CN104140973A

CN104140973A - 大丽轮枝菌致病相关基因VdNUC-2的功能分析及其应用

Info

Publication number: CN104140973A
Application number: CN201410369671.5A
Authority: CN
Inventors: 邓晟; 林玲; 王彩月; 张昕
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-07-28
Filing date: 2014-07-28
Publication date: 2014-11-12

Abstract

本发明涉及从大丽轮枝菌V07DF2菌株中克隆的一个参与磷酸盐吸收途径的VdNUC-2基因，该基因全长为6542个碱基(包括该基因的启动子、外显子、内含子和终止子)。根据该基因及其侧翼的核酸序列，构建了针对该基因的敲除、回补载体。利用农杆菌介导的转化方法，获得了该基因的敲除突变体和回补突变体。通过对这些转基因材料的表型观察和分析，发现VdNUC-2基因不仅控制病原菌对磷酸盐的感应和吸收，同时还影响病原菌对棉花的致病能力。另外，序列分析表明，VdNUC-2表达的蛋白质在植物和动物当中没有同源物，因此，以VdNUC-2蛋白作为杀菌剂的潜在作用靶标对于作物、动物和人都是安全、无风险的。

Description

大丽轮枝菌致病相关基因VdNUC-2的功能分析及其应用

技术领域

本发明涉及大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)致病相关基因VdNUC-2的功能分析及其潜在应用的研究，属于生物技术研究领域。

背景技术

无机磷酸盐(inorganic phosphate)是生物细胞中不可缺少的重要营养物质之一，在其被吸收后，将以磷酸化合物的形式参与生物细胞的多种关键的生理生化过程。这些过程包括遗传物质脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)和核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)的合成，细胞膜结构上磷脂类物质的合成，蛋白质的磷酸化以及一切以三磷酸腺苷(Adenosinetriphosphate，ATP)为底物的需要能量转换而完成的生化和细胞生物学反应。因此，调节和维持细胞内磷酸盐水平的稳定对于生物细胞来说显得尤为重要。

在各类真菌中，感应磷酸盐胞外浓度以及调控磷酸盐吸收的分子机理以模式菌株Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)和Neurospora crassa(粗糙脉孢霉)解析的最为透彻和深入。目前研究发现，在N.crassa中控制磷酸盐吸收的有四个基因，NUC-2，PREG，GPOV和NUC-1；而在S.cerevisiae中，有四个基因在功能上分别与之相对应，它们是PHO81，PHO80，PHO85和PHO4。PHO80是一种细胞周期蛋白，而PHO85则是细胞周期依赖的蛋白激酶。PHO85和PHO80形成复合物，通过对PHO4的超磷酸化负调控磷酸盐吸收系统(Kaffman etal.，1994)。PHO4是一个转录因子，当其抑制因子被解除后，可以激活下游参与磷酸盐吸收的各个基因的转录表达(Kang and Metzenberg，1990)。1990年，PHO81基因在酵母中被克隆；1996年，Peleg等人在N.crassa中克隆并鉴定了其同源基因NUC-2。在磷酸盐感应和吸收信号途径中，NUC-2被认为是在所有四个基因的最上游(Gras et al，2013)。当外界磷酸盐水平降低时，NUC-2通过一系列的信号作用抑制PREG-GPOV复合物(功能与PHO85-PHO80复合物相似)的活性，从而使NUC-1(功能与PHO4相似)的功能被启动，激活下游的参与磷酸盐吸收的功能基因的转录。

目前由大丽轮枝菌引起的多种经济、园艺作物的黄萎病在生产上仍为害较重，而且由于抗性品种缺乏，加之病菌定殖于作物根部和维管束系统，导致常规的防治方法很难有效控制病害。而越来越多的大丽轮枝菌致病相关基因和效应因子的发现为该病害的防治提供了潜在的、新的药物作用靶标和定向作物分子育种的技术、理论储备。

对于一部分细菌和真菌，在构建载体时，将其基因组上靶标基因两侧一定长度的同源序列进行克隆，并且将抗生素抗性基因盒连接到两者当中。利用如原生质体转化或农杆菌介导的转化方法，将这一带有同源序列的质粒导入该微生物细胞内后，细胞会在一定比例上启动核酸修复机制，而原靶标基因的核酸序列将被载体上带有抗性基因盒的序列替换，从而产生不含有靶基因的敲除突变体。而通过对敲除突变体表型的观察和检测，可以确定该基因的生物学功能及其在相关领域的应用前景。

发明内容

从大丽轮枝菌V07DF2菌株中克隆了参与磷酸盐吸收途径的VdNUC-2基因，该基因全长为6542个碱基(包括该基因的启动子、外显子、内含子和终止子，详见序列1)。根据该基因及其侧翼的核酸序列，构建了针对该基因的敲除、回补载体。利用农杆菌介导的转化方法，获得了该基因的敲除突变体和回补突变体。通过对这些转基因材料的表型观察和分析，发现VdNUC-2基因不仅控制病原菌对磷酸盐的感应和吸收，同时还影响病原菌对棉花的致病能力。另外，序列分析表明，VdNUC-2表达的蛋白质在植物和动物当中没有同源物，因此，以VdNUC-2蛋白作为杀菌剂的潜在作用靶标对于作物、动物和人都是安全、无风险的。

相关技术路线如下：

1.利用网上共享的生物信息资源，设计核酸引物，构建VdNUC-2基因的敲除载体，并将载体导入大肠杆菌和农杆菌菌株中。

2.利用网上共享的生物信息资源，设计核酸引物，构建VdNUC-2回补载体，并将载体导入大肠杆菌和农杆菌菌株中。

3.分别将敲除载体和回补载体利用农杆菌转化的方法导入到大丽轮枝菌V07DF2中，获得敲除和回补突变体。

4.观察野生型菌株以及敲除和回补突变体在磷酸盐缺陷培养基生长和侵染植物过程中的差异。

有益效果：VdNUC-2基因是大丽轮枝菌侵染棉花所需要的致病相关基因，该基因的敲除可以导致大丽轮枝菌对棉花的致病能力显著降低，加上该基因编码的蛋白在氨基酸水平上与植物和动物同源性很低，因此若针对该基因开发新的杀菌剂可以有效的控制病害，同时对作物、动物和人安全无毒。

附图说明

图1.VdNUC-2基因的敲除载体图谱

图2.VdNUC-2回补载体图谱

图3.野生型菌株以及敲除和回补突变体在磷酸盐缺陷培养基上的生长形态(V07DF2为野生菌株；6C4为T-DNA筛选突变体；NUC-2Δ5和NUC-2Δ14为两个敲除突变体菌株；NUC-2C6和NUC-2C7为两个回补突变体菌株)

图4.野生型菌株以及敲除和回补突变体对寄主棉花的致病力分析结果，平均病情指数标注在处理菌株的右侧(V07DF2为野生菌株；6C4为T-DNA筛选突变体；NUC-2Δ5和NUC-2Δ14为两个敲除突变体菌株；NUC-2C6和NUC-2C7为两个回补突变体菌株)

具体实施方式

1.VdNUC-2基因的敲除载体和回补载体的构建，并将构建好的载体用化学转化法导入农杆菌AGL-1菌株中，分别获得具有VdNUC-2基因敲除功能以及回补功能的AGL-1农杆菌各一个，具体流程描述如下：

A.利用网上共享的生物信息资源(参见：http：//www.broadinstitute.org/annotation/genome/verticillium_dahliae/MultiHome.html)，分别设计两对核酸引物，即5′侧翼扩增引物上游：GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAAGCGCTAGCAGGGTTTCTCAC；5′侧翼扩增引物下游：GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTCGTAGCACGTGGGTGTGATC；3′侧翼扩增引物上游：GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTCCAAGTCGATGGACGGTATC；3′侧翼扩增引物下游：GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTTCGTCTACACTGTTGTTCTTG。利用它们对大丽轮枝菌V07DF2的基因组DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，得到VdNUC-2基因5′和3′两侧各约1kb的序列，然后将目的条带进行纯化。将纯化好的核酸片段各20ng与各60ng的pA-Hyg-OSCAR和pOSCAR质粒(购于Fungal Genetics Stock Center)混合，并加入1μl BPII enzyme mix(购于Invitrogen)，混匀后，25℃反应16小时，获得敲除质粒VdNUC2-Del。将该质粒转化大肠杆菌，经核酸测序正确后，采用热激法将敲除质粒导入农杆菌AGL-1中，由此即得到带有VdNUC-2基因敲除功能的AGL-1农杆菌菌株。

B.利用网上共享的生物信息资源(参见：http：//www.broadinstitute.org/annotation/genome/verticillium_dahliae/MultiHome.html)，分别设计两条核酸引物，即上游：CCATGATTACGAATTCAGGACAAGTCAGGCTCGAAGGA；下游：TACCGAGCTCGAATTCGCGAAACCACAGAACAAGAATC。利用该引物对大丽轮枝菌基因组DNA进行PCR扩增，获得包括VdNUC-2基因启动子，ORF以及终止子在内的约6970bp的核酸片段。将该序列纯化，利用ClonExpress^TM II重组反应体系(购于Vazyme生物技术公司)将该片段连接至用HindIII线性化的1300-ble载体(经本实验室改造)上，获得VdNUC-2回补质粒1300-ble-Pro-VdNUC2-Ter(详见序列2)。经测序验证正确后，将该质粒导入农杆菌AGL-1中，获得具有回补功能的农杆菌菌株。

2.VdNUC-2基因的敲除突变体和回补突变体的获得

利用上一步骤中获得的具有VdNUC-2基因敲除功能以及回补功能的AGL-1农杆菌菌株分别对野生型V07DF2菌株和T-DNA突变体库筛选出来的6C4突变体进行转化，具体的转化步骤如下：大丽轮枝菌转接至液体PDA中，28℃，150rpm培养3天；含有T-DNA双元载体的农杆菌AGL-1挑取单克隆接至液体MM培养基当中(现配现用，1升超纯水中溶解：2.05g K₂HPO₄，1.45g KH₂PO₄，0.15g NaCl，0.5g MgSO₄·7H₂O，0.1g CaCl₂·6H₂O，0.0025g FeSO₄·7H₂O，0.5g(NH₄)₂SO₄和2.0g glucose)，28℃，150rpm培养2天。之后将农杆菌用IM培养基(在90ml MM培养基中加入0.5ml甘油和0.7808g MES，pH值调至5.3-5.5，并用MM定容至100ml)稀释到OD₆₀₀＝0.15，预培养6小时，然后与等体积的、浓度为1.0×10⁵孢子/ml的大丽轮枝菌孢子液混合。将混合物取适量涂布于灭菌的、置于CM固体培养基(与IM培养基相似，但葡萄糖浓度为IM培养基的一半，另外还包含200μM乙酰丁香酮)上的硝酸纤维素膜(0.45μm孔径)上，于28℃共培养48小时。之后，硝酸纤维素膜被转移至SM固体培养基上【成份与MM相同，另外包含琼脂、200μM cefotaxime和50μg/mlhygromycin B(筛选VdNUC-2敲除突变体)或25μg/ml Bleomycin(筛选VdNUC-2回补突变体)】。相同条件培养5-7天后，可见小的转化子菌落，用接种针分别挑取其孢子进行培养，经过单孢分离后以终浓度25％甘油-70℃保存。

3.大丽轮枝菌V07DF2野生菌株以及VdNUC-2敲除和回补突变体在磷酸盐缺陷培养基生长和侵染植物过程中的差异观察

A.获得敲除突变体和回补突变体后，我们将它们和野生型以及T-DNA筛选的6C4菌株一起培养于Czapek-Dox培养基、P1％培养基(其它成分与Czapek-Dox培养基相同，磷酸盐为正常浓度的1％)和P-培养基(其它成分与Czapek-Dox培养基相同，不含磷酸盐)上，培养条件为25℃，黑暗培养7天，然后测量平板上菌丝的生长直径并拍照。

B.将上述各菌株用液体PDB进行培养，摇床温度25℃，转速150rpm，一周后取其孢子，并将孢子浓度稀释至1.0×10⁷个/ml，分别对棉花苗进行灌根处理。处理后的棉花培养于25℃，12h/12h(昼/夜)周期的温室中，7-8周后分别对各处理进行病情指数调查、统计并拍照。

Claims

1.一个来源于大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的致病相关基因，命名为VdNUC-2，该基因的DNA序列包括其启动子、外显子、内含子和终止子，共计6542个碱基。

2.根据权利要求1中所述的基因核酸序列构建的VdNUC-2回补质粒。

1)利用引物对大丽轮枝菌基因组DNA进行PCR扩增，获得包括VdNUC-2基因启动子，外显子、内含子以及终止子在内的约6970bp的核酸片段。将该片段纯化，并连接至线性化的1300-ble载体上，获得VdNUC-2回补质粒。

2)经测序验证正确后，将该质粒导入农杆菌AGL-1中。