CN106498043A

CN106498043A - 一种香蕉冠腐病菌分子检测引物及检测方法

Info

Publication number: CN106498043A
Application number: CN201610900832.8A
Authority: CN
Inventors: 杜宜新; 石妞妞; 陈福如; 阮宏椿; 杨秀娟; 代玉立; 甘林
Original assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2016-10-17
Filing date: 2016-10-17
Publication date: 2017-03-15

Abstract

本发明涉及一种香蕉冠腐病菌分子检测引物及其检测方法，属于农作物病害检测和生物技术领域。该引物包括上游引物FDF：5’‑CCCGAGGACCCCTAAACTCT‑3’，下游引物FDR：5’‑GCGGGTATTCCTACCTGATCC‑3’。所发明的检测引物及检测方法可用于香蕉冠腐病菌纯培养的检测鉴定，也能对香蕉果冠及香蕉果柄进行检测；本发明检测引物适用性强、灵敏度高，检测方法实用性好，操作简便快捷；本发明能实现香蕉冠腐病的早期检测，还能有效区分香蕉上相似的炭疽病、焦腐病、黑孢冠腐病、轮枝菌冠腐病及酸腐病，对香蕉冠腐病的早期预警和防控，防治病害的扩散蔓延具有重要意义。

Description

一种香蕉冠腐病菌分子检测引物及检测方法

技术领域

本发明涉及一种香蕉冠腐病菌分子检测引物及其检测方法，专用于香蕉冠腐病菌的快速分子检测，同时可实现田间及采后香蕉冠腐病菌的早期诊断和病菌的监测鉴定，属于农作物病害检测和生物技术领域。

背景技术

香蕉（Musa AAA Group）为芭蕉科芭蕉属多年生单子叶草本植物，具有速生和生物量高等特点，栽培品种都是天然单性结果，一般没有种子。芭蕉属植物按果实食用性可分为三类。第一类是纤维用香蕉，又称麻蕉，果实极小，有种子，味涩不可食。第二类是供观赏的，果实细小，其蕉叶婆娑多姿、蕉花奇特美丽，如美人蕉、红花蕉等。第三类果蔬类香蕉，果实大，无种子或极个别败育种子，果肉香甜味美，可作为果品食用，或配作菜肴。这类香蕉只有香蕉（中国矮蕉、香牙蕉）和甘蕉（芭蕉、大蕉）二个种。香蕉是世界鲜果贸易量最大的水果，产量第二位，仅次于柑橘。香蕉也是栽培面积最广的水果之一。据 FAO 统计，2005 年香蕉产量达 10613万t，其中产量排名前列的国家是:印度、乌干达、巴西、厄瓜多尔、中国、菲律宾、哥伦比亚、印度尼西亚、卢旺达和加纳。近几年来，全球香蕉生产量都在稳步增长。我国南部是香蕉原产地之一，有 2000 年以上的栽培历史，现在香蕉已成为我国南亚热带地区的大宗水果，主产地在北纬 22 度附近，主要分布在广东、广西、福建、海南、云南等省（区）。此外在四川、贵州等省的南部也少量栽培。

香蕉冠腐病，主要为害香蕉果冠，使香蕉果冠变褐，后期变黑褐色、黑色。病部无明显界限，发病后从果冠逐渐向指果的端部延伸。在香蕉切口发生大量白色絮状的霉状物、毛状物，即病原菌的菌丝体和子实体，造成轴腐。延伸至果柄后，往往指果散落，果皮爆裂。香蕉采收后如用聚乙烯袋包装，冠腐病发生颇为严重，运输过程中的机械伤也是该病的主要诱因之一，可造成70%-100%轴腐率，15%-30%的果腐率，已成为香蕉采后最主要的病害之一。造成香蕉冠腐病的病原菌为镰刀菌属中的多个种，包括为串珠链孢（Fusarium moniliforme）、串珠链孢亚黏团变种（Fusarium moniliforme var. sulglutinans）、双胞镰孢（Fusarium dimeum）厚孢镰孢（Fusarium chlamydosporum）和半裸镰孢（Fusarium semitectum），其中串珠链孢为主要病原菌，半裸镰孢致病性最强。采后香蕉的带菌检测及针对性的保鲜处理是预防香蕉冠腐病的最佳措施，因此，建立一种快速、灵敏的检测方法用于香蕉冠腐病的早期诊断，将为病害的最佳防治时期提供技术支撑，有效减少香蕉冠腐病造成的损失。因此迫切需要建立一套方便快捷、结果可靠、灵敏度高的快速诊断技术。

近年来，分子生物学技术发展迅速，随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，其中PCR（polymerase chain reaction）技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断。真菌核糖体转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）序列种内的保守性和科属种间可变性的特点，设计特异性引物进行PCR，对病原菌进行快速检测和鉴定的技术已受到广泛的应用，国内外研究人员已成功开发出大豆疫霉、辣椒疫霉、柑橘溃疡病菌、甘薯黑斑病菌和玉米南方锈病菌等多种病原菌的特异性引物和检测方法，实现了快速、灵敏和准确的鉴定。但目前有关香蕉冠腐病菌分子检测的研究尚未见报道。

发明内容

针对现有技术中对香蕉冠腐病菌的检测和鉴定主要基于病原形态学特征，程序繁琐、耗死长、对鉴定经验要求高、准确度低，难以满足香蕉冠腐病诊断的实际需要问题，提供了一种香蕉冠腐病菌分子检测引物及其检测方法。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

本发明首先提供了一种香蕉冠腐病菌分子检测引物，其核苷酸序列为：

上游引物FDF：5’-CCCGAGGACCCCTAAACTCT-3’；

下游引物FDR：5’-GCGGGTATTCCTACCTGATCC-3’。

所述引物FDF和FDR对香蕉冠腐病菌扩增出400bp的产物。

本发明还提供了一种香蕉冠腐病菌的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)从香蕉果冠或香蕉果柄中提取DNA；

用于检测病原菌纯培养物时，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA；用于检测香蕉果冠、果柄组织是否存在香蕉冠腐病菌时，采用NaOH 快速裂解法提取香蕉果冠组织基因组DNA。

(2) 以提取香蕉果冠或香蕉果柄DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的FDF和FDR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能扩增出400bp的产物，则可判定所述的香蕉果冠或香蕉果柄中存在香蕉冠腐病菌，否则所述的香蕉果冠或香蕉果柄中不存在香蕉冠腐病菌。

本发明的积极有益效果在于：

（1）准确性高：本发明是根据真菌核糖体转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对香蕉冠腐病菌具有特异扩增作用的PCR 引物。已经对不同地理来源的香蕉冠腐病菌、携带香蕉冠腐病菌的果冠组织、携带香蕉冠腐病菌的果柄和健康的香蕉组织进行了检测验证，只有香蕉冠腐病菌和携带该病菌的组织能地扩增出一条400 bp 的电泳条带，说明本发明所设计的引物用于检测香蕉冠腐病菌准确可靠；

（2）适用性强：本发明所设计的引物对香蕉冠腐病菌具有很强的适用性，能够用于区别香蕉冠腐病菌、香蕉炭疽病菌、焦腐病菌、黑孢冠腐病菌、轮枝菌冠腐病菌及酸腐病菌等香蕉上常见的病原菌，从而能有效区分发生在香蕉上症状特征相似的病害；

（3）灵敏度高：本发明将设计的特异引物与ITS 基因通用引物（ITS1/ITS4）联合起来进行巢式PCR 扩增后，对香蕉冠腐病菌的检测灵敏度在DNA 水平上可达到10fg；

（4）实用性好：本发明的香蕉冠腐病菌的检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的香蕉组织进行检测，可实现香蕉冠腐病菌的早期检测，即在病害显症前进行检测，防治病害的爆发流行。

（5）、操作简便快速：本发明只需进行DNA 提取、PCR 扩增和琼脂糖电泳后即可判定结果，一般整个检测过程可在数小时内完成，操作简便快捷。

附图说明

图1为本发明引物对香蕉冠腐病菌扩增电泳图：其中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道2、泳道3为香蕉冠腐病菌，泳道4-10分别为：香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、香蕉焦腐病菌 (Botryodiplodia theobromae)、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae)、轮枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum)、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)、阴性对照。

图2为本发明引物香蕉冠腐病菌的灵敏性检测扩增电泳图： A：普通PCR灵敏度检测，其中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道2-12分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、阴性对照、阳性对照；B为巢式PCR灵敏度检测，其中泳道M为2000bp DNAMarker，泳道2-12分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、阴性对照、阳性对照。

图3为本发明香蕉果冠组织和香蕉果柄中冠腐病菌检测扩增电泳图，其中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道2-10分别为自然发病的香蕉果冠组织、自然发病香蕉果柄组织、人工接种发病的香蕉果冠组织、人工接种发病初期香蕉果冠组织、健康香蕉果冠组织、健康香蕉果柄组织、健康香蕉果皮组织、阴性对照、阳性对照。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 分子检测引物设计及香蕉冠腐病菌分子检测方法的建立

1.香蕉冠腐病菌基因组DNA的提取：

采用 CTAB 法提取本实验室保存的7株香蕉冠腐病菌的基因组 DNA，具体步骤如下：

(1)取0.1 g菌丝粉于1.5 mL 离心管中，加入900 μL2%CTAB提取液，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴60min，室温条件下，12000r/min离心15 min；

(2)取上清液700 μL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（各体积比为25:24:1），温和摇动，室温条件下，8000 r/min离心10min ；

(3)取上清液500 μL，加入等体积氯仿再抽提一次，室温条件下，8000 r/min离心10min；

(4)取上清液350 μL，加入1/10 体积3 mol/L NaAc 和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀60min，4℃条件下，8000 r/min离心5 min ；

(5)弃去上清液，加入700μL 体积浓度为70%冰乙醇，轻摇10sec，4℃条件下，8000 r/min离心10sec，晾干，加入50 μL TE缓冲液，-20℃保存备用。

2.香蕉冠腐病菌ITS序列测定：

以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS）通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 为引物对提取香蕉冠腐病菌的DNA 进行PCR 扩增，扩增反应体系和反应程序为：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶（Takara 大连宝生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10min；所得PCR产物送大连宝生物工程有限公司测序。

3.香蕉冠腐病菌特异分子检测引物的设计：

根据香蕉冠腐病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种间高度变异和种内稳定性，用Clustal X软件将测序得到的7株香蕉冠腐病菌的ITS 序列与GenBank 中串珠链孢（Fusarium moniliforme）、串珠链孢亚黏团变种（Fusarium moniliforme var.sulglutinans）、双胞镰孢（Fusarium dimeum）、厚孢镰孢（Fusarium chlamydosporum）、半裸镰孢（Fusarium semitectum）、F.roseum、F.graminearum、F.equiseti、F.moniliforme、 F.oxysporum、F.solani等镰刀菌属多个种的ITS序列、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）ITS 序列、香蕉焦腐病菌(Botryodiplodia theobromae)ITS 序列、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae)ITS 序列、轮枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)ITS 序列、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum)ITS 序列、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)ITS 序列进行同源性分析和差异位点比较，用Primer Primer5软件设计了对香蕉冠腐病菌具有扩增作用的一对PCR引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，即特异分子检测引物的序列为：

上游引物FDF：5’-CCCGAGGACCCCTAAACTCT-3’；

下游引物FDR：5’-GCGGGTATTCCTACCTGATCC-3’

4.香蕉冠腐病菌快速分子检测方法的建立：

(1)从香蕉果冠或香蕉果柄中提取DNA:

①用于检测病原菌纯培养物时，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA;

②用于检测香蕉果冠组织是否存在香蕉冠腐病菌时，采用NaOH 快速裂解法提取香蕉果冠组织基因组DNA，具体步骤如下：

a.称取待检测的植物组织0.1 g，加入0.5 mol/L NaOH 30 μL，将组织充分磨碎成糊；

b.将糊状组织转入1.5 mL 离心管中，12000r/min 离心6 min，取上清液5 μl；

c.上清液中加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），混合均匀，取1.0 μL 作为PCR模板进行扩增；

实施例2 香蕉冠腐病菌扩增

1.采用CTAB 法提取2株香蕉冠腐病菌、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、香蕉焦腐病菌 (Botryodiplodia theobromae)、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae)、轮枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum)、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)的基因组DNA。

2. 以提取供试菌的DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的FDF和FDR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。

3.适用性扩增结果

如图1所示，2株香蕉冠腐病菌可以扩增出400bp的条带，而香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、香蕉焦腐病菌 (Botryodiplodia theobromae)、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae)、轮枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum)、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)和阴性对照均无扩增条带，表明本发明的分子检测引物可以将香蕉冠腐病菌与其他病原菌区分开来，具有很强的适用性。

实施例3本发明引物对香蕉冠腐病菌的灵敏性检测

1.采用CTAB 法提取香蕉冠腐病菌的基因组DNA；

2.将提取的香蕉冠腐病菌的基因组DNA，经分光光度计测定浓度后，用无菌超纯水稀释，配制成系列浓度，备用；

3. 以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的FDF和FDR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。

4. 以配制的成系列浓度DNA为模板进行巢式PCR扩增：

（1）第一轮PCR 扩增：以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS）通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3' 为外引物对配制的成系列浓度DNA 进行第一轮PCR 扩增，扩增反应体系和反应程序为：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶（Takara 大连宝生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10min；

（2）第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增的产物为模板，以FDF/FDR为引物进行第二轮PCR扩增，PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的FDF和FDR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共30个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。

5.检测结果

如图2所示，以本发明引物FDF/FDR为引物进行常规PCR时，在25μL反应体系中，10pg的香蕉冠腐病菌DNA可以获得可视条带，其检测灵敏度可达到10pg（图A）；而进一步以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS）的通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 为外引物扩增的产物为模板，以本发明引物FDF/FDR为引物进行第二轮扩增时，在25μL反应体系中，10fg的香蕉冠腐病菌DNA可以获得可视条带，其检测灵敏度可达到10fg(图B)。

实施例4香蕉果冠及香蕉果柄中香蕉冠腐病菌的检测

1.采用NaOH 快速裂解法提取香蕉果冠组织基因组DNA。

2. 以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的FDF和FDR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。

3. 检测结果

如图3所示，自然发病的香蕉果冠组织、自然发病香蕉果柄组织、人工接种发病的香蕉果冠组织、人工接种发病初期的香蕉果冠组织、阳性对照中均可产生400bp左右的可视条带，而健康香蕉果冠组织、健康香蕉果柄组织、健康香蕉果皮组织、阴性对照均无任何条带出现，表明本发明引物和检测方法还可用于田间香蕉冠腐病发病植株的检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种香蕉冠腐病菌分子检测引物及检测方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccgaggacc cctaaactct 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcgggtattc ctacctgatc c 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccgtaggga acctgcgg 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1. 一种香蕉冠腐病菌分子检测引物，其特征在于：引物的核苷酸序列为：

上游引物FDF：5’-CCCGAGGACCCCTAAACTCT-3’

下游引物FDR：5’-GCGGGTATTCCTACCTGATCC-3’。

2.根据权利要求1所述香蕉冠腐病菌分子检测引物，其特征在于：所述上游引物FDF和下游引物FDR对香蕉冠腐病菌扩增出400bp的产物。

3.一种香蕉冠腐病菌的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)提取香蕉果冠或香蕉果柄的DNA；

(2) 以提取的香蕉果冠或香蕉果柄DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的权利要求1所述的FDF和FDR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能扩增出400bp的产物，则可判定香蕉果冠或香蕉果柄存在香蕉冠腐病菌。

4.如权利要求1所述的香蕉冠腐病菌分子检测引物在检测香蕉冠腐病菌中的应用。