阅读框(ORF)。诸多的研究证据表明，uORF是真核生物应对外界生物和非生物胁迫，调节关键蛋白质翻译的重要着力点。有研究报道，约35％的拟南芥mRNA和超过一半的人类mRNA至少含有一种序列上被确认的uORF。并且，uORF被发现通常会抑制主效开放阅读框(mORF)的翻译。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种通过单碱基编辑靶基因启动子失活基因的方法及应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种通过单碱基编辑靶基因启动子失活基因的方法，所述靶基因的启动子区域包含5’非翻译区(5’UTR)，所述方法包括，向靶细胞中导入靶向所述靶基因启动子的5’UTR区域的单碱基编辑系统；使靶基因产生1个或多个上游开放阅读框(uORF)从而导致靶基因失活。

需要说明的是，其中导入靶向所述靶基因启动子的5’UTR区域的单碱基编辑系统包括基于CRISPR/Cas9系统的胞嘧啶单碱基系统 (CBEs)、腺嘌呤单碱基编辑系统(ABEs)以及先导编辑系统(PEs)。

“CRISPR/Cas9系统”指的是由细菌免疫系统CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)/Cas9发展而来的基因组编辑系统。它包含核酸酶Cas9以及向导RNA。核酸酶Cas9在向导RNA的引导下，靶向结合并且切割目标DNA序列，形成DNA双链断裂(DSB)。适用于本发明的CRISPR/Cas9基因编辑系统包括但不限于发表于Li，JF.et al. Multiplex andhomologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotianabenthamiana using guide RNA and Cas9.Nature biotechnology，31，688–69，2013的系统。

在本发明中，“sgRNA”和“向导RNA”可互换使用，指的是能与CRISPR/Cas9形成蛋白核酸复合物并将复合物靶向靶序列的具有发卡结构的RNA分子。一般地，决定向导RNA特异性的是其5’端的 20个碱基。

“单碱基编辑系统”指的是近年来基于CRISPR/Cas9系统开发而成的，可对生物体基因组上的单个碱基序列编辑替换的系统。单碱基系统使用的是核酸酶部分失活的nCas9(D10A)蛋白与胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶的融合蛋白，称为胞嘧啶或腺嘌呤单碱基编辑器。在向导RNA的引导下，nCas9(D10A)负责结合到靶标DNA上，由于其核酸酶活性部分缺失，其仅能切割靶标DNA的一条链，而不能形成双链断裂。随后，胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶催化靶标DNA上特定位置的 C胞嘧啶碱基或A腺嘌呤碱基脱氨基化形成U尿嘧啶碱基或I次黄嘌呤碱基。在细胞内源DNA修复机制的作用下，U尿嘧啶碱基或I次黄嘌呤碱基被修复为T胸腺嘧啶碱基或G鸟嘌呤碱基。最终实现了C 或A到T或G的碱基替换。

常用的胞嘧啶脱氨酶包括并不限于来自大鼠的rAPOBEC1、来自七鳃鳗的PmCDA1、来自人的hAID、来自人的hAPOBEC3A、来自人的 hAPOBEC3B、来自人的hAPOBEC3G。胞嘧啶单碱基编辑器除了含有 nCas9(D10A)和胞嘧啶脱氨酶，经常还包含有拷贝数不等的尿嘧啶糖苷酶抑制子(UGI)蛋白。

常用的腺嘌呤脱氨酶包括并不限于大肠杆菌tRNA腺嘌呤脱氨酶 TadA(ecTadA)的变体，特别是以单链DNA作为底物的变体，包括TadA- 7.10和TadA-8e。适用于本发明的CRISPR/Cas9衍生的单碱基编辑系统包括但不限于发表于于Zong，Y.et al.Precise baseediting in rice,wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion.Naturebiotechnology，35，438-440，2017的系统。

先导编辑系统(PEs)通常包括融合有莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV RT)变体的nCas9(H840A)缺刻酶以及先导延长向导 RNA(pegRNA)，PE2或者PE3(b)是现在最常用的先导编辑系统。其能在pegRNA的引导下，通过M-MLV反转录酶变体的反转录作用，以pegRNA延长出来的骨架为模板合成DNA序列，同时随着nCas9(H840A) 缺刻酶的单链切割作用，促进了特定新DNA序列的整合，最后达到使靶标序列特定区域的单个碱基的随意替换和小片段增加或删除。适用于本发明的CRISPR/Cas9衍生的先导编辑系统系统包括但不限于发表于于Lin，Q.et al.Prime genome editing in rice and wheat. Naturebiotechnology，38，582-585，2020的系统。

本发明所述的单碱基编辑系统可以包含以下之一：

i)核酸酶部分失活的Cas9蛋白和胞苷(腺苷)脱氨酶的融合蛋白，和向导RNA；

ii)包含编码核酸酶部分失活的Cas9蛋白和胞苷(腺苷)脱氨酶的融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和向导RNA；

iii)核酸酶部分失活的Cas9蛋白和胞苷(腺苷)脱氨酶的融合蛋白，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

iv)包含编码核酸酶部分失活的Cas9蛋白和胞苷(腺苷)脱氨酶的融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

或v)包含编码核酸酶部分失活的Cas9蛋白和胞苷(腺苷)脱氨酶的融合蛋白的核苷酸序列和编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体。

在一些实施方案中，所述编码核酸酶部分失活的Cas9蛋白相对于野生型Cas9(化脓链球菌SpCas9)包含氨基酸取代D10A。所述胞苷脱氨酶的实例包括但不限于：APOBEC1脱氨酶、激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)、APOBEC3G或CDA1。

在一些优选实施方案中，所述胞苷脱氨酶为来源于人类的激活诱导的胞苷脱氨酶(hAID)及其变体。

本发明所述的先导编辑系统可以包含以下之一：

i)核酸酶部分失活的Cas9蛋白和逆转录酶的融合蛋白，和先导延长向导RNA(pegRNA)；

ii)包含编码核酸酶部分失活的Cas9蛋白和逆转录酶的融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和先导延长向导RNA；

iii)核酸酶部分失活的Cas9蛋白和逆转录酶的融合蛋白，和包含编码先导延长向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

iv)包含编码核酸酶部分失活的Cas9蛋白和逆转录酶的融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码先导延长向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

或v)包含编码核酸酶部分失活的Cas9蛋白和逆转录酶的融合蛋白的核苷酸序列和编码先导延长向导RNA的核苷酸序列的表达构建体。

在一些实施方案中，所述核酸酶部分失活的Cas9蛋白相对于野生型Cas9(化脓链球菌SpCas9)包含氨基酸取代H840A。所述逆转录酶的实例包括但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV RT) 及其变体。

需要说明的是，通过靶位点上单个碱基的替换，使所述靶点产生强翻译起始密码子如ATG或弱翻译起始密码子如GTG、ATC、ACG、TTG 或AAG。

在一些具体实施方案中，所述靶位点上单个碱基的替换包括并不限于，胞嘧啶碱基编辑如5’-ACG-3’到5’-ATG-3’(C到T)或5’- GTG-3’到5’-ATG-3’(G到A)，腺嘌呤碱基编辑如5’-ACA-3’到5’-ATG-3’(A到G)’。

需要说明的是，经过编辑后，靶基因编码的完整靶蛋白不表达或者表达量极低。

特别地，检测靶基因表达的手段仅能通过使用靶蛋白的内源抗体或是植物表型的变化，实时定量PCR不适用检测本发明所述基因失活。有大量研究表明基因的开放阅读框(uORF)通常影响蛋白质的翻译效率，而对基因的转录水平不影响或者影响不大。

需要说明的是，所述靶细胞是植物细胞，包括单子叶植物或双子叶植物，如拟南芥、水稻、小麦、大麦、高粱、玉米或大豆。

本发明还提供一种通过单碱基编辑靶基因启动子失活基因方法的应用，即经基因失活的细胞再生出的完整植株，其中所述植株中的靶基因失活。

在一些实施方案中，所述靶基因的失活导致所述植物性状发生变化，优选农艺性状的改良。

“农艺性状”指可测量的指标参数，包括但不限于：叶片绿色、籽粒产量、籽粒品质、生长速率、总生物量或积累速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物氮含量、植物游离氨基酸含量、植物蛋白含量、抗旱性、耐热性、氮的吸收、根的倒伏、收获指数、茎的倒伏、株高、穗高、穗长、抗病性、抗寒性、抗盐性和分蘖数。

在一些具体实施方案中，所述靶基因是BAK1。在一些具体实施方式中，所述BAK1基因是拟南芥的AtBAK1。BAK1是植物中重要的受体激酶，是免疫信号转导和植物激素油菜素甾醇信号转导的中枢蛋白。 AtBAK1的蛋白失活会导致植物叶片变得短缩肥大，也影响了其在黑暗状态下的下胚轴伸长。

在一些实施方式中，本发明的所述经遗传修饰的植物是无转基因的。例如，通过基因组编辑系统的瞬时转化可以获得无转基因的经遗传修饰的植物。或者，在获得整合有外源转基因的经遗传修饰的植物之后，通过后代的遗传分离可以获得不含转基因的经遗传修饰的植物。

另一方面，本发明包括通过本发明所述方法产生的经遗传修饰的植物或其后代。

本发明的有益效果在于，通过运用单碱基编辑器使目的基因启动子5‘非翻译区(5‘UTR)增加1个或多个上游开放阅读框(uORF)，大大削弱主效开放阅读框(mORF)的翻译，从而达到失活靶基因的目的。

相比CRISPR/Cas9基因编辑、EMS诱变或T-DNA随机插入等传统基因失活手段，具有不引发DNA双链断裂，精确高效以及对靶基因 mRNA水平影响小等优点。除此之外，实验证据表明使用本发明方法获得的基因突变体，生长发育，蛋白功能等表型与公开发表的经传统T-DNA插入获得的突变体表型一致。

附图说明

图1为筛选AtBAK1基因启动子的5’UTR上能使该基因失活效果最强的潜在uORF位点。

图中，A为AtBAK1基因的5’UTR序列示意图(浅灰色)；深灰低标注区域为两个潜在的sgRNA靶位点，其中黑色标注的AC₂G,AC₈G, AC₁₂G为潜在uORF位点；黑色标记的ATG为该基因的主效ORF。B为筛选最优潜在uORF所构建的一系列荧光素酶报告基因的示意图。C 为荧光素酶报告系统筛选最优潜在uORF位点的结果，即sgRNA-2中 AC₂G变为AT₂G，削弱启动子活性最明显。”n.s.”表示无显著差异。

图2为使用胞嘧啶单碱基编辑器获得包含有最优uORF突变的纯合转基因拟南芥筛选过程。

图中，A为转基因双元载体示意图，NLS代表入核信号，XTEN代表灵活的连接序列，hAID为单碱基编辑系统核心的脱氨酶，EC1.2p 为特异在卵细胞中表达的启动子，sgRNA使用的是图1中筛选过的sgRNA-2。B是经过测序筛选获得的杂合T1代植株，显示编辑效率为1.5％，全部为AC₂G到AT₂G突变。C是经过传代筛选获得的纯合T2代基因编辑植株测序情况，显示AC₂G到AT₂G突变全部为纯合。

图3为包含有最优uORF突变的纯合转基因拟南芥显示出与AtBAK1 基因缺失突变体bak1-4相似的蛋白表达水平，生长发育表型和黑暗下下胚轴伸长表型。

图中，A为western blot实验中，用内源BAK1抗体检测出uORF 纯合突变体与缺失突变体bak1-4具有相似的蛋白水平，均比野生型 (WT)显著降低；且荧光实时定量PCR结果显示，uORF纯合突变体的BAK1转录水平相比野生型仅下降37％-50％，而缺失突变体bak1-4检测不到BAK1转录水平。B为5周龄的野生型(WT)、bak1-4和两个uORF纯合突变体#13-11和#205-3生长发育的表型。C和D为前述几种植株在黑暗条件下生长5天的表型。”n.s.”表示#13-3，#205-10 及bak1-4之间下胚轴长度无显著性差异。“**”表示与Col-0野生型植株相比差异显著。

具体实施例

以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

实施例1：分析AtBAK1基因编码区前5’UTR区域潜在uORF位点并使用荧光素酶报告系统确定最优潜在uORF位点。

首先从TAIR(https://www.arabidopsis.org/)网站上获取了拟南芥AtBAK1的完整cDNA序列，其中5’UTR序列(前导核苷酸序列)如图1A所示。然后，在其中搜索潜在的uORF位点(以使用胞嘧啶碱基编辑器为例，能定向将C碱基突变为T碱基)，即5’-ACG- 3’序列(经胞嘧啶碱基编辑后变为初始密码子ATG)。同时，也兼顾了胞嘧啶碱基编辑器的工作特性，因此选择了两个sgRNA靶位点 (sgRNA-1,如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；sgRNA-2,如SEQ IDNO：2所示核苷酸序列)，其中包含了3个潜在uORF位点(可突变 5’-ACG-3’序列)。

研究表明，uORF会影响基因启动子的活性。因此，发明人拟利用荧光素酶报告系统来研究前述哪个潜在的uORF位点突变后影响基因启动子活性的能力最大。具体实验方法如下：

1、构建系列荧光素酶报告基因BAK1p-WT/uORF^1st/uORF^1st/ uORF^2nd-1/uORF^2nd-2/uORF^2nd/uORF^1st+2nd-LUC瞬时表达载体

根据已发表论文描述的方法(Li,Z.et al.Targeted TranscriptionalActivation in Plants Using a Potent Dead Cas9-Derived Synthetic GeneActivator.Current protocols in molecular biology,127,e89，2019)。首先通过PCR的方式将 AtBAK1基因启动子(一般认为，ATG前-2kb左右可作为启动子序列) 从野生型拟南芥Col-0叶片基因组中克隆出来，同时在启动子序列开始和末尾(ATG前，不包含ATG)分别引入BamHI和NcoI内切酶序列；之后，将上述片段经BamHI和NcoI内切酶(NEB公司)双酶切之后，由T4连接酶连接进已使用上述双内切酶消化过的LUC载体，从而克隆出具有AtBAK1启动子序列的BAK1p-WT-LUC报告基因(SEQ ID NO：3 所示核苷酸序列)。随后，根据图1B所示以BAK1p-WT-LUC报告基因为模板，使用购自诺唯赞生物技术有限公司的定点突变试剂盒MutExpress II Fast Mutagenesis Kit V2，定点突变出具有不同人工定制uORF的系列报告基因BAK1p-uORF^1st/uORF^1st/uORF^2nd-1/uORF^2nd-2/ uORF^2nd/uORF^1st+2nd-LUC。

2、拟南芥原生质体的制备

1)12小时光照/12小时黑暗、24℃、60％湿度，培养4周拟南芥；

2)配制酶解溶液(1.5％纤维素酶R10，0.4％果胶酶R10，0.4M 甘露醇，20mM MES(pH 5.7)，20mM KCl，10mM CaCl2和0.1％BSA) 并取10mL平铺于植物培养板中；

3)选取20-30片生长健康的拟南芥叶片，用刀片切成0.5-1mm 的条带；

4)将条带放入酶解液中，注意用塑料环将其拨散开来，使其四面都充分与酶液接触，黑暗酶解3小时；

5)在酶解进行2小时左右，配置PEG反应液(40％PEG4000(v/v)，0.2M甘露醇和0.1MCaCl2)，并将其放置于摇晃的仪器上慢慢溶解；

6)酶解完后，加入10ML W5溶液(154mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl和2mM MES(pH5.7))，用适当的力度摇晃培养板，使原生质体释放于溶液中。此时可以看到溶液变绿，用75μm的尼龙膜过滤，收集细胞溶液于30mL离心管中；

7)细胞溶液用水平转子以800rpm的转速离心2分钟，之后用真空泵吸去尽可能多的上清液；

8)加入10mL W5溶液重悬细胞，轻轻摇晃使其重悬起来，并将其至于冰上休息0.5小时-1小时；

9)800rpm离心1分钟，将其上清液吸走，加入适量MMg溶液 (0.4M甘露醇，15mMMgCl2和4mM MES(pH5.7))重悬，在光学显微镜下使用细胞计数板将原生质体浓度调节至2×10⁵个/mL。

3、拟南芥原生质体的瞬时转化

在2mL圆底离心管中，加入200μL拟南芥原生质体与4μL(8μ g)BAK1p-WT/uORF^1st/uORF^2nd-1/uORF^2nd-2/uORF^2nd/uORF^1st+2nd-LUC 质粒(一个组加入一种LUC报告基因质粒，共6组)和1μL(2μg) UBQ10-GUS质粒/组，再加入220μL PEG反应液，轻柔地充分混匀，室温静置(避光15分钟)，随后加入880μL W5溶液，混匀以终止转染。水平离心机离心(1000rpm离心2分钟)，吸去上清，加入100 μL W5溶液重悬，并转移至1mL WI溶液中，室温黑暗培养12小时。

4、萤光素酶报告基因活性的检测

1)细胞裂解：

转染后的拟南芥原生质体黑暗培养12小时后，1100rpm水平离心 2分钟，吸去上清，加入100μL裂解液[25mM Tris-HCl(pH 7.8)，2mM DTT，2mM trans-1,2-diaminocyclohexane-N’N’N’N’-tetraacetic acid，10％(v/v)glycerol和1％(v/v)Triton X-100]，剧烈震荡使原生质体充分裂解，裂解液呈绿色。12000rpm离心30秒。此后裂解液须置于冰上，并尽快进行后续测量步骤。

2)GUS检测：

把黑底酶标板置于冰上，向各孔中分别加入10μL裂解上清；用排枪向同一个重复的样品中同时加入50μL MUG工作液[10mM Tris- HCl(pH 8.0)，1mM 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide(MUG)， 2mM MgCl2]，轻微吹打数下混匀，注意避免气泡产生；37℃避光反应30分钟；反应结束后把酶标板置于冰水浴中5分钟以终止反应；用Varioskan LUX microplate reader酶标仪“GUS程序”读数(程序设置：选择读取荧光——激发波长365nm、发射波长455nm——设置读取区域)。

3)LUC检测：

GUS反应开始后即可进行LUC检测；于白底酶标板各孔中分别加入10μL裂解液；用普通枪(或冲锋枪)按机器读数顺序先后或用排枪同时，向各孔中分别加入100μL LUC工作液；迅速进入酶标仪读数，选取“LUC程序”(化学发光——设置读取间隔为1000ms——设置读数顺序与加样顺序一致——设置每孔读书次数为10次——设置读取区域)；注意LUC反应开始时速率能保持数分钟的稳定，随后逐渐衰减，故加入底物后应尽快测量。

4)计算：

数据导出至Excel表后，应首先扣除空白组的背景值，再计算各样品的LUC/GUS比值，接着将对照组(即仅含promoter-LUC和 UBQ10pro-GUS的组)的LUC/GUS值换算成1，再以此为标准计算各样品的Relative LUC activity，该值即为Promoter activity；根据Promoter activity作柱状图，并添加Error bar。

通过上述实验获得图1C结果，通过与各种经突变获得的具有不同uORF数量(1，2，3)的BAK1启动子相比，仅使sgRNA-2靶标序列内AC₂G突变为AT₂G获得的单个新uORF即可削弱BAK1启动子87.3％的活性，且该uORF削弱效果明显强于其他突变获得的uORF。

上述结果表明，通过单碱基编辑BAK1基因启动子中5’UTR区域，使该基因获得新的uORF，可极大削弱该启动子下游基因(LUC 基因)的翻译。

实施例2：在转基因植株层面使用单碱基编辑器编辑拟南芥内源BAK1，获得具有最优削弱能力uORF的纯合基因编辑植株。

接下来将前述筛选获得的sgRNA-2与已发表的基于hAID脱氨酶单碱基编辑载体，通过简单PCR与酶切连接的方法融合获得如图2A 所示双元载体(SEQ ID NO：4所示核苷酸序列)。将其通过农杆菌花粉管导入法转化拟南芥。具体方法简述如下：

将上述最终双元载体通过电击转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系GV3101中，利用花粉管导入法(floral dip)转化拟南芥植株。具体地，将含有目标双元载体的GV3101菌液，按1:100 的比例接种于含卡那霉素(50mg/L)的液体LB培养基中，在28℃摇床中以转速220rpm培养2天。5000g收集菌体，弃去培养基，加入含 0.05％Silwet L77的5％蔗糖溶液重悬。取已开花的拟南芥植株，倒置并使花序完全浸入农杆菌菌液中，轻轻搅动约10s后取出，置于湿润黑暗环境中1天后，转移至正常生长环境，直到收获成熟种子。

将前述转基因操作获得的成熟种子在无菌环境下播撒于含有 50mg/L的潮霉素B(hygromycin B)的无菌1/2MS(购自Sigma公司) 固体培养基中。10天左右，将生根的阳性苗移至土壤中恢复培养。半个月后，使用购自诺唯赞公司的FastPure Plant DNA IsolationMini Kit试剂盒提取阳性苗的叶片基因组。随后，使用特异性引物 BAK1-F:5’-gggcgaacataacaaac-3’；BAK1-R:5’- gaccatggtttatcctcaagagattaaaaacaa-3’,将待测片段PCR后送擎科公司进行桑格测序。如图1B所示，我们在325颗T1代阳性植株中检测有突变的植株5颗，编辑情况全部为AC₂G到AT₂G，且均为杂合状态，编辑效率为1.5％。经过筛选传代，我们获得了两株具有纯合最优uORF序列的T2代碱基编辑植株#13-10、#205-3。

实施例3：评估含有最优uORF突变的基因编辑纯合植株的基因失活效果以及表型分析

将含有最优uORF突变的基因编辑纯合植株#13-10和#205-3与来源于ABRC突变体库(https://abrc.osu.edu)的BAK1基因T-DNA插入突变体bak1-4(CS71788)一起背靠背的种在相同的营养土中，5周后观察其生长发育表型同时分别取相同位置的叶片进行免疫印迹实验(Western Blot)和RNA的提取以及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验，具体方法如下：

1、免疫印迹(Western blot)

1)首先对不同基因型的拟南芥WT、#13-10、#205-3以及bak1-4 植株剪取相同重量的叶片(约15mg)。迅速冻于-80℃液氮中，然后使用研磨仪将样品磨碎，注意随时添加液氮。向前述研磨好的样品中加入一定量10×Protein Loading Buffer(全式金生物)，于95℃金属加热仪中煮10分钟，裂解样品。随后，将前述变性后的蛋白样品上样至10％SDS-PAGE胶电泳槽中，没有样品的孔用等量的2×浓度蛋白质缓冲液(全式金生物)补齐，100V恒压电泳2小时30分钟[1x SDS Running Buffer(Glycine 14.4g/L,Tris base 3.02g/L, SDS 1g/L)浸没)]。

2)取一张大小合适的PVDF膜，用甲醇浸泡30秒，然后用纯水洗涤3-5遍，用1×Transfer Buffer(Glycine 14.4g/L,Tris base 3.02g/L)浸泡，将跑胶结束的凝胶取出，去掉浓缩胶，用纯水漂洗2-3次后用1×Transfer Buffer浸泡。

3)取出分离胶，按照阴极板-海绵-滤纸-分离胶-PVDF膜-滤纸- 海绵-阳极板的顺序叠好材料，赶走气泡，350mA恒流下转膜2.5小时。

4)取出PVDF膜，靠近分离胶的一面朝上，用1×TBST[15mM NaCl,25mM Tris base,0.5％Tween-20(v/v),pH 7.4]洗涤一次，然后用5％脱脂奶粉溶液(1g脱脂奶粉溶于20mL 1×TBST缓冲液) 于60rpm的水平摇床室温封闭1小时，弃去溶液。

5)加入含有2μLα-BAK1抗体(Genscript公司)的10mL 5％脱脂奶粉溶液，4℃水平摇床过夜孵育。

6)用1×TBST缓冲液洗涤4次，每次10分钟，弃去溶液，将ECL 显色液按1:1的体积比混匀后加到洗好的膜上，在成像仪中拍照。

2、拟南芥叶片总RNA提取

使用TAKARA公司的RNAiso Plus产品，方法如下：

1)剪取15-30mg约5周大的拟南芥叶片放入装有研磨珠的2 mL研磨管中，迅速放入液氮；将上述样品放入研磨机中研磨，时刻注意补充液氮以避免样品降解；

2)研磨充分后迅速加入1mL RNAiso Plus液体，充分涡旋混匀，室温静置5分钟；

3)4℃，12000g离心5分钟；

4)上清迅速转移至RNase-free的1.5mL离心管中，加入200 μL氯仿，盖紧管盖并上下剧烈震荡15秒，可明显看到溶液乳化，室温静置5分钟；

5)4℃，12000g离心15分钟，液体分为三层，最上层无色上清为RNA。

6)将上清(450μL)转移至新的1.5mL RNase-free的离心管中，注意枪头不要触碰白色中间层；

7)迅速加入500μL异丙醇，上下颠倒，充分混匀，室温静置10 分钟；

8)4℃，12000g离心10分钟，一般可在底部看到白色RNA沉淀；

9)倒掉上清，加入使用DEPC水配制的75％乙醇1mL，轻柔颠倒混匀；

10)4℃，7500g离心5分钟；

11)重复第9)，10)步洗涤操作一次，倒掉上清，注意尽量倒干净以免酒精残留过多；必要时可用枪吸干，不能触碰白色RNA沉淀；

12)将上述管子室温晾干或于超净台中吹干，经验表明在沉淀刚刚由白色变为透明状态时加水溶解效果最好，一般依沉淀量加入15- 30μL DEPC水，注意不要离心或加热干燥，可能造成RNA难以完全溶解；

13)将上述RNA水溶液在60℃金属浴中加热5分钟，以促进RNA 充分溶解；

14)最后将RNA样品于-80℃保存。

3、RNA反转录

使用TAKARA公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser进行反转录：

1)去除基因组DNA：

Total RNA 1μg

gDNA Eraser 1μL

5×gDNA Eraser Buffer 2μL

RNase-Free dH2O补至10μL

瞬时离心，于42℃反应2分钟后迅速放于冰上；

2)RT-PCR：

第一步反应产物10μL

PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL

RT Primer Mix 1μL

5×Prime Script Buffer 2(for Real Time)4μL

RNase-free dH2O 4μL

Total 20μL

注意：此步最好以配置成Mix的形式分装，若单独反应则需先加水和5×Buffer，混匀使gDNA Eraser活性充分受到抑制后再加入其他组分。

37℃，15min；

85℃，5sec；

4℃，保存。

以上步骤如无特殊说明应全程4℃进行；

合成的cDNA若需长期保存，应保存于至少-20℃。

4、实时荧光定量PCR

使用TAKARA公司的TB GreenTM RT Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)在LightCyceler 96System(Roche Diagnostics)机器上进行实时定量PCR：

1)所使用引物序列：

靶标基因：

AtBAK1-qPCR-F TTATTGAGGGTTTTAGCTTCTGCTG；

AtBAK1-qPCR-R TGGGTTTTAGCTTTCAACAACATTC；

内参基因：

AtACT2-qPCR-F GACCTTTAACTCTCCCGCTATG；

AtACT2-qPCR-R AAACCCTCGTAGATTGGCAC。

2)稀释引物及模板：

配置Primer Mix(4μM，50μL)：

qPrimer-F(100μM)2μL

qPrimer-R(100μM)2μL

ddH2O 46μL

模板通常将前述反转录产物稀释8倍来使用(20μL cDNA+80μ L ddH2O)。

3)qPCR：

cDNA(已稀释)3μL

Primer Mix(4μM)1μL

2×TB Green Premix Ex Taq 7μL

ddH2O 4μL

Total 15μL

通常将除cDNA以外的其它组分混成SYBR Mix，然后分装12 μL/孔，最后加cDNA模板，低速离心2分钟，上机测试(注意：2×TB Green Premix Ex Taq应避光吸样，同时避免反复冻融，配置SYBR Mix应分引物配置，至少包含内参与目的基因两种Mix，全程操作保持低温)。

LightCyceler 96System(Roche Diagnostics)机器的qPCR程序：

本实验室通常采用3步法；

变性：95℃，30sec[Ramp rate(升温速率)：4.4℃/sec]， 1cycle。

PCR：

分析模式：定量分析；

95℃，30sec(Ramp rate:4.4℃/sec)；

55℃，30sec(Ramp rate:2.2℃/sec，Acqusition Mode: Single)；

72℃，30sec(Ramp rate:2.2℃/sec)。

融解：

分析模式：融解曲线；

95℃，5sec(Ramp rate:4.4℃/sec)；

60℃，1min(Ramp rate:2.2℃/sec)；

95℃1sec(Ramp rate:0.11℃/sec,Acqusition Mode: Continuous,Acqusitions:5per℃),1cycle。

降温：

50℃，30sec(Ramp rate:2.2℃/sec),1cycle。

4)分析数据

使用

96SW 1.1获取数据，通过融解曲线来判断引物是否特异以及数据是否可信，并在EXCEL表上根据2^(-ΔCt) 和2^(-ΔΔCt)计算目的基因的绝对表达量和相对表达量。

如图3A所示，含有最优uORF的碱基编辑纯合植株#13-10和 #205-3的BAK1蛋白质降至与突变体bak1-4水平一致，几乎检测不到。而相应mRNA水平相对野生型植株仅降至50％到67％的水平，与之相对的突变体bak1-4检测不到mRNA的表达。这印证了uORF会极大的影响蛋白质翻译效率而对Mrna水平的影响较小。如图3B所示，#13-10和#205-3BAK1蛋白质水平的极大削弱，反应到整体生长发育的表型就和突变体bak1-4一致，均展现出叶柄短缩，叶片肥大(5周龄)。前人报道，BAK1基因参与到植物激素油菜素甾醇的信号转导，其突变体bak1-4会有一个黑暗条件下下胚轴身长缩短的表型。如图3C所示，#13-10和#205-3展现了与突变体bak1-4相同的下胚轴短缩表型，而作为对照的bri1-116是河南大学王学路教授馈赠的突变体，其具有一个极致的BR缺陷表型。图3C的7天下胚轴长度统计结果也印证了这点。综上，本实施例的结果有力的说明了通过前述实施例获得的具有最优uORF突变的纯合拟南芥，其靶标基因BAK1的蛋白表达几乎丧失，同时其在生长发育与BR信号转导上的表型与突变体bak1-4一致。这些结果证明本发明的核心内容，即通过单碱基编辑靶基因启动子5’UTR区域，使其增加1个或多个 uORF，可以达到失活靶基因的目的。

对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种通过单碱基编辑靶基因启动子失活基因的方法

<130> 123

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tagtcaacgg tcagcgatct cgg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acgggtggat acgcgttgag agg 23

<210> 3

<211> 6600

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccatggatgg aagacgccaa aaacataaag aaaggcccgg cgccattcta tcctctagag 60

gatggaaccg ctggagagca actgcataag gctatgaaga gatacgccct ggttcctgga 120

acaattgctt ttacagatgc acatatcgag gtgaacatca cgtacgcgga atacttcgaa 180

atgtccgttc ggttggcaga agctatgaaa cgatatgggc tgaatacaaa tcacagaatc 240

gtcgtatgca gtgaaaactc tcttcaattc tttatgccgg tgttgggcgc gttatttatc 300

ggagttgcag ttgcgcccgc gaacgacatt tataatgaac gtgaattgct caacagtatg 360

aacatttcgc agcctaccgt agtgtttgtt tccaaaaagg ggttgcaaaa aattttgaac 420

gtgcaaaaaa aattaccaat aatccagaaa attattatca tggattctaa aacggattac 480

cagggatttc agtcgatgta cacgttcgtc acatctcatc tacctcccgg ttttaatgaa 540

tacgattttg taccagagtc ctttgatcgt gacaaaacaa ttgcactgat aatgaattcc 600

tctggatcta ctgggttacc taagggtgtg gcccttccgc atagaactgc ctgcgtcaga 660

ttctcgcatg ccagagatcc tatttttggc aatcaaatca ttccggatac tgcgatttta 720

agtgttgttc cattccatca cggttttgga atgtttacta cactcggata tttgatatgt 780

ggatttcgag tcgtcttaat gtatagattt gaagaagagc tgtttttacg atcccttcag 840

gattacaaaa ttcaaagtgc gttgctagta ccaaccctat tttcattctt cgccaaaagc 900

actctgattg acaaatacga tttatctaat ttacacgaaa ttgcttctgg gggcgcacct 960

ctttcgaaag aagtcgggga agcggttgca aaacgcttcc atcttccagg gatacgacaa 1020

ggatatgggc tcactgagac tacatcagct attctgatta cacccgaggg ggatgataaa 1080

ccgggcgcgg tcggtaaagt tgttccattt tttgaagcga aggttgtgga tctggatacc 1140

gggaaaacgc tgggcgttaa tcagagaggc gaattatgtg tcagaggacc tatgattatg 1200

tccggttatg taaacaatcc ggaagcgacc aacgccttga ttgacaagga tggatggcta 1260

cattctggag acatagctta ctgggacgaa gacgaacact tcttcatagt tgaccgcttg 1320

aagtctttaa ttaaatacaa aggatatcag gtggcccccg ctgaattgga atcgatattg 1380

ttacaacacc ccaacatctt cgacgcgggc gtggcaggtc ttcccgacga tgacgccggt 1440

gaacttcccg ccgccgttgt tgttttggag cacggaaaga cgatgacgga aaaagagatc 1500

gtggattacg tcgccagtca agtaacaacc gcgaaaaagt tgcgcggagg agttgtgttt 1560

gtggacgaag taccgaaagg tcttaccgga aaactcgacg caagaaaaat cagagagatc 1620

ctcataaagg ccaagaaggg cggaaagtcc aaattgtaaa atgtaactgt attcagcgat 1680

gacgaaattc ttagctattg taatattata tgcaaattga tgaatggtaa ttttgtaatt 1740

gtgggtcact gtactatttt aacgaataat aaaatcaggt ataggtaact aaaaaggaat 1800

tcgagctcga attgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt 1860

tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat 1920

taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt 1980

atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg 2040

cgcggtgtca tctatgttac tagatctcta gaattcgtaa tcatgtcata gctgtttcct 2100

gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 2160

aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 2220

gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 2280

agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 2340

gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 2400

gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 2460

cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 2520

aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 2580

tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 2640

ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 2700

ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 2760

cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 2820

ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 2880

gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt 2940

atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 3000

aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 3060

aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 3120

gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 3180

cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 3240

gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 3300

tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 3360

ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 3420

ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 3480

atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 3540

cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 3600

tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 3660

aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 3720

tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 3780

ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 3840

agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 3900

gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 3960

agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 4020

accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 4080

gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 4140

cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 4200

ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 4260

atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt 4320

gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa 4380

gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg 4440

ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt 4500

gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc gccattcagg 4560

ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg 4620

aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga 4680

cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt gcatgcctgc aggctctaga ggatccagag 4740

agggagaaaa gaattggaag agatttggag agagagaatc gctaagacgg tgaaaacaag 4800

gagaagaaac gcccacgaag gtcttgtaat ggcactcaat actgtggtcg gattcttctc 4860

cggttccatt gttttttgga aacagagaga aaactcaaaa gcccatgaag caagctctga 4920

gataaaatta caaacagaag aatgctaaag tgggactttt agatggttgg agagaattat 4980

gcatgtgtgt ggcaatgatt agcgtagtgt ggtggtgaca acaaacaaag gtggaggaag 5040

atagaaagtc gatagatacc ttacctcgaa aattcgtctc tctctttgat tatttttgta 5100

tatataaata gaaaaaagta gtagtaaata agaaaattgg atacagacac agatatgtcg 5160

tgaaaagggc actaaaatat tggatggtgc atgtgaatcg tcaaaaagtg gcaaggagaa 5220

agtgaaagtc ttcacgaatt atattttggt ttatatataa aagaagaaga aagaagaaga 5280

aagaagaaga aagaagatgg atgatacaca atcggtcacg gactcacggg taggaaggat 5340

tgtgaggcgt tacaatctcg tcagacttcc aagtcttaat ctgatgggcc tttaaatagc 5400

ctactgtact gagttgtttg ttgtgttttt gttttgtttt ttaatgccaa actaaggtat 5460

atgtccgtat tttattgctg gcaacatata ctctgtccgt ttgtgttttt tgttttttat 5520

ttcatttttc ctcaaaatta cttttgttct tttaaaaata ttaaatggca taaatagtta 5580

aactatcaac cagtaaatta tatatgatac aataatgttt tttgttttgt ttaattcatt 5640

ggaccagatg gattattcag cttacatttt tcaatattga attgtaattt tttagagcta 5700

taatctttaa aaaagaataa aaaaatcaaa aaagcttttg ctcatctttg gaataaacga 5760

acttgctatt aagaccaagc ccaataaaca ataaaagccc gaaaaaatag agctgggccg 5820

gtaattagga ttatgatgat ggtatataac tcactatcaa ctatcatgag ttcatgacca 5880

tcatggttta tatctaatgt catatgatgg atgatgataa ggtgggcgaa cataacaaac 5940

atgattcgga atgaagtcgt gcgtctttga ctttgactag ctctaaaaaa gctttgaaaa 6000

tgctcgtcca cgtcatcatc ctctttgtcg ttttctcaat cttaaatgtc atttttttaa 6060

tatagttttc acagtacaac aactcaaccc agtaaaatcc cttctttaag caaagaaaat 6120

aattaaaatt cgtcttcctt ccttgctctc ggcgataact tggtttctct cctctctctc 6180

atctctcttt gtttcgaccc ttttttagta tatttccagg aaatatcttc ttcctccttt 6240

cgttttctct atctcagttt tctctcttct cagcattaag tagtcaacgg tcagcgatct 6300

cggcgttcct tctaatcgga aaagtctagc ttcagtttct tttttttttg cttttttggt 6360

ttccgcgatt aatcgatttg ggtattttga ttttctcttc aaattaagtc aacgggtgga 6420

tacgcgttga gagggctttt ctcgtattct gcttctaatt tcatcatctt ggtattacct 6480

tgtgtgggtg gtagcttaat cgaaggattc gagatccctt ttatcagggg ttttaacaat 6540

gatggatttt ctctgatgag ggatagttct agggtttgtt tttaatctct tgaggataaa 6600

<210> 4

<211> 17592

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agctcgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta 60

aactgaaggc gggaaacgac aatctgatcc aagctcaagc tgctctagca ttcgccattc 120

aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 180

gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 240

cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc ctcgagtacg taggatccat ttaaattcta 300

gaggcgcgcc gatatcctct cttaaggtag cgagctctta attaataggg ataacagggt 360

aattaactat aacggtccta aggtagcgat ggcaaacagc tattatgggt attatgggtg 420

gttctttatg cggacactga cggctttatg cctgcagaaa aaagcaccga ctcggtgcca 480

ctttttcaag ttgataacgg actagcctta ttttaacttg ctatttctag ctctaaaacc 540

tcaacgcgta tccacccgtc aatcactact tcgactctag ctgtatataa actcagcttc 600

gttttcttat ctaagcgatg tgggactttt gaagattgtt ttcaacttaa atgggcctat 660

ataagaaata ctattgttct ttcccatata aatgggcctg cttctcttct ttcagattcc 720

caggggcctt ttgaagatta tcttcatatc ttaagaatga agatgtttta ttcaatcaaa 780

ttcttgaagg ttcgatgcct aatcattcta atcctgggac aaactatgaa acaagataca 840

aaaactccga atggaaagtt aaaaagaaga aaacgaaagc tacggttcaa gaaaatgtaa 900

gctgataaac aaaaaaaaac tgtatgaacg aagaagaaga aaaaaagctg gtaccgcccg 960

ggcgtcgaca ggcctaagcg aataaaagca tttgcgtttg gtttatcatt gcgtttatac 1020

aaggacagag atccactgag ctggaatagc ttaaaaccat tatcagaaca aaataaacca 1080

ttttttgtta agaatcagag catagtaaac aacagaaaca acctaagaga ggtaacttgt 1140

ccaagaagat agctaattat atctatttta taaaagttat catagtttgt aagtcacaaa 1200

agatgcaaat aacagagaaa ctaggagact tgagaatata cattcttgta tatttgtatt 1260

cgagattgtg aaaatttgac cataagttta aattcttaaa aagatatatc tgatctaggt 1320

gatggttata gactgtaatt ttaccacatg tttaatgatg gatagtgaca cacatgacac 1380

atcgacaaca ctatagcatc ttatttagat tacaacatga aatttttctg taatacatgt 1440

ctttgtacat aatttaaaag taattcctaa gaaatatatt tatacaagga gtttaaagaa 1500

aacatagcat aaagttcaat gagtagtaaa aaccatatac agtatatagc ataaagttca 1560

atgagtttat tacaaaagca ttggttcact ttctgtaaca cgacgttaaa ccttcgtctc 1620

caataggagc gctactgatt caacatgcca atatatacta aatacgtttc tacagtcaaa 1680

tgctttaacg tttcatgatt aagtgactat ttaccgtcaa tcctttccca ttcctcccac 1740

taatccaact ttttaattac tcttaaatca ccactaagct agtaacgcct atcatgaatt 1800

agctctacta aatctagcaa cctttcaaat ttgcagtatt gcaggtgtct ctgtgtcttt 1860

aaaatagttg ccttatgatt tcttcggttt caagatgatc aaatagttat agatttcatg 1920

ctcacacatg ctcattagat gtgtacatac tttacttacc caaatctatt ttctcgcaaa 1980

gattttgatg gtaaagctga tttggttcta ttgaactaaa tcaaacgagt ttcagactga 2040

gtgattctaa tccggcccat tagcccctaa acagacccac taattacgca gcttttaata 2100

gagtaattac acctagttta cccactaaac cactaagcac taattatctc acaatctaat 2160

gagcttccct cgtaattact tgggctttca ctctaccatt tatttgtaac agtcaagtct 2220

ctactgtctc tatataaact ctctaaagtt aacacacaat tctcatcaca aacaaatcaa 2280

ccaaagcaac ttctactctt tcttctttcg accttatcaa tctgttgaga acctaggatg 2340

ccaaagaaga agagaaaggt tggaatccac ggagttccag ctgctgacag cctcttgatg 2400

aaccggaggg agtttcttta ccaattcaaa aatgtccgct gggctaaggg tcggcgtgag 2460

acctacctgt gctacgtagt ggagaggcgt gactgtgcta catccttttc actggacttt 2520

ggttatcttc gcaataagaa cggctgccac gtggaattgc tcttcctccg ctacatctcg 2580

gactgggacc tagaccctgg ccgctgctac cgcgtcacct ggttcatctc ctggagcccc 2640

tgctacgact gtgcccgaca tgtggccgac tttctgcgag ggaaccccaa cctcagtctg 2700

aggatcttcg ccgcgcgcct ctacttctgt gaggaccgca aggctgagcc cgaggggctg 2760

cggcggctgc gccgcgccgg ggtgcaaata gccatcatga ccttcaaaga ttatttttac 2820

tgctggaata cttttgcaga aaaccatgga agaactttca aagcctggga agggctgcat 2880

gaaaattcag ttcgtctctc cggacagctt cggcgcatcc ttagcggcag cgagactccc 2940

gggacctcag agtccgccac acccgaaagt gataagaagt actctatcgg acttgctatc 3000

ggaaccaact ctgttggatg ggctgttatc accgatgagt acaaggttcc atctaagaag 3060

ttcaaggttc ttggaaacac cgatagacac tctatcaaga agaaccttat cggtgctctt 3120

cttttcgatt ctggagagac cgctgaggct accagattga agagaaccgc tagaagaaga 3180

tacaccagaa gaaagaacag aatctgctac cttcaggaaa tcttctctaa cgagatggct 3240

aaggttgatg attctttctt ccacagactt gaggagtctt tccttgttga ggaggataag 3300

aagcacgaga gacacccaat cttcggaaac atcgttgatg aggttgctta ccacgagaag 3360

tacccaacca tctaccacct tagaaagaag ttggttgatt ctaccgataa ggctgatctt 3420

agacttatct accttgctct tgctcacatg atcaagttca gaggacactt ccttatcgag 3480

ggagacctta acccagataa ctctgatgtt gataagttgt tcatccagct tgttcagacc 3540

tacaaccagc ttttcgagga gaacccaatc aacgcttctg gagttgatgc taaggctatc 3600

ctttctgcta gactttctaa gtctcgtaga cttgagaacc ttatcgctca gcttccagga 3660

gagaagaaga acggactttt cggaaacctt atcgctcttt ctcttggact taccccaaac 3720

ttcaagtcta acttcgatct tgctgaggat gctaagttgc agctttctaa ggatacctac 3780

gatgatgatc ttgataacct tcttgctcag atcggagatc agtacgctga tcttttcctt 3840

gctgctaaga acctttctga tgctatcctt ctttctgaca tccttagagt taacaccgag 3900

atcaccaagg ctccactttc tgcttctatg atcaagagat acgatgagca ccaccaggat 3960

cttacccttt tgaaggctct tgttagacag cagcttccag agaagtacaa ggaaatcttc 4020

ttcgatcagt ctaagaacgg atacgctgga tacatcgatg gaggagcttc tcaggaggag 4080

ttctacaagt tcatcaagcc aatccttgag aagatggatg gaaccgagga gcttcttgtt 4140

aagttgaaca gagaggatct tcttagaaag cagagaacct tcgataacgg atctatccca 4200

caccagatcc accttggaga gcttcacgct atccttcgta gacaggagga tttctaccca 4260

ttcttgaagg ataacagaga gaagatcgag aagatcctta ccttcagaat cccatactac 4320

gttggaccac ttgctagagg aaactctcgt ttcgcttgga tgaccagaaa gtctgaggag 4380

accatcaccc cttggaactt cgaggaggtt gttgataagg gagcttctgc tcagtctttc 4440

atcgagagaa tgaccaactt cgataagaac cttccaaacg agaaggttct tccaaagcac 4500

tctcttcttt acgagtactt caccgtttac aacgagctta ccaaggttaa gtacgttacc 4560

gagggaatga gaaagccagc tttcctttct ggagagcaga agaaggctat cgttgatctt 4620

cttttcaaga ccaacagaaa ggttaccgtt aagcagttga aggaggatta cttcaagaag 4680

atcgagtgct tcgattctgt tgaaatctct ggagttgagg atagattcaa cgcttctctt 4740

ggaacctacc acgatctttt gaagatcatc aaggataagg atttccttga taacgaggag 4800

aacgaggaca tccttgagga catcgttctt acccttaccc ttttcgagga tagagagatg 4860

atcgaggaga gactcaagac ctacgctcac cttttcgatg ataaggttat gaagcagttg 4920

aagagaagaa gatacaccgg atggggtaga ctttctcgta agttgatcaa cggaatcaga 4980

gataagcagt ctggaaagac catccttgat ttcttgaagt ctgatggatt cgctaacaga 5040

aacttcatgc agcttatcca cgatgattct cttaccttca aggaggacat ccagaaggct 5100

caggtttctg gacagggaga ttctcttcac gagcacatcg ctaaccttgc tggatctcca 5160

gctatcaaga agggaatcct tcagaccgtt aaggttgttg atgagcttgt taaggttatg 5220

ggtagacaca agccagagaa catcgttatc gagatggcta gagagaacca gaccacccag 5280

aagggacaga agaactctcg tgagagaatg aagagaatcg aggagggaat caaggagctt 5340

ggatctcaaa tcttgaagga gcacccagtt gagaacaccc agcttcagaa cgagaagttg 5400

tacctttact accttcagaa cggaagagat atgtacgttg atcaggagct tgacatcaac 5460

agactttctg attacgatgt tgatcacatc gttccacagt ctttcttgaa ggatgattct 5520

atcgataaca aggttcttac ccgttctgat aagaacagag gaaagtctga taacgttcca 5580

tctgaggagg ttgttaagaa gatgaagaac tactggagac agcttcttaa cgctaagttg 5640

atcacccaga gaaagttcga taaccttacc aaggctgaga gaggaggact ttctgagctt 5700

gataaggctg gattcatcaa gagacagctt gttgagacca gacagatcac caagcacgtt 5760

gctcagatcc ttgattctcg tatgaacacc aagtacgatg agaacgataa gttgatcaga 5820

gaggttaagg ttatcacctt gaagtctaag ttggtttctg atttcagaaa ggatttccag 5880

ttctacaagg ttagagagat caacaactac caccacgctc acgatgctta ccttaacgct 5940

gttgttggaa ccgctcttat caagaagtac ccaaagttgg agtctgagtt cgtttacgga 6000

gattacaagg tttacgatgt tagaaagatg atcgctaagt ctgagcagga gatcggaaag 6060

gctaccgcta agtacttctt ctactctaac atcatgaact tcttcaagac cgagatcacc 6120

cttgctaacg gagagatcag aaagagacca cttatcgaga ccaacggaga gaccggagag 6180

atcgtttggg ataagggaag agatttcgct accgttagaa aggttctttc tatgccacag 6240

gttaacatcg ttaagaaaac cgaggttcag accggaggat tctctaagga gtctatcctt 6300

ccaaagagaa actctgataa gttgatcgct agaaagaagg attgggaccc aaagaagtac 6360

ggaggattcg attctccaac cgttgcttac tctgttcttg ttgttgctaa ggttgagaag 6420

ggaaagtcta agaagttgaa gtctgttaag gagcttcttg gaatcaccat catggagcgt 6480

tcttctttcg agaagaaccc aatcgatttc cttgaggcta agggatacaa ggaggttaag 6540

aaggatctta tcatcaagtt gccaaagtac tctcttttcg agcttgagaa cggaagaaag 6600

agaatgcttg cttctgctgg agagcttcag aagggaaacg agcttgctct tccatctaag 6660

tacgttaact tcctttacct tgcttctcac tacgagaagt tgaagggatc tccagaggat 6720

aacgagcaga agcagctttt cgttgagcag cacaagcact accttgatga gatcatcgag 6780

caaatctctg agttctctaa gagagttatc cttgctgatg ctaaccttga taaggttctt 6840

tctgcttaca acaagcacag agataagcca atcagagagc aggctgagaa catcatccac 6900

cttttcaccc ttaccaacct tggtgctcca gctgctttca agtacttcga taccaccatc 6960

gatagaaaaa gatacacctc taccaaggag gttcttgatg ctacccttat ccaccagtct 7020

atcaccggac tttacgagac cagaatcgat ctttctcagc ttggaggaga tggtggaggt 7080

ggttctggtg gtggtggttc tggtggtggt ggatctggag gcggtgggtc cggaggtggc 7140

ggttcgggcg gaggtggatc cactaacctg tccgacatca tcgagaagga gactggcaag 7200

cagctggtga tccaggagtc tattctgatg ctgccagagg aggtggaaga ggtgatcggc 7260

aacaagccag agtctgatat cctggtgcac actgcctacg acgagtccac tgacgaaaac 7320

gtgatgctgc tgacttccga tgccccagaa tacaagccat gggccctggt gattcaggac 7380

tccaacggcg agaacaagat caagatgctg tctggtggtt ctaagagacc agctgctacc 7440

aagaaggctg gacaggctaa gaagaagaag aggcctcccc cttctgacta caaggacgac 7500

gatgacaagg actacaagga cgacgatgac aagtgagctc agagctttcg ttcgtatcat 7560

cggtttcgac aacgttcgtc aagttcaatg catcagtttc attgcgcaca caccagaatc 7620

ctactgagtt tgagtattat ggcattggga aaactgtttt tcttgtacca tttgttgtgc 7680

ttgtaattta ctgtgttttt tattcggttt tcgctatcga actgtgaaat ggaaatggat 7740

ggagaagagt taatgaatga tatggtcctt ttgttcattc tcaaattaat attatttgtt 7800

ttttctctta tttgttgtgt gttgaatttg aaattataag agatatgcaa acattttgtt 7860

ttgagtaaaa atgtgtcaaa tcgtggcctc taatgaccga agttaatatg aggagtaaaa 7920

cacttgtagt tgtaccatta tgcttattca ctaggcaaca aatatatttt cagacctaga 7980

aaagctgcaa atgttactga atacaagtat gtcctcttgt gttttagaca tttatgaact 8040

ttcctttatg taattttcca gaatccttgt cagattctaa tcattgcttt ataattatag 8100

ttatactcat ggatttgtag ttgagtatga aaatattttt taatgcattt tatgacttgc 8160

caattgattg acaacgaatt cgtaatcatg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat 8220

ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc 8280

taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga 8340

aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 8400

attggctaga gcagcttgcc aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata 8460

tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat 8520

cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcaaa aggacagtag 8580

aaaaggaagg tggcacctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag 8640

atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 8700

aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgaacat ggtggagcac 8760

gacactctcg tctactccaa gaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggctatt 8820

gagacttttc aacaaagggt aatatcggga aacctcctcg gattccattg cccagctatc 8880

tgtcacttca tcaaaaggac agtagaaaag gaaggtggca cctacaaatg ccatcattgc 8940

gataaaggaa aggctatcgt tcaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc 9000

ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg 9060

gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa 9120

gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga ggacacgctg aaatcaccag 9180

tctctctcta caaatctatc tctctcgagc tttcgcagat ccggggggca atgagatatg 9240

aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc tgatcgaaaa gttcgacagc 9300

gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta 9360

ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt 9420

tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg 9480

gagtttagcg agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtt cacagggtgt cacgttgcaa 9540

gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctacaaccgg tcgcggaggc tatggatgcg 9600

atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc 9660

ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac 9720

tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg 9780

atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg tgcacgcgga tttcggctcc 9840

aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg 9900

ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac atcttcttct ggaggccgtg gttggcttgt 9960

atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg agcttgcagg atcgccacga 10020

ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt gaccaactct atcagagctt ggttgacggc 10080

aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg caatcgtccg atccggagcc 10140

gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg ccgtctggac cgatggctgt 10200

gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga cgccccagca ctcgtccgag ggcaaagaaa 10260

tagagtagat gccgaccggg atctgtcgat cgacaagctc gagtttctcc ataataatgt 10320

gtgagtagtt cccagataag ggaattaggg ttcctatagg gtttcgctca tgtgttgagc 10380

atataagaaa cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct 10440

aattcctaaa accaaaatcc agtactaaaa tccagatccc ccgaattaat tcggcgttaa 10500

ttcagtacat taaaaacgtc cgcaatgtgt tattaagttg tctaagcgtc aatttgttta 10560

caccacaata tatcctgcca ccagccagcc aacagctccc cgaccggcag ctcggcacaa 10620

aatcaccact cgatacaggc agcccatcag tccgggacgg cgtcagcggg agagccgttg 10680

taaggcggca gactttgctc atgttaccga tgctattcgg aagaacggca actaagctgc 10740

cgggtttgaa acacggatga tctcgcggag ggtagcatgt tgattgtaac gatgacagag 10800

cgttgctgcc tgtgatcacc gcggtttcaa aatcggctcc gtcgatacta tgttatacgc 10860

caactttgaa aacaactttg aaaaagctgt tttctggtat ttaaggtttt agaatgcaag 10920

gaacagtgaa ttggagttcg tcttgttata attagcttct tggggtatct ttaaatactg 10980

tagaaaagag gaaggaaata ataaatggct aaaggtaatg actccaactt attgatagtg 11040

ttttatgttc agataatgcc cgatgacttt gtcatgcagc tccaccgatt ttgagaacga 11100

cagcgacttc cgtcccagcc gtgccaggtg ctgcctcaga ttcaggttat gccgctcaat 11160

tcgctgcgta tatcgcttgc tgattacgtg cagctttccc ttcaggcggg attcatacag 11220

cggccagcca tccgtcatcc atatcaccac gtcaaagggt gacagcaggc tcataagacg 11280

ccccagcgtc gccatagtgc gttcaccgaa tacgtgcgca acaaccgtct tccggagact 11340

gtcatacgcg taaaacagcc agcgctggcg cgatttagcc ccgacatagc cccactgttc 11400

gtccatttcc gcgcagacga tgacgtcact gcccggctgt atgcgcgagg ttaccgactg 11460

cggcctgagt tttttaagtg acgtaaaatc gtgttgaggc caacgcccat aatgcgggct 11520

gttgcccggc atccaacgcc attcatggcc atatcaatga ttttctggtg cgtaccgggt 11580

tgagaagcgg tgtaagtgaa ctgcagttgc catgttttac ggcagtgaga gcagagatag 11640

cgctgatgtc cggcggtgct tttgccgtta cgcaccaccc cgtcagtagc tgaacaggag 11700

ggacagctga tagaaacaga agccactgga gcacctcaaa aacaccatca tacactaaat 11760

cagtaagttg gcagcatcac catggctaaa atgagaatat caccggaatt gaaaaaactg 11820

atcgaaaaat accgctgcgt aaaagatacg gaaggaatgt ctcctgctaa ggtatataag 11880

ctggtgggag aaaatgaaaa cctatattta aaaatgacgg acagccggta taaagggacc 11940

acctatgatg tggaacggga aaaggacatg atgctatggc tggaaggaaa gctgcctgtt 12000

ccaaaggtcc tgcactttga acggcatgat ggctggagca atctgctcat gagtgaggcc 12060

gatggcgtcc tttgctcgga agagtatgaa gatgaacaaa gccctgaaaa gattatcgag 12120

ctgtatgcgg agtgcatcag gctctttcac tccatcgaca tatcggattg tccctatacg 12180

aatagcttag acagccgctt agccgaattg gattacttac tgaataacga tctggccgat 12240

gtggattgcg aaaactggga agaagacact ccatttaaag atccgcgcga gctgtatgat 12300

tttttaaaga cggaaaagcc cgaagaggaa cttgtctttt cccacggcga cctgggagac 12360

agcaacatct ttgtgaaaga tggcaaagta agtggcttta ttgatcttgg gagaagcggc 12420

agggcggaca agtggtatga cattgccttc tgcgtccggt cgatcaggga ggatatcggg 12480

gaagaacagt atgtcgagct attttttgac ttactgggga tcaagcctga ttgggagaaa 12540

ataaaatatt atattttact ggatgaattg ttttagtacc tagaatgcat gaccaaaatc 12600

ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 12660

tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 12720

ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 12780

ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 12840

ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 12900

gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 12960

aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 13020

acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 13080

gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 13140

gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 13200

cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 13260

aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct 13320

gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct 13380

cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgcctg 13440

atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc 13500

agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg 13560

actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt 13620

gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc 13680

agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcaggg tgccttgatg tgggcgccgg 13740

cggtcgagtg gcgacggcgc ggcttgtccg cgccctggta gattgcctgg ccgtaggcca 13800

gccatttttg agcggccagc ggccgcgata ggccgacgcg aagcggcggg gcgtagggag 13860

cgcagcgacc gaagggtagg cgctttttgc agctcttcgg ctgtgcgctg gccagacagt 13920

tatgcacagg ccaggcgggt tttaagagtt ttaataagtt ttaaagagtt ttaggcggaa 13980

aaatcgcctt ttttctcttt tatatcagtc acttacatgt gtgaccggtt cccaatgtac 14040

ggctttgggt tcccaatgta cgggttccgg ttcccaatgt acggctttgg gttcccaatg 14100

tacgtgctat ccacaggaaa cagacctttt cgaccttttt cccctgctag ggcaatttgc 14160

cctagcatct gctccgtaca ttaggaaccg gcggatgctt cgccctcgat caggttgcgg 14220

tagcgcatga ctaggatcgg gccagcctgc cccgcctcct ccttcaaatc gtactccggc 14280

aggtcatttg acccgatcag cttgcgcacg gtgaaacaga acttcttgaa ctctccggcg 14340

ctgccactgc gttcgtagat cgtcttgaac aaccatctgg cttctgcctt gcctgcggcg 14400

cggcgtgcca ggcggtagag aaaacggccg atgccgggat cgatcaaaaa gtaatcgggg 14460

tgaaccgtca gcacgtccgg gttcttgcct tctgtgatct cgcggtacat ccaatcagct 14520

agctcgatct cgatgtactc cggccgcccg gtttcgctct ttacgatctt gtagcggcta 14580

atcaaggctt caccctcgga taccgtcacc aggcggccgt tcttggcctt cttcgtacgc 14640

tgcatggcaa cgtgcgtggt gtttaaccga atgcaggttt ctaccaggtc gtctttctgc 14700

tttccgccat cggctcgccg gcagaacttg agtacgtccg caacgtgtgg acggaacacg 14760

cggccgggct tgtctccctt cccttcccgg tatcggttca tggattcggt tagatgggaa 14820

accgccatca gtaccaggtc gtaatcccac acactggcca tgccggccgg ccctgcggaa 14880

acctctacgt gcccgtctgg aagctcgtag cggatcacct cgccagctcg tcggtcacgc 14940

ttcgacagac ggaaaacggc cacgtccatg atgctgcgac tatcgcgggt gcccacgtca 15000

tagagcatcg gaacgaaaaa atctggttgc tcgtcgccct tgggcggctt cctaatcgac 15060

ggcgcaccgg ctgccggcgg ttgccgggat tctttgcgga ttcgatcagc ggccgcttgc 15120

cacgattcac cggggcgtgc ttctgcctcg atgcgttgcc gctgggcggc ctgcgcggcc 15180

ttcaacttct ccaccaggtc atcacccagc gccgcgccga tttgtaccgg gccggatggt 15240

ttgcgaccgc tcacgccgat tcctcgggct tgggggttcc agtgccattg cagggccggc 15300

aggcaaccca gccgcttacg cctggccaac cgcccgttcc tccacacatg gggcattcca 15360

cggcgtcggt gcctggttgt tcttgatttt ccatgccgcc tcctttagcc gctaaaattc 15420

atctactcat ttattcattt gctcatttac tctggtagct gcgcgatgta ttcagatagc 15480

agctcggtaa tggtcttgcc ttggcgtacc gcgtacatct tcagcttggt gtgatcctcc 15540

gccggcaact gaaagttgac ccgcttcatg gctggcgtgt ctgccaggct ggccaacgtt 15600

gcagccttgc tgctgcgtgc gctcggacgg ccggcactta gcgtgtttgt gcttttgctc 15660

attttctctt tacctcatta actcaaatga gttttgattt aatttcagcg gccagcgcct 15720

ggacctcgcg ggcagcgtcg ccctcgggtt ctgattcaag aacggttgtg ccggcggcgg 15780

cagtgcctgg gtagctcacg cgctgcgtga tacgggactc aagaatgggc agctcgtacc 15840

cggccagcgc ctcggcaacc tcaccgccga tgcgcgtgcc tttgatcgcc cgcgacacga 15900

caaaggccgc ttgtagcctt ccatccgtga cctcaatgcg ctgcttaacc agctccacca 15960

ggtcggcggt ggcccatatg tcgtaagggc ttggctgcac cggaatcagc acgaagtcgg 16020

ctgccttgat cgcggacaca gccaagtccg ccgcctgggg cgctccgtcg atcactacga 16080

agtcgcgccg gccgatggcc ttcacgtcgc ggtcaatcgt cgggcggtcg atgccgacaa 16140

cggttagcgg ttgatcttcc cgcacggccg cccaatcgcg ggcactgccc tggggatcgg 16200

aatcgactaa cagaacatcg gccccggcga gttgcagggc gcgggctaga tgggttgcga 16260

tggtcgtctt gcctgacccg cctttctggt taagtacagc gataaccttc atgcgttccc 16320

cttgcgtatt tgtttattta ctcatcgcat catatacgca gcgaccgcat gacgcaagct 16380

gttttactca aatacacatc acctttttag acggcggcgc tcggtttctt cagcggccaa 16440

gctggccggc caggccgcca gcttggcatc agacaaaccg gccaggattt catgcagccg 16500

cacggttgag acgtgcgcgg gcggctcgaa cacgtacccg gccgcgatca tctccgcctc 16560

gatctcttcg gtaatgaaaa acggttcgtc ctggccgtcc tggtgcggtt tcatgcttgt 16620

tcctcttggc gttcattctc ggcggccgcc agggcgtcgg cctcggtcaa tgcgtcctca 16680

cggaaggcac cgcgccgcct ggcctcggtg ggcgtcactt cctcgctgcg ctcaagtgcg 16740

cggtacaggg tcgagcgatg cacgccaagc agtgcagccg cctctttcac ggtgcggcct 16800

tcctggtcga tcagctcgcg ggcgtgcgcg atctgtgccg gggtgagggt agggcggggg 16860

ccaaacttca cgcctcgggc cttggcggcc tcgcgcccgc tccgggtgcg gtcgatgatt 16920

agggaacgct cgaactcggc aatgccggcg aacacggtca acaccatgcg gccggccggc 16980

gtggtggtgt cggcccacgg ctctgccagg ctacgcaggc ccgcgccggc ctcctggatg 17040

cgctcggcaa tgtccagtag gtcgcgggtg ctgcgggcca ggcggtctag cctggtcact 17100

gtcacaacgt cgccagggcg taggtggtca agcatcctgg ccagctccgg gcggtcgcgc 17160

ctggtgccgg tgatcttctc ggaaaacagc ttggtgcagc cggccgcgtg cagttcggcc 17220

cgttggttgg tcaagtcctg gtcgtcggtg ctgacgcggg catagcccag caggccagcg 17280

gcggcgctct tgttcatggc gtaatgtctc cggttctagt cgcaagtatt ctactttatg 17340

cgactaaaac acgcgacaag aaaacgccag gaaaagggca gggcggcagc ctgtcgcgta 17400

acttaggact tgtgcgacat gtcgttttca gaagacggct gcactgaacg tcagaagccg 17460

actgcactat agcagcggag gggttggatc aaagtacttt gatcccgagg ggaaccctgt 17520

ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt ttcacgccct tttaaatatc 17580

cgattattct aa 17592

Claims (6)

1.一种通过单碱基编辑靶基因启动子失活基因的方法，所述靶基因的启动子区域包含5’非翻译区(5’UTR)，其特征在于，所述方法包括，向靶细胞中导入靶向所述靶基因启动子的5’UTR区域的单碱基编辑系统；使靶基因产生1个或多个上游开放阅读框(uORF)从而导致靶基因失活。

2.根据权利要求1所述的通过单碱基编辑靶基因启动子失活基因的方法，其特征在于，其中导入靶向所述靶基因启动子的5’UTR区域的单碱基编辑系统包括基于CRISPR/Cas9系统的胞嘧啶单碱基系统(CBEs)、腺嘌呤单碱基编辑系统(ABEs)以及先导编辑系统(PEs)。

3.根据权利要求1所述的通过单碱基编辑靶基因启动子失活基因的方法，其特征在于，通过靶位点上单个碱基的替换，使所述靶点产生强翻译起始密码子ATG或弱翻译起始密码子GTG、ATC、ACG、TTG或AAG。

4.根据权利要求1所述的通过单碱基编辑靶基因启动子失活基因的方法，其特征在于，经过编辑后，靶基因编码的完整靶蛋白不表达或者表达量极低。

5.根据权利要求1通过单碱基编辑靶基因启动子失活基因的方法，其中所述靶细胞是植物细胞，包括单子叶植物或双子叶植物，如拟南芥、水稻、小麦、大麦、高粱、玉米或大豆。

6.一种利用如权利要求1所述的通过单碱基编辑靶基因启动子失活基因的方法的应用，其特征在于，经基因失活的细胞再生出的完整植株，其中所述植株中的靶基因失活。

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