CN102268452A - 一种培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法。本发明克隆黄瓜花叶病毒复制酶基因cDNA片段，长308bp，位于CMV2a全长基因序列1207bp-1515bp之间，然后将该基因片段构建到RNAi高通量表达载体pHellsgate2上，再通过根癌农杆菌介导的遗传转化法将CMV2aRNAi植物表达载体导入烟草中并稳定表达，通过实验分析转基因植株的病毒抗性，最后获得对CMV抗性增强的转基因烟草植株；通过实验证实在植物中表达病毒基因片段的双链RNA能诱发RNA干涉的发生，进而产生相应基因的小干涉RNA，并特异性的抑制病毒的侵染。

Description

一种培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法

技术领域

本发明涉及一种培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法，属于基因工程领域。

背景技术

植物病毒病有植物“癌症”之称，每年因病毒病对农作物所造成的经济损失约数百亿元。植物病毒必须在寄主细胞内专性寄生生活，虽然一些病毒只能侵染某一种或某些植物，也有少数病毒危害十分广泛，如黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)。CMV在世界范围内普遍发生，并且寄主范围最广，能侵染约65科885种植物。因其引起病害的重要性，CMV已经成为世界范围内最重要的植物RNA病毒，也是目前研究最多的植物RNA病毒之一。

CMV是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的成员，基因组由3条正义单链RNA组成，根据大小依次命名为RNA1、RNA2和RNA3。RNA1编码1a蛋白。1a蛋白是CMV复制酶复合体的一个亚单位，在CMV复制过程中起到解旋酶和甲基转移酶的功能。此外，CMV 1a蛋白在病毒移动过程中也起重要的作用。RNA2编码2a蛋白，即复制酶复合体中依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP），2a与1a蛋白协同作用形成复制复合体。在CMV复制过程中，首先1a-2a与一些寄主蛋白组成的RNA依赖的RNA聚合酶合成反义链RNA，然后1a-2a断开，再由磷酸化的2a和一些寄主蛋白共同起作用合成正义链RNA (Seo JK, Kwon SJ, Choi HS, et al. Evidence for alternate states of Cucumber mosaic virus replicase assembly in positive- and negative-strand RNA synthesis. Virology, 2009, 383(2):248-260)。RNA3编码运动蛋白(movement protein，MP)和衣壳蛋白(coat protein，CP)分别负责病毒的长距离移动和衣壳化。另外，由RNA2的亚基因组RNA4表达产生的大小为11-13KDa蛋白2b，是转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)的抑制蛋白(Brigneti G, Voinnet O, Li WX, et al. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO J, 1998, 17: 6739-6746)。

由于病毒对植物寄生性生活，其复制所需要的能量、物质场所等完全由寄主细胞提供，因而病毒病的防治十分困难。到目前为止，对病毒病的防治主要有三种方法。一是化学防治法，但因其对植物的绝对寄生性和发病的独特性使得化学防治等常规措施难以发挥作用，而且还存在化学农药的污染问题。二是可利用脱毒技术获得无毒繁殖材料。但其只适用于鳞茎、接穗等，使用范围有限。三是预防为主、综合防治，一方面消灭侵染来源和传播介体；另一方面采取增强植物抗病力、培育和推广耐病或抗病品种等。虽然这些传统方法能够不同程度的降低病毒发病的严重程度，但不能从根本上解决问题。

近年来，病毒分子生物学的发展和植物基因工程技术的出现为防治植物病毒病开辟了新的途径。在植物抗病毒基因工程研究方面，主要采用3种策略提高植物的病毒抗性：一是植物病毒来源基因介导的抗性(pathogen-derived resistance，PDR)；二是植物、微生物的核糖体失活蛋白(ribosome inactivating proteins, RIPs)；三是利用植物中自然存在的抗性基因。目前PDR已成为遗传工程中增强作物对病毒抗性的主要措施之一(Prins M, Laimer M, Noris E, el at. Strategies for antiviral resistance in transgenic plants. Mol Plant Pathol, 2008, 9: 73-83)。

RNA干涉(RNA interference，RNAi)是由双链RNA (double-stranded RNA，dsRNA)引起的序列特异性基因沉默，可以调节关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动(Denli AM, Hannon GJ. RNAi: an ever-growing puzzle. Trends Biochem Sci, 2003, 28: 196-201)。RNAi是由dsRNA诱导的多步骤、多因素参与的过程，是生物体的一种防御机制，普遍存在于绝大多数真核细胞中。在这个过程中，两种类型的小RNA发挥了核心功能作用，即长度为21-26nt的小干涉RNA (small intertering RNA，siRNA)和miRNA (microRNA)。dsRNA是RNAi的激发子，长的dsRNA被核糖核酸酶Dicer识别并剪切成长度为21-26nt的siRNA。接着siRNA被RNA诱导的干涉复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)识别、解链，并以单链RNA的形式与RISC结合，随后直接剪切具有siRNA同源序列的mRNA，阻断其翻译成蛋白。来自于非编码RNA基因茎环结构转录前体的小RNA称为miRNAs。siRNAs和miRNAs介导的基因沉默都属于转录后水平的基因沉默。

RNAi是一项自然发生的高效的病毒防御机制。利用RNAi技术的原理设计合成与病毒同源的dsRNA，并将其导入植物，植物的RNAi机制受到激发并对病毒基因组进行特异性切割降解，阻止病毒的复制扩张，从而保护植物不受病毒危害。克隆CMV长747bp的CP基因cDNA片段，并构建至植物表达载体，即在花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV) 35S启动子后面同时插入正义和反义的CP cDNA序列，中间插入一个内含子将其分开，形成一个反向重复序列。将构建的表达载体导入到烟草中，转基因植株中CMV CP双链RNA的表达产生了小的干涉RNA，118株转基因植株中有20株产生了对CMV的抗性(Kalantidis K, Psaradakis S, Tabler M, et al. The occurrence of CMV-specific short RNAs in transgenic tobacco expressing virus-derived double-stranded RNA is indicative of resistance to the virus. Mol Plant Microbe interact, 2002,15: 826-833)。以马铃薯Y病毒(Photo virus Y, PVY)的3’端保守序列设计引物，构建RNAi表达载体并转化马铃薯，结果15株转基因植株中有12株可以表达siRNAs，并且能对三种不同亚型的PVY表现出高强度的抗性(Missiou A, Kalantidis K, Boutla A, et al. Generation of transgenic potato plants highly resistant to potato virus Y (PVY) through RNA silencing. Mol Breed, 2004, 14: 185-197)。

发明内容

本发明利用基因工程手段及RNAi技术，目的是提供一种培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法，抗黄瓜花叶病毒植物能表达黄瓜花叶病毒复制酶基因2a的发夹RNA，在细胞内转录形成具有发夹结构的2a双链RNA分子，诱导细胞产生RNA干涉，并形成2a的小干涉RNA，特异性的抑制病毒的侵染。

在CMV中，RNA2编码2a蛋白，即复制酶复合体中依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)，2a与1a蛋白协同作用形成复制复合体。在CMV复制过程中，首先1a-2a与一些寄主蛋白组成的RNA依赖的RNA聚合酶合成负义链RNA，然后1a-2a断开，再由磷酸化的2a和一些寄主蛋白共同起作用合成正义链RNA。本发明利用植物基因工程技术手段，从感染CMV的病叶组织中克隆CMV的复制酶基因2a的cDNA片段，长308bp，位于CMV 2a全长基因序列的1207bp-1515bp之间，接着将该基因片段构建到RNAi高通量表达载体pHellsgate2上，再通过根癌农杆菌介导的遗传转化法将CMV 2a RNAi植物表达载体导入烟草中并稳定表达，并以重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)获得真正的转基因植株，然后对阳性转基因烟草植株接种CMV，定期观察发病情况，分析转基因烟草植株对CMV的抗性，最后得到具有CMV抗性的转基因烟草植株。

病毒侵染过程中，在植物被侵染组织或其它组织都能检测到长度为21nt的双链siRNAs存在，由此可见PTGS的激活。PTGS作为一种RNA介导的防卫反应能维持植物基因组的稳定性和保护植物免受病毒侵染。利用RNAi技术并结合转基因技术能高频率大规模产生抗病毒植物。从生物安全性方面考虑，利用RNAi提高植物的病毒抗性也是一种很好的方法。dsRNA在植物中很快被降解成siRNAs，因此不会积累所转基因的转录产物，更不可能表达形成外源蛋白。

本发明提供的方法具体操作如下：

(1) 从感染黄瓜花叶病毒的植物组织中克隆获得CMV 2a的cDNA片段；

(2) 将克隆的cDNA片段与RNAi高通量表达载体pHellsgate2进行BP重组反应，构建CMV 2a RNAi植物表达载体；

(3) 将构建CMV 2a的RNAi表达载体通过根癌农杆菌介导转入目标植物中；

(4) 以重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过聚合酶链式反应获得真正的转基因植株，接种黄瓜花叶病毒，观察发病情况，最后筛选出对CMV抗性明显增强的转基因植株。

本发明构建的CMV 2a RNAi植物表达载体含有来源于黄瓜花叶病毒复制酶基因2a基因序列的发夹RNA (hpRNA)的表达盒。

本发明中2a发夹RNA表达盒含有CaMV35S启动子、表达2a基因发夹RNA的DNA分子和Nos终止子；表达2a基因发夹RNA的DNA分子由三个组件构成，两段反向重复序列之间由内含子分隔，两边组件分别为308bp的黄瓜花叶病毒复制酶2a基因片段。

本发明为提高烟草、黄瓜、百合等植物对黄瓜花叶病毒病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病毒植物能克服传统育种的不足，不仅育种周期短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明利用RNAi技术以及基因工程手段，构建CMV 2a RNAi表达载体并在植物中表达病毒基因的hpRNA，诱导植物产生RNAi，从而使植物能够抵抗病毒的侵染。它可以为农作物的大规模生产提供方便，大量减少抗病毒化学制剂的使用，为农业生产节约成本、减小环境污染且提高管理水平，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是部分转基因烟草基因组DNA的PCR凝胶电泳图谱。Marker：DL2000 DNA Marker (大连宝生物)，由2,000bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp六条DNA片段组成。正对照：以CMV 2a RNAi植物表达载体质粒为模板的PCR产物；WT：以非转基因烟草(野生型，WT)总DNA为模板的PCR产物。

图2是转基因烟草病毒抗性分析效果图。A：转基因烟草接种CMV两周后的发病情况；B：野生型烟草(WT)接种CMV两周后的发病情况。

图3是转基因烟草接种CMV两周后叶片的RT-PCR凝胶电泳图谱。Marker：DL2000 DNA Marker，其余泳道为部分转基因烟草株系。

图4是野生型烟草接种CMV两周后叶片的RT-PCR凝胶电泳图谱。Marker：DL2000 DNA Marker；WT1、WT3、WT5、WT7、WT9为野生型烟草未接种CMV叶片的扩增结果；WT2、WT4、WT6、WT8、WT10为野生型烟草接种CMV叶片的扩增结果。

具体实施方式

实施例1

1、CMV 2a基因片段的扩增和序列分析

用液氮将带有CMV症状的百合叶片研磨成粉末，转入1.5ml的离心管中，采用改良的异硫氰酸胍法提取总RNA。采用逆转录酶M-MLV (promega)以总RNA为模板合成cDNA 第一链，反应体系和操作过程为：取8 μg Total RNA，依次加入50 ng oligo(dT)、4μL ddH₂O (RNase-free)至反应体积为12.5 μL；混匀后，70℃加热变性5min后迅速在冰上冷却5min，然后依次加入2 μL dNTP (2.5mM each)、4 μL M-MLV 5×buffer、0.5 μL核酸酶抑制剂RNasin (200U)、1 μL 反转录酶M-MLV (200U)，混匀并短时离心，42℃温浴1.5h，取出后95℃加热5min，终止反应。cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因CMV 2a，所用引物序列分别为5’-GTCTAGATTGAGTAAAGCTGTGGCT-3’和5’-TGAATAACGGTGAGAACT GGGAG-3’。采用大连宝生物的高保真DNA聚合酶Ex Taq扩增出目的基因。PCR反应条件：94 ℃ 2min；94 ℃ 30s，59 ℃ 30s，72 ℃ 30s，32个循环；72 ℃ 10min。反应体系(20μL)为1 μL cDNA、2 μL Ex taq Buffer、1.5 μL dNTP (2.5 mM each)、0.1 μL 正向引物(20μM)、0.1 μL 反向引物(20 μM)、0.2 μL Ex Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL)、15.1 μL重蒸水ddH₂O。PCR结束后通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的特异性以及大小，点样量为5 μL。

由于PCR产物只有一条DNA特征带，且符合预期设计的大小，故直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pMD18-T vector kit (大连宝生物)，反应体系和操作过程为：取1.5 μL PCR产物，依次加入1 μL pMD18-T 载体 (50 ng/μL)和2.5 μL 2×Ligation solution I（连接液），混匀后置于16℃过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入到大肠杆菌DH5α中，再涂于含有氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的LB固体平板上，筛选阳性克隆。挑单菌落，摇菌，之后用扩增CMV 2a的特异引物进行PCR检测。将检测出的阳性克隆进行序列测定，最终获得CMV 2a的cDNA片段长308bp，位于CMV 2a全长基因序列的1207bp-1515bp之间。通过NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析发现克隆的基因片段与不同植物CMV分离物2a基因序列的同源性达到99%以上。

2、CMV 2a RNAi植物表达载体的构建和含有CMV 2a RNAi表达载体质粒的农杆菌的构建

采用碱裂解法提取插入CMV 2a的大肠杆菌质粒pMD-18T-2a以及RNAi表达载体pHellsgate2的质粒，取1 μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性和浓度高低。用含有attB1和attB2接头的引物扩增pMD-18T-2a，所用引物序列分别为5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCGTCTAGATT GAGTAAAGCTGTGGCT-3’和5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTG AATAACGGTGAGAACTGGGAG-3’。PCR反应条件为：95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30s，72 ℃ 40 s，28 cycles；72 ℃ 5 min。反应体系(20μL)为：1 μL质粒模板，2 μL Ex Taq Buffer、1.5 μL dNTP (2.5 mM each)、0.1 μL 正向引物(20μM)、0.1 μL 反向引物(20 μM)、0.2 μL Ex Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、15.1 μL ddH₂O。PCR结束后，取5 μL PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小以及浓度。

上述attB-PCR产物大小介于300bp-400bp，更接近400bp，符合预期值，并且没有杂带，直接用PCR产物进行BP重组反应。将BP Clonase™ II enzyme mix (invitrogen)在冰上解冻2min，并短时涡旋2次，在0.5 mL离心管中依次加入下面的试剂：2 μL attB-PCR产物 (10 ng/μL)，1 μL pHellsgate2质粒(150 ng/μL)，2 μL BP Clonase™ II。短时涡旋2次充分混匀反应物，短时离心收集反应物到管底。置于25 °C水浴锅中反应4 h后加入1 μL蛋白酶K，短时涡旋，37 °C温育10 min中止反应。取2 μL BP反应产物转化大肠杆菌DH10B，筛选抗生素为壮观霉素。挑取若干个单克隆摇菌提质粒，同一个克隆的质粒分别用XbaI、XhoI酶切，检测两个位点是否同时重组上外源基因片段，两种酶切产物理论上大小相同，且都与PCR产物大小相当。经酶切验证符合要求的质粒，即CMV 2a与pHellsgate2成功重组的克隆，在阳性菌株中加入20%甘油混匀，置于-80℃保存备用。

用碱裂解法提取并纯化上述大肠杆菌中的CMV 2a RNAi表达载体的质粒。制备农杆菌LBA4404菌株的感受态细胞，操作过程为：将实验室保存的LBA4404菌株在LB固体培养基(含利福平20mg/L)上划线，28℃培养至长出单菌落后，挑取一个单克隆于含20mg/L利福平的2 mL LB液体培养基，28℃振荡培养至混浊；取5 mL菌液转接于含20mg/L利福平的100 mL LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.5；4℃离心5min (5,000g/min)收集菌体，弃上清，加入10 mL预冷的0.1M CaCl₂，轻轻充分悬浮菌体，冰浴20min；接着4℃离心5min (5,000g/min)收集菌体，弃上清，加入4 mL预冷的含15%甘油的0.1M CaCl2溶液，轻轻悬浮后分装于1.5 mL离心管中，每管200 μL，液氮速冻后置于-80℃保存备用。

采用液氮冻融法将上述构建的CMV 2a RNAi植物表达载体转入所制备的农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取2 μg质粒加入含有200 μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5min，接着转入液氮中冷冻1min，然后迅速置于37℃水浴5min，之后立即冰浴2min，加入800 μL LB液体培养基，28℃振荡培养4h。将活化后的农杆菌涂于含有50mg/L Km的LB固体培养基上，28℃倒置培养。挑选单菌落摇菌，用扩增CMV 2a的特异引物进行PCR，检测重组载体是否转入农杆菌中。对于阳性克隆，加入20%甘油混匀后置于-80℃保存备用。

3、农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

本实验的转基因受体是烟草(Nicotiana tabacum L.)。将烟草的种子用75%的酒精浸泡30s，用无菌水洗涤后用0.1%的HgCl₂浸泡8min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2 MS培养基上，28℃暗培养5-8d，发芽后转至光照培养箱(25℃，16h/d光照)，以后每月用MS培养基继代一次。

从-80℃冰箱中取出保存的含有CMV 2a RNAi表达载体质粒的农杆菌LBA4404菌种，接种于5 mL含有50mg/L Km和20mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃培养至浑浊。吸取1mL浑浊的菌液至含有50mg/L Km的LB固体培养基上，28℃培养48h。将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于MGL液体培养基中，附加一定量的乙酰丁香酮，28℃振荡培养2-3h以活化农杆菌。

取烟草的无菌苗叶子切成1cm²左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中15min。用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，将叶盘置于共培养基上进行室温培养。烟草转化的共培养基为MS+0.02mg/L 6-BA+2 mg/L NAA+30g/L蔗糖，培养时间为2d。将共培养后的叶盘转到加有抗生素的筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+50mg/L Km+200mg/L 头孢霉素(cefotaxime sodium salt，Cef)。筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养（25℃，16h/d光照，8h/d黑暗）。烟草出芽后，用含有50mg/L Km和200mg/L Cef的MS培养基继代培养。因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选。将烟草再生苗移至含有50mg/L Km（卡那霉素）和200mg/L Cef（头孢霉素）的MS培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗进行分子水平的检测。

采用植物总DNA的快速少量抽提法（CTAB）法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，将提取的基因组DNA取1 μL通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度。以转基因植株的基因组DNA为模板、以新霉素磷酸转移酶基因NPT Ⅱ(位于pHellsgate2 T-DNA区段，作为转基因阳性转化子的抗性筛选标记)设计特异引物进行PCR，引物序列为5’-CCCTGATGCTCTTCGTCCA-3’和5’-CTCTGATGCCGCCGTGTT-3’。PCR反应条件为：95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，28 cycles；72 ℃ 2min。反应体系为：1 μL烟草总DNA，0.2 μL正向引物，0.2 μL反向引物，9 µL 2×power Taq PCR MasterMix，10.6 µL ddH₂O。PCR结束后，取8 μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株。由于阳性转基因烟草基因组中整合了CMV 2a RNAi表达载体的T-DNA，因此能扩增出长度为679bp的NPT Ⅱ基因特征条带。部分转基因烟草植株的扩增结果如图1所示。转基因烟草共筛选到132株阳性植株，分别编号为1～132。

4、转基因烟草的CMV抗性分析

首先制备黄瓜花叶病毒粗提液。取5g辣椒CMV症状病样组织加100ml抽提缓冲液[0.5M柠檬酸缓冲液(pH6.5)，含0.1%的β-巯基乙醇]，在研钵中研磨均匀，尼龙纱布过滤，滤液加25%氯仿，震荡15min，置4℃冰箱1h，然后5000rpm/min离心20min，取上清加8%的聚乙二醇(PEG6000)、3% NaCl，搅拌至PEG完全溶解，置4℃冰箱内4h，8000rpm/min离心30min，取沉淀，用ddH₂O悬浮过夜，8000rpm/min离心30min，取上清液，沉淀用ddH₂O再悬浮一次，两次上清液合并，并加入8%PEG、3%NaCl沉淀，再用少量的ddH₂O过夜悬浮沉淀，最后8000rpm/min离心10min，收获的上清液即为病毒粗提液。

挑选PCR检测为阳性的转基因烟草植株，移栽到盛有培养液的三角瓶中。待长出3-4片新叶后，使用摩擦接种法对各阳性株的叶片进行接种，操作过程为：预备接种的植株置于25℃培养箱中暗培养24h，接种叶片上撒少量500目石英砂，蘸取少量的病毒粗提液，以逆着叶脉的方向轻轻摩擦叶片，放置15min后，接种植株用清水冲洗干净后置于暗室培养过夜，再放置进光照培养箱培养。

两周后取接种叶片进行RT-PCR检测，每株检测4-6片叶，具体步骤如下：选取接种后烟草叶片，采用异硫氰酸胍法，提取总RNA。用RT-PCR方法检测CMV感染情况，RT-PCR反应条件同步骤1。以合成的第一链cDNA为模板，使用CMV CP基因引物进行PCR扩增，引物序列为：5’-CCAACTATTAACCACCCAACCTT-3’和5’-TGCTCGACGTCAACATGAAGT

AC-3’。PCR反应条件为：95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30s，72 ℃ 40 s，28 个循环；72 ℃ 5 min。反应体系(20μL)为：2 μL cDNA，0.2 μL正向引物，0.2 μL反向引物，2 µL 10×Reaction Buffer（反应缓冲液），1.5 µL dNTP Mix (2.5 mM)，2 µL MgCl₂，0.3 µL Taq PCR聚合酶 (5 U/μL)，12.8 µL ddH₂O。接种烟草叶片感染CMV后，即能通过RT-PCR检测到CMV CP基因470bp的扩增产物。如果被检测植株具有对CMV侵染的抗性，叶片RT-PCR检测结果不会出现CP基因的特征条带。

野生型烟草和转基因烟草接种CMV两周后的表型观察结果如图2所示。接种CMV的野生型烟草叶片出现扭曲，黄化，失去光泽，并出现黄绿相间的花叶症状，而转基因烟草植株的叶片大部分没有CMV感染的症状，个别表现轻微的感病症状。

转基因烟草接种CMV两周后叶片的RT-PCR检测结果如图3所示。野生型烟草接种CMV后，叶片RT-PCR检测呈阳性，即能从叶片中检测到CMV衣壳蛋白基因CP的表达；而接种CMV的38株2a RNAi载体转基因烟草中，有8株的所有检测叶片均未受CMV侵染，有17株仅有个别叶片受CMV侵染。显然，2a RNAi载体转基因烟草对CMV的抗性较野生型烟草明显增强。CMV 2a双链RNA在烟草中的表达使转基因烟草对CMV的侵染产生了不同程度的抗性。

SEQUENCE LISTING

<110> 昆明理工大学

<120> 一种培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtctagattg agtaaagctg tggct 25

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tgaataacgg tgagaactgg gag 23

<210> 3

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg cgtctagatt gagtaaagct gtggct 56

<210> 4

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tgaataacgg tgagaactgg gag 53

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ccctgatgct cttcgtcca 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ctctgatgcc gccgtgtt 18

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ccaactatta accacccaac ctt 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tgctcgacgt caacatgaag tac 23

Claims (8)

1.一种培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法，其特征在于按如下步骤完成：

(1) 从感染黄瓜花叶病毒的植物组织中克隆获得CMV 2a的cDNA片段；

(2) 将克隆的cDNA片段与RNAi高通量表达载体pHellsgate2进行BP重组反应，构建CMV 2a RNAi植物表达载体；

(3) 将构建CMV 2a的RNAi表达载体通过根癌农杆菌介导转入目标植物中；

(4) 以重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过聚合酶链式反应获得真正的转基因植株，接种黄瓜花叶病毒，观察发病情况，最后筛选出对CMV抗性明显增强的转基因植株。

2.根据权利要求1所述培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法，其特征在于CMV 2a基因的cDNA片段长308bp，位于CMV 2a全长基因序列的1207bp-1515bp之间。

3.根据权利要求1所述培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法，其特征在于黄瓜花叶病毒2a基因RNAi植物表达载体，具有2a发夹RNA表达盒。

4.根据权利要求1或3所述培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法，其特征在于黄瓜花叶病毒2a基因发夹RNA表达盒自上游至下游依次包括花椰菜花叶病毒的35S启动子，表达2a基因发夹RNA的DNA分子和终止子。

5.根据权利要求4所述培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法及应用，其特征在于表达2a发夹RNA的DNA分子由三个组件构成，中间组件为一个内含子，两边组件分别为308bp的黄瓜花叶病毒复制酶2a基因片段。

6.根据权利要求1或3所述培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法，其特征在于表达2a发夹RNA的DNA分子其特征在于内含子两端的组件为反向互补的基因序列。

7.根据权利要求4所述培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法，其特征在于表达2a发夹RNA的DNA分子其特征在于内含子两端的组件为反向互补的基因序列。

8.根据权利要求5所述培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法，其特征在于表达2a发夹RNA的DNA分子其特征在于内含子两端的组件为反向互补的基因序列。

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