CN104151412B - 植物含油量相关蛋白GhENR及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物含油量相关蛋白GhENR及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物含油量相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明提供了棉花中与籽粒含油量相关蛋白和基因，对于进一步阐明植物籽粒含油量的分子机理并通过基因工程的技术和手段培育优质、籽粒含油量高的作物新品种具有重要的理论意义和现实意义。

Description

植物含油量相关蛋白GhENR及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及一种植物含油量相关蛋白GhENR及其编码基因和应用。
背景技术
我国每年食用油消费总量已达2500多万吨，其中60%以上依赖进口。据专家分析，中国食用油年生产能力即便能达到年增幅10%,10年内每年仍需大量进口才能保障市场的正常供给，积极开发不与粮棉争地的特种油料资源意义重大。
棉花作物是一种不与粮棉油争地的油料资源。棉籽油的脂肪酸组成：棕榈油21.6-24.8%，硬脂酸1.9-2.4%，花生酸0-0.1%，油酸18.0-30.7%，亚油酸44.9-55.0%，其中油酸可降低血液总胆固醇和有害胆固醇的含量。营养界把油酸称为“安全脂肪酸”，油酸与多不饱和脂肪酸最大的不同在于：在降低有害胆固醇同时，不降低有益胆固醇。多不饱和脂肪酸在降低总胆固醇和有害胆固醇的同时，也会降低有益胆固醇，因此从营养价值角度看棉籽油也是一种很好的食用油。
我国棉花种植较为集中，其产量也较为稳定，将收获的棉纤维投入纺织品生产的同时还能将副产品棉籽油用来生产生物柴油，可谓一举两得。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物含油量相关蛋白GhENR及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，来自棉花(Gossypium hirsutum L.），命名为GhENR蛋白，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物含油量相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白的基因（GhENR基因）也属于本发明的保护范围。
所述基因为如下(1）或(2）或(3）或（4）或（5）所述的DNA分子：
（1）序列表中序列2自5’末端第105至1286位核苷酸所示的DNA分子；
（2）序列表中序列2自5’末端第105至1289位核苷酸所示的DNA分子；
（3）序列表中序列2所示的DNA分子；
（4）在严格条件下与（1）或（2）或（3）限定的DNA序列杂交且编码植物含油量相关蛋白的DNA分子；
（5）与（1）或（2）或（3）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且植物含油量相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。
含有所述GhENR基因基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因。
所述重组载体具体可为在p2301M载体的多克隆位点（如BamHI和SpeI酶切位点之间）插入序列表的序列2所示的GhENR基因得到的重组质粒P2301M-GhENR。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述GhENR基因导入目的植物中，得到含油量高于所述目的植物的转基因植物。所述含油量具体可为籽粒含油量。携带有所述GhENR基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述GhENR基因具体可通过所述重组质粒P2301M-GhENR导入所述目的植物中。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥。所述双子叶植物具体可为棉花，如棉花品种“苏棉20号”。
本发明还保护所述GhENR蛋白或所述GhENR基因在调控植物含油量中的应用。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥。所述双子叶植物具体可为棉花，如棉花品种“苏棉20号”。
本发明提供了棉花中与籽粒含油量相关蛋白和基因，对于进一步阐明植物籽粒含油量的分子机理并通过基因工程的技术和手段培育优质、籽粒含油量高的作物新品种具有重要的理论意义和现实意义。
附图说明
图1为实施例1中棉花RNA的电泳图谱。
图2为实施例1中PCR扩增目的基因的电泳图谱。
图3为实施例1中高、低油棉花材料不同发育时期幼胚中GhENR基因的表达水平。
图4为实施例1中高、低油棉花材料不同发育时期的幼胚中的含油量。
图5为实施例2中重组质粒P2301M-GhENR的BamHI和SpeI双酶切鉴定图谱。
图6为实施例2中重组质粒P2301M-GhENR的部分结构示意图。
图7为实施例2中部分T2代植株的PCR鉴定电泳图。
图8为实施例2中各株系拟南芥的表型照片。
图9为实施例2中某一样本的气相色谱图。
图10为实施例2中各株系的总脂肪酸含量。
图11为实施例3中部分T2代植株的PCR鉴定电泳图。
图12为实施例3中各株系的籽粒含油量。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
哥伦比亚生态型拟南芥(Columbia ecotype Arabidopsis thaliana,col-0)：从Tair网站注册购买（http://arabidopsis.org/），tair登录号：SpeciesVariant:90。农杆菌EHA105：中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，产品货号Biovector008。pCAMBIA2301载体：中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，产品货号：Biovector008。
棉花品种“珂字201”：参考文献：吕复兵，张献龙，刘金兰．陆地棉原生质体培养与植株再生．华北农学报，1999，14（1）：73-78。
棉花品种“苏棉20号”：参考文献：“李卫华，胡新燕，王阶祥，杨峰，张正敏，丁震乾。高产抗病棉花新品种苏棉20号。中国棉花，2003，30（1）：8”。
p2301M载体的结构描述如下：在pCAMBIA2301载体的EcoR I与HindⅢ酶切位点之间插入与序列表的序列3的第12-1177位核苷酸反向互补的双链DNA分子得到的重组质粒。p2301M载体的构建方法如下：将序列表中序列3所示双链DNA分子用限制性内切酶与HindⅢ和EcoR I进行双酶切，回收酶切片段，与经过HindⅢ和EcoR I双酶切pCAMBIA2301载体得到的载体骨架相连，得到p2301M载体。
实施例1、GhENR蛋白及其编码基因的发现
一、GhENR蛋白及其编码基因的发现
利用拟南芥油脂代谢数据库中AtENR的cDNA序列在NCBI的棉花EST数据库中进行比对,下载一致性高的EST用CAP3Sequence assembly进行拼接，用ORF finder预测ORF区，设计引物，PCR扩增出棉花的ENR的基因片段，送交测序，将测序结果与拼接结果提交NCBI进行比对，并用DNAMAN将其翻译成蛋白序列进行验证。
棉花RNA的电泳图谱见图1；A为经DNase I消化前的RNA；B为经DNase I消化后的RNA；泳道1-3表示3次重复；上面的一个条带均为28S RNA，下面的一个条带均为18S RNA。
图2为PCR扩增目的基因的电泳图谱。其中，泳道1为PCR扩增产物；泳道M为D15000plus DNA ladder分子量标准。
从棉花品种“珂字201”中发现一个新蛋白，如序列表的序列1所示，由394个氨基酸残基组成，将其命名为GhENR蛋白。将编码GhENR蛋白的基因命名为GhENR基因，其开放阅读框如序列表的序列2自5’末端第105至1289位核苷酸所示。
二、GhENR蛋白的生物信息学分析
GhENR蛋白的分子量为41.928kD，理论等电点为8.56，是一种不稳定蛋白，GRAVY值为0.017；亚细胞定位预测GhENR定位在线粒体的可能性为69.6%；GhENR二级结构预测显示主要为α螺旋和无规则卷曲。
三、GhENR基因的表达分析
分别种植棉花高低油材料，开花当天去挂牌，分别取开花后（DPA）5天、10、15、20、25、30、35天的棉铃放冰盒，送回实验室，立即播出幼胚，分为3份，放-80℃保存，用于RNA抽提。在室内种植水培苗，待长至三叶一心时分别取根、茎、叶3份样，放-80℃保存，用于RNA抽提。
提取棉花总RNA并反转录为cDNA，采用GhE3F和GhE3R组成的引物对进行RT-PCR和QRT-PCR。
GhE3F：5’-CGAAGCAGGAAGAAAGCACA-3’；
GhE3R：5’-CATAGCCGAAGCCAAAGGTG-3’。
RT-PCR结果表明，GhENR基因在根、茎、叶和幼胚各时期均有表达。
高、低油棉花材料不同发育时期的幼胚中GhENR基因的表达水平见图3。高、低油棉花材料不同发育时期的幼胚中的含油量见图4。高油材料的GhENR基因在幼胚各发育时期均高于低油材料，并且都在幼胚发育后期30-35DPA时达到表达高峰，并与油分在这时期的快速积累相一致，表明了GhENR蛋白在油分合成过程中的重要功能。
实施例2、转基因植物的获得和鉴定（拟南芥）
一、转基因植物的获得
1、重组表达载体的构建
（1）合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
（2）以步骤（1）的双链DNA分子为模板，用GhE2F和GhE2R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
GhE2F：5’-CGGGATCCCG CCTCAACATTTCTTCTCCT-3’；
GhE2R：5’-GACTAGTC GTTTGCTATCAGTCTCCCG-3’。
（3）用限制性内切酶BamHI和SpeI双酶切步骤(2)的PCR扩增产物，回收酶切产物。
（4）用限制性内切酶BamHI和SpeI双酶切p2301M载体，回收约12kb的载体骨架。
（5）将步骤（3）的酶切产物和步骤（4）的载体骨架连接，得到重组质粒P2301M-GhENR。重组质粒P2301M-GhENR的BamHI和SpeI双酶切鉴定图谱见图5，1为D15000plusMarker，M3为酶切产物。根据测序结果，对重组质粒P2301M-GhENR进行结构描述如下：在p2301M载体的BamHI和SpeI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的GhENR基因。重组质粒P2301M-GhENR的部分结构示意图见图6。
2、转基因植物的获得
（1）重组农杆菌的获得
将重组质粒P2301M-GhENR转化农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。
2、转基因拟南芥的获得
利用重组农杆菌，通过花浸泡法（Clough S.J.,Bent A.F.Floral dip:Asimplified method for Agrobacterium mediated Arabidopsis thaliana.PlantJ.1998,16,735-743.）将GhENR基因导入哥伦比亚生态型拟南芥，得到T1代种子。
T1代种子收获后在MS培养基（含有50mg/L的卡那霉素）中筛选抗性植株，将抗性植株移栽到土中，收获T2代种子并将其培育为植株（T2代植株）。
分别提取T1代植株和T2代植株的叶片的基因组DNA，用Kan1F和Kan1R组成的引物对对来自各个样本的基因组DNA进行PCR鉴定（靶序列为约500bp的条带），PCR鉴定为阳性的植株即转基因植株。对于某一T1代植株，如果其T2代植株均PCR鉴定为阳性，则该植株为纯合的转基因植株，该植株及其后代即为1个纯合的转基因株系。部分T2代植株的PCR鉴定电泳图见图7，箭头标注靶序列。图7中：1为E1-2株系，2为E1-8株系，3为E2-1株系，4为E2-4株系，5为E3-9株系，6为E3-11株系，7为E3-14株系，8为E3-20株系，9为阴性对照（哥伦比亚生态型拟南芥），10为阳性对照（重组质粒P2301M-GhENR）；M：D2000plus Marker。
Kan1F：5’-CACTGAAGCGGGAAGGGACT-3’；
Kan1R：5’-CGATACCGTAAAGCACGAGGAA-3’。
T2代转基因植株自交产生T3代种子。T3代转基因植株自交产生T4代种子。
随机选取两个纯合的转基因株系（E1-2、E2-4）进行步骤四和步骤五的鉴定。
三、转空载体植株的获得
用p2301M载体代替重组质粒P2301M-GhENR，其它同步骤二，得到转空载体植株。
四、转GhENR基因拟南芥植株表型鉴定
将E1-2株系的T3代种子、E2-4株系的T3代种子、转空载体植株的T3代种子和哥伦比亚生态型拟南芥的种子分别播种并在相同条件下正常培养10天，观察表型并拍照。进行三次重复试验。
照片见图8（每张照片中为8个植株，左边4株为哥伦比亚生态型拟南芥，右边4株为转基因植株）。E1-2株系的植株、E2-4株系的植株、转空载体植株和哥伦比亚生态型拟南芥的表型均没有显著差异，即转基因后植株的根长及叶片都没有受到影响，这一结果说明GhENR基因的表达对受体材料苗期的生长没有明显影响。
五、含油量鉴定
将E1-2株系的T4代种子、E2-4株系的T4代种子、转空载体植株的T4代种子和哥伦比亚生态型拟南芥的种子分别采用气相色谱法进行含油量检测，方法如下：
取0.01-0.02g待测种子，加2ml无水甲醇和氯乙酰的混合液（无水甲醇∶氯乙酰=10∶1；体积比），2.5ml浓度为1mg/ml的内标溶液（内标为十九烷酸甲酯，购自百灵威化学技术有限公司，货号：SFA-013N；溶剂为正己烷），振荡混匀，80℃水浴2小时，冷却到室温，加2.5ml浓度为7g/100ml的K2CO3水溶液以中和脂肪酸，漩涡旋均匀后倒入10ml的离心管，2700转/分钟离心2分钟，取上清进行气相色谱分析。
气相色谱条件如下：交联石英毛细管柱，PEG-20M为固定相，氮气为载气，恒流流速1.2ml/min，柱温200℃，检测温度350℃，FID检测器。
使用HP7890气相色谱仪自带的HP-chemstation软件进行自动积分后，分别用如下公式计算脂肪酸各组分的含量以及总含量。
FA ( % ) = PA x × ( C STD × V STD ) PA STD × m S × 100 %
OIL ( % ) = ( Σ PA x - PA STD ) × ( C STD × V STD ) PA STD × m S × 100 %
其中PAx为脂肪酸单成分的峰面积，PASTD为内标的峰面积，CSTD为内标的浓度，VSTD为所加内标的体积，ms为样品的重量。FA代表某种脂肪酸重量占待测种子重量的百分比。OIL代表总脂肪酸重量占待测种子重量的百分比。
进行三次重复实验，结果取平均值。
结果见图9、图10和表2。
表2各个株系种子的脂肪酸含量检测结果
脂肪酸组成 col-0 转空载体植株 E1-2 E2-4
C14:0 0.03% 0.03% 0.04% 0.05%
C16:0 2.56% 2.55% 3.20% 3.10%
C16:1 0.06% 0.06% 0.06% 0.06%
C18:0 1.31% 1.30% 1.79% 1.66%
C18:1 3.16% 3.15% 4.04% 3.86%
C18:2 7.96% 7.95% 8.91% 8.46%
C18:3 4.63% 4.61% 4.70% 4.39%
C20:0 0.51% 0.51% 0.52% 0.51%
C20:1 5.15% 5.16% 5.93% 5.47%
C22:0 0.17% 0.17% 0.19% 0.16%
总脂肪酸 25.5% 25.4% 29.4% 27.7%
实施例3、转基因植物的获得和鉴定（棉花）
一、转基因棉花的获得
用实施例2构建的重组质粒P2301M-GhENR通过花粉管通道法(Zhou G Y,etal.Introduction of exogenous DNA into cotton embryos.Methods inEnzymology.1983,101:433～488)转化棉花品种“苏棉20号”，得到T1代种子。
T1代种子收获后在大田中筛选抗性植株（长出真叶时用5g/L的卡那霉素涂抹），将抗性植株移栽到土中，收获T2代种子并将其培育为植株（T2代植株）。
分别提取T1代植株和T2代植株的叶片的基因组DNA，用Kan1F和Kan1R组成的引物对对来自各个样本的基因组DNA进行PCR鉴定（靶序列为约500bp的条带），PCR鉴定为阳性的植株即转基因植株。对于某一T1代植株，如果其T2代植株均PCR鉴定为阳性，则该植株为纯合的转基因植株，该植株及其后代即为1个纯合的转基因株系。部分T2代植株的PCR鉴定电泳图见图11，箭头标注靶序列，M为D2000plus Marker。
随机选取五个纯合的转基因株系（LK723-1、LK723-3、LK723-9、LK723-10、LK723-13）进行步骤三的鉴定。
二、转空载体植株的获得
用p2301M载体代替重组质粒P2301M-GhENR，其它同步骤二，得到转空载体植株。
三、含油量鉴定
将LK723-1株系的T2代种子、LK723-3株系的T2代种子、LK723-9株系的T2代种子、LK723-10株系的T2代种子、LK723-13株系的T2代种子、转空载体植株的T2代种子和苏棉20号的种子分别采用索氏提取器进行含油量检测。
含油量检测的方法如下：
（1）将棉花种子去壳，取2.00g左右棉籽仁，称重（A1）；称量铝盒的重量（B），将棉籽仁放入对应的铝盒内，130℃烘箱内烘干2h；
（2）将平底烧瓶用蒸馏水洗净，与棉籽仁同时烘干2h；
（3）取出样品置于干燥器中冷却30min，称量棉籽仁与铝盒的合重（A2+B）及平底烧瓶的重量（C）；
（4）将棉籽仁在研钵中磨碎，装入滤纸斗内，封紧，放入提取筒；
（5）向已恒重的平底烧瓶内倒入80-90mL无水乙醚（乙醚不能与提取筒下端接触），把装有样品的提取筒安装在平底烧瓶上，将冷凝管安装在提取筒上，保证接口不漏气，打开冷凝水。提取装置于恒温水浴锅加热（水温65℃-72℃），提取2.5h；
（6）取出装有样品的滤纸斗，连同铝盒置于103℃烘箱内烘干7-8min，立即研磨装入滤纸斗（原来的滤纸）中，提取2.5h；再取出装有样品的滤纸斗，置于烘箱内烘干7-8min，立即研磨装入滤纸斗（换新的滤纸）中提取1h；
（7）回收乙醚，打开冷凝管下端开关，至无无水乙醚滴下，表明平底烧瓶中的乙醚已经回收完全，关闭冷凝水和水浴锅；
（8）将平底烧瓶置于103℃烘箱内烘30min，密封干燥器中完全冷却约30min后称重，记录平底烧瓶与油份的合重，记为Co。
数据计算：
进行3次重复实验，结果取平均值。
结果见图12和表3。
表3各个株系棉仁含油量检测结果
含油量/%
苏棉20号 25.6
空载体植 25.4
K723-1 27.5
K723-3 27.1
K723-9 27.9
K723-10 27.6
K723-13 27.6

Claims (8)

1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(1)或(2)或(3)所述的DNA分子：
(1)序列表中序列2自5’末端第105至1286位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表中序列2自5’末端第105至1289位核苷酸所示的DNA分子；
(3)序列表中序列2所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到含油量高于所述目的植物的转基因植物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：权利要求3所述基因通过权利要求4所述重组载体导入所述目的植物中。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。
8.权利要求1所述蛋白，或权利要求2或3所述基因在调控植物含油量中的应用。
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