CN105219790A - 一种镰刀菌几丁质合酶基因Chs3b及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种镰刀菌几丁质合酶基因<i>Chs3b</i>及应用，一种分离、克隆的镰刀菌<i>Chs3b</i>基因，功能验证表明该基因是一种几丁质合酶基因，与真菌细胞壁中几丁质的合成相关，其核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO：1所示，它编码的氨基酸序列如SEQ？ID？NO：2所示，编码905个氨基酸。针对<i>Chs3b</i>基因的5个不同区段（分别命名为Chs3b-1，2，3，4和5），构建了5个不同的RNAi载体，分别转化镰刀菌，进行有效RNAi干扰区段的筛选，发现它们在生长、发育以及致病力等方面受到显著抑制，其中Chs3b-1、3、5段RNAi干扰效果最为明显，Chs3b-2段次之。在植物中表达针对该基因的RNAi载体，可以抑制镰刀菌的侵染，提高了转基因植株的抗赤霉病能力，进一步证实了该基因的功能及在植物抗病性状中的用途。

Description

一种镰刀菌几丁质合酶基因Chs3b及应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域。具体涉及一种镰刀菌几丁质合酶基因Chs3b，同时还涉及一种镰刀菌几丁质合酶基因Chs3b的RNAi载体的制备方法，还涉及一种镰刀菌几丁质合酶基因Chs3b在植物抗病性状中的用途。
背景技术
几丁质（chitin）是真菌细胞壁的主要组成成分，它在真菌细胞形态建成过程中起关键作用，对维持细胞壁结构的完整性及细胞的正常生长发育具有重要作用。几丁质是一种由β-1,4糖苷键连接N-乙酰胺基葡聚糖而形成的线性链状聚合物，由几丁质合成酶（chitinsynthase,Chs）催化合成。几丁质合成酶是一种膜结合蛋白，它催化尿嘧啶-核苷二磷酸-N-乙酰胺基葡聚糖（UDP-N-acetyl-D-glucosamine）中的N-乙酰胺基葡聚糖（N-acetyl-D-glucosamine）转移到正在合成中的几丁质链上，使几丁质合成能够持续不断的进行。当几丁质合成酶基因被失活后，细胞壁结构失序，真菌细胞形态出现畸形并会导致渗透压不稳定，对外界渗透压改变的敏感性增强（Specht等，ThechsDandchsEgenesofAspergillusnidulansandtheirrolesinchitinsynthesis.FungalGenetBiol.1996.20:153-167）。
不同真菌所含有的几丁质合成酶基因数目不等，在一种古老的真菌Encephalitozoncuniculi中只含有一个几丁质合成酶基因，而在米根霉（Rhizopusoryzae）中含有超过20个不同类型的几丁质合成酶基因（Latgé等，Thecellwall:acarbohydratearmourforthefungalcell.MolMicrobiol.2007.66:279-290）。同种真菌的不同几丁质合成酶基因的功能重要性也不一样。例如，尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）基因组中含有6个几丁质合成酶基因（Martín-Urdíroz等，aclassVIIchitinsynthaseinvolvedinseptation,iscriticalforpathogenicityinFusariumoxysporum.EukaryotCell.2008.7:112-121）。Chs1基因失活虽然使突变体菌株的表型和致病力没有显著变化，但是平均每个细胞含有的细胞核数目却显著多于野生型的，而且突变体的几丁质含量也下降了10%。Chs2和Chs7基因失活导致致病力下降，细胞核数目没有异常，Chs2基因失活还能导致几丁质含量下降10%（Martín-Urdíroz等，RoleofchitinsynthasegenesinFusariumoxysporum.Microbiology.2004.150:3175-3187）。Chs3基因失活后无法得到相应的突变体，推测该基因的失活有致死效应。ChsV基因失活会导致突变体菌株致病力急剧下降，在植物体上丧失侵染扩展能力，细胞壁完整性严重受损，对植物杀菌剂等极其敏感（Madrid等，ClassVchitinsynthasedeterminespathogenesisinthevascularwiltfungusFusariumoxysporumandmediatesresistancetoplantdefencecompounds.MolMicrobiol.2003.47:257-266）。ChsVb基因失活导致的突变体表型变化更加明显，突变体菌株隔膜出现异常，菌丝不同部位出现气球状结构，透射电镜观察到了特殊的菌丝内菌丝（Intrahyphalhyphae）现象，突变体完全丧失致病力，对杀菌剂等化合物极度敏感。这些都说明，ChsV和ChsVb基因在保持尖孢镰刀菌细胞壁完整性和侵染植物的过程中具有重要作用（Martín-Urdíroz等，aclassVIIchitinsynthaseinvolvedinseptation,iscriticalforpathogenicityinFusariumoxysporum.EukaryotCell.2008.7:112-121）。在禾谷镰刀菌中，克隆分离到了一个Chs1基因（Li等，CloningandcharacterizationofagenecodingforaclassIchitinsynthasefromFusariumgraminearum.Can.J.PlantPathol.2003.25:240-248），通过对其同源敲除后，发现△Chs1突变菌株的细胞壁结构发生明显的变化，其几丁质合酶活性，几丁质含量，分生孢子的数量、大分生孢子的长度以及对小麦的致病力等都比野生型菌株都显著减少（Xu等，DisruptionofthechitinsynthasegeneChs1fromFusariumasiaticumresultsinanalteredstructureofcellwallsandreducedvirulence.FungalGenetBiol.2010.47(3):205-215）。
由于几丁质是真菌细胞壁的重要功能性组成成分，并且它只特异性的存在于真菌细胞壁，甲壳类动物、昆虫和其他节肢动物外骨骼中，不存在植物和哺乳动物中，因此几丁质及几丁质合成酶成为人们设计研发新型杀菌剂和防治真菌病害的理想靶标（BowmanandFree等，Thestructureandsynthesisofthefungalcellwall.BioEssays.2006.28:799-808;Latgé等，Thecellwall:acarbohydratearmourforthefungalcell.MolMicrobiol.2007.66:279-290）。
近几年来，Host-inducedgenesilencing（HIGS）技术在植物抗病虫害方面的应用，开辟了植物病害防治的新途径。针对病原菌生长、发育或致病过程中的关键基因作为靶标基因，在寄主植物中表达该靶标基因的RNAi载体，当病原菌侵染植物的过程中，摄入相应的dsRNA/siRNA会对其内源的靶标基因的表达进行干扰，起到抑制病原菌侵染的作用（Nowara等，HIGS:host-inducedgenesilencingintheobligatebiotrophicfungalpathogenBlumeriagraminis.ThePlantCell.2010.22:3130-3141；Koch等，Host-inducedgenesilencingofcytochromeP450lanosterolC14α-demethylase-encodinggenesconfersstrongresistancetoFusariumspecies.ProcNatlAcadSciUSA.2013.110(48):19324-19329）。靶标基因的选择是决定HIGS沉默效应大小的关键。可作为HIGS靶标的基因包括生长发育关键或致死基因、决定致病性或病原菌侵染过程中的必需基因等，用这些靶基因的同源序列构建RNAi载体，将其导入寄主植物，寄主就会通过RNAi途径沉默病原菌中相应的基因的表达，从而达到控制病害的作用。由于具有基于核苷酸序列的靶向特异性，这项技术为培育稳定、环境安全的转基因作物奠定了基础，显示了巨大的应用潜力。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种镰刀菌几丁质合酶基因Chs3b，可作为研发新型杀菌剂和防治真菌病害的理想靶标，为植物抗病性状的改良提供了新的基因资源；
本发明的另一个目的是在于提供了一种镰刀菌几丁质合酶基因Chs3b的RNAi载体的制备方法，将靶标基因分成不同的区段进行RNAi载体的制备，可以进行有效RNAi干扰区段的筛选。
本发明的另一个目的是在于提供了一种镰刀菌几丁质合酶基因Chs3b在植物抗病性状中的应用，针对Chs3b基因为靶标，在植物中表达RNAi载体，为培育可稳定遗传，对环境安全的抗赤霉病转基因作物新品系奠定了基础，具有很大的应用前景。
本发明的Chs3b基因及其DNA片段还可以构建到真菌或植物表达载体中时，可以在其转录起始核苷酸前加上任何一种适用真菌的或植物的强启动子、特异启动子或诱导型启动子以及其他调控序列，以保证目的序列的转录或表达。
本发明还可以针对其他不同类型的病原真菌，以Chs3b基因或其同源基因作为研发新型杀菌剂和防治真菌病害靶标。
本发明的Chs3b基因或其同源基因中的任意一区段都可以作为HIGS靶标设计基于发卡环结构或表达dsRNA/siRNA的RNAi载体，可以利用基因枪，农杆菌，植物病毒载体，显微注射等生物技术方法导入小麦、大麦等植物寄主中，通过RNAi途径沉默相应病原菌中Chs3b基因或其同源基因的表达，从而达到控制病害、获得改良植物抗病性状的应用。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种镰刀菌几丁质合酶基因Chs3b的克隆方法，其步骤是：
1）利用Trizol抽提试剂盒法，提取在PDA培养基上培养3d的禾谷镰刀菌5035菌丝的总RNA；
2）cDNA第一链的合成：用DNaseI(RNasefree)降解总RNA中的基因组DNA后，按照cDNA第一链合成试剂盒（SuperScriptTMIIIReverseTranscriptaseKit）合成cDNA第一链；
3）根据FusariumComparativeDatabase数据库中的Chs3b（FGSG_10116）基因cDNA序列，设计特异引物PCR扩增Chs3bcDNA全长。引物如下：
Chs3bcdnacloneP1：ATGGCGTACAATGGCCGTGAC
Chs3bcdnacloneP2：TTAATTTCTTGAGAAACAG
分离获得Chs3b基因的cDNA序列，一种分离的基因，其编码基因为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列（序列长度为2718bp）；一种分离的蛋白质，其编码序列为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列（编码905个氨基酸）。
一种镰刀菌几丁质合酶基因Chs3b的RNAi载体的制备方法，其步骤是：
本发明从禾谷镰刀菌5035菌株（由申请人所在实验室1999年在武汉分离与保存的一种高致病力禾谷镰刀菌菌株，请见遗传资源表）中分离克隆的几丁质合酶基因Chs3b，通过基因敲除手段不能获得突变菌株，说明它是一个与禾谷镰刀菌生长发育相关的致死基因。于是针对Chs3b基因的5个不同区段（分别命名为Chs3b-1，2，3，4和5），构建了5个不同的发卡环结构的真菌RNAi载体（分别命名为pChs3bRNAi-1，2，3，4和5），所述的核苷酸序列（SEQIDNO.1）含有真菌转化载体pChs3bRNAi-1，pChs3bRNAi-2，pChs3bRNAi-3，pChs3bRNAi-4，pChs3bRNAi-5的序列信息。利用原生质体转化技术将这些pChs3bRNAi载体分别导入野生型禾谷镰刀菌5035菌株中，定向整合至PLS基因位点，产生5种Chs3bRNAi菌株。与野生型5035菌株相比，发现它们在生长发育、几丁质含量（Chs3bRNAi-2,-3,-5菌株几丁质含量下降5.3~33%）以及致病力（Chs3bRNAi-1,-2,-3和-5菌株苗期接种致病力下降了22~47%，花期接种致病力下降了64~72%）等方面受到显著抑制，综上功能鉴定表明：第1、3、5段RNAi干扰效果最为明显，第2段次之，第4段不明显。
一种镰刀菌几丁质合酶基因Chs3b在植物抗病性状中的应用，其步骤是：
本发明将在镰刀菌中RNAi干扰效果最为明显的Chs3b-1，3和5区段，分别构建植物RNAi载体pXJC-Chs3bRNAi-1，pXJC-Chs3bRNAi-3和pXJC-Chs3bRNAi-5，所述的核苷酸序列（SEQIDNO.1）含有植物转化载体pXJC-Chs3bRNAi-1，pXJC-Chs3bRNAi-3和pXJC-Chs3bRNAi-5的序列信息。利用基因枪法共转化小麦，获得的转基因小麦株系能产生相应的siRNA，通过RNAi途径沉默入侵的镰刀菌Chs3b基因的表达，从而达到抑制病原菌侵染的作用。通过苗期和花期接种镰刀菌表明，获得的转基因小麦的抗赤霉病能力有了很大水平的提高，与非转基因对照植株扬麦15相比，苗期接种后，转基因植株病情降低了75~89%；花期接种后，转基因植株病情降低了56~70%。
本发明所述的植物为小麦，大麦、玉米、水稻、油菜等经济或粮食作物。本发明还可以针对其他不同类型的真菌病害，如小麦（大麦）白粉病，小麦（大麦）锈病，水稻稻瘟病，小麦（玉米、水稻）纹枯病等，以Chs3b或其同源基因作为靶标基因，在小麦、大麦，玉米，水稻等经济作物的抗病性状改良中应用。
附图说明
图1为将Chs3b基因分成5个不同区段以及相应的真菌pChs3bRNAi载体构建示意图。
图2为不同禾谷镰刀菌Chs3bRNAi菌株的渗透压敏感性实验及其致病力分析。
A：野生型菌株5035及不同Chs3bRNAi菌株在PDA及PDA添加不同逆境试剂培养基中培养3d的表型。B：左图为野生型菌株5035及不同Chs3bRNAi菌株在苗期接种小麦品种安农8455的致病力分析；右图为野生型菌株5035及不同Chs3bRNAi菌株花期接种小麦品种苏麦3号的致病力分析（P<0.05）。
图3为野生型菌株5035及不同Chs3bRNAi菌株的几丁质含量测定（P<0.01）。
图4为一种植物pXJC-Chs3bRNAi表达载体的示意图。
图5为T5代转Chs3bRNAi基因小麦的PCR检测。
图中：Y15为阴性对照植株，H2O为空白对照植株，R1和R2分别为不同的Chs3bRNAi转基因阳性植株。
图6为T5代转Chs3bRNAi基因小麦的siRNANorthernbolt检测。
图中：Y15为阴性对照植株，R1和R2分别为不同的Chs3bRNAi转基因阳性植株。
图7为T5代转Chs3bRNAi基因小麦接种镰刀菌的发病情况。
图中：Y15为阴性对照植株，R1和R2分别为不同的Chs3bRNAi转基因植株。经镰刀菌苗期接种（A）后，非转基因对照植株病斑长度为1.45cm，而转基因植株R1和R2分别为0.16cm和0.36cm，病情降低了75~89%；经花期接种（B）后，非转基因对照植株的病小穗率为36.9%，而转基因植株R1和R2分别为11.1%和16.3%，病情降低了56~70%。转基因小麦的抗赤霉病能力有了显著提高（P<0.01）。
具体实施方式
实施例1：
Chs3b基因cDNA的分离与克隆
本发明中的Chs3b基因与FusariumComparativeDatabase数据库（http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_graminearum/MultiHome.html）公布的FGSG_10116序列相对应。通过常规的RT-PCR方法（参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南（第三版），北京，科学出版社，2002版）从PDA培养基培养3d的禾谷镰刀菌5035菌丝中扩增得到cDNA序列。
一种镰刀菌几丁质合酶关键基因Chs3b的克隆方法，其具体步骤是：
1）抽提PDA培养基培养3d的镰刀菌5035（由申请人所在实验室1999年在武汉分离与保存的一种高致病力禾谷镰刀菌菌株）菌丝的RNA，RNA抽提使用Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒（具体操作步骤见试剂盒说明书）；
2）cDNA第一链的合成：用DNaseI(RNasefree)降解总RNA中混的基因组DNA。配制50μl的反应体系:10×DNaseIBuffer5μl，DNaseI(RNasefree)2μl，RNaseinhibitor(40U/μl)0.5μl，总RNA3μg，ddH2O(RNasefree)补充至50μl；37℃反应40min，补加150μl的ddH2O(RNasefree)；加入200μl的P.C.I.，充分混匀；4℃、12000r/min离心15min，取上层液体180μl于新的离心管中，加入等体积的C.I.，充分混匀；4℃、12000r/min离心10min，取上层液体160μl于新的离心管中，加入160μl异丙醇，充分混匀，室温放置15min；4℃、12000r/min离心15min，弃上清，加入500μl4℃预冷的75%(v/v)乙醇清洗沉淀；12000r/min离心15min，弃上清，室温放置数分钟，使沉淀干燥，加入20μlddH2O(RNasefree)溶解RNA。取1μl电泳检测。得到高质量的RNA后，按照cDNA第一链合成试剂盒（SuperScriptTMIIIReverseTranscriptaseKit）的使用说明进行如下反应：混合Oligo(dT)20(100ng/μl)3μl，dNTPs(10mmol/L)1μl，RNA2μg，ddH2O(RNasefree)补至13μl；65℃水浴反应5min，立即冰浴3min；短暂离心数秒后，加入5×First-standBuffer4μl，DTT(0.1mol/L)1μl，RNaseinhibitor(40U/μl)0.5μl，SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase(200U/μl)0.5μl，ddH2O(RNasefree)1μl；轻轻混匀各成分，50℃温浴反应60min；70℃加热15min使酶失活；冰浴冷却3min后-20℃保存备用。
3）根据FusariumComparativeDatabase数据库中的Chs3b（FGSG_10116）基因cDNA序列，设计特异引物PCR扩增Chs3bcDNA全长。引物如下：
Chs3bcdnacloneP1：ATGGCGTACAATGGCCGTGAC
Chs3bcdnacloneP2：TTAATTTCTTGAGAAACAG
PCR反应总体系50μl：cDNA第一链模板1μl，10×LAPCRbuffer5μl，10mMdNTP4μl，正反向引物各1μl，LATaq酶0.5μl，加水到50μl（PCR反应所用试剂购自宝生物工程大连有限公司）。PCR反应条件为：95℃预变性3分钟；95℃20s，54℃30s，72℃2.5min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
4）PCR产物连接到T/A克隆载体pMD18-T（购自宝生物工程大连有限公司）上并用M13F和M13R引物（载体pMD18-T自带的引物）测序验证，得到Chs3b基因的cDNA序列，一种分离的基因，其编码基因为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列（序列长度为2718bp）；一种分离的蛋白质，其编码序列为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列（编码905个氨基酸）。
实施例2：
针对Chs3b基因不同区段的RNAi载体的构建和真菌转化：
1）本发明将Chs3b基因的分成5个不同区段，如图1所示，分别命名为Chs3b-1，Chs3b-2，Chs3b-3，Chs3b-4及Chs3b-5（大小分别为569bp，587bp，500bp，523bp及615bp），相邻的两段首尾间有14bp左右的重叠区。设计特异PCR引物扩增每个区段的正向序列，引物序列如下：
Chs3bRNAi1s-P1：TCCCCCGGGTCTTGAGGGTGAAGTCGTTGGGAT
Chs3bRNAi1s-P2：ATAAGAATGCGGCCGCCCGTGACCAGGAGTATGGAGGC
Chs3bRNAi2s-P1：TCCCCCGGGTGTAGAAACCCTCCCAAAGAGCAAG
Chs3bRNAi2s-P2：ATAAGAATGCGGCCGCCTTCACCCTCAAGAACGGTTACGA
Chs3bRNAi3s-P1：TCCCCCGGGCAGAGTGGCAGCGAACGAACC
Chs3bRNAi3s-P2：ATAAGAATGCGGCCGCTCCTTGCTCTTTGGGAGGGTTTC
Chs3bRNAi4s-P1：TCCCCCGGGTAATAAGAGCGACCAGAATAACACCACCAG
Chs3bRNAi4s-P2：ATAAGAATGCGGCCGCTCGTTCGCTGCCACTCTGTACTCGCTGATG
Chs3bRNAi5s-P1：TCCCCCGGGCCTGCCGAGGAACCACAAGAAACC
Chs3bRNAi5s-P2：ATAAGAATGCGGCCGCGCTGGTGGTGTTATTCTGGTCGCTCTT
PCR反应总体系50μl：cDNA第一链模板1μl，10×LAPCRbuffer5μl，10mMdNTP4μl，正反向引物各1μl，LATaq酶0.5μl，加水到50μl（PCR反应所用试剂购自宝生物工程大连有限公司）。PCR反应条件为：95℃预变性3分钟；95℃20s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经凝胶回收后通过SmaI和NotI限制性内切酶酶切连接至pBlueScriptSK(+)载体，形成pBlue-Chs3b正向不同区段载体。
设计SOE-PCR引物扩增PDKintron+Chs3b不同区段反向序列，引物如下：
PDK-P1：ATAAGAATGCGGCCGCGCTTGGTAAGGAAATAATTA
Chs3bRNAi1as-P2：TTCCCCGCGGGGATCGAGCTCTCTTGAGGGTGAAGTCGTTG
Chs3bRNAi2as-P2：TTCCCCGCGGGGATCGAGCTCTGTAGAAACCCTCCCAAAGAGCAAG
Chs3bRNAi3as-P2：TTCCCCGCGGGGATCGAGCTCCAGAGTGGCAGCGAACGAACC
Chs3bRNAi4as-P2：TTCCCCGCGGGGTTCGAGCTCTAATAAGAGCGACCAGAATAACACC
Chs3bRNAi5as-P2：TGCTCCGCGGCGATCGAGCTTTAATTTCTTGAGAAACAGCACATG
SOE-PCR反应总体系50μl：10×LAPCRbuffer5μl，10mMdNTP4μl，正反向引物各1μl，LATaq酶0.5μl，加水到48μl；95℃3min；95℃10s，56℃30s，72℃40s，7个循环；加入等摩尔分子数的PDKintron和Chs3b各反向片段；95℃10s，56℃30s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经凝胶回收后通过NotI和SacII限制性内切酶酶切连接至pBlue-Chs3b正向不同区段载体，形成pBlue-Chs3bRNAi不同区段载体。随后通过SmaI和SacII酶切Chs3bsense-PDKintron-Chs3bantisense发卡环结构连接至真菌转化载体上形成不同区段的pChs3bRNAi载体（pChs3bRNAi-1，pChs3bRNAi-2，pChs3bRNAi-3，pChs3bRNAi-4和pChs3bRNAi-5，见图1）。所述的核苷酸序列（SEQIDNO.1）含有真菌转化载体pChs3bRNAi-1，pChs3bRNAi-2，pChs3bRNAi-3，pChs3bRNAi-4和pChs3bRNAi-5的序列信息。
2）利用真菌原生质体转化法（Maier等，Developmentofahighlyef?cientgenetargetingsystemforFusariumgraminearumusingthedisruptionofapolyketidesynthasegeneasavisiblemarker.FEMSYeastRes.2005.(5):653-662），将5个RNAi干扰载体分别导入禾谷镰刀菌5035原生质体中，使启动子、Chs3bRNAi发卡环结构序列、终止子序列定点整合到PLS基因位点，产生禾谷镰刀菌Chs3bRNAi-1，Chs3bRNAi-2，Chs3bRNAi-3，Chs3bRNAi-4和Chs3bRNAi-5菌株。
实施例3：
禾谷镰刀菌Chs3b基因有效RNAi干扰区段的筛选：
1.渗透压敏感性实验：
制备下列各种培养基平板：PDA（马铃薯200g煮沸15min取浸出液，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌20min）,PDA添加1.2mol/Lsorbitol及0.025%(w/v)SDS,PDA添加1.2mol/LNaCl,PDA添加6mmol/LHCl,PDA添加1.43mmol/LH2O2,PDA添加1.2mol/Lsorbitol。6cm的皿倒7ml相应的培养基，取浓度为5×105个/ml的各菌株新鲜分生孢子或者子囊孢子液10μl，接种于上述几种不同的培养基平板中央，将平板放28℃培养箱，黑暗培养，3d后观察菌落形态。结果显示：Chs3bRNAi-1，Chs3bRNAi-3和Chs3bRNAi-5菌株在PDA以及PDA添加不同逆境试剂的培养基上生物量降低最为明显，其次为Chs3bRNAi-2菌株（见图2A）。这说明针对Chs3b基因的这4个片段RNAi干扰后可造成菌丝生物量和生长势的降低。
苗期和花期接种：
1）苗期接种：
将成熟种子进行表面消毒：先用70%（体积比）乙醇处理30sec；无菌水快速冲洗1次；0.1％升汞消毒6～8min；无菌水冲洗3～4次，每次2min。灭菌后，将种子背面向上，间隔均匀地放置于铺有湿润滤纸的塑料盒内，于室温条件下萌发3d。将萌发一致的种子胚芽鞘顶端剪去2～3mm，将3μL镰刀菌5035孢子悬浮液（5×105个/mL），接种于胚芽鞘伤口处，于25℃，16h光照，95%相对湿度条件下培养7d，测量胚芽鞘病斑的长度与照相。
2）花期接种：
小麦扬花初期，选择长势良好且一致的主穗，用微量注射器吸取镰刀菌孢子5035（5×105个/mL）悬浮液10μL，注入麦穗中部外侧一朵小花的外桴和内桴之间。于25℃，相对湿度90%以上保湿3d。之后，早中晚各喷水保湿一次，相对湿度保持在70%～80%左右。于21d后调查接种麦穗的病小穗数和总小穗数。根据下列公式计算病小穗率：
利用Student’stests和方差分析中的多重比较对接种调查结果进行差异性分析。
经苗期和花期的致病力分析表明，Chs3b基因的第1、2、3、5段造成禾谷镰刀菌致病力下降尤为明显（苗期接种致病力下降了22~47%，花期接种致病力下降了64~72%，见图2B）。
几丁质含量测定：
试剂配方：50mg/mlN-乙酰胺基葡萄糖：N-乙酰胺基葡萄糖（N-acetylglucosamine）250mg溶解定容于5ml超纯水中，分装保存于-20℃；6mol/LHCl：51.72ml浓盐酸超纯水定容至100ml；SolutionA(1.5mol/LNa2CO3in4%(v/v)acetylacetone)：Na2CO315.9g，100%(v/v)乙酰丙酮(acetylacetone,Sigma)4ml，无菌水溶解，定容至100ml，4℃保存；SolutionB(1.6g4-dimethylaminobenzaldehydein30mlconcentratedHCland30ml95%ethanol)：4-dimethylaminobenzaldehyde（4-对二甲氨基苯甲酸）1.6g，溶解于30ml的95%乙醇中，量取30ml的浓盐酸，缓慢倒入上述溶液中，轻轻搅拌均匀，待混匀后4℃保存。
用事先称重的离心管离心收集各菌株孢子，用无菌水清洗孢子两次，去上清，余下的孢子和离心管一起做冻干处理，称量离心管和孢子的重量，确保离心管中的孢子净重为5mg；加入1ml的6mol/LHCl，100℃酸解17h；将样本在真空干燥器中52℃干燥并除去HCl；干燥后的样本重新溶解于1ml无菌水中，充分溶解后离心，除去不溶解部分；取100μl上清液，加入100μl的SolutionA，混匀放入100℃水浴中煮沸20min；取出样品，待冷却至室温后，加入700μl的95%（体积比）乙醇和100μl的SolutionB，充分混匀，室温放置1h，测定样品的OD520值。每个菌株做18个重复，几丁质含量以酸解释放出来的葡聚糖胺（glucosamine）重量占冻干菌丝或者孢子的重量的百分比表示。结果表明：与野生型相比，Chs3b基因第2、3、5区段RNA干扰后几丁质含量显著降低（几丁质含量下降5.3~33%）（P<0.01）(见图3)。
实施例4：
植物Chs3bRNAi表达载体的构建和遗传转化：
1、植物Chs3bRNAi表达载体的构建：
综合以上对禾谷镰刀菌Chs3b基因有效RNAi干扰区段的筛选表明：针对Chs3b-1，Chs3b-3和Chs3b-5区段的RNAi干扰效果最为明显。为了验证利用HIGS技术在植物中表达针对该靶标基因的dsRNA/siRNA能否提高了转基因小麦的抗赤霉病能力，本发明构建了植物表达载体pXJC-Chs3bRNAi-1,pXJC-Chs3bRNAi-3,pXJC-Chs3bRNAi-5，其载体示意图见图4。所述的核苷酸序列（SEQIDNO.1）含有植物转化载体pXJC-Chs3bRNAi-1，pXJC-Chs3bRNAi-3和pXJC-Chs3bRNAi-5的序列信息。这3个载体的发卡环结构分别由组成型启动子玉米Ubi启动子介导，由Nos终止子终止。pXJC-Chs3bRNAi-1和pXJC-Chs3bRNAi-3质粒由限制性内切酶MluⅠ,pXJC-Chs3bRNAi-5质粒由限制性内切酶NotⅠ分别酶切，凝胶电泳后切胶回收得到最小表达框（启动子，发卡环结构，终止子以及两端约150bp的保护碱基）DNA片度，用于基因枪轰击。
、小麦遗传转化过程：
通过基因枪介导的小麦遗传转化方法，将上述植物表达载体pXJC-Chs3bRNAi-1,pXJC-Chs3bRNAi-3,pXJC-Chs3bRNAi-5以及筛选标记基因bar以最小表达框的方式共转化到小麦品种“扬麦15”中，经过幼胚愈伤诱导、基因枪轰击、恢复培养、分化筛选、以及生根、壮苗、移栽，获得抗性植株。小麦遗传转化的具体步骤如下：
1）剥取幼胚与愈伤诱导：
剪取小麦扬花后12～14d后的麦穗，剥取中间部位饱满一致的未成熟籽粒。在超净工作台中，将籽粒倒入无菌三角瓶内，加入适量70％乙醇，消毒30sec；无菌水快速冲洗1次；0.1％升汞消毒6～8min；无菌水冲洗3～4次，每次2min；期间需不断地摇动三角瓶，确保灭菌彻底。在无菌条件下剥取半透明状的幼胚(0.8～1.2mm)，盾片朝上，接种于诱导培养基MSI中，每皿50～60个幼胚,于27℃暗培养4～6d。
2）高渗处理：
挑选状态良好的胚性愈伤转至高渗培养基MSH，置于直径约2cm的圆圈内，高渗处理4～6h后进行基因枪轰击，转化后继续高渗处理16～20h，于27℃暗培养。
3）基因枪轰击：
微弹载体的制备：取50μL已制备好的金粉悬液（50mg/mL），室温下溶解，超声波处理1min；将金粉涡旋混匀后加入5μLDNA(3μg/μL)，涡旋混匀；然后慢慢加入50μL2.5mol/LCaCl2·2H2O（抽滤灭菌），涡旋混匀；加入20μL0.1mol/L亚精胺（抽虑灭菌），一滴一滴加，使离心管一直处于涡旋状态，涡漩振荡3min，然后冰浴静置15min，移液枪移走上清；再加入300μL70%（体积比）乙醇，重悬后冰浴放置15min，移液枪移走上清；最后重悬于100μL无水乙醇（10μL/枪），涡旋混匀后涂至微弹承载片，超净工作台吹干后用于基因枪轰击。
轰击参数：压力：1100psi；距离：9cm；真空度：27.5inchesHg；轰击次数：1次；每枪金粉用量为250μg/枪，DNA用量为1.5μg/枪。
4）恢复培养：
轰击后的愈伤继续高渗16～20h后，转入诱导培养基MSI中，于27℃暗条件下恢复培养2～3w，之后进入分化筛选阶段。
5）分化筛选：
将恢复培养后的愈伤转入分化筛选培养基MSB3(3mg/LBialaphos)中，于22℃，16h光照条件下进行第一轮分化筛选；2w后将带绿点的愈伤转入分化筛选培养基MSB5(5mg/LBialaphos)中，进行第二轮分化筛选；将再生幼苗（苗高﹥2cm）转入含生根筛选培养基MST5(5mg/LBialaphos)的直形管或三角瓶中继续筛选1～2轮，每轮2周。
6）壮苗、春化及移栽：
将生根筛选后健壮的幼苗转入壮苗培养基MST0(不含筛选压)中，3～4d后置于4℃春化2w，然后移栽至温室（20～22℃，16h光照）中生长。
具体培养基成分：见表1
表1小麦遗传转化过程中所用的培养基
培养基种类 培养基组成成分
诱导培养基 MS + 0.1 g/L 肌醇 + 0.5 g/L 谷氨酰胺 + 0.1 g/L 水解酪蛋白 + 30 g/L 蔗糖 + 2 mg/L 2, 4-D + 2.7 g/L phytagel，pH 5.8
高渗培养基 诱导培养基 + 0.2 mol/L 甘露醇 + 0.2 mol/L 山梨醇+ 2.7 g/L phytagel，pH 5.8
分化筛选培养基 MS + 0.1 g/L 肌醇 + 30 g/L 蔗糖 + 5 mg/L ZT + 3～5 mg/L Bialaphos + 2.7 g/L phytagel，pH 5.8
生根筛选培养基 MS（大量元素减半）+ 0.1 g/L 肌醇 + 20 g/L 蔗糖 + 0.5 mg/L NAA + 5 mg/L Bialaphos + 2.7 g/L phytagel，pH 5.8
壮苗培养基 MS（大量元素减半）+ 0.1 g/L 肌醇 + 20 g/L 蔗糖 + 0.5 mg/L NAA + 2.7 g/L phytagel，pH 5.8
实施例5：
转Chs3bRNAi基因小麦的PCR检测：
为了检测获得的抗性植株是否为转基因阳性植株，通过T0—T5代的PCR检测，获得了2个能稳定遗传转基因株系，分别命名为R1和R2，其T5代PCR检测结果见图5。转基因植株R1和R2可以扩增出特异的目的条带，阴性对照植株和空白对照不能扩增出相应的目的条带。本实施例的PCR检测具体步骤如下：
1、小麦基因组DNA的提取（CTAB法）：
1）取3～4叶期的小麦幼嫩叶片，置于2mL离心管中，每管加1颗钢珠，在液氮中预冷后，用TissueLyserII（QIAGEN公司）研磨样品。
2）往样品中加入900μL预热的CTAB缓冲液并混匀，65℃水浴1h，期间颠倒混匀3～4次。
3）加入305μL5mol/LKAc，225μL氯仿，颠倒混匀至溶液下层颜色为深绿色，大约5min，-20℃放置30min。
4）12000r/min离心15min，将上清900μL转移至新的离心管，加入900μLPCI，轻柔颠倒混匀5min。
5）12000r/min离心15min，取上清约800μL，要注意不能吸到上下液体分界面处白色固体蛋白质颗粒部分，加入等体积CI，点到混匀后，12000r/min离心15min，去除残留苯酚。
6）取出离心管，取上清液700～800μL加入到新的1.5mL离心管中，加入0.8倍体积异丙醇及0.1倍体积3mol/LNaAc，颠倒混匀后，室温静置10min。
7）12000r/min离心15min，弃上清，加500μL预冷的70%（体积比）乙醇洗沉淀，12000r/min离心5min，弃上清。
8）室温下风干，加入适量体积的TER（TE:RNA酶=499:1），DNA溶解后-20℃保存备用。
、PCR检测：
反应体系：2×TaqPCRMix10μL，10μmol/L上下游引物（见表2）各0.5μL，模板DNA100～150ng，补ddH2O至20μL。反应程序：95℃预变性5min；94℃变性40sec，58℃退火（退火温度根据不同引物有所不同）40sec，72℃延伸30sec（延伸时间根据扩增片段长度有所不同，扩增效率一般1kb/min），共35个循环；72℃再延伸7min。PCR反应结束后，取10μLPCR产物进行电泳（1%（质量体积比）琼脂糖凝胶，90V，～40min），利用紫外凝胶成像仪进行照相并记录。
表2PCR扩增引物
Primer Annealing site Sequence (5’—3’) Size (bp)
ZJB Ubi promoter GTTTCTTTTGTCGATGCTCACCC
Chs3bR1 Chs3bRNAi-1 CCGACTCTGCCTTTGATCCTG 333a
Chs3bR3 Chs3bRNAi-3 ATCTTGGTGGTGCTTGTGGT 533b
Chs3bR5 Chs3bRNAi-5 GTCGCTCTTATTACCATTTACG 633c
aUbi-Chs3bRNAi-1目的片段PCR检测由引物ZJB和Chs3bR1扩增，片段大小为333bp
bUbi-Chs3bRNAi-3目的片段PCR检测由引物ZJB和Chs3bR3扩增，片段大小为533bp
cUbi-Chs3bRNAi-5目的片段PCR检测由引物ZJB和Chs3bR5扩增，片段大小为633bp。
实施例6：
转Chs3bRNAi基因小麦的siRNA-northernblot检测：
为了检测转Chs3bRNAi基因小麦的siRNA形成与否，本发明对转基因植株R1和R2,以及阴性对照植株进行了northernblot检测，见图6。转基因植株R1和R2可以产生相应的21nt左右的siRNA干扰分子，阴性对照植株不能形成。本实施例的si-RNAnorthernblot检测的具体步骤如下：
1、转基因植株小RNA的提取（PurelinkTMmiRNAisolationKit）
1）液氮研磨0.1g植物组织叶片，研磨成粉后转移入1.5mL离心管中，加入300μLL3，旋涡混匀。
2）室温下，12000rpm，离心2min。转移上清至一个新的离心管中，加入300μL70%（体积比）乙醇（使乙醇的终浓度为35%），旋涡混匀。
3）将混合液上柱，12000rpm，离心1min，总RNA结合于柱上，保留收集管中的液体。
4）加入96%～100%乙醇到收集管中，使乙醇的终浓度为70%（即600μL溶液中，加入700μL96%～100%乙醇），然后旋涡混匀。
5）吸取700μL混匀的液体，到第二个柱子中，12000rpm，离心1min，siRNA/miRNA结合于柱子上，弃去废液（此步可重复1次）。
6）加入500μL漂洗液（W5）12000rpm，离心1min，弃去废液，此步可重复一次。
7）最大速度13200rpm，离心2～3min，弃去残留的漂洗液。
8）将离心柱置于1.5mL离心管中，加入50μLDEPCddH2O（pH>7.0）洗脱，室温放置1min，最大转速离心1min，-80℃冰箱中保存备用。
、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：
1）先用Liquinox清洗剂，然后用含10%（质量体积比）SDS的DEPCH2O清洗玻璃板，梳子和电泳槽等，再用DEPCH2O处理的95%的乙醇清洗。
2）安装好配胶板和电泳槽
3）用DEPCH2O配制好电泳缓冲液0.5×TBE
4）配制15%变性聚丙烯酰胺凝胶（10mL）
5×TBE 1mL
30%聚丙烯酰胺 5mL
尿素 4.2g
DEPC H2O 0.75mL
37℃或室温完全溶解尿素，再加入10%（质量体积比）过硫酸胺（APS）70μL，加入TEMED（N,N,N′,N′-四甲基乙二胺）3.5μL，倒置混匀，不要漩涡振荡。将凝胶快速倒入胶板内，插好梳子，聚合30min以上。
5）100V预跑胶30min。
6）准备RNA样品（30μg），加2×RNALoadingbuffer，混匀后稍离心，65℃加热10min，冰上速冷1min后加样。每个样品保证相同的体积。
7）100～150V电泳直到bromophenolblue（bottomdye）到达胶底1/4处。
、转膜：（Bio-RadSemi-dry）
1）电泳结束后，将胶板取出，置于0.5×TBE中，分离胶片，去除点样孔部分凝胶。
2）剪2张与凝胶大小相同的extra-thickwhatman滤纸和1张硝酸纤维膜（Hybond-N+Amersham）浸泡于0.5×TBE中5～10min。
3）从正极向负极依次铺好滤纸、硝酸纤维膜、凝胶、滤纸。除凝胶外，每铺一层要赶气泡。
4）400mA电转45min后拆除装置。
5）室温晾干膜，用紫外透射交联仪固定（1200J×100）后用于杂交或于4℃保存。
、预杂交与杂交：
1）将膜放入合适大小的杂交管中，加入5mLPerfectHybTMplusbuffer，于杂交炉中38℃预杂交至少1h。
2）制备探针：PCR扩增DNA片段，电泳，凝胶回收；用Takara随机引物标记试剂盒进行探针的同位素标记。标记的步骤如下：在1.5mL离心管中加入150ngDNA片段，2μL随机引物，并补水到17μL；沸费水中煮沸5min，冰水浴中冷却8min，离心；加入2.5μL10×Buffer，2.5μLdNTP，2μLα-[32P]-dCTP，1μLDNA聚合酶；37℃水浴3h。
3）将标记好的探针沸水中煮沸5min，冰浴中冷却10min，加入到杂交管中（忌直接加于膜上），38℃杂交～16h左右。
、洗膜与放射自显影：
1）将杂交液倒入放射性废液桶中，用1×SSC，0.1%SDS倒入杂交管中，缓慢旋转，洗膜2～3次；将杂交膜从杂交管中取出，放入盛有足量1×SSC和0.1%SDS洗膜液的托盘中，摇动15min；将第二次的洗膜液倒入放射废液桶中，加入足量0.1×SSC和0.1%SDS洗膜液，40℃摇动10～20min。在洗膜的过程中，杂交膜不能变干，洗膜时要随时监测膜的放射性，放射信号急剧减少时，即可停止洗膜。
2）将膜从洗膜液中取出，放置在干净的滤纸上，除去大部分的液体（不能太干，膜上无可见水斑即可）；用保鲜膜包住膜，信号为20～25caps时，放在曝光夹中，将磷屏压上（白色的一面面向膜），压膜3～12h，将磷屏取出，在磷屏显像仪上照相；以后每次用0.1×SSC和0.1%SDS洗膜液洗膜，并监测信号，直到信号为8～15caps，相应压屏时间增加到24～72h。
实施例7：
转Chs3bRNAi基因小麦的抗病性鉴定：
为了检测转Chs3bRNAi基因小麦形成的siRNA能否抑制入侵的镰刀菌的生长，本发明采用苗期接种和花期接种的方法检测了转基因植株的抗赤霉病性状，见表3与图7。本实施例的抗病性鉴定的具体步骤见本发明实施例3中的苗期和花期接种方法。通过接种表型观察与统计，转基因株系的抗赤霉病能力和非转基因对照扬麦15相比，达到极显著差异（P<0.01）。经镰刀菌苗期接种7d后，非转基因对照植株病斑长度为1.45cm，而转基因植株R1和R2分别为0.16cm和0.36cm，病情降低了75~89%；经花期接种21d后，非转基因对照植株的病小穗率为36.9%，而转基因植株R1和R2分别为11.1%和16.3%，病情降低了56~70%。
表3转Chs3bRNAi基因小麦的抗赤霉病能力鉴定
基因型 苗期接种病斑长度（cm） 花期接种病小穗率（%）
R1 0.16±0.03a 11.1±1.71a
R2 0.36±0.11a 16.3±2.04a
Y15 1.45±0.16b 36.9±4.23b
SEQUENCELISTING
<110>华中农业大学
<120>一种镰刀菌几丁质合酶基因Chs3b的克隆与应用
<160>2
<170>PatentInversion3.1
<210>1
<211>2718
<212>DNA
<213>
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151015
AspLeuProAlaGlySerSerGlnTyrHisLeuProProGlnGluAsn
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AspGluGluGlnGlyArgGlyLeuLeuAsnSerGlyTyrGluGlnAsp
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ArgLeuGlyAlaArgThrProProAspArgProValSerAlaTyrSer
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GlyProThrGlyTyrGlyAspThrGlyGlySerPheGlyGlnPheGly
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ProGluAspSerTrpValGluArgGlnGlnGlnProGlnMetGlyGly
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130135140
GlySerValLeuSerIleAspTyrProValProSerAlaIleLysAsn
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HisLysMetArgTyrThrAlaAlaThrCysAspProAsnAspPheThr
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LeuLysAsnGlyTyrAspLeuArgProArgMetTyrAsnArgHisThr
195200205
GluLeuLeuIleAlaIleThrTyrTyrAsnGluAspLysValLeuLeu
210215220
AlaArgThrLeuHisHisThrMetGlnAsnIleArgAspIleValAsn
225230235240
LeuLysLysSerThrPheTrpAsnLysGlyGlyProAlaTrpGlnLys
245250255
IleValValCysLeuValPheAspGlyIleAspLysAlaAspLysAsn
260265270
ThrLeuAspValLeuAlaThrValGlyValTyrGlnAspGlyValIle
275280285
LysLysAspValAspGlyLysGluThrValAlaHisIlePheGluTyr
290295300
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LysGlnLysAsnThrLysLysIleAsnSerHisArgTrpLeuPheAsn
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GlyThrLysProSerProArgSerLeuLeuAlaLeuTrpGluGlyPhe
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TyrAsnAspLysAspLeuGlyGlyAlaCysGlyGluIleHisAlaMet
385390395400
LeuGlyLysGlyGlyLysLysLeuPheAsnProLeuValAlaValGln
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GluLeuValAlaLysAlaGlyGlnLysTrpHisLeuSerTyrIleLys
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SerGlnArgArgArgTrpLeuAsnGlySerPheAlaAlaThrLeuTyr
530535540
SerLeuMetHisPheGlyArgMetTyrLysSerGlyHisAsnIleIle
545550555560
ArgMetPhePheLeuHisIleGlnLeuIleTyrThrThrLeuAsnThr
565570575
MetPheAlaTrpPheSerLeuGlySerTyrTrpLeuThrThrSerVal
580585590
IleMetAspLeuValGlyLysProAsnAlaThrSerGlyValHisAla
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TrpProPheGlyAspThrGlyThrProIleValAsnAlaLeuLeuGln
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TyrLeuTyrLeuAlaPheValMetLeuGlnPheIleLeuAlaLeuGly
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AsnArgProLysGlySerLysPheThrTyrIleAlaSerPheMetVal
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LeuSerLeuValArgPhePheGlyPheLeuTrpPheLeuGlyArgThr
885890895
GlyIleMetCysCysPheSerArgAsn
900905

Claims (5)

1.一种分离的基因，其编码基因为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
2.一种分离的蛋白质，其序列为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的一种镰刀菌几丁质合酶基因Chs3b在植物抗病性状中的应用；
所述的植物为小麦，大麦、玉米、水稻、油菜。
4.根据权利要求1所述的一种分离的基因，其特征在于：所述的核苷酸序列含有真菌转化载体为pChs3bRNAi-1，pChs3bRNAi-2，pChs3bRNAi-3，pChs3bRNAi-4，pChs3bRNAi-5。
5.根据权利要求1所述的一种分离的基因，其特征在于：所述的核苷酸序列含有植物转化载体pXJC-Chs3bRNAi-1，pXJC-Chs3bRNAi-3和pXJC-Chs3bRNAi-5。
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