CN102260706A - 一种农杆菌介导法获得转基因黄瓜植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种农杆菌介导法获得转基因黄瓜植株的方法，是利用农杆菌介导法将目的基因构建到植物表达载体pBI121上，然后转化根癌农杆菌LBA4404，侵染黄瓜，进而得到转基因黄瓜植株。主要包括以下步骤：外植体准备、预培养、侵染及共培养、选择及分化培养、生根培养等步骤，通过PCR鉴定所得株系是否呈阳性，再通过RT-PCR检测所得株系的表达情况，进一步确定获得转基因黄瓜植株。本发明是针对农杆菌介导法获得转基因黄瓜植株，具有外植体易得、再生和转化频率高、操作简单等优点，为创建黄瓜新种质提供新途径。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种农杆菌介导法获得转基因黄瓜植株的方法，是利用农杆菌介导法将目的基因构建到植物表达载体pBI121上，然后转化根癌农杆菌LBA4404，侵染黄瓜，进而得到转基因黄瓜植株，属于农业高新技术领域。
（二）背景技术
目前，应用较广泛的转基因技术有农杆菌介导法、花粉通道法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法等等，其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐。
农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体，通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触，以完成可遗传细胞的转化，然后利用组织培养的方法培育出转基因植株，并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。
黄瓜高效再生体系是实现农杆菌介导基因转化的基础，但当前黄瓜再生体系并不成熟，植物组织培养在黄瓜育种中的应用远没有在花卉、果树等园艺植物中那么广泛。对黄瓜组织培养的研究主要集中在外植体种类、苗龄、接种方式等方面，已经建立的再生体系存在再生频率低、再生周期长、遗传稳定差的缺点，严重影响了黄瓜遗传转化体系的建立。
本发明的目的是在建立一套完整高效的黄瓜再生体系基础上，进而建立高转化率的农杆菌介导法黄瓜遗传转化体系，获得转基因黄瓜植株，为创建黄瓜新种质提供新途径。
（三）发明内容
为了解决目前现有技术存在的黄瓜中基因转化率低的问题，建立高转化率的农杆菌介导法黄瓜遗传转化体系，获得转基因黄瓜植株，本发明提供了一种农杆菌介导法获得转基因黄瓜植株的方法，包括以下步骤：
1）选取6~7 d苗龄、两片子叶张开呈竖直状态的无菌黄瓜幼苗，切取连带下胚轴2 mm子叶，去除生长点，从下胚轴处纵切为二，切除子叶末端1/3部分，并切除叶缘得到外植体子叶节；将子叶节平铺于分化培养基[MS + 1.5~1.7 mg·L-1 6-苄基腺膘呤（6-BA）] 上置于黑暗中进行预培养2 d；
2）把经过预培养的子叶节浸没在农杆菌悬浮液中 15~20 min；侵染结束后用无菌纸吸干子叶节表面残留的菌液，将子叶节置于分化培养基（MS + 1.5~1.7 mg·L-1 6-BA）上于黑暗中进行共培养2~3 d；
3）共培养结束后，用含有250 mg·L-1羧苄青霉素（Cb）的液体 MS 培养基洗净子叶节表面农杆菌，用无菌纸吸干子叶节表面的液体；
4）将上述处理好的子叶节接种到分化及选择培养基（MS + 1.5~1.7 mg·L-1 BA +100~150 mg·L-1 Kan + 250 mg·L-1 Cb）上进行芽诱导培养不定芽；待不定芽长至1.5~2 cm 高时，将其从子叶节基部切下，接种到生根培养基（MS + 50mg·L-1 Kan）上进行生根培养。当不定芽基部产生大量须根，逐步开启封口膜，炼苗一周后移栽入土。
缓苗后，长出2~3片新叶时，提取所得黄瓜幼苗新叶的DNA和RNA，进行PCR鉴定，再通过RT-PCR 检测所得株系的表达情况，进一步确定获得转基因黄瓜植株。鉴定结果表明使用本发明转化方法所得转基因黄瓜幼苗植株转化率高达4.8%。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
1. 外植体易得：本发明所用外植体为黄瓜无菌苗子叶节，材料易得。
2. 再生频率高：本发明条件下，以子叶节为外植体，其再生频率高达94.3%；上胚轴再生频率为 21 %；而下胚轴、子叶、真叶不能产生不定芽。
3. 转化体系步骤简单：本发明条件下，经过预培养、侵染及共培养、选择及分化培养、生根培养等步骤，不必经过启动培养、芽伸长培养等步骤，简化了程序，操作简单。
4. 转化效率高：本发明条件下，使用150 mg·L-1Kan（卡那霉素）进行转基因株系筛选，所得转基因黄瓜幼苗植株转化率高达4.8%。
（四）附图说明
图1为外植体子叶节获得流程图
图中：（1）6~7 d苗龄、两片子叶张开呈竖直状态的无菌黄瓜幼苗，1子叶，2生长点，3下胚轴；（2）切取大部分下胚轴，上留2 mm 下胚轴3；（3）切取连带下胚轴2 mm 子叶；（4）去除生长点2；（5）从下胚轴处纵切为二；（6）切除子叶末端1/3部分；（7）切除子叶末端1/3部分后的子叶节；（8）切除叶缘；（9）切除叶缘后的子叶节
图2为pBI121载体结构示意图
图3为转基因黄瓜植株的PCR检测结果示意图
图中：泳道1-12为转基因黄瓜植株；泳道N为未转基因植株，作为阴性对照；泳道M为DL 2,000TM DNA Marker；泳道P为质粒 pBI121 的质粒 DNA 的 PCR 扩增结果，作为阳性对照
图4为转基因植株磷脂酶Dα基因的相对表达量示意图
图中：横坐标Control为未转基因黄瓜植株；T1-T5为转基因黄瓜植株
（五）具体实施方案
实施例1：依照发明步骤
1. 挑选成熟饱满的‘新泰密刺’黄瓜种子用 70-75 %（V:V）乙醇浸泡消毒 30 s，再用 4 %（V:V）NaClO浸泡消毒20 min，无菌水冲净后播种于大量元素和蔗糖含量减半的 1/2 MS 培养基上，培养条件为：每天光照 16 h，光照强度 1600-1800 lux，培养温度为（25±1）℃；
2. 选取6~7 d苗龄、两片子叶张开呈竖直状态的无菌黄瓜幼苗（1），切取连带下胚轴2 mm子叶（2），去除生长点（3），从下胚轴处纵切为二（4），切除子叶末端部分的1/3（5,6），并切除叶缘（7），得外植体子叶节（8），平铺到添加分化培养基（MS+1.5 mg·L-1 6-BA）上，置于黑暗中进行预培养2 d，预培养温度为（25±1）℃；
3.农杆菌悬浮液制备：所用农杆菌菌株为 LBA4404，质粒为 pBI121。LBA4404具有利福平（Rifampicin, Rif）和链霉素（Steptomycin, Stre）抗性。pBI121 中包含筛选基因 NPTⅡ ，具有 Kan 抗性，长 977 bp 的 cuPLDα 基因反向插入 35S 启动子的下游（图 2）。农杆菌每次使用前活化，取 1 ml 农杆菌菌液加入 Rif 、Stre 浓度均为 50 mg·L-1 的 LB 培养基中，37 ℃ 下 100~110 rpm 震荡过夜，农杆菌菌液浓度达到 OD600 = 0.4~0.6 时停止震荡，将农杆菌菌液置于灭菌的离心管中，10000 r/min 离心 3 min，滤去上清液，用与上清液相同体积的 MS 液体培养基溶解附着于离心管壁上的农杆菌制成农杆菌悬浮液。
4. 把预培养的外植体子叶节浸没在上述农杆菌悬浮液中 15~20 min，侵染结束后用无菌纸吸干外植体表面残留的菌液，将外植体子叶节置于分化培养基（MS+1.5 mg·L-1 6-BA）上，放于黑暗中进行共培养2~3 d；
5. 共培养结束后，用含有250 mg·L-1羧苄青霉素（Cb）的液体 MS 培养基洗净外植体表面农杆菌，用无菌纸吸干外植体表面的液体。将处理好的外植体接种到分化及选择培养基（MS + 1.5 mg·L-1 6-BA +150 mg·L-1 Kan + 250 mg·L-1 Cb）上，进行芽诱导培养，每10~15 d继代一次，大约需要25~30 d；
6. 当不定芽长至1.5~2 cm 高时，将其从外植体基部切下，接种到生根培养基（MS + 50 mg·L-1 Kan）上，进行生根培养，大约需要20~25d；
7. 当不定芽基部产生大量须根，逐步开启封口膜，炼苗一周后移栽入土。
8. 缓苗后，幼苗长出2~3片新叶时，提取所得黄瓜幼苗新叶的DNA和RNA，进行PCR鉴定，再进行RT-PCR 检测所得株系的表达情况，进一步确定获得转基因黄瓜植株，转化率高达4.8%。
实施例2：该实施例中，其转化方法同实施例1，不同的是预培养及共培养分化培养基为MS+1.5 mg·L-1 6-BA，分化及选择培养基为MS + 1.5 mg·L-1 6-BA +100 mg·L-1 Kan + 250 mg·L-1 Cb。
实施例3：该实施例中，其转化方法同实施例1，不同的是预培养及共培养分化培养基为MS+1.67 mg·L-1 6-BA，分化及选择培养基为MS + 1.67 mg·L-1 6-BA +100 mg·L-1 Kan + 250 mg·L-1 Cb。
实施例4：该实施例中，其转化方法同实施例1，不同的是预培养及共培养分化培养基为MS+1.5 mg·L-1 6-BA，分化及选择培养基为MS + 1.5 mg·L-1 6-BA +120 mg·L-1 Kan + 250 mg·L-1 Cb。
采用本发明获得转基因黄瓜植株，不必经过启动培养、芽伸长培养等步骤，简化了程序，操作简单；以子叶节为外植体，其再生频率高达94.3%；上胚轴再生频率为 21 %；使用150 mg·L-1Kan进行转基因株系筛选，所得转基因黄瓜幼苗植株转化率高达4.8%。
Claims (1)
1.一种农杆菌介导法获得转基因黄瓜植株的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）选取6~7 d苗龄、两片子叶张开呈竖直状态的无菌黄瓜幼苗，切取连带下胚轴2 mm子叶，去除生长点，从下胚轴处纵切为二，切除子叶末端1/3部分，并切除叶缘得到外植体子叶节；将子叶节平铺于分化培养基MS + 1.5~1.7 mg·L-1 6-BA上置于黑暗中进行预培养2 d；
2）把经过预培养的子叶节浸没在农杆菌悬浮液中 15~20 min；侵染结束后用无菌纸吸干子叶节表面残留的菌液，将子叶节置于分化培养基MS + 1.5~1.7 mg·L-1 6-BA上置于黑暗中进行共培养2~3 d；
3）共培养结束后，用含有250 mg·L-1 Cb的液体 MS 培养基洗净外植体表面农杆菌，用无菌纸吸干子叶节表面的液体；
4）将上述处理好的子叶节接种到分化及选择培养基MS + 1.5~1.7 mg·L-1 BA +100~150 mg·L-1 Kan + 250 mg·L-1 Cb上进行芽诱导培养不定芽；待不定芽长至1.5~2 cm 高时，将其从子叶节基部切下，接种到生根培养基MS + 50mg·L-1 Kan上进行生根培养；当不定芽基部产生大量须根，逐步开启封口膜，炼苗一周后移栽入土。
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