CN101802181A - 具有改变的木质素组分的转基因甜高粱及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种与野生植物相比具有改变的木质素含量和/或改变的木质素组分的甜高粱，其通过包含SEQ ID NO 2所示的和可选择地包含SEQ ID NO 1所示的分离的DNA序列的构建体的整合，通过在甜高粱中具体操纵咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAoMT)的表达和可选择地操纵咖啡酸O-甲基转移酶(COMT)的表达获得。

Description

具有改变的木质素组分的转基因甜高粱及其制备方法
背景技术
甜高粱(Sweet sorghum)，甜高粱种(Sorghum bicolor(L.)Moench)，是提供可用于制造酒精、糖、糖浆、燃料等的穗粒和茎秆的唯一的农作物。这种植物的主要问题是细胞壁中存在木质素，其不利地影响了有益物质的提取工艺。木质素含量的改变有可能改善植物的质量。所有用于栽培具有减少的木质素含量的变种所采取的传统育种方法，成功率有限。因此，通过基因工程开发具有改变的木质素含量的栽培变种的可能性被认为是完全可能的。
木质素被认为是由对-香豆醇(p-coumaryl alcohol)、松柏醇(coniferylalcohol)和芥子醇(sinapyl alcohol)单体脱氢聚合而成的。这些单体通过苯基丙酸类合成路径(phenylpropanoid pathway)合成。这些单体在结构上仅在芳环(aromatic ring)的3C和5C位置的甲氧基不同。改变单体的比例决定着木质素的类型。木质素分子的变化/异质性取决于特定组分的总量：当对-香豆醇的总量高于其它组分时，其被称为羟苯基木质素(hydroxyphenyl(H)lignin，H木质素)；当松柏醇的总量高于其它组分时，其被称为愈创木基木质素(guaiacyl lignin(G)，G木质素)。类似地，如果芥子醇的含量超过其它组分时，则被称为紫丁香基木质素(syringyllignin(S)，S木质素)。在酶降解过程中，G木质素比S木质素具有更高的抗性。因为在G木质素中存在更多数量的分子间连接而使其更加致密，从而呈现更高的抗性。据观察，木质素的水平随着饲料作物，包括如紫花苜蓿(alfalfa(Jung et al.，1997))的豆类植物和高羊茅(fescue(Buxton andRedfearn，1997)的草本植物的茎干的渐进成熟而增加。另外，木质素组分随着进一步成熟，其中的S/G比渐进地升高(Buxton and Russell，1988)。
已采取多种方法降低木质素的含量和提高S/G比。但是，结果发现是矛盾的，这可能由于缺少对木质素生物合成途径的了解，及由于采用不合适的用于木质素生物合成酶活性的下调方法，这包括转基因、应用的启动子、反义盒的构建的选择，最重要的是转化子的筛选。调控如苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase)、肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate4-hydroxylase)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4-hydroxycinnamate CoA ligase)的酶的初始反应步骤减少了木质素的含量。但是，这会导致多效性的效果，其包括改变的叶子形状，局部的荧光病变、植株矮小、降低的授粉活性、改变的花的形态和色素沉着，降低了水平的可溶苯丙氨酸，降低了的S/G比等。由其它工作者进行的改变或改良的S/G比而得到的相似效果是导致表型缺陷植物。结果表明，咖啡酸O-甲基转移酶(caffeic acidO-methyltransferase)的活性下调会导致紫丁香基木质素生物合成的剧烈下降，而对愈创木基木质素的影响不大，这个结果是不理想的，因为后者对化学降解具有更高的抗性。在这样的背景下，本发明应用一种不同的方法构建反义基因盒从而提供了一种新的在细胞壁中具有改良的木质素含量的转基因甜高粱植物。
附图说明
图1：用于植物转化的CCoAOMT基因的反义盒的限制性分析
H：Hind III，S：SacI，B：BamHI，E：EcoRI，M：用HindIII/EcoRI消化的Lambda DNA；
图2：用于植物转化的COMT基因的反义盒的限制性分析
H：Hind III，S：SacI，B：BamHI，E：EcoRI，M：用HindIII/EcoRI消化的Lambda DNA；
图3：转基因植物的照片；
图4：通过PCR从基因组中扩增的反义-COMT。泳道1-7表示假定的转化子；-ve表示对照植物；+ve表示细菌中的反义构建体，M表示标准(marker)；
图5：通过PCR从基因组中扩增的反义-CCoAOMT。泳道1-7表示假定的转化子；-ve表示对照植物；+ve表示细菌中的反义构建体，M表示标准(marker)；
图6：双链介导的反义-COMT构建体；
图7：双链介导的反义-CCoAOMT构建体；
图8：双链介导的反义-COMT和反义-CCoAOMT构建体。
发明详述
通过大量的试验，申请人发现木质素组分受CCoAOMT特别影响，受COMT一般影响，当调控时，CCoAOMT对甜高粱植物中的木质素组分具有直接的影响。
因此，本发明提供一种与野生植物相比具有改变的木质素含量和/或改变的木质素组分的甜高粱，这是通过包含如SEQ ID NO 2所示的用于编码咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)的分离的DNA序列的构建体的整合，操作甜高粱中的咖啡酸O-甲基转移酶(COMT)和咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)的表达而实现的。
在本发明的一个优选方面，甜高粱显示了改变的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶活性。可选择地，植物还显示了与野生植物的咖啡酸O-甲基转移酶活性相比改变的咖啡酸O-甲基转移酶活性。
因此，本发明的优选植物包含至少一个外源核苷酸，该外源核苷酸包含与至少一部分咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因“反义”的核苷酸序列，使得转录外源核苷酸时，内源咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的活性被抑制。
本发明的植物包含至少两个外源核苷酸，第一外源核苷酸包含与至少一部分咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因反义的核苷酸序列，第二外源核苷酸包含与至少一部分咖啡酸O-甲基转移酶基因反义的核苷酸序列。当呈现调控内源咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶和内源咖啡酸O-甲基转移酶两者的活性时，上述的构建体包含第一和第二外源核苷酸。外源核苷酸可以呈现于植物中作为相同核苷酸分子的一部分(例如，当它们呈现于相同载体时)；或者它们可以作为单独的分子存在(例如，当它们呈现于不同的载体时)。
本发明在此还提供制备具有改变的木质素含量的转基因植物的方法。植物被遗传性地改造，以降低木质素合成所涉及的一种或多种酶的活性。在一实施例中，本发明公开了制备基因工程植物的方法，其包括用至少一个外源核苷酸转染植物细胞，该外源核苷酸与植物中木质素生物合成所涉及的至少一个生物合成酶的降低的活性相关联，然后使转染的植物细胞生长为与可比较的野生植物的木质素含量相比具有降低的木质素含量的基因工程植物。
在本发明中，所需要的酶是CCoAOMT，外源核苷酸包括与至少一部分CCoAOMT基因“反义”的核苷酸序列。可选择地，植物细胞还可以用例如与至少一部分COMT基因“反义”的第二外源核苷酸转染。转染的植物细胞然后生长为与野生植物相比具有改变的木质素含量和/或改变的木质素组分的转基因植物。转染的植物细胞然后生长为具有改变的木质素组分的基因工程植物。
通过公知方法，例如通过表达载体，将外源核苷酸整合入植物细胞中。通过用编码所有需要的反义分子的单一载体或通过每个都编码一个或多个反义核苷酸的多个载体转染植物细胞，可以制得包含两个或更多个不同的反义核苷酸的植物细胞。单个反义核苷酸的多个拷贝可以，但非必要包含在单一载体中。最好，反义核苷酸的每个拷贝可操作地连接到其各自的启动子和终止子上。
CCoAOMT基因(或基因单元)以与可借助于反转录酶/聚合酶通过mRNA获得的cDNA(″拷贝″DNA)互补的方式存在。CCoAOMT基因还可以以部分或全部合成的形式存在。通过合成的基因，也可以理解为其是通过新加入部分天然基因形成的。
表达盒
表达盒将包含用于筛选转化细胞的选择标记基因。选择标记基因用于筛选转化细胞或组织。选择标记基因包括编码抗生素抗性潮霉素磷酸转移酶(hptII)的基因。
表达盒可以包含一个或多于一个的被转移到转化植物并在其中表达的基因或核苷酸序列。因此，每个核苷酸序列将被可操作性地连接到5′和3′的调控序列。可选择地，可以提供多个表达盒。
本发明提供用于减少甜高粱(Sorghum bicolor，高粱)中木质素的高粱的有效转化的组合物和方法。转化的高粱植物的特征在于包含转移的核苷酸，例如是转移的基因或侧翼连接有至少一个T-DNA接头并插入到高粱植物基因组内的目的基因。由此生成的植物在形态和生殖上是正常的。
咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶，下称CCoAOMT，在生物合成途径中催化咖啡酰辅酶A的甲基化，使其从反式-4-香豆酰-CoA转化为反式-阿魏酰-CoA。此处所说的CCoAOMT基因，应理解为其转录成RNA后并翻译为蛋白质的任意核苷酸(DNA)，形成了具有CCoAOMT的性质的酶，该核苷酸从其天然环境中分离而来，或被整合到载体上或在原核或真核DNA中被包裹为“外源”DNA或“附加”DNA。此处所说的CCoAOMT基因，还应理解为是在其起始和/或末端包含不会或实质上不会妨碍基因的功能的附加DNA序列的CCoAOMT基因。这些DNA序列，还可以称为“基因单元”(″gene units″)，例如可以通过限制性酶切切割形成，因为在基因的起始和末端没有有惯常的限制性酶的切点可以利用。CCoAOMT基因或基因单元在其末端还可以携带适于它们操作的DNA序列(例如“连接子”)。
本发明的方法有益于转化高粱植物细胞。这些细胞可以来源于具有愈伤组织形成潜能的未成熟的胚组织和枝条顶端分生组织。可选择地，愈伤组织可以来源于花粉囊、小孢子、成熟的胚，其原则上来源于能够形成愈伤组织和/或第二胚的高粱植物的任何其它组织。生成再生愈伤组织的有用的组织是从已发育的种子中切下的枝条顶端分生组织。用灭菌蒸馏水洗涤用吐温20(5分钟)和0.2％氯化汞(7分钟)灭过菌的种子表面。然后将种子在培养皿中的浸有灭菌蒸馏水的灭菌过滤纸上孵育，在黑暗中保持3天，以在农杆菌(Agrobacterium)孵育前使枝条顶端生长。
反义盒的生成和其在农杆菌中的转化：
本发明包含的用于生成咖啡酸O-甲基转移酶(COMT)和咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)的cDNA的反义盒及将其导入植物细胞的步骤包括：
(1)从高粱植物的茎秆组织中分离mRNA；
(2)由mRNA制备cDNA；
(3)分离所需要的cDNA；
(4)通过测序测定cDNA的性质；
(5)通过应用用于生成双链RNA的连接子加入正向和反向的基因片段构建基因盒；
(6)通过在表达各个转录本的启动子的下面放置正向-反向基因盒构建表达盒；
(7)在根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中转化盒；
(8)将携带各个基因盒的根瘤农杆菌转化到合适的高粱移植体中；及
(9)筛选假定的转化子。
此处使用的重组技术包含所属技术领域公知的及在例如Sambrook etal(1989)的标准参考资料中描述的标准的分子生物学技术。一般地，根据制造商的使用说明书，需要进行包含DNA连接、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶反应。
本发明包含双链RNA-介导的基因干涉或融合发卡(CV hairpin)RNA方法。双链RNA(dsRNA)-介导的基因干涉的使用已经在多种生物体包括植物中证明。双链RNA分子与单链RNA相比具有的优势是：
a)双链RNA能启动依赖同源的mRNA降解的天然的核糖核酸酶H(RNaseH)；
b)合成的双链siRNA分子形成了特异地抑制基因表达的3′突出粘性末端(3’-overhang)；
c)双链siRNA具有意想不到的高效率和稳定性。已经证明极少数目的dsRNA分子可以对大量转录的靶目标产生在ssRNA情况下不可能实现的特异的抑制(Montogomery and Fire，1998)。
cDNA的制备：
cDNA通过反转录从甜高粱茎秆的mRNA制备。引物对提供可以用于被反转录酶延长的自由3’端的mRNA退火。酶使其按通常的5’到3’延长，由与mRNA模板配对的互补碱基引导形成杂交分子，该杂交分子由与互补的cDNA链配对的模板RNA链碱基组成。最初的mRNA降解后，使用DNA聚合酶合成互补的DNA链，将单链cDNA转变为双螺旋cDNA。应用从来自异源植物系统的基因的保守氨基酸序列设计的兼并引物，通过5’和3’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends，快速扩增cDNA末端)，应用PCR(聚合酶链式反应)分离所需的完全的cDNA。DNA扩增后，将双链DNA插入到pUC18载体中在E.coli中增殖。通过蓝-白斑筛选假定的重组克隆。通过测序并结合计算机分析鉴定和测定包含所需cDNA的克隆的特征。
通过连接子在正和反方向加入所需cDNA片段的适当区域生成正义-反义构建体。将该构建体导入到用于高粱植物转化的表达载体中，以抑制内源COMT/CCoAOMT基因。载体最好包含具有广泛宿主范围的原核复制起点。还应该包含选择标记，使其能够筛选具有所需构建体的细菌细胞。合适的原核选择标记包含对如卡那霉素的抗生素的抗性。
众所周知，在载体中还可以呈现其它编码附加功能的DNA序列。例如，在农杆菌转化的情况下，还可以包含用于后续转移到植物染色体的T-DNA序列。
为了在植物中表达，采用在其中可以导入目的基因的双载体。重组表达盒除了包含所需要的序列外，还将包含植物启动子区域、转录起始点和转录终止子序列。典型地包括盒的5’和3’端的特异限制性酶位点，以使得能够易于插入到先前存在的载体中。本领域技术人员也知晓控制真核基因表达的序列。
本发明的启动子的制备：
DNA转录成mRNA是由被称为启动子的DNA区域调控的。启动子区域包含传递信号给RNA聚合酶使其结合DNA、并将其中一条DNA链作为模板启动mRNA的转录、形成相应的互补RNA链的碱基序列。由于RNA链的5’区域与3’区域互补，因此将生成双链RNA，该双链RNA随后应用产生短的干涉RNA(RNAi)的机制降解。启动子序列包括TATA盒共有序列(TATAAT)，其通常为位于转录起始位点上游的20-30个碱基对(bp)(按照惯例，为从相对于转录起始点的-30到-20bp)。TATA盒是相对于起始点具有相对固定位置的唯一的上游启动子元件。
CAAT盒共有序列以-75为中心，但在从起始点的相当不固定的距离处从任一方向起作用。
另一通常的启动子元件是位于-90的GC盒，其包含共有序列GGGCGG。其可以以多个拷贝且在任一方向出现。
在启动子区域还可以发现其它赋予最大效率的序列。在启动子和结构基因组合中，启动子最好大约位于其与异源转录起始点的距离与在其天然背景中的转录起始点的距离相同的位置。
表达盒中应用的具体的启动子对本发明来说不是关键。在植物细胞中指导转录的任意启动子都是适合的。启动子可以是组成型或诱导型的。
在本发明的研究中应用的玉米泛素启动子(ubiquitin promoter)已经显示在大部分组织中被高度激活和结构性地表达。该玉米泛素启动子包含在植物中选择性表达玉米泛素基因的第一内含子。启动子在HindIII/BamHI位点克隆到载体中，该位点下放置了COMT/CCOAOMT反义构建体。在2x35S启动子下包含选择标记基因潮霉素磷酸转移酶，以能够筛选具有所需构建体的植物细胞。
基因构建体的分析：
A)用于植物转化的COMT基因的反义盒的限制性分析
为了进行限制性分析，从农杆菌克隆中分离重组的DNA。重组DNA的分离方法如下：将包含重组质粒的农杆菌克隆接种至5ml的YEP培养基(酵母提取物10g/l，蛋白胨10g/l和氯化钠5g/l)中，在28℃下孵育36小时。用溶液I(葡萄糖9g/l，Tris 3g/l和EDTA 3.72g/l)悬浮收集的细胞，并在37℃下用溶菌酶(4mg/ml)处理30分钟。然后添加溶液II(1％十二烷基硫酸钠(SDS)和0.2N NaOH)。在室温下孵育30分钟，添加溶液III(醋酸钾294.4g/l)，冰浴15分钟。离心混合物。先用苯酚-氯仿随后用氯仿-异戊醇处理收集的上清液。通过加入十分之一体积的醋酸钠和两倍体积的冷却乙醇沉淀质粒DNA，在-20℃下保持30分钟，以10000rpm离心10分钟。干燥沉淀块并用TE溶解(1M TRIS和0.5M EDTA)。
通过用于产生重组盒的酶的限制性消化分析DNA，消化的片段用分子大小标准参照物检测(图1)。
B)用于植物转化的CCoAOMT基因的反义盒的限制性分析
方法同上(图2)。
通过PCR鉴定基因组中的反义-COMT：
应用整个基因组DNA来鉴定基因组中反义-COMT基因的存在。对于PCR，正向引物从启动子的1393bp处设计，反向引物从基因的5’区域制得。整个扩增区域为1.2kb(0.4kb的启动子区域和0.8kb的用于反义构建体的基因片段)(图5)。
在转化子中用于反义COMT基因的PCR筛选的引物序列：
正向引物：5’gaa ttc tgt ttc aaa cta cct ggt gg 3’
反向引物：5’gaattc atg ggg tcg acg gcg gag gac gtg 3’。
通过PCR鉴定基因组中的反义-CCoAOMT：
应用整个基因组的DNA鉴定基因组中的反义-CCoAOMT基因的存在。对于PCR，正向引物从启动子的1393bp处设计，反向引物从基因的5’区域制得。整个扩增区域为0.89kb(大约0.4kb的启动子区域和大约0.49kb的用于反义构建体的基因片段)(图6)。
在转化子中用于反义CCoAOMT基因的PCR筛选的引物序列：
正向引物：5’gaa ttc tgt ttc aaa cta cct ggt gg 3’
反向引物：5’gaattc atg ggg tcg acg gcg gag gac gtg 3’
从茎尖外植体转化甜高粱(Sorghum bicolor，高粱)：
用灭菌蒸馏水洗涤用吐温20(5分钟)和0.2％的氯化汞(7分钟)灭过菌的种子表面。然后将种子在培养皿中的浸有灭菌蒸馏水的灭菌过滤纸上孵育。黑暗中孵育3天后，切离生成的茎尖并用其中具有农杆菌悬浮液的感染培养基感染20分钟。在共培养基上孵育外植体，并于25℃在黑暗中保持3天。间或用头孢噻肟酸(cefotaxime)和蒸馏水洗涤外植体，以防止细菌污染，并将其转移到具有2mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、30gm/l的蔗糖和250mg/l的头孢噻肟酸的MS上，黑暗中保持12天，以生成愈伤组织。切离在茎尖的切口末端的愈伤组织部分，并将其转移到具有潮霉素筛选的再生培养基(具有30g/l的蔗糖，2mg/l的BAP和2mg/l的潮霉素的MS)上，保持在28℃的2∶1的光照/黑暗周期条件下。2周后，将绿色的愈伤组织转移到含有更高浓度的选择标记(4mg/l的潮霉素)的相同培养基上。将获得的芽转移到具有更高浓度的潮霉素(5mg/l)的相同培养基上2个月，每2周定期传代培养。使伸长的芽生长于生根培养基上以生成根。最后在1/2MS液体培养基上用6mg/l的潮霉素筛选成苗。由单一愈伤组织生成的苗被称为单系。
农杆菌介导的转化：
本发明的农杆菌介导的转化方法可以分为若干个步骤。基本的步骤包括感染步骤；共培养步骤；可选择的休眠步骤(resting step)；筛选步骤；及再生步骤。
在感染步骤中，分离待转化的细胞，并使其接触农杆菌。如果靶细胞是未成熟的胚，分离胚，并使其接触农杆菌的悬浮液。如上所述，农杆菌已被改造为包含目的基因或目的核苷酸。该核苷酸插入到载体的T-DNA区域内。本发明中应用的一般的分子技术由例如Sambrook等(eds.)的分子克隆：实验室手册，1989，冷泉港实验室杂志，冷泉港(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)提供。
在感染步骤和共培养步骤中使用的农杆菌的浓度可以影响转化频率。同样地，非常高浓度的农杆菌会损伤待转化的组织，例如未成熟的胚，并导致愈伤组织的反应降低。因此，本发明的方法中使用的农杆菌的浓度可以随着应用的农杆菌的菌株、转化的组织、转化的高粱的基因型等而变化。为了优化特定的高粱系或组织的转化程序，待转化的组织(例如未成熟的胚)可以用各种浓度的农杆菌孵育。同样地，可以用标记基因表达和转化的程度评测各种农杆菌的浓度。尽管农杆菌的浓度可以变化，本发明中应用的农杆菌，一般地OD600nm为0.7到1.0。
为了优化转化效率，一般将待转化的组织加入到包含某一浓度的农杆菌且为液态接触相的农杆菌悬浮液中。接触相有利于待转化的细胞/组织与农杆菌悬浮液的最大接触。细胞与农杆菌悬浮液接触的时间为至少约3分钟到约15分钟，较佳地为约4分钟到约10分钟，最好为约5分钟到约8分钟。
感染步骤的液体接触相是在液体溶液MS培养基中加入68.5g/l蔗糖，36g/l葡萄糖，100μM乙酰丁香酮(acetosyringone)，pH调整为5.2形成的。本发明应用的其它培养基为：共培养培养基(MS中加入20g/l蔗糖，10g/l葡萄糖，2mg/l 2，4-D，100μM乙酰丁香酮和8.5g/l琼脂，pH 5.8)、细菌培养培养基(YEP培养基-酵母提取物-10g/l，蛋白胨-10g/l和氯化钠-5g/l)、感染培养基(MS中加入68.5g/l蔗糖，36g/l葡萄糖和100μM乙酰丁香酮，pH 5.2)、再生培养基(MS中加入30g/l蔗糖，2mg/lBAP and 8.5g/l琼脂)和生根培养基(1/2MS中加入20g/l蔗糖，0.5mg/lIAA和0.5mg/l NAA)。
感染期间农杆菌的浓度
农杆菌的O.D.-在0.7-1.0之间
后续的共培养步骤，或休眠步骤中(如果应用的话)，将已转化的细胞接受选择压力以筛选那些已经接收到并正表达由农杆菌导入的来自异源核苷酸的多肽的细胞。细胞为胚的情况下，将胚转移到具有固态培养基的平板上，该固态培养基包括抑制农杆菌生长的抗生素及筛选剂。用于筛选转化子的筛选剂将选择用于包含至少一个位于超级双元载体(superbinary vector)内并通过农杆菌导入的可选择的标记插入的外植体的择优生长。
一般地，所属技术领域公知的任何一种适于培养高粱的培养基都可应用于筛选步骤，例如包含悬浮有30g/l蔗糖，2mg/l 2，4-D的N6盐或MS盐的培养基，黑暗中保持15天。筛选期间，培养胚，直到观察到愈伤组织形成。典型地，在选择培养基上生长的愈伤组织能够生长到直径约为1.5到2cm大小。
愈伤组织达到合适大小后，在再生培养基上在黑暗中培养愈伤组织数周，一般地为约1到3周，以使体细胞胚成熟。优选的再生培养基包括包含悬浮有30g/l蔗糖，2mg/l BAP和8.5g/l琼脂的MS培养基。然后在生根培养基上培养愈伤组织，在光照/黑暗循环中培养，直到芽和根生长。
然后将小苗转移到包含生根培养基的管子中大约又一周，使其生长和发育更多根。然后将植物移植到温室中的罐中的土壤混合物中。
应用的外植体：
切自发芽的种子的顶端分生组织的切块
来自茎尖外植体的高粱的转化程序：
用灭菌蒸馏水洗涤用吐温20(5分钟)和0.2％的氯化汞(7分钟)灭过菌的种子表面。然后将种子在培养皿中的浸有灭菌蒸馏水的灭菌过滤纸上孵育。在黑暗中孵育3天后，切离生成的茎尖并用其中具有农杆菌悬浮液的感染培养基感染20分钟。在共培养基上孵育外植体并于25℃在黑暗中保持3天。间或用头孢噻肟酸(cefotaxime)和蒸馏水洗涤外植体，以防止细菌污染，并将其转移到具有2mg/l的2，4-D、30gm/l的蔗糖和250mg/l的头孢噻肟酸的MS上，在黑暗中保持12天，以形成愈伤组织。切离在茎尖的切口末端的愈伤组织部分，并将其转移到具有潮霉素筛选的再生培养基(具有30g/l的蔗糖、2mg/l的BAP和2mg/l的潮霉素的MS)上，保持在28℃的2∶1的光照/黑暗周期条件下。2周后，将绿色的愈伤组织转移到含有更高浓度的选择标记(4mg/l的潮霉素)的相同培养基上。将获得的芽转移到具有更高浓度的潮霉素(5mg/l)的相同培养基上2个月，每2周定期传代培养。使伸长的芽生长于生根培养基上以生成根。最后在1/2MS液体培养基上用6mg/l的潮霉素筛选成苗。由单一愈伤组织生成的苗称为单系。
至少来自转化的细胞的愈伤组织的两个基因咖啡酸O-甲基转移酶 (COMT)和咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAoMT)的酶法测定
方法：收集对照的愈伤组织和转化的愈伤组织，并在液氮中混匀。在4℃在提取缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 7.5，10％甘油，2mM DTT，0.2mMMgCl2，1mM苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride))中提取粉状的组织1小时，在G-50柱上脱盐。应用以BSA为标准品的Bradford法测定蛋白质的浓度。将包含5μl的[14CH3]-S-adenosyl-L-Met，5μl的咖啡酸(1mM)或咖啡酰CoA(1mM)，30μl的测定缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 7.5，10％甘油，2mM DTT，0.2mM MgCl2)的测定混合物和蛋白提取物在30℃孵育30分钟。在COMT和CCoAOMT的情况下，通过分别加入50μl的0.2M HCl和10μl的3 M NaOH终止反应。混合物在37℃保持10分钟后，用40μl的1M HCl酸化CCoAOMT混合物。用200μl的正己烷(hexane)：乙酸乙酯(ethyl acetate)(1∶1，v/v)提取标注的阿魏酸(Labeled ferulic acid)。将分离的有机相转移到闪烁计数瓶并测定放射性。
结果：
测定每个转化系的五个转化的愈伤组织的酶活性，以验证反义策略作为初步研究的作用。结果显示，尽管发现在多数情况下活性的改变不明显，但某些愈伤组织响应明显(通过星号指示)。但是，结果已经证实采用的用于下调表达水平的策略是有效的。
Figure G2008800120824D00141
G和S木质素的估算：
方法：在Lapierre et al.(1986)的硫代酸解法(thioacidolysis)和兰尼镍脱硫(Raney nickel desulfurization)法条件下测定已转化和未转化植物的木质素组分。利用约20mg的细胞壁残渣与15ml的0.2M三氯化鹏(boron trifluoride)和乙醚(etherate)在8.75∶1的二氧杂环乙烷/乙硫醇混合物(dioxane/ethanethiol mixture)反应进行硫代酸解。将二氯甲烷中等份的硫代酸解溶液与1ml兰尼镍水浆混合以脱硫。通过气相色谱-质谱测定如木质素的三甲基硅基衍生物(trimethylsilyl derivatives)的木质素衍生的单体的组分。
结果：
Figure G2008800120824D00151
甜高粱中的G和S木质素组分的含量
发现20天的老野生甜高粱植物的茎秆中的G和S木质素的平均含量分别为415μmol/g干燥样品和390μmol/g干燥样品。平均的紫丁香基木质素/愈创木基木质素比(S/G比)约为0.94。在转化系COMT中观察到总木质素减少。尽管在转化系为COMT的情况下观察到S/G比降到0.7，但是，在转化系为CCoAOMT的情况下观察到S/G比增加到1.2。结果显示，双链反义介导的CCoAOMT下调适于具有改变的木质素含量和组分的甜高粱植物的繁殖。
本发明中包含的培养基组分：
共培养培养基
MS+20g/l蔗糖+10g/l葡萄糖+2mg/l 2，4-D+100μM乙酰丁香酮+8.5g/l琼脂，pH 5.8
细菌培养培养基：
YEP培养基-gm/公升
酵母提取物-10g
蛋白胨-10g
氯化钠-5g
感染培养基：
具有68.5g/l蔗糖，36g/l葡萄糖和100μM乙酰丁香酮的MS，pH 5.2
再生培养基：
具有30g/l蔗糖，2mg/l BAP和8.5g/l琼脂的MS
生根培养基：
具有20g/l蔗糖，0.5mg/l IAA和0.5mg/l NAA的1/2MS
在感染期间的农杆菌的浓度
农杆菌的O.D.-在0.7-1.0之间
愈伤组织感染的条件：
愈伤组织在具有30g/l蔗糖，2mg/l 2，4-D的MS中生长，在黑暗中保持15天。
序列表
<110>纳佳遒纳能源私人有限公司
 
<120>具有改变的木质素组分的转基因甜高粱及其制备方法
 
<130>IP4280-GB/VCD
 
<140>1481/CHE/2006
<141>2007-02-21
 
<160>4
 
<170>PatentIn version 3.3
 
<210>1
<211>1089
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>咖啡酸0-甲基转移酶(COMT)的cDNA序列
 
<400>1
atggggtcga cggcggagga cgtggcggcg gtggcggacg aggaggcgtg catgtacgcg     60
atgcagctgg cgtcgtcgtc gatcctcccc atgacgctga agaacgcgct ggagctgggc    120
ctgctggagg tgcttcagaa ggacgccggc aaggcgctgg cggcggagga ggtggtggcg    180
cggctgcccg tggcgccgac gaaccccgcc gcggcggaca tggtggaccg catgctccgc    240
ctcctcgcct cctacgacgt cgtgaggtgc cagatggagg acaaggacgg caagtacgag    300
cgtcggtact ccgccgcccc cgtcggcaag tggctcaccc ctaacgagga cggcgtctcc    360
atggccgccc tcgcgctcat gaaccaggac aaggtcctca tggagagctg gtactacctc    420
aaggacgcgg tgcttgacgg cggcatcccg ttcaacaagg cgtacgggat gacggcgttc    480
gagtaccacg gcacggaccc gcgcttcaac cgcgtgttca acgagggcat gaagaaccac    540
agcgtgatca tcaccaagaa gctcctcgag ttctacacgg gcttcgacga gtccgtctcg    600
acgctcgtcg acgtgggcgg cggcatcggc gccaccttac acgccatcac ctcccaccac    660
tcccacatca gggggatcaa cttcgacctc ccgcacgtga tctccgaggc gccgccgttc    720
cccggcgtgc agcacgtcgg cggggacatg ttcaagtcgg tgccggccgg cgacgccatc    780
ctcatgaagt ggatcctcca cgactggagc gacgcgcact gcgccacgct gctcaagaac    840
tgctacgacg cgctgccgga gaagggcggc aaggtgatcg tcgtcgagtg cgtgctgccg    900
gtgaccaccg acgccgtccc caaggcgcag ggcgtgttcc atgtcgacat gatcatgctc    960
gcgcataacc ccggcggcag ggagcggtac gagcgggagt tccgtgacct cgccaaggcc   1020
gctggcttct ctgggttcaa ggccacctac atctacgcca acgcctgggc catcgagttc   1080
atcaagtaa                                                           1089
 
<210>2
<211>753
<212>DNA
<213>咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶CCoAOMT的cDNA
 
<400>2
atggccacaa atggcgaaga gcaacagtca caagcaggca ggcaccaaga agtcgaacat   60
aagtcggtgc tgcagtcaga tgccttgtac caatacattc ttgagacttc agtatatcct  120
cgggagccag agccaatgaa ggagctcagg gaattgactg ccaagcatcc atggaatctg  180
atgacaacat cagcagatga atggcaattc ctgaacatgc ttctgaagct gatcaatgcc  240
aagaacacca tggaaattgg tgtttacact ggctactctc tcttagccac agcccttgct  300
cttcctgacg atgccaagat cttggccatg gacattaaca gggaaaacta cgagttgggt  360
ctgcctgtaa tccaaaaagc aggcgttgca cacaaaattg aattcaaaga gggccctgct  420
ttgcctgttc ttgacaaact agtcgaagat gaaaagaatc atgaatcata tgacttcatc  480
ttcgtggatg ctgacaaaga caactacata aactacataa actaccacaa gaggttaata  540
gaccttgtga aagttggagg cttaatcggc tacgacaaca ctctatggaa tggttcggtc  600
gtcgcaccac ctgacgcacc aatgaggaag tatgttcggt actatcggga tttcgtcttg  660
gaaataaata aagcactcgc tgccgaccca aggatcgaga tttgcatgct acctgtcgaa  720
gatggtatca cagtatgtag gcggatccaa tga                               753
 
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>用于扩增CCoAOMT的正向引物
 
<400>3
gaattctgtt tcaaactacc tggtgg                             26
 
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>用于扩增CCoAOMT的反向引物
 
<400>4
gaattcatgg ggtcgacggc ggaggacgtg                          30

Claims (23)

1.由SEQ ID NO 2所示的分离的编码咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAoMT)的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的分离的DNA，其特征在于所述DNA是cDNA。
3.根据权利要求1所述的分离的DNA，其特征在于所述DNA是从甜高粱(高粱)中分离的。
4.包含由SEQ ID NO 2所示的第一外源核苷酸的构建体，所述核苷酸可操作地连接到启动子，其中第一核苷酸在反义方向上，并与至少一部分CCoAOMT基因反义，所述构建体可选择地包含由SEQ ID NO 1所示的与编码咖啡酸O-甲基转移酶(COMT)的核苷酸序列反义的第二核苷酸。
5.包含权利要求4所述的反义构建体的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞是根癌农杆菌。
7.根据权利要求4所述的构建体，其特征在于，所述构建体在植物细胞中的表达导致植物中木质素含量和组分的改变。
8.根据权利要求7所述的构建体，其特征在于，改变的木质素组分的特征是，与野生型植物的紫丁香基木质素/愈创木基木质素比(S/G比)相比，具有改变的紫丁香基木质素/愈创木基木质素比。
9.根据权利要求8所述的构建体，其特征在于在转化的植物中S/G比是1.2。
10.根据权利要求4所述的构建体，其特征在于第一外源核苷酸包含“反义”于至少一部分CCoAOMT基因的“反义”核苷酸序列。
11.根据权利要求10所述的构建体，其特征在于第一外源核苷酸包含与至少一部分内源CCoAOMT RNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的构建体，其特征在于所述内源RNA是前体RNA或mRNA。
13.根据权利要求4所述构建体，其特征在于第二外源核苷酸包含与至少一部分内源COMT RNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
14.根据权利要求11和13所述的反义构建体，其特征在于内源RNA是前体RNA或mRNA。
15.一种制备具有改变的木质素含量和组分的转基因植物的方法，所述方法包含：
a.用第一和可选择地用第二外源核苷酸转染植物细胞，以生成基因工程细胞，所述核苷酸与基因工程植物中的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAoMT)和咖啡酸O-甲基转移酶(COMT)的活性与在野生植物中的CCoAoMT和COMT的活性相比发生改变相关；及
b.使植物细胞在与野生型植物相比具有改变的木质素含量的转基因植物中生长。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于用包含第一外源核苷酸的载体转染植物细胞，以生成基因工程植物细胞，该第一外源核苷酸包含与CCoAOMT基因“反义”的第一核苷酸序列，并可选择地包含与COMT反义的第二外源核苷酸序列。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于第一外源核苷酸的表达引起转基因植物细胞产生第一“反义”RNA转录，该第一外源核苷酸具有与至少一部分内源CCoAOMT RNA互补的核苷酸序列。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于第二外源核苷酸与COMT活性的降低相关。
19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，与野生植物的紫丁香基木质素/愈创木基木质素比相比，基因工程植物的改变的木质素含量和组分具有增加的紫丁香基木质素/愈创木基木质素比。
20.根据权利要求15所述的方法，其特征在于紫丁香基木质素/愈创木基木质素比为1.2。
21.分别由SEQ ID NO 3和4所示的用于扩增CCoAOMT的正向和反向引物。
22.包含权利要求4所述的构建体的载体。
23.根据权利要求22所述的载体，其特征在于应用的载体是pUC18载体。
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