BR112021002698A2 - métodos de biocontrole com base no rna para proteger plantas contra bactérias patogênica e/ou promover efeitos benéficos de bactérias simbióticas e comensais - Google Patents

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Abstract

MÉTODOS DE BIOCONTROLE COM BASE NO RNA PARA PROTEGER PLANTAS CONTRA BACTÉRIAS PATOGÊNICAS E/OU PROMOVER EFEITOS BENÉFICOS DE BACTÉRIAS SIMBIÓTICAS E COMENSAIS. A presente invenção pertence ao campo da agricultura. A invenção se refere a um método para inibir a expressão de gene em bactérias, que é aqui referido como Sileciamento de Gene Bacteriano (AGS). Particularmente, o método é usado para proteger plantas contra bactérias patogênicas por direcionamento de fatores de patogenicidade e/ou genes essenciais de uma maneira específica da sequência por meio de RNAs não codificantes pequenos. O método pode também ser usado para realçar efeitos beneficios e/ou crescimento de bactérias simbióticas ou comensais associadas à planta. A invenção envolve a geração de plantas transgênicas estáveis que constitutivamente expressam RNAs pequenos antibacterianos ou, a liberação exógena das entidades de RNA pequeno sobre plantas, ou na forma de extratos de RNA ou embutidas em vesículas extracelulares da planta (EVs), que descobriu-se ser eficaz na redução da patogenicidade bacteriana. A invenção também descreve um método para identificar de maneira rápida, confiável e de baixo custo, pequenos RNAS que possuem atividade antibacteriana e que podem também ser explorados para aplicações de biocontrole com base no RNA para conferir proteção à planta contra bactérias patogênicas. Além disso, o último método é instrumental para rapidamente caracterizar genes de quaisquer espécies bacterianas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTO-
DOS DE BIOCONTROLE COM BASE NO RNA PARA PROTEGER PLANTAS CONTRA BACTÉRIAS PATOGÊNICAS E/OU PROMOVER EFEITOS BENÉFICOS DE BACTÉRIAS SIMBIÓTICAS E COMEN- SAIS”. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção pertence ao campo da agricultura. A in- venção refere-se a um método para inibir a expressão de gene em bac- térias, que é referida aqui como Sileciamento de Gene Antibacteriano (AGS). Em modalidades particulares, o método é usado para proteger plantas contra bactérias patogênicas por direcionamento de fatores de patogenicidade e/ou genes essenciais de uma maneira específica da sequência por meio de RNAs não codificantes pequenos. O método pode também ser usado para realçar efeitos benéficos e/ou crescimento de bactérias simbióticas ou comensais associadas à planta. A invenção envolve ou a geração de plantas transgênicas estáveis que constitutiva- mente expressam RNAs pequenos antibacterianos ou, alternativa- mente, a liberação exógena destas entidades de RNA pequeno sobre plantas, ou na forma de extratos de RNA ou embutidas em vesículas extracelulares da planta (EVs), que se descobriu ser eficaz na redução da patogenicidade bacteriana. A invenção também descreve um método para identificar de uma maneira rápida, confiável e de baixo custo, RNAs pequenos que possuam atividade antibacteriana e que podem também ser explorados para aplicações de biocontrole com base no RNA para conferir proteção à planta contra bactérias patogênicas. Além disso, o último método é instrumental para rapidamente caracterizar quaisquer genes de quaisquer espécies bacterianas. Descrição da Técnica Anterior Visão geral do sistema imunológico da planta
[002] A primeira camada do sistema imunológico da planta envolve o reconhecimento de Padrões Moleculares Associados à Patógenos ou Micróbios (PAMPs ou MAMPs), que são assinaturas microbianas con- servadas que são detectadas por receptores de reconhecimento de pa- drões localizados na superfície (PRRs) 1. Após a ligação do ligante, es- ses receptores iniciam uma cascata de fosforilação complexa no com- plexo PRR que leva à imunidade desencadeada por PAMP (PTI) 1. Para permitir a doença, os patógenos secretam efetores que suprimem a PTI
2. Por exemplo, a bactéria Gram-negativa Pseudomonas syringae pv. cepa tomato DC3000 (Pto DC3000) injeta 36 efetores secretados tipo III em células vegetais para amortecer PTI 3. Esta bactéria também produz coronatina (COR), uma fitotoxina que é essencial para sua patogenici- dade 4. Plantas desenvolveram proteínas resistentes a doenças (R) que podem perceber a presença de efetores do patógeno para desencadear uma contra-defesa do hospedeiro 5. A maioria das proteínas R pertence ao domínio de ligação aos nucleotídeos (NBD), superfamília de repeti- ção rica em leucina (NLR), que também estão presentes em animais (2, 5). Eles reconhecem, direta ou indiretamente, efetores de patógenos e montam a imunidade desencadeada por efetores (ETI), uma potente resposta imune que se sobrepõe significativamente à PTI, embora com uma amplitude mais forte (6, 7). Silenciamento de gene pós-transcricional (PTGS) controla as interações patógeno-hospedeiro
[003] PTGS é um mecanismo regulador de gene pós-transcricional conservado que foi extensivamente caracterizado como uma resposta de defesa antiviral natural em plantas por direcionamento e degradação de transcrições virais 8. O mecanismo de núcleo de silenciamento de RNA ou interferência de RNA (RNAi) em plantas envolve o reconheci- mento e processamento de RNAs de fita dupla (dsRNAs) por proteínas da enzima RNase III DICER-LIKE (DCL) levando à produção de duple-
xes de RNAs de interferência curta (siRNAs) de 20 a 25 nt de compri- mento. Esses duplexes de siRNA se associam a uma proteína Argo- naute (AGO), o componente central do complexo de silenciamento in- duzido por RNA (RISC). Separação subsequente da fita na proteína AGO forma um RISC maduro composto de AGO e um RNA de fita sim- ples, a fita guia, enquanto a fita passageira é degradada. O RNA pe- queno guia direciona AGO-RISC em alvos de mRNA complementares de sequência, levando à sua clivagem endonucleolítica e/ou inibição da translação. Durante a última década, vários RNAs e microRNAs (miR- NAs) de interferência curta endógenos (siRNAs) foram adicionalmente encontrados para orquestrar respostas de PTI e ETI contra patógenos não virais 9, implicando em um papel fundamental de PTGS na regula- ção do sistema imunológico de plantas.
[004] Em plantas, RNAs pequenos móveis podem desencadear si- lenciamento autônomo não celular em células adjacentes, bem como em tecidos distais 10. Eles são notavelmente importantes para preparar a defesa antiviral antes da frente de infecção 10. O silenciamento autô- nomo não celular também é crítico para a translocação de sinais de si- lenciamento entre células de plantas e seus organismos patogênicos, parasitários ou simbióticos não virais de interação - excluindo bactérias, que não foram mostradas como alvo deste processo 11. Este meca- nismo regulatório natural de reinos cruzados foi notavelmente caracteri- zado recentemente em interações planta-fungo (12-17). Por exemplo, foram encontrados miRNAs de plantas específicas para serem exporta- dos para as hifas do patógeno fúngico Verticillium dahliae para desen- cadear o silenciamento de fatores de virulência (14, 17). Por outro lado, RNAs pequenos de B. cinerea endógeno podem ser exportados para células vegetais para silenciar genes de defesa de plantas 16, desta- cando RNAi de reino cruzado bidirecional entre patógenos vegetais e fúngicos. Embora muito pouco se saiba sobre os mecanismos de tráfego de RNA/dsRNA pequenos entre as células do hospedeiro e as células fúngicas, a presença de numerosas vesículas na matriz extra-exaustiva sugere que elas podem transferir sinais de silenciamento entre os dois organismos 18. Consistente com esta hipótese, dois estudos recentes fornecem evidências de que as vesículas extracelulares (EVs) vegetais são essenciais para liberar RNAs pequenos antifúngicos em células de B. cinerea, bem como RNAs pequenos antioomicetos em células de Phytophthora capsici (17, 19). RNAi de reino cruzado pode ser explorado para conferir proteção contra patógenos que possuem um mecanismo de silenciamento de RNA ca- nônico
[005] A relevância biológica do RNAi de reino cruzado foi inicial- mente demonstrada pela expressão de dsRNAs carregando homologias a fatores vitais ou de patogenicidade de um determinado parasita ou praga, desde que possuam um mecanismo de RNAi canônico (por exemplo, DCL funcionais e proteínas AGO). Até agora, esta tecnologia de Silenciamento de Gene Induzido por Hospedeiro (HIGS) foi usada com sucesso para proteger as plantas da invasão e predação de inse- tos, nematóides, oomicetos, fungos e plantas parasitas (WO 2012/155112, WO 2012/155109, CA 2 799 453, EP 2 405 013, US 2013/177539, 15, 20, 21)). Por exemplo, HIGS confere proteção total contra Fusarium graminearum e B. cinerea e este fenômeno é total- mente recapitulado por pulverização de dsRNAs ou siRNAs exógenos relevantes em plantas de tipo selvagem antes de infecções fúngicas (15, 20, 21). O último fenômeno é referido como Silenciamento Genético In- duzido por Spray (SIGS) e é uma reminiscência de 'RNAi ambiental', um processo que envolve a absorção de RNAs do ambiente inicialmente descrito em Caenorhabditis elegans e em alguns insetos (15, 21, 22). HIGS/SIGS é, portanto, considerado como um complemento poderoso,
ou mesmo às vezes uma alternativa, à produção convencional ou modi- ficação genética projetada para introduzir genes R ou receptores PAMP em culturas agrícolas relevantes (5, 23, 24). Além disso, esta tecnologia fornece uma solução de proteção vegetal mais durável e ecologica- mente correta que provavelmente contribuirá para uma redução no uso de agroquímicos, o que pode ter, em alguns casos, um impacto signifi- cativo na saúde humana e no meio ambiente. Limitação atual das tecnologias HIGS/SIGS
[006] As tecnologias HIGS/SIGS são limitadas pelo fato de que só se mostraram funcionais contra patógenos de plantas e parasitas que possuem um mecanismo de silenciamento de RNA canônico. Por exem- plo, SIGS contra F. graminearum depende, pelo menos em parte, da captação de dsRNAs e processamento adicional pela proteína fúngica DICER-LIKE 1 21. Até o momento, não há exemplo de HIGS/SIGS dire- cionado contra patógenos de plantas que não possuem um mecanismo de RNAi canônico, tais como os patógenos bacterianos que são usados aqui pelos inventores e que não contêm fatores de silenciamento de RNA canônicos tipo eucarióticos em seus genomas, como explicado na revisão de S. Ghag, 2017 22. É por isso que, até hoje, as tecnologias de silenciamento baseadas em RNA não foram exploradas para prote- ger as plantas de patógenos bacterianos. Esta é uma limitação conside- rável porque os patógenos bacterianos têm um grande impacto na qua- lidade e produção de alimentos agrícolas, o que resulta em perdas eco- nômicas significativas em todo o mundo. É o caso, por exemplo, de pa- tógenos bacterianos, tais como Pseudomonas, Ralstonia, Xylella, Xan- thomonas, que causam infecções em uma ampla gama de plantas cul- tivadas 25.
[007] Alguns autores especularam que seria possível afetar o cres- cimento bacteriano pelo contato de células bacterianas com dsRNAs longos. Por exemplo, WO 2006/046148 propõe o controle da prolifera- ção de pragas que podem absorver fragmentos de dsRNA longos (> 80 pares de bases), entre os quais, supostamente, também bactérias. No entanto, os inventores do WO 2006/046148 não fornecem qualquer evi- dência experimental de que as bactérias são sensíveis a tais fragmentos de RNA longos (seus exemplos apenas divulgam o efeito de dsRNAs em nematóides). Pelo contrário, os presentes inventores aqui demons- tram que as bactérias não são sensíveis a dsRNAs longos, indicando que a hipótese levantada pelos inventores do WO 2006/046148 não é válida quando alvejando de células procarióticas. Propósito da invenção
[008] Na presente invenção, os autores mostram aqui pela pri- meira vez que RNAs pequenos de plantas podem inibir com eficiência a expressão de genes de fitopatógenos bacterianos de uma maneira es- pecífica de sequência, um fenômeno aqui referido como "Silenciamento de Gene Antibacteriano" (AGS). Este mecanismo regulador foi notavel- mente mostrado para operar dentro de duas espécies bacterianas Gram-negativas diferentes, indicando que RNAs pequenos de plantas podem ser eficientemente absorvidos por células bacterianas, apesar da presença de uma parede celular compreendendo uma intrincada es- trutura de membrana dupla (as membranas interna e externa da bacté- ria). Este é um resultado inesperado, uma vez que nunca foi demons- trado no passado que RNAs pequenos podem penetrar através da bica- mada de fosfolipídios bacteriana ou ser passiva ou ativamente transpor- tados dentro de células bacterianas patogênicas de plantas.
[009] No entanto, apesar de todos esses prejuízos, as descobertas dos inventores demonstram que é de fato possível direcionar o silenci- amento de qualquer gene bacteriano, por exemplo, fatores de virulência ou genes essenciais, pelo contato de células bacterianas com RNAs pe-
quenos com homologias de sequência a um ou vários genes bacteria- nos alvo. Esses RNAs pequenos podem ser expressos de forma estável pelas referidas células vegetais para protegê-las contra um ou vários patógenos bacterianos. Alternativamente, eles podem ser administra- dos exogenamente em tecidos de plantas que irão encontrar a bactéria fitopatogênica alvo, diminuindo assim sua patogenicidade e cresci- mento. Assim, ao contrário do que se pensava até agora, o silencia- mento direcionado a RNA pequeno pode ser usado para derrubar com eficiência a expressão de genes de patógenos bacterianos de plantas que não possuem um mecanismo de silenciamento de RNA do tipo eu- cariótico e que possuem ainda uma membrana dupla.
[0010] Esta sensibilidade inesperada de células bacterianas a RNAs pequenos liberados exogenamente pode ser usada propositada- mente em aplicações antibacterianas, e um grande número de trata- mentos pode ser considerado para reduzir a sobrevivência, patogenici- dade e/ou crescimento de fitopatógenos bacterianos.
[0011] Finalmente, os inventores usaram um ensaio com base in vi- tro para identificar de uma maneira rápida, confiável e econômica, RNAs pequenos com atividade antibacteriana. Portanto, prevê-se que a pre- sente invenção será amplamente usada para (i) conferir proteção de planta pré e pós-colheita contra patógenos bacterianos, (ii) aumentar o efeito benéfico e/ou o crescimento de bactérias simbióticas ou comen- sais, e (iii) caracterizar a função dos genes em qualquer espécie bacte- riana. Descrição Detalhada da Invenção Visão Geral
[0012] Nos resultados abaixo, os Inventores mostram que AGS é uma tecnologia eficiente para aumentar a proteção de plantas contra infecções bacterianas, tendo como alvo - individual ou concomitante- mente - genes-chave necessários para a patogenicidade bacteriana.
Eles expressaram de forma constitutiva em plantas transgênicas está- veis de Arabidopsis, RNAs pequenos com homologias a dois principais fatores de virulência da bactéria Gram-negativa Pto DC3000, a saber Cfa6 e HrpL, e encontraram uma virulência e crescimento significativa- mente mais baixos deste patógeno bacteriano quando em contato com células de planta expressando esses RNAs pequenos. Uma proteção aprimorada contra Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), que é o agente causador da podridão negra, uma das doenças mais devas- tadoras da cultura de crucíferas, também foi observada em plantas Ara- bidopsis transgênicas que expressam RNAs pequenos contra os fatores de virulência HrpG, HrpX e RsmA. Estes dados demonstram que AGS pode ser usado para proteger as plantas contra fitopatógenos com rele- vância agrícola não relacionados.
[0013] Eles também mostram que a virulência reduzida observada em plantas transgênicas de Arabidopsis que expressam siRNAs anti- Cfa6 e anti-HrpL está associada a uma diminuição específica na expres- são dos fatores de virulência de dois alvos em Pto DC3000. Este fenô- meno de silenciamento de genes bacterianos in vivo não foi apenas con- siderado eficaz contra esses genes de virulência responsivos ao es- tresse endógeno, mas também contra genes repórter artificiais expres- sos constitutivamente a partir do genoma Pto DC3000. Essas descober- tas, portanto, destacam que, apesar de sua falta de mecanismo de si- lenciamento de RNA canônico do tipo eucariótico, as células bacteria- nas são realmente sensíveis à ação de RNAs pequenos codificados por plantas. Eles também fornecem evidências de que RNAs pequenos ar- tificiais produzidos em plantas podem induzir o silenciamento de genes em patógenos bacterianos extracelulares, indicando que os RNAs pe- quenos devem ser exportados de células hospedeiras para células bac- terianas, através de um mecanismo que envolve diferentes populações de RNAs pequenos de plantas extracelulares (veja abaixo).
[0014] Surpreendentemente, este efeito de silenciamento foi obser- vado não apenas em plantas geneticamente modificadas de modo a ex- pressar de forma estável os RNAs pequenos com homologia com genes Cfa6 e HrpL, mas também em plantas WT pré-tratadas com RNA total contendo siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL e subsequentemente inoculado com Pto DC3000. Curiosamente, fenótipos similares foram observados quando os siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL sintetizados in vitro foram usa- dos nesses ensaios. A última descoberta indica que o AGS não pode ser desencadeado apenas por RNAs pequenos derivados de plantas, mas também por RNAs pequenos de fita dupla sintéticos.
[0015] Além disso, ao gerar bactérias recombinantes que expres- sam uma versão resiliente de RNA pequeno de HrpL que contém tantas mutações silenciosas quanto possível na região que é direcionada por RNAs pequenos (que foram projetados para alterar a ligação de RNAs pequenos com o mRNA HrpL, mas para produzir o mesma sequência de proteína), os inventores mostraram que o silenciamento de HrpL não era mais eficaz. Além disso, observaram que a virulência dessa bactéria recombinante permaneceu inalterada após a aplicação exógena de RNAs totais contendo RNAs pequenos anti-HrpL eficazes. Essas des- cobertas fornecem evidências experimentais convincentes de que RNAs pequenos direcionados contra o gene HrpL são causais tanto para AGS quanto para diminuição da patogenicidade bacteriana.
[0016] Os Inventores continuaram a investigar quais entidades de RNA são responsáveis pelo fenômeno AGS observado em resposta a RNAs totais exógenos portadores de RNA antibacteriano. Interessante- mente, separando espécies de RNAs pequenos e RNAs longos de RNAs totais extraídos de plantas transgênicas que expressam um grampo de cabelo quimérico que tem como alvo ambos os genes Cfa6 e HrpL, eles mostraram que a liberação exógena da fração de RNA pe-
queno nas plantas desencadeou o efeito antibacteriano, enquanto o tra- tamento com a fração de RNA longo foi ineficaz. Além disso, os inven- tores mostraram que extratos de RNA total de uma linha de referência IR-CFA6/HRPL, que foi mutado nos genes DCL2, DCL3 e DCL4 e, por- tanto, prejudicado na biossíntese de siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL, não foram eficazes no desencadeamento de AGS nem na redução da pato- gênese. Coletivamente, essas descobertas fornecem evidências con- vincentes de que RNAs pequenos, mas não seus precursores de dsRNA longo (a menos que sejam processados em RNAs pequenos in planta), são as entidades de RNA que são causais para AGS. Esta é uma grande distinção do RNAi ambiental relatado anteriormente em C. elegans e herbívoros vegetais, que se baseia especificamente em dsRNAs longos (26-32), ou nos patógenos filamentosos eucarióticos B. cinerea e F. gra- minearum, que é desencadeado por dsRNAs ou siRNAs (15, 21).
[0017] É importante ressaltar que os inventores demonstram adici- onalmente que a aplicação exógena de RNAs totais contendo RNAs pe- quenos eficazes contra os genes Cfa6 e HrpL pode reduzir de forma eficiente o crescimento de Pto DC3000 e a patogenicidade na planta Solanum lycopersicum agricolamente relevante (tomate), que é o hos- pedeiro natural desta bactéria. Portanto, é antecipado que esta aborda- gem de biocontrole com base em RNA pode ser explorada para conferir - com uma alta seletividade com base em sequência - proteção a uma ampla gama de plantas cultivadas contra fitopatógenos bacterianos. Também pode ser previsto que a aplicação de RNAs pequenos com homologias de sequência a fatores de virulência e/ou genes essenciais na superfície de frutas, vegetais, flores e folhas reduzirá significativa- mente a infecção contra vários patógenos bacterianos devastadores. Este método também seria adequado em tratamentos de sementes para controlar patógenos bacterianos transmitidos por sementes, que repre- sentam uma grande ameaça para a indústria de sementes. Além disso,
este método pode ser facilmente projetado para controlar vários pató- genos bacterianos, direcionando concomitantemente genes essenciais e/ou fatores de virulência de vários fitopatógenos bacterianos. AGS, por- tanto, representa uma nova tecnologia com base em RNA ambiental- mente amigável para proteger as plantas contra doenças bacterianas.
[0018] No passado, Escobar et al 33 usou um método com base em silenciamento de RNA para alvejar os dois oncogenes de Agrobacterium tumefaciens iiaM e ipt em Arabidopsis e tomate. No entanto, neste rela- tório, os autores têm como alvo oncogenes que são transferidos e inte- grados no genoma da planta pelo T-DNA do grande plasmídeo de indu- ção de tumor (Ti). Na verdade, o mecanismo que se manifesta depende de um processo de silenciamento clássico de RNA de genes direciona- dos que são expressos a partir de células vegetais, mas não de células bacterianas. Esta é uma distinção importante da presente invenção que se baseia no silenciamento de genes que são expressos dentro das cé- lulas bacterianas. Além disso, no estudo de Escobar et al 33, apenas a tumorigênese da galha em coroa induzida pela bactéria Agrobacterium tumefaciens é evitada, pois o efeito de silenciamento do RNA inibe a expressão dos oncogenes iiaM e ipt expressos nas células vegetais. Portanto, os resultados só podem ser transpostos para outras bactérias de indução de tumorigênese que são conhecidas por integrar seu DNA no genoma da planta. Consequentemente, este estudo tem um impacto limitado na proteção de plantas, como destacado no próprio estudo (pá- gina 13442, coluna da direita; "Good nursery practices would need to be maintained in the cultivation of these plants to minimize the dissemina- tion of large populations of virulent Agrobacterium tumefaciens bacteria into the field"). Na verdade, a virulência intrínseca dessas bactérias não foi afetada pelos RNAs pequenos usados pelos autores neste estudo.
[0019] Nos resultados abaixo, os inventores também investigaram o possível papel dos EVs no tráfego de RNAs pequenos antibacterianos derivados de plantas em direção às células bacterianas. Eles descobri- ram pelo menos duas populações de EVs possuindo atividades antibac- terianas, uma de tamanho grande, que era totalmente ativa na diminui- ção da patogênese bacteriana, e outra de EVs menores, que eram mo- deradamente menos ativos. Além disso, eles mostraram que RNAs pe- quenos antibacterianos são protegidos da digestão da nuclease micro- cócica (Mnase) quando incorporados a esses EVs, destacando o poten- cial dos EVs de plantas para futuras estratégias de gerenciamento de doenças em condições de campo. Curiosamente, os inventores desco- briram adicionalmente que RNAs pequenos antibacterianos livres de EV apoplásticos, que não estavam associados a proteínas, também eram totalmente ativos na diminuição de patogênese. Essas novas espécies de RNA pequeno são referidas aqui como RNAs pequenos livres extra- celulares ou “efsRNAs”, e eram sensíveis à digestão com Mnase. Os inventores concluíram, portanto, que o apoplasto de plantas transgêni- cas IR-CFA6/HRPL é composto por pelo menos três populações de RNAs pequenos antibacterianos funcionais, que são incorporados em EVs grandes, em EVs menores ou em uma forma livre.
[0020] Os Inventores também expressaram transitoriamente RNAs pequenos usando transformação transitória de folhas de tabaco medi- ada por Agrobacterium bem estabelecida, seguida pela incubação de siRNAs antibacterianos candidatos correspondentes com células bacte- rianas. Este método foi notavelmente útil para determinar que siRNAs direcionados contra o gene HrpL foram igualmente eficientes na preven- ção da reabertura do estomática induzida por Pto DC3000 em compa- ração com siRNAs direcionados aos genes Cfa6 e HrpL concomitante- mente. Além disso, os inventores demonstraram que a síntese in vitro de RNAs pequenos é um método fácil, rápido e confiável para rastrear RNAs pequenos candidatos que desencadeiam efeitos antibacterianos,
tais como silenciamento de genes bacterianos e a supressão da reaber- tura estomática induzida por bactérias. Eles também acoplaram o mé- todo de síntese de RNA pequeno in vitro com um sistema microfluídico com base em gotículas para demonstrar que os siRNAs direcionados contra os genes conservados GyrB ou FusA de Pto DC3000 podem al- terar drasticamente o crescimento bacteriano in vitro, identificando as- sim novos agentes bactericidas. Portanto, antecipa-se que tal síntese com base em tabaco transitório ou in vitro de RNAs pequenos candida- tos, seguida pela incubação de RNAs pequenos correspondentes com células bacterianas in vitro, será amplamente usada no futuro por indus- triais para identificar RNAs pequenos com fortes efeitos na expressão de genes bacterianos e/ou em fenótipos específicos (por exemplo, cres- cimento bacteriano, sobrevivência, atividades metabólicas). Também é antecipado que a tecnologia AGS aqui descrita será amplamente utili- zada para caracterizar a função de genes bacterianos através de um novo método genético reverso com base em RNA. Este método foi, por exemplo, instrumental para demonstrar pela primeira vez um papel para HrpL na reabertura estomática induzida por Pto DC3000, bem como um papel para GyrB e FusA na sobrevivência de Pto DC3000. Por fim, por- que as plantas de tabaco já são usadas por indústrias para produzir al- tas produções de proteínas recombinantes ou partículas tipo vesículas de uma maneira econômica (cf.EP2610345 da Medicago Inc.), eles pro- vavelmente serão explorados para produzir RNAs pequenos candida- tos, particularmente dentro de EVs nos quais serão protegidos da de- gradação de nuclease, para futuras aplicações de biocontrole com base em RNA.
[0021] Com base em todas essas descobertas, os presentes Inven- tores propõem um método para inibir a expressão de pelo menos um gene em bactérias, o referido método compreendendo:
i) introdução em pelo menos uma célula vegetal de pelo me- nos uma molécula de RNA de interferência funcional (iRNA) direcionada especificamente a pelo menos um gene bacteriano, sendo o referido iRNA capaz de induzir o silenciamento específico de sequência dos re- feridos genes em bactérias portadoras dos referidos genes, ou ii) liberação de RNAs pequenos ou extratos de plantas con- tendo esses RNAs pequenos em tecidos vegetais antes e/ou após a infecção bacteriana, ou iii) liberação de RNAs pequenos diretamente nas células bacterianas, sendo esses RNAs pequenos em EVs, em fluidos apoplás- ticos ou como RNAs livres extracelulares.
[0022] Curiosamente, este método permite o direcionamento de um ou vários genes bacterianos pela expressão de moléculas de RNA de interferência (precursoras de siRNAs e miRNAs) em células vegetais ou liberação de RNAs pequenos em tecidos vegetais antes e/ou após a infecção bacteriana. Este método terá grandes aplicações agrícolas de biocontrole com base em RNA no manejo de infecções bacterianas em plantas.
[0023] Mais precisamente, esta tecnologia fornecerá uma maneira de controlar infecções bacterianas em plantas e, portanto, reduzir os tratamentos químicos na agricultura sem ter um efeito negativo nas bac- térias benéficas ou no meio ambiente devido à alta seletividade com base em sequência deste método.
[0024] Além disso, esta estratégia fornecerá resistência durável a doenças, o que não é o caso dos programas convencionais ou de me- lhoramento molecular que visam introduzir um único gene de resistência a doenças nas culturas.
[0025] Finalmente, pode-se antecipar que a tecnologia aqui descrita também será útil para controlar a expressão de genes de bactérias be- néficas a fim de aumentar sua multiplicação e/ou seus efeitos benéficos para as plantas hospedeiras.
[0026] Além dessas vantagens, o método proposto é econômico e relativamente fácil de industrializar. Na verdade, o processo de projetar e produzir iRNAs artificiais eficazes (tais como os siRNAs) contra genes bacterianos leva apenas algumas semanas quando expresso transitori- amente a partir de folhas de N. benthamiana ou mesmo um único dia quando sintetizado in vitro. Além disso, é relativamente fácil reprojetar e produzir iRNAs artificiais de novo após o aparecimento de bactérias re- sistentes a siRNA. Finalmente, é possível produzir iRNAs direcionados contra uma espécie bacteriana específica ou contra uma vasta gama de cepas bacterianas fitopatogênicas, proporcionando assim tratamentos de plantas direcionados ou de amplo espectro, dependendo da aplica- ção de biocontrole com base em RNA desejada.
[0027] O presente método/uso pode ser realizado in vivo ou in vitro. Por "in vitro", entende-se aqui que as etapas dos métodos ou usos rei- vindicados são conduzidas usando componentes biológicos (por exem- plo, células bacterianas) que foram isolados de seus organismos hos- pedeiros usuais (plantas ou tecidos vegetais, tais como folhas, frutos, raízes, etc.) ou que são cultivados diretamente em meio in vitro (na au- sência de seus organismos hospedeiros). Este é o caso quando os RNAs pequenos da invenção são contatados diretamente com as célu- las bacterianas.
[0028] Por "in vivo" ou "in planta", entende-se aqui que as etapas dos métodos ou usos reivindicados são conduzidas usando organismos inteiros, por exemplo, plantas inteiras. Este é o caso quando os iRNAs da invenção são expressos de forma estável a partir de plantas, onde são processados em RNAs pequenos (siRNAs ou miRNAs) e então li- berados no meio circundante de modo a encontrar as células bacteria- nas.
[0029] Quando RNAs pequenos da invenção são contatados direta- mente com células bacterianas, notavelmente para desencadear o si- lenciamento de genes de fatores de virulência dentro das células bacte- rianas, o presente método/uso é dito ser realizado em um ensaio "semi- in vivo".
[0030] É digno de nota que todos os métodos da invenção devem ser realizados fora de organismos animais ou humanos. Elementos de silenciamento de RNA
[0031] A presente invenção alveja o uso de pelo menos um RNA de interferência funcional (iRNA) para inibir a expressão de pelo menos um gene em uma célula bacteriana.
[0032] Como usado aqui, o termo "RNA de interferência funcional" (iRNA funcional) refere-se a uma molécula de RNA capaz de induzir o processo de silenciamento específico de sequência de pelo menos um gene bacteriano, especialmente em células de bactérias. Em particular, a referida molécula de RNA de interferência funcional pode ser i) um RNA de interferência pequeno, bem conhecido na técnica como molé- cula de RNA de interferência pequeno ou curto (siRNA) (simplex ou du- plex) ou um precursor da mesma, ou ii) uma molécula de microRNA (miRNA) (simplex ou duplex) ou um precursor da mesma.
[0033] O termo "precursor de siRNA" ou "precursor de siRNA" aqui refere-se a uma molécula de RNA que pode ser direta ou indiretamente processada em duplexes de siRNA em plantas (ou extratos de plantas). Exemplos de precursores de siRNA que podem ser processados direta- mente incluem RNA de fita dupla longo (dsRNA longo), enquanto exem- plos de precursores de siRNA que podem ser indiretamente processa- dos incluem RNA de fita simples longo (ssRNA longo) que pode ser usado como modelo para a produção de dsRNAs longos processáveis.
[0034] O termo "precursor de miRNA" ou "precursor de miRNA" aqui refere-se a uma molécula de RNA que pode ser processada em duple- xes de miRNA em plantas (ou extratos de plantas). Exemplos de pre- cursores de miRNA incluem precursores de miRNA primários (pri-miR- NAs) e pré-miRNAs, compreendendo uma alça em grampo de cabelo.
[0035] De nota, plasmídeos ou vetores e outras construções de DNA ou vetores virais que codificam as referidas moléculas precursoras também estão incluídos na definição de "iRNA de interferência funcio- nal".
[0036] Para direcionar vários genes em uma bactéria, o método da invenção pode usar i) uma mistura de vários iRNAs diferentes que, em conjunto, têm como alvo vários genes bacterianos de interesse ou ii) um iRNA quimérico alvejando vários genes bacterianos diferentes de inte- resse ou iii) uma mistura de qualquer um desses iRNAs quiméricos.
[0037] Em uma modalidade particular, o método/uso da invenção compreende a introdução de um ou vários iRNAs funcionais em células vegetais como precursores, para produzir in planta os RNAs pequenos (tais como siRNAs ou miRNAs) que podem ser posteriormente formula- dos e pulverizados em um campo de planta.
[0038] Em uma modalidade mais particular, os iRNAs funcionais da invenção são moléculas de RNA de fita simples longas (doravante de- nominadas "ssRNAs longos"). Tal ssRNA longo pode ser produzido por um transgene de planta, convertido em moléculas de dsRNA longas por polimerases de RNA dependentes de RNA de plantas e posteriormente processados em siRNAs por proteínas DCL de plantas. Alternativa- mente, o ssRNA longo pode ser produzido por um vírus de RNA de planta e posteriormente convertido em moléculas de dsRNA longas du- rante a replicação viral (como intermediários replicativos) e/ou através da ação de RNA polimerases dependentes de RNA de plantas. O dsRNA viral resultante é subsequentemente processado em siRNAs por proteínas DCL de planta, que posteriormente desencadeiam o silencia- mento específico de sequência por meio de um processo denominado Silenciamento de Gene Induzido por Vírus (VIGS) (11).
[0039] Como usado aqui, o termo "ssRNA longo" designa estruturas de fita simples contendo uma fita única de pelo menos 50 bases, mais preferivelmente de 80 a 7000 bases. Os ssRNAs longos podem conter 80 a 7000 bases quando produzidos por um transgene de planta, mas preferivelmente contêm 80 a 2000 bases quando produzidos por um ví- rus de RNA recombinante vegetal.
[0040] Em uma modalidade mais particular, os iRNAs funcionais da invenção são moléculas de RNA de fita dupla longa (doravante denomi- nadas "dsRNAs longos") que atuam como precursores de siRNA e po- dem ser processados em siRNAs, in planta, graças às proteínas DCL e outros fatores de biogênese de RNA codificados por genomas de plan- tas.
[0041] Como usado aqui, o termo "dsRNA longo" designa estruturas de fita dupla contendo uma primeira fita (fita de senso) e uma segunda fita (antissenso) de pelo menos 50 pares de bases, mais preferivelmente de 80 a 7000 pares de base.
[0042] Em plantas ou células vegetais, dsRNAs longos podem ser processados em duplexes de RNA pequeno. Tais dsRNAs longos são vantajosamente dsRNA quiméricos, ou seja, eles carregam homologias de sequência com vários genes bacterianos (ver abaixo).
[0043] Em uma modalidade, o iRNA funcional da invenção é um dsRNA longo que é clivável por proteínas DCL em células vegetais de modo a gerar siRNAs.
[0044] Os dsRNAs longos da invenção podem ser gerados a partir de uma estrutura de grampo de cabelo, por meio de construções de transcrição de senso-antissenso, por meio de uma construção de trans-
crição de senso artificial usada ainda como um substrato por polimera- ses de RNA dependentes de RNA de plantas, ou através de VIGS. Mais precisamente, eles podem compreender protuberâncias, alças ou pares de bases oscilantes para modular a atividade da molécula de dsRNA de modo a mediar a interferência de RNA eficiente em células bacterianas. As regiões de senso e antissenso complementares da molécula de dsRNA longo da invenção podem ser conectadas por meio de ligantes com base em ácido nucleico ou com base em ácido não nucleico. O dsRNA longo da invenção também pode compreender uma estrutura duplex e uma estrutura de alça para formar uma estrutura secundária de grampo de cabelo simétrica ou assimétrica.
[0045] Portanto, em uma modalidade, o iRNA funcional da invenção é dsRNA longo (pelo menos 50 pares de bases, mais preferivelmente de 80 a 400 pares de bases, 100 a 200 pares de bases, 125 a 175 pares de bases, em particular cerca de 150 pares de bases) compreendendo um grampo de cabelo, tal como precursores de miRNA.
[0046] Como demonstrado nos exemplos da presente aplicação, a introdução de dsRNA em células vegetais induz um silenciamento es- pecífico de sequência dos genes bacterianos nas células bacterianas por meio da ação de RNAs pequenos, mas não de dsRNAs longos (exemplo 6 e figura 7). Isso significa que as células bacterianas só são sensíveis a AGS quando são diretamente contatadas por entidades de RNA pequeno. O contato de bactérias com precursores de RNAs pe- quenos não terá efeito, uma vez que essas células procarióticas não possuem o mecanismo do tipo eucariótico canônico para processá-las adequadamente em iRNAs funcionais. Isso foi notavelmente mostrado pela inativação dos genes de Arabidopsis DCL2, DCL3 e DCL4 em uma linha transgênica IR-CFA6/HRPL#4 de referência. Os RNAs totais deri- vados dessas plantas expressaram abundantes transcrições CFA6/HRPL de repetição invertida (isto é, dsRNAs CFA6/HRPL não processados) que não eram competentes no desencadeamento de AGS dos genes Pto DC3000 Cfa6 e HrpL nem redução da patogênese (figura 7).
[0047] No entanto, é possível inibir a expressão de genes bacteria- nos diretamente nas células bacterianas, contactando-os com espécies de RNA pequeno cujo tamanho é menor que 50 pares de bases (figura 8 e figura 10).
[0048] Portanto, em outra modalidade preferida, os iRNAs funcio- nais da invenção são RNAs pequenos, tais como siRNAs ou miRNAs. Esses RNAs pequenos têm um tamanho curto, que é inferior a 50 pares de bases, preferivelmente compreendido entre 15 e 30 pares de bases, mais preferivelmente entre 19 e 27 pares de bases, ainda mais preferi- velmente entre 20 e 25 pares de bases.
[0049] Estes RNAs pequenos podem ser formulados em composi- ções fitossanitárias, por exemplo, em composições líquidas pulverizá- veis (ver abaixo). Neste caso, as referidas composições contendo os referidos RNAs pequenos podem ser administradas diretamente aos te- cidos da planta ou a bactérias.
[0050] Em uma modalidade particularmente preferida, o iRNA fun- cional da invenção é um “siRNA”, que designa um “duplex de siRNA” ou um “simplex de siRNA”.
[0051] Mais especificamente, o termo "duplex de siRNA" designa estruturas de fita dupla ou moléculas de duplex contendo uma primeira fita (fita de senso) e uma segunda fita (antissenso) de pelo menos 15 pares de bases, preferivelmente de pelo menos 19 pares de bases; pre- ferivelmente, a referida fita de antissenso compreende uma região de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que são complementares a uma transcrição do gene alvo. Esses duplexes de siRNA são produzidos a partir de precursores de dsRNA longo que são processados por proteí- nas DCL vegetais. Eles têm um tamanho curto que é inferior a 50 pares de bases, preferivelmente compreendido entre 15 e 30 pares de bases, mais preferivelmente entre 19 e 27 pares de bases, ainda mais preferi- velmente entre 20 e 25 pares de bases.
[0052] Como mostrado na parte experimental abaixo (Exemplo 9 e Figura 10), os RNAs pequenos da invenção são eficientes quando estão sob a estrutura de fita dupla. Foi demonstrado com duplexes de siRNA sintetizados in vitro de novo, e acredita-se que o efeito biológico obser- vado com extratos de plantas é, pelo menos em parte, devido a esses duplexes de siRNA secretados pelas plantas.
[0053] Como usado aqui, o termo "simplex de siRNA" ou "siRNA maduro" designa moléculas de simplex (também conhecidas como mo- léculas de "fita simples") que se originam do duplex de siRNA, mas fo- ram amadurecidas no mecanismo RISC de uma célula vegetal e são carregadas em uma proteína AGO e/ou associadas a outras proteínas de ligação a RNA. Eles têm um tamanho curto que é inferior a 50 bases, preferivelmente compreendido entre 15 e 30 bases, mais preferivel- mente entre 19 e 27 bases, ainda mais preferivelmente entre 20 e 25 bases.
[0054] Em outra modalidade, o iRNA funcional da invenção é um "miRNA", que designa um "duplex de miRNA" ou um " simplex de miRNA".
[0055] Mais especificamente, o termo "duplex de miRNA" designa estruturas de fita dupla ou moléculas de duplex contendo uma primeira fita (fita de senso) e uma segunda fita (antissenso) de pelo menos 15 pares de bases, preferivelmente de pelo menos 19 pares de bases; pre- ferivelmente, a referida fita de antissenso compreende uma região de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que são complementares a uma transcrição do gene alvo. Esses duplexes de miRNA também podem conter protuberâncias. Esses duplexes de miRNA são produzidos a par- tir de precursores de miRNA que são processados por proteínas DCL vegetais.
[0056] Como usado aqui, o termo "simplex de miRNA" ou "miRNA maduro" designa moléculas de simplex (também conhecidas como mo- léculas de "fita simples") que se originam do duplex de miRNA, mas fo- ram amadurecidas no mecanismo RISC de uma célula vegetal e são carregadas em uma proteína AGO e/ou associadas a outras proteínas de ligação a RNA.
[0057] Métodos para projetar iRNAs, tais como dsRNAs/siR- NAs/miRNAs longos estão disponíveis na técnica e podem ser usados para obter a sequência de dsRNAs longos, siRNA e miRNA com essas propriedades.
[0058] Os inventores aqui mostram (Exemplo 9, Figura 10) que é possível usar siRNAs de fita dupla sintetizados in vitro artificiais a fim de (i) inibir a expressão do gene bacteriano (ii) diminuir a patogenicidade bacteriana e (iii) desencadear efeitos bactericidas in vitro (ver Figura 10).
[0059] A invenção, portanto, abrange o uso de iRNAs sintéticos, semi-sintéticos ou recombinantes compreendendo apenas ribonucleotí- deos ou ambos desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. A invenção também abrange o uso de moléculas de iRNA modificadas compreen- dendo uma ou mais modificações, que aumentam a resistência à degra- dação da nuclease in vivo e/ou melhoram a estabilidade celular (por exemplo, metilação da extremidade 3' de RNA pequeno, ácido nucleico bloqueado (LNA)), absorção por células bacterianas (por exemplo, por- tadores de peptídeo) ou eficácia de silenciamento dentro das células bacterianas. Os iRNAs da invenção podem incluir nucleotídeos, que são modificados no açúcar, fosfato e/ou porção de base e/ou modificações das extremidades 5' ou 3', ou a ligação inter-nucleotídica.
[0060] Moléculas de dsRNA sintetizadas quimicamente, como defi-
nido na invenção, podem ser montadas a partir de dois oligonucleotí- deos distintos, que são sintetizados separadamente. Alternativamente, ambas as fitas do duplex de RNA ou molécula precursora de RNA po- dem ser sintetizadas em tandem usando um ligante clivável, por exem- plo, um ligante com base em sucinila. Alternativamente, as moléculas precursoras de RNA da invenção podem ser expressas (in vitro ou in planta) a partir de unidades de transcrição inseridas em vetores de DNA ou RNA conhecidos por aqueles versados na técnica e disponíveis co- mercialmente. É digno de nota que o último método pode incluir a trans- crição de transgenes que expressam estruturas dobráveis de fita dupla longa, transcrições senso-antissenso através de promotores posiciona- dos em ambas as extremidades do transgene e em orientação oposta, precursores de miRNA, transcrição de miRNA primário ou transcrições de senso que podem, em alguns casos (por exemplo, direcionados por miRNAs longos de 22 nt endógenos ou exógenos) ser usados como substratos pelas polimerases de RNA dependentes de RNA de plantas para gerar dsRNAs.
[0061] As moléculas de iRNA da invenção diminuem preferivel- mente o nível de expressão dos genes bacterianos direcionados em pelo menos 30%, preferivelmente em pelo menos 60%, mais preferivel- mente em pelo menos 80%, em bactérias portadoras dos referidos ge- nes. O silenciamento dos genes bacterianos pode ser avaliado no nível do RNA ou da proteína, por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por RT-PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR), Northern Blot, FACS, análises imuno-histológicas ou análises de Western Blot.
[0062] No contexto da invenção, o silenciamento dos genes bacte- rianos por moléculas de iRNA artificiais, que podem ser parciais ou to- tais, deve ser suficiente para produzir o efeito desejado nas bactérias, tal como, por exemplo, reduzir a patogenicidade bacteriana ou infectivi- dade da referida bactéria em células vegetais ou no organismo vegetal.
Bactéria alvo
[0063] O uso/método da invenção é útil para silenciar genes em qualquer tipo de bactéria (patogênica ou não patogênica; Gram-positiva ou Gram-negativa), incluindo bactérias benéficas conhecidas por esta- rem associadas a organismos vegetais.
[0064] Exemplos não limitantes de bactérias patogênicas que po- dem ser direcionadas usando o uso/método da invenção incluem Rals- tonia solanacearum, Xanthomonas oryzae pathovars, Xanthomonas campestris pathovars, Xanthomonas axonopodis pathovars, Xantho- monas euvesicatoria pathovars, Xanthomonas hostorum pathovars, Pseudomonas syringae pathovars, Pseudomonas viridiflava pathovars, Pseudomonas savastonoi pathovars, Candidatus liberibacter asiaticus, Candidatus liberibacter solanacearum, Acidovoraxcitrulli, Acidovoraxa- venae pathovars, Pectobacterium atrosepticum pathovars, Pectobacte- rium carotovorum pathovars, Pectobacterium sp., Agrobacterium tume- faciens, Dickeya (dadantii e solani), Erwinia amylovora, Clavibactermi chiganensis (michiganensis e sepedonicus), Xylella fastidiosa, Pecto- bacterium (carotovorumand atrosepticum), Streptomyces scabies, Phytoplasma sp., Spiroplasma sp. (25).
[0065] Se as plantas ornamentais forem tratadas, as seguintes bac- térias podem ser alvejadas: Pseudomonas cichorii, conhecidas por in- fectarem Crisântemo, Gerânio, e Impatiens; Xanthomonas campestris pv. Pelargoni, conhecidas por infectarem Gerânio; Rhodococcusfasci- ans, conhecidas por infectarem Chrysanthemum morifolium, Pelargônio, Phlox, e possivelmente Rhododendron; Ralstonia solanacearum, co- nhecidas por infectarem Gerânio, Anthuriums spp, Roseira, Cúrcumas, e Antúrios; Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas hortorum, conhe- cidas por infectarem Gerânio, Begônia, Antúrio, e Hibiscus rosa-sinen- sis; Pectobacterium carotovorum, conhecidas por infectarem Amarilis, Begônia, Calla, Ciclâmen, Dracena e Impatiens.
[0066] Em uma modalidade particular, o método da invenção usa iRNAs funcionais alvejando um ou vários genes de bactérias benéficas, frequentemente referidas como rizobactérias promotoras de cresci- mento de plantas (PGPR). O propósito desta modalidade particular é promover os efeitos benéficos do referido PGPR. Nesta modalidade par- ticular, os genes bacterianos direcionados são fatores que, quando si- lenciados, promovem a replicação das células bacterianas direcionadas ou uma via que é benéfica para o hospedeiro e que regula positivamente a produção de um composto benéfico (por exemplo, um fitohormônio), metabólitos secundários que (i) alteram a sobrevivência/patogenicidade dos fitopatógenos circundantes, (ii) ativam as respostas de defesa da planta (por exemplo, resistência sistêmica induzida), (iii) facilitam a ab- sorção de nutrientes do meio ambiente (por exemplo, aumentando a produção de fatores bacterianos essenciais para simbiose de Rhizo- bium-legume), (iv) aumentam a tolerância do organismo hospedeiro a condições de estresse abiótico etc. O silenciamento de tais genes bac- terianos direcionados levaria, assim, a um aumento da taxa de cresci- mento do organismo hospedeiro e/ou vários outros possíveis efeitos be- néficos para o organismo hospedeiro.
[0067] Em tal modalidade, os iRNAs da invenção devem ter homo- logias de sequência com genes bacterianos benéficos, mas sem homo- logia de sequência com genomas bacterianos patogênicos, com o ge- noma do hospedeiro ou com outros genomas de colonizadores de hos- pedeiro e/ou mamíferos que se alimentam do organismo hospedeiro.
[0068] Exemplos não limitantes de bactérias benéficas que podem ser direcionadas com o método da invenção incluem: Bacillus (por exemplo, Bacillus subtilis), Pseudomonas (por exemplo, Pseudomonas putida, Pseudomonas stuzeri, Pseudomonas fluorescens, Pseudomo- nas protegens, Pseudomonas brassicacearum), Rhizobia (Rhizobium meliloti), Burkholderia (por exemplo, Burkholderia phytofirmans), Azos- pirillum (por exemplo, Azospirillumlipoferum), Gluconacetobacter (por exemplo, Gluconacetobacter diazotrophicus), Serratia (por exemplo, Serratia proteamaculans), Stenotrophomonas (por exemplo, Steno- trophomonas maltophilia), Enterobacter (por exemplo, Enterobacter clo- acae). Genes bacterianos direcionados
[0069] O iRNA da invenção deve ter uma homologia de sequência suficiente com pelo menos um gene bacteriano a fim de induzir o silen- ciamento específico da sequência de pelo menos um gene referido. Além disso, para evitar efeitos indesejados fora do alvo, a homologia de sequência dos dsRNAs, miRNAs ou espécies de RNA pequeno da in- venção com o genoma do hospedeiro eucariótico ou outros genomas de bactérias benéficas, colonizadores de hospedeiro e/ou mamíferos que se alimentam do organismo hospedeiro deve ser quase inexistente (se não ausente).
[0070] O iRNA da invenção é capaz de inibir a expressão de pelo menos um gene bacteriano.
[0071] De acordo com a invenção, o termo "gene bacteriano" refere- se a qualquer gene em bactérias, incluindo genes codificadores de pro- teínas (naturais) ou genes não codificantes, presentes naturalmente em bactérias ou genes artificiais introduzidos em bactérias por tecnologia de DNA recombinante. Os referidos genes bacterianos alvo são especí- ficos para uma determinada espécie bacteriana ou conservados em vá- rias espécies bacterianas. De preferência, não compartilham homologia com qualquer gene do genoma do hospedeiro eucariótico, colonizado- res de hospedeiro e/ou mamíferos que se alimentam do organismo hos- pedeiro. Isso evita efeitos colaterais na planta hospedeira, bactérias be- néficas associadas ao hospedeiro, colonizadores do hospedeiro e/ou mamíferos que se alimentam do organismo hospedeiro.
[0072] Em uma modalidade preferida, pelo menos um gene bacte- riano referido é um fator de virulência bacteriana ou um gene essencial para bactérias.
[0073] Como usado aqui, o termo “gene essencial para bactérias” refere-se a qualquer gene bacteriano que é essencial para a viabilidade da célula bacteriana. Esses genes são absolutamente necessários para manter as bactérias vivas, contanto que todos os nutrientes estejam dis- poníveis. Pensa-se que o número absolutamente necessário de genes essenciais para bactérias é cerca de 250 a 500 em número. A identifi- cação de tais genes essenciais de bactérias não relacionadas está agora se tornando relativamente facilmente acessível através do uso de métodos de sequenciamento de transposons. Esses genes essenciais codificam proteínas para manter um metabolismo central, replicar DNA, garantir divisão celular adequada e/ou alongamento, traduzir genes em proteínas, mantém uma estrutura celular básica e medeiam processos de transporte para dentro e para fora da célula (34). É o caso de GyrB e FusA, cujo silenciamento prejudicou drasticamente o crescimento de Pto DC3000 in vitro (figura 10D e 10E).
[0074] Como usado aqui, o termo “gene de virulência” refere-se a qualquer gene bacteriano que demonstrou desempenhar um papel crí- tico para pelo menos uma das seguintes atividades: patogenicidade, de- senvolvimento de doença, colonização de tecidos específicos do hos- pedeiro (por exemplo, tecidos vasculares) ou ambiente da célula hospe- deira (por exemplo, o apoplasto), supressão de respostas PTI e ETI, modulação da sinalização de hormônios vegetais e/ou biossíntese para facilitar a multiplicação e/ou desenvolvimento de doenças, interferência com processos reguladores de hospedeiros conservados para facilitar a multiplicação e/ou desenvolvimento de doenças, etc. Todas essas ativi- dades ajudam a bactéria a crescer e/ou promovem sintomas de doença no hospedeiro, embora não sejam essenciais para sua sobrevivência in vitro. Fatores de virulência bem conhecidos são: adesinas, fitotoxinas (por exemplo, coronatina, siringolina A), enzimas degradantes (por exemplo, celulases, celobiosidases, lipases, xilanases, endoglucana- ses, poligalacturonases), fatores necessários para a montagem do tipo I/II/III/IV ou VI de sistemas de secreção, proteínas efetoras, fatores de transcrição necessários para promover a expressão de genes Hrp em contato com células vegetais, mecanismos necessários para a expres- são adequada de fatores de virulência (por exemplo, sensor de quorum, sistemas de dois componentes), fatores pós-transcricionais que contro- lam a estabilidade/translação de mRNAs de genes de fator de virulência.
[0075] Genes bacterianos essenciais ou fatores de virulência bem conhecidos são fornecidos nas tabelas a seguir, para várias bactérias fitopatogênicas diferentes:  Para a maioria das bactérias: fatores centrais necessários para a divisão celular, como FtsZ, FtsA, FtsN, FtsK, FtsI, FtsW, ZipA, ZapA, TolA, TolB, TolQ, TolR, Pal, MinCD ou genes relacionados à actina, tal como MreB e Mld.  Para a bactéria Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (cepas Pph 1448A; Pph 1302A), conhecida por infectar plantas de feijão comum Phaseolus vulgaris e causar a doença da mancha do halo: Gene Essential Descrição Função cheA2 Histidina cinase CheA sensora de quimiotaxia Quimiotaxia cheZ Proteína CheZ de quimiotaxia Quimiotaxia flhB Proteína FlhB biossintética flagelar Flagelo fliO Proteína FliO flagelar Flagelo fliN Proteína FliN interruptor motora flagelar Flagelo fliM Proteína FliM interruptor motora flagelar Flagelo fliK Proteína FliK de controle de comprimento de gancho flagelar Flagelo fleS Histidina Cinase FleS de sensor flagelar Flagelo flgJ Peptidoglicano hidrolase FlgJ Flagelo flgE proteína FlgE de gancho flagelar Flagelo flgD Proteína FlgD de modificação de bastão de corpo basal Flagelo FlgA Proteína putative de formação de anel P de corpo basal flagelar Flagelo MotA Proteína de motilidade da família MotA Flagelo plsC Proteína hdtS (100%) molécula sensora do quorum impL proteína de domínio OmpA (98%) proteína de membrane externa e patogenicidade; pode estar envolvida em T6SS mdoG1 proteína MdoG de biossíntese de glucanas periplásmicas CobQ ácido cobírico sintase biossíntese de cobalamina (vtamina B12) carA subunidade pequena de carbamoil-fosfato sintase biossíntese de pirimidina pyrB aspartato carbamoiltransferase biossíntese de pirimidina carB subunidade grande de carbamoil-fosfato sintase biossíntese de pirimidina purH Proteína PurH de biossíntese de Purina bifuncional biossíntese de purina pyrD di-hidro-orotato desidrogenase biossíntese de pirimidina
 Para a bactéria Pseudomonas syringae pv. actinidiae, que se sabe infectar plantas kiwi e seus frutos (Actinidia spp.) e causar o câncer do fruto kiwi: Essential gene Descrição fliR Proteína de biossíntese flagelar flhA Proteína de biossíntese flagelar flgC Proteína de bastão de corpo basal flagelar flgH Proteína de biossíntese flagelar FlgL proteína associada ao gancho flagelar Proteína de modificação de bastão de corpo basal  Para a bactéria Pectobacterium carotovorum, que se sabe flagelar infectar o repolho chinês e causar a doença da podridão mole: Gene Essential Descrição pyrD Di-hidro-orotato desidrogenase Fosforibosilaminoimidazol carboxamida purH formiltransferase/IMP ciclo-hidrolase bifuncional purD Fosforibosilamina-glicina ligase leuA 2-lsopropilmalato sintase serB Fosfosserina fosfatase expl Síntese de lactona de N-(3-oxoexanoil)-l-homosserina expR Regulador transcricional de sensibilização de quorum figA Proteína de biossintese de anel P de corpo basal flagelar fliA fator sigma de biossintese flagelar flhB Proteína de biossíntese flagelar qseC Receptor adrenérgico bacteriano QseC de proteína sensora tolC Proteína de canal de membrana externa PCC21 023220 Proteína de ligação ao DNA putativa  Para a bactéria Ralstonia solanacearum, que se sabe infec- tar, por exemplo, tomate, batata, tabaco, banana e soja e causar a mur- cha bacteriana: Essential gene Descrição em Tomate RSc2735 (phcB) Proteína regutatória RSc2748 (phcA) Um regulador transcricional da família LysR, regulador transcricional de genes de virulência RSp0852 (hrpG) Proteína reguladora de transcrição RSc2827 (pilD) Prepilina peptidase tipo 4, provável; bifuncional: peptidase líder e proteína de transmembrana de N-metiltransferase RSc3111 (gspL) Proteína de transmembrana L da via secetora geral provável RSc3114 (gspD) Proteína de transmembrana D da via secetora geral provável RSp 1007 Proteína acetil transferase putativa RSc0571 (pgk) Proteína fosfoglicerato cinase provável RSc1591 (hpal1) Proteína aldolase de ácido 2,4-di-hidroxihept-2-eno-1,7-dioico
RSp1010 Proteína hipotética RSc3115 (gspE) Proteína E da via de secreção geral provável em Arabidopsis RSc0903 (serC) Proteína fosfoserina aminotransferase provável (PSAT) RSc1981 (trpA) Proteína de cadeia alfa de triptofano sintase provável RSc0454 Fe-S oxidorredutase putative; proteína desidrogenase oxidorredutase contendo FAD/FMN RSc0411 Proteína de transmembrana provável RSc0353 (gpmA) Fosfoglicerato mutase dependente de 2,3-bisfosfoglicerato provável RSc1956 (murl) Proteína glutamate racemase provável RSc0565 (rfaF) Proteína ADP-heptose—lipopolissacarídeo heptosiltransferase II provável RSc1326 Proteína aspartato aminotransferase provável RSc2464 (clpA) Proteína protease dependente de ATP provável (subunidade de especificidade de ligação à ATP) RSc0734 (tolA) Proteína de transmembrana de transporte relacionada com tolA provável RSc0736 (pal) Precursor de lipoproteína associada ao peptidoglicano provável RSc0732 (tolQ) Proteína de transmembrana de transporte relacionada com TolQ provável RSc2684 (proC) Proteína de peptídeo sinal de pirrolina-5-carboxilato redutase de oxidorredutase provável RSc1206 lipoproteína NlpD provável RSc0500 (ruvB) proteína RuvB de DNA helicase de junção de feriado provável
 Para a bactéria Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, que se sabe infectar o arroz (Oryza sativa) e causar a estria bacteriana da folha do arroz: Gene Essencial Descrição XOCORF_4443 (Hrcll) Proteína HrcU de secreção tipo III XOCORF_4444 (HcrV) Proteína HrcV de secreção tipo III XOCORF_4434 (HrcC) Proteína HrcC de secreção tipo III XOCORF_3864 (wxocB) Glicosiltransferase putativa XOCORF_2264 (rpfG) RpfG regulador de resposta ao sistema de dois componentes XOCORF_2899 (pilYl) RpfG XOCORF_3636 (pilQ) Proteína de montagem fimbrial XOCORF_3640 (pilM) Proteína de montagem de pilus de tipo IV XOCORF_1181 (pilZ) Proteína de montagem de pilus de tipo IV XOCORF_1487 (pilT) Proteína de mobilidade de contração muscular XOCORF_3589 (pgk) Fosfoglicerato cinase XOCORF_3592 (gapA) Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, tipo I XOCORF_1172 3-Oxoacil-[proteína portadora de acila] sintase III XOCORF_2877 Proteína P
XOCORF_3805 (XpsE) Proteína E da via de secreção geral (XpsE) XOCORF_4457 (HrpF)
XOCORF_3672 (ThiE) Tiamina-fosfato pirofosforilase (ThiE) XOCORF_3439 (HrpX)
XOCORF_3794 (XpsD) Proteína D da via de secreção geral (XpsD) XOCORF_4434 (HrcC-) HrcC XOCORF_1450 Proteína hipotética conservada XOCORF 1282 Dipeptidil carboxipeptidase I
 Para a bactéria Xanthomonas campestris pv. campestris, que se sabe infectar todas as Brassicaceae (repolho, brócolis, couve- flor, couve, nabo, colza, mostarda, rabanete, etc.) e causar a podridão da raiz negra crucífera: Essential gene Descrição
B109F06 (pilC) Proteína de montagem fimbrial
B205G02 (pilB) Proteína de biogênese de pilus
B202G01 (iroN) Receptor dependente de TonB
B302H04 (wxcM) acetil transferase /isomerase bifuncional
A404F11 (wrcC) Glicosiltransferase
C302F11 (wxcA) Glicosiltransferase
A105E01 (nagA) N-acetilglucosamina-6-fosfato desacetilase
C110C10 (rmlA) Glicose-1 -fosfato timidililtransferase
A202H06 (xpsM) Proteína M da via de secreção geral
C406A04 (xpsK.) Proteína K da via de secreção geral
B502F09 (xpsF) Proteína F da via de secreção geral
B405E02 (xpsE) Proteína E da via de secreção geral
B401G05 (virB8) Proteína VirB8
C109G03 (engXCA) Celulase
Regulador de resposta B101F11 (rpfG)
B203D06 Proteína CaR transdutora
A308G04 (trpE) Componente I de antranilato sintase
B605H08 (trpD) Componente II de antranilato sintase
B504A10 (metA) Homoserina O-acetilransferase
A506A08 (hisF) Ciclase
C206E04 Subunidade de especificidade do sistema de modificação de restrição provável
C111B03 (cypC) Ácido graxo hidroxilase alfa
A507C08 (fadB) P-hidroxicinamoil CoA hidratase/liase
B302H05 (uptB) Maleilacetoacetato isomerase
C307G11 (catB) Catalase (precursora)
B104E02 (icd) Isocitrato desidrogenase
B106G06 (ppsA) Fosfoenolpiruvato sintase
Gene Essencial Descrição C401E10 Proteína hipotética conservada
C205C01 Proteína hipotética conservada C301C03 Proteína hipotética conservada C407F08 Proteína hipotética conservada C410B02 Proteína hipotética conservada B606A8 Inserido entre XC0132 e XC0133 B310E10 Inserido entre XC0350 e XC0351 B203A9 Inserido entre XC0408 e XC0409 (bfeA) A505G9 Inserido entre XC0509 e XC0510 (purH) A301D7 Inserido entre XC2898 e XC2899 (btuB) A306H2 Inserido entre XC3602 e XC3603 (alkB) A105E4 Inserido entre XC3604 (etf-qo) e XC3605 A401H6 Inserido entre XC3604 (etf-qo) e XC3605 B203C8 Inserido entre XC4037 (catB) e XC4038 (dinG)
 Para as bactérias Xanthomonas axonopodis pathovars (por exemplo, pv. citri e pv.
Manihotis), que se sabe infectarem a árvore de cítrico e o mandioca respectivamente e causar câncer dos cítricos e a mancha bacteriana da mandioca, respectivamente: Essential gene Descrição XAC1211 (KatE) Catalase monofuncional Xac1815 (XacFhaB) Proteína transportadora de hemaglutinina putativa XAC3600 (wzt) Biossíntese de LPS
AvrBs2 Efetor de secreção de tipo três XopX Efetor de secreção de tipo três XopZ Efetor de secreção de tipo três XopAOl Efetor de secreção de tipo três XopN Efetor de secreção de tipo três XopQ Efetor de secreção de tipo três
 Para a bactéria Erwinia amylovora, que se sabe infectar a macieira e a pereira e causar a doença da queimadura:
Gene Essencial A7/74SmSp-A20 Ea7/74SmSp-A29 Ea7/74Sm-A33 Ea7174SmSp- A38 Ea7/74Sm-A41 Ea7/74SmSp-A56 Ea7/74SmSp-A64 Ea7/74SmSp-A72 Ea7/74SmSp-A75 Ea7/74SmSp-A76 Ea7/74SmSp-A83
 Para as bactéria Dickeya dadantii, que se sabe infectar a ba- tata, tomate, berinjela, chicória e causar a podridão mole: Gene Essencial Descrição Dda3937_00335 (glpD) Glicerol-3-fosfato desidrogenase Dda3937_O3379 (purL) Fosforibosilformil-glicinaamida sintetase Dda3937_03564 (opgG) Precursor da proteína G de biossíntese das glucanas Dda3937_00244 (purH) Fosforibosilaminoimidazolcarboxamida Formiltransferase/IMP ciclo-hidrolase Dda3937_00532 (hflK) Regulador de FtsH protease Dda3937_02515 (purM) Fosforibosilaminoimidazol sintetase Dda3937_02627 4-hidroxitreonina-4-fosfato desidrogenase Dda3937_00004 (guaB) IMP desidrogenase Dda3937_03563 (opgH) glicosiltransferase H de biossíntese de glucanas Dda3937_01284 (pyrB) aspartato carbamoiltransferase Dda3937_03924 (rffG) dTDP-glicose 4,6-desidratase
Dda3937_01389 (carB) subunidade grande de carbamoil-fosfato sintase Dda3937_03299 (acrA) subunidade adaptadora periplásmica transportadora de RND de efluxo de multifármaco da família MexE Dda3937_03300 (acrB) proteína do sistema de efluxo de multifármaco Dda3937_03258 (pyrE) orotato fosforibosiltransferase
Dda3937_02336 (nlpl) lipoproteína Dda3937_02506 (nlpB) Fator BamC de montagem de proteína de membrana ex- terna Dda3937_04018 (pta) fosfato acetiltransferase
Dda3937_03554 (pyrC) di-hidro-orotase Dda3937_04573 (IpxM) acil (miristato) transferase Dda3937_01116 (glnG) Proteína NR(I) de regulação de nitrogênio, sistema de dois componentes Dda3937 02099 (purF) amidofosforibosiltransferase
 Para a bactéria Xylella fastidiosa, que se sabe infectar videi- ras e oliveiras e causar a doença de fura na videira, a clorose variegada dos cítricos ou a síndrome do declínio rápido da azeitona: Gene Essencial Descrição rpfC proteína regulatória de dois componentes (PD1709) MopB proteína de membrane exerna maior LesA lipase/esterase putativa PD1703 (LipA) lipase PD0928 (Zot) toxina ocludensde Zonula PD0986 proteína tipo hemaglutinina gumD gene de biossíntese de exopolisacarídeos gumH gene de biossíntese de exopolisacarídeos xhpT reguladores de resposta PD0528 (XatA) proteína autotransportadora PD0279 (cgsA) di-GMP cíclica sintase A PD0062 (FimA) proteína de adesões fimbriais PD0058 (FimF) Proteína de adesões fimbriais PD0731 (XadA) Proteína A tipo adesina de Xanthomonas codificantes PD1792 (HxfB) hemaglutinas
 Para a bactéria Candidatus Liberibacter solanacearum, que se sabe infectarem a batata e causar doença de Zebra Chip, e Candi- datus Liberibacter asiaticus (oramericanus/africanus), que se sabe in- fectarem cítricos e causar doença de esverdeamento de citricos: Candidatus Liberibacter solanacearum Gene Essencial * Descrição WP_013462130 Proteína contendo domínio VWA WP_076969829 Proteína desconhecida WP_013461676 Proteína da família endonuclease/exonuclease/fosfatase WP_076969883 Proteína desconhecida WP_013462162 Proteína da família OmpA WP_080550991 Proteína da família TadE/TadG
WP_076969829 Proteína desconhecida WP_076970537 Proteína desconhecida WP_034443047 Proteína desconhecida WP_034441878 Proteína desconhecida WP_076970544 Proteína contendo o domínio VWA WP_076969422 Proteína desconhecida WP_103846864 Proteína contendo domínio VWA ONI59292 Serralisina WP_013462515 Proteína desconhecida WP_045960760 Proteína desconhecida WP_013462289 Proteína desconhecida WP_076969829 Proteína desconhecida WP_013461834 NhaA antiporter Na+/H+ WP_013461833 ferredoxina-NADP+ redutase proteína
* Genes denotados como WP_XXXXXXXXX correspondem à “proteína_id” do gene em Can- didatus Liberibacter solanacearum CLso-ZC1, genoma complete com número de acesso Gen- bank NC_014774.1 de 17 de abril de 2017. Candidatus Liberibacter asiaticus WP_012778355 Proteína desconhecida WP_012778427 Proteína desconhecida WP_012778510 Proteína desconhecida WP_012778517 Proteína desconhecida ACT56857 Serralisina WP_012778607 Proteína contendo domínio VWA WP_012778668 Proteína desconhecida WP_015452668 Proteína contendo domínio VWA WP_015452678 Proteína desconhecida WP_0015452727 Proteína desconhecida WP_015824938 Proteína desconhecida WP_015824940 Proteína desconhecida WP_015452765 Proteína contendo domínio VWA WP_015452784 Proteína da família OmpA WP_015452797 Proteína desconhecida WP_015452837 Proteína desconhecida WP_015824957 Proteína desconhecida WP_015452939 Proteína contendo domínio VWA ACT56835 NhaA antiporter Na+/H+ WP_056837 proteína ferredoxina-NADP+ redutase
* Genes denotados como WP_XXXXXXXXX correspondem à “pro- tein_id” do gene em Candidatus Liberibacter asiaticus str. psy62, gene complete com número de acesso Genbank NC012985.3 de 30 de março de 2017.
[0076] Qualquer um desses genes pode ser o alvo dos iRNAs da invenção.
[0077] Em bactérias benéficas, os genes bacterianos a serem dire- cionados são, por exemplo: genes necessários para a produção de fa- gos que regulam negativamente a sobrevivência bacteriana (por exem- plo, proteína de montagem da placa de base do fago GpV), genes NolA e NodD2 de Bradyrhizobium japonicum que são conhecidos por reduzir a expressão de genes nod em altas densidades populacionais e, por- tanto, para diminuir a produção de Nod, um sinal bacteriano que é es- sencial para a invasão simbiótica (derrubar esses genes de cepas ino- culantes deve, portanto, resultar em nodulação competitiva), a man- cha42 de RNA não codificante pequeno codificado pelo gene de qua- renta e duas manchas (spf) e que controla o metabolismo e a absorção de carboidratos (derrubar esse gene de uma determinada bactéria deve resultar em um título bacteriano aumentado).
[0078] Em bactérias vasculares, os genes bacterianos a serem di- recionados são, por exemplo, genes de secreção do tipo III.
[0079] Quando as bactérias visadas são bactérias fitopatogênicas, os referidos genes bacterianos essenciais ou de virulência podem con- ter genes estruturais de sistemas de secreção, incluindo o sistema de secreção tipo III (por exemplo, HrcC), - genes que são necessários para o bom funcionamento do sistema de secreção tipo VI (por exemplo, TssB), - genes que codificam reguladores mestres da expressão bacteriana efetora (por exemplo, HrpL, HrpG, HrpX),
- genes que codificam fatores necessários para a biossíntese de fitotoxi- nas (por exemplo, Cfa6, que é importante para a biossíntese de corona- tina em alguns patovares de Pseudomonas syringae), - genes necessários para a biossíntese de compostos de virulência (por exemplo, XpsR, que é importante para a biossíntese do exopolissa- carídeo EPS1, sistema de dois componentes RavS/RavR).
[0080] Os iRNAs da invenção compartilham vantajosamente homo- logias de sequência com qualquer um desses genes essenciais ou gene de virulências das espécies de patógenos bacterianos alvo.
[0081] Como usado neste documento, o termo "homologia de se- quência" refere-se a sequências que possuem similaridade de se- quência, ou seja, um grau suficiente de identidade ou correspondência entre sequências de ácido nucleico. No contexto da invenção, duas se- quências de nucleotídeos compartilham "homologia de sequência" quando pelo menos cerca de 80%, alternativamente pelo menos cerca de 81%, alternativamente pelo menos cerca de 82%, alternativamente pelo menos cerca de 83%, alternativamente pelo menos cerca de 84%, alternativamente pelo menos cerca de 85%, alternativamente pelo me- nos cerca de 86%, alternativamente pelo menos cerca de 87%, alterna- tivamente pelo menos cerca de 88%, alternativamente pelo menos cerca de 89%, alternativamente pelo menos cerca de 90%, alternativa- mente pelo menos cerca de 91%, alternativamente pelo menos cerca de 92%, alternativamente pelo menos cerca de 93%, alternativamente pelo menos cerca de 94%, alternativamente pelo menos cerca de 95%, alternativamente pelo menos cerca de 96%, alternativamente pelo me- nos cerca de 97%, alternativamente pelo menos cerca de 98%, alterna- tivamente pelo menos cerca de 99% dos nucleotídeos são similares.
[0082] Por outro lado, as sequências de nucleotídeos que têm "nenhuma homologia de sequência" são sequências de nucleotídeos que têm um grau de identidade inferior a cerca de 10%, alternativamente inferior a cerca de 5%, alternativamente inferior a 2%.
[0083] De preferência, as sequências de nucleotídeos semelhantes ou homólogas são identificadas usando o algoritmo de Needleman e Wunsch. A menos que indicado de outra forma, os valores de identi- dade/similaridade de sequência aqui fornecidos referem-se ao valor ob- tido usando GAP Versão 10 usando os seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeos usando Peso de GAP de 50 e Peso de Comprimento de 3, e o nws- gapdna.cmp matriz de pontuação; % de identidade e % de similaridade para uma sequência de aminoácidos usando peso de GAP de 8 e peso de comprimento de 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62; ou qualquer programa equivalente. Por "programa equivalente" entende-se qualquer programa de comparação de sequência que, para quaisquer duas se- quências em questão, gere um alinhamento com correspondências de resíduos de nucleotídeo idênticas e uma identidade de sequência per- centual idêntica quando comparado com o alinhamento correspondente gerado pela Versão GAP 10.
[0084] Digno de nota, os iRNAs da invenção não inibem genes que são expressos em células eucarióticas ou em fungos, insetos, pragas ou outros patógenos que infectam plantas. Especificamente, os iRNAs da invenção não inibem a expressão de oncogenes que têm origem bac- teriana e são inseridos em outros genomas. Mais precisamente, os iR- NAs da invenção não inibem a expressão dos oncogenes iiaM e ipt da bacteria Agrobacterium tumefaciens. Elementos silenciadores quiméricos
[0085] Para proteger as plantas contra doenças causadas por vários patógenos bacterianos, o método da invenção usa vantajosa- mente RNAs funcionais que transportam homologias de sequência com mais de um gene bacteriano (doravante referidos como “iRNAs quimé-
ricos”). Estes iRNAs quiméricos preferencialmente compartilham homo- logia com pelo menos dois, três, quatro ou mais genes bacterianos es- senciais e/ou fatores de virulência, tais como aqueles descritos acima.
[0086] Exemplos de tais iRNAs quiméricos incluem: (1) Um dsRNA quimérico com pelo menos 80% de homologia de se- quência com os genes HrpB, HrcC, XpsR e TssB de fatores de codifi- cação de R. solanacearum envolvidos na ativação transcricional de efe- tores bacterianos (isto é, HrpB), na montagem do TTSS (isto é, HrcC), na biossíntese do exopolissacarídeo EPS1 (isto é, XpsR), e no funcio- namento adequado do sistema de secreção tipo VI (isto é, TssB). Em particular, um dsRNA possuindo as sequências SEQ ID NO: 20 (fita de senso) e 21 (fita antissenso), de preferência um RNA grampo de cabelo no qual as duas fitas estão conectadas por uma alça correspondente à SEQ ID NO: 2; (2) Um dsRNA quimérico com pelo menos 80% de homologia de se- quência com os genes HrpG, HrpX e RsmA de Xanthomonas campestris ou Xanthomonas oryzae, em particular de Xanthomonas campestris pv. campestris ou Xanthomonas oryzaepv. oryzae: HrpGencodes um regu- lador de HrpX, que é necessário para a ativação transcricional de efe- tores Xanthomonas e RsmA codifica uma proteína de ligação a RNA que desempenha um papel crítico na patogenicidade de Xanthomonas e na expressão adequada de fatores de virulência. Em particular, um dsRNA tendo as sequências SEQ ID NO: 22 (fita de senso) e 23 (fita antissenso), preferencialmente um RNA grampo de cabelo no qual as duas fitas estão conectadas por uma alça correspondente à SEQ ID NO: 2; (3) Um dsRNA quimérico com pelo menos 80% de homologia de se- quência com os genes essenciais RpoB, RpoC e FusA de diferentes patovares de Pseudomonas Syringae incluindo Pto DC3000 e Pseudo-
monas syringaepv. CC440. Em particular, um dsRNA tendo as se- quências SEQ ID NO: 24 (fita de senso) e 25 (fita antissenso), de prefe- rência um RNA grampo de cabelo no qual as duas fitas estão conecta- das por uma alça correspondente à SEQ ID NO: 2; (4) Um dsRNA quimérico com pelo menos 80% de homologia de se- quência com os genes essenciais SecE, RpoA e RplQ de diferentes pa- tovares de Pseudomonas Syringae incluindo Pto DC3000 e Pseudomo- nas syringae pv. CC440. Em particular, um dsRNA tendo as sequências SEQ ID NO: 26 (fita de senso) e 27 (fita anti-sentido), de preferência um RNA grampo de cabelo no qual as duas fitas estão conectadas por uma alça correspondente à SEQ ID NO: 2; (5) Um dsRNA quimérico tendo pelo menos 80% de homologia de se- quência com os genes essenciais NadHb, NadHd e NadHe de diferentes patovares de Xanthomonas. Em particular, um dsRNA possuindo as se- quências SEQ ID NO: 28 (fita de senso) e 29 (fita antissenso), de prefe- rência um RNA grampo de cabelo no qual as duas fitas estão conecta- das por uma alça correspondente à SEQ ID NO: 2; (6) Um dsRNA quimérico tendo pelo menos 80% de homologia de se- quência com os genes essenciais DnaA, DnaE1 e DnaE2 de diferentes patovares de Xanthomonas. Em particular, um dsRNA tendo as se- quências SEQ ID NO: 30 (fita senso) e 31 (fita antissenso), de prefe- rência um RNA grampo de cabelo no qual as duas fitas estão conecta- das por uma alça correspondente à SEQ ID NO: 2;
[0087] Outros exemplos de iRNAs quiméricos que se direcionam a esses genes incluem: - um dsRNA que se direciona concomitantemente aos genes HrpG, HrpB e HrcC de Ralstonia solanacearum, em particular um dsRNA tendo as sequências SEQ ID NO: 18 (fita de senso) e 19 (fita antissenso), de preferência um RNA grampo de cabelo em que as duas fitas estão co- nectadas por uma alça correspondente a SEQ ID NO: 2;
- um dsRNA que se direciona concomitantemente aos genes HrpL e Cfa6 de PtoDC3000, em particular um dsRNA tendo as sequências SEQ ID NO: 1 (fita de senso) e 3 (fita antissenso), de preferência um RNA grampo de cabelo em que as duas fitas são conectadas por uma alça correspondente à SEQ ID NO: 2; - um dsRNA que se direciona concomitantemente aos genes AvrPto e AvrPtoB de Pto DC3000, em particular um dsRNA tendo as sequências SEQ ID NO: 14 (fita de senso) e 15 (fita antissenso), de preferência um RNA grampo de cabelo em que as duas fitas são conectadas por uma alça correspondente à SEQ ID NO : 2; - um dsRNA que se direciona concomitantemente aos genes LuxA e LuxB de Pto DC3000 marcado com lux, em particular um dsRNA tendo as sequências SEQ ID NO: 108 (fita de senso) e 109 (fita antissenso), de preferência um RNA grampo de cabelo em que as duas fitas são conectadas por uma alça correspondente a SEQ ID NO: 2;
[0088] Em uma modalidade preferida, o iRNA da invenção é um iRNA quimérico que inibe pelo menos um gene que codifica um fator de virulência ou um gene essencial de células bacterianas conforme defi- nido acima, juntamente com pelo menos um outro gene que codifica um fator de virulência ou um gene essencial de outros patógenos ou para- sitas conhecidos por serem sensíveis a HIGS. Também pode ser um gene necessário para a biossíntese de metabólitos secundários tóxicos de patógenos não bacterianos ou parasitas de plantas.
[0089] O referido outro gene é, por exemplo, escolhido no grupo que consiste em: alvos fungicidas conhecidos (por exemplo, Citocromo P450 lanosterol C-14α-desmetilase (CYP51) de Fusarium gramine- arum, o agente causal da Fusariose da espiga do trigo (FHB) (20); ge- nes essenciais ou fatores de patogenicidade de fungos não relaciona- dos (por exemplo, DCL1 e DCL2 dos fungos necrotróficos Botrytis cine-
rea e Verticiliumdahliae (15)), quitina sintase Ch3b de Fusarium grami- nearum (35), β-1, 3-Glucan sintase (FcGls1), Proteína cinase 1 ativada por mitogênio (FsFmk1), domínio motor da misosina contendo quitina sintase V (FsChsV) de Fusarium culmorum (36), MAP cinase (PtMAPK1) ou Ciclofilina 1 (PtCYC1) de Puccinia triticina (37), o agente causal da ferrugem da folha do trigo e PsCPK1 de Puccinia striiformis (38), causando ferrugem da faixa do trigo); genes essenciais ou fatores de patogenicidade de patógenos oomicetos (por exemplo, Mensagem Altamente Abundante 34 (HAM34) ou Sintase de Celulose (CES1) de Bremia lactucae, causando míldio da alface (39)); genes necessários para a biossíntese de um metabólito secundário tóxico chave como o gene AflC, que é necessário para a biossíntese de aflatoxina em espé- cies de Aspergillus e que é sensível à tecnologia HIGS em milho trans- gênico (40).
[0090] Em outra modalidade preferida, o método da invenção: (i) um ou mais iRNAs que se direcionam a uma região de sequência generali- zada de um gene de virulência ou essencial que é conservado em um grande conjunto de patógenos bacterianos ou (ii) um ou mais iRNAs que se direcionam aos genes que são fatores essenciais ou de virulência de patógenos bacterianos não relacionados. Tal modalidade particular do método confere proteção de amplo espectro para patógenos bacteria- nos múltiplos. Os iRNAs da invenção são dsRNAs vantajosamente lon- gos, miRNAs e/ou siRNA conforme definido acima.
[0091] Em uma modalidade particular, o método da invenção com- preende ainda a introdução nas plantas de um ou mais dsRNAs que se direcionam a um ou vários genes de parasita(s) que são diferentes de bactérias, tais como vírus, fungos, oomicetos, insetos ou nematóides. Nesta modalidade, os iRNAs são direcionados a um gene essencial ou a um gene de virulência do(s) parasita(s). Os referidos um ou mais iR- NAs que se direcionam aos genes dos parasitas são vantajosamente entregues concomitantemente ou coexpressos com o iRNA que se dire- ciona ao(s) gene(s) bacteriano(s). Esse método é útil para a prevenção ou tratamento concomitante de doenças causadas por patógenos bac- terianos e outros parasitas. Este método pode ser realizado usando iR- NAs quiméricos carregando homologias de sequência com bactérias, mas também outros genes patogênicos/parasitas, como proposto acima, ou um coquetel de moléculas de iRNA, alguns tendo homologias para genes bacterianos e outros tendo homologias para genes de outros patógenos/parasitas. Vectores da invenção
[0092] Em uma modalidade preferida, os RNAs longos e pequenos da invenção são moléculas isoladas de RNA nuas que são usadas dire- tamente nas células das plantas produtoras e nas células bacterianas alvo, respectivamente.
[0093] Em outra modalidade preferida, os RNAs longos da invenção são codificados por construções de DNA recombinante que facilitam a introdução em uma célula vegetal e/ou facilitam a expressão de RNAs longos na referida célula vegetal. As referidas construções recombi- nantes podem ser um plasmídeo ou um vetor, que pode estar disponível comercialmente. É de preferência um vetor de expressão de planta con- forme descrito abaixo.
[0094] A presente invenção desse modo, também refere-se a um vetor de DNA recombinante de planta (ou "contruções de DNA de planta") ou um vetor viral de planta compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica pelo menos um RNA de interferência fun- cional (iRNA) que inibe a expressão de pelo menos um gene bacteriano, em que a referida sequência de polinucleotídeo é expressável em célu- las eucarióticas.
[0095] O referido iRNA funcional é como definido acima, um dsRNA curto ou longo, um ssRNA longo, um siRNA ou miRNA, de preferência o referido iRNA funcional é um dsRNA longo, um ssRNA longo, asiRNA ou um miRNA.
[0096] O referido pelo menos um gene bacteriano é preferencial- mente um gene bacteriano essencial ou de virulência conforme definido acima.
[0097] Em uma modalidade, o vetor é um vetor de DNA. O referido vetor de DNA compreende vantajosamente uma unidade de transcrição que compreende: uma região de iniciação da transcrição, uma região de terminação da transcrição e o polinucleotídeo que codifica o iRNA da invenção, em que a referida sequência de polinucleotídeo está opera- cionalmente ligada às referidas regiões de iniciação e terminação de uma maneira que permite a expressão da molécula de iRNA na célula eucariótica.
[0098] Em uma modalidade preferida, a referida célula eucariótica é uma célula vegetal que é capaz de expressar grandes quantidades de iRNAs, tal como folhas de N. benthamiana que são bem adaptadas para transformação transitória mediada por Agrobacterium.
[0099] O vetor de DNA da invenção pode codificar uma ou ambas as fitas da molécula de iRNA da invenção, ou uma única fita auto-com- plementar que se auto-hibridiza em um duplex de dsRNA. A região de iniciação da transcrição pode ser de um promotor para um RNA polime- rase II ou III eucariótica (pol II ou III), incluindo promotores virais ativos em células de planta, tal como o promotor CaMV35S, uma vez que os transcritos desses promotores são expressos em níveis elevados em todas as células dos organismos vegetais. Uma grande escolha de pro- motores adequados para a expressão de genes heterólogos em células de plantas está disponível na técnica. Eles podem ser obtidos, por exemplo, de vírus de plantas. Eles incluem promotores constitutivos, ou seja, promotores que são ativos na maioria dos tecidos e células e sob a maioria das condições ambientais, bem como promotores específicos de tecidos ou células que são ativos apenas ou principalmente em cer- tos tecidos ou certos tipos de células, e promotores induzíveis que são ativados em resposta a estímulos químicos. Promotores específicos de órgãos ou tecidos que podem ser adicionalmente usados na presente invenção para proteção de plantas contra patógenos bacterianos in- cluem, em particular, promotores que são ativos em tecidos/tipos de cé- lulas que são relevantes para a entrada e a propagação de patógenos bacterianos, por exemplo, em hidátodos, células guarda, células do parênquima do xilema e células ao redor da base dos tricomas.
[00100] A referida região de terminação da transcrição é preferen- cialmente reconhecida por uma RNA polimerase eucariótica, mais pre- ferencialmente por Pol II ou Pol III. Por exemplo, a referida terminação da transcrição pode ser uma sequência TTTTT.
[00101] Um grande número de vetores de DNA adequados para a expressão da molécula de dsRNA são conhecidos pelos versados na técnica e estão disponíveis comercialmente. A seleção de vetores ade- quados e os métodos para inserir construções de DNA neles são bem conhecidos. Os vetores recombinantes capazes de expressar de forma estável as moléculas de dsRNA podem ser transformados em planta e persistir nas células alvo. A escolha do vetor depende do hospedeiro pretendido e do método pretendido de transformação do referido hos- pedeiro.
[00102] Em uma modalidade, o vetor é um vetor viral. O referido vetor viral é preferencialmente selecionado a partir de vários vírus de RNA de plantas recombinantes (por exemplo, Tobacco mosaic virus, Tobacco rattle virus, Potato virus X, Barley stripe mosaic virus, Tomato bushy shunt virus), que podem ser usados para produzir grande quantidade de RNA pequeno por célula de planta através do VIGS (11). Aqui também, a escolha do vetor viral depende do hospedeiro pretendido e do método pretendido de infecção do referido hospedeiro. Este vírus vegetal re- combinante desencadeia a produção em planta de RNAs pequenos que podem inibir a expressão de pelo menos um gene bacteriano alvo.
[00103] A presente invenção também abrange vetores de DNA re- combinante ou vetores virais, incluindo um ou mais genes marcadores, o que permite a seleção das células hospedeiras transformadas.
[00104] Em uma modalidade preferida, o DNA ou vetor viral da in- venção compreende uma sequência polinucleotídica que codifica dois, três ou quatro genes de RNA de interferência funcional (iRNA) conforme definido acima, sendo, portanto capaz de inibir dois, três ou quatro ge- nes bacterianos diferentes. A pessoa versada pode identificar as melho- res combinações de iRNA por meios convencionais. Combinações de mais de quatro genes direcionados também estão incluídas na presente invenção.
[00105] Em uma modalidade, o vetor de DNA da invenção com- preende pelo menos uma das sequências SEQ ID NO: 1-31 e 108-109, em particular pelo menos uma das sequências SEQ ID NO: 1-31, e de preferência os sistemas de sequência: SEQ ID Nº: 1-2-3; 14-2-15; 18-2- 19; 20-2-21; 22-2-23; 24-2-25; 26-2-27; 28- 2-29; 30-2-31, 108-2-109, mais preferencialmente os sistemas de sequência: SEQ ID NO: 1-2-3; 14-2-15; 18-2-19; 20-2-21; 22-2-23; 24-2-25; 26-2-27; 28- 2-29; 30-2-31.
[00106] Em outra modalidade, o vetor de DNA da invenção compre- ende pelo menos uma das sequências SEQ ID NO: 88-97, de preferên- cia os sistemas de sequência: SEQ ID NO: 88-89, 90-91, 92-93, 94-95, 96 -97.
[00107] O vetor de DNA da invenção pode ser preparado por méto- dos convencionais conhecidos na técnica. Por exemplo, pode ser pro- duzido por amplificação de uma sequência nucleica por PCR ou RT- PCR, por análise de bibliotecas de DNA genômico por hibridação com uma sonda homóloga ou então por síntese química total ou parcial. Os vetores recombinantes podem ser introduzidos em células hospedeiras por técnicas convencionais, que são conhecidas na técnica. Métodos antibacterianos e usos da invenção
[00108] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um mé- todo in vitro para inibir a expressão de pelo menos um gene em uma célula bacteriana alvo, o referido método compreendendo a etapa de contatar a referida célula bacteriana alvo com um ou mais dos RNAs pequenos da invenção ou com composições compreendendo as mes- mas. No caso de fatores de virulência que são ativados transcricional- mente no contato das células de planta, será utilizado meio específico (por exemplo, meio mínimo conhecido por ativar a expressão de fitoto- xinas e fatores de transcrição necessários para a expressão do gene Hrp, ou presença de pedaços de folhas como nos ensaios de reabertura estomática semi-in vivo da invenção).
[00109] Em outras palavras, a presente invenção refere-se ao uso in vitro de RNAs pequenos ou de uma composição compreendendo RNAs pequenos, para inibir a expressão de pelo menos um gene em uma cé- lula bacteriana alvo, em que a referida célula bacteriana alvo é conta- tada diretamente com o referido pequeno RNA ou com a referida com- posição.
[00110] De preferência, o referido RNA pequeno é uma fita simples ou um siRNA de fita dupla ou um duplex de miRNA de fita simples ou dupla. Mais preferencialmente, o referido pequeno RNA inibe a expres- são de pelo menos um gene que codifica um fator de virulência ou um gene essencial ou um gene de resistência antibacteriana se a referida célula bacteriana for patogênica ou inibir a expressão de pelo menos um gene que codifica um repressor de crescimento ou um regulador nega- tivo de uma via que é útil para o hospedeiro se a referida célula bacteri- ana for benéfica.
[00111] De preferência, a referida composição contém extratos ve- getais obtidos a partir de células de planta produtoras que expressam pelo menos um dsRNA longo que é específico para pelo menos um gene da referida célula bacteriana. Mais preferencialmente, a referida composição contém RNAs totais, ou RNAs pequenos totais ou fluidos apoplásticos, ou vesículas extracelulares, ou RNAs pequenos extrace- lulares livres recuperados das referidas células de planta. As referidas células de planta produtoras são, por exemplo, escolhidas no grupo que consiste em: Tabaco (por exemplo, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabaco); Taro (Colocasia esculenta); Gengibre (Zingiber officinale), Ara- bidopsis (por exemplo, Arabidopsis thaliana); Tomate (por exemplo, Lycopersicon esculentum ou Solanum lycopersicum); Batata (Solanum tuberosum); Arroz (Oryza sativa); Milho (Zea mays); Cevada (Hordeum vulgare); Trigo (por exemplo, Triticum aestivum, Triticum durum), caroço de algodão, algodão, feijão, banana/banana da terra, sorgo, ervilha, ba- tata doce, soja, repolho, mandioca, cebola, melão, aveia, amendoim, gi- rassol, óleo de palma, centeio, Citrinos, Trigo, Pimenta, Inhame, Azei- tona, Uva, Gergelim, Cana-de-açúcar, Beterraba, Ervilha e Café, Laran- jeiras, Macieiras, Citrinos, Oliveiras, etc..
[00112] As plantas ornamentais também podem ser usadas para pro- duzir os referidos RNAs pequenos da invenção. Estas plantas ornamen- tais são, por exemplo, Crisântemo (como Crisântemo morifolium), Impa- tiens, Gerânio, Pelargônio, Phlox, Rhododendron anthurium spp, Ro- seira, Cúrcumas, Antúrios, Begônia, Hibiscus rosa-sinensis, Amarilâmis, Calla, Ciclâmen, Dracena, etc.
[00113] Por "inibir a expressão de pelo menos um gene", entende-se aqui que a expressão do referido gene é reduzida, ou seja, o mRNA ou os níveis de proteína da sequência alvo são estatisticamente mais bai- xos do que o nível de mRNA ou o nível de proteína do mesmo alvo em bactérias de controle apropriadas que são expostas a RNAs pequenos de controle direcionados a genes não relacionados (por exemplo, genes de fungos). Em particular, a redução do nível de polinucleotídeo de mRNA e/ou do nível de polipeptídeo do gene alvo em uma bactéria de acordo com a invenção resulta em atingir menos de 60%, menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos do que 20%, menos do que 10% ou menos do que 5% do nível de polinucleotídeo do mRNA, ou o nível do polipeptídeo codificado por esse meio, da mesma sequên- cia alvo em uma bactéria de controle apropriada. Os métodos para ava- liar o nível de expressão do transcrito de RNA, o nível de expressão do polipeptídeo codificado pelo gene direcionado ou a atividade do referido polinucleotídeo ou polipeptídeo são bem conhecidos na técnica.
[00114] Em uma modalidade, os RNAs pequenos da invenção com- preendem pelo menos uma das sequências SEQ ID NO: 1-31, e 108- 109, em particular pelo menos uma das sequências SEQ ID NO: 1-31, e preferivelmente os sistemas de sequência: SEQ ID Nº: 1-2-3; 14-2-15; 18-2-19; 20-2-21; 22-2-23; 24-2-25; 26-2-27; 28- 2-29; 30-2-31, 108-2- 109, mais preferivelmente os sistemas de sequência: SEQ ID NO: 1-2- 3; 14-2-15; 18-2-19; 20-2-21; 22-2-23; 24-2-25; 26-2-27; 28- 2-29; 30-2-
31.
[00115] Em outra modalidade, os RNAs pequenos da invenção com- preendem pelo menos uma das sequências SEQ ID NO: 88-97, preferi- velmente os sistemas de sequência: SEQ ID NO: 88-89, 90-91, 92-93, 94-95, 96 -97.
[00116] Nesse aspecto, qualquer tipo de bactéria pode ser direcio- nado. Bactérias patogênicas ou benéficas podem ser direcionadas, con- forme descrito acima.
[00117] Em uma modalidade, este método é de particular interesse para inibir ou limitar a patogenicidade e o crescimento de bactérias pa- togênicas em uma amostra. Também é útil para matar células bacteria- nas patogênicas em uma amostra.
[00118] Em outra modalidade, este método também pode ser usado para promover a replicação de bactérias benéficas pela inibição de ge- nes que regulam negativamente, direta ou indiretamente, o crescimento bacteriano, como mencionado acima.
[00119] Em outra modalidade, também é possível usar este método para restaurar a sensibilidade das células bacterianas a um composto antibacteriano, direcionando um gene que está envolvido na resistência bacteriana ao referido composto antibacteriano.
[00120] Por "composto antibacteriano", entende-se um composto que é usado ou proposto para matar bactérias. Os compostos antibac- terianos clássicos usados no campo fitossanitário são, por exemplo, bactericidas à base de cobre ou metabólitos secundários derivados de macro e micro-organismos.
[00121] A quantidade de RNAs pequenos a serem usados normal- mente depende do número de bactérias e do tipo de bactérias a que são direcionadas. Esta quantidade pode estar compreendida entre 10 e 30 ng/µl de RNAs totais contendo os RNAs pequenos eficazes. Métodos fitoterápicos e usos da invenção
[00122] De acordo com a invenção, os referidos um ou mais iRNAs da invenção são introduzidos em células de planta usando os métodos padrão mencionados acima para expressar ácidos nucleicos. Uma vari- edade de métodos para transformação genética de células eucarióticas estão disponíveis na técnica para muitas espécies de plantas. A título de exemplos não limitativos, pode-se mencionar o bombardeio de pro- jéteis, a transformação mediada por vírus, a transformação mediada por Agrobacterium e semelhantes. A eletroporação não está incluída.
[00123] O termo "introduzido" no contexto da inserção de um ácido nucleico em uma célula significa "transfecção" ou "transformação" ou "transdução" e inclui a referência à incorporação de um ácido nucleico em uma célula eucariótica onde o ácido nucleico pode ser estável incor- porado no genoma da célula (por exemplo, cromossoma, plasmídeo), ou expresso transitoriamente (por exemplo, liberação transitória de uma construção de gene por meio de Agrobacteriumtumefaciens).
[00124] A expressão do iRNAs da invenção na célula vegetal hospe- deira pode ser transitória ou estável. A expressão estável refere-se em particular à preparação de plantas transgênicas usando técnicas con- vencionais.
[00125] O referido iRNA será processado em siRNA ou duplexes de miRNA usando as enzimas vegetais tipo Dicer e outros pequenos fato- res de processamento de RNA. Os referidos pequenos duplexes de RNAs e/ou pequenos guias de RNA maduros (isto é, carregados em AGOs) são posteriormente translocados no meio extracelular, ou na su- perfície das células de planta, onde podem encontrar as células bacte- rianas.
[00126] Conforme demonstrado nos exemplos abaixo (exemplos 4, 5 e figuras 4 a 6), o crescimento e a virulência das células bacterianas são ambos diminuídos quando colocadas em contato com as células de planta da invenção nas condições em que os RNAs maduros da inven- ção são secretados.
[00127] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para tratar plantas alvo contra uma infecção bacteriana, o referido mé- todo compreendendo a etapa de introdução em pelo menos uma célula da referida planta alvo de uma molécula de dsRNA longo que se direci- ona especificamente a um gene bacteriano de virulência ou um gene bacteriano essencial ou um gene de resistência antibacteriana.
[00128] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um mé- todo de biocontrole com base em RNAi para o tratamento de plantas contra infecção bacteriana, o referido método compreendendo a etapa de entrega de RNAs pequenos, ou um extrato de planta contendo tais
RNAs pequenos ou uma composição compreendendo esses RNAs pe- quenos (por exemplo, RNAs totais extraídos de células de planta ou te- cidos que expressam de forma estável ou transiente essas pequenas entidades de RNA) em tecidos vegetais antes de e/ou após infecção bacteriana.
[00129] Preferivelmente, a referida composição contém extratos ve- getais obtidos a partir de células de planta que expressam pelo menos um dsRNA longo que é específico para o referido, pelo menos, uma vi- rulência ou gene bacteriano de resistência essencial ou antibacteriana. Mais preferivelmente, a referida composição contém EVs recuperados dos referidos extratos vegetais, ou RNAs pequenos extracelulares livres secretados pelas referidas células de planta e recuperados nos referi- dos extratos vegetais, ou fluidos apoplásticos recuperados dos referidos extratos vegetais. Ainda mais preferivelmente, a referida composição é uma composição líquida vaporizável.
[00130] Neste aspecto, as células bacterianas são eventualmente contatadas diretamente com RNAs pequenos (ou seja, siRNAs ou miR- NAs) que serão capazes de cruzar a membrana dupla bacteriana no caso de bactérias Gram negativas e atingir o citosol das células bacte- rianas onde o gene alvo ou genes alvos serão silenciados de uma ma- neira específica da sequência, resultando assim no amortecimento da patogenicidade bacteriana (ver exemplos 5-7 e figuras 4-6 e figuras 9- 10).
[00131] Como usado neste documento, o termo “RNAs pequenos” designa os RNAs pequenos que carregam a atividade inibidora dos iR- NAs da invenção. Especificamente, são siRNAs ou miRNAs (duplexes ou simplexes) que compartilham pelo menos 80% de homologia de se- quência com pelo menos um gene bacteriano, de preferência com pelo menos uma virulência bacteriana ou um gene essencial, mais preferen- cialmente com pelo menos um dos genes citados acima. Esses RNAs pequenos geralmente compreendem não mais do que 40 pares de ba- ses. De preferência, eles contêm entre 18 e 30, mais preferencialmente entre 18 e 25 pares de base. Mais preferencialmente, os referidos RNAs pequenos inibem especificamente pelo menos um dos genes essenciais bacterianos ou de virulência definidos acima.
[00132] De preferência, estes RNAs pequenos são siRNAs de fita dupla, conforme divulgado acima. Esses RNAs de fita dupla podem ser incorporados em vesículas extracelulares e/ou associados a proteínas de ligação a RNA.
[00133] Outro aspecto da invenção refere-se ao uso de pelo menos um iRNA ou um vetor contendo este iRNA, conforme definido acima, como um agente fitoterápico. De preferência, o referido iRNA ou vetor é usado para tratar uma doença causada por uma bactéria patogênica em plantas ou para prevenir uma infecção bacteriana em plantas.
[00134] Em uma modalidade, este fitoterápico iRNA é um dsRNA curto ou longo, um siRNA duplex ou miRNA duplex, um siRNA simplex ou um miRNA simplex, conforme definido acima. Em ainda outra moda- lidade, o iRNA tem como alvo genes bacterianos e genes de outros pa- tógenos ou parasitas não bacterianos, conforme definido acima, para prevenção ou tratamento concomitante de doenças causadas por pató- genos bacterianos e outros patógenos/parasitas em plantas. Todas as modalidades propostas acima para os iRNAs, os vetores e os métodos de transformação são aqui abrangidos e não precisam ser repetidos.
[00135] No contexto do problema técnico fitossanitário, os referidos RNAs pequenos podem ser entregues aos tecidos da planta por vários meios (por exemplo, por spray). Eles podem ser incorporados em mi- croesferas, nanopartículas, lipossomas ou exossomas naturais. As for- mulações preferidas são divulgadas abaixo. Plantas transgênicas da invenção
[00136] As células de planta transformadas com os iRNAs da inven- ção e capazes de gerar os RNAs pequenos da invenção são mais adi- ante designadas como “células de planta da invenção” ou “células hos- pedeiras da invenção”. Eles contêm pelo menos um iRNA (de preferên- cia um RNA longo) contendo pelo menos uma sequência direcionada especificamente a um gene bacteriano, por exemplo, uma virulência ou gene bacteriano essencial, ou uma construção de DNA ou vetor como definido acima. Eles são capazes de gerar e secretar RNAs pequenos que inibem a virulência, a patogenicidade e a proliferação bacteriana.
[00137] As plantas que foram transformadas de forma estável com um transgene que codifica os RNAs longos podem ser fornecidas como sementes, material reprodutivo, material de propagação ou material de cultura de células que não expressam ativamente o RNA longo, mas tem a capacidade de fazê-lo.
[00138] Se forem usados apenas para produzir os RNAs pequenos da invenção, podem ser chamados de “células de planta produtoras”. Se eles se beneficiarem do efeito antibacteriano conferido pelos RNAs pequenos produzidos, também podem ser chamados de “plantas-alvo”. Ambos os tipos de plantas (as produtoras e as alvo) são células recom- binantes que expressam e produzem os RNAs pequenos da invenção.
[00139] O termo "planta" aqui abrange uma célula de planta, um te- cido de planta, uma parte de planta, uma planta inteira, ancestrais e progênies dos mesmos. Uma parte da planta pode ser qualquer parte ou órgão da planta e inclui, por exemplo, semente, fruto, caule, folha, broto, flor, antera, raiz, tubérculo e pecíolo. O termo “planta” também abrange culturas em suspensão, embriões, meristemáticos, regiões, te- cido caloso, gametófitos, esporófitos, pólen e microesporos. Refere-se a todas as plantas, incluindo samambaias e árvores.
[00140] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma cé- lula vegetal isolada ou a uma planta transgênica que expressa de forma estável ou transiente pelo menos um iRNA da invenção funcional. Tam- bém refere-se a uma célula vegetal isolada contendo um DNA ou vetor viral da invenção. A referida célula vegetal pode ser uma célula geneti- camente modificada obtida por transformação com o referido vetor de DNA. Exemplos de processos de transformação são a transformação mediada por Agrobacterium ou a transformação mediada por arma de fogo.
[00141] A referida célula vegetal também pode ser uma célula modi- ficada obtida por infecção ou, alternativamente, por transformação me- diada por Agrobacterium com o referido vetor viral.
[00142] O DNA que codifica o iRNA pode ser expresso transitoria- mente ou integrado de forma estável no cromossomo da célula vegetal.
[00143] Todas as modalidades propostas acima para as células de planta, os iRNAs, os vetores e os métodos de transformação estão aqui englobados e não precisam ser repetidos.
[00144] Métodos para gerar tais plantas transgênicas são divulgados na parte de exemplo abaixo. Eles contêm a etapa de: i) transformar uma célula vegetal com um vetor de DNA que expressa pelo menos um RNA de interferência funcional da invenção, ou ii) infectar uma célula de planta com um vírus de planta, de preferência um vírus de RNA de planta, expressando pelo menos um RNA de inter- ferência funcional da invenção, por um tempo suficiente (tipicamente 3 a 4 dias para uma planta de tabaco) para que a célula da planta ex- presse de forma estável ou transiente uma quantidade significativa de RNAs pequenos.
[00145] Por "quantidade significativa", entende-se aqui uma quanti- dade que demonstrou ter um efeito antibacteriano em um teste como descrito acima. Esta quantidade significativa está preferencialmente compreendida entre 10 e 30 ng/µl de RNAs totais que expressam os RNAs pequenos eficazes.
[00146] Em particular, a referida planta transgênica é capaz de silen- ciar o gene de uma bactéria induzido pelo hospedeiro, e contém um pequeno RNA expressável maduro capaz de regular negativamente ou suprimir a expressão de pelo menos um gene de uma bactéria. Con- forme demonstrado pelos inventores, os referidos RNAs pequenos são capazes de se propagar ou cruzar a membrana dupla da bactéria alvo.
[00147] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma planta transgênica alvo que expressa de forma estável ou transiente os RNAs pequenos maduros da invenção. Em uma modalidade, a referida planta transgênica alvo contém o vetor de DNA da invenção. Em uma modalidade preferida, a referida planta alvo é Arroz, Milho, Cevada, Se- mente de Algodão, Algodão, Feijão, Banana/Banana da terra, Sorgo, Ervilha, Batata-doce, Soja, Couve, Mandioca, Batata, Tomate, Cebola, Melão, Aveia, Amendoim, Girassol, Óleo de Palma, Centeio, Citrinos, Trigo, Pimenta, Inhames, Azeitonas, Uvas, Tarô, Tabaco, Gergelim, Cana-de-açúcar, Beterraba sacarina, Ervilha e Café, Laranjeiras, Maci- eiras, Citrinos, e Oliveiras. Todas as modalidades propostas acima para os iRNAs, os vetores e as técnicas de transformação estão aqui englo- badas e não precisam ser repetidas.
[00148] As plantas ornamentais também podem ser utilizadas como alvo para os RNAs pequenos da invenção. Essas plantas ornamentais são, por exemplo, Crisântemo (como Chrysanthemum morifolium), Im- patiens, Gerânio, Pelargônio, Phlox, Rhododendronanthurium pp, Ro- seira, Cúrcumas, Antúrios, Begônia, Hibiscus rosa-sinensis, Amarilâmis, Calla, Ciclo, Dracaena, etc.
[00149] Por outro lado, as “plantas produtoras” que expressam de forma estável ou transiente os RNAs pequenos maduros da invenção são escolhidas entre: Tabaco (por exemplo, Nicotiana benthamiana, Ni- cotiana tobaccum); Taro (Colocasia esculenta); Gengibre (Zingiber offi- cinale), Arabidopsis (por exemplo, Arabidopsis thaliana); Tomate (por exemplo, Lycopersicon esculentumor Solanum lycopersicum); Batata (Solanum tuberosum); Arroz (Oryza sativa); Milho (Zea mays); Cevada (Hordeum vulgare); Trigo (por exemplo, Triticum aestivum, Triticum du- rum). As plantas produtoras preferidas são Tabaco, Taro e Gengibre. Composições compreendendo os elementos silenciadores da in- venção
[00150] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a composi- ções fitoterápicas contendo os RNAs pequenos da invenção e, opcio- nalmente, um carreador, excipiente ou diluente fisiológico ou agronô- mico aceitável. Em particular, refere-se a composições fitoterápicas contendo uma quantidade significativa de siRNAs ou miRNAs que ini- bem a expressão de pelo menos um gene bacteriano, de preferência inibindo um gene bacteriano essencial ou de virulência ou gene de re- sistência antibacteriana e, opcionalmente, um carreador, excipiente ou diluente fisiológico ou agronômico aceitável e/ou um composto bacteri- cida.
[00151] Os RNAs pequenos contidos nas composições fitoterapêuti- cas da invenção podem ser sintéticos ou podem ser obtidos a partir de plantas, tecidos vegetais ou células de planta que expressam de forma estável ou transiente os referidos RNAs pequenos. Em particular, plan- tas, tecidos vegetais ou células de planta transformados de forma está- vel ou transitória por um vetor de DNA da invenção ou infectados por um vetor viral da invenção produzirão RNAs pequenos. Uma composi- ção fitoterapêutica da invenção pode, portanto, compreender tanto RNAs totais de plantas, tecidos vegetais ou células de planta que ex- pressam estavelmente ou transitoriamente os RNAs pequenos de inte- resse, ou uma pequena fração de RNA purificada dos RNAs totais ou RNAs sintéticos produzidos por meios convencionais.
[00152] Para a produção de RNAs totais de plantas, tecidos vegetais ou células de planta que expressam de forma estável ou transiente
RNAs pequenos da invenção, um DNA ou vetor viral da invenção pode ser usado para transformar as referidas plantas, tecidos vegetais ou cé- lulas de planta, conforme descrito acima na seção "Plantas Transgêni- cas”. Os RNAs totais são então extraídos por métodos conhecidos na técnica.
[00153] Em um aspecto particular, a presente invenção, portanto, também refere-se a uma composição compreendendo um DNA ou vetor viral da invenção, conforme definido acima, que pode ser usado para produzir RNAs pequenos da invenção em plantas, e assim, eventual- mente, produzir as composições fitoterápicas da invenção.
[00154] Estas composições são preferencialmente utilizadas para a fabricação de composições fitoterápicas em métodos que compreen- dem as etapas de: a) gerar, conforme divulgado acima, células de plantas transgênicas re- combinantes produzindo siRNAs ou miRNAs que inibem especifica- mente um gene bacteriano essencial ou um gene bacteriano de viru- lência ou um gene de resistência a antibióticos de uma bactéria fitopa- togênica, b) recuperar o extrato celular vegetal ou as vesículas extracelulares ou os fluidos apoplásticos ou os RNAs pequenos extracelulares livres das referidas células de planta recombinantes, contendo uma quantidade si- gnificativa dos referidos siRNAs ou miRNAs, c) opcionalmente, adicionar um excipiente ou outro princípio ativo na referida composição fitoterápica.
[00155] Por "quantidade significativa", entende-se aqui uma quanti- dade que demonstrou ter um efeito antibacteriano em um teste como descrito acima. Esta quantidade está preferencialmente compreendida entre 10 e 30 ng/µl de RNAs totais que expressam os RNAs pequenos eficazes.
[00156] Como explicado acima, é possível usar composições fitote- rapêuticas contendo precursores de dsRNA (curtos ou longos, depen- dendo das espécies de pequeno RNA resultantes) ou outros precurso- res de RNAs pequenos que serão potencialmente processados e talvez amplificados através da ação de RNA polimerases dependentes de RNA de plantas acoplado ao processamento direcionado por DCL de dsRNAs levando a RNAs pequenos antibacterianos eficazes.
[00157] A presente invenção, portanto, também refere-se a uma composição fitoterapêutica contendo uma quantidade significativa de RNAs pequenos que inibem a expressão de um gene bacteriano essen- cial, ou de um gene bacteriano de virulência ou de um gene bacteriano de resistência antibacteriana.
[00158] Estes RNAs pequenos estão preferencialmente contidos em extratos de RNA total, ou vesículas extracelulares, ou fluidos apoplásti- cos ou pequenas frações de RNAs extracelulares livres da planta trans- gênica da invenção.
[00159] A presente invenção refere-se ao uso dessas composições para inibir ou prevenir o crescimento ou patogenicidade de bactérias em plantas alvo.
[00160] Em uma modalidade, o elemento silenciador da invenção pode ser fornecido como uma composição externa, como um spray na planta, parte da planta, semente ou uma área de cultivo. Em outra mo- dalidade, a planta é estavelmente ou transitoriamente transformada di- retamente com uma construção de DNA ou cassete de expressão ou infectada por um vetor viral para a expressão de pelo menos um ele- mento de silenciamento. No entanto, plantas estáveis ou transitoria- mente transformadas são preferencialmente utilizadas para a produção de RNAs pequenos da invenção, que são então fornecidos à planta de interesse para proteção contra uma ou múltiplas bactérias patogênicas.
[00161] O elemento silenciador da invenção também pode ser apli- cado por injeção no tronco e absorção do pecíolo, conforme divulgado em (41).
[00162] As composições fitoterapêuticas da invenção também po- dem compreender células (tais como extratos brutos de células de planta), nas quais um polinucleotídeo que codifica o iRNA da invenção é integrado de forma estável no genoma e operacionalmente ligado a promotores ativos na célula. As composições compreendendo uma mis- tura de extratos celulares, alguns extratos celulares de células de planta que expressam pelo menos um iRNA da invenção, também são abran- gidas. Em outras modalidades, as composições fitoterapêuticas da in- venção não contêm nenhuma célula.
[00163] Em uma modalidade, a composição é aplicada externamente a uma planta (ou seja, vaporizando um campo ou área de cultivo) para proteger a planta de infecção bacteriana. Em outra modalidade, é apli- cado por injeção no tronco e absorção do pecíolo.
[00164] As composições fitoterápicas da invenção podem ser formu- ladas em um veículo agricolamente adequado e/ou ambientalmente aceitável. Esses carreadores podem ser qualquer material que a planta a ser tratada possa tolerar. Além disso, o carreador deve ser tal que a composição permaneça eficaz no controle da infecção bacteriana, e não tóxica para animais ou insetos que se alimentam das plantas tratadas. Exemplos de tais carreadores incluem água, solução salina, solução de Ringer, dextrose ou outras soluções de açúcar, solução de Hank, e ou- tras soluções salinas fisiologicamente equilibradas, tampão fosfato, tampão bicarbonato e tampão Tris.
[00165] As composições da invenção podem ser fornecidas na forma concentrada, tal como uma solução aquosa concentrada. Pode até ser fornecido na forma congelada ou na forma de pó secado por congela-
mento ou liofilizado. Este último pode ser mais estável para armazena- mento de longo prazo e pode ser descongelado e/ou reconstituído com um diluente adequado imediatamente antes do uso.
[00166] Estas composições podem ainda conter um agente tensoa- tivo, um carreador inerte, um conservante, um umectante, um estimu- lante de alimentação, um atraente, um agente encapsulante, um agluti- nante, um emulsificante, um corante, um protetor de UV, um tampão, um agente de fluxo ou fertilizantes, doadores de micronutrientes ou ou- tras preparações que influenciam o crescimento das plantas. Um ou mais agroquímicos incluindo, mas não se limitando a, herbicidas, inse- ticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas, acaricidas, reguladores de crescimento de plantas, auxiliares de colheita e fertili- zantes podem ser combinados com carreadores, tensoativos ou adju- vantes habitualmente usados na técnica de formulação ou outros com- ponentes para facilitar o manuseio do produto e aplicação a bactérias alvo específicas. Os carreadores e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias normalmente usa- das na tecnologia de formulação, por exemplo, substâncias minerais na- turais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, agentes de aderência, aglutinantes ou fertilizantes.
[00167] As composições da invenção podem ser formulações sólidas de liberação lenta, formulações de terra de diatomácea de tensoativos para uso pesticida na forma de grânulos secos para disseminar, lipos- feras insolúveis em água formadas por um núcleo hidrofóbico sólido com uma camada de um fosfolipídeo incorporado na superfície do nú- cleo, microcápsulas, etc.
[00168] A natureza dos excipientes e a forma física da composição podem variar dependendo da natureza da parte da planta que se deseja tratar.
[00169] Os ingredientes ativos da presente invenção (isto é, o ele- mento silenciador) podem normalmente ser aplicados na área de cultivo, planta, órgãos reprodutivos, frutos, sementes e raízes a serem infecta- dos ou que já estão infectados.
[00170] Métodos de aplicação de um ingrediente ativo ou uma com- posição que contém pelo menos um elemento de silenciamento incluem, mas não estão limitados a, absorção de pecíolo, aplicação foliar, reves- timento de sementes e aplicação no solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infecção bacteriana.
[00171] Especificamente, as composições da invenção podem ser aplicadas às plantas, por exemplo, vaporizando, atomizando, polvi- lhando, disseminando, revestindo ou despejando, introduzindo no ou sobre o solo, introduzindo na água de irrigação, por tratamento de se- mentes ou aplicação geral ou vaporização no momento em que a infec- ção bacteriana começou ou antes da infecção bacteriana como medida de proteção.
[00172] A invenção também refere-se ao uso da referida composição fitoterápica para inibir ou prevenir o crescimento ou patogenicidade de bactérias em plantas alvo.
[00173] Em outras palavras, a composição da invenção pode ser usada para: - Tratar e/ou prevenir e/ ou controlar a patogenicidade bacteriana, - Tratar e/ou prevenir e/ou controlar o crescimento bacteriano, aumentando assim o rendimento das plantas. Vesículas extracelulares compreendendo os RNAs pequenos da in- venção
[00174] Em uma modalidade preferida, os RNAs pequenos da inven- ção ou seus precursores estão contidos em Vesículas Extracelulares (EVs) naturais ou em vesículas artificiais nas quais serão protegidos da ação de RNases. Nanofolhas de argila em camadas duplas de hidróxido
(LDH), que não são tóxicas e são degradáveis, também podem ser usa- das para carrear iRNAs antibacterianos. Eles já foram usados com su- cesso para liberar dsRNAs antivirais e descobriu-se que conferem con- ferir proteção viral por um período de pelo menos 20 dias (42).
[00175] Uma série de estudos já foi publicada, destacando o impor- tante papel protetor dos EVs na liberação de RNAs pequenos para pa- tógenos eucarióticos de plantas (17, 19).
[00176] Os inventores presentes aqui mostram que a liberação de RNAs pequenos de plantas para bactérias também ocorreu, pelo menos parcialmente, através de EV excretados pelas plantas transgênicas (fi- gura 9B).
[00177] As composições da invenção, portanto, contêm preferencial- mente EVs que foram secretados pelas plantas transgênicas da inven- ção.
[00178] EVs têm diâmetros de tamanhos heterogêneos (43, 44). Eles contêm proteínas citosólicas e de membrana derivadas das células pa- rentais (43-46). Eles também contêm mRNAs funcionais, RNAs não co- dificantes longos, precursores de miRNA e miRNAs e siRNAs maduros (17, 19, 47, 48).
[00179] A purificação de EVs pode ser realizada por vários métodos, sendo o mais comum e mais preferido a ultracentrifugação diferencial (43, 44).
[00180] Mais particularmente, é possível obter EVs a partir de células de planta por filtração e etapas de centrifugação diferencial, conforme descrito anteriormente (43, 44). Em síntese, as folhas são infiltradas à vácuo com tampões clássicos usados para coletar fluido de lavagem apoplástico (por exemplo, tampão MES de pH 6) e posteriormente cen- trifugados em baixa velocidade (44). O fluido de lavagem apoplástico é posteriormente coletado, filtrado e centrifugado com sucesso, conforme descrito recentemente (44). Uma população de EVs de planta, em uma faixa de tamanho de aproximadamente 50 a 300 nm em Arabidopsis (com uma média de 150 nm) pode ser recuperada a uma velocidade de centrifugação de 40.000g de fluido apoplástico (44). EVs menores, em uma faixa de tamanho de aproximadamente 10 a 20 nm em Arabidopsis, também podem ser recuperados exercendo ultracentrifugação diferen- cial do fluido apoplástico na velocidade de centrifugação de 40.000g se- guida por outra a 100.000g no sobrenadante obtido na etapa anterior (44). A análise EV da planta também deve ser concentrada usando co- lunas dedicadas (por exemplo, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters Ultra- cel 30K), e ressuspensas em tampão dedicado para que possam ser posteriormente usados para incubação com células bacterianas (ensaio in vitro) ou aplicados exogenamente na superfície da planta (ensaio em planta) antes ou depois das infecções bacterianas.
[00181] A composição da invenção também pode conter RNAs pe- quenos apoplásticos livres de EV secretados pelas plantas transgênicas da invenção e que não estão associados a proteínas. Essas pequenas espécies de RNA são referidas aqui como RNAs pequenos Extracelula- res Livres ou "efsRNAs". Essas pequenas espécies de RNA podem ser obtidas através da recuperação do sobrenadante de uma ultracentrifu- gação diferencial de fluido apoplástico envolvendo uma velocidade de centrifugação de 100.000g ou o sobrenadante de uma ultracentrifuga- ção diferencial de fluido apoplástico envolvendo uma velocidade de cen- trifugação de 40.000g seguida por uma velocidade de centrifugação de
100.000g. O sobrenadante resultante pode ser misturado em tampão dedicado ou usado diretamente para incubação com células bacterianas (ensaio in vitro) ou aplicado exogenamente na superfície da planta (en- saio in planta) antes ou após infecções bacterianas.
[00182] Estas frações EV são vantajosamente mantidas ou forneci- das na forma congelada ou na forma de pó secada por congelamento ou liofilizada, sob a qual mantêm a sua alta funcionalidade.
Kit de peças com compostos bactericidas
[00183] As composições podem ser aplicadas simultaneamente ou em sucessão com outros compostos.
[00184] Em uma modalidade preferida, a composição fitoterápica da invenção contém, além do elemento silenciador da invenção, um com- posto bactericida. Isto é particularmente apropriado quando o elemento silenciador da invenção inibe a expressão de um gene que desencadeia a resistência ao referido composto bactericida.
[00185] Neste caso, a composição da invenção pode ser fornecida como um “kit de partes”, compreendendo o elemento silenciador da in- venção (os RNAs pequenos definidos acima) e o composto bactericida correspondente em um recipiente separado.
[00186] O referido kit parcial contém preferencialmente a composi- ção fitoterápica da invenção contendo EVs portadores de RNAs peque- nos e o composto bactericida correspondente.
[00187] A invenção também refere-se ao uso do referido produto de combinação, para inibir ou prevenir o crescimento ou patogenicidade de bactérias em plantas alvo.
[00188] Em outros termos, a presente invenção refere-se a um mé- todo para o tratamento de plantas alvo contra infecção bacteriana, o re- ferido método compreendendo a etapa de introdução em uma célula da referida planta alvo de uma molécula de dsRNA longo que se direciona a pelo menos um gene de resistência antibacteriana, e liberando para a referida planta o composto bactericida correspondente.
[00189] A invenção também refere-se a um método para o trata- mento de plantas alvo contra infecção bacteriana, o referido método compreendendo a etapa de liberação de RNAs pequenos que inibem pelo menos um gene bacteriano de resistência antibacteriana, ou uma composição contendo esses RNAs pequenos, bem como o composto bactericida correspondente, em tecidos alvo da planta antes de e/ou após a infecção bacteriana.
[00190] Os RNAs pequenos ou EVs contendo os mesmos são prefe- rencialmente aplicados antes do composto bactericida, por exemplo, poucas horas antes, tipicamente, duas horas antes. Sistema de análise da invenção
[00191] Em uma modalidade específica, os métodos da invenção também podem ser usados como ferramentas para pesquisa experi- mental, particularmente no campo da genômica funcional. A sub-regu- lação de genes bacterianos de regulação negativa com RNAs pequenos podem ser usados para estudar a função do gene, em uma abordagem análoga ao que foi descrito na técnica para o verme nematóide C.ele- gans e também Drosophila melanogaster. Esta abordagem é particular- mente útil contra bactérias que não podem ser cultivadas in vitro.
[00192] Ensaios com base na sub- ou super-regulação de gene(s) bacteriano(s) específico(s), levando a um fenótipo mensurável, forne- cem novas ferramentas para a identificação de agentes antibacterianos.
[00193] Os inventores desenvolveram, de fato, ensaios para identifi- car RNAs pequenos candidatos com atividade antibacteriana antes dos ensaios em planta (os últimos são mais demorados para o experimen- talista). Conforme demonstrado na Figura 8C/D, este sistema pode con- tar com a expressão transitória de RNAs pequenos usando transforma- ção transitória de folhas de tabaco mediada por Agrobacterium bem es- tabelecida. Pode ser seguido pela incubação de siRNAs candidatos cor- respondentes com células bacterianas (na presença de tecidos/extratos vegetais na proximidade de células bacterianas ou em meios in vitro, como meios mínimos que mimetizam o ambiente do hospedeiro, que são conhecidos por desencadear a expressão de fatores de virulência).
[00194] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a métodos de análise in vitro que permitem a identificação rápida, confiável e eco- nômica de iRNAs funcionais com atividade antibacteriana, o referido método compreendendo as etapas de: a) expressar em células de planta RNAs pequenos que inibem pelo me- nos um gene bacteriano, coletando os extratos vegetais ou os RNAs totais secretados pelas referidas células de planta, b) incubar as referidas células de planta ou os referidos RNAs pequenos ou os referidos extratos com células bacterianas (cultivadas em meio in vitro ou na presença de tecidos/extratos vegetais em sua proximidade), e c) avaliar a expressão/atividade de repórteres (por exemplo, repórteres de replicação bacteriana, de resposta geral ao estresse, divisão celular etc.), atividade metabólica (por exemplo, liberação exógena do marca- dor fluorescente resazurina que é comumente usado para monitorar a atividade respiratória bacteriana, indicador de equilíbrio redox e viabili- dade), crescimento (por exemplo, expressão de repórter fluorescente conduzido por um promotor constitutivo que é cromossomicamente in- tegrado ou codificado a partir de um plasmídeo), a expressão do gene que é direcionado por RNAs pequenos (por exemplo, análise RT-qPCR, análises de Western Blot, expressão de um gene repórter fundido ao gene alvo ou à região do gene que é direcionado por RNAs pequenos) das referidas células bacterianas.
[00195] A expressão estável ou transitória dos RNAs pequenos anti- bacterianos pode ser usada como divulgado acima. Para a expressão transitória, as referidas células de planta são preferencialmente células de folhas de tabaco que podem ser facilmente e eficientemente trans- formadas com construções exógenas através da transformação transi- tória mediada por Agrobacterium. Todas as modalidades propostas acima para a produção de RNAs, os vetores, as células hospedeiras, os genes direcionados, as bactérias e as técnicas de transformação estão aqui englobadas e não precisam ser repetidas.
[00196] Também é possível usar o fluido apoplástico das células de planta, contendo as moléculas secretadas e EVs (em associação com os RNAs pequenos eficazes), para entrar em contato com as células bacterianas na etapa b). O fluido apoplástico pode ser recuperado por qualquer meio convencional, como infiltração a vácuo e centrifugação, que são comumente usados por aqueles versados na técnica. A con- centração de EVs também pode ser realizada em colunas dedicadas (por exemplo, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters Ultracel 30K), de acordo com as instruções do fabricante.
[00197] O método da invenção pode conter uma etapa final d) com- parando a viabilidade, o crescimento, as atividades metabólicas ou de repórter gênico de células bacterianas incubadas com o referido fluido apoplástico ou os referidos RNAs pequenos com os das mesmas célu- las bacterianas, mas na ausência de fluido de lavagem ou os referidos RNAs pequenos ou, preferencialmente, na presença de fluido de lava- gem apoplástico - de plantas que expressam RNAs pequenos de con- trole - ou controle de RNAs pequenos direcionados a genes não relaci- onados, como os genes de fungos CYP51 de F. graminearumas usados na presente invenção.
[00198] Os presentes inventores também desenvolveram sistemas que não estão relacionados à produção vegetal de RNAs pequenos, mas, em vez disso, à síntese do usuário in vitro de RNAs pequenos de fita dupla direcionados a genes bacterianos (figura 10). Como experi- mentos de prova de conceito, os inventores demonstraram que siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL sintetizados in vitro desencadearam silenciamento de genes bacterianos, bem como supressão da reabertura estomática induzida por Pto DC3000 na mesma extensão que RNAs totais deriva- dos de plantas transgênicas IR-CFA6/HRPL (Figura 10B/C, Figura 6A). Além disso, eles mostraram que os siRNAs anti-fusA e anti-gyrB sinte- tizados in vitro possuem um forte efeito bactericida, evitando assim o crescimento de Pto DC3000 em condições in vitro (Figura 10D/E).
[00199] Eles, portanto, também propõem um método in vitro para identificar RNAs pequenos artificiais candidatos com efeitos antibacteri- anos, o referido método compreendendo as etapas de: a) conduzir a síntese in vitro de RNAs pequenos (de preferência de fita dupla) inibindo pelo menos um gene bacteriano, b) incubar os referidos RNAs pequenos com células bacterianas, e c) avaliar a viabilidade, crescimento, atividade metabólica das referidas células bacterianas, como explicado acima.
[00200] Alternativamente, o método de análise in vitro da invenção pode compreender as etapas de: a) expressar em células de planta pelo menos um dsRNA longo que inibe pelo menos um gene bacteriano, b) contatar as referidas células de planta com um tampão de lise, c) incubar os referidos lisados de células de planta com células bacte- rianas, e d) avaliar a viabilidade, crescimento, atividade metabólica das referidas células bacterianas.
[00201] Nestes métodos de análise, qualquer gene bacteriano pode ser direcionado, sendo o objetivo identificar se o referido gene está en- volvido no crescimento bacteriano, virulência, patogenicidade, resistên- cia bacteriana, etc. Configurações adequadas para a etapa c) ou d) po- dem ser desenvolvidas por alguém versado na técnica a fim de identi- ficar tal atividade.
[00202] Prevê-se que esses sistemas de análise serão explorados no futuro para selecionar, e eventualmente produzir, RNAs pequenos antibacterianos eficientes, que podem ser incorporados em composi- ções ou agentes fitoterápicos, a fim de proteger as plantas contra doen- ças bacterianas em mais condições em planta e de campo.
[00203] Eles podem ser acoplados com dispositivo microfluídico ou outros métodos de análise usando procedimentos automáticos de alto rendimento para ler o comportamento fenotípico em multiplex.
[00204] Além das disposições acima, a invenção também compre- ende outras disposições, que emergirão da descrição que se segue, que refere-se a modalidades exemplares do assunto da presente invenção, com referência aos desenhos anexos e à Tabela de sequências em que: Tabela 1: Detalhes de sequência nas ferramentas usadas nos exemplos SEQ ID NO: Nome/detalhes 1 Sequência do primeiro braço do dsRNA CFA6/HRPL usado para direcio- nar concomitantemente os genes HrpL e Cfa6 de Pto DC3000 2 Sequência do intron CHSA usada para gerar todas as repetições inverti- das da presente invenção 3 Sequência do segundo braço do dsRNA CFA6/HRPL usado para dire- cionar concomitantemente os genes HrpL e Cfa6 de Pto DC3000 4 Sequência do primeiro braço do dsRNA CFA6-A usada para direcionar o gene Cfa6 de Pto DC3000 5 Sequência do segundo braço do dsRNA CFA6-A usada para direcionar o gene Cfa6 de Pto DC3000 6 Sequência do primeiro braço do dsRNA CFA6-B usada para direcionar o gene Cfa6 de Pto DC3000 7 Sequência do segundo braço do dsRNA CFA6-B usada para direcionar o gene Cfa6 de Pto DC3000 8 Sequência do primeiro braço do dsRNA HRPL-A usada para direcionar o gene HrpL de Pto DC3000 9 Sequência do segundo braço do dsRNA HRPL-A usada para direcionar o gene HrpL de Pto DC3000 10 Sequência do primeiro braço do dsRNA HRPL-B usada para direcionar o gene HrpL de Pto DC3000 11 Sequência do segundo braço do dsRNA HRPL-B usada para direcionar o gene HrpL de Pto DC3000 12 Sequência do primeiro braço do dsRNA HRCC usada para direcionar o gene HrcC de Pto DC3000 13 Sequência do segundo braço do dsRNA HRCC usada para direcionar o gene HrcC de Pto DC3000
14 Sequência do primeiro braço do dsRNA AvrPto/AvrPtoB usada para di- recionar os genes AvrPto e AvrPtoB de Pto DC3000 15 Sequência do segundo braço do dsRNA AvrPto/AvrPtoB usada para di- recionar os genes AvrPto e AvrPtoB de Pto DC3000 16 Sequência do primeiro braço do dsRNA CYP51 usada para direcionar os genes FgCYP51A, FgCYP51B e FgCYP51C de Fusarium graminearum 17 Sequência do segundo braço do dsRNA CYP51 usada para direcionar os genes FgCYP51A, FgCYP51B e FgCYP51C de Fusarium grami- nearum 18 Sequência do primeiro braço do dsRNA HRPG/HRPB/HRCC usada para direcionar concomitantemente os genes HrpG, HrpB e HrcC de espécies de Ralstonia 19 Sequência do segundo braço do HRPG/HRPB/HRCC dsRNA usada para direcionar concomitantemente os genes HrpG, HrpB e HrcC de es- pécies de Ralstonia 20 Sequência do primeiro braço do dsRNA HRPB/HRCC/TssB/XpsR usada para direcionar concomitantemente os genes HrpB, HrcC, XpsR e TssB de espécies de Ralstonia 21 Sequência do segundo braço do dsRNA HRPB/HRCC/TssB/XpsR usada para direcionar concomitantemente os genes HrpB, HrcC, XpsR e TssB de espécies de Ralstonia 22 Sequência do primeiro braço do dsRNA HRPG/HRPX/RsmA usada para direcionar concomitantemente os genes HrpG, HrpX, e RsmA de Xan- thomonas campestrispv.
Campestris 23 Sequência do segundo braço do dsRNA HRPG/HRPX/RsmA usada para direcionar concomitantemente os genes HrpG, HrpX, e RsmA de Xan- thomonas campestrispv.
Campestris 24 Sequência do primeiro braço do dsRNA RpoB/RpoC/FusA usada para direcionar concomitantemente os genes RpoB, RpoC e FusA de PtoDC3000 e Pseudomonas syringae CC440 25 Sequência do segundo braço do RpoB/RpoC/FusA dsRNA usada para direcionar concomitantemente os genes RpoB, RpoC e FusA de PtoDC3000 e Pseudomonas syringae CC440 26 Sequência do primeiro braço do SecE/RpoA/RplQ dsRNA usada para di- recionar concomitantemente os genes SecE, RpoA e RplQ de
PtoDC3000 e Pseudomonas syringae CC440 27 Sequência do segundo braço do SecE/RpoA/RplQ dsRNA usada para direcionar concomitantemente os genes SecE, RpoA e RplQ de PtoDC3000 e Pseudomonas syringae CC440 28 Sequência do primeiro braço do dsRNA NadHb/NadHd/NadHe usada para direcionar concomitantemente os genes NadHb, NadHdandNadHe das espécies Xanthomonas 29 Sequência do segundo braço do dsRNA NadHb/NadHd/NadHe usada para direcionar concomitantemente os genes NadHb, NadHdandNadHe das espécies Xanthomonas 30 Sequência do primeiro braço do dsRNA DnaA/DnaE1/DnaE2 usada para direcionar concomitantemente o DnaA, DnaE1 e DnaE2genes de espé- cies de Xanthomonas 31 Sequência do segundo braço do dsRNA DnaA/DnaE1/DnaE2 usada para direcionar concomitantemente o DnaA, DnaE1 e DnaE2genes de espécies de Xanthomonas 32 Sequência repórter GFP contida no plasmídeo GFPpPNpt 33 Sequência iniciadora de Cfa6-dianteira usada para LMW Northern Blot 34 Sequência de Iniciador de Cfa6-reversa usada para LMW Northern Blot 35 Sequência iniciadora de HrpL-Forward usada para LMW Northern Blot 36 Sequência iniciadora de HrpL-Reverse usada para LMW Northern Blot 37 Sequência iniciadora da sonda miR159 usada para LMW Northern Blot 38 Sequência de Iniciador de GyrA-Fwd usada para RT-qPCR 39 Sequência de Iniciador de GyrA-Rev usada para RT-qPCR 40 Sequência iniciadora de CFA6-Fwd usada para RT-qPCR 41 Sequência iniciadora de CFA6-Rev usada para RT-qPCR 42 Sequência iniciadora de HrpL-Fwd usada para RT-qPCR 43 Sequência iniciadora de HrpL-Rev usada para RT-qPCR 44 Sequência iniciadora de ProC-Fwd usada para RT-qPCR 45 Sequência iniciadora de ProC-Rev usada para RT-qPCR 46 Sequência iniciadora de RpoB-Fwd usada para RT-qPCR 47 Sequência iniciadora de RpoB-Rev usada para RT-qPCR 48 Sequência iniciadora de Cyp3-Fwd usada para LMW Northern Blot 49 Sequência iniciadora de Cyp3-Rev usada para LMW Northern Blot 50 Preparação da sonda para análise de Northern Blot: U6
51 Sequência iniciadora de Tomate Ubi-Fwd usada para RT-qPCR 52 Sequência iniciadora de Tomate Ubi-Rev usada para RT-qPCR 53 Sequência iniciadora de PtoGFP-Fwd usada para RT-qPCR 54 Sequência iniciadora de PtoGFP-Rev usada para RT-qPCR 55 Sequência iniciadora de IR-CFA6/HRPL-Fwd usada para RT-qPCR 56 Sequência iniciadora de IR-CFA6/HRPL-Rev usada para RT-qPCR 57 Sequência iniciadora de Ath-Ubi-Fwd usada para RT-qPCR 58 Sequência iniciadora de Ath-Ubi -Rev usada para RT-qPCR 59 HRPL-pDON207-Fwd para Clonagem de WT HRPL e mut HRPL em pDON207-attB1/B2 60 HRPL-pDON207-Rev para Clonagem de WT HRPL e mut HRPL em pDON207-attB1/B2 61 Iniciador dcl2-1-WT-fwd para genotipagem do alelo dcl2-1 62 Iniciador dcl2-1-mut-fwd para genotipagem do alelo dcl2-1 63 Iniciador dcl2-1-WT-Rev para genotipagem do alelo dcl2-1 64 Iniciador dcl3-1-fwd para genotipagem do alelo dcl3-1 65 Iniciador dcl3-1-Rev para genotipagem do alelo dcl3-1 66 Iniciador LBa1 67 Iniciador dcl4-2-G8605 Fwd para genotipagem do alelo dcl4-2 68 Iniciador dcl4-2-G8605 Rev para genotipagem do alelo dcl4-2 69 Iniciador GABI-8474-LP 70 Análise de Northern Blot de Iniciador Fwd IR-HHR 71 Análise de Northern Blot de Iniciador Rev IR-HHR 72 RT-qPCR LuxAFwd 73 RT-qPCR LuxA Rev 74 RT-qPCR LuxBFwd 75 RT-qPCR LuxB Rev 76 HRPL-pDON207-Fwd 77 HRPL-pDON207-Rev 78 T7 Fwd CFA6/HRPL 79 T7 Rev CFA6/HRPL 80 T7 Fwd CYP51 81 T7 Rev CYP51 82 T7 Fwd Dc3000_FusA 83 T7 Rev Dc3000_FusA
84 T7 Fwd Dc3000_SecE 85 T7 Rev Dc3000_SecE 86 T7 Fwd Dc3000_GyrB 87 T7 Rev Dc3000_GyrB 88 Primeira fita XC_RS06155: XC_1225 89 Segunda fita XC_RS06155: XC_1225 90 Primeira fita XC_RS02265 = XC_0447 91 Segunda fita XC_RS02265 = XC_0447 92 Primeira fita XC_RS18260 = XC_3609 93 Segunda fita XC_RS18260 = XC_3609 94 Primeira fita XC_RS11930 = XC_2375 95 Segunda fita XC_RS11930 = XC_2375 96 Primeira fita XC_RS17005 = XC_3357 97 Segunda fita XC_RS17005 = XC_3357 98 T7 Fwd XC_RS06155: XC_1225 99 T7 Rev XC_RS06155: XC_1225 100 T7 Fwd XC_RS02265 = XC_0447 101 T7 Rev XC_RS02265 = XC_0447 102 T7 Fwd XC_RS18260 = XC_3609 103 T7 Rev XC_RS18260 = XC_3609 104 T7 Fwd XC_RS11930 = XC_2375 105 T7 Rev XC_RS11930 = XC_2375 106 T7 Fwd XC_RS17005 = XC_3357 107 T7 Rev XC_RS17005 = XC_3357 108 Sequência do primeiro braço do LuxA/LuxBdsRNA usada para direcio- nar concomitantemente o LuxA e LuxBgenes de Pto DC3000 109 Sequência do segundo braço do LuxA/LuxBdsRNA usada para direcio- nar concomitantemente o LuxA e o LuxBgenes de Pto DC3000 LEGENDAS DAS FIGURAS: Figura 1. Caracterização fenotípica e molecular de plantas Arabi- dopsis transgênicas que expressam a repetição invertida IR- CFA6/HRPL em ambas as condições, não tratadas e bacterianas desafiadas A.
Representação esquemática dos genes Pto DC3000 Cfa6 e
HrpL.
As regiões de 250 pb dos genes Cfa6 (1-250 nt) e HrpL (99-348 nt) foram usadas para gerar a construção grampo de cabelo quimérica sob o controle do promotor 35S constitutivo.
B.
Imagens representativas de plantas Col-0 com cinco sema- nas de idade e de plantas transgênicas homozigóticas independentes que expressam o 35Spro: IR-CYP51 (vetor de controle: CV) ou a cons- trução 35Spro: IR-CFA6/HRPL.
C.
O nível de acúmulo de siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL detec- tados por análise de Northern Blot de baixo peso molecular das plantas de Arabidopsis representadas em B.
U6 foi usado como um controle de carga.
D.
O acúmulo de mRNA Pto DC3000 HrpL é significativamente diminuído em plantas infectadas com IR-CFA6/HRPL em comparação com plantas infectadas com Col-0- e CV.
As plantas de Arabidopsis re- presentadas em B. foram inoculadas por imersão com a cepa Pto DC3000 WT e, 3 dias após a infecção (dpi), os níveis de transcrição bacteriana de ProC, Cfa6 e HrpL foram monitorados por análise quanti- tativa de RT-PCR.
Esses níveis de mRNA são quantificados em relação ao nível de transcrição bacteriana de GyrA.
As barras de erro indicam os desvios padrão dos valores de mRNA obtidos em três experiências independentes.
Diferenças estatisticamente significativas foram avalia- das usando o teste ANOVA (ns: valor p > 0,05; *: valor p < 0,05, **: valor p < 0,01, ***: valor p < 0,001).. Figura 2. Caracterização fenotípica e molecular de plantas Arabi- dopsis transgênicas que expressam a repetição invertida IR- LuxA/LuxB em ambas as condições não tratadas e bacterianas de- safiadas A.
Representação esquemática do operon luxCDABE inserido no genoma Pto DC3000 WT.
As regiões de 250 pb dos genes LuxA (1- 250 nt) e LuxB (1-250 nt) foram usadas para gerar a construção grampo de cabelo quimérica sob o controle do promotor 35S constitutivo.
B.
O nível de acúmulo de anti-LuxA/LuxB detectado por análise Northern Blot de baixo peso molecular das plantas transgênicas Arabi- dopsis.
U6 foi usado como um controle de carga.
C.
Um impacto significativo na luminescência da luciferase Pto DC3000 (Pto Luc) foi observado nas linhagens transgênicas que expres- sam o IR-LuxA/LuxB em comparação com Col-0 após a infecção.
As duas linhagens transgênicas independentes de IR-LuxA/LuxB #18 e #20, junto com Col-0 foram infiltradas com seringa com Pto Luc em uma concentração de 106 cfu/mL e a luminescência foi medida 24 horas após a infiltração.
D.
O crescimento em planta de Pto DC3000 é inalterado em plantas transgênicas IR-LuxA/LuxB em comparação com plantas Col-0. Discos de folhas das plantas usadas em C. foram triturados e semeados em uma diluição em série para contar Pto Luc para cada condição 24 horas após a infecção.
Figura 3. Plantas Arabidopsis transgênicas que expressam a cons- trução IR-CFA6/HRPL suprimem a reabertura estomática induzida por Pto DC3000 A.
As cepas Pto ΔCfa6 e ΔhrpL, mas não a cepa ΔhrcC, foram prejudi- cadas em sua capacidade de reabrir estômatos e esses fenótipos foram resgatados após adição de COR exógena.
Seções de folhas não des- cascadas de plantas Col-0 foram incubadas com solução simulada (água) ou cepas Pto DC3000 WT, ΔCfa6, ΔHrpL ou ΔhrcC por 3 horas.
A abertura dos estômatos foi avaliada medindo a largura e o compri- mento usando o software ImageJ.
B.
Pto DC3000 WT não mais induziu a reabertura estomática em linha- gens transgênicas de Arabidopsis que superexpressam o grampo de cabelo IR-CFA6/HRPL.
A medição da abertura estomática foi conduzida em Col-0 e 35Spro: linhagens IR-CFA6/HRPL #4, #5, #10 transgênicas infectadas com a cepa Pto WT conforme descrito em A.
C.
A resposta de reabertura estomática induzida por Pto DC3000 ficou inalterada em CV em comparação com plantas Col-0. A medição da abertura estomática foi conduzida em plantas Col-0 e CV infectadas com a cepa Pto WT conforme descrito em A.
Nota: Para todos esses experimentos, n = número de estômatos anali- sados por condição e significância estatística foi avaliado usando o teste ANOVA (ns: valor p> 0,05; ****: valor p < 0,0001). Figura 4. Plantas Arabidopsis transgênicas que expressam a cons- trução IR-CFA6/HRPL exibem uma dispersão vascular reduzida e crescimento de Pto DC3000 em folhas adultas A.
As plantas infectadas com IR-CFA6/HRPL #4, #5 e #10 exibem dis- seminação vascular reduzida de Pto WT em comparação com plantas infectadas com Col-0 e CV.
As plantas foram inoculadas no ferimento em veias médias com Pto WT-GFP e Col-0 foi inoculado no ferimento com Pto ΔCfa6-GFP.
O sinal de fluorescência GFP foi observado sob luz ultravioleta e as fotos foram tiradas 3 dias após a infecção (dpi). Para indexar a disseminação de bactérias a partir dos sítios de inoculação, a fluorescência de GFP foi observada sob luz ultravioleta.
Quando a bac- téria se propagou para longe de qualquer um dos três sítios de inocula- ção, ela foi indexada como propagação com 4 correspondentes ao maior índice de propagação.
Fotos de três replicas biológicas foram le- vadas em consideração.
B.
Imagens representativas de folhas infectadas de condições usadas em A. são mostradas.
Os círculos brancos indicam o sítio de inoculação do ferimento na veia média da folha.
C.
As linhagens transgênicas IR-CFA6/HRPL #4, #5 e #10 exi- bem um título de Pto WT significativamente reduzido quando compa- rado a plantas infectadas com Col-0 e CV.
As plantas Col-0, CV e IR- CFA6/HRPL #4, #5 e #10 foram inoculadas por imersão com Pto WT e as plantas Col-0 foram inoculadas por imersão com a cepa Pto ΔCfa6- GFP.
Os títulos bacterianos foram monitorados 2 dias após a infecção (dpi). Quatro folhas de três plantas por condição e de três experimentos independentes (n) foram consideradas para a análise comparativa.
D.
As plantas transgênicas IR-CFA6/HRPL #4, #5 e #10 exibem sinto- mas de embebimento em água reduzidos em comparação com as plan- tas Col-0 e CV.
Fotos de folha representativas de sintomas de embebi- mento em água foram tiradas 24 horas após a inoculação por imersão.
Nota: Para todos os experimentos acima, a significância estatística foi avaliada usando o teste ANOVA bidirecional (ns: valor p> 0,05; *: valor p < 0,05; **: valor p < 0,01; ***: valor p < 0,001; ****: valor-p < 0,0001) Figura 5. Caracterização fenotípica de plantas Arabidopsis trans- gênicas que expressam a repetição invertida IR- HRPG/HRPX/RSMA em ambas as plantas não tratadas e condições desafiadas de Xanthomonas campestris pv.
A.
As plantas infectadas com IR-HRPG/HRPX/RSMA #1 e #6 exibem disseminação vascular reduzida da cepa XccΔXopAC virulenta (GUS/GFP) em comparação com as plantas infectadas com Col-0. As plantas foram inoculadas em feridas em veias médias com XccΔXopAC (GUS/GFP) em DO = 0,01. O sinal de fluorescência GFP foi observado sob luz ultravioleta e as fotos foram tiradas 3 dias após a infecção (dpi). A indexação foi feita conforme descrito em 4A.
B.
Imagens representativas de folhas infectadas de condições usadas em B. são mostradas.
Os círculos brancos indicam o sítio da inoculação do ferimento na veia média da folha.
Figura 6. RNAs totais liberados exogenamente de IR-CFA6/HRPL reduzem a patogenicidade Pto DC3000 quando aplicadas na super- fície de folhas de Arabidopsis e tomate tipo selvage A.
Ensaio AGS in vitro mostrando que o extrato de RNA total de plantas CFA6/HRPL #4 desencadeia o silenciamento de ambos os genes Cfa6 e HrpL.
As células Pto WT foram incubadas in vitro por 4 e 8 horas com 20 ng/μl de RNAs totais de plantas CV ou IR-CFA6/HRPL #4. Redução significativa das transcrições bacterianas Cfa6 e HrpL foi observada por RT-qPCR em ambos os pontos do tempo, enquanto o acúmulo de trans- crições ProC e RpoB permaneceu inalterado.
GyrA foi usado como con- trole interno para quantificar o acúmulo de transcrições bacterianas.
As barras de erro indicam os desvios padrão dos valores de três experi- mentos independentes.
B.
A capacidade de Pto WT para reabrir estômatos foi alterada após a aplicação exógena do extrato de RNAs totais de plantas IR-CFA6/HRPL em comparação com plantas CV.
Folhas Col-0 foram tratadas por 1 hora com água ou 20 ng/μl de RNAs totais extraídos de plantas CV ou IR- CFA6/HRPL #4 e foram incubadas com Pto WT por 3 horas.
A abertura estomática foi medida e analisada conforme descrito na Fig. 3A.
C.
O tratamento com IR-CFA6/HRPL, mas não com CV, RNAs totais comprometeramu a capacidade de Pto DC3000 de se multiplicar no apoplasto das folhas quando comparado ao pré-tratamento com RNAs totais de CV.
Folhas Col-0 foram tratadas com 20ng/μl de RNAs totais de plantas CV ou IR-CFA6/HRPL #4 por 1 hora, seguido de inoculação por imersão com Pto WT.
Os títulos bacterianos foram monitorados a 2 dpi.
O número de folhas (n) corresponde a valores coletivos de três ex- perimentos independentes.
D.
As folhas tratadas com RNAs totais de CV exibiram mais sintomas necróticos em comparação com as folhas tratadas com RNAs totais de IR-CFA6/HRPL #4. O experimento foi conduzido como em C., mas usando plantas de tomate com cinco semanas de idade (Solanum lyco- persicum 'Moneymaker'). Imagens representativas de folhas infectadas nas duas condições são mostradas.
E.
Um número reduzido de focos dePto DC3000-GFP foi observado em folhas de tomate tratadas com extratos de RNA total de plantas IR-
CFA6/HRPL #4 versus plantas CV.
Folhas infectadas foram observadas a 3 dpi sob luz ultravioleta para estimar o número de loci GFP.
À es- querda: Gráfico de pontos representando o número de loci GFP anali- sados usando o software ImageJ de 3-4 folhas diferentes por condição com pelo menos 4 fotos por folha.
Os valores usados para a análise são de dois experimentos independentes diferentes.
O teste t de Student foi realizado para a análise comparativa.
À direita: imagem representativa das folhas de tomate descritas em D.
F.
O teor de DNA de Pto WT-GFP é diminuído em folhas de tomate tratadas com extratos de RNA total de IR-CFA6/HRPL #4 versus plantas CV.
O nível de teor de DNA bacteriano foi analisado por qPCR usando Ubiquitina de tomate como um controle.
O teste t de Student foi reali- zado para a análise comparativa.
Nota: Para A, B e C, as diferenças estatisticamente significativas foram avaliadas usando o teste ANOVA (ns: valor p > 0,05; **: valor p < 0,01, ***: valor p < 0,001). Figura 7. siRNAs antibacterianos dependentes de DCL, mas não os precursores de dsRNA não processados correspondentes, são as entidades de RNA responsáveis por AGS e pela supressão da reabertura estomática A.
Painel superior: Nível de acúmulo de transcrições de IR-CFA6/HRPL em Col-0, dcl2-1 dcl3-1 dcl4-2 (dcl234), IR-CFA6/HRPL #4 (#4) e IR- CFA6/HRPL #4 base mutante dcl234 (#4 x dcl234) foi realizado por RT- qPCR.
Ubiquitina foi usada como um controle.
O gráfico representa a média e o desvio padrão de três experimentos independentes.
Painel inferior: O nível de acúmulo de anti-Cfa6 e anti-HrpLsiRNAs foi realizado por análises de Northern Blot de baixo peso molecular nos mesmos ge- nótipos.
U6 foi usado como um controle de carga.
B.
O extrato de RNA total de plantas #4 x dcl234 não altera os níveis de acúmulo de transcrição de Cfa6 e HrpL.
As células de Pto WT foram incubadas in vitro por 8 horas com 20 ng/μl de RNAs totais extraídos dos mesmos genótipos descritos em A.
Os níveis de acúmulo de trans- crições de Cfa6 e HrpL foram avaliados por análise RT-qPCR usando GyrA como um controle.
As barras de erro indicam os desvios padrão dos valores de três experiências independentes.
Diferenças estatistica- mente significativas foram avaliadas usando o teste ANOVA (ns: valor p > 0,05; *: valor p < 0,05, **: valor p < 0,01). C.
O extrato de RNA total de plantas #4 x dcl234 não suprime a resposta de reabertura estomática induzida por Pto DC3000. Folhas de Col-0 fo- ram tratadas com água ou 20 ng/μl de extratos de RNA total dos mes- mos genótipos que aqules usados em A. por 1 hora e incubados com Pto WT por 3 horas.
A abertura estomática foi medida e analisada con- forme descrito na Fig. 2A.
Duas outras réplicas biológicas são apresen- tadas na Fig. 4B suplementar.
D.
Painel superior: Perfis de eletrograma representando a distribuição de tamanho de RNA, de RNAs totais, longos e pequenos de plantas IR- CFA6/HRPL #4 determinados com um Agilent Bioanalyzer 2100 equi- pado com um RNA Nano chip.
As frações de RNA de baixo peso mole- cular são circundadas para cada amostra.
Os picos ribossomais 18S e 25S são destacados.
Painel inferior: imagem de gel de agarose de RNAs totais, longos e pequenos manchadoscom brometo de etídio usa- dos em A.
E.
Pequenas espécies de RNA, mas não as espécies correspondentes de RNA longo, de plantas IR-CFA6/HRPL suprimem a reabertura esto- mática na mesma medida que os extratos de RNA total.
O experimento foi conduzido como em D., mas com frações de RNA total, longo (> 200 nt) ou pequeno (< 200 nt), que foram separadas dos RNAs totais de plantas IR-CFA6/HRPL #4. Nota: Para todos os experimentos de estô- matos, a significância estatística foi avaliada usando o teste ANOVA (ns: valor p> 0,05; ****: valor p <0,0001).
Figura 8. Uma versão resiliente de RNA pequeno expresso em bac- térias de HrpL é refratária ao silenciamento de genes direcionado por siRNAs anti-HrpL e exibe um fenótipo de reabertura estomática normal após a aplicação exógena de siRNAs anti-HrpL A.
Representação esquemática da cepa Pto ΔHrpL juntamente com as cepas de complementação geradas após transformação com os plas- mídeos que codificam WT HrpL ou mut HrpL, respectivamente sob o controle do promotor constitutivo NptII.
B.
Ensaio AGS in vitro mostrando que a cepa PtoΔHrpL WT HrpL é sen- sível a RNAs antibacterianos, enquanto a PtoΔHrpL mut HrpL é refratá- ria a essas entidades de RNA.
Cepas bacterianas de PtoΔHrpLWT HrpLandPtoΔHrpLmutHrpL foram incubadas com RNAs totais extraídos de plantas CV ou IR-CFA6/HRPL #4 por 8 horas.
O nível de acúmulo de transcrições WT HrpL e mut HrpL foi analisado por RT-qPCR (os níveis de mRNA eram relativos ao nível de transcrição GyrA). Barras de erro indicam os desvios padrão dos valores de três experimentos indepen- dentes.
Diferenças estatisticamente significativas foram avaliadas usando o teste ANOVA (ns: valor p > 0,05; *: valor p < 0,05, **: valor p < 0,01). C.
Acúmulo de siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL foi avaliada por análise Northern de baixo peso molecular usando extratos de RNA total de plan- tas de N. benthamiana expressando transitoriamente 35Spro: IR-HRPL, 35Spro: IR-CFA6/HRPL e de folhas não transformadas de N. benthami- ana (Nb). U6 foi usado como um controle de carga.
D.
A cepa PtoΔHrpL mut HrpL é refratária à ação anti HrpL siRNA.
As folhas de Col-0 foram tratadas com RNAs totais extraídos de N. bentha- miana (Nb) apenas ou de N. benthamiana expressando a repetição in- vertida IR-HRPL.
A resposta à reabertura estomática foi avaliada con- forme descrito anteriormente.
Nota: Para todos os experimentos de estômatos, a significância estatís- tica foi avaliada usando o teste ANOVA (ns: valor p > 0,05; ****: valor p < 0,0001). Figura 9. O fluido apoplástico de plantas IR-CFA6/HRPL é com- posto por siRNAs antibacterianos funcionais que são embutidos em EVs, e protegidos da ação da nuclease microcócica, ou em uma forma livre, e sensíveis à digestão da nuclease microcócica A.
A capacidade de Pto WT para reabrir estômatos também foi alterada para níveis similares após a aplicação exógena de extrato de fluido apo- plástico (APF) em comparação com RNAs totais derivados de plantas IR-CFA6/HRPL.
RNAs totais e APF extraídos de plantas CV foram usa- dos como controle negativo.
Folhas de Col-0 foram tratadas por 1 hora com água (Simulação) ou 20 ng/μl de RNAs totais ou 500 μl de APF extraído de plantas CV ou IR-CFA6/HRPL #4 e foram incubadas com Pto WT por 3 horas.
A abertura estomática foi medida e analisada con- forme descrito em experimentos anteriores.
B.
As duas diferentes frações vesiculares, P40 e P100, bem como a população de RNA livre presentes no sobrenadante (SN), transportam os siRNAs antibacterianos e, desse modo, estão envolvidos em AGS.
O fluido apoplástico extraído de ambas as plantas CV e IR-CFA6/HRPL #4 foi submetido a ultracentrifugação a 40.000g para peletizar a maior população de EVs (P40) e o sobrenadante restante foi também subme- tido a ultracentrifugação a 100.000g para peletizar os EVs menores (P100). SN também foi restaurado.
Folhas de Col-0 foram tratadas por 1 hora com água (simulação) ou P40, P100 e SN extraídos de plantas CV ou IR-CFA6/HRPL #4 e foram incubadas com Pto WT por 3 horas.
Os P40, P100 e SN de #4 foram tratados com 20 unidades de Mnase e o SN de #4 também foi tratado com 20 unidades de Proteinase K.
A abertura estomática foi medida e analisada como descrito em experi- mentos anteriores.
Nota: Para todos os experimentos de estômatos, a significância estatís- tica foi avaliada usando o teste ANOVA (ns: valor p > 0,05; ****: valor p <0,0001). Figura 10. Liberação exógena de siRNAs antibacterianos sintetiza- dos in vitro reduz a patogenicidade, bem como a viabilidade de Pto DC3000 A. 2% de gel de agarose de brometo de etídio mancharam dsRNAs longos sintetizados in vitro e RNase III digeriram siRNAs corresponden- tes a IR-CYP51 e IR-CFA6/HRPL são representados.
B.
A capacidade de Pto WT para reabrir estômatos foi alterada após a aplicação exógena de siRNAs sintetizados in vitro, mas não os dsRNAs longos, correspondentes a IR-CFA6/HRPL. dsRNAs longos e siRNAs de IR-CYP51 foram usados como controle negativo.
Folhas de Col-0 foram tratadas por 1 hora com água (simulação) ou RNA apresentado em A. e em seguida incubadas com Pto WT por 3 horas.
A abertura estomática foi medida e analisada como descrito nos experimentos an- teriores.
C.
O ensaio de AGS in vitro usando os siRNAs sintetizados in vitro de IR-CFA6/HRPL desencadeia o silenciamento de ambos os genes Cfa6 e HrpL.
As células Pto WT foram incubadas in vitro por 8 horas com 2 ng/μl de siRNAs sintetizados in vitro de plantas IR-CYP51 ou IR- CFA6/HRPL #4. Redução significativa das transcrições bacterianas Cfa6 e HrpL foi observada por RT-qPCR, embora o acúmulo de trans- crições ProC e RpoB permanecesse inalterado.
GyrA foi usado como um controle interno para quantificar o acúmulo de transcrições bacteri- anas.
As barras de erro indicam os desvios padrão dos valores de três experiências independentes.
D. e E. siRNAs sintetizados in vitro contra fusA ou gyrB de Pto DC3000 têm um impacto significativo no crescimento da cepa Pto DC3000-GFP. siRNAs direcionados aos genes secE, gyrB e fusA de Pto DC3000 foram sintetizados usando transcrição in vitro seguida por digestão com RNa- seIII. A cepa Pto DC3000-GFP foi incubada com a concentração indi- cada de siRNAs sintetizados in vitro. A placa de 96 cavidades foi colo- cada na máquina para que as amostras fossem fracionadas em gotícu- las pelo sistema microfluídico com base em gotas (Millidrop). Para cada cavidade, 10 gotas de ~ 500nl cada foram formadas e incubadas dentro do instrumento. Para cada gota, as medições de biomassa e de fluores- cência de GFP foram adquiridas a cada ~ 30 minutos. EXEMPLOS: EXEMPLO 1: Materiais e métodos Geração de linhagens transgênicas transportando construções de repetições invertidas
[00205] O grampo de cabelo quimérico IR-CFA6/HRPL foi projetado para produzir siRNAs artificiais direcionados a uma região de 250 pb de Cfa6 (do nucleotídeo 1 a 250) e uma região de 250 bp de HrpL do nu- cleotídeo 99 a 348 (SEQ ID NO: 1, 2 e 3). O IR-CFA6-A e IR-CFA6-B são duas repetições invertidas independentes que visam especifica- mente o gene Cfa6 do nucleotídeo 1 a 250 (SEQ ID NO: 4, 2 e 5) e do nucleotídeo 1 a 472 (SEQ ID NO: 6, 2 e 7), respectivamente. O IR- HRPL-A e IR-HRPL-B são duas repetições invertidas independentes que se direcionam especificamente para HrpL do nucleotídeo 99 ao 348 (SEQ ID NO: 8, 2 e 9) e do nucleotídeo 1 ao 348 (SEQ ID NO: 10, 2 e 11), respectivamente. O grampo de cabelo IR-HRCC foi projetado para direcionar especificamente o gene HrcC (SEQ ID NO: 12, 2 e 13) e o IR- AvrPto/AvrPtoB para direcionar concomitantemente os genes efetores de tipo III AvrPto e AvrPtoB (SEQ ID NO: 14, 2 e 15). O grampo de cabelo IR-CYP51 foi projetado para produzir siRNAs contra três genes do citocromo P450 lanosterol C-14α-desmetilase do fungo F. gramine- arum, a saber FgCYP51A, FgCYP51B e FgCYP51C como realizado an- teriormente (SEQ ID NO: 16, 2 e 17), (19). Este grampo de cabelo foi utilizado como controle negativo para todos os ensaios em planta da invenção.
Repetições invertidas adicionais foram projetadas e clonadas como parte deste estudo para direcionar fatores de virulência ou genes essenciais de diferentes cepas de Pseudomonas, Xanthomonas e Rals- tonia.
Esses grampos de cabelo são descritos a seguir: o grampo de cabelo IR-HrpG/HrpB/HrcC projetado para se direcionar concomitante- mente aos genes HrpG, HrpB e HrcC de espécies de Ralstonia (SEQ ID NO: 18, 2 e 19), o grampo de cabelo IR-HrpB/HrcC/TssB/XpsR proje- tado para se direcionar concomitantemente aos genes HrpB, HrcC, TssB e XpsR de espécies de Ralstonia (SEQ ID NO: 20, 2 e 21), o grampo de cabelo IR-HrpG/HrpX/RsmA projetado para se direcionar concomitantemente aos genes HrpG, HrpX e Rsma de Xanthomonas campestris pv. campestris (SEQ ID NO: 22, 2 e 23), o grampo de cabelo IR-RpoB/RpoC/FusA projetado para se direcionar concomitantemente aos genes essenciais RpoB, RpoC e FusA de Pto DC3000 e Pseudo- monas syringae cepa CC440 (SEQ ID NO: 24, 2 e 25), o grampo de cabelo IR-SecE-RpoA-RplQ projetado para se direcionar concomitante- mente aos genes essenciais SecE, RpoA e RplQ de Pto DC3000 e Pseudomonas syringae cepa CC440 (SEQ ID NO: 26, 2 e 27), o grampo de cabelo IR-NadHb/NadHd/NadHe projetado para se direcionar conco- mitantemente aos genes essenciais NadHb, NadHd e NadHe de dife- rentes espécies de Xanthomonas, incluindo Xanthomonas campestris pv. campestris (SEQ ID NO: 28, 2 e 29), o grampo de cabelo IR-DnaA / DnaE1 / DnaE2 projetado para se direcionar concomitantemente aos genes essenciais NadHb, NadHd e NadHe de diferentes espécies de Xanthomonas incluindo Xanthomonas campestris pv. campestris (SEQ ID NO: 30, 2 e 31). Além disso, uma repetição invertida quimérica foi projetada e clonada como parte deste estudo para se direcionar ao ope- ron Photorhabdus luminescens luxCDABE cromossomicamente ex- presso em Pto DC3000 sob o promotor de canamicina constitutivo: o grampo de cabelo IR-LuxA/LuxB, projetado para se direcionar concomi- tantemente aos genes LuxA e LuxB da cepa Pto DC3000 de luciferase (SEQ ID NO: 108, 2 e 109). Todos os grampos de cabelo descritos acima contêm uma sequência de íntron específica do gene de Petúnia Calcona sintase CHSA (SEQ ID NO: 2) e foram clonados em um vetor portador do promotor constitutivo 35S do vírus mosaico da couveflor (CaMV). Mais especificamente, as seguintes sequências de grampo de cabelo: IR-CFA6/HRPL, IR-CYP51, IR-CFA6-B, IR-HRPL-B, IR- HrpG/HrpB/HrcC, IR-HrpB/HrcC/TssB/XpsR, IR-AvrPto/AvrPtoB, IR- HRCC, IR-HrpG/HrpX/RsmA e IR-LuxA/LuxB foram clonadas em um ve- tor pDON221-P5-P2 modificado transportando sítios de restrição EcoRI e SalI adicionais para facilitar a inserção dessas repetições invertidas longas neste vetor.
Uma recombinação dupla entre pDON221-P5-P2 transportando a sequência de grampo de cabelo e pDON221-P1-P5r (Life Technologies, 12537-32), transportando a sequência do promotor 35S constitutivo, foi conduzida no vetor de destino compatível pB7WG GATEWAY (vetor binário transportando um marcador de seleção BAR e locais de recombinação de gateway). Os grampos de cabelo restan- tes, nomeadamente as sequências IR-CFA6-A, IR-HRPL-A, IR- RpoB/RpoC/FusA, IR-SecE-RpoA-RplQ, IR-NadHb/NadHd/NadHe e IR-DnaA/DnaE1/DnaE2 foram geradas por amplificações de PCR das regiões de senso e antissenso dos genes alvo usando o DNA genômico bacteriano como modelo e seguido pela geração de módulos necessá- rios para a clonagem em um vetor de destino GreenGate final pGGZ003. Todos os plasmídeos foram então introduzidos nas cepas GV3101 ou C58C1 de Agrobacterium tumefaciens e posteriormente usados para expressão transitória em Nicotiana benthamiana ou expressão estável no acesso de referência de Arabidopsis thaliana Columbia-0 (Col-0). Material vegetal e condições de crescimento
[00206] Linhagens transgênicas estáveis de IR-CFA6/HRPL e CV fo- ram geradas por transformação de plantas Arabidopsis WT (acesso Col- 0) usando o método de imersão floral mediado por Agrobacterium. Três linhagens transgênicas independentes, # 4, # 5 e # 10 expressando quantidade igual de siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL foram selecionadas e propagadas até a geração de T4. Similarmente, a linhagem homozigó- tica selecionada de CV expressa nível abundante de siRNAs contra os genes CYP51A/B/C de F. graminearum foi propagada até a geração de T4 para experimentação. Similarmente, as linhagens transgênicas que expressam IR-LuxA/LuxB e IR-HrpG/HrpX/RsmA foram selecionadas com base na produção de siRNA e propagadas posteriormente. Para análise genética, planta mutante tripla dcl2 dcl3 dcl4 (dcl234) foi cruzada com a linhagem de referência IR-CFA6/HRPL # 4 e as plantas F3 foram genotipadas para selecionar mutante dcl234 homozigoto contendo transgene homozigoto IR-CFA6/HRPL. Sementes esterilizadas de Ara- bidopsis Col -0 e as linhagens transgênicas homozigotas selecionadas foram cultivadas primeiro por 12 a 14 dias a 22°C em placas contendo meio ½ x MS (Duchefa), 1% de sacarose e 0,8% de ágar (com ou sem seleção de antibiótico) em 8 horas de fotoperíodo. As mudas foram pi- cadas em vasos de solo e cultivadas em condições ambientalmente controladas a 22°C/19°C com fotoperíodo de 8 horas sob intensidade de luz de 100 μE/m2/s. Plantas com quatro a cinco semanas de idade foram usadas para todos os experimentos. Sementes de tomate (Sola- num lycopersicum 'Moneymaker') e N. benthamiana foram semeadas diretamente em vasos de solo e cultivadas em condições ambiental- mente controladas a 22°C/19°C (dia/noite) com fotoperíodo de 16 horas sob intensidade de luz de 100 μE/m2/s. Plantas com quatro a cinco se- manas de idade foram usadas para todos os experimentos. Cepas bacterianas
[00207] As cepas GFP expressando Pto DC3000-GFP e Pto
DC3000Δcfa6-GFP (Pto DC3118) foram um presente do Dr. S.Y.He, en- quanto a cepa Pto DC3000ΔhrpL foi um presente do Dr. Cayo Ramos. A cepa de luciferase Pto DC3000 foi um presente do Dr. Chris Lamb. As cepas Pto DC3000ΔhrpL e Pto DC3000ΔhrcC que expressam o gene repórter GFP foram geradas transformando-as com o mesmo plasmídeo que em Pto DC3000-GFP, por eletroporação e então semeadas a 28°C em meio NYGB (5 g/l de bactopeptona, 3 g/l de extrato de levedura, 20 ml/l de glicerol) contendo gentamicina (1 µg/ml) para seleção. Para ge- rar as cepas Pto DC3000-WT-HrpL e -mut-HrpL, a cepa Pto DC3000ΔhrpL foi transformada com os plasmídeos NPTIIpro: WT-HrpL e NPTIIpro:mut-HrpL, respectivamente, por eletroporação e então seme- adas em meio NYGB com gentamicina. Análises de Gel Blot de RNA
[00208] Para realizar análises de Northern Blot de RNAs de baixo peso molecular, RNA total foi extraído usando o reagente TriZOL e es- tabilizado em 50% de formamida. Cerca de 30 μg de RNA total das con- dições especificadas foram usados para realizar análises de Northern Blot como descrito anteriormente (49). Regiões de 150 pb a 300 pb fo- ram amplificadas dos plasmídeos usando iniciadores específicos de ge- nes e os amplicons foram ainda usados para gerar sondas marcadas radioativamente 32P específicas sintetizadas por iniciação aleatória. A sonda U6 foi usada como controle para carregamento igual de RNAs pequenos. Separação de frações de RNA longo e pequeno
[00209] Os RNAs totais foram extraídos de folhas de Arabidopsis de IR-CFA6/HRPL #4 usando Tri-Reagent (Sigma, St. Louis, MO) de acordo com as instruções do fabricante. Usando 100 μg de RNA total, as frações de RNA longo e pequeno foram separadas usando o kit de isolamento de miRNA mirVana (Ambion, Life technologies) de acordo com as instruções do fabricante.
A separação de RNAs longos e peque- nos dos RNAs totais foi visualizada usando eletroforese em gel de aga- rose e posteriormente analisada usando método com base em micro- fluidos (Bioanalyzer 2100; Agilent Technologies, http://www.agi- lent.com). Os RNAs totais, longos e pequenos foram posteriormente usados para realizar o ensaio de reabertura estomática.
Ensaios de infecção bacteriana em plantas (a) Ensaio de crescimento bacteriano: As plantas para este experi- mento foram especificamente utilizadas após três horas do início do ci- clo noturno na câmara de crescimento.
Três plantas por condição foram inoculadas por imersão utilizando a bactéria a 5 x 107 ufc/mL com 0,02% de Silwet L-77 (Lehle seeds). As plantas após a imersão bacteriana fo- ram imediatamente colocadas em câmaras com elevada umidade para facilitar uma infecção adequada.
Foram observados sintomas de imersão em água após a imersão 24 horas após a infecção e foram ti- radas fotografias de folhas de três plantas por condição.
Dois dias pós- inoculação, o título bacteriano para cada condição mencionada foi medido para folhas individuais infectadas, tal como descrito em (49). Para quantificar as transcrições bacterianas em plantas infectadas, foi recolhido um conjunto de amostras de folhas infectadas três dias após a inoculação. (b) Ensaio de inoculação de feridas: Para monitorar a propagação de bactérias nas veias médias, cerca de 15 folhas de três plantas por con- dição foram inoculadas manualmente com um palito imerso em bacté- rias marcadas com GFP a uma concentração de 5x106 cfu/ml e, em se- guida, as plantas foram colocadas em câmaras com alta umidade por 3 dias.
A propagação bacteriana foi então analisada monitorando o sinal GFP sob uma luz UV usando um macrozoom Olympus MV 10x e as fotos foram tiradas com uma câmera CCD AxioCamMrc Zeiss com um filtro GFP.
(c) Ensaio de proteção de planta: Antes da infecção bacteriana, quatro folhas de roseta de três plantas de Arabidopsis por condição foram tra- tadas individualmente por embebimento repetido com solução simulada ou soluções de RNA a uma concentração de 20 ng/μl de RNAs totais específicos, ambos suplementados com Silwett L-77 (0,02%). Uma hora após o pré-tratamento, as folhas foram inoculadas por imersão com Pto DC3000 WT ou Pto DC3000Δcfa6 a uma concentração de 5x107 cfu/ml de maneira similar à dos RNAs. Os títulos bacterianos foram monitora- dos dois dias após a inoculação, como especificado anteriormente. No tomate, duas folhas de três plantas por condição foram pré-tratadas com uma suspensão contendo 20 ng/μl de RNA total específico suplemen- tado com Silwett L-77 (0,02%) e foram imersas uma hora depois com Pto DC3000 marcado com GFP a 5x107 cfu/ml. As plantas foram então colocadas em condições controladas a 24°C/19°C (dia/noite) com foto- período de 16 horas sem tampa por 3 dias. A infecção bacteriana foi então analisada monitorando o sinal GFP sob uma luz UV usando um macrozoom Olympus MV 10x e as fotos foram tiradas. Amostras de folhas individuais foram coletadas para quantificar a quantidade de bac- térias em cada condição usando o software ImageJ. Quantificação de luminescência bacteriana
[00210] Três plantas por condição foram infiltradas com seringa com a cepa Pto DC3000 Luciferase (Pto Luc) a 1x106 cfu/ml. As plan- tas foram colocadas em câmaras com alta umidade para facilitar a in- fecção apropriada. Os discos de folha foram colocados em cavidades individuais de uma placa de 96 cavidades para quantificar a lumines- cência usando Berthold Centro LB 960 Microplate Luminometer. Qua- tro folhas por planta foram levadas em consideração. Os discos de fo- lhas de folhas individuais foram agrupados após realizar a quantifica- ção do título bacteriano como mencionado acima. Quantificação de infecção de tomate
(a) Quantificação de loci de GFP: folhas de tomate infectadas com a cepa Pto DC3000-GFP foram submetidas à quantificação de GFP sob uma luz UV usando um macrozoom Olympus MV 10x e as fotos foram tiradas com uma câmera CCD AxioCamMrc Zeiss com um filtro GFP. O número de loci de GFP foi quantificado com o software ImageJ para pelo menos 10 fotos por condição. (b) Quantificação de DNA genômico bacteriano Para quantificar a infecção bacteriana nas plantas de tomate infectadas (Ross et al., 2006), a quantidade de DNA genômico bacteriano (gDNA) foi medida em relação ao gDNA da planta. O DNA genômico foi isolado de amostras de folhas de tomate infectadas com Pto DC3000-GFP usando o mini kit de planta DNeasy (QIAGEN, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Usando 1 ng de gDNA, qPCR foi reali- zado usando Takyon SYBR Green Supermix (Eurogentec®) e ini- ciadores específicos do gene GFP. A quantidade de gDNA bacteriano foi normalizada para a de tomate usando iniciadores específicos de Ubi- quitina. Expressão transitória mediada por Agrobacterium de repetições in- vertidas em N. benthamiana
[00211] Para produzir grampos de cabelo únicos, IR-CFA6 e IR- HRPL, e o grampo de cabelo quimérico IR-CFA6/HRPL, a cepa de A. tumefaciens transportando os plasmídeos foram cultivados durante a noite em meio LB a 28°C. As células foram colhidas por centrifugação e ressuspensas em uma solução contendo 10 mM de MES, pH 5,6, 10 mM de MgCl2 e 200 μM de acetosseringona a uma densidade final de 0,5 OD600. As culturas foram incubadas no escuro na temperatura am- biente durante 5 a 6 horas antes da infiltração mediada por Agrobacte- rium em N. benthamiana de quatro semanas. Após 3 dias de infiltração, o tecido foliar foi colhido e a análise de Northern Blot foi realizada para confirmar a produção de siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL. As amostras de folhas foram então utilizadas para extração de RNA total. Ensaio de silenciamento de gene antibacteriano in vitro
[00212] Para avaliar se as transcrições bacterianas Cfa6 e HrpL po- dem ser direcionadas diretamente pelo dsRNA e/ou pelos siRNAs gera- dos pelo grampo de cabelo IR-CFA6/HRPL, 2 ml de cultura de Pto DC3000 WT, Pto DC3000-WT-HrpL e Pto DC3000-mut-HrpL a 107 cfu/ml foi tratado por 4 e/ou 8 horas, com 20 ng/μl de RNA total especi- ficado extraído de plantas transgênicas CV ou IR-CFA6/HRPL #4 em uma placa de seis cavidades, respectivamente. Similarmente, para quantificar o silenciamento de genes bacterianos após tratamentos com siRNAs sintetizados in vitro, 2 ml de Pto DC3000-GFP a 1x107 cfu/ml foram tratados por 6 horas com 2 ng/µl de siRNAs de IR-CYP51 ou siR- NAs de IR-CFA6/HRPL sintetizados in vitro em uma placa de seis cavi- dades, respectivamente. As bactérias foram coletadas para cada condi- ção e posteriormente processadas para análises moleculares. Extração de fluido apoplástico (AF) e vesículas extracelulares (EVs)
[00213] A extração foi feita como descrito anteriormente (44). Ses- senta folhas de plantas CV ou IR-CFA6/HRPL com 5 semanas de idade foram infiltradas com tampão de isolamento de vesículas (VIB; 20 mM de MES, 2 mM de 324 CaCl2, 0,01 M de NaCl, pH 6,0) com uma seringa sem agulha. As folhas foram então colocadas dentro de uma seringa sem agulha de 20 ml. A seringa foi então colocada em 50 ml de Falcon e centrifugada a 900 g por 15 minutos. O fluido apoplástico (APF) foi coletado e centrifugado subsequentemente a 2.000g e 10.000g por 30 minutos para se livrar de quaisquer detritos celulares e, em seguida, passado através de um filtro de 0,45 µm. O APF foi ainda submetido à etapa de ultracentrifugação a 40.000 g para a fração de EV de pélete (P40). A pélete foi ressuspensa em 2 ml de 20 µM de tampão Tris pH = 7,5. O sobrenadante foi então submetido à etapa de ultracentrifugação a 100.000 g para a fração de EV de pélete (P100). O sobrenadante desta etapa foi restaurado (SN). Medidas de abertura estomática
[00214] As plantas foram mantidas sob luz (100 μE/m2/s) por pelo menos 3 horas antes de serem submetidas a qualquer tratamento para assegurar a expansão total dos estômatos. Seções de folhas intactas de três plantas com quatro semanas de idade foram dissecadas e imer- sas em água (simulação) ou suspensão bacteriana a uma concentração de 1x108 cfu/ml. Após 3 horas de tratamento, a superfície abaxial da folha não descascada foi observada sob microscópio confocal de varre- dura a laser SP5 e as fotos foram tiradas de diferentes regiões. A aber- tura estomática (largura/comprimento) foi medida usando o software ImageJ para 30 a 70 estômatos por condição. No caso de pré-tratamen- tos de RNA, as seções de folhas foram incubadas com RNAs totais ex- traídos de genótipos especificados por uma hora antes da incubação com a bactéria. Quando necessário em experiências especificadas, 1 μM de Coronatina exógena (COR) (Sigma) (50) foi suplementado à sus- pensão bacteriana. Análises de RT-PCR em tempo real
[00215] Para monitorar as transcrições codificadas por plantas, o RNA total foi extraído de amostras de plantas usando o RNeasy Plant Mini kit (Qiagen). 0,5 µg de RNA livre de DNA foi transcrito reversamente usando qScript cDNA Supermix (Quanta Biosciences). O cDNA foi en- tão amplificado por reações de PCR em tempo real usando Takyon SYBR Green Supermix (Eurogentec®) e iniciadores específicos de transcrição. A expressão foi normalizada para a da Ubiquitina. Para mo- nitorar as transcrições bacterianas, o RNA total foi extraído de amostras de plantas infectadas com bactérias ou de bactérias tratadas in vitro como descrito anteriormente. Após o tratamento com DNAse, 250 ng de
RNA total foram transcritos reversamente usando iniciadores hexâme- ros aleatórios e qScript Flex cDNA kit (Quanta Biosciences). O cDNA foi então amplificado por reações de PCR em tempo real usando Takyon SYBR Green Supermix (Eurogentec®) e iniciadores específicos de transcrição. A expressão foi normalizada para a de GyrA. O PCR foi realizado em placas de reação óptica de 384 cavidades aquecidas a 95°C por 10 minutos, seguido de 45 ciclos de desnaturação a 95°C por 15 segundos, revenimento a 60°C por 20 segundos e alongamento a 72°C por 40 segundos. Uma curva de fusão foi realizada no final da amplificação por etapas de 1°C (de 95°C a 50°C). Síntese in vitro de RNAs de repetição invertida (IR)
[00216] A síntese in vitro de RNAs foi gerada seguindo as instruções do kit MEGAscript® RNAi (Life Technologies, Carlsbad, CA). Modelos como foram amplificados por PCR introduzindo o promotor T7 em am- bas as extremidades 5' e 3' da sequência. A amplificação por PCR foi feita em duas etapas com duas temperaturas de revenimento diferentes para aumentar a especificidade do revenimento de iniciadores. Após a etapa de amplificação, os produtos de PCR foram purificados por extra- ção em gel, graças a NucleoSpin® Gel e kit PCR Clean-up (Macherey- Nagel) para eliminar qualquer amplificação do parasita. Esses produtos de PCR purificados foram então usados como modelos para transcrição in vitro: 2 µg foram incubados por cinco horas a 37°C com 2 µL de poli- merase T7 (Mistura de enzimas T7), 2 µL de Tampão de Reação T7 10X e 2 µL de cada 75mM de ATP, CTP, GTP e UTP. O volume total é ajus- tado para 20 µL com água livre de nuclease. Após a reação de transcri- ção, os dsRNAs foram tratados com 2 µL de DNaseI, 2 µL de RNase, 5 µL de tampão de reação 10X para eliminar modelos de DNA e RNAs de fita simples. Em seguida, os dsRNAs são purificados com os cartuchos de filtro fornecidos com o kit. dsRNA longo obtido nesta etapa é usado para as seguintes experiências (Figura 1). Os siRNAs foram obtidos gra- ças a ShortCut® RNase III (NEB, Ipswich, MA). Os dsRNAs foram dige- ridos por 20 minutos com RNaseIII e depois purificados graças a mir- Vana™ miRNA Isolation Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA). Após a purificação, siRNAs são usados para as seguintes experiências (Figura 1). Cada etapa do processo foi seguida por eletroforese em gel (TAE 1X, 1% de gel de agarose para amplificação de DNA e 2% de gel de agarose para RNAs) para verificar a qualidade dos RNAs. Ensaio microfluídico com base em gotículas para o monitoramento do crescimento de Pto DC3000 in vitro
[00217] Experiências microfluídicas com base em gotículas foram re- alizadas em meio NYGB a uma temperatura de 28°C. Os ensaios de RNAi foram preparados pipetando diretamente na placa de 96 cavida- des as soluções diferentes para obter 200 µl final: 100 µl de meio, 20 µl de um Pto DC3000 marcado com GFP (Pto DC3000-GFP) a 107 cfu/ml, 20 µl de siRNAs candidatos sintetizados in vitro para obter uma concen- tração final de 2 ng/µl de água estéril para a amostra de controle seguida por 60 µl de meio. No caso da mistura de diferentes RNAs, uma propor- ção v/v dos diferentes RNAs foi preparada e 20 µl da mistura foram adi- cionados às cavidades correspondentes. A placa de 96 cavidades foi colocada na máquina para que as amostras fossem fracionadas em go- tículas pelo Analisador Millidrop (http://www.millidrop.com). Para cada cavidade, 10 gotículas de ~500nl cada foram formadas e incubadas dentro do instrumento por 24 horas. Para cada gotícula, as medições de biomassa e fluorescência de GFP foram adquiridas a cada ~30 minutos. EXEMPLO 2. siRNAs codificados por Arabidopsis direcionados a fatores de virulência endógenos ou genes repórter artificiais de Pto DC3000 desencadeiam seu silenciamento no contexto de infecção bacteriana
[00218] Para testar se RNAs pequenos codificados pelo hospedeiro poderiam alterar a expressão do gene bacteriano, foram geradas plan- tas transgênicas estáveis de Arabidopsis que expressam constitutiva- mente uma repetição invertida quimérica trazendo homologia de se- quência com o gene HrpL do fator sigma da família ECF e a biossíntese de coronatina (COR), gene Cfa6, ambos os quais codificam determinan- tes virulentos chave de Pto DC3000 (Figura 1A, (51, 52)). Como contro- les negativos, também foram geradas linhagens transgênicas que supe- rexpressam uma repetição invertida trazendo homologia de sequência com três genes do citocromo P450 lanosterol C-14α-desmetilase (CYP51) do fungo F. graminearum, que anteriormente foi mostrado que confere proteção total contra este fitopatógeno fúngico em Arabidopsis e barley (20,21). Essas linhas transgênicas estáveis são referidas como IR-CFA6/HRPL e IR-CYP51 (ou CV, plantas de vetor de controle), res- pectivamente; e não exibem qualquer defeito de desenvolvimento (Fi- gura 1B), apesar do alto acúmulo de siRNAs artificiais (Figura 1C). Para investigar se os siRNAs artificiais direcionados contra Cfa6 e HrpL po- dem interferir na expressão desses fatores de virulência durante a in- fecção bacteriana, foram inoculadas por imersão as plantas transgêni- cas acima com Pto DC3000 e foi monitorado ainda os níveis de mRNA de Cfa6 e HrpL por análises de RT-qPCR.
Enquanto os níveis de mRNA de Cfa6 foram moderadamente alterados em duas das três linhagens independentes de IR-CFA6/HRPL em comparação com plantas Col-0, os níveis de transcritos de HrpL foram reduzidos de forma reprodutível em todas as três linhagens de IR-CFA6 / HRPL em comparação com plantas Col-0 neste momento (Figura 1D). Ao contrário, a regulação ne- gativa de mRNAs de Cfa6 ou HrpL não foi observada em plantas infec- tadas com IR-CYP51- versus Col-0 (Figura 1D), apoiando um efeito es- pecífico desses RNAs antibacterianos neste processo regulatório.
Simi- larmente, o nível de mRNA do gene ProC não direcionado não foi alte- rado em ambas as linhagens infectadas com IR-CFA6/HRPL e IR-
CYP51 em comparação com as plantas infectadas com Col-0 (Figura 1D). Coletivamente, esses dados indicam que a repetição invertida de IR-CFA6/HRPL codificada por Arabidopsis pode, pelo menos, desenca- dear o silenciamento específico de sequência do transcrito HrpL bacte- riano no contexto da infecção.
[00219] Como a expressão de fatores de virulência de HrpL e Cfa6 é conhecida por ser regulada por várias pistas ambientais (52, 53), tam- bém foi testado se AGS poderia ser eficaz contra o operon Photorhab- dus luminescens luxCDABE cromossomicamente expresso em Pto DC3000 sob o promotor de canamicina constitutivo (54). A cepa Pto DC3000 marcada com lux emite espontaneamente luminescência por- que coexpressa os genes luxA e luxB dos componentes catalíticos da luciferase junto com os genes necessários para a produção de subs- trato, ou seja, luxC, luxD e luxE (55). Duas linhagens transgênicas inde- pendentes de Arabidopsis, linhagens IR-LuxA/LuxB, superexpressando siRNAs anti-luxA e anti-luxB foram selecionados e infiltrados com se- ringa com a cepa Pto DC3000 marcada com lux (Figura 2A/B). Os níveis de mRNAs de luxA e luxB, bem como a atividade de luminescência, fo- ram posteriormente monitorados 24 horas após a inoculação (hpi). Ao fazer isso, encontrou-sefoi encontrada uma redução significativa na abundância de mRNA luxA e luxB, bem como na atividade de lumines- cência em IR-LuxA/LuxB em comparação com plantas infectadas com Col-0 (Figura 2C). Ao contrário, o crescimento da cepa repórter bacte- riana permaneceu inalterado nas linhagens de IR-LuxA/LuxB em com- paração com as plantas Col-0 nessas condições (Figura 2D), indicando que os efeitos acima não foram devidos a uma diminuição do título bac- teriano nessas plantas transgênicas. Em conjunto, esses dados indicam que o AGS é eficaz contra genes bacterianos responsivos ao estresse endógeno e genes repórter bacterianos constitutivos exógenos durante a infecção por Pto DC3000.
EXEMPLO 3. siRNAs codificados por hospedeiro direcionados contra Cfa6 e HrpL previnem a reabertura estomática induzida por Pto DC3000, presumivelmente pela supressão da biossíntese de coronatina.
[00220] Como o Cfa6 e o HrpL são conhecidos por se regularem (53) e porque o HrpL e o Cfa6 são essenciais para a biossíntese de corona- tina (COR) (52, 53), foi investigado a seguir se as plantas IR- CFA6/HRPL poderiam ser protegidas das respostas de virulência de- pendentes de COR. Para este propósito, foi monitorada a reabertura estomática desencadeada por Pto DC3000 3 horas após a inoculação (3 hpi), um fenótipo que é totalmente dependente da biossíntese de COR e, portanto, abolido após inoculação com mutantes de Pto DC3000 que são deletados em genes Cfa6 ou HrpL (Figura 3A , (50)). É digno de nota que este fenótipo não é dependente de efetores do tipo III neste ponto de infecção porque uma resposta de reabertura estomática nor- mal foi observada após o tratamento com o mutante Pto DC3000 hrcC (Figura 3A, (50)), que é prejudicado na montagem do sistema de secre- ção do tipo III. Significativamente, foi descoberto que a reabertura esto- mática induzida por Pto DC3000 foi totalmente abolida nas três linha- gens transgênicas independentes de IR-CFA6/HRPL infectadas com a cepa Pto DC3000 virulenta em comparação com as folhas infectadas com Col-0 (Figura 3B), imitando assim o fenótipo observado em folhas Col-0 inoculadas com as cepas deletadas de cfa6 ou hrpl de Pto DC3000 (Figura 3A). Ao contrário, uma reabertura estomática normal induzida por Pto DC3000 foi observada em plantas infectadas por IR- CYP51 (Figura 3C), indicando que o efeito observado é específico para siRNAs direcionados aos genes Cfa6 e HrpL. Além disso, o fenótipo de reabertura estomática comprometido detectado em pla+ntas transgêni- cas infectadas por IR-CFA6/HRPL foi totalmente resgatado após a apli- cação exógena de COR (Figura 3B). Estes dados fornecem, portanto,
evidência farmacológica de que a patogênese reduzida de Pto DC3000 manifestada em estômato de IR-CFA6/HRPL infectado é provavelmente causada por uma capacidade alterada das células bacterianas circun- dantes e / ou associadas para produzir COR. EXEMPLO 4. Plantas transgênicas estáveis de Arabidopsis que ex- pressam RNAs pequenos contra fatores de virulência chave de Pto DC3000 ou Xanthomonas campestris pv. campestris são protegi- das de infecções bacterianas
[00221] Para monitorar também os efeitos possíveis que siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL podem ter na patogenicidade de Pto DC3000, foi monitorado a seguir, a capacidade desta bactéria de se disseminar na vasculatura da folha de plantas transgênicas de IR-CFA6/HRPL de Ara- bidopsis. Para este propósito, marcou-se o número de disseminação bacteriana ocorrendo em três sítios da veia média de folhas individuais inoculadas com uma cepa virulenta de Pto DC3000 marcada com GFP (Pto DC3000-GFP). Usando este método de quantificação, observou-se um índice de propagação bacteriana que foi significativamente diminu- ído nas três linhagens transgênicas de IR-CFA6/HRPL independentes em comparação com as plantas Col-0 (Figura 4A). Isso sugere que os siRNAs direcionados a Cfa6 e HrpL podem atingir os vasos do xilema e diminuir ainda a atividade de virulência de Pto DC3000 na vasculatura da folha de Arabidopsis. Ao contrário, uma disseminação vascular nor- mal de Pto DC3000 foi observada na linhagem transgênica de IR- CYP51 em comparação com folhas infectadas por Col-0 (Figura 4A), aumentando um efeito específico de siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL neste processo. Coletivamente, esses resultados indicam que os siRNAs di- recionados aos determinantes de patogenicidade Cfa6 e HrpL podem restringir especificamente a disseminação de Pto DC3000 na vascula- tura da folha de Arabidopsis. Um efeito de proteção aumentado contra doenças vasculares para a bactéria Gram-negativa de Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) também foi encontrado em plantas transgênicas de Arabidopsis superexpressando siRNAs contra os fato- res de virulência HrpX, HrpG e RsmA (Figura 5, dados não mostrados, (56-60)). Isso demonstra que o AGS pode, adicionalmente, ser usado para proteger as plantas contra esse patógeno vascular bacteriano bem caracterizado de Arabidopsis, que é o agente causal da podridão negra, uma das doenças mais devastadoras das culturas de crucíferas em todo o mundo (25, 61).
[00222] Em seguida, foi investigadoinvestiga-se se a expressão es- tável de siRNAs contra Cfa6 e HrpL também poderia impactar o cresci- mento de Pto DC3000 em planta, um fenótipo conhecido por ser depen- dente de COR e de um sistema de secreção tipo III funcional (52). Para este fim, inoculou-se por imersão plantas IR-CFA6/HRPL, IR-CYP51 e WT com Pto DC3000 e posteriormente foi monitorado o título bacteriano a 48 hpi. Usando este ensaio, encontrou-se uma redução significativa no título de Pto DC3000 nas três linhagens transgênicas independentes IR-CFA6/HRPL em comparação com plantas infectadas com Col-0, e este fenótipo foi reminiscente ao observado em plantas WT infectadas com uma cepa deletada de cfa6 (Figura 4C). Curiosamente, observou- se adicionalmente uma redução dos sintomas de doença de embebi- mento em água induzido por Pto DC3000 nas três plantas independen- tes IR-CFA6/HRPL em comparação com plantas infectadas com WT em 24 hpi, que se assemelham ao fenótipo observado em folhas WT inocu- ladas por imersão com a cepa mutante cfa6 (Figura 4D). Ao contrário, o crescimento bacteriano e os sintomas da doença de embebimento em água não foram alterados em plantas transgênicas IR-CYP51 inocula- das por imersão com Pto DC3000 (Figura 4C/D), indicando que os efei- tos acima são específicos para siRNAs direcionados contra os genes Cfa6 e HrpL. Em conjunto, estes dados suportam ainda um papel im- portante para siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL na redução da atividade de virulência de Pto DC3000 no contexto da infecção. Eles também forne- cem evidências convincentes de que AGS é uma estratégia eficaz que pode ser usada para controlar a patogenicidade bacteriana em plantas transgênicas estáveis. EXEMPLO 5. Liberação exógena de RNAs totais derivados de plan- tas IR-CFA6/HRPL protegem plantas de WT Arabidopsis e tomate contra Pto DC3000
[00223] O RNAi ambiental é um fenômeno pelo qual (micro)organis- mos podem captar RNAs externos do ambiente, resultando no silencia- mento de genes contendo homologias de sequência aos gatilhos de RNA (24). Este processo com base em RNA foi inicialmente caracteri- zado em C. elegans (26-29), e foi ainda constatado operar em outros nematódeos, mas também em insetos, plantas e fungos (26, 30). No entanto, esse método nunca foi usado contra um fitopatógeno bacteri- ano que precisa de um mecanismo de RNAi do tipo eucariótico canô- nico, como Pto DC3000. Para testar essa possibilidade, primeiro ava- liou-se se os RNAs expressos de plantas IR-CFA6/HRPL poderiam de- sencadear o silenciamento dos genes Cfa6 e HrpL em condições in vi- tro. Para esse propósito, extraiu-se RNAs totais de plantas CV e IR- CFA6/HRPL, incubou-se com células Pto DC3000 e analisou-se poste- riormente por RT-qPCR os níveis de mRNAs de Cfa6 e HrpL 4 e 8 horas após os tratamentos de RNA. Os resultados dessas análises divulgaram um acúmulo reduzido de ambos os fatores de virulência de RNAs após o tratamento com extratos de RNA de plantas IR-CFA6/HRPL, um efeito molecular que não foi observado com extratos de RNA derivados de plantas CV (Figura 6A). Ao contrário, o nível dos mRNAs de ProC e RpoB não direcionados permaneceu inalterado nas mesmas condições (Figura 6A). Esses dados, portanto, implicam que RNAs antibacterianos de plantas são provavelmente absorvidos por células Pto DC3000 e,
subsequentemente, desencadeiam o silenciamento de específico de se- quência dos genes Cfa6 e HrpL.
Também sugere que a aplicação exó- gena desses RNAs antibacterianos pode ser usada como uma estraté- gia para amortecer a patogênese do Pto DC3000 em plantas Col-0. Para testar essa hipótese intrigante, foram tratados tecidos de folhas de Ara- bidopsis Col-0 com extratos de RNA total de plantas IR-CFA6/HRPL por uma hora, posteriormente foi desafiado com Pto DC3000 por 3 horas, e foram monitorados eventos de reabertura estomática induzida por bac- térias.
Surpreendentemente, foi descoberto que os extratos de RNA de plantas IR-CFA6/HRPL suprimiram totalmente a capacidade de Pto DC3000 para reabrir estômatos (Figura 6B), imitando assim o fenótipo observado em plantas transgênicas IR-CFA6/HRPL infectadas (Figura 3). Além disso, foi investigado se este método poderia ser usado para controlar o crescimento de Pto DC3000 em planta.
Para este propósito, primeiro pré-tratamos plantas Col-0 de Arabidopsis por uma hora com extratos de RNA total de plantas IR-CFA6/HRPL e posteriormente as foi inoculado por imersão com Pto DC3000. Foi descoberto que esses ex- tratos de RNA desencadearam uma diminuição do título de Pto DC3000 em 2 dpi (Figura 6C), um fenótipo que era comparável aos observados em plantas transgênicas IR-CFA6/HRPL infectadas (Figura 4C), bem como em plantas Col-0 inoculadas com a cepa PtoΔcfa6 (Figura 6C). Ao contrário, a aplicação de extratos de RNA total de plantas CV não alterou o crescimento de Pto DC3000 nas mesmas condições (Figura 6C), apoiando um efeito específico de RNAs antibacterianos neste pro- cesso.
Para avaliar se esse método de biocontrole com base em RNA também poderia ser eficaz em plantas cultivadas, repetimos o mesmo ensaio em tomate (Solanum lycopersicum, cultivar Moneymaker), que é o hospedeiro natural de Pto DC3000. O pré-tratamento de folhas de to- mate WT por uma hora com extratos de RNA de plantas IR-CFA6/HRPL levou a sintomas de doença necrótica induzida por Pto DC3000 com- prometida e também a uma redução no conteúdo bacteriano em com- paração com folhas pré-tratadas com extratos de RNA derivados de CV plantas (Figura 6D-F). Coletivamente, esses dados fornecem evidências de que a aplicação externa de RNAs antibacterianos derivados de plan- tas podem desencadear AGS e proteção contra doenças contra Pto DC3000 em Arabidopsis e tomate. EXEMPLO 6. Espécies de RNA pequeno, mas não seus precursores de dsRNA, são causais para o fenótipo de reabertura estomática comprometido observado após a aplicação exógena de RNAs to- tais derivados do grampo de cabelo IR-CFA6/HRPL
[00224] Em seguida, foram interrogados quais entidades de RNA são responsáveis pela redução de AGS e patogênese mediante aplicação externa de RNAs antibacterianos. Para resolver esta questão, primeiro foi cruzado a linhagem de referência IR-CFA6/HRPL # 4 com o mutante triplo dcl2-1 dcl3-1 dcl4-2 (dcl234) e posteriormente selecionamos plan- tas F3 que eram homozigotas para as três mutações dcl e para o trans- gene IR-CFA6/HRPL. A caracterização molecular dessas plantas IR- CFA6/HRPL #4 x dcl234 divulgou um acúmulo realçado de transcritos de repetição invertida de IR-CFA6/HRPL (isto é, dsRNAs não processa- dos) em comparação com o nível detectado na linhagem parental de IR- CFA6/HRPL # 4 (Figura 7A ). Além disso, este efeito foi associado a níveis indetectáveis de siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL (Figura 7A). Esses dados são, portanto, consistentes com um papel de DCL2, DCL3 e DCL4 na biogênese desses iRNAs por meio do processamento da re- petição invertida de IR-CFA6/HRPL. Subsequentemente, extraiu-se RNAs totais dessas plantas, incubou-se com células Pto DC3000 por 8 horas e foram monitorados os níveis de mRNA de Cfa6 e HrpL por aná- lise de RT-qPCR. Usando este ensaio in vitro, foi descoberto que os extratos de RNA de plantas IR-CFA6/HRPL #4 x dcl234 não eram mais capazes de desencadear a regulação negativa de mRNAs de Cfa6 e HrpL (Figura 7B), apesar do alto acúmulo de precursores dsRNA artifi- ciais (Figura 7A). Ao contrário, os extratos de RNA da linhagem parental de IR-CFA6/HRPL #4, que contém altos níveis de siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL (Figura 7A), desencadeou o acúmulo reduzido de ambos os fatores de virulência direcionados (Figura 7B). Além disso, enquanto ex- tratos de RNA de plantas IR-CFA6/HRPL #4 suprimiram eventos de re- abertura estomática induzida por Pto DC3000, foi descoberto que extra- tos de RNA de plantas IR-CFA6/HRPL # 4 x dcl234 foram inativos neste processo, como extratos de RNA de controle derivados de plantas Col- 0 ou dcl234 (Figura 7C, dados não mostrados). Coletivamente, esses dados fornecem evidências convincentes de que dsRNAs produzidos a partir da repetição invertida de IR-CFA6/HRPL não estão envolvidos na AGS nem na redução da patogênese.
Em vez disso, sugeriram que RNAs pequenos são provavelmente as entidades de RNA antibacteria- nas responsáveis por esses fenótipos moleculares e fisiológicos.
Para verificar essa suposição, purificamos ainda espécies de RNA de RNAs totais pequenos de plantas IR-CFA6/HRPL usando um método com base em filtro de fibra de vidro (Figura 7D), e os submetemos ao ensaio de reabertura estomática.
Ao fazer isso, foi descoberto que essas espé- cies de RNA pequeno suprimiram a reabertura estomática desencade- ada por Pto DC3000, na mesma medida que os extratos de RNA total de plantas IR-CFA6/HRPL (Figura 7E). Ao contrário, as espécies de RNA longo (acima de 200 bp), que não foram filtradas através das colu- nas acima, estavam inativas (Figura 7E), apoiando ainda mais que os dsRNAs de plantas antibacterianas não estão envolvidos nesta res- posta.
De um modo geral, esses dados fornecem evidências sólidas de que siRNAs dependentes de DCL produzidos a partir da repetição in- vertida de IR-CFA6/HRPL são críticos para AGS e redução da patogê- nese, enquanto precursores de dsRNA cognatos são ineficazes para ambos os processos. EXEMPLO 7. Uma versão resiliente de RNA pequeno bacteriana- mente expresso de HrpL é insensível ao silenciamento direcionado por siRNA e exibe um fenótipo de reabertura estomática normal in- dicando que siRNAs anti-HrpL são causais para AGS e redução de patogênese
[00225] Embora as descobertas acima indiquem que a aplicação ex- terna de siRNAs pode desencadear AGS e atividade antibacteriana, eles não demonstram firmemente que essas entidades de RNA são cau- sais desses fenômenos. Para resolver esse problema, decidimos gerar e caracterizar bactérias recombinantes que expressam uma versão re- siliente de siRNA do gene HrpL, que foi submetido à regulação de AGS em condições in vitro e em planta (Figuras 1 e 6). Para este fim, com- plementamos o mutante PtoΔhrpL com um transgene WT HrpL ou uma versão mutada, mut HrpL que contém tantas mutações silenciosas quanto possível na região direcionada de siRNA, que se prevê alterar a ligação de siRNAs com o mRNA de HrpL, mas para produzir a mesma sequência de proteínas. Além disso, para avaliar o controle regulatório pós-transcricional que os siRNAs anti-HrpL podem exercer sobre esses transgenes bacterianos, nós os expressamos sob o promotor constitu- tivo da neomicina fosfotransferase II (NPTII). As duas bactérias recom- binantes resultantes são referidas como PtoΔhrpL WT HrpL e PtoΔhrpL mut HrpL, respectivamente, e descobriu-se restaurarem a capacidade de reabrir estômatos quando inoculados em plantas Col-0 (Figura 8A, dados não mostrados), indicando que ambos os transgenes são funcio- nais. Avaliou-se ainda a sensibilidade de cada bactéria recombinante ao AGS. Para este propósito, incubou-se as cepas PtoΔhrpL WT HrpL e PtoΔhrpL mut HrpL com extratos de RNA total de plantas CV e IR- CFA6/HRPL #4 por 8 horas e monitoramos os níveis de mRNA do trans-
gene HrpL por análise de RT-qPCR.
Encontrou-se uma diminuição sig- nificativa no acúmulo de mRNAs de HrpL expressos da cepa PtoΔhrpL WT HrpL, que não foi detectada no tratamento com extratos de RNA de controle de plantas CV (Figura 8B). Estes dados indicam que o trans- gene WT HrpL expresso a partir da cepa PtoΔhrpL WT HrpL é total- mente sensível a AGS, apesar de sua expressão constitutiva direcio- nada para o promotor NPTII.
Ao contrário, o acúmulo de mRNAs de HrpL expresso a partir da cepa PtoΔhrpL mut HrpL foi inalterado em resposta aos extratos de RNA de plantas IR-CFA6/HRPL #4 (Figura 8B), indicando que os siRNAs não exercem mais seu efeito AGS em relação a esta bactéria recombinante.
Coletivamente, esses resultados demons- tram que os siRNAs anti-HrpL são causais para o silenciamento pós- transcricional do gene do fator de virulência HrpL dentro das células Pto DC3000. Em seguida, foi investigado a capacidade de resposta de cada cepa bacteriana recombinante à redução da patogênese direcionada por siRNA, explorando o ensaio de reabertura estomática induzida por Pto DC3000, que é altamente sensível à ação de RNA pequeno.
Para avaliar o efeito específico de siRNAs para a supressão da função de reabertura estomática mediada por HrpL, primeiro clonamos uma repe- tição invertida IR-HRPL alvejando a mesma região de sequência HrpL que aquela direcionada pelo grampo de cabelo IR-CFA6/HRPL, e vali- damos também sua capacidade de produzir siRNAs de HrpL sobre transformação transitória mediada por Agrobacterium em folhas de Ni- cotiana benthamiana (Figura 8C). Extratos de RNA total de N. bentha- miana contendo siRNAs anti-HrpL foram constatados suprimir total- mente a capacidade de Pto DC3000 para reabrir estômatos (Figura 8D). É importante ressaltar que resultados similares foram obtidos quando os extratos de RNA de N. benthamiana contendo siRNAs anti-HrpL fo- ram incubados com a cepa PtoΔhrpL WT HrpL (Figura 8D), suportando uma sensibilidade desta cepa bacteriana à ação do siRNA.
Ao contrário,
a cepa PtoΔhrpL mut HrpL era totalmente competente na reabertura dos estômatos nas mesmas condições (Figura 8D), indicando que os siR- NAs anti-HrpL não exercem mais seus efeitos antibacterianos em rela- ção a esta cepa bacteriana recombinante. Esses dados fornecem, por- tanto, evidências de que os siRNAs anti-HrpL são causais para a su- pressão da função de reabertura estomática mediada por HrpL. Eles também validam ainda um novo papel de HrpL na reabertura estomática induzida por bactérias, indicando que AGS pode ser usado como uma ferramenta para caracterizar a função do gene bacteriano. EXEMPLO 8. O fluido apoplástico de plantas IR-CFA6/HRPL é com- posto por siRNAs antibacterianos funcionais que são embutidos em EVs e protegidos da ação da nuclease microcócica, ou em uma forma livre e sensível à digestão da nuclease microcócica
[00226] Os resultados das análises fenotípicas descritas nos EXEM- PLOS 3 e 4 implicam que espécies de RNA pequeno que são constitu- tivamente expressas em linhagens transgênicas IR-CFA6/HRPL devem ser externalizadas das células vegetais para a superfície da folha, o am- biente apoplástico e os vasos do xilema, a fim de atingir o epífito e po- pulações bacterianas endofíticas. Para obter alguns critérios sobre os mecanismos de tráfico de RNA pequeno que podem estar implicados neste fenômeno, primeiro extraiu-se o fluido apoplástico (APF) de plan- tas IR-CFA6/HRPL e testamos sua capacidade de amortecer a patogê- nese bacteriana, monitorando seu impacto na reabertura estomática in- duzida por Pto DC3000. Verificamos que este fluido extracelular desen- cadeou uma supressão total da reabertura estomática durante a infec- ção, mimetizando assim o efeito desencadeado por RNAs totais deriva- dos de IR-CFA6/HRPL (Figura 9A). Ao contrário, o APF de plantas IR- CYP51 era inativo, apoiando um efeito específico de siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL do AFP de plantas IR-CFA6/HRPL neste processo (Figura
9A). Testamos ainda se EVs de plantas IR-CFA6/HRPL podem contri- buir para AGS. Para tanto, recuperamos APF de plantas IR-CFA6/HRPL e, posteriormente, realizamos ultracentrifugação diferencial a 40.000g ou 40.000g seguida de 100.000g, o que nos permitiu coletar duas fra- ções, denominadas P40 e P100, respectivamente. Curiosamente, foi descoberto que ambas as frações foram capazes de suprimir a reaber- tura estomática, embora P100 tenha sido moderadamente menos eficaz neste processo (Figura 9B). É importante ressaltar que ambas as fra- ções permaneceram ativas na presença de nuclease microcócica (Mnase), indicando que RNAs pequenos são protegidos da degradação externa quando incorporados em EVs. Curiosamente, também notamos que a fração sobrenadante (SN), recuperada após a centrifugação se- quencial a 40.000g e 100.000g, exibiu forte atividade antibacteriana, apesar da falta de EVs canônicas detectadas nesta fração (Figura 9B, dados não mostrados). Isso sugere que RNAs pequenos livres de EV que estão associados a proteínas e / ou em uma forma livre também podem ser competentes para AGS. Para determinar qual das duas pe- quenas entidades de RNA poderia possuir tal atividade antibacteriana, tratamos as frações SN de plantas IR-CFA6/HRPL com Mnase ou pro- teinase K e posteriormente as submetemos ao ensaio de reabertura es- tomática.
[00227] Curiosamente, foi contastado que o tratamento com Mnase anulou o efeito antibacteriano desencadeado pela fração SN derivada de IR-CFA6/HRPL, enquanto uma atividade antibacteriana inalterada foi detectada na presença de proteinase K, que degradou globalmente as proteínas (Figura 9B, dados não mostrados). Coletivamente, esses da- dos indicam que RNAs pequenos antibacterianos funcionais livres de EV são improváveis de estar associados a proteínas e, portanto, são referidos aqui como RNAs pequenos extracelulares livres ou "efsRNAs". Nossos resultados também indicam que efsRNAs são sensíveis à ação da Mnase porque perderam seu efeito antibacteriano após o tratamento com esta nuclease (Figura 9B). Com base nessas descobertas, propo- mos que o APF de plantas IR-CFA6/HRPL seja composto por pelo me- nos três populações de RNAs pequenos antibacterianos funcionais, que são 1) embutidos em grandes EVs (fração P40), 2) embutidos em EVs de menores tamanho (fração P100), ou 3) em uma forma livre. EXEMPLO 9. A síntese in vitro de RNAs pequenos é um método fácil, rápido e confiável para a avaliação de RNAs pequenos candi- datos que possuem atividades antibacterianas.
[00228] A fim de desenvolver uma plataforma de avaliação para a identificação de RNAs pequenos candidatos com atividades antibacteri- anas, nosso objetivo foi produzir siRNAs sintetizados in vitro contra transcritos de genes bacterianos específicos e testar ainda mais suas atividades na patogenicidade ou sobrevivência bacteriana. Para este fim, primeiro decidimos gerar siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL sintetizados in vitro alvejando as mesmas sequências que os siRNAs de planta pro- duzidos a partir do processamento dependente de DCL de IR- CFA6/HRPL. Para fazer isso, usamos iniciadores transportando se- quências de promotor T7 para amplificar DNA de CYP51 ou CFA6/HRPL de plasmídeos contendo as sequências IR-CYP51 ou IR- CFA6/HRPL. Os produtos de PCR resultantes foram purificados em gel e subsequentemente usados como modelos para a transcrição de RNA in vitro usando uma polimerase de RNA T7, que levou à produção de dsRNAs de CYP51 ou CFA6/HRPL de tamanho esperado (Figura 10A). Os RNAs pequenos foram obtidos ainda por digestão destes dsRNAs em siRNAs de 18 a 25 bp usando oShortCut® RNase III, embora outra RNase III não comercial também possa ser usada para este processo (dados não mostrados). Como divulgado por eletroforese em gel de aga- rose, esses siRNAs foram privados de dsRNA (Figura 10A), indicando que a RNase III usada nessas experiências processou totalmente o agrupamento inicial de moléculas de dsRNA. Nós, a seguir analisou-se a capacidade do dsRNA e siRNAs sintéticos de suprimir a reabertura estomática. Consistente com nossos dados anteriores mostrando que dsRNAs de plantas são inativos no desencadeamento de AGS (Figura 7), foi descoberto que dsRNAs de CFA6/HRPL sintetizados in vitro não interferiram na reabertura estomática induzida por Pto DC3000, nem dsRNAs de CYP51 sintetizados in vitro, que foram usados como contro- les negativos (Figura 10B). Ao contrário, siRNAs sintetizados in vitro di- recionados contra Cfa6 e HrpL preveniram a reabertura estomática in- duzida por Pto DC3000, enquanto siRNAs anti-CYP51 sintetizados in vitro foram inativos neste processo (Figura 10B). O último resultado su- geriu que os siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL sintetizados in vitro eram pro- vavelmente capazes de desencadear o silenciamento dos genes Cfa6 e HrpL. Para testar esta hipótese, incubou-se ainda os siRNAs de CYP51 e CFA6/HRPL sintetizados in vitro a uma concentração de 2 ng/ul com 1 x 107 cfu/ml de Pto DC3000 por 6 horas e monitoramos posteriormente os mRNAs de Cfa6 e HrpL por análises de RT-qPCR. Ao fazer isso, foi descoberto que os siRNAs anti-Cfa6/HrpL desencadearam um acúmulo reduzido significativo de mRNAs de Cfa6 e HrpL em comparação com os siRNAs anti-CYP51 (Figura 10B), um efeito molecular que foi com- parável ao observado em resposta a produtos derivados de plantas RNAs totais contendo siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL (Figura 6A, 7B). Ao contrário, os níveis dos mRNAs de ProC e RpoB não direcionados per- maneceram inalterados em resposta a siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL em comparação com siRNAs anti-CYP51 (Figura 10B). Coletivamente, es- ses dados indicam que siRNAs sintetizados in vitro podem desencadear AGS e atividade antibacteriana na mesma medida que siRNAs anti-Cfa6 e anti-HrpL derivados de plantas.
[00229] Em seguida, decidiu-se determinar se este método poderia ser instrumental para a identificação de siRNAs candidatos com ativida- des bactericidas.
Para testar essa ideia, realizamos na vitrossíntese de siRNAs direcionados contra três genes conservados e de manutenção de Pto DC3000, a saber SecE (PSPTO_0613, subunidade SecE de translocase de pré-proteína, FusA (PSPTO_0623, fator de alongamento de tradução G) e subunidade GirB (PSPTO_0004, subunidade de DNA girase) e monitoramos também seu impacto sobre o crescimento dessa bactéria.
Para fazer isso, aproveitamos a vantagem de um sistema mi- crofluídico com base em gotículas estabelecido, que é adequado para as medições precisas da biomassa bacteriana e da atividade do repórter de fluorescência expressa em bactérias.
Usando este método, foi des- coberto que 0,33 ng/µl de siRNAs sintetizados in vitro direcionados con- tra FusA foi capaz de reduzir a biomassa e o sinal GFP de um Pto DC3000 marcado por GFP (Pto DC3000-GFP), em comparação com as condições na ausência de siRNAs ou na presença de siRNAs anti-SecE (Figura 10E, F). Surpreendentemente, não detectamos nenhum sinal de GFP nem biomassa bacteriana quando a cepa Pto DC3000-GFP foi in- cubada com 1 ng/ul de siRNAs anti-FusA sintetizados in vitro, nem quando siRNAs sintetizados in vitro direcionados contra GyrB foram aplicados em concentrações de 0,33 ng/µl ou 1 ng/µl (Figura 10E, F). Esses dados indicam que siRNAs direcionados contra FusA e GyrB pos- suem uma potente atividade bactericida que mimetiza o efeito que seria detectado na presença de um antibiótico.
Com base nessas experiên- cias de prova de conceito, concluímos que a síntese in vitro de siRNAs é um método fácil, rápido e confiável para a avaliação de novos RNAs pequenos candidatos com atividades antibacterianas.
Eles também di- vulgam o papel de FusA e GyrB na sobrevivência de Pto DC3000, que não havia sido relatado anteriormente para esta bactéria.
Esses resul- tados, portanto, apóiam o fato de que AGS pode ser usado como uma ferramenta para caracterizar a função do gene bacteriano.
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Claims (34)

REIVINDICAÇÕES
1. Método in vitro para inibir a expressão de pelo menos um gene em uma célula bacteriana alvo, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende a etapa de contato da referida célula bac- teriana alvo com pequenos RNAs, ou com composições contendo pe- quenos RNAs.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido RNA pequeno é um siRNA ou um miRNA que inibe especificamente a expressão de um gene bacteriano essencial ou um gene de virulência bacteriana ou um gene de resistência antibacte- riana de uma bactéria fitopatogênica.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que a referida célula bacteriana alvo é uma célula de uma bactéria fitopatogênica que é, por exemplo, escolhida entre: Ral- stonia solanacearum, Xanthomonas oryzae pathovars, Xanthomonas campestris pathovars, Xanthomonas axonopodis pathovars, Xanthomo- nas euathomovars patovars, Xanthomonas euathomovars patovars, Xanthomonas euathomovars patovars. Pseudomonas syringae patova- res, Pseudomonas viridiflava patovars, Pseudomonas savastonoi pato- vars, Candidatusliberibacter asiaticus, Candidatusliberibacter sola- nacearum, Acidovoraxcitrulli, Acidovoraxavenae patovars, patovares Pectobacteriumatrosepticum, Pectobacteriumcarotovorum patovars, Pectobacterium sp., Agrobacterium tumefaciens, Dickeya (dadantii e solani), Erwinia amylovora, Clavibactermichiganensis (michiganensis e sepedonicus), Xylella fastidiosa, Pectobacterium (carotovorum e atrosepticum), Streptomyces scabies, Phytoplasma sp. e Spiroplasma sp.
4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que a referida célula bacteriana alvo é uma célula de uma bactéria benéfica de planta, que é, por exemplo, escolhida entre:
Bacillus (por exemplo, Bacillus subtilis), Pseudomonas (por exemplo, Pseudomonas putida, Pseudomonas stuzeri, Pseudomonas fluo- rescens, Pseudomonas protegens, Pseudomonas brassicacearum), Rhizobia (por exemplo, Rhizobium meliloti), Burkholderia (por exemplo, Burkholderia phytofirmans), Azospirillum (por exemplo, Azospirillum lipoferum), Gluconacetobacter (por exemplo, Gluconacetobacter diazo- trophicus, Serratia (por exemplo, Serratia proteamaculans), Stenotroph- omonas (por exemplo, stenotrophomonas maltophilia), Enterobactéria (por exemplo, Enterobacter cloacae).
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que os referidos pequenos RNAs têm um tamanho compreendido entre 15 e 30 pares de base.
6. Uso in vitro de um pequeno RNA ou de uma composição compreendendo pequenos RNAs, para inibir a expressão de pelo menos um gene em uma célula bacteriana alvo, caracterizado pelo fato de que a referida célula bacteriana alvo é contatada diretamente com o referido pequeno RNA ou com a referida composição.
7. Uso in vitro, de acordo com a reivindicação 6, caracter- izado pelo fato de que o referido pequeno RNA é de fita simples ou du- pla.
8. Uso in vitro, de acordo com a reivindicação 6, caracter- izado pelo fato de que a referida composição contém extratos de planta obtidos de células de planta produtoras que expressam pelo menos um dsRNA longo que exibe homologias de sequência com pelo menos um gene da referida célula bacteriana.
9. Uso in vitro, de acordo com a reivindicação 8, caracter- izado pelo fato de que a referida composição contém RNAs totais, ou pequenos RNAs totais, ou fluidos apoplásticos, ou vesículas extracelu- lares, ou pequenos RNAs extracelulares livres das referidas células da planta.
10. Uso in vitro, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, ca- racterizado pelo fato de que as referidas células da planta produtora são células de plantas escolhidas no grupo que consiste em: tabaco (por exemplo, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tobaccum); taro (Colocasia esculenta); Giger (Zingiber officinale), arabidopsis (por exemplo, Ara- bidopsis thaliana); tomate (por exemplo, Lycopersicon esculentum ou Solanum lycopersicum); batata (Solanum tuberosum); arroz (Oryza sa- tiva); milho (Zea mays); cevada (Hordeum vulgare); trigo (por exemplo, Triticum aestivum, Triticum durum), caroço de algodão, algodão, feijão, banana / banana da terra, sorgo, ervilha, batata doce, soja, repolho, mandioca, cebola, melão, aveia, amendoim, girassol, óleo de palma, centeio, citrinos, trigo, pimentão, inhames, azeitonas, uvas, gergelim, cana-de-açúcar, beterraba doce, ervilha e café, laranjeiras, macieiras, citrinos, oliveiras, crisântemo, Impatiens, gerânio, pelargônio, Phlox, Ro- dodendron anthurium spp, roseira, cúrcumas, antúrio, begônia, Hibiscus rosa-sinensis, Amaryllis, Calla, ciclâmen e dracena.
11. Uso in vitro, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 6 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido RNA pequeno ou longo inibe pelo menos um gene que codifica um fator de virulência ou um gene essencial ou um gene de resistência antibacteriana se a referida célula bacteriana for patogênica ou inibir pelo menos um gene que codifica um repressor de crescimento ou um regulador negativo de uma via que é útil para o hospedeiro se a referida célula bacteriana for benéfica para o hospedeiro.
12. Método para o tratamento de plantas alvo contra infecção bacteriana, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de in- trodução em uma célula da referida planta alvo uma molécula longa de dsRNA direcionada especificamente a pelo menos um gene bacteriano de virulência ou pelo menos um gene bacteriano essencial ou pelo menos um gene antibacteriano de resistência.
13. Método para tratar plantas alvo contra infecção bacteri- ana, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de liberação de pequenos RNAs que inibem pelo menos um gene bacteriano essencial ou de virulência ou resistência antibacteriana, ou uma composição contendo tais pequenos RNAs, em tecidos de planta alvo antes de e / ou após infecção bacteriana.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a referida composição contém extratos de planta obti- dos de células da planta que expressam pelo menos um dsRNA longo que é específico para pelo menos uma virulência ou gene bacteriano essencial ou antibacteriana.
15. Método, de acordo com a reivindicação 13 a 14, carac- terizado pelo fato de que a referida composição contém fluidos apoplásticos, ou vesículas extracelulares, ou pequenos RNAs livres ex- tracelulares recuperados dos referidos extratos de planta.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que a referida composição é uma composição líquida pulverizável.
17. Vírus de RNA de planta recombinante que desencadeia a produção em planta de pequenos RNAs caracterizado pelo fato de que podem inibir a expressão de pelo menos um gene bacteriano alvo.
18. Vetor de DNA recombinante caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de polinucleotídeo de DNA que codi- fica RNAs longos que inibem a expressão de pelo menos um gene bac- teriano essencial, de virulência ou de resistência antibacteriana, em que a referida sequência de polinucleotídeo é expressável em células da planta.
19. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de que com- preende o vírus de RNA de planta recombinante, como definido na reivindicação 17, ou o vetor recombinante, como definido na reivindi- cação 18.
20. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que expressa de forma estável ou transitória uma sequência de polinucleotídeo de DNA que codifica RNAs longos que inibem a expressão de pelo menos um gene bacteriano essencial, gene bacteriano de virulência ou gene de resistência antibacteriana.
21. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que expressa de forma estável ou transitória pequenos RNAs funcionais que inibem a expressão de pelo menos um gene bacteriano essencial, gene bacteriano de virulência ou gene de resistência antibacteriana.
22. Composição fitoterápica caracterizada pelo fato de que contém uma quantidade significativa de pequenos RNAs que inibem a expressão de um gene bacteriano essencial, ou de um gene bacteriano de virulência, ou de um gene bacteriano de resistência antibacteriana.
23. Composição fitoterapêutica, de acordo com a reivindi- cação 22, caracterizada pelo fato de que contém pequenos RNAs que estão contidos em extratos de RNA total, ou vesículas extracelulares, ou fluidos apoplásticos ou extratos de RNA pequenos livres extracelula- res da planta transgênica, como definida na reivindicação 19.
24. Composição fitoterápica, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizada pelo fato de que contém ainda um composto bactericida.
25. Produto de combinação, caracterizado pelo fato de que compreende a composição fitoteterápica como definida na reivindicação 22 ou 23, e um composto bactericida.
26. Uso da composição fitoterápica, como definida nas reivindicações 22 a 24, ou do produto de combinação, como definido na reivindicação 25, para inibir ou prevenir o crescimento ou patogenicid- ade de bactérias em plantas alvo.
27. Uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias fitopatogênicas são escolhidas entre: Ralstonia solanacearum, Xanthomonas oryzae pathovars, Xanthomonas campestris pathovars, Xanthomonas axonopodis pathovars, Xanthomonas euathomovars patovars, Xanthomonas eu- athomovars patovars, Xanthomonas euathomovars patovars. Pseudo- monas syringae patovares, Pseudomonas viridiflava patovars, Pseudo- monas savastonoi patovars, Candidatusliberibacter asiaticus, Candida- tusliberibacter solanacearum, Acidovoraxcitrulli, Acidovoraxavenae pa- tovars, patovares Pectobacteriumatrosepticum, Pectobacteriumcaroto- vorum patovars, Pectobacterium sp., Agrobacterium tumefaciens, Dick- eya (dadantii e solani), Erwinia amylovora, Clavibactermichiganensis (michiganensis e sepedonicus), Xylella fastidiosa, Pectobacterium (ca- rotovorum e atrosepticum), Streptomyces scabies, Phytoplasma sp. e Spiroplasma sp.
28. Uso, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracter- izado pelo fato de que as referidas plantas alvo são escolhidas entre arroz, milho, cevada, semente de algodão, algodão, feijão, banana / ba- nana da terra, sorgo, ervilha, batata-doce, soja, repolho, mandioca, ba- tata, tomate, cebola, melão, aveia, amendoim, girassol, óleo de palma, centeio, citrino, trigo, pimenta, inhame, azeitona, uva, taro, tabaco, gergelim, cana-de-açúcar, beterraba doce, ervilha e café, laranjeira, macieira, citrino, oliveiras, crisântemo, impatiens, gerânio, pelargônio, phlox, Rododendron anthurium spp, roseira, cúrcumas, antúrio, begônia, hibiscus rosa-sinensis, amarílis, calla, ciclâmen e dracena.
29. Método para fabricar a composição fitoterápica, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que com- preende as etapas de: a) gerar uma célula de planta transgênica recombinante que produz um siRNA ou um miRNA que inibe especificamente um gene bacteriano essencial ou um gene de virulência bacteriana ou um gene de resistência antibacteriana de uma bactéria fitopatogênica, b) recuperar o extrato de células da planta, ou os RNAs totais, ou fluidos apoplásticos, ou vesículas extracelulares, ou RNAs pe- quenos livres extracelulares das referidas células da planta recom- binantes, c) opcionalmente, adicionar um excipiente ou outro princípio ativo na referida composição fitoterápica.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a referida célula da planta transgênica recombinante é derivada de tabaco (por exemplo, Nicotiana benthamiana, Nicotiana to- baccum); taro (Colocasia esculenta); giger (Zingiber officinale), Ara- bidopsis (por exemplo, Arabidopsis thaliana); tomate (por exemplo, Ly- copersicon esculentum ou Solanum lycopersicum); batata (Solanum tu- berosum); arroz (Oryza sativa); milho (Zea mays); cevada (Hordeum vul- gare); trigo (por exemplo, Triticum aestivum, Triticum durum).
31. Método, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, carac- terizado pelo fato de que a etapa a) é realizada expressando células da planta com pelo menos um dsRNA longo que é específico para o refer- ido pelo menos um gene bacteriano.
32. Método in vitro para identificar pequenos RNAs candida- tos com atividade antibacteriana, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) expressar em células da planta pelo menos um dsRNA longo que inibe pelo menos um gene bacteriano, b) contatar as referidas células da planta com um tampão de lise ou com o fluido apoplástico das referidas células da planta, c) incubar os referidos lisados ou fluido de células da planta com células bacterianas alvo, e d) avaliar a viabilidade, crescimento, atividade metabó- lica das referidas células bacterianas.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que as referidas células da planta são produzidas de folhas de tabaco.
34. Método in vitro para identificar genes candidatos que afetam a proliferação de células bacterianas, o referido método carac- terizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) gerar pequenos RNAs que inibem pelo menos um gene bacteriano, b) incubar os referidos RNAs pequenos com células bac- terianas, e c) avaliar a viabilidade, crescimento, atividade metabóli- ca das referidas células bacterianas.
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