CN105274101A - 马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用，提供了：分离的多核苷酸，其序列如SEQIDNO:1、2所示；载体，含有SEQIDNO:1或2所示的多核苷酸；重组载体，含有如SEQIDNO:7所示的序列；马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体，是以pEarleyGate303为骨架载体，在重组位点处置换插入顺序连接的EcoRI、AsiSI、PRBCS3B启动子、NotI、SEQIDNO:1的序列、SbfI、RBCS3B的第2个内含子、BbvCI、SEQIDNO:1的反向互补序列、AscI、TRBCS3B终止子、EcoRI。

Description

马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种RNAi表达载体及其构建方法和应用，尤其涉及一种马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)属鞘翅目，叶甲科，是世界著名的毁灭性检疫害虫，原产在美国，后传入法国、荷兰等一些国家，现已广泛分布于欧美和亚洲的40多个国家，是中国外检对象。寄主主要是茄科植物，大部分是茄属，其中马铃薯是最适寄主，此外还可危害番茄、茄子、辣椒、烟草等。马铃薯甲虫是一种分布最广、为害最甚的马铃薯害虫，成虫和幼虫常常将马铃薯的叶片全部吃光，造成马铃薯减产30-50％，最严重的地方甚至减产90％左右。现在主要的防治措施还是通过喷洒化学农药，然而，一方面，化学农药的大量使用导致害虫产生了抗药性；另一方面，农药残留直接危害自然环境和人类的健康。虽然马铃薯甲虫传入我国才20年左右，但马铃薯甲虫抗药性水平发展很快，研究表明发生区大部分马铃薯甲虫种群对拟除虫菊酯类(三氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯)杀虫剂普遍产生中到极高水平的抗性。因此，积极开展马铃薯甲虫生物防治技术的研究与应用，对我国发生区马铃薯甲虫的危害实施科学有效控制，以及延缓其抗药性产生和抗药性治理具有十分重要作用。

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象，具有高效、特异、易操作等特点。由于使用RNAi技术可以特异性关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。通过基因干涉来防治马铃薯甲虫具有绿色、环保、可持续、经济有效等特点，有利于保护人们生命健康，由于RNAi具有高度的特异性，对非靶标基因或同源性不高的基因没有效果，具有极高的种间特异性，不危害人类的生命安全。

TOR(TargetofRapamycin)是一种进化中保守的丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，在酵母、动物、植物中通过整合营养和能量信号来促进细胞的增殖和生长。TOR信号通路在动物胚胎形成、分生组织激活，植物根和叶的生长、开花、衰老和生命周期的控制中都扮演着关键作用。近几年研究发现，TOR还具有调节核糖体的生物合成、促进翻译、新陈代谢调节和抑制自噬的功能。在模式动物线虫、果蝇和小鼠中，TOR基因的缺失能够导致动物胚胎致死，说明TOR基因是动物体内的必须基因，在动物的生长发育进程中扮演着核心作用。构建TOR基因的RNAi载体来干扰马铃薯甲虫的TOR基因在马铃薯甲虫中还没有被研究过。

发明内容

本发明的目的是提供马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。提供另一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有SEQIDNO:1或2所示的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种重组载体，含有如SEQIDNO:7所示的核苷酸序列，所述重组载体是以pCR8/GW/TOPO载体为骨架载体，在多克隆酶切位点处插入顺序连接的EcoRI酶切位点、AsiSI酶切位点、PRBCS3B启动子、NotI酶切位点、SEQIDNO:1所示的序列、SbfI酶切位点、RBCS3B的第2个内含子、BbvCI酶切位点、SEQIDNO:1所示序列的反向互补序列、AscI酶切位点、TRBCS3B终止子、EcoRI酶切位点。

在本发明的另一方面，提供一种马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体，所述RNAi表达载体是以植物表达载体pEarleyGate303为骨架载体，在重组位点处置换插入顺序连接的EcoRI酶切位点、AsiSI酶切位点、PRBCS3B启动子、NotI酶切位点、SEQIDNO:1所示的序列、SbfI酶切位点、RBCS3B的第2个内含子、BbvCI酶切位点、SEQIDNO:1所示序列的反向互补序列、AscI酶切位点、TRBCS3B终止子、EcoRI酶切位点。

在本发明的另一方面，提供一种含有前述马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体的微生物转化体。

在本发明的另一方面，提供一种前述的马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体的制备方法，包括如下步骤：

((1)合成如SEQIDNO:1和2所示的序列，SEQIDNO:1所示的序列命名为TOR-RNAi，SEQIDNO:2所示的序列命名为RBCS3B-IN2，对pCR8/GW/TOPO载体和RBCS3B-IN2序列进行酶切连接，获得含有RBCS3B-IN2的载体，命名为pRBCS3B-IN2；

(2)将步骤(1)合成的TOR-RNAi序列和载体pRBCS3B-IN2进行酶切连接得到载体pRBCS3B-TORIN2；

(3)将载体pRBCS3B-TORIN2和TOR-RNAi序列进行酶切连接得到载体pRBCS3B-TORRI，pRBCS3B-TORRI中含有如SeqIDNo：7所示的序列；

(4)将pRBCS3B-TORRI中插入的SeqIDNo：7序列重组到植物表达载体pEarleyGate303上，得到马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体。

在本发明的另一方面，提供一种SEQIDNO:1所示的多核苷酸的用途，用于作为制备特异性干扰马铃薯甲虫基因表达或抑制亚马铃薯甲虫生长的干扰分子的抑制或沉默靶标。

在本发明的另一方面，提供一种SEQIDNO:1所示的多核苷酸或SEQIDNO:2所示的多核苷酸或含有SEQIDNO:1或2所示的多核苷酸的载体或含有序列如SEQIDNO:7所示的重组载体或前述马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体在培育抗马铃薯甲虫的转基因植物中的应用。

本发明的有益效果是：构建了一种针对马铃薯甲虫TOR基因的RNAi载体，实验证明将该载体转入到马铃薯野生型植株中后，转基因植株对马铃薯甲虫的抗性明显增加，证明本发明构建的马铃薯甲虫TOR基因的RNAi载体十分有效。本发明对培育抗虫植物具有重要意义，有很好的应用前景，对降低农药使用、延缓害虫抗性的产生、对维持生态系统的平衡和可持续发展也具有重大的应用价值。

附图说明

图1为载体pRBCS3B-IN2的结构示意图。

图2为载体pRBCS3B-TORRI构建过程示意图。

图3为载体pRBCS3B-TORRI酶切后电泳条带图；其中条带1、2为pRBCS3B-TORRI载体用AsiSI和AscI酶切后的产物，条带3、4为pRBCS3B-TORRI载体用BbvCI和AscI酶切后的产物。

图4为载体pERBCS3B-TORRI构建过程示意图。

图5为转基因马铃薯基因组DNA的PCR检测结果；其中M为Trans2kplusDNAmarker,P为正对照pRBCS3B-TORRI质粒,WT为负对照野生型Co1-0，1～12为转基因马铃薯。

图6为饲喂马铃薯转基因植株的马铃薯甲虫的食叶量数据图。

图7为饲喂马铃薯转基因植株后马铃薯甲虫产卵前幼虫的平均质量数据图。

图8为饲喂马铃薯转基因植株后产卵前马铃薯甲虫幼虫的存活率数据图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

主要试剂及生产者：

酶EcoRI、AsiSI、BbvCI、AscI、NotI、SbfI均为(NEB公司，美国)，pCR8/GW/TOPO载体(Invitrogen公司，美国)，胶回收试剂盒(Takara公司，日本)，T4DNA连接酶(Takara公司，日本)，DH5α感受态细胞(Takara公司，日本)，质粒提取试剂盒(Takara公司，日本),农杆菌LBA4404菌株、pEarleyGATE303载体(重庆大学生命科学学院植物分子育种实验室提供)，DNA提取试剂盒(天根公司，中国)，去磷酸化试剂盒(Takara公司，日本)，TaqDNAPolymerase(全式金公司，中国)，GatewayLRClonaseenzymemix(Invitrogen公司，美国)，质粒DNA提取试剂盒(Takara公司，日本)。本发明实施例中的各序列合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1马铃薯甲虫TOR基因RNAi载体的构建

一、马铃薯甲虫TOR基因RNAi片段的获取及合成

通过马铃薯甲虫基因组数据库(https://www.hgsc.bcm.edu/colorado-potato-beetle-genome-project)找到了马铃薯甲虫TOR基因的全长CDS序列。用马铃薯甲虫TOR的CDS序列在NCBI中进行同源性比对，找出一段最保守序列，在序列的5’端加上AscI-NotI酶切位点，在3’端加上SbfI-BbvCI酶切位点，得到最终的序列，命名为TOR-RNAi,序列如序列表SeqIDNo：1所示，合成该序列。

二、马铃薯甲虫TOR基因RNAi载体的构建

按照如下步骤操作：

(1)合成如序列表SeqIDNo：2所示的序列，将该序列命名为RBCS3B-IN2，该序列包含EcoRI、AsiSI、NotI、SbfI、BbvCI和AscI酶切位点(如下面序列所示，下划线字母依次表示该6个酶切位点)，该序列含有拟南芥核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶的启动子(PRBCS3B)、RBCS3B的第2个内含子(Intron2)和拟南芥核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶的终止子(TRBCS3B)序列。RBCS3B-IN2的序列为：

GAATTCGCGATCGCTTTCATTTGTAAAATAGAAATTTCTAATTTTTTTTCTAAAGCAAAAAATAGAGATTTTTATTTTTTCTCTTATTTATTTTTTCTAACGAATTTTTGAGGAACCATTGAAGTTAAAATATAAATCTCTATTATATTTTTTCCTCTATATTCAGAAAGAAAATAATAGAAACAAATATTGGAGATGGTTAAAGCTTTTTTTTTTGTCCGGATAAATATCATACAATATATTTATGTAAATATCAAATTTAAATAATTTTGTTATAACTATTTTTTAATGCGACCTTATTTCCAAAGAAAGTGTTAAGCCAAATTAAATCATACATGGTAAATAAGAGGTCCAAAAGACCAAAAGCATTAAATTTAAGGTAATGCGTCTGGTTTCTTTTCTCCCAAACGAAAGGAGCCAAAAGCAACCGATCAAGTGGAGACCAGTAACCGCACATTCACTTCATTTCCCCCACAAGAGAAAAGATAAGATAATGGAGTTTTCTGCCACGTGGCCTTATCCTAGTGGTGCGTACCGATAAGGGTGTCAACACCTTTCCTTAATCCTGTGGCAGTAAACGACGTTATCATGAATCATGGACCCTTTGATCATGAGGGCTTTTCGCCTTTAGGGGGTTCTCATTATATAAAGATGACAACACCAGTAGGAAAACAAGTCAGTAAGTAAACGAGCAAAAGAAGAAGAGAAACAACAAGAAGTAGTAGCGGCCGCAAAAAACCTGCAGGAAAGTTTTCTTTTGTCTACTAATCATTATTATTTATTCGTTTTCATTGCTAGAAATATTAGCCTATAACCGGATTTTGTAGAACCGAAATAGACTATATCACCTTGTGCATATCCTCCAATATCAATTGTATTGAATGGTTTTCTTATGTGTTTATAGCACCCTCAGCAAAAAAGGCGCGCCTTTCTTTTCTAAAACATTCTTATGAATTATCTCTGCTCATTTCATTTCCTATTGTCTGTGTTCTTTTTCTCTTTATGAGACAATTTCTATCGGATTGTCAAATGTCTGATTTATGAATATGTAATTTATATATCCGTGCGTCTTGATTTTTTCCGATGGTTAACTAGTTTGAAAATTTCCGATGAGATAAGACAACATACAAAAAATCGAATAAATTGTGTAAATATAGATAATAGTGACATATGGATTTGTATTCATATTTGTCCATTGTTTTAAGAGGAAAAAAGTTACAAAATCTTATTTTCTTAATAATAAGTAAATTTACTTTATAAGGACTGTGAAGTGTGTAACATGTGTTTGTAGATCTCAGTCACACAGAGTTATTACCTTAAAGGAAAAGGATGGTCCACTTGAAAGGATGATAGACACATTTGTGGACGGTGCCAGTGCCATATACATAAGATAGGCTTGCGGATAAGAGTCCACTTTTAAATTTATGATTAAGACCCTTTTCTTAATGATCTCACATATCAATCTGAAACTTGTGTGTCAACATTGTCTTAATGACCTGAAATATCAATTTGAAACTTGTGTGTTCATTGACTTAATGAAACTACAAGAAATCATCGAATTC

用EcoRI对pCR8/GW/TOPO载体和RBCS3B-IN2序列进行单酶切，酶切体系为50μL体系，如下所示：

37℃酶切3小时后，用胶回收试剂盒回收相应的片段。将回收的载体pCR8/GW/TOPO用去磷酸化试剂盒去磷酸化，防止自连。将酶切的RBCS3B-IN2片段和去磷酸化的载体pCR8/GW/TOPO进行连接，连接体系为5μL体系，如下所示：

置于冰水混合物上过夜连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，菌液PCR鉴定阳性克隆。用引物PRBCS3BF(如序列表SeqIDNo：3所示)和Intron2R(如序列表SeqIDNo：4所示)鉴定阳性克隆，PCR扩增的反应体系为50μL体系，包括5μL10×TaqBuffer、4μL2.5mMdNTPs、1μLTaqDNAPolymerase、1μL10μMPRBCS3BF引物、1μL10μMIntron2R引物、1μL的菌液作为模板，用ddH₂O补足至50μL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,40个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增得到450bp左右的片段即为阳性克隆。获得含有RBCS3B-IN2的载体，命名为pRBCS3B-IN2，其结构如图1所示。引物序列为：PRBCS3BF:5’-AACCGCACATTCACTTCATTTC-3’,Intron2R:5’-CACATAAGAAAACCATTCAATAC-3’。

(2)将前述合成的TOR-RNAi(331bp)序列和载体pRBCS3B-IN2分别用内切酶NotI和SbfI进行酶切，酶切体系为50μL体系，如下所示：

37℃酶切3小时后，用胶回收试剂盒分别回收相应的片段。将回收的TOR-RNAi和载体pRBCS3B-IN2进行连接，连接体系为5μL体系，如下所示：

置于冰水混合物上过夜连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，用引物TOR-RNAiF(如序列表SeqIDNo：5所示)和Intron2R鉴定菌液阳性克隆，TOR-RNAiF:5’-ATGCTCAAACACCTCCACCTTC-3’。

鉴定阳性克隆的步骤方法与本步骤前述鉴定阳性克隆的步骤方法一样，只是将相应的对象和引物置换即可。PCR扩增得到450bp左右的片段即为阳性克隆。得到pRBCS3B-IN2+TOR-RNAi的载体，命名为pRBCS3B-TORIN2。

(3)用质粒提取试剂盒提取pRBCS3B-TORIN2质粒。再将合成的TOR-RNAi序列和pRBCS3B-TORIN2质粒用内切酶BbvCI和AscI进行酶切连接，酶切连接体系和方法同本步骤前述酶切连接方法，只是相应的对象和内切酶不同。用引物Intron2F(如序列表SeqIDNo：6所示)和TOR-RNAiF鉴定阳性克隆，PCR扩增得到400bp左右的片段即为阳性克隆，Intron2F：5’-GGATTTTGTAGAACCGAAATAGAC-3’，鉴定阳性克隆的步骤方法与本步骤前述鉴定阳性克隆的步骤方法一样，只是将相应的对象和引物置换即可。获得pRBCS3B-TORIN2+TOR-RNAi的载体，命名为pRBCS3B-TORRI(其序列如序列表SeqIDNo：7所示)，其构建过程示意图如图2所示，即为以pCR8/GW/TOPO载体为骨架载体，在多克隆酶切位点处插入顺序连接的EcoRI酶切位点、AsiSI酶切位点、PRBCS3B启动子、NotI酶切位点、SEQIDNO:1所示的序列、SbfI酶切位点、RBCS3B的第2个内含子、BbvCI酶切位点、SEQIDNO:1所示序列的反向互补序列、AscI酶切位点、TRBCS3B终止子、EcoRI酶切位点，在pCR8/GW/TOPO中插入的这些片段连接起来的序列如序列表SeqIDNo：7所示，将该序列命名为RBCS3B-TORRI。pRBCS3B-TORRI载体中的TOR序列能够形成一个茎环结构，以达到干扰马铃薯甲虫TOR基因的目的。将构建的载体pRBCS3B-TORRI进行酶切验证，一组酶切体系为用内切酶AsiSI、AscI，另一组酶切体系为用内切酶BbvCI、AscI，酶切体系均为50μL体系，如下所示：

37℃酶切3小时后，用1％的琼脂糖跑胶，结果如图3所示。图中1、2为pRBCS3B-TORRI载体用AsiSI和AscI酶切后的产物，大片段为3451bp，小片段为1590bp；图中3、4为pRBCS3B-TORRI载体用BbvCI和AscI酶切后的产物，大片段为4710bp，小片段为331bp，同时得到这4个大小片段的pRBCS3B-TORRI载体即为构建成功的载体。酶切验证后将正确的pRBCS3B-TORRI载体送去测序，测序结果显示所得到的载体为正确的构建。

(4)再通过GatewayLR反应将pRBCS3B-TORRI中插入的SeqIDNo：7序列重组到植物表达载体pEarleyGate303上，LR反应体系为2.5μL体系，如下所示：

在PCR仪中25℃反应3小时，反应产物转化DH5α感受态细胞。用PRBCS3BF和Intron2R引物鉴定阳性克隆,PCR扩增得到750bp左右的片段即为阳性克隆。得到pEarleyGate303+RBCS3B-TORRI的载体，命名为pERBCS3B-TORRI，其构建过程示意图如图4所示。鉴定阳性克隆的步骤方法与前述步骤(3)中鉴定阳性克隆的步骤方法一样，只是将相应的对象和引物置换，将循环程序中的72℃延伸时间改为40s即可。

实施例2转基因马铃薯植株的获得

按照如下步骤操作：

(1)将实施例1得到的pERBCS3B-TORRI载体转化农杆菌LBA4404菌株，转化步骤为：1)在装有50μL农杆菌LBA4404菌株感受态细胞的离心管中加入pERBCS3B-TORRI载体质粒DNA(用质粒DNA提取试剂盒提取得到，操作方法参考试剂盒说明书)5μL，轻轻混匀后冰浴30min；2)放入液氮中1min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3)取出离心管，置于冰上冰浴3min；4)在超净工作台中将离心管中冰浴后的液体加入500μLLB液体培养基，28℃、200rpm振荡培养4h；5)取出菌液在含有利福平和卡那霉素各50mg/L的LB固体培养基上涂板，待干后在28℃培养箱中倒置培养。2天左右菌落可见。

挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃、220rpm振荡培养过夜。用PRBCS3BF和Intron2R引物鉴定阳性克隆,PCR扩增得到750bp左右的片段即为阳性克隆。PCR扩增的反应体系为50μL体系，包括5μL10×TaqBuffer、4μL2.5mMdNTPs、1μLTaqDNAPolymerase、1μL10μMPRBCS3BF引物、1μL10μMIntron2R引物、1μL的菌液作为模板，用ddH₂O补足至50μL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸40s,40个循环，最后72℃延伸10min。将阳性克隆的菌液接种到新鲜无菌的LB液体培养基(含利福平和卡那霉素各50mg/L)中,28℃200rpm震荡培养至OD600大约为0.8时,5000rpm离心10min,将菌体用15mL无菌的MS液体培养基重悬，制得用于转化马铃薯的菌液。

(2)农杆菌介导的马铃薯遗传转化步骤如下：1)在90mm平板培养皿中加入15mL无菌的MS液体培养基，然后将90个左右的外植体(5-6mm长，不能含有叶芽)放入培养皿中，再加入1mLMS悬浮的步骤(1)中制备好的转化马铃薯的菌液，用封口膜密封，置于细菌恒温摇床中，22℃；50rpm转化45分钟。2)用无菌滤纸将外植体表面的水分吸干，然后置于CM培养基上(每个平板上放30个外植体)。将平板密封后，在18-22℃，弱光处(光照强度为20μE/m²/s)转化48h。3)然后将转化好的外植体置于CMC培养基上进行共培养，每个平板上的外植体应低于10个。将平板密封后，在18-22℃，充足光照处(光照强度为80-110μE/m²/s)16h光照8h黑暗培养。4)12天后，将CMC培养基中的外植体转移到CMCK培养基中进行培养。5)每14天更换一次新的CMCK培养基。6)愈伤组织和丛生芽在4周后出现，然后继续培养。当大约第三次更换CMCK培养基时，小心剪下5-10mm左右的丛生芽，然后置于SM培养基中正常培养。7)继续每14天转移一次外植体，同时剪下后长出丛生芽，确保每个芽发育成单独的植株。

前述各培养基配方为：

共培养基(CM)：在MS培养基中加入0.2mg/L的NAA，0.02mg/L的GA3，2.5mg/L的玉米素核苷(ZR)。

第一阶段再生培养基(CMC)：在CM培养基中加入500mg/L的头孢霉素。

第二阶段再生培养基(CMCK)：在MS培养基中加入0.02mg/L的NAA，0.02mg/L的GA3，2mg/L的玉米素核苷(ZR)，500mg/L的头孢霉素，50mg/L的卡那霉素。

选择培养基(SM)：在MS培养基中加入500mg/L的头孢霉素，50mg/L的卡那霉素。

(3)对获得的抗性马铃薯植株做PCR检测,用DNA提取试剂盒提取抗性马铃薯植株DNA。PCR扩增的反应体系为50μL体系，包括5μL10×TaqBuffer、4μL2.5mMdNTPs、1μLTaqDNAPolymerase、1μL10μMPRBCS3BF引物、1μL10μMIntron2R引物、1μL的DNA作为模板，用ddH₂O补足至50μL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸40s,40个循环；最后72℃延伸10min。最后获得转抗虫基因植株。将转入马铃薯甲虫TOR-RNAi片段的马铃薯命名为CPB-TORRI/WT。图5为转基因马铃薯基因组DNA的PCR检测结果，扩增出745bp条带的植株即为转基因成功的植株。

实施例3转基因马铃薯的抗虫能力研究

1、马铃薯甲虫的群体饲养

在实验室繁殖培养马铃薯甲虫,其培养条件为26℃,16h光照/8h黑暗。用马铃薯野生型植株叶片饲养马铃薯甲虫幼虫,待成虫产卵后，将虫卵转移到带有滤纸的干净的塑料培养皿中,待虫卵孵化后,用孵化的幼虫做转TOR-RNAi片段马铃薯的抗虫性检测实验。

2.转TOR-RNAi片段马铃薯对马铃薯甲虫抗性的分析

分别用转基因马铃薯CPB-TORRI/WT不同株系T3-2、T3-7、T3-8和野生型马铃薯WT(作为阴性对照)叶片饲养马铃薯甲虫初孵幼虫,平均每个株系饲喂30头马铃薯甲虫初孵幼虫，每天早晚各饲喂一次。统计马铃薯甲虫的食叶量、产卵前马铃薯甲虫幼虫的平均质量、产卵前马铃薯甲虫幼虫的存活率。分别统计了饲喂叶片后第3天、第5天、第7天和第9天的数据。结果如图6、7所示，饲喂转基因植株T3-2、T3-8叶片的马铃薯甲虫食叶量和平均重量显著低于对照组WT；饲喂转基因植株T3-7叶片的马铃薯甲虫RNAi效果弱于转基因植株T3-2、T3-8。从马铃薯甲虫的存活率来看，如图8所示，随着饲喂转基因叶片时间的增加，马铃薯甲虫的存活率逐渐降低，到第9天时，饲喂转基因植株T3-2、T3-8叶片的马铃薯甲虫存活率只有20％左右；而饲喂转基因植株T3-7叶片的马铃薯甲虫存活率在40％左右。从图6～8可以看出，转基因植株T3-2、T3-8对马铃薯甲虫具有显著的抗虫性，而转基因植株T3-7对马铃薯甲虫的抗虫性要弱于转基因植株T3-2、T3-8。通过以上实验，说明我们构建的马铃薯TOR基因RNAi载体在对马铃薯甲虫的防治上有显著效果，在马铃薯甲虫的基因干涉防治上应用前景广阔。

Claims (9)

1.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。

3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1或2所述的多核苷酸。

4.一种重组载体，其特征在于，含有如SEQIDNO:7所示的核苷酸序列，所述重组载体是以pCR8/GW/TOPO载体为骨架载体，在多克隆酶切位点处插入顺序连接的EcoRI酶切位点、AsiSI酶切位点、PRBCS3B启动子、NotI酶切位点、SEQIDNO:1所示的序列、SbfI酶切位点、RBCS3B的第2个内含子、BbvCI酶切位点、SEQIDNO:1所示序列的反向互补序列、AscI酶切位点、TRBCS3B终止子、EcoRI酶切位点。

5.一种马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体，其特征在于：所述RNAi表达载体是以植物表达载体pEarleyGate303为骨架载体，在重组位点处置换插入顺序连接的EcoRI酶切位点、AsiSI酶切位点、PRBCS3B启动子、NotI酶切位点、SEQIDNO:1所示的序列、SbfI酶切位点、RBCS3B的第2个内含子、BbvCI酶切位点、SEQIDNO:1所示序列的反向互补序列、AscI酶切位点、TRBCS3B终止子、EcoRI酶切位点。

6.一种含有权利要求5所述RNAi表达载体的微生物转化体。

7.一种权利要求5所述的马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)合成如SEQIDNO:1和2所示的序列，SEQIDNO:1所示的序列命名为TOR-RNAi，SEQIDNO:2所示的序列命名为RBCS3B-IN2，对pCR8/GW/TOPO载体和RBCS3B-IN2序列进行酶切连接，获得含有RBCS3B-IN2的载体，命名为pRBCS3B-IN2；

(2)将步骤(1)合成的TOR-RNAi序列和载体pRBCS3B-IN2进行酶切连接得到载体pRBCS3B-TORIN2；

(3)将载体pRBCS3B-TORIN2和TOR-RNAi序列进行酶切连接得到载体pRBCS3B-TORRI，pRBCS3B-TORRI中含有如SeqIDNo：7所示的序列；

(4)将pRBCS3B-TORRI中插入的SeqIDNo：7序列重组到植物表达载体pEarleyGate303上，得到马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体。

8.一种权利要求1所述的多核苷酸的用途，用于作为制备特异性干扰马铃薯甲虫基因表达或抑制亚马铃薯甲虫生长的干扰分子的抑制或沉默靶标。

9.一种权利要求1所述的多核苷酸或权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的载体或权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体在培育抗马铃薯甲虫的转基因植物中的应用。