CN109880826A - dsRNA在马铃薯甲虫防治中的应用及产品 - Google Patents

Abstract

dsRNA在马铃薯甲虫防治中的应用及产品，涉及基因产品在马铃薯甲虫防治中的应用及衍生产品。本发明dsRNA产品稳定性强、生产技术成熟、成本低，是有效价廉的专一性强、绿色、环保的“基因农药”产品。本发明dsRNA产品在马铃薯甲虫防治中的应用对于马铃薯甲虫的防治具有重大和深远的意义。本发明马铃薯甲虫杀虫剂低剂量喷施马铃薯植株叶片后，盆栽马铃薯植株上能够持续防虫28天以上，防效达80％以上；室外强紫外条件下，本发明马铃薯甲虫杀虫剂对马铃薯甲虫仍具有较强的毒杀作用，田间防控持效期在3周左右，且防效从50％逐渐下降至10％左右。

Description

dsRNA在马铃薯甲虫防治中的应用及产品

技术领域

本发明涉及一种基因产品在马铃薯甲虫防治中的应用及衍生产品。

背景技术

马铃薯是世界上重要的粮、菜、饲兼用作物和工业原料作物，近年来，由于其比较经济效益明显等特点在我国种植面积不断增大，目前已成为我国继水稻、小麦、玉米之后的第4大主粮作物。马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata又名马铃薯叶甲，英文名Colorado Potato Beetle(CPB)隶属鞘翅目，叶甲科，被公认为世界范围内马铃薯的毁灭性害虫，也是我国对外重大检疫对象之一。其寄主范围相对较窄，主要危害马铃薯、茄子、栽培番茄、天仙子、黄花刺茄等20余种茄科植物。该重大外来有害生物自上个世纪90年代初马铃薯甲虫首次传入我国的新疆地区以来，其不断扩散蔓延，目前已成为新疆马铃薯种植业最突出、最主要的植保问题，并对我国甘肃等内地马铃薯主要种植区相关种植业的健康发展构成了巨大威胁。由于其具有高繁殖率、暴食性、兼性滞育、迁飞和世代重叠等特性，环境适应能力和生态可塑性极强，极易产生强抗药性，探索并开展其新型生防防治技术等相关研究已成为一个热点。

RNAi(RNA interference,RNA干扰)是一种古老的、在多细胞真核生物中存在的、通过外源的dsRNA、siRNA或内源的miRNA引发的在转录后基因沉默的现象(Post-transcriptional Gene Silencing,PTGS)。一般认为，该过程主要参与病毒免疫、基因表达调控等过程。

但目前RNAi技术仍有明显不足：①引发RNAi作用的dsRNA或siRNA在环境中易被无处不在的核酸酶降解，故不稳定；②生产和保存的dsRNA技术尚未成熟，生产成本高。

发明内容

本发明dsRNA产品稳定性强、生产技术成熟、成本低，是有效价廉的专一性强、绿色、环保的“基因农药”产品。本发明dsRNA产品在马铃薯甲虫防治中的应用对于马铃薯甲虫的防治具有重大和深远的意义。

本发明dsLdcact在马铃薯甲虫防治中的应用，dsLdcact的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

进一步的，dsLdcact作为马铃薯甲虫杀虫剂的活性成分。

优选的，用含有表达dsLdcact的转基因工程菌的菌液作为马铃薯甲虫杀虫剂。

进一步的，用原核表达载体构建表达dsLdcact的表达载体。

本发明马铃薯甲虫杀虫剂有效成分为dsLdcact，dsLdcact的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

进一步的，马铃薯甲虫杀虫剂为含有表达dsLdcact的转基因工程菌的菌液。

本发明dsLdcact表达载体，编码dsLdcact的DNA序列如SEQ ID NO:2所示，载体为原核表达载体。

进一步的，所述的原核表达载体为pET-2p。

本发明马铃薯甲虫致死基因dsLdcact的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明表达dsLdcact的转基因工程菌，以大肠杆菌Escherichia coli HTl15(DE3)为宿主，以dsLdcact表达载体为转录表达载体。

本发明马铃薯甲虫杀虫剂对马铃薯甲虫幼虫具有特异性、致死效率高，作用过程快的优点。

本发明马铃薯甲虫杀虫剂低剂量喷施马铃薯植株叶片后，盆栽马铃薯植株上能够持续防虫28天以上，防效达80％以上；室外强紫外条件下，本发明马铃薯甲虫杀虫剂对马铃薯甲虫仍具有极强的毒杀作用，田间防控持效期在3周左右，且防效从50％逐渐下降至10％左右。

本发明技术方案在世界上首次构建出原核表达的dsRNA。用原核表达dsRNA可以大幅减少dsRNA的生产成本，本发明每毫升菌液发酵量可达50μg，即便选用价格昂贵的进口蛋白胨、酵母提取物等制作培养基，1g的生产成本也不到100美金。

附图说明

图1是实施例1喂食浓度梯度的dsRNA后第一天幼虫取食的危害等级，其中L2为喂食dsLdcact菌液，L11为喂食dsATPaseA菌液、L12为喂食dsATPaseE菌液。

图2是实施例1喂食浓度梯度的dsRNA后第二天幼虫取食的危害等级，其中L2为喂食dsLdcact菌液，L11为喂食dsATPaseA菌液、L12为喂食dsATPaseE菌液。

图3是实施例1喂食浓度梯度的dsRNA后第三天幼虫取食的危害等级，其中L2为喂食dsLdcact菌液，L11为喂食dsATPaseA菌液、L12为喂食dsATPaseE菌液。

图4是实施例1喂食浓度梯度的dsRNA后第四天幼虫取食的危害等级，其中L2为喂食dsLdcact菌液，L11为喂食dsATPaseA菌液、L12为喂食dsATPaseE菌液。

图5是实施例1喂食马铃薯甲虫2龄幼虫dsRNA菌液后第7天的存活率，其中L2为喂食dsLdcact菌液，L11为喂食dsATPaseA菌液、L12为喂食dsATPaseE菌液。

图6是实施例1喂食dsRNA菌液的马铃薯甲虫幼虫化蛹率，其中L2为喂食dsLdcact菌液，L11为喂食dsATPaseA菌液、L12为喂食dsATPaseE菌液。

图7是实施例1喂食dsRNA菌液的马铃薯甲虫2龄幼虫的盆栽一个月后回收率统计图，其中L2为喂食dsLdcact菌液，L11为喂食dsATPaseA菌液、L12为喂食dsATPaseE菌液。

图8是实施例1喂食dsLdcact菌液的马铃薯甲虫2龄幼虫的盆栽一个月后长势图。

图9是实施例1喂食dsRNA菌液的马铃薯甲虫2龄幼虫的盆栽每周回收幼虫体重的统计图，其中L2为喂食dsLdcact菌液，L11为喂食dsATPaseA菌液、L12为喂食dsATPaseE菌液。

图10是实施例1喷施dsRNA菌液田间马铃薯植株对马铃薯甲虫2龄幼虫死亡率统计图，其中L2为喂食dsLdcact菌液，L11为喂食dsATPaseA菌液、L12为喂食dsATPaseE菌液。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式dsLdcact在马铃薯甲虫防治中的应用，其中dsLdcact的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：dsLdcact作为马铃薯甲虫杀虫剂的活性成分。其它与实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：用含有表达dsLdcact的转基因工程菌的菌液作为马铃薯甲虫杀虫剂。其它与实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：所述含有表达dsLdcact的转基因工程菌是以大肠杆菌Escherichia coli HTl15(DE3)为宿主，以dsLdcact表达载体为转录表达载体。其它与实施方式三相同。

Escherichia coli HTl15(DE3)为RNA酶Ⅲ缺陷型菌株。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四的不同点是：所述dsLdcact表达载体为原核表达载体。其它与实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：所述原核表达载体为pET-2p。其它与实施方式五相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六的不同点是：编码dsLdcact的DNA序列如SEQ ID NO:2所示。其它与实施方式一至六相同。

具体实施方式八：本实施方式马铃薯甲虫杀虫剂，有效成分为dsLdcact，dsLdcact的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八的不同点是：马铃薯甲虫杀虫剂为含有表达dsLdcact的转基因工程菌的菌液。其它与实施方式八相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式九的不同点是：所述含有表达dsLdcact的转基因工程菌是以大肠杆菌Escherichia coli HTl15(DE3)为宿主，以dsLdcact表达载体为转录表达载体。其它与实施方式九相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式十的不同点是：所述dsLdcact表达载体为原核表达载体。其它与实施方式十相同。

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式十一的不同点是：所述原核表达载体为pET-2p。其它与实施方式十一相同。

具体实施方式十三：本实施方式dsLdcact表达载体，其中编码dsLdcact的DNA序列如SEQ ID NO:2所示，载体为原核表达载体。

具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式十三的不同点是：所述的原核表达载体为pET-2p。其它与实施方式十三相同。

具体实施方式十五：本实施方式表达dsLdcact的转基因工程菌，以大肠杆菌Escherichia coli HTl15(DE3)为宿主，以dsLdcact表达载体为转录表达载体。

具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式十五的不同点是：所述dsLdcact表达载体为原核表达载体。其它与实施方式十五相同。

具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式十六的不同点是：所述原核表达载体为pET-2p。其它与实施方式十六相同。

具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式十五至十七的不同点是：其中编码dsLdcact的DNA序列如SEQ ID NO:2所示。其它与实施方式十五至十七相同。

实施例1致死基因致死效率实验

(1)试验虫源

马铃薯甲虫卵块均随机采集于新疆农科院植物保护研究所安宁渠试验地。(N：43.9128，E：87.4918)。培养箱饲养温度：26(±1)℃；光周期：14L：10D；相对湿度50％～60％。用新鲜马铃薯叶片饲喂，取同一时间蜕皮至2龄初的幼虫作实验用虫。

(2)马铃薯甲虫备选致死基因的获取

在马铃薯甲虫的转录组和基因组中(转录组数据由南京农业大学李国清老师提供，马铃薯甲虫的基因组数据下载自美国贝勒医学院人类基因组测序中心网站https:// www.hgsc.bcm.edu/arthropods/colorado-potato-beetle-genome-Project。)中搜索选取，得到序列SEQ ID NO:2(dsLdcact的cDNA片段)。

(3)dsRNA原核表达载体的构建

本实验以南京农业大学惠赠的大肠杆菌Escherichia coli HTl15(DE3)为宿主、以南京农业大学惠赠的pET-2p dsRNA为表达载体。

序列SEQ ID NO:2PCR，PCR产物的回收与纯化、连接和转化及单克隆的挑选，获得的阳性克隆通过测序和异丙基硫代半乳糖(isopropyl-D-hiogalactoside，IPTG)诱导发酵dsRNA验证结果。在菌液重新扩大培养至OD₆₀₀＝1.0时加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，发酵表达6h即可获得稳定表达的浓度约为0.05μg/μL的dsLdcact。采用Premier Primer5.0设计dsRNA片段的引物，上游引物为5’-GAGGGTTGCTCAGGGTAT-3’，下游引物为5’-TTCGCTGTCTTCAGTATCG-3’，dsLdcact片段长度为222bp。

(4)室内喂食实验

经饲喂马铃薯甲虫二龄幼虫不同浓度的dsLdcact，以超纯水和dsEGFP、LdATPaseE和LdATPaseA(LdATPaseE和LdATPaseA于2007年在Nature Biotechnology发表的“防控玉米根莹叶甲和马铃薯甲虫的转基因表达dsRNA的马铃薯和玉米的基因”中公开)为对照，并分析对幼虫的20％取食剂量AD₂₀、化蛹中量PD₅₀和幼虫7天致死中量LD₅₀。

连续喂食一周表达dsLdcact、dsATPaseE、dsATPaseA的菌液后，马铃薯甲虫幼虫表现出拒食、发育迟缓的情况。在4个剂量50μg、5μg、0.5μg、0.05μg的处理中，在剂量50μg与5μg处理叶片上的幼虫取食率呈明显下降趋势，极显著低于超纯水组、dsEGFP处理组和低浓度处理组叶片上幼虫的取食率。

处理24h时后，剂量50μg的dsLdcact、dsATPaseE、dsATPaseA组叶片取食率与dsEGFP处理组叶片上取食率差异不显著(P>0.05)，取食率均在25％以下，危害等级为Ⅰ；剂量0.05μg的dsLdcact、dsATPaseE、dsATPaseA组与dsEGFP组取食率差异不显著(P>0.05)，但与其它处理剂量组的取食率有差异(P<0.05)。处理72h和96h后，dsLdcact、dsATPaseE、dsATPaseA处理组幼虫取食量随天数增长呈明显下降趋势，浓度越高抑制反应越强，而在超纯水组和dsEGFP处理组幼虫取食率则呈继续上升，接近甚至达到IV级的取食为害，实验结果如图1～4所示。

考虑到幼虫在喂食表达dsRNA菌液后，于处理后第三天出现显著的取食抑制表型，各处理组浓度加大，拒食率升高，即以处理后第三天作为抑制取食表型的分析时刻。运用SPSS 20.0对幼虫3天的拒食率进行回归分析。dsLdcact拒食率回归方程为Y＝4.523x-2.302，取食20％剂量(AD₂₀)为1.57±0.09μg，稀释倍数为31.9±2.8倍；dsATPaseE拒食率回归方程为Y＝4.076x-1.71，取食20％剂量(AD₂₀)为3.47±0.06μg，稀释倍数为14.4±0.8倍；dsATPaseA拒食率回归方程为Y＝3.46x-1.187，取食20％剂量(AD₂₀)为5.29±0.27μg，稀释倍数为9.5±3.2倍。

dsLdcact、dsATPaseE、dsATPaseA处理组干扰后幼虫减少取食甚至停止进食，迫使其生长发育得到抑制，最后导致死亡。每日统计死亡头数，待老熟幼虫入土化蛹前，即dsRNA喂食处理第7天后统计死亡率。dsLdcact对马铃薯幼虫在入土前均具有一定的毒杀作用，在浓度为50μg/mL与5μg/mL下对马铃薯甲虫2龄幼虫表现出高致死活性，致死率均超过50％，致死活性随浓度增高而增大，表现出剂量依赖效应。与对照组存在显著差异(P＜0.05)，如图5所示。

运用SPSS20.0对处理后7天的死亡率进行显著性分析与回归分析。入土化蛹前时间大约为处理后的第7天，dsLdcact死亡率回归方程为Y＝3.708x-2.034，致死中量(LD₅₀)为1.84±0.30μg，稀释倍数为27.1±3.0倍；dsATPaseE死亡率回归方程为Y＝4.681x-2.245，致死中量(LD₅₀)为4.54±0.54μg，稀释倍数为11±0.3倍；dsATPaseA死亡率回归方程为Y＝4.308x-2.183，致死中量(LD₅₀)为3.08±0.23μg，稀释倍数为16.2±0.2倍。

老熟幼虫入土化蛹后第七天统计化蛹率，且化蛹率随处理浓度的增加而减小，dsLdcact处理组浓度为50μg/mL下对马铃薯甲虫老熟幼虫化蛹率低至0％，dsLdcact处理组在剂量为5μg下化蛹率均未超过50％，即使剂量低至0.05μg，也比对照降低幼虫20～30％的化蛹率，如图6所示。

运用SPSS21.0对老熟幼虫入土化蛹率进行显著性分析与回归分析。入土时间大约为7天，dsLdcact化蛹率回归方程为Y＝3.633x-2.262，化蛹中量(PD₅₀)为0.81±0.08μg，稀释倍数为61.5±0.0倍；dsATPaseE化蛹率回归方程为Y＝3.21x-2.261，化蛹中量(PD₅₀)为0.46±0.02μg，稀释倍数为109.8±15.9倍；dsATPaseA化蛹率回归方程为Y＝3.551x-2.428，化蛹中量(PD₅₀)为0.50±0.09μg，稀释倍数为100.8±11.7倍。

结果表明：dsLdcact对马铃薯甲虫幼虫有抑制取食、抑制化蛹及致死活性。其致死活性随浓度增高而增大，表现出剂量依赖效应，与对照存在显著差异。dsLdcact具有较高的生物活性，且dsLdcact的毒力高于dsATPaseE和dsATPaseA。

(5)盆栽喂食实验

在室内盆栽马铃薯上分别将表达dsLdcact、dsATPaseE、dsATPaseA、dsEGFP的稀释10倍菌液(浓度为5μg/mL)喷施于盆栽，待风干后，每株马铃薯放置5头马铃薯甲虫二龄幼虫自由取食，6个重复组，每个处理总计30头幼虫。待一周后回收幼虫，称重并统计死亡率，重新放置5头二龄幼虫，每周重复实验，每周对马铃薯植株和幼虫拍照。

盆栽马铃薯的诱导抗性实验连续开展四周，每周回收幼虫数量进行统计。实验进行到第7天超纯水与表达dsEGFP稀释10倍菌液对照组回收率分别高达55％、60％。dsLdcact处理组幼虫回收率<5％，与对照组存在极显著差异(P＜0.05)。第14天超纯水与表达dsEGFP稀释10倍菌液对照组回收率分别高达72.5％、57.5％；dsLdcact处理组幼虫回收率未超过20％与对照组存在显著差异(P＜0.05)。第21天超纯水与表达dsEGFP稀释10倍菌液对照组回收率分别为60％、50％；dsLdcact处理组幼虫回收率未超过30％。第28天超纯水与表达dsEGFP稀释10倍菌液对照组回收率分别为62.5％、65％；dsLdcact处理组幼虫回收率未超过20％。dsLdcact处理组马铃薯甲虫2龄幼虫回收率趋势均低于对照组幼虫，如图7所示。尤其是实验前两周数据表现出对试虫回收率显著的抑制作用与较好的致死效果。

盆栽马铃薯的诱导抗性实验连续开展四周。在试验中，每隔7d对试虫进行一次体重称量，观测其体重增长速率。实验进行到第7天超纯水与表达dsEGFP稀释10倍菌液组幼虫平均体重分别为0.149g、0.135g。dsLdcact处理组回收幼虫平均体重未超过0.05g与对照组存在极显著差异(P＜0.05)。第14天超纯水与表达dsEGFP稀释10倍菌液组回收幼虫平均体重分别为0.129g、0.122g；dsLdcact处理组回收幼虫平均体重未超过0.1g。第21天超纯水与表达dsEGFP稀释10倍菌液组回收幼虫平均体重分别为0.128g、0.124g，dsLdcact处理组回收幼虫平均体重未超过0.05g与对照组存在显著差异(P＜0.05)。第28天超纯水与表达dsEGFP稀释10倍菌液组回收幼虫平均体重分别为0.132g、0.153g，dsLdcact处理组回收幼虫平均体重未超过0.1g。dsLdcact处理组马铃薯甲虫2龄幼虫体重增长趋势均低于对照组幼虫体重增长趋势，如图9所示。尤其是实验前两周数据表现出对试虫体重增长显著的抑制作用，与较好的致死效果。

结果表明，dsLdcact的致死效果可长达28天以上，防效可最高可达80％以上，随后衰减至50％。

(6)田间小区试验

在田间小区马铃薯上将分别表达dsLdcact、dsATPaseE、dsATPaseA、dsEGFP的稀释10倍菌液，对田间进行菌液喷施。每周将马铃薯甲虫二龄幼虫置于9cm标准玻璃皿中，每个处理5头幼虫，6组生物学重复。用采自大田处理过的叶片进行饲喂。每天更换喂食的叶片均采自大田处理过的叶片。每天统计死亡率，实验开展一个月。

运用SPSS对饲喂各处理dsRNA马铃薯甲虫2龄幼虫4周死亡率进行方差分析，实验进行到第7天超纯水对照组幼虫死亡率为0，表达dsEGFP稀释10倍菌液处理组幼虫死亡率为8％，dsLdcact处理组幼虫死亡率较高为5.9％。，如图10所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作出了描述，若在本发明基础上作出一些修改或改进，而其并不偏离本发明之精神，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 新疆农业科学院植物保护研究所

<120> dsRNA在马铃薯甲虫防治中的应用及产品

<130> dsLdcact

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 222

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaggguugcu caggguauac ggcccugcac uacgcuguca agcaaagaga ugaagcucuc 60

augcaguacu ugauugacug uaagaauauc gacuuaaaag uggaaacgua ugcaggaaau 120

aauguccucg uauucaacaa aguaauucca gcuuccauca ggguguucuu aaggaaugaa 180

ggaguaccgu caccuuaucc uagcgauacu gaagacagcg aa 222

<210> 2

<211> 222

<212> DNA

<213> 马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)

<400> 2

gagggttgct cagggtatac ggccctgcac tacgctgtca agcaaagaga tgaagctctc 60

atgcagtact tgattgactg taagaatatc gacttaaaag tggaaacgta tgcaggaaat 120

aatgtcctcg tattcaacaa agtaattcca gcttccatca gggtgttctt aaggaatgaa 180

ggagtaccgt caccttatcc tagcgatact gaagacagcg aa 222

Claims (10)

1.dsLdcact在马铃薯甲虫防治中的应用，其特征在于，dsLdcact的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，dsLdcact作为马铃薯甲虫杀虫剂的活性成分。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用含有表达dsLdcact的转基因工程菌的菌液作为马铃薯甲虫杀虫剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用原核表达载体构建表达dsLdcact的表达载体。

5.马铃薯甲虫杀虫剂，其特征在于，马铃薯甲虫杀虫剂有效成分为dsLdcact，dsLdcact的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

6.根据权利要求5所述的马铃薯甲虫杀虫剂，其特征在于，马铃薯甲虫杀虫剂为含有表达dsLdcact的转基因工程菌的菌液。

7.dsLdcact表达载体，其特征在于，编码dsLdcact的DNA序列如SEQ ID NO:2所示，载体为原核表达载体。

8.根据权利要求7所述的dsLdcact表达载体，其特征在于，所述的原核表达载体为pET-2p。

9.表达dsLdcact的转基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌Escherichia coli HTl15(DE3)为宿主，以dsLdcact表达载体为转录表达载体。

10.马铃薯甲虫致死基因dsLdcact，其特征在于，dsLdcact的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。