CN107860774A - 一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法 - Google Patents

一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，属于蔬菜生物技术育种技术领域，包括以下步骤：将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌固态接种侵染黄瓜子叶节外植体；将侵染的外植体置于共培养基上黑暗培养；共培养结束后，切除外植体2/3的子叶，仅保留外植体的子叶节区，再浸没于GUS染色液中染色、脱色；根据GUS组织化学染色部位和染色面积进行染色分级，确定归属每个GUS瞬时表达级别的外植体数目，根据式I所示公式和分级情况计算得到GUS基因瞬时表达指数，当GUS瞬时表达指数值位于区间(55.56～77.77]时，判定为敏感基因型。本发明提供的筛选方法可以准确地评价不同基因型黄瓜对农杆菌侵染的敏感性，解决了传统GUS瞬时表达率难以区分不同基因型农杆菌敏感性的问题。

Description

一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法
技术领域
本发明涉及蔬菜生物技术育种技术领域，具体涉及一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法。
背景技术
黄瓜是世界范围内重要的蔬菜作物，也是我国设施生产中重要的蔬菜作物之一，2013年我国设施黄瓜种植面积为1051万亩，仅次于番茄的1215万亩，居第二位(李天来.我国设施蔬菜科技与产业发展现状及趋势[J].中国农村科技,2016,05:75-77.)。由于栽培黄瓜自身遗传背景狭窄，抗性种质缺乏，以及与野生抗性种质资源存在远缘杂交不亲和现象，致使采用传统的杂交育种手段难以将抗病、抗虫的优异基因导入栽培种中(顾兴芳,张圣平,张思远,王长林.抗南方根结线虫黄瓜砧木的筛选[J].中国蔬菜,2006,02:4-8.)。早在上世纪八十年代末期，随着根癌农杆菌遗传转化体系的成熟应用，国外已经开始了黄瓜转基因研究。自Trulson等(1986)采用发根农杆菌感染黄瓜下胚轴诱导再生植株以来，(Trulson A J,Simpson R B,Shahin E A.Transformation of cucumber(Cucumissativus L.)plants with Agrobacterium rhizogenes[J].Theoretical AppliedGenetics,1986,73(1):11-15.)黄瓜遗传转化体系不断完善，目前已经基本建立了农杆菌介导子叶或子叶节的遗传转化体系，主要用于基因功能验证。新型的CRISPR/cas9等基因编辑技术具有定向编辑且不引入外源基因等优势，为黄瓜等作物抗病、抗逆育种打开了新的思路。基因编辑技术依赖于高效的遗传转化系统，因此，建立高效规模化黄瓜遗传转化体系，将为基因编辑技术在黄瓜育种中的应用提供基础。
黄瓜遗传转化主要采用农杆菌介导子叶或子叶节遗传转化途径，由于黄瓜遗传转化影响因素较多，特别是农杆菌介导法步骤繁琐，遗传转化效率在各基因型间差异较大(0.5％～23.0％)，限制了转基因技术在黄瓜种质遗传改良和基因功能分析方面的应用(WANG S L,Ku S S,YE X G,HE C F,Kwon S Y,Choi P S.Current status of genetictransformation technology developed in cucumber(Cucumis sativus L.)[J].Journal of Integrative Agriculture,2015,14(3)：469-482.)。传统的GUS瞬时表达率为GUS染色阳性外植体数与侵染外植体数的比值。由于GUS染色阳性外植体之间存在巨大差异，若不进行详细分类描述，难以区分出不同黄瓜品种对农杆菌侵染的敏感性差异。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，准确地评价不同基因型黄瓜材料对农杆菌侵染的敏感性，解决了传统GUS瞬时表达率区分不出不同品种农杆菌敏感性的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，包括以下步骤：
1)将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌固态接种侵染黄瓜子叶节外植体，得到侵染外植体；
2)将所述步骤1)得到的侵染外植体置于共培养基上黑暗培养，得到黑暗培养后的外植体；
3)对所述步骤2)得到的黑暗培养后的外植体进行处理，仅保留外植体的子叶节区，将处理后的外植体浸没于GUS染色液中染色10～12h，再置于乙醇溶液中脱色12～15h，得到除去叶绿素的外植体；
4)根据步骤3)中除去叶绿素的外植体的GUS蓝色部位和显色面积进行GUS组织化学染色分级，确定归属每个GUS瞬时表达级别的外植体数目，根据式I所示公式和分级情况计算得到GUS基因瞬时表达指数，当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间(55.55,77.77]时，判定待测黄瓜基因型为黄瓜根癌农杆菌敏感基因型；
所述GUS组织化学染色分级分为5个GUS瞬时表达级别：
0级 无GUS蓝色；
1级 GUS蓝色的的组织或细胞部位呈点状分布，蓝色面积≤子叶节区面积的25％；
2级 子叶节区面积的50％≥蓝色面积>子叶节区面积的25％，染色部位位于不定芽再生部位之外；
3级 子叶节区面积的75％≥蓝色面积>子叶节区面积的50％，染色部位位于不定芽再生部位；
4级 蓝色面积>子叶节区面积的75％，染色部位位于不定芽再生部位，所述4级为GUS瞬时表达级别的最高级别；
所述GUS染色液包括以下组分：35～40mM磷酸钠缓冲液，0.1～1.0mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，0.1～1.0mM K3[Fe(CN)6]，体积百分含量为15～25％的甲醇溶液，体积百分含量为0.5～1.5％的TritonX-100，0.5～1.5mg·mL-1的X-Gluc。
优选的，所述GUS染色液包括以下组分：38.5mmol·L-1磷酸钠缓冲液，0.5mmol·L-1K4[Fe(CN)6]·3H2O，0.5mmol·L-1K3[Fe(CN)6]，体积百分含量为20％的甲醇溶液，体积百分含量为1.0％的Triton X-100，1.0mg·mL-1的X-Gluc。
优选的，所述步骤1)固态接种侵染的方法包括：将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌在固体YEB平板划线活化培养至肉眼可见明显菌斑，用灭菌棉棒蘸取活化的农杆菌菌体在黄瓜子叶节伤口区域轻轻涂抹2～3次。
优选的，所述步骤2)中黑暗培养的条件包括：所述黑暗培养的温度为22-25℃，所述黑暗培养的时间为1～5d。
优选的，所述步骤2)共培养基以MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，包括以下组分：1～3mg·L-16-苄基氨基嘌呤、0.1～0.3mg·L-1脱落酸、150～250μmol·L-1乙酰丁香酮、质量体积百分含量为1～5％的蔗糖、质量体积百分含量为0.5～1.2％的琼脂，所述共培养基的pH值为5.0～6.0。
优选的，所述步骤4)乙醇溶液中乙醇的体积百分含量为90～95％。
优选的，当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间[0.0,11.11]时，判定待测黄瓜基因型为高抗根癌农杆菌侵染基因型；
当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间(11.11,33.33]时，判定待测黄瓜基因型为抗根癌农杆菌侵染基因型；
当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间(33.33,55.55]时，判定待测黄瓜基因型为耐根癌农杆菌侵染基因型；当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间(77.78～100]时，判定待测黄瓜基因型为根癌农杆菌侵染高感基因型。
优选的，所述步骤1)黄瓜子叶节外植体的获取方法包括：将黄瓜种子消毒后置于萌发培养基上进行萌发培养4～5d，获得黄瓜无菌苗；在所述黄瓜无菌苗苗上，取含有2～3mm下胚轴的子叶，得到黄瓜子叶节外植体。
优选的，所述萌发培养基以1/2MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，包括以下组分：质量体积百分含量为1～3％的蔗糖和质量体积百分含量为0.5～1.2％的琼脂，所述萌发培养基的pH值为5.0～6.5。
优选的，所述萌发培养的条件包括：所述培养的温度为20～30℃，所述培养在光暗交替的条件下进行，一个交替周期中先光培养14～18h再暗培养6～10h，所述光培养的光照强度为90～150μmol·m-2·s-1。
本发明提供的黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，通过固态接种的方法侵染子叶节外植体，具有操作简单，快速，可固定部位侵染的优势。并且根据GUS基因表达特征对组织化学染色后的外植体进行分级，以便于区分GUS染色外植体之间的差异。通过计算GUS基因瞬时表达指数，得出不同黄瓜基因型的瞬时表达指数存在显著性差异，GUS基因瞬时表达指数越高，表明该黄瓜基因型对根癌农杆菌侵染越敏感，进而能够筛选黄瓜根癌农杆菌敏感基因型，作为候选材料用于黄瓜遗传转化。
本发明实施例的结果显示：本发明提供的筛选方法能够准确地评价不同基因型黄瓜材料对农杆菌侵染的敏感性，解决了传统GUS瞬时表达率难以区分不同品种农杆菌敏感性的问题，为大规模筛选黄瓜遗传转化材料提供了技术保障。
附图说明
图1为根癌农杆菌侵染及共培养流程；
图2为不同黄瓜品种GUS组织化学染色分析结果。
具体实施方式
本发明提供了一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，包括以下步骤：1)将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌固态接种侵染黄瓜子叶节外植体，得到侵染外植体；2)将所述步骤1)得到的侵染外植体置于共培养基上黑暗培养，得到黑暗培养后的外植体；3)对所述步骤2)得到的黑暗培养后的外植体进行处理，仅保留外植体的子叶节区，将处理后的外植体浸没于GUS染色液中染色10～12h，再置于乙醇溶液中脱色12～15h，得到除去叶绿素的外植体；4)根据步骤3)中除去叶绿素的外植体的GUS蓝色部位和显色面积进行GUS组织化学染色分级，确定归属每个GUS瞬时表达级别的外植体数目，根据式I所示公式和分级情况计算得到GUS基因瞬时表达指数，当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间(55.55,77.77]时，判定待测黄瓜基因型为黄瓜根癌农杆菌敏感基因型；所述GUS组织化学染色分级分为5个GUS瞬时表达级别：0级无GUS蓝色；1级GUS蓝色的的组织或细胞部位呈点状分布，蓝色面积≤子叶节区面积的25％；2级子叶节区面积的50％≥蓝色面积>子叶节区面积的25％，染色部位位于不定芽再生部位之外；3级子叶节区面积的75％≥蓝色面积>子叶节区面积的50％，染色部位位于不定芽再生部位；4级蓝色面积>子叶节区面积的75％，染色部位位于不定芽再生部位，所述4级为GUS瞬时表达级别的最高级别；
所述GUS染色液包括以下组分：35～40mM磷酸钠缓冲液，0.1～1.0mMK4[Fe(CN)6]·3H2O，0.1～1.0mM K3[Fe(CN)6]，体积百分含量为15～25％的甲醇溶液，体积百分含量为0.5～1.5％的Triton X-100，0.5～1.5mg·mL-1的X-Gluc。
本发明先提供黄瓜子叶节，在本发明中，所述黄瓜子叶节的获取方法优选包括以下步骤：
将黄瓜种子消毒后，置于萌发培养基上培养4～5d，获得黄瓜苗，本发明优选采用灭菌手术刀切掉黄瓜苗大部分根系，保留2～3mm的下胚轴，然后从两片子叶之间纵向剖开，剔除定芽和腋芽，得到黄瓜子叶节。
本发明对所述消毒使用的试剂和方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规采用消毒黄瓜种子的方法即可，在本发明实施例中，所述消毒具体为：将黄瓜种子在55℃温水浸泡20min，使种子完全沉降，然后在超净工作台中，采用体积百分含量为70％的乙醇溶液消毒1min，再用无菌水快速清洗3～4次，添加质量体积百分含量为10～15％的NaClO溶液(加入1滴Tween-20)消毒15min，无菌水首先快速清洗3～4次，再浸泡清洗20min。
本发明优选将消毒后的黄瓜种子在水中浸泡3～5h后，再置于萌发培养基上培养，更优选为浸泡4h。
在本发明中，所述萌发培养基以1/2MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，优选包括以下组分：质量体积百分含量为1～3％的蔗糖、质量体积百分含量为0.5～1.2％的琼脂；更优选为质量体积百分含量为2％的蔗糖、质量体积百分含量为0.8％的琼脂；所述萌发培养基的pH值优选为5.0～6.5，更优选为5.8。
在本发明中，所述黄瓜种子在萌发培养基上培养的条件包括：所述培养的温度优选为20～30℃，更优选为22～28℃，最优选为25℃；所述培养优选在光暗交替的条件下进行，在一个交替中期内优选先光培养14～18h再暗培养6～10h，更优选为光培养16h再暗培养8h；所述光培养时的光照强度优选为90～150μmol·m-2·s-1。
本发明将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌侵染黄瓜子叶节外植体，得到侵染的外植体。
本发明对所述含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌保存于青岛市农业科学研究院蔬菜研究所，可通过申请协议获取或购买得到。
本发明优选将所述含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌活化后再侵染黄瓜子叶节。在本发明中，所述活化使用的培养基以水为溶剂，优选包括以下组分：蛋白胨5g·L-1，酵母提取物1g·L-1，牛肉膏5g·L-1，MgSO4·7H2O0.5g·L-1，蔗糖5g·L-1，琼脂15g·L-1，所述培养基的pH值为7.0。在本发明中，所述活化的方式优选采用在培养基上进行划线，培养至长出肉眼可见的菌落，所述活化培养的温度优选为28℃；所述活化培养的时间优选为12～24h，更优选为14～18h，最优选为16h。
本发明将根癌农杆菌在黄瓜子叶节的伤口处涂抹2～3次，所述涂抹优选采用无菌的棉棒蘸去少量活化的根癌农杆菌轻轻地涂抹黄瓜子叶节的伤口处。
本发明将侵染后的黄瓜子叶节置于共培养基上黑暗培养，得到外植体。
在本发明中，所述共培养基以MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，优选包括以下组分：1～3mg·L-16-苄基氨基嘌呤、0.1～0.3mg·L-1脱落酸、150～250μmol·L-1乙酰丁香酮、质量体积百分含量为1～5％的蔗糖、质量体积百分含量为0.5～1.2％的琼脂；更优选为2mg·L-16-苄基氨基嘌呤、0.2mg·L-1脱落酸、200μmol·L-1乙酰丁香酮、质量体积百分含量为3％的蔗糖、质量体积百分含量为0.8％的琼脂；所述共培养基的pH值优选为5.0～6.0，更优选为5.4。
在本发明中，所述黑暗培养的条件包括：所述黑暗培养的温度优选为22～25℃，更优选为23～24℃；所述黑暗培养的时间优选为1～5天，优选为2～4天，最优选为3天。
黑暗培养得到外植体后，本发明所述对外植体进行处理，仅保留外植体的子叶节区，将得到的外植体浸没于GUS染色液中染色10～12h，将染色后的外植体置于乙醇溶液中脱色12～15h，得到除去叶绿素的外植体。
在本发明中，所述对外植体处理优选为切除2/3外植体的子叶，仅留下1/3子叶和2-3mm下胚轴的子叶节区。
本发明将得到的外植体优选经无菌水冲洗3～4次后，再浸没于GUS染色液中，所述冲洗以除去根癌农杆菌。
在本发明中，所述GUS染色液包括以下组分：35～40mM磷酸钠缓冲液，0.1～1.0mMK4[Fe(CN)6]·3H2O，0.1～1.0mM K3[Fe(CN)6]，体积百分含量为15～25％的甲醇溶液，体积百分含量为0.5～1.5％的TritonX-100，0.5～1.5mg·mL-1的X-Gluc；优选包括：37～39mM磷酸钠缓冲液，0.3～0.8mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，0.3～0.8mM K3[Fe(CN)6]，体积百分含量为18～22％的甲醇溶液，体积百分含量为0.8～1.2％的TritonX-100，0.8～1.2mg·mL-1的X-Gluc；更优选包括：38.5mM磷酸钠缓冲液，0.5mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，0.5mM K3[Fe(CN)6]，体积百分含量为20％的甲醇溶液，体积百分含量为1.0％的Triton X-100，1.0mg·mL-1的X-Gluc。
本发明在染色前优选对外植体的子叶节所处的环境进行抽真空2～8min后再进行染色，更优选为4～6min，最优选为5min；所述抽真空的压强优选为负0.08MPa。
在本发明中，所述染色的时间为10～12h；所述染色的温度优选为25～45℃，更优选为30～40℃，最优选为37℃。
本发明将染色后的外植体置于乙醇溶液中脱色12～15h，得到除去叶绿素的外植体。在本发明中，所述乙醇溶液中乙醇的体积百分含量优选为90～95％。在本发明中，所述乙醇溶液的作用是去除外植体的叶绿素。
本发明优选在脱色后用数码相机或体视显微镜拍照记录。
本发明根据外植体的子叶节的GUS蓝色染色部位和显色面积进行GUS组织化学染色分级，确定归属每个GUS瞬时表达级别的外植体数目，根据式I所示公式和分级情况计算得到GUS基因瞬时表达指数，当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间(55.55,77.77]时，判定待测黄瓜基因型为根癌农杆菌敏感基因型；
所述GUS组织化学染色分级分为5个GUS瞬时表达级别：
0级 无GUS蓝色；
1级 GUS蓝色的组织或细胞部位呈点状分布，蓝色面积≤子叶节区面积的25％；
2级 子叶节区面积的50％≥蓝色面积>子叶节区面积的25％，染色部位位于不定芽再生部位之外；
3级 子叶节区面积的75％≥蓝色面积>子叶节区面积的50％，染色部位位于不定芽再生部位；
4级 蓝色面积>子叶节区面积的75％，染色部位位于不定芽再生部位，所述4级为GUS瞬时表达级别的最高级别；
在本发明中，所述黄瓜农杆菌敏感性归类标准为高抗侵染、抗侵染、耐侵染、敏感和高感，所述高抗侵染的GUS瞬时表达指数值位于区间[0,11.11]所述抗侵染的GUS瞬时表达指数值位于区间(11.11,33.33]，所述耐侵染的GUS瞬时表达指数值位于区间(33.33,55.55]，所述敏感的GUS瞬时表达指数值位于区间(55.55,77.77]，所述高感的GUS瞬时表达指数值位于区间(77.77,100]。在本发明中，所述GUS基因瞬时表达指数越高，表明该黄瓜品种的基因型对根癌农杆菌侵染越敏感。
下面结合本发明的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例以8个华南型黄瓜品种\品系‘玉龙’、‘鲁黄瓜3号’、‘翠龙’、‘C369’、‘C661’、‘C677’、‘C699’和‘C215×118’为材料，采用农杆菌固态接种的方法侵染子叶节外植体，共培养结束后进行GUS组织化学染色分级评价，具体实施方式如下：
1.黄瓜无菌苗的制备：
挑选健康饱满的黄瓜种子，55℃温水浸泡20min，使种子完全沉降；然后在超净工作台中，70％乙醇消毒1min，无菌水快速清洗3次；添加10％NaClO(加入1滴Tween-20)消毒15min；无菌水首先快速清洗4次，继续清洗20min左右，种子浸泡4h后接种于萌发培养基上培养，获得黄瓜无菌苗。萌发培养基以1/2MS基本培养基为基础培养基，以水为溶剂，包括3％(w/v)蔗糖和0.8％(w/v)琼脂，培养基的pH为5.8；培养条件为：在25℃条件下，光暗交替培养5天，先光培养16h再暗培养8h，光照强度为90μmol·m-2·s-1。
2.子叶节外植体的获得：
选取子叶变绿但尚未展开的5d苗龄的幼苗，用灭菌手术刀切掉大部分根系，保留3mm的下胚轴，然后从两片子叶之间纵向剖开，剔除顶芽和腋芽，得到子叶节外植体。
3.农杆菌的活化与培养：
本实施例中选用含有pCAMBIA3301植物表达载体的根癌农杆菌EHA105进行侵染，在外植体制备的前一天，取-80℃保存的根癌农杆菌，在YEB培养基上划线，在28℃的条件下培养24h，至肉眼可见明显的菌落，YEB培养基以水为溶剂，包括蛋白胨5g·L-1，酵母提取物1g·L-1，牛肉膏5g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5g·L-1，蔗糖5g·L-1，琼脂15g·L-1，pH值为7.0。
4.农杆菌固态接种共培养：
准备灭菌的棉棒，棉棒要求紧实，大小适中与子叶节基部基本吻合，用棉棒蘸取少量活化的根癌农杆菌，轻轻地涂抹于子叶节处，涂抹3次，操作过程要迅速，避免子叶节伤口脱水干燥，接种结束的外植体，迅速置于含有共培养基的平板上，共培养3d。共培养基以MS基本培养基为基础培养基，以水为溶剂，包括2mg·L-16-苄基氨基嘌呤，0.2mg·L-1脱落酸，200μmol·L-1乙酰丁香酮，3％(w/v)蔗糖和0.8％(w/v)琼脂，共培养基的pH值为5.4。
步骤1-4中的根癌农杆菌浸染及共培养流程见图1，其中，A为无菌苗；B为活化的农杆菌；C为接种用棉棒；D为子叶节共培养；E为共培养3d后的子叶节；F为GUS染色液真空渗透。
5.GUS组织化学染色及分级评价：
(1)GUS染色液的制备：
GUS染色液包括以下成分：38.5mmol·L-1磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，0.5mmol·L-1K4[Fe(CN)6]·3H2O，0.5mmol·L-1K3[Fe(CN)6]，20％(v/v)甲醇，1％(v/v)TritonX-100，1mg·mL-1X-Gluc。
(2)GUS组织化学染色：
共培养结束后的外植体，用无菌水冲洗4次，以除去过量增殖的农杆菌，切除2/3子叶，仅保留子叶节部位，分批次转移至50mL锥形瓶中，加入染色液，以染色液没过外植体为准，将离心管开盖置于真空干燥器中，负0.08MPa抽真空5min，使显色液渗透进外植体组织中，在恒温箱中37℃染色12h，中途摇动2～3次，染色结束后，95％乙醇脱色12h去除叶绿素，用数码相机或体视显微镜拍照记录，结果见图2，其中，A为未侵染外植体(对照)；B为‘鲁黄瓜3号’；C为‘玉龙’；D为‘C699’；E为‘翠龙’；F为‘C215×118’；G为‘C661’；H为‘C667’；I为‘C369’。
(3)组织化学染色结果分级评价
通过肉眼观察及图像处理软件辅助分析，根据GUS组织化学染色部位、染色面积和染色的深浅将GUS瞬时表达情况分为5个等级，见表1：
表1子叶节外植体GUS组织化学染色分类标准
其中GUS瞬时表达指数的计算公式如下:
表2黄瓜农杆菌敏感性归类标准
采用固态侵染结合GUS组织化学染色结果分级评价的方法，对8个华南型黄瓜品种的农杆菌侵染敏感性进行评价，结果见表3。
表3不同基因型黄瓜子叶节外植体的GUS瞬时表达指数
注：图中各级别的外植体数为三次重复试验的平均值。
yGUS瞬时表达指数＝∑(GUS染色级别×该级别外植体数)/(侵染外植体数×最高级别)×100％，通过单因素方差分析，对各数值进行反正弦转换后，用Duncan's新复极差法在P<0.05水平进行显著性测验，统一栏中不同小写字母表示差异显著。
xGUS瞬时表达率＝GUS染色外植体数/侵染外植体数×100％，通过单因素方差分析，对各数值进行反正弦转换后，用Duncan's新复极差法在P<0.05水平进行显著性测验，统一栏中不同小写字母表示差异显著。
根据表3可以得出，不同基因型黄瓜对农杆菌侵染的敏感性不同，采用GUS染色分级的方法可以发现不同基因型子叶节外植体GUS瞬时表达指数存在显著差异，其中‘鲁黄瓜3号’、‘玉龙’和‘C699’的GUS瞬时表达指数较高，显著高于其他品种；而‘C369’的GUS瞬时表达指数最低仅为38.15，对根癌农杆菌侵染具有较强的耐性。根癌农杆菌介导黄瓜遗传转化过程中，根癌农杆菌侵染效率是遗传转化能否获得成功的关键，采用农杆菌敏感基因型进行遗传转化更容易获得转基因苗，提高遗传转化率。本实施例中‘鲁黄瓜3号’、‘玉龙’和‘C699’的GUS瞬时表达指数均超过55.55，因此为根癌农杆菌敏感基因型，可作为候选材料用于黄瓜遗传转化。
然而，传统的GUS瞬时表达率难以准确反映GUS基因表达的实际情况，从表3中可以看出，GUS瞬时表达率在各品种间并无显著差异，难以区分不同品种间的农杆菌敏感性。
由以上实施例可知，本发明提供的筛选方法能够在7～8天内快速准确地评价不同基因型黄瓜材料的农杆菌敏感性，解决了传统GUS瞬时表达率难以区分不同品种农杆菌敏感性的问题，为大规模筛选黄瓜遗传转化材料提供了技术保障。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，包括以下步骤：
1)将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌固态接种侵染黄瓜子叶节外植体，得到侵染外植体；
2)将所述步骤1)得到的侵染外植体置于共培养基上黑暗培养，得到黑暗培养后的外植体；
3)对所述步骤2)得到的黑暗培养后的外植体进行处理，仅保留外植体的子叶节区，将处理后的外植体浸没于GUS染色液中染色10～12h，再置于乙醇溶液中脱色12～15h，得到除去叶绿素的外植体；
4)根据步骤3)中除去叶绿素的外植体的GUS蓝色部位和显色面积进行GUS组织化学染色分级，确定归属每个GUS瞬时表达级别的外植体数目，根据式I所示公式和分级情况计算得到GUS基因瞬时表达指数，当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间(55.55,77.77]时，判定待测黄瓜基因型为黄瓜根癌农杆菌敏感基因型；
所述GUS组织化学染色分级分为5个GUS瞬时表达级别：
0级 无GUS蓝色；
1级 GUS蓝色的的组织或细胞部位呈点状分布，蓝色面积≤子叶节区面积的25％；
2级 子叶节区面积的50％≥蓝色面积>子叶节区面积的25％，染色部位位于不定芽再生部位之外；
3级 子叶节区面积的75％≥蓝色面积>子叶节区面积的50％，染色部位位于不定芽再生部位；
4级 蓝色面积>子叶节区面积的75％，染色部位位于不定芽再生部位，所述4级为GUS瞬时表达级别的最高级别；
所述GUS染色液包括以下组分：35～40mM磷酸钠缓冲液，0.1～1.0mMK4[Fe(CN)6]·3H2O，0.1～1.0mM K3[Fe(CN)6]，体积百分含量为15～25％的甲醇溶液，体积百分含量为0.5～1.5％的Triton X-100，0.5～1.5mg·mL-1的X-Gluc。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述GUS染色液包括以下组分：38.5mmol·L-1磷酸钠缓冲液，0.5mmol·L-1K4[Fe(CN)6]·3H2O，0.5mmol·L-1K3[Fe(CN)6]，体积百分含量为20％的甲醇溶液，体积百分含量为1.0％的TritonX-100，1.0mg·mL-1的X-Gluc。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)固态接种侵染的方法包括：将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌在固体YEB平板划线活化培养至肉眼可见明显菌斑，用灭菌棉棒蘸取活化的农杆菌菌体在黄瓜子叶节伤口区域轻轻涂抹2～3次。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤2)中黑暗培养的条件包括：所述黑暗培养的温度为22～25℃，所述黑暗培养的时间为1～5d。
5.根据权利要求1或4所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤2)共培养基以MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，包括以下组分：1～3mg·L-16-苄基氨基嘌呤、0.1～0.3mg·L-1脱落酸、150～250μmol·L-1乙酰丁香酮、质量体积百分含量为1～5％的蔗糖、质量体积百分含量为0.5～1.2％的琼脂，所述共培养基的pH值为5.0～6.0。
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤4)乙醇溶液中乙醇的体积百分含量为90～95％。
7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间[0.0,11.11]时，判定待测黄瓜基因型为高抗根癌农杆菌侵染基因型；
当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间(11.11,33.33]时，判定待测黄瓜基因型为抗根癌农杆菌侵染基因型；
当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间(33.33,55.55]时，判定待测黄瓜基因型为耐根癌农杆菌侵染基因型；
当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间(77.78～100]时，判定待测黄瓜基因型为根癌农杆菌侵染高感基因型。
8.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)黄瓜子叶节外植体的获取方法包括：将黄瓜种子消毒后置于萌发培养基上进行萌发培养4～5d，获得黄瓜无菌苗；在所述黄瓜无菌苗苗上，取含有2～3mm下胚轴的子叶，得到黄瓜子叶节外植体。
9.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，所述萌发培养基以1/2MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，包括以下组分：质量体积百分含量为1～3％的蔗糖和质量体积百分含量为0.5～1.2％的琼脂，所述萌发培养基的pH值为5.0～6.5。
10.根据权利要求8或9所述的筛选方法，其特征在于，所述萌发培养的条件包括：所述培养的温度为20～30℃，所述培养在光暗交替的条件下进行，一个交替周期中先光培养14～18h再暗培养6～10h，所述光培养的光照强度为90～150μmol·m-2·s-1。
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