CN112442511A - 提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法 - Google Patents

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CN112442511A CN202110000878.5A CN202110000878A CN112442511A CN 112442511 A CN112442511 A CN 112442511A CN 202110000878 A CN202110000878 A CN 202110000878A CN 112442511 A CN112442511 A CN 112442511A
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Abstract

本发明公开了一种提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法，首先利用生物信息资源，选定能够编码腺苷酸环化酶催化活性中心的模板DNA序列，然后采用PCR扩增或化学合成或其它可选择的克隆方法得到带有该序列片段的DNA产物，并且使其能够在转录表达后翻译生成具有腺苷酸环化酶催化活性的肽链或蛋白质；将获得的DNA产物利用DNA克隆技术，导入到所选的植物基因表达载体系统中，将其插入到控制外源基因表达的启动子和终止子元件序列之间的多克隆位点；将构建的植物基因表达载体进行遗传转化，获得腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量显著提高的转基因植物。本发明方法为人们在植物中开发利用cAMP提供了新的思路，填补了对该项研究的空白。

Description

提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法
技术领域
本发明涉及生物技术，尤其是涉及一种提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法。
背景技术
环腺苷酸（3',5'-cyclic adenosine monophosphate；cycilc AMP；cAMP）的发现与研究已有60多年的历史。它是在生物界普遍存在的一种第二信使分子，能够在生命活动中发挥重要的调节作用，对基因表达、细胞周期、免疫反应、新陈代谢、认知与记忆、环境适应性和生长发育等许多生物学过程产生显著影响。目前，人们对cAMP在细菌、真菌和动物等物种中的信号调节作用及其机制已具有相当的认识和了解，正在日益重视探索它在人类健康与卫生、疾病治疗和药物研发中的应用价值。
植物组织细胞中cAMP的含量普遍较低，甚至达不到实验室常规技术的检测水平，导致人们迄今对植物中cAMP信号调节作用的了解明显落后于其它物种（徐如强等，2020；Blanco et al. 2020），从而也极大地限制了人们在植物中开发利用cAMP的前景。cAMP是由腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase)直接催化三磷酸腺苷(ATP；adenosine 5′-triphosphate)生成的产物, 这也是生物界合成cAMP的唯一生化反应途径；但是，cAMP也能够被磷酸二酯酶(phosphodiesterase)水解成单磷酸腺苷(AMP；adenosine 5′-monophosphate)。因此，细胞中cAMP的含量或水平取决于腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶的活性反应之间所建立起的动态平衡结果。尽管如此，细胞内cAMP的信号调节作用主要依赖于激活腺苷酸环化酶的活性和cAMP浓度水平的提高。不同物种编码的腺苷酸环化酶在蛋白质结构上均包含非常保守的环化酶同源结构域(cyclase homology domain)，并形成具有明显特征的催化活性中心，从而决定了腺苷酸环化酶的活性。与其它物种不同，人们迄今在植物基因组中并未发现编码腺苷酸环化酶的专一功能基因，而是发现一些植物基因编码的蛋白质结构中既包含腺苷酸环化酶的催化活性中心序列，又具有其它明显不同功能的保守结构域。例如，拟南芥编码的钾离子转运蛋白AtKUP5和AtKUP7主要发挥钾离子的吸收和转运功能，它们却包含腺苷酸环化酶催化活性中心的保守序列，并具有催化生成cAMP的腺苷酸环化酶活性（Al-Younis et al. 2015，2018）。很显然，自然界中植物的腺苷酸环化酶活性被整合在了一个具有其它明显不同功能的基因中，这可能是造成植物组织细胞中cAMP含量较低的重要原因之一，它也对解析植物中cAMP的信号调节作用及其开发利用带来不可避免的局限性。解决这些问题的根本途径是开发和利用具有编码腺苷酸环化酶活性专一功能基因的植物模型，提高植物中腺苷酸环化酶活性的表达水平与cAMP含量。很遗憾，迄今在这方面的研究报道仍属空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法，包括下述步骤：
第一步，利用生物信息资源，选定能够编码腺苷酸环化酶催化活性中心的模板DNA序列，然后采用PCR扩增或化学合成方法（或其它的克隆方法）得到带有该序列片段的DNA产物，所述DNA产物能够在转录表达后翻译生成具有腺苷酸环化酶催化活性的肽链或蛋白质；
第二步，将第一步获得的DNA产物利用DNA克隆技术，导入到所选的植物基因表达载体系统中，将其插入到控制外源基因表达的启动子和终止子元件序列之间的多克隆位点；所述的启动子是指以组成型或者诱导型方式控制基因转录起始的调控元件序列，终止子是指控制基因转录终止或者poly(A)形成的调控元件序列，从而形成一个完整的基因表达单元或者基因表达盒，使其能够在植物基因组中进行转录表达与蛋白质翻译；
第三步，将上述所构建的植物基因表达载体进行遗传转化，获得腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量显著提高的转基因植物。
将第三步得到的转基因植物提取总RNA，并通过反转录合成cDNA模板，然后利用定量PCR检测腺苷酸环化酶活性转基因的表达水平。
采集第三步得到的转基因植物组织样品，在液氮中研磨成粉末，加入高氯酸溶液进行提取，随后低温离心，收集上清提取液，冷冻干燥成粉末，利用cAMP酶联免疫法检测试剂盒测定样品中的cAMP含量。
本发明利用编码腺苷酸环化酶催化活性中心保守序列的核苷酸片段，尤其是植物来源的这种核苷酸片段，通过DNA重组技术构建表达腺苷酸环化酶活性的人工合成基因，并通过转基因技术手段将其导入植物基因组内表达，获得能够使腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量显著提高的转基因植物，为人们在植物中开发利用cAMP提供了新的思路，填补了对该项研究的空白。
附图说明
图1 是所构建的表达载体pMDC83-AC和诱导性表达载体pTA7001-AC中T-DNA片段的组成结构示意图。
图2 是AC转基因拟南芥植株的PCR分子鉴定结果以及获得的代表性转基因植株的照片。
图3 是AC转基因甘蓝型油菜植株的PCR分子鉴定结果以及获得的转基因植株的照片。
图4 是获得的转基因拟南芥植株中AC基因的表达水平与cAMP含量检测结果。
图5 是获得的转基因甘蓝型油菜植株中AC基因的表达水平与cAMP含量检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。如无特别说明，本发明实施例中所用到的试剂和实验仪器均为分子生物学实验室中常用的试剂和仪器，所用方法也为分子生物学实验室中使用的常规技术方法。
实施例1 腺苷酸环化酶活性基因AC的克隆组装及其植物表达载体的构建
1、克隆编码腺苷酸环化酶催化活性中心的DNA序列片段：
根据文献记载（Al-Younis et al. 2015），拟南芥基因组中AT5G09400基因位点编码AtKUP7，其蛋白质序列中由100个氨基酸组成的氨基末端片段包含腺苷酸环化酶催化活性中心。因此，依据AtKUP7基因的DNA序列，设计能够对编码腺苷酸环化酶催化活性中心的DNA片段进行特异性扩增的PCR引物：
KUP7-F1，5’-CACCATGGCGGAGGAAAGCAGTAT-3’，其中的下划线序列为AtKUP7基因的起始密码子；
KUP7-R1，5’-TTATTTCCTCCCAACGGTCAAG-3’，其中的下划线序列为添加的终止密码子序列。
准备野生型Col-0拟南芥幼苗材料，在液氮中研磨成粉末，利用柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒（生工生物工程有限公司）提取总RNA，随后利用反转录试剂盒HIScript® IIIRT SuperMix for qPCR (+ gDNA wiper) Reagent Kit（南京诺唯赞生物科技有限公司）合成cDNA模板，并使用2xPfu MasterMix PCR试剂（康为世纪生物科技有限公司）和上述引物配制PCR反应液，在Bio-Rad T100™ 热循环仪上进行PCR扩增，循环参数设定为：95℃预变性3min；30个循环的95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min；72℃延伸5min。
将获得的PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，可以看到一条319bp大小的DNA条带。该DNA产物的序列由一个带有起始密码子ATG和终止密码子TAA的开放阅读框组成，转录表达后的翻译产物为由104个氨基酸组成的多肽或蛋白质，它具有与AtKUP7 中腺苷酸环化酶催化活性中心一样的氨基酸序列，在此将其命名为AC基因。
AC基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
利用磁珠法琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）对上述DNA条带进行提取并纯化，备用。
2、制备AC基因的Gateway™入门载体：
利用限制性内切酶AhdI对1µg的pGWC质粒载体（Chen et al. 2006）DNA在37℃条件下进行酶切3h，将反应产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，可以看到一条2537bp大小的DNA条带，利用上述磁珠法琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行提取并纯化，获得pGWC的线性化DNA，与上述回收的AC基因片段混合，加入T4连接酶及反应缓冲液，置于4℃进行连接反应16h。取2µl连接反应液，利用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将菌液涂在含有25 mg/L氯霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养。挑取单菌落，放入50µl无菌水中煮沸裂解5min作为DNA模板，并利用2xES Taq Master Mix试剂（康为世纪生物科技有限公司）和引物：KUP7-F2，5’-ATGGCGGAGGAAAGCGATAT-3’；RV-M，5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’ 配制菌落PCR反应液，在Bio-Rad T100™ 热循环仪上进行PCR扩增，循环参数为：94℃预变性2min；32个循环的94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s；72℃延伸5min。
将获得的扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，阳性克隆菌落的PCR产物可以看到一条508bp大小的条带。将阳性菌落接种在含有25 mg/L氯霉素的LB液体培养基中，在37℃摇床上培养过夜，收集菌液。利用试剂盒PurePlasmid Mini Kit（康为世纪生物科技有限公司）提取质粒DNA。最后，利用通用测序引物：SP6，5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’或T7，5’-TAATACGACTCACTATAGGGC-3’对提取的质粒DNA进行测序，验证插入的AC基因序列，从而获得AC基因的Gateway™入门载体，命名为pGWC-AC。
3、构建AC基因的植物表达载体：
利用Gateway™克隆重组试剂盒（Invitrogen公司），将50ng的上述pGWC-AC入门载体DNA分别与100ng的组成型植物表达载体pMDC83（Curtis et al. 2003）和诱导型植物表达载体pTA7001-DEST（http://n2t.net/addgene:71745；Aoyama et al. 1997; Gu et al.2011）混合，加入Gateway™ LR Clonase™酶及缓冲液，在25℃温度条件下进行重组反应3h。取2μL反应液，利用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将菌液涂在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养。按照上述介绍的操作方法，利用引物：
HPT-F1，5’-GTGATGGACGACACCGTCAGTG-3’；
HPT-R1，5’-CGGACGATTGCGTCGCATCGA-3’进行菌落PCR鉴定，循环参数为：94℃预变性2min；32个循环的94℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 30s；72℃延伸5min。阳性克隆菌落的PCR产物可以看到一条401bp大小的电泳条带，挑取阳性菌落接种在含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃摇床上培养过夜，收集菌液。
利用上述PurePlasmid Mini Kit试剂盒提取质粒DNA，并利用测序引物：MDC，5’-GCATGCCTGCAGGTCGACTC-3’和
PTA，5’-ACCTCGATCGAGATCTTCGCAA-3’分别对pMDC83和pTA7001-DEST所衍生的重组质粒DNA进行测序，验证插入的AC基因序列，从而获得AC基因的植物表达载体，分别命名为pMDC83-AC和pTA7001-AC。
附图1是所构建的腺苷酸环化酶活性AC基因植物表达载体中T-DNA片段的组成结构示意图：
在pMDC83-AC载体（附图1A）中，AC基因的转录表达由来源于花椰菜花叶病毒的组成型启动子CaMV35S （图中标记为P2x35S；2个拷贝的序列）和来源于农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子元件序列（图中标记为nos-T）共同控制，而T-DNA抗性筛选标记为潮霉素抗性基因（Hygr）；
在pTA7001-AC载体（附图1B）中，GVG是一个能够被类固醇类激素（例如，人工合成的糖皮质类激素地塞米松）诱导表达的转录因子，它由CaMV35S （图中标记为P35S；1个拷贝的序列）启动子和来源于豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小亚基rbcS-E9 的poly(A)添加调控元件序列（图中标记为E9）共同控制，而AC基因的转录表达由6xUASGAL4启动子和来源于豌豆rbcS-3A的poly(A)添加调控元件序列（图中标记为3A）共同控制，其中6xUASGAL4启动子的活性需要GVG的激活表达所诱导，该载体的T-DNA抗性筛选标记为潮霉素抗性基因（Hygr）。
实施例2 AC基因植物表达载体对拟南芥的遗传转化
1、 制备AC基因植物表达载体转化的农杆菌：
将实施例1中所构建的pMDC83-AC和pTA7001-AC植物表达载体分别转化农杆菌GV3101，采用冻融转化法的操作步骤为：
取1µg的pMDC83-AC或pTA7001-AC质粒DNA与100µl的GV3101化学感受态细胞混合，放置冰上30min，然后在液氮中速冻2-3min，随后转移至37℃水浴锅中3-5min，再放置冰上5min。加入200μL的LB液体培养基，在28℃摇床上培养3-5h，将菌液涂在含有50mg/L卡那霉素、25mg/L利福平和50mg/L庆大霉素的LB固体培养基上，随后放入28℃恒温箱中培养2-3天。
按照实施例1中所述操作方法以及所述引物KUP7-F1和KUP7-R1进行菌落PCR鉴定，阳性克隆菌落的PCR产物可以看到一条319bp大小的电泳条带。挑取阳性单菌落，接种2mL含有上述抗生素的LB液体培养基，在28℃摇床上培养2天，将菌液在-80℃冰箱中保存，备用。
2、准备拟南芥植株：将营养土（PINDSTRUP substrate 0-6mm, pH6.0）装满花盆，然后剪一块纱网覆盖在营养土表面，并使用橡皮筋将纱网固定在花盆上。将Col-0野生型拟南芥种子均匀地播种于营养土表面，使用喷壶将营养土表面喷湿，随后用透明塑料盖罩住保湿，置于22℃和16h光照/8h黑暗的生长室中培养，待种子萌发后，去掉塑料盖，继续培养，注意浇水施肥管理，待植株生长抽苔大约5cm后，剪掉主茎，促进侧枝生长，大约一周后利用上述保存的农杆菌进行遗传转化。
3、利用蘸花法转化拟南芥植株：从-80℃冰箱中取出含有pMDC83-AC或pTA7001-AC的农杆菌GV3101，接种在含有50mg/L卡那霉素、25mg/L利福平和50mg/L庆大霉素的LB液体培养基中，在28℃摇床上培养至接近饱和生长期（OD600大约为1.5），收集菌液，离心（3000 xg）10min，倒掉上清液，加入含有5%蔗糖和0.05%（V/V）Silwet L-77的水溶液重悬，并将菌液浓度调整至OD600为0.8。将上述准备好的拟南芥植株倒扣在盛有农杆菌重悬液的烧杯中，使植株地上部分充分浸泡在菌液中1min，取出后水平放置在托盘中，然后用透明塑料盖罩住保湿，过夜后去掉塑料盖，并将植株竖起直立生长，直至成熟后收获种子，期间注意浇水施肥管理。
4、筛选AC转基因拟南芥植株：将上述收获的种子（T0代）进行酒精消毒处理，均匀地种植在含有20 mg/L潮霉素的1/2MS基础盐固体培养基上，置于4℃低温处理2天，随后转移至22℃和16h光照/8h黑暗的生长室中培养。潮霉素抑制非转基因种子的萌发和生长，将能够正常生长并且长出真叶的抗性幼苗移栽至营养土中继续生长，收获单株种子（T1代）。按照上述步骤在培养基上继续种植T1代种子，并计数每一个单株后代的抗性与非抗性幼苗的分离比率，在基因组中插入单拷贝T-DNA的转基因植株分离比率为3:1。将单拷贝转基因植株的抗性幼苗移栽到营养土中继续生长，并收获单株种子（T2代）。按照上述步骤在培养基上继续种植T2代种子，全部生长为抗性幼苗的单株种子既为纯合子后代，从而获得纯合子转基因株系。
5、AC转基因拟南芥植株的分子鉴定：种植上述所获得的AC转基因植株后代，利用试剂盒AmPure Plant DNA Kit（广州美基生物科技有限公司）提取植株基因组DNA作为模板，使用实施例1中所述引物KUP7-F1和KUP7-R1对T-DNA片段中的AC转基因进行PCR检测，阳性转基因植株的PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离出现一条319bp大小的条带；而使用引物：
HPT-F2，5’-GCGAGAGCCTGACCTATTGCATCT-3’；
HPT-R2，5’-GCCGTCAACCAAGCTCTGATAGAGT-3’检测T-DNA片段中的潮霉素抗性基因（Hgrr），阳性转基因植株的PCR产物则出现一条593bp大小的电泳条带。由于引物KUP7-F1和KUP7-R1能够对拟南芥基因组中AtKUP7基因的DNA序列进行扩增，从而使Col-0野生型和转基因植株的PCR产物均会出现一条882bp大小的电泳条带。
附图2为AC转基因拟南芥植株的PCR分子鉴定结果以及获得的代表性转基因植株的照片：凝胶电泳图片（附图2A和2B）中泳道#1-3和泳道#4-5分别为pTA7001-AC和pMDC83-AC转基因株系，泳道#6-7为Col-0野生型植株（WT），NC为无模板DNA阴性对照，M为分子量标记；可以看出，利用引物KUP7-F1和KUP7-R1在野生型植株中仅扩增出一条对应AtKUP7基因中DNA片段的882bp条带，而在转基因植株中则扩增出882bp条带和对应AC转基因的319 bp条带，NC阴性对照无扩增条带；而利用引物HPT-F2和HPT-R2仅在转基因植株中扩增出对应潮霉素抗性基因（Hgrr）的593 bp条带，NC阴性对照和野生型材料则均无扩增条带；附图2C是获得的代表性转基因植株。
实施例3 AC基因植物表达载体对甘蓝型油菜的遗传转化
说明：本实施例中的MSB5是指由MS（Murashige & Skoog）培养基的基础盐成分与Gamborg B5培养基的维生素成分复合组成的培养基。所有配置的培养基均利用氢氧化钾调pH值，灭菌后的pH约为5.6-5.8。无菌操作过程均在超净工作台上进行。
1、培养无菌苗：利用甘蓝型油菜育种亲本品系P300（由河南省农业科学院油菜育种研究室提供）为实验材料，挑选健康的种子在70%酒精中浸泡30s，无菌水冲洗2-3次，然后利用0.1% 的HgC12处理5min，无菌水冲洗3-5次。将种子种植在萌发培养基（1/2 MSB5 +10g/L 蔗糖 + 8g/L琼脂粉）上，置于22℃-16h光照/20℃-8h黑暗，湿度65%，光照强度5000Lux的智能人工培养箱中，黑布遮光培养4天。
2、切取下胚轴外植体与预培养：从上述无菌苗上切取长度5-10mm的下胚轴切段，接种在预培养基（MSB5 + 1mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸 + 2mg/L 6-苄氨基嘌呤 + 0.05mg/L萘乙酸 + 500mg/L 2-吗啉乙磺酸 + 30g/L 蔗糖 + 8g/L琼脂粉）上，置于上述智能人工培养箱中，黑布遮光培养3天。
3、农杆菌侵染外植体与共培养：利用实施例2中获得的含有pTA7001-AC的农杆菌GV3101，接种在含有50mg/L卡那霉素、25mg/L利福平和50mg/L庆大霉素的YEP液体培养基中，在28℃摇床上培养至接近饱和生长期（OD600大约为1.5），离心（3000 x g）10min，重悬至OD600约为0.4。将上述预培养的外植体浸泡在农杆菌重悬液中10min，然后接种至表面附有一层无菌滤纸的共培养基（MSB5 + 1mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸 + 2mg/L 6-苄氨基嘌呤 +0.05mg/L 萘乙酸 + 500mg/L 2-吗啉乙磺酸 + 100μM 乙酰丁香酮 + 30g/L 蔗糖 + 8g/L琼脂粉）上，置于上述智能人工培养箱中，黑布遮光共培养3天。
4、诱导愈伤组织：将上述经过农杆菌侵染与共培养的外植体转移至愈伤组织诱导培养基（MSB5 + 1mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸 + 1mg/L 激动素 + 500mg/L 2-吗啉乙磺酸 +5mg/L 硝酸银 + 4mg/L 潮霉素 + 300mg/L 特美汀 + 30g/L 蔗糖 + 8g/L琼脂粉）上，置于上述智能人工培养箱中，黑布遮光培养7天。
5、诱导幼芽分化：将上述经过愈伤组织诱导培养的外植体转移至分化培养基（MSB5 + 1mg/L 玉米素 + 3mg/L 6-苄氨基嘌呤 + 500mg/L 2-吗啉乙磺酸 + 5mg/L 硝酸银 + 4mg/L 潮霉素 + 300mg/L 特美汀 + 30g/L 蔗糖 + 8g/L琼脂粉）上，在上述智能人工培养箱中继续培养，每2周继代培养一次，大约4-6周后可以看到抗性幼芽的分化再生。
6、芽延长培养：将上述再生幼芽从外植体上切下，转移至芽延长培养基（MSB5 +0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤 + 500mg/L 2-吗啉乙磺酸 + 5mg/L 硝酸银 + 300mg/L 特美汀 +30g/L 蔗糖 + 8g/L琼脂粉）上，在上述智能人工培养箱中继续生长至2-3cm大小的幼苗。
7、生根培养：将上述再生幼苗转移至生根培养基（MS + 1mg/L 吲哚丁酸 + 1mg/L潮霉素 + 20g/L 蔗糖 + 8g/L琼脂粉）上，置于上述智能人工培养箱中诱导生根，大约1周后可以看到根系的生长。
8、幼苗移栽：将上述已生根的再生幼苗转移至温度22±2℃，湿度65%，16h光照/8h黑暗，光照强度5000-6000 Lux的生长室中，首先将培养基上生长的幼苗暴露于空气中进行炼苗3-5天，然后移栽到营养土中生长，注意适当浇水施肥，直至开花结果，收获成熟种子。
9、 AC转基因油菜植株的分子鉴定：按照实施例2中介绍的分子鉴定操作步骤，提取转基因植株的基因组DNA，利用引物KUP7-F1和KUP7-R1检测T-DNA片段中的AC基因，阳性转基因植株的PCR产物出现319bp大小的电泳条带；而利用引物HPT-F2和HPT-R2检测T-DNA片段中的潮霉素抗性基因（Hgrr），阳性转基因植株的PCR产物出现593bp大小的电泳条带。
附图3为AC转基因油菜植株的PCR分子鉴定结果以及获得的转基因植株照片：凝胶电泳图片（附图3A和3B）中泳道#1-4为获得的转化再生植株，WT为P300对照植株，NC为无模板DNA阴性对照，M为分子量标记；可以看出，在NC阴性对照和P300对照植株的PCR产物中均未出现任何扩增条带，而在转化再生植株#1和#3中利用引物KUP7-F1和KUP7-R1以及HPT-F2和HPT-R2分别扩增出一条对应AC转基因的319bp条带（附图3A）和一条对应潮霉素抗性基因（Hgrr）的593 bp条带（附图3B），从而证实这两个植株（附图3C）为转化成功的转基因植株。将转基因植株#1和#3收获的种子在温室中种植，植株开花后套袋自交，收获种子后继续种植，通过后代分离获得纯合子转基因植株材料。
实施例4 转基因拟南芥中AC基因表达与cAMP含量检测
1、AC基因表达检测：将实施例2中获得的pTA7001-AC和pMDC83-AC转基因拟南芥株系以及Col-0野生型材料种植在花盆中，置于22℃和16h光照/8h黑暗的生长室中培养。在植株生长4周左右，对pTA7001-AC转基因植株材料喷施含有30µM 地塞米松（dexamethasone，DEX)和0.01% (W/V) Tween-20的水溶液。其中，地塞米松是一种人工合成的糖皮质类激素，能够诱导AC转基因的表达，而Tween-20是作为叶表面活性剂。在喷施DEX处理后0h（这里是指喷施后立即取样），6h和24h分别采集叶片组织，同时采集pMDC83-AC和Col-0野生型植株在同一时期（对应0h）的叶片组织，在液氮中研磨成粉末，利用柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒（生工生物工程有限公司）提取总RNA，随后利用反转录试剂盒HIScript® III RT SuperMixfor qPCR (+ gDNA wiper) Reagent Kit（南京诺唯赞生物科技有限公司）合成cDNA模板。使用ChamQTM Universal SYBR® qPCR试剂（南京诺唯赞生物科技有限公司）配制PCR反应液，利用引物：
KUP7-F2，5’-ATGGCGGAGGAAAGCGATAT-3’；
KUP7-R2，5’-TTTCCTCCCAACGGTCAAG-3’扩增AC转基因；以拟南芥基因组中编码β-tubulin的基因（At5G44340）作为内参基因，扩增引物序列为：
TUB-F1，5’-TGTTTCGTTCATGTGTGTTCGTT-3’；
TUB-R1，5’-ACACGCAAAAGTTTAACAAATCCA-3’。
PCR扩增反应在Roche LightCycler® 480 II 实时荧光定量PCR仪上进行，循环参数为：95°C预变性30s；40 个循环的95°C 10s，60°C 30s。通过熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳验证PCR扩增产物的特异性，并利用2-ΔΔCt方法（Livak et al. 2001）计算基因的相对表达量。
附图4A为所获得的转基因拟南芥植株中AC基因表达水平的检测结果：可以看出，AC基因在组成型启动子CaMV35S 控制表达条件下，所获得的pMDC83-AC转基因植株中AC基因的表达水平是野生型（WT）植株的2倍（t测验显著性**p < 0.01）；而在诱导型启动子控制表达条件下，所获得的pTA7001-AC转基因植株中AC基因的表达水平在诱导处理6h和24h后（与0h相比）分别提高24倍和50倍（t测验显著性***p < 0.001）。
结论：本发明设计构建的腺苷酸环化酶活性AC基因能够在获得的转基因拟南芥植株中高水平表达mRNA。
2、 cAMP含量检测：参照已发表的植物组织cAMP检测方法（Ma et al. 2009）进行，具体步骤为：依照上述介绍的方法步骤种植拟南芥材料，在植株生长3周左右对pTA7001-AC转基因植株材料喷施DEX，分别在处理后0h，6h和24h采集植株的地上部分组织，同时采集pMDC83-AC和野生型植株在同一时期（对应0h）的地上部分组织，称重后在液氮中研磨成粉末，然后每克鲜重组织加入2mL的1M高氯酸溶液，颠倒混匀，在冰中放置5min提取cAMP，随后加入1/4体积的4M氢氧化钾进行中和反应，涡旋混匀，4°C离心（12000x g）20min，取上清液，放入-80°C冰箱中，过夜后取出，在4°C冰箱中融化，4°C离心（12000 x g）20min，取上清液，使用冷冻干燥机制成干粉。利用cAMP 酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测试剂盒（金斯瑞生物科技股份有限公司），按照产品说明书介绍的操作步骤测定cAMP含量。
附图4B为获得的转基因拟南芥植株中cAMP含量的检测结果：可以看出，AC基因在组成型启动子CaMV35S 控制表达条件下，所获得的pMDC83-AC转基因拟南芥植株在叶片组织中的cAMP含量是野生型（WT）植株叶片组织的1.8倍（t测验显著性*p < 0.05）；而在诱导型启动子控制表达条件下，所获得的pTA7001-AC转基因拟南芥植株在诱导表达24h后（与0h相比）使叶片组织中的cAMP含量提高了1.3倍（t测验显著性*p < 0.05）。
结论：本发明设计构建的腺苷酸环化酶活性AC基因能够在获得的转基因拟南芥植株中显著提高腺苷酸环化酶的表达活性与cAMP含量。
实施例5 转基因甘蓝型油菜中AC基因表达与cAMP含量检测
1、AC基因表达检测：将实施例3中获得的pTA7001-AC转基因油菜植株及其P300亲本对照材料（WT）种植在花盆中，置于22℃和16h光照/8h黑暗的生长室中培养。在植株生长30天左右，按照实施例4中介绍的方法步骤对pTA7001-AC转基因植株材料喷施DEX，分别在喷施后0h，6h和24h采集真叶组织样品，同时采集WT植株在同一时期（对应0h）的真叶组织样品，随后在液氮中研磨成粉末，按照实施例4中介绍的方法步骤提取总RNA，反转录合成cDNA模板，利用引物：AC-F1，5’-GCAGGCTTTGACTTTCACCA-3’；
AC-R1，5’-CTCAGGTATCTCGTCCTCAT-3’对AC转基因的表达水平进行荧光定量PCR检测，并以油菜基因组中编码F-box蛋白质的基因（Bra006317）作为内参基因，扩增引物序列为：FBOX-F，5’-GAGATAAGTCGCTTCCTACCG-3’；FBOX-R，5’-TGTTCCCATTGCCCTGTG-3’。
附图5A为所获得的转基因甘蓝型油菜植株中AC基因表达水平的检测结果：可以看出，在诱导型启动子控制表达条件下，所获得的pTA7001-AC#1和pTA7001-AC#3转基因植株中AC基因的表达水平在诱导处理6h（与0h相比）后分别提高近40倍和2.7倍（t测验显著性**p < 0.01; ***p < 0.001）。
结论：本发明设计构建的腺苷酸环化酶活性AC基因能够在获得的转基因甘蓝型油菜植株中高水平表达mRNA。
2、cAMP含量检测
按照上述介绍的方法步骤，种植pTA7001-AC转基因油菜植株及其P300亲本对照材料（WT）。在植株生长30天左右，按照实施例4中介绍的方法步骤对pTA7001-AC转基因植株材料喷施DEX，分别在喷施后0h，6h和24h采集真叶组织样品，同时采集WT植株在同一时期（对应0h）的真叶组织样品。依照实施例4中介绍的方法步骤对采集的组织样品进行cAMP含量检测。
附图5B为所获得的转基因甘蓝型油菜植株中cAMP含量的检测结果：可以看出，在诱导型启动子控制表达条件下，所获得的pTA7001-AC转基因油菜植株#1在诱导表达6h和24h后（与0h相比）叶片组织中的cAMP含量分别提高了3.3倍和2.6倍（t测验显著性**p <0.01），而转基因油菜植株#3在诱导表达6h和24h后（与0h相比）叶片组织中的cAMP含量分别提高了0.8倍和1.5倍（t测验显著性***p < 0.001）；与P300亲本对照植株材料（WT）相比，AC转基因油菜植株#1和#3在诱导表达24h之内可使叶片组织中的cAMP含量分别提高0.9倍和2.5倍。
结论：本发明设计构建的腺苷酸环化酶活性AC基因能够在获得的转基因油菜植株中显著提高腺苷酸环化酶的表达活性与cAMP含量。
需要说明的是：本发明的具体实施方式并不仅限于以上描述的具体实施例。对于本技术领域的技术人员而言，可以利用本发明的构思和技术原理在权利要求的范围内对上述实施例进行各种改变、修饰、替换或添加，或者通过不同的实施方式实现本发明之精神，也均属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法，其特征在于：包括下述步骤：
第一步，利用生物信息资源，选定能够编码腺苷酸环化酶催化活性中心的模板DNA序列，然后采用PCR扩增或化学合成的方法得到带有该序列片段的DNA产物，所述DNA产物能够在转录表达后翻译生成具有腺苷酸环化酶催化活性的肽链或蛋白质；
第二步，将第一步获得的DNA产物利用DNA克隆技术，导入到所选的植物基因表达载体系统中，将其插入到控制外源基因表达的启动子和终止子元件序列之间的多克隆位点；
第三步，将上述所构建的植物基因表达载体进行遗传转化，获得腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量显著提高的转基因植物。
2.根据权利要求1所述的提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法，其特征在于：第二步中所述的启动子是指以组成型或者诱导型方式控制基因转录起始的调控元件序列，终止子是指控制基因转录终止或者poly(A)形成的调控元件序列，从而形成一个完整的基因表达单元或者基因表达盒，使其能够在植物基因组中进行转录表达与蛋白质翻译。
3.根据权利要求1所述的提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法，其特征在于：将第三步得到的转基因植物提取总RNA，并通过反转录合成cDNA模板，然后利用定量PCR检测腺苷酸环化酶活性转基因的表达水平。
4.根据权利要求1所述的提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法，其特征在于：采集第三步得到的转基因植物组织样品，在液氮中研磨成粉末，加入高氯酸溶液进行提取，随后低温离心，收集上清提取液，冷冻干燥成粉末，利用cAMP酶联免疫法检测试剂盒测定样品中的cAMP含量。
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