CN1944651A

CN1944651A - 通过猝灭团体感应信号防治细菌疾病的细菌菌株、基因和酶

Info

Publication number: CN1944651A
Application number: CNA2006100746173A
Authority: CN
Inventors: 张炼辉; 董义虎; 张海保; 徐金玲
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date: 2000-08-23
Filing date: 2000-08-23
Publication date: 2007-04-11
Also published as: US7888493B2; CN1454260A; AU2000276976B2; WO2002016623A8; KR100751448B1; WO2002016623A1; KR20030065468A; MY142448A; CA2420393A1; AU2000276976B8; EP1325139A1; AU7697600A; US20080182790A1; US7410638B1

Abstract

本发明涉及编码自体诱导物灭活蛋白的、分离的核酸分子，其中所述被编码的蛋白包含选自¹⁰⁴HXHXDH¹⁰⁹～59aa～H¹⁶⁹～21aa～D¹⁹¹和¹⁰³HXHXDH¹⁰⁸～71aa～H¹⁸⁰～21aa～D²⁰²的氨基酸序列，本发明还涉及包含所述核酸分子的表达载体和转化的植物及动物细胞。由这些核酸分子编码的蛋白质使得易感植物或动物对毒力由自体诱导物调节的疾病的抗性提高。本发明还提供了在易感植物和动物体内提高疾病抗性的方法。

Description

通过猝灭团体感应信号防治细菌疾病的细菌菌株、基因和酶

本申请是2003年2月24日提交的题为“通过猝灭团体感应信号防治细菌疾病的细菌菌株、基因和酶”的中国专利申请00819848.9的分案申请。

发明领域

本发明涉及编码细菌代谢调节物的基因，尤其涉及编码猝灭团体感应(quorum-sensing)信号的酶的基因。本发明还涉及防治细菌疾病的方法，所述方法包含表达编码自体诱导物抑制剂的基因。

发明背景

N-酰基-高丝氨酸内酯，已知是自体诱导物(autoinducers，AI)，是存在于许多革兰氏阴性菌的团体感应系统中的广泛保守的信号分子。

已经发现AI参与调节许多生物功能，包括在弧菌种属中的生物发光功能(Eberhard等，1981；Cao和Meighen，1989)，在根癌土壤杆菌中Ti质粒接合转移(Zhang等，1993)，在胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)，菊欧文氏菌(Erw.Chrysanthemi)，斯氏泛菌(Erw.Stewartii)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aemginosa)，茄伯克霍尔德氏菌(P.Solanacerum)，和嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophilus)中产生毒力基因(Jones等，1993；Passador等，1993；Pirhonen等，1993；Pearson等，1994；Beck von Bodman和Farrand，1995；Flavier等，1998；Costa和Loper，1997；Nasser等，1998)，在致金色假单胞菌(P.Aureofaciens)和胡萝卜软腐欧文氏菌中调节抗生素产生(Costa和Loper，1997；Pierson等，1994)，在液化沙雷氏菌(Serratia liquifaciens)中调节游动能力(swarming motility)(Eberl等，1996)，及在荧光假单胞菌(P.fluorescens)和铜绿假单胞菌中形成生物膜(Allison等，1998；Davies等，1998)。已知许多细菌种属产生AI，但相关生物学功能还未确定(Bassler等，1997；Dumenyo等，1998；Cha等，1998)。生物膜形成对细菌的致病性是特别重要的，其使细菌对抗生素和宿主防御应答更具抗性，而且在医疗设施和饮用水管道中导致微生物污染。

不同的细菌菌种可以产生不同的AI。所有的AI衍生物均呈现相同的高丝氨酸内酯组分，但其酰基团的长度和结构不同。尽管由AI调节的靶基因是非常不同的，但AI生物合成和基因调节的基本机制在不同的细菌中看起来是不变的。AI的基因调节的一般特点是细胞密度依赖性，也称为团体感应。在低细胞密度，AI是低浓度的，在高细胞密度，AI可以积聚达到一定的浓度，从而足以激活相关的调节基因(Fuqua和Winans，1996)。由AI调节的生物学功能在学术、经济和医学上具有相当的重要性。正或负调节细菌团体感应系统的新措施不仅在学术方面，在实际应用方面也有重要价值。

近来已经报道一种编码自体诱导物灭活的新基因(aiiA)，已经从革兰氏阳性芽孢杆菌属菌株240B1中克隆(Dong等，2000)。胡萝卜软腐欧文氏菌菌株SCG1是在许多植物中导致软腐病的一种病原体，在转化的胡萝卜软腐欧文氏菌菌株SCG1中表达aiiA，可明显减少AI的释放，降低胞外pectrolytic酶活性，并弱化其对马铃薯，茄子，白菜，胡萝卜，芹菜，花椰菜和烟草的致病性胡萝卜软腐欧文氏菌。这些结果表明使用AI灭活措施来预防一些其毒力由团体感应信号调节的疾病具有很大的潜力。

发明概述

能有效灭活N-酰基高丝氨酸内酯自体诱导物(AI)的细菌菌株和酶具有相当大的生物技术应用价值。本发明发现，所有经测试的苏云金芽孢杆菌菌株及其密切相关的菌种均能酶促灭活AI。通过Tn5插入诱变产生的一个根癌土壤杆菌菌株A6的AI合成负突变体，也发现其能产生AI灭活酶。从选择的细菌菌株中，通过功能克隆方法或通过PCR方法克隆编码AI灭活酶的基因。肽序列对比表明所有这些酶均属于金属水解酶家族，与先前报道的AiiA酶具有35.4％-94.0％的氨基酸相同性。当与产生AI的致病细菌共同培养时，苏云金芽孢杆菌菌株有效猝灭AI活性，并可有效地生物防治由胡萝卜软腐欧文氏菌导致的马铃薯软腐病。这些结果提示猝灭调节毒力的生物信号是防治疾病的一种有效策略，而且已知具有杀虫作用的苏云金芽孢杆菌菌株也可作为一类大有希望的生物防治剂以用于预防那些其毒力是由AI调节的疾病。

附图简述

图1示出通过根癌土壤杆菌菌株M103的蛋白质提取物灭活AI(OOHL)的时程。M103的总蛋白质是通过在1/15M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中超声破坏细菌细胞提取的。将等体积的M103蛋白提取物(1.46mg/ml)和5000nM OOHL混合，并在1.5ml Eppendorf离心管中在28℃温育。将同样的蛋白质提取物通过煮沸5分钟变性并用作对照。在反应后1，3，6小时取样品，并通过煮沸3分钟中止反应。分析样品的AI活性。

图2示出来自突变体M103的粘粒克隆的AI灭活区的克隆。两个粘粒克隆包含于粘粒载体pLAFR3中，而4个亚克隆在质粒载体pBluescript II SK(+)中。符号：+，在AI灭活中是阳性的；-，在AI灭活中是阴性的；E：EcoRI；P：PstI。

图3示出：(A)，用序列分析程序推定的1.5kbAI灭活区中潜在的ORFs；及(B)，缺失分析以确定编码AI灭活酶(AiiB)的ORF。将PCR扩增的片段克隆入载体pBluescript II SK(+)(pBM克隆)或载体pKK223-3(pKM克隆)中。每个克隆下的数字表示相当于所述1.5kb区的核苷酸序列的PCR片段的起始和终止位置。通过测序分析证实所有的构建体。aiiB ORF的起始密码子(GTG)和终止密码子(TAA)示于克隆pKM103-315之下。

实线箭头表示在这些克隆中lac和tac启动子的位置和方向，ORFs是用虚线箭头表示的。符号：+，阳性AI灭活活性；-，阴性AI灭活活性。

图4示出：从根癌土壤杆菌M103中克隆的aiiB具有的(A)，核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，和(B)，推定的肽序列(SEQ ID NO：11)。下划线处是推导的核糖体结合(SD)区和两个PstI限制酶位点，并表示出了推导的转录终止密码子。

图5示出AiiB(SEQ ID NO：11)和AttM(SEQ ID NO：21)蛋白质序列对比，所述AttM是在根癌土壤杆菌的att区域中由attM基因编码的一种推导的蛋白质，但其功能还未经实验证实(基因库登记号No.U59485)。这两种蛋白质呈现高度相似性(中心序列表示共有序列，4个片段等同于SEQ ID NO：11的8-43，45-158，160-186和188-263位氨基酸)，但功能性AiiB蛋白在N末端具有额外的7个氨基酸。

图6示出AiiB(SEQ ID NO：11)和AiiA(SEQ ID NO：22)的蛋白质序列对比，AiiA是灭活克隆自芽孢杆菌属240B1的AI的一种推导的金属水解酶。下划线处是两个保守的锌结合区。

图7示出aiiC基因的功能性克隆。(A)，通过悬浮培养Bt菌株酶促灭活AI。将等体积的细胞悬浮培养物(OD₆₀₀＝1.1)和40uM OOHL混合，并在28℃温育(▲)。将煮沸的培养物和同浓度的OOHL用作对照(■)。在所示时间取样品进行AI活性分析。(B)，从苏云金芽孢杆菌Cot1的粘粒克隆pLAFR3-aiiC中直接亚克隆AI-灭活区。将粘粒克隆用EcoRI消化并亚克隆至pGEM-7Z载体中。通过酶活性分析鉴别AI灭活阳性克隆pGEM7-aiiC。在BamHI消化后，将pGEM7aiiC进一步亚克隆至pBluescript II SK(+)载体中。将包含于克隆pBSaiiC中的大约1.4kb的AI灭活区完整测序。限制酶：E：EcoRI；B：BamHI。

图8示出从Bt菌株Cot1中克隆的aiiC基因的(A)，核苷酸序列(SEQID NO：2)和(B)推定的肽序列(SEQ ID NO：12)。aiiC ORF的核苷酸序列是用大写字母表示的，未翻译区是用小写字母表示的。

图9示出分别来自Bt菌株B1，B2，B17，B18，B20，B21，B22和B25的基因aiiD(SEQ ID NOS 3和13)，aiiE(SEQ ID NOS 4和14)，aiiF(SEQ ID NOS 5和15)，aiiG(SEQ ID NOS 6和16)，aiiH(SEQ ID NOS 7和17)，aiiI(SEQ ID NOS 8和18)，aiiJ(SEQ IDNOS 9和19)和aiiK(SEQ ID NOS 10和20)的核苷酸序列和推定的蛋白质序列(括号内)。

图10示出11个克隆的AI灭活基因的系统树分析和氨基酸相同性。所述系统树是通过DNASTAR序列分析软件(DNASTAR Inc.)产生的。距离在树下示出。每个样品与AiiA的氨基酸相同性在图的右手侧示出。

图11示出Bt菌株对胡萝卜软腐欧文氏菌产生AI的作用。将胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1单独接种在15ml的LB培养基中(◆)，或分别与以下菌株一起以1∶1比例共同接种在相同培养基中：Bt菌株Cot1(△)和B1(●)，大肠杆菌菌株DH5α(▲)及梭形气芽孢杆菌(■)。SCG1的接种浓度(T₀)为1×10⁷CFU/ml(菌落形成单位/ml)，其它为1×10⁶CFU/ml。在30℃温育1，2，3，4，6和24小时后，取细菌悬浮液并将上清用于生物学分析产生的AI。数据是4次重复试验的平均值。

图12示出Bt菌株Cot1对胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1所致的马铃薯软腐病的防治作用。浸渍：将马铃薯切片浸渍在水平为大约5×10⁸CFU/ml的Bt菌株Cot1(C)，大肠杆菌DH5α(D)或梭形气芽孢杆菌(Bf)悬浮液中，或浸渍在水(W)中，时间为20秒，然后在无菌气流中干燥大约20分钟。将表面无水分的切片用2.5μl的细菌悬浮液接种，所述悬浮液含有等于5×10⁵或5×10⁴CFU的SCG1细胞。混合物：将SCG1的细胞培养物(2×10⁸或2×10⁷CFU/ml)分别与等体积的Cot1(C)，大肠杆菌DH5α(D)，梭形气芽孢杆菌(Bf)(5×10⁸CFU/ml)或水(W)混合。将2.5μl的所述混合物接种于切片上部。接种的SCG1的最终细胞数目是2.5×10⁵或2.5×10⁴CFU，在图下的第二条线表示。在28℃温育20小时后，测定软化部位的面积。数据是4或12次(对Cot1是12次)重复试验的平均值。

图13示出Bt菌株Cot1和B1对胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1生长的影响。将胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1(■)单独接种于或分别与Bt菌株Cot1(◆)和B1(▲)一起以1∶1比例接种于15ml LB培养基中。在T0培养基中，每个菌株的接种终浓度：SCG1为大约1×10⁷CFU/ml，其它的为1×10⁶CFU/ml。在30℃培养2，4，6和24小时后，取细菌悬浮液，并稀释以涂布于平板上计数菌落。将所述试验重复4次，以平均值表示结果。上方：将SCG1，Cot1和B1温育并单独生长；中间：将SCG1与Cot1一起温育；下方：将SCG1与B1一起温育。

图14示出接种的马铃薯切片上细菌细胞数目的变化(A)，及软腐症状的发生(B)。将马铃薯切片浸渍在Cot1悬浮液中(5×10⁸CFU/ml)(▲)或水(◆)，时间为20秒，然后在层流室中干燥大约20分钟。然后将切片用5μl的胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1接种(2×10⁹CFU/m1)。在28℃温育1，2，3和4天后，将接种的切片切成小片，并加入10ml的0.1M的NaCl溶液以重悬所述细菌细胞。将混合物摇动30分钟，并将悬浮液稀释，涂布于平板上计数菌落。SCG1的菌落数示为log10CFU/切片(▲，只有SCG1；■，在Cot1中浸渍)，Cot1的菌落数为log10CFU/mm²(◆)。将试验重复4次，取平均数据表示结果。

发明详述

已经从9个革兰氏阳性菌分离株和1个革兰氏阴性菌(根癌土壤杆菌)中克隆了编码AI灭活酶的10个基因。这些基因示出与aiiA基因具有不同水平的同源性，所述aiiA编码一种具有强AI灭活活性的推定的金属水解酶(Dong等，2000)。与AiiA相似，在这些新克隆的AI灭活基因编码的酶蛋白中，锌结合基序区是高保守的。很可能这10个基因也是金属水解酶家族成员，并使用与AiiA相同的分子学机制灭活N-酰基高丝氨酸内酯自体诱导物。本发明进一步丰富了AI灭活酶的基因集合。

在根癌土壤杆菌中，N-酰基高丝氨酸内酯自体诱导物，主要是OOHL，参与调节Ti质粒接合转移(Zhang等，1993)。OOHL在根癌土壤杆菌中的产生是通过冠瘿瘤分泌的接合冠瘿氨基酸诱导的(Zhang和Kerr，1991)。反过来OOHL诱导tra基因表达。Tra蛋白负责完成Ti质粒接合转移的过程。从冠瘿氨基酸产生到完成Ti质粒接合转移只需要几个小时，因此Ti质粒接合转移可以认为是瞬时的。本发明的一个实施方案，在根癌土壤杆菌中鉴别的针对N-酰基高丝氨酸内酯降解的aiiB基因，突出了所述细菌具有防治AI信号翻转的复杂机制的可能性。似乎可能的是AI在完成Ti质粒接合转移后在土壤杆菌属中降解。

已经注意到大多数能灭活AI的细菌分离株是革兰氏阳性的，属于苏云金芽孢杆菌及密切相关的种属。迄今为止，大多数以被描述的革兰氏阴性菌的团体感应信号是N-酰基高丝氨酸内酯(Fuqua等，1996)，而革兰氏阳性菌产生寡肽作为团体感应信号(Dunny和Leonard，1997)。

在过去的30年中，苏云金芽孢杆菌(Bt)已经广泛用作杀微生物剂。所述微生物是革兰氏阳性的产芽孢土壤杆菌，并在孢子形成期间产生由一或多个晶体(Cry)蛋白组成的伴孢晶体，其示出对昆虫家族如鳞翅目昆虫，双翅目昆虫，和鞘翅目昆虫幼虫期的杀灭活性(Lambert和Peferoen，1992)。还报道了一些Bt菌株具有抗其它昆虫家族，以及螨虫，线虫，扁形动物和原生动物的活性(Feitelson等，1992)。不同的Bt菌株产生28种以上不同但相关的杀昆虫晶体蛋白基团(http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/)。不同的晶体蛋白基团通常对一特定范围的昆虫属具有活性，但不影响对农业有益的其它昆虫。目前，基于Bt的组方是最广泛使用的，而且是农业最有效的微生物杀虫剂。

作为有价值的生物防治剂，Bt有许多优点，包括其对靶昆虫具有特异性，低廉的生产费用，及其环境相容性(Lambert和Peferoen，1992)。Bt通常见于天然土壤中，一般通过细胞分裂而增殖，但当养分缺乏或当环境不利时产生孢子。这些孢子对应激条件如热和干旱具有高度抗性，使细菌在应激条件下存活一段时间。这个形成孢子的革兰氏阳性微生物易于制成稳定的产物，如干粉，以用于对昆虫或疾病的生物防治。Bt也已经进行了许多安全性测试，对动物和人没有有害作用。

Bt还未开发用于疾病防治，因为其通常不产生有效的抗细菌和真菌的抗生素。在本发明中，发现所有测试的Bt菌株均能灭活AI，而且这个Bt菌株提供有效抗胡萝卜软腐欧文氏菌感染的生物防治作用，而不具有AI灭活基因的梭形气芽孢杆菌和大肠杆菌菌株不能提供抗胡萝卜软腐欧文氏菌的生物防治作用。Bt菌株不产生任何抗生素，且不抑制病原体的生长。这些结果明显提示AI灭活基因在疾病防治中的重要作用。由于AI易于扩散至细菌细胞中，因此能将AI从其周围环境中持续消除的Bt是一种有前途的生物防治剂，不仅可用于防治由胡萝卜软腐欧文氏菌引起的植物软腐病，还可用于防治其中毒力基因是由AI调节的其它疾病。

因此，本发明的一方面是提供一种提高植物或动物对毒力是由AI调节的疾病的抗性的方法(如由铜绿假单胞菌，斯氏泛菌，菊欧文氏菌，茄伯克霍尔德氏菌，和野油菜黄单胞菌(Passador等1993；Pirhonen等，1993；Pearson等，1994；Beck von Bodman和Farrand，1995；Barber等，1997；Clough等，1997；Costa和Loper，1997；Nasser等，1998)引起的疾病，尤其是由胡萝卜软腐欧文氏菌引起的植物软腐病)，包括为所述植物或动物施用有效量的细菌，所述细菌能产生一种自体诱导物抑制剂。在本发明这方面的一个优选实施方案中，施用的细菌是芽孢杆菌属，更优选的是各种苏云金芽孢杆菌，最优选的是选自B1，B2，B17，B18，B20，B21，B22和B25的各种苏云金芽孢杆菌。在本发明此方面的另一个优选的实施方案中，所处理的动物优选是人。

本发明另一目的是提供分离的编码自体诱导物灭活蛋白的核酸分子。这些核酸分子编码自体诱导物灭活蛋白，其呈现保守的氨基酸基序¹⁰⁴HXHXDH¹⁰⁹～59aa～H¹⁶⁹～21aa～D¹⁹¹，或相似的基序¹⁰³HXHXDH¹⁰⁸～71aa～H¹⁸⁰～21aa～D²⁰²。这些核酸分子优选编码SEQ ID NO：11-20的蛋白，最优选这些核酸分子具有SEQ ID NO：1-10的序列。

本发明另一目的是提供一种表达载体，其包含至少一个编码自体诱导物灭活蛋白的核酸序列，其中编码的蛋白包含保守的氨基酸基序¹⁰⁴HXHXDH¹⁰⁹～59aa～H¹⁶⁹～21aa～D¹⁹¹，或类似的基序¹⁰³HXHXDH¹⁰⁸～71aa～H¹⁸⁰～21aa～D²⁰²，其中所述表达载体在原核或真核细胞中增殖。这些表达载体优选包含至少一个核酸序列，所述核酸序列编码具有选自SEQ ID NO：11-20序列的蛋白质，最优选具有SEQ ID NO：1-10的核酸序列。

本发明的另一目的是提供一种用本发明表达载体转化或转染的原核细胞或真核细胞。

本发明的又一目的是提供一种分离的具有自体诱导物灭活活性的蛋白质，其中所述蛋白包含保守的氨基酸序列¹⁰⁴HXHXDH¹⁰⁹～59aa～H¹⁶⁹～21aa～D¹⁹¹，或相似基序¹⁰³HXHXDH¹⁰⁸～71aa～H¹⁸⁰～21aa～D²⁰²。本发明优选的实施方案包含具有SEQ ID NO：11-20氨基酸序列的蛋白质。

本发明的再一目的是提供一种提高植物或动物对疾病的抗性的方法，所述方法包括将至少一种编码自体诱导物灭活蛋白的核酸分子导入这种植物或动物细胞中，以使所述细胞表达所述核酸序列，其中所述自体诱导物灭活蛋白包含保守的氨基酸序列¹⁰⁴HXHXDH¹⁰⁹～59aa～H¹⁶⁹～21aa～D¹⁹¹，或相似基序¹⁰³HXHXDH¹⁰⁸～71aa～H¹⁸⁰～21aa～D²⁰²。本发明此方面的优选实施方案包括导入至少一种核酸分子，所述核酸分子编码具有选自SEQ ID NO：11-20序列的蛋白质，及最优选的实施方案可导入至少一种核酸序列，所述核酸序列选自SEQ ID NO：1-10。

本发明的另一目的涉及一种预防或降低细菌对植物或动物损害的方法，所述方法包括为需要这种预防或降低损害的植物或动物施用有效量的至少一种自体诱导物灭活蛋白，其中所述蛋白包含保守的氨基酸序列¹⁰⁴HXHXDH¹⁰⁹～59aa～H¹⁶⁹～21aa～D¹⁹¹，或相似基序¹⁰³HXHXDH¹⁰⁸～71aa～H¹⁸⁰～21aa～D²⁰²。本发明此方面的优选实施方案包含至少提供具有SEQ ID NO：11-20氨基酸序列的蛋白质。

本发明的另一目的涉及一种预防或降低细菌生物膜形成的方法，所述方法包括将形成生物膜的细菌暴露于至少一种自体诱导物抑制蛋白，其中所述蛋白包含保守氨基酸序列¹⁰⁴HXHXDH¹⁰⁹～59aa～H¹⁶⁹～21aa～D¹⁹¹，或相似基序¹⁰³HXHXDH¹⁰⁸～71aa～H¹⁸⁰～21aa～D²⁰²。本发明此方面优选的实施方案包括将形成生物膜的细菌暴露于至少具有SEQ IDNO：11-20氨基酸序列的蛋白质。

使用遗传方法修饰此类菌株，例如通过导入编码额外的或更具活性的自体诱导物抑制剂的基因，有可能进一步增强Aii-产生菌株的效力。通过体外DNA进化方法，也可以使aii基因的酶活性最佳化。通过将aii基因偶联于强启动子或提高Bt细胞中aii基因的拷贝数而提高Aii酶的表达，是增强Bt菌株猝灭AI信号能力的另一种有效方式。分泌AI灭活酶或在细胞外膜中含有所述酶的经遗传修饰的Bt菌株，其猝灭AI信号的效力比其野生型亲代菌株更好。这可以通过将aii基因与编码分泌信号肽或膜附着信号肽的序列融合而实现。

可以通过熟知的方法将所述序列导入植物或动物细胞中。用外源核酸序列转化或转染真核细胞的方法包括转染，发射轰击，电穿孔或通过根癌土壤杆菌感染。这些方法是分子生物学和生物技术领域技术人员熟知的，在此不需要详细阐述。

由于病原菌细胞限于植物组织的细胞间区域，因此需要将Aii蛋白导向细胞间隙。这可以通过将分泌信号肽融合于Aii蛋白而实现(Sato等，1995；Firek等，1993；Conrad和Fiedler，1998；Borisjuk等，1999)。或者，可以将植物膜附着基序掺入Aii肽序列中，以将Aii酶锚定在植物细胞膜的外表面。

本发明还涵盖了细菌自体诱导物灭活蛋白在直接治疗或预防细菌损害方面的用途。例如，可以将所述蛋白直接用于需要这种治疗或预防的植物中。在优选的实施方案中，所述蛋白是以组合物形式应用的，所述组合物包含有效量的所述蛋白质和一种适当的载体。所述组合物可以是各种形式的，包括溶液，粉末，乳状液，分散液，膏状，气雾剂等。

所述细菌自体诱导物灭活蛋白也可以用于治疗动物包括人体内的细菌感染。在这样的应用中，将有效量的活性成分施用于需要这种治疗的动物。

针对治疗性处理，所述活性成分可以配制为药用组合物，除了有效量的活性成分之外，可以包括可药用的载体，稀释剂，缓冲剂，防腐剂，表面活性剂等。如果必需或需要，组合物还可以包括一或多种其它活性成分。

本发明的药物组合物可以用本领域技术人员已知的各种方式施用。可以例如局部，口服，吸入，或非肠道施用。局部施用配方可以包括软膏，洗液，乳剂，凝胶，滴剂，栓剂，喷雾剂，液体和粉末。口服配方包括例如粉末，颗粒，在水或非水介质中的悬浮液或溶液，胶囊或片剂。如果需要可以使用增稠剂，香料，稀释剂，乳化剂，分散剂或结合剂。非肠道配方可以包括无菌水溶液，其也可以含有缓冲剂，稀释剂和其它适当添加剂。剂量应用方案依赖于许多易于确定的因素，如所治疗的病变的严重程度和反应。

传统地，微生物的生物防治依赖于抗生素或抗微生物化合物的产生(Cronin等，1997；Liao和Sapers，1999；Emmert和Handelsman，1999)。本发明提供了另一种生物防治策略，其基于猝灭毒力所必需的生物信号。

实施例1：能灭活自体诱导物的细菌菌株

为鉴别负责灭活自体诱导物信号的基因，对400个以上的土壤和植物细菌分离株及大约100个实验室细菌培养物进行了筛选。用于测试灭活自体诱导物信号能力的所述细菌菌株，可如前所述分离自土壤和植物悬浮液(Dong等，2000)，或者得自芽孢杆菌Genetic StockCentre(BGSC)和美国典型培养物保藏中心(ATCC)。胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1分离自出现软腐症状的中国白菜叶，其已从16S DNA序列、及其特征性产生自体诱导物及在马铃薯和中国白菜中导致软腐病得到证实。将这些菌株在28℃在Luria-Bertani(LB)培养基中生长，当必需时进行摇动培养。将根癌土壤杆菌菌株在28℃在YEB中，在BM基本培养基(基本营养培养基，添加甘露醇作为唯一碳源)，或在营养琼脂平板上(Difco Laboratories)生长。终浓度为0.2％的甘露醇在基本培养基中用作唯一碳源。将大肠杆菌菌株在37℃在LB中或LB琼脂平板上生长。当需要时，加入以下浓度的抗生素：50μg/ml利福平，100μg/ml链霉素，100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素，和10μg/ml四环素。培养基中包含50μg/ml的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-吡喃半乳糖苷)(Promega)以检测β-半乳糖苷酶活性。

有30多个菌株示出不同水平的AI灭活活性。为定性所述未知分离株，将这些分离株的16SrRNA序列通过PCR扩增加以分析，及随后进行测序。这些序列研究示出能灭活AI的这些菌株的16S rRNA序列是与苏云金芽孢杆菌(Bt)高度同源的。

为测试其它芽孢杆菌菌株是否也具有AI-灭活活性，选择已知的菌株苏云金芽孢杆菌，腊状芽孢杆菌，蕈状芽孢杆菌和球形芽孢杆菌进行生物分析。为确定细菌菌株和分离株的AI灭活能力，将自体诱导物，N-β-氧-己酰基-L-高丝氨酸内酯(OHHL)或N-β-氧-辛酰基-L-高丝氨酸内酯(OOHL)，加入到已稀释为OD₆₀₀＝1.1的细菌过夜培养物中，或加入到蛋白质提取物中，OHHL或OOHL的终浓度为20uM，在28℃温育30分钟。然后如前所述确定上清中的剩余的AI(Zhang，1993；Dong等，2000)。

表1示出选择的菌株和一些新鉴别的分离株的AI灭活活性。所有测试的细菌菌株，除了球形芽孢杆菌和梭形气芽孢杆菌之外，均以不同水平的酶活性消除了AI(浓度为20uM OHHL)。这些菌株包括13个已知的芽孢杆菌菌种(表1中以B打头的菌株)，1个已知土壤杆菌菌种和9个通过16S rDNA序列分析鉴别的芽孢杆菌菌种。其中，12个细菌菌株示出高水平AI灭活活性(＞30μM/h/OD₆₀₀)；8个示出中等水平活性(25-30μM/h/OD₆₀₀)；及根癌土壤杆菌菌株M103示出低水平活性(4.5μM/h/OD₆₀₀)。除了根癌土壤杆菌之外，所有这些AI灭活菌株均为革兰氏阳性并属于苏云金芽孢杆菌或其密切相关菌种。

表1细菌菌株及其AI灭活活性

	菌株	来源	酶活性(μM/h/OD₆₀₀)
	菌株	来源	酶活性(μM/h/OD₆₀₀)	28-32258-36960-1250262B18B20B21B22B23B1B2B12B17B25B14579B6462240BCotM103269B29	苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种苏云金芽孢杆菌以色列亚种苏云金芽孢杆菌苏云金亚种苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种苏云金芽孢杆菌武汉亚种蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌蕈状芽孢杆菌芽孢杆菌属苏云金芽孢杆菌根癌土壤杆菌梭形气芽孢杆菌球形芽孢杆菌	此项研究此项研究此项研究此项研究此项研究此项研究此项研究此项研究此项研究此项研究BGSC(4Q7)BGSC(4A3)BGSC(4D1)BGSC(4J4)Mycogen(PSS2A1)此项研究ATCC(14579)ATCC(6462)此项研究此项研究此项研究此项研究BGSC(12A4)	32.4±1.132.5±1.230.9±2.328.2±5.123.4±3.923.1±1.527.4±3.032.7±2.433.1±0.832.8±1.326.7±3.532.5±0.333.0±0.633.5±0.928.8±4.133.7±0.831.7±0.629.8±2.233.0±1.025.1±2.44.500

*不含质粒(Plasmid minus)

**将等体积的细菌悬浮液(来自过夜培养物，稀释为OD₆₀₀＝1.1)和OHHL(40μM)在28℃温育30分钟，然后如前所述确定上清中剩余的OHHL(Zhang，1993)。所述酶活性以每小时每OD₆₀₀细菌培养物被消化的OOHL的μM值表示。数值是4次重复试验的平均值±标准误差。以“B”打头的菌株是已知的杆菌属。其它杆菌菌株是通过16S rDNA序列分析鉴别的。

这些证据提示AI灭活基因位于染色体DNA中，但不在质粒中，因为苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种菌株B2及其不含质粒的衍生菌株B22，均示出相似水平的酶活性。第二个不含质粒菌株B23属于苏云金芽孢杆菌以色列亚种，也能酶促灭活AI。

为研究灭活AI的基因的遗传多样性，选择示出高水平，中等及低水平AI-灭活活性的代表性菌株进行进一步克隆试验。

实施例2：从根癌土壤杆菌菌株M103中功能性克隆aiiB基因

使用大肠杆菌SM10中自杀质粒pSUP10(Simon等，1983)将转座子Tn5插入体导入根癌土壤杆菌章鱼肉碱(octopine)菌株A6中，按照Garfinkel和Nester(1980)所述方法进行，将细菌悬浮液涂布于含有卡那霉素(100μg/ml)的BM基本培养平板上。将根癌土壤杆菌突变菌株M103的总DNA用EcoRI部分酶切，从低熔点的琼脂糖凝胶中回收20-30kb片段并纯化。将纯化的片段连接于粘粒载体pLAFR3的去磷酸化EcoRI位点(Staskawicz等，1987)。将所述连接混合物用GigapackTMIII XL包装提取试剂盒(Stratagene)包装，然后转染入大肠杆菌DH5α中。将在含有四环素的选择培养基上生长的大约2000个菌落加以维持，作为根癌土壤杆菌突变体菌株M103的基因组文库。将含有Tn5的粘粒克隆在含有卡那霉素的培养基上选择，并通过上述生物分析方法进一步分析AI灭活活性。通过常规方法亚克隆入测序载体pGEM-7Zf(+)中(Sambrook等，1989)。使用ABI PrismdRhodamine终止子循环测序便利反应试剂盒(Perkin-Elmer应用生物系统)对两个链均进行测序。

根癌土壤杆菌菌株A6产生N-酰基高丝氨酸内酯自体诱导物(AI)，其参与调节Ti质粒接合转移(Zhang和Kerr，1991)。但其通过Tn5插入诱变产生的衍生物M103能灭活AI(表1和图1)。菌株A6中编码AI降解的基因可能是由阴性调节物调节的，而且Tn5插入导致灭活AI的基因的组成型表达。

基于AI灭活基因可以位于Tn5插入位点下游的假设，含有Tn5转座子的粘粒克隆通过卡那霉素抗性表型选择。对卡那霉素具有抗性的及示出AI灭活活性的两个粘粒克隆，得自M103的粘粒文库。限制分析和生物分析示出一个5.2kb的EcoRI片段具有AI灭活活性。进一步的亚克隆限定所述区域为一个1.5kb的PstI片段(图2)。序列分析示出在所述片段内存在一些推定的起自ATG或UTG的开放读框(ORF)。所述ORF之一示出与预先鉴别的根癌土壤杆菌的attM基因(U59485)具有96.8％核苷酸序列相同性和98％的氨基酸序列相同性。然而，当通过表达载体pKK223-3在大肠杆菌中表达attM中时，未检测到AI灭活活性。对所述1.5kb片段的缺失分析示出一个792bp的ORF，其起始密码子是GTG，而非通常的ATG，其编码AI灭活(图3)。将该基因命名为aiiB(图4)。与尚未经试验鉴定生物功能的AttM相对比，所述AiiB在N末端具有7个额外的氨基酸(图5)。AiiB与先前报道的AiiA相对比，在氨基酸水平示出35.4％相同性(图6)。实施例3：从苏云金芽孢杆菌菌株Cot1中功能性克隆aiiC基因

菌株Cot1的悬浮培养物在温育2小时后完全消除AI(20uM)，但通过煮沸5分钟杀死的细菌细胞不能灭活AI(图7A)，表明存在一种酶促灭活机制。为从Cot1中鉴别编码AI灭活的基因，用EcoRI部分酶切细菌分离株Cot1的基因组DNA构建一个粘粒文库。从细菌分离株Cot1中提取基因组DNA，并用EcoRI部分酶切。将所述DNA片段与粘粒载体pLAFR3的去磷酸化的EcoRI位点连接。包装连接的DNA并转染入大肠杆菌DH5α中。通过上述生物分析方法鉴定具有AI灭活活性的粘粒克隆。通过常规方法亚克隆入测序载体pGEM-7Zf(+)或pBlueScript SK中。

从1000个筛选的粘粒克隆中鉴别一个示出AI灭活功能的克隆。限制性内切酶分析示出这个克隆含有一个24kb的插入体。将通过EcoRI完全消化产生的所有5个片段亚克隆入pGEM7载体中。对这些亚克隆进行的生物分析示出一个克隆，即具有5kb插入体的pGEM7-aiiC，具有AI灭活活性。进一步的亚克隆鉴定发现在克隆pBS-AiiC中含有一个1.4kb BamHI片段，其与AI灭活功能相关(图7B)。克隆pBS-AiiC的完整序列示出其具有一个750bp核苷酸的ORF(从166到918)，其编码一种250个氨基酸的蛋白质(图8)。将这个ORF在大肠杆菌表达载体中克隆证实其编码一种功能性AI灭活酶，称为AiiC。在肽序列水平，所述AiiC基因与AiiA和AiiB分别示出91％和33％的相同性。通过FASTA和BLAST分析，在核苷酸或肽水平所述aiiC基因与数据库中其它已知序列没有明显相似性。

实施例4：Bt中自体诱导物灭活基因属于相同基因家族

在经过检测的具有AI灭活活性的细菌分离株中，除了根癌土壤杆菌菌株M103之外，所有菌株均是革兰氏阳性的，并属于苏云金芽孢杆菌(Bt)或密切相关的细菌属。来自两种杆菌菌株的aiiA和aiiC基因示出高水平相似性。非常有可能的是aiiA和aiiC基因在苏云金芽孢杆菌菌株中是高度保守的。使用aiiC片段作为探针进行DNA杂交(Southem印迹)。从以下18个选择的细菌菌株中分离基因组DNA：B1(Bt ssp.thuringiensis)，B2，B3和B4(Bt ssp.kurstaki)，B22(Bt ssp.kurstaki plasmid minus)，B12(Bt ssp.Aizawai)，B16和B17(Bt ssp.Wuhanensis)，B23(Bt ssp.Israelensis)，和其它Bt菌株B18，B20，B21，240B1，471W，和Cot1以及B25和B26(腊状芽孢杆菌)，及B29(球形芽孢杆菌)。根据厂商指导，将用EcoRI酶切的基因组DNA(20μg)在0.8％琼脂糖凝胶中通过电泳分离，然后将所述DNA移至Hybond-N+膜上(Amersham Pharmacia，Biotech.)。将含有aiiC密码子区域的1.4kb的BamHI片段用DIG标记，以用作杂交探针。

在65C杂交后，将所述膜在2×SSC，0.1％SDS中，在室温冲洗5分钟，共两次，随后在0.1×SSC，0.1×SDS中，在65℃冲洗15分钟，共两次。在冲洗后，根据厂商指导(Boehringer Mannheim)，将所述膜用抗DIG-AP缀合物检测，NBT/BCIP溶液用作显色底物。

结果示出除了B29(球形芽孢杆菌)之外，从所有测试的菌株中清晰检测出一个杂交条带。这些结果表明在所有测试的苏云金芽孢杆菌菌株及其密切相关的蜡状芽孢杆菌中，均存在一个基因，其具有类似于aiiC的序列。这与生物分析数据一致(表1)。

实施例5：从更多的细菌分离株中克隆其它AI灭活基因

由于AI灭活基因是高度保守的，因此使用PCR方法从选择的苏云金芽孢杆菌分离株中克隆其它的AI灭活基因。分离自细菌分离株B1，B2，B17，B18，B20，B21，B22和B25的基因组DNA用作模板。引物是基于aiiA和aiiC基因的5’和3’末端的保守序列而设计的。使用标准PCR条件从选择的细菌分离株中扩增AI灭活基因。所述引物序列是：C5f：5′-ATG GGA TCC ATG ACA GTA AAG AAG CTT TAT-3′；C3r：5′-GTC GAA TTC CTC AAC AAG ATA CTC CTA ATG-3′。所述PCR反应如下进行35次循环：94℃30秒，55℃30秒，及72℃1分钟，使用Perkin Elmer GenAmp PCR系统2400。进行两次独立的PCR反应，以保证在扩增的序列中没有误差。将所述PCR产物通过使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，并将纯化的PCR片段连接于pGEM-T载体(Promega)。选择具有灭活自体诱导物活性的克隆进行进一步研究。对得自每个菌株的两个这样的克隆测序。对核酸序列数据和推导的氨基酸序列，用DNASTARTM序列分析软件包(DNASTAR公司)和GCG序列分析软件(Genetics Computer Group，Wisconsin)进行分析。使用BLASTA研究程序进行数据库研究。

图9示出分别从Bt菌株B1，B2，B17，B18，B20，B21，B22和B25中克隆的8个AI灭活基因(称为aiiD-aiiK)的核苷酸序列和推导的肽序列。这些序列均含有一个750bp的ORF，其编码一种250个氨基酸的蛋白质。

实施例6：自体诱导物灭活基因在Bt和密切相关的芽孢杆菌菌种.的成员中是高度保守的

除了aiiB基因，所有其它基因均是克隆自革兰氏阳性细菌分离株。序列分析表明克隆自革兰氏阳性菌分离株的aii基因是高度保守的，与AiiA相对比具有90.4％-94.0％的高度氨基酸相同性(图10)。克隆自革兰氏阴性根癌土壤杆菌的aiiB基因示出与其它aii基因的相似性较低，在进化树中簇集为一个小组(图10)。这些结果表明自体诱导物基因在Bt和与其密切相关的芽孢杆菌成员中是高度保守的。

在所有这些Aii蛋白质序列中，除了AiiB之外均含有一些具有天冬氨酸残基的不变的组氨酸，模式为¹⁰⁴HXHXDH¹⁰⁹～59aa～H¹⁶⁹～21aa～D¹⁹¹；根癌土壤杆菌的AiiB含有相似的但又不同的基序¹⁰³HXHXDH¹⁰⁸～71aa～H¹⁸⁰～21aa～D²⁰²。这个模式与金属水解酶标准一致(Vallee和Galdes，1984)。据推测，Arabidopsis乙二醛酶II中的基序HXHXDH参与了与锌离子的结合(Crowder等，1997)。定点诱变示出除了第一个组氨酸(AiiA中的104H)之外，这个基序中所有这些残基均是AiiA活性所必需的。这些不变的组氨酸和天冬氨酸残基也存在于AiiB到AiiK中，表明它们属于相同的自体诱导物金属水解酶。

实施例7：Bt菌株对胡萝卜软腐欧文氏菌产生AI的作用

为测试Bt菌株对猝灭病原菌产生AI的作用，将胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1分别与Bt菌株Cot1，B1，大肠杆菌DH5α和梭形气芽孢杆菌一起培养。如实施例1所述分析AI。在温育2小时后检测到菌株SCG1产生AI，并在第2-6小时温育期间迅速提高(细胞数目见图14)，而在SCG1与产生AI灭活酶的Cot1或B1菌株一起培养的上清中未检测到AI。在SCG1与不含有aii基因的大肠杆菌DH5α或梭形气芽孢杆菌一起培养的上清中，检测到的AI产生水平与SCG1的单独培养物中观测的结果相似(图11)。这些结果表明当将两者一起培养时，Bt菌株可有效猝灭由病原胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1产生的AI信号。

实施例8：Bt菌株对胡萝卜软腐欧文氏菌致病性的作用

已知AI在调节一些病原菌属的毒力决定因素中起关键作用。由于Bt菌株有效猝灭由病原产生的AI信号，因此Bt菌株的这种新功能可以用于疾病防治。为测试这种可能性，研究了Bt菌株抗植物软腐病的生物防治作用。马铃薯(Solanum tuberosum L.cv.Bintje)块茎得自本地的商店。在自来水中清洗后，在纸杯上干燥，将马铃薯块茎表面用70％乙醇灭菌，然后切成3mm的切片。就浸渍处理而言，将马铃薯切片浸渍在Cot1或其它细菌菌株的悬浮液中，稀释至浓度为5×10⁸菌落形成单位(CFU)/ml，时间为大约20秒。用无菌水作对照。将所述切片在层流室中干燥20分钟，以除去表面水分，之后在每个切片的上部用含有将近2×10⁸或2×10⁷CFU/ml的2.5μl的胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1细菌悬浮液接种。就混合处理而言，将等体积的每种测试有机体(5×10⁸CFU/ml)或无菌水与胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1细菌悬浮液(2×10⁸或2×10⁷CFU/ml)混合。将所述混合物(2.5μl)接种于马铃薯切片的切面。将所有的马铃薯切片在28℃在Petri平皿中温育。在温育期间测定软化面积。将每次处理重复4-12次(针对Cot1进行12次)，在一个切面上将每次重复接种3处。针对集群现象(colonisation)实验，每个块茎切片只在切片中心接种一次，每种处理重复4次。将马铃薯块茎切片首先用Bt菌株Cot1或其它对照物处理，之后接种胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1，或者将SCG1菌与Cot1或其它对照物混合，之后接种于马铃薯切片上。

在温育20小时后，胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1导致严重的组织软化，而在Bt菌株Cot1预处理的马铃薯切片上，软化现象明显减弱(图12)。SCG1与Bt菌株Cot1共同接种也减弱软腐烂现象，尤其以较低浓度接种的情况下。相反，用大肠杆菌或梭形气芽孢杆菌预处理马铃薯切片之后接种SCG1，或者SCG1分别与大肠杆菌和梭形气芽孢杆菌一起接种，这样的对照处理示出严重的组织软化现象(图12)。这些结果提示Bt菌株可以用作抗植物软腐病的生物防治剂。

实施例9：Bt菌株和胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1之间的体外竞争

测试Bt菌株Cot1和B1产生抗胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1的抗生素情况。将Bt菌株和胡萝卜软腐欧文氏菌以1∶1比例一起接种进行竞争实验。针对胡萝卜软腐欧文氏菌，每个菌株均以1×10⁷CFU/ml水平接种，其它菌株以1×10⁶CFU/ml水平接种。将混合物在30℃温育。在不同时间点取细菌样品，进行生物学分析AI的产生(如实施例1中进行的生物学分析)，并稀释为适当浓度涂布于平板上以计数菌落。将此试验重复4次。针对集群现象试验，在指定的时间取用胡萝卜软腐欧文氏菌接种的马铃薯切片，并切成环绕接种点大约15×15mm的植物组织。将此组织切成小片并置于10ml的0.1M NaCl中。在摇动30分钟后，将上清稀释为适当浓度。计数细菌细胞的存活数目。

在丰富培养基(rich media)和基本培养基(minimum media)平板上，Bt菌株均未示出对SCG1生长的任何抑制作用。当菌株SCG1与Bt菌株Cot1或B1一起接种时，Bt菌株和SCG1均正常生长，示出在24小时后相同的生长趋势(图13)。

实施例10：Bt菌株对胡萝卜软腐欧文氏菌对块茎切片集群现象的作用

为研究在温育后马铃薯切片上胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1的集群现象，将含有GFP基因的一种表达载体转化入菌株SCG1中。所述表达载体在没有选择压力时可以稳定保持在菌株SCG1中。SCG1(GFP)和野生型SCG1之间毒力无差别。为在植物上研究Bt菌对SCG1的存活和生长的作用，将马铃薯块茎切片浸渍在Cot1细菌悬浮液中，然后用SCG1(GFP)接种，或者用SCG1(GFP)和Cot1同时接种。每天监测细菌细胞数目变化和马铃薯组织的软腐烂现象的发生，共4天。结果示出在4天温育期间，SCG1(GFP)对Cot1处理的切片和SCG1(GFP)对水处理的切片之间，细胞数目无大的变化(图14)。结果表明Bt菌株Cot1不明显影响马铃薯块茎切片上SCG1(GFP)的生长，提示Bt菌株Cot1对Erwinia SCG1(GFP)的毒力的弱化作用的原因不是SCG1(GFP)细胞生长的抑制。

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Zhang，L.-H.(1993).Mo1ecularbiology and biochemistry of a novelconjugation factor in Agrobacterium.Doctoral Dissertation，The AdelaideUniversity，Australi a。

Zhang，L.-H.，Xu，J.，and Birch，R.G.(1998).High affinity binding ofalbicidin phytotoxins by the AlbA protein from Klebsiella oxytoca.微生物学144，555559。

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Zhang，L.-H.，Murphy，P.J.，Kerr，A.，and Tate，M.E.(1993).Agrobacterium conjugation and gene regulation by N-acyl-L-homoserinelactones.自然(伦敦)362，446-447。

序列表

<110>新加坡科技研究局

<120>通过猝灭团体感应信号防治细菌疾病的细菌菌株、基因和酶

<130>2577-140

<160>22

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>1581

<212>DNA

<213>Agrobacterium tumefaciens M103

<220>

<221>misc_feature

<222>(315)..(1103)

<223>编码序列

<400>1

ctgcagcgtc gctttatgcg gagcttgccg acgtgctggg tgttccgggt gaaggggatg 60

cggcaacccg ttcggatgcg ttcgttcagc atatggaaac gctgatggac gaaagcggcg 120

cgccgcgacg tctgcgcgat gtcggcgtga cggacaacac gctcgccatg cttgcgtccg 180

acgcaatgaa acagagccgt ctgttggtca ataatccggt cgaagtccgc gaagaggatg 240

cgcttgcgct ctaccgcgag gcgttctgac ccatttctga cagcaatatc ttcagtccca 300

agggaggaaa acgagtgacc gatatcagac tttacatgct tcagtcgggt acgctgaaat 360

gcaaggtaca caacatcaag atgaaccagg ggaacggtgc agactatgag atccccgttc 420

cgtttttcct gattacccat ccgggcgggc acaccgtgat cgacggcggc aacgcgattg 480

aagttgcaac ggatccgcgt ggccattggg gcggcatctg cgatgtctat tggccagtgc 540

tggacaagga ccagggctgc gttgaccaga tcaaggcgct tggtttcgat ccggccgatg 600

tcaagtatgt tgtgcagtcg cacctgcatc tcgatcatac cggcgccatc ggtcgcttcc 660

ccaacgcaac ccacatcgtg cagcgctcgg aatatgagta tgccttcacg cccgactggt 720

ttgccggtgg cggctatatc cgcaaggact tcgacaagcc gggcctgaag tggcagttcc 780

tcaacggtac gcaggacgac tattacgacg tttacggcga cggcacgctc accacgatct 840

tcacgcccgg tcatgcgccc ggccaccagt ccttgctggt gcgactgcca aacagcaaac 900

cgcttctcct gacgatcgat gctgcctaca ccctggacca ctgggaggag aaggctttgc 960

ctggcttcct cgcctcgacc gttgacacgg tccgttcggt tcagaaactc cgaacctatg 1020

ccgaaaagca tgatgcgacg gtcgttaccg gccatgaccc tgacgcgtgg gcgaacttca 1080

agaaggctcc cgaattttac gcgtaaataa aacgcgcaag tcaacagcca gatgcggcga 1140

ggttgcgtgc agcctcgccg atttttgtca tatgagccaa ggaccccgaa cctggcggga 1200

ccgtgtattt ctgcgcagag gccttttcag gatatacgcc ttcactcagg tcgttcgcgt 1260

tgtcgcctca aggcctgaaa gctgtcctcc cgctgcgcga gtgtccccat atgcggttta 1320

ttaccccggc gttactgtgg gccatcaggc ttcgggctga caatttgcaa atgccggatg 1380

gcttaaagta gacttgtctc tttgatccaa gccgtcggca aatggtgcag attgtggcgc 1440

ctattttgcg ttcccaaggc gtcgggccag ccatgccccc caaaacaggc ttgcgaaaaa 1500

ccgaagcggc tcgttgaaac ccgcgccggc cagcaatgaa acgacctcgt cttccgatcg 1560

gggtggctct gcaccctgca g 1581

<210>2

<211>1339

<212>DNA

<213>Bacillus thuringiensis Cot1

<220>

<221>misc_feature

<222>(166)..(918)

<223>编码序列

<400>2

gaattcttta cttctatatt atagatggtg aaatactgct atgtaaaaaa aataccctct 60

tttttctgta agctgtactg atagtctaga aggagtttat ttctaaaaag aagaattttt 120

tactgtatta ctttatccca aactaaatgt aaaggtggat acataatgac agtaaagaag 180

ctttatttcg ttccagcagg tcgttgtatg ttagatcatt cttctgttaa tagtacaatc 240

gcgccgggaa atttattgaa cttacctgta tggtgttatc ttttggagac ggaagaaggt 300

cccattttag tagatacagg tatgccagaa agtgcggtta ataatgaaaa cttgtttgaa 360

gggacatttg cagaaggaca gattttaccg aaaatgactg aagaagatag aataatagct 420

attttaaaac gtgcagggta tgagccagat gacctcctat atattattag ttcacatttg 480

cattttgatc atgcaggagg aaatggtgct tttattaata ctccaatcat tatacagcgt 540

gctgaatatg aggcagcgca gtatagagag gaatatttga aagagtgtat actgccgaat 600

ttgaactaca aaattattga aggggattat gaagtggtac caggtgttca actattgtat 660

acaccaggac attcaccagg gcatcagtca ctattaattg agacagaaaa atctggtgtt 720

gtgttattaa ccattgatgc atcttatacg aaagagaatt ttgaagatga agtaccgttt 780

gctggatttg atccagaatt agctttatca tcaattaaac gtttaaaaga agttgtgatg 840

aaagagaagc cgcttgtttt ctttggacat gatatagagc aggaaaaggg atgtaaagtg 900

ttcccggaat atatatagtg caaaaagtca tgagcttacg tgctcatgac tttttgattt 960

aaataatttt tttaaataag ttataaactt ttttggaact atcttcattt aattgatagt 1020

acgtaagatt tacatcatca ggagtatctt gctgtgcaat catcacttcg ttactatgat 1080

gatcaactac ccatatgaaa tattttttat aagtaccatc ctcaaatgta atccacatat 1140

cacaatctat taaatctgat ccttcttcat ctaatgttaa ttttcctttt ttggccgtat 1200

tcatactgtt aatgaatgtc tttaattcat ctgtttttgc gagaaagata tctttttttg 1260

ttttaatgga ctcgacatgt atatctttta tttcctgttt tcccaaaaag acagggggct 1320

catttggatc cctttgagt 1339

<210>3

<211>753

<212>DNA

<213>Bacillus thuringiensis B1

<400>3

atgacagtaa agaagcttta tttcatccca gcaggtcgtt gcatgttgga tcattcgtct 60

gttaacagtg cgttaacacc ggggaaacta ttaaacttgc cggtgtggtg ttatcttttg 120

gagacggaag aaggtcctat tttagtagac acaggtatgc cagaaagtgc agttaataat 180

gaagggcttt ttaacggtac atttgttgaa ggacagatct taccgaaaat gactgaagaa 240

gatagaatcg tgaatatatt aaagcgtgtg gggtatgagc cggacgacct tttatatatt 300

attagttctc acttacattt tgatcatgca ggaggaaacg gtgcttttac aaatacacca 360

attattgtgc agcgaacgga atatgaggca gcacttcata gagaagaata tatgaaagaa 420

tgtatattac cgcatttgaa ctacaaaatt attgaagggg attatgaagt ggtaccaggt 480

gttcaattat tgtatacgcc aggtcattct ccaggccatc agtcgctatt cattgagacg 540

gagcaatccg gttcagtttt attaatgatt gatgcatcgt acacgaaaga gaattttgaa 600

gatgaagtgc cgttcgcagg atttgatcca gaattagctt tatcttcaat taaacgttta 660

aaagaagttg tgaaaaaaga gaaaccaatt attttctttg gtcatgatac agagcaggaa 720

aagagttgta gagtgttccc ggaatatata tag 753

<210>4

<211>753

<212>DNA

<213>Bacillus thuringiensis B2

<400>4

atgacagtaa agaagcttta tttcatccca gcaggtcgtt gcatgttgga tcattcgtct 60

gttaacagtg cgttaacacc ggggaaacta ttaaacttgc cggtgtggtg ttatcttttg 120

gagacggaag aaggtcctat tttagtagac acaggtatgc cagaaagtgc agttaataat 180

gaagggcttt ttaacggtac atttgttgaa ggacagatct taccgaaaat gactgaagaa 240

gatagaatcg tgaatatatt aaagcgtgta gggtatgagc cggacgacct tttatatatt 300

attagttctc acttacattt tgatcatgca ggaggaaacg gtgcttttac aaatacacca 360

attattgtgc agcgaacgga atatgaggca gcacttcata gagaagaata tatgaaagaa 420

tgtatattac cgcatttgaa ctacaaaatt attgaagggg attatgaagt ggtaccaggt 480

gttcaattat tgtatacgcc aggtcattct ccaggccatc agtcgctatt cattgagacg 540

gagcaatccg gttcagtttt attaacgatt gatgcatcgt acacgaaaga gaattttgaa 600

gatgaagtgc cgttcgcagg atttgatcca gaattagctt tatcttcaat taaacgttta 660

aaagaagttg tgaaaaaaga gaaaccaatt attttctttg gtcatgatat agagcaggaa 720

aagagttgta gagtgttccc ggaatatata tag 753

<210>5

<211>753

<212>DNA

<213>Bacillus thuringiensis B17

<400>5

atgacagtaa agaagcttta tttcgtccca gcaggtcgtt gtatgttaga tcattcttct 60

gttaatagta cactcgcgcc ggggaattta ttgaacttac ctgtatggtg ttatcttttg 120

gagacagaag aggggcctat tttagtagat acaggtatgc cagaaagtgc agttaataat 180

gaagggcttt ttaacggtac atttgttgaa ggacagattt taccgaaaat gactgaagaa 240

gatagaatcg tgaatatatt aaagcgtgta gggtatgagc cggacgacct tttatatatt 300

attagttctc acttacattt tgatcatgca ggaggaaacg gtgcttttac aaatacaccg 360

attattgtgc aacgaacgga atatgaggca gcacttcata gagaagaata tatgaaagaa 420

tgtatattac cgcatttgaa ctataaaatt attgaagggg attatgaagt ggtaccaggt 480

gttcaattat tgtatacgcc aggtcattct ccaggccatc agtcgctatt aattgagaca 540

gaaaaatccg gtcttgtatt attaacgatt gatgcatctt atacgaaaga aaattttgaa 600

gatgaagtgc cgttcgcggg atttgattcg gaattagctt tatcttcaat taaacgttta 660

aaagaagttg tgatgaaaga gaagccaatt attttctttg gtcatgatat agaacaggaa 720

aagggattta aagtgttccc tgaatatata taa 753

<210>6

<211>753

<212>DNA

<213>Bacillus thuringiensis B18

<400>6

atgacagtaa agaagcttta tttcgtccca gcaggtcgtt gtatgttgga tcattcgtct 60

gttaacagtg cgttaacacc gggaaaacta ttaaacttgc cggtttggtg ttatcttttg 120

gagacggaag aaggtcctat tttagtagac acaggtatgc cagaaagtgc agttaataat 180

gaagggcttt ttaacggtac atttgcaaaa ggacagattt taccgaaaat gactgaagaa 240

gatagaattg taactatttt aaaacgtgca gggtatgagc cagatgatct cctatatatt 300

attagttcgc acttgcattt tgatcatgca ggaggaaatg gtgctttttt gaatacgcca 360

atcattatac aacgtgctga atatgaggca gcgcagcata gagaggaata tttgaaagag 420

tgcatactac cagatttaaa ctacaaaatt attgaaggtg attatgaagt ggtacctggt 480

gttcggttat tgtatacacc aggacattct ccagggcatc agtcattatt aattgagacg 540

gaaaaatccg gtcctgtatt attaacgatt gatgcatctt atacgaaaga gaattttgaa 600

gatgaagtac cgtttgcggg atttgattcg gaattagcct tatcttcaat taaacgttta 660

aaagaagttg tgatgaaaga gaaaccgatt gttttctttg gacatgatat agaacaggaa 720

aagggatgta aagtgttccc tgaatatata tag 753

<210>7

<211>753

<212>DNA

<213>Bacillus thuringiensis B20

<400>7

atgacagtaa agaagcttta tttcatccca gcaggtcgtt gtatgttaga tcattcttct 60

gttaatagta cactcgcgcc ggggaattta ttgaacttac ctgtatggtg ttatcttttg 120

gagacagaag aagggcctat tttagtagat acaggtatgc cagaaagtgc agttaataat 180

gaagggcttt ttaacggtac atttgttgaa ggacagattt taccgaaaat gactgaagaa 240

gatagaatcg tgaatatatt aaagcgtgta gggtatgagc cggacgacct tttatatatt 300

attagttctc acttacattt tgatcatgca ggaggaaacg gtgcttttac aaatacaccg 360

attattgtgc agcgagcgga atatgaggca gcacttcata gagaagaata tatgaaagaa 420

tgtatattac cgcatttgaa ctacaaaatt attgaagggg attatgaagt ggtaccaggt 480

gttcaattat tgtatacgcc aggtcattct ccaggccatc agtcgttatt cattgagacg 540

gagcaatccg gttcagtttt attaacaatt gatgcatcgt acacgaaaga gaattttgaa 600

gatgaagtgc cgttcgcagg atttgatcca gaattagctt tatcttcaat caaacgttta 660

aaaggagttg tggcggaaga gaaaccaatt gttttctttg gtcatgatat agagcaggaa 720

aagggttgta gagtgttccc tgagtatata tag 753

<210>8

<211>753

<212>DNA

<213>Bacillus thuringiensis B21

<400>8

atgacagtaa agaagcttta tttcgtccca gcaggtcgtt gtatgttaga tcattcttct 60

gttaatagta cactcgcgcc ggggaattta ttgaacttac ctgtatggtg ttatcttttg 120

gagacagaag aggggcctat tttagtagat acaggtatgc cagaaagtgc agttaataat 180

gaagggcttt ttaacggtac atttgttgaa ggacagattt taccgaaaat gactgaagaa 240

gatagaatcg tgaatatatt aaagcgtgta gggtatgagc cggacgacct tttatatatt 300

attagttctc acttacattt tgatcatgca ggaggaaacg gtgcttttac aaatacaccg 360

attattgtgc agcgagcgga atatgaggca gcacttcata gagaagaata tatgaaagaa 420

tgtatattac cgcatttgaa ctacaaaatt attgaagggg attatgaagt ggtaccaggt 480

gttcaattat tgtatacgcc aggtcattct ccaggccatc agtcgttatt cattgagacg 540

gacaattccg gttcagtttt attaacaatt gatgcatcgt acacgaaaga gaattttgaa 600

gatgaagtgc cgttcgcagg atttgatcca gaattagctt tatcttcaat caaacgttta 660

aaaggagttg tggcggaaga gaaaccaatt gttttctttg gtcatgatat agagcaggaa 720

aagggttgta gagtgttccc tgagtatata tag 753

<210>9

<211>753

<212>DNA

<213>Bacillus thuringiensis B22

<400>9

atgacagtaa agaagcttta tttcatccca gcaggtcgtt gtatgttaga tcattcttct 60

gttaatagta cactcgcgcc ggggaattta ttgaacttac ctgtatggtg ttatcttttg 120

gagacagaag aggggcctat tttagtagat acaggtatgc cagaaagtgc agttaataat 180

gaagggctt tttaacggtac atttgttgaa ggacagattt taccgaaaat gactgaagaa 240

gatagaatcg tgaatatatt aaagcgtgta gggtatgagc cggacgacct tttatatatt 300

attagttctc acttacattt tgatcatgca ggaggaaacg gtgcttttac aaatacaccg 360

attattgtgc agcgagcgga atatgaggca gcacttcata gagaagaata tatgaaagaa 420

tgtatattac cgcatttgaa ctacaaaatt attgaagggg attatgaagt ggtaccaggt 480

gttcaattat tgtatacgcc aggtcattct ccaggccatc agtcgttatt cattgagacg 540

gagcaatccg gttcagtttt attaacaatt gatgcatcgt acacgaaaga gaattttgaa 600

gatgaagtgc cgttcgcagg atttgatcca gaattagctt tatcttcaat caaacgttta 660

aaaggagttg tggcggaaga gaaaccaatt gttttctttg gtcatgatat agagcaggaa 720

aagggttgta gagtgttccc tgagtatata tag 753

<210>10

<211>753

<212>DNA

<213>Bacillus thuringiensis B25

<400>10

atgacagtaa agaagcttta tttcatccca gcaggtcgtt gtatgttaga tcattcttct 60

gttaatggta cactcgcgcc ggggaattta ttgaacttac ctgtatggtg ttatcttttg 120

gagacagaag aaggggccat tttagtagat acaggtatgc cagaaagtgc agttaataat 180

gaagggcttt ttaacggtac atttgttgaa ggacagattt taccgaaaat gactgaagaa 240

gatagaatcg tgaatatatt aaagcgtgta gggtatgagc cggacgacct tttatatatt 300

attagttctc acttacattt tgatcatgca ggaggaaacg gtgcttttac aaatacaccg 360

attattgtgc agcgaacgga atatgaggca gcacttcata gagaagaata tatgaaagaa 420

tgtatattac cgcatttgaa ctacaaaatt attgaagggg attatgaagt ggtaccaggt 480

gttcaattat tgtatacgcc aggtcattct ccaggccatc agtcgttatt cattgagacg 540

gagcaatccg gttcagtttt attaacaatt gatgcatcgt acacgaaaga gaattttgaa 600

gatgaagtgc cgttcgcagg atttgatcca gaattagctt tatcttcaat taaacgttta 660

aaaggagttg tggcgaaaga gaaaccaatt gttttctttg gtcatgatat agagcaggaa 720

aagggttgta gagtgttccc tgagtatata tag 753

<210>11

<211>263

<212>PRT

<213>Agrobacterium tumefsciens M103

<400>11

Val Thr Asp Ile Arg Leu Tyr Met Leu Gln Ser Gly Thr Leu Lys Cys

1 5 10 15

Lys Val His Asn Ile Lys Met Asn Gln Gly Asn Gly Ala Asp Tyr Glu

20 25 30

Ile Pro Val Pro Phe Phe Leu Ile Thr His Pro Gly Gly His Thr Val

35 40 45

Ile Asp Gly Gly Asn Ala Ile Glu Val Ala Thr Asp Pro Arg Gly His

50 55 60

Trp Gly Gly Ile cys Asp Val Tyr Trp Pro Val Leu Asp Lys Asp Gln

65 70 75 80

Gly Cys Val Asp Gln Ile Lys Ala Leu Gly Phe Asp Pro Ala Asp Val

85 90 95

Lys Tyr Val Val Gln Ser His Leu His Leu Asp His Thr Gly Ala Ile

100 105 110

Gly Arg Phe Pro Asn Ala Thr His Ile Val Gln Arg Ser Glu Tyr Glu

115 120 125

Tyr Ala Phe Thr Pro Asp Trp Phe Ala Gly Gly Gly Tyr Ile Arg Lys

130 135 140

Asp Phe Asp Lys Pro Gly Leu Lys Trp Gln Phe Leu Asn Gly Thr Gln

145 150 155 160

Asp Asp Tyr Tyr Asp Val Tyr Gly Asp Gly Thr Leu Thr Thr Ile Phe

165 170 175

Thr Pro Gly His Ala Pro Gly His Gln Ser Leu Leu Val Arg Leu Pro

180 185 190

Asn Ser Lys Pro Leu Leu Leu Thr Ile Asp Ala Ala Tyr Thr Leu Asp

195 200 205

His Trp Glu Glu Lys Ala Leu Pro Gly Phe Leu Ala Ser Thr Val Asp

210 215 220

Thr Val Arg Ser Val Gln Lys Leu Arg Thr Tyr Ala Glu Lys His Asp

225 230 235 240

Ala Thr Val Val Thr Gly His Asp Pro Asp Ala Trp Ala Asn Phe Lys

245 250 255

Lys Ala Pro Glu Phe Tyr Ala

260

<210>12

<211>250

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis Cot1

<400>12

Met Thr Val Lys Lys Leu Tyr Phe Val Pro Ala Gly Arg Cys Met Leu

1 5 10 15

Asp His Ser Ser Val Asn Ser Thr Ile Ala Pro Gly Asn Leu Leu Asn

20 25 30

Leu Pro Val Trp Cys Tyr Leu Leu Glu Thr Glu Glu Gly Pro Ile Leu

35 40 45

Val Asp Thr Gly Met Pro Glu Ser Ala Val Asn Asn Glu Asn Leu Phe

50 55 60

Glu Gly Thr Phe Ala Glu Gly Gln Ile Leu Pro Lys Met Thr Glu Glu

65 70 75 80

Asp Arg Ile Ile Ala Ile Leu Lys Arg Ala Gly Tyr Glu Pro Asp Asp

85 90 95

Leu Leu Tyr Ile Ile Ser Ser His Leu His Phe Asp His Ala Gly Gly

100 105 110

Asn Gly Ala Phe Ile Asn Thr Pro Ile Ile Ile Gln Arg Ala Glu Tyr

115 120 125

Glu Ala Ala Gln Tyr Arg Glu Glu Tyr Leu Lys Glu Cys Ile Leu Pro

130 135 140

Asn Leu Asn Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Asp Tyr Glu Val Val Pro Gly

145 150 155 160

Val Gln Leu Leu Tyr Thr Pro Gly His Ser Pro Gly His Gln Ser Leu

165 170 175

Leu Ile Glu Thr Glu Lys Ser Gly Val ValLeu Leu Thr Ile Asp Ala

180 185 190

Ser Tyr Thr Lys Glu Asn Phe Glu Asp Glu Val Pro Phe Ala Gly Phe

195 200 205

Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Lys Arg Leu Lys Glu Val Val

210 215 220

Met Lys Glu Lys Pro Leu Val Phe Phe Gly His Asp Ile Glu Gln Glu

225 230 235 240

Lys Gly Cys Lys Val Phe Pro Glu Tyr Ile

245 250

<210>13

<211>250

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis B1

<400>13

Met Thr Val Lys Lys Leu Tyr Phe Ile Pro Ala Gly Arg Cys Met Leu

1 5 10 15

Asp His Ser Ser Val Asn Ser Ala Leu Thr Pro Gly Lys Leu Leu Asn

20 25 30

Leu Pro Val Trp Cys Tyr Leu Leu Glu Thr Glu Glu Gly Pro Ile Leu

35 40 45

Val Asp Thr Gly Met Pro Glu Ser Ala Val Asn Asn Glu Gly Leu Phe

50 55 60

Asn Gly Thr Phe Val Glu Gly Gln Ile Leu Pro Lys Met Thr Glu Glu

65 70 75 80

Asp Arg Ile Val Asn Ile Leu Lys Arg Val Gly Tyr Glu Pro Asp Asp

85 90 95

Leu Leu Tyr Ile Ile Ser Ser His Leu His Phe Asp His Ala Gly Gly

100 105 110

Asn Gly Ala Phe Thr Asn Thr Pro Ile Ile Val Gln Arg Thr Glu Tyr

115 120 125

Glu Ala Ala Leu His Arg Glu Glu Tyr Met Lys Glu Cys Ile Leu Pro

130 135 140

His Leu Asn Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Asp Tyr Glu Val Val Pro Gly

145 150 155 160

Val Gln Leu Leu Tyr Thr Pro Gly His Ser Pro Gly His Gln Ser Leu

165 170 175

Phe Ile Glu Thr Glu Gln Ser Gly Ser Val Leu Leu Met Ile Asp Ala

180 185 190

Ser Tyr Thr Lys Glu Asn Phe Glu Asp Glu Val Pro Phe Ala Gly Phe

195 200 205

Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Lys Arg Leu Lys Glu Val Val

210 215 220

Lys Lys Glu Lys Pro Ile Ile Phe Phe Gly His Asp Thr Glu Gln Glu

225 230 235 240

Lys Ser Cys Arg Val Phe Pro Glu Tyr Ile

245 250

<210>14

<211>250

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis B2

<400>14

Met Thr Val Lys Lys Leu Tyr Phe Ile Pro Ala Gly Arg Cys Met Leu

1 5 10 15

Asp His Ser Ser Val Asn Ser Ala Leu Thr Pro Gly Lys Leu Leu Asn

20 25 30

Leu Pro Val Trp Cys Tyr Leu Leu Glu Thr Glu Glu Gly Pro Ile Leu

35 40 45

Val Asp Thr Gly Met Pro Glu Ser Ala Val Asn Asn Glu Gly Leu Phe

50 55 60

Asn Gly Thr Phe Val Glu Gly Gln Ile Leu Pro Lys Met Thr Glu Glu

65 70 75 80

Asp Arg Ile Val Asn Ile Leu Lys Arg Val Gly Tyr Glu Pro Asp Asp

85 90 95

Leu Leu Tyr Ile Ile Ser Ser His Leu His Phe Asp His Ala Gly Gly

100 105 110

Asn Gly Ala Phe Thr Asn Thr Pro Ile Ile Val Gln Arg Thr Glu Tyr

115 120 125

Glu Ala Ala Leu His Arg Glu Glu Tyr Met Lys Glu Cys Ile Leu Pro

130 135 140

His Leu Asn Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Asp Tyr Glu Val Val Pro Gly

145 150 155 160

Val Gln Leu Leu Tyr Thr Pro Gly His Ser Pro Gly His Gln Ser Leu

165 170 175

Phe Ile Glu Thr Glu Gln Ser Gly Ser Val Leu Leu Thr Ile Asp Ala

180 185 190

Ser Tyr Thr Lys Glu Asn Phe Glu Asp Glu Val Pro Phe Ala Gly Phe

195 200 205

Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Lys Arg Leu Lys Glu Val Val

210 215 220

Lys Lys Glu Lys Pro Ile Ile Phe Phe Gly His Asp Ile Glu Gln Glu

225 230 235 240

Lys Ser Cys Arg Val Phe Pro Glu Tyr Ile

245 250

<210>15

<211>250

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis B17

<400>15

Met Thr Val Lys Lys Leu Tyr Phe Val Pro Ala Gly Arg Cys Met Leu

l 5 10 15

Asp His Ser Ser Val Asn Ser Thr Leu Ala Pro Gly Asn Leu Leu Asn

20 25 30

Leu Pro Val Trp Cys Tyr Leu Leu Glu Thr Glu Glu Gly Pro Ile Leu

35 40 45

Val Asp Thr Gly Met Pro Glu Ser Ala Val Asn Asn Glu Gly Leu Phe

50 55 60

Asn Gly Thr Phe Val Glu Gly Gln Ile Leu Pro Lys Met Thr Glu Glu

65 70 75 80

Asp Arg Ile Val Asn Ile Leu Lys Arg Val Gly Tyr Glu Pro Asp Asp

85 90 95

Leu Leu Tyr Ile Ile Ser Ser His Leu His Phe Asp His Ala Gly Gly

100 105 110

Asn Gly Ala Phe Thr Asn Thr Pro Ile Ile Val Gln Arg Thr Glu Tyr

115 120 125

Glu Ala Ala Leu His Arg Glu Glu Tyr Met Lys Glu Cys Ile Leu Pro

130 135 140

His Leu Asn Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Asp Tyr Glu Val Val Pro Gly

145 150 155 160

Val Gln Leu Leu Tyr Thr Pro Gly His Ser Pro Gly His Gln Ser Leu

165 170 175

Leu Ile Glu Thr Glu Lys Ser Gly Leu Val Leu Leu Thr Ile Asp Ala

180 185 190

Ser Tyr Thr Lys Glu Asn Phe Glu Asp Glu Val Pro Phe Ala Gly Phe

195 200 205

Asp Ser Glu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Lys Arg Leu Lys Glu Val Val

210 215 220

Met Lys Glu Lys Pro Ile Ile Phe Phe Gly His Asp Ile Glu Gln Glu

225 230 235 240

Lys Gly Phe Lys Val Phe Pro Glu Tyr Ile

245 250

<210>16

<211>250

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis B18

<400>16

Met Thr Val Lys Lys Leu Tyr Phe Val Pro Ala Gly Arg Cys Met Leu

1 5 10 15

Asp His Ser Ser Val Asn Ser Ala Leu Thr Pro Gly Lys Leu Leu Asn

20 25 30

Leu Pro Val Trp Cys Tyr Leu Leu Glu Thr Glu Glu Gly Pro Ile Leu

35 40 45

Val Asp Thr Gly Met Pro Glu Ser Ala Val Asn Asn Glu Gly Leu Phe

50 55 60

Asn Gly Thr Phe Ala Lys Gly Gln Ile Leu Pro Lys Met Thr Glu Glu

65 70 75 80

Asp Arg Ile Val Thr Ile Leu Lys Arg Ala Gly Tyr Glu Pro Asp Asp

85 90 95

Leu Leu Tyr Ile Ile Ser Ser His Leu His Phe Asp His Ala Gly Gly

100 105 110

Asn Gly Ala Phe Leu Asn Thr Pro Ile Ile Ile Gln Arg Ala Glu Tyr

115 120 125

Glu Ala Ala Gln His Arg Glu Glu Tyr Leu Lys Glu Cys Ile Leu Pro

130 135 140

Asp Leu Asn Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Asp Tyr Glu Val Val Pro Gly

145 150 155 160

Val Arg Leu Leu Tyr Thr Pro Gly His Ser Pro Gly His Gln Ser Leu

165 170 175

Leu Ile Glu Thr Glu Lys Ser Gly Pro Val Leu Leu Thr Ile Asp Ala

180 185 190

Ser Tyr Thr Lys Glu Asn Phe Glu Asp Glu Val Pro Phe Ala Gly Phe

195 200 205

Asp Ser Glu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Lys Arg Leu Lys Glu Val Val

210 215 220

Met Lys Glu Lys Pro Ile Val Phe Phe Gly His Asp Ile Glu Gln Glu

225 230 235 240

Lys Gly Cys Lys Val Phe Pro Glu Tyr Ile

245 250

<210>17

<211>250

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis B20

<400>17

Met Thr Val Lys Lys Leu Tyr Phe Ile Pro Ala Gly Arg Cys Met Leu

1 5 10 15

Asp His Ser Ser Val Asn Ser Thr Leu Ala Pro Gly Asn Leu Leu Asn

20 25 30

Leu Pro Val Trp Cys Tyr Leu Leu Glu Thr Glu Glu Gly Pro Ile Leu

35 40 45

Val Asp Thr Gly Met Pro Glu Ser Ala Val Asn Asn Glu Gly Leu Phe

50 55 60

Asn Gly Thr Phe Val Glu Gly Gln Ile Leu Pro Lys Met Thr Glu Glu

65 70 75 80

Asp Arg Ile Val Asn Ile Leu Lys Arg Val Gly Tyr Glu Pro Asp Asp

85 90 95

Leu Leu Tyr Ile Ile Ser Ser His Leu His Phe Asp His Ala Gly Gly

100 105 110

Asn Gly Ala Phe Thr Asn Thr Pro Ile Ile Val Gln Arg Ala Glu Tyr

115 120 125

Glu Ala Ala Leu His Arg Glu Glu Tyr Met Lys Glu Cys Ile Leu Pro

130 135 140

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Val Gln Leu Leu Tyr Thr Pro Gly His Ser Pro Gly His Gln Ser Leu

165 170 175

Phe Ile Glu Thr Glu Gln Ser Gly Ser Val Leu Leu Thr Ile Asp Ala

180 185 190

Ser Tyr Thr Lys Glu Asn Phe Glu Asp Glu Val Pro Phe Ala Gly Phe

195 200 205

Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Lys Arg Leu Lys Gly Val Val

210 215 220

Ala Glu Glu Lys Pro Ile Val Phe Phe Gly His Asp Ile Glu Gln Glu

225 230 235 240

Lys Gly Cys Arg Val Phe Pro Glu Tyr Ile

245 250

<210>18

<211>250

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis B21

<400>18

Met Thr Val Lys Lys Leu Tyr Phe Val Pro Ala Gly Arg Cys Met Leu

1 5 10 15

Asp His Ser Ser Val Asn Ser Thr Leu Ala Pro Gly Asn Leu Leu Asn

20 25 30

Leu Pro Val Trp Cys Tyr Leu Leu Glu Thr Glu Glu Gly Pro Ile Leu

35 40 45

Val Asp Thr Gly Met Pro Glu Ser Ala Val Asn Asn Glu Gly Leu Phe

50 55 60

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Asp Arg Ile Val Asn Ile Leu Lys Arg Val Gly Tyr Glu Pro Asp Asp

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Leu Leu Tyr Ile Ile Ser Ser His Leu His Phe Asp His Ala Gly Gly

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Asn Gly Ala Phe Thr Asn Thr Pro Ile Ile Val Gln Arg Ala Glu Tyr

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His Leu Asn Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Asp Tyr Glu Val Val Pro Gly

145 150 155 160

Val Gln Leu Leu Tyr Thr Pro Gly His Ser Pro Gly His Gln Ser Leu

165 170 175

Phe Ile Glu Thr Asp Asn Ser Gly Ser Val Leu Leu Thr Ile Asp Ala

180 185 190

Ser Tyr Thr Lys Glu Asn Phe Glu Asp Glu Val Pro Phe Ala Gly Phe

195 200 205

Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Lys Arg Leu Lys Gly Val Val

210 215 220

Ala Glu Glu Lys Pro Ile Val Phe Phe Gly His Asp Ile Glu Gln Glu

225 230 235 240

Lys Gly Cys Arg Val Phe Pro Glu Tyr Ile

245 250

<210>19

<211>250

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis B22

<400>19

Met Thr Val Lys Lys Leu Tyr Phe Ile Pro Ala Gly Arg Cys Met Leu

1 5 10 15

Asp His Ser Ser Val Asn Ser Thr Leu Ala Pro Gly Asn Leu Leu Asn

20 25 30

Leu Pro Val Trp Cys Tyr Leu Leu Glu Thr Glu Glu Gly Pro Ile Leu

35 40 45

Val Asp Thr Gly Met Pro Glu Ser Ala Val Asn Asn Glu Gly Leu Phe

50 55 60

Asn Gly Thr Phe Val Glu Gly Gln Ile Leu Pro Lys Met Thr Glu Glu

65 70 75 80

Asp Arg Ile Val Asn Ile Leu Lys Arg Val Gly Tyr Glu Pro Asp Asp

85 90 95

Leu Leu Tyr Ile Ile Ser Ser His Leu His Phe Asp His Ala Gly Gly

100 105 110

Asn Gly Ala Phe Thr Asn Thr Pro Ile Ile Val Gln Arg Ala Glu Tyr

115 120 125

Glu Ala Ala Leu His Arg Glu Glu Tyr Met Lys Glu Cys Ile Leu Pro

130 135 140

His Leu Asn Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Asp Tyr Glu Val Val Pro Gly

145 150 155 160

Val Gln Leu Leu Tyr Thr Pro Gly His Ser Pro Gly His Gln Ser Leu

165 170 175

Phe Ile Glu Thr Glu Gln Ser Gly Ser Val Leu Leu Thr Ile Asp Ala

180 185 190

Ser Tyr Thr Lys Glu Asn Phe Glu Asp Glu Val Pro Phe Ala Gly Phe

195 200 205

Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Lys Arg Leu Lys Gly Val Val

210 215 220

Ala Glu Glu Lys Pro Ile Val Phe Phe Gly His Asp Ile Glu Gln Glu

225 230 235 240

Lys Gly Cys Arg Val Phe Pro Glu Tyr Ile

245 250

<210>20

<211>250

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis B25

<400>20

Met Thr Val Lys Lys Leu Tyr Phe Ile Pro Ala Gly Arg Cys Met Leu

1 5 10 15

Asp His Ser Ser Val Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Asn Leu Leu Asn

20 25 30

Leu Pro Val Trp Cys Tyr Leu Leu Glu Thr Glu Glu Gly Ala Ile Leu

35 40 45

Val Asp Thr Gly Met Pro Glu Ser Ala Val Asn Asn Glu Gly Leu Phe

50 55 60

Asn Gly Thr Phe Val Glu Gly Gln Ile Leu Pro Lys Met Thr Glu Glu

65 70 75 80

Asp Arg Ile Val Asn Ile Leu Lys Arg Val Gly Tyr Glu Pro Asp Asp

85 90 95

Leu Leu Tyr Ile Ile Ser Ser His Leu His Phe Asp His Ala Gly Gly

100 105 110

Asn Gly Ala Phe Thr Asn Thr Pro Ile Ile Val Gln Arg Thr Glu Tyr

115 120 125

Glu Ala Ala Leu His Arg Glu Glu Tyr Met Lys Glu Cys Ile Leu Pro

130 135 140

His Leu Asn Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Asp Tyr Glu Val Val Pro Gly

145 150 155 160

Val Gln Leu Leu Tyr Thr Pro Gly His Ser Pro Gly His Gln Ser Leu

165 170 175

Phe Ile Glu Thr Glu Gln Ser Gly Ser Val Leu Leu Thr Ile Asp Ala

180 185 190

Ser Tyr Thr Lys Glu Asn Phe Glu Asp Glu Val Pro Phe Ala Gly Phe

195 200 205

Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Lys Arg Leu Lys Gly Val Val

210 215 220

Ala Lys Glu Lys Pro Ile Val Phe Phe Gly His Asp Ile Glu Gln Glu

225 230 235 240

Lys Gly Cys Arg Val Phe Pro Glu Tyr Ile

245 250

<210>21

<211>256

<212>PRT

<213>Agrobacterium tumefaciens

<400>21

Met Leu Gln Ser Gly Thr Leu Lys Cys Lys Val His Asn Ile Lys Met

1 5 10 15

Asn Gln Gly Asn Gly Ala Asp Tyr Glu Ile Pro Val Pro Phe Phe Leu

20 25 30

Ile Thr His Pro Ala Gly His Thr Val Ile Asp Gly Gly Asn Ala Ile

35 40 45

Glu Val Ala Thr Asp Pro Arg Gly His Trp Gly Gly Ile Cys Asp Val

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Tyr Trp Pro Val Leu Asp Lys Asp Gln Gly Cys Val Asp Gln Ile Lys

65 70 75 80

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Leu His Leu Asp His Thr Gly Ala Ile Gly Arg Phe Pro Asn Ala Thr

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His Ile Val Gln Arg Ser Glu Tyr Glu Tyr Ala Phe Thr Pro ASp Trp

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Phe Ala Gly Gly Gly Tyr Ile Arg Lys Asp Phe Asp Lys Pro Gly Leu

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Gly Asp Gly Thr Leu Thr Thr Ile Phe Thr Pro Gly His Ala Pro Gly

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Thr Ile Asp Ala Ala Tyr Thr Leu Asp His Trp Glu Glu Lys Ala Leu

195 200 205

Pro Gly Phe Leu Ala Ser Thr Val Asp Thr Val Arg Ser Val Gln Lys

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Leu Arg Thr Tyr Ala Glu Lys His Asp Ala Thr Val ValThr Gly His

225 230 235 240

Asp Pro Asp Ala Trp Ala Asn Phe Lys Lys Ala Pro Glu Phe Tyr Ala

245 250 255

<210>22

<211>248

<212>PRT

<213>Bacillus sp.24081

<400>22

Met Thr Val Lys Lys Leu Tyr Phe Val Pro Ala Gly Arg Cys Met Leu

1 5 10 15

Asp His Ser Ser Val Asn Ser Thr Leu Thr Pro Gly Glu Leu Leu Asp

20 25 30

Leu Pro Val Trp Cys Tyr Leu Leu Glu Thr Glu Glu Gly Pro Ile Leu

35 40 45

Val Asp Thr Gly Met Pro Glu Ser Ala Val Asn Asn Glu Gly Leu Phe

50 55 60

Asn Gly Thr Phe Val Glu Gly Gln Val Leu Pro Lys Met Thr Glu Glu

65 70 75 80

Asp Arg Ile Val Asn Ile Leu Lys Arg Val Gly Tyr Glu Pro Glu Asp

85 90 95

Leu Leu Tyr Ile Ile Ser Ser His Leu His Phe Asp His Ala Gly Gly

100 105 110

Asn Gly Ala Phe Ile Asn Thr Pro Ile Ile Val Gln Arg Ala Glu Tyr

115 120 125

Glu Ala Ala Gln His Ser Glu Glu Tyr Leu Lys Glu CysIle Leu Pro

130 135 140

Asn Leu Asn Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Asp Tyr Glu Val Val Pro Gly

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Val Gln Leu Leu His Thr Pro Gly His Thr Pro Gly His Gln Ser Leu

165 170 175

Leu Ile Glu Thr Glu Lys Ser Gly Pro Val Leu Leu Thr Ile Asp Ala

180 185 190

Ser Tyr Thr Lys Glu Asn Phe Glu Asn Glu Val Pro Phe Ala Gly Phe

195 200 205

Asp Ser Glu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Lys Arg Leu Lys Glu Val Val

210 215 220

Met Lys Glu Lys Pro Ile Val Phe Phe Gly His Asp Ile Glu Gln Glu

225 230 235 240

Arg Gly Cys Lys Val Phe Pro Glu

245

Claims

1.一种分离的核酸分子，其编码由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1的分离的核酸分子，其由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成。

3.一种表达载体，其包含权利要求1或2的核酸分子。

4.一种蛋白质，其由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成。

5.一种提高易感植物对毒力由自体诱导物调节的疾病的抗性的方法，包括为所述植物施用有效量的能产生所述自体诱导物抑制剂的细菌，其中所述抑制剂包含权利要求4的蛋白质。

6.一种提高植物对毒力由自体诱导物调节的疾病抗性的方法，所述方法包括在这种植物细胞中导入编码自体诱导物灭活蛋白的至少一种核酸序列，以使得所述细胞表达所述核酸序列，其中所述自体诱导物灭活蛋白包含权利要求4的蛋白质。

7.权利要求6的方法，其中所述核酸序列由SEQ ID NO：1组成。

8.权利要求5、6或7的方法，其中对其抗性得以提高的疾病是由铜绿假单胞菌、斯氏泛菌、菊欧文氏菌、茄伯克霍尔德氏菌、野油菜黄单胞菌或胡萝卜软腐欧文氏菌引起的。

9.权利要求5、6或7的方法，其中对其抗性得以提高的疾病是由胡萝卜软腐欧文氏菌引起的植物软腐病。

10.权利要求5的方法，其中所述施用的细菌是芽孢杆菌菌种。

11.权利要求10的方法，其中所述芽孢杆菌菌种是苏云金芽孢杆菌的一种变种。

12.权利要求11的方法，其中所述苏云金芽孢杆菌的变种选自B1，B2和B17。

13.能够产生疾病调节性自体诱导物的抑制剂的细菌在制备用于提高对毒力由所述自体诱导物调节的疾病的抗性的组合物中的应用，其中所述抑制剂包含权利要求4的蛋白质。

14.权利要求13的应用，其中所述细菌是芽孢杆菌菌种。

15.权利要求14的应用，其中所述芽孢杆菌菌种是苏云金芽孢杆菌的一种变种。

16.权利要求15的应用，其中所述苏云金芽孢杆菌的变种选自B1，B2和B17。

17.至少一种自体诱导物灭活蛋白在制备用于提高对疾病抗性的组合物中的应用，所述疾病的毒力通过由所述自体诱导物灭活蛋白灭活的自体诱导物调节，其中所述自体诱导物灭活蛋白包含权利要求4的蛋白质。

18.至少一种编码自体诱导物灭活蛋白的核酸序列在制备用于提高对疾病抗性的组合物中的应用，所述疾病的毒力通过由所述自体诱导物灭活蛋白灭活的自体诱导物调节，其中所述自体诱导物灭活蛋白包含权利要求4的蛋白质且其中所述核酸分子在细胞中表达。

19.权利要求18的应用，其中所述核酸由SEQ ID NO：1组成。

20.权利要求13-19任一项的应用，其中对其抗性得以提高的疾病是由铜绿假单胞菌、斯氏泛菌、菊欧文氏菌、茄伯克霍尔德氏菌、野油菜黄单胞菌或胡萝卜软腐欧文氏菌引起的。

21.一种降低细菌对植物造成的损害的方法，所述方法包括为需要降低这种损害的植物施用有效量的权利要求4的蛋白质。

22.一种降低细菌生物膜形成的方法，包括将形成生物膜的细菌暴露于权利要求4的蛋白质。

23.一种用编码权利要求4的蛋白质的至少一种核酸分子稳定转化的原核或真核细胞。

24.权利要求23的细胞，其中所述至少一种核酸分子由SEQ IDNO：1组成。